efeito do fluoreto no osso de camundongos com diferentes

Claudia Ayumi Nakai Kobayashi

Efeito do fluoreto no osso de camundongos com

diferentes susceptibilidades genticas fluorose:

uma anlise protemica

Tese apresentada Faculdade de Odontologia de

Bauru da Universidade de So Paulo para

obteno do ttulo de Doutor em Cincias

Odontolgicas Aplicadas, na rea de

concentrao Odontopediatria

Orientadora: Profa. Dra. Marlia Afonso Rabelo

Buzalaf

Verso corrigida

BAURU

2012

Nota: A verso original desta tese encontra-se disponvel no Servio de Biblioteca e Documentao da

Faculdade de Odontologia de Bauru - FOB/USP.

Kobayashi, Cludia Ayumi Nakai

K791e Efeito do fluoreto no osso de camundongos com diferentes

susceptibilidades genticas fluorose: uma anlise protemica /

Claudia Ayumi Nakai Kobayashi. Bauru, 2012.

215 p : il. ; 30cm.

Tese. (DOUTORADO) Faculdade de Odontologia de Bauru.

Universidade de So Paulo.

Orientadora: Profa. Dra. Marlia Afonso Rabelo Buzalaf

Autorizo, exclusivamente para fins acadmicos e cientficos, a reproduo total ou

parcial desta tese, por processos fotocopiadores e outros meios eletrnicos.

Assinatura:

Data:

Comit de tica da FOB-USP

Protocolo N: 006/2008

Data: 19 de junho de 2008

DEDICATRIA

Ao meu marido Thomas, pelo amor, pela grande ajuda, pelo incentivo sempre, pela

pacincia e pela compreenso em abdicar tanto tempo do nosso convvio para

que eu pudesse concluir o doutorado,

Aos meus pais, por terem me dado a chance de participar desta experincia

fascinante que a vida. Em especial, minha querida me, Chieko, pelo amor

incondicional, pela apoio e estmulo que sempre me deu para que eu pudesse

vencer mais esta etapa,

s minhas irms, Clara e Mnica, pela grande amizade que nos une e por serem

importantes exemplos de competncia, coragem e dedicao,

Dedico a vocs este trabalho

AGRADECIMENTOS

Agradeo a todas as pessoas que direta ou indiretamente participaram desta trajetria.

Em especial professora Marlia por ter me dado a honra de fazer parte do seu laboratrio por tantos anos,

por ser um modelo de inspirao, pela confiana e incentivo que fizeram com que eu me tornasse uma

pessoa completamente diferente do que eu era quando iniciei a vida acadmica. Devo muito a voc pelo

meu amadurecimento profissional e pessoal. Levarei sempre comigo seus ensinamentos, seu exemplo de

carter e competncia. Muito obrigada por ter sido muito mais do que minha orientadora em pesquisa, mas

tambm pela amizade, por me apoiar nas horas difceis, pela compreenso e por tornar mais fcil, apesar

das dificuldades, o caminho percorrido nessa etapa da minha vida. MUITO OBRIGADA!

Ao professor Walter Siqueira pela oportunidade de realizar o meu estgio sanduche no seu laboratrio, na

UWO (The University of Western Ontario) durante um ano. Muito obrigada por me aceitar em seu

laboratrio e pela grande e valiosa colaborao em um passo fundamental deste trabalho, a anlise

protemica das protenas sseas. Foi uma importante experincia que contribuiu muito para o meu

crescimento cientfico e pessoal.

Ao professor Eric Everett no apenas pelos ensinamentos sobre micro-CT e anlises de MAR, mas

tambm pela pacincia em ensinar, pela valiosa ajuda e por ter me recebido to bem em seu laboratrio na

University of North Carolina.

Faculdade de Odontologia de Bauru da Universidade de So Paulo, na pessoa de seu Diretor, Prof. Dr.

Jos Carlos Pereira.

Comisso de Ps-Graduao da FOB-USP, na pessoa de seu presidente, Prof. Dr. Paulo Csar

Rodrigues Conti.

Aos rgos de fomento Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo (FAPESP) processo

2008/01449-3 e Coordenadoria de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior (CAPES)- Bolsa

Sanduche processo 2008/01449-3 e Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico

(CNPq) N 014/200808, pelo suporte financeiro que viabilizou este estudo cientfico.

Aline de Lima Leite, agradeo sinceramente pela grande ajuda no trabalho e na impresso da tese, pela

amizade, pela companhia agradvel durante o estgio na UNC, e por todos os bons momentos que

passamos no laboratrio. Muito obrigada por ser uma grande amiga que nos momentos mais difceis

sempre esteve pronta para me ajudar.

Camila pela grande ajuda, em especial na anlise de Western Blotting e dosagem de fosfatase alcalina,

pela pacincia em discutir os resultados e pela amizade.

Mileni por me ajudar sempre que preciso, por me receber to bem na sua casa e pela amizade.

Flvia Iano pela amizade e pela grande ajuda sempre que preciso. No perodo dos estgios no exterior e

durante essas idas e vindas para Bauru, sua preciosa ajuda foi fundamental.

minha querida amiga Flavinha que j concluiu o seu trabalho nesse laboratrio, mas apesar de no

termos mais a convivncia diria, nossa amizade continua forte e verdadeira.

Juliane companheira no grupo proteoma, pela amizade e pelo apoio nos momentos mais difceis.

Mel, Lucas, Vincius e Ju pela ajuda no laboratrio e com o tratamento dos animais no biotrio. Lucas,

muito obrigada pelos dias que me ajudou digitando os valores para anlise de MAR que pareciam

infinitos...

Aos alunos e funcionrios do laboratrio no Carolina Center for Genome Sciences, em especial a Lauren

Katz pela valiosa ajuda na anlise do micro-CT, a Daniela e Gustavo Mendona pela simpatia e por me

ajudar desde o incio nos preparativos para viagem e durante todo o perodo que fiquei em Chapel Hill,

tornando tudo muito mais fcil e agradvel.

Aos alunos e funcionrios do Siqueira Lab e de outros laboratrios da UWO, em especial, Tom Chrones,

Nada Tabbara, Carla Martins, Cindy Xiao, Young, Heide Yinyin Liao e Paula Yamaguti pela ajuda, pelo

bom convvio, por serem sempre to prestativos e pela amizade.

Aos funcionrios da Odontopediatria D Lia, Lilian e Estela e do laboratrio de Bioqumica, Thelma,

Ovdio, Larissa e Aline pelo apoio e amizade.

A todos os professores do curso de ps-graduao da FOB-USP, em especial aos professores da

Odontopediatria e Bioqumica por todos os ensinamentos.

Profa. Dra. Salete Moura Bonifcio da Silva e Dra Camila Peres-Buzalaf pela importante contribuio

no Exame de Qualificao.

Ftima e ao tcnico administrativo Alexandre da Odontopediatria, sempre nos ajudando a resolver todos

os trmites burocrticos.

Aos colegas da odontopediatria Juliana, Adriana, Flavia, Vanessa, Natalino, Tati, Carla, e todos os outros

e aos colegas de laboratrio da bioqumica, por vivenciarmos juntos tantos momentos de trabalho e

tambm descontrao: Camila, Aline Leite, Mileni, Flvia Iano, Thiemi, Mel, Helo, Maria, Tasa, Senda,

Amanda, Flvia Levy, Cris, Lucas, Ju, Aline Dionzio, Isa, todos os outros e aos que j esto longe

Flavinha, Juliane e Juliano. Sentirei muita falta de todos vocs!

minha famlia que sempre me apoia, meus pais Minoru e Chieko, minhas irms Clara e Mnica, meus

cunhados Adam, Ricardo, Martin e sua esposa Marion, minhas sobrinhas Anna e Amanda que enchem

nossas vidas de alegria, minha sogra Ursula e seu marido Gottfried, meu sogro Werner, e em especial meu

marido, Thomas pela ajuda com o trabalho e com as planilhas de protenas, pela pacincia para me ensinar

a usar o excel, pela fora e estmulo para que eu alcance os meus objetivos.

Se a cincia a constelao de fatos, teorias e mtodos coletados na

literatura, ento os cientistas so os indivduos que tm se esforado,

com sucesso ou no, para contribuir com um ou outro

elemento desta particular constelao.

Thomas S. Kuhn

RESUMO

Tem sido demonstrado que fatores genticos influenciam a resposta do osso e esmalte ao fluoreto

(F), mas os mecanismos moleculares envolvidos no esto bem definidos. No presente estudo, foi

empregada uma abordagem protemica livre de marcadores para identificar e avaliar alteraes na

expresso de protenas sseas em duas linhagens de camundongos com diferentes susceptibilidades

fluorose (A/J susceptvel e 129P3/J resistente). Camundongos machos das linhagens 129P3/J e

A/J foram distribudos em trs grupos para cada linhagem, que receberam rao com baixa

concentrao de F e gua de beber contendo 0, 10 e 50 ppm F por 8 semanas. A concentrao de F

foi analisada no plasma e fmur. A atividade da fosfatase alcalina foi dosada no plasma. Fmur,

tbia e vrtebra lombar foram submetidos anlise por micro-CT. A taxa de aposio mineral

(MAR) tambm foi avaliada no osso cortical dos camundongos. Em adio, eletroforese

unidimensional e cromatografia lquida - espectrometria de massas sequencial (LC-ESI-MS/MS)

foram utilizadas para identificar e caracterizar as protenas de fmur da linhagem 129P3/J. Para

anlise protemica quantitativa, protenas sseas foram extradas para cada grupo empregando

quatro diferentes etapas: (a) tampo PBS (pH 7,4) por 24h, (b) tampo de Guanidina HCl 4 M / Tris

HCl 50 mM (pH 7,4) por 96 h, (c) tampo EDTA 0,5 M / Tris HCl 50 mM (pH 7,4) por 96 h, e por

ltimo (d) tampo de Guanidina HCl 4 M / Tris HCl 50 mM (pH 7,4) por 96 h. As protenas sseas

extradas para cada grupo foram separadamente submetidas ao LC-ESI-MS/MS, seguido da anlise

semi-quantitativa de diferena de expresso proteica livre de marcadores. Foram identificadas

vrias protenas sseas com alterao na abundncia entre os 3 tratamentos com F para cada

linhagem e entre as duas linhagens para cada tratamento com F (razo 1,5 or 0,5,

respectivamente). O F promoveu alteraes na expresso de protenas envolvidas na osteognese e

osteoclastognese de maneira distinta para cada linhagem. Embora no tenha sido observada

diferena significativa nos valores de BMD e parmetros histomorfomtricos entre os grupos

tratados com F para ambas as linhagens, a taxa de aposio mineral (MAR) foi maior no grupo

129P3/J tratado com 50 ppm F comparado com os grupos controle e 10 ppm F, demonstrando que

o F aumentou a formao ssea nesse grupo. Em concluso, o tratamento com F em baixa e alta

dose apresentou um efeito especfico para cada linhagem, confirmando uma influncia gentica na

resposta do osso exposio ao F.

Palavras-chave: Espectrometria de massas. Osteoporose. Fluoreto de Sdio. Protemica. Gentica.

ABSTRACT

Effect of fluoride on bone of mice with different genetic susceptibilities to fluorosis: a

proteomic analysis

Genetic factors have been shown to influence bone and enamel responses to fluoride (F), but the

molecular mechanisms involved remain unclear. In this study, a label-free proteomics approach was

employed to identify and evaluate changes in bone protein expression of two mouse strains with different

susceptibilities to fluorosis (A/J a susceptible strain, 129P3/J a resistant strain). Male 129P3/J and A/J

mice were assigned to three groups given low-F food and water containing 0, 10 or 50 ppmF for 8 weeks.

Plasma and femur were analyzed for F levels. Plasma was also evaluated for alkaline phosphatase activity.

Femurs, tibiae and lumbar vertebrae were subjected to micro-CT analysis. Mineral apposition rate (MAR)

was also measured in mice cortical bone. In addition, unidimensional electrophoresis and liquid

chromatography/Tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS) was used to identify and characterize the

femur protein profile from 129P3/J mouse strain. For quantitative proteomic analysis, bone proteins were

extracted using four different steps: (a) PBS buffer (pH 7.4) for 24h, (b) 4 M Guanidine HCl/50 mM Tris

HCl buffer (pH 7.4) for 96 h, (c) 0.5 M EDTA/50 mM Tris HCl buffer (pH 7.4) for 96 h, followed by (d)

4 M Guanidine HCl/50 mM Tris HCl buffer (pH 7.4) for 96 h. Bone proteins extracted from each group

were separately subjected to LC-ESI-MS/MS, followed by label-free semi-quantitative differential

expression analysis. Changes in many bone proteins abundance were found among the F treatment groups

for each mouse strain and between the strains for each F treatment group (ratio 1.5 or 0.5,

respectively). F led to alterations in expression of proteins involved in osteogenesis and osteoclatogenesis

in a different way for each strain. Although F treatment had no significant effects on BMD and

histomorphometric measurements for both strains, mineral apposition rate (MAR) was higher in 129P3/J

mice treated with 50 ppm F compared to control and 10 ppm F groups, showing that F increased bone

formation for this group. In conclusion, F treatment at low and high levels had strain specific effects in

mice, confirming a genetic influence in bone response to F exposure.

Keywords: Mass spectrometry. Osteoporosis. Sodium Fluoride. Proteomics. Genetics.

LISTA DE ILUSTRAES

Figura 1 Representao esquemtica das estratgias baseadas em 2DE e LC/MS

mais comumente empregadas em anlise protemica quantitativa. Adaptado de:

(COLUCCI-D'AMATO et al. 2011) ........................................................................................ 39

Figura 2 Administrao de 10 mg/Kg corporal de calcena em 2% de bicarbonato de

sdio (A) e 30 mg/Kg corporal de alizarina complex one (B) por via intra-peritoneal,

em dose nica, 11 e 2 dias antes da eutansia, respectivamente ............................................. 62

Figura 3 Avaliao da taxa de aposio mineral (MAR) de fmures de camundongos

da linhagem A/J e 129P3/J submetidos a tratamento com 0, 10 e 50 pppm F ............................ 64

Figura 4 Gel 2DE representativo de protenas de fmures de camundongos A/J

controle extrados com o mtodo 1 (A), 2 (B) e 3 (C). As protenas sseas foram

separadas em strips de 24 cm e pH 3-10 linear, seguido de SDS-PAGE e coradas com

azul de coloidal CBB G250 ..................................................................................................... 68

Figura 5 Fluxograma do mtodo de extrao sequencial para protenas sseas

(DOMENICUCCI et al. 1988 modificado). ............................................................................ 69

Figura 6 SDS-PAGE 12% de extratos PBS de protenas de fmur de camundongo

da linhagem 129P3/J. Alquotas correspondentes a 20 g dos extratos de PBS no

submetidos centrifugao prvia sem e com adio de 0,5 mM EDTA, do

sobrenadante aps centrifugao sem e com adio de 0,5 mM EDTA e do

precipitado aps centrifugao sem e com adio de EDTA 0,5 mM foram aplicadas

nos poos 2, 3, 5, 6, 8 e 9, respectivamente. As protenas foram coradas com

Coomassie Blue (A) e prata (B) ............................................................................................... 70

Figura 7 SDS-PAGE 12% de protenas de fmures de camundongos AJ grupo

controle (AJC). Foram aplicados 10 g do extrato G1G2. As protenas foram coradas

com Coomassie Blue ............................................................................................................... 71

Figura 8 SDS PAGE de saliva da partida (PS). Alquotas correspondentes a 20

g de PS contendo guanidina HCl 4 M, 2 M, 1 M ou no foram aplicadas nos poos

3, 5, 7 e 9, respectivamente. Apenas as amostras contendo guanidina HCl

apresentaram o precipitado, cujo aumento foi diretamente proporcional

concentrao de guanidina HCl ............................................................................................... 73

Figura 9 SDS-PAGE 12% de saliva da partida (PS). Alquotas correspondentes a

20 g de PS contendo guanidina HCl 4 M, 2 M, 1 M ou no foram aplicadas nos

poos 3, 5, 7 e 9, respectivamente. Durante a corrida, a guanidina HCl aumentou a

condutividade do gel, diminuindo o campo eletrofortico, mesmo em baixas

concentraes........................................................................................................................... 73

Figura 10 SDS-PAGE 12% de saliva da partida (PS). Alquotas correspondentes a

20 g de PS contendo guanidina HCl 4 M, 2 M, 1 M ou no foram aplicadas nos

poos 3, 5, 7 e 9, respectivamente. As protenas foram coradas com Coomassie Blue. ......... 75

Figura 11 SDS-PAGE 12% de protenas de fmur de camundongo 129P3/J.

Alquotas correspondentes a 10 e 20 g do extrato G1G2 foram precipitadas com

etanol 90% e aplicadas nos poos 3 e 5, respectivamente. As protenas foram coradas

com Coomassie Blue (A) e prata (B) ....................................................................................... 77

Figura 12 SDS-PAGE 12% de 20 g do extrato E de fmur de camundongo da

linhagem 129P3/J, aps filtrao centrfuga com Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter

Unit (membrana de 3KDa). As protenas foram coradas com Coomassie Blue (A) e

prata (B).. ................................................................................................................................. 79

Figura 13 Gel de poliacrilamida catinico dos extratos PBS, G1G2 e E da linhagem

de camundongos 129P3/J grupo controle. Alquotas correspondentes a 10 g do

extrato PBS, 20 g do extrato G1G2 e 10 g do extrato E foram aplicadas nos poos

1, 2 e 3, respectivamente. As protenas foram coradas com prata. .......................................... 80

Figura 14 - Gel de poliacrilamida catinico dos extratos PBS, G1G2 e E da linhagem

de camundongos 129P3/J grupo controle. Alquotas correspondentes a 20 g do extrato

PBS, 50 g do extrato G1G2 e 20 g do extrato E foram aplicadas nos poos 1, 2 e 3,

respectivamente. As protenas foram coradas com Coomassie Blue (A) e prata (B) .................. 81

Figura 15 Concentrao de protena (g/mL) para cada frao eluda no PD Mini

Trap G-10 determinda pelo mtodo BCA ................................................................................ 83

Figura 16 Quantificao da concentrao de guanidina HCl utilizando uma escala

com diferentes concentraes de guanidina HCl (0,125, 0,25, 0,5, 1, 2 e 4 M) para

cada frao eluda no PD Mini Trap G-10 .............................................................................. 83

Figura 17 Alinhamento cromatogrfico das amostras 129P3/J e A/J grupo controle

realizado no SIEVE software 1.3, utilizando o algoritmo ChromAlign ................................... 86

Figura 18 Workflow da anlise protemica semi-quantitativa livre de marcadores

utilizada no presente estudo para avaliar diferenas na expresso de protenas sseas

de fmures de camundongos das linhagens A/J e 129P3/J tratados com F ............................. 87

Figura 19 Quantificao da atividade da fosfatase alcalina (ALP) no plama de

camundongos da linhagem A/J e 129P3/J em funo do tratamento com F (0, 10 e 50

ppm) por 8 semanas. As barras indicam o desvio-padro. Letras distintas indicam

diferenas significativas entre as linhagens, para cada tratamento (p

Figura 22 Mdia da BMD e de parmetros histomorfomtricos da regio cortical de

fmur nas linhagens de camundongos A/J e 129 P3/J em funo da concentrao de F

administrada na gua de beber (0, 10 e 50 ppm) por 8 semanas. n = 8/grupo. As

barras indicam o desvio-padro. Letras distintas indicam diferenas significativas

entre as linhagens, para cada tratamento (p

Figura 35 SDS-PAGE 12% representativo de protenas de fmur de camundongos

das linhagens A/J e 129P3/J tratados com 0, 10 e 50 ppm F. Alquotas

correspondentes a 10 g dos extratos PBSe E e 20 g do extrato G1G2 foram

aplicadas no gel SDS e as protenas foram coradas com prata ................................................ 129

Figura 36 Distribuio de acordo com o processo biolgico das protenas de fmur

com expresso diferencial quando se compararam os grupos controle e tratados com

10 e 50 ppm F para cada linhagem (A/J ou 129 P3/J). n = 8 por grupo .................................. 150

Figura 37 Distribuio de acordo com a localizao celular das protenas de fmur

com expresso diferencial quando se compararam os grupos controle e tratados com

10 e 50 ppm F para cada linhagem (A/J ou 129 P3/J). n = 8 por grupo .................................. 151

Figura 38 Distribuio de acordo com o processo biolgico das protenas de fmur

identificadas com expresso diferencial quando se compararam as linhagens de

camundongos A/J e 129 P3/J em funo da concentrao de F administrada na gua

de beber (0, 10 e 50 ppm) por 8 semanas. n = 8 por grupo ...................................................... 152

Figura 39 Distribuio de acordo com a localizao celular das protenas de fmur

com expresso diferencial quando se compararam as linhagens de camundongos A/J e

129 P3/J em funo da concentrao de F administrada na gua de beber (0, 10 e 50

ppm) por 8 semanas. n = 8 por grupo ...................................................................................... 153

Figura 40 SDS-PAGE 12% de protenas de fmur de camundongo da linhagem A/J

e 129P3/J utilizadas nos experimentos de Western Blotting. Alquotas

correspondentes a 30 g dos extratos PBS, G1G2 e E foram aplicadas no gel SDS e

as protenas foram coradas com Coomassie Blue. N= 4 animais/grupo .................................. 154

Figura 41 Imagem representativa de 4 experimentos para validao da diferena de

expresso do colgeno tipo I (140 kDa) por Western Blotting, realizados com

diferentes amostras de fmures de camundongos (n=4 animais/grupo) .................................. 154

Figura 42 Anlise de Western Blotting do colgeno tipo I (140 kDa) nas linhagens

de camundongos A/J e 129 P3/J em funo da concentrao de F administrada na

gua de beber (0, 10 e 50 ppm) por 8 semanas. n = 4 animais/grupo. Na anlise de

densitometria foi atribudo para o grupo A/J controle um valor arbitrrio = 1, sendo

que os valores para os demais grupos foram calculados considerando o A/J como

referncia. As barras indicam o desvio-padro. Letras distintas indicam diferenas

significativas entre as linhagens, para cada tratamento (p

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Quantificao protica utilizando Bradford para trs diferentes mtodos

de extrao de protenas sseas .................................................................................... 67

Tabela 2 Concentrao de F no plasma (g/L) e no fmur (mg/Kg) de

camundongos da linhagem A/J e 129P3/J em funo do tratamento com F (0, 10 e

50 ppm) por 8 semanas ................................................................................................. 93

Tabela 3 Concentrao de protena (g/mL) pelo mtodo BCA e nmero protenas

identificadas por LC-ESI-MS/MS para cada extrato proteico obtidos de fmur de

camundongo da linhagem 129P3/J ............................................................................... 118

Tabela 4 Lista de protenas de fmur de camundongo da linhagem 129P3/J obtidas

pelo mtodo de extrao sequencial com tampo PBS (extrato PBS) identificadas

por LC-ESI-MS/MS ..................................................................................................... 120

Tabela 5 Lista de protena de fmur de camundongo da linhagem 129P3/J obtidas

pelo mtodo de extrao sequencial com tampo 4 M Guanidina HCl (extrato

G1G2) identificadas por LC-ESI-MS/MS .................................................................... 122

Tabela 6 Lista de protenas de fmur de camundongo da linhagem 129P3/J obtidas

pelo mtodo de extrao sequencial com tampo 0,5 M EDTA (extrato E)

identificadas por LC-ESI-MS/MS ................................................................................ 125

Tabela 7 Quantidade total de protenas identificadas com diferena de expresso

para as comparaes entre os tratamentos e linhagens de camundongos A/J e

129P3/J utilizando o SIEVE software .......................................................................... 130

Tabela 8 Lista de protenas identificadas com expresso diferencial no grupo A/J

controle (A) comparado ao A/J 10 ppm F (B) .............................................................. 133


controle (A) comparado ao A/J 50 ppm F (B) .............................................................. 135


10 ppm F (A) comparado ao A/J 50 ppm F (B) ........................................................... 136

Tabela 11 Lista de protenas identificadas com expresso diferencial no grupo

129P3/J controle (A) comparado ao 129P3/J 10 ppm F (B) ........................................ 136

Tabela 12 Lista de protenas identificadas com expresso diferencial no grupo

129P3/J controle (A) comparado ao 129P3/J 50 ppm F (B). ....................................... 138

Tabela13 Lista de protenas identificadas com expresso diferencial no grupo

129P3/J 10 ppm F (A) comparado ao 129P3/J 50 ppm F (B) ...................................... 142

Tabela 14 Lista de protenas identificadas com expresso diferencial entre as

linhagens 129P3/J controle (A) comparado ao A/J controle (B) .................................. 142


linhagens A/J 10 ppm F (A) comparado ao 129P3/J 10 ppm F (B) ............................. 148


linhagens 129P3/J 50 ppm F (A) comparado ao A/J 50 ppm F (B) ............................. 149

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

2D-DIGE Difference Gel Electrophoresis / Eletroforese de Fluorescncia

Diferencial em Gel Bidimensional

2D-PAGE Two Dimensional Polyacrylamide Gel Electrophoresis / Eletroforese

Bidimensional em Gel de Poliacrilamida

AFB1-AR Aflatoxin B1 Aldehyde Reductase Member 2

ALP Alkaline Phosphatase / Fosfatase Alcalina

B.Ar Mean Total Cross Sectional Bone Area / rea Mdia do Osso nas Sees

Transversais da Amostra

B.Pm Mean Total Cross Sectional Bone Perimeter / Permetro Mdio do Osso

nas Sees transversais da Amostra

BCA Bicinchoninic Acid / cido Bicinconnico

BGP Bone Gla Protein ou Osteocalcin

BMD Bone Mineral Density / Densidade Mineral ssea

BMP Bone Morphogenetic Protein / Protena Morfogentica ssea

BS/BV Bone Specific Surface / Razo entre a Superfcie ssea Trabecular e o

Volume sseo Trabecular

BS/TV Bone Surface Density / Razo entre a Superfcie ssea Trabecular e o

Volume Total da Amostra

BSP Bone Sialoprotein

BV/TV Bone Volume Fraction / Razo entre o Volume sseo Trabecular e o

Volume Total da Amostra

CaM Calmodulin

CBR Carbonyl Reductase NADPH 2

CHD Chromodomain_Helicase_DNA_Binding Protein

Cl Cloro

CO2 Dixido de Carbono

COL1A1 Collagen Type I Alpha 1

DNA Deoxyribonucleic Acid / cido Desoxirribonucleico

DTT Ditiotreitol

ECM Extracellular Matrix / Matriz Extracelular

EDTA cido Etilenodiamino Tetra-Actico

EF-Gmt Elongation Factor G Mitochondrial

eIF2k3 Eukaryotic Translation Initiation Factor 2 Alpha Kinase 3 Precursor

emPAI Exponentially Modified Protein Abundance Index / ndice de Abundncia

Proteica Exponencialmente Modificado

EP Erro Padro

ESI Electrospray Ionization / Ionizao por Eletrospray

F Fluoreto

FAp Fluorapatita

FGF Fator de Crescimento Fibroblstico

FGFR3 Receptor FGF 3

FIGNL1) Fidgetin_Like Protein 1

FTIR Fourier Transform Infrared Spectroscopy / Espectroscopia na Regio do

Infravermelho Fourier

GDP Guanidine Diphosphate / Difosfato de Guanidina

Gla cido Gama-Carboxiglutmico

GTP Guanidine Triphosphate / Trifosfato de Guanidina

HCl cido clordrico

HMDS cido Sulfrico Saturado

HSC Hematopoietic Stem Cells / Clulas Tronco Hematopoiticas

ICAT Isotope-Coded Affinity Tag / Marcador de Afinidade Enriquecido

Isotopicamente

IEF Isoelectric Focusing / Focalizao Isoeltrica

IPG Immobilized pH Gradient / Gradiente Imobilizado de pH

iTRAQ Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantification /

Marcador Isobrico para Quantificao Relativa e Absoluta

JNK Jun N-Terminal Kinase

L4 Quarta Vrtebra Lombar

LC Liquid Chromatography / Cromatografia Lquida

LC MS/MS Liquid Chromatography - Tandem Mass Spectrometry / Cromatografia

Lquida - Espectrometria de Massas Sequencial

LC/LC Cromatografia Lquida Bidimensional

M Molar

MALDI-TOF Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation-Time of Flight /

Dessoro/Ionizao a Laser Auxiliada por Matriz Tempo de voo

MAR Mineral Apposition Rate / Taxa de Aposio Mineral

MCAT Mass-Coded Abundance Tagging / Protenas Codificadas com

Marcadores Isotpicos

MDLC MS/MS Multi-Dimensional Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass

Spectrometry / Cromatografia Lquida Multidimensional Combinada

com Espectrometria de Massas Sequencial

MFP monofluorfosfato de sdio

Mg Magnsio

MGP Matrix Gla Protein

micro-CT Microtomografia Computadorizada

MMI Mean Polar Moment of Inertia / Mdia do Momento Polar de Inrcia

MMPs Metaloproteinases da Matriz

MS Mass Spectrometry / Espectrometria de Massas

MS/MS Tandem Mass Spectrometry / Espectrometria de Massas Sequencial

MudPIT Multidimensional Protein Identification Technology / Tecnologia

Multidimensional para Identificao de Protenas

NaF Fluoreto de Sdio

NaOH Hidrxido de Sdio

NEM N-Etilmaleimida

NFkB Fator Nuclear Kapa B

NH4HCO3 Bicarbonato de Amnio

NHA Sodium/Hydrogen Exchanger 5

NMJ Juno Neuromuscular

Nox4 NADPH oxidase 4

NSAF Normalized Spectral Abundance Fator / Fator de Abundncia Espectral

Normalizado

PBS Tampo Fosfato Salina

PDHE1-A Pyruvate Dehydrogenase E1 Component Subunit Alpha

PERK PKR-Like Endoplasmic Reticulum Kinase

PGE2 Prostaglandina E2

pI Ponto Isoeltrico

PI3-K Fosfatidilinositol 3-Quinase

PMSF Fluoreto e Fenil Metil Sulfonila

PN3 Sodium Channel Protein Type 10 Subunit Alpha

p-NP P-Nitrofenol

ppm Parte por Milho

PPRL Proteoglicanas Pequenas Ricas em Leucina

PTH Paratormnio

PTP Phosphotyrosyl Phosphatase

PVDF Polivinil Fluorado

RANKL Ligante do Receptor Ativador do Fator Nuclear Kapa B

RGD Arginina-Glicina-cido Asprtico

RLIM E3 Ubiquitin-Protein Ligase RLIM

RNAm RNA (cido Ribonuclico) mensageiro

RPLC Reverse Phase Liquid Chromatography / Cromatografia Lquida em Fase

Reversa

SAF Spectral Abundance Factor / Fator de Abundncia Espectral

SAX Strong-Anion Exchange / Troca Aninica Forte

SAXS Small Angle X-ray Scattering / Espalhamento de Raio-x a Baixo ngulo

SCX Strong-Cation Exchange / Troca Catinica Forte

SDS Dodecil Sulfato de Sdio

SDS-PAGE SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis / Eletroforese desnaturante em

gel de poliacrilamida em SDS

SEC Size-Exclusion Chromatography / Cromatografia por Excluso

Molecular

SERMs Selective Estrogen Receptor Modulators / Moduladores Seletivos do

Receptor De Estrgeno

SHIP1 Phosphatidylinositol 3-4-5 Trisphosphate 5-Phosphatase 1

SILAC Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture / Anlise da

Razo de Istopos Estveis em Aminocidos em Cultura de Clulas

SPARC Osteopontin

SpC Contagem Espectral

T.Ar Mean Total Crossectional Tissue Area / rea Mdia de Tecido Total nas

Sees Transversais da Amostra

T.Pm Mean total crossectional tissue perimeter / Permetro Mdio do Tecido

Total nas Sees Transversais da Amostra

Tb.N Trabecular Number Density / Nmero e Densidade Trabecular

Tb.Pf Trabecular Bone Pattern Factor / Fator de Forma do Osso Trabecular

Tb.Sp Trabecular Separation / Separao Trabecular

Tb.Th Trabecular Thickness / Espessura Trabecular

TBS-T Soluo Tampo Tris acrescida de Tween-20

TGF- Fator Beta de Crescimento tumoral

TMT Tandem Mass Tags / Marcadores de Massa Sequencial

TNF Fator-Alfa de Necrose Tumoral

TRACP Fosfatase cida Tartarato Resistente

USP31 Ubiquitin Specific Protease 31

SUMRIO

1 INTRODUO .............................................................................................. 25

2 REVISO DE LITERATURA ..................................................................... 31

2.1 EFEITOS DO F NO TECIDO SSEO ........................................................... 31

2.1.1 Efeitos fsico-qumicos do F na matriz mineral ssea ................................. 31

2.1.2 Efeito do F na matriz orgnica e clulas sseas .......................................... 34

2.2 INFLUNCIA GENTICA NA RESPOSTA DO TECIDO SSEO AO F ... 36

2.3 ANLISE PROTEMICA QUANTITATIVA .............................................. 38

2.3.1 Anlise protemica quantitativa livre de marcadores (Label-free) ........... 42

2.3.1.1 Quantificao Relativa por Intensidade de Sinal dos ons de Peptdeos ......... 43

2.3.1.2 Quantificao Relativa por Contagem Espectral ............................................. 46

2.3.1.3 Quantificao Absoluta Livre de Marcadores ................................................. 48

2.4 ANLISE PROTEMICA QUANTITATIVA EM TECIDO SSEO .......... 49

3 PROPOSIO ............................................................................................... 53

4 MATERIAL E MTODOS .......................................................................... 57

4.1 OBTENO DOS ANIMAIS E TRATAMENTO COM FLOR ................ 57

4.2 EUTANSIA DOS ANIMAIS E COLETA DAS AMOSTRAS ................... 58

4.3 DOSAGEM DE F NO PLASMA .................................................................... 58

4.4 DOSAGEM DE F NO FMUR....................................................................... 60

4.5 QUANTIFICAO DA ATIVIDADE DA FOSFATASE ALCALINA (ALP) NO PLASMA ....................................................................................... 60

4.6 ANLISE DE MICROTOMOGRAFIA COMPUTADORIZADA (MICRO-CT) ................................................................................................... 61

4.7 TAXA DE APOSIO MINERAL (MINERAL APPOSITION RATE MAR) ............................................................................................................... 62

4.8 EXTRAO DAS PROTENAS SSEAS DE CAMUNDONGOS ............. 64

4.9 ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA DE PROTENAS DE FMUR ..................................................................................................... 69

4.9.1 Eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS (SDS-PAGE) ......... 70

4.9.2 Eletroforese em gel de poliacrilamida catinico ....................................... 79

4.9.3 Eletroforese em gel de poliacrilamida aninico ........................................ 82

4.10 ANLISE PROTEMICA .............................................................................. 82

4.10.1 Preparo das amostras para espectrometria de massas LC-ESI-MS/MS 82

4.10.2 Espectrometria de massas LC-ESI-MS/MS .............................................. 84

4.11 ANLISE DA EXPRESSO PROTEICA POR WESTERN BLOTTING ...... 88

4.12 ANLISE ESTATSTICA............................................................................... 88

5 RESULTADOS ............................................................................................... 93

5.1 DOSAGEM DE F NO PLASMA E NO FMUR ............................................ 93

5.2 QUANTIFICAO DA ATIVIDADE DE FOSFATASE ALCALINA (ALP) NO PLASMA ........................................................................................ 94

5.3 ANLISE DE MICROTOMOGRAFIA COMPUTADORIZADA (MICRO-CT) .................................................................................................... 97

5.4 TAXA DE APOSIO MINERAL (MINERAL APPOSITION RATE MAR)................................................................................................................ 102

5.5 ANLISE PROTEMICA .............................................................................. 115

5.5.1 Caracterizao das protenas de fmur de camundongo da linhagem 129P3/J ............................................................................................................ 115

5.5.2 Anise protemica quantitative .................................................................... 129

5.5.3 Anlise da expresso proteica por Western Blotting.................................... 154

6 DISCUSSO ................................................................................................... 159

6.1 SELEO DOS ANIMAIS ............................................................................. 159

6.2 DOSAGEM DE F NO PLASMA E NO FMUR ............................................ 159

6.3 ANLISE DE MICROTOMOGRAFIA COMPUTADORIZADA (MICR-CT) ....................................................................................................... 160

6.4 TAXA DE APOSIO MINERAL (MINERAL APPOSITION RATE MAR)................................................................................................................ 164

6.5 CARACTERIZAO DAS PROTENAS DE FMUR DE CAMUNDONGO DA LINHAGEM 129P3/J .................................................. 165

6.6 ANLISE PROTEMICA QUANTITATIVA ............................................... 172

7 CONCLUSES .............................................................................................. 189

REFERNCIAS ............................................................................................. 193

ANEXOS ......................................................................................................... 215

Claudia A. N. Kobayashi 25

1 INTRODUO

A osteoporose uma doena do sistema esqueltico que se caracteriza por uma baixa

densidade mineral ssea (BMD) associada ao aumento do risco de fraturas sseas, muitas vezes

envolvendo a coluna, o quadril e o antebrao. A reduo da BMD consequncia de um

desequilbrio no processo de remodelao ssea, no qual a reabsoro maior do que a formao

ssea (BARON; HESSE 2012). De acordo com a patognese, existem dois tipos distintos de

osteoporose, a primria (70 - 80%) e a secundria (20 - 30%) (LEIDIG-BRUCKNER; RAUE;

FRANK-RAUE 2012). A osteoporose primria afeta predominantemente mulheres na ps-

menopausa, mas tambm pode ocorrer em homens idosos (BARON; HESSE 2012). A

osteoporose secundria est associada a certas doenas endcrinas, gastrointestinais e

hematolgicas ou uso prolongado de medicamentos como glicocorticide e terapia anti-hormonal

(inibidor da aromatase em mulheres com cncer de mama e terapia de privao de andrgenos em

homens com cncer de prstata) (LEIDIG-BRUCKNER; RAUE; FRANK-RAUE 2012). O uso

prolongado de corticosteroides em alta dose pode levar a quadros severos de osteoporose em

crianas (REJOU et al. 1986). A prevalncia e morbidade associadas com osteoporose secundria

e fraturas em pacientes com mielomeningocele (espinha bfida) enfatizam a importncia da

preveno da osteoporose e o tratamento precoce na infncia (MARREIROS; LOFF; CALADO

2012).

Diferentes agentes tm sido utilizados para o tratamento de osteoporose, incluindo

antirreabsortivos (bifosfonato, ibandronato, calcitonina e para as mulheres os moduladores

seletivos do receptor de estrgeno SERMs), anablicos (teriparatida, sais de clcio, fluoreto de

sdio NaF) e outros agentes (inibidores de RANKL, ralenato de estrncio, e nutrientes como

clcio e vitamina D) (AL-ANAZI et al. 2011). Atualmente, os agentes antirreabsortivos esto

entre as principais opes teraputicas para o tratamento da osteoporose. No entanto, esses

agentes apresentam limitaes, em especial o fato de levar a um baixo estado de neoformao

ssea, no qual a formao ssea reduzida com a supresso da atividade de remodelao ssea

(BARON; HESSE 2012).

Ao contrrio dos agentes antirreabsortivos, o fluoreto (F) um agente anablico sseo

potente, que age estimulando a atividade osteoblstica, resultando no aumento da massa ssea

(RUBIN et al. 2001). O F tem sido utilizado clinicamente durante muitos anos, mas seu uso

26 Claudia A. N. Kobayashi

permanece controverso e muitas questes permanecem sem respostas (CHACHRA et al. 1999).

Embora o F aumente a BMD, evidncias encontradas em estudos clnicos randomizados

mostraram que o mesmo no reduz o risco de fratura de vrtebra (HAGUENAUER et al. 2000).

O tratamento com NaF, suplementado com clcio e vitamina D, ajudou no controle de

osteoporose secundria em um caso clnico de uma criana de 10 anos submetida a tratamento

crnico com corticosteroide (REJOU et al. 1986). A avaliao da eficcia da terapia com F

complicada, uma vez que o osso apresenta uma resposta bifsica dose dependente, ou seja, o F

pode ter uma ao mitognica em baixas concentraes e txica em altas concentraes

(CHENG; BADER; GRYNPAS 1995; EVERETT 2011). A eficcia do F para o tratamento da

osteoporose depende da administrao precoce e de regimes com baixas doses no qual os nveis

txicos so evitados e a mineralizao no prejudicada (BALENA et al. 1998). Contudo, ainda

existe uma dificuldade para determinar qual dosagem seria a mais apropriada (CHACHRA et al.

1999). Em adio, na ltima dcada, evidncias de que existe uma interao do background

gentico do indivduo levaram a uma nova percepo dos efeitos fisiolgicos do F (CHOUBISA;

CHOUBISA; CHOUBISA 2001; EVERETT 2011; GROBLER et al. 2009). O F pode ter um

efeito positivo na densidade axial do osso, mas aproximadamente um tero dos pacientes no

responde ao tratamento (DEQUEKER; DECLERCK 1993). Estudos para avaliar o efeito fsico-

qumico do F nas propriedades mecnicas sseas em diferentes linhagens de camundongos

demonstraram que existe uma influncia gentica na susceptibilidade do osso ao F (MOUSNY et

al. 2006; MOUSNY et al. 2008). Entretanto, os mecanismos moleculares envolvidos nos

diferentes efeitos do F, influenciados pela gentica, na qualidade ssea, ainda no so

conhecidos.

Quando se deseja desvendar os mecanismos moleculares envolvidos em uma patologia ou

no seu tratamento, a anlise protemica uma importante ferramenta. A protemica um dos

vrios campos MICOS que vem crescendo rapidamente na era ps-genmica. uma rea da

Cincia, desenvolvida na ltima dcada, que analisa as protenas em larga escala, contribuindo

muito para o entendimento da funo do gene (PANDEY; MANN 2000; ZHANG et al. 2010). O

proteoma o conjunto de todas as protenas expressas em uma clula, tecido ou organismo em

um dado momento, e constantemente alterado pelas interaes bioqumicas entre o genoma e o

ambiente (COLUCCI-D'AMATO et al. 2011; PORTEUS et al. 2011). A anlise protemica

fornece informaes globais sobre a expresso de protenas, suas concentraes relativas e


possveis modificaes ps-traducionais que elas possam sofrer (PANDEY; MANN 2000;

SCHULZE; USADEL 2010).

Numa das abordagens mais comuns em protemica quantitativa, emprega-se a eletroforese

bidimensional em gel de poliacrilamida (2D-PAGE) para separar e comparar as protenas

presentes em amostras biolgicas, seguida de identificao por espectrometria de massas (MS),

em combinao com ferramentas de bioinformtica (ISSAQ; VEENSTRA 2008). Devido s

limitaes do gel 2D para caracterizao e comparao das protenas, tcnicas de cromatografia

lquida (LC) livres de gel (gel free) em conjunto com a espectrometria de massas surgiram como

uma alternativa para quantificar os nveis de protenas, com maior sensibilidade e

reprodutibilidade (AEBERSOLD; MANN 2003).

Nos ltimos anos, o desenvolvimento de mtodos livres de gis tem fornecido ferramentas

poderosas para o estudo em larga escala da expresso de protenas e caracterizao de sistemas

biolgicos complexos (DOMON; AEBERSOLD 2006; MOTOYAMA; YATES 2008). Esse tipo

de abordagem protemica baseada em MS pode ser dividido em duas estratgias: a que utiliza

marcadores isotpicos e a livre de marcador (label-free). Devido s propriedades fsicas e

qumicas dos marcadores isotpicos serem idnticas s propriedades do seu homlogo, exceto

pela massa, as molculas marcadoras isotpicas foram incorporadas em MS como padro interno

ou referncia relativa (ZHU; SMITH; HUANG 2010). Entretanto, logo aps a marcao com

istopos tornar-se popular e ser aceita como mtodo de quantificao, abordagens livres de

marcadores comearam a ser desenvolvidas. Estes mtodos encontraram grande resistncia por

parte da comunidade cientfica, mas gradualmente foram amplamente aceitos e a sua validade na

prtica tem sido demonstrada constantemente. Um exemplo um estudo publicado em 2007 pela

ABRF (The Association of Biomolecular Resource Facilities), no qual foram comparadas vrias

abordagens com marcadores isotpicos e livre de marcador com gis 2D para anlise cega de um

conjunto de misturas de protenas, e os resultados mostraram claramente que o mtodo livre de

marcador foi bem sucedido (BECKER; BERN 2011).

Portanto, o conhecimento do proteoma sseo em resposta ao tratamento com F em

linhagens de camundongos com diferente susceptibilidade ao F seria til para compreender a

influncia gentica na regulao dos processos de remodelao ssea pelo F. Trata-se de um

estudo de grande relevncia, pois, como foi relatado acima, nem todos os pacientes com

osteoporose respondem ao tratamento com F (DEQUEKER; DECLERCK 1993), o que um dos


maiores entraves do uso do F no tratamento e preveno desta patologia. Deve ser destacado

ainda que a osteoporose uma patologia altamente prevalente, cujo tratamento demanda um dos

maiores gastos em Sade Pblica (BORGSTROM et al. 2007). Nos EUA, o custo anual do

tratamento de osteoporose e fraturas em 2008 foi estimado em 22 bilhes de dlares (BLUME;

CURTIS 2011). O tratamento com F tem um custo significativamente mais baixo que as demais

terapias hoje disponveis para o tratamento/preveno da osteoporose. Dessa maneira, a

identificao de pacientes sensveis aos efeitos anablicos do F no tecido sseo de extrema

importncia para que esta terapia possa ser indicada com segurana para estes pacientes.


2 REVISO DE LITERATURA

2.1 EFEITOS DO F NO TECIDO SSEO

2.1.1 Efeitos fsico-qumicos do F na matriz mineral ssea

Aps a comprovao de que comunidades com gua naturalmente fluoretada tm menor

incidncia de crie, muitos pases iniciaram programas de fluoretao artificial da gua, nos quais

aproximadamente 1 mg/L (ppm) de F adicionado na gua de beber (LUDLOW; LUXTON;

MATHEW 2007).

A gua fluoretada tem sido utilizada na preveno da crie dentria, mas tambm pode

afetar o osso positiva ou negativamente. Uma reduo no risco de fratura ssea tem sido relatado

em populaes consumindo gua fluoretada a 1 mg/L (LI et al. 2001). Em adio, a anlise de 33

estudos australianos forneceu evidncias substanciais de que uma concentrao de at 1 mgF/L

no produz efeitos adversos na resistncia ssea, densidade mineral ssea ou incidncia de

fratura, e com base em cinco estudos transversais concluiu-se que o uso de gua fluoretada a 1

mgF/L teve um efeito favorvel sobre a densidade ssea (DEMOS et al. 2001). A investigao

dos efeitos de uma longa exposio ao F encontrou uma densidade ssea significativamente

maior em mulheres que residiam em uma rea com 1 mgF/L comparada com as que residiam em

uma rea com 0,1 mgF/L, indicando um efeito favorvel da gua fluoretada durante os anos de

crescimento (ARNOLD et al. 1997). Por outro lado, outro estudo, no qual a gua de beber tinha

sido fluoretada (1 mg/L) por um perodo superior a 30 anos, no encontrou nenhuma influncia

na densidade ssea mas relatou a possibilidade de reduo de fraturas de bacia em indivduos

idosos com osteoporose (LEHMANN et al. 1998). Crianas com 14-15 anos que residiam em

rea com alta concentrao de F na gua (3 mgF/L), apresentaram valores de densidade ssea

maior do que as crianas com a mesma faixa etria residindo em reas com baixa concentrao

de F (0,19 mgF/L) (GROBLER et al. 2009). Entretanto, uma concentrao na gua de beber

maior que 4,32 mgF/L aumentou o risco de fratura (LI et al. 2001). Estudos utilizando altos

nveis de sais fluoretados (> 50 mg/dia) tm encontrado resultados no conclusivos na preveno

de fraturas (MEUNIER et al. 1998; RIGGS et al. 1990).


Estudos em pacientes com osteoporose tm sugerido que baixas doses de F resultam em um

aumento moderado na BMD, o que pode ser vantajoso em termos de reduo do potencial de

fratura ssea (RINGE et al. 1999). Terapias com baixas doses de monofluorfosfato de sdio

(MFP) (10-20 mg/dia) associado ao clcio parecem diminuir o risco de fratura nas vrtebras e

aumentar a BMD na espinha dorsal, lombar e fmur (REGINSTER et al. 1998; RINGE et al.

1999). Ratos tratados com 80 mM/dia de NaF ou MFP por 30 dias produziram um aumento

significativo na massa ssea (BRUN; PERA; RIGALLI 2010). O F pode ter um efeito positivo na

densidade axial do osso, mas alteraes similares no foram observadas no osso cortical

(DEQUEKER; DECLERCK 1993). Existem indcios de que o aumento da BMD do osso

trabecular ocorra s expensas do osso cortical (RIGGS et al. 1990).

Em relao s propriedades mecnicas, algumas evidncias indicam que o F pode produzir

um osso mais frgil do que um osso normal. Foi demonstrado que o tratamento tanto de ratos

quanto de coelhos com F (com uma dose que no afeta a mineralizao) levou a uma diminuio

na resistncia ssea, apesar do aumento na massa ssea e na frao do volume de osso

(SOGAARD et al. 1995). O tratamento de ossos de camundongos ex vivo, os quais so

histologicamente similares a ossos de ratos, produz efeitos similares nas propriedades mecnicas.

A imerso do fmur de camundongos em tampo com NaF 1,5 M por 12 h diminuiu a resistncia

toro e dureza do osso total e aumentou o deslocamento da fratura (SILVA; ULRICH 2000).

Efeitos similares foram observados para espcimes de osso cortical bovino que foram testados

uniaxialmente. Os ossos imersos em NaF (0,145, 0,5 ou 2 M) apresentaram menor resistncia e

dureza, e uma maior deformao comparado ao osso no tratado, tanto na tenso (DEPAULA et

al. 2002; KOTHA et al. 1998) quanto na compresso (WALSH; GUZELSU 1994). Com altas

doses de F (2,0 M NaF), um aumento significativo foi tambm observado na dureza (DEPAULA

et al. 2002). A concentrao de F, pH e o tempo de imerso afetam a ultraestrutura e a resposta

mecnica (NYMAN; REYES; WANG 2005). Em adio, o tratamento in vivo com diferentes

concentraes de F (25, 50 e 100 mgF/L) alterou negativamente as propriedades mecnicas na

linhagem de camundongos A/J, mas nenhuma diferena significativa foi encontrada para a

linhagem 129P3/J (MOUSNY et al. 2006).

Diferenas na estrutura cristalina, pela formao de cristais de fluorapatita, poderiam ser

uma das explicaes para a potencial associao entre exposio ao F e risco de fratura ssea. O

F pode substituir os grupos hidroxila com efeitos controversos na resistncia ssea (LI et al.


2001) e tamanho do cristal (MOUSNY et al. 2008). Muitos autores acreditam que o comprimento

do cristal no alterado pelo tratamento com F ((EANES; HAILER 1998). Por outro lado, a

maioria dos autores relata um aumento na largura do cristal (CHACHRA et al. 1999; EANES;

MEYER 1978; EANES; HAILER 1998; MOUSNY et al. 2008; TURNER et al. 1997).

Espectroscopia na regio do infravermelho (FTIR) de ossos de camundongos controle e tratados

com F (in vivo) mostrou que os ltimos apresentaram maior cristalinidade, menos carbonato tipo

A (CO3 substitui OH na apatita) e diferena no tamanho da clula unitria (GRYNPAS; REY

1992). A anlise de difrao de raio-X de osso de coelho tratado com F tambm mostrou aumento

na largura do cristal (CHACHRA et al. 1999).

Em adio, evidncias experimentais tm sugerido que o F altera a ligao interfacial entre

o mineral e o colgeno (WALSH; GUZELSU 1994). O osso um material anisotrpico no

homogneo composto por uma fase mineral (hidroxiapatita) embebida em uma matriz orgnica

(colgeno tipo I e protenas no colgenas). Assim como em outros compsitos, a resistncia do

osso depende de vrios fatores como frao do volume, propriedade material, orientao das

fibras e da interao interfacial (WALSH; GUZELSU 1994). Dentre esses fatores, a resistncia

mecnica do osso parece derivar principalmente da interface entre o colgeno e o mineral

(CATANESE et al. 1999). A ligao interfacial entre o mineral e os constituintes orgnicos

baseada, em parte, nas interaes eletrostticas entre as cargas negativas da matriz orgnica e as

cargas positivas na superfcie do mineral. Tem sido demonstrado que o F altera a interao

orgnico-mineral, influenciando nas propriedades mecnicas do osso sob tenso (WALSH;

GUZELSU 1994). Um estudo utilizou espalhamento de raio-x a baixo ngulo (SAXS) para

analisar bipsias de ossos de mulheres normais (controle) e com osteoporose (tratadas com 60 mg

NaF/dia por 1-2 anos). Os resultados sugerem que, mediante tratamento com NaF, cristais mais

largos so formados, os quais provavelmente no esto associados com fibras colgenas e,

portanto no contribuem para a resistncia mecnica, apesar de aumentar a BMD (FRATZL et al.

1994). Resultados semelhantes foram encontrados em um estudo de ossos fluoretados in vitro que

demonstraram que a adio de ons de F ao osso promoveu uma falha na ligao entre o colgeno

e o mineral, alterando as propriedades mecnicas do osso compresso e tenso (WALSH et al.

1994). Outro estudo com coelhos tratados com 16 mgF/dia na gua de beber por 6 meses

demonstrou que apesar de aumentar a massa ssea e a dureza, o tratamento com F alterou

negativamente as propriedades mecnicas do osso. Essa diminuio na resistncia ssea no


estava associada com uma mineralizao anormal, mas sim com o aumento do tamanho do cristal

que se mostrou inversamente proporcional resistncia flexo do fmur (TURNER et al. 1997).

Esses resultados enfatizam o delicado equilbrio entre o aumento da massa ssea e o

enfraquecimento das propriedades ssea resultantes do efeito do F no osso (FRATZL et al. 1996).

2.1.2 Efeito do F na matriz orgnica e clulas sseas

Embora muitas vezes seja considerado como uma estrutura esttica e inerte, o osso um

tipo de tecido conjuntivo dinmico e altamente especializado. Trs tipos diferentes de clulas

podem ser encontrados no tecido sseo: osteoblastos, osteoclastos e ostecitos. Os osteoblastos se

originam a partir de clulas-tronco mesenquimais multipotentes presentes na medula ssea

(LONG 2001), e so responsveis pela produo da matriz extracelular (ECM) ssea. Alm disso,

regulam a mineralizao da matriz ssea recm-formada (osteide) e a diferenciao e atividade

dos osteoclastos (HOFBAUER et al. 2000). A fuso de clulas mononucleares hematopoiticas

origina os osteoclastos, clulas gigantes multinucleadas equipadas com um conjunto de enzimas

proteolticas. Os osteoclastos so responsveis pela degradao e remodelao ssea, e so

capazes de dissolver tanto o mineral como a matriz orgnica ssea (TEITELBAUM 2000). Os

ostecitos so as clulas mais abundantes no osso, representando 90% de todas as clulas no

esqueleto de um adulto. So formados a partir de osteoblastos maduros que criam uma rede de

interligao atravs da matriz ssea, e essa comunicao com as clulas adjacentes feita por

meio de junes comunicantes (tipo gap) (KLEIN-NULEND; NIJWEIDE; BURGER 2003).

Estudos in vitro e in vivo tm demonstrado que o F pode agir tanto nos osteoblastos como nos

osteoclastos (EVERETT 2011). A administrao de F em cultura de osteoblastos de rato

promoveu inibio da transformao da fase S para a fase G2/M, aumento da apoptose,

diminuio no RNAm para o COL1A1, e menor expresso do colgeno tipo I (YAN et al. 2011).

Lau e Baylink (2003) sugeriram que a inibio da TRACP tipo 5 osteoblstica estaria envolvida

no mecanismo molecular da ao mitognica do F, aumentando a proliferao e diferenciao

dos osteoblastos e a formao ssea. Embora existam inmeros estudos sobre a ao anablica do

F, sabe-se pouco em relao ao seu mecanismo de ao na osteoclastognese (EVERETT 2011).

Camundongos da linhagem C3H/HeJ tratados com 50 ppm F demonstraram um aumento na

osteoclastognese (YAN et al. 2007). Estudos in vitro tm demonstrado que o F pode inibir a


funo de osteoclastos em concentraes entre 0,5 a 1 mM (OKUDA; KANEHISA; HEERSCHE

1990) ou prximas aos nveis fisiolgicos (15 ppm F, equivalendo aproximadamente a 0,8 mM)

(TAYLOR; BOYDE; JONES 1989).

A matriz extracelular produzida pelas clulas sseas mineralizada, e contm cerca de 25%

de matriz orgnica, incluindo as clulas sseas, 5% de gua e 70% de minerais inorgnicos

(hidroxiapatita) (LAMMI; HAYRINEN; MAHONEN 2006). A matriz orgnica do osso ocupa 32%

do volume e consiste principalmente de colgeno tipo I (90%), com pequena, mas importante

concentrao de protenas no-colagnicas como osteocalcina e osteonectina, as quais participam

do processo de mineralizao (NYMAN; REYES; WANG 2005). A ligao cruzada do colgeno

uma importante caracterstica do osso no apenas porque organiza as fibrilas, mas tambm

porque contribui para o processo de mineralizao, afetando o comportamento mecnico do osso

(NYMAN; REYES; WANG 2005). Em um estudo in vitro, osteoblastos de calvria de ratos

tratados com 221 mg/L NaF na gua de beber por 2 meses secretaram uma menor quantidade de

colgeno tipo I quando comparados com o controle (MIAO et al. 2002). Um estudo com cultura

de clulas sseas de rato incubadas em 10-5

e 10-7

M de F demonstrou que o F tambm pode

influenciar as metaloproteinases da matriz (MMPs), afetando a composio da matriz remodelada

e a subsequente mineralizao (WADDINGTON; LANGLEY 2003).

As principais funes do osso so fornecer suporte para as partes moles e proteger rgos

vitais, proporcionar apoio mecnico para a atividade muscular e servir de depsito de clcio,

fosfato e outros ons, contribuindo para a homeostase mineral a nvel sistmico (LAMMI;

HAYRINEN; MAHONEN 2006). Em relao ao F, em condies fisiolgicas, alguns minutos

aps sua ingesto, ele rapidamente absorvido, e um aumento nos seus nveis plasmticos j so

detectados. Depois que a maior parte da dose foi absorvida, os nveis no plasma e nos tecidos

moles mostram um declnio rpido devido incorporao contnua pelo osso e excreo

urinria (BUZALAF; WHITFORD 2011). Em recm-nascidos e crianas pequenas, a quantidade

de F retida nos tecidos calcificados maior que 50% da ingesto diria (LUDLOW; LUXTON;

MATHEW 2007). Aproximadamente 99% do F presente no organismo est associado com

tecidos calcificados. No entanto, o F nos tecidos calcificados no est ligado irreversivelmente,

principalmente aquele recentemente adquirido, que est localizado nos cristalitos na superfcie

ssea, os quais podem fazer trocas isoinicas ou heteroinicas (com outros nions do fluido


extracelular). Ao longo do tempo, o F em regies profundas do osso pode ser liberado durante o

processo normal de remodelao ssea (LEITE et al. 2008; WHITFORD 1996).

As apatitas biolgicas, componentes mineral do osso normal, so caracterizadas pela

presena de constituintes menores, como ons magnsio (Mg), cloro (Cl), ou F. Atualmente, os

efeitos do F na migrao celular e proliferao de clulas sseas esto sendo explorados na

medicina e odontologia, usando compostos que contenham F como material de enxerto sseo

(INOUE et al. 2011). A implantao de fluorapatita (FAp) com baixa concentrao de F (0,48%

por peso) em tbia de ratos promoveu a migrao de macrfagos, a ligao, proliferao e

expresso fenotpica das clulas sseas, levando a formao de osso novo diretamente sobre as

partculas (INOUE et al. 2011). Entretanto, com uma alta porcentagem de F (2,23% por peso), o

aumento de novo osso foi menor e mais lento (INOUE et al. 2005).

2.2 INFLUNCIA GENTICA NA RESPOSTA DO TECIDO SSEO AO F

Embora seja de grande relevncia, a concentrao de F no parece ser o nico fator que

influencia o seu efeito no tecido sseo (MOUSNY et al. 2006). Durante mais de quatro dcadas,

o F vem sendo estudado como um agente teraputico em mulheres para o tratamento de

osteoporose ps-menopausa (REGINSTER et al. 1998; RIGGS et al. 1990; RINGE et al. 1999).

Um tratamento apropriado de F (25 mg por dia durante 1 ano, seguidas por um perodo de 2

meses sem o F) parece reduzir fratura no osso espinhal em mulheres que apresentaram pelo

menos uma fratura prvia (RUBIN et al. 2001). Entretanto, aproximadamente um tero dos

pacientes com osteoporose que recebem terapia de F no respondem ao tratamento

(DEQUEKER; DECLERCK 1993). Existem evidncias crescentes de que a sensibilidade do

tecido trabecular tanto para estmulos catablicos como anablicos influenciada pela gentica e

isto poderia em parte explicar porque vrios tratamentos profilticos para osteoporose ssea no

so efetivos em todos os indivduos (JUDEX; DONAHUE; RUBIN 2002).

Em adio, estudos epidemiolgicos tm relatado dificuldades para determinar o efeito da

exposio prolongada ao F em baixas concentraes devido grande variabilidade em

populaes urbanas heterogneas (CHACHRA et al. 2010). Cerca de 40% da populao em reas

com gua naturalmente fluoretada com altos nveis no so afetadas por fluorose esqueltica

(CHOUBISA; CHOUBISA; CHOUBISA 2001). Vrios estudos tm demonstrado uma diferena


na prevalncia de fluorose dentria e esqueltica dependendo do sexo, idade e a origem da

populao estudada, apesar do fato de que todos os indivduos tenham recebido a mesma

concentrao de F (BELTRAN-AGUILAR; GRIFFIN; LOCKWOOD 2002; BUTLER;

SEGRETO; COLLINS 1985; GROBLER et al. 2009; VIEIRA et al. 2005; YODER et al. 1998).

Estes achados sugerem que determinantes genticos podem influenciar a susceptibilidade

individual ou os efeitos de resistncia ao F (MOUSNY et al. 2006). Para testar esta hiptese,

Everett et al. (2002) estudaram 12 linhagens de camundongos e observaram variaes no incio e

na severidade da fluorose dentria. Algumas linhagens desenvolveram fluorose dentria severa

rapidamente, enquanto outras foram minimamente afetadas, com menor grau de fluorose

dentria. As linhagens foram agrupadas em resistentes, intermedirias e sensveis aos efeitos do

F.

Para avaliar a influncia gentica nos efeitos do F no metabolismo sseo, Mousny et al.

(2006) utilizaram trs linhagens de camundongos com diferentes susceptibilidades para

desenvolver fluorose dentria (A/J, susceptvel, 129P3/J, resistente e SWR/J,

intermediria). Os camundongos da linhagem 129P3/J (resistente), expostos a baixas doses

de F, apresentaram uma maior concentrao de F no osso em relao linhagem A/J

susceptvel, indicando uma influncia gentica no acmulo de F no osso. Embora no estudo

conduzido por Mousny et al. (2006) as linhagens tenham demonstrado um aumento significativo

dose-dependente da concentrao de F no fmur e na vrtebra, como o tratamento com F no

afetou nem a macro arquitetura ssea, nem a BMD nas trs linhagens, esses fatores no poderiam

explicar as variaes nas propriedades mecnicas sseas observadas entre as linhagens avaliadas,

ou seja, alteraes significativas na qualidade ssea na linhagem A/J susceptvel, moderadas

na linhagem SWR/J intermediria e ausncia de alteraes na linhagem 129P3/J resistente.

Em um estudo posterior (MOUSNY et al. 2008), verificou-se que o aumento da largura do cristal

foi diretamente proporcional dose de F para todas as linhagens, sendo que a linhagem 129P3/J

(resistente) apresentou o menor cristal comparado com as outras duas linhagens independente da

dose. O tamanho reduzido dos cristais sugere um crescimento mais lento, o que poderia ser

devido maior fora de ligao na interface orgnica/inorgnica, reduzindo o fluxo de ons clcio

e fosfato para a superfcie do cristal. Isto poderia explicar a ausncia de alteraes nas

propriedades mecnicas sseas na linhagem 129P3/J, mesmo sob exposio a altas doses de F

(MOUSNY et al. 2008).


Outra possvel explicao para as diferentes respostas mecnicas ao F das trs linhagens

estudadas seria um efeito do F nas clulas sseas. Mousny et al. (2008) demonstraram que alm

dos efeitos fsicos e qumicos no cristal sseo, o tratamento com 100 ppm F aumentou o volume e

a superfcie osteide para as trs linhagens. O aumento da formao de osteide suporta a teoria

de que o F estimula a atividade osteoblstica e atrasa a mineralizao do osso recm-formado

(MOUSNY et al. 2008). O emprego da protemica quantitativa permitiria uma melhor

investigao das protenas alteradas nas diferentes linhagens e poderia ajudar a esclarecer melhor

os mecanismos moleculares envolvidos na resposta do osso ao F.

2.3 ANLISE PROTEMICA QUANTITATIVA

A anlise protemica, desenvolvida h pouco mais de uma dcada, surgiu como uma

abordagem sistemtica para o mapeamento qualitativo e quantitativo de todo o proteoma,

diferindo das abordagens moleculares convencionais que so capazes de analisar um nmero

limitado de protenas (ZHANG et al. 2010). Alm de estudos protemicos sobre o perfil global de

protenas presentes em um sistema em um dado momento, o nmero de estudos trazendo

informaes sobre o nvel de expresso protica tambm vem crescendo nos ltimos anos (ZHU;

SMITH; HUANG 2010). A quantificao de diferenas entre dois ou mais estados fisiolgicos de

um sistema biolgico uma das tarefas mais importantes, assim como um dos maiores desafios

das tcnicas protemicas (BANTSCHEFF et al. 2007).

A anlise de uma mistura complexa de protenas requer mtodos para separar, identificar e

quantificar protenas, assim como ferramentas para integrar e analisar todos os dados

(AEBERSOLD; MANN 2003). Dentre as mltiplas tcnicas e instrumentos, algumas estratgias

vm sendo comumente utilizadas (Figura 1) (AEBERSOLD; MANN 2003; COLUCCI-

D'AMATO et al. 2011; SCHULZE; USADEL 2010).


Figura 1 Representao esquemtica das estratgias baseadas em 2D-PAGE e LC/MS mais comumente

empregadas em anlise protemica quantitativa. Adaptado de: (COLUCCI-D'AMATO et al. 2011).

A primeira estratgia consiste em um mtodo clssico para anlise quantitativa de misturas

complexas de protenas que combina 2D-PAGE e MS. A separao das protenas feita em duas

dimenses. Na primeira dimenso, as protenas so separadas de acordo com seu pI (ponto

isoeltrico), utilizando a focalizao isoeltrica. Posteriormente, na segunda dimenso, so

separadas de acordo com seu volume molecular, empregando eletroforese em gel de

poliacrilamida na presena de SDS, resultando em uma separao bidimensional contendo spots

de protenas que diferem em tamanho molecular e/ou pI (GRAVES; HAYSTEAD 2002;

O'FARRELL 1975; PANDEY; MANN 2000). Aps a separao, as protenas podem ser

visualizadas no prprio gel por mtodos de colorao como o azul brilhante de Coomassie,

nitrato de prata, compostos fluorescentes, autorradiografia ou deteco com imunoqumicos

(CANDIANO et al. 2004; PANDEY; MANN 2000). Aps colorao, os gis so escaneados, e


com o uso de um software especial, os spots em cada gel so alinhados e sua intensidade

individual mensurada (GRAVES; HAYSTEAD 2002; ISSAQ; VEENSTRA 2008; PANDEY;

MANN 2000). As protenas de interesse so excisadas do gel, digeridas, usualmente com tripsina,

e identificadas por MS ou espectrometria de massas tandem (MS/MS) (GRAVES; HAYSTEAD

2002; PENG; GYGI 2001). O desenvolvimento da eletroforese de fluorescncia diferencial em

gel bidimensional (2D-DIGE) trouxe maior acurcia e confiabilidade em relao quantificao

de protenas, pois as amostras comparadas correm juntas no mesmo gel, eliminando a potencial

variao dos gis em corridas distintas (LILLEY; FRIEDMAN 2004). Entretanto, com certa

frequncia spots no gel 2D podem conter mais do que uma protena, tornando a quantificao

ambgua, uma vez que no mostra qual dessas protenas em um mesmo spot sofreu alterao na

expresso. Alm disso, o gel 2D est sujeito s limitaes impostas pelo mtodo, as quais

incluem faixa dinmica limitada, problema na reprodutibilidade, dificuldades para analisar

protenas de membrana devido a sua alta hidrofobicidade, identificar protenas pouco abundantes

e detectar protenas com peso molecular e valores de pI extremos (HERBERT et al. 2001; ZHU;

SMITH; HUANG 2010).

Na segunda estratgia esto as chamadas tcnicas de protemica shotgun que consistem

na anlise direta dos peptdeos provenientes de uma mistura complexa de protenas, digeridas

(protemica do tipo bottom-up) ou no (protemica do tipo top-down) (ENG; MCCORMACK;

YATES 1994; MOTOYAMA; YATES 2008). Neste mtodo a separao realizada a nvel de

peptdeos ao invs de ser a nvel de protenas, como era feito para o gel 2D (LINK et al. 1999;

WASHBURN; WOLTERS; YATES 2001). Os fragmentos peptdicos so separados por LC

MS/MS (cromatografia lquida - espectrometria de massas tandem), e empregando algoritmos

computacionais, como SEQUEST ou MASCOT, realizada uma busca dos espectros que

possuam sequncias equivalentes quelas existentes nos bancos de dados para identificar as

protenas presentes na mistura (MOTOYAMA; YATES 2008; PERKINS et al. 1999). Um marco

para esta abordagem ocorreu em 2001, quando 1484 protenas do lisado celular de levedura

foram identificadas utilizando cromatografia lquida multidimensional combinada com

espectrometria de massas tandem (MDLC MS/MS) (WASHBURN; WOLTERS; YATES

2001). Atualmente, esta metodologia conhecida como tecnologia multidimensional para

identificao de protenas (MudPIT), e combina duas ou mais formas de LC para melhorar o

poder de resoluo e a separao dos fragmentos peptdicos antes de submet-los para anlise no


espectrmetro de massas (MOTOYAMA; YATES 2008). Uma variedade de separaes na

primeira dimenso, nem todas baseadas em LC, tm sido utilizadas: cromatografia por excluso

molecular (SEC) (OPITECK; JORGENSON 1997); troca catinica forte (SCX) (JIANG et al.

2007; LINK et al. 1999; WASHBURN; WOLTERS; YATES 2001); troca aninica forte (SAX)

(ZHOU et al. 2011); eletroforese desnaturante em gel de poliacrilamida em SDS (SDS-PAGE)

(BALCERZAK et al. 2008) e tcnicas de focalizao isoeltrica (IEF) (CARGILE et al. 2005;

CHEN et al. 2002).

Uma ampla variedade de combinaes de tcnicas cromatogrficas em inmeras dimenses

teoricamente possvel, mas consideraes prticas na interface dos mtodos com o MS limita o

uso de muitas delas. Importantes questes incluem a quantidade de tempo necessrio para as

anlises, tipo de tampo usado para separao prvia ao MS, e uma integrao efetiva entre as

duas dimenses e ao MS (MOTOYAMA; YATES 2008). O ltimo passo, o qual est geralmente

acoplado diretamente ao MS, frequentemente a cromatografia lquida em fase reversa (RPLC)

por apresentar uma alta resoluo na separao dos peptdeos, ser efetivo na remoo de sal das

amostras, e compatvel com a deteco por ESI (Ionizao por eletrospray) e MS (CLAESSENS;

VAN STRATEN 2004).

Vrios mtodos utilizando marcadores isotpicos estveis tm sido desenvolvidos para

anlise protemica quantitativa do tipo shotgun (Figura 1). Dentre esses mtodos esto

marcadores utilizados em cultura de clulas (in vivo) como SILAC - Stable Isotope Labeling by

Amino Acids in Cell Culture (anlise da razo de istopos estveis em aminocidos em cultura de

clulas) e 15

N/ 14

N marcadores metablicos, alm dos marcadores para estudos in vitro, como

ICAT - Isotope-Coded Affinity Tag (marcador de afinidade enriquecido isotopicamente), MCAT -

Mass-Coded Abundance Tagging, ICPL - Isotope Coded Protein Labeling (protenas codificadas

com marcadores isotpicos), 18

O / 16

O marcadores enzimticos, TMT - Tandem Mass Tags

(marcadores de massa sequencial), iTRAQ - Isobaric Tags for Relative and Absolute

Quantification (marcador isobrico para quantificao relativa e absoluta), alm de outros

marcadores qumicos (BANTSCHEFF et al. 2007; BECKER; BERN 2011; CHEN; YATES

2007; CHONG et al. 2010; COLUCCI-D'AMATO et al. 2011; SESHI 2006; UNWIN;

GRIFFITHS; WHETTON 2010). Apesar da valiosa contribuio aos estudos das alteraes

proteicas em misturas complexas, muitas tcnicas que utilizam marcadores isotpicos apresentam

potenciais limitaes como o aumento do tempo e complexidade no preparo das amostras,


necessidade de amostra altamente concentrada, alto custo dos reagentes, marcaes incompletas,

interferncia do sinal devido co-eluio de componente de massa similar, e a necessidade de um

software especfico para a quantificao (CHELIUS; BONDARENKO 2002; MATTHIESEN;

CARVALHO 2010; MUELLER et al. 2008; SCHULZE; USADEL 2010; ZHU; SMITH;

HUANG 2010). Alm disso, dentre os mtodos citados, apenas TMT e iTRAQ permitem a

comparao de mltiplas (at 8) amostras ao mesmo tempo. Os outros mtodos utilizando

marcadores podem comparar somente a quantidade relativa de protenas entre 2 ou 3 amostras

diferentes (BANTSCHEFF et al. 2007; SCHULZE; USADEL 2010).

2.3.1 Anlise protemica quantitativa livre de marcadores (Label-free)

Com a finalidade de tentar resolver as questes existentes nos mtodos utilizando

marcadores, houve um aumento no interesse nas tcnicas de anlise protemica quantitativa do

tipo shotgun livre de marcadores (label-free) (CHEN; YATES 2007; COLUCCI-D'AMATO et

al. 2011; PORTEUS et al. 2011).

De uma forma geral, todos os mtodos de anlise protemica quantitativa livre de

marcadores incluem os seguintes passos fundamentais: preparo da amostra (extrao da protena,

reduo, alquilao e digesto); separao dos peptdeos proteolticos utilizando cromatografia

lquida uni ou bidimensional (LC ou LC/LC) e anlise por MS/MS; anlises dos dados incluindo

identificao peptdeo/protena, quantificao, e anlise estatstica (ZHU; SMITH; HUANG

2010). Nos mtodos que utilizam marcadores, diferentes amostras de protenas antes ou aps a

digesto so marcadas com os respectivos istopos e combinadas em um nico tubo e o pool

analisado em uma nica corrida de LC-MS/MS ou LC/LC- MS/MS. Em contraste, nos mtodos

quantitativos livre de marcadores, cada amostra preparada separadamente, e ento submetida

individualmente corrida de LC-MS/MS ou LC/LC- MS/MS (ZHU; SMITH; HUANG 2010).

Os mtodos para a quantificao de protenas esto usualmente baseados nas alteraes da

intensidade dos ons (reas ou alturas dos picos dos peptdeos na cromatografia), e/ou na

contagem dos espectros das protenas identificadas aps anlise de MS/MS (BANTSCHEFF et

al. 2007; BECKER; BERN 2011). A intensidade do pico do peptdeo ou a contagem dos

espectros so determinadas individualmente para cada corrida LC-MS/MS ou LC/LC-MS/MS e


alteraes na abundncia da protena so calculadas por comparao direta entre as diferentes

anlises (ZHU; SMITH; HUANG 2010).

2.3.1.1 Quantificao Relativa por Intensidade de Sinal dos ons de Peptdeos

A quantificao relativa por intensidade do pico de LC-MS baseia-se somente no MS (no

usa dados do MS/MS) (BECKER; BERN 2011). Os valores de m/z obtidos no MS para todos os

ons so detectados e suas intensidades de sinal so registradas em um tempo determinado (ZHU;

SMITH; HUANG 2010). Tem sido relatado que a intensidade do sinal de uma ionizao por

eletrospray (ESI) est altamente correlacionada concentrao do on. Portanto, os nveis

relativos dos peptdeos entre as amostras podem ser determinados diretamente pelas intensidades

dos seus picos (VOYKSNER; LEE 1999).

Para avaliar a hiptese de que a rea do pico de peptdeos de uma determinada protena

estaria relacionada com a sua concentrao, Chelius e Bondarendko (2002) realizaram o primeiro

estudo utilizando a quantificao livre de marcadores de peptdeo/protena via intensidade do

pico em LC-MS. Para tanto, 10 fmol-100 pmol de mioglobulina digerida foram aplicados no

nano-LC e analisados por LC-MS/MS. Aps calcular as reas dos picos cromatogrficos dos

peptdeos identificados, observou-se que as reas dos picos aumentavam com o aumento da

concentrao do peptdeo injetado. As reas dos picos de todos os peptdeos identificados da

mioglobulina foram combinadas e plotadas contra a quantidade de mioglobulina, e o resultado

mostrou uma correlao linear entre a rea do pico e a concentrao de protena (r2

= 0,991). Em

adio, uma forte correlao entre as reas dos picos cromatogrficos e a concentrao

peptdeo/protena tambm foi observada quando mioglobulina de cavalo foi adicionada em soro

humano e os fragmentos digeridos foram detectados por LC-MS/MS (CHELIUS;

BONDARENKO 2002).

Embora tenha sido comprovado que a quantificao relativa dos peptdeos poderia ser

obtida pela comparao direta da intensidade do pico de cada on peptdico em mltiplos

conjuntos de dados do LC-MS, a aplicao desse mtodo para anlise das alteraes de expresso

de protenas presentes em amostras biolgicas complexas apresenta algumas limitaes (ZHU;

SMITH; HUANG 2010). Um dos maiores desafios est no preparo da amostra e no

fracionamento quando mltiplas amostras so comparadas quantitativamente, exigindo que o


preparo e todos os passos subsequentes sejam rigorosamente idnticos para todas as amostras

(COLUCCI-D'AMATO et al. 2011). A variao experimental decorrentes do preparo e injeo da

amostra faz com que uma mesma amostra possa apresentar diferenas nas intensidades dos picos

dos peptdeos em diferentes corridas (ZHU; SMITH; HUANG 2010). Para corrigir esse tipo de

variao, alm de tcnicas meticulosas e reprodutveis para o preparo da amostra, necessrio

fazer uma normalizao (BECKER; BERN 2011). O erro experimental pode tambm ser

minimizado pela adio de padres na amostra (COLUCCI-D'AMATO et al. 2011). Outra

limitao seria o fato de que qualquer desvio experimental no tempo de reteno e m/z ir

significativamente prejudicar a acurcia na comparao dos mltiplos conjuntos de dados do LC-

MS. Alteraes cromatogrficas podem ocorrer como resultado de mltiplas injees da amostra

em uma mesma coluna para cromatografia lquida em fase reversa. Consequentemente,

comparaes entre picos desalinhados resultaro em uma grande variabilidade e inacurcia na

quantificao. Portanto, uma alta reprodutibilidade do LC-MS e um cuidadoso alinhamento nos

picos cromatogrficos so necessrios e crticos para este mtodo comparativo (ZHU; SMITH;

HUANG 2010). Alm disso, devido grande quantidade de dados coletados durante as anlises

de LC-MS/MS de misturas complexas de protenas, algoritmos computacionais especficos so

necessrios para automatizar o alinhamento dos picos e fazer a comparao dos mesmos (HIGGS

et al. 2005).

A fim de resolver essas questes, foram realizados estudos posteriores para automatizar o

processamento dos dados em uma escala global (HIGGS et al. 2005; WANG et al. 2003;

WIENER et al. 2004). O primeiro passo foi melhorar a deteco do pico, ou seja, distinguir o

pico de um peptdeo do sinal de rudo e dos seus picos vizinhos (ZHU; SMITH; HUANG 2010).

Algumas anlises automatizadas reduzem a complexidade dos dados atravs da extrao e

comparao de picos espectrais e cromatogrficos. Isto pode produzir bons resultados, mas como

qualquer tentativa de separar o sinal do rudo, corre-se o risco de perder caractersticas

importantes dos dados (WIENER et al. 2004). Em adio, os tempos de reteno do LC-MS

foram cuidadosamente ajustados para corrigir o alinhamento dos picos de massa com o seu

correspondente entre as mltiplas corridas de LC-MS (ZHU; SMITH; HUANG 2010). O

alinhamento dos picos pode ser feito atravs de peptdeos que funcionam como pontos de

referncia (landmark) entre duas ou mais amostras a serem comparadas (HIGGS et al. 2005). Foi

necessria tambm a normalizao da intensidade do pico cromatogrfico (rea do pico ou altura)


para permitir uma maior acurcia no alinhamento e quantificao (ZHU; SMITH; HUANG

2010). Wang et al. (2003) desenvolveram o MassView software, que entre outras funes,

executa a normalizao comparando dois ou mais espectros para determinar a relao de

intensidade constante entre analitos invariveis. Outra alternativa seria a adio de compostos

exgenos para normalizar o mtodo de quantificao (WANG et al. 2003). Anlises estatsticas

foram empregadas para determinar a significncia das alteraes entre mltiplas amostras

(BECKER; BERN 2011; ZHU; SMITH; HUANG 2010). Atualmente, vrios softwares de cdigo

aberto (MapQuant, MZmine, MsInspect, OpenMs, MSight, SuperHirn, e PEPPeR) ou comercial

(Decyder MS GE Healthcare, SIEVE Thermo Electron, Elucidator Rosetta e ProteinLinx -

Waters) esto disponveis (ZHU; SMITH; HUANG 2010).

No presente estudo foi utilizado o SIEVE software 1.3 (Thermo Fisher Scientific, San Jose,

CA), que consiste em trs grandes passos: alinhamento, framing e identificao. Para o

alinhamento, emprega-se o algoritmo ChromAlign que minimiza os efeitos da variabilidade

cromatogrfica, tornando a anlise diferencial mais confivel. Neste primeiro passo, pares de

espectro de varredura completa so alinhados. No segundo passo, o SIEVE utiliza um processo

exclusivo (Recursive Base-Peak Framing) para gerar um nico frame para cada grupo de picos

com valor de m/z e intervalo de tempo de reteno especficos. Todos os picos acima de um dado

limite, de todos os dados brutos, so coletados de forma que nenhuma informao seja perdida.

Utilizando todos os dados brutos LC/MS para enquadrar os picos no frame em um espao

tridimensional (m/z versus tempo de reteno versus intensidade do pico), o SIEVE fornece um

resultado mais confivel comparado com abordagens que utilizam a manipulao dos picos

(peak-modeling). Para cada frame feita a reconstruo do cromatograma inico. Frame a frame,

o algoritmo determina se existe uma abundncia diferencial estatisticamente significante entre os

grupos controle e tratados. O programa fornece informaes teis como o valor de p, razo, o

desvio padro da razo, nmero de varreduras MS2, correlao MS/MS e razo normalizada do

cromatograma inico total. No ltimo passo, os peptdeos que apresentam diferenas

estatisticamente significativas so comparados contra um banco de dados para a identificao do

peptdeo e da protena. Essa funo de pr-filtrao reduz o nmero de componentes necessrios

a serem avaliados, reduzindo significativamente o tempo utilizado para identificao e tornando

mais rpido o processamento para descoberta de biomarcadores (THERMOSCIENTIFIC1 ;

THERMOSCIENTIFIC2 ; THERMOSCIENTIFIC3).


2.3.1.2 Quantificao Relativa por Contagem Espectral

No mtodo da contagem espectral, a quantificao relativa de protenas obtida pela soma

do nmero de espectros MS/MS identificados de uma mesma protena em cada um dos mltiplos

conjuntos de dados do LCMS/MS ou LC/LC-MS/MS. Isto possvel, pois um aumento da

abundncia da protena resulta no aumento do nmero de seus peptdeos proteolticos, e vice-

versa. Geralmente, este aumento no nmero de fragmentos trpticos resulta em um aumento da

cobertura da sequncia proteica, do nmero de peptdeos nicos identificados, e do nmero total

de espectros MS/MS identificados (contagem espectral) para cada protena (ZHU; SMITH;

HUANG 2010).

Adicionando protenas marcadoras s amostras de lisados celulares, Liu et al. (2004)

estudaram a correlao entre a abundncia relativa da protena e a cobertura da sequncia, o

nmero de peptdeos, e a contagem espectral. Foi demonstrado que entre todos os fatores de

identificao, somente a contagem espectral mostrou uma forte correlao linear com a

abundncia relativa da protena (r2

= 0,9997), apresentando uma faixa dinmica superior a 2

ordens de magnitude (LIU; SADYGOV; YATES 2004).

Portanto, a contagem espectral mostrou ser um simples, mas confivel ndice para

quantificao relativa de protenas (ZHU; SMITH; HUANG 2010). Entretanto, este mtodo se

torna pouco confivel quando o nmero de identificaes por protena muito pequeno, menor

ou igual a 5. Esse um dos problemas do mtodo, pois muitas protenas em uma mistura

complexa entram nessa categoria de identificaes limitadas, com poucos ou apenas um peptdeo

identificado, somado ao fato de que cada amostra precisa ser extensivamente submetida s

anlises MS/MS (BECKER; BERN 2011).

Ao contrrio da quantificao baseada na intensidade do pico cromatogrfico, a qual requer

algoritmos computa

efeito do fluoreto no osso de camundongos com diferentes

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