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1
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
MARIA DANIELE AZEVEDO TEIXEIRA
EFEITO NEUROPROTETOR DA CATEQUINA E DO ESTRESSE DE IMOBILIZAÇÃO SUBCRÔNICO NA DOENÇA DE PARKINSON
EXPERIMENTAL
FORTALEZA
2011
2
MARIA DANIELE AZEVEDO TEIXEIRA
EFEITO NEUROPROTETOR DA CATEQUINA E DO ESTRESSE DE IMOBILIZAÇÃO SUBCRÔNICO NA DOENÇA DE PARKINSON EXPERIMENTAL
Tese submetida à Coordenação do Programa de Pós-Graduação em
Farmacologia, da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em
Farmacologia.
Orientadora: Profa. Dra. Geanne Matos de Andrade Cunha. Tese de Doutorado.
FORTALEZA
2011
3
MARIA DANIELE AZEVEDO TEIXEIRA
EFEITO NEUROPROTETOR DA CATEQUINA E DO ESTRESSE DE IMOBILIZAÇÃO SUBCRÔNICO NA DOENÇA DE PARKINSON EXPERIMENTAL
Tese submetida à Coordenação do Programa de Pós-Graduação em
Farmacologia, da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Farmacologia.
Aprovada em ___/___/______
BANCA EXAMINADORA
_______________________________________________ Profa. Dra. Geanne Matos de Andrade Cunha (Orientadora)
Universidade Federal do Ceará – UFC
____________________________________________________
Prof. Dr. Reinaldo Naoto Takahashi Universidade Federal de Santa Catarina – UFSC
_______________________________________________ Profª. Dra. Lisiane de Oliveira Porciúncula
Universidade Federal do Rio Grande do Sul – UFRGS
_______________________________________________
Profª Dra. Glauce Socorro de Barros Viana
Universidade Federal do Ceará – UFC
________________________________________________
Profª. Dra. Silvânia Maria Mendes de Vasconcelos Universidade Federal do Ceará - UFC
4
Dedicatórias
A Deus, que está sempre comigo, me guiando pelos bons caminhos;
À minha querida mãe, Maria de Lourdes (in memorian), a mulher mais forte que já conheci e a quem tudo devo, um exemplo de perseverança, luta, ternura e amor;
Ao meu querido pai, Eleazar, que é um exemplo de vida, força e integridade e foi
quem me levou aos caminhos do saber;
Ao meu querido noivo, Marcello, que com imenso amor e companheirismo, passou comigo por todos os momentos difíceis desta jornada, me incentivando sempre;
Á minha tia Socorro, que muito me apoiou e incentivou na conclusão deste
trabalho.
5
À Maria de Lourdes Azevedo Teixeira
Mãe... São três letras apenas
As desse nome bendito: Também o Céu tem três letras...
E nelas cabe o infinito.
Para louvar nossa mãe, Todo o bem que se disse
Nunca há de ser tão grande Como o bem que ela nos quer...
Palavra tão pequenina,
Bem sabem os lábios meus Que és do tamanho do Céu E apenas menor que Deus!
(Mário Quintana)
6
AGRADECIMENTOS
À minha querida orientadora, Profª. Dra. Geanne Matos de Andrade, agradeço
pela orientação valiosa, paciência, confiança, atenção, dedicação e amizade, bem
como, pelo incrível aprendizado e pela oportunidade que me foi concedida.
Aos professores do departamento de pós-graduação em farmacologia, em
especial à Profª. Dra. Glauce Socorro de Barros Viana, pelos ensinamentos e pelo
apoio na realização dos experimentos.
À colega e doutoranda Carolina Melo Souza, pelo incrível apoio na realização
dos experimentos e pela amizade sincera e companheirismo.
Aos meus colegas do Laboratório de Neurociências e Comportamento: Ailton,
Monique, Marta, Flávio, Ana Paula e Rosemary. Agradeço pela contribuição na parte
experimental e pela amizade que fica;
Aos bolsistas Jaquellyne, Dayse, Aline, Juliana, Analu e João. Obrigada pela
enorme contribuição e apoio na parte experimental desta tese.
Aos técnicos de laboratório, Rafael e Vilani, pela contribuição no trabalho e
amizade.
Aos meus colegas do Laboratório de Neurociências e Comportamento:
Carolina, Ailton, Monique, Marta, Flávio, Ana Paula e Rosemary. Agradeço pela
contribuição na parte experimental e pela amizade que fica.
Aos funcionários do departamento de Fisiologia e Farmacologia, em especial
à secretária da pós-graduação, Aura Rhanes.
À CAPES, pelo incentivo científico e suporte financeiro.
7
A todos que colaboraram para a execução deste trabalho de alguma forma,
muito obrigada!
8
“O que dá o verdadeiro sentido ao encontro é a busca e é preciso andar muito para alcançar o que está perto."
José Saramago
9
RESUMO
Efeito neuroprotetor da catequina e do estresse de imobilização subcrônico na
Doença de Parkinson experimental. Maria Daniele Azevedo Teixeira. Orientadora: Profa. Dra. Geanne Matos de Andrade Cunha. Tese de Doutorado. Programa de Pós-graduação em Farmacologia. Departamento de Fisiologia e
Farmacologia, UFC, 2011.
A Doença de Parkinson (DP) é uma desordem neurodegenerativa
caracterizada pela perda de neurônios dopaminérgicos na substancia nigra (SN).
Estudos epidemiológicos sugerem uma associação entre estresse, depressão e DP.
Agentes antioxidantes tem sido relatados como capazes de mudar o curso da
doença, bloqueando a neurodegeneração dopaminérgica. Com a finalidade de
estudar os efeitos neuroprotetores da catequina, um flavonóide encontrado na
Camelia sinensis, o presente trabalho avaliou os efeitos deste composto no
comportamento motor, memória, avaliação imunohistoquímica e bioquímica em um
modelo de DP induzido em ratos pela 6-OHDA. Em uma outra etapa do trabalho
também avaliou-se os efeitos da associação do estresse com a DP sobre estes
mesmos parâmetros, usando um modelo animal de estresse de imobilização
subcrônico (11d/6hrs). Os animais (ratos Wistar machos, 200-250g) foram tratados
com catequina (10 e 30 mg/kg i.p.) diariamente por 16 dias, iniciando-se na ocasião
da lesão estriatal pela 6-OHDA (21µg/ 3µL). Os resultados obtidos demonstram que
a 6-OHDA aumentou o número de rotações contralaterais à lesão induzida por
apomorfina e a catequina nas duas doses foi capaz de reverter esse dano motor.
Houve uma recuperação da atividade exploratória e memória de trabalho promovido
pela catequina nas doses testadas. A 6-OHDA diminuiu a imunorreatividade para
tirosina hidroxilase (TH) e transportador de dopamina (DAT) no corpo estriado e
mesencéfalo, além de promover uma diminuição nos níveis de GSH. A catequina nas
duas doses em animais lesionados pela 6-OHDA foi capaz de recuperar a
imunorreatividade para TH e DAT, além de aumentar significativamente os níveis de
GSH em relação aos animais lesionados pela 6-OHDA. A 6-OHDA promoveu a morte
neuronal demonstrada pela diminuição nos níveis de catecolaminas, a catequina,
por sua vez, foi capaz de reverter esses níveis. O estresse de imobilização
subcrônico não reverteu o número de rotações contralaterais induzidas pela
apomorfina, nem melhorou a memória de trabalho dos danos pela 6-OHDA, mas foi
capaz de melhorar a atividade locomotora e a memória aversiva. O estresse
10
subcrônico levou os animais a um estado depressivo no teste de nado forçado, o
que não foi observado em animais que sofreram apenas a lesão estriatal. Houve
uma diminuição no ganho de peso nos animais submetidos ao estresse. Além disso,
houve uma aumento discreto da imunorreatividade para a TH e DAT em animais
submetidos ao estresse e lesão pela 6-OHDA. Em relação às catecolaminas, houve
uma reversão parcial nos níveis de noradrenalina e serotonina pelo efeito do
estresse. Os resultados do presente trabalho demonstram que tanto a catequina,
quanto estresse de imobilização foram neuroprotetores neste modelo experimental
da DP. A catequina na dose de 30mg demonstrou um efeito pró-oxidante. O estresse
de imobilização parece ter exercido um condicionamento fisiológico nos animais,
protegendo, de certa maneira, dos efeitos tóxicos da 6-OHDA.
Palavras-chave: Doença de Parkinson experimental, 6-OHDA, catequina, estresse
de imobilização, neuroproteção.
11
ABSTRACT
Neuroprotector effect of catechin and restraint stress in experimental
Parkinson’s Disease. MARIA DANIELE AZEVEDO TEIXEIRA. Supervisor: Prof. Dr. Geanne Matos de Andrade Cunha. Doctorate’s Thesis. Post-graduation program in Pharmacology. Department of Physiology and Pharmacology, UFC,
2011.
Parkinson’s disease (PD) is a neurodegenerative disorder reported since antiquity and characterized for neuronal dopaminergic loss mainly in the substantia nigra (SN). Epidemiological studies suggest association between depression and PD
and stress has been implicated in causing depression. The currently available therapies can not prevent the progression of PD, but are able to contain the
symptoms. Neuroprotective agents have been reported as able to change the course of the disease, stopping dopaminergic neurodegeneration. Many of these agents are derived from plants with antioxidant actions, as catechin, a flavonoid found in green
tea. In order to study the neuroprotective effects of catechin, the present study evaluated the effects of this compound on motor behavior, memory,
Immunohistochemistry, biochemical evaluation and determination of catecholamines in an animal model of PD by 6-OHDA. Another stage of the study also evaluated the effects of stress associated with PD on the same parameters, in an animal model of
subchronic restraint stress (11d/6hrs). Animals (male Wistar rats, 200-250g) were treated with catechin (10 and 30mg/kg ip) daily for 16 days, starting at the time of
injury by striatal 6-OHDA. Results show that 6-OHDA increased the number of rotations contralateral to the lesion induced by apomorphine and catechin in the two doses was able to reverse the 6-OHDA damage. There was a recovery of exploratory
activity and working memory promoted by catechin in both doses. Catechin in a dose of 30mg worsened the aversive memory. 6-OHDA decreased the immunoreactivity
for tyrosine hydroxylase (TH) and dopamine transporter (DAT) in striatum and midbrain, and promote a decrease in GSH levels. Catechin in two doses in animals injured by 6-OHDA was able to increase the immunoreactivity for TH and DAT,
significantly increasing the levels of GSH compared to lesioned animals by 6-OHDA. 6-OHDA caused neuronal death demonstrated by decreasing levels of
catecholamines, catechin, in turn, was able to reverse these levels. The subchronic restraint stress did not reverse the number of contralateral rotations induced by apomorphine, neither improved the working memory of the damage by 6 -OHDA, but
was able to increase the number of crossings and improve the aversive memory. Stressed subchronic animals led to an increase in immobilization time in the forced
swimming test, which was not observed in animals that were only striatal injury. There was a decrease in weight gain in animals subjected to stress. There was a slight increase of immunoreactivity for TH and DAT in animals subjected to stress and
injury by 6-OHDA. In relation to catecholamines, there was a partial reversal in the levels of noradrenaline and serotonin by the effect of stress. Results of this study
demonstrate that both catechin and immobilization stress were neuroprotective in this experimental model of PD. The catechin in a dose of 30mg was both oxidant and pro-oxidant. Restraint stress appears to have exerted a priming in animals, protecting, in
a way, the toxic effects of 6-OHDA.
Keywords: Parkinson's experimental disease, 6-OHDA, catechin, immobilization stress, neuroprotection.
12
LISTA DE FIGURAS
1 Mudanças relacionadas a DP na atividade global do circuito
motor talamocortical nos gânglios da base ................................. 33
2 Estruturas de alguns dos flavonóides presentes no chá verde .. 49
3 Protocolo Experimental 1 ............................................................ 63
4 Protocolo experimental 2 ............................................................. 65
5 Arena do teste de campo aberto dividido em quatro quadrantes
iguais ........................................................................................... 68
6 Labirinto em Y............................................................................... 69
7 Representação da perda parcial de receptores de neurônios
dopaminérgicos nigroestratais ...................................................... 72
8 Efeito da catequina sobre a atividade exploratória de ratos
parkinsonianos ............................................................................... 84
9 Efeito da catequina no comportamento rotacional induzido por
apomorfina em ratos lesionados pela 6-OHDA …………………... 86
10 Efeito da catequina (10 e 30mg) na memória operacional de
ratos no teste do labirinto em Y ………………............................... 87
11 Efeito da catequina (10 e 30mg/kg) na memória aversiva
animais lesionados com a 6-OHDA após 15 dias ......................... 89
12 Fotomicrografias representativas neurônios imunorreativos para
tirosina-hidroxilase no mesencéfalo em ratos submetidos à lesão
estriatal ....................................................................................... 90
13 Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos a
tirosina-hidroxilase no corpo estriado em ratos submetidos à
lesão estriatal ................................................................................. 91
14 Fotomicrografias representativas das respectivas secções de
neurônios imunorreativos ao transportador de dopamina (DAT)
no mesencéfalo de ratos submetidos à lesão estriatal .................. 92
13
15 Fotomicrografias representativas das respectivas secções de
neurônios imunorreativos ao transportador de dopamina (DAT)
na corpo estriado de ratos submetidos à lesão estriatal ............... 93
16 Determinação da dosagem de nitrito em mesencéfalo de ratos
tratado com catequina (10 e 30mg) ............................................... 95
17 Determinação da dosagem de nitrito em corpo estriado (CE)
direito e esquerdo de ratos tratado com catequina (10 e 30mg) ... 95
18 Determinação da peroxidação lipídica em mesencéfalo de
ratos submetidos a lesão estriatal ................................ ................. 96
19 Determinação da atividade da SOD em mesencéfalo de ratos
submetidos à lesão estriatal .......................................................... 97
20 Determinação da atividade da GSH em mesencéfalo de ratos
submetidos à lesão estriatal ......................................................... 98
21 Avaliação do ganho de peso em animais submetidos a estresse
de imobilização subcrônico (11d/6h) e lesão estriatal com a 6-
OHDA ........................................................................................... 101
22 Avaliação do peso ponderal durante 11 dias em animais
submetidos ao estresse de imobilização subcrônico (11dias/6h) e
lesão estriatal com a 6-OHDA ....................................................... 102
23 Efeito do estresse de imobilização na na atividade exploratória
em submetidos à lesão estriatal com 6-OHDA e estresse de
imobilização subcrônico (11dias/6h) ............................................. 104
24 Efeito do estresse de imobilização subcrônico no comportamento
rotacional induzido por apomorfina em ratos lesionados pela 6-
OHDA ………………………………………….................................. 106
25 Efeito da 6-OHDA e estresse de imobilização (11dias/6h) na
memória operacional de ratos no teste do labirinto em Y ……...… 107
26 Efeito do estresse de imobilização subcrônico na memória
aversiva de animais submetidos a lesão estriatal pela 6 -OHDA ... 109
27 Teste do nado forçado nos animais que sofreram lesão estriatal
submetidos a estresse de imobilização subcrônico (11dias/6h) .... 111
14
28 Fotomicrografia representativas de neurônios imunorreativos
para tirosina-hidroxilase no mesencéfalo de ratos submetidos a
lesão estriatal e estresse de imobilização ..................................... 113
29 Fotomicrografia representativa de neurônios imunorreativos para
tirosina-hidroxilase no corpo estriado de ratos submetidos a
lesão estriatal e estresse de imobilização ......................... ............ 114
30 Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos
para o transportador de dopamina (DAT) no mesencéfalo ............ 115
31 Determinação da dosagem de nitrito em mesencéfalo de ratos
submetidos a estresse de imobilização subcrônico (11dias/6h) .... 116
32 Determinação da dosagem de nitrito em corpo estriado de ratos
submetidos a estresse de imobilização subcrônico (11dias/6h) .... 117
33 Avaliação da atividade da superóxido dismutase (SOD) em
tecido mesencefálico de ratos submetidos a estresse de
imobilização subcrônico e lesão estriatal pela 6-OHDA ................ 118
34 Determinação dos níveis de substâncias reativas ao ácido
tiobarbitúrico (TBARS) em mesencéfalo de ratos submetidos à
lesão estriatal que sofreram estresse de imobilização subcrônico 119
35 Determinação dos níveis de TBARS em corpo estriado de ratos
submetidos à lesão estriatal que sofreram estresse de
imobilização subcrônico ................................................................ 120
36 Determinação da atividade da GSH em mesencéfalo de animais
que sofreram lesão estriatal e estresse de imobilização
subcrônico ..................................................................................... 122
37 Determinação da atividade da GSH em corpo estriado de
animais submetidos à lesão estriatal e estresse de imobilização . 122
38 Determinação dos níveis de glicose em ratos submetidos a
estresse de imobilização e lesão estriatal pela 6-OHDA ............... 123
15
LISTA DE TABELAS 1 Tratamento com catequina ........................................................... 62
2 Estresse de imobilização .............................................................. 64
3 Sítios das lesões estriatais unilaterais com a 6-OHDA ................. 67
4 Efeito da catequina na concentração de monoaminas em tecido
mesencefálico de ratos submetidos à lesão estriatal pela 6-
OHDA .......................................................................................... 100
5 Efeito do estresse de imobilização subcrônico na concentração
de monoaminas em tecido mesencefálico de ratos submetidos
à lesão estriatal .......................................................................... 125
16
LISTA DE ABREVIATURAS
6-OHDA - 6-hidroxidopamina
ACM - Área cingulato-motora
ANOVA - Análise de variância
ATP - Adenosina tri-fosfato
AVC - Acidente Vascular Cerebral
5-HT - Serotonina
5-HT1A - Receptor de serotonina 1A
5-HT2A - Receptor de serotonina 2A
BDNF - Fator neurotrófico derivado do cérebro
C - Catequina
CL - Corpos de Lewy
CM - Núcleo do tálamo centromediano
CoQ10 - Coenzima Q10
COMT - enzima catecol O-metiltransferase
ELA - Esclerose amiotrófica lateral
D1 - Receptor de dopamina do tipo 1
D2 - Receptor de dopamina do tipo 2
DA - Dopamina
DAT - Transportador de dopamina
Dir - Via direta
DNA - Ácido desoxirribonucléico
DOPAC - Ácido dihidroxifenilacético
DP - Doença de Parkinson
EGC - Epicatequina galato
EGCG - Epigalocatequina
EPM - Erro padrão da média
ERK - Quinase reguladora de sinais extracelulares
EROs - Espécies reativas do oxigênio
FO - Falso-operado
GABA - Àcido γ-amino butírico
GC - Galocatequina
17
GPe - Globo pálido externo
GPi - Globo pálido interno
GSH - Glutationa reduzida
H2O2 - Radical superóxido
HPA - Eixo hipotalâmico-pituitário-adrenal
HPLC - Cromatografia líquida de alta performance
HVA - Ácido homovalínico
IL – 1β - Interleucina 1 beta
IF-γ - Interferon-gama
Indir - Via indireta
i.p. - Intra-peritoneal
LCR - líquido céfalo-raquidiano
L-Dopa - L-3,4- dihidroxifenilanina
M1 - Córtex motor primário
MAO - Monoamina oxidase
MAS - Área motora suplementar
Min - minuto
MnSOD - manganês superóxido dismutase
NA - Noradrenalina
NMDA - N-metil-D-aspartato
MPP+ - 1-metil- 4- fenilpiridina
MPTP - 1-metil- 4- fenil-1,2,3,6 – tetraidropiridina
NF- ΚB - Fator de transcrição NF-KB
NO - Óxido nítrico
•OH - Radical hidroxila
Pf - Núcleo do tálamo parafascicular
PKC - Proteína quinase C
PMC - Córtex pré-motor;
PPN - Núcleo pedúnculo-pontino
RNAm - Ácido Ribonucléico mensageiro
SNC - Sistema Nervoso Central
SNc - Substância negra pars compacta
SNpr - Substância negra pars reticulata
SOD - Superóxido dismutase
18
NST - Núcleo subtalâmico
TBA - Ácido tiobarbitúrico
TH - Tirosina hidroxilase
THA - Treo-hidroxiaspartato
TBARs - Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
TNF - Fator de necrose tumoral
VA - Núcleo do tálamo ventral anterior
VL - Núcleo do tálamo ventrolateral
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SUMÁRIO
I INTRODUÇÃO...................................................................................................... 23
1 Histórico............................................................................................................... 23
2 Epidemiologia........................................................................... ............................ 24
3 Fatores Ambientais............................................................................................... 25
4 Fatores Genéticos.............................................................................................. .. 27
5 Outros fatores predisponentes à doença.............................................................. 29
6 Fisiopatologia......................................................................................................... 30
6.1 Depleção de glutationa...................................................................................... 35
6.2 Disfunção mitocondrial...................................................................................... 36
7 Modelos da Doença............................................................................................. 38
8 Tratamento farmacológico da Doença de Parkinson................ ............................ 41
9 Antioxidantes na Doença de Parkinson................................. ............................... 44
9.1 Catequinas da Camellia sinensis ..................................................................... 47
10 Depressão na Doença de Parkinson.................................................................. 50
11 Estresse e Depressão......................................................................................... 51
12 Estresse e Memória............................................................................................. 54
II RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA......................................................................... 57
III OBJETIVOS......................................................................................................... 59
IV MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................... 61
1. ANIMAIS.............................................................................................................. 63
2.DROGAS............................................................................................................... 63
3.PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS....................................................................... 63
3.1 PROTOCOLO 1 – Ratos tratados com catequina.............................................. 64
3.2 PROTOCOLO 2 – Ratos tratados com catequina e submetidos a estresse de
imobilização subcrônico.......................................................................................... 66
3.3 Cirurgia Estereotáxica......................................................................................... 68
3.4 Estresse de Imobilização.................................................................................... 69
3.5 Testes Comportamentais..................................................................................... 69
3.5.1 Avaliação da atividade locomotora (teste do Campo Aberto).......................... 70
3.5.2 Labirinto em Y (Y-maze).................................................................................. 71
3.5.3 Esquiva passiva (Passive avoidance test)....................................................... 72
3.5.4 Nado Forçado.................................................................................................. 72
20
3.5.5 Teste Rotacional.............................................................................................. 73
4. Avaliação imunohistopatológica........................................................................... 75
4.1 Imunohistoquímica para Tirosina Hidroxilase..................................................... 75
4.2 Imunohistoquímica para DAT.............................................................................. 76
5. Análises Bioquímicas............................................................... ............................. 76
5.1 Dosagem de Nitrito................................................................ ............................. 76
5.1.1 Método................................................................................ ............................. 76
5.1.2 Reagentes........................................................................................................ 76
5.1.3 Preparação do Reagente de Griess................................................................. 77
5.1.3 Curva Padrão................................................................................................... 77
5.1.4 Protocolo.......................................................................................................... 77
5.2 Dosagem da enzima superóxido dismutase – SOD............................................ 78
5.3 Determinação da Peroxidação Lipídica – TBARS............................................... 78
5.4 Dosagem de GSH............................................................................................... 79
5.5 Dosagem de Glicose........................................................................................... 81
5.6 Determinação de monoaminas e metabólitos com HPLC.............................. ..... 82
6. Análise Estatística ................................................................................................ 84
V RESULTADOS ...................................................................................................... 83
1. Efeito da Catequina nas doses de 10 e 30mg sobre a lesão estriatal com 6-
OHDA em ratos ....................................................................................................... 83
1.1 Determinação da atividade locomotora através do teste do campo aberto em
ratos com lesão estriatal tratados com catequina ................................................... 83
1.2 Determinação do comportamento rotacional induzido por apomorfina em
ratos com lesão estriatal pela 6-OHDA, tratados com catequina nas doses de 10
e 30mg/kg ............................................................................................................... 85
1.3. Determinação da memória operacional através do teste do labirinto em Y (Y-
maze) em ratos com lesão estriatal tratados com catequina ................................. 87
1.4 Avaliação da memória recente e tardia em ratos com lesão estriatal pela 6-
OHDA, tratados com catequina nas doses de 10 e 30mg/kg ................................. 88
1.5 Efeito da catequina sobre a imunorreatividade para tirosina hidroxilase no
corpo estriado e mesencéfalo de ratos submetidos à lesão estriatal com a 6-
OHDA ................................................................................................................. ..... 90
1.6 Efeito da catequina sobre a imunorreatividade para o DAT no corpo estriado
21
e mesencéfalo de ratos submetidos à lesão estriatal com a 6-OHDA .................... 92
1.7 Efeito da catequina sobre a dosagem de Nitrito no corpo estriado e
mesencéfalo de ratos submetidos à lesão estriatal com a 6-OHDA ....................... 94
1.8 Determinação da peroxidação lipídica no mesencéfalo de ratos submetidos à
lesão estriatal com a 6-OHDA, tratados com catequina nas doses de 10 e
30mg/kg .................................................................................................................. 96
1.9 Efeito da catequina nas doses de 10 e 30 mg/Kg sobre a atividade da SOD
(superóxido dismutase) em ratos submetidos a lesão estriatal com a 6-OHDA .... 97
1.10 Efeito da catequina sobre a glutationa reduzida (GSH) no mesencéfalo de
ratos submetidos à lesão estriatal com a 6-OHDA ................................................ 98
1.11. Determinação das concentrações de Dopamina(DA) e seus metabólitos
(DOPAC e HVA), Noradrenalina (NA) e Serotonina (5-HT) no mesencéfalo de
ratos submetidos à lesão estriatal com a 6-OHDA e tratados com catequina nas
doses de 10 e 30mg/kg ............................................................................... ............ 99
2.Efeito do Estresse de Imobilização subcrônico sobre a lesão estriatal com a 6-
OHDA em ratos........................................................................................................ 101
2.1 Avaliação do ganho de peso e peso ponderal .................................................. 101
2.2 Determinação da atividade locomotora através do teste do campo aberto em
ratos com lesão estriatal submetidos ao estresse de imobilização ........................ 103
2.3 Determinação do comportamento rotacional induzido por apomorfina em
ratos com lesão estriatal pela 6-OHDA, submetidos ao estresse de imobilização
subcrônico ............................................................................................................... 105
2.4 Determinação da memória operacional através do teste do labirinto em Y (Y-
maze) em ratos com lesão estriatal submetidos ao estresse de imobilização ....... 107
2.5 Avaliação da memória recente e tardia em ratos com lesão estriatal pela 6-
OHDA, submetidos ao estresse de imobilização subcrônico .................................. 108
2.6 Avaliação do estado depressivo dos animais que sofreram lesão estriatal e
submetidos a estresse de imobilização subcrônico no teste nado forçado............ 110
2.7 Efeito do estresse de imobilização subcrônico sobre a imunorreatividade
para a tirosina hidroxilase no corpo estriado e mesencéfalo de ratos submetidos
à lesão estriatal com a 6-OHDA .............................................................................. 112
2.8 Efeito do estresse de imobilização subcrônico sobre a imunorreatividade
para o Transportador de Dopamina (DAT) no mesencéfalo de ratos submetidos à
lesão estriatal com a 6-OHDA ................................................................................. 115
22
2.9 Determinação da concentração de Nitrito em ratos submetidos a estresse de
imobilização subcrônico que sofreram lesão estriatal com a 6OHDA ..................... 116
2.10 Efeito do estresse de imobilização subcrônico sobre a dosagem da
Superóxido Dismutase (SOD) no corpo estriado e mesencéfalo de ratos
submetidos à lesão estriatal com a 6-OHDA .......................................................... 118
2.11 Determinação dos efeitos do estresse de imobilização subcrônico sobre a
peroxidação lipídica em de ratos submetidos à lesão estriatal com a 6-OHDA ..... 119
2.12 Efeito do estresse de imobilização subcrônico sobre a Glutationa reduzida
(GSH) em ratos submetidos à lesão estriatal com a 6-OHDA no mesencéfalo e
corpo estriado ......................................................................................................... 121
2.13 Determinação da Glicose em ratos submetidos a estresse de imobilização
subcrônico (11 dias/6h) e lesão estriatal pela 6-OHDA ...................................... 123
2.14 Determinação das concentrações de Dopamina(DA) e seus metabólitos
(DOPAC e HVA), Noradrenalina (NA) e Serotonina (5-HT) no corpo estriado e
mesencéfalo de ratos submetidos ao estresse de imobilização subcrônico (11
dias/6h) e que sofreram lesão estriatal com a 6-OHDA .......................................... 124
VI DISCUSSÃO....................................................................................................... 126
1. Efeito da Catequina nas doses se 10 e 30mg sobre a lesão estriatal com 6-
OHDA ...................................................................................................................... 127
2. Efeito do Estresse de Imobilização subcrônico sobre a lesão estriatal com 6-
OHDA ..................................................................................................................... 140
VII CONCLUSÃO ................................................................................................... 153
REFERÊNCIAS ..................................................................................................... 154
23
I-INTRODUÇÃO
HISTÓRICO
A doença de Parkinson foi inicialmente descrita em um contexto médico por
James Parkinson, um clínico geral de Londres, em 1817. Entretanto, a doença já era
conhecida e parcialmente descrita desde os tempos da bíblia.
Existem pelo menos duas referências sobre tremor na bíblia, uma se
encontra no livro de Jó (34:19) (GARCIA RUIZ, 2004). Além disso, encontraram-se
outras referências que se pode atribuir à identificação da Doença de Parkinson por
várias civilizações antigas. Na Índia, 1000 aC, foi publicado o tratado médico
Ayurveda (do sânscrito:ciência, ayur:vida). Se faz referência a uma doença que era
designada por Kampavata, cujos sintomas eram coincidentes com os da Doença de
Parkinson. Curiosamente, para tratar a Kampavata, eles usavam um legume tropical
(Mucuna pruriens) que conheciam pelo nome de Atmagupta. As sementes deste
legume são um fonte natural de elevadas quantidades de L -Dopa.(NAGASHAYANA
et al.,2000).
Galênico, na Grécia antiga, era o mais influente médico da antiguidade e em
seus escritos estão várias referências às alterações posturais e ao tremor: “um tipo
de paralisia que impede as pessoas de andarem corretamente, misturando os lados
e trocando a direita com a esquerda, abstendo-se de levantar o pé e puxando-o para
trás, ao invés disso, como se aproximasse de um acentuado aclive”. (STERN, 1989).
A DP já era bem conhecida em 425 A.C. na China. As primeiras descrições da
doença se encontram no livro Ru Men Shi Qin escrito por Zhang durante o período
da dinastia Jin. Wang Kentang (Dinastia Ming, AD1549-1613) compilou um livro de
44 volumes onde através da medicina tradicional chinesa relatava o uso de
24
tratamentos como a pílula antitremor à base de ervas e escorpião (ZHANG et
al.,2006).
Desde 1861 até 1868 Jean-Marie Charcot, considerado o fundador da
primeira escola neurológica do mundo e o "pai da neurologia", expandiu os
conhecimentos sobre os sintomas e subsequentemente avançou para a designação
de síndrome da Doença de Parkinson. Sua contribuição foi tão brilhante, que seria
justo que seu nome fosse acrescentado ao de Parkinson na nomeação da doença,
mas foi o próprio Charcot quem sugeriu a mudança do nome "paralisia agitante' para
“doença de Parkinson" (“la maladie de Parkinson”) (MENEZES, 2003 & TEIVE,
1998). As alterações bioquímicas no cérebro foram identificadas nos anos 50 do
século XX, muito devido ao trabalho do cientista sueco Arvid Carlsson, que começou
a testar o uso de L-Dopa em modelos animais. A L-Dopa foi introduzida na prática
clínica em 1967.
EPIDEMIOLOGIA
A Doença de Parkinson (DP) é a segunda desordem neurodegenerativa
progressiva mais comum(depois da Doença de Alzheimer) causada pela perda de
neurônios dopaminérgicos principalmente na substancia nigra. A incidência e a
prevalência da DP estão crescendo com o envelhecimento da população. O número
de casos nos Estados Unidos foi estimado de 340000 em 2005 e é previsto subir
para 610.000 em no ano de 2030 ( DORSEY et al., 2007).
Segundo a Associação Européia de Doença de Parkinson (European
Parkinson Disease Association), a estimativa de DP é de 6,3 milhões de pessoas
no mundo. A idade do aparecimento é comumente após os 60 anos de idade, mas
um entre dez indivíduos é afetado antes dos 50 anos. De acordo com as estatísticas,
1,2 milhões de pessoas na Europa tem DP: aproximadamente 260.000 na
Alemanha, 200.000 na Itália, 150.000 na Espanha, 120.000 no Reino Unido e
25
117.000 na França. No Brasil, a DP já ultrapassa 200.000 casos (Associação Brasil
Parkinson). Estudos recentes acerca da incidência da doença, apontam que ela
atinge mais indivíduos brancos que negros que habitam grandes cidades nos
Estados Unidos (WILLIS et al., 2010). Na Ásia, a doença parece ser menos
prevalente que em países do ocidente (MUANGPAISAN et al., 2009).
Existe uma maior incidência da doença em homens que em
mulheres (BALDERESCHI et al., 2000). Alguns autores sugerem que a prevalência
da DP em homens é quase duas vezes maior que em mulheres. Além disso, a idade
de aparecimento da doença tende a ser mais tardia em mulheres comparada com a
idade dos homens (ELBAZ et al., 2002; DE LAU et al., 2004; SHULMAN et al., 2007
& PAVON et al., 2010). A maior prevalência da doença em homens levou vários
pesquisadores a questionar se o estrógeno teria um papel neuroprotetor na DP. A
deficiência de estrógeno na menopausa parece agravar os sintomas da doença,
enquanto mulheres que usam estradiol apresentam sintomas (SANDIK, 1989).
Vários estudos sugerem um efeito benéfico do estrógeno na DP (ROCCA et al.,
2007; VEGETO et al., 2009).
ETIOLOGIA
FATORES AMBIENTAIS
Estudos epidemiológicos indicam que a exposição a um certo número de
fatores pode aumentar o risco do desenvolvimento da DP. Alguns dos fatores são
relacionados ao uso de pesticidas e herbicidas, substâncias químicas, exposição a
metais, raspa de madeira e a vida rural. Mesmo tendo os estudos epidemiológicos
apontado para um papel significante dos pesticidas na DP, somente determinados
tipos de pesticidas têm tido sua função biológica investigada em relação à doença.
Assim, pouca evidência biológica está disponível para afirmar que a exposição a
pesticidas seria a causa da doença (HANCOCK et al., 2008 & SAWLE, 1999).
26
A maior evidência para que haja um fator ambiental na DP é relacionado a
toxina 1,2,3,6-methyl-phenyl-tetrahydropyridine (MPTP). A pesquisa do MPTP se
iniciou quando em 1982, jovens da California se contaminaram ao injetarem uma
heroína sintética contaminada com a toxina, eles desenvolveram uma síndrome
muito parecida com a doença, tanto clinicamente quanto patologicamente (KIDD,
2000). Este composto é um bioproduto da manufatura ilícita de um derivado sintético
da meperidina (OLANOW & TATTON,1999). A descoberta do MPTP como toxina
dopaminérgica levou a um subsequente desenvolvimento de modelos da doença
baseados nesta toxina em macacos e camundongos (BÜELER, 2009).
Uma associação positiva entre a exposição ocupacional ao paraquat
(pesticida agrícola) e o desenvolvimento da doença foi encontrada em alguns
estudos epidemiológicos (SEMCHUK et al., 1992; LIOU et al., 1997; HERTZMAN et
al., 1990). Entretanto outros estudos falharam nesta associação (FIRESTONE et al.,
2005; KAMEL et al., 2007). Bertabet (2002) relata que a exposição experimental de
roedores a herbicidas e pesticidas sustenta ainda mais o envolvimento de toxinas
ambientais na doença de Parkinson.
A dieldrina é um pesticida organoclorado que não é mais produzido, nem
utilizado nos Estados Unidos, mas traços desta substância foram encontrados na
substancia nigra (SN) de pacientes com DP (CORRIGAN et al., 2000). Em estudos in
vitro, dieldrina misturada a uma preparação da proteína neuronal α -sinucleína,
acelera o desenvolvimento de agregados de proteína similares àqueles encontrados
no corpos de Lewy. Rotenona e Paraquat tem o mesmo efeito (UVERSKY et al.,
2001). Um estudo recente demonstrou que a exposição subcrônica à dieldrina altera
a abundância de RNA mensageiro (RNAm) e proteínas no hipotálamo que estão
associadas ao metabolismo, estabilidade e integridade celular, bem como ao
estresse e reparo do DNA (MARTYNIUK et al., 2010). Existe uma corrente científica
que acredita que a combinação de fatores ambientais e genéticos podem contribuir
para o aparecimento da doença, havendo um sinergismo (THIRUCHELVAM, 2000).
27
Dois estudos adicionaram à literatura mais uma ligação de fatores ambientais
à DP. A primeira investigou a associação entre o consumo de cafeína e a doença
(atuando de forma protetora): Ross et al.(2000) utilizando informações de 8004
homens americanos- japoneses, verificaram que o risco para a DP era 2,2 vezes
maior para não consumidores de café. O risco decaiu com altas quantidades de
cafeína consumida e foi cinco vezes mais alto para aqueles que não ingeriam café.
Este estudo sugere claramente uma relação entre o consumo de cafeína e o risco de
DP, mas não se distingue ainda se esse efeito é neuroprotetor ou se o alto consumo
de café protege da doença por outras razões. Um segundo estudo descreveu um
modelo animal para a doença produzido pela exposição por longo período ao
pesticida rotenona (SIDEROWF and STERN, 2003). A rotenona é um inibidor do
complexo I mitocondrial bem caracterizado e mais conhecida por seu uso como
pesticida. Betarbet e colegas (2003) estudaram o efeito da rotenona em ratos, tendo
observado que a toxina promoveu o aparecimento de sintomas característicos, bem
como achados histopatológicos da DP como inclusões citoplasmáticas similares aos
corpos de Lewis. Este estudo demonstrou que a rotenona constitiu um modelo
animal de estudo da DP e que exposições ambientais a toxinas, especialmente as
que tem ação como inibidoras mitocondriais, podem contribuir para o
desenvolvimento da doença à longo prazo.
Um trabalho recente relata que muitos pesticidas usados comercialmente
inibem diretamente o complexo I mitocondrial causando dano oxidativo e toxicidade
a células de neoblastoma SK-N-MC, sugerindo que a inibição do complexo I pode
ser um mecanismo comum dos pesticidas que promovem toxicidade dopaminérgica
(SHERER et al., 2007).
FATORES GENÉTICOS
Somente uma pequena proporção de casos pode ser atribuída a fatores
puramente genéticos. Altos níveis de deleção genética de DNA mitocondrial tem sido
28
apontados como importante no processo de perda neuronal seletiva na SN durante o
envelhecimento e DP.
Existe um grande interesse na descoberta do papel dos fatores genéticos na
etiologia da doença (GOLBE, 1990). A hipótese genética ganhou importância com a
identificação da forte evidência para um único gene responsável por causar o
parkinsionismo em pacientes de uma mesma família situados entre a Itália e os
Estados Unidos (SAWLE, 1999). Aproximadamente 5-10% dos pacientes tem uma
forma familiar de parkinsonismo com um padrão autossômico-dominante de herança
genética. Entretanto fatores genéticos parecem ser mais importantes em pacientes
mais jovens, mas não têm importância em pacientes com doença de Parkinson
esporádica (OLANOW & TATTON,1999). A forma de doença de Parkinson
precoce(antes de 50 anos) parece estar ligada a um forte fator de hereditariedade
(pelos menos em homens brancos, o único grupo estudado) (Kidd,2000).
A forma esporádica da doença ocorre na maioria dos casos. A forma familiar
(que compreende menos de 10% dos diagnósticos) apresenta fatores de risco
genéticos específicos que incrementam as possibilidades do desenvolvimento da
doença. Foram identificados 12 locus cromossômicos ligados à forma familiar da DP
(MIZUNO et al., 2008). Mutações em três genes: α-sinucleína, parkina e DJ-1, estão
claramente relacionadas ao aparecimento precoce da doença, enquanto mutações na
UCH-L1 (uma ubiquinação da hidrolase do terminal carboxílico) também estão
implicadas no processo (ERIKSEN, 2003).
A α-sinucleína é uma proteína predominantemente neuronal com 140
aminoácidos. Foram identificados dois pontos de mutação do seu gene cognato em
algumas famílias com DP, entretanto ao que parece, as mutações da α-sinucleína
representam uma causa rara da doença (MOURADIAN, 2002). Mutações na α -
sinucleína que causam a forma hereditária da DP (A30P e A53T) aceleram a
oligomerização da α-sinucleína para dentro de estruturas intemediárias de fibrilização,
chamadas de protofibrilas, estas são hipoteticamente responsáveis pela morte
29
neuronal na DP (CONWAY et al, 2000). Lucking e colaboradores (2000) examinaram
73 famílias com doença de Parkinson de aparecimento precoce e concluiram que
havia mutações no gene parkina em 49% destas famílias, além de um grande número
de diferentes mutações (SIDEROWF & STERN, 2003).
Alguns indivíduos com a doença apresentam um comprometimento na função
hepática. A enzima P450IID6, que se caracteriza pela capacidade de metabolizar a
debrisoquina, foi encontrada mais disfuncional em pacientes de Parkinson que em
pessoas normais. Os pacientes que desenvolveram a doença mais precocemente
(antes dos 40 anos) eram os mais suscetíveis à disfunção. É interessante observar
que a P450IID6 está presente no sistema nigroestriatal e o MPTP é um substrato
deste complexo (KIDD, 2000).
OUTROS FATORES PREDISPONENTES À DOENÇA:
A prevalência da DP aumenta após a idade de 50 anos, havendo um
incremento maior entre 65 a 90 anos. Um declínio geral na função fisiológica ocorre
naturalmente com o envelhecimento. O radical superóxido, H2O2, e radicais hidroxila
(os mesmos oxidantes produzidos pela radiação) e possivelmente o oxigênio singlet
são produzidos continuamente a altas taxas como produto do metabolismo aeróbico.
Eles danificam macromoléculas celulares incluindo DNA(FRAGA et al.,1990),
proteinas (STADTMAN,1992) e lipídios (MARNETT et al.,1985). O acúmulo de tais
espécies reativas de oxigênio (ERO) pode contribuir para o envelhecimento e
doenças degenerativas associadas à idade.
Muitos estudos tem reportado que episódios de traumatismos cranianos no
passado estão associados com um risco aumentado de desenvolvimento da DP mais
tarde. Riscos podem ser duplicados ou triplicados naqueles em que a injúria foi
severa (DAVIE, 1995 & BOWER, 2003).
30
O ferro é outra toxina ambiental implicada como causa da DP. Um acúmulo
consistente deste metal na SN tem sido relatado em casos da doença (GERLACH et
al.,2006). Depósitos de ferro parecem ser tóxicos para neurônios da substancia nigra
pars compacta (SNpc) e tem sido observados em conjunto com outras inclusões de
proteína. O ferro pode causar agregação de α-sinucleína (maior constituinte dos
corpos de Lewy), por causa de sua propensão a gerar excesso de espécies reativas
ao oxigênio (EROs) (JELLINGER, 1999).
FISIOPATOLOGIA:
As manifestações clínicas da DP foram inicialmente descritas por James
Parkinson em 1817. Ele relatou em uma monografia alguns dos sintomas clínicos da
doença em seis pacientes. Dentre os quais estavam: bradicinesia, acinesia, tremor
durante o repouso, instabilidade postural, postura curvada e micrografia. Ele não
descreveu a rigidez, descrita por Charcot em 1888.
Os sintomas iniciais da DP aparecem somente após a patologia ter alcançado
um estágio avançado, onde aproximadamente 50% das células dopaminérgicas da
SN já morreram, com uma brusca depleção de 80% da dopamina estriatal (BRAAK et
al.,2003).
A DP é resultante de anormalidades primárias nos gânglios da base, uma
estrutura cerebral que atua em tarefas como a motivação crítica, planejamento motor
e funções de aprendizagem (PRESCOTT, 2009). Os gânglios da base são parte de
uma alça fechada que conecta sequencialmente todas as áreas corticais através do
corpo estriado, globo pálido e tálamo com o córtex frontal. O córtex frontal se projeta
para baixo em direção ao nível espinhal formando circuitos. Os componentes dos
gânglios da base incluem além do corpo estraido(caudato e putamên) e os segmentos
palidais internos e externos(globo pálido interno-gpi e externo-gpe), também o núcleo
31
subtalâmico (NST) e a substância negra pars reticulata(SNr) e pars compacta(SNc)
(ROSIN et al.,2007 & GALVAN et al., 2008).
As estruturas dos gânglios da base formam circuitos paralelos que são
divididos em alças motoras, associativas e límbicas, dependendo da função da área
cortical envolvida (MIDDLETON & STRICK, 2000). O estriato e NST recebem
aferências glutamatérgicas de áreas específicas do córtex cerebral ou tálamo e
transferem a informação para os núcleos de saída dos gânglios da base, que são o
globo pálido interno e SNr. A projeção entre o estriato e o gpe/SNr está dividida em
duas vias separadas: uma via direta e uma via indireta, através da intercalação do
globo pálido externo e do núcleo subtalâmico. A via direta conecta diretamente o
estriato aos núcleos de saída (gpi/SNr), e age facilitando o movimento pela
desinibição do tálamo. A via indireta começa na projeção que vai do estriado ao globo
pálido externo (gpe), segue então ao núcleo subtalâmico (nst) e só depois termina nos
núcleos de saída (gpi/SNr) (GALVAN, et al., 2008).
Os neurônios que se projetam para o córtex, NST e tálamo utilizam o
neurotransmissor glutamato, que é conhecido por suas propriedades excitatórias no
SNC, o que resulta em um efeito excitatório na via direta. Desta forma, na via direta
há uma facilitação do movimento. Contrariamente, a projeção de neurônios no estriato
e em ambos os segmentos do globo pálido uti liza GABA, que é considerado um
neurotransmissor inibitório do SNC, resultando em efeitos inibitórios. Portanto, a via
indireta inibe o movimento, inibindo o tálamo ( TEPPER et al. 2007).
Além das aferências corticais que chegam ao corpo estriado, existe uma outra
projeção muito importante que é a via dopaminérgica nigro-estriatal. Essa projeção se
inicia nos neurônios SNc, e termina diretamente nos espinhos dos dendritos dos
neurônios de projeção médios espinhosos. São esses neurônios que dão origem à via
direta e à via indireta. Nessa posição estratégica, a via nigro-estriatal é capaz de
modular o afluxo de informações corticais que chegam aos neurônios de projeção no
estriado. Assim, ela pode modular a atividade das vias direta e indireta. A dopamina é
32
o neurotransmissor dessa via. Ela atua como neurotransmisor excitatório aos
neurônios que vão formar a via direta, ligando-se a receptores do tipo D1. Por outro
lado, a dopamina é inibitória aos neurônios que vão formar a via indireta, ligando-se a
receptores do tipo D2. Dessa forma, a via nigro-estriatal age facilitando o movimento,
já que ela ativa a via direta e inibe a via indireta (GROENEWEGEN, 2003) (Figura 1).
Existem vários estudos acerca do papel da dopamina a nível estriatal, porém
muitos aspectos ainda não foram compreendidos. Na doença de Parkinson, a
degeneração de neurônios dopaminérgicos da SNc inicia uma cascata de mudanças
funcionais afetando todos os circuitos do gânglios da base. As alterações mais
relevantes afetam o núcleo de saída do circuito, o globo pálido e a SNr, que se tornam
hiperativos, levando a uma inibição excessiva dos sistemas motores tála mo-cortical e
mesencefálico. Tal hiperatividade é sustentada pela entrada glutamatérgica acentuada
que o núcleo de saída recebe do NST (CALABRESI et al., 2000). A reduzida ativação
dos receptores dopaminérgicos, causada pela deficiência de dopamina, resulta na
inibição reduzida dos neurônios da via indireta e na diminuição da excitação dos
neurônios da via direta. A redução da inibição da via indireta origina potente inibição
do gpe, desinibição do NST e excitação aumentada dos neurônios do gpi e da SNr. Já
a ativação diminuída da via direta causa redução de sua influência inibitória sobre o
gpi e a SNr. O resultado final é uma ativação excessiva dos neurônios de saída dos
gânglios da base, gerando excessiva inibição dos sistemas motores e ocasionando os
prejuízos motores característicos da doença de Parkinson (SANTENS et al., 2003)
(figura 1).
33
Figura 1. Mudanças relacionadas a DP na atividade global do circuito motor
talamocortical nos gânglios da base. Setas negras indicam conexões inibitórias e
setas cinzas indicam conexões excitatórias. A espessura das setas corresponde a sua
atividade presumida. Abreviações: CM, núcleo do tálamo centromediano; ACM, área
cingulato-motora; Dir, via direta; D1 e D2, subtipos dos receptores de dopamina; GPe,
globo pálido externo; GPi, globo pálido interno; Indir, via indireta; M1, córtex motor
primário; Pf, núcleo do tálamo parafascicular; PMC, córtex pré-motor; PPN, núcleo
pedúnculo-pontino; MAS, área motora suplementar; SNc, substância negra pars
compacta; SNr, substância negra pars reticulata; VA, núcleo do tálamo ventral
anterior; VL, núcleo do tálamo ventrolateral.(Fonte: Galvan, 2008) .
Existe um consenso de que o evento patológico mais importante que leva ao
aparecimento dos sintomas motores da DP e em especial a acinesia, é a morte de
neurônios dopaminérgicos no mesencéfalo e nas suas projeções estriatais. A DP é
caracterizada por uma perda celular progressiva principalmente de neurônios
dopaminérgicos do SNC, mas o mecanismo de morte celular ainda não está bem
definido (VON BOHLEN et al., 2004). Tem sido mostrado que neurônios do sistema
nervoso central de pacientes de DP apresentaram características de apoptose e
34
degeneração autofágica, além de alterações atribuídas a apoptose, como
condensação nuclear, fragmentação da cromatina e formação de corpos do tipo
apoptótico (ANGLADE et al., 1997 & TATTON et al., 2003; TOMPKINS et al., 1997). È
provável que a degeneração das células neuronais na DP envolva apoptose de uma
maneira dessincronizada por um período de tempo prolongado e a sobrevivência do
núcleo com DNA fragmentado dure uma questão de horas.
Possíveis mecanismos de morte celular para neurônios dopaminérgicos nigro-
estriatais incluem estresse oxidativo, processos inflamatórios, óxido nítrico, acúmulo
de ferro, toxicidade do glutamato e diminuição das respostas dos fatores
neurotróficos. Existe um consenso de que a doença de Parkinson não é uma simples
desordem, mas uma síndrome que pode se iniciar por muitos fatores (SCHAPIRA,
1999).
Além da severa depleção de neurônios dopaminérgicos na SNpc, a doença
tem como característica patológica, a presença de corpos de Lewy (CL) nas células
sobreviventes. CL são inclusões intracitoplasmáticas compostas principalmente de
estruturas parecidas com neurofilamentos que se coram positivamente para ubiquitina
e α-sinucleína. Estes corpúsculos não são restritos à SN, eles também podem ser
encontrados no locus coerulos, núcleos basais de Meynert, núcleo cranial motor do
tronco cerebral e mesmo em divisões do sistema nervoso autonômico (TAKAHASHI et
al., 2001).
O aminoácido glutamato desempenha um papel integrativo no funcionamento
dos gânglios da base, como já foi visto, porém o balanço entre glutamato e dopamina
é perturbado quando neurônios dopaminérgicos nigrostriatais sofrem degeneração no
curso da DP (STARR, 1995). Estes neurônios possuem receptores de glutamato que
degeneram quando expostos a excitotoxicidade do glutamato (ALEXI et al., 2000). A
antagonização desta excitoxicidade tem recebido atenção por seu potencial
terapêutico na DP (GOLEMBIOWSK et al., 2002).
35
A degeneração dos neurônios dopaminérgicos na DP está associada com uma
grande atividade microglial (MCGEER et al., 1988). A gliose é uma característica
neuropatológica marcante em muitas doenças do cérebro cuja única função pensava -
se, por muitos anos, ser a remoção de restos celulares. Desde então crescentes
evidências indicam que o papel da gliose em situações patológicas pode não se
restringir a função de “limpeza”, mas pode também incluir ações que
significativamente e ativamente contribuem para a morte neuronal, especialmente em
desordens neurodegenerativas como a DP (WU, 2002). Células da microglia podem
ter um efeito deletério sobre neurônios dopaminérgicos, elas representam macrófagos
cerebrais e são ativadas com subseqüente produção de citocinas pró-inflamatórias
que agravam o processo neurodegenerativo da DP (SANCHEZ-GUAJARDO et al.,
2010) É relatado um aumento na densidade de células da glia expressando citocinas
pro-inflamatórias incluindo fator-alfa de necrose tumoral (TNF-α) e interleucina-1β
(HUNOT et al., 1999). Níveis aumentados de citocinas como o TNF-α, interleucina-
1β,-2, -4, -6, fator α transformador do crescimento e fatores transformadores do
crescimento β1 e β2 tem sido detectados por vários investigadores no parênquima
cerebral ou no líquor de pacientes com DP (NAGATSU et al., 2000). Além disso,
mudanças nas subpopulações de linfócitos também tem sido reportadas no sangue e
líquor de pacientes de DP (ORR et al., 2002). Essas informações sugerem que ocorre
uma mudança no microambiente do cérebro parkinsoniano, essas mudanças não
envolvem somente células neuronais e da glia, mas também células perféricas do
sistema imunológico e mesmo capilares cerebrais. Os mecanismos pelos quais as
células da glia e citocinas inflamatórias liberadas realizam seus efeitos sobre
neurônios dopaminérgicos ainda não estão completamente entendidos, mas sabe-se
que em modelos experimentais utilizando animais, a inibição do processo inflamatório
previne a neurodegeneração (HIRSCH et al., 2005).
DEPLEÇÃO DE GLUTATIONA
Existem fortes evidências de que a depleção de glutationa (GSH) é o evento
principal na etiologia da DP. A glutationa é uma potente molécula antioxidante que age
36
como cofator para a conjugação feita pelo sistema P450 no fígado e um cofator para a
família de enzimas antioxidantes glutationa peroxidase. A GSH também desempenha
grandes papéis como antiinflamatório, antitoxina e regulador metabólico. (KIDD,
2000).
É notável que a depleção de GSH contribui para o aparecimento de doenças
neurodegenerativas. Em numerosos modelos animais de depleção de GSH, o
bloqueio da capacidade de sintetizar GSH distorce a capacidade de desenvolvimento
cerebral, resultando em patologias neuronais (BAINS & SHAW, 1997). Mesmo sendo
a quantidade de GSH encontrada no cérebro na ordem de concentrações milimolares,
esta estrutura é mais suscetível ao dano oxidativo que outros tecidos (DRINGEN &
HIRLINGER, 2000). Tradicionalmente, tem se apontado o decréscimo dos níveis de
GSH como consequência do aumento do estresse oxidativo. Entretanto, evidências
recentes sugerem que a depleção de GSH sozinha desempenha um papel ativo na
patogênese da DP (MARTIN & TEISMANN, 2009).
O dano oxidativo promovido pela depleção de GSH pode acelerar o acúmulo
de proteínas defeituosas levando neurônios dopaminérgicos da SN à morte celular
por prejudicar a via ubiquitina-proteossoma da degradação protéica. A restauração
dos níveis normais de glutationa no cérebro pode vir a ser uma estratégia importante
na terapêutica da DP (BHARATH, 2002).
DISFUNÇÃO MITOCONDRIAL:
As mitocôndrias são organelas citoplasmáticas relacionadas ao metabolismo
energético resultante de várias reações bioquímicas que ocorrem dento dela. Essa
energia produzida é que faz com que a vida dos metazoários seja possível. O ATP
(trifosfato de adenosina) mitocondrial é quem gera tal energia. Diferente de outras
organelas nos animais, a mitocôndria tem seu próprio genoma (DNA mitocond rial) que
37
codifica componentes do sistema de fosforilação oxidativa (OXPHOS). A maquinaria
mitocondrial é composta de cinco multisubunidades (complexo I–V). A fosforilação
oxidativa é o processo metabólico de síntese de ATP a partir da energia liberada pelo
transporte de elétrons na cadeia respiratória (MORAES, 2008).
Por causa do seu alto nível de atividade metabólica e estrutura complexa, as
mitocôndrias são vulneráveis a uma variedade de problemas funcionais (FEARNLEY
& LEES,1991, MULLER-HOCKER, 1992), incluindo aqueles decorrentes de mutações
no DNA nuclear e mitocondrial, uma série de fatores exógenos, como drogas,
infecções, encargos metabólicos (como obesidade ou diabetes mellitus tipo II) certos
fatores da dieta, e episódios de hipóxia cerebral. Finsterer (2006) enfatiza que tecidos
ou órgãos com alta demanda de oxigênio e energia, tais como o cérebro, coração,
fígado, pele, intestino e túbulos renais, são aqueles mais afetados pelas
mitocondriopatias.
Danos nas enzimas mitocondriais na cadeia transportadora de elétrons,
membranas mitocondriais ou na própria cadeia (a partir de qualquer fonte) irão
interferir na formação de ATP e mesmo levar a apoptose celular ou reduzir a sua
habilidade da célula em funcionar. Este processo de fosforilação oxidativa promove a
formação de numerosos radicais livres(espécies reativas ao oxigênio-ERO) os quais
são extremamente reativos e causam oxidação de moléculas vizinhas através da
extração de um elétron. As mitocôndrias são a principal fonte celular de ERO,
particularmente os radicais superóxido que são gerados no complexo I da cadeia
transportadora de elétrons. As ERO podem atacar DNA e proteína mitocondrial
(SCHEFFER, 2001). A razão de formação de EROs pode exceder a habilidade de
enzimas como a superóxido dismutase (SOD), catalase e outros mecanismos
protetores em convertê-las para formas menos reativas ou inofensivas. O estresse
oxidativo descontrolado pode desencadear consequências que resultariam na morte
celular programada (MARTIN, 2006 & LANG, et al.,1998).
Evidências sugerem a hipótese que o complexo I mitocondrial tem importante
38
papel na etiologia da DP. A atividade do complexo I está reduzida em 35–40% em
homogenatos de substância negra de pacientes da DP em estudos postmortem
(SCHAPIRA et al.,1989; SCHAPIRA et al.,1990a; SCHAPIRA et al., 1990b).
Recentemente foi reportado a ocorrência de uma mutação no DNA mitocondrial na
forma idiopática da doença (PARKER JR & PARKS, 2005) e uma redução associada
na atividade do complexo I nas mitocôndrias do córtex frontal (PATHAK, 2008).
A exposição crônica a inibidores do complexo I, como pesticidas, pode
contribuir para o desenvolvimento da forma idiopática da doença, no entanto, é
improvável que somente a exposição à toxina seja responsável pelo defeito seletivo
no complexo I na população em geral. Pacientes da doença sem qualquer história de
exposição a toxinas também exibem defeitos no complexo I de plaquetas (GU et al.,
1998).
MODELOS DA DOENÇA
Para o melhor entendimento da patofisiologia da DP e também com o objetivo
de desenvolver novos tratamentos, se faz importante o desenvolvimento de modelos
experimentais da doença nos quais novos agentes farmacológicos e estratégias
terapêuticas possam ser acessadas antes dos testes clínicos (BETARBET, 2002).
Requerimentos específicos devem ser preenchidos para se estabelecer um
modelo de doença de Parkinson. Para testar novas estratégias protetoras, o modelo
deve induzir uma lesão intranigral replicável, a perda de neurônios dopaminérgicos
deve manter-se estável além da recuperação espontânea do animal e o modelo deve
proporcionar a oportunidade para que uma estratégia terapêutica possa funcionar
(EMBORG, 2004). Deste modo foram desenvolvidos modelos animais utilizando-se
neurotoxinas dopaminérgicas e modelos de linhagens genéticas com deleção
genética para a doença. Assim, foram introduzidos agentes que seletivamente lesam
e destroem os sistemas catecolaminérgicos tais com 6-hidroxidopamina (6-OHDA) e
39
1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) (DAUER & PRZEDBORSKI, 2003).
A 6-OHDA foi o primeiro composto a ser descoberto com a capacidade de
induzir morte seletiva em células catecolaminérgicas (UNGERSTEDT, 1968). É uma
toxina seletiva para neurônios dopaminérgicos. Atualmente, 6-OHDA representa uma
das neurotoxinas mais comumente utilizadas em modelos de degeneração de
projeções catecolaminérgicas centrais, incluindo o sistema nigroestriatal, in vivo e in
vitro (SCHOBER, 2004). A neurotoxina é capaz de induzir dano específico via
estresse oxidativo, uti lizando um sistema transportador de dopamina (DA) e
noradrenalina. Alguns estudos demonstram que a 6-OHDA possui uma potente ação
inibitória na cadeia respiratória mitocondrial. A morte neuronal induzida por 6-OHDA
está ligada fundamentalmente a formação de H2O2, radicais livres tipo hidroxila (•OH)
e quinonas que são produzidas em sua metabolização. Ela não atravessa a barreira
hematoencefálica, por isso deve ser administrada intracerebralmente para exercer
seus efeitos tóxicos. Este modelo experimental tem sido produzido em diversas
espécies incluindo camundongos, ratos, cães e primatas (EMBORG, 2004).
Existem dois tipos de injeção intracerebral com 6-OHDA: diretamente na
substancia nigra levando a uma morte rápida das células (1-3 dias) ou através da
injeção diretamente no corpo estriado, que causa degeneração retrógrada dos
neurônios da substância negra. Esse último modelo causa uma lesão lenta, parcial e
progressiva das células neuronais, em torno de quatro semanas, e tem sido utilizada
com sucesso no intuito de mimetizar a lesão lenta e progressiva da DP (SHIMOHAMA
et al., 2003).
A 6-OHDA é usualmente injetada unilateralmente, enquanto o hemisfério intacto
serve como controle interno. Esta injeção unilateral representa o modelo conhecido
como “hemiparkinsoniano” (PERESE et al., 1989), que se caracteriza por um
comportamento de assimetria motora após a administração de drogas
dopaminérgicas, devido ao desbalanço fisiológico entre o corpo estriado lesionado e o
não-lesionado (BETARBET et al., 2002). Por isso, os animais apresentarão um
40
comportamento rotacional contralateral no sentido do hemisfério o qual a estimulação
do receptor dopaminérgico for predominante. O comportamento rotacional pode ser
quantificado e correlacionado com o grau da lesão, a maior vantagem desde modelo
(BEAL, 2001).
O MPTP é um inibidor do complexo I mitocondrial que foi acidentalmente
descoberto após humanos serem expostos a ele e desenvolverem sintomas
parkinsonianos em poucas semanas. O MPTP demonstra uma evidência forte de que
o fator ambiental pode ser uma das causas de parkinsionismo e proporciona uma
pista para a possível relevância da função mitocondrial no mecanismo de morte
celular nigral (SAWLE, 1999). Ele é altamente lipofílico e atravessa facilmente a
barreira hematoencefálica. Para exercer efeitos tóxicos o MPTP deve ser convertido
em MPP+ pela enzima MAO-B. MPP+ é então transportado para dentro de neurônios
dopaminérgicos pelo sistema transportador de dopamina, onde inibe o sistema de
transporte de elétrons do complexo I, resultando em falha de energia na célula e na
formação de ânions superóxido (EMBORG, 2004).Os animais mais freqüentemente
utilizados neste modelo são os camundongos e os macacos, ratos são relativamente
insensíveis a toxina (GIOVANNI et al., 1994).
Recentemente, foi reportado que pesticidas agrícolas como a rotenona e o
paraquat, quando administrados sistemicamente podem induzir características
específicas da DP (BETARBET et al., 2002). Por causa da sua similaridade estrutural
com o MPP+, foi hipotetizado que o Paraquat inibia o Complexo I mitocondrial,
entretanto esta hipótese tem sido questionada. Muitas características da disfunção
mitocondrial foram observadas em camundongos, em exposição crônica ou aguda,
incluindo-se perda de neurônios dopaminérgicos, redução da densidade das fibras
positivas para TH e inclusões positivas para α-sinucleína em neurônios
dopaminérgicos. Em culturas mesencefálicas, o pré-tratamento com baixas doses de
Paraquat aumentou a vulnerabilidade de neurônios dopaminérgicos para o MPP+.
Além disso, o Paraquat causou apoptose em culturas primárias de neurônios
dopaminérgicos de rato pela ativação da proteína quinase, resultando na oxidação da
tioredoxina citosólica em células SK-N-MC. Coletivamente, estas informações
41
sugerem que a vulnerabilidade do neurônio dopaminérgico induzida pelo Paraquat
está relacionada ao aumento do estresse oxidativo e sinalização pro -apoptótica
(BÜELER, 2009).
A rotenona, um composto natural extraído de plantas e utilizado como
inseticida e no controle da população de peixes, tem demonstrado ser capaz de
induzir dano em neurônios dopaminérgicos. Em contraste com o Paraquat, a rotenona
facilmente atravessa a barreira hematoencefálica e membranas biológicas e age
como potente inibidora do Complexo I. A exposição sistêmica de ratos à rotenona
reproduz características da DP, incluindo degeneração nigroestriatal seletiva e
inclusões citoplasmáticas positivas para α-sinucleína (BETARBET, 2000).
Existem algumas limitações no modelo da rotenona, incluindo períodos de
longa administração (semanas a meses); variabilidade da dose; baixa taxa de
sobrevivência dos animais; achados patológicos variáveis e específicos; e diferenças
de efeitos entre espécies e cepas diferentes. Apesar disto, este modelo propõe
descobertas valiosas em relação aos mecanismos relevantes na etiologia da DP
(PETZINGER & JAKOWEK, 2007).
TRATAMENTO FARMACOLÓGICO DA DOENÇA DE PARKINSON
Não existe cura para a DP, as terapias atualmente disponíveis não conseguem
impedir a progressão da doença. No entanto, muitas opções de tratamento
descobertas recentemente são capazes de controlar os sintomas, levando a uma
melhora significante no controle motor tanto em estágio inicial, quanto em estágios
avançados da doença. As drogas uti lizadas no tratamento da DP agem aumentando
os níveis de dopamina no cérebro ou imitando os efeitos da dopamina (DA) (SINGH
et al., 2006). Uma outra opção terapêutica seriam os agentes neuroprotetores, cuja
importância está nas suas propriedades antioxidantes, estes poderiam ser capazes de
42
mudar o curso da doença, barrando a neurodegeneração dopaminérgica. Muitos
agentes potencialmente neuroprotetores tem sido identificados e requerem testes
clínicos (HART et al., 2009; SCHAPIRA et al., 2006).
A levodopa é uma amina precursora de dopamina, que age como o
componente chave no tratamento da DP. Ela é oralmente ativa e absorvida no
intestino delgado, sendo logo descarboxilada pela enzima dopa descarboxilase e
apenas uma pequena dose chega inalterada no SNC. A meia vida plasmática da
levodopa é muito curta, não passando de 90 minutos. Assim, uma alta dose é
requerida para que haja efeito, o que leva a vômitos e náuseas nos pacientes. Para
bloquear os efeitos periféricos da dopamina e aumentar a biodisponibilidade da
levedopa, ela é coadministrada com a carbidopa ou a benzerazida, que são inibidores
da descarboxilase do ácido amino aromático (DDC) (PETZINGER & JAKOWEK,
2007). Arritimias cardíacas também estão relacionadas a pacientes com histórico de
doença cardiovascular (BENAIM, 1972). Apesar destes efeitos, a levedopa reduz os
sintomas motores da DP, não agindo nos outros sintomas, nem impedindo a
degeneração nigroestriatal (SINGH, 2007). O tratamento com a levedopa à longo
prazo aumenta o pico de concentração da droga (Cmax) e diminui a meia-vida desta
(T1/2) (MURATA, 2009).O tratamento com a levedopa à longo prazo está associado a
muitos efeitos motores adversos que limitam seu uso, incluindo discinesias e
flutuações motoras.(OLANOW et al., 2004; JANKOVIC, 2005).
A terapia com a levedopa é altamente efetiva durante os primeiros estágios do
tratamento, no entanto, com o tratamento prolongado, os pacientes tendem a
desenvolver complicações motoras. Flutuações na concentração de levedopa no
sangue e no cérebro, produzidas na administração periódica de levedopa podem levar
a estimulação de receptores dopaminérgicos no estriato, o que pode causar
flutuações na resposta clínica levando a discinesia (NAGATSU et al., 2009). As
discinesias são geralmente movimentos involuntários hipercinéticos, sendo os
distônicos e de coréia/coreiformes, os mais comuns (KIEBURTZ, 2008).
43
Alguns pesquisadores acreditam que a levedopa é de fato neurotóxica e
promove a degeneração neuronal (JENNER & BRIN, 1998; MYTILINEOU et al., 2003;
MÜLLER et al., 2004; WEINER, 2006). A autooxidação da levedopa in vitro leva a
geração de metabólitos que causam estresse oxidativo e levam à destruição neuronal.
Entretanto, sua administração crônica in vivo não demonstrou evidências suficientes
que sugiram que ela acelere a destruição nigroestriatal (MURATA, 2009). Tanto os
efeitos tóxicos e os efeitos neuroprotetores da levedopa foram descritos em vários
estudos, in vivo e in vitro, que investigaram se a levedopa poderia acelerar ou retardar
a progressão da DP em humanos. Apesar disso, a levedopa ainda é a droga mais
efetiva para tratar a DP (HATTORI et al., 2009) e ainda permanecerá muito tempo
como o “padrão ouro” para a terapia da DP, pelo menos até o desenvolvimento de
agonistas dopaminérgicos mais potentes e seguros ou terapias neuroprotetoras e
neurorestauradoras completas (NAGATSU et al., 2009).
Historicamente, agonistas dopaminérgicos foram usados como terapia
adjuvante em conjunto com a levedopa no tratamento de complicações motoras.
Existem muitas evidências indicando a eficácia dos agonistas dopaminérgicos como
adjuvantes na terapia de controle das flutuações motoras e discinesias induzidas pela
L-dopa. Inibidores da monoamina oxidase B (MAO B) e a zonisamida também podem
ser usados na terapia adjuvante para melhorar as flutuações motoras (MURATA,
2009). Os agonistas dopaminérgicos são divididos em duas classes. Os derivados do
ergot incluem bromocriptina, cabergolina, lisuride, e pergolide. Os não-derivados do
ergot incluem apomorfina, piribedil,pramipexole, e ropinirole (SINGH, 2007). Eles
podem ser usados sozinhos para retardar a necessidade de levodopa, ou podem ser
usados em conjunto com a levodopa para aumentar a sua efetividade. Alguns estudos
sugerem que estes agentes tem ação neuroprotetora (SCHAPIRA, 2003; SCHAPIRA
et al., 2006).
Amantadina e anticolinérgicos têm sido utilizados por muitas décadas como
terapia na DP. A amantadina (Symmetrel®) foi aprovada pela FDA (Food and Drug
Administration) em 1966 com a indicação de agente antiviral. Seu uso como agente
antiparkinsoniano foi primeiramente descrito em 1969, quando uma mulher em
44
avançado estágio da DP notou alívio transiente nos tremores, rigidez e bradicinesia,
durante o uso da amantadina por seis semanas para tratar uma gripe. Estudos
demonstraram que o uso corrente deste agente é efetivo na redução das discinesias.
Estes efeitos parecem ser mediados por sua ação antiglutamatérgica. À amantadina
também é atribuída a capacidade de promover a liberação, prevenir a recaptação ou
influenciar na síntese de dopamina. Seu mecanismo exato ainda não foi esclarecido,
além disso existe a suspeita de que este agente potencialize doenças
cardiovasculares ou mesmo induza convulsões em pacientes suscetíveis (SINGH,
2007).
Os anticolinérgicos são benéficos no tratamento dos sintomas cardinais da DP
e possivelmente no controle do tremor, o que parece ser controverso. Por mais de um
século, até que a levedopa fosse descoberta, a atropina e outros fármacos
relacionados eram a forma de tratamento da DP. Os receptores muscarínicos de
acetilcolina parecem exercer um efeito inibitório nos terminais nervosos
dopaminérgicos, cuja supressão compensa a falta de dopamina. Os efei tos adversos
incluem boca seca, visão borrada, retenção urinária, constipação e propensão a
causar confusão em indivíduos idosos. Anticolinérgicos tem sua indicação preferencial
em pacientes mais jovens como terapia inicial por um curto período (LEUNG & MOK,
2005).
As monoaminas incluem os neurotransmissores catecolaminérgicos dopamina,
norepinefrina e 5-hidroxitriptamina. Os inibidores de monoamina oxidases (MAOs) são
enzimas intracelulares encontradas em membranas mitocondriais que catabolizam
estas aminas. A inibição da MAO-B bloqueia o metabolismo da dopamina e através
disso aumenta tanto a dopamina endógena quanto a dopamina produzida da
Levedopa exogenamente administrada. Inibidores da MAO-B bloqueiam a conversão
de MPTP para o seu metabólito ativo MPP+, que uma neurotoxina seletiva para
substancia negra sugerindo que esta classe de agentes pode ter atividade
neuroprotetoras.
45
ANTIOXIDANTES NA DOENÇA DE PARKINSON
Substâncias antioxidantes são amplamente discutidas na literatura científica
como agentes promotores da saúde que podem fornecer proteção contra várias
doenças relacionadas ao envelhecimento. Antioxidantes são classificados como
compostos exógenos (naturais ou sintéticos) ou endógenos, responsáveis pela
remoção de radicais livres (EROs) (GILGUN-SHERKI, 2001). Os organismos vivos
normalmente possuem um equilíbrio dinâmico entre a geração de radicais livres e a
sua extinção. Os sistemas de defesa fisiológicos uti lizam de sistemas enzimáticos e
não enzimáticos para neutralizar estes radicais livres. Tais sistemas enzimáticos são
compostos pela catalase, glutationa redutase, superóxido dismutase, glutationa,e
coenzima Q e têm efeito antioxidante pela sua capacidade de transformar EROs em
compostos menos reativos (VALKO et al., 2006). Sistemas não-enzimáticos
antioxidantes incluem a ação direta de substâncias antioxidantes que são
extremamente importantes na defesa contra o estresse oxidativo. A maioria delas
inclui ácido ascórbico e ácido lipóico, polifenóis e carotenóides, compostos estes,
derivados de fontes dietéticas (UTTARA et al., 2009).
O estresse oxidativo é um fator significativo associado ao declínio das funções
fisiológicas com o advento do envelhecimento cerebral. Com o aumento
desproporcional da população em envelhecimento na próxima década, existe uma
grande preocupação em se desenvolver terapias que combatam os processos
oxidativos relacionados ao envelhecimento. Considerável atenção está sendo
direcionada a compostos extraídos de vegetais, frutas, sementes, flores, raízes, chás
e vinho tinto. (BURGENER et al. 2008).
Muitos estudos têm indicado o papel potencialmente importante de
antioxidantes na dieta nas doenças relacionadas ao envelhecimento (MEYDANI et al.,
2001). A dieta mediterrânea, que é rica em frutas e vegetais, tem demonstrado
diminuir a incidência de doenças cardiovasculares (SERRA-MAJEM et a.,l 2006). A
vitamina E, que tem seu papel antioxidante bastante estudado, demonstrou inibir a
46
oxidação do LDL in vitro (HODIS et al., 2002), diminuir a agregação plaquetária
(MUNTEANU et al., 2004), proteção contra a peroxidação lipídica (PRYOR, 2000) e
prevenir AVCs (CHATTOPADHAY & BANDYO-PADHYAY, 2006), dentre outras
propriedades antioxidantes. A vitamina C, ou ácido ascórbico possui diferentes
funções tanto em seres humanos quanto em outros mamíferos, além disso seu papel
antioxidante é bem conhecido, a vitamina é utilizada como co -fator em diversas
reações enzimáticas. Além dessas funções, a vitamina C parece exercer algumas
ações no sistema nervoso central, como por exemplo na maturação de células tronco
neurais, ou tendo um papel de neuromodulador de neurotransmissores e
neuroprotetor em várias doenças cerebrais. Na DP, o ascorbato parece melhorar a
disponibilidade da levedopa, melhorando os sintomas da doença, além da sua ação
antioxidante( HARRISON & MAY, 2009). Atualmente existe um grande interesse em
substâncias de origem vegetal conhecidas como flavonóides, devido às suas
propriedades antioxidantes e quelantes de metais que teriam um possível papel na
prevenção de doenças crônicas relacionadas ao envelhecimento. (SCHROETER et
al., 2002).
Vários estudos têm demonstrado os efeitos protetores de plantas fenólicas
contra o dano cerebral na DP. Estes estudos utilizam, por exemplo, um composto
único como o resveratrol, a curcumina, a epigalocatequina (EGCG), ou uma mistura
complexa de extratos de uva, mirtilo ou chá verde. Os efeitos neuroprotetores destes
compostos são atribuídos em parte à remoção de radicais livres, à quelação de
ferro/metais e às suas atividades antiinflamatórias (SUN et al., 2008 & VAFEIADOU et
al., 2007).
A selegilina e a rasagilina, inibidores da enzima monoamina-oxidase B (MAO-
B) empregadas no tratamento da DP, são algumas das drogas antioxidantes mais
estudadas em ensaios clínicos e tem provado diminuir a progressão da doença
(YACOUBIAN et al., 2009). A coenzima Q10 (CoQ10) é um co-fator da cadeia
transportadora de elétrons na mitocôndria que tem demonstrado reduzir a
neurodegeneração dopaminérgica em estudos com modelo de camundongo para a
DP (BEAL et al., 1998). Um estudo com 80 pacientes demonstrou que a CoQ10 foi
47
capaz promover benefícios na progressão da doença na dose de 1200mg por dia
(SHULTS et al., 2002). Um estudo recente mostrou a eficácia da CoQ10 em conjunto
com a creatina, um composto guanidínico, na neuroproteção de animais submetidos a
um modelo experimental da DP (YANG et al., 2009).
CATEQUINAS DA CAMELLIA SINENSIS
A natureza tem sido uma fonte contínua de moléculas farmacologicamente
ativas e ervas medicinais têm sido utilizadas por incontáveis gerações de pessoas.
Além disso, alguns extratos de plantas demonstraram ser neuroativos. Existe um
reconhecimento crescente de que as catequinas, que são polifenóis, exercem um
papel protetor no processo de neurodegeneração (MANDEL, 2005). Os flavonóides
demonstram um grande potencial como antioxidantes porque possuem um grupo
hidroxila altamente reativo que fica oxidado pela doação de elétrons, desta forma
estabilizam o radical livre, transformando-o em uma molécula menos reativa. Além
das muitas propriedades farmacológicas destes compostos, eles parecem melhorar a
função cognitiva durante o envelhecimento e prevenir a demência (SCHMITT-
SCHILLIG et al.,2005, PATIL et al., 2003).
Polifenóis são substâncias naturais presentes em bebidas obtidas de plantas,
frutas e vegetais como óleo de oliva, vinho tinto e chás. Os flavanóides são o maior
grupo de polifenóis responsáveis pelas cores azul, laranja e púrpura nos frutos, folhas
e flores, além de serem encontrados também em vegetais, grãos, especiarias,
sementes, vinho, chá e cerveja. Foram identificados cerca de 6000 diferentes
flavonoides que podem ser divididos em seis classes dependendo da sua estrutura
química: flavanol (catequina), flavona, flavonona, isoflavona, flavonol e antocianidina
(HARBONE, 2000 & BUTTERFIELD, 2002). Os componentes estruturais comuns a
estas moléculas incluem dois anéis benzeno sobre cada lado de uma anel 3-carbono.
A pesquisa com flavonóides ganhou impulso com a descoberta da observação
da correlação na baixa mortalidade cardiovascular de populações mediterrâneas com
48
a associação no consumo de vinho tinto numa dieta rica em gorduras saturadas. Os
flavonóides no vinho são responsáveis, em parte, por deste efeito (FORMICA, 1995).
Além disso, a associação entre o consumo de flavonóides e seus efeitos a longo
prazo na mortalidade foram estudados posteriormente, e sugeriu-se que o consumo
de flavonóides é inversamente proporcional à mortalidade devido a doença
coronariana cardíaca (KNEKT, 1996). Vários protótipos destes grupos têm
demonstrado promover grandes benefícios fisiológicos, especialmente na função
cognitiva e memória (MANDEL, 2005).
As folhas do chá verde (Camellia sinensis) contêm um alto teor de catequinas,
que constituem 30-45% do extrato sólido da planta (WANG, 1994; YANG, 1993).
Acredita-se que as propriedades favoráveis atribuídas ao consumo do chá são
devidas aos seus componentes bioativos, as catequinas e outros derivados, capazes
de agir diretamente como varredores de radicais e exercerem propriedades
antioxidantes indiretas através da ativação de fatores de transcrição e enzimas
antioxidantes (WISEMAN, 1997). As catequinas do chá verde incluem a catequina (C),
a galocatequina (GC), a epicatequina (EC), a epigalocatequina (EGC), a epicatequina
galato (ECG) e a epigalocatequina galato (EGCG) (LUNDER, 1992; BALENTINE,
1992) (Figura 2). EGCG constitui a catequina mais abundante do chá verde com 65%
do total de conteúdo de catequinas. Uma xícara de chá verde contem 100 a 200mg
de EGCG. A catequina(C) e a galocatequina são as catequinas que estão em menor
quantidade no chá verde (CHU & JUNEJA, 1997).
Muitos estudos epidemiológicos, bem como modelos animais, demonstraram
que o chá verde pode oferecer proteção contra vários tipos de câncer como: de pele,
mama, próstata e pulmão (MUKHTAR & AHMAD, 2000; YANG et al., 2002). Em
adição, o chá verde e a EGCG tem demonstrado ser anti-angiogênicos (capazes de
prevenir o crescimento de vasos sanguíneos nos tumores) (CAO & CAO, 1999;
PFEFFER et al., 2003) e anti-mutagênicos (WANG et al., 1989; HAN, 1997). O chá
verde também demonstrou ser hipocolesterolêmico (YANG & KOO, 2000) e capaz de
prevenir o desenvolvimento de placas ateroscleróticas (CHYU et al., 2004). Chá verde
também demonstrou efeitos antidiabéticos em modelos animais de resistência
49
insulínica (WU et al., 2004). Outros benefícios à saúde atribuídos ao chá verde
incluem atividade antibactericida (STAPLETON et al., 2004), anti-HIV (NANCE &
SHEARER, 2003), anti-envelhecimento (ESPOSITO et al., 2002) and anti-inflamatória
(DONA et al., 2003).
Figura 2. Estruturas de alguns dos flavonóides presentes no chá verde (Adaptado de
Zaveri, 2006).
Estudos epidemiológicos têm demonstrado o risco diminuído da DP associado
ao consumo de duas ou mais xícaras de chá por dia, da mesma forma, há o risco
diminuído da doença na população chinesa (que tem por hábito consumir chá). Além
disso, é comprovado que na China a prevalência da DP é bem menor que em países
ocidentais (CHECKOWAY, 2002; TAN, 2003 & LI, 1995). Os mecanismos envolvidos
neste papel benéfico do chá verde foram investigados em modelos animais da DP. O
pré-tratamento de camundongos com o extrato de chá verde preveniu a morte de
neurônios dopaminérgicos da via nigroestriatal pelo MPTP (LEVITES et al.,2001). Um
estudo feito por Guo (2005) demonstrou que os polifenóis do chá verde protegem
células da neurotoxicidade da 6-OHDA através de diferentes vias: pela direta inibição
da oxidação da 6-OHDA ou remoção de EROs, pela inibição da PKC ou ERK, pela
inibição da ativação da NF-κB ou por último, pela modulação da morte celular. Uma
das catequinas mais abundantes do chá verde, a EGCG, tem sido extensamente
50
estudada por seus efeitos neuroprotetores, Levites (2002) demonstrou que ela é
capaz de proteger in vitro células contra a toxicidade da 6-OHDA. Um estudo feito por
Jeong et al. (2007) mostrou que a EGCG aumenta a atividade de neurônios
dopaminérgicos da SN de ratos, provavelmente pela inibição de correntes de potássio
dependentes de cálcio.
A catequina é um dos membros da família dos flavonóides, que apresenta uma
variedade de efeitos farmacológicos. Estudos acerca dos efeitos biológicos da (+) -
catequina em cultura de células e in vivo indicam que este composto, como outros da
classe, é quelante de metais e capaz de inibir a peroxidação lipídica (MOREL, 1998;
CHEN, 1995; LOTITO, 1998). Um estudo realizado por Pignatelli e cols .(2000),
demonstrou a capacidade da catequina em conjunto com outro flavonóide, a
quercetina em inibir a adesão plaquetária, o que pode ser importante para se entender
as propriedades antioxidantes destes compostos nas doenças cardiovasculares. Os
efeitos protetores da catequina também foram estudados na isquemia. Tanto in vitro,
quanto in vivo, a catequina parece ter melhorado a recuperação cardíaca durante a
reperfusão após a isquemia no coração isolado de rato (MODUN, 2003). A catequina
também foi capaz de incrementar a atividade da enzima manganês superóxido
dismutase (MnSOD) in vitro (CHOW, 2002).
Em relação à DP, Nobre Júnior e colaboradores (2003) em um trabalho
desenvolvido no laboratório de Neurociências e Comportamento da Universidade
Federal do Ceará, viram que a catequina foi capaz de proteger da morte neuronal
culturas de células mesencefálicas expostas à 6-OHDA. O mecanismo preciso de
neuroproteção ainda merece maiores estudos, principalmente in vivo.
DEPRESSÃO NA DP
A epidemiologia, bem como estudos de caso controle, sugerem que um relato
51
de ansiedade e depressão podem preceder a DP (SHIBA et al., 2000; RICHARD,
2005; TANBERG et al, 1997). No Brasil, dois estudos relatam a ocorrência da
depressão em 38.33% e 24% dos pacientes da DP (PRADO et al.,2005, TUMAS et
al., 2008). A depressão tem sido reconhecida como um dos maiores responsáveis
para uma pobre qualidade de vida dos pacientes, piora nas funções motoras e
cognitivas e sobrecarga dos cuidadores na DP (SCALZO et al., 2009). Sabe-se que a
depressão tem maior impacto no prognóstico da DP: pacientes deprimidos tem
menores escores de desempenho da função motora e das atividades diárias, além
disso, exibem mais sintomas cognitivos e relatam uma baixa qualidade de vida
(SHULMAN, 2002; WEINTRAUB, 2003).
A deficiência de noradrenalina e serotonina que acompanha a doença está bem
documentada e a terapia com fármacos que acentuam a transmissão noradrenérgica
ou serotoninérgica atua satisfatoriamente na depressão relacionada a DP. Regiões
que possuem neurônios para estes neurotransmissores (locus coerulus e rafe) são
afetadas pela doença precocemente o que pode explicar o aparecimento destes
sintomas antes dos sintomas motores (DICKSON et al, 2009). Na DP, a depressão
maior pode ser resultante de um estágio avançado da doença degenerativa, uma
disfunção entre o sistema catecolaminérgico (dopamina e noradrenalina) e
serotoninérgico, inclusive sendo um indicativo de um estágio mais avançado da
neurodegeneração (PALHAGEN, 2009). Existe uma hipótese sustentada por alguns
pesquisadores que considera a baixa atividade serotoninérgica como fator de risco
para o desenvolvimento da DP. A serotonina tem função inibitória na liberação de
dopamina no estriato. Assim, a redução da atividade da serotonina pode ser um
mecanismo compensatório para a redução da atividade de dopamina na DP. Porém,
pelo fato de que a diminuição da serotonina predispõe a um quadro depressivo, existe
também a possibilidade de uma maior vulnerabilidade dos pacientes com DP sofrerem
um transtorno depressivo. Logo, a interação entre a depressão e a DP é complexa e
bidirecional. Pode-se afirmar que a depressão é um fator de risco para DP, assim
como a DP é um fator de risco para depressão ( MAYEUX, 1990; SCHUURMANN et
al., 2002).
52
Uma possível suscetibilidade em desenvolver depressão na DP pode também
estar associada a uma condição genética. Um modelo animal recente para a DP
demonstrou que um gene pode estar envolvido no aparecimento da depressão em
alguns pacientes da doença (LE PEN et al., 2008).
ESTRESSE E DEPRESSÃO
A perda de interesse nas atividades diárias se configura como o sintoma central
da depressão, um estado similar pode ser reproduzido em ratos induzidos a um
regime de estresse crônico (WILLNER, 1997). Nos seres humanos, a depressão pode
estar associada à DP (25-40% dos pacientes), mas ainda não se conhece os
mecanismos que fundamentam esse estado. Supõe-se que esta depressão possa ser
exarcerbada por fatores estressores como a aposentadoria ou perda de algum
membro da família (OKUN & WATTS, 2002). Ao longo da vida ocorrem uma série de
eventos estressantes que envolvem perda, humilhação ou derrota, e que influenciam
o aparecimento da depressão (KESSLER,1997).
O estresse é um fator comum apontado como desencadeador do aparecimento
depressão, entretanto nem todas as pessoas expostas ao estresse se tornam
deprimidas. Parece haver um componente genético que i nfluencia o desenvolvimento
da depressão maior em algumas pessoas expostas ao estresse. Um estudo sugere
que uma interação entre um gene e o ambiente, em portadores do alelo curto do
transportador de serotonina, pode fazer destes indivíduos, especialmente vulneráveis
a depressão, sob condições estressantes (CASPI et al., 2003). Além disso, existem
indícios de que a dopamina também desempenha um papel importante na
patofisiologia da depressão maior. A amígdala em resposta a situações de ameaça,
aumenta os níveis de dopamina no córtex pré-frontal e no estriato. Efeitos inibitórios
locais garantem o retorno a homeostase, entretanto, um estressor severo pode
romper este sistema de feedback, alterando os níveis estriatais do fator neurotrófico
derivado do cérebro (BDNF), que promove o crescimento e a diferenciação de novos
53
neurônios e suas conexões. Mudanças no sistema de dopamina estriatal parecem ser
responsáveis pelo aparecimento de sintomas da anedonia, em pacientes com
depressão maior (NESTLER & CARLEZON, 2006; MCCLUNG; NESTLER, 2008; AAN
HET ROT et al., 2009).
Hormônios adrenais (catecolaminas e glicocorticóides) são responsáveis pelos
efeitos nocivos do estresse no SNC e sistema cardiovascular (STRATAKIS &
CHORUSOS, 1995). O hipocampo é um dos principais sítios alvo para estes
hormônios no SNC (WATANABE et al., 1992). Na verdade, tem sido reportado que a
exposição ao estresse crônico em humanos leva a atrofia hipocampal (SHELINE et
al., 1996). A hiperatividade do eixo hipotalâmico-pituitário-adrenal (HPA) na depressão
maior é um dos achados mais consistentes em psiquiatria. Uma significativa
porcentagem dos pacientes com depressão maior têm demonstrado um incremento
nas concentrações de cortisol(o hormônio glicocorticóide em humanos) no plasma,
urina e líquido céfalo-raquidiano (LCR) (HOLSBOER, 1996).
Algumas dessas ações nocivas dos hormônios adrenais são mediadas por
aminoácidos excitatórios (GILAD et al., 1990; MOGHADDAM, 1993; MAGARIÑOS &
MCEWEN, 1995). Muitas destas mudanças dependem da transcrição dos genes e
síntese de proteínas envolvidas na plasticidade neural e sináptica, haja visto que o
estresse regula fatores neurotróficos, tais como o fator neurotrófico derivado do
cérebro (BDNF) e neurotrofina 3 (NT3) no hipocampo (SMITH et al., 1995). O
estresse induz mudanças na expressão destas proteínas, como a sinaptofisina e
sinaptogmina, contribuindo para a base molecular das mudanças induzidas na
plasticidade sináptica do hipocampo, associadas com o comportamento e alterações
cognitivas (THOME et al., 2001).
Os efeitos do estresse são mediados principalmente pelos glicocorticóides que
têm funções paradoxais no cérebro. Enquanto níveis basais de glicocorticóides são
essenciais para o desenvolvimento neuronal, plasticidade e sobrevivência, níveis de
estresse podem aumentar a vulnerabilidade dos neurônios aos insultos metabólicos,
54
potencialmente por alterarem a capacidade de defesa neuronal contra o dano
oxidativo (DESOLE et al., 1994).
Algumas ações dos hormônios do estresse podem ser mediadas via liberação
de mediadores secundários. Tem se investigado um possível papel do óxido nítrico
como mediador da injúria induzida pelo estresse (Leza et al., 1998) Evidências tem
sido apresentadas a cerca do papel do óxido nítrico em alguns processos patológicos
no SNC. De fato, uma geração excessiva de óxido nítrico tem sido demonstrada na
epilepsia, dano isquêmico-hipóxico e desordens neurodegenerativas, incluindo
doenças de Alzheimer e de Parkinson e coréia de Huntington (Moncada et al., 1991).
Os mecanismos de indução iNOS (óxido nítrico sintase) durante o estresse ainda
devem ser elucidados, porém foi mostrado em alguns trabalhos que muitos indutores
da iNOS como citocinas são liberados no cérebro do animal estressado (Shintani et
al. 1995).
O estresse leva a múltiplas transformações morfológicas e eletrofisiológicas no
hipocampo de humanos e animais induzindo a alterações significativas de
comportamento (Foy et al 1987; Kim and Yoon 1998; Magariños et al 1997; Xu et al
1997). Estudos com modelos animais têm por objetivo avaliar as mudanças
comportamentais e fisiológicas sob estresse crônico. No modelo de estresse de
imobilização, os animais são mantidos imobilizados em tubos plásticos diariamente
durante algumas horas (LUINE et al., 1994). Este modelo possui elementos
psicogênicos nele que não promovem sofrimento físico, mas de forma diferente, é
uma forma de estressor puramente psicogênico, nele a restrição envolve um
componente físico que limita a resposta/estilo defensivo do animal (MCINTYRE et al.,
1999). A combinação de componentes psicológicos e neurogênicos sugere que o
estresse de imobilização pode resultar em mudanças neuroquímicas e funcionais
generalizadas no cérebro (BOWMAN et al., 2003). No hipocampo do rato, a
corticosterona tem mostrado regular o metabolismo neuronal, funções fisiológicas,
expressão dos genes e alterações na morfologia celular. Consequentemente, certas
funções hipocampais (como aprendizado e memória) parecem ser suscetíveis ao
estresse incontrolável (WALESIUK et al., 2005).
55
ESTRESSE E MEMÓRIA
O domínio das funções da memória é mediado pelo hipocampo e regiões
corticais vizinhas anatomicamente associadas. Isto foi descoberto a cerca de 50 anos
atrás, com um estudo de caso de um homem (H.M.) que sofreu amnésia após a
remoção do lobo temporal medial para alívio de crises epiléticas. (SCOVILLE &
MILNER, 1957). O hipocampo é uma estrutura localizada no lobo temporal medial que
é necessária para a formação da memória declarativa (ou explícita) em humanos e a
memória espacial (ou relacional/contextual) em roedores (EICHENBAUM, 2000 &
MOSER et al., 1998).
Estudos recentes sugerem que o hipocampo e o córtex pré-frontal são
prováveis candidatos a responsáveis pelas memórias dependentes do contexto no
cérebro (RASCH et al,.2007). Ambas estas duas estruturas expressam uma alta
densidade de receptores para glicocorticóides, hormônios liberados pelo córtex da
adrenal em resposta ao estresse, e são altamente sensíveis ao estresse (WOLF,
2008). Funções da memória que dependem da integridade do hipocampo e córtex
frontal, como a memória espacial ou memória de trabalho, muitas vezes são
prejudicadas quando o estresse ou o cortisol são administrados antes do aprendizado
(SCHWABE et al., 2009).
A exposição ao estresse agudo leva a ativação do eixo hipotalâmico-
hipofisário-adrenal (HPA), e em conseqüência disso, há a liberação de adrenalina e
glicocorticóides da glândula adrenal. Uma vez liberados, adrenalina e glicocorticóides
podem produzir uma variedade de efeitos periféricos, variando do aumento nas
atividades cardiovasculares à diminuição da função gastrintestinal e imunológica e
aumento da mobilização de energia. Hormônios do estresse também desempenham
funções críticas no SNC, incluindo facilitação e consolidação de fortes memórias
emocionais que envolvem ligação de glicocorticóides aos receptores nas regiões
límbicas como o hipocampo e a amígdala. Ao contrário do estresse agudo, a
exposição ao estresse crônico leva a uma disfunção nos níveis de glicocorticóides e
56
eixo HPA que mediam estados patológicos periféricos e no SNC (REAGAN et al.,
2008). Em nível comportamental, a exposição ao estresse crônico tem demonstrado
aumentar comportamentos relacionados à ansiedade, bem como prejudicar o
aprendizado e memória (LUINE et al., 1994; FILE, 1980).
Um grande número de mudanças fisiológicas induzidas pelo estresse têm sido
observadas no hipocampo, incluindo alterações na morfologia da plasticidade
sináptica neuronal, neurotoxicidade e neurodegeneração em adultos (SAPOLSKY,
1984). Em um estudo com um modelo animal de estresse crônico, Magarinõs et
al.(1997), demonstraram que a aplicação do estresse de imobilização durante três
semanas causou atrofia de dendritos na região CA3 do hipocampo. McEwen (2000)
fez uma extensa análise dos efeitos do estresse crônico e da administração de
corticosterona sobre a morfologia dos dendritos e também observou que três
semanas de estresse levava a atrofia dos dendritos na região CA3 do hipocampo. Um
estudo recente realizado por Lee e colegas (2009), utilizando ressonância magnética
estrutural (MRI), demonstrou que o estresse crônico produziu aproximadamente cerca
de 3% de redução do volume hipocampal.
57
II. RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA
A doença de Parkinson (DP) é a segunda desordem neurodegenerativa mais
comum, afetando 1 a 2% da população com mais de 60 anos (DE LAU & BRETELER,
2006). Existe um grande interesse na descoberta de novos agentes
antiparkinsonianos que consigam bloquear ou mesmo reverter o processo de
neurodegeneração. Além disto, sabe-se que a doença de Parkinson no decorrer da
sua evolução leva muitos dos pacientes ao estado de depressão. A depressão na
doença de Parkinson (DP) é comum e afeta 38.33% e 24% de brasileiros com a
doença (PRADO et al., 2005; TUMAS et al., 2008), entretanto a etiologia desta
depressão é desconhecida. Evidências sugerem que mudanças bioquímicas, fatores
fisiológicos, fatores estressantes e fatores genéticos podem contribuir para o seu
desenvolvimento (GOTHAM et al., 1986; MAYEUX et al.,1990; CASPI, 2003; LE PEN
et al., 2008). Indiferente das causas, a depressão afeta adversamente a qualidade de
vida dos pacientes com DP.
Vários estudos tem demonstrado os efeitos protetores de plantas fenólicas
contra o dano cerebral na DP. Os efeitos neuroprotetores destes compostos são
atribuídos em parte à remoção de radicais livres, à quelação de ferro/metais e às suas
atividades antiinflamatórias (SUN et al., 2008; VAFEIADOU et al., 2007). As
catequinas do chá verde, que são polifenóis, tem ganhado importância por
demonstrarem exercer um papel protetor no processo de neurodegeneração, agindo
diretamente como removedores de EROs e exercendo efeitos antioxidantes indiretos
através da ativação fatores de transcrição e enzimas antioxidantes (MANDEL, 2005;
SRIVIDHYA et al., 2008; ASSUNÇÃO et al., 2010). A catequina, que é um dos
membros desta família de flavonóides, foi capaz de proteger da morte neuronal
culturas de células mesencefálicas expostas à 6-OHDA (NOBRE JÚNIOR et al.,
2003). Poucos estudos existem acerca das propriedades neuroprotetoras deste
composto in vivo.
Considerando-se que a Doença de Parkinson está frequentemente associada
58
à depressão e que esta seria agravada por fatores como o estresse crônico,
resolvemos investigar esta associação em um modelo experimental de DP em ratos .
Por um outro lado, o interesse por novas terapias capazes de reverter o processo
neurodegenerativo, nos levou a investigar o papel da catequina na DP experimental
com a neurotoxina 6-OHDA, avaliando através de testes comportamentais, a
memória, a locomoção e a coordenação motora, bem como, através de um estudo
imunohistoquímico a análise e quantificação dos possíveis efeitos neuroprotetores do
flavonóide catequina e dos efeitos do estresse de imobilização subcrônico.
59
III. OBJETIVOS
Objetivos Gerais
Este trabalho objetiva primeiramente estudar o efeito neuroprotetor da
catequina, uma substância conhecida por possuir propriedades antioxidantes, em
ratos com lesão estriatal produzida pela 6-hidroxidopamina (6-OHDA), num modelo
experimental de DP, sendo analisado sob o ponto de vista comportamental, os efeitos
motores, a memória e depressão; e neuroquímico, como a liberação de dopamina e
serotonina, o estresse oxidativo, a inflamação e o dano neuronal. Em uma segunda
etapa vamos estudar os efeitos do estresse de imobilização subcrônico em animais
submetidos a lesão estriatal com a 6-OHDA .
Objetivos Específicos
- Reproduzir o modelo de parkinsonismo em ratos, pela injeção intra-estriatal
de 6-OHDA, induzindo alterações motoras e dano neuronal na substância
negra e corpo estriado;
- Avaliar o potencial neuroprotetor da catequina, um flavonóide, sobre a lesão
estriatal e do mesencéfalo induzida pela 6-OHDA em ratos;
- Avaliar o potencial neuroprotetor da catequina, sobre os efeitos motores, na
memória e comportamento depressivo induzido pela 6-OHDA em ratos;
- Avaliar as alterações nos sistemas de neurotransmissores envolvidos no
processo neurodegenerativo da DP, através da determinação das
concentrações de monoaminas e de seus metabólitos.
60
- Avaliar efeito da catequina sobre a peroxidação lipídica, produção de nitrito e
glutationa redutase, induzida pela 6-OHDA em ratos;
- Avaliar a influência do estresse psicossocial (estresse de imobilização) sobre
a lesão estriatal e mesencefálica induzida pela 6-OHDA em ratos;
- Estudar a influência do estresse de imobilização, usando o modelo de
parkinsonismo em ratos, avaliando os efeitos motores, na memória, e
comportamento depressivo;
- Estudar a influência do estresse de imobilização, usando o modelo de
parkinsonismo em ratos, avaliando seus efeitos antioxidantes na
peroxidação lipídica, liberação de nitrito e glutationa redutase;
61
IV. Material e Métodos
1. ANIMAIS
Ratos Wistar machos sadios, pesando entre 200-250g, provenientes do
Biotério Central da UFC, foram usados no presente estudo. Os animais foram
mantidos sob condições de temperatura e umidade controladas, num ciclo de doze
horas claro/escuro, com livre acesso à alimentação e à água.
Os protocolos experimentais seguiram as recomendações do Colégio Brasileiro
de Experimentação Animal (COBEA), e foram aprovados pelo Comitê de Ética em
Pesquisa Animal da Universidade Federal do Ceará (UFC), nº do protocolo 29/05.
2. DROGAS/REAGENTES
As seguintes drogas foram utilizadas: Catequina (Sigma USA), 6-
hidroxidopamina (Sigma USA), ácido ascórbico, apomorfina (Sigma USA), padrões de
aminoácidos e monoaminas (Sigma USA), quetamina (König Argentina), xilazina
(König Argentina).
3. PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS
Os animais foram divididos em 10 grupos, cada um com 10 animais, da
seguinte forma:
62
3.1 PROTOCOLO 1 – Ratos tratados com catequina
Tabela 1- Tratamento com catequina.
Grupos
Tratamento
1 Falso-operado (salina i.p.), durante 16 dias
2 6-OHDA (21 μg/3μL, intra estriatal) + salina, i.p., 16dias
3 Catequina (10 mg/kg, i .p.), 16 dias
4 Catequina, (30 mg/kg, i.p.), 16 dias
5 6-OHDA (21 μg/3μL, intra estriatal) + catequina(10mg/kg, i.p.),
16 dias
6 6-OHDA (21 μg/3μL, intra estriatal) + catequina (30 mg/kg,
i.p.), 16 dias
Os animais foram submetidos à lesão nigroestriatal com injeção estereotáxica
de 6-OHDA e tratados com catequina nas doses de 10 e 30mg/kg durante 146 dias.
Decorridos 14 dias após a cirurgia, todos os animais foram submetidos a testes
comportamentais. Após a realização destes testes, os animais foram sacrificados
para a realização de testes bioquímicos e imunohistoquímicos (figura 3).
A catequina foi dissolvida em água destilada e administrada nas duas doses
por via intraperitoneal (ip) a partir do dia da cirurgia até o último teste compo rtamental
(aproximadamente 16 dias).
63
Figura 3. Protocolo Experimental 1.Os animais sofreram a lesão estriatal pela
6-OHDA (ou foram falso-operados) no primeiro dia e começaram a ser tratados neste
mesmo dia. No 14º dia. Os animais foram submetidos ao teste do campo aberto, y-
maze e esquiva passiva. No 15º dia os animais foram submetidos à segunda parte do
teste da esquiva passiva e no 16º dia foram submetidos ao teste de rotacional, sendo
sacrificados e seus cérebros ou dissecados ou perfundidos para posterior análise
imunohistoquímica.
64
3.2 PROTOCOLO 2 – Ratos tratados com catequina e submetidos a estresse de
imobilização subcrônico.
Tabela 2- Estresse de imobilização
Grupos Tratamento
1 Falso-operado (salina i.p.)
2 Falso-operado + Estresse de imobilização (11dias)
3 6-OHDA (21 μg/3μL, intra estriatal)
4 6-OHDA (21 μg/3μL, intra estriatal) + Estresse de imobilização
(11 dias)
Os animais foram submetidos à lesão nigroestriatal com injeção estereotáxica
de 6-OHDA e submetidos a sessões diárias de estresse de imobilização durante 6
horas. Decorridos 14 dias após a cirurgia, todos os animais foram submetidos a testes
comportamentais. Após a realização destes testes, os animais foram sacrificados
para a realização de testes bioquímicos e imunohistoquímicos (figura 4).
65
Figura 4. Protocolo experimental 2. Os animais sofreram a lesão estriatal pela
6-OHDA (ou foram falso-operados) no primeiro dia. No 4º dia, estes animais iniciaram
sessões diárias de estresse de imobilização. No 14º dia. Os animais foram
submetidos ao teste do campo aberto, y-maze e esquiva passiva. No 15º dia os
animais foram submetidos à segunda parte do teste da esquiva passiva e no 16º dia
foram submetidos ao teste de rotacional e nado forçado, sendo sacrificados e seus
cérebros ou dissecados ou perfundidos para posterior análise imunohistoquímica.
66
3.3 CIRURGIA ESTEREOTÁXICA – (UNGERSTEDT,1968)
Os procedimentos de lesão do corpo estriado foram realizados através de
cirurgia estereotáxica. Os animais do grupo falso-operado foram submetidos aos
mesmos procedimentos cirúrgicos, no entanto, não receberam a neurotoxina 6 -
OHDA, sendo somente introduzida à agulha nas mesmas coordenadas
estereotáxicas, seguido de infusão de salina estéril e veículo (ácido ascórbico a 1%).
Os animais foram anestesiados com xilazina (20 mg/kg via intraperitoneal) e
quetamina (100mg/kg via intramuscular) e posicionados no aparelho estereotáxico
(Stoelting). Foi realizada uma incisão de aproximadamente 2 cm de comprimento com
um bisturi, no alto do crânio, expondo-se as suturas ósseas cranianas, com o objetivo
de localizar o bregma.Três cordenadas de acesso ao corpo estriado foram marcadas,
com uma caneta, de acordo com o atlas de Paxinos e Watson (1984). O modelo
experimental de lesão do corpo estriado com a 6-OHDA foi proposto por Ungerstedt
(1968). Foram feitas perfurações nos crânios dos animais com uma broca de baixa
rotação (Dremel), permitindo entrada da seringa Hamilton com a 6-OHDA diretamente
no corpo estriado. As lesões foram feitas unilateralmente, apenas no hemisfério direito
dos animais. Os animais receberam 3 microinjeções de uma seringa Hamilton
contendo 6-OHDA na dose de 7µg/µL por cada sítio. Os sítios onde a lesão foi
realizada situavam-se nas coordenadas descritas na tabela 3. Após as injeções, os
animais tiveram sua pele suturada.
67
Coordenadas
Estriatais
1ª 2ª 3ª
Antero-posterior +0,5 -0,5 -0,9
Medio-lateral -2,5 -3,0 -3,7
Dorso-ventral -5,0 -6,0 -6,5
Tabela 3. Sítios das lesões estriatais unilaterais com a 6-OHDA (segundo
Paxinos & Watson, 1984).
3.4 Estresse de Imobilização (Restraint stress) (LUINE ET AL., 1994)
Este é um modelo de estresse psicossocial, que induz um comportamento
depressivo no animal. Os animais foram submetidos ao estresse de imobilização
durante doze dias, começados três dias após a cirurgia. Os animais foram colocados
em contensores cilíndricos de acrílico, medindo 22 cm de comprimento, 8,5 cm de
largura e 5 cm de raio (figura 6), perfurados para ventilação durante um período de
seis horas diariamente (10:00 às 16:00hrs).
3.5 Testes Comportamentais
Após 14 dias do início do tratamento, os animais foram submetidos a testes de
comportamento para avaliar a atividade locomotora, memória e severidade da
degeneração nigroestriatal. Os testes empregados foram o do campo aberto, labirinto
em Y, esquiva passiva e apomorfina.
68
3.5.1 Avaliação da atividade locomotora (teste do Campo Aberto)
(BROADHURST, 1957)
Neste teste é possível avaliar a atividade exploratória do animal. Foi usado o
modelo do Campo Aberto (Open Field). O teste foi realizado 24h após o fim do
tratamento com a catequina. O campo aberto consiste de uma arena quadrada (50 x
50 cm), iluminada com luz vermelha (figura 7). O piso da arena é dividido em 4
quadrados iguais. No teste, os animais foram colocados na arena e deixados para
explorar o ambiente por 5 minutos, durante este período foi registrado o número de
quadrantes atravessados pelo animal (crossing). Também foi avaliado o número de
vezes que o animal se levantou para explorar o ambiente, mantendo-se suspenso
apenas pelas patas traseiras, caracterizando o comportamento exploratório do tipo
rearing. A arena foi limpa com álcool a 20% após cada animal ser retirado, para evitar
que o cheiro de urina e fezes interferissem no teste.
Figura 5. Arena do teste de campo aberto dividido em quatro quadrantes iguais.
(Fontenele Filho, 2009)
69
3.5.2 Labirinto em Y (Y-maze) (SARTER ET AL., 1988)
Esse teste avalia a memória operacional (working memory) e o aprendizado. O
labirinto em Y consiste de uma caixa acrílica com 2mm de espessura, altura 34,5 cm,
com cada braço medindo 75,5 cm de comprimento e 11,7 cm de largura (figura 8).
Neste teste, o animal foi colocado em um braço e alternou espontaneamente as
entradas nos outros braços durante 8 minutos. Todas as entradas em cada braço
foram sequencialmente anotadas, assim o número total de entradas em cada baço,
bem como a seqüência de entradas, foram registradas. As informações fora m
analisadas para determinar o número de entrada do braço sem repetição. Os dados
foram expressos como a porcentagem de alternância nos braços sem repetição. O
sucesso do teste é indicado pela alta taxa de alternância nos grupos controle,
indicando que os animais podem se lembrar em qual braço eles entraram por último.
O resultado é expresso em porcentagem e obtido através de uma fórmula matemática
(alternações espontâneas % = nº de acertos/total – 2 X 100). Entre cada sessão, o
labirinto foi higienizado com uma solução de álcool a 20% e secado com toalhas de
papel.
Figura 6. Labirinto em Y. Fonte: http://www.bpc.northwestern.edu/assays.html
70
3.5.3 Esquiva passiva (Passive avoidance test) (BASEADO EM DeNOBLE ET AL.
1986)
O teste tem como objetivo, avaliar a a memória aversiva. Após 14 dias da lesão
com 6-OHDA e tratamento com a catequina (ou estresse de imobilização), os animais
foram habituados ao aparelho de esquiva passiva (UGO BASILLE 21025). O aparelho
consiste de uma caixa de acrílico (48 x 22 x 22), dividida em dois compartimentos
separados por uma porta, um branco (i luminado) e um preto (escuro), este tem o piso
eletrificado.
O animal foi deixado para ambientação no aparelho durante um 1 minuto, e
retirado. Após 30 segundos foi colocado no compartimento iluminado. A tendência de
o animal preferir o ambiente escuro faz com que, ao passar para este compartimento,
o mesmo recebesse um choque de 1,0 mA, durante 1s, com o tempo de latência para
entrar sendo registrado, até um máximo de 300 segundos (treino). O animal foi
retirado e após 15 minutos, foi colocado novamente no compartimento claro sendo
registrada a latência de entrada (memória recente). A retenção do aprendizado foi
testada após 24h, quando os animais foram colocados no compartimento claro e o
tempo de latência para a entrada no escuro foi registrado (os animais nesta fase não
levaram choque) (memória tardia).
3.5.4 Nado Forçado (PORSOLT et al., 1978)
Este modelo experimental é utilizado para o estudo da atividade depressiva.
Neste teste, roedores foram submetidos a um período de nado forçado, uma situação
inescapável de estresse como o objetivo de identificar se os animais estavam em
estado depressivo. Eles foram colocados em um cilindro de acrílico (40cm de altura e
20cm de diâmetro) (figura 9), contendo 20 cm de água por 6 minutos. O tempo de
imobilização (apenas com pequenos movimentos que os impediam de submergir) foi
71
registrado.
3.5.5 Teste Rotacional (UNGERSTEDT, 1976)
A severidade da depleção de dopamina foi avaliada pelo comportamento
rotacional. Este é um teste sensível para lesões estriatais com extensões maiores que
80%. (Deumens et al., 2002) (figura 10).
Após 15 dias da lesão estriatal, foi injetada uma dose de 3mg/kg de apomorfina
i.p. (Sigma, dissolvidos em salina) em cada animal, estes foram colocados por 60
minutos em bacias plásticas. O comportamento rotacional foi observado e
determinado através do monitoramento das rotações induzidas pela apomorfina, tanto
no número de rotações na direção contrária à lesão(lado contralateral), quanto no
número de rotações na direção da lesão (ipsilaterais).
72
Apomorfina
Dopamina
Receptor de dopamina
Figure 7. Representação da perda parcial de receptores de neurônios
dopaminérgicos nigroestratais. O animal roda para o lado que estiver com menos
receptores devido a uma assimetria nos hemisférios cerebrais, decorrente de uma up
regulation dos receptores dopaminérgicos no lado lesionado (adaptado de
Wietzikoski, 2006).
73
4. Avaliação imunohistopatológica
Após os testes, os animais foram subdivididos dentro dos grupos e sacrificados
para a realização das análises bioquímicas ou imunohistológicas. Para a realização
das análises imunohistopatológicas, os animais foram perfundidos
transcardiacamente com paraformaldeído a 4%, os cérebros dissecados, fixados em
formol a 10%, fatiados (20μm) e montados em lâminas gelatinizadas. Foi realizada a
imunohistoquímica para tirosina hidroxilase e transportador de dopamina (DAT).
4.1 Imunohistoquímica para Tirosina Hidroxilase
A Tirosina hidroxilase (TH) é uma enzima envolvida na síntese de dopamina e
um marcador molecular de neurônios dopaminérgicos. Na doença de Parkinson há
uma deficiência de TH, assim como baixos níveis de dopamina. A detecção
imunohistoquímica foi realizada sobre cortes mesencefálicos e estriatais. Para
examinar a extensão da desnervação presente na substância negra, a
imunorreatividade a TH foi avaliada. Os cortes montados em lâminas gelatoinizadas
foram lavados três vezes com 0.05 M Tris buffer (TBS; pH 7.6), o bloqueio da
peroxidase foi feito com H2O2 a 3% diluído em TBS por 30min, e depois lavados 3
três vezes em água corrente. Após a pré-incubação com albumina bovina a 5% (BSA)
+ Triton a 3% (1hora), os cortes foram incubados com o anticorpo primário (1:500),
anti-TH (Calbiochem, Nottingham, United Kingdom) em soro de cabra a 2% durante
48 horas a 4°C. Após três lavagens com TBS, os cortes foram incubados com o
anticorpo secundário (Kit Dako) por 40 minutos e lavados novamente três vezes com
TBS. O cromógeno DAB foi diluído no tampão DAB específico do kit e aplicado sobre
as lâminas. Aguardou-se de 3 a 5 minutos até se obter uma coloração marron. As
lâminas foram montadas em um meio de montagem aquoso e uma base selante foi
aplicada.
74
4.2 Imunohistoquímica para DAT
DAT é o transportador transmembrana de dopamina que fica localizado na
terminação nervosa pré-sináptica, onde é responsável por finalizar a atividade
de dopamina através da recaptação pré-sináptica desse neurotransmissor, ou seja, o
transporte de dopamina para o sítio pré-sináptico (recaptação). Os receptores
dopaminérgicos parecem apresentar alterações na DP. A perda de dopamina
mesencefálica na doença de Parkinson é acompanhada de uma perda de
DAT (Rachakonda et al., 2004). O procedimento segue o mesmo para TH, sendo o
anticorpo anti-DAT diluído em 1:100.
5. Análises Bioquímicas
5.1 Dosagem de Nitrito (GREEN ET AL. 1981)
5.1.1 Método
O reativo de Griess (N-1-naftiletilenodiamina a 0,1% em água bidestilada,
sulfanilamida 1% em ácido fosfórico 5%) revela a presença de nitrito em uma amostra
(urina, plasma, homogenato tecidual) por uma reação de diazotização que forma um
cromóforo de cor róseo, com um pico de absorbância em 560 nm.
5.1.2 Reagentes
Ácido Fosfórico 5%
Sulfoni lamide 1%
NEED (N-1-naftiletilenodiamina) 0,1% - C10H14N22HCL
75
5.1.3 Preparação do Reagente de Griess
1volume de ác. fosfórico 5%
1 volume de sulfonilamida 1% em ac. fosfórico 5%
1 volume de NEED 0,1%
1 volume de água destilada.
5.1.3 Curva Padrão
Solução estoque de NaNO2 (10mM em tampão). Pesar 6,9mg e dissolver em
10mL de água destilada. Foram feitas diluições em série e usadas na obtenção da
curva padrão (100; 50; 25; 12,5; 6,25; 3,12; 1,56; 0,76 μM).
5.1.4 Protocolo
Para realização do ensaio foram usados 100 μL do reagente de Griess e
adicionados 100 μL do sobrenadante (amostras previamente centrifugadas) do
homogenato a 10% do corpo estriado e mesencéfalo dos ratos em salina ou 100 μL
μos padrões nas várias concentrações. Para o branco foram usados 100 μL do
reagente de Griess e adicionados 100 μL de salina. A leitura da absorbância foi feita
em 540 nm em leitor de placa. As leituras da absorbância dos padrões (y) foram
plotadas contra a concentração de cada padrão (x), então se determinou a equação
da reta, que foi usada para a determinação da concentração de nitrito em cada
amostra.
76
5.2 Dosagem da enzima superóxido dismutase - SOD (BEAUCHAMP;
FRIDOVICH, 1971)
A atividade da enzima superóxido dismutase (SOD) foi avaliada medindo-se
sua capacidade de inibir a redução fotoquímica do azul de nitrotetrazolio (NBT).
Nesse método a riboflavina reduzida fotoquimicamente gera O2-, o qual reduz o NBT,
produzindo formazam, que absorve no comprimento de onda de 560 nm. Na presença
de SOD, a redução do NBT é inibida. Os resultados foram expressos em unidades da
enzima, que é a quantidade de SOD necessária para inibir a taxa de redução do NBT
em 50%. O homogenato (10% em tampão fosfato) foi centrifugado (dez minutos 3600
rotações por minuto-rpm a 4°C). O sobrenadante foi retirado e centrifugado
novamente (20 min 12000 rpm 4°C). Para o ensaio, foi utilizado o sobrenadante.
Numa câmara escura, foram misturados 1 mL do meio de reação (tampão fosfato 50
mM, EDTA 100 nM e L-metionina 13 mM pH 7,8), 150 μL do NBT 75 μM, 300 μL
riboflavina 2 μM e 20 μL da amostra ou do tampão uti lizado para o preparo dos
homogenatos. Os tubos contendo a solução obtida foram expostos a lâmpadas
fluorescentes (15W) por 15 minutos. Ao término do tempo o material foi lido em
espectrofotômetro 560 nm.
5.3 Determinação da Peroxidação Lipídica -- TBARS (DRAPER; HADELY, 1990)
A atividade antioxidante foi medida pela dosagem das substâncias reativas ao
ácido tiobarbitúrico (TBARS). Os tecidos mesencefálicos e estriatais foram
homogeneizados a 10% em tampão fosfato 50 mM (pH 7,4) gelado. Duzentos e
cinquenta microlitros (250 µL) do homogenato foram incubados no banho de água a
temperatura de 37ºC por uma hora. Após a incubação, 400 µL de ácido perclórico
(35%) foram adicionados para interromper a peroxidação e centrifugados a 12000
rotações por minuto (rpm) 4ºC por dez minutos. Em seguida, 600 µL do sobrenadante
foram retirados, tendo-se adicionado mais 400 µL de ácido tiobarbitúrico a 0,6%. A
mistura foi levada ao banho de água por 30 minutos a uma temperatura variável de 95
- 100ºC. A solução foi então retirada e colocada para esfriar. Após isso, foi feita a
leitura em 532 nm. A curva-padrão foi obtida mediante da leitura de várias
77
concentrações de malonaldeído (MDA)-padrão.
5.4 Dosagem de GSH
Glutationa, um tripeptídeo (g-L-glutamil-L-cisteinil-glicina), existe no organismo
em suas formas reduzida (GSH) e oxidada (GSSG), atuando direta ou indiretamente
em muitos processos biológicos importantes, incluindo metabolismo e proteção
celular. Em particular, problemas na síntese de glutationa estão associados a algumas
doenças, nas quais os níveis de glutationa e enzimas que atuam no seu metabolismo
podem ser significativos na avaliação do estresse oxidativo. Mudanças na
concentração deste tripeptídeo podem ser um indicador útil em certas desordens
fisiológicas como alterações dos estados antioxidantes (Meister & Anderson, 1983).
Reagentes
EDTA 0,05M
1. Pesou-se 465mg;
2. Adicionou-se cerca de 20mL de água destilada;
3. Para dissolver o material foi aquecido
4. Depois de dissolvido foi completado o volume até 25mL
Tris 0,4M +EDTA 0,02M
1. Pesou-se 1,212g de Tris;
2. Adicionou-se 10mL de EDTA 0,05M e cerca de 10mL de água
destilada;
3. Ajustou-se o pH 8,9;
4. Completou-se o volume até 25mL.
78
Ácido Tricloroacético (TCA) 50%
Foi diluído 2x o ácido puro (6,1N).
DTNB 0,01M
1. Pesou-se 5,94mg de DTNB;
2. Dissolveu-se em 1,5mL de metanol;
3. Preparou-se no dia do uso;
4. Armazenou-se fechado e protegido da luz.
PREPARO DA CURVA PADRÃO:
1. Pesou-se 5mg de GSH;
2. Foi diluído em 5mL de água destilada (1mg/mL);
3. Foi diluída a solução 1mg/mL 10x
50µL da 1mg/mL + 450µL de tampão (100µg/mL);
Procedimento Experimental
A determinação da concentração da GSH é realizada em placa de ELISA
(método SEDLAK & LINDSAY, 1968 modificado). Baseia-se na reação do reagente
de Ellman, o 5,5'-ditiobis (ácido 2-nitrobenzóico) (DTNB) com o tiol livre originando um
dissulfeto misto mais ácido 2-nitro-5-tiobenzóico. O preparo das amostras foi feito da
seguinte forma: 40µL de cada amostra (homogenato do tecido a 10% em tampão
fosfato) foi adicionada a um eppendorf + 50µL de água destilada + 10µL de TCA
(ácido tricloro acético) 50%. As amostras foram centrifugadas a 3000 rpm por 15min,
à temperatura de 4ºC. Os sobrenadantes foram separados. Adicionou-se 60µL dos
sobrenadantes à placa de ELISA (mantida resfriada), assim como os brancos. O
material permaneceu resfriado durante todo o ensaio. Imediatamente antes da leitura,
a este foi adicionado o tampão fosfato + 0,65mL de DTNB. Adicionou-se 102µL desta
solução em cada poço da placa. A medida do produto de reação formado foi feita a
leitura da absorbância a 412 nm. A concentração da glutationa reduzida foi expressa
em μg de GSH por grama de tecido.
79
5.5 Dosagem de Glicose
A glicemia foi dosada pelo método enzimático da glicose-oxidase - kit glicose
pap liquiform (Labtest).
As amostras de sangue foram coletadas após as sessões de estresse de
imobilização subcrônico através do plexo retro-orbital, separadas em alíquotas em
microtubos, centrifugadas (4000rpm/10min) imediatamente após a colheita, sendo o
plasma separado.
No plasma, foi realizada a análise da concentração de glicose através do
método glicose-oxidase. As amostras (1ml) de plasma foram incubadas em banho-
maria por 15 minutos a 37ºC e depois 100μL adicionadas à placa de ELISA. As
leituras do teste e padrão foram feitas em 505nm no leitor de placas, acertanto o zero
com o branco .
80
5.6 Determinação de monoaminas e metabólitos com HPLC (AGUIAR, 2006).
Método
Para a determinação dos níveis de catecolaminas foi utilizado o equipamento
HPLC (High Performance Liquid Chromatography). Na cromatografia líquida clássica,
um adsorvente (alumina ou sílica) é empacotado em uma coluna e é eluído por um
líquido ideal (fase móvel). Uma mistura para ser separada é introduzida na coluna, e é
carregada através da mesma por um líquido eluente. Se um composto da mistura
(soluto) é adsorvido fracamente pela superfície da fase sólida estacionária, ele
atravessará a coluna mais rapidamente que um outro soluto que seja mais
rapidamente adsorvido. Então, a separação dos solutos é possível se existem
diferenças na adsorção pelo sólido. Os detectores eletroquímicos medem a
condutância do eluente, ou a corrente associada com a oxidação ou redução dos
solutos. Para ser capaz de detectar, no primeiro caso os solutos devem ser iônicos, e
no segundo caso, os solutos devem ter a característica de serem relativamente fáceis
de se oxidarem ou reduzirem.
Detectores eletroquímicos que medem corrente associada com a redução ou
oxidação de solutos são chamados detectores amperimétricos ou coulométricos.
Neste estudo, foi utilizado o tipo amperimétrico que reage com uma quantidade muito
menos de soluto, em torno de 1%. Todas as técnicas eletroquímicas envolvem a
aplicação de um potencial para um eletrodo (geralmente de carbono vítreo), oxidação
da substância que está sendo estudada próximo à superfície do eletrodo, seguindo a
amplificação e medida da corrente produzida. As catecolaminas são oxidadas nos
grupos de anel hidroxil para produzir um derivado ortoquinona com a liberação de
dois elétrons.
81
Procedimento Experimental
O corpo estriado e o mesencéfalo foram utilizados para preparar homogenatos
a 10% respectivamente. Os tecidos cerebrais foram sonicados em ácido pérclórico
(HCLO4) por 30 segundos e centrifugados por 15 minutos em centrífuga refrigerada a
15000 rpm. O sobrenadante foi separado e filtrado através de uma membrana
(Millipore- 0,2μm) e uma alíquota de 20μl foi retirada e injetada no equipamento de
HPLC para a análise eletroquímica.
Para a análise das monoaminas, uma coluna CLC-ODS (M) com comprimento
de 25cm, calibre 4,6mm e diâmetro da partícula de 3μm da (Shimadzu, Japão) foi
utilizada. A fase móvel foi composta por tampão ácido cítrico 0,163M, pH3,0, contendo
ácido octasulfônico sódico, 0,69M (SOS), como reagente formados do par iônico,
acetonitri la 4% v/v. Dopamina (DA), Ácido homovalínico (HVA), Serotonina (5-HT) e
Ácido diidroxifeni lacético (DOPAC), Ácido homovalínico (HVA), Serotonina (5-HT) e
Ácido 5-hidroxiindolacético (5-HIAA) foram eletricamente detectados usando um
detector amperométrico (Modelo L-ECD-6A da Shimadzu, Japão) pela oxidação em
um eletrodo de carbono vítreo fixado em 0,85V relativo a um eletrodo de referência de
Ag-AgCl.
Soluções Reagentes
Foram pesados 15,75g de ácido cítrico (Grupo Química, RJ, Brasil) e
completado para um volume de 400mL com água puríssima (Milli -Q). Esta solução foi
ajustada para pH 3,0 com hidróxido de sódio 12,5M (Reagen, RJ, Brasil). A esta
solução foi adcicionado o ácido octasulfônico sódico 75g (Sigma, MO, EUA) e
completado o volume para 471,5mL com água Milli-Q. Em seguida, procedeu-se a
filtração e degaseificação, e, posteriormente, adicionados 20mL de acetonitri la( Carlo
Erba Reagenti. MI, Itália) e 10ml de tetrahidrofurano (Sigma, Mo, EUA) para um
volume final de 500mL.
82
Ácido Perclórico
Foram adicionados 1,8ml de ácido perclórico (Sigma,MO, EUA) em um balão
volumétrico e completado o volume para 300 mL.
Padrões
Os padrões foram preparados em uma concentração final de 4ng de DA, 5-HT,
DOPAC, HVA e 5HIAA. A partir da área dos picos desses padrões, as concentrações
das amostras foram calculadas e os resultados expressos em ng/g de tecido.
6. Análise Estatística
Foram feitos testes não paramétricos para a análise estatística dos testes
comportamentais. O programa de computador usado foi o Graph Pad Instat ® 3.0.
Para ensaios bioquímicos foram feitos ANOVA e o teste de Tukey. Com o critério de
significância de p < 0,05.
83
V RESULTADOS
1. Efeito da Catequina nas doses de 10 e 30mg sobre a lesão estriatal com 6-
OHDA em ratos.
1.1 Determinação da atividade locomotora através do teste do campo aberto
em ratos com lesão estriatal tratados com catequina.
Para examinar a existência de um possível efeito neuroprotetor mediado pela
catequina, foram realizados experimentos para determinar os parâmetros motores.
Após 14 dias da lesão estriatal com a 6-OHDA, foi realizado o teste de campo aberto
que avalia a atividade locomotora dos animais através da observação dos
comportamentos de crossing e de rearing.
Na figura 8, estão representados os resultados deste experimento. Os
animais lesionados tiveram uma diminuição significativa na atividade locomoto ra. A
catequina protegeu os animais deste déficit. (FO- 10,30 ± 2,600; 6-OHDA - 5,70 ±
0,90; CAT 10 + 6-OHDA- 17,47 ± 2,30; CAT 30 + 6-OHDA- 10,0 ± 3,20; CAT 10 -
9,00 ± 2,28; CAT 30 - 7,33 ± 1,78).
O grupo 6-OHDA teve uma diminuição no comportamento de crossings. Os
animais que sofreram a lesão estriatal e foram tratados com catequina nas doses de
10 e 30mg/kg tiveram um aumento significativo no número de crossings em relação
ao grupo lesionado não tratado (6-OHDA). (FO- 21,10 ± 3,70; 6-OHDA - 14,20 ±
0,80; CAT 10 + 6-OHDA - 24,50 ± 2,40; CAT 30 + 6-OHDA - 21,10 ± 3,70; CAT 10 -
23,67 ± 5,73; CAT 30 - 17,33 ± 0,91).
84
FO
6-O
HDA
Cat
10+
6-O
HDA
Cat
30+
6-O
HDA
Cat
10
Cat
30
0
10
20
30crossing
rearing
*
**
**N
úm
ero
de
even
tos /
5m
inu
tos
Figura 8. Efeito da catequina sobre a atividade exploratória de ratos parkinsonianos.
Os animais foram submetidos à lesão estriatal com 6-OHDA e tratados com
catequina nas doses de 10mg/kg e 30mg/kg. Os valores são expressos como a
média ± EPM. * versus falso-operado; ** versus 6-OHDA; p <0,05, ANOVA e teste
de Tukey.
85
1.2 Determinação do comportamento rotacional induzido por apomorfina em
ratos com lesão estriatal pela 6-OHDA, tratados com catequina nas doses de
10 e 30mg/kg.
Para avaliar o comportamento rotacional de animais que sofreram lesão
estriatal pela 6-OHDA, realizou-se o teste padrão que utiliza a apomorfina, um
agonista dopaminérgico que induz rotações de 360°. O teste foi realizado após 16
dias da lesão estriatal.
Um aumento significativo no número de rotações contralaterais induzidas por
apomorfina foi observado nos animais lesionados (6-OHDA), quando comparados
com o grupo falso-operado (6-OHDA - 76.30 ± 28.50; FO - 0±0 rotações/h; p<0,01)
(figura 9).
O tratamento com catequina nas doses de 10 e 30mg/kg durante 14 dias após
a lesão estriatal foi capaz de diminuir significativamente o número de rotações
induzidas por apomorfina. No grupo que recebeu catequina 10mg/kg houve uma
redução de aproximadamente 85% no número de rotações induzidas por
apomorfina. No grupo que recebeu catequina 30mg/kg houve uma redução quase
que completa no número de rotações induzidas por apomorfina (aproximadamente
90%) quando comparados com o grupo 6-OHDA. (CAT 10- 11,73 ± 5,90; CAT 30-
0,75 ± 0,47).
86
FO 6-OHDA Cat 10 Cat 300
50
100
150
ipsi-lateralcontra-lateral
**
**
*
.
Núm
ero
de r
otaç
ões
Figura 9. Efeito da catequina no comportamento rotacional induzido por apomorfina
em ratos lesionados pela 6-OHDA. Os valores são expressos como a média ± EPM
do número de rotações. * versus falso-operado,**versus 6-OHDA; p <0,05, ANOVA e
teste de Tukey.
87
1.3. Determinação da memória operacional através do teste do labirinto em Y
(Y-maze) em ratos com lesão estriatal tratados com catequina.
Para avaliar o possível efeito neuroprotetor da catequina na memória
operacional dos animais, realizou-se o teste de Y-maze, 14 dias após a lesão
estriatal.
Na figura 10, estão representados os resultados deste experimento. Os
animais que sofreram a lesão estriatal tiveram um déficit na memória quando
comparados aos animais falso-operados. Os animais que foram tratados com
catequina nas duas doses (10 e 30mg/kg) demonstraram uma melhora significativa
na memória operacional (alternações espontâneas (%)) (6-OHDA). (FO- 70.8 ±
5.1%; 6-OHDA- 50.1 ± 9.8%; CAT 10 + 6-OHDA- 77.6 ± 2.1%; CAT + 6-OHDA 30-
80.4 ± 5.7%, CAT 10- 61,20 ± 6,56; CAT 30 - 68,80 ± 3,17).
FO
6-O
HDA
CAT 1
0
CAT 3
0
CAT 1
0
CAT 3
00
25
50
75
100
*
****
alte
rnaç
ões
esp
on
tân
eas
(%)
6-OHDA
Figura 10. Efeito da catequina (10 e 30mg) na memória operacional de ratos no
teste do labirinto em Y. O número de alternações espontâneas foi avaliado após 8
minutos. *versus falso-operado, **versus 6-OHDA; p <0,05, ANOVA e teste de Tukey.
88
1.4 Avaliação da memória recente e tardia em ratos com lesão estriatal pela 6-
OHDA, tratados com catequina nas doses de 10 e 30mg/kg.
A memória aversiva dos animais submetidos à lesão experimental foi avaliada
através do teste da esquiva passiva, 14 dias após a cirurgia estereotáxica.
Os animais submetidos à lesão estriatal não demonstraram um decréscimo na
memória recente. Da mesma forma, os grupos lesionados tratados com catequina
nas duas doses não evidenciaram alterações significativas em relação ao grupo
falso-operado (FO- 165,20 ± 60,50s; 6-OHDA - 117,0 ± 31,30s; CAT 10 + 6-OHDA -
127,50 ± 33,60s; CAT30 + 6-OHDA - 66,60 ± 58,40s; CAT 10 - 160,80 ± 45,82s; CAT
30 - 55,44 ± 25,18s) (figura 11).
Os animais submetidos à lesão estriatal tiveram um desempenho mais baixo
na memória tardia em comparação ao grupo falso-operado. O tratamento com a
catequina nas duas doses(10 e 30 mg/kg) não foi capaz de reverter o dano
significativo na memória tardia produzido pela lesão estriatal (FO - 266,50 ± 33,40s ;
6-OHDA- 106,50 ± 29,60s; CAT 10 + 6-OHDA- 147,90 ± 35,60s; CAT30 + 6-OHDA-
10,30 ± 2,0s; CAT 10 - 205,90 ± 59,55s; CAT 30 - 94,14 ± 53,21s).
89
Contr
ole
6-O
HDA
Cat
10+6-
OHDA
Cat
30+6-
OHDA
Cat
equina
10
Cat
equina
300
100
200
300Treino
MR
MT
*
Lat
ênci
a (s
egu
nd
os)
Figura 11. Efeito da catequina (10 e 30 mg/kg) na memória aversiva de animais
lesionados com a 6-OHDA. O tempo de latência para a entrada dos animais no
compartimento escuro foi registrado durante 300 s. Os valores são expressos como
a média ± EPM em segundos. ; *versus falso-operado; p <0,05, ANOVA e teste de
Tukey.
90
1.5 Efeito da catequina sobre a imunorreatividade para tirosina hidroxilase no
corpo estriado e mesencéfalo de ratos submetidos à lesão estriatal com a 6-
OHDA.
A imunorreatividade para tirosina hidroxilase em neurônios dopaminérgicos na
SN e corpo estriado foi avaliada. As figuras 12 e 13 ilustram que a 6-OHDA causou
uma redução de neurônios dopaminérgicos no mesencéfalo e no corpo estriado,
quando comparados ao grupo falso-operado. O tratamento com a catequina (10 e
30mg) preveniu a degeneração dos neurônios expostos à toxicidade da 6-OHDA.
Figura 12. Fotomicrografias representativas neurônios imunorreativos para tirosina-
hidroxilase no mesencéfalo em ratos submetidos à lesão estriatal. Coloração marrom
representa células imunorreativas a tirosina-hidroxilase do mesencéfalo. A- Falso-
operado, B- OHDA, C- catequina 10mg + 6-OHDA, D - catequina 30mg + 6-OHDA.
Aumento de 40vezes. Barra 200μm.
91
Figura 13. Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos a tirosina-
hidroxilase no corpo estriado em ratos submetidos à lesão estriatal. Coloração
marron representa células imunorreativas à tirosina-hidroxilase ao longo do corpo
estriado . A- Falso-operado, B- OHDA, C- catequina 10mg + 6-OHDA, D - catequina
30mg + 6-OHDA. Aumento de 40vezes. Barra 200μm.
92
1.6 Efeito da catequina sobre a imunorreatividade para o DAT no corpo
estriado e mesencéfalo de ratos submetidos à lesão estriatal com a 6-OHDA.
Os efeitos da catequina nas doses de 10 e 30mg sobre a imunorreatividade
do transportador de dopamina foram examinados por imunohistoquímica para DAT
(transportador de dopamina). As figuras 14e 15 mostram que a 6-OHDA promoveu
uma redução na expressão do transportador de dopamina na substância negra,
quando comparados ao grupo falso-operado. O tratamento com a catequina na dose
de 30mg preveniu o decréscimo da expressão do transportador de dopamina na
substância negra quando exposta à toxicidade pela 6-OHDA.
Figura 14. Fotomicrografias representativas das respectivas secções de neurônios
imunorreativos ao transportador de dopamina (DAT) no mesencéfalo de ratos
submetidos à lesão estriatal. A- Falso-operado, B- OHDA, C- catequina 10mg + 6-
OHDA Catequina 30mg + 6-OHDA. Aumento de 40 vezes. Barra 200μm.
93
Figura 15. Fotomicrografias representativas das respectivas secções de neurônios
imunorreativos ao transportador de dopamina (DAT) na corpo estriado de ratos
submetidos à lesão estriatal. A- Falso-operado, B- OHDA, C- catequina 10mg + 6-
OHDA Catequina 30mg + 6-OHDA. Aumento de 40 vezes. Barra 200μm.
94
1.7 Efeito da catequina sobre a dosagem de Nitrito no corpo estriado e
mesencéfalo de ratos submetidos à lesão estriatal com a 6 -OHDA.
No mesencéfalo (figura 16) foi observada uma diminuição significativa nos
níveis de nitrito do grupo tratado com catequina na dose de 10mg em relação aos
demais grupos e um aumento significativo dos níveis de nitrito no grupo lesionado
pela 6-OHDA e tratado com catequina 30mg (FO - 6.68 ± 0.62µM; FO + CAT 30 -
0.20 ± 0.14 µM; 6-OHDA - 7.18 ± 1.06 µM; 6-OHDA + CAT 10 - 6.49 ± 1.21 µM; 6-
OHDA + CAT 30 - 12.01 ± 2.96 µM).
No corpo estriado (figura 17) foi observado apenas um aumento significativo
do grupo catequina 30 em relação ao grupo falso-operado, do lado direito lesionado
(D). (FO D - 47.27 ± 6.92 µM; FO E - 64.54 ± 30.84 µM; FO + CAT 30 D - 67.48 ±
14.13 µM; FO + CAT 30 E - 31.93 ± 5.02 µM; 6-OHDA D - 31.74 ± 4.65 µM; 6-OHDA
E- 34.28 ± 10.03 µM; 6-OHDA + CAT 10 D - 33.26 ± 5.87 µM; 6-OHDA + CAT 10 E-
39.54 ± 4.75 µM; 6-OHDA + CAT 30 D - 34.59 ± 9.11 µM; 6-OHDA + CAT 30 E -
45.68 ± 8.24 µM).
95
F.O.
6-O
HDA
6-O
HDA +
Cat
10
6-O
HDA +
Cat
30
FO+ C
at 3
00
5
10
15
*
**
Nit
rito
(M
)
Figura 16. Determinação da dosagem de nitrito em mesencéfalo de ratos tratado
com catequina (10 e 30mg). Os valores são expressos como a média ± EPM em
μM. *versus falso-operado, **versus 6-OHDA; p <0,05, ANOVA e teste de Tukey.
CE Direito CR Esquerdo0
25
50
75
100FO
6-OHDA
6-OHDA + CAT 10
6-OHDA + CAT 30
FO CAT 30
Nit
rito
(
M)
Figura 17. Determinação da dosagem de nitrito em corpo estriado (CE) direito
lesionado e esquerdo de ratos tratado com catequina (10 e 30mg). Os valores são
expressos como a média ± EPM em μMolar.
96
1.8 Determinação da peroxidação lipídica no mesencéfalo de ratos submetidos
à lesão estriatal com a 6-OHDA, tratados com catequina nas doses de 10 e
30mg/kg.
Não foram observadas diferenças significativas entre os grupos submetidos
ao ensaio para determinação da peroxidação liipídica, apenas um aumento nos
níveis de TBARS dp grupo catequina 10mg (TBARS – ŋg/gtecido) (FO - 0.28 ± 0.02;
FO + CAT 10 - 0.49 ± 0.05; FO + CAT 30 - 0.30 ± 0.03 ; 6-OHDA - 0.26 ± 0.03; 6-
OHDA CAT 10 - 0.36 ± 0.15; 6-OHDA CAT 30 - 0.26 ± 0.01).
FO
6-O
HDA
6-O
HDA +
Cat
10
6-O
HDA +
Cat
30
FO +
Cat
10
FO +
Cat
30
0.00
0.25
0.50
0.75
TB
AR
s (
ng
/gte
cid
o)
*
Figura 18. Determinação da peroxidação lipídica em mesencéfalo de ratos
submetidos a lesão estriatal. Os valores são expressos como a média ± EPM em
ng/g de tecido.
97
1.9 Efeito da catequina nas doses de 10 e 30 mg/Kg sobre a atividade da SOD
(superóxido dismutase) em ratos submetidos a lesão estriatal com a 6-OHDA.
Os resultados obtidos (figura 19) demonstram que não houve alterações
significativas na atividade da SOD no mesencéfalo (SOD- U/mg de proteína). (FO -
0.59 ± 0.10; FO+ CAT10 - 0.78 ± 0.16; 6-OHDA - 0.56 ± 0.06; 6-OHDA+CAT10 - 0.46
± 0.005; 6-OHDA+CAT30 - 0.52 ± 0.01).
FO
6-OHDA
6-OHDA+C
AT10
6-OHDA+C
AT30
FO+ C
AT100.00
0.25
0.50
0.75
1.00
SO
D (
U/m
g d
e p
rote
ína)
Figura 19. Determinação da atividade da SOD em mesencéfalo de ratos submetidos
à lesão estriatal. Os valores são expressos como a média ± EPM.
98
1.10 Efeito da catequina sobre a glutationa reduzida (GSH) no mesencéfalo de
ratos submetidos à lesão estriatal com a 6-OHDA.
Os resultados obtidos (figura 20) demonstram que no mesencéfalo, a 6-
OHDA inibiu significativamente os níveis de GSH em relação ao grupo falso-
operado. O tratamento com a catequina nas duas doses foi capaz de proteger de
maneira significativa o dano oxidativo induzido pela 6-OHDA. (nmol/g de tecido) (FO
- 0,14 ± 0,01; 6-OHDA - 0,058 ± 0,00; 6-OHDA + CAT 10 - 0,18 ± 0,01; 6-OHDA +
CAT 30 - 0,17 ± 0,02; CAT 30 - 0,24 ± 0,05).
F.O.
6-OHDA
6-OHDA +
CAT 10
6-OHDA +
CAT 30
FO+ Cat
30
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
*
** **
**
nmol G
SH/g t
ecido
Figura 20. Determinação da atividade da GSH em mesencéfalo de ratos submetidos
à lesão estriatal. Os valores são expressos como a média ± EPM. *versus falso-
operado; ** versus 6-OHDA; p < 0,001, ANOVA e teste de Tukey.
99
1.11. Determinação das concentrações de Dopamina(DA) e seus
metabólitos(DOPAC), Noradrenalina (NA) e Serotonina (5-HT) no mesencéfalo
de ratos submetidos à lesão estriatal com a 6-OHDA e tratados com catequina
nas doses de 10 e 30mg/kg.
A injeção intraestriatal de 6-OHDA produziu lesão nos neurônios
catecolaminérgicos resultando na diminuição da concentração de monoaminas no
mesencéfalo quando comparados aos animais controle (falso-operado). Houve uma
redução de aproximadamente 85% de dopamina nos animais que sofreram a lesão
estriatal, 80% dos níveis de noradrenalina, 93% dos níveis de serotonina e 70% nos
níveis de DOPAC em relação ao grupo falso-operado (Tabela 4). A catequina nas
duas doses foi capaz de diminuir significativamente a perda de monoaminas quando
comparadas ao grupo 6-OHDA. Os níveis de serotonina e DOPAC. não sofreram
alterações significativas em relação a 6-OHDA (Tabela 4).
A catequina 30mg/Kg administrada a animais que sofreram a lesão estriatal
com a 6-OHDA levou a uma diminuição de cerca de 55% nos níveis de dopamina.
Houve também um diminuição na perda de noradrenalina (53%). Os níveis de
serotonina e DOPAC. não sofreram alterações significativas em relação a 6 -OHDA
(Tabela 4).
100
Tabela 4. Efeito da catequina na concentração de monoaminas em tecido
mesencefálico de ratos submetidos à lesão estriatal pela 6 -OHDA (ng/tecido).
Grupo DA NA 5-HT DOPAC
FO 2363 ± 431 1886 ±151 2904 ±180 143 ±53
6-OHDA 359 ± 83* 369 ± 82* 202 ±142* 42 ±15*
Catequina 10mg 980 ± 120** 882 ± 113 116 ± 38 89 ±32
Catequina 30mg 1200 ± 110** 897 ± 195 40 ± 7 60 ±6*
Cat 10 + 6-OHDA 1000 ± 340** 901 ± 143** 114 ± 68** 110 ± 33
Cat 30 + 6-OHDA
1300 ± 200** 883 ± 76** 49 ± 5** 64 ±10
A catequina foi administrada nas doses de 10 e 30mg/kg, i.p. durante 14 dias. * vs
controle, ** vs 6-OHDA (p<0,05, ANOVA e teste de Tukey). Os resultados são
expressos como média ±EPM do número de experimentos; p<0,05 (ANOVA e teste
de Tukey).
101
2.Efeito do Estresse de Imobilização subcrônico sobre a lesão estriatal com a 6-
OHDA em ratos.
2.1 Avaliação do ganho de peso e peso ponderal
Na avaliação do ganho de peso nos 3 grupos, observou-se uma diminuição do
ganho de peso significativa nos animais do grupo estresse ao longo de 11 dias. Os
animais estresse + 6-OHDA também demonstraram uma diminuição no ganho de
peso que não foi significativa em relação ao controle (figura 21) (FO - 10,22 ±2,64g;
FO + estresse- -4,71± 3,55g; 6-OHDA - 7,97 ± 3,62g; 6-OHDA + estresse - 4,85 ±
3,54g).
Na avaliação ganho de peso ao longo de 11 dias nos diferentes grupos
estudados, demonstrou-se que nos animais do grupo estresse, o ganho de peso foi
inferior aos dois outros grupos (figura 22).
FO
FO +
est
ress
e
6-OHDA
6-OHDA +
est
ress
e-10
0
10
20
Gan
ho
de p
eso
*
Figura 21. Avaliação do ganho de peso em animais submetidos a estresse de
imobilização subcrônico (11d/6h) e lesão estriatal com a 6 -OHDA. Os valores são
expressos como a média ± EPM; *versus falso-operado; p <0,05, ANOVA e teste de
Tukey.
102
Peso Ponderal
0 1 2 3 4 5175
200
225
250
275falso-operado
estresse
estresse+6-OHDA
dias em pesagem
Peso
(g)
Figura 22. Avaliação do peso ponderal durante 11 dias em animais submetidos
ao estresse de imobilização subcrônico (11dias/6h) e lesão estriatal com a 6-OHDA .
Os valores são expressos como a média ± EPM.
103
2.2 Determinação da atividade locomotora através do teste do campo aberto
em ratos com lesão estriatal submetidos ao estresse de imobilização.
Após 14 dias da lesão estriatal com a 6-OHDA e as sessões de estresse, foi
realizado o teste de campo aberto que avalia a atividade locomotora dos animais
através da observação dos comportamentos de crossing e de rearing.
Os resultados obtidos no crossing mostram que não houve alteração
significativa no grupo que sofreu a lesão estriatal. Entretanto, no grupo que sofreu
lesão e foi submetido ao estresse de imobilização subcrônico, houve um aumento
significativo no número de crossings em relação ao grupo 6-OHDA. (Figura 23) (FO
-21,10 ± 3,70; estresse - 23,71 ± 4,35; 6-OHDA - 14,20 ± 0,80; estresse + 6-OHDA -
29,63 ± 2,12).
Os resultados com o rearing mostram uma diminuição significativa deste
comportamento no grupo que sofreu a lesão estriatal (Figura 23) ( FO - 10,30 ±
2,60; estresse - 8,14 ± 2,34; 6-OHDA - 5,70 ± 0,90; estresse + 6-OHDA - 5,70 ±
0,90).
104
FO
estre
sse
6-O
HDA
estre
sse+
6-O
HDA
0
10
20
30
40crossing
rearing
Nú
me
ro d
e e
ve
nto
s
*
**
*
Figura 23. Efeito do estresse de imobilização sobre a atividade exploratória em
submetidos à lesão estriatal com 6-OHDA e estresse de imobilização subcrônico
(11dias/6h). *versus falso-operado, **versus 6-OHDA. p <0,05, ANOVA e teste de
Tukey.
105
2.3 Determinação do comportamento rotacional induzido por apomorfina em
ratos com lesão estriatal pela 6-OHDA, submetidos ao estresse de imobilização
subcrônico.
Para avaliar o comportamento rotacional de animais que sofreram lesão
estriatal pela 6-OHDA, realizou-se o teste padrão que utiliza a apomorfina, um
agonista dopaminérgico que induz rotações de 360°. O teste foi realizado após 14
dias da lesão estriatal e no final da última sessão de estresse de imobilização.
Um aumento significativo no número de rotações contralaterais induzidas por
apomorfina foi observado nos animais lesionados (6-OHDA), quando comparados
com o grupo falso-operado (6-OHDA - 76.30 ± 28.50 vs FO - 0±0 rotações/h; p<0,01)
(figura 24). O estresse não protegeu ou piorou os animais do déficit induzido pela 6-
OHDA. (6-OHDA + estresse - 88,80 ± 36,19 vs FO - 0±0 rorações/h; p<0,01)
(Figura 24).
106
falso-o
perado 6-O
HDA
6-OHDA + es
tresse
0
50
100
150ipsi-lateral
contra-lateral*
*
número
de rota
ções
Figura 24. Efeito do estresse de imobilização subcrônico no comportamento
rotacional induzido por apomorfina em ratos lesionados pela 6-OHDA. Os valores
são expressos como a média ± EPM do número de rotações (360°). * versus falso-
operado,**versus 6-OHDA; p <0,05, ANOVA e teste de Tukey.
107
2.4 Determinação da memória operacional através do teste do labirinto em Y
(Y-maze) em ratos com lesão estriatal submetidos ao estresse de imobilização.
Para avaliar efeito do estresse de imobilização na memória operacional dos
animais experimentais, realizou-se o teste de Y-maze, 14 após a lesão estriatal e
sessões diárias de estresse de imobilização subcrônico.
Os resultados demonstram que houve uma diminuição significativa na
memória de trabalho do grupo que sofreu a lesão estriatal pela 6-OHDA em relação
ao grupo falso-operado. O estresse não exerceu nenhum efeito na memória destes
animais. (Figura 25) (FO - 70,80 ± 5,10; estresse - 64,60 ± 4,15; 6-OHDA - 50,10 ±
9,80; 6-OHDA + estresse - 57,89 ± 4,58).
falso-
opera
do
estre
sse
6-O
HDA
6-O
HDA +
est
ress
e0
25
50
75
100
alte
rnaç
ões
esp
on
tân
eas
(%)
*
Figura 25. Efeito da 6-OHDA e estresse de imobilização (11dias/6h) na memória
operacional de ratos no teste do labirinto em Y. *versus falso -operado, p <0,05,
ANOVA e teste de Tukey.
108
2.5 Avaliação da memória recente e tardia em ratos com lesão estriatal pela 6-
OHDA, submetidos ao estresse de imobilização subcrônico.
A memória aversiva (recente e tardia) dos animais submetidos ao estresse de
imobilização subcrônico foi avaliada 14 dias após a lesão estriatal.
Não houve alteração significativa na memória recente do grupo lesionado pela
6-OHDA em relação ao falso-operado, porém o grupo lesionado pela 6-OHDA e
submetido ao estresse mostrou uma melhora significativa na memória recente em
relação ao grupo 6-OHDA. Latência (s) (figura 26) (FO - 165,20 ± 60,50s; estresse -
165,20 ± 50,90s; 6-OHDA - 135,00 ± 40,00s; estresse + 6-OHDA - 243,70 ±
36,65s).
Observou-se um decréscimo significativo na memória tardia dos grupos
estresse e 6-OHDA em relação ao grupo controle. Os animais estressados e
submetidos à lesão com 6-OHDA tiveram uma melhora na memória aversiva de
longa duração em relação ao grupo lesionado pela 6-OHDA. Latência (s) (Figura
26). ( FO - 266,50 ± 33,40s; estresse - 95,71 ± 45,58s; 6-OHDA - 98,50 ± 39,60s;
estresse + 6-OHDA - 206,20 ± 39,43s).
109
falso-
opera
do
estre
sse
6-0H
DA
estre
sse+
6-O
HDA
0
100
200
300
* *la
tên
cia
(s)
**
**
Figura 26. Efeito do estresse de imobilização subcrônico na memória aversiva de
animais submetidos a lesão estriatal pela 6-OHDA. O tempo de latência para a
entrada dos animais no compartimento escuro foi registrado durante 300 s. Os
valores são expressos como a média ± EPM em segundos. * vs controle, ** vs 6-
OHDA (p<0,05, ANOVA e teste de Tukey.
110
2.6 Avaliação do estado depressivo dos animais que sofreram lesão estriatal e
submetidos a estresse de imobilização subcrônico no teste nado Forçado.
O teste do Nado Forçado foi realizado após 15 dias da lesão estriatal e no
final da última sessão de estresse de imobilização.
Os animais falso-operados que sofreram sessões de 11dias/ 6 horas de
estresse de imobilização tiveram um aumento significativo no tempo de imobilização
quando comparados ao grupo controle (falso-operado), confirmando que o estresse
leva a um comportamento depressivo.
Animais submetidos à lesão estriatal pela 6-OHDA não demonstraram
alteração no tempo de imobilização quando comparados ao grupo falso-operado,
significando que este modelo de DP, não leva os animais a um comportamento
depressivo.
Os animais que sofreram a lesão pela 6-OHDA e foram submetidos ao
estresse tiveram um aumento significativo no tempo de imobilização, quando
comparados ao grupo falso-operado, mas este tempo de imobilização foi
significativamente menor comparado ao grupo sofreu apenas estresse de
imobilização, significando um menor comportamento depressivo deste animais.
(Figura 27) Tempo de Imobilização (s)( FO - 36,83 ± 7,07s; estresse - 215,80 ±
20,26s; 6-OHDA - 56,40 ± 5,7s; 6-OHDA + estresse - 118,50 ± 30,96s).
111
falso-o
perado
Estre
sse
6-OHDA
6-OHDA +
est
ress
e0
100
200
300
*
***
**
Tem
po
de
Imo
bil
izaç
ão(s
)
Figura 27. Teste do nado forçado nos animais que sofreram lesão estriatal
submetidos a estresse de imobilização subcrônico (11dias/6h). Os valores são
expressos como a média ± EPM em segundos(s). *versus falso-operado; **versus
6-OHDA; ***versus estresse.
112
2.7 Efeito do estresse de imobilização subcrônico sobre a imunorreatividade
para a tirosina hidroxilase no corpo estriado e mesencéfalo de ratos
submetidos à lesão estriatal com a 6-OHDA.
A figura 28 mostra que a 6-OHDA (B) causou uma redução de neurônios na
substância negra e copo estriado, quando comparados ao grupo falso-operado. O
estresse sozinho(C) alterou a quantidade de neurônios na SN. A associação 6-OHDA
+ estresse promoveu um aumento na expressão destes neurônios na SN(D), quando
comparado com o grupo 6-OHDA(B).
No corpo estriado (figura 29) também houve uma diminuição na
imunorreatividade para TH no grupo 6-OHDA (B). Não foi observado uma aumento
desta imunorreatividade quando estes animais (6-OHDA) foram submetidos ao
estresse (D).
113
Figura 28. Fotomicrografia representativas de neurônios imunorreativos para
tirosina-hidroxilase no mesencéfalo de ratos submetidos a lesão estriatal e estresse
de imobilização. Coloração marron representa células imunorreativas a tirosina-
hidroxilase no mesencéfalo. A- Falso-operado, B- OHDA, C- estresse D – estresse +
6-OHDA. Aumento de 400vezes. Barra 200μm.
114
Figura 29. Fotomicrografia representativa de neurônios imunorreativos para tirosina-
hidroxilase no corpo estriado de ratos submetidos a lesão estriatal e estresse de
imobilização. Coloração marron representa células imunorreativas a tirosina-
hidroxilase ao longo do corpo estriado. A- Falso-operado, B- OHDA, C- estresse, D –
estresse + 6-OHDA. Aumento de 40 vezes. Escala 200μm.
115
2.8 Efeito do estresse de imobilização subcrônico sobre a imunorreatividade
para o Transportador de Dopamina (DAT) no mesencéfalo de ratos submetidos
à lesão estriatal com a 6-OHDA.
Os efeitos do estresse de imobilização sobre a expressão do transportador de
dopamina foram examinados por imunohistoquímica para DAT (transportador de
dopamina). A figura 30 mostra que a 6-OHDA (B) causou uma discreta redução na
expressão do transportador de dopamina na substância negra, quando comparados
ao grupo falso-operado (A). O estresse de imobilização não alterou a expressão do
DAT (C), mas observou-se um discreto aumento desta imunorreatividade nos
animais parkinsonianos submetidos ao estresse (D).
Figura 30. Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para o
transportador de dopamina (DAT) no mesencéfalo. A- Falso-operado, B- OHDA, C-
estresse, D – estresse + 6-OHDA. Aumento de 400vezes. Barra 200μm.
116
2.9 Determinação da concentração de Nitrito em ratos submetidos a estresse
de imobilização subcrônico que sofreram lesão estriatal com a 6-OHDA.
No mesencéfalo não foram observadas alterações significativas entre os
grupos nitrito (FO - 6,68 ± 0,62µM; estresse - 4,04 ± 1,46 µM; 6-OHDA - 7,18 ± 1,06
µM; 6-OHDA + estresse - 6,45 ± 1,44 µM) (figura 31).
No corpo estriado direito (lesionado) houve um aumento significativo nos
níveis de nitrito nos grupos submetidos ao estresse de imobilização em relação ao
grupo 6-OHDA. No corpo estriado esquerdo, não foram observadas alteraççoes
significativas (Figura 32). (FO D - 47,27 ± 6,92 µM; FO E - 64,54 ± 30,84 µM;
estresse D - 74,28 ± 25,08 µM; estresse E - 33,17 ± 5,98 µM; 6-OHDA D- 31.74 ±
4.65 µM; 6-OHDA E- 34,28 ± 10,03 µM; 6-OHDA + estresse D - 71,03 ± 18,14 µM; 6-
OHDA + estresse E - 40,77 ± 4,07 µM).
F.O.
Estre
sse
6-O
HDA
6-O
HDA+est
ress
e0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
Nit
rito
(
Mo
lar)
Figura 31. Determinação da dosagem de nitrito em mesencéfalo de ratos
submetidos a estresse de imobilização subcrônico (11dias/6h). Os valores são
expressos como a média ± EPM.
117
E. direito E. esquerdo0
25
50
75
100falso-operado
estresse
6-OHDA
6-OHDA + estresse
****
M
ola
r
Figura 32. Determinação da dosagem de nitrito em corpo estriado de ratos
submetidos a estresse de imobilização subcrônico (11dias/6h). O corpo estriado
direito corresponde ao lado lesionado pela 6-OHDA. Os valores são expressos
como a média ± EPM em μMolar. **versus 6 -OHDA
118
2.10 Efeito do estresse de imobilização subcrônico sobre a dosagem da
Superóxido Dismutase (SOD) no corpo estriado e mesencéfalo de ratos
submetidos à lesão estriatal com a 6-OHDA.
A lesão pela 6-OHDA ou o estresse de imobilização subcrônico não
promoveram alterações significativas nos níveis da SOD (figura 33). (FO - 0,59 ±
0,10; estresse - 0,52 ± 0,02; 6-OHDA - 0,56 ± 0,06; 6-OHDA + estresse - 0,46 ± 0,00)
(U/mg de proteína).
falso-
oper
ado
estre
sse
6-OHDA
6-OHDA +
est
ress
e0.00
0.25
0.50
0.75
SO
D(U
/mg
de p
rote
ína)
Figura 33. Avaliação da atividade da superóxido dismutase (SOD) em tecido
mesencefálico de ratos submetidos a estresse de imobilização subcrônico e lesão
estriatal pela 6-OHDA. Os valores são expressos como a média ± EPM.
119
2.11 Determinação dos efeitos do estresse de imobilização subcrônico sobre a
peroxidação lipídica em de ratos submetidos à lesão estriatal com a 6-OHDA.
Não houve aumento da peroxidação lipídica no tecido mesencefálico dos
grupos testados em relação ao grupo controle (Figura 34). TBARS: (FO - 0,28 ±
0,02; estresse - 0,21 ± 0,01; 6-OHDA - 0,26 ± 0,03; estresse + 6-OHDA - 0,22 ± 0,02)
(ŋg/g de tecido).
Em relação ao corpo estriado, o grupo estresse (corpo estriado direito -
lesionado) apresentou uma diminuição nos níveis de TBARS quando comparados ao
controle e aos outros grupos (figura 35). Nos demais grupos, não houve alterações
significativas.( FO D - 0,85 ± 0,09; FO E - 0,57 ± 0,15; estresse D - 0,21 ± 0,01;
estresse E - 0,61 ± 0,12; 6-OHDA D - 0,67 ± 0,17; 6-OHDA E - 0,55 ± 0,07; 6-OHDA
+ estresse D - 0,95 ± 0,25; 6-OHDA + estresse E- 0,51 ± 0,13).
falso-o
perado
estre
sse
6-OHDA
6-OHDA +
est
ress
e 0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
TB
AR
S (
ng
/g d
etec
ido
)
Figura 34. Determinação dos níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
(TBARS) em mesencéfalo de ratos submetidos à lesão estriatal que sofreram
estresse de imobilização subcrônico. Os valores são expressos como a média ±
EPM em ng/g de tecido.
120
Estriado Direito Estriado Esquerdo
0.0
0.5
1.0
1.5
6-OHDA
6-OHDA + estresse
estresse
falso-operado
*
TB
AR
S (
ng
/g d
e t
ecid
o)
Figura 35. Determinação dos níveis de TBARS em corpo estriado de ratos
submetidos à lesão estriatal que sofreram estresse de imobilização subcrônico. Os
valores são expressos como a média ± EPM. * vs controle (p<0,05, ANOVA e teste
de Tukey).
121
2.12 Efeito do estresse de imobilização subcrônico sobre a Glutationa
Reduzida (GSH) em ratos submetidos à lesão estriatal com a 6 -OHDA no
mesencéfalo e corpo estriado.
Os resultados obtidos no tecido mesencefálico mostram que o grupo que
sofreu a lesão estriatal pela 6-OHDA teve uma diminuição significativa nos níveis
de GSH em relação ao controle. Os animais que sofreram estresse de imobilização
subcrônico tiveram um aumento significativo na concentração da GSH em relação ao
controle. O estresse de imobilização foi capaz de inibir significativamente a
diminuição dos níveis de GSH induzida pela 6-OHDA (Figura 36) GSH: (FO - 0,14 ±
0,01; estresse - 0,22 ± 0,02; 6-OHDA - 0,05 ± 0,00; 6-OHDA + estresse - 0,16 ± 0,01)
(nmol/g de tecido).
No corpo estriado, não houve alterações significativas nas concentrações de
GSH, com exceção de uma diminuição nos níveis de GSH no corpo estriado direito
(lesionado) do grupo estresse quando comparado ao controle ( figura 37). GSH:(FO
D - 14,46 ± 3,26; FO E - 10,19 ± 0,53; estresse D - 9,38 ± 0,60; estresse E - 12,71 ±
2,00; 6-OHDA D - 10,48 1,38; 6-OHDA E - 10,25 ±1,88; 6-OHDA + estresse D - 11,79
± 2,09; 6-OHDA + estresse E - 14,49 ± 2,99) (nmol/g de tecido).
122
falso-
opera
do
estre
sse
6-O
HDA
6-O
HDA +
est
ress
e 0.0
0.1
0.2
0.3
*
nm
ol
GS
H/g
de
teci
do
*
**
Figura 36. Determinação da atividade da GSH em mesencéfalo de animais que
sofreram lesão estriatal e estresse de imobilização subcrônico. Os valores são
expressos como a média ± EPM. * vs controle, ** vs 6-OHDA (p<0,05, ANOVA e teste
de Tukey).
E. direito E. esquerdo0
10
20falso-operado
estresse
6-OHDA
6-OHDA + estresse*
nm
ol
GS
H/g
de
teci
do
Figura 37. Determinação da atividade da GSH em corpo estriado de animais
submetidos à lesão estriatal e estresse de imobilização. Os valores são expressos
como a média ± EPM em nmol GSH/g de tecido.
123
2.13 Determinação da Glicose em ratos submetidos a estresse de imobilização
subcrônico (11 dias/6h) e lesão estriatal pela 6-OHDA.
Não foram observadas alterações significativas entre os grupos (figura 38) (
FO - 141,1 ± 13,44; estresse - 141,3 ± 19,22; 6-OHDA + estresse - 139,1 ±
5,25)mg/dL.
Falso-o
perado Estre
sse
Estresse
6-OHDA
0
100
200
Glicose
(mg/d
L)
Figura 38. Determinação dos níveis de glicose em ratos submetidos a estresse de
imobilização e lesão estriatal pela 6-OHDA. Os valores são expressos como a média
± EPM.
124
2.14 Determinação das concentrações de Dopamina(DA) e seus
metabólitos(DOPAC e HVA), Noradrenalina (NA) e Serotonina (5-HT) no corpo
estriado e mesencéfalo de ratos submetidos ao estresse de imobilização
subcrônico (11 dias/6h) e que sofreram lesão estriatal com a 6-OHDA.
A injeção intraestriatal de 6-OHDA produziu destruição dos neurônios
catecolaminérgicos resultando na diminuição da concentração de monoaminas no
mesencéfalo quando comparados aos animais controle (falso-operado). Houve uma
redução de aproximadamente 85% de dopamina nos animais que sofreram a lesão
estriatal, 80% dos níveis de noradrenalina, 93% dos níveis de serotonina e 70% nos
níveis de DOPAC (Tabela 5).
O estresse de imobilização subcrônico levou a uma diminuição nas
concentrações de dopamina e DOPAC em relação ao controle (aproximadamente 90
e 62%). Os níveis de noradrenalina tiveram um aumento de 20% sobre a influência
do estresse (Tabela 5).
O estresse não protegeu contra a perda de dopamina e seu metabólito
(DOPAC) induzida pela 6-OHDA, mas protegeu da perda de NA e 5-HT induzida pela
6-OHDA, inclusive com um grande aumento de NA em relação aos animais FO.
125
Tabela 5. Efeito do estresse de imobilização subcrônico na concentração de
monoaminas em tecido mesencefálico de ratos submetidos à lesão estriatal
(ng/tecido).
Grupo DA NA 5-HT DOPAC
FO
Estresse
2,363 ± 431
240 ± 110*
1,886 ±151
2349 ± 222*
2,904 ± 180
2173 ±791.5
143 ± 53
53,9 ± 24,5*
6-OHDA 359 ± 83* 369 ± 82* 202 ± 142* 42 ± 15*
6-OHDA +
Estresse
330 ± 180* 5913 ± 1545** 1550 ± 408.3** 57.3 ± 49.7*
O estresse de imobilização foi realizado durante 11d/6hs * vs controle, ** vs 6-OHDA,
***versus estresse; Os resultados são expressos como média ±EPM do número de
experimentos; p<0,05 (ANOVA e teste de Tukey).
126
VI DISCUSSÃO
Com o objetivo de investigar um novo agente neuroprotetor capaz de prevenir
a neurodegeneração da doença, investigamos o papel da catequina, um flavonóide
com ação antioxidante e quelante de metais, usando um modelo experimental de
DP. Em uma outra etapa do nosso trabalho também foi avaliado o efeito do estresse
subcrônico neste modelo experimental da DP, levando em consideração a hipótese
de que o estresse poderia induzir a danos em neurônios dopaminérgicos (SMITH et
al., 2002).
A DP tem sido amplamente estudada através de modelos experimentais que
são capazes de reproduzir a perda de neurônios dopaminérgicos que ocorre na
doença. Estes modelos são importantes para o conhecimento dos mecanismos
patológicos da doença, além disso, são essenciais para o desenvolvimento e teste
de novos agentes terapêuticos. Baseados nas características neuropatológicas mais
importantes da DP, toxinas como o MPTP, a 6-OHDA, o paraquat e a rotenona, são
utilizadas para induzir degeneração da via nigroestriatal (MEREDITH et al., 2008). A
6-OHDA é um modelo confiável que leva a déficits motores robustos e é o modelo
mais uti lizado após 40 anos de pesquisas (DA CONCEIÇÃO et al., 2010). Ela tem
estrutura semelhante à dopamina e à noradrenalina e possui alta afinidade para o
transportador de membrana plasmática destas catecolaminas. Seu mecanismo de
toxicidade consiste na sua entrada nos neurônios catecolaminérgicos, onde é
rapidamente oxidada e produz peróxido de hidrogênio e paraquinona, que são
altamente tóxicos, além de inibir o complexo I da cadeia transportadora de elétrons
(MEREDITH et al., 2008). Esta toxina não atravessa a barreira hematoencefálica,
mas quando administrada diretamente no cérebro é capaz de le var a morte de
neurônios dopaminérgicos e noradrenérgicos e seus terminais. A 6-OHDA é
geralmente administrada na SN, feixe prosencefálico medial ou no corpo estriado
(MEREDITH et al., 2008; YAMASHITA & MATSUMOTO, 2007 ).
127
O modelo uti lizando a 6-OHDA torna mais acessível a evidenciação de danos
motores através de testes específicos, como no caso de lesões unilaterais que
promovem assimetria, como por exemplo o teste rotacional, que é o “gold standard”
para avaliar a magnitude da perda nigroestriatal. (UNGERSTEDT & ARBUTHNOTT,
1970). A injeção da 6-OHDA oferece algumas desvantagens. O fato de não
atravessar a barreira hematoencefálica, sendo necessária uma cirurgia estereotáxica
para administração intranigral ou intraestriatal da toxina, nem sempre leva a uma
perda maciça das células dopaminérgicas (IANCU et al., 2005). Sugeriu-se também
que a cirurgia intraestriatal pode causar uma resposta inflamatória local que induziria
a liberação de várias citocinas, incluindo interleucina 1 beta (IL – 1β ), interferon-
gama (IF-γ) e fator de necrose tumoral α (TNF-α) (WIDNER et al., 1988; CHUNG et
al., 2010). Este modelo não imita todas as características patológicas e clínicas da
DP, como por exemplo, a formação de inclusões citoplasmáticas (corpúsculos de
Lewy), mas no entanto é o modelo mais útil para o estudo de substâncias
neuroprotetoras (HIRSCH et al., 2003). Apesar da disponibilidade de novos modelos,
a 6-OHDA permanece sendo a ferramenta experimental mais utilizada para induzir a
lesão nigroestriatal no rato (BLANDINI et al., 2008).
1. Efeito da Catequina nas doses de 10 e 30mg sobre a lesão estriatal com 6-
OHDA em ratos.
O presente estudo demonstrou que a 6-OHDA foi capaz de produzir danos
motores, confirmando os dados da literatura. Os resultados do teste do campo
aberto demonstraram que a 6-OHDA induziu déficits na atividade exploratória vertical
dos animais. Rizelio et al. (2010) e Srinivasan & Schmidt (2004) demonstraram uma
diminuição significativa no número total de movimentos de rearing (exploração
vertical) em animais submetidos a lesão estriatal com 6-OHDA. A catequina na duas
doses foi capaz de prevenir a diminuição de crossings induzida pela 6-OHDA e na
dose de 10mg preveniu a diminuição do comportamento de rearing.
128
Poucos estudos existem acerca do efeito da catequina in vivo, em se tratando
de modelos experimentais da DP. A catequina é um flavonóide isolado do chá verde.
Ela, e outros tipos de catequinas pertencentes ao mesmo grupo, possuem na sua
estrutura um grupo hidroxila altamente reativo que fica oxidado pela doação de
elétrons, desta forma estabiliza o radical livre, transformando-o em uma molécula
menos reativa (WEINREB et al.,2009). A epigalocatequina galato (EGCG), que é
catequina mais abundante no chá verde, tem sido extensamente estudada por suas
já conhecidas propriedades antioxidantes e pela sua atividade como quelante de
metais (WEINREB et al., 2009). A EGCG administrada oralmente demonstrou
melhorar a performance de animais submetidos a lesão pelo MPTP em testes
motores (LEAVER et al., 2009). Em um trabalho realizado por Kumar & Kumar
(2009) foi demonstrado que a EGCG aumentou a atividade locomotora de animais
com dano cerebral induzido pelo ácido-3 nitropropiônico. Um trabalho com extrato de
chá preto, que também é rico em catequinas, mostrou que o composto foi capaz de
melhorar a atividade locomotora que havia sido prejudicada pela 6 -OHDA
(CHATURVEDI et al., 2006), corroborando com nossos dados.
Os mecanismos responsáveis pela recuperação da atividade motora ainda
não estão elucidados, porém algumas pistas apontam para uma explicação destes
mecanismos. Alguns trabalhos demonstram que as catequinas melhoram a utilização
de gordura como fonte de energia em animais submetidos a exercício físico, levando
a uma melhor performance motora destes animais (MURASE et al., 2006). Além
disso, os flavonóides são apontados como inibidores da enzima COMT in vitro, a
enzima que degrada catecolaminas, elevando assim, os níveis de noradrenalina,
aumentando a estimulação do simpático e consequentemente o aumento do
metabolismo (BORCHARDT & HUBER, 1975; LU et al., 2003). A enzima COMT,
também é responsável pela degradação da dopamina. A dopamina é a responsável
pela regulação e controle dos movimentos através da via nigroestriatal, influenciando
os receptores dopaminérgicos pós-sinápticos expressos nos neurônios estriatais
(SMITH & VILLALBA, 2008). Na DP, como sabemos, esta via está prejudicada pela
deficiência de dopamina na SN. Um possível papel da catequina como inibidora da
COMT, atuaria na melhor performance motora dos animais submetidos à lesão pela
6-OHDA e consequentemente nos sintomas motores da DP.
129
Um outro mecanismo que pode ser responsável pela melhor performance
locomotora dos animais, seria uma possível função das catequinas na liberação do
neurotransmissor glutamato em neurônios motores. Yu e cols (2010) viram que a
EGCG tem uma atividade protetora sobre os neurônios motores, modulando a
atividade de glutamato, que em excesso causa excitotoxidade neuronal, em um
modelo de esclerose amiotrófica lateral (ELA). Na DP, a perda de dopamina é
acompanhada por um distúrbio da neurotransmissão glutamatérgica corticoestriatal,
o que pode resultar num aumento da hiperatividade nas sinapses glutamatérgicas,
que seria altamente tóxico para os neurônios dopaminérgicos (MASSIE et al., 2010).
A catequina pode estar agindo como moduladora na função do glutamato,
diminuindo assim a excitotoxidade produzida por este neurotransmissor.
O modelo “hemiparkinsoniano” da 6-OHDA leva a uma assimetria motora
evidenciada após a administração de agonistas dopaminérgicos resultando em um
comportamento rotacional contralateral à lesão (BETARBET et al., 2002).. Este é o
clássico teste da apomorfina ou rotacional, primeiramente descrito por Ungerstedt
(1977), que proporciona a verificação de grandes lesões nigroestriatais (DEUMENS
et al., 2002).
No presente trabalho, animais lesionados com a 6-OHDA exibiram um grande
número de rotações contralaterais à lesão. Este resultado está em concordância
com a literatura (METZ et al., 2004; SINGH et al., 2006; BALUCHNEJADMOJARAD
& ROGHANI, 2006; RIZELIO et al., 2010; YU et al., 2010) que demonstra que
lesões extensas promovidas pela 6-OHDA acarretam este tipo de comportamento
durante a realização do teste. O agonista dopaminérgico apomorfina induz rotações
contralaterais ao lado lesionado, porque estimula o lado do corpo estriado que se
encontra desnervado, apresenteando uma up regulation dos receptores D2. Esse
fenômeno ocorre somente após uma grande perda de neurônios dopaminérgicos
(UNGERSTEDT, 1971; DEUMENS et al., 2002).
A catequina nas duas doses testadas foi capaz de reverter significativamente
130
o dano motor promovido pela 6-OHDA no teste da apomorfina. Em um modelo com a
6-OHDA, a EGCG reverteu os déficits motores promovidos pela 6-OHDA no teste da
apomorfina (BALUCHNEJADMOJARAD & ROGHANI, 2006). A catequina
provavelmente atua através dos mesmos mecanismos neuroprotetores da EGCG.
Estudos realizados tanto com extratos do chá verde, quanto com a EGCG in vivo
(LEVITES et al., 2001), relatam a potente atividade destas substâncias em prevenir a
perda de dopamina estriatal e na SN de camundongos. Um dos possíveis
mecanismos pelo qual estes compostos atuam contra as neurotoxinas experimentais
envolveria os seus grupamentos químicos do tipo catecol, que são potentes
antioxidantes e quelantes do íon metálico ferro (GUBINA et al., 1998; GRUNBLATT
et al., 1999; GRUNBLATT et al.,2001; KANG et al., 2010). Além disso, a EGCG em
baixas doses inibiu a atividade da enzima catecol O-metiltransferase (COMT) em
homogenatos de fígado de rato (LU et al., 2003). Sabe-se que a dopamina é um
substrato para a COMT, consequentemente, a inibição desta enzima levaria a uma
maior disponibilidade de dopamina no cérebro, como foi comentado anteriormente.
Um exemplo disto é o uso de inibidores da COMT (entocapone e tolcapone) no
tratamento da DP (WEINREB et al, 2009).
O acúmulo de ferro está implicado em várias patologias neurodegenerativas.
Relata-se que o ferro se acumula em neurônios e microglias da SN de pacientes da
DP (RIEDERER & YOUDIM, 1990; ZECCA et al., 2001). O ferro pode induzir a
excerbação do estresse oxidativo em doenças no cérebro (DESPORT et al., 2002),
porque participa da reação de Fenton que continuamente produz EROs. Substâncias
quelantes de ferro têm demonstrado neuroproteção tanto in vivo quanto in vitro, pois
podem remover o ferro livre prevenindo o estresse oxidativo e consequentemente a
geração de radicais OH• (GOSH et al., 2010). As propriedades quelantes da EGCG
e de outras catequinas na neuroproteção têm sido reconhecidas pela observação de
que tanto MPTP, quanto 6-OHDA aumentaram significativamente os níveis de ferro
na SNpc em camundongos, ratos e macacos (MONTEIRO & WINTERBOURN ,1989;
TEMLETT et al., 1994). Em ratos tratados com MPTP, Mandel e cols. (2004)
mostraram que a EGCG preveniu o acúmulo de ferro na SNpc. Essa propriedade
das catequinas vem sendo pesquisada no tratamento de doenças como a talassemia
onde devido a transfusões de sangue, há uma carga excessiva de ferro (SAEWONG
131
et al., 2010). Raza e cols. (2006) viram que as catequinas em baixas concentrações
podem inibir parcialmente a reação de Fenton, porém, altas concentrações destas
mesmas catequinas podem ser pro-oxidantes.
A memória operacional ou de trabalho pode ser definida como uma memória
de curta duração para estímulos ou localizações espaciais. Há um armazenamento
de uma informação temporária que será utilizada para o planejamento de uma ação
futura (DUDCHENKO, 2004). Segundo Brioni (1993), o septo medial e o hipocampo
parecem ter papel fundamental na memória operacional. Outros trabalhos sugerem
que a principal área funcional cerebral relacionada à memória operacional é o córtex
pré-frontal (BADDELEY, 1986, GOLDMANN-RAKIC et al., 1990, DUJARDIN &
LAURENT, 2003).
Pacientes com DP têm a memória de trabalho e espacial prejudicada (OWEN,
2004). Segundo Stebbins (1999), a redução da atividade dopaminérgica no estriado
e no lobo frontal pode levar a déficits de memória operacional. Em animais, existem
vários testes usados para avaliar a memória de trabalho. A alternação entre os
braços de um labirinto após um curto prazo tem sido proposto como modelo de
memória de trabalho (LALONDE, 2002).
Observou-se neste trabalho que no teste do Y-maze, os animais que sofreram
a lesão com a 6-OHDA, tiveram a sua memória operacional prejudicada. Estes
dados estão em conformidade com trabalhos que demonstraram que a 6-OHDA,
provavelmente por aumentar o estresse oxidativo, é capaz de promover danos na
memória operacional similares aos danos característicos da DP (HEFCO et al.,
2003; HRITCU & NABESHIMA., 2008; PEREZ et al., 2009).
A catequina nas duas doses, conseguiu prevenir significativamente estes
danos na memória operacional promovidos pela 6-OHDA, provavelmente devido às
suas propriedades antioxidantes. Trabalhos com catequinas do chá verde em
modelos animais têm demonstrado que estas substâncias protegem a memória de
132
déficits associados ao envelhecimento (UNNO et al., 2007; KISHIDO et al., 2007) e
também previnem danos associados a aprendizagem espacial (LI et al., 2009).
Os possíveis mecanismos pelos quais as catequinas protegem a memória são
muitos. Van Praag e cols. (2007) viram que a epicatequina melhorou a memória e
constataram um aumento da angiogênese no giro dentado do hipocampo, embora
não tenham sido constatado o surgimento de novas células hipocampais. Além
disso, no trabalho citado, a epicatequina em combinação com o exercício físico
aumentou a densidade de neurônios espinhais no giro dentado do hipocampo e
levou a uma up regulation da expressão de genes no tecido hipocampal. Um outro
trabalho mais recente relata que a administração oral de EGCG aumenta a
proliferação celular, diferenciação de neuroblastos e maturação neuronal na zona
subgranular do giro dentado de camundongos (YOO et al., 2010).
A maioria dos trabalhos explora apenas as propriedades antioxidantes e
quelantes de metais das catequinas como responsáveis pela ação neuroprotetora
destes compostos, no entanto existem outros mecanismos moleculares que podem
estar implicados. A habilidade da catequinas em alterar vias sinalizadoras pode
contribuir significativamente para a sobrevivência celular (WEIREB et al., 2009).
Vários trabalhos tem demonstrado que a EGCG atua na ativação da via proteína
quinase C (PKC) (KALFON et al., 2007; CHOU et al., 2007; MANDEL et al., 2008).
Alguns estudos in vitro têm demonstrado que a EGCG é capaz de inibir a
toxicidade induzida pelo glutamato em células de hipocampo de camundongos e
este efeito está associado à redução do acúmulo de EROs e à redução da atividade
transcripcional do NF-κB (FU & KOO, 2006; KANG et al., 2010). O glutamato, como
se sabe, é o principal aminoácido excitatório do SNC e desempenha papéis
importantes em vários processos fisiológicos, incluindo aprendizagem e memória
(ORREGO & VILLANUEVA, 1993). O número de astrócitos da região CA3 do
também foi diminuído pela ação do pré-tratamento com a EGCG, sugerindo que tal
composto possa exercer uma proteção in vivo contra o estresse oxidativo
133
conjuntamente através da promoção da sobrevivência neuronal e da supressão da
ativação das células da glia (FU & KOO, 2006; KANG et al., 2010). Chao e cols
(2010) sugeriram que a EGCG aumenta a sobrevivência das células através da via
sinalizadora Akt, uma proteína quinase que é responsável pela inibição da apoptose
e down-regulation das proteínas envolvidas na cascata apoptótica.
Outro mecanismo de proteção exercido pelas catequinas seria pela
diminuição do glutamato induzido por Ca+2, o que foi visto em células da linhagem
PC12 (LEE et al., 2004). Já em um estudo com neurônios da SN, Jeong et al.,(2007)
mostraram que a EGCG aumentou a atividade elétrica destes neurônios, esta
atividade elétrica está diretamente relacionada à liberação de dopamina, neste
estudo houve atividade dos neurônios dopaminérgicos através da inibição das
correntes de potássio dependentes de cálcio pela EGCG e este tipo de ação
também pode ter contribuído para o efeito neuroprotetor da catequina visto no
nosso estudo.
As catequinas do chá verde têm sido objeto de estudo de vários autores que
têm relatado suas ações neuroprotetores não só na DP, mas também em outras
doenças neurodegenerativas (MANDEL et al., 2005; HAQUE et al., 2005;
RASOOLIJAZI et al., 2007; HAQUE et al., 2008). Lee e cols. (2009) estudando um
modelo de Doença de Alzheimer, viram que a EGCG preveniu o dano na memória de
animais através da inibição da via ERK/NF-κB .
Em relação à memória aversiva, o presente estudo constatou que a 6 -OHDA
promoveu danos significativos na memória aversiva de longa duração (memória
tardia), porém sem afetar a memória aversiva de curta duração. Corroborando com
estes dados, Fernadez Espejo (2003) demonstrou que lesões com a 6-OHDA no
córtex pré-frontal e núcleo accumbens afetam a memória aversiva de longa duração.
Outros autores (MITCHAM & THOMAS, 1972; ZIS et al.,1974; ECHAVARRIA-MAGE
et al., 1976) também demonstraram que lesões nigroestriatais prejudicam a
aquisição da memória de longa duração.
134
Disfunções na memória são comuns em pacientes com a DP. Alguns estudos
sugerem que estes pacientes devem ter algum problema em vincular informações
armazenadas a longo prazo, o que é consistente com possíveis defeitos no córtex
entorrinal e hipocampo, regiões envolvidas na consolidação da memória (HELKALA
et al., 1988; PANEGYRES, 2004).
A depleção massiva de dopamina é reproduzida pelo modelo com a 6-OHDA,
onde os sintomas motores aparecem após uma perda de aproximadamente 70%
(DEUMENs, 2002). Jay (2003) demonstrou que a dopamina, parece ser uma das
chaves da regulação de certos estágios da aprendizagem e memória e da
plasticidade sináptica. O que foi reforçado por outros trabalhos que relatam o papel
dos receptores dopaminérgicos na amígdala basolateral e seu envolvimento nos
comportamentos de medo e ansiedade (ABE et al., 2009; DE LA MORA et al., 2010).
No presente estudo, os déficits encontrados na memória aversiva a longo prazo, são
provavelmente decorrentes da ação neurotóxica da 6-OHDA levando à depleção dos
neurônios dopaminérgicos e consequente falta de dopamina que é responsável por
alguns processos da memória e aprendizado.
A catequina na duas doses empregadas não foi capaz de prevenir o déficit de
memória aversiva produzido pela 6-OHDA. Um trabalho com a EGCG mostrou
déficits na memória aversiva em camundongos e atribui a este composto
propriedades amnésicas imitando drogas benzodiazepínicas. Vignes e cols. (2006)
sugerem que a EGCG modula a função do receptor de GABAA, levando a amnésia
anterógrada que é um efeito exercido pelo neurotransmissor GABA. Existe a
possibilidade de que a catequina também possua as mesmas propriedades da
EGCG, já que, as duas substâncias tem estruturas parecidas, justificando assim, a
inabilidade desta em proteger contra os danos de memória induzidos pela 6-OHDA.
Além de não ter protegido contra o déficit de memória induzido pela 6-OHDA,
a catequina na dose de 30mg/kg piorou a memória aversiva dos animais falso-
135
operados. Uma explicação para este resultado seria um efeito negativo relacionado
à dose. Alguns trabalhos relatam que a catequina pode ter ação pró-oxidante sobre
certas condições (YEN et al., 1997; SHIN et al., 2007; SUH et al., 2010). A atividade
pró-oxidante pode acelerar o dano oxidativo ao DNA, proteínas e carboidratos in
vitro. Yin e cols. (2010) mostraram o efeito pró-oxidante da EGCG em neurônios
hipocampais e atribuiram a este efeito, um excesso de cálcio intracelular, ativação de
caspases, injúria mitocondrial e geração de EROs. O possível efeito pró -oxidante da
catequina parece ser dose-dependente, como demonstrado por Elbling e cols.
(2005) que relataram que alguns compostos polifenólicos podem ter seus
mecanismos de ação dependentes da concentração e associados ao grau de
desbalanço redox e tipo de célula. Chung e cols. (2007) também viram que a EGCG
em doses maiores (acima de 25 μM) não foi capaz de proteger células da linhagem
SH-SY5Y de neuroblastoma humano da citotoxicidade induzida pela rotenona e,
além disso, aumentou a toxicidade do pesticida. A toxidade da rotenona parece
envolver um aumento da apoptose e na produção intracelular do radical superóxido.
A tirosina hidroxilase (TH) tem provado ser um bom marcador para neurônios
que contêm catecolaminas e tem sido utilizada para proporcionar mapas de sistemas
contendo catecolaminas (CUELLO, 1978). No presente trabalho, a imunorreatividade
para TH, promoveu a diminuição da TH no corpo estriado e SN. Estes resultados
estão em concordância com a literatura (CHATURVEDI et al., 2006; KWON et al.,
2010; YOKOIAMA et al., 2010) que demonstram que a 6-OHDA é capaz de diminuir
a expressão de TH em neurônios dopaminérgicos.
A catequina nas duas doses testadas foi capaz de proteger os neurônios
dopaminérgicos contra a 6-OHDA, demonstrado pelo aumento da imunorreatividade
para TH na SN e corpo estriado. Este resultado está de acordo com estudos feitos
com a EGCG que preveniu a perda de TH induzida pelo MPTP em camundongos
(CHOI et al., 2002) e com extrato de catequinas do chá verde (GUO et al., 2007).
Mandel e cols. (2004) também observaram o aumento dos níveis de neurônios
imunorreativos a TH na SNpc de camundongos tratados com EGCG que sofreram
lesão nigroestriatal pelo MPTP.
136
Os possíveis mecanismos envolvidos que explicam a neuroproteção das
catequinas contra toxicidade da 6-OHDA englobam ações antioxidantes, quelantes
de metais, inibição da enzima COMT, atividade antiinflamatória, estimulação da PKC
e outros fatores de transcrição gênica, bem como um efeito sobre a sobrevivência
celular (VAFEIADOU et al., 2007; MANDEL et al., 2008; ZHAO, 2009; WEIREB et al.,
2009). A atividade antiinflamatória das catequinas se deve à diminuição na
expressão de citocinas pró-inflamatórias e outro mediadores da inflamação
(MARUYAMA et al., 2010; SINGH et al., 2010; HIRAO et al., 2010). A ação
antiinflamatória das catequinas também é atribuída à inibição da enzima
ciclooxigenase 2 (COX-2). Hussein e cols. (2005) sugerem este mecanismo como
responsável por sua ação antitumoral. Foi demonstrado que além dos efeitos
antiinflamatórios, os polifenóis do chá verde têm a capacidade de inibir o bloqueio da
PKC. A PKC que é uma proteína transdutora de sinais intracelulares que se encontra
diminuída pelo efeito oxidante da 6-OHDA. A perda da PKC está implicada em outras
patologias resultantes de dano neuronal, como a isquemia e a privação de glicose. A
expressão da PKC está vinculada à preservação da sobrevivência celular e
formação e consolidação de diferentes tipos de memória. A ativação da proteína
quinase C pelas catequinas parece ser um dos muitos mecanismos neuroprotetores
que impedem a morte dos neurônios dopaminérgicos (LEVITES et al.,2002 ;KIM et
al.,2004; MANDEL et al., 2005; REZNICHENKO et al., 2005; KALFON et al., 2006).
Além disso, outros fatores de transcrição gênica parecem estar envolvidos na ação
das catequinas do chá verde, como as proteínas quinases ativadas por mitógenos
(MAPKs) que são ativadas pelas catequinas e genes pró-apoptóticos que têm a sua
expressão diminuída pela ação da catequina (MANDEL et al., 2005).
O transportador de dopamina (DAT) é uma proteína da membrana plasmática,
expressa exclusivamente em neurônios dopaminérgicos, que age sequestrando a
dopamina liberada na membrana sináptica, regulando assim a amplitude e a duração
da sinalização da dopamina (BANNON, 2005). Em mamíferos, o DAT está distribuído
principalmente em neurônios dopaminérgicos da SNpc, corpo estriado e núcleo
acumbens.. Na DP existe uma redução na densidade do DAT devido à perda dos
terminais dopaminérgicos (STORCH et al., 2004).
137
No presente trabalho, foi demonstrado que a 6-OHDA promoveu uma
diminuição na imunorreatividade para o DAT, tanto no mesencéfalo, quanto no corpo
estriado. Vários trabalhos tem demonstrado a diminuição da expressão e na
imunorreatividade do DAT na SN e corpo estriado em animais que sofreram lesão
nigroestriatal tanto com a 6-OHDA, quanto com o MPTP (MURER et al., 1998;
MARIN et al., 2008; YOKOYAMA et al., 2008; XU et al., 2009; AFONSO-ORAMAS et
al.,2010). Estes resultados corroboram com trabalhos em estudos post mortem em
pacientes de DP, mostrando que neurônios dopaminérgicos que sobrevivem em
pacientes da DP exibem baixa expressão para o gene do DAT comparados a
indivíduos normais (BANNON, 2005). A diminuição da expressão do DAT é
considerado um achado esperado após lesões dopaminérgicas, já que ele é uma
conseqüência direta da perda de dopamina (AFONSO-ORAMAS et al., 2010).
A catequina nas duas doses conseguiu bloquear uma diminuição do DAT
induzido pela 6-OHDA. Um estudo com cultura de células dopaminérgicas
mesencefálicas, realizado por Pan e cols (2003), mostrou que os polifenóis do chá
verde parecem bloquear a captação da toxina MPP+ pelo DAT. Um outro trabalho
sugere que a EGCG exerce um efeito modulando a internalização do DAT, regulada
pela ativação da PKC (LI et al., 2006). Considerando que tanto o MPTP, quanto a 6-
OHDA são transportados para o neurônio dopaminérgico pelo DAT (UHL, 2003),
muito provavelmente as catequinas do chá verde também atuam inibindo o
transporte da 6-OHDA pelo DAT por estes mesmos mecanismos propostos acima.
Os resultados das análises bioquímicas do nosso estudo demonstraram que a
6-OHDA não promoveu um aumento significativo dos níveis de nitrito, SOD e ou
peroxidação lipídica induzido pela 6-OHDA, como esperado. Trabalhos com a 6-
OHDA reportam que a lesão nigroestriatal causa aumento nos níveis de nitrito
(SINGH et al., 2005; GUO et al., 2007), decréscimo nos níveis da SOD (AHMAD et
al., 2005; YU et al., 2010;) e aumento da peroxidação lipídica (AHMAD et al 2005;
GUO et al., 2007; KABUTO et al., 2007; KHAN et al., 2010).
138
Em um trabalho realizado no nosso laboratório, Nobre Júnior e cols. (2003)
demonstraram que a catequina, in vitro, foi capaz de prevenir a morte de cultura
primárias de células mesencefálicas de rato induzida pela 6-OHDA, não diminuiu os
níveis de nitrito, mas foi capaz de inibir a peroxidação lipídica. Os mecanismos para
esta citoproteção estão apontados para a diminuição no estresse oxidativo e
quelação de ferro.
No presente trabalho, a catequina, por sua vez, alterou os níveis de nitrito.
Observamos um aumento nos níveis de nitrito no grupo experimental submetido à
lesão estriatal com a 6-OHDA e tratado com catequina na dose de 30mg. Ao que
parece, a catequina nesta dose, teve um efeito pró-oxidante sobre a formação de
nitrito. Este resultado está em concordância com alguns autores que atribuem aos
polifenóis do chá verde uma atividade pró-oxidante (SANG et al., 2005; SHIN et al.,
2007; LAMBERT & ELIAS., 2010).
Estudos em humanos relatam que altas doses de polifenóis do chá verde (600
-1800mg/dia) não causam efeitos adversos (CHOW et al., 2003; BERTUZZI et al.,
2006). No entanto existe um aumento de números de hepatotoxicidade associado ao
consumo de suplementos do chá verde (MAZZANTI et al., 2009). Em animais, como
já comentado, vários trabalhos sugerem um efeito pró-oxidante das catequinas
relacionado ao aumento da dose (CHUNG et al., 2007; YEN et al., 1997; SHIN et al.,
2007; TIAN et al., 2007; SUH et al., 2010). Efeitos pró-oxidantes destes compostos
são apontados também como responsáveis pelas propriedades anticancerígenas e
indutoras da apoptose e estão relacionados à presença de íons ferro-cobre e
aumento de caspases e fatores de transcrição associados à apoptose (AZAM et al.,
2004; LEE et al., 2010).
Uma das primeiras mudanças bioquímicas observadas nos pacientes da DP é
o decréscimo nos níveis da GSH. O GSH é o mais importante componente das
defesas antioxidantes celulares (Dickinson et al., 2002). Em geral, a SN é uma das
estruturas onde o GSH se encontra em níveis mais baixos e na DP os níveis de GSH
139
sofrem um decréscimo maior (Barath et al., 2002). Níveis baixos de GSH levam a um
aumento do estresse oxidativo, disfunção mitocondrial e consequentemente morte
celular (Jha et al., 2000).
No nosso estudo, a toxicidade da 6-OHDA promoveu um decréscimo nos
níveis de GSH em tecido mesencefálico, corroborando com os dados da literatura
(GARCÍA et al., 2000; AHMAD et al 2005; CHENG et al., 2009; KHAN et al., 2010;
YU et al., 2010). A 6-OHDA é apontada como responsável pelo aumento do estresse
oxidativo, especificamente por promover a produção de radicais superóxido, H2O2,
hidroxil e quinonas, através da sua ação inibitória sobre a cadeia respiratória
mitocondrial (EMBORG, 2004).
A catequina, nas duas doses propostas, aumentou significativamente os
níveis de GSH, revertendo o efeito neurotóxico induzido pela 6-OHDA. Estes efeitos
da catequina provavelmente ocorreram devido às suas propriedades antioxidantes já
descritas no nosso trabalho (WEINREB et al., 2009). O tripeptídeo glutationa possui
importantes funções antioxidantes como cofator em reações de isomerização, na
proliferação celular, regulação da apoptose, defesa celular contra EROs e interação
com outros mecanismos antioxidantes não-enzimáticos (DRINGEN, 2000; FORMAN
et al., 2009). A restauração dos níveis normais de glutationa no cérebro é
considerada uma chave importante na terapêutica da DP e a catequina pode ser
candidata ao tratamento adjuvantes da doença por este motivo.
O presente trabalho mostrou que a injeção unilateral de 6-OHDA no corpo
estriado causou uma diminuição significativa nas concentrações de dopamina (DA),
noradrenalina (NE), serotonina (5-HT) e DOPAC no mesencéfalo. Apesar da 6-
OHDA ter sido injetada no corpo estriado, a lesão atingiu o mesencéfalo
retrogradamente, depletando as monoaminas que se encontram em grande
quantidade na SN (local onde são sintetizadas). As lesões estriatais pela 6 -OHDA
têm demonstrado induzir neurodegeneração retrógrada dos neurônios da SN, que
são progressivas nas primeiras semanas da lesão (BERGER et al., 1991; CADET et
140
al., 1991; LEE et al., 1996; BLANDINI et al., 2008). Além da perda massiva de DA,
são descritas alterações em outros neurotransmissores, o que inclui alterações nos
níveis de 5-HT no corpo estriado e SN e redução do conteúdo de NA na SN
(READER & DEWAR, 1999). Um estudo realizado pelo nosso grupo também
constatou a que a 6-OHDA causou perda significativa de catecolaminas em tecido
estriatal (AGUIAR et al.,2006).
A catequina nas duas doses estudadas conseguiu diminuir significativamente
a perda de DA e NA no mesencéfalo induzida pela 6-OHDA. Um trabalho realizado a
EGCG, demonstrou a prevenção da perda de DA em animais submetidos à lesão
nigroestriatal pelo MPTP promovido por esta catequina (LEVITES et al., 2001). No
presente estudo, a catequina não foi capaz de reverter a perda de 5-HT induzida
pela 6-OHDA. Ao longo do nosso estudo, pudemos constatar que a catequina parece
ter exercido uma ação pró-oxidante, em doses maiores, como já comentado e
relatado por vários autores e que parece estar relacionado a uma maior
concentração do composto (YEN et al., 1997; CHUNG et al., 2007; SHIN et al., 2007;
SUH et al., 2010; YIN et al., 2010).
A catequina demonstrou, através do nosso estudo, exercer uma ação
neuroprotetora no modelo experimental de DP com a 6-OHDA, estes efeitos foram
evidenciados pela melhor performance dos animais no comportamento motor, na
memória de trabalho, diminuição da morte neuronal e aumento nos níveis de GSH.
Dentre os nossos achados, pudemos constatar que doses maiores deste polifenol
podem ser pró-oxidantes, acentuando o efeito tóxico da 6-OHDA, portanto, é
importante evitar doses maiores deste composto numa terapia para a DP.
2. Efeito do Estresse de Imobilização subcrônico sobre a lesão estriatal com 6-OHDA em ratos.
Segundo Chacot (1878), o estresse foi uma das primeiras causas propostas
para a DP. Foi proposto que tanto o estresse agudo, quanto o crônico podem levar
141
ao rápido aparecimeto da doença ou piorar os sintomas motores desta (SMITH et al.,
2008). Alguns autores sugerem que o estresse psicológico e social pode levar ao
surgimento de outras doenças neurodegenerativas como a doença de Alzheimer
(HASEGAWA, 2007; BISSETE, 2009). O estresse repetido está associado a
alteração de uma série de comportamentos e é capaz de mudar a fisiologia, sistema
imune, sistema endócrino, além de levar a doenças como diabetes, aterosclerose,
câncer e depressão (BUYNITSKY & MOSTOFSKY, 2009). Com base nestas
observações, decidimos estudar os efeitos do estresse sobre a DP no modelo
experimental com a 6-OHDA.
No presente estudo, utilizamos o estresse de imobilização (restraint stress),
onde ratos foram imobilizados em tubos plásticos diariamente durante seis horas por
11 dias (Luine et al., 1994). O estresse de restrição (imobilização) possui elementos
psicogênicos nele que não promovem sofrimento físico, mas de forma diferente, um
estressor puramente psicogênico, a restrição envolve um componente físico que
limita a resposta/estilo de defensiva do animal (McIntyre et al., 1999).
Um parâmetro importante utilizado para avaliar os efeitos do estresse é o
peso corporal. Considerando que a requisição de energia, consumo de alimentos e
processos metabólicos são mediados pelos glicocorticóides, a exposição crônica ao
estresse está relacionada a mudanças no peso corporal, tais como a perda de peso
(MARTI et al., 1994). No nosso modelo experimental, o grupo estressado apresentou
uma diminuição do ganho de peso significativa em relação aos outros grupos
testados. Naert e col.(2010) estudando os efeitos adaptativos do estresse,
observaram que após 5 dias de estresse de imobilização crônico houve um
decréscimo significativo do ganho de peso dos animais. Outros trabalhos também
demonstram esse mesmo efeito (CHEN et al., 2008; MCLAUGHLIN et al., 2009). A
redução no ganho de peso associada ao estresse está relacionada, pelo menos em
parte, pela anorexia (MARIN et al., 2007).
Paradoxalmente, o grupo submetido ao estresse que sofreu a lesão estriatal,
142
não apresentou uma diminuição significativa no ganho de peso. A associação
estresse e 6-OHDA, de alguma forma, teve um efeito fisiológico positivo sobre este
parâmetro, mas os mecanismos envolvidos são desconhecidos. Também observou-
se que animais que sofreram a lesão pela 6-OHDA, que não foram submetidos ao
estresse, não demonstraram diminuição no ganho de peso.
No teste do campo aberto, os animais falso-operados submetidos ao estresse
de imobilização tiveram um pior desempenho no comportamento exploratório
vertical. Este achado confirma resultados de outros trabalhos com estresse de
imobilização e campo aberto que sugerem que o estresse diminui a atividade
locomotora devido às inúmeras mudanças no comportamento, função autonômica e
secreção hormonal, além de induzir a depressão tanto em humanos quanto em
animais (KAUR et al., 2010; NADE & YADAV, 2010; CHEN et al., 2010).
Animais que sofreram a lesão com a 6-OHDA e que foram submetidos ao
estresse de imobilização tiveram uma melhor performance tanto no comportamento
exploratório vertical, quanto no horizontal. Smith e cols. (2008), estudando o efeito
do estresse crônico no parkinsonismo em ratas fêmeas da linhagem Long-Evans,
obtiveram uma diminuição nestes mesmos parâmetros testados. De maneira
contraditória, no presente trabalho, o estresse de imobilização parece ter induzido
uma melhor performance nestes testes motores.
O estresse de imobilização subcrônico em associação com a 6 -OHDA não
modificou significativamente o número de rotações induzidas pela apomorfina, não
demonstrando um efeito protetor motor na DP. Estes dados são corroborados por um
estudo realizado por Smith e cols (2008) que também avaliou os efeitos da
associação estresse e DP, e que embora os dados mostrados neste trabalho
sugiram um efeito negativo do estresse na progressão da doença, no nosso
trabalho, não evidenciamos uma piora motora.
143
O estresse social crônico é um dos fatores mais importantes responsáveis
pelo desencadeamento e/ou progressão de desordens depressivas e de ansiedade
em seres humanos (ST-JEAN-TRUDEL et al., 2009; FAGRING et al., 2008; CLOW &
HAMER, 2010). A DP frequentemente está associada à depressão (MAYEUX,1990).
Existe uma associação positiva entre depressão e subseqüente risco de DP
(SCHUURMANN et al., 2002). Por isso, também investigamos um efeito depressivo
da associação do parkinsonismo com o estresse de imobilização subcrônico.
O teste do nado forçado é realizado no intuito de pesquisar novos tratamentos
antidepressivos (PORSOLT, 1979). Ratos e camundongos são forçados a nadar em
um espaço restrito. Um tempo de imobilidade maior está correlacionado com o
comportamento depressivo. No presente trabalho, o modelo de Porsolt (1978) foi
empregado com o objetivo de verificar o comportamento depressivo nos animais
experimentais.
Os animais do grupo estresse apresentaram um comportamento depressivo.
Alguns estudos relatam que o estresse de imobilização é considerado um dos mais
severos estressores que implicam em estresse emocional (VALLÈS et al. 2004).
Estes resultados estão de acordo com a literatura (CANCELA et al., 1991; MOLINA
et al., 1994; ULLOA et al., 2010), que demonstra que o estresse crônico repetido
está associado com o desenvolvimento de manifestações da depressão.
Os animais parkinsonianos não se apresentavam deprimidos, de maneira
diferente daqueles submetidos ao estresse subcrônico. Ao contrário deste resultado
com a 6-OHDA, alguns trabalhos demonstram que a neurotoxina é capaz de induzir
um comportamento depressivo nos animais (TADAIESKY et al., 2008; SANTIAGO et
al., 2010). Estes autores sugerem que este achado ocorre devido à depleção de 5-
HT e de outras catecolaminas pela 6-OHDA. A etiologia da depressão na DP é
complexa e pode resultar da mudança nos níveis 5 -HT relacionada à deficiência
dopaminérgica central associada aos sintomas da doença (MAYEUX,1990). A
dopamina é apontada como uma das monoaminas envolvidas na patofisiologia da
144
depressão. Através da teoria monoaminérgica foi postulado que a depressão ocorre
devido à falta de monoaminas (5-HT, DA e NA) (DUNLOP & NEMEROFF, 2007). A
anedonia, uma condição que ocorre na depressão maior e que se caracteriza pela
perda da capacidade de sentir prazer, está relacionada a projeções dopaminégicas
no núcleo acumbens, sugerindo que o neurocircuito mesolímbico desempenha um
papel crucial na patogênese da depressão (STEIN, 2008).
Os animais parkinsonianos estressados apresentaram menor comportamento
depressivo do que os estressados sem a doença. Este resultado sugere que a lesão
induzida pela 6-OHDA pode levar a um pré-condicionamento dos animais, fazendo
com que haja menor efeito depressivo. O pré condicionamento é um fenômeno onde
baixas doses de um insulto nocivo protegem o cérebro de futuros insultos
(SHPARGEL et al., 2008). Os mecanismos moleculares responsáveis por este efeito
envolvem sinalização através de moléculas anti-apoptóticas, aumento de fatores
neurotróficos, ativação do receptor NMDA, alteração de fatores de transcrição dentre
outros (MARINI et al., 2008; SHPARGEL et al., 2008).
O estresse de imobilização subcrônico não causou danos na memória
operacional. Vários trabalhos demonstram o efeito prejudicial do estresse na
memória de trabalho. Chen e colaboradores (2010) demonstraram déficits na
memória operacional em testes com Y-maze, em camundongos submetidos ao
estresse de imobilização crônico (6h/28dias). Kleen e cols (2006) também obtiveram
o mesmo resultado. Outros trabalhos relatam que o estresse induz danos na
memória operacional mediados pelo rompimento da regulação do eixo hipotalâmico-
hipofisário-adrenal (HPA) (LUINE et al., 1994; FILE, 1980; RIGHT et al., 2006;
REAGAN et al., 2008). No entanto, é importante salientar que os efeitos do estresse
estão relacionados à duração, intensidade e tipo de estressor. Luine e col.(1996)
demonstraram que ratos submetidos ao estresse de imobilização (6h/13d) tiveram
uma melhor performance no teste do labirinto radial, que envolve a memória de
referência e de trabalho. Os mecanismos apontados parecem envolver alterações
nos sistemas noradrenérgico, colinérgico, serotoninérgico e gabaérgico.
145
O estresse biológico pode acarretar muito alterações neuroanatômicas e
neuroquímicas no sistema nervoso, no entanto, existem evidências de que certos
tipos de estresse podem facilitar o aprendizado (RADULOVIC, 1999). Os diferentes
efeitos do estresse no aprendizado (prejudicial versus benéfico) dependem de
algumas variáveis que incluem duração do estímulo, intensidade, número de
sessões, tipo de teste e gênero dos animais (SHORS & SERVATIUS, 1997; ADLARD
et al., 2010). McLaughlin e cols. (2007) sugerem que mudanças no comportamento
dos animais relacionadas ao estresse crônico podem ocorrer no período de 7-13
dias de estresse. O estresse de 21 dias/6h é considerado capaz de induzir danos na
memória espacial e retração na células CA3 do hipocampo (MAGARIÑOS &
MCEWEN, 1995; LUINE et al., 1996; MCLAUGHLIN et al.,2007; CONRAD et al.,
2010). O modelo de estresse utilizado no presente trabalho (11d/6h) não demonstrou
induzir danos na memória de trabalho provavelmente devido a menor duração e
intensidade do estressor.
O estresse é um forte modulador da memória. Em roedores, o estresse
moderado tem sido reportado como facilitador da memória, enquanto altos níveis de
estresse prejudicam a sua função (CORDERO & SANDI, 1998; DEL ARCO et al.,
2007; SANDI & PINELO-NAVA, 2007; SANDI et al., 1997; SELDEN et al., 1990). O
estresse aumenta a expressão do gene da noradrenalina nas enzimas que atuam na
sua síntese (Gavrilovic et al., 2009), sendo que o sistema noradrenérgico está
envolvido na consolidação da memória na amígdala (FERRY & MCGAUGH, 2000).
Outros neurotransmissores estão envolvidos na ativação da memória na amígdala,
como é o caso do GABA (MAKKAR et al., 2010).
No presente estudo, animais submetidos ao estresse de imobilização
subcrônico demonstraram um dano significativo na memória aversiva de longa
duração. Estes resultados estão em concordância com a litera tura. Nagata e cols
(2009) demonstraram que sessões de estresse de dez horas diárias por duas
semanas levaram a perda de memória tardia em camundongos, e esta perda é
atribuída ao aumento do estresse oxidativo cerebral e diminuição da neurogênese.
A associação entre a DP e o estresse ainda é um assunto pouco estudado.
146
Snyder e cols. (1985) estudaram o efeito de vários estressores (exposição ao frio
severo, choques elétricos e privação de glicose) na doença de Parkinson, em um
modelo utilizando a 6-OHDA. Os resultados obtidos revelaram que estes estressores
em conjunto prejudicaram o comportamento motor destes animais. Um outro estudo
(WEIHMULLER et al., 1988) utilizando camundongos submetidos a lesão
nigrostriatal pelo MPTP revelou que o estresse agudo (natação na água gelada)
também piorou déficits motores nestes animais. O modelo de estresse utilizado no
presente estudo é um método menos severo que os utilizados por estes autores,
além de ser um modelo subcrônico, que induz um estresse fisiológico e físico, devido
a imobilidade.
No presente estudo, ratos com lesão estriatal pela 6-OHDA submetidos ao
estresse de imobilização diariamente por 11 dias, apresentaram uma melhora na
memória aversiva de longa duração quando comparados aos animais lesionados
pela 6-OHDA. Alguns trabalhos sugerem que o estresse de imobilização aumentaria
os níveis de dopamina no cérebro (ABERCROMBIE et al., 1989; KIM et al.,2005;
SWANSON et al.,2004), sustentando essa hipótese, a dopamina liberada pode, de
alguma maneira, estar atuando nos processos de formação de memória e
aprendizado, através dos receptores dopaminérgicos específicos (D1 e D2) (JAY,
2003; ABE et al., 2009; DE LA MORA et al., 2010), levando a uma melhor
performance destes animais na memória aversiva de longa duração, quando
submetidos ao teste da esquiva passiva.
O fato do estresse de imobilização em animais falso-operados induzir a
déficits na memória aversiva, enquanto que em animais lesionados com a 6-OHDA e
estressados apresentaram uma melhora na memória, é um fato intrigante. Keefe e
cols (1993) comprovaram que o estresse aumenta o efluxo de dopamina no corpo
estriado de animais submetidos a lesão pela 6-OHDA e este processo parece ser
iniciar através de aminoácidos excitatórios como glutamato e aspartato. Um outro
trabalho (ZIGMOND et al., 1998) acrescenta que o glutamato atua na síntese de
dopamina via receptores ionotrópicos no corpo estriado e na liberação de dopamina
através de receptores da SN, sob condições de estresse prolongado e/ ou
147
degeneração de neurônios dopaminérgicos. Pode ser que o significado fisiológico
destes achados contraditórios resida no fato de que a associação estresse 6 -OHDA
acarrete uma liberação extra de dopamina em determinada fase da degeneração
nigroestriatal levando a mecanismos compensatórios apenas momentaneamente.
Uma outra explicação seria um possível efeito protetor do condicionamento ao
estresse. O estresse foi aplicado por 11 dias, neste tempo a lesão nigroestriatal
começou a progredir e provavelmente houve algum mecanismo adaptativo, através
de um pré-condicionamento ao estresse, levando a uma melhora nas respostas aos
estímulos fisiológicos, como já citado anteriormente, no teste do nado forçado
também ocorreu esta mesma resposta. Um outro exemplo disso seria o aumento do
ganho de peso no animais submetidos ao estresse e à lesão estriatal, diferente
daqueles animais que sofreram apenas estresse.
O estresse de imobilização subcrônico não alterou a imunorreatividade para
TH no mesencéfalo, quando comparado com o controle, mas o estresse associado à
lesão com a 6-OHDA, aparentemente melhorou o dano neuronal dopaminérgico.
Smith e cols (2008) demonstram que o estresse crônico não aumentou a perda de
TH no mesencéfalo de animais submetidos ao estresse de imobilização por 14 dias
e que sofreram lesão nigroestriatal pela 6-OHDA. Copeland (2005), estudando os
efeitos do estresse crônico, demonstrou que o estresse de 7 dias não alterou os
níveis de TH no corpo estriado.
Alguns trabalhos sugerem que o estresse de imobilização crônico e agudo
aumenta os níveis de TH em células catecolaminérgicas (RUSNÁK et al., 2001;
TÓTH et al., 2008). Dagnino-Subiabre e cols. (2006) relatam que o estresse de
imobilização crônico leva a perda significativa da expressão de TH, mas outros
discordam, Saban & Kvetnanský (2001), reportaram que a substância negra é
relativamente resistente aos efeitos do estresse.
No presente trabalho, foi demonstrado a 6-OHDA foi capaz de promover uma
diminuição na imunorreatividade para o DAT, tanto no mesencéfalo, quanto no corpo
148
estriado. Vários trabalhos também demonstraram a diminuição do DAT na SN e
corpo estriado (MURER et al., 1998; MARIN et al., 2008; XU et al., 2009). Os
resultados também mostraram que o estresse de imobilização subcrônico, inibiu
discretamente esta perda de DAT. Os resultados da literatura são conflitantes com
relação ao DAT e estresse, um trabalho relata que o estresse crônico diminui os
níveis de DAT no corpo estriado, enquanto o estresse agudo aumenta (LUCAS,
2007). Copeland e cols (2005) observaram que o estresse de imobilizaçao crônico
aumenta a expressão do RNAm e o binding do DAT no mesencéfalo, e esse
aumento parece estar ligado a um mecanismo compensatório que tenta manter a
transmissão dopaminérgica a níveis normais, durante exposição ao estresse.
No presente trabalho, o estresse de imobilização subcrônico aumentou os
níveis de nitrito no corpo estriado direito (lesado), tanto nos animais falso-operados,
quando em animais lesionados pela 6-OHDA. Alguns autores tem demonstrado que
o estresse aumenta parâmetros bioquímicos como o nitrito, em tecidos cerebrais e
atribuem este incremento ao aumento no estresse oxidativo (Dhir et al., 2006;
Kumari et al., 2007; Kumar et al., 2010; Gulati et al., 2009).
O estresse não alterou atividade da SOD e nem a peroxidação lipídica. Um
estudo realizado por Akpinar e cols (2008) mostrou que o estresse de imobilização
crônico (1hora/21dias) aumenta os níveis cerebrais de TBARS, diminui a atividade
da catalase e SOD. Outros trabalhos relatam o aumento do estresse oxidativo
cerebral induzido pelo estresse de imobilização crônico (ABIDIN et al., 2004; SAHIN
& GÜMÜŞLÜ et al., 2007; CHAKRABORTI et al., 2010; BALK et al., 2010). Ao
contrário, destes trabalhos citados, o modelo de estresse empregado não parece ter
acentuado o estresse oxidativo, provavelmente pelo tipo de estresse (moderado e
subcrônico) empregado.
Numerosos estudos têm demonstrado que o estresse de imobilização agudo
ou crônico resulta em um desbalanço do status antioxidante, levando ao aumento do
estresse oxidativo, e dano aos tecidos (OISHI et al.,1999; 2001; ATIF et al., 2008;
149
GULATI et al., 2009; GULATI et al., 2009; AKPINAR et al., 2008). No presente
estudo, o estresse de imobilização não alterou os níveis de GSH, o que está em
desacordo com alguns trabalhos da literatura que relatam que o estresse diminui os
níveis de GSH (SAHIN & GÜMÜSLÜ et al., 2007; ATIF et al., 2008; AKPINAR et al.,
2008; CHAKRABORTI et al., 2008. Um outro trabalho feito por Madrigal e cols
(2001) mostrou que o estresse de imobilizaçao subcrônico de 7 e 14 dias não
diminui os níveis de GSH, no entanto, na exposição ao estresse por um tempo mais
prolongado (21 dias) acarretou um decréscimo nos níveis de GSH.
Apesar do estresse não ter alterado os níveis de GSH, nos animais
parkinsonianos, o estresse de imobilização conseguiu reverter significativamente os
efeitos induzidos pela 6-OHDA. Este resultado, sugere que o estresse de
imobilização promoveu um pré-condicionamento, levando a uma melhora no dano
neuronal induzido pela lesão estriatal.
De uma maneira geral, a exposição de humanos ao estresse psicológico
crônico e de animais ao estresse de imobilização resulta em dano oxidativo, o que
acarreta mudanças na fisiologia. A ativação do eixo HPA tem sido a medida mais
utilizada para avaliar os efeitos do estresse (RABASA et al., 2010). Quando os
animais são expostos ao mesmo estressor por vários dias, existe uma redução na
resposta do eixo HPA e de outras variáveis fisiológicas devido a uma habituação
para com o estressor. Após 10 ou 14 dias de estresse, os níveis de ACTH e
corticosterona são similares aos controles, isto é, retornam a níveis normais devido
ao feedback negativo do hormônio sobre o eixo HPA (ISHIKAWA et al.,1995; KANT
et al.,1992). Essa redução na resposta parece estar relacionada à familiarização
com o estressor, eventualmente resultando na redução do impacto global do
estresse sobre o organismo (DE BOER et al., 1980; GRISSOM & BHATNAGAR,
2009).
Armario e cols (1990) e De Boer e cols (1980) relatam que a dosagem da
glicose plasmática é uma ferramenta importante para verificação de parâmetros
150
como a intensidade e a habituação ao estresse. A exposição aguda ao estresse leva
a ativação do eixo HPA, que libera adrenalina e glicocorticóides da glândula adrenal,
o que consequentemente, leva a um aumento na liberação da glicose plasmática
(JACOBSON & SAPOLSKY, 1991). No nosso trabalho, não observamos alterações
na glicose em animais estressados, como esperado, já que depois de 11 dias,
provavelmente, existe uma habituação ao estresse (ARMARIO et al., 1990; RABASA
et al., 2010).
O presente estudo mostrou que a injeção estriatal de 6-OHDA promoveu uma
depleção de DA, NA, 5-HT e DOPAC no mesencéfalo destes animais, como já
comentado na primeira parte desta discussão. O estresse de imobilização de 11
dias/6horas levou a uma depleção significativa de DA e DOPAC no mesencéfalo de
animais controles e não protegeu contra a diminuição induzida pela 6-OHDA.
Imperato e cols. (1993) demonstraram que inicialmente o estresse aumenta os níveis
de DA, mas com repetidas sessões do mesmo estressor, há uma inibição dos
neurônios dopaminérgicos causado pelo surgimento da depressão, que é
consequência do estresse. Outros autores demonstraram que o estresse crônico
diminuiu os níveis de DA. Rasheed & Ahmad e cols. (2010) observaram que vários
tipos de estressores durante 7 dias, diminuíram as concentrações de DA no corpo
estriado. Além disso, Rasheed e cols. relatam um aumento na expressão do receptor
D1 no corpo estriado sob estas condições. O receptor D1 predomina na via direta do
sistema nigroestriatal e facilita o movimento, na DP esta via está prejudicada.
Possivelmente um aumento na expressão do receptor D1 explique uma melhor
performance em alguns testes de animais (crossing e memória aversiva) que
sofreram a lesão estriatal e foram submetidos ao estresse.
O estresse de imobilização subcrônico causou um aumento nos níveis de
noradrenalina nos grupos falso-operado e lesionado pela 6-OHDA. Este resultado é
corroborado por outros autores que viram que o estresse crônico aumenta os níveis
de noradrenalina (ANOKHINA et al., 1985; ADELL et al., 1989; PAVCOVICH et al.,
1990). Como já comentado, o estresse aumenta a expressão do gene da
noradrenalina nas enzimas que atuam na sua síntese (GAVRILOVIC et al., 2009).
151
Provavelmente este mecanismo está implicado no aumento da NA nos animais q ue
sofreram estresse subcrônico. O estresse protegeu da perda de 5-HT induzida pela
lesão estriatal pela 6-OHDA. Essa depleção de serotonina não está provavelmente
relacionada ao estado depressivo dos animais, verificado através do teste do nado
forçado, mas a depleção de dopamina está possivelmente envolvida na gênese da
depressão.
A depressão clínica está associada à deficiência na função normal das
monoaminas centrais (BONHOMME & ESPOSITO, 1998) e parece resultar em parte
do decréscimo na atividade do sistema serotoninérgico. O sistema serotoninérgico
tem sido amplamente investigado como um elemento chave na patofisiologia da
depressão e como mediador na ação terapêutica de antidepressivos (ALBERT &
LEMONDE, 2004). Não existe somente alteração nos níveis de serotonina, mas
também na expressão de receptores dopaminérgicos. Além disso, inúmeras
evidências favorecem a hipótese de que a neurotransmissão serotoninérgica seja
sensível a diferentes estresses e que esteja envolvida com os processos de
adaptação a eventos aversivos. De acordo com esta teoria, a depressão estaria
relacionada a uma falha na capacidade de adaptação dos receptores 5-HT1A à
exposição crônica a eventos aversivos e, indiretamente, ao excesso de
neurotransmissão mediada pelos receptores 5-HT2A. (DEAKIN & GRAEFF, 1991).
Por um outro lado, a dopamina também parece exercer um papel importante na
patofisiologia da depressão, estando associada ao aparecimento de sintomas como
a anedonia (Stein, 2008). Uma prova disto é que no presente trabalho, os animais
submetidos ao estresse de imobilização demonstraram uma grande depleção de
dopamina, mesmo sem terem sofrido a lesão estriatal pela 6-OHDA.
Nos animais submetidos à lesão nigroestriatal pela 6-OHDA houve uma
grande depleção de 5-HT no mesencéfalo, bem maior que a depleção promovida
pelo estresse de imobilização, no entanto estes animais não se encontravam em
estado depressivo. Este resultado pode ser explicado pelo fato de que a depleção de
5-HT ocorreu devido à lesão e não acarretada pelo estresse de imobilização. A lesão
pela 6-OHDA se mantém restrita ao sistema nigroestriatal, enquanto que o estresse
152
promove mudanças no sistema serotoninérgico que envolve áreas cerebrais mais
específicas nos roedores, como o hipocampo, núcleo accumbens, amígdala, córtex
pré-frontal e estruturas límbicas (CELADA et al., 2004.; FINK & GÖTHERT, 2007;
SAVITZ et al., 2009; SCHOLL et al., 2010).
Nos gânglios da base, a SN é a região com mais densa inervação de
neurônios serotoninérgicos, principalmente de receptores do tipo 5-HT2C (FOX &
BROTCHIE, 2000). Receptores 5-HT2C são excitatórios e modulam a liberação de
DA pelo sistema nigroestriatal. Pacientes com DP exibem anormalidades nestes
receptores, bem como ratos submetidos à lesão intranigral pela 6 -OHDA (FOX et al.,
1998). Possivelmente, um mecanismo fisiológico adaptativo relacionado ao estresse
e exercido pelos receptores 5-HT2C da SN esteja contribuindo para que os níveis de
serotonina no mesencéfalo não tenham decaído muito nos animais sob o efeito do
estresse de imobilização, que sofreram a lesão estriatal em comparação aos que
sofreram apenas a lesão estriatal. Este mecanismo provavelmente atua melhorando
a transmissão dopaminérgica, já que estes animais evidenciaram uma recuperação
parcial do comportamento motor, diminuição na morte neuronal e aumento das
defesas antioxidantes.
O presente trabalho mostrou que o modelo de estresse de imobilização
subcrônico de 11d/6hrs não levou a uma piora no parkinsonismo experimental. Pelo
contrário, houve uma melhora nos sintomas. Os mecanismos para estes resultados
provavelmente envolvem uma melhora na via serotoninérgica e dopaminérgica, e
merecem ser investigados mais profundamente.
153
VII. CONCLUSÃO
A catequina, um flavonóide encontrado na Camelia sinensis, demonstrou,
através do nosso estudo, exercer uma ação neuroprotetora no modelo experimental
de DP com a 6-OHDA, estes efeitos foram evidenciados pela melhor performance dos
animais no comportamento motor, na memória de trabalho, diminuição da morte
neuronal e aumento nos níveis de GSH. Dentre os nossos achados, pudemos
constatar que doses maiores deste polifenol podem ser pró-oxidantes, acentuando o
efeito tóxico da 6-OHDA, portanto, é importante evitar doses maiores deste composto
numa terapia para a DP.
O modelo de estresse de imobilização subcrônico de 11d/6hrs não levou a uma
piora no parkinsonismo experimental como poderíamos supor. Pelo contrário, houve
uma melhora nos sintomas motores. O estresse de imobilização também reverteu
parcialmente a morte neuronal no corpo estriado e mesencéfalo nos animais
parkinsonianos. Houve um aumento nos níveis de GSH no tecido mesencefálico,
demonstrando um efeito neuroprotetor sobre este tecido. O estresse de imobilização
não protegeu da diminuição das concentrações de dopamina e DOPAC, mas levou a
um aumento nos níveis de noradrenalina e serotonina no mesencéfalo. A explicação
para estes achados provavelmente envolvem uma melhora nas vias serotoninérgica e
dopaminérgica, o que leva a uma melhora nos sintomas motores.
Os resultados do presente trabalho demonstram que tanto a catequina, quanto
estresse de imobilização foram neuroprotetores neste modelo experimental da DP.
154
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