efeitos farmacolÓgicos e morfolÓgicos do...
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MÁRIO OSHIMA
EFEITOS FARMACOLÓGICOS E MORFOLÓGICOS
DO POLIETILENOGLICOL (PEG 400) EM PREPARAÇÕES
NEUROMUSCULARES
CAMPINAS
Unicamp
2008
i
MÁRIO OSHIMA
EFEITOS FARMACOLÓGICOS E MORFOLÓGICOS
DO POLIETILENOGLICOL (PEG 400) EM PREPARAÇÕES
NEUROMUSCULARES
Dissertação de Mestrado apresentada à Pós-Graduação
da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade
Estadual de Campinas para a obtenção do título de
Mestre em Farmacologia
ORIENTAÇÃO: PROFA. DRA. LÉA RODRIGUES SIMIONI
CO-ORIENTAÇÃO: PROFA. DRA. YOKO OSHIMA FRANCO
CAMPINAS
Unicamp
2008
ii
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA DA FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS DA UNICAMP
Bibliotecário: Sandra Lúcia Pereira – CRB-8ª / 6044
Oshima, Mário Os26e Efeito farmacológicos e morfológicos do polietilenoglicol (PEG400) em preparações neuromusculares / Mário Oshima. Campinas, SP : [s.n.], 2009.
Orientador : Léa Rodrigues Simioni, Yoko Oshima Franco
Dissertação( Mestrado ) Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas.
1. Polietileno glicol. 2. Solventes. 3. Junção neuromuscular.
I. Simioni, Léa Rodrigues. II. Franco, Yoko Oshima. III. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas. IV. Título.
Título em inglês : The influence of polyethylene glycol 400 (PEG) on the neuromuscular junction Keywords: • Polyethylene glycol • Solvent • Neuromuscular junction Titulação: Mestre em Farmacologia Banca examinadora: Profa. Dra. Léa Rodrigues Simioni Profa. Dra. Angélica de Fátima de Assunção Braga Prof. Dr. Cháriston Dal Belo Data da defesa: 30-01-2009
iii
DEDICO...
Aos meus irmãos Akiyoshi Oshima e Yoko Oshima Franco,
que me fizeram acreditar na possibilidade de que não era tarde demais.... e a
Yoko, que me ofereceu um caminho e se tornou minha co-orientadora.
à Dra. Lea Rodrigues Simioni, que abriu as portas da Unicamp.
A Deus que colocou todas as pessoas certas neste caminho...
A todas estas pessoas certas que estiveram ao meu lado
torcendo, ajudando e motivando...
Me ajudaram, assim, a construir parte muito importante
da minha história...
Obrigado ao meu universo de mundo, família e amigos que
ajudam para que minha vida seja linda e maravilhosa para ser
vivida e é através desse amor que tento buscar um pouco mais de
conhecimento e evolução.
iv
AGRADECIMENTOS
A Deus...com seu amor infinito, cuida de todos nós e me possibilita evoluir..
aos meus Pais...referência e luz para minha felicidade...
aos meus irmãos...que me protegem.. verdadeiros amigos....
à minha família tão grande...em quantidade e qualidade...
à Caroline e Marcela...filhas que não educo...namoro...quanto amor...
à Maria Claudia Garavati Oshima....meu anjo, mulher da minha vida....
aos meus funcionários...sempre me apoiando e elevando minha imagem...
aos meus pacientes...que tiveram paciência e compreensão....
ao Luiz Massa Shimura....compreensão, apoio, amizade e companheirismo...
aos meus amigos do futebol e do surf ....que me afastei, mas volto....”é nóis”...
à USP (Graduação) e à Unicamp (Mestrado)...geradores de oportunidades...
à Profa. Dra. Lea Rodrigues Simioni...bela visão da ciência, sabedoria e
liderança...
à Profa. Dra. Yoko Oshima Franco...que energia, dedicação e amor...
ao Prof. Dr. Oswaldo Vital Brasil (in memorian)....orgulhoso por te conhecer...
aos Professores da banca de qualificação...Prof. Dr. Edson Antunes, Professora
Dra.Angélica de Fátima Assunção Braga e Professora Dra. Albetiza L. Araujo
à Professora Maria Alice da Cruz Höfling...acesso ao IB e atenção carinhosa...
ao Prof. Stephen Hyslop...belo conhecimento...
v
ao Prof. Dr. Alexandre Corrado...sempre querendo ensinar algo a mais...
à Profa. Julia Prado Franceschi...sua aula é uma história gostosa de assistir...
ao Prof. Dr. Nadin F. Heluany...em meia hora me ajudou com alegria...
ao Chariston André Dal Belo...quantos requisitos aprimorados...
à Saraguaci Hernandes Oliveira Silva...astral e carinho pra todos...
ao Valdemir de Abreu...tudo de professor e que simpatia...
à Priscila Randazzo...alguém que realmente gosta de estudar....que valor....
à Lilian Gobbo de Freitas Bueno...me recebeu com muita delicadeza...
à Caroline Ribeiro de Borja...que meiguice de pessoa...
à Georgina Sucasaca Monzon....uma pessoa doce e bondosa...
à Charlene Galbiatti...seu sorriso fala mais alto e diz muito...
à Delkia Moraes...que “chegou chegando”parecendo uma amiga antiga...
à Mariana Cintra Francischinelli....produtividade de quem sabe o que quer....
ao Aracélio Viana Colares...que bons momentos na sua companhia....
à Lourdes, Thomaz, Mariana, Adriana, Delano, Luiz...convivência alegre e
descontraída...
à Thalita, Catarina, Karina....como me receberam bem na Histologia...
à Marta Leonardo...ensina, ajuda e confia nos alunos de outros departamentos...
à Elaine , Fran e Wanderlei....simpatia, competência e sempre dizendo sim...
ao Miguel, Marcos, Toninho, Zé Ilton, Agnaldo, Adilson...sempre prestativos...
vi
à Cleide do serviço de Estatística...quanta paciência comigo...
à Mercedes do apoio didático...que capricho e amor com os alunos...
aos animais....à cada experimento melhorando minha ética...
ao Thiago Magalhães Camargo...chegou para ser companheiro e cativar
amizade...
ao Dimas dos Santos Rocha Jr...verdadeiro e que facilidade se divertir ao seu
lado...
ao Sandro Rostelato...amigo, companheiro....inesquecível...e que potencial....
ao Gildo Bernardo Leite...simplesmente fundamental....e que ser humano....
vii
As duas maiores forças... o AMOR e DEUS...
Se não for humilde pela essência, que seja pela postura...
Fidelidade e lealdade também é postural...
Desta vida levamos os sentimentos, a moral e o conhecimento...
Conhecimento é sinônimo de responsabilidade...
Única opção pra se viver é ser feliz... e é opção....
Todos temos os mesmos sentimentos e mesmos problemas... portanto, somos iguais...
Poucas chances pra quem se envolve com vícios e crimes...
Difícil lidar com as três maiores cobiças: sexo, poder e dinheiro...
Reflito o egoísmo... talvez o pior sentimento humano e destruidor de tudo...
É mais fácil viver acreditando em eternidade...
Tudo que passamos....ou merecemos ou precisamos...e o motivo é evolução...
Diante do difícil... use a inteligência e a bondade...
A dúvida é científica... e na dúvida não decida...e quem tem dúvidas decide melhor....
Pais... entidade sagrada....
Evoluir como ser humano, cidadão, profissional... para isso serve o estudo...
Perseverar é o caminho da certeza....e da realização....
Pratique com emoção e prazer os cinco sentidos...
Lembre-se várias vezes ao dia as dez melhores coisas da sua vida....
Desenvolva sempre...des-envolva...e olhe com outra visão...
O maior patrimônio material... o nosso corpo físico...e o maior valor...a saúde.
(autor desconhecido).
viii
RESUMO
O polietilenoglicol (PEG) tem sido amplamente utilizado em diversos setores, entre eles, o
cosmético, odontológico, farmacêutico (até como carreador de fármacos a órgãos-alvo), em
virtude de suas fantásticas propriedades químicas. Por tal razão, é denominada uma
molécula bioativa e teve o seu consumo interno aprovado pelo Food and Drug
Administration (FDA).
O objetivo deste trabalho foi pesquisar os efeitos farmacológicos do PEG 400 sobre a
junção neuromuscular; a partir de observações experimentais em preparações de
camundongo e pintainho.
Concentrações de 3 µM, 20 µM e 100 µM de PEG 400, d-Tc (6 µM), neostigmina (12 µM)
e dantrolene (30 µM) auxiliaram na busca do entendimento do mecanismo do PEG sobre a
junção neuromuscular. Foram utilizadas em técnicas miográfica, eletrofisiológica e análise
morfológica, nas preparações nervo frênico-diafragma (NFD) de camundongos e biventer
cervicis (BC) de pintainhos. Especificamente, foi investigada a ação do PEG 400 sobre o
terminal nervoso, fenda sináptica, receptores nicotínicos ou fibra muscular.
Os resultados obtidos através da técnica eltrofisiológica mostraram que o PEG 400 não
exibe ação pré-sináptica, pois não interfere no valor do CQ e nem mesmo apresenta ação
anticolinesterásica quando comparado à neostigmina como controle positivo; também não
mostrou qualquer efeito em receptores nicotínicos, mas alterou a polaridade do sarcolema
causando despolarização das fibras musculares (-80 mV para -16 ± 1,7 mV) para o
PEG 400 (100 µM). Além disso, o PEG 400 (20 µM ) em BC, exibiu antagonismo
ao dantrolene (inibidor de receptor de rianodina) e impediu seu efeito sobre a contração
muscular através do Cálcio. Finalmente, o PEG 400 não causa mionecrose (3 µM e 20 µM),
nem mesmo em concentrações maiores (100 µM), nas quais causa bloqueio total das
respostas do músculo BC.
ix
ABSTRACT
Polyethyleneglycol has been widely used in several areas such as cosmetic, odontology and
pharmaceutical (even as drugs carrier) due to its chemical properties. Thus, it is considered
a bioactive molecule being its internal consumption approved by the Food and Drug
Administration (FDA). The aim of this study was to analyze the pharmacological effects of
PEG 400 over the neuromuscular junction through experimental observations in mice
preparations due to the increase of the contractile response amplitude (facilitating effect).
Conventional myographic techniques, morphological and electrophysiological analysis
were used in mice, phrenic nerve diaphragm preparations (PND) and chick, biventer
cervicis preparations (BC). Concentrations of 3 µM, 20 µM and 100 µM of PEG 400, d-Tc
6 µM, neostigmine 12 µM and dantrolene 30 µM helped in the search for the understanding
of PEG mechanism. Specifically, the action of PEG 400 was investigated over the nervous
terminal, the synaptic cleft, nicotinic receptors or muscle fiber.
The results obtained through the electrophysiological technique showed that PEG 400 did
not exhibit pre-synaptic action and did not act as an anticholinesterasic, as well as
neostigmine. It has not presented action over nicotinic receptors but it presented post-
synaptic action, interfering on the sarcolemma polarity and reverting the action of the
Calcium antagonist, dantrolene, suggesting an interference of the contraction mechanism
through Calcium and the ryanodine receptor. Finally, PEG 400 did not cause mionecrosis
(3 µM and 20 µM) even in concentrations high enough to cause total muscle blockade
(100 µM).
x
LISTA DE ABREVIATURAS
µg Micrograma (s)
µL Microlitro (s)
ACh Acetilcolina
ANOVA Análise de variância
BC biventer cervicis
CaCl2 Cloreto de cálcio
CO2 Gás carbônico
CQ Conteúdo quântico
d-Tc d-Tubocurarina
FDA Food and Drug Administration
Hz Hertz
KCl Cloreto de potássio
MgCl2 Cloreto de magnésio
MgSO4 Sulfato de magnésio
mL Mililitro (s)
mM milimolar
µM micromolar
ms Milisegundo (s)
NaCl Cloreto de sódio
NaH2PO4 Fosfato de sódio
NaHCO3 Bicarbonato de sódio
NFD Nervo Frênico Diafragma
xi
O2 Oxigênio
PE Potencial de equilíbrio
PEG Polietilenoglicol
PEO Polioxidoetileno
PM Potencial de membrana
PPT Potencial de placa terminal
PPT’ Potencial de placa terminal corrigido
V Volts
w Lavagem
xii
LISTA DE FIGURAS
PÁG.
Figura 1- Gráfico representativo da curva concentração-resposta do PEG
400 em preparações neuromusculares de ave e de mamífero........
30
Figura 2- Conteúdo Quântico (CQ) em preparação NFD de camundongo,
técnica do músculo cortado............................................................
32
Figura 3- Experimentos em preparações curarizadas (6 µM) músculo
biventer cervicis de pintainhos, estímulo indireto..........................
33
Figura 4- Respostas contraturantes à adição exógena de ACh e KCl em
preparações BC tratadas com PEG 400.........................................
34
Figura 5- Registro miográfico representativo da preparação BC de
pintainho sob estimulação elétrica direta.......................................
36
Figura 6- Medidas do potencial de membrana no músculo diafragma de
camundongo (NFD)........................................................................
38
Figura 7- Preparações biventer cervicis tratadas com dantrolene, seguidas
da adição de PEG 400....................................................................
39
Figura 8- Figuras representativas de miografias na preparação BC de
pintainho, sob estimulação elétrica direta (20 V, 2ms)..................
40
Figura 9- Registro miográfico representativo de protocolos experimentais
em preparações NFD......................................................................
41
Figura 10- Figura representativa de cortes do músculo biventer cervicis de
pintainho exposto à solução Krebs.................................................
42
xiii
SUMÁRIO
PÁG.
RESUMO............................................................................................................ ix
ABSTRACT........................................................................................................ x
1- INTRODUÇÃO............................................................................................. 16
2- OBJETIVOS.................................................................................................. 19
2.1- Objetivo geral......................................................................................... 20
2.2- Objetivos específicos.............................................................................. 20
3- MATERIAL E MÉTODOS.......................................................................... 21
3.1- Animais................................................................................................... 22
3.2- Materiais................................................................................................. 22
3.3- Soluções nutritivas................................................................................. 22
3.4- Ensaios biológicos................................................................................... 23
3.4.1- Preparação nervo frênico diafragma (NFD) de camundongo........ 23
3.4.2- Preparação biventer cervicis de pintainho..................................... 23
3.5- Técnica histológica (microscopia óptica).............................................. 24
3.6- Técnica eletrofisiológica......................................................................... 25
3.7- Registro do potencial de membrana (PM)........................................... 26
3.8- Análise do conteúdo quântico (CQ)...................................................... 26
3.9- Análise estatística................................................................................... 27
4- RESULTADOS.............................................................................................. 28
4.1- Curva concentração-resposta do PEG 400........................................... 29
4.2- Atividade do PEG 400 avaliada através da técnica eletrofisiológica.. 31
4.3- Protocolo para avaliação de ação anticolinesterásica do PEG 400.... 33
xiv
4.4- Resposta à adição exógena de ACh e KCl............................................ 34
4.5- Preparação biventer cervicis de pintainho (estimulo direto)............. 35
4.6- Potencial de membrana em repouso..................................................... 37
4.7- Protocolo com dantrolene...................................................................... 39
4.8- PEG 400 a 100 µM em preparação BC................................................ 40
4.9- PEG 400 a 100 µM em preparação NFD.............................................. 41
4.10- Análise morfológica do músculo biventer cervicis de pintainho...... 42
5- DISCUSSÃO.................................................................................................. 43
5.1- Técnica miográfica................................................................................. 44
5.2- Técnica eletrofisiológica (análise do Conteúdo quântico)................... 45
5.3- Estudo do PEG 400 comparado com os efeitos da Neostigmina........ 46
5.4- Estudo pós-sináptico............................................................................... 46
5.4.1- Resposta contraturante à adição exógena de ACh e KCl.............. 46
5.5- Estímulo direto em pintainhos (músculo biventer cervicis)................ 47
5.6- Registro do potencial de membrana...................................................... 47
5.7- Protocolo experimental com dantrolene................................................ 48
5.8- Bloqueio total (pintainhos e camundongos sob estímulo elétrico
direto).......................................................................................................
48
5.9- Análise morfológica................................................................................. 49
6- CONCLUSÃO................................................................................................ 50
7- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................ 52
8- ANEXOS......................................................................................................... 57
Anexo 1- Comissão de Ética na experimentação animal................................ 58
Anexo 2- Comprovante de envio de paper a Muscle & Nerve....................... 59
Anexo 3- Artigo encaminhado à Revista Muscle & Nerve............................ 60
xv
1- INTRODUÇÃO
16
O polietilenoglicol é um composto de grande importância para as áreas
biomédicas e de biomateriais (Li, 2001). É produzido mundialmente em grandes
quantidades e com massas molares variando de poucas centenas a milhares de dáltons. A
designação PEG (Polietilenoglicol) é usada para compostos de baixa massa molar (abaixo
20.000 g/mol) e a designação PEO, poli (óxido de etileno), é restrita a compostos de altas
massas molares (maiores que 20.000 g/mol) (Ribeiro, 2001).
Os PEGs com massas molares menores que 1.000 g/mol são fornecidos na
forma de soluções incolores estáveis ou pastas. Os de massas molares elevadas, acima de
1.000 g/mol, são encontrados na forma de pó ou flocos brancos. Podem ser estocados à
temperatura ambiente, embora a 4ºC a ocorrência de oxidação em soluções seja retardada
(Ribeiro, 2001).
A utilização de PEG é de grande interesse na biotecnologia principalmente por
excluir, em ambiente aquoso, outros polímeros de sua vizinhança, não se solubilizando com
esses agentes. Por serem compostos biodegradáveis e atóxicos, a descarga de PEG não é
problemática para o meio ambiente. O PEG possui uma variedade de propriedades
pertinentes para aplicações biomédicas, sendo elas: insolubilidade em água a elevadas
temperaturas, formação de complexos com cátions metálicos, alta mobilidade com grande
poder de volume excluído em água, agente precipitante de proteínas e ácidos nucléicos.
Tais propriedades conferem ampla utilização (agente emulsificante, umectante, lubrificante,
plastificante e detergente) em diversos setores (alimentício, farmacêutico, médico,
odontológico, cosmético, têxtil, industrial, entre outros). Vale ressaltar que o PEG foi
aprovado para consumo interno pelo FDA (Food and Drug Administration) (Li, 2001).
Os estudos com PEG sobre a junção neuromuscular seguiram os passos do
dimetil sulfóxido (DMSO), com a pesquisa de Evans e Jaggard (1973), que referiu a este
(DMSO) uma propriedade fusogênica, posteriormente estudado sobre a transmissão
neuromuscular (McLarnon et al., 1986).
A propriedade fusogênica do PEG em outros tipos celulares tem sido relatada
há várias décadas. Maggio et al. (1976) observaram que o PEG, glicerol e DMSO
diminuíam notavelmente os potenciais da superfície de monocamadas de fosfatidilcolina e
fosfatidiletanolamina, além dos seus envolvimentos na fusão celular.
Introdução
17
Os efeitos destas substâncias continuaram a ser investigados sobre o aspecto da
fusão celular em membranas isoladas também de retículos sarcoplasmáticos
(Stromer et al., 1976); células somáticas (Norwood et al., 1976); células CHO (linhagem
celular de mamífero, Chinese Hamster Origin) (Lau et al., 1977); pesquisou-se a influência
da água e íons cálcio na fusão celular induzida pelo PEG (Blow et al., 1978); em eritrócitos
de galinhas (Smith et al., 1982); em pequenas vesículas unilamelares de fosfatidilcolina de
ovo (Boni et al., 1984); em eritrócitos de peru e humanos (Huang e Hui, 1986; 1990); em
vesículas unilamelares expulsas (Massenburg e Lentz, 1993).
Geron e Meiri (1985) estudaram a fusão de vesículas sinápticas com a
superfície da membrana do terminal nervoso, que é um passo na transmissão sináptica e
que normalmente requer o influxo de íons cálcio no terminal. Os autores verificaram que a
fusão (e a subseqüente liberação do neurotransmissor) pode também ser induzida pelas
substâncias fusogênicas DMSO e PEG. Concluíram que íons cálcio e DMSO exibiam um
efeito sinérgico na fusão de vesículas sinápticas com o axolema, de forma semelhante ao
fenômeno da fusão com lipossomos.
O fenômeno da fusão passou, então, a ser estudado em lipossomos
(Mishra et al., 1988; Holland et al., 1996; Basanez et al., 1997); em seus aspectos
morfológicos nos axônios mielinizados (Krause e Bittner, 1990); com substâncias
inibidoras da fusão (Baldwin et al., 1992); nos aspectos bioquímicos (Haque et al., 2001a,b;
Haque e Lentz, 2002); e nos aspectos genéticos (Kishi et al., 2003).
O PEG 400 que foi utilizado neste estudo possui massa molecular entre
380 a 420 g/mol e para efeitos de cálculos de concentração foi fixado o peso molecular em
400 g/mol. Sua fórmula química H(OCH2CH2)nOH, onde n determina o peso molecular, é
solúvel em água, higroscópico e estável em condições ordinárias. O PEG é uma substância
com muitos sinônimos: Macrogol, Polyoxiethylene, Aquaffin, Nycoline,
alpha-hidro-omega-hidroxipoly (oxy-1,2-ethanedyl), polyethylene glycol, Poly Ethylene
Oxide, Polyoxyethylene, Poly (ethylene glycol).
Nota-se, portanto, que o PEG, embora extensivamente estudado em vários tipos
celulares tem apresentado poucos estudos no âmbito da junção neuromuscular, é utilizado
na formulação de vários medicamentos, presente em vários setores de atividade, fatores
estes, que determinaram a exploração desse agente no presente estudo.
Introdução
18
2- OBJETIVOS
19
2.1- Objetivo geral
O principal objetivo deste trabalho foi pesquisar os efeitos farmacológicos do
PEG 400 sobre a junção neuromuscular, utilizando diferentes preparações neuromusculares
(camundongo e ave).
2.2- Objetivos específicos
1) Estudo do PEG 400 sob análise do Conteúdo quântico (CQ).
2) Estudo do PEG 400 comparado com os efeitos da Neostigmina.
3) Estudo do PEG 400 comparado com efeitos do Dantrolene.
4) Estudo dos efeitos bloqueadores do PEG 400.
5) Estudo do PEG 400 sob análise morfológica.
Objetivos 20
3- MATERIAL E MÉTODOS
21
3.1- Animais
Foram utilizados camundongos machos da linhagem Swiss, pesando entre 25 e
30 g, fornecidos pela Central de Bioterismo (Unicamp) e pintainhos da linhagem HY LINE
W36, com peso entre 40 e 50 g (4 a 8 dias), fornecidos pela Granja Globo Aves. Os animais
foram mantidos no biotério do Departamento de Farmacologia (Unicamp) em gaiolas
abastecidas com água e ração ad libitum, em ambiente com temperatura constante e
iluminação controlada (12 horas com luz e 12 horas sem luz).
O projeto foi submetido e aprovado sob o protocolo no 973-1 (Anexo 1) pela
Comissão de Ética em Experimentação Animal da Unicamp (CEEA-IB-Unicamp) em
reunião realizada em 22 de março de 2006.
3.2- Materiais
Polietilenoglicol 400 (PEG 400) foi obtido do laboratório Labsynth Produtos
para Laboratórios Ltda (Diadema-SP). Drogas como d-Tubocurarina (d-Tc) da Abbott
Laboratories (São Paulo, Brasil), acetilcolina (ACh), Cloreto de potássio (KCl),
neostigmina (laboratório Roche, São Paulo, Brasil) e dantrolene da Sigma- Aldrich Co
(St. Louis, MO, USA), foram utilizadas como ferramentas farmacológicas.
3.3- Soluções nutritivas
Para camundongos - Solução de Tyrode (mM): NaCl 137; KCl 2,7; CaCl2 1,8;
MgCl2 0,49; NaH2PO4 0,42; NaHCO3 11,9 e glicose 11,1.
Para pintainhos - Solução de Krebs (mM): NaCl 118,1, KCl 4,8, CaCl2 2,5,
MgSO4 1,2, NaHCO3 25 e glicose 11,1.
Material e Métodos 22
3.4- Ensaios biológicos
3.4.1- Preparação nervo frênico-diafragma (NFD) de camundongo
Camundongos foram sacrificados pela secção e sangria dos vasos cervicais,
após anestesia com halotano (via inalatória). A preparação foi retirada, segundo técnica
descrita por Bülbring (1946), colocada em cuba contendo solução de Tyrode presa aos
músculos intercostais por ganchos existentes na base da cuba. A temperatura foi mantida a
37ºC e a preparação aerada com carbogênio (mistura de 95% O2 e 5% CO2). O registro da
força de contração muscular foi obtido por meio de transdutor isométrico Load Cell BG-10
GM, acoplado a um fisiógrafo Gould Universal Amplifier Model RS 3400. O músculo foi
submetido à tensão constante de 5 g/cm e à estimulação indireta (nervo frênico) gerado por
estimulador S48F (Grass Instruments), 3 V, 0,2 ms de duração e 0,1 Hz de freqüência. Para
a estimulação direta, a voltagem foi de 50 V e 2 ms de duração. As contrações musculares
foram registradas em um fisiógrafo (Gould RS 3400), por meio de um transdutor isométrico
(Load Cell BG-10 GM). O PEG 400 em diferentes concentrações foi aplicado à preparação
para obtenção da curva dose-resposta (3 µM, 20 µM e 100 µM) e observadas durante
60 min. A ação muscular direta foi ensaiada tratando a preparação com d-Tubocurarina
(6 µM), seguida de estimulação direta.
3.4.2- Preparação biventer cervicis de pintainho
A preparação foi isolada e montada de acordo com o método de Ginsborg e
Warriner (1960). Os pintainhos foram anestesiados com halotano (via inalatória), após o
isolamento, o músculo foi suspenso em uma cuba de 5 mL, contendo solução nutritiva de
Krebs. A solução foi areada de modo constante com carbogênio (mistura 95% O2 e 5%
CO2) e mantida a 37°C. A preparação foi submetida à tensão constante de 1 g/cm e
estimulada por meio de eletrodos bipolares (estimulação de campo).
Foram aplicados pulsos supramaximais de 5 V, 0,1 Hz de freqüência e 0,2 ms
de duração (estimulador Grass S48) para estimulação indireta e 20 V, 2 ms de duração,
0,1 Hz, para estimulação direta. As contrações musculares resultantes de estímulos elétricos
Material e Métodos 23
maximais e as contraturas em resposta às adições exógenas de KCl (13,4 mM) e ACh
(110 μM) foram registradas em fisiógrafo Gould RS 3400, por meio de transdutores
isométricos Load Cell BG-10 GM. O registro das contraturas para o potássio e para a
acetilcolina foram realizados com ausência de estimulação elétrica, no início (antes da
adição da droga) e no final do experimento (após 60 minutos de incubação com o PEG 400
ou após bloqueio total). Para o registro das respostas à estimulação direta (20 V), foi
utilizada d-Tubocurarina na concentração de 6 µM (para total curarização). PEG 400 em
diferentes concentrações foram aplicados para se obter a curva dose-resposta (3 µM, 20 µM
e 100 µM). Nesta preparação, fármacos clássicos em junção neuromuscular foram
utilizados como ferramentas farmacológicas, tais como, neostigmina (12 µM) e dantrolene
(30 µM).
Utilizou-se preparações BC de pintainho, por meio da técnica miográfica, sob
estimulação elétrica indireta, baseado no conhecimento dos efeitos das drogas neostigmina
(ação anticolinesterásica) e d-Tubocurarina (bloqueador neuromuscular competitivo), na
concentração 20 µM de PEG 400 e comparou-se com os controles Krebs e neostigmina
12 µM.
Utilizou-se preparação BC de pintainho, dantrolene (30 µM), seguido de PEG
400 (20 µM), cuja resposta contrátil apresenta facilitação mantida na técnica miográfica.
3.5- Técnica histológica (microscopia óptica)
Os músculos provenientes da técnica miográfica com preparações BC foram, ao
seu final, fixados em Solução de Bouin por 24 h, lavados com solução de amônia e
preservadas em álcool 70%, para posterior análise histológica, seguindo os procedimentos
usuais de histologia: desidratação, inclusão em historesina (Leika NuBloch/Heidelberg,
Alemanha), confecção de blocos, microtomia (micrótomo Leika RM 2035) em secções de 2
µm de espessura, preparação de lâminas e coloração com azul de toluidina 0.5%
(Vetec, São Paulo) e Bórax 5% (Quimesp, São Paulo).
Material e Métodos 24
Um software para a captura de imagens (image Pro Plus 6.0, Mídia Cybernetics
Inc.) foi utilizado acoplado a um microcomputador e assim fotografadas em
fotomicroscópio Zeiss Axiophot.
As lâminas foram observadas em microscópio óptico (Olimpus BX51) e
analisadas por três examinadores. As alterações morfológicas foram quantificadas pela
contagem do número de células lesadas e expresso em porcentagem do número total de
células em três áreas não superpostas, não adjacentes de cada músculo. Esse procedimento
foi usado em todos os experimentos controle e tratado (n=3, cada).
3.6- Técnica eletrofisiológica
A técnica do músculo cortado, proposta primeiramente por Barstad (1962)
modificada para camundongos por Banker et al. (1983) foi utilizada para impedir a
propagação do potencial de ação muscular, evitar o processo contrátil e permitir a captação
do potencial de placa terminal. Fixou-se o conjunto (músculo cortado e nervo)
horizontalmente por meio de alfinetes, em cuba revestida de resina e silicone
(Dow Corning-Sylgard) e preenchido com solução nutritiva de Tyrode. Manteve-se em
temperatura ambiente, e aerou-se a preparação com carbogênio. Observaram-se as
preparações antes e após a adição de PEG a 1 µM e 10 µM (To, T15, T45, T60 min),
concentrações eleitas após ensaios-piloto com PEG 400 a 20 µM, que dificultaram a
resposta basal por 60 minutos, utilizando lupa (Wild m 7 S-Switzerland) de capacidade para
aumento de 40 vezes. Utilizou-se a técnica Fatt e Katz (1951) com introdução de
microeletrodos de vidro intracelularmente sobre as fibras musculares superficiais, com o
auxílio de micromanipulador Leitz, para a obtenção do potencial de placa terminal (PPT),
em resposta à estimulação elétrica indireta (10 V, 0,2 ms, 1 Hz), por meio de eletrodo de
platina posicionado de modo a sugar o coto distal do nervo frênico, sendo utilizado o
software AqDados 4 (Lynx) para registro e armazenamento dos dados em computador para
posterior análise.
Material e Métodos 25
3.7- Registro do potencial de membrana (PM)
Para a medida do potencial de membrana das fibras musculares, os
microeletrodos foram inseridos intracelularmente sobre as fibras musculares superficiais,
com o auxílio do microscópio, fazendo a medida do deslocamento vertical sofrido pelo
feixe no osciloscópio, no momento da inserção. Além disso, o potencial de membrana foi
monitorado digitalmente por intermédio do software já descrito. O mesmo procedimento foi
repetido em cinco fibras distintas em um período de 1 minuto como padrão. O estudo dos
efeitos induzidos pelo PEG 400 (20 µM e 100 µM, esta tratada anteriormente com d-Tc, 6
µM) sobre o potencial de repouso da fibra muscular foi feito nos tempos zero (controle),
t15, t30, t45 e t60 min.
3.8- Análise do conteúdo quântico (CQ)
O conteúdo quântico do Potencial de placa terminal (PPT) corresponde ao
número de “unidades quânticas”, cujo somatório deu origem a esse PPT. Os cálculos
relativos ao conteúdo quântico dos potenciais de placa terminal foram realizados após a
correção dos PsPT para a somatória não-linear de quanta (quantidade de vesículas de
acetilcolina liberadas na fenda sináptica), de acordo com a seguinte fórmula
(Elmqvist e Quastel, 1965), nos tempos zero ( controle), T15, T30, T45 e T60 min.
PPT’ = [(PPT x (PM-PE)] / (PM-PE-PPT)
Onde:
PPT’ = PPT corrigido
PPT = PPT observado
PE = potencial de equilíbrio, que foi considerado -5 mV (Miyamoto, 1975)
PM = potencial de membrana
Material e Métodos 26
3.9- Análise estatística
Os resultados foram expressos como média + erro padrão. Para a significância
das diferenças observadas foram utilizados a Análise de Variância para medidas repetidas
ANOVA (Repeated Measures), com valor p < 0,05 considerado significativo, comparando
os tratamentos e as medidas ao longo do tempo.
Material e Métodos 27
4- RESULTADOS
28
4.1- Curva concentração-resposta do PEG 400 em preparações neuromusculares
isoladas de camundongo e de pintainho
A Figura 1 ilustra a curva concentração-resposta do PEG 400 em preparações
nervo frênico-diafragma de camundongo (Fig. 1A) e biventer cervicis de pintainho
(Fig. 1B). Diferentes concentrações de PEG 400 (3, 20 e 100 µM) dissolvidos em solução
nutritiva (Tyrode ou Krebs), produzem quase que imediatamente um aumento da resposta
contrátil, mesmo com concentrações baixas quanto às de 3 µM (p < 0,05 em relação ao
controle Krebs, principalmente nos tempos de 20 a 60 minutos de incubação). A facilitação
inicial observada pode causar diferentes efeitos sobre a resposta contrátil e é dependente da
concentração. Aquelas de 3 e 20 µM retornam ao nível basal (camundongos) ou mantêm a
resposta facilitatória (pintainhos), durante 60min, enquanto que a concentração de 100 µM
induz um bloqueio neuromuscular completo ligeiramente mais rápido (10min) em
camundongos do que em pintainhos (30min). Nessa concentração, um efeito contraturante
foi observado em todos os experimentos realizados em preparações de ave (n=6). Esses
resultados tomados em conjunto revelam uma maior sensibilidade da preparação NFD à
ação do PEG, quando comparada a de aves. A lavagem (w) sucessiva das preparações com
novas soluções nutritivas de Tyrode ou de Krebs é suficiente para a completa remoção do
PEG 400 e para a reversão das respostas musculares à condição controle.
Resultados 29
0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 8 00
3 0
6 0
9 0
1 2 0
1 5 0
1 8 0
***
*
*****
******
w
B
A
p i n t a i n h o ( m ú s c u l o B C ) P E G 3 μ M ( n = 8 ) P E G 2 0 μ M ( n = 6 ) P E G 1 0 0 μ M ( n = 6 ) C o n t r o l e K r e b s ( n = 7 )
Res
post
a co
ntrá
til (%
)
T e m p o ( m i n )
0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 8 00
3 0
6 0
9 0
1 2 0
1 5 0
1 8 0
******
*
*
w
c a m u n d o n g o ( N F D ) P E G 3 μ M ( n = 6 ) P E G 2 0 μ M ( n = 1 4 ) P E G 1 0 0 μ M ( n = 8 ) C o n t r o l e T y r o d e ( n = 8 )
Res
post
a co
ntrá
til (%
)
T e m p o ( m i n )
Figura 1- Gráfico representativo da curva concentração-resposta do PEG 400 em
preparações neuromusculares de ave e de mamífero, sob estímulo elétrico
indireto. (A) Preparação nervo frênico-diafragma de camundongos. (B)
Preparação biventer cervicis de pintainhos. Efeito facilitatório inicial é
observado rapidamente quando adicionado o PEG 400 dissolvido em solução
nutritiva, para respostas mantidas (pintainhos) ou não (camundongos) com 3 e
20 µM ou bloqueio neuromuscular com 100 µM. Cada ponto representa a
média ± erro-padrão. O número de experimentos é mostrado na legenda das
figuras. (w, lavagem; PEG, polietilenoglicol; *, p < 0,05).
Resultados 30
4.2- Atividade do PEG 400 avaliada através de técnica eletrofisiológica
O Polietilenoglicol (PEG 400) foi investigado através de técnica
eletrofisiológica, para capturar biopotenciais, tais como Potencial de membrana (mostrados
à pág. 40) e Potencial de Placa Terminal (PPT), necessário para a obtenção do Conteúdo
Quântico (CQ), conforme ilustrado na Figura 2.
A Figura 2A ilustra os efeitos do PEG 400 na concentração de 1 µM sobre o
CQ, que apresentou um aumento da amplitude dos PPT evocados nos 30 minutos iniciais,
não significativo e retornou ao nível basal ao longo do experimento, e a concentração de 10
µM não ocasionou aumento das respostas evocadas ao longo de 60 minutos de observação,
Figura 2B. Ambas as concentrações utilizadas não apresentaram diferença significativa em
relação ao controle Tyrode (p > 0,05).
Resultados 31
Resultados 32
Figura 2- Conteúdo Quântico (CQ) em preparação NFD de camundongo, técnica do
músculo cortado, com adição do PEG 400 após o controle Tyrode, nos tempos
15, 30, 45 e 60 minutos. (A) 1 µM e (B) 10 µM de PEG 400 (n=4, p > 0,05).
1 2 3 4 50
2
4
6
8
10
12
14
16
18
PEG 400 60 min
PEG 400 45 min
PEG 400 30 min
PEG 400 15 min
controle tyrode
Con
teúd
o Q
uant
ico
(CQ
)
camundongo (NFD)(1 μM)eletrofisiologiaPEG 400n=4
1 2 3 4 50
10
20
30
40
50
60
PEG 400 60 min
PEG 400 45 min
PEG 400 30 min
PEG 400 15 min
controle tyrode
Con
teúd
o Q
uant
ico
(CQ
)
camundongo (NFD)(10 μM)eletrofisiologiaPEG 400n=4
A
B
4.3- Protocolo para avaliação de ação anticolinesterásica do PEG 400
A Figura 3 mostra os registros miográficos representativos das preparações que
foram tratadas com d-Tc (Fig. 3A, 6 µM) (n=6), d-Tc seguido de neostigmina (Fig. 3B,
12 µM) (n=4) e d-Tc seguido de PEG 400 (Fig. 3C) (n=6). Os resultados para o PEG 400
(20 µM) mostraram efeito contrário aos do anticolinesterásico utilizado. Enquanto a
neostigmina reverteu o efeito do curare, o PEG 400 manteve o bloqueio neuromuscular
semelhante ao da d-Tc sozinha.
d-Tc
Figura 3- Experimentos em preparações curarizadas (d-Tc, 6 µM) músculo biventer
cervicis de pintainhos, estímulo indireto (técnica miográfica). (A) Controle
Krebs (n=6), (B) neostigmina (12 µM) (n=4) e (C) PEG 400 (20 µM) (n=6).
Observa-se que o PEG 400 não tem a mesma ação anticolinesterásica da
neostigmina. ∆ KCl, □ ACh, tempo zero= momento da adição da nestostigmina
ou PEG 400. Tensão = 1g.
neostigmina
d-Tc
d-Tc PEG 400
Resultados 33
4.4- Resposta à adição exógena de ACh e KCl
A preparação de ave forneceu dados adicionais quanto à resposta contraturante
à adição exógena de ACh e KCl, em função do tipo de inervação, que é múltipla, ao
contrário da preparação de camundongos. As concentrações de 3 µM (n=8) e 20 µM (n=6)
não alteraram a resposta contraturante à adição de ACh, porém alteraram a resposta
contraturante frente à adição de KCl, 3 µM (80 ± 4,3%) e 20 µM (123 ± 12 %), (p < 0,05)
(Fig. 4), enquanto as preparações tratadas com PEG 400 em elevadas concentrações
(100 µM, n=6) causaram bloqueio total tanto às respostas contraturantes de ACh quanto às
do KCl. Estes resultados indicam que a facilitação possa ocorrer em função do PEG
melhorar a excitabilidade da membrana por ação direta e não por uma ação pós-sináptica
sobre receptores nicotínicos.
Figura 4- Respostas contraturantes à adição exógena de ACh e KCl em preparações BC
tratadas com PEG 400 em diferentes concentrações (3, 20 e 100 µM).
* p < 0,05 em relação à condição controle (100%, antes do tratamento). Δ,
bloqueio total. PEG, Polietilenoglicol.
0
20
40
60
80
100
120
140
**
*
*
^^ 10020310020Concentração (μM)3
Res
post
a co
ntra
tura
nte
(%)
ACh KCl
Resultados 34
4.5- Preparação biventer cervicis de pintainho (estímulo direto)
Protocolos usando estimulação elétrica direta foram realizados com a finalidade
de elucidar os fenômenos de facilitação e bloqueio neuromuscular induzidos pelo
tratamento com PEG 400 (20 µM, n=4 e 100 µM, n=8). A Figura 5 ilustra registros
miográficos representativos da média do número de experimentos realizados. Preparações
tratadas com 20 µM apresentaram o mesmo perfil daquele obtido sob estímulo indireto
(facilitação inicial, com retorno da resposta contrátil aos níveis basais após a lavagem da
preparação). A diferença observada quando ensaiou-se o PEG 400 em concentração elevada
(100 µM) foi o aparecimento de contratura concomitante à facilitação inicial, seguida de
bloqueio neuromuscular. O tempo para causar um bloqueio neuromuscular de 50% (T50)
foi de 23 ± 4,3 min, sem diferença significativa com o mesmo protocolo realizado sob
estímulo elétrico indireto, cujo T50 foi de 15 ± 1,4 min (n=6).
Resultados 35
Resultados 36
Figura 5- Registro miográfico representativo da preparação BC de pintainho sob
estimulação elétrica direta. Figura 5A representa o Controle Tyrode, Figuras
5B e 5C, representam as preparações expostas às concentrações de PEG 400
20 µM e 100 µM, respectivamente. O tempo zero representa o momento da
adição do PEG 400 em B e C. Note o nível de recobro da resposta contrátil
após a lavagem, nos diferentes tratamentos. Tensão = 1 g, 20 V e 2 ms.
(n=6 para A, B e C); w, lavagem.
A
B
C PEG 400
PEG 400 w
w
w
4.6- Potencial de membrana em repouso
As preparações controle mantiveram os valores dos potenciais de membrana
em - 83 ± 1,5 mV ao longo do experimento, no entanto, a adição do PEG 400 na
concentração de 20 µM (Fig. A) induziu a um efeito despolarizante da preparação NFD
após 30 min, em -70 ± 1,6 mV, enquanto a preparação que foi pré tratada com d-Tc (6 µM),
para a obtenção do bloqueio total e possibilitar a avaliação dos valores do potencial de
membrana em repouso da fibra muscular, na concentração de 100 µM (Fig. B), induziu
uma diminuição do potencial de repouso, portanto um efeito despolarizante da ordem de -
16 ± 1,7 mV, que foi observado logo após 15 minutos de incubação com o polietilenoglicol
e que se manteve durante os 60 min de observação.
Os resultados mostraram alterações significativas do potencial de membrana
após 30 min e 15 min de incubação com 20 µM e 100 µM, respectivamente.
Resultados 37
Resultados 38
Figura 6- Medidas do potencial de membrana no músculo diafragma de camundongo
(NFD). Na Figura A, adição de PEG 400 na concentração de 20 µM (n=4) após
o registro inicial controle Tyrode pelos tempos de 15, 30, 45 e 60 minutos. A
figura B representa o experimento utilizando o pré-tratamento com
d-Tubocurarina (6 µM) e adição de PEG 400 na concentração de 100 µM (n=4).
*, p < 0,05.
A
B
controle 15 30 45 600
10
20
30
40
50
60
70
80
90
***
PEG 400 20 μM controle
camundongo (NFD)eletrofisiologian = 4Po
tenc
ial d
e m
embr
ana
(-mV)
Tempo (min)
contole 15 30 45 600
10
20
30
40
50
60
70
80
90
****
PEG 400 100 μM controle
camundongo (NFD)eletrofisiologiad-Tcn = 4
Pote
ncia
l de
mem
bran
a (-m
V)
Tempo (min)
4.7- Protocolo com dantrolene
Com a adição de dantrolene (30 µM), foi observado um bloqueio
neuromuscular de 47 ± 4,7%, após 30 minutos (Fig. 7). Após a adição do PEG 400
(20 µM), observa-se uma reversão das respostas contrácteis em resposta à adição do
dantrolene, ocorrendo portanto, um efeito de reversão sobre a resposta de contração
muscular da ordem de 35 ± 10,1% (p < 0,05).
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 11050
60
70
80
90
100
110
DANTROLENE
Biventer cervicis E.I.PEG 400 20μMn=4
Res
post
a C
ontra
til (%
)
Tempo (min)
A
PEG 400
B 0
Figura 7- Preparações biventer cervicis tratadas com dantrolene, seguidas da adição de
PEG 400 (30min), sob estimulação elétrica indireta. (A) dantrolene na
concentração 30 µM causou bloqueio parcial próximo de 47% e aos 30 minutos
adicionou-se PEG 400 a 20 µM. (B) registro miográfico representativo da
condição acima. Note que o PEG 400 antagonizou o efeito do dantrolene à
resposta contrátil (p < 0,05). Tensão 1g.
w Tempo (min) PEG 400
Resultados 39
4.8- PEG 400 a 100 µM em preparação BC
Este protocolo experimental foi realizado com intuito de pesquisar o bloqueio
total causado pela concentração de 100 µM de PEG 400 na preparação BC, concentração
que também causa bloqueio total na preparação NFD de camundongo. Foi utilizada, a d-Tc
(6 µM) e em seguida, a preparação foi estimulada diretamente (20 V, 2ms). Após a
estabilização foi adicionado o PEG 400 (100 µM) por um período de 60 minutos.
A Figura 8 mostra o traçado do registro miográfico com o tratamento de PEG
400 (100 µM) sob estimulação elétrica direta. Observou-se um bloqueio da resposta
muscular, acompanhado de uma importante contratura ao longo do experimento, que não
retornou à linha de base mesmo após sucessivas lavagens e adição exógena de ACh e KCl.
A
B
ACh KCl d-Tc Ed PEG 400 ACh KCl Ei
Figura 8- Figuras representativas de miografias na preparação BC de pintainho, sob
estimulação elétrica direta (20 V, 2ms). (A) Controle Krebs e (B) adição de
PEG 400 (100 µM) observado por 60 minutos. Note que a preparação tratada
com PEG 400 não retornou à linha de base, mesmo após lavagens com solução
nutritiva. Ei, estimulo indireto, Ed, estimulo direto. Barra (Tensão=1g).
Resultados 40
Resultados 41
4.9- PEG 400 a 20 µM e 100 µM em preparação NFD
Este protocolo experimental foi realizado para estudo do bloqueio total na
preparação NFD em camundongos, sob estimulação elétrica direta, nas concentrações de
20 µM (Fig. A) e 100 µM (Fig. B) de PEG 400, objetivando complementar o estudo
anterior em preparações BC de pintainho. O uso da d-Tc também foi utilizado para ocupar
os receptores nicotinicos e visualizar os efeitos do PEG sobre as contrações musculares em
resposta ao estímulo elétrico direto na fibra muscular.
A Figura 9 mostra o registro miográfico da preparação NFD, incubada com o
PEG 400 20 µM (Fig. 9A), sem apresentar bloqueio da resposta muscular. Em 100 µM
(Fig. 9B) houve bloqueio da contração muscular e uma pequena contratura ao longo do
experimento. Após a lavagem com solução nutritiva obteve-se um retorno dessa resposta
diferentemente da resposta à preparação BC, que não houve retorno da resposta muscular,
após a lavagem.
Figura 9- Registro miográfico representativo de protocolos experimentais em preparações
NFD, sob estimulação elétrica direta. O PEG 400 foi adicionado (Tempo zero)
nas concentrações de (A) 20 µM e (B) 100 µM. Note que o bloqueio total
ocorreu em 100 µM com um breve efeito contraturante e pequeno retorno da
resposta muscular pós lavagem (n = 6). W, lavagem, Ei, estimulo indireto, Ed,
estimulo direto, Barra= 5g
A
B
Ei d-Tc Ed w Ed Ei
Ei d-Tc Ed w Ed Ei
Resultados 42
4.10- Aná
A Figura 10 ilustra secções transversais de preparações músculo biventer
nutritiva de Krebs
(controle) observaram-se 3,6 ± 0,5% de fibras alteradas. Quando os músculos foram
tratados com PEG 400 nas c
lise morfológica do músculo biventer cervicis de pintainho
cervicis de pintainho. Nos músculos que foram incubados com solução
oncentrações de 3 µM, 20 µM e 100 µM, apresentaram
2 ± 0,6 %, 5,2 ± 0,6% e 4,3 ± 0,9% de alterações, respectivamente. Não houve diferença
significativa entre os protocolos controle e tratado (p > 0,05).
µµMM
µµMM µµMM
Figura 10- Figura representativa de cortes do músculo biventer cervicis de pintainho
exposto à solução Krebs (controle Krebs), 3 µM, 20 µM e 100 µM de PEG
400. Note que não foram observadas alterações morfológicas nos tratamentos
(p > 0,05). Barra= 20 µm.
5- DISCUSSÃO
43
5.1- Técnica miográfica
O PEG 400, quando adicionado em preparações neuromusculares para o
regsitro miográfico, é capaz de produzir efeitos concentração dependente, e ocorrem
diferenças importantes entre as preparações nervo frênico diafragma (NFD) de
camundongos e músculo biventer cervicis (BC) de pintainhos. A concentração de 3 µM,
mostrou-se sem efeito aparente sobre a preparação NFD e foi a utilizada por Cintra
Francischinelli et al. (2008) para a solubilizar o extrato hidroalcoolico das folhas da planta
Casearia sylvestris, popularmente conhecida como guaçatonga. Na preparação BC, a
concentração de 3 µM já apresentou um efeito evidente facilitador da neurotransmissão, e
na concentração de 20 µM causou efeito facilitador em ambas as preparações. Assim, em
preparações de camundongo houve retorno da resposta contrátil ao nível basal, ao passo
que na preparação de ave a facilitação foi mantida até o final do experimento. Esta
diferença pode ser interpretada como sendo em virtude do tipo de preparação utilizada,
pois diferem quanto ao tipo de inervação que exibem. Harvey et al. (1994) consideram a
preparação BC vantajosa no estudo de venenos e toxinas, quando comparada à preparação
NFD de camundongo, especialmente quando tal estudo se destina a diferenciar os seus
mecanismos de ação pré e/ou pós-juncionais. A importância da diferença de inervação
destas preparações é que poderá resultar nas diferentes respostas farmacológicas, quando
expostas às concentrações de substâncias semelhantes (Rodrigues et al., 2004). Diferença
de resposta na sensibilidade das preparações também foram evidenciadas na concentração
de 100 µM, sendo que a preparação diafragma de camundongo exibiu um bloqueio
neuromuscular completo ocorrido 15 min antes que o na preparação de ave.
Os experimentos foram observados por 60 minutos, e assim padronizadas tanto
para experimentos sob a técnica miográfica quanto os sob a técnica eletrofisiológica, pois
neste período foi possível a observação dos eventos nas preparações neuromusculares
utilizadas.
Quando as preparações BC e NFD foram lavadas, após 60 minutos de registro,
foram lavadas com solução nutritiva de Krebs ou de Tyrode respectivamente, verificou-se
um retorno da atividade contrátil (exceto na concentração de 100 µM), e esses eventos
comprovam que o PEG 400 não exibe qualquer ação lesiva às preparações
Discussão 44
neuromusculares. Este resultado corrobora àquele obtido através do estudo histológico que
mostrou ausência de alteração morfológica.
Vale lembrar, também, que foram realizados outros protocolos experimentais
em diferentes concentrações, usando-se a técnica miográfica, mas com resultados similares
à concentração de 20 µM, o que levou à escolha das concentrações de 3, 20 e 100 µM para
o prosseguimento do estudo do PEG.
Os diferentes efeitos farmacológicos alcançados do PEG 400 na técnica
miográfica, das preparações neuromusculares de pintainhos (3 µM, 20 µM e 100 µM),
foram também avaliados morfologicamente.
5.2- Técnica eletrofisiológica
A técnica eletrofisiológica pode fornecer informações que indicam o sítio de
ação de substâncias ou toxinas na junção neuromuscular. A preparação nervo frênico
diafragma de camundongo exibe fibras de pequeno diâmetro, o que determina a
manutenção somente por um curto de período de tempo de empalamento; diferente das
fibras de rã, que são grandes (Rodrigues-Simioni et al., 1983), e uma vez empaladas
(inserção do microeletrodo na fibra muscular) mantém-se dessa forma até o final do
experimento.
A utilização da eletrofisiologia nos estudos do PEG 400 foi para observar a
influência da concentração, uma vez que Geron e Meiri (1985) encontraram atividade pré
sináptica utilizando PEG 8000 na concentração de 12,5 mM.
A concentração de 10 µM de polietilenoglicol foi condizente com os efeitos
facilitatórios observados na técnica miográfica em preparações NFD, mas neste tipo de
preparação ocorre o retorno da resposta contrátil para o nível basal ao longo do
experimento. Nas concentrações de 15 µM e 20 µM não foi possível a captação dos
biopotenciais pela dificuldade de empalamento.
Discussão 45
Nas concentrações de 1 µM e 10 µM não se observou diferenças significativas
quando os tempos de 15, 30, 45 e 60 minutos após a adição do PEG 400 foram comparados
com o controle Tyrode (p > 0,05). Portanto, os achados do presente estudo não
corroboraram a atribuição de atividade pré-sináptica do PEG 400 por meio de estudos
eletrofisiológicos, no que diz respeito ao estudo da variação do PPT (potencial de placa
terminal), para a medida do conteúdo quântico (CQ), que é a quantidade de liberação de
vesículas de neurotransmissor (Acetilcolina) na fenda sináptica.
5.3- Estudo da atividade anticolinesterásica
As drogas anticolinesterásicas, por inibirem a enzima que hidrolisa a
acetilcolina, propiciam maior concentração dessa substância nas placas terminais após cada
impulso nervoso e permanece por muito mais tempo nos receptores na membrana
subsináptica (Eccles e MacFarlane, 1949). Quando esta enzima, acetilcolinesterase, é
inibida, ocorre um aumento significativo da amplitude da resposta contrátil.
Foi utilizada a d-Tubocurarina (6 µM), para bloqueio total em preparações de
BC para comparação com o anticolinesterásico neostigmina (12 µM) e com a ação do PEG
400 (20 µM). Não foi observado o mesmo efeito de reversão da resposta contrátil quando
foi utilizado o polietilenoglicol 400; já com a adição da neostigmina foi observada a
reversão do bloqueio neuromuscular, pelo fato que as drogas anticolinesterásicas
possibilitam o aumento da concentração de acetilcolina na fenda sináptica, que por sua vez
desloca a d-Tubocurarina dos receptores nicotínicos por mecanismo competitivo.
Por intermédio desse protocolo experimental foi evidenciado que o PEG 400
(20 µM) não apresenta ação anticolinesterásica.
5.4- Estudo da atividade pós sináptica
5.4.1- Resposta contraturante à adição exógena de ACh e KCl
Após a observação da ausência dos eventos pré-sinápticos, foram analisadas as
curvas de acetilcolina (ACh) e de Cloreto de potássio (KCl) para avaliar, respectivamente,
eventos sub-sinápticos e pós-sinápticos, em preparações neuromusculares de pintainhos,
Discussão 46
por possuir inervação multifocal e apresentar vários receptores ao longo da sua fibra. Esta
preparação exibe respostas contraturantes à adição exógena de ACh (permite avaliar a
integridade do receptor nicotínico) e KCl (permite avaliar a integridade do sarcolema), não
observadas usando-se outras preparações como a de mamífero (Harvey et al., 1994).
As respostas contraturantes à ACh e KCl foram analisadas após a adição do
PEG 400 (3 µM, 20 µM e 100 µM). Para as respostas à ACh não houve diferença
significativa (p > 0,05) em relação às contraturas controle. Desse modo, não houve efeito
do PEG 400 sobre receptores nicotínicos, mas sobre as fibras musculares, pois apresentou
diferença estatística entre as contraturas em resposta à adição de KCl quando comparadas
aos controles (p < 0,05). Na concentração PEG 400 (100 µM), contudo, houve bloqueio
das respostas contraturantes tanto à ACh quanto ao KCl.
5.5- Estímulo direto em pintainhos (músculo biventer cervicis)
Este estudo foi realizado em razão dos indicativos de uma ação do PEG 400
sobre a fibra muscular através de observações usando-se a técnica miográfica, sob estímulo
elétrico direto. Com o uso da d-Tc (6 µM), exclui-se a participação do receptor nicotínico e
os efeitos sobre a fibra muscular podem ser avaliados isoladamente.
Com a adição do PEG 400, os resultados obtidos foram similares aos
experimentos sob estimulação indireta, evidenciando sua ação direta sobre a fibra muscular.
5.6- Registro do potencial de membrana
O potencial de membrana é uma técnica utilizada para evidenciar as
despolarizações que ocorrem no sarcolema. Com a adição do PEG 400 (20 µM) e PEG 400
(100 µM pré tratada com d-Tc), foram evidenciadas diferenças significativas (p < 0,05),
quando comparadas ao potencial de membrana em repouso (controle). O PEG 400 (20 µM)
induziu um efeito despolarizante, de forma significativa. Quando usado o PEG 400
(100 µM), despolarização ocorreu a partir dos 15 minutos, mesmo na presença da d-Tc. Ou
Discussão 47
seja, o polietilenoglicol 400 apresenta um efeito despolarizante do sarcolema, mesmo
quando os receptores nicotínicos estão ocupados pelo curare, evidenciando uma ação na
fibra muscular.
5.7- Protocolo experimental com dantrolene
O dantrolene age diretamente sobre o músculo esquelético por interferir com a
liberação do Ca2+ do retículo sarcoplasmático; previne ou reduz o aumento da concentração
do Ca2+ citosólico que ativa o processo catabólico agudo associado com hipertermia
maligna (Britt et al., 1984; Langeron et al., 1999).
Em estudos anteriores utilizando a preparação NFD, o uso de dantrolene em
10 µM causou bloqueio neuromuscular de 70% (Oshima-Franco ET al.,2005). No presente
estudo, sob estimulação indireta, as preparações BC foram previamente tratadas com
dantrolene 30 µM, e observado um bloqueio de 50% em aproximadamente 30 minutos,
após esse período foi analisado o efeito da resposta contrátil com a adição do PEG 400
(20 µM). Curiosamente, foi observado o fenômeno de reversão do bloqueio neuromuscular
induzido pelo dantrolene.
Com estes achados, pode-se sugerir um mecanismo de ação pós-sináptico para a
ação do PEG 400 na junção neuromuscular, tendo uma possível relação com a ação do
cálcio sobre o mecanismo contrátil da fibra muscular.
5.8- Estudo da atividade bloqueadora (BC e NFD sob estímulo elétrico direto)
A ação do PEG 400 em preparações neuromusculares de camundongos e
pintainhos é concentração dependente como mostrado neste trabalho, e o PEG 400 (100
µM) causa bloqueio total em ambas as preparações. Estas respostas ou resultados obtidos
não foram suficientes para explicar exatamente os fenômenos de bloqueio neuromuscular
dessas preparações, mas sugerem uma possível saturação das soluções nutritivas e/ou uma
ação despolarizante persistente na presença do polietilenoglicol 400 (100 µM).
Discussão 48
5.9- Análise morfológica
A análise morfológica das preparações BC não apresentou alterações em suas
fibras musculares, quando tratadas com PEG 400 (3 µM, 20 µM e 100 µM) e comparadas
com o controle Krebs (p > 0,05). Ressalta-se que mesmo na concentração de (100 µM), que
apresentou bloqueio neuromuscular e ausência das respostas contraturantes à adição
exógena de ACh e KCl, não foram observadas alterações morfológicas.
Murakami et al. (2007) demonstraram, por meio de experimentos in vivo, que o
polietilenoglicol inibiu mais de 90% dos efeitos miotóxicos da bothropstoxina-I, que é a
principal miotoxina encontrada no veneno de Bothrops jararacussu. Esses dados
corroboram com a ausência dos danos morfológicos causados pelo PEG 400, uma vez que
foi usado para avaliar atividade antimiotóxica.
Discussão 49
6- CONCLUSÃO
50
• A ação pré-sináptica relatada na literatura (para PEG 8000) não foi
estatisticamente confirmada neste estudo, sugerindo que o tamanho
molecular do PEG 400 torne-o solúvel em membranas, mascarando
possíveis alterações na liberação quântica do neurotransmissor.
• O efeito facilitatório demonstrado pelo PEG 400 deve-se à liberação de íons
cálcio do retículo sarcoplasmático, mas não de inibição da enzima
acetilcolinesterase.
• Elevadas concentrações de PEG 400 causam despolarização persistente,
contratura e bloqueio neuromuscular completo, mas não mionecrose.
Conclusão
51
7- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Referências Bibliográficas
56
8- ANEXOS
57
Anexo 1
58
30‐Nov‐2008 Dear Prof. Oshima‐Franco, Your manuscript entitled "The influence of polyethylene glycol 400 (PEG) on the neuromuscular junction" has been successfully submitted online and is presently being given full consideration for publication in Muscle and Nerve. Your manuscript number is MUS‐08‐0645. Please mention this number in all future correspondence regarding this submission. You can view the status of your manuscript at any time by checking your Author Center after logging into http://mc.manuscriptcentral.com/mus . If you have difficulty using this site, please click the 'Get Help Now' link at the top right corner of the site. Thank you for submitting your manuscript to Muscle and Nerve. Yours sincerely, Muscle and Nerve Editorial Office No virus found in this incoming message. Checked by AVG ‐ http://www.avg.com Version: 8.0.176 / Virus Database: 270.9.11/1820 ‐ Release Date: 11/29/2008 6:52 PM
Anexo 2
59
Anexo 3
60
Anexo 3
61
Anexo 3
62
Anexo 3
63
Anexo 3
64
Anexo 3
65
Anexo 3
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Anexo 3
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Anexo 3
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Anexo 3
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Anexo 3
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Anexo 3
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Anexo 3
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Anexo 3
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Anexo 3
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Anexo 3
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Anexo 3
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Anexo 3
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Anexo 3
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Anexo 3
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Anexo 3
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Anexo 3
83
Anexo 3
84
Anexo 3
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Correção ortográfica e Edição
-2009-
86