efeito do tratamento com suco de uvaia (eugenia uvalha ......sugerem o uso do fruto da uvaia como...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA METABÓLICA
Efeito do Tratamento com Suco de Uvaia (Eugenia uvalha Cambess)
Sobre a Esteatose Hepática e os Mecanismos Envolvidos no
Metabolismo de Lipídios e Estresse Oxidativo em um Modelo
Experimental
Juliana Márcia Macedo Lopes
Ouro Preto – Minas Gerais
2018
UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA METABÓLICA
Efeito do Tratamento com Suco de Uvaia (Eugenia uvalha Cambess)
Sobre a Esteatose Hepática e os Mecanismos Envolvidos no
Metabolismo de Lipídios e Estresse Oxidativo em um Modelo
Experimental
Juliana Márcia Macedo Lopes
Orientadora: Profª. Drª. Maria Lucia Pedrosa
Coorientador: Prof. Dr. Marcelo Eustáquio Silva
Ouro Preto – Minas Gerais
2018
Tese de doutorado apresentado ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências Biológicas do Núcleo de
Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade
Federal de Ouro Preto, como parte integrante dos
requisitos para a obtenção do Título de Doutor em
Ciências Biológicas, área de concentração: Bioquímica
Metabólica e Fisiológica.
Catalogação: www.sisbin.ufop.br
L881e Lopes, Juliana Márcia Macedo. Efeito do tratamento com suco de uvaia (Eugenia uvalha Cambess) sobre aesteatose hepática e os mecanismos envolvidos no metabolismo de lipídios eestresse oxidativo em modelo experimental [manuscrito] / Juliana MárciaMacedo Lopes. - 2018. 109f.: il.: color; grafs; tabs.
Orientadora: Profª. Drª. Maria Lúcia Pedrosa. Coorientador: Prof. Dr. Marcelo Eustáquio Silva.
Tese (Doutorado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto deCiências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas.Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Área de Concentração: Bioquímica Metabólica e Fisiológica.
1. Eugênia (Planta). 2. Dieta de alto teor proteico. 3. Esteatose hepática. 4.Stresse oxidativo . I. Pedrosa, Maria Lúcia. II. Silva, Marcelo Eustáquio. III.Universidade Federal de Ouro Preto. IV. Titulo.
CDU: 612.354
i
ii
Dedico esta tese aos meus pais Joana e Antônio
Marcio que sempre me educaram e me
incentivaram na busca de meus objetivos.
iii
APOIO FINANCEIRO
Agradeço ao auxílio financeiro da CAPES, FAPEMIG, CNPq e UFOP.
iv
AGRADECIMENTO
Á Profª. Drª Maria Lúcia Pedrosa e Ao Prof. Dr. Marcelo Eustáquio Silva pela
orientação, disponibilidade, sabedoria, dedicação, empenho, conselhos, motivação,
ensinamentos e valores que levarei para a vida toda. As críticas construtivas, as discussões
e reflexões foram fundamentais ao longo de todo o percurso. Sou grata a vocês por terem
me dado à oportunidade de desenvolver este trabalho, e pelos exemplos de pessoas e
profissionais que foram para mim durantes esses anos. Muito obrigada.
Á todos os colegas dos Laboratórios de Bioquímica Metabólica e Nutrição Experimental
Narinha, Joyce, Renata, Larissa, Alice, Ana Maria, Mayara, Josilene e Mariana pela
amizade e companheirismo, pela ótima convivência e por sempre estarem dispostas a
ajudar. A realização deste trabalho não seria possível sem vocês!
Ao Professor Wanderson Geraldo de Lima pela colaboração.
Ao Jair Pastor Mota e Clodoaldo Pereira dos Santos, pela ajuda nos cuidados
despendidos com os animais.
Aos laboratórios do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da UFOP por
gentilmente cederem o uso dos equipamentos.
Aos professores do Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas pelos
ensinamentos.
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas pela oportunidade de poder
concluir a pós-graduação em um curso de ótima qualidade.
Muito obrigada!
v
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
Primeiramente agradeço a Deus por ter me concedido o dom da vida e por abençoar
sempre todos os meus passos.
Aos Meus Pais, pelo apoio incondicional, amor e dedicação e por sempre me motivarem
me mostraram o quanto era importante estudar e serem meus exemplos de vida.
Á minha irmã Isabela, pelo carinho, amizade e apoio.
Aos Meus Avós por sempre acreditarem em mim e pelas orações.
Ao Erick pelo amor, dedicação e incentivo. Por me acompanhar nessa longa caminhada,
sempre cuidando de mim. Obrigada pela compreensão e paciência.
vi
RESUMO
O consumo excessivo de uma dieta hiperlipídica eleva os níveis dos lipídios
plasmáticos, podendo resultar em doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD). Por
outro lado, sabe-se que a dieta desempenha um papel fundamental na NAFLD, tornando
as intervenções dietéticas para a prevenção um tópico importante para pesquisas
particularmente devido à grande diversidade de compostos bioativos presentes nos
alimentos. A uvaia é um fruto pertencente à família da Mirtaceae e vem sendo estudado
por apresentar elevada capacidade antioxidante in vitro e por possuir diversos compostos
bioativos relacionados a efeitos benéficos à saúde. Assim, o presente trabalho investigou
o efeito do tratamento com suco de uvaia sobre a esteatose hepática e mecanismos
envolvendo o metabolismo de lipídios e estresse oxidativo em um modeloexperimental
de NAFLD induzida por dieta hiperlipídica. Trinta e dois ratos Ficsher fêmeas foram
divididos inicialmente em 2 grupos experimentais, um grupo (C) recebeu dieta padrão
AIN-93M, e o outro grupo (H) recebeu uma dieta hiperlipídica (25% de óleo de soja e
2% de colesterol) por duas semanas, após este período, os grupos C e H foram
subdivididos em quatro grupos de oito animais de acordo com o tratamento recebido. Os
grupos C e CUv receberam dieta padrão, e os grupos H e HUv receberam dieta
hiperlipídica, os grupos CUv e HUv receberam tratamento com suco de uvaia (2 ml),
administrado diariamente via gavagem por mais seis semanas. A administração do suco
de uvaia reduziu significativamente o colesterol total e o colesterol não-HDL, reduziu o
conteúdo de lipídios hepáticos em 23%, diminuiu o volume das macrovesículas de
gordura e melhorou os níveis séricos das transaminases, apresentando, portanto, efeito
protetor sobre a esteatose hepática. Além disso a administração do suco de uvaia
aumentou a expressão do gene relacionado a β-oxidação de ácidos graxos mediada por
PPAR-α, e modulou seu gene alvo ACOX1, diminui a expressão do gene da ácido graxo
sintase. A uvaia ainda restaurou a biogênese peroxissomal quando observado a expressão
de PEX11α, PMP70, genes relacionados com a proliferação do peroxissomo, e a catalase,
principal enzima dessa organela. E ainda, promoveu uma melhora no balanço
oxidante/antioxidante hepático quando observado os níveis de proteína carbonilada,
glutationa reduzida, atividade de catalase e atividade paraoxonásica da enzima
paraoxonase sugerindo uma proteção contra a progressão da doença. Esses achados
sugerem o uso do fruto da uvaia como uma potencial terapia para injúrias hepáticas
através da regulação da biogênese peroxisomal e do estresse oxidativo, apoiando a ideia
de que os compostos bioativos são importantes na a prevenção da NAFLD.
Palavras chave: Eugenia uvalha Cambess, Dieta hiperlipídica, esteatose hepática,
estresse oxidativo.
vii
ABSTRACT
Excessive consumption of a high fat diet increases plasma lipid levels and may result in
non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). It is known that diet plays a key role in
NAFLD, making dietary interventions for prevention an important topic for research
particularly because of the great diversity of bioactive compounds present in foods. The
uvaia is a fruit belonging to the family of Mirtaceae and has been studied for having high
antioxidant capacity in vitro and for having several phytochemical compounds related to
beneficial effects to health. The present study investigated the protective effect of uvaia
juice in an animal model of NAFLD induced by high fat diet. Thirty-two female Ficsher
rats were initially divided into 2 experimental groups, one group (C) received AIN-93M
standard diet, and the other group (H) received a hyperlipid diet (25% soybean oil and
2% cholesterol) for two weeks, after this period, groups C and H were subdivided into
four groups of eight animals according to the treatment received. Groups C and CUv
received a standard diet, and groups H and HUv received a hyperlipidic diet, the CUv and
HUv groups received treatment with uvaia juice (2 ml) administered daily via gavage for
another six weeks. The administration of urea juice significantly reduced total cholesterol
and non-HDL cholesterol, showed a protective effect on hepatic steatosis when a
reduction of hepatic lipid content was observed in 23%, a decrease in the volume of fat
macrovesicles and an improvement in serum levels transaminases. In addition, grape juice
administration modulated the expression of the PPAR-α-mediated β-oxidation-related
gene, ACOX1, and decreased the expression of the FAS-related fatty acid synthesis gene.
The uvaia also restored the peroxisomal biogenesis when the expression of PEX11α,
PMP70 and catalase was observed in steatosis rats treated with uva juice. In addition, it
promoted an improvement in hepatic oxidant / antioxidant balance when observed levels
of carbonylated protein, reduced glutathione, catalase activity and paraoxonase activity
of the enzyme paraoxonase. These findings suggest the use of uvaia fruit as a potential
therapy for liver injury by regulating peroxisomal biogenesis and oxidative stress,
supporting the idea that dietary antioxidants are a promising pathway for NAFLD
prevention.
Key words: Eugenia uvalha Cambess, high fat diet, hepatic steatosis, oxidative stress.
viii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Espectro de condições clínicas que compõe a doença hepática gordurosa não
alcoólica (NAFLD). .......................................................................................................... 5
Figura 2- Hipótese múltipla para o desenvolvimento da doença hepática gordurosa não
alcoólica (NAFLD) ........................................................................................................... 8
Figura 3- Ativação da lipogênese celular pela regulamentação proteína de ligação aos
elementos de resposta a esterol (SREBP). ...................................................................... 11
Figura 4- Metabolismo dos ácidos graxos e NAFLD, vias de oxidação e síntese nos
hepatócitos. ..................................................................................................................... 13
Figura 5- Biogênese dos peroxissomos em células de mamíferos ................................ 15
Figura 6- Enzimas envolvidas na geração e na inativação de espécies reativas de oxigénio
(ERO). ............................................................................................................................ 19
Figura 7- Fotos mostrando A: Árvore da uvaieira; B: O fruto da uvaia maduro e expondo
as sementes; C: Suco e geleia de uvaia. ......................................................................... 23
Figura 8- Representação esquemática do delineamento experimental. ......................... 30
Figura 9 - Perfil lipídico sérico de ratos que receberam dieta controle ou dieta
hiperlipídica, tratados suco de uvaia............................................................................... 45
Figura 10- Atividade sérica da alanina aminotransferase (ALT), aspartato
aminotransferase (AST) e fosfatase alcalina de ratos que receberam dieta padrão e dieta
hiperlipídica tratados suco de uvaia................................................................................ 47
Figura 11- Fotomicrografias representativas de secções do fígado de ratos que receberam
dieta padrão ou dieta hiperlipídica e foram tratados com suco de uvaia. ....................... 48
Figura 12- Expressão do mRNA de genes envolvidos no metabolismo do colesterol no
fígado em ratos que receberam dieta padrão e hiperlipídica tratados com suco de uvaia.
........................................................................................................................................ 51
Figura 13- Expressão do mRNA de genes envolvidos na biossíntese de ácidos graxos no
fígado em ratos que receberam dieta padrão e hiperlipídica tratados com suco de uvaia.
........................................................................................................................................ 52
Figura 14- Expressão do mRNA de genes envolvidos na oxidação de ácidos graxos no
fígado em ratos que receberam dieta padrão e hiperlipídica tratados com suco de uvaia.
........................................................................................................................................ 53
ix
Figura 15- Expressão do mRNA de genes envolvidos na biogênese peroxissomal no
fígado em ratos que receberam dieta padrão e hiperlipídica tratados com suco de uvaia.
........................................................................................................................................ 54
Figura 16- Níveis de TBARS e proteína carbonilada no fígado de ratos que receberam
dieta controle ou dieta hiperlipídica tratados com suco de uvaia. .................................. 55
Figura 17- Atividade arilesterásica e paraoxonásica da enzima PON no soro em ratos que
receberam dieta controle ou dieta hiperlipídica tratados com suco de uvaia. ................ 56
Figura 18- Atividade das enzimas antioxidantes, superóxido dismutase, catalase,
glutationa peroxidase e glutationa redutase em ratos alimentados com dieta controle e
dieta hiperlipídica tratados com suco de uvaia. .............................................................. 57
Figura 19- Conteúdo hepático de glutationa total, glutationa oxidada, glutationa reduzida
e a relação entre a glutationa total e glutationa oxidada no fígado de ratos que receberam
dieta controle ou dieta hiperlipídica tratados com suco de uvaia. .................................. 58
Figura 20- Resumo das evidências encontradas sobre o metabolismo de lipídios e estresse
oxidativo que possivelmente contribuíram para amenizar os danos hepáticos induzidos
por dieta hiperlipídica. .................................................................................................... 66
x
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Composição das dietas experimentais (g/Kg de dieta). ................................. 29
Tabela 2- Sequência dos oligonucleotídeos iniciadores utilizados para a análise de qRT-
PCR. ................................................................................................................................ 33
Tabela 3- Composição centesimal, conteúdo de polifenóis totais e capacidade
antioxidante do suco de uvaia. ........................................................................................ 43
Tabela 4- Composição corporal, ganho de massa, ingestão alimentar, eficiência alimentar
e excreção fecal de ratos que receberam dieta controle e hiperlipídica, tratados com suco
de uvaia. .......................................................................................................................... 44
Tabela 5- Massa relativa do fígado, lipídios totais, colesterol total e triacilgliceróis
hepático e fecal de ratos que receberam dieta controle ou dieta hiperlipídica tratados com
suco de uvaia. ................................................................................................................. 46
xi
LISTA DE ABREVIATURAS
ABCG5 ATP-binding cassette subfamily G transportes 5
ABCG8 ATP-binding cassette subfamily G transportes 8
ACAT-2 enzima colesterol aciltransferase-2
ACC1 acetil-CoA carboxilase 1
ACOX 1 acil-CoA oxidase 1
AG ácidos graxos
AIN do inglês, American Institute of Nutrition
ALT alanina aminotransferase
AST aspartato aminotransferase
ATP trifosfato de adenosine
BHT butilhidroxitolueno
cDNA ácido desoxirribonucleico complementar
CEA coeficiente de eficiência alimentar
Cq do inglês, Quantification cycle
CYP7A1 enzima colesterol-7α-hidroxilase
CPT-1α carnitina palmitoil transferase 1 α
DNPH 2,4-dinitrofenilhidrazina
dNTPs desoxirribonucleotídeos fosfatados
DPPH• 2,2-difenil-1- picril-hidrazil
DTNB ácido 5,5´ditio-bis (2-nitrobenzóico)
DTT Ditiotreitol
EAG equivalentes de ácido gálico
ERO espécies reativas de oxigênio
FAS ácido graxo sintase
FDN fibra detergente neutro
GPx glutationa peroxidase
xii
GR glutationa redutase
GSH glutationa reduzida
GSSG glutationa oxidada
H2O2 peróxido de hidrogênio
HDL Lipoproteína de alta densidade
HMG CoA – R enzima 3-hidróxi-3-metil-glutaril CoA redutase
LDL lipoproteína de baixa densidade
LDL-R receptor da lipoproteína de baixa densidade
MDA malondialdeído
NADPH-oxidase nicotinamida adenina dinucleótido fosfato oxidase
NAFLD doença hepática gordurosa não alcoólica
NASH esteato-hepatite não alcoólica
NO óxido nítrico
OH• radical hidroxila
O2•- radicais superóxido
PCR reação em cadeia da polimerase
PMPs proteínas de membranas peroxissomais
PMP70 proteína de membrana peroxissomal de 70 kDa
PON1 Paraoxonase-1
PPAR receptor ativado por proliferadores peroxissomais
PPAR-α receptor alfa ativado por proliferadores peroxissomais
qRT-PCR reação em cadeia da polimerase quantitativa pós-transcrição reversa
RNA ácido ribonucleico
rRNA ácido ribonucleico ribosomal
RO alcoxila
SDS dodecil sulfato de sódio
SDS-PAGE do inglês, sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
xiii
SOD superóxido dismutase
SREBP-1c proteína 1c ligadora do elemento regulado por esteróis
SREBP-2 proteína ligadora aos elementos de resposta a esterol-2
TAG Triacilgliceróis
TAR Reatividade antioxidante total
TBA ácido tiobarbitúrico
TBARS substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
TEA trietanolamina
TEAC capacidade antioxidante equivalente ao trolox
TMB 3,3’,5,5’ tetrametilbenzidina
TMP 1,3,3-tetrametoxipropano
TNB ácido 5-tio-2-nitrobenzóico
TNF fator de necrose tumoral
TRAP potencial antioxidante reativo total
VLDL lipoproteina de muito baixa densidade
XO xantina oxidase
γ-GCS gama-glutamilcisteína sintetase
xiv
SUMÁRIO
RESUMO................... ..................................................................................................... iv
ABSTRACT................ ..................................................................................................... v
LISTA DE FIGURAS ..................................................................................................... vi
LISTA DE TABELAS ................................................................................................... vii
LISTA DE ABREVIATURAS ...................................................................................... viii
1. INTRODUÇÃO/JUSTIFICATIVA .......................................................................... 1
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................................. 4
2.1 Doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD) .............................................. 4
2.1.1 Definição e epidemiologia da NAFLD ............................................................ 4
2.1.2. Patogênese, diagnóstico e terapia da NAFLD ............................................ 6
2.2. NAFLD e dieta hiperlipídica ............................................................................. 8
2.3. Homeostase do colesterol e NAFLD ................................................................. 9
2.4. Metabolismo dos ácidos graxos e NAFLD ...................................................... 12
2.5. Proliferação e crescimento peroxissonal .......................................................... 13
2.6. Estresse Oxidativo e NAFLD .............................................................................. 14
2.7. Sistema de defesa antioxidante enzimático ......................................................... 16
2.8. Sistema de Defesa Antioxidante não-enzimático ............................................ 18
2.9. Caracterização do fruto da uvaia (Eugenia uvalha Cambess) ......................... 20
2.9.1. Composição química do fruto da uvaia .................................................... 21
2.9.1. Compostos bioativos presentes no fruto da uvaia ......................................... 21
3. OBJETIVOS............................................................................................................ 23
3.1. Objetivo Geral .................................................................................................. 23
3.2. Objetivos Específicos .......................................................................................... 23
4. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................... 24
4.1. Suco de Uvaia .................................................................................................. 24
4.2. Preparo do Suco de Uvaia ................................................................................ 24
4.3. Caracterização do Suco de Uvaia .................................................................... 24
4.3.1. Composição Centesimal ........................................................................... 24
4.3.2. Conteúdo de polifenóis totais ................................................................... 24
4.3.3. Capacidade Antioxidante in vitro do Suco de Uvaia ................................ 25
4.4. Animais ............................................................................................................ 26
xv
4.5. Dietas ............................................................................................................... 26
4.6. Delineamento Experimental ............................................................................ 27
4.7. Dosagens dos metabólicos e enzimas séricos .................................................. 28
4.8. Extração e dosagem de lipídios hepáticos ....................................................... 29
4.9. Extração e dosagem de lipídios fecais ............................................................. 29
4.10. Avaliação histológica do fígado ................................................................... 29
4.11. Ensaio de RT-PCR quantitativa em tempo real ........................................... 30
4.11.1. Cálculo da eficiência dos primers ............................................................. 30
4.11.2. Extração de RNA ...................................................................................... 30
4.11.3. Síntese do cDNA ...................................................................................... 30
4.11.4. Desenho dos oligonucleotídeos iniciadores (primers) .............................. 31
4.11.5. RT-PCR Quantitativa em Tempo Real ..................................................... 32
4.12. Avaliação do estresse oxidativo ................................................................... 33
4.12.1. Peroxidação lipídica no fígado por TBARS ............................................. 33
4.12.2. Proteínas carboniladas .............................................................................. 34
4.13. Defesas antioxidantes ................................................................................... 35
4.13.1. Atividade arilesterásica e paraoxonásica da enzima Paraoxonase ........... 35
4.13.2. Atividade da enzima Catalase................................................................... 35
4.13.3. Atividade da enzima Superóxido dismutase ............................................. 36
4.13.4. Conteúdo de Glutationa total .................................................................... 36
4.13.5. Conteúdo de Glutationa oxidada .............................................................. 37
4.13.6. Conteúdo Glutationa reduzida .................................................................. 37
4.13.7. Glutationa Peroxidase e Glutationa Redutase .......................................... 38
4.14. Determinação de proteínas totais ................................................................. 39
4.15. Estatística ..................................................................................................... 40
5. RESULTADOS... .................................................................................................... 41
5.1. Composição centesimal, polifenóis totais e capacidade antioxidante do suco de
uvaia... ......................................................................................................................... 41
5.2. Composição corporal, ingestão alimentar e excreção fecal. ............................ 41
5.3. Perfil lipídico sérico ......................................................................................... 42
5.4. Massa do fígado, perfil lipídico hepático e fecal. ............................................ 43
5.5. Efeito do suco de uvaia sobre os indicadores séricos de dano hepático .......... 44
5.6. Efeito do suco de uvaia na esteatose hepática ................................................. 45
5.7. Expressão do mRNA de genes envolvidos no metabolismo de lipídios .......... 46
xvi
5.7.1. Efeito do suco de uvaia na expressão de genes do metabolismo de colesterol
no fígado .................................................................................................................. 47
5.7.2. Efeito do suco de uvaia no metabolismo de ácidos graxos no fígado ...... 49
5.7.3. Efeito do suco de uvaia na expressão de proteínas peroxissomais ........... 51
5.8. Efeito do suco de uvaia nos biomarcadores do Estresse Oxidativo e Defesas
Antioxidantes .............................................................................................................. 53
5.9. Defesas antioxidantes ...................................................................................... 54
6. DISCUSSÃO...... ..................................................................................................... 57
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS .................................................................................. 64
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................... 65
9. ANEXOS............ ..................................................................................................... 85
9.1ANEXO I - Certificado de Aprovação da Comissão de Ética no Uso de
Animais......... .............................................................................................................. 85
9.2 ANEXO II – Trabalho publicado no Food Research International ..................... 86
9.3. ANEXO III – Trabalho submetido no Food Research International .................. 87
1
1. INTRODUÇÃO/JUSTIFICATIVA
A prevalência de doenças crônicas de origem metabólica, têm aumentado nas últimas
décadas, tendo sido responsáveis, em 2015, por 51,6% do total de óbitos na população de 30
a 69 anos no Brasil e por cerca de 70% de todas as mortes em todo o mundo (MENDIS, 2014;
MALTA et al., 2017). Esses distúrbios têm uma etiologia complexa, envolvendo fatores
genéticos, ambientais e nutricionais.
A doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD) é uma das causas mais comuns de
doenças do fígado na atualidade, pois sua alta prevalência está fortemente associada com a
obesidade, resistência à insulina, hipertensão e dislipidemia e representa a principal causa de
morbidade e mortalidade ligadas a doenças do fígado (ANGULO, 2002; CHOUDHURY;
SANYAL, 2004). Estima-se que atualmente a prevalência da NAFLD seja de 25 a 30% da
população em geral (YOUNOSSI et al., 2018). A NAFLD compreende a esteatose, a qual
pode progredir para formas mais graves de hepatopatia, tais como a esteato-hepatite não
alcoólica (NASH), fibrose, cirrose e carcinoma hepatocelular (ADAMS; ANGULO, 2005;
WHITE; KANWAL; EL–SERAG, 2012).
Diversas vias metabólicas estão envolvidas com o desenvolvimento e progressão da
NAFLD entre elas: distúrbios da homeostase do colesterol hepático e acúmulo de colesterol
livre no fígado, o aumento da liberação de ácidos graxos (AG) não esterificados do tecido
adiposo, aumento da síntese de novo de AG, redução na β-oxidação (POSTIC; GIRARD,
2008; COHEN.; HORTON; HOBBS, 2011; ABREU et al., 2014).
Uma das principais características da NAFLD é o acúmulo de triacilgliceróis (TAG)
hepáticos. Os receptores ativados por proliferadores peroxissomais (PPARs) desempenham
papel importante neste contexto, eles e possuem importante função regulatória de genes
envolvidos no metabolismo dos AG, sendo um alvo terapêutico para NAFLD. As principais
funções dos PPARs são, a degradação de AG e desintoxicação de xenobióticos por meio das
vias de β-oxidação. O receptor alfa ativado por proliferadores peroxissomais (PPAR-α) é o
principal receptor envolvido no metabolismo de lipídios (GONZALEZ; PETERS;
CATTLEY, 1998; KOEK; LIEDORP; BAST, 2011). Na sobrecarga lipídica hepática, um
estímulo de PPAR-α conduz à proliferação de peroxissomos no fígado, uma vez que o PPAR-
α regula a expressão da acil-CoA oxidase 1 (ACOX 1), enzima limitante da velocidade de β-
oxidação peroxissomal. (REDDY, 2001; RAKHSHANDEHROO et al., 2010).
2
Em conjunto com PPAR-α, a proteína 1c ligadora do elemento regulado por esteróis
(SREBP-1c), fator de transcrição importante na homeostase de lipídios hepática, é o que
coordena a biossíntese de AG, através do aumento da transcrição de enzimas chave, incluindo
ácido graxo sintase (FAS) e acetil-CoA carboxilase 1 (ACC1). A expressão deste fator de
transcrição encontra-se constitutivamente elevada no desenvolvimento da NAFLD
(SHIMOMURA; BASHMAKOV; HORTON, 1999).
Os peroxissomos são organelas de membrana única encontrados em quase todas as
células eucariotas. São altamente versáteis e dinâmicas cujo tamanho, forma, número e teor
de proteína adapta-se ao tipo de célula, requisitos metabólicos, e estímulos extracelulares
(SCHRADER; FAHIMI, 2006; KOCH et al., 2010). Os peroxissomos de mamíferos têm
diversas funções metabólicas, incluindo a β-oxidação de AG de cadeia muito longa, síntese
de colesterol e ésteres de lipídios e decomposição do peróxido de hidrogênio (H2O2) pela
enzima catalase (WANDERS; WATERHAM, 2006). Estudos tem demonstrado a relação
entre a diminuição das proteínas relacionadas com a proliferação dos peroxissomos e o
acúmulo de lipídios no fígado. Dentre elas a PEX 11 α e PMP 70 são importantes proteínas
peroxissomais, a deficiência de ambas pode afetar o crescimento e proliferação dos
peroxissomos, o que acomete a oxidação de AG e contribui para o acúmulo de lipídios no
fígado (WENG et al., 2013; WENG et al., 2015). Além disso no peroxissomo encontram-se
quantidades consideráveis de enzimas que podem degradar ERO, a mais conhecida e uma das
mais importantes é a catalase, enzima antioxidante responsável pela decomposição do H2O2
convertendo-o em oxigênio molecular (ANTONENKOV et al., 2010; NORDGREN;
FRANSEN, 2014).
As espécies reativas de oxigênio (ERO) são formadas durante o metabolismo celular e
das atividades funcionais e têm um importante papel em vias de sinalização vitais (SEIFRIED
et al., 2007). Contudo, o excesso dessas pode provocar danos oxidativos em biomoléculas
(SCANDALIOS, 2005; BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006). Na NAFLD, a oxidação do
excesso de AG tanto nas mitocôndrias quanto nos peroxissomos geram ERO, a partir do
processo de β-oxidação (DAY, 2002; CHALASANI et al., 2012). No fígado, o excesso de
ERO tem papel significativo na progressão da NAFLD tornando-o susceptível a eventos
subsequentes como inflamação e fibrose, morte celular dos hepatócitos, lesão e perda de
função hepática, características de estágios mais graves de dano hepático (DAY.; JAMES,
1998; BROWNING; HORTON, 2004; ALBANO, EMANUELE, 2015).
Os maus hábitos alimentares e o sedentarismo são considerados importantes fatores de
risco para o aparecimento da NAFLD. Uma alimentação saudável tem sido descrita como um
3
importante fator na prevenção e controle da NAFLD e suas consequências. Estudos vêm
demonstrando que o consumo de frutas, hortaliças e grãos podem prevenir inúmeras doenças,
benefício este associado à ingestão de substâncias contidas nestes alimentos. A presença de
compostos fenólicos, tais como flavonoides, ácidos fenólicos, antocianinas, vitaminas C,
vitamina E e carotenoides contribuem para os efeitos benéficos desses alimentos na prevenção
de distúrbios metabólicos (DONGIOVANNI et al., 2016).
Neste contexto, muitas frutas brasileiras nativas da Mata Atlântica, como a uvaia, têm
grande potencial de mercado, despertando grande interesse nacional, principalmente por suas
características nutricionais, fitoterápicas e seu sabor exótico. A uvaia, pertencente à família
da Mirtaceae e vem sendo estudada por apresentar elevada capacidade antioxidante in vitro e
por possuir diversos compostos fitoquímicos relacionados a efeitos benéficos à saúde
(ANDERSEN; ANDERSEN, 1988; RUFINO et al., 2010; HAMINIUK et al., 2011). Dos
compostos presentes na uvaia destacam-se os polifenóis e os carotenoides (DA SILVA et al.,
2014). No entanto, ressalta-se que estudos in vivo utilizando a uvaia ainda são escassos.
Portanto, considerando que uma dieta hiperlipídica pode desencadear a NAFLD e que
a progressão da doença tem consequências graves, e tendo em vista a sua alta prevalência em
todo o mundo e a falta de tratamento efetivo justifica-se a busca por alimentos ricos em
compostos bioativos, como os polifenois, que possam apresentar benefícios sobre a NAFLD
e os danos oxidativos relacionados ao seu desenvolvimento. Assim, considerando a
composição fitoquímica do fruto da uvaia a hipótese deste trabalho é que o suco de uvaia seja
capaz de atenuar a esteatose hepática, as alterações do metabolismo de lipídios e o estresse
oxidativo decorrente da ingestão de dieta hiperlipídica
4
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD)
2.1.1 Definição e epidemiologia da NAFLD
A NAFLD é o termo usado para descrever um espectro de alterações histopatológicas
que é caracterizada por excessiva deposição de lipídios nos hepatócitos (esteatose hepática),
na ausência de consumo significativo de álcool, hepatite viral, ou de outras doenças do fígado
(LUDWIG et al., 1980; COHEN; HORTON; HOBBS, 2011; CHALASANI et al., 2012;
LOMONACO et al., 2013).
Histologicamente a NAFLD é dividida em esteatose hepática e NASH. A esteatose é
definida como um acúmulo de lipídios na forma de vacúolos macro e/ou microvesiculares em
mais de 5% dos hepatócitos. Devido à atividade inflamatória progressiva, a esteatose pode
evoluir para NASH, que envolve inflamação hepática, morte celular por apoptose, vários graus
de fibrose hepática e pode eventualmente resultar em cirrose e/ou insuficiência hepática
podendo evoluir até mesmo para um carcinoma hepatocelular (ALBANO et al., 2005;
COHEN.; HORTON; HOBBS, 2011; TANDRA et al., 2011) (Figura 1).
A esteatose hepática pode manifestar-se de duas formas, dependendo do tamanho dos
vacúolos de lipídios em esteatose macrovesicular e esteatose microvesicular. Na NAFLD é
geralmente vista esteatose macrovesicular na qual um único vacúolo grande de lipídio desloca
o núcleo para a periferia. Muitas vezes a esteatose macrovesicular pode estar presente com
gotículas grandes e pequenas que podem se unir. A esteatose macrovesicular isolada é
considerada como tendo um bom prognóstico a longo prazo, com rara progressão para fibrose
ou cirrose. A esteatose microvesicular é representada por hepatócitos contendo inúmeros e
pequenos vacúolos de gordura, não ocorrendo o deslocamento periférico do núcleo e reflete
alterações mais graves do metabolismo celular, está comumente relacionada a insuficiência
hepática grave e a defeitos severos na β-oxidação mitocondrial. (BURT; MUTTON; DAY,
1998; BRUNT; TINIAKOS, 2010; TANDRA et al., 2011).
5
Figura 1- Espectro de condições clínicas que compõe a doença hepática gordurosa não
alcoólica (NAFLD).
Esquema da progressão da NAFLD (A). O acúmulo de triacilgliceróis nos hepatócitos causa
a esteatose. A esteatose associada à inflamação, morte celular e fibrose caracteriza a esteato
hepatite não alcoólica (NASH) que pode evoluir para cirrose e hepatocarcinoma celular.
Seções histológicas ilustrando o fígado normal, esteatose, NASH e cirrose (B). As fibras de
colágeno estão coradas em azul pelo tricrômico de Masson. CV, veia central; PT, tríade portal.
Fonte: Adaptado COHEN; HORTON; HOBBS (2011)
Atualmente, a NAFLD é reconhecida como a forma mais comum de doença do fígado
em todo o mundo e afeta 25 e 30% da população geral. A NAFLD é frequentemente associada
as características da síndrome metabólica e é considerada uma manifestação hepática da
síndrome metabólica. Entre os pacientes obesos, aproximadamente 60% apresentam esteatose,
20-25% têm NASH e 2-3% apresentam cirrose (DIXON; BHATHAL; O'BRIEN, 2001;
TANDRA et al., 2011). A NAFLD é altamente prevalente em todos os continentes, mas as
taxas mais altas são reportadas na América do Sul (31%) e no Oriente Médio (32%), seguido
pela Ásia (27%), EUA (24%) e Europa (23%) e é menos comum na África (14%). Estima-se
que 10% dos pacientes com esteatose hepática irá avançar para uma condição mais grave
(NASH) (YOUNOSSI et al., 2016; YOUNOSSI et al., 2018). Devido sua alta prevalência e o
fato de que fígados gordurosos são mais vulneráveis a progressão para NASH, a probabilidade
6
de morbidade e mortalidade aumenta. De fato, dados recentes mostram que NASH deverá
tornar-se a principal causa de transplante de fígado em 2020. Finalmente, a NAFLD tem sido
também associada a um risco aumentado de diabetes mellitus tipo II e doença cardiovascular
(DCV) (CHARLTON et al., 2011; VERNON; BARANOVA; YOUNOSSI, 2011; ANSTEE;
TARGHER; DAY, 2013; BYRNE; TARGHER, 2015).
2.1.2. Patogênese, diagnóstico e terapia da NAFLD
Conceitos atuais sobre a patogênese da doença ainda estão evoluindo com novas
informações a partir de modelos experimentais e estudos em seres humanos e animais
(MARRA; LOTERSZTAJN, 2013). Inicialmente DAY; JAMES (1998) propuseram a ''teoria
dos dois hits'' para explicar a origem e progressão da NAFLD. No "primeiro hit", o acúmulo
de TAG hepáticos aumentam a suscetibilidade do fígado a lesões mediadas por "segundos
hits", como citocinas/adipocinas inflamatórias, disfunção mitocondrial e estresse oxidativo,
que por sua vez levam a NASH e/ou fibrose.
O primeiro “hit” é o resultado do estilo de vida sedentário, dieta hiperlipídica,
obesidade e resistência à insulina que culmina em um metabolismo desregulado de AG
levando ao acúmulo de lipídios hepáticos que pode ser causado por diversos mecanismos,
entre eles: o aumento da oferta e absorção de AG devido ao excesso da ingestão de lipídios
ou maior lipólise no tecido adiposo, aumento da síntese hepática de novo de AG e TAG,
diminuição da síntese ou secreção hepática de lipoproteína de muito baixa densidade (VLDL)
e da exportação de TAG e a falha na eliminação de AG devido ao comprometimento da β-
oxidação mitocondrial e peroxissomal hepática (SANYAL et al., 2001; SARGIN et al., 2003;
TAKAMURA et al., 2012; PEVERILL; POWELL; SKOIEN, 2014). O desenvolvimento da
esteatose (primeiro “hit”) provoca lipotoxicidade primária causando produção elevada de
ERO no interior dos hepatócitos e consequente aumento da peroxidação lipídica que
sensibiliza o fígado, aumentando a susceptibilidade e vulnerabilidade ao segundo “hit”,
caracterizado pela inflamação hepática (XU et al., 2015). A ativação das vias inflamatórias
pode ser desencadeada por vários estímulos tais como: estresse oxidativo, citocinas pró-
inflamatórias, lipólise alterada, lipotoxicidade, colesterol intra-hepático anormal,
hiperinsulinemia, disfunção mitocondrial, desregulação da sinalização das adipocinas e morte
celular (apoptose e necrose) podendo conduzir a progressão da doença para NASH (WOBSER
et al., 2009; TAKAHASHI; SOEJIMA; FUKUSATO, 2012; CAZANAVE; SANYAL, 2016).
A teoria dos dois hits é considerada a teoria tradicional do desenvolvimento da patogênese
da NAFLD. Contudo, essa teoria já foi modificada diversas vezes, pois, devido à
7
complexidade e heterogeneidade de fatores envolvidos que incluem resistência à insulina,
estresse oxidativo, inflamação, disfunção mitocondrial, dentre outros fatores, não é possível
definir isoladamente uma única alteração associada a progressão da doença. Assim têm
proposto o modelo dos múltiplos hits, o qual considera que a esteatose hepática se instala por
mecanismos patogênicos distintos agindo em conjunto em indivíduos geneticamente
predispostos e fornece uma explicação mais precisa da patogênese da NAFLD. Tais “hits”
incluem resistência à insulina, hormônios secretados pelo tecido adiposo (TNF-α e IL-6),
fatores nutricionais (dieta hiperlipídica), microbiota intestinal e fatores genéticos e
epigenéticos. (TAKAKI; KAWAI; YAMAMOTO, 2014; BUZZETTI; PINZANI;
TSOCHATZIS, 2016). O primeiro hit consiste na resistência à insulina combinada com
diversas disfunções metabólicas, gerando esteatose simples e expondo o fígado aos riscos dos
demais “hits”, tais como: ativação de vias do estresse oxidativo, ativação de citocinas pro
inflamatórias, estresse do retículo endoplasmático e ativação das vias de sinalização da
apoptose e fibrogênese, que culminarão em NASH e cirrose hepática (MCCULLOUGH,
2006; WATANABE, 2017) (Figura 2). Ambas as hipóteses têm em comum que a esteatose
simples é a base para o desenvolvimento da esteato-hepatite (WREE et al., 2013;
BETTERMANN; HOHENSEE; HAYBAECK, 2014).
8
Figura 2- Hipótese múltipla para o desenvolvimento da doença hepática gordurosa não
alcoólica (NAFLD)
Fatores dietéticos e ambientais, juntamente com a obesidade, levam a níveis séricos elevados
de ácidos graxos (AG) e colesterol, desenvolvimento de resistência à insulina, proliferação e
disfunção de adipócitos e alterações na microbiota intestinal. A resistência à insulina atua no
tecido adiposo, induz lipólise e liberação de adipocinas e citocinas pró-inflamatórias No
fígado, a resistência à insulina amplifica a lipogênese “de novo” (DNL). O aumento do fluxo
de AG hepáticos e uma microbiota intestinal alterada leva a síntese e acúmulo de triglicerídeos
(TG) e níveis 'tóxicos' de AG, colesterol livre que causaram disfunção mitocondrial e
peroxissomal e aumento da produção de ERO e estresse do retículo endoplasmático (RE)
levando à inflamação hepática e consequentemente esteato-hepatite não alcoólica (NASH).
Fonte: Adaptado de BUZZETTI; PINZANI; TSOCHATZIS (2016)
Em todos os estágios, a NAFLD é habitualmente assintomática. Enzimas indicadoras
de danos hepáticos elevadas pode ser um indício que existe alguma doença associada.
Elevações nos níveis de alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST)
ocorrem em até 90% dos casos e são alterações mais comumente encontradas (FARRELL;
LARTER, 2006). Os sintomas, quando existentes, são pouco específicos como dor no
quadrante abdominal superior direito. O melhor método para o diagnóstico para NAFLD é a
biópsia hepática, no entanto por se tratar de um procedimento invasivo não é sempre requerido
(CARVALHEIRA; SAAD, 2006; CAVE et al., 2007; TARGHER et al., 2016). Contudo, a
9
esteatose também pode ser diagnosticada por meios não invasivos, por exemplo, através de
técnicas radiográficas, como ultrassonografia, tomografia computadorizada e ressonância
magnética (YEN et al., 2017).
As opções terapêuticas para o tratamento da NAFLD são limitadas e se baseiam
principalmente em modificações no estilo de vida e dieta, recomendações gerais incluem uma
redução nos consumos de gordura total, AG saturados e AG trans, além disso, o consumo de
dietas ricas em frutas e legumes são utilizadas para a prevenção da NAFLD (DONGIOVANNI
et al., 2016). Essas dietas proporcionam quantidades significativas de componentes bioativos,
alguns com efeitos benéficos já conhecidos, como por exemplo, os compostos fenólicos, estes
visam reduzir os fatores de risco associados ao desenvolvimento e progressão da doença,
principalmente a resistência à insulina e o estresse oxidativo (MUSSO et al., 2003). Estatinas
(hipolipidemiantes), glitazonas (sensibilizadores de insulina), metiformina tem sido utilizado
como terapias, porém nenhuns destes medicamentos são específicos para NAFLD (MUSSO
et al., 2010; LOMONACO et al., 2013). Dessa forma é importante o desenvolvimento de
investigações com o intuito de esclarecer os mecanismos envolvidos na patogênese da doença
e estabelecer então estratégias farmacológicas e terapias nutricionais.
2.2. NAFLD e dieta hiperlipídica
Diversos fatores estão associados a NAFLD, entre eles deve-se considerar a
predisposição genética e fatores ambientais que também têm um papel importante. Um dos
fatores mais relevantes são os hábitos alimentares. Em estudo publicado por LESLIE et al.
(2014) observaram que pacientes com NAFLD eram mais propensos a relatar o consumo de
alimentos processados e com alto teor de gordura e se abstendo do consumo de frutas frescas.
(KIM et al., 2010; MCCARTHY; RINELLA, 2012; LESLIE et al., 2014).
Estudos em animais investigaram a NAFLD resultante de uma dieta hiperlipídica.
Uma dieta acrescida de 0,5% a 1,0% de colesterol aumentou os níveis de VLDL e lipoproteína
de baixa densidade (LDL) no soro de ratos e modificou o metabolismo de TAG, aumentando
o teor desses no fígado e desenvolvendo a esteatose hepática (WANG, D.; WEI;
PAGLIASSOTTI, 2006; LEE et al., 2009; ARGUELLO et al., 2015; LIANG et al., 2015).
Também, ABREU et al. (2014) usaram uma dieta hiperlipídica consistindo em 25% de soja
óleo e 1% de colesterol administrada por oito semanas, sendo efetiva na indução de esteatose
hepática em ratos.
LIU; HUANG; HUANG (1995) sugeriram que a lipogênese aumentada, a diminuição
da oxidação de AG e diminuição da secreção de VLDL são causas para o acúmulo de TAG
10
no fígado de ratos alimentados com excesso de lipídios. FUNGWE et al. (1994) em seu estudo
relataram um maior depósito de TAG no fígado devido à ingestão elevada de colesterol.
Embora a esteatose hepática seja caracterizada pelo aumento na concentração de TAG,
o aumento correspondente de colesterol pode também desempenhar um papel bioquímico no
acúmulo de lipídios no fígado. Estudos realizados em humanos apoiam a hipótese de que a
adição de colesterol na dieta desempenha um papel no desenvolvimento da NASH. Além
disso, o consumo de colesterol na dieta foi associado de forma independente ao
desenvolvimento de cirrose. Em camundongos e ratos, a presença em excesso de triacilglicerol
e colesterol na dieta foi necessário para o desenvolvimento de NASH e suas anormalidades
metabólicas associadas (IOANNOU et al., 2009; SAVARD et al., 2013; ABREU et al., 2014;
ARGUELLO et al., 2015).
O excesso de lipídios também pode levar a lesão hepática por meio da ativação de
vias de sinalização intracelular em células de Kupffer e hepatócitos, a ativação destas promove
inflamação e fibrose. O acúmulo de lipídios em mitocôndrias e peroxissomos do fígado pode
também induzir a disfunção dessas organelas, o que resulta no aumento da produção de ERO,
culminando na progressão da doença (ARGUELLO et al., 2015).
2.3. Homeostase do colesterol e NAFLD
O colesterol tem sido apontado como um fator de risco e gravidade da NAFLD
(MUSSO et al., 2003; ARGUELLO et al., 2015). SAVARD et al. (2013) demonstraram que
uma dieta hiperlipídica que continha 15% de gordura saturada e 1% de colesterol causou o
desenvolvimento de um grau de esteatose hepática pronunciado, inflamação substancial e
fibrose perisinusoidal (esteato-hepatite), associada com inflamação do tecido adiposo. Além
disso, os autores demonstraram que os efeitos hepáticos e metabólicos induzidos pela gordura
e colesterol da dieta em conjunto foram bem maiores do que os efeitos encontrados para cada
um dos componentes da dieta avaliados separadamente, demonstrando uma interação positiva
significativa. ICHIMURA et al. (2015) também mostraram uma indução de NASH
caracterizada por um maior acúmulo de TAG, inflamação, balonização dos hepatócitos,
fibrose e progressão à cirrose com a adição de colesterol à dieta hiperlipídica.
A homeostase de colesterol hepático está amplamente desregulada na NAFLD e
alterações das vias de síntese e excreção do colesterol no fígado em diferentes níveis podem
promover o acúmulo de colesterol livre e TAG no fígado. De fato, a síntese de colesterol
hepático mostrou-se aumentada em NAFLD. O excesso de colesterol hepático na NAFLD
pode resultar em alterações no transporte de colesterol intracelular e na homeostase do mesmo
11
caracterizada pela ativação de vias de síntese e desesterificação do colesterol além da
diminuição da exportação do colesterol e síntese de ácidos biliares (SAVARD et al., 2013;
ARGUELLO et al., 2015).
Genes alvos que regulam o metabolismo de colesterol podem ser controlados por diversos
mecanismos. A síntese endógena do colesterol é controlada pela proteína de ligação aos
elementos de resposta a esterol -2 (SREBP-2). O fator de transcrição SREBP-2 é capaz de se
ligar a elementos de resposta a esterol localizados na região promotora de genes relacionados
à síntese do colesterol, como o da enzima 3-hidróxi-3-metil-glutaril CoA redutase (HMG CoA
– R) e do receptor da lipoproteína de baixa densidade (LDL-R), ativando a transcrição desses
genes e promovendo o aumento na concentração intracelular de colesterol (BROWN;
GOLDSTEIN, 1997; MISEREZ et al., 2002; EBERLE et al., 2004). Outro destino do
colesterol livre é a sua eliminação via formação de ácidos biliares catalisado pela enzima
colesterol-7α-hidroxilase (CYP7A1). A eliminação direta do colesterol na bile é controlada
pelos transportadores ATP-binding cassette subfamily G transportes 5 e 8 (ABCG5 e
ABCG8). Além destes destinos, o colesterol também pode ser reesterificado pela ação da
enzima colesterol aciltransferase-2 (ACAT-2) e armazenado (YU et al., 2002; TEMEL et al.,
2007; GUO, J. et al., 2011; YIU et al., 2011) (Figura 3).
Figura 3- Ativação da lipogênese celular pela regulamentação proteína de ligação aos
elementos de resposta a esterol (SREBP).
Níveis de esteróis celulares controlam a atividade do fator de transcrição SREBP. As SREBPs
(vermelho) são sintetizadas como precursores inativos no retículo endoplasmático (ER), que
residem num complexo com a proteína ativadora de clivagem (SCAP) (verde) e o gene 1
induzido por insulina (INSIG) (azul claro). Fonte: Adaptado (LE HELLARD et al., 2009).
12
Diversos transportadores afetam diretamente ou indiretamente a absorção intestinal de
colesterol. Neste contexto, os transportadores ABCG5 e ABCG8 desempenham papéis
significativos na excreção de colesterol direto por via biliar (GRUNDY, 1983; WILSON;
RUDEL, 1994; YU et al., 2002). Outro destino do colesterol livre é a sua eliminação via
formação de ácidos biliares. A formação de ácidos biliares a partir do colesterol é catalisada
pela enzima CYP7A1.Essa enzima é determinante da velocidade de síntese dos ácidos biliares
e é o principal mecanismo de eliminação do colesterol (CHIANG, 2004; LI, T. et al., 2011).
Estudos têm demonstrado que o colesterol dietético induz o aumento da atividade de CYP7A1
e um aumento significativamente alto na expressão de RNAm dessa enzima (BOONE et al.,
2011; GUO et al., 2011; YIU et al., 2011).
Além destes destinos, o colesterol também pode ser esterificado pela ação da ACAT-
2. O excesso de colesterol é muitas vezes armazenado como éster de colesterol como uma
forma de manter o gradiente de concentração (CHANG et al., 2010). A ACAT-2, no fígado
desempenha um papel importante na síntese e a secreção de partículas de lipoproteínas de
muito baixa densidade (VLDL) e a absorção de colesterol (AZUMA et al., 2001) A atividade
da ACAT-2 depende da disponibilidade de colesterol hepático, sugerindo que a homeostase
da atividade de ACAT-2 é importante para a regulação da absorção de colesterol e secreção
de VLDL hepática. Estudos in vitro e in vivo indicam que a inibição da atividade de ACAT-2
pode reduzir o teor de éster de colesterol hepático e a secreção de VLDL, diminuindo a
absorção de colesterol (HYLEMON; PANDAK; VLAHCEVIC, 2001; SHELNESS;
SELLERS, 2001; TEMEL et al., 2007; FERRAMOSCA; ZARA, 2014).
2.4. Metabolismo dos ácidos graxos e NAFLD
O fígado é exposto a vários tipos de lipídios da dieta, o fluxo excessivo de AG livres no
fígado através da veia porta pode causar NAFLD (RASO et al., 2013). Os AG da dieta estão
envolvidos na lipogênese hepática e podem desempenhar um papel duplo na patogênese da
esteatose hepática, pois estão envolvidos tanto no seu desenvolvimento quanto na reversão do
acúmulo de lipídios hepáticos. A composição de AG da dieta é um componente importante no
desenvolvimento da NAFLD, uma vez que 15% dos TAG do fígado são provenientes da dieta
(FERRAMOSCA; ZARA, 2014) (Figura 4).
13
Figura 4- Metabolismo dos ácidos graxos e NAFLD, vias de oxidação e síntese nos
hepatócitos.
A má alimentação, obesidade e resistência à insulina aumentam a captação hepática, assim
como a síntese de AG pelos hepatócitos, o que resulta no acúmulo de AG armazenados como
triglicerídeos e no desenvolvimento de esteatose (setas verdes). Na NAFLD, a ativação do
fator de transcrição PPAR-α induz a up regulation das enzimas ACOX-1 e CPT-1 nos
peroxissomos e nas mitocôndrias, respectivamente. Ambos catalisam a β-oxidação AG e
como resultado O2•- e H2O2 são formados (setas laranjas). As ERO produzidas nesses
processos são capazes de oxidar biomoléculas, sensibiliza os hepatócitos para a morte celular,
o que constitui um processo chave no desenvolvimento da NASH (setas vermelhas). NAFLD.
NAFLD, doença hepática gordurosa não alcoólica; NASH, esteato-hepatite não alcoólica;
AG, ácidos graxos; PPAR-α, receptor alfa ativado por proliferadores peroxissomais; ACOX-
1, acil-CoA oxidase 1; CPT-1, Carnitina palmitoil transferase 1; SREBP-1c, Proteína 1c
ligadora do elemento regulado por esteróis; FAS, ácido graxo sintase; ACC, acetil CoA
carboxilase; ERO, espécies reativas de oxigênio. Fonte: Adaptado de REINIERS et al. (2014).
PPAR-α é um fator de transcrição ativado por ligante, predominantemente expresso no
fígado e é um dos principais reguladores do metabolismo de lipídios, sua ativação leva ao
aumento na oxidação de AG no fígado (GROSS et al., 2017). Esse fator de transcrição se liga
a regiões específicas do DNA denominadas elemento de resposta a proliferadores de
peroxissomos, ativando a transcrição de genes alvo, dentre eles, carnitina palmitoil transferase
1 α (CPT-1α) e ACOX-1, e assim estimula a β-oxidação mitocondrial e peroxissomal, reduz
a biossíntese de lipídios e dessa forma previne o acúmulo excessivo de TAG e
consequentemente a NAFLD (MANDARD; MÜLLER; KERSTEN, 2004; GRYGIEL-
GÓRNIAK, 2014) (Figura 4).
14
É importante enfatizar que o principal processo de oxidação e eliminação dos AG, a β-
oxidação, ocorre não somente na mitocôndria, mas também em peroxissomos. Os
peroxissomos são capazes de oxidar AG livres mais rapidamente que as mitocôndrias e
aumentam a capacidade da célula em metabolizar esses lipídios. Na esteatose hepática caso
ocorra uma estimulação do PPAR-α pode ocorrer um aumento da expressão de ACOX-1,
enzima limitante para β-oxidação peroxissomal, e amenizar os danos causados pelos lipídios
hepáticos (BENZIE, 1996; KOEK; LIEDORP; BAST, 2011; OSHIDA et al., 2015).
As proteínas de ligação a elementos reguladores de esteróis (SREBPs) são fatores de
transcrição que ativam a síntese de AG, TAG e colesterol. A superativação dos SREBPs no
fígado causa acumulação de TAG e consequentemente a esteatose hepática (MOON et al.,
2012). O SREBP-1c é responsável por coordenar a biossíntese de AG, através do aumento da
transcrição de enzimas chaves, sendo um importante fator de transcrição envolvido na
homeostase dos lipídios hepáticos. O aumento do consumo de lipídios, incluindo o colesterol
ativa SREBP-1c, que pode estar envolvido na síntese excessiva de colesterol hepático e tem
como alvo várias enzimas lipogênicas tais como ACC1 e FAS induzindo a lipogênese e
consequentemente o acúmulo de lipídios hepáticos (ZHOU et al., 2008). A expressão deste
fator de transcrição é constitutivamente elevada em indivíduos com resistência à insulina, e
está associada ao acúmulo de TAG e desenvolvimento da esteatose hepática (SHIMOMURA;
BASHMAKOV; HORTON, 1999) (Figura 4).
2.5. Proliferação e crescimento peroxissonal
Os peroxissomos são organelas onipresentes delimitadas por apenas uma membrana. Os
peroxissomos de mamíferos possuem diversas funções metabólicas importantes, entre elas a
β -oxidação de AG de cadeia muito longa, a síntese de colesterol e éteres de lipídios e o
metabolismo de H2O2 (LAZAROW; FUJIKI, 1985) o que implica a presença de muitas
proteínas na matriz peroxissomal. Uma das mais importantes proteínas da matriz peroxissomal
é a enzima catalase, enzima antioxidante responsável pela decomposição do H2O2. Os
peroxissomos podem se multiplicar pelo crescimento e divisão e a sua proliferação pode ser
dividida em pelo menos três etapas distintas em células de mamíferos, incluindo alongamento,
segregação e constrição da membrana e divisão (TITORENKO; RACHUBINSKI, 2001;
HOEPFNER et al., 2005; FAGARASANU; FAGARASANU; RACHUBINSKI, 2007;
HETTEMA; MOTLEY, 2009).
Os mecanismos de multiplicação do peroxissomo têm sido assunto de debate, e dois
modelos têm dominado o campo de estudo. No primeiro os peroxissomos formam-se de novo
15
a partir do retículo endoplasmático através de um processo de maturação (TABAK et al.,
2006). HOEPFNER et al. (2005) propuseram que, durante a formação “de novo”, vesículas
pré peroxissômicas surgem da membrana do retículo, em seguida ocorre a formação de
estruturas que adquirem proteínas de membranas peroxissomais (PMPs) para formação dos
peroxissomos maduros. No segundo, os peroxissomos se multiplicam por crescimento e
divisão, estas vesículas podem ainda formar peroxissomas maduros após a fusão, e importação
de proteínas da matriz. (LAZAROW, 2003). (Figura 5)
Figura 5- Biogênese dos peroxissomos em células de mamíferos
Os peroxissomos são formados por duas vias distintas: a biogênese de novo; e crescimento e
divisão dos peroxissomas existentes. RE, Retículo endoplasmético; PMPs, Proteínas de
membrana peroxissomal; PEX 11, Peroxina 11. Fonte: Adaptado de MA; AGRAWAL;
SUBRAMANI (2011)
A proteína de membrana peroxissomal de 70 kDa (PMP70) é um dos principais
componentes das membranas dos peroxissomos. Em roedores, PMP70 é induzida pela
administração de agentes hipolipidêmicos em paralelo com a proliferação do peroxissomo e a
indução de enzimas peroxissomais da β-oxidação de AG (IMANAKA et al., 2000). A
superexpressão de PMP70, em células leva a um aumento de duas a três vezes a taxa de β-
oxidação de ácido palmítico, sugerindo que a PMP70 está envolvida no transporte de ácido
graxos de cadeia longa através da membrana peroxissomal. Além disso, estudo em
16
camundongos knockout PMP70, também foi relacionado com o transporte de outros tipos de
AG (JIMENEZ-SANCHEZ et al., 2000).
As proteínas que controlam a montagem, divisão e a herança do peroxissoma são
denominadas peroxinas (codificadas pelos genes PEX). Pex11 são proteínas de membrana
necessárias para a biogênese dos peroxissomos e mostraram-se promotoras da divisão de
peroxissomos em leveduras e células de mamíferos (SUBRAMANI, 1998; MA; AGRAWAL;
SUBRAMANI, 2011). Nos mamíferos, três subtipos do gene Pex11 (α, β e γ) foram
identificados e mapeados em diferentes cromossomos. Pex11 α e Pex11 γ são específicas de
tecido e expressas mais proeminente no fígado e Pex11 β é expresso de forma ubíqua.
(SCHRADER et al., 1998; DELILLE et al., 2010; KOCH et al., 2010). LI, X.; GOULD (2002)
observaram em seu estudo que uma produção excessiva de Pex11α foi suficiente para induzir
a proliferação de peroxissomos em células cultivadas de rato e de humano. Além disso,
WENG et al. (2013) demostraram que Pex11α é importante para o crescimento e divisão dos
peroxissomos e que a deficiência de Pex11α afeta o alongamento e abundância de
peroxissomos, e consequentemente a oxidação de AG, contribuindo para o aumento de
lipídios hepáticos.
2.6. Estresse Oxidativo e NAFLD
Espécies reativas de oxigênio resultam de processos metabólicos normais e
importantes para manter funções biológicas relevantes. Porém o aumento da produção destas
juntamente com a desordem no sistema de defesa antioxidante resultam em um desequilíbrio
em favor da geração de radicais livres ou em detrimento da velocidade de remoção desses,
levando ao dano oxidativo celular também conhecido como estresse oxidativo (FERREIRA;
MATSUBARA, 1997; SEIFRIED et al., 2007). O estresse oxidativo é uma característica
importante no desenvolvimento e progressão da NAFLD (BROWNING; HORTON, 2004;
ROLO; TEODORO; PALMEIRA, 2012).
As ERO compreendem um grupo de oxidantes, que incluem os radicais livres e as
espécies moleculares capazes de gerar radicais livres, como os peróxidos (CERQUEIRA; DE
MEDEIROS; AUGUSTO, 2007; NARANG; YADAV; VAIDYA, 2011). Tais espécies
abrangem radicais livres derivados do oxigênio tais como, os íons superóxido (O2•-), íons
hidroxila (OH•) e óxido nítrico (NO•) e alcoxila (RO•) e derivados não radicais do oxigênio
como o H2O2 (FRIDOVICH, 1998; HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2015).
17
Vários sistemas de enzimas que podem produzir ERO foram identificados. Algumas
parecem ser de grande importância como, por exemplo, a nicotinamida adenina dinucleótido
fosfato oxidase (NADPH-oxidase), xantina oxidase (XO) e as enzimas da cadeia respiratória
mitocondrial (LI.; HORKE; FÖRSTERMANN, 2013). A NADPH-oxidase produz O2•-
através da transferência de elétrons a partir de NADPH para dentro da célula reduzindo o
oxigênio molecular. A principal fonte de XO é o fígado. A liberação de XO a partir desse
órgão é aumentada em situação de hiperlipidemia. A XO doa elétrons para o oxigénio
molecular, produzindo, assim, O2•- e H2O2 (TANG et al., 2014).
Estas moléculas reativas em baixas concentrações atuam em mecanismos de defesa
contra agentes infecciosos e modulam vias de sinalização redox celular (SIES, 2015). No
entanto, quando não neutralizadas, podem modificar e causar danos em diversos componentes,
como por exemplo, na estrutura e na função de ácidos nucleicos, lipídios e proteínas.
Compostos podem ser produzidos devido a estes danos e são, portanto, usados como medidas
indiretas do estresse oxidativo (HALLIWELL; WHITEMAN, 2004). Como por exemplo,
degradação oxidativa dos lipídios produz malondialdeído (MDA), danos em proteínas podem
gerar produtos da carbonilação e oxidação da cadeia lateral, como a formação e acumulação
de proteína carbonilada, ambos MDA e proteína carbonilada são marcadores de dano
oxidativo que são utilizados como parâmetros para medir o dano oxidativo (PIRINCCIOGLU
et al., 2010).
Dentre os fatores envolvidos nos múltiplos hits da patogênese da NAFLD, o estresse
oxidativo desempenha um papel central e se correlaciona com a severidade da doença
(SEIFRIED et al., 2007). A maior disponibilidade de AG nos hepatócitos na NAFLD, pode
causar alterações na morfologia da mitocôndria e do peroxissomo levando a um dano em
ambas as organelas que é comum em indivíduos com NAFLD, já que uma grande quantidade
de lipídios na dieta é um importante fator para aumentar os níveis de colesterol e TAG no
fígado e consequentemente levar a maior formação de ERO, devido ao maior vazamento de
elétrons da cadeia respiratória nas mitocôndrias e maior formação de peroxido de hidrogênio
nos peroxissomos (BALKAN et al., 2004; ROLO; TEODORO; PALMEIRA, 2012; LI, et al.,
2015).
As mitocôndrias são capazes de produzir ERO já que a principal fonte celular destas
espécies é a cadeia respiratória mitocondrial, essas são continuamente formadas como produto
do metabolismo aeróbico, onde ocorre a redução do oxigênio molecular a água, na qual a
entrada de 4 elétrons na molécula de oxigênio promove a formação de intermediários reativos
18
entre eles o ânion superóxido, o peróxido de hidrogênio e o radical hidroxil (LI.; HORKE;
FÖRSTERMANN, 2013; INDO et al., 2015) (Figura 6).
Nos peroxissomos os principais processos metabólicos que contribuem para a geração
de H2O2 são a β-oxidação dos AG. Durante a β-oxidação peroxissomal ocorre produção H2O2
que é facilmente convertido em radical hidroxila. Porém, o peroxissomo desempenha um
papel fundamental na eliminação metabólica de ERO, aliviando os danos oxidativos, isso
ocorre porque os peroxissomos possuem alta concentração de catalase, que convertem H2O2
em H2O e O2. (KOEK; LIEDORP; BAST, 2011). Portanto, o peroxissomo pode desempenhar
um papel importante na remoção fisiológica de lipídios e das ERO indesejáveis a progressão
da NAFLD.
No fígado, um excesso de ERO pode induzir a progressão da NAFLD causando morte
celular dos hepatócitos por apoptose ou necrose e levando a lesão e perda de função hepática
(ARGUELLO et al., 2015). Sendo assim, em NAFLD, a sobrecarga de lipídios desempenha
um papel importante na geração de ERO, como resultado do extravasamento de elétrons
durante a β-oxidação mitocondrial e o aumento de ERO durante a β-oxidação peroxissomal.
2.7. Sistema de defesa antioxidante enzimático
A exposição do organismo aos efeitos dos radicais livres encontra resistência de um
importante sistema antioxidante com o intuito de minimizar os danos causados por
quantidades excessivas de ERO. Usualmente, esses sistemas são divididos em enzimático e
não enzimático (CHEESEMAN; SLATER, 1993). O sistema antioxidante chamado de
"primeira linha de defesa" foi identificado como o sistema antioxidante enzimático. Os mais
importantes antioxidantes enzimáticos são a superóxido dismutase (SOD), catalase e
glutationa peroxidase (GPx) (VALKO et al., 2006; BARBOSA et al., 2010; HALLIWELL;
GUTTERIDGE, 2015). Além destas enzimas, diversos estudos têm demonstrado a ligação da
enzima paraoxonase 1(PON 1) com o perfil lipídico e com a NAFLD e um efeito protetor
desta enzima através do potencial antioxidante. Esta enzima está associada com a lipoproteína
de alta densidade (HDL) e protege a LDL e a HDL contra a oxidação, também atua eliminando
os lipídios oxidados das células além disso, as isoformas 2 e 3 podem impedir a geração de
O2•- mitocondrial. (Figura 6) (MACKNESS; ARROL; DURRINGTON, 1991; DE SOUZA
et al., 2010; LI; HORKE; FÖRSTERMANN, 2013; PEREIRA et al., 2016)
19
Figura 6- Enzimas envolvidas na geração e na inativação de espécies reativas de oxigénio
(ERO).
O ânion superóxido (O2•-) pode ser produzido por NADPH oxidase, xantina oxidase e o pelo
vazamento de oxigénio ativado das mitocôndrias (MITO) durante a respiração oxidativa. O
ânion superóxido pode ser convertido em peróxido de hidrogénio (H2O2) pela enzima
superóxido dismutase (SOD). H2O2 pode sofrer conversão espontânea para o radical hidroxil
(OH•) através da reação de Fenton. H2O2 pode ser detoxificada através de glutationa
peroxidase e catalase para H2O e O2. Paraoxonase (PON) pode impedir a geração de O2•-
mitocondrial. Fonte: Adaptado LI; HORKE; FÖRSTERMANN (2013)
A SOD é uma das principais enzimas de defesa antioxidante celular e constitui a
primeira linha de defesa contra os radicais superóxido (O2•-) transformando-os em H2O2 e
oxigênio molecular (2 O2•- + 2 H+ → O2 + H2O2). Três tipos de SOD podem ser encontrados
em tecidos de mamíferos: SOD-Cu/Zn (SOD1) presente no citosol, SOD-Mn (SOD2)
encontrada na matriz mitocondrial e SOD extracelular (SOD3) (ZELKO; MARIANI; FOLZ,
2002; PISOSCHI; POP, 2015)
A catalase é uma importante enzima antioxidante intracelular localizada
principalmente em peroxissomos e em menor quantidade no citosol, ela é expressa na maioria
das células, órgãos e tecidos e em concentrações mais elevadas, no fígado e nos eritrócitos
(HALLIWELL, 1999). Esta enzima é responsável por catalisar a reação de decomposição do
H2O2, produzido sob condições de estresse, formando água e oxigênio molecular, protegendo,
portanto, as células de danos oxidativos. Ao remover peróxidos de hidrogênio, a catalase age
indiretamente contra os radicais superóxido, que são convertidos em H2O2 pela SOD. Outros
antioxidantes enzimáticos, a enzima GPx, também é responsável pela neutralização do H2O2.
Sendo assim a enzima torna-se especialmente importante em casos onde a quantidade de
glutationa está limitada ou atividade da GPx é reduzida, desempenhando um papel
20
significativo no desenvolvimento de resistência ao estresse oxidativo (ALBANO,
EMANUELE, 2015; FRIJHOFF et al., 2015; PISOSCHI; POP, 2015).
A Glutationa é sintetizada endogenamente no fígado e age contra o estresse oxidativo
cooperando com catalase e SOD (HALLIWELL, 1999; YANG et al., 2012). A GPx é uma
enzima que contém selênio, ela catalisa a redução de peróxidos de hidrogênio e
hidroperóxidos orgânicos em água e álcool, na mitocôndria. A GPx funciona como um
eficiente doador de elétrons nesse processo. A redução do H2O2, ocorre pela conversão da
glutationa reduzida (GSH) a glutationa oxidada (GSSH), que é catalisada pela GPx
(HALLIWELL, 1999; DROGE, 2002; HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2015; PISOSCHI;
POP, 2015).
Uma dieta hiperlipídica está associada à redução da atividade da enzima PON, da
catalase, da GPx e da SOD (AFONSO et al., 2013; FENG et al., 2016). No entanto, quanto à
atividade de SOD, outros estudos têm observado a atividade aumentada desta enzima
antioxidante no fígado de ratos alimentados com uma dieta rica em colesterol, em comparação
com uma dieta normal. Os níveis elevados de SOD podem ser uma resposta ao alto conteúdo
de ânion superóxido produzido devido a dieta hiperlipídica, já que esta enzima catalisa a
dismutação deste radical livre (JUNG et al., 2003; BELGUITH-HADRICHE et al., 2010).
Sendo assim, um desequilíbrio causado por modificações nos mecanismos de defesa
antioxidante enzimático como, por exemplo, um aumento na produção de radicais livres como
ânion superóxido, radical hidroxila e peroxila, bem como espécies não radicais, como
peróxido de hidrogênio, peroxi-nitrito e oxigênio singlete contribui para o estabelecimento de
estresse oxidativo, que está envolvido em várias desordens metabólicas, como por exemplo a
NAFLD (SEIFRIED et al., 2007; ALBANO, EMANUELE, 2015; SIES, 2015).
2.8. Sistema de Defesa Antioxidante não-enzimático
Além das enzimas antioxidantes, diversos antioxidantes não-enzimáticos são
encontrados e estes representam a "segunda linha de defesa", constituída principalmente por
tióis reduzidos e antioxidantes de baixo peso molecular. Estes últimos incluem uma ampla
variedade de moléculas que são componentes encontrados nos alimentos, como os tocoferóis,
polifenóis e carotenoides ou compostos metabólicos como a glutationa, ácido úrico e
bilirrubina. (BARREIROS; DAVID; DAVID, 2006; PISOSCHI; POP, 2015). Estes
compostos conferem basicamente, a capacidade antioxidante para os meios biológicos
podendo chegar a locais específicos em células afetadas pelo ataque oxidativo (COHEN;
NYSKA, 2002). Sugere-se, portanto que uma dieta rica em antioxidantes pode trazer
21
benefícios para a saúde. Assim, antioxidantes, como flavonoides, polifenóis, vitamina C e E
e carotenoides são sugeridos como protetores contra as ERO (HALLIWELL, 1999; VALKO
et al., 2007).
Os carotenoides são amplamente distribuídos nos alimentos e estão presentes na uvaia.
O β-caroteno é considerado excelente antioxidante, capaz de sequestrar radicais livres com
grande eficiência e age como protetor contra a oxidação de lipídios e DNA. Este constitui um
dos principais mecanismos da defesa exógena do organismo (BIANCHI; ANTUNES, 1999;
PISOSCHI; POP, 2015). A luteína, pigmento de cloração amarela, apresenta capacidade de
proteger as biomoléculas contra os radicais livres, devido a sua capacidade de inativação
destes radicais, na complexação de íons metálicos e na redução de hidroperóxidos (ALVES-
RODRIGUES; SHAO, 2004; MA, et al., 2012).
Os compostos fenólicos são os antioxidantes mais abundantes da dieta, são
encontrados em uma ampla variedade de frutas, legumes, cereais, leguminosas, e em bebidas
de origem vegetal, como o vinho, chá e café. Estes compostos são considerados de grande
importância na inibição da formação de radicais livres devido a sua propriedade redox,
bloqueando os processos de oxidação em certos sistemas, como por exemplo, a peroxidação
de lipídios, sendo, portanto, considerados um dos principais responsáveis pelo aumento do
potencial antioxidante in vivo (HARTMAN; SHANKEL, 1990; CERQUEIRA; DE
MEDEIROS; AUGUSTO, 2007; COUTINHO et al., 2008).
A ingestão de alimentos ricos em polifenóis está associada com diminuição de
dislipidemias, aterosclerose, processos inflamatórios associados com doenças
cardiovasculares, além de efeitos antihiperlipidêmico e hepatoprotetor na NAFLD (FEILLET-
COUDRAY et al., 2009; LUO et al., 2012; YOSHIMURA et al., 2013; GUERRA et al., 2015).
Portanto tem-se sugerido que os polifenóis são compostos eficientes para atenuar a esteatose
hepática, sendo importantes na saúde humana.
Diversos estudos in vitro e in vivo investigaram as propriedades de polifenóis relacionadas
a benefícios na NAFLD. A respeito dos mecanismos de ação destes compostos sobre esteatose
hepática os mais importantes são redução da lipogênese e o aumento da lipólise, diminuição
da síntese de triacilgliceróis, do estresse oxidativo, da inflamação, da resistência à insulina e
do acúmulo de lipídios no fígado (DONGIOVANNI et al., 2016). Tomando por base os
estudos relatados, acreditamos que a suplementação com polifenóis pode representar uma
abordagem útil para o manejo de pacientes com NAFLD.
22
2.9.Caracterização do fruto da uvaia (Eugenia uvalha Cambess)
A uvaia (Eugenia uvalha Cambess) é um fruto exótico da família Mirtaceae cujo nome
vem do Tupi e significa “fruta ácida”, também conhecida como uvalha, uvaia-do-mato,
uvalheira. Este fruto é nativo do Brasil, amplamente cultivado em quase todo o território
nacional, no entanto é encontrado principalmente na região da Mata Atlântica destacando-se
os estados do Rio Grande do Sul, Paraná, Santa Catarina, São Paulo e Minas Gerais
(ANDERSEN; ANDERSEN, 1988; LORENZI, 1998).
A árvore da uvaieira é muito utilizada em reflorestamento urbano, em pomares
domésticos e tem grande potencial para cultivo, principalmente por agricultores familiares,
possui de seis a treze metros de altura, dotada de copa arredondada, tronco geralmente ereto,
com 30 a 50 centímetros de diâmetro, a madeira é dura, pesada e resistente, possui flores
solitárias, de cor branca e floresce no mês de agosto a setembro, com início de maturação dos
frutos de setembro a novembro (LORENZI, 1998; ANDRADE; FERREIRA, 2000).
Este fruto, do tipo baga, é carnoso, arredondado, de coloração amarela, sabor ácido e
possui de uma a quatro sementes com tegumento de coloração castanha. Pode ser consumido
in natura e segundo KINUPP (2007) o fruto da uvaia é muito versátil podendo ser utilizado
na elaboração de vários produtos apresentando potencialidade de uso industrial sendo muito
apreciado na forma de sucos, geleias, doces, vinho e licor (Figura 7).
No entanto uma questão importante é a conservação desse fruto pós-colheita, devido
ao fato de que quando maduro, é frágil e muito sensível ao toque, sendo assim, altamente
perecível, o que dificulta a comercialização in natura (LACERDA; LORENZI, 2006). Porém,
segundo SCALON; OLIO; FORNASIERI (2004) as uvaias embaladas apropriadamente
conservam a aparência e qualidade para comercialização até quatro dias sob temperatura de
30 ± 2ºC e 12 dias em refrigeração a 13 ± 2ºC.
O cultivo comercial de uvaia no Brasil ainda é escasso, no entanto esta fruta está
inserida no programa de melhoramento genético de frutas nativas da Embrapa e possui grande
potencial para exploração econômica, pois mostra alta produtividade com baixo custo de
implantação e manutenção (KROLOW, 2009).
Estudos com este fruto demonstraram atividade inibidora do crescimento de algumas
espécies de bactérias e relataram a ação letal do óleo essencial de suas folhas em ácaros
(STIEVEN; MOREIRA; SILVA, 2009; MATTOS, 2013).
23
2.9.1. Composição química do fruto da uvaia
COUTINHO, A. M.; PASCOLATTI (2014) determinaram a composição nutricional
do fruto da uvaia e encontraram 84,52% de umidade, 0,55 % de lipídios, 5,39 % de
carboidratos e 2,14 % de proteínas. Já DA SILVA et al. (2014) avaliaram a composição da
polpa de uvaia e encontraram 2,2 % de lipídios, e 5,5 % de proteínas e 44,4 % de carboidratos
dos quais 42,2% são de fibras.
Quanto aos micronutrientes, minerais como o cálcio, fósforo e ferro também foram
encontrados no fruto da uvaia, além de vitamina A, B1 e B2, esse fruto apresenta ainda teor
de ácido ascórbico variando de 33 a 39,52 mg/100g (LORENZI, 1998). Contudo os valores
observados para estes compostos divergem bastante de acordo com a fonte bibliográfica.
2.9.1. Compostos bioativos presentes no fruto da uvaia
A capacidade antioxidante dos alimentos está relacionada ao seu conteúdo de
compostos bioativos, dentre esses os frutos se destacam como ricos em antioxidantes naturais.
A busca de frutos exóticos, como a uvaia, que tem altos níveis de compostos bioativos foi
intensificada nos últimos anos, estudos epidemiológicos tem indicado uma associação entre o
aumento do consumo de vegetais e frutos ricos em antioxidantes com a redução do risco de
desenvolver doenças crônicas, como o câncer, diabetes tipo II, doença cardíaca coronária e
NAFLD (SEIFRIED et al., 2007; DONGIOVANNI et al., 2016).
O fruto da uvaia apresenta níveis significativos de compostos fenólicos, também
conhecidos como polifenóis, sendo que o ácido fenólico predominante no fruto é o ácido
gálico (PEREIRA et al., 2012; RAMIREZ et al., 2012; DA SILVA et al., 2014). Além disso,
A B C
Fonte: Arquivo pessoal; KROLOW (2009)
Figura 1- Fotos mostrando A: Árvore da uvaieira; B: O fruto da uvaia maduro e expondo
as sementes; C: Suco e geleia de uvaia.
24
o fruto ainda contém flavonoides, dos quais o de maior evidência é a quercetina e teores
consideráveis de ácido ascórbico (RUFINO et al., 2010; PEREIRA et al., 2012). No entanto,
à quantidade de antocianinas da uvaia é baixo quando comparado ao de outros frutos nativos
(HAMINIUK et al., 2011; KARWOWSKI, 2013).
Utilizando técnica de HPLC (Cromatografia liquida de alta eficiência) DA SILVA et
al. (2014) separaram os carotenoides do fruto da uvaia, sendo o carotenoide β-criptoxantina o
principal encontrado, representando 40% do total. Além disso, esse fruto ainda se destaca por
conter luteína (33,8% do total de carotenoides) e o β-caroteno (21%).
Quanto à sua capacidade antioxidante (HAMINIUK et al., 2011) utilizando método de
branqueamento de β-caroteno, encontraram um percentual de inibição de 94,71% da
peroxidação lipídica. Além disso, outros estudos in vitro mostraram que a uvaia possui uma
alta atividade antioxidante utilizando os métodos de inibição dos radicais DPPH e ABTS, os
valores encontrados para uvaia foram maiores do que os encontrados para outros frutos da
mesma família. (HAMINIUK et al., 2011; PEREIRA et al., 2012).
RAMIREZ et al. (2012) demonstraram efeito anti-inflamatório do extrato de uvaia em
ratos machos com edema de pata induzido por carragenina. Além disso, eles investigaram o
efeito do tratamento com o extrato de uvaia sobre a capacidade antioxidante do plasma e
observaram que a dosagem de TRAP (Potencial antioxidante reativo total), que reflete as
defesas antioxidantes não enzimáticas no tecido, foi significativamente reduzida. Em
contraste, o TAR (Reatividade antioxidante total) que representa a qualidade dos antioxidantes
foi significativamente aumentada nos mesmos animais. Os autores avaliaram ainda a
peroxidação lipídica no plasma através do método de substâncias reativas ao ácido
tiobarbitúrico (TBARS) e não encontram alteração significativa quando administrado o
extrato de uvaia. Até o momento o estudo acima citado é o único trabalho in vivo encontrado
na literatura utilizando o fruto da uvaia.
Diante do exposto, e da crescente incidência da NAFLD e suas complicações, e
considerando a composição fitoquímica e propriedades antioxidantes do fruto da uvaia, é
importante investigar seu possível efeito benéfico sobre a NAFLD, agentes do metabolismo
de lipídios, mecanismos de defesas antioxidantes e danos oxidativos.
25
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo Geral
Avaliar o efeito do tratamento com suco de uvaia sobre a esteatose hepática e mecanismos
envolvidos no metabolismo de lipídios e estresse oxidativo.
3.2. Objetivos Específicos
I. Determinar a composição centesimal, fitoquímica e atividade antioxidante do suco de uvaia;
Investigar os efeitos do suco de uvaia em ratos alimentados com dieta hiperlipídica e controle
sobre:
II. Massa corporal, ingestão alimentar e excreção fecal;
III. Perfil lipídico sérico, hepático e fecal;
IV. Alterações hepáticas através de marcadores bioquímicos séricos e padrão histológico;
V. Dano oxidativo e atividade de enzimas antioxidantes no fígado.
VI. A expressão de mRNA no fígado de genes relacionados ao metabolismo de lipídios.
VII. A expressão de mRNA no fígado de genes relacionados ao metabolismo peroxissomal
26
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Suco de Uvaia
Os frutos da uvaia foram colhidos durante seu período de maturação, entre os meses de
setembro e novembro de 2013, na região de Ouro Preto – MG. Os frutos inteiros foram
previamente higienizados utilizando solução de hipoclorito a 200 ppm por 10 minutos e
armazenados a - 20ºC até a sua utilização.
4.2.Preparo do Suco de Uvaia
O suco de uvaia foi filtrado através da compressão dos frutos em uma gaze limpa com
objetivo de filtrar a maior quantidade de fibras para facilitar a administração do suco nos
experimentos in vivo e em seguida foi armazenado a -20 ºC. Para as análises fitoquímicas e
determinação da capacidade antioxidante, uma amostra do suco foi centrifugada a 2.000 g a
4ºC por 15 min, para remoção de resíduos sólidos e lipídios. O sobrenadante foi utilizado
nessas análises.
4.3.Caracterização do Suco de Uvaia
4.3.1. Composição Centesimal
Foram analisados os teores de umidade, cinzas, lipídios totais, proteínas, fibras
detergente neutro (FDN) e carboidratos presentes no suco de uvaia. As análises foram
realizadas no Laboratório de Bromatologia da Escola de Nutrição da Universidade Federal de
Ouro Preto. A umidade foi determinada utilizando-se o método de secagem em estufa à 105ºC,
até peso constante. As cinzas totais foram determinadas após as amostras serem submetidas à
incineração em mufla (500-600ºC). Os lipídios totais foram extraídos com éter de petróleo,
com aquecimento, em extrator do tipo Soxhlet. A determinação de nitrogênio total foi baseada
no método tradicional de Kjeldahl, onde a concentração de proteína bruta foi calculada pelo
produto da quantidade de nitrogênio total (g) utilizando um fator de conversão pré-
estabelecido. Essas análises foram realizadas de acordo com Official methods of analysis of
Association of oficial Analytical Chemists International (HORWITZ; LATIMER, 2000). A
determinação de fibras em detergente neutro foi realizada de acordo com SOEST (1963). Os
carboidratos foram determinados pela diferença em relação aos demais componentes.
27
4.3.2. Conteúdo de polifenóis totais
O conteúdo de polifenóis totais do suco de uvaia foi determinado pelo método de
Folin-Ciocalteu descrito por GEORGÉ et al. (2005). Neste método, o reagente de Folin-
Ciocalteu, que é uma mistura dos ácidos fosfotungstico (H3PW12O40) e fosfomolíbdico
(H3PMo12O40), se reduz ao oxidar os compostos fenólicos, produzindo óxidos tungstico (W8
O23) e molibdênio de cor azul que absorvem no comprimento de onda de 760 nm. Inicialmente,
0,1 mL do suco de uvaia foram diluídos em 9,9 ml de água destilada. Em tubos de ensaio, 2,5
ml do reagente de Folin diluído em água destilada 1:10 foi adicionado a 0,5 mL da amostra
diluída ou solução padrão de ácido gálico em diferentes concentrações para obtenção da curva
de calibração. Água destilada foi utilizada como branco. Após 2 minutos, à temperatura
ambiente, foram adicionados 2 mL de solução carbonato de sódio 7,5% e a mistura foi agitada.
Após incubação de 15 minutos a 50°C colocou-se a mistura em banho de gelo. As
absorbâncias relativas ao branco foram determinadas a 760nm. Todas as análises foram
realizadas em triplicata. Foi construído um gráfico utilizando os valores de absorbância versus
a concentração do ácido gálico. Após análise de regressão linear e obtenção da equação da
reta, os valores de absorbância da amostra foram utilizados para o cálculo da concentração de
polifenóis. O conteúdo de polifenóis totais foi expresso em miligramas de equivalentes de
ácido gálico (GAE) por 100g de suco de uvaia.
4.3.3. Capacidade Antioxidante in vitro do Suco de Uvaia
A capacidade antioxidante do suco de uvaia foi determinada de acordo com o método
previamente descrito por BRAND-WILLIAMS; CUVELIER; BERSET (1995). Este método
baseia-se na transferência de elétrons de um composto antioxidante para o radical DPPH• (2,2-
difenil-1- picril-hidrazil) em solução de metanol. A redução do DPPH por antioxidantes
presentes na amostra é seguida pela redução da absorbância a 515nm. Resumidamente, as
determinações foram realizadas adicionando-se em tubos de ensaio, 3,9 ml de solução de
DPPH 60 μM, dissolvidos em metanol 80% e 0,1mL do suco de uvaia em diferentes
concentrações ou o mesmo volume para as soluções padrões e água destilada (controle). A
mistura foi homogeneizada e mantida na ausência de luz por 30 minutos à temperatura
ambiente. A absorbância da solução foi determinada a 515nm. Metanol 80% foi utilizado
como branco. Trolox (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromo-2-ácido carboxílico) em metanol
80% foi utilizado como antioxidante de referência. A atividade antioxidante foi determinada
28
através da redução da absorbância do radical DPPH a 515nm e o percentual de inibição foi
calculado de acordo com a equação 1:
(1)
% 𝑑𝑒 𝑖𝑛𝑖𝑏𝑖çã𝑜 𝑑𝑜 𝑟𝑎𝑑𝑖𝑐𝑎𝑙 𝐷𝑃𝑃𝐻 = (𝐴𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑒 515 − 𝐴𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 515)
𝐴𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑒 515 × 100
Onde;
Aamostra 515 é a absorbância da amostra obtida a 515nm;
Acontrole 515 é a absorbância da solução de DPPH sem a presença de antioxidantes obtida a
515nm (controle).
4.4.Animais
Foram utilizados 32 ratos, fêmeas, da linhagem Fischer com aproximadamente 50 dias
de idade e peso médio de 120g, provenientes do Laboratório de Nutrição Experimental
(LABNEX) da Escola de Nutrição da Universidade Federal de Ouro Preto. Os animais foram
mantidos em gaiolas individuais e estas foram dispostas em ambiente arejado, com controle
de temperatura, umidade e ventilação, os animais receberam água e dieta ad libitum, sendo as
dietas específicas para cada grupo experimental. Todos os procedimentos foram aprovados
pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da UFOP (Protocolo nº 2013/32)
(ANEXO I).
4.5.Dietas
Os animais foram alimentados com dieta AIN-93M (4% de óleo de soja) (REEVES;
NIELSEN; FAHEY JR, 1993) ou dieta hiperlipídica (25% de óleo de soja e 2% de colesterol
(MATOS et al., 2005). A composição das dietas experimentais está descrita na tabela 1. As
dietas foram produzidas no LABNEX, embaladas em sacos plásticos devidamente
identificados e armazenadas a 4°C durante todo o experimento. Além da dieta os animais
recebiam 2 mL/dia de água destilada ou suco de uvaia por via oral (gavagem) do 14º dia do
experimento até 70º dia. A dose de suco de uvaia administrada aos animais foi correspondente,
em termos calóricos, ao consumo de uma porção do fruto de uvaia (200 ml de suco
29
concentrado) por um humano adulto que ingere em média 2000 kcal por dia e o consumo de
polifenóis totais foi de 2,70 ± 0,19 mg de equivalentes de ácido gálico por dia.
Tabela 1- Composição das dietas experimentais (g/Kg de dieta).
Nutrientes Dietas
Padrão (AIN93-M) Hiperlipídica
Colina 2,5 2,5
Mix Vitaminas1 10,0 10,0
Mix Minerais2 35,0 35,0
Celulose 50,0 50,0
Sacarose 100,0 100,0
Óleo de Soja 40,0 250,0
Caseína 140,0 140,0
Amido de milho 622,5 402,5
Colesterol 0,0 20,0
Valor calórico (Kcal /kg) 3810 4820 ¹ - Mistura de Minerais (expresso em g/kg da mistura): NaCl - 74/KI - 0,01/Citrato Tripotássico - 28/CaCO3 -
357/MnCO3 - 0,63/Citrato de Ferro - 6,06/ MgO - 24/ K2SO4 - 46,6/ KH2PO4 - 250 / ZnCO3 - 1,65/CuCO3 -
0,3/Na2SeO4 - 0,01/(NH4)6MoO24. 4 H2O - 0,00795. Os sais foram adquiridos da Reagen, Rio de Janeiro, Brasil.
² - Mistura de Vitaminas (expresso em g/kg da mistura): Niacina - 3/ Pantotenato de Cálcio - 1,6/Piridoxina
HCl - 0,7/Tiamina HCl - 0,6/Riboflavina - 0,6/Ácido Fólico - 0,2/Biotina - 0,02/Cianocobalamina - 2,5/Vitamina
E (500 IU/g) - 15/Vitamina A (500.000 IU/g) - 0,8/Vitamina D (400.000 IU/g) - 0,25/Vitamina K -
0,075/Sacarose q.s.p. 1Kg. As vitaminas foram adquiridas da Merck, Darmstadt, Alemanha.
4.6.Delineamento Experimental
Inicialmente, trinta e dois ratos adultos foram submetidos a um período de adaptação
às dietas por 14 dias. Para isso, eles foram divididos, aleatoriamente, em 2 grupos (n = 16), de
acordo com a massa corporal e com a dieta recebida: grupo Controle (C), que recebeu dieta
padrão AIN-93M (REEVES; NIELSEN; FAHEY JR, 1993) e grupo hiperlipídico (H), que
recebeu dieta hiperlipídica (25% de óleo de soja e 2% de colesterol) (MATOS et al., 2005).
Após duas semanas, os C e H foram subdivididos de acordo com o tratamento recebido,
obtendo-se 4 grupos experimentais (n = 8). Os grupos C e CUv (controle uvaia) receberam
dieta padrão e os grupos H e HUv (hiperlipídico uvaia) receberam dieta hiperlipídica. Além
da dieta, os grupos CUv e HUv receberam tratamento com suco de uvaia, administrado
diariamente por via oral (gavagem) do início da 3ª semana até o final da 10ª semana. A
30
pesagem dos animais foi realizada semanalmente para avaliar a evolução da massa corporal
durante o experimento. Na 5ª semana de experimento, foi realizado o controle de ingestão
alimentar e a excreção fecal também foi determinada. Ao final de dez semanas experimentais,
os animais foram deixados 12 horas em jejum e, após anestesia com isoflurano, foram
eutanasiados (Figura 8).
Figura 8- Representação esquemática do delineamento experimental.
O sangue foi coletado por incisão da artéria braquial e recolhido em tubos de
polipropileno, centrifugado a 3.000 g por 15 minutos, para obtenção do soro. Alíquotas de
soro foram armazenadas a - 80ºC. Os fígados dos animais foram coletados, lavados em solução
salina, pesados, imersos em nitrogênio líquido e imediatamente armazenados a -80ºC para
posteriores análises. O menor lóbulo do fígado foi separado para análise histopatológica,
sendo conservado em formol a 10% tamponado.
A eficiência alimentar foi calculada pela razão entre o ganho de massa (g) e a ingestão
alimentar (g).
4.7. Dosagens dos metabólicos e enzimas séricos
Para avaliação do perfil lipídico sérico, os TAG, colesterol total e HDL, atividade
séricas de AST, ALT e fosfatase alcalina foram feitos por métodos colorimétricos (Kits
Labtest Diagnóstica S.A), sendo os procedimentos realizados de acordo com as instruções do
fabricante. A fração colesterol não-HDL foi obtida pela diferença entre colesterol total menos
colesterol HDL.
31
4.8. Extração e dosagem de lipídios hepáticos
Os lipídios totais foram extraídos de uma alíquota de fígado de acordo com o método
proposto por FOLCH; LEES; SLOANE-STANLEY (1957). Para isso, 400 mg de fígado
foram homogeneizados com 4 mL de solução de clorofórmio/metanol (2:1, vol/vol). Em
seguida, adicionou-se mais 4 mL da solução de clorofórmio/metanol (2:1, vol/vol) e a solução
resultante foi vigorosamente agitada no vórtex por 3 minutos. Foram adicionados aos tubos
0,8 mL de metanol, que foi então centrifugado a 3.000 g, durante 10 minutos. O sobrenadante
foi transferido para outro tubo ao qual foi adicionado 1,6 mL de clorofórmio e 0,64 mL de
solução de NaCl a 0,73%. Após este procedimento, foi feita uma nova centrifugação a 3.000
g, durante 10 minutos. O sobrenadante foi descartado e o precipitado foi lavado três vezes
com 0,3 mL de solução de Folch (3% de clorofórmio, 48% metanol, 47% água e 2% de NaCl
a 0,2%). Os extratos lipídicos foram secos em estufa semiaberta à 40ºC e ressuspensos em
1mL de isopropanol. Os conteúdos de lipídios foram determinados pela diferença de peso
entre o tubo contendo os lipídios e o mesmo tubo vazio. Os conteúdos de TAG e colesterol
total foram determinados utilizando-se Kits Labtest Diagnóstica S.A. (Lagoa Santa, MG,
Brasil), de acordo com as instruções do fabricante.
4.9. Extração e dosagem de lipídios fecais
Os lipídios totais fecais foram extraídos conforme descrito por FOLCH; LEES;
SLOANE-STANLEY (1957). Inicialmente, 200 mg de fezes foram homogeneizadas com 1,9
mL de solução clorofórmio/metanol (2:1 vol/vol). À mistura foram adicionados 0,4 mL de
metanol e posteriormente foi realizada a centrifugação a 3.000 g, por 10 minutos. As etapas
seguintes deste procedimento foram realizadas tal como descrito anteriormente para extração
de lipídios hepáticos.
4.10. Avaliação histológica do fígado
Fragmentos do fígado foram fixados em formol 10% por 72h. Em seguida, os
fragmentos foram cortados transversalmente, processados em série decrescentes de álcoois e
incluídos em parafina. Secções parafinadas (4 μm) foram cortadas em micrótomo rotativo
(Leica, Alemanha) e montadas em lâminas de microscópio. As lâminas foram coradas com
hematoxilina e eosina (H&E), visualizadas em microscópio Leica DM5000B e fotografadas
na ampliação de 400x (Leica Application Suite, Versão 2.40R1, Alemanha). A histologia
hepática foi avaliada a partir de 15 imagens (campos) aleatórias obtidas do tecido do fígado
32
de cada animal. Posteriormente foi feita uma medida quantitativa da área das microvesículas
de gordura utilizando o software Image J.
4.11. Ensaio de RT-PCR quantitativa em tempo real
4.11.1. Cálculo da eficiência dos primers
Para determinar as eficiências da amplificação dos genes alvo e do gene controle
endógeno, foram construídas curvas padrões para cada amplicon, a partir de diluições seriadas
do cDNA de uma mesma amostra. A análise da regressão linear dos valores de CTs em função
do logaritmo da respectiva diluição determinou o coeficiente angular da reta (𝑎, em 𝛾 = 𝑎𝑥 +
𝑏) que foi utilizado para o cálculo da eficiência de amplificação do produto pelos primers,
utilizando a equação 2.
(2)
𝐸𝑓 = (10−1/𝑐𝑜𝑒𝑓𝑖𝑐𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑎𝑛𝑔𝑢𝑙𝑎𝑟 − 1) × 100
4.11.2. Extração de RNA
O RNA total do fígado de ratos foi isolado utilizando o sistema SV Total RNA
Isolation System (Promega Corporation, Madison, USA) de acordo com as instruções do
fabricante e quantificado por leitura em espectrofotômetro (Nano Vue, GE Healthcare) no
comprimento de onda de 260nm. A pureza do RNA total foi verificada pela razão A260/A230
que indica possíveis contaminações por sais e compostos orgânicos. As amostras com razões
entre 2,0 e 2,2 foram consideradas adequadas para quantificação da expressão gênica.
4.11.3. Síntese do cDNA
O ácido desoxirribonucléico complementar (cDNA) foi sintetizado a partir de 2 μg de
RNA total utilizando o kit Hight-Capacity cDNA Reverse Transcription da Applied
Biosystems, (Foster City, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. O meio de
reação continha 2 μL de tampão 10x (500 mM de KCl, 100 mM de Tris-HCl, 25 mM de
MgCl2, pH 8,3), 0,8 μL da mistura de desoxiribonucleotídeos trifosfato (dNTPs) 100 mM, 2
μL de primers randômicos e 1 μL da enzima transcriptase reversa MultiScribe (50 U/μL). A
reação foi realizada nas seguintes condições, 10 minutos a 25 °C, seguidos de 120 minutos a
37 °C e 5 minutos a 85 °C no termociclador Biocycler modelo MJ96+.
33
4.11.4. Desenho dos oligonucleotídeos iniciadores (primers)
O oligonucleotídeo iniciador utilizado para amplificação do transcrito de interesse foi
desenhado de acordo com sequências de nucleotídeos utilizados por DE SOUZA, MELINA
OLIVEIRA et al. (2012) para SREBP-2, HMGCoA-R, CYP7A1, LDL-R, PPARα, ABCG5 e
ABCG8. Os demais oligonucleotídeos iniciadores utilizados para amplificação dos transcritos
de interesse, foram desenhados de acordo com sequências de mRNA de Rattus novergicus
disponível no banco de dados Gen Bank (National Center for Biotechnology Information)
utilizando o programa Primer-BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). O
gene de referência endógeno é utilizado para correção da expressão gênica do gene-alvo, este
gene foi selecionado a partir de um teste onde foram usados os genes rRNA 18S GAPDH e
β-actina, sendo que o gene que sofreu menor oscilação na expressão sob diferentes situações
testadas foi o rRNA 18S, sendo este selecionado como gene de referência. As sequências dos
oligonucleotídeos iniciadores estão apresentadas na tabela 2.
Tabela 2- Sequência dos oligonucleotídeos iniciadores utilizados para a análise de qRT-
PCR.
Genes Sequências
rRNA 18S F: 5′-GTAAGTGCGGGTCATAAG-3′
R: 5′-CCATCCAATCGGTAGTAGC-3′
ABCG5 F: 5′-AGGCTCAGTTACAGGCTCAGAG-3′
R: 5′-GTC CCACTTCTGCTGGCATGAT-3′
ABCG8 F: 5’-CGTCAGATTTCCAATGACTTCCG -3’
R: 5’-TCCGTCCTCCAGTTCATAGTACA-3’
HMGCoA-R F: 5’- AGATACTGGAGAGTGCCGAGAAA-3’
R: 5’-TTTGTAGGCTGGGATGTGCTT-3’
CYP7A1 F: 5’-GCTTTGGGCTTTAGACCCTCCC-3’
R: 5’-TTCGCTCCATGAAAAACTTCTG-3’
LDL-R F: 5’-CCAACCTGAAGAATGTGGTG-3’
R: 5’-CAGGTCCTCACTGATGATGG-3’
SREPB-2 F: 5’-TGGGCTTCTTGGCTAGCTACTT-3’
R: 5’-TTCGCTCCATGAAAAACTTCT G-3’
ACAT-2 F: 5’-GTCTCTGAGAAACCGGCTGT-3’
R: 5’-CCAACTGCCTCTTCTTGGCT-3’
PPARα F: 5’-TGTCGAATATGTGGGGACAA-3’
R: 5’-AAACGGATTGCATTGTGTGA-3’
CPT-1α F: 5’-ATATTGGGCACAGTCCCCTG-3’
R: 5’-TGTGAAGAAACAACCCCCAGA-3’
ACOX-1 F: 5’-TGGAACCTGTTGGCCTCAAT-3’
34
R: 5’-ATCTGGAGTTCTTGGGACGG-3’
FAS F: 5’-CTTGGGTGCCGATTACAACC-3’
R: 5’-CAGACACCTTCCCATCACACA-3’
ACC1 F: 5’-AGGAAGATGGTGTCCGCTCTG-3’
R: 5’-GGGGAGATGTGCTGGGTCAT-3’
SREBP-1c F: 5’-CCGAGGTGTGCGAAATGGA - 3’
R: 5’-CCAGCATAGGGGGCATCAAA-3’
PMP70 F: 5’-TGGCATCATTGGTCGTAGCA - 3’
R: 5’-GATAAGAGGCATGGCAGCGA-3’
PEX11a F: 5’- ATCCGAGTCGCCAACCAAAG - 3’
R: 5’-GCCTCTTTGCCAGCCTTAGA - 3’
Catalase F: 5’- ATTGCCGTCCGATTCTCC - 3’
R: 5’- CCAGTTACCATCTTCAGTGTAG - 3’
rRNA 18S, Ácido ribonucleico ribossomal 18S; ABCG5, ATP-binding cassette subfamily G member 5; ABCG8,
ATP-binding cassette subfamily G member 8; ACAT-2, Colesterol aciltransferase-2; ACC1, Acetil Co-A
carboxilase 1; ACOX-1, Acil-CoA oxidase 1; CPT1-α, Carnitina palmitoil transferase 1 alfa; CYP7A1, Colesterol-
7α-hidroxilase; FAS, ácido graxo sintase; HMGCoA-R. a 3-hidróxi-3-metil-glutaril CoA redutase LDL-R,
receptor da lipoproteína de baixa densidade; PEX11a; Proteína de membrana peroxisomal 11a. PMP70; Proteína
de Membrana Peroxisomal 70 kDa. PPAR-α, Receptor alfa ativado por proliferadores peroxissomais; SREBP-1c;
Proteína 1c ligadora do elemento regulado por esteróis. SREPB-2; Proteína de ligação ao elemento de resposta a
esterol-2.
4.11.5. RT-PCR Quantitativa em Tempo Real
Para a análise da expressão dos genes em estudo foi utilizada a técnica da reação em
cadeia da polimerase quantitativa pós-transcrição reversa (qRT-PCR). As reações foram
realizadas em placas de 96 poços, com um volume final de reação de 12 μL, foram pipetados
2 μL de cDNA (50 ng), 0,5 μL de cada primer (forward e reverse, 10 μM), 6 μL de SYBR®
Green Master Mix (Applied Biosystems), o volume final foi ajustado com água DEPC
(dietilpirocarbonato) que é considerado um inibidor de RNAase e DNAse. As reações foram
realizadas nas seguintes condições, 50 °C por 2 min, 95 °C por 10 min e então 40 ciclos de 95
°C por 15 s (desnaturação) e 60 °C por 1 min (anelamento dos primers e extensão dos
produtos) no termociclador ABI 7300 (Applied Biosystems). O gerenciamento do
termociclador e a coleta dos dados gerados durante a amplificação foram realizados pelo
programa 7500 Software (Applied Biosystems). Todas as análises foram realizadas em
triplicata técnica. A especificidade dos produtos obtidos foi confirmada pela análise das curvas
de dissociação do produto amplificado ao final de cada reação.
Os dados obtidos foram analisados utilizando o método de quantificação relativa da
expressão gênica (Cq comparativo ou ΔΔCq), que permite quantificar diferenças no nível de
expressão de um gene específico entre as diferentes amostras. A expressão dos genes alvo foi
35
determinada em função da expressão do gene de referência rRNA 18S e o grupo controle foi
utilizado como base para os resultados de expressão comparativa. De posse dos valores de Cq
(quantification cycle), que corresponde ao número de ciclos na fase exponencial do PCR em
que a fluorescência ultrapassa o valor basal, foi calculado o ΔCq de cada amostra, de acordo
com a equação 3, na qual o valor do Cq do gene controle endógeno (rRNA 18S) foi subtraído
do Cq do gene alvo.
(3)
∆𝐶𝑞 = 𝐶𝑞 𝑑𝑜 𝑔𝑒𝑛𝑒 𝑎𝑙𝑣𝑜 − 𝐶𝑞 do gene de referência
Em seguida foram calculados os valores de ΔΔCq, de acordo com a equação 4, na qual
o valor do ΔCq da amostra controle (grupo C) foi subtraído do ΔCq das amostras teste (demais
grupos experimentais).
(4)
∆∆𝐶𝑞 = ∆𝐶𝑞 𝑑𝑎 𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑡𝑒𝑠𝑡𝑒 − ∆𝐶𝑞 𝑑𝑎 𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙
Os valores do ΔΔCq obtidos foram utilizados em uma fórmula aritmética para o
cálculo final da diferença de expressão dos genes entre as amostras analisadas, dada por 2 –
ΔΔCT.
4.12. Avaliação do estresse oxidativo
4.12.1. Peroxidação lipídica no fígado por TBARS
A geração de radicais livres e a peroxidação lipídica são reações extremamente rápidas,
que, geralmente, são mensuradas pelos seus produtos, principalmente TBARS, entre os quais
o MDA é o principal. A mensuração dos metabólitos reativos foi realizada em placa de 96
poços pelo método descrito por BUEGE; AUST (1978) Inicialmente, 100mg de tecido foi
homogeneizado em 1 mL de tampão Tris-HCl 20 mM e o homogenato foi centrifugado a
10.000 g, por 10 minutos a 4ºC. Em seguida, 0,5 mL do sobrenadante foram misturados com
0,25 mL de ácido tricloroacético (TCA) (28% p/vol em HCl 0,25 M), 0,25 mL de ácido
tiobarbitúrico (TBA) (1% de ácido acético 0,25 M) e 12,5 mL de butilhidroxitolueno (BHT)
(125 mM em etanol), aquecido por 15 min a 95ºC e colocado em banho de gelo. Foram
transferidos 0,6 mL da mistura para um tubo de polipropileno e adicionados 0,6 mL de
butanol. Os tubos foram agitados e, após uma centrifugação de 10.000 g por 10 min a 4ºC, o
sobrenadante foi recolhido e plaqueado. A absorbância foi determinada a 535nm e a água
destilada foi utilizada como branco. A quantificação de MDA foi feita a partir de uma curva
36
de calibração construída com concentrações conhecidas. O padrão utilizado foi o 1,1,3,3-
tetrametoxipropano (TMP) que, em condições ácidas do teste, sofrem hidrólise, resultando na
liberação de MDA. Os resultados foram expressos em nmol de MDA/mg de proteína.
4.12.2. Proteínas carboniladas
A concentração de proteínas carboniladas foi determinada de acordo com o método de
LEVINE et al. (1994). A oxidação de proteína por ERO leva à formação de derivados
carbonilados. Estes podem ser mensurados por métodos sensíveis, particularmente aqueles
que utilizam o 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNPH). O DNPH reage com grupos carbonílicos
gerando a hidrazona correspondente, a qual pode ser analisada espectrofotometricamente. Na
dosagem, 400 mg do fígado foi homogeneizado com 2 mL de tampão fosfato 50 mM (pH 6,7)
e o homogenato foi centrifugado a 10.000 g, a 4ºC por 15 minutos. Em seguida, 0,5 mL do
sobrenadante foram transferidos para tubos de polipropileno identificados para as amostras e
um branco para cada amostra. A cada tubo, foi adicionado igual volume de ácido
tricloroácetico (TCA 10%) e após centrifugação a 5.000 g a 4ºC por 10 minutos, o
sobrenadante foi descartado. Depois, foram adicionados 0,5 mL de DNPH 10 mM aos tubos
com as amostras e 0,5 mL de HCl 2M aos brancos. Todos os tubos foram mantidos no escuro
à temperatura ambiente por um período de 30 minutos e a cada 15 minutos foram agitados
vigorosamente. No passo seguinte, foram adicionados 0,5 mL de TCA 10% em cada tubo.
Esses foram centrifugados a 10.000 g por 10 minutos a 4°C e os sobrenadantes foram
descartados. Os precipitados em ambos os tubos foram lavados com 1 ml da mistura
etanol/acetato de etila na proporção de 1:1, agitados vigorosamente em vórtex e novamente
centrifugados conforme descrito na etapa anterior, e o sobrenadante foi descartado. Este
último passo foi repetido por duas vezes. Ao final do processo de lavagem, foi adicionado em
ambos os tubos 1 ml de SDS 6%, misturados no vórtex e centrifugados a 10.000 g a 4ºC por
10 minutos. Por fim, as absorbâncias dos sobrenadantes foram determinadas a 370nm. Os
resultados foram expressos em nmol de DNPH incorporado/mg de proteína. O conteúdo de
DNPH incorporado foi calculado utilizando o coeficiente de extinção molar do DNPH (22000
M-1cm-1) segundo a lei de Lambert Beer.
37
4.13. Defesas antioxidantes
4.13.1. Atividade arilesterásica e paraoxonásica da enzima Paraoxonase
A atividade arilesterásica da PON 1 foi realizada conforme método descrito por
BEŁTOWSKI; WÓJCICKA; JAMROZ (2002). Esse método utiliza o fenilacetato como
substrato, tendo como base a velocidade de hidrólise enzimática do fenilacetato com formação
de fenol, cuja taxa de formação é determinada espectrofotometricamente. Uma alíquota de 5
µL (diluído 1:3) do soro foi adicionada a 2,5 mL de Tris-HCl 9 mM; pH 8,0 contendo 0,9
mM de Cloreto de cálcio (CaCL2) e 1 mM de fenilacetato em um tubo. Após exatamente 3
minutos a absorbância foi lida a 270nm. Para a correção da hidrólise espontânea do
fenilacetato incluiu-se um branco constituído pelo tampão Tris/HCl/CaCl2 e fenilacetato sem
a amostra. O resultado foi calculado segundo a lei de Lambert Beer, assumindo o coeficiente
de extinção molar de fenilacetato (ɛ = 1310 L mol-1 cm-1). Os valores foram expressos em
unidades por mililitro de soro (U/mL), onde 1 U de paraoxonase é equivalente à hidrólise de
1mmol de fenilacetado por minuto.
A determinação da atividade paraoxonásica sérica da enzima PON 1 foi também
realizada a partir do método proposto por BEŁTOWSKI; WÓJCICKA; JAMROZ (2002).
Nessa dosagem, utilizou-se como substrato o paraoxon (O dietil-O- paranitrofenil fosfato). A
hidrólise enzimática do paraoxon libera p-nitrofenol, cuja taxa de formação foi determinada
por espectrofotometria. Inicialmente, preparou-se uma solução contendo 9 mL de tampão
Glicina/NaOH 50mM; pH 10,5 contendo CaCl2 0,9mM e 2µL de paraoxon. Posteriormente,
em tubo de polipropileno adicionaram-se 780µL dessa solução a 20µL de soro. As amostras
foram homogeneizadas e as absorbâncias das mesmas foram determinadas no
espectrofotômetro a 412nm, exatamente a cada minuto, por 3 minutos. Para o branco, utilizou-
se no lugar da amostra, 20µL de água destilada. O resultado foi calculado segundo a lei de
Lambert Beer, assumindo o coeficiente de extinção molar do paraoxon (ɛ = 18290 L mol-1
cm-1). Os valores foram expressos em unidades por mililitro de soro (U/mL), onde 1 U de
paraoxonase é equivalente à hidrólise de 1mmol de paraoxon por minuto.
4.13.2. Atividade da enzima Catalase
A atividade da enzima catalase foi determinada de acordo com AEBI (1984). O método
baseia-se na decomposição do H2O2 pela enzima observada durante 3 min por
espectrofotometria a 240 nm. Resumidamente, 100 mg do fígado foi homogeneizado em 1
mL de tampão fosfato 100 mM, pH 7,2 e, em seguida, o homogenato foi centrifugado a 10.000
38
g a 4ºC por 10 minutos. Em um tubo de polipropileno foi colocado 50 μL de tampão fosfato
100 mM, (pH 7,2), 40 μL de água destilada e 10 μL do sobrenadante do homogenato. A reação
foi iniciada pela adição de 0,9 mL de H2O2 10 mM. As absorbâncias foram determinadas
exatamente a cada minuto, durante três minutos a 240nm. Água destilada foi utilizada como
branco. A atividade da catalase foi calculada segundo a lei de Lambert Beer, utilizando o
coeficiente de extinção molar do H2O2,39,4 M-1cm-1. Os resultados foram expressos em
unidade por miligrama de proteína (U/mg), onde uma unidade de catalase é equivalente a
decomposição de 1 μmol de H2O2 por minuto.
4.13.3. Atividade da enzima Superóxido dismutase
Atividade da SOD foi determinada no fígado de acordo com o método de
MARKLUND; MARKLUND (1974) adaptado, baseado na auto oxidação do pirogalol e a
inibição da redução do corante brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il) - 2,5-difeniltetrazólio)
(MTT). O superóxido é gerado por auto oxidação do pirogalol em meio básico e a SOD
compete por este radical inibindo a auto oxidação. A quantidade de enzima necessária para
promover 50% de inibição da auto oxidação do pirogalol é considerada como uma unidade de
atividade enzimática.
Para o procedimento, fragmentos de 100 mg do fígado foram homogeneizados com 1
mL de tampão fosfato 50mM, pH 7,0 e em seguida centrifugado a 10.000 g a 4ºC por 10
minutos. O sobrenadante foi retirado e usado como amostra biológica. As dosagens foram
feitas usando placa de Elisa, foi pipetado 30 μL de amostra, 99 μL de tampão fosfato, 6 μL de
MTT 1.25 mM e 15 μL de pirogalol 100 μM. Para o branco foi pipetado 144 μL de tampão
fosfato e 6 μL de MTT e para o padrão 129 μL de tampão, 6 μL de MTT e 15 μL de pirogalol.
Em seguida a placa foi incubada por 5 minutos em estufa a 37 ºC. Logo após, 150 μL de
DMSO (dimetilsulfóxido) foram adicionados às mesmas para parar a reação. As absorbâncias
foram lidas no leitor de Elisa em um comprimento de onda de 570 nm. Para cálculo da
atividade de SOD, subtrai-se o resultado obtido da amostra pelo valor encontrado do branco
e, a seguir, divide-se esse valor pelo encontrado da subtração do padrão pelo branco. Os
resultados foram expressos em U de SOD/mg de poteína.
4.13.4. Conteúdo de Glutationa total
O conteúdo de glutationa total foi determinado por meio de um ensaio que utiliza um
método cinético baseado na redução do DTNB (ácido 5,5´ditio-bis (2-nitrobenzóico)) a TNB
39
(ácido 5-tio-2-nitrobenzóico) proposto por GRIFFITH (1980), que pode ser detectado
espectrofotometricamente a 412nm, conforme descrito nas seguintes reações:
1) 2 GSH + DTNB → GSSG + 2 TNB
Glutationa redutase 2) GSSG + NADPH + H+ 2 GSH + NADP
A combinação das duas reações:
Glutationa redutase DTNB + H+ + NADPH 2 TNB + NADP+ GSSH/GSH
Para o procedimento experimental, 100mg do fígado foram homogeneizados com 1mL
de ácido de sulfosalicílico 5% e em seguida centrifugado por 10 minutos a 4ºC. Em
microplaca, adicionou-se 10 μL do sobrenadante do homogenato e 150 μL de solução
contendo 95 mM de tampão fosfato pH 7,0, EDTA 0,95 mM, NADPH 48 μM, 0,031 mg/mL
de DTNB, 0,115 unidades/mL de glutationa redutase, e 0.24% de ácido de sulfosalicílico. As
amostras foram incubadas por 5 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, 50 μL de
NADPH 0,16mg/mL foram adicionados às mesmas e o cronômetro disparado. As
absorbâncias das amostras foram lidas durante 5 minutos a cada minuto, no leitor de ELISA
à 412nm.
As absorbâncias de diluições seriadas de uma solução padrão de glutationa reduzida
foram determinadas conforme descrito anteriormente, para obtenção da curva de calibração.
Após análise de regressão linear, foi determinada a equação da reta. Esta equação foi utilizada
para determinar a concentração em nmoles de glutationa total em 10 μL de amostra, e este
valor convertido para 1 mL de amostra.
4.13.5. Conteúdo de Glutationa oxidada
Para determinar a concentração de glutationa oxidada, 100 mg do fígado foram
homogeneizados com 1mL de ácido de sulfosalicílico 5% e, em seguida, centrifugado por 10
minutos à 4ºC. Em tubos de polipropileno adicionou-se 100 μL do sobrenadante a 2 µL de
vinilpiridina e misturou-se em vórtex. O pH foi ajustado na faixa 6-7 com trietanolamina
(TEA). As amostras foram incubadas a temperatura ambiente durante 60 min e, em seguida,
procedeu-se o ensaio conforme a dosagem da glutationa total.
4.13.6. Conteúdo Glutationa reduzida
A concentração de glutationa reduzida foi obtida pela subtração entre a glutationa total
e a glutationa oxidada.
40
4.13.7. Glutationa Peroxidase e Glutationa Redutase
A atividade da glutationa peroxidase foi determinada de acordo com o método
proposto por PAGLIA; VALENTINE (1967) com modificações. O método se baseia na
oxidação da glutationa reduzida (GSH), catalisada pela glutationa peroxidase, acoplada a
reciclagem da GSSG através da reação catalisada pela enzima glutationa redutase que utiliza
o NADPH como cofator. O decréscimo na absorbância medida a 340nm durante a oxidação
do NADPH é indicativo da atividade da glutationa peroxidase.
Uma alíquota de 100 mg de tecido hepático foi homogeneizada em 1 mL de tampão
Tris HCL 50mM, pH 7,0. Após centrifugação a 10.000 g por 15 minutos a 4º C o sobrenadante
foi removido e utilizado no ensaio. Em uma microplaca de 96 poços foram adicionados 100
μL de tampão de ensaio, 10 μL de amostra e 80 μL do mix composto por NADPH 0,25mM,
GSH 2,1 mM, 0,5 U/mL de glutationa redutase e azida sódica 1mM. A azida sódica foi
adicionada ao meio, para inibir a atividade da catalase que também utiliza peróxido de
hidrogênio como substrato. A reação foi iniciada pela adição de 10 μL de H2O2 0,2 mM,
utilizado como substrato da reação. A oxidação do NADPH foi monitorada a 340 nm. Foram
realizadas cinco leituras, com intervalo de vinte segundos entre elas. A atividade da GPx foi
calculada utilizando a fórmula descrita abaixo.
𝐴𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑑𝑒 𝐺𝑃𝑥 = ∆𝐴340/𝑚𝑖𝑛
3.73 µmol/min ×
𝑉𝑅
𝑉𝐴
Onde;
ΔA340 é o delta da absorbância por minuto,
3,73 é o coeficiente de extinção molar do NADPH. O valor real do coeficiente de extinção
molar do NADPH de μmol-1 cm-1 é de 6,22, no entanto este valor foi ajustado para o caminho
óptico da solução em microplaca de 0,6 cm.
VR é o volume de reação em mL,
VA é o volume de amostra em mL.
Uma unidade de enzima é definida como a quantidade de enzima que causa a oxidação
de 1μmol de NADPH por minuto a 25º C. A atividade específica foi expressa em unidades
por mg de proteína.
(5)
41
A determinação da atividade enzimática da glutationa redutase foi realizada de acordo
com o método proposto por CARLBERG; MANNERVIK (1985). O ensaio é baseado na
redução da glutationa oxidada pelo NADPH na presença da glutationa redutase.
Amostras de 100mg de tecido hepático foram homogeneizadas em 1mL de tampão
fosfato de potássio 100mM, pH 7,5 contendo 1mM de EDTA. Após centrifugação a 10.000g
por 15 minutos a 4º C o sobrenadante foi removido e utilizado no ensaio. Em uma microplaca
de 96 poços foram adicionados 60 μL de tampão de ensaio, 100μL de GSSG 2mM e 10 μL de
amostra. A reação foi iniciada pela adição de uma solução 2mM de NADPH. A atividade da
glutationa redutase foi mensurada espectrofotometricamente através da redução da
absorbância, causada pela oxidação do NADPH a 340 nm. Foram realizadas dez leituras, com
intervalo de vinte segundos entre elas e a atividade foi calculada de acordo com a equação
abaixo:
𝐴𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑑𝑒 𝐺𝑅 = ∆𝐴340/𝑚𝑖𝑛
3.73 µmol/min ×
𝑉𝑅
𝑉𝐴
Onde;
ΔA340 é o delta da absorbância por minuto,
3,73 é o coeficiente de extinção molar do NADPH. O valor real do coeficiente de extinção
molar do NADPH em unidades de μmol-1 cm-1 é de 6,22, no entanto este valor foi ajustado
para o caminho óptico da solução no poço da microplaca de 0,6 cm.
VR é o volume de reação em mL,
VA é o volume de amostra em mL,
Uma unidade de enzima é definida como a quantidade de enzima que causa a oxidação de
1μmol de NADPH por minuto a 25º C e a atividade específica foi expressa em unidades por
mg de proteína.
4.14. Determinação de proteínas totais
As proteínas totais nas amostras de fígado utilizadas para determinação da peroxidação
lipídica por TBARS, níveis de proteínas carboniladas, atividade das enzimas catalase,
superóxido dismutase e glutationa peroxidase e redutase foram mensuradas pela técnica de
LOWRY et al. (1951).
(6)
42
4.15. Análises Estatísticas
A normalidade dos dados foi verificada através do teste de Kolmogorov–Smirnov. Para
análise dos dados paramétricos foi utilizada a análise de variância univariada ANOVA one-
way seguida pelo teste de Tukey para comparação das médias e foram expressos como a média
± erro padrão da média (EPM). Para análise dos dados não-paramétricos foi utilizado o teste
de Kruskal-Wallis seguido do teste de Dunn para comparação das medianas e os resultados
foram expressos como a mediana ± intervalo interquartil. Diferenças foram consideradas
significantes para p<0,05. Todas as análises foram realizadas utilizado o software GraphPad
Prism versão 6.00 para Windows (San Diego, California, USA)
43
5. RESULTADOS
5.1.Composição centesimal, polifenóis totais e capacidade antioxidante do suco
de uvaia.
Os dados da composição centesimal do suco de uvaia e os resultados obtidos para o
conteúdo de polifenóis e capacidade antioxidante equivalente ao trolox (TEAC) no suco de
uvaia são apresentados na tabela 3.
Tabela 3- Composição centesimal, conteúdo de polifenóis totais e capacidade antioxidante
do suco de uvaia.
Constituintes Composição em 100g
Umidade 96,00
Resíduo Mineral Fixo 0,22
Proteínas** 1,05
Fibras (FDN) 0,85
Lipídios 0,57
Carboidratos* 1,31
Compostos Concentração
Polifenóis totais (mg EAG/100g) 135,14 ± 9,74
Capacidade Antioxidante (µM TEAC/g) 4,42 ± 0,04
As análises foram realizadas em triplicata. Os dados são apresentados como a média destas análises.
* Carboidratos = 100 - (umidade + proteína + lipídios + cinzas + fibras).
** Fator de conversão do nitrogênio em proteína: 6,25.
FDN, fibra detergente neutro; EAG, equivalentes de ácido gálico; TEAC, capacidade antioxidante equivalente
ao trolox; (µM de equivalentes de Trolox/g)
5.2.Composição corporal, ingestão alimentar e excreção fecal.
Na tabela 4 estão representados os valores de massa corporal inicial, massa corporal
final, ganho de massa, ingestão alimentar, consumo calórico, eficiência alimentar e excreção
fecal. Com relação à massa corporal dos animais, os dados mostram que não foi observada
diferença significativa na massa corporal inicial, final e no ganho de massa entre os grupos
experimentais, sendo que o suco de uvaia não influenciou nesses parâmetros.
Já com relação ao consumo médio de dieta, os animais dos grupos H e HUv
apresentaram menor consumo em relação ao grupo C. Entretanto, com relação ao coeficiente
de eficiência alimentar (CEA) e o consumo calórico não houve diferença entre os grupos
experimentais. Com relação à excreção fecal a dieta hiperlipídica promoveu uma maior
44
excreção quando comparada a controle. No entanto, a administração do suco de uvaia não
interferiu no consumo alimentar e na excreção fecal dos animais.
Tabela 4- Composição corporal, ganho de massa, ingestão alimentar, eficiência alimentar e
excreção fecal de ratos que receberam dieta controle e hiperlipídica, tratados com suco de
uvaia.
Os dados estão apresentados como a média ± erro padrão da média. C, grupo controle; CUv, grupo controle + suco de uvaia;
H, grupo hiperlipídico e HUv, grupo hiperlipídico + suco de uvaia; CEA, Coeficiente de eficiência alimentar (CEA = ganho
de massa (g) /ingestão (g)); PT, Polifenóis Totais. (n = 8). Diferenças significativas (p ˂ 0,05) estão representadas por letras
sobrescritas diferentes na mesma linha.
5.3.Perfil lipídico sérico
Foi avaliado se a administração do suco de uvaia poderia modificar o perfil lipídico
sérico nos animais alimentados com dieta hiperlipídica. Para isto, os níveis de colesterol total,
colesterol-HDL, colesterol não-HDL e TAG foram mensurados.
Conforme observado na figura 9, ratos do grupo H apresentaram alteração nos níveis
de colesterol total e colesterol não-HDL, com valores de ambos elevados em relação ao grupo
C. O tratamento com suco de uvaia reduziu significativamente os níveis séricos de colesterol
total e não- HDL quando comparados os grupos H e HUv.
Quanto aos níveis de colesterol HDL e TAG observou-se uma redução significativa
nos grupos H e HUv comparados ao controle. A administração do suco de uvaia influenciou
nos níveis de TAG e o grupo CUv apresentou uma redução significativa quando comparado
ao grupo controle.
Variáveis Grupos Experimentais
C CUv H HUv
Massa Inicial (g) 122,10 ± 3,57 123,77 ± 3,79 124,29 ± 3,51 119,77 ± 4,66
Massa Final (g) 194,40 ± 4,23 193,50 ± 2,21 196,90 ± 5,53 203,01 ± 5,65
Ganho de Massa (g) 72,30 ± 1,93 69,68 ± 3,06 72,64 ± 3,14 83,25 ± 4,58
Consumo Alimentar (g/dia) 10,73 ± 0,31a 10,31 ± 0,26a 8,37 ± 0,27b 8,49 ± 0,33b
Consumo Calórico (Kcal/dia) 40,89 ± 1,21 39,24 ± 0,96 40,31 ± 1.27 40,92 ± 1,58
CEA 0,02 ± 0,01 0,06 ± 0,01 0,04 ± 0,01 0,05 ± 0,01
Excreção Fecal (g/dia) 0,55 ± 0,03b 0,60 ± 0,02b 0,75 ±0,04a 0,76 ± 0,04a
45
Figura 9 - Perfil lipídico sérico de ratos que receberam dieta controle ou dieta hiperlipídica,
tratados suco de uvaia.
Os dados estão apresentados como a média ± erro padrão da média. C, grupo controle; CUv, grupo controle + suco
de uvaia; H, grupo hiperlipídico e HUv, grupo hiperlipídico + suco de uvaia. (n = 8). Diferenças significativas (p
˂ 0,05) estão representadas por letras diferentes.
5.4. Massa do fígado, perfil lipídico hepático e fecal.
De posse dos resultados do perfil lipídico e sabendo que o aumento do colesterol total
e uma dieta hiperlipídica podem provocar alterações hepáticas, foram realizadas análises do
perfil lipídico do fígado. Os resultados da massa relativa do fígado e o conteúdo de lipídios
totais, colesterol total e TAG presentes nas amostras estão apresentados na tabela 5.
Ao final do experimento os grupos H e HUv apresentaram aumento na massa relativa
do fígado em comparação aos animais alimentados com a dieta controle. Os animais dos
grupos H e HUv também apresentaram aumento significativo nos conteúdos de lipídeos totais,
colesterol total e TAG no fígado quando comparados aos animais do grupo C (p˂0,001). O
tratamento com suco de uvaia foi capaz de reduzir 23,13% o conteúdo de lipídios totais
hepáticos quando comparados aos animais que receberam somente a dieta hiperlipídica. Não
houve diferença estatística significativa nos demais parâmetros analisados quando foi
administrado o suco de uvaia para os animais.
Co
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tero
l T
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C C U v H H U v
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C C U v H H U v
0 .0
0 .2
0 .4
0 .6
0 .8 a
bb
b
46
Afim de esclarecer se os nossos resultados do perfil lipídico sérico poderiam ser
consequência de uma maior absorção e consequente excreção dos lipídios da dieta, o perfil
lipídico das fezes também foi testado. Em relação a esse parâmetro, os animais dos grupos H
e HUv apresentaram aumento significativo no conteúdo de lipídios totais, colesterol total e
TAG quando comparados aos animais que receberam a dieta controle (p˂0,001). No entanto
o tratamento com suco de uvaia não alterou nenhum dos parâmetros investigados.
Tabela 5- Massa relativa do fígado, lipídios totais, colesterol total e triacilgliceróis hepático
e fecal de ratos que receberam dieta controle ou dieta hiperlipídica tratados com suco de
uvaia.
Variáveis Grupos experimentais
C CUv H HUv
Massa relativa do
fígado (g/100 g) 3,05 ± 0,05b 2,99 ± 0,06b 3,82 ± 0,09a 4,06 ± 0,06a
Lipídios hepáticos
totais (mg/g) 42,50 ± 3,84c 46,25 ± 3,95c 194,10 ± 12,36a 149,20 ± 12,93b
Colesterol total
hepático (mg/g) 3,28 ± 0,20b 3,18 ± 0,09b 29,45 ± 2,20a 30,33 ± 1,88a
Triacilgliceróis
hepáticos (mg/g) 14,79 ± 2,10b 6,64 ± 1,19b 38,13 ± 2,44a 38,20 ± 2,88a
Lipídios fecais
totais (mg/g) 17,86 ± 1,84b 26,88 ± 3,12b 267,50 ± 8,56a 248,20 ± 5,57a
Colesterol total
fecal (mg/g) 3,27 ± 0,70b 4,39 ± 0,38b 171,50 ± 7,27a 177,40 ± 6,50a
Triacilgliceróis
fecais (mg/g) 13,07 ± 0,91b 13,70 ± 0,98b 168,60 ± 7,62a 170,80 ± 8,02a
Os dados estão apresentados como a média ± erro padrão da média. C, grupo controle; CUv, grupo controle + suco
de uvaia; H, grupo hiperlipídico e HUv, grupo hiperlipídico + suco de uvaia; (n = 8). Diferenças significativas (p
˂ 0,05) estão representadas por letras sobrescritas diferentes na mesma linha.
5.5. Efeito do suco de uvaia sobre os indicadores séricos de dano hepático
Alterações na atividade das enzimas alanina aminotransferase (ALT), aspartato
aminotransferase (AST) e fosfatase alcalina são importantes marcadores de doenças ou lesão
tecidual hepática. Sendo assim para avaliar o dano hepático esses marcadores foram
determinados. Os resultados são representados na figura 10.
Os animais do grupo H apresentaram aumento na atividade de ALT, AST e fosfatase
alcalina quando comparados ao grupo C, evidenciando uma possível alteração na função
hepática. A administração do suco de uvaia reduziu a atividade da AST e fosfatase alcalina
no grupo HUv quando comparado ao grupo H (p < 0,05). Apesar da atividade de ALT no
47
grupo HUv não ter sido significativamente diferente do grupo H, foi estatisticamente
semelhante ao grupo C.
Figura 10- Atividade sérica da alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase
(AST) e fosfatase alcalina de ratos que receberam dieta padrão e dieta hiperlipídica tratados
suco de uvaia.
Os dados de AST e fosfatase alcalina estão apresentados como a média ± erro padrão da média e os níveis de ALT
estão expressos como mediana e intervalo interquartil. C, grupo controle; CUv, grupo controle + suco de uvaia;
H, grupo hiperlipídico e HUv, grupo hiperlipídico + suco de uvaia. (n = 8). Diferenças significativas (p ˂ 0,05)
estão representadas por letras diferentes.
5.6.Efeito do suco de uvaia na esteatose hepática
Para confirmar as análises do perfil lipídico hepático, observações histológicas do
fígado foram realizadas. As análises das secções de fígado coradas com H&E demostraram
que os grupos C e CUv foram caracterizados por apresentarem quadros semelhantes a
normalidade (figura 11A e 11B). No entanto, foi observada intensa deposição de lipídios em
ambos os grupos alimentados com a dieta hiperlipídica, os quais desenvolveram esteatose
macro e microvesicular (figura 11C e 11D). Os animais do grupo H tiveram macrovesículas
com a maior área (figura 11E) (p <0,001) e o tratamento com o suco de uvaia foi capaz de
atenuar a esteatose hepática provada pela dieta rica em lipídios, evidenciada pela redução da
AL
T (
U/L
)
C C U v H H U v
0
1 0
2 0
3 0 a
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C C U v H H U v
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1 0 0
a
c
c
b
48
área das macrovesículas no grupo HUv em relação ao grupo H (figura 11D e 11E).
Corroborando com o resultado da extração de lipídios totais citada anteriormente.
5.7.Expressão do mRNA de genes envolvidos no metabolismo de lipídios
Como foi observado um efeito da dieta hiperlipídica e do tratamento com o suco de
uvaia no perfil lipídico sérico e no perfil histológico, avaliamos os níveis de expressão dos
genes correspondentes ao metabolismo do colesterol e AG.
Áre
a d
as
ma
cro
ve
sic
ula
s(µ
²)
C C U v H H U v
0
1 0 0
2 0 0
3 0 0
4 0 0
5 0 0 a
b
c c
E
Secções do fígado de ratos que receberam dieta controle (A), dieta padrão e tratamento com suco de uvaia
(B), dieta hiperlipídica (C) e dieta hiperlipídica e tratamento com suco de uvaia (D) coradas com H&E em
aumento de 400 ×. A seta preta indica hepatócitos com esteatose macrovesicular, e a ponta de seta preta
indica hepatócitos com esteatose microvesicular. Barra de escala = 50 µm. (E) Área das macrovesículas do
fígado, representadas como média ± erro padrão da média (n=8), diferenças significativas (p ˂ 0,05) estão
representadas por letras sobrescritas diferentes.
Figura 2- Fotomicrografias representativas de secções do fígado de ratos que receberam
dieta padrão ou dieta hiperlipídica e foram tratados com suco de uvaia.
49
5.7.1. Efeito do suco de uvaia na expressão de genes do metabolismo de
colesterol no fígado
A expressão de genes envolvidos no metabolismo do colesterol foi avaliada por ensaio
de RT-PCR. Os resultados mostraram diminuição na expressão de mRNA correspondente aos
genes que codifica para o fator de transcrição SREBP-2 e para enzima HMGCoA-R nos
animais do grupo H em relação ao grupo C. As expressões desses genes não foram
estatisticamente diferentes ao grupo H para o grupo HUv, por outro lado estes foram
estatisticamente semelhante ao grupo C. Com relação à enzima CYP7A1 foi observado um
aumento estatisticamente significativo da expressão gênica dessa enzima no grupo H, que não
foi modificada no grupo HUv (p<0,001) quando comparado ao grupo controle. A dieta
hiperlipídica não alterou a expressão dos demais genes avaliados (ABCG5, ABCG8, LDL-R,
e ACAT-2). No entanto, o tratamento com suco de uvaia modificou a expressão do
transportador ABCG5, foi observado um aumento da expressão deste gene no grupo CUv (p<
0,05) quando comparado ao grupo C e apesar da expressão desse gene não ter sido
estatisticamente diferentes nos grupos H e C, o grupo HUv foi estatisticamente semelhante ao
grupo CUv (Figura 12).
50
HM
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A
C C U v H H U v
0 .0
0 .5
1 .0
1 .5
2 .0
b
b
51
Figura 12- Expressão do mRNA de genes envolvidos no metabolismo do colesterol no fígado
em ratos que receberam dieta padrão e hiperlipídica tratados com suco de uvaia.
Os dados estão apresentados como a média ± erro padrão da média (n = 6). C, grupo controle; CUv, grupo
controle + suco de uvaia; H, grupo hiperlipídico e HUv, grupo hiperlipídico + suco de uvaia. Diferenças
significativas (p˂0,05) estão representadas por letras sobrescritas diferentes. A expressão dos genes alvo foi
determinada em função da expressão do gene de referência rRNA 18S e o grupo controle foi utilizado como base
para os resultados de expressão comparativa. rRNA 18S, Ácido ribonucleico ribossomal 18S; ABCG5, ATP-
binding cassette subfamily G member 5; ABCG8, ATP-binding cassette subfamily G member 8; ACAT-2,
Colesterol aciltransferase-2; CYP7A1, Colesterol-7α-hidroxilase; HMGCoA-R. a 3-hidróxi-3-metil-glutaril coa
redutase LDL-R, receptor da lipoproteína de baixa densidade; SREPB-2; proteína de ligação ao elemento de
resposta a esterol-2.
5.7.2. Efeito do suco de uvaia no metabolismo de ácidos graxos no
fígado
Como houve uma redução de lipídios hepáticos, além de redução da área das
macrovesículas de gorduras nos hepatócitos após o tratamento com o suco de uvaia, podendo
ser resultado de alterações nas vias de lipogênese e/ou oxidação de AG, avaliamos os níveis
de expressão de SREBP-1c um fator de transcrição determinante na biossíntese de AG e
também seus genes alvo, as enzimas ACC, enzima que catalaliza a primeira e limitante etapa
da síntese de AG, e FAS, complexo enzimático responsável pela construção da cadeia dos
AG. Conforme mostrado na figura 13 não foram observadas diferenças na expressão de
SREBP-1c entre os grupos experimentais. Além disso, observamos que a dieta hiperlipídica
não modificou os níveis de mRNA que codificam para ambas as enzimas ACC e FAS. Porém
no grupo HUv a expressão de FAS foi significativamente reduzida em relação ao grupo H.
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Figura 13- Expressão do mRNA de genes envolvidos na biossíntese de ácidos graxos no
fígado em ratos que receberam dieta padrão e hiperlipídica tratados com suco de uvaia.
Os dados estão apresentados como a média ± erro padrão da média (n = 6). C, grupo controle; CUv, grupo
controle + suco de uvaia; H, grupo hiperlipídico e HUv, grupo hiperlipídico + suco de uvaia. Diferenças
significativas (p˂0,05) estão representadas por letras sobrescritas diferentes. A expressão dos genes alvo foi
determinada em função da expressão do gene de referência rRNA 18S e o grupo controle foi utilizado como base
para os resultados de expressão comparativa. SREBP-1c, Proteína 1c ligadora do elemento regulado por esteróis;
FAS, ácido graxo sintase; ACC1, acetil Co-a carboxilase 1.
Já com relação à via de oxidação dos AG, sabemos que o PPARα funciona como um
sensor de lipídios no fígado, ele reconhece e responde para que ocorra a oxidação de AG
através da estimulação da transcrição de genes específicos como CPT-1α e ACOX-1 que são
genes alvos deste fator de transcrição. Resultados de expressão destes genes são mostrados na
figura 14.
Quanto à expressão do mRNA do fator de transcrição PPARα não foi observada
diferença estatisticamente significativa entre os grupos H e C. No entanto, quando foi
administrado o suco de uvaia um aumento de mais de duas vezes foi observado no grupo HUv
comparado ao grupo H. Quanto aos seus genes alvos CPT1-α e ACOX-1 foi demonstrado que
a dieta com alto teor de colesterol reduziu os níveis de expressão do mRNA que codificam
para estas enzimas no grupo H em relação ao grupo controle. Apesar do tratamento com o
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suco de uvaia não ter modificado estatisticamente a expressão de ACOX-1 quando
comparados os grupos HUv e H, o grupo hiperlipídico tratado com o suco de uvaia (HUv) não
foi diferente do grupo C, demonstrando um efeito parcial do tratamento na expressão de ambos
os genes.
Figura 14- Expressão do mRNA de genes envolvidos na oxidação de ácidos graxos no fígado
em ratos que receberam dieta padrão e hiperlipídica tratados com suco de uvaia.
Os dados estão apresentados como a média ± erro padrão da média (n = 6). C, grupo controle; CUv, grupo
controle + suco de uvaia; H, grupo hiperlipídico e HUv, grupo hiperlipídico + suco de uvaia. Diferenças
significativas (p˂0,05) estão representadas por letras sobrescritas diferentes. A expressão dos genes alvo foi
determinada em função da expressão do gene de referência rRNA 18S e o grupo controle foi utilizado como base
para os resultados de expressão comparativa. ACOX-1, Acil-CoA oxidase 1; CPT1-α, Carnitina palmitoil
transferase 1 alfa; PPAR-α, receptor alfa ativado por proliferadores peroxissomais.
5.7.3. Efeito do suco de uvaia na expressão de proteínas peroxissomais
O acúmulo de lipídios pode se dar também por alterações em organelas, além das
mitocôndrias, os peroxissomos têm papel importante no metabolismo de lipídios hepáticos.
Portanto analisamos a expressão gênica de duas proteínas peroxissomais: Pex 11α e PMP70.
A deficiência de Pex 11α prejudica a biogênese peroxissomal e a oxidação de AG o que
contribui para o acúmulo de gordura no fígado (WENG et al., 2013).
54
A dieta rica em lipídios causou uma diminuição significativa na expressão de PMP70,
Pex11α e catalase, em comparação com a dieta de controle. Quando a uvaia foi administrada
no grupo HUv a expressão de PMP70 aumentou seis vezes em comparação ao grupo H (p
<0,001). Além disso, a expressão da enzima catalase foi cinco vezes maior no grupo HUv em
comparação ao grupo H. Apesar da expressão de PEX11α no grupo HUv não ter sido
significativamente diferente do grupo H, foi estatisticamente semelhante ao grupo C (Figura
15).
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Figura 15- Expressão do mRNA de genes envolvidos na biogênese peroxissomal no fígado
em ratos que receberam dieta padrão e hiperlipídica tratados com suco de uvaia.
Os dados estão apresentados como a média ± erro padrão da média (n = 6). C, grupo controle; CUv, grupo
controle + suco de uvaia; H, grupo hiperlipídico e HUv, grupo hiperlipídico + suco de uvaia. Diferenças
significativas (p˂0,05) estão representadas por letras sobrescritas diferentes. A expressão dos genes alvo foi
determinada em função da expressão do gene de referência rRNA 18S e o grupo controle foi utilizado como base
para os resultados de expressão comparativa. PEX11a; Proteína de membrana peroxisomal 11a. PMP70; Proteína
de Membrana Peroxisomal 70 kDa.
55
5.8.Efeito do suco de uvaia nos biomarcadores do Estresse Oxidativo e Defesas
Antioxidantes
Como foi observada uma capacidade antioxidante in vitro do suco da uvaia,
mensuramos então se o mesmo poderia ter efeito sobre o balanço redox no fígado, já que o
estresse oxidativo pode ocorrer como consequência do consumo de uma dieta hiperlipídica e
ser um agravante da NAFLD. Possíveis alterações no balanço oxidante/antioxidante hepático
foram determinadas através de biomarcadores do estresse oxidativo, TBARS e proteína
carbonilada e avaliação das defesas antioxidantes no fígado.
Os níveis de TBARS e o conteúdo de proteínas carboniladas são amplamente usados
como marcadores de danos a lipídios de membranas celulares e oxidação de proteínas,
respectivamente. Conforme pode-se observar na figura 16 os animais do grupo H
apresentaram níveis significativamente maiores de proteína carbonilada em comparação aos
animais dos grupos controle, indicando um aumento de oxidação proteica no fígado destes
animais (p ˂ 0,05).
O suco de uvaia promoveu uma redução nos níveis de proteína carbonilada no grupo
HUv quando comprado aos grupos controles (C e CUv) e ao grupo H. Quanto à concentração
TBARS, não foi observado efeito da dieta hiperlipidica nesse parâmetro, portanto não houve
diferença estatisticamente significativa entre o grupo hiperlipídico (H) e o grupo controle.
Figura 16- Níveis de TBARS e proteína carbonilada no fígado de ratos que receberam dieta
controle ou dieta hiperlipídica tratados com suco de uvaia.
Os dados estão apresentados como a média ± erro padrão da média. C, grupo controle; CUv, grupo controle + suco
de uvaia; H, grupo hiperlipídico e HUv, grupo hiperlipídico + suco de uvaia. (n = 8). Diferenças significativas (p
˂ 0,05) estão representadas por letras diferentes.
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5.9.Defesas antioxidantes
Considerando que o estresse oxidativo está implicado na patogênese da NAFLD, e que
este pode ser amenizado por um sistema de defesa antioxidante endógeno composto por
diversas enzimas, foi então avaliado se o tratamento com o suco de uvaia melhora essas
defesas antioxidantes no fígado de ratos alimentados com uma dieta hiperlipídica. Para isso,
determinamos a atividade arilesterásica e paraoxonásica da enzima paraoxonase (PON) no
soro e as atividades da superóxido dismutase (SOD), catalase, glutationa peroxidase (GPx) e
glutationa redutase no fígado. Os resultados estão apresentados nas figuras 17 e 18.
Quando avaliada a atividade arilesterásica da enzima PON no soro, foi observada
diferença estatisticamente significativa entre os grupos que receberam a dieta hiperlipídica e
os grupos controles onde os grupos H e HUv apresentaram menor atividade da enzima (figura
17). Já em relação a atividade paraoxonásica da enzima, foi observada uma atividade
significativamente menor no grupo H em comparação ao grupo C (p <0,001). Quando
administrado o suco de uvaia (grupo HUv) foi observado uma maior atividade da enzima
comparado ao grupo H (p<0,05). Demostrando que o tratamento com o suco de uvaia
provavelmente contribuiu para melhorar a atividade da PON no soro de ratos alimentados com
a dieta hiperlipídica.
Figura 17- Atividade arilesterásica e paraoxonásica da enzima PON no soro em ratos que
receberam dieta controle ou dieta hiperlipídica tratados com suco de uvaia.
O dado de atividade paraoxonásica está apresentado como a média ± erro padrão da média e atividade
arilesterásica está expressa como a mediana e intervalo interquartil. C, grupo controle; CUv, grupo controle +
suco de uvaia; H, grupo hiperlipídico e HUv, grupo hiperlipídico + suco de uvaia. (n = 8). Diferenças
significativas (p ˂ 0,05) estão representadas por letras diferentes.
A atividade das enzimas que compõem o sistema de defesa antioxidante endógeno foi
determinada (SOD, catalase, GPx e GR). Conforme mostrado na figura 18. A atividade da
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enzima superóxido dismutase foi estatisticamente maior nos grupos que receberam a dieta
hiperlipídica (H e HUv). A administração do suco de uvaia não alterou este parâmetro.
Com relação à atividade da enzima catalase, pode-se observar redução significativa no
grupo H quando comparado ao grupo controle (C). O tratamento com o suco de uvaia
associado à dieta hiperlipídica restaurou a atividade desta enzima no fígado dos animais do
grupo HUv. No entanto o tratamento com o suco de uvaia e a dieta com adição de lipídios não
promoveram alterações significativas nas atividades de glutationa peroxidase e de glutationa
redutase.
Figura 18- Atividade das enzimas antioxidantes, superóxido dismutase, catalase, glutationa
peroxidase e glutationa redutase em ratos alimentados com dieta controle e dieta hiperlipídica
tratados com suco de uvaia.
Os dados estão apresentados como a média ± erro padrão da média. C, grupo controle; CUv, grupo controle + suco
de uvaia; H, grupo hiperlipídico e HUv, grupo hiperlipídico + suco de uvaia. (n = 8). Diferenças significativas (p
˂ 0,05) estão representadas por letras diferentes.
A Glutationa (γ-L-glutamil-L-cisteinil-glicina) existe no organismo em suas formas
reduzida (GSH) e oxidada (GSSG), e é considerada um dos agentes mais importantes do
sistema de defesa antioxidante. A enzima glutationa peroxidase (GPx) é dependente de
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glutationa reduzida (GSH) para agir como antioxidante, onde, através da GSH ocorre a
metabolização do H2O2 e produção de H2O e glutationa oxidada (GSSG), que pode voltar
novamente à forma reduzida (GSH), pela glutationa redutase (GR).
No presente estudo foi avaliado o efeito do tratamento com o suco de uvaia sobre as
concentrações hepáticas de glutationa total (GSH), glutationa oxidada (GSSG), glutationa
reduzida (GSH reduzida) e sobre a razão GSH/GSSG no fígado dos ratos que receberam dieta
controle ou dieta hiperlipídica. Os dados estão apresentados na figura 19.
Não foram observadas diferenças significativas entre os grupos experimentais quanto
as concentrações de GSH total e reduzida. No entanto, observou-se um aumento significativo
na concentração de GSSG no grupo H (p˂0,001) e uma redução na razão GSH reduzida/GSSG
no grupo H quando comparados ao grupo C (p˂0,05). Já com relação as concentrações de
GSSG e a razão GSH/GSSG o tratamento com a uvaia nãocando esses níveis iguais ao
controle, contudo, sem diferença estatística significativa quando comparado ao grupo H.
Figura 19- Conteúdo hepático de glutationa total, glutationa oxidada, glutationa reduzida e a
relação entre a glutationa total e glutationa oxidada no fígado de ratos que receberam dieta
controle ou dieta hiperlipídica tratados com suco de uvaia.
Os dados de GSH total e GSH reduzida estão apresentados como a média ± erro padrão da média e os níveis de
GSSG e a relação GSH/GSSG estão expressos como mediana e intervalo interquartil. C, grupo controle; CUv,
grupo controle + suco de uvaia; H, grupo hiperlipídico e HUv, grupo hiperlipídico + suco de uvaia. (n = 8).
Diferenças significativas (p ˂ 0,05) estão representadas por letras diferentes.
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59
6. DISCUSSÃO
Em nosso estudo, os ratos alimentados com uma dieta rica em gordura durante 10 semanas
foram utilizados para investigar os potenciais benefícios do suco de uvaia na NAFLD com
enfoque nas alterações do metabolismo de lipídios, danos oxidativos, bem como defesas
antioxidantes.
A capacidade antioxidante dos frutos está associada aos seus compostos bioativos, pois
possuem capacidade de eliminar radicais livres (SEIFRIED et al., 2007; MANDIC et al.,
2008). A atividade antioxidante do suco de uvaia foi determinada através da capacidade do
suco em inibir a oxidação do radical DPPH. Nosso resultado mostra que a uvaia apresentou
capacidade antioxidante de 4,42 ± 0,04 µM TEAC/g. Esse dado corrobora com resultados de
diversos trabalhos encontrados na literatura que mostram que a uvaia possui alta capacidade
antioxidante. Dentre estes HAMINIUK et al. (2011), demonstram que a uvaia obteve um
percentual de inibição de 71,08%, maior que diversos frutos nativos da mesma família, como
por exemplo, o araçá, a grumixama, o cambuci, a gabiroba e o feijoa. MIYAZAWA (2009),
também observou uma elevada capacidade antioxidante do fruto da uvaia, (656,29 μmol de
Trolox/100 mL de polpa).
Os polifenóis são importantes componentes fitoquímicos encontrados na uvaia. Por
conseguinte, o consumo de frutas ricas em compostos fenólicos que têm sido associados com
baixos níveis de ERO em seres humanos e animais experimentais (MARIUTTI et al., 2014).
A concentração de compostos fenólicos totais no suco testado, foi semelhante aos valores
relatados para outras frutas brasileiras, como açaí, caju, umbu, abacaxi e papaia. Em um estudo
recente, DA SILVA et al. (2014) identificaram e quantificaram os compostos fenólicos do
fruto da uvaia por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC-DAD-MSn) e
encontraram o ácido gálico e o galloyl HHDP-bis-hexosido como os principais compostos
fenólicos de uvaia. Outros estudos também demonstraram que a ingestão de alimentos ricos
em compostos fenólicos promoveu aumento da atividade de enzimas antioxidantes, sugerindo
seu papel na prevenção e tratamento de muitas doenças crônicas como obesidade, diabetes e
doenças cardiovasculares e progressão da NAFLD (GUERRA et al., 2015; DONGIOVANNI
et al., 2016; PEREIRA et al., 2016).
A presença de compostos bioativos, tais como os polifenóis, em alimentos, tem sido
relacionada a prevenção de diversas doenças crônicas, cuja prevalência vem aumentando
rapidamente. Os resultados obtidos neste estudo relacionados às variáveis peso e eficiência
alimentar, demonstraram que nem a dieta com alto teor de gordura, nem o suco de uvaia
60
tiveram um efeito adverso no crescimento dos animais experimentais. No entanto, a dieta
hiperlipídica alterou a ingestão alimentar e a excreção, sendo que a ingestão diminuiu nos
grupos H e HUv e a excreção aumentou nestes grupos. Esse comportamento é comum em
ratos, onde a ingestão alimentar é ajustada ao requerimento energético, ou seja, proporcional
à densidade energética da dieta e dietas com alto teor de lipídios tornam-se altamente
energéticas (SHARP; VILLANO, 2012).
Em nosso trabalho, o modelo de esteatose induzida por dieta hiperlipídica em ratos,
apresentou um aumento na concentração de lipídios nos hepatócitos e um evidente dano
hepático, conforme indicado pelo aumento da gordura no fígado, aumento das macrovesículas
de gordura, hepatomegalia e aumento das enzimas hepáticas AST, ALT e fosfatase alcalina
no soro. A administração do suco de uvaia minimizou o acúmulo de lipídios no fígado e
reduziu a área das macrovesículas de gorduras. Além disso, reduziu a atividade sérica das
enzimas AST, ALT e fosfatase alcalina, indicando um efeito protetor ao dano no fígado.
Outros estudos também mostraram efeitos hepatoprotetores similares com a administração de
frutos ricos em polifenóis (PARAFATI et al., 2015; EKHLASI et al., 2016; GLISAN et al.,
2016; WU et al., 2017). O papel dos compostos fenólicos na proteção do fígado a partir de
dietas com alto teor de gordura tem sido relatado em outros trabalhos que propõem que
eventos seja mediado pela modulação de mecanismos moleculares que levam ao acúmulo de
gordura, como lipogênese e oxidação lipídica, além do estresse oxidativo, inflamação e fibrose
hepática. (GUERRA et al., 2015; DONGIOVANNI et al., 2016; PEREIRA et al., 2016).
Dados sugerem que distúrbios na homeostase de colesterol hepático são relevante para
a patogênese de NAFLD (ARGUELLO et al., 2015). De fato, em nosso modelo de dieta
hiperlipídica com adição de 2% de colesterol ocorreu um desequilíbrio na homeostase do
colesterol caracterizado por um aumento de colesterol total, do não HDL, uma diminuição do
colesterol HDL. Com relação aos níveis séricos de triacilgliceróis, nós observamos uma
redução nos grupos CUv, H e HUv quando comparados ao controle. No caso dos grupos
alimentados com a dieta hiperlipídica, os baixos níveis de triacilgliceróis
plasmáticos podem ser explicados pela quantidade de óleo de soja insaturado adicionado
nessas dietas. A administração do suco de uvaia minimizou os níveis de colesterol sérico total
e colesterol não-HDL além de uma redução dos triacilgliceróis no grupo controle
suplementados com uvaia, demostrando que a uvaia consiste em um importante agente
hipolipidêmico. DE SOUZA et al. (2012) e DE MIRANDA et al. (2017) relataram efeitos
semelhantes no colesterol sérico e frações e nos triacilgliceróis quando animais alimentados
com uma dieta rica em lipídios foram suplementados com os alimentos ricos em polifenóis.
61
A homeostase do colesterol é mantida por um conjunto de mecanismos onde a
biossíntese, a captação e a excreção são perfeitamente regulados. As concentrações séricas e
intracelulares do colesterol são reguladas principalmente pelo fator de transcrição SREBP-2,
um fator de transcrição chave da biossíntese do colesterol. A redução intracelular de colesterol
tende a inibir a sua própria produção endógena através da regulação do SREBP-2, que, em
células privadas de colesterol, liga e ativa os promotores dos genes HMGCoA-R. De fato, os
ratos alimentados com a dieta hiperlipídica exibiram uma menor expressão de SREBP-2 e
HMGCoA-R, possivelmente a dieta hiperlipídica promoveu uma saturação nos níveis de
colesterol nos hepatócitos o que resultou em uma inibição da síntese endógena no fígado e
resultando na redução na expressão do SREBP-2 e consequentemente da HMGCoA-R.
Contudo, no grupo que recebeu o suco de uvaia (HUv) as expressões desses genes foram
semelhantes aos observados nos ratos alimentados com a dieta controle e hiperlipídica,
provavelmente por diminuir os níveis de colesterol circulante como foi observado. SILVA et
al. (2013) e DE MIRANDA et al. (2017) também relataram que a alimentação de ratos com
uma dieta rica em lipídios suplementada com fonte de compostos fenólicos restaurou a
expressão do HMGCoA-R e SREBP-2 para os níveis observados em ratos alimentados com
uma dieta controle.
Outra possível via relacionada com acúmulo de lipídios no fígado pelo qual uvaia pode
ter agido para atenuar NAFLD, é biossíntese e degradação de AG. SREBP-1C é um fator de
transcrição que regula a homeostase de AG por ligação e ativação dos promotores dos genes
das enzimas chave, incluindo ACC1 e FAS (SHIMOMURA; BASHMAKOV; HORTON,
1999; HORTON; GOLDSTEIN; BROWN, 2002). No nosso trabalho não foram observadas
diferenças estatísticas entre os grupos experimentais para e expressão do SREBP-1c e para a
enzima ACC. Contudo foi constatado que o suco de uvaia inibiu a expressão da enzima FAS
no grupo hiperlipídico. LI, X.-C. et al. (2002); TSURUTA et al. (2011) demostraram que
polifenóis de plantas têm exibido atividade inibidora de FAS in vitro, consistente com o efeito
observado devido aos polifenóis presentes no suco de uvaia. Além disso, em ratos alimentados
com dieta hiperlipídica enriquecida em polifenóis, (PARK et al., 2013) relataram a regulação
da expressão de mRNA de FAS, diminuindo a expressão desta enzima. Sugerindo que os
compostos bioativos presentes no fruto da uvaia possam ter efeitos benéficos na NAFLD, já
que uma das vias pelas quais os lipídios podem se acumular no fígado é o aumento da síntese
de AG.
PPARα é um regulador mestre de oxidação de AG, regulando CPT-1α e ACOX-1,
estimulando a β-oxidação e reduzindo a biossíntese lipídica e, portanto, evitando o excesso de
62
TAG no fígado. O tratamento de suco uvaia aumentou a expressão de PPAR-α e seu alvo nos
peroxissomos, ACOX-1. SEO et al. (2008) relatou em seu estudo níveis hepáticos de PPAR-
α diminuídos em pacientes com NAFLD e os agonistas farmacológicos foram capazes de
melhorar o contexto. Além disso, BAES; VAN VELDHOVEN (2016) observou que
camundongos knockout com perda de atividade de ACOX-1 desenvolveram esteatose
hepática. Nossos resultados foram consistentes com estudos anteriores que relataram que
compostos isolados de fenólicos e extratos ricos em polifenóis aumentam os níveis de mRNA
de PPAR-α (CUI et al., 2014; LIAO et al., 2014; WANG et al., 2015).
Além das mitocôndrias, os peroxissomos têm papel importante no metabolismo de AG
hepáticos. Estudos recentes relataram que a escassez de peroxissomos funcionais é
intensificada pela dieta rica em gordura e está associada ao agravamento da esteatose hepática
(WENG et al., 2013; WENG et al., 2015; BAES; VAN VELDHOVEN, 2016). PEX11 é uma
peroxina com três isoformas (α, γ e β), está envolvida nas primeiras etapas da fissão do
peroxissomo e é altamente expressa no fígado. A deficiência da isoforma PEX11α leva à
redução do alongamento e da quantidade dos peoxissomos e consequentemente ao
comprometimento da β-oxidação peroxissomal (WENG et al., 2013; SCHRADER et al.,
2016). Em nosso estudo, a expressão de PEX11α diminuiu em ratos alimentados com dieta
hiperlipídica, no entanto, a adição de uvaia restaurou a expressão de PEX11α em níveis
semelhantes àqueles dos animais alimentados com a dieta de controle. Assim, a diminuição
da concentração de lipídios promovida por uvaia pode ter ocorrido, pelo menos em parte,
devido a um efeito positivo na expressão dessa peroxina.
Além da PEX11α, um outro componente essencial das membranas peroxissomais é o
PMP70, uma proteína que também está relacionada à abundância de peroxissomos e a ação
de enzimas peroxissomais responsáveis pela β-oxidação (WENG et al., 2015). Paralelamente
à β-oxidação, a catalase, principal enzima peroxissomal, que atua na neutralização do H2O2
está diretamente relacionada a possível progressão da NAFLD (VIDELA et al., 2004). Sabe-
se que mutações nos genes PMP70 e catalase acarretam defeitos na biogênese de
peroxissomos e toxicidade peroxissomal devido ao excesso de H2O2, caracterizando uma
desordem e, consequentemente, desencadeando o desenvolvimento de doenças graves tais
como a NAFLD e NASH (SHEIKH et al., 1998; IMANAKA et al., 1999). O tratamento com
o suco de uvaia aumentou a expressão de PMP70 em ratos com esteatose (Grupo HUv). Além
disso aumentou a expressão da enzima catalase e foi capaz de restaurar a atividade desta
enzima a níveis normais em animais alimentados com dieta hiperlipídica. Tomados em
conjunto, nossos resultados sustentam a ideia de que o aumento da biogênese peroxissomal
63
representa um mecanismo importante pelo qual o tratamento com o suco de uvaia abrandou a
esteatose hepática.
Sabe-se que uma dieta rica em lipídios é um fator importante para o desequilíbrio redox
e que o estresse oxidativo é uma característica proeminente no desenvolvimento e progressão
da NAFLD (BROWNING; HORTON, 2004; ROLO; TEODORO; PALMEIRA, 2012). O
acúmulo de ERO nos hepatócitos pode provocar a progressão da doença devido a mecanismo
de peroxidação lipídica, carbonilação de proteínas e dano ao DNA (DIEHL, ANNA MAE,
2005).
A carbonilação de proteínas é irreversível e a proteína carbonilada é um indicador de
dano oxidativo grave (DALLE-DONNE et al., 2003; YANG et al., 2012). Após 10 semanas
de experimento o dano oxidativo à proteínas foi significativamente maior em ratos
alimentados com a dieta hiperlipídica em comparação com os alimentados com a dieta
controle. O tratamento com suco de uvaia diminuiu o acúmulo de proteína carbonilada no
fígado. Esse resultado é consistente com o trabalho DE SOUZA et al. (2010), onde
alimentaram ratos com uma dieta com alto teor de lipídios adicionada de açaí, uma fruta rica
em polifenol, e observaram uma diminuição nas concentrações de proteína carbonilada no
fígado em comparação com a dos ratos alimentados apenas com dieta hiperlipídica. O efeito
do suco de uvaia no conteúdo de proteína carbonilada no fígado pode ser devido à presença
de compostos fenólicos nesse fruto. Em estudo com jovens com NAFLD que ingeriram suco
de fruta rico em polifenóis por 4 semanas GUO et al. (2014) observaram redução da
carbonilação de proteínas.
A redução de enzimas do sistema de defesa antioxidante também é uma consequência
ao aumento crônico de ERO na hipelipidemia e contribui para o estresse oxidativo (VIDELA
et al., 2004; LIZANA; GALDAMES; RODRIGO, 2017). No nosso estudo investigamos o
status antioxidante dos animais ao avaliar a atividade sérica de PON utilizando os substratos
fenilacetato e o paraoxon, a atividade da SOD, catalase, GPx, GR e as concentrações da GSSG
e GSH no fígado dos animais.
A família paraoxonase tem sido objeto de grande interesse por prevenir o estresse
oxidativo e o processo inflamatório. Este mecanismo de prevenção se dá devido associação
entre a PON e o HDL, protegendo a LDL de modificações oxidativas (AVIRAM;
ROSENBLAT, 2004; DEAKIN; JAMES, 2004). Além disso, vários estudos têm associado a
diminuição da atividade de PON com aumento de danos hepáticos, entre eles a NAFLD
(SAMY; HASSANIAN, 2011; PEREIRA et al., 2016). Ao avaliar os nossos dados
encontramos que a dieta hiperlipídica causou alterações significativas na atividade da PON no
64
soro dos animais, diminuindo ambas as atividades (paraoxonásica e arilesteárica) nos animais
que receberam a dieta rica em lipídios em comparação aos animais controles. A administração
do suco de uvaia promoveu um aumento significativo na atividade paraoxonásica de PON.
Corroborando com os nossos resultados diversos estudos demonstraram um papel
antioxidante de frutos ricos em polifenóis na modulação da atividade dessa enzima
(FUHRMAN; AVIRAM, 2002; DE SOUZA et al., 2010; PEREIRA et al., 2016).
GSH é sintetizado endogenamente no fígado e é a primeira linha de defesa contra o
estresse oxidativo (ANDERSON, 1998; HALLIWELL, 1999; LIMA; FERNANDES-
FERREIRA; PEREIRA-WILSON, 2006). Em geral, os níveis elevados de GSH e a
diminuição dos níveis de GSSG estão associados ao aumento da resistência ao estresse
oxidativo. Isso leva a uma diminuição da relação GSSG / GSH, que é um indicador potente
do estresse oxidativo no tecido (YANG et al., 2012). No nosso estudo, o suco de uvaia não
apenas diminuiu significativamente a oxidação da proteína, mas também aumentou
efetivamente os mecanismos de defesa antioxidante, modulando o metabolismo da glutationa
hepática e aumentando a atividade e a expressão gênica da enzima catalase. A formação e
acumulação de GSSG foi inibida pelo suco de uvaia, deslocando o GSH endógeno para o
estado oxidado no grupo hiperlipídico suplementado com uvaia em comparação com o grupo
controle (C). Além disso, a relação GSH / GSSG no fígado do grupo HUv foi semelhante à
do grupo controle (C), sugerindo que o tratamento com o suco de uvaia promoveu uma
melhora no estado redox sérico e hepático.
A enzima SOD desempenha um papel importante na proteção das células contra danos
oxidativos ao converter radicais superóxido em H2O2 (CHAUDIÈRE; FERRARI-ILIOU,
1999; PISOSCHI; POP, 2015). Em nosso estudo, a dieta hiperlipídica acarretou um aumento
significativo na atividade SOD, consistente com alguns estudos realizados anteriormente
(JUNG et al., 2003; BELGUITH-HADRICHE et al., 2010; BELLASSOUED et al., 2015). O
aumento da atividade de SOD no fígado dos animais hiperlipidêmicos pode ser uma adaptação
em resposta a níveis elevados de superóxido, resultando em maior defesa contra os radicais
livres. Não observamos aumento da atividade de SOD com tratamento com suco de uvaia,
sugerindo que a uvaia não teve efeito sobre a redução de ânions superóxido para H2O2.
CAT e GPx são enzimas importantes responsáveis pela conversão do H2O2 produzido
sob condições de estresse em água e oxigênio, protegendo as células do dano oxidativo
relacionado ao estresse (FANG; YANG; WU, 2002; HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2015).
A enzima CAT é especialmente importante quando a quantidade ou atividade de GPx é
reduzida e desempenha um papel significativo na resistência ao estresse oxidativo. É uma
65
hemoproteína localizada nos peroxissomos e catalisa a detoxificação do peróxido de
hidrogênio em oxigênio e água. A inibição desta enzima por ânions superóxido já foi
demonstrada e, portanto, o aumento de ERO na NAFLD pode estar relacionado a redução de
sua atividade. (LI.; HORKE; FÖRSTERMANN, 2013; PISOSCHI; POP, 2015). Nós
observamos que animais alimentados com uma dieta hiperlipídica tiveram uma redução
significativa na atividade e na expressão da enzima CAT, indicando que a dieta rica em
lipídios suprimiu a ação da enzima. SOUR et al. (2015) também observaram em seu estudo
que ratos alimentados com uma dieta rica em lipídios apresentaram baixa atividade de CAT
tanto no soro como no fígado. O tratamento com o suco de uvaia promoveu reversão das
alterações tanto na atividade quanto na expressão da catalase. Consistente com nosso trabalho,
VIDYASHANKAR; VARMA; PATKI (2013) demostraram que em células esteatóticas
(HepG2) incubadas com o composto fenólico quercetina, a atividade da CAT foi
significativamente aumentada. Este resultado sugere que os compostos antioxidantes no fruto
da uvaia foram capazes de melhorar o estado redox e consequentemente os mecanismos
moleculares envolvidos na patogênese da NAFLD.
Sendo assim, a administração da uvaia foi associada também a uma melhora no status
antioxidante, demonstrando que o suco de uvaia foi capaz de neutralizar o dano oxidativo
causado por radicais livres. A presença de compostos fenólicos com atividade antioxidante no
suco pode ter contribuído para proteger o fígado de uma lesão e proteger contra os radicais
livres evitando assim a progressão da NAFLD.
O presente estudo demonstrou os potenciais benefícios do suco de uvaia, uma fonte de
polifenóis, sobre a NAFLD em ratos alimentados com dieta hiperlipídica. A administração do
suco de uvaia evitou a progressão do dano hepático, melhorou os níveis de lipídios no soro,
modulou a expressão dos genes envolvidos na síntese e β-oxidação de AG (FAS, PPARα e
ACOX-1) e da biogênese peroxissomal (PMP70, PEX11α e catalase) e melhorou o estado
redox.
66
7. CONCLUSÃO
Os resultados sugerem que a dieta hiperlipídica pode estar limitando a homeostase do
metabolismo dos AG e a atividade de peroxissomos, além de promover um desequilíbrio
redox. O tratamento com o suco de uvaia demonstrou possível efeito nestas vias metabólicas,
tomando por base os nossos resultados A administração do suco melhorou o dano hepático,
melhorou os níveis de lipídios séricos, modulou a expressão dos genes envolvidos na síntese
e β-oxidação de AG (FAS, PPARα e ACOX-1) e da biogênese peroxissomal (PMP70,
PEX11α e catalase) e melhorou o estado redox.
Em conclusão, nossos achados demonstraram que o suco de uvaia tem um efeito
protetor contra NAFLD e forneceu nova perspectiva na compreensão dos possíveis
mecanismos envolvidos. O presente estudo apoia a ideia de que um provável aumento da
biogênese peroxissomal, da oxidação de AG e de melhora no balanço oxidante/antioxidante
hepático provavelmente representam mecanismos importantes pelo qual o suco de uvaia
amenizou a NAFLD induzida por dieta hiperlipídica em ratos.
Considerando que não há tratamento efetivo para NAFLD e que o suco de uvaia
provou ser uma importante fonte antioxidante, além de ser fácil de obter. Estes dados indicam
que a uvaia pode representar uma estratégia dietética viável, associada à prevenção e/ou
tratamento de distúrbios do metabolismo de lipídios.
Figura 20- Resumo das evidências encontradas sobre o metabolismo de lipídios e estresse
oxidativo que possivelmente contribuíram para amenizar os danos hepáticos induzidos por
dieta hiperlipídica.
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8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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89
9. ANEXOS
9.1 ANEXO I - Certificado de Aprovação da Comissão de Ética no Uso de
Animais
90
9.2 ANEXO II – Trabalho publicado no Food Research International
91
9.3. ANEXO III – Trabalho submetido no Food Research International