efeito do ambiente endócrino peri-ovulatório na expressão gênica e

MOANA RODRIGUES FRANA

Efeito do ambiente endcrino peri-ovulatrio na expresso gnica e proteica de

transportadores de glicose no endomtrio durante a primeira semana do ciclo estral em

bovinos de corte

Dissertao apresentada ao Programa de Ps-

Graduao em Reproduo Animal da

Faculdade de Medicina Veterinria e

Zootecnia da Universidade de So Paulo para

obteno do ttulo de Mestre em Cincias.

Departamento:

Reproduo Animal

rea de concentrao:

Reproduo Animal

Orientador:

Prof. Dr. Mario Binelli

De acordo:______________________

Orientador

So Paulo

2012

Obs: A verso original se encontra disponvel na Biblioteca da FMVZ/USP

Autorizo a reproduo parcial ou total desta obra, para fins acadmicos, desde que citada a fonte.

DADOS INTERNACIONAIS DE CATALOGAO-NA-PUBLICAO

(Biblioteca Virginie Buff Dpice da Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia da Universidade de So Paulo)

T.2745 Frana, Moana Rodrigues FMVZ Efeito do ambiente endcrino peri-ovulatrio na expresso gnica e proteica de transportadores de

glicose no endomtrio durante a primeira semana do ciclo estral em bovinos de corte / Moana Rodrigues Frana. -- 2012.

72 f. : il.

Dissertao (Mestrado) - Universidade de So Paulo. Faculdade de Medicina Veterinria e Zootecnia. Departamento de Reproduo Animal, So Paulo, 2013.

Programa de Ps-Graduao: Reproduo Animal. rea de concentrao: Reproduo Animal.

Orientador: Prof. Dr. Mario Binelli. 1. Bovinos. 2. tero. 3. Solute carrier protein. 4. Glicose. 5. Esterides sexuais. I. Ttulo.

FOLHA DE AVALIAO

Nome: FRANA, Moana Rodrigues

Ttulo: Efeito do ambiente endcrino peri-ovulatrio na expresso gnica e proteica de


bovinos de corte

Dissertao apresentada ao Programa de Ps-

Graduao em Reproduo Animal da Faculdade de

Medicina Veterinria e Zootecnia da Universidade

de So Paulo para obteno do ttulo Mestre em

Cincias

Data:______/______/______

Banca Examinadora

Prof. Dr. ____________________________________________________________________

Instituio: _________________________________Julgamento________________________

Prof. Dr. ____________________________________________________________________


Prof. Dr. ____________________________________________________________________


Ainda que eu falasse as lnguas dos homens e dos anjos, e no tivesse amor, seria como o metal que

soa ou como o sino que tine.

E ainda que tivesse o dom de profecia, e conhecesse todos os mistrios e toda a cincia, e ainda que

tivesse toda a f, de maneira tal que transportasse os montes, e no tivesse amor, nada seria.

1 Corntios 13:1,2

Dedicatria

Dedico este trabalho a minha me Teresinha Maria Rodrigues Frana, minha amiga, meu pilar, meu

exemplo, minha inspirao. Aquela cujo abrao cura qualquer dor, o carinho afasta qualquer angstia

e o olhar dizima qualquer medo. Aquela que me ensinou o valor do estudo, do conhecimento, da

honestidade e do carter. Aquela que me mostrou a importncia da f e da confiana. Aquela que

sempre torceu, participou, lutou, vibrou, chorou, sorriu. Aquela que me deu o melhor de si e lapidou o

melhor de mim. Aquela cujo amor to grande, to poderoso, to pleno que me trouxe at aqui.

Com muito amor, Obrigada!

AGRADEO

Primeiramente a Deus, O criador de tudo, minha fora maior, por ter me iluminado, me direcionado

me protegido e me abenoado, sempre.

Aos professores Guilherme de Medeiros Bastos, Karen Regina Lemos, Mikael Neumann, Paulo

Roberto Ost, DeonisiaMartinichen e RajDuggavathi, por terem acreditado no meu potencial desde a

graduao, pelo direcionamento, pelos conselhos sempre motivadores.

Ao meu orientador, Prof. Dr. Mario Binelli, pela oportunidade, pela compreenso, pela confiana, pelo

conhecimento a mim cedido, pela pacincia, pelo exemplo.

Ao Dr. Fernando Mesquita, pelo conhecimento a mim transmitido, com calma e sabedoria e ainda pela

amizade construda juntamente com a Sibele e o Luiz Antnio.

Prof. Dr. Claudia Bertan, pela coleta das amostras de endomtrio e participao intensa nos

experimentos, pelas oportunidades de aprendizado e crescimento, pelas conversas, sempre agradveis.

Ao Dr. Guilherme Pugliesi, pelas contribuies para a concluso desta dissertao.

Aos demais membros da famlia LFEM, Milena, Estela, Roney, Everton, Saara, Stephanie, Heitor,

Yasmim, Bruna, pelas colaboraes nos experimentos, pelos momentos de descontrao e pelo

trabalho em equipe.

A meus primos Jozilda e Claudio, por terem to carinhosamente me recebido em sua casa em So

Paulo durante o mestrado.

Prof. Dr. Paula Papa por possibilitar a realizao das imunoshistoquimicas, cedendo seu laboratrio,

reagentes, anticorpos e seu tempo para ensinar a tcnica e analisar os resultados. Agradeo ainda toda

a equipe do LEME, em especial Renata dos Santos Silva, pelo auxlio na execuo da tcnica.

Aos nossos demais colaboradores, Prof. Dr. Luciano Silva, Prof. Dr. Flavio Meirelles, Prof. Dr.

Guilherme Nogueira, Prof. Dr. Bruce Murphy e suas equipes, em especial, Fabiana Bressan, Fbio

Pinaffi, Reno Arajo, Kalyne e Arnab, pela prontido, e pela fundamental colaborao.

Micheline por ter me recebido em sua casa e s demais moradoras Laryssa e Mariane, pela amizade

e agradvel convivncia.

Ao programa de ps-graduao em reproduo animal da FMVZ da USP, pela oportunidade de fazer

parte desta equipe excelente.

prefeitura do campus de Pirassununga, pelos animais cedidos para o experimento.

Aos professores do VRA de Pirassununga, Prof. Dr, Ed Hoffman, Prof. Dr. Rubens Paes de Arruda,

Prof. Dra. Annelise Traldi (Kiky), pela convivncia agradvel, pelo emprstimo de reagentes e

equipamentos alm do espao fsico de seus laboratrios, colaborao fundamental para a realizao

dos experimentos.

Aos funcionrios do VRA, pela ajuda na limpeza, organizao, manejo dos animais, facilitando nosso

trabalho.

Harumi pela ajuda durante todo o mestrado.

Elza, pelo auxlio na correo da dissertao.

Ao Cludio do Laboratrio de Histopatologia, pela disposio para fazer os cortes histolgicos.

Aos moradores da Casa do VRA, Dani, Shirley, Milena, Mayra, Henrique, Kleber, Milton, Roney,

Thiago, pela convivncia, momentos de descontrao, ajuda, conversas, conselhos.

Aos demais amigos de Pirassununga, Gisele, Priscila, Qui, Roberta, Mariane, por tornarem a vida em

Pirassununga mais divertida.

Aos meus pais, Moacyr e Teresinha, por terem acima de tudo respeitado a minha escolha, pelo apoio

financeiro e emocional, pela compreenso, por terem suportado junto comigo a dor da saudade e feito

o inimaginvel para minimizar as dificuldades. Agradeo as conversas, o carinho, os momentos juntos.

s minhas irms e cunhados Moema e Juliano e Moara e Guilherme, pelo apoio, pelo incentivo, por

terem se desdobrado para resolver problemas quando a distncia impediu minha presena.

Aos meus sobrinhos, Guilherme e Giovana, pelo carinho mais que especial, pela motivao, pelas

oraes inocentes que sempre foram atendidas, pela ateno, pela companhia, pela confiana.

A toda a famlia Rodrigues, tios e primos, pelo incentivo, pelo afeto, pelo apoio, pelos momentos que

passamos juntos.

Aos meus amigos Gisara, Gabi, Karine, Robson, Wagner, Dani, pelas conversas demoradas, pelos

momentos de descontrao, pela compreenso e cumplicidade.

A FAPESP pelo suporte financeiro para realizao do experimento.

A CAPES pela bolsa concedida durante o mestrado.

RESUMO

FRANA, M. F. Efeito do ambiente endcrino peri-ovulatrio na expresso gnica e

proteica de transportadores de glicose no endomtrio durante a primeira semana do

ciclo estral em bovino de corte. [Effect of the periovulatory endocrine milieu on endometrial

glucose transporters gene and protein expression during the first week post-estrus in beef

cattle]. 2013. 72 f. Dissertao (Mestrado em Cincias) Faculdade de Medicina Veterinria

e Zootecnia, Universidade de So Paulo, So Paulo, 2012.

Em bovinos de corte, maiores dimetros do folculo pr-ovulatrio (FPO) e as subsequentes

altas concentraes de progesterona [P4] aumentam o crescimento do concepto e a taxa de

prenhez. Formulou-se a hiptese que a modulao do tamanho do FPO e [P4] no diestro

subsequente ovulao do FPO estimulam a expresso endometrial de transcritos e protenas

da famlias das Solute Carrier Proteins (SLC) que esto relacionadas ao transporte de glicose.

Vacas Nelore (n=60), solteiras e ciclando receberam duas injees de PGF2 (PGF; 0,5mg;

i.m.) com intervalo de 14 dias. Dez dias aps (dia -10; D-10), receberam um dispositivo intra-

vaginal liberador de P4 e benzoato de estradiol (2mg; i.m.). Para modular o crescimento do

FPO e alterar a produo de P4 ps-ovulao, no D-10 os animais receberam PGF (grupo alta

P4; AP) ou no (grupo baixa P4; BP). Dispositivos foram removidos e PGF injetada 60 a 42

horas antes da induo da ovulao para o grupo AP e 48 a 30 horas antes da induo para o

grupo BP e ovulaes foram induzidas com GnRH (buserelina; 10g; i.m.) no D0.

Crescimento e ovulao do FPO e formao do CL foram avaliados por ultrassom e [P4]

medidas por radioimunoensaio. No D7 os animais que ovularam foram abatidos (AP, N=18 e

BP, N=18), o endomtrio foi dissecado e submetido extrao de RNA total para anlises de

qPCR, extrao de protenas totais para anlises de western blotting e includo em parafina

para anlises de imunohistoqumica. Diferena entre as mdias dos grupos foi determinada

pelo teste t de student. O dimetro mximo do FPO (mdia erro padro da mdia; 12,80,4

vs. 11,10,4mm) foi maior no grupo AP (P

proteica de SLC2A1 no endomtrio dos animais do grupo AP em relao ao grupo BP.

SLC2A1 foi identificada na membrana basal no epitlio luminal (EL), epitlio glandular (EG)

e no estroma uterino dos animais. SLC2A4 foi identificada na membrana basal e membrana

apical no EL, EG e no estroma uterino dos animais. Em concluso, a modulao do tamanho

do FPO e [P4] no diestro no afetaram a expresso gnica ou proteica dos transportadores de

glicose. possvel que ao invs da expresso gnica ou proteica, a atividade transportadora

das SLCs, ou ainda, a expresso e funo de genes relacionados ao metabolismo de

carboidratos, sejam regulados pelo ambiente endcrino peri-ovulatrio em vacas.

Palavras-chave :Bovinos. tero. Solute carrier protein. Glicose. Esteroides sexuais.

ABSTRACT

FRANA, M. F. Effect of the periovulatory endocrine milieu on endometrial glucose

transporters gene and protein expression during the first week post-estrus in beef cattle.

[Efeito do ambiente endcrino peri-ovulatrio na expresso gnica e proteica de


bovinos de corte]. 2013. 72 f. Dissertao (Mestrado em Cincias) Faculdade de Medicina

Veterinria e Zootecnia, Universidade de So Paulo, So Paulo, 2012.

In beef cattle, changes in the peri-ovulatory endocrine milieu are associated with conceptus

growth and fertility. A large size of the pre-ovulatory follicle (POF) and resulting elevated

progesterone (P4) concentrations during diestrus affect pregnancy rates positively. Our

hypothesis is that modulation of POF size and diestrus P4 concentrations regulate nutrient

availability in the uterus. Specifically, optimal glucose concentrations in the histotroph are

required for adequate embryo growth during early gestation. The objective was to determine

if POF size and resulting P4 concentrations during the first week of diestrus influence gene

expression of Solute Carrier Protein (SLC) families that are related to glucose transport.

Cyclic, non-lactating Nelore cows received two injections of cloprostenol (PGF; 0.5mg; i.m.)

14 days apart. Ten days later (day -10; D-10), cows received a P4-releasing device along with

estradiol benzoate (2mg; i.m.). To modulate the growth of the POF and alter post-ovulatory

P4 production, on D-10 animals received PGF (high post-ovulatory P4 group; HP) or not (low

post-ovulatory P4 group; LP). The P4-releasing devices were removed and PGF injected 60 to

42 hours before the ovulation induction in the HP group and 48 to 30 hours before the

ovulation induction in the LP group. Ovulation was induced with buserelin (GnRH; 10g;

i.m.) on D0. Diameter of POF and ovulation were assessed by ultrasonography starting onD-

2. From D1 to D7, plasma was obtained for measurement of P4 concentration. On D7, cows

that ovulated were slaughtered (HP, n=18 and LP, n=18) and endometrium was dissected and

subjected total RNA extraction for qPCR analyzes, total protein extraction for western

blotting analyzes and included in paraffin for imunohistochemical analyzes. Differences

between group means were determined by students t test. Maximum diameter of the POF

(mean SEM; 12.80.4 vs. 11.10.4mm) was greater in HP vs. LP (P

significant differences in expression of SLC2A1 (mean SEM;0.910.04 vs. 1.020.07),

SLC2A3 (1.140.16 vs. 1.050.1), SLC2A4 (1.200.14 vs. 1.010.05), SLC2A5 (0.950.12

vs. 1.040.12), SLC5A1 (1.350.25 vs. 1.490.44), ATP1A2 (1.290.17 vs. 1.030.1),

ATP1B2 (1.200.11 VS. 1.060.1) ,SLC37A4 (1.160.16 vs. 1.10.12), between HP and LP,

respectively (P>0.05). There was no difference in the abundance of SLC2A1 protein between

groups. The SLC2A1 protein was localized in the luminal epithelium (LE), glandular

epithelium (GE) and uterine stroma (US) of animals. The SLC2A4 protein was localized on

the basal and apical membrane of the LE, GE and US of animals. In conclusion, modulation

of POF size and diestrus P4 concentrations did not affect the expression of glucose transporter

genes or proteins. It is possible that activity of SLC proteins rather than gene expression, or

alternatively, expression and function of genes related to carbohydrate metabolism, are

regulated by the peri-ovulatory endocrine milieu in cows.

Keywords:Cattle.Uterus.Solute Carrier Proteins.Glucose. Sexual Steroids

LISTA DE ILUSTRAES

Figura 1 - Modelo Hipottico Grfico............................................................................................ 18

Figura 2 - Protocolo-base do manejo reprodutivo experimental dos animais para obteno de

amostras.........................................................................................................................

29

Figura 3 - Fluxograma da quanficao de transcritos por qPCR. ................................................. 33

Figura 4 - Condio de corrida de qPCR para anlise de abundncia de transcritos em extratos

de tecidos endometriais de vacas nelore........................................................................

34

Figura 5 - Comparaes das medidas de folculo e corpo lteo entre os animais dos grupos alta

progesterona aps a ovulao (AP) e baixa progesterona aps a ovulao (BP)..........

44

Figura 6 - Dinmica temporal das alteraes das concentraes plasmticas de progesterona do

dia 1 at o dia 7 dos animais dos grupos alta progesterona aps a ovulao (AP) e

baixa progesterona aps a ovulao (BP)......................................................................

45

Figura 7 - Taxa de aumento da concentrao de progesterona (P4) do dia 1 ao dia 7 e

concentrao de progesterona no dia 7 dos animais dos grupos alta progesterona

aps a ovulao (AP) e baixa progesterona aps a ovulao (BP)................................

45

Figura 8 - Eletroforese em gis de agarose para separao de produtos de PCR de genes que

codificam as SLCs.........................................................................................................

46

Figura 9 - Mdia ( erro padro da mdia) da abundncia relativa de transcritos de genes

relacionados ao transporte facilitado de glicose. ..........................................................

49

Figura 10 - Mdia ( erro padro da mdia) da abundncia relativa de transcritos de gene

transportador de glicose dependente de sdio e outros genes relacionados ao

transporte de glicose. ....................................................................................................

50

Figura 11 - Expresso proteica de SLC2A1 no endomtrio de vacas no dia 7 aps a induo da

ovulao.........................................................................................................................

53

Figura 12 - Imunohistoqumica para SLC2A1 em tero de vacas do grupo AP e BP..................... 54

Figura 13 - Imunohistoqumica para SLC2A4 em tero de vacas do grupo AP e BP..................... 55

Quadro 1 - Caractersticas dos primers utilizados nas deteces utilizando qPCR......................... 36

Quadro 2 - Anticorpos usados na Imunohistoqumica. ................................................................... 41

Quadro 3 - Caracterstica das reaes de amplificao e da curva-padro para validao de

pares de primers.............................................................................................................

48

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Volumes (L) e descrio de reagentes utilizados para

procedimentos com qPCR para teste de concentrao de primers,

curva-padro e comparao entre grupos.......................................

33

Tabela 2 - Ingredientes para preparao da curva padro de cDNA obtido a

partir de extratos de endomtrio de vacas Nelore (volumes em

L)..........................................................................................

38

Tabela 3 - Anlise de regresso entre os dados de expresso gnica, ou

entre expresso e variveis relacionadas s concentraes de

progesterona (P4).....................................................................

51

SUMRIO

1 INTRODUO ......................................................................................................................... 16

2 REVISO DE LITERATURA ................................................................................................ 19

2.1 BIOLOGIA DA GESTAO INICIAL EM RUMINANTES .................................................. 19

2.2 REGULAO DO AMBIENTE UTERINO PELOS HORMNIOS ESTEROIDES

OVARIANOS ....................................................................................................................................... 21

2.3 IMPORTNCIA DA GLICOSE PARA O DESENVOLVIMENTO DO

EMBRIO..............................................................................................................................................23

2.4 PROTENAS CARREADORAS DE GLICOSE NO TERO DE BOVINOS...........................24

2.4.1 Famlia SLC2A ........................................................................................................................... 24

2.4.2 Famlia SLC5A e outras SLCs relacionadas ao transporte de glicose ........................................ 26

3 MATERIAL E MTODOS ..................................................................................................... 27

3.1 ANIMAIS E MANEJO REPRODUTIVO .................................................................................. 27

3.1.1 Exames ultrassonogrficos .......................................................................................................... 29

3.2 OBTENO DE AMOSTRAS .................................................................................................. 30

3.2.1 Plasma para mensurao de progesterona ................................................................................... 30

3.2.2 Endomtrio para anlises de expresso gnica e proteica ........................................................... 30

3.2.3 Corpo lteo, dados morfolgicos ................................................................................................ 30

3.2.4 tero para imunohistoqumica .................................................................................................... 31

3.3 PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS .................................................................................. 31

3.3.1 Extrao de RNA ....................................................................................................................... 31

3.3.2 Sntese de cDNA ......................................................................................................................... 31

3.3.3 Extrao de protenas .................................................................................................................. 32

3.4 ANLISES LABORATORIAIS ................................................................................................ 32

3.4.1 Reao de polimerase em cadeia em tempo real ......................................................................... 32

3.4.2 Desenho de primers e validao.................................................................................................. 34

3.4.3 Eletroforese ................................................................................................................................. 38

3.4.4 Sequnciamento de produtos de PCR ......................................................................................... 39

3.4.5 Western blot ................................................................................................................................ 39

3.4.6 Imunohistoqumica ..................................................................................................................... 40

3.5 ANLISE ESTATSTICA ......................................................................................................... 41

4 RESULTADOS E DISCUSSO .............................................................................................. 43

4.1 MODELO ANIMAL .................................................................................................................. 43

4.2 EXPRESSO GNICA .............................................................................................................. 46

4.3 DADOS DE EXPRESSO PROTEICA .................................................................................... 51

4.4 LOCALIZAO PROTEICA .................................................................................................... 52

5 CONCLUSO ........................................................................................................................... 56

6 IMPLICAES ....................................................................................................................... 57

REFERNCIAS ....................................................................................................................... 58

APNDICES ............................................................................................................................. 64

16 Introduo

1 INTRODUO

O Brasil o segundo maior exportador mundial de carne bovina e precisa de

melhorias na produo de bovinos de corte a fim de suprir a demanda nacional e internacional

sem perder sua posio de destaque no mercado mundial de carne (ANUALPEC, 2012). Para

otimizar o retorno financeiro da criao de bovinos de corte, imprescindvel melhorar as

taxas de produo juntamente com as taxas de reproduo (OLIVEIRA et al., 2007), visto que

o principal fator que altera a lucratividade da atividade a reproduo (FORMIGONI et al.,

2002). Alm disso, a expectativa de aumento da populao torna indispensvel o aumento da

eficincia da produo de carne, que inquestionavelmente depende de taxas reprodutivas mais

elevadas que as observadas atualmente.

Perdas embrionrias tendem a ocorrer, em sua maioria at 14 dias aps a

fertilizao e so importantes fatores causadores de prejuzos da indstria agrcola (DUNNE

et al., 2000). Durante a gestao inicial, a mortalidade embrionria pode ser causada por

fatores genticos, fisiolgicos, endcrinos ou ambientais (ASHWORTH; SALES; WULMUT,

1994; ZAVY, 1994).

Durante as primeiras semanas de gestao, o embrio encontra-se solto no lmen

uterino e a garantia de sua sobrevivncia depende do endomtrio que sintetiza, secreta e ainda

transporta inmeras substncias como protenas, inibidores de proteases, citocinas, fatores de

crescimento, hormnios, aminocidos e ons, que juntos formam o histotrofo (BAZER, 1975;

ROBERTS; BAZER, 1988; KANE et al., 1997).

As oscilaes hormonais que acontecem a cada ciclo coincidem com alteraes

que acontecem no tero e implicam sua preparao para receber o embrio. A progesterona,

hormnio liberado pelo corpo lteo, o principal fator regulador das funes endometriais

durante a gestao inicial (BAZER et al., 1979; SPENCER et al., 2004; SPENCER et al.,

2007). Um correto funcionamento do tero necessrio para o desenvolvimento do embrio.

De fato, demonstrou-se que existe associao positiva entre a concentrao plasmtica de

progesterona medida sete dias aps a inseminao e a probabilidade de concepo

(DEMETRIO et al., 2007), o que ressalta a importncia do papel da progesterona na primeira

semana de gestao. Alm disso, acelerado aumento nas concentraes de progesterona no

perodo imediatamente aps o cio est relacionado positivamente ao alongamento do concepto

(GARRETT et al., 1988; CARTER et al., 2008; SATTERFIELD et al., 2009).

17 Introduo

Estudos recentes evidenciaram mudanas temporais no perfil do transcriptoma do

endomtrio bovino no perodo peri-ovulatrio. Tais mudanas levaram concluso de que

condies de baixa progesterona levam a um ambiente uterino sub-timo e uma habilidade

reduzida de promover o alongamento do concepto (FORDE et al., 2011). Em contraste a

suplementao com progesterona aps a ovulao altera a expresso gnica endometrial em

estgios crticos do perodo peri-implantao do embrio (FORDE et al., 2009). Dentre os

genes cuja expresso alterada pela concentrao de progesterona ainda no perodo peri-

ovulatrio encontram-se alguns que codificam protenas carreadoras de solutos, que so

cruciais na determinao da composio do histotrofo, do qual o concepto depende para seu

crescimento e desenvolvimento (FORDE et al., 2010).

Como nem o endomtrio nem o concepto realizam gliconeognese, a glicose

depende de transportadores especficos para ser levada at o lmen uterino (LEESE;

BARTON, 1984; MOLEY et al., 1998) o que justifica a extrema importncia da presena das

protenas carreadoras no endomtrio nas primeiras semanas de gestao. O transporte de

glicose pela membrana plasmtica pode ser mediado por um ou mais membros de duas

famlias de transportadores de glicose: os facilitadores (SLC2A ou GLUT) e os dependentes

de sdio (sdio/glicose co-transportadores SLC5A ou SGLT; WOOD; TRAYHURN, 2003).

Membros dessas famlias de transportadores estavam presentes em clusters de

genes que tiveram sua expresso alterada pela concentrao de progesterona no perodo

imediatamente aps a ovulao (SHIMIZU et al., 2010). Ainda Gao et al.,(2009) relataram

que alguns membros das famlias SLC2A e SLC5A tm sua expresso induzida pela

progesterona no epitlio luminal, glandular e/ou glandular superficial e estroma do

endomtrio, bem como trofectoderma e endoderma extraembrionrio.

Porm, os efeitos positivos da progesterona aps a ovulao na receptividade do

tero, tambm esto relacionados s concentraes de estradiol antes da ovulao, ou seja, a

criao de um ambiente uterino favorvel ao desenvolvimento embrionrio se d em resposta

a oscilaes dos esteroides sexuais antes, durante e aps a ovulao. Os modelos at hoje

propostos para estudo do ambiente uterino em resposta a esteroides se caracterizam por

modelos essencialmente farmacolgicos, mediante suplementao de hormnios sexuais em

animais ovariectomizados (SHIMIZU et al., 2010), suplementao de progesterona aps a

ovulao (CARTER et al., 2008) ou ainda reduo da funo do corpo lteo aps a ovulao

(BELTMAN et al., 2009).

O presente tem por objetivo um estudo da influncia das oscilaes hormonais

durante o perodo peri-ovulatrio na abundncia transcritos e protenas pertencentes s

18 Introduo

famlias de transportadores de glicose no endomtrio de vacas de corte no dia 7 aps a

induo da ovulao. Para isso prope-se a modulao do crescimento do folculo pr-

ovulatrio de vacas Nelore, com a finalidade de manipular a formao e crescimento do corpo

lteo subsequente e decorrentes concentraes de progesterona circulante. Este modelo

experimental visa testar a hiptese de que o ambiente endcrino peri-ovulatrio regula a via

das protenas carreadoras de glicose no endomtrio de vacas de corte na primeira semana do

ciclo estral (Figura 1).

Figura 1- Modelo hipottico grfico

Fonte: (FRANA, M. R, 2012)

Transporte da glicose por intermdio das SLCs em resposta a diferentes ambientes endcrinos no perodo peri-

ovulatrio. Maiores concentraes de progesterona no diestro induzem um aumento na expresso gnica e

proteica de transportadores de glicose levando ao aumento na concentrao de glicose disponvel no histotrofo.

A glicose transportada at o lmen uterino, onde compe juntamente com outras substncias, o histotrofo.

Folculo pr-ovulatrio (FPO). Corpo lteo (CL). Dia da induo da ovulao (D0). Dia 7 aps a induo da

ovulao (D7). Seta vermelha para cima indica alta concentrao de progesterona [P4]. Seta vermelha para baixo

indica baixa concentrao de progesterona.

19 Reviso de Literatura

2 REVISO DE LITERATURA

Nesta reviso de literatura sero abordados temas referentes biologia da gestao

inicial em bovinos, regulao do ambiente uterino pelos hormnios esteroides ovarianos,

importncia da glicose para o desenvolvimento do embrio e protenas carreadoras de glicose

no tero de bovinos.

2.1 BIOLOGIA DA GESTAO INICIAL EM RUMINANTES

Estmulos endcrinos e parcrinos que atuam em ocitos imaturos levam

retomada da meiose do gameta feminino e ovulao (revisado por MEHLMANN, 2005).

Aps a ovulao, o ocito entra na tuba uterina. Na presena de espermatozoides j

capacitados ocorre a fertilizao. A sequncia dos eventos de capacitao espermtica,

penetrao no ocito, ativao e concluso da meiose II precede a srie de ciclos de divises

celulares que caracteriza a fase de clivagens embrionrias (revisado por BARNES;

EYESTONE, 1990).

At o estgio de 16 clulas, o embrio caracterizado pelo nmero de clulas. A

partir deste momento ele passa a ser denominado mrula. Este estgio atingido por volta do

dia 5 aps a fertilizao. Nesse momento, ocorre a passagem do embrio do oviduto para o

lmen uterino. No prximo estgio, 32 clulas, tem incio o processo de compactao. Este

evento de extrema importncia, pois considerado um pr-requisito para a formao da

blastocele e consequente expanso do embrio, a blastocele uma cavidade repleta de fluido

que aparece entre os dias 6 e 7 e representa a transformao de uma estrutura compacta, a

mrula, em blastocisto, que inicialmente composto por cerca de 100 clulas (revisado por

BETTERIDGE; FLCHON, 1988).

O blastocisto passa ento por um perodo de expanso, entre os dias 7 e 8, quando

ocorre um aumento no dimetro da estrutura e uma diminuio na espessura da zona pelcida.

Em seguida, ocorre a ecloso e inicia-se o processo de alongao que tem incio

aproximadamente no dia 12 e fim por volta do dia 18 aps a fertilizao (revisado por

PEIPPO; MACHATY; PETER, 2011).

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0093691X11003037http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0093691X11003037http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0093691X11003037


Ainda no incio da gestao, ocorrem algumas mudanas no transcriptoma

endometrial mesmo na ausncia do concepto, ou seja, as primeiras mudanas at o

reconhecimento da gestao so independentes da presena do embrio (FORDE et al., 2011).

Para que ocorra sucesso gestacional, necessrio que o concepto secrete quantidades

suficientes de interferon-tau (IFN-) a fim de inibir a produo de prostaglandina F2 pelo

endomtrio e consequente lutelise (revisado por FORDE; LONERGAN, 2012). A partir

deste momento, ocorre a regulao de genes no endomtrio induzida pelo interferon e em

alguns casos regulada pela progesterona (FORDE et al., 2011). Alm do interferon, outras

molculas derivadas do concepto podem provocar mudanas especficas no endomtrio

relacionadas gestao (MAMO, 2012).

Este prolongado perodo pr-implantao de embries bovinos permite a fcil

obteno de conceptos, a base da indstria de transferncia de embries (BETTERIDGE;

FLCHON, 1988). Por outro lado, at que ocorra a implantao, ainda sem contato com o

tecido materno, o concepto encontra-se flutuante no lmen uterino e depende do histotrofo

para seu desenvolvimento.

Histotrofo um complexo de enzimas, fatores de crescimento, citocinas,

linfocinas, hormnios, protenas de transporte entre outras substncias transportadas ou

secretadas das glndulas endometriais para o lmen uterino (SPENCER; BAZER, 2004).

No incio da gestao, o concepto que trata-se do embrio juntamente com as

membranas extraembrionrias, depende do endomtrio para seu desenvolvimento, visto que

nesta fase ainda no ocorreu a placentao e o concepto tem contato direto apenas com o

histotrofo (SPENCER; BAZER, 2004). Durante esta fase em que o concepto permanece

flutuante nas secrees uterinas, o blastocisto sofre, em um curto perodo de tempo, uma

expanso associada ao alongamento da vescula trofoblstica e atinge o comprimento do

corno ipsilateral ao lado da ovulao (CHAVATTE-PALMER; GUILLOMOT, 2007).

A exposio de ovelhas no perodo pr-natal a 19-norprogestina do nascimento

at oito semanas de idade induz a ablao epigentica da morfognese de glndulas

endometriais sem alterar a formao do miomtrio ou outras estruturas do trato reprodutivo

feminino que derivam do ducto Mulleriano. Este tratamento deu origem ao modelo de ovelhas

knockout para glndulas uterinas (GRAY et al., 2000).

A ausncia de glndulas uterinas em ovinos levou ao insucesso no

desenvolvimento do concepto. Alm disso, a infuso de interferon-tau no tero de ovelhas

knockout aumentou a expresso de genes estimulados pelo interferon-tau no endomtrio

desses animais. Portanto, a falha no desenvolvimento do concepto nesses animais parece estar


relacionada ausncia das glndulas e suas secrees e no incapacidade do endomtrio em

responder a estmulos do concepto (GRAY et al., 2002).

Esses resultados corroboram com evidncias de que o histotrofo indispensvel

para que o concepto obtenha xito na fase de crescimento garantindo sucesso na manuteno

da gestao (SPENCER; BAZER, 2004).

2.2 REGULAO DO AMBIENTE UTERINO PELOS HORMNIOS ESTEROIDES

OVARIANOS

Durante os diferentes perodos do ciclo estral de bovinos, ocorre uma oscilao

nas concentraes dos hormnios esteroides progesterona e estradiol. Ocorre prevalncia na

circulao de progesterona, estradiol e progesterona durante o diestro, proestro-estro e

metaestro, respectivamente. Essa sequncia de exposio do endomtrio aos hormnios

esteroides ovarianos de extrema importncia para a sobrevivncia do embrio e sucesso da

gestao (MILLER, 1976). Variaes na sntese e secreo de protenas pelas clulas do

oviduto e do epitlio e estroma do endomtrio bovino ocorrem em resposta a variaes na

produo de estradiol e progesterona e seus receptores (BINELLI et al., 1999;

BAUERSACHS et al., 2004; BAUERSACHS et al., 2005).

A exposio de vacas ovariectomizadas ao estradiol aumentou a expresso de

genes relacionados ao ciclo celular, morfognese e diferenciao celular no endomtrio. A

exposio desses animais a estradiol precedido de uma exposio progesterona levou a um

aumento na expresso endometrial de genes relacionados a migrao, diferenciao e adeso

celular. Esta interao entre esses dois hormnios no endomtrio pode estar relacionada a uma

remodelao tecidual controlada, necessria ao funcionamento do endomtrio (SHIMIZU et

al., 2010).

Secrees continuadas de progesterona pelo corpo lteo estimulam e mantm

funes endometriais cruciais para crescimento, alongamento e pr-implantao do concepto

bovino (THATCHER et al., 1984; SPENCER; BAZER, 2004). Concentraes de

progesterona ps-estro parecem controlar secrees do endomtrio que contribuem para a

composio do histotrofo em ovinos e bovinos (FORDE et al.,2010).

A induo de concentraes mais altas de progesterona na primeira semana de


gestao em gado de corte est associada ao aumento do tamanho no concepto entre os dias

14 e 16 de gestao (GARRET et al., 1988; CARTER et al., 2008). Este incremento no

tamanho do concepto em resposta a altas concentraes de progesterona durante o diestro se

deve a mudanas no ambiente onde o embrio se desenvolve e no a uma ao direta da

progesterona no embrio (CLEMENTE et al., 2009).

Uma srie de alteraes no transcriptoma do endomtrio de ruminantes em

resposta a esteroides j foi descrita. Dentre os genes cuja expresso alterada pela

concentrao de progesterona ainda no perodo ps-ovulatrio encontram-se alguns que

codificam protenas carreadoras, que so cruciais na determinao da composio do

histotrofo, do qual o concepto depende para seu crescimento e desenvolvimento (FORDE et

al.,2010).

De fato, maiores concentraes de progesterona obtidas atravs da suplementao

do hormnio aps induo da regresso do corpo lteo alterou a composio dos fluidos do

oviduto e tero, porm de forma diferente em cada meio. A concentrao de aminocidos

aumentou no oviduto por estmulo da progesterona, porm no houve alteraes nas

concentraes das fontes de energia. J no tero, o esteroide provocou aumento na

concentrao de glicose no histotrofo (HUGENTOBLER et al., 2010). Esta regulao local do

transporte de substncias atende s necessidades do embrio, que no incio de seu

desenvolvimento, enquanto localizado no oviduto, no depende da glicose como fonte de

energia, porm aps atingir a fase de blastocisto e passar do oviduto para o lmen uterino

utiliza a glicose como sua principal fonte de energia (LEESE; BARTON, 1984; KIM et al.,

1993).

Concentraes mais altas de progesterona no dia 5 ps-estro, ou a suplementao

de progesterona nos dias 1 a 4 ou 5 a 9 ps-inseminao favoreceram o desenvolvimento

embrionrio, induziram a secreo de protenas para o fluido uterino e estimularam a

produo de IFN- (GARRETT et al., 1988;GREEN, et al., 2005; MANN et al., 2006).

Ovelhas suplementadas com progesterona nos dias 9 ou 12 aps inseminao

tiveram aumento na abundncia de transcritos de genes de transportadores de glicose e

aminocidos associada ao aumento da concentrao desses substratos no lavado uterino em

comparao aos animais que no receberam suplementao do hormnio. Adicionalmente,

animais que receberam a suplementao de progesterona seguida da administrao de uma

substncia antiprogestina do dia 8 ao dia 12 no manifestaram alteraes no perfil dos

transcritos no endomtrio nem da composio do histotrofo (SATTERFIELD et al., 2009).

Esses dados evidenciam a influncia especfica da progesterona na regulao do transporte de


glicose no endomtrio.

2.3 IMPORTNCIA DA GLICOSE PARA O DESENVOLVIMENTO DO EMBRIO

A glicose uma molcula composta por seis carbonos e serve como substrato

tanto para produo de energia quanto para sntese de molculas complexas. Aps entrar na

clula e ser fosforilada a glicose-6-fosfato, a glicose participa de quatro vias principais sendo

elas a produo de ATP, NADPH, glicosamina-6-fosfato e glutamato ou ainda glicognio

para armazenamento (RIEGER, 1992).

Dificilmente ocorrer o desenvolvimento do concepto na ausncia de substratos

energticos (KIM et al., 1993). Durante as primeiras semanas aps a fertilizao, ocorrem

mudanas nas necessidades nutricionais do embrio. Desde as primeiras divises celulares at

a blastulao, o substrato de maior importncia para o desenvolvimento do concepto parece

ser o piruvato. A partir da fase de blstula, a glicose passa ser a mais importante fonte de

energia (LEESE; BARTON, 1984; KIM et al., 1993), porm em seu estudo, Rieger et al.,

(1992) sugeriram que a relao glicose e glutamina tem grande importncia a partir do incio

do estgio de clivagem. A captao de glicose pelo embrio parece ser um indicador positivo

do potencial de desenvolvimento fetal (FLEMING et al., 2004).

Mesmo sendo indispensvel para o desenvolvimento inicial do embrio a glicose

em altas concentraes pode ser desfavorvel para o crescimento do concepto (RIEGER et al.,

1995). Portanto, necessrio que exista um controle na quantidade de glicose a ser

disponibilizada no histotrofo para garantir o crescimento do concepto sem prejudicar seu

desenvolvimento.

Efeitos de distrbios nutricionais e no desenvolvimento sofridos durante o incio

das divises celulares afetam toda a trajetria de desenvolvimento embrionrio e fetal. As

variveis associadas ao metabolismo do embrio esto relacionadas ao crescimento futuro e

atividade fisiolgica (FLEMING et al., 2004).

A glicose depende da presena de transportadores especficos no endomtrio para

ser levado at o lmen uterino, visto que nem o endomtrio nem o concepto realizam

gliconeognese (MOLEY et al., 1998; LEESE et al., 1984).

O primeiro passo na utilizao da glicose a sua captao para dentro da clula

que pode ser mediada por um co-transportador de glicose sdio-dependente (SGLTs,


atualmente chamado de SLC5A) ou por um transportador facilitador de glicose (GLUTs,

atualmente chamado de SLC2A; FROLOVA; MOLEY, 2011). So membros destas duas

famlias que faro ainda o transporte da glicose at o lmen uterino.

Alm da glicose outras substncias importantes para o desenvolvimento do

embrio tambm precisam de carreadores para que sejam disponibilizadas no histotrofo. O

transporte de aminocidos pela membrana plasmtica representa a primeira etapa de sua

utilizao pelas clulas (WU et al., 2008), pois os carreadores de aminocidos regulam a

concentrao dos aminocidos livres em clulas e tecidos, incluindo placenta e endomtrio

(SMITH et al., 2003). As mudanas nas concentraes dos aminocidos nos fluidos uterinos

so controladas pelas diferentes concentraes de seus transportadores, membros da famlia

SLC7A das protenas carreadoras de solutos (GROEBNER et al., 2011).

2.4 PROTENAS CARREADORAS DE GLICOSE NO TERO DE BOVINOS

O transporte de glicose atravs da membrana das clulas pode ser mediado por

membros de duas famlias de transportadores de glicose: SLC2A e SLC5A (WOOD;

TRAYHURN, 2003).

2.4.1 Famlia SLC2A

A famlia SLC2A tambm conhecida como GLUT engloba protenas que fazem o

transporte facilitado da glicose e outros acares atravs da membrana plasmtica pelo

gradiente de difuso (WOOD; TRAYHURN, 2003). So doze membros j descritos (SLC2A1

at SLC2A12), e um transportador mio-inositol acoplado a H SLC2A13 (RILEY; MOLEY,

2006). Diferentes membros desta famlia apresentam sequncias conservadas localizadas

distintamente na estrutura primria, porm no se pode predizer o substrato especfico de

transporte pela presena dessas sequncias (ULDRY; THORENS, 2004).

Esta famlia subdividida em trs classes de transportadores facilitados. A Classe

I abrange os membros SLC2A1 a SLC2A4, responsveis pelo transporte de glicose. A Classe

II contm o transportador de frutose SLC2A5 e ainda SLC2A7 e SLC2A9. A Classe III

engloba os transportadores SLC2A6, SLC2A8, SLC2A10, SLC2A12 e SLC2A13. Uma das


caractersticas da terceira classe que stio de glicosilao se localiza em uma regio distinta

dos outros membros da famlia (WOOD; TRAYHURN, 2003).

SLC2A1 pode ser encontrada em quase todos os tecidos, em diferentes nveis de

expresso em diferentes tipos celulares (ULDRY; THORENS, 2004). Possui grande afinidade

para o transporte de glicose e sua expresso no endomtrio est associada a uma resposta a

concentraes dos hormnios esteroides ovarianos (FROLOVA; MOLEY, 2011).

No endomtrio de vacas ovariectomizadas, sua expresso aumentou em resposta a

administrao de progesterona (SHIMIZU et al., 2010). Em ovinos SLC2A1 est presente no

epitlio luminal uterino e sua expresso induzida por progesterona e estimulada por IFN-

(GAO et al., 2009; SATTERFIRLD et al., 2009).

SLC2A3 transporta glicose com alta afinidade (ULDRY; THORENS, 2004). No

tero de murinos se localiza preferencialmente nas clulas do estroma, mas tambm est

presente no lmen. Embries de camundongos knockout para SLC2A3 tiveram apoptose

induzida. Esta protena depende de uma exposio glicose para induo da sua expresso em

embries associada passagem do estgio de mrula para o estgio de blastocisto

(FROLOVA; MOLEY, 2011).

SLC2A4 o transportador de glicose mais estudado. Sua relevante atuao na

homeostase da glicose na clula se deve ao estmulo da translocao da protena do

citoplasma at a membrana pela insulina (THORENS; MUECKLER, 2010). A ligao da

insulina ao seu receptor na superfcie celular leva a um aumento na atividade celular de

transporte de glicose. Porm, esta pode no ser a nica via de ativao da SLC2A4. Em menor

escala, a translocao desta protena j foi descrita em resposta a uma sinalizao regulada

pela AMP ativada por protena quinase (HOLMAN et al., 1990).

SLC2A5 possui alta afinidade para o transporte de frutose, mas tambm pode

atuar no transporte de glicose em menor escala (ULDRY; THORENS, 2004). No dia 7 do

ciclo estral, altas concentraes de progesterona, induzidas atravs da insero de dispositivos

vaginais liberadores de P4, estimularam a expresso de SLC2A5 no endomtrio de novilhas

(FORDE et al., 2010).


2.4.2 Famlia SLC5A e Outras SLCs Relacionadas ao Transporte de Glicose

Membros da famlia SLC5A so os transportadores de glicose dependentes de

sdio, que atuam conduzindo a glicose contra os gradientes eletroqumicos, o que

importante para o transporte de glicose pelo endomtrio para dentro do lmen uterino

(GARDNER et al., 1996). Esta famlia inclui mais de 200 membros entre animais e bactrias

(WRIGHT; TURK, 2004).

Pouco se sabe ainda sobre essas protenas, a SLC5A1 parece ter baixa afinidade

para o transporte de glicose. A expresso desta protena no endomtrio foi induzida por

suplementao de progesterona no diestro em novilhas (SHIMIZU et al., 2010).

No existem estudos sobre a SLC37A4 e as ATPases (ATP1A2 e ATP1B2) no

tero de espcies de mamferos. A SLC37A4, tambm denominada transportadora de G-6-P

(G6PT) expressa ubiquitosamente e co-dependente da enzima Glicose-6-fosfatase

(G6Pase) para transporte de G6P para o lmen do retculo endoplasmtico (FROISSART et

al., 2011).

As ATPases so transportadores de ons. Caracterizam-se por protenas

heterodmeras de membrana e regulam a homeostase inica de clulas e transporte de

substratos (WANG; O'DOHERTY, 2012). ATP1B2 e ATP1A2 so membros da famlia das

Na+/K

+-ATPases (tambm denominadas Na, K-ATPase ou ATPase transportadora de

sdio/potssio). Esses transportadores possuem funes ainda no totalmente elucidadas,

porm em clulas de mamferos geram gradientes de ons que mantm o potencial da

membrana e auxiliam no transporte de outros solutos principalmente em transporte

dependente de sdio (CLAUSEN; EVERTS, 1989).

27 Material e Mtodos

3 MATERIAL E MTODOS

3.1 ANIMAIS E MANEJO REPRODUTIVO

O experimento foi realizado na Universidade de So Paulo, Campus de

Pirassununga. Foram utilizadas 60 vacas Nelore (Bos indicus) plurparas, cclicas, no

lactantes, sem afeces reprodutivas detectveis por exame ginecolgico e com escore

corporal entre 3 e 4 (0:magra, 5:obesa). Os animais foram mantidos a pasto e suplementados

com cana de acar e/ou silagem de milho, concentrado e sais minerais e gua ad libitum. As

dietas foram formuladas para atenderem s exigncias de mantena para vacas de corte.

O objetivo do manejo reprodutivo foi estabelecer um protocolo hormonal a fim de

manipular o ambiente endcrino peri-ovulatrio e possibilitar a formao de dois grupos com

distintos tamanhos de folculos pr-ovulatrios que levassem ao desenvolvimento de corpos

lteos com distintas concentraes de progesterona no diestro subsequente ovulao desses

folculos. A manipulao do crescimento do folculo pr-ovulatrio foi baseada na conhecida

influncia da progesterona na frequncia de pulsos de liberao do hormnio luteinizante

(LH). A progesterona reduz a frequncia dos pulsos de LH e em consequncia ocasiona

menor estmulo ao crescimento do folculo aps o momento da divergncia de crescimento

folicular (PFEIFER et al., 2009). Corpos lteos subsequentes ovulao de folculos maiores

tendem a ser maiores e capazes de produzir mais progesterona em relao a corpos lteos

menores (CARTER et al., 2008; MANN, 2009). Baseando-se nesse princpio, estabeleceu-se

um protocolo-base de tratamentos hormonais e testaram-se variaes pontuais desse protocolo

para melhorar sua eficcia em produzir grupos de animais distintos quanto ao crescimento

folicular e funo lutenica. No foi objetivo dessa dissertao apresentar, comparar ou

discutir os detalhes de cada protocolo. Assim, foi descrito abaixo o protocolo-base utilizado e,

quando relevante, modificaes realizadas sero apontadas no texto.

No protocolo-base, as vacas foram submetidas a uma pr-sincronizao do ciclo

estral. Para tanto os animais receberam duas aplicaes de 0,5 mg de prostaglandina F2

(Cloprostenol Sdico; Sincrocio; Ourofino, Cravinhos, SP, Brasil), administradas com 14

dias de intervalo (Figura 2). Objetivou-se obter animais contendo um corpo lteo responsivo

prostaglandina 10 dias aps a segunda aplicao (dia experimental -10; D-10). A presena do


corpo lteo foi confirmada por exame ultrassonogrfico transretal (US). No D-10, todos os

animais receberam 2 mg de Benzoato de Estradiol (Sincrodiol; Ourofino, Cravinhos, SP,

Brasil) para induzir o recrutamento de uma nova onda de crescimento folicular e a insero de

um dispositivo intravaginal liberador de progesterona de primeiro uso (1g; Sincrogest;

Ourofino, Cravinhos, SP, Brasil). Neste momento os animais foram divididos nos grupos Alta

Progesterona Ps-ovulao (AP) e Baixa Progesterona Ps-ovulao (BP). Ainda nesse dia,

os animais do grupo AP receberam uma aplicao de prostaglandina F2 (0,5 mg de

Cloprostenol sdico; Sincrocio)

. A PGF foi aplicada nos animais do grupo AP com o intuito

de lisar o corpo lteo, com isso, os animais deste grupo teriam progesterona circulante apenas

exgena, proveniente do dispositivo intravaginal. Raciocinou-se que a concentrao

plasmtica de progesterona durante o crescimento folicular desses animais seria menor que a

dos animais do grupo BP, visto que os animais do grupo BP teriam fonte endgena (corpo

lteo) e exgena (Sincrogest) de progesterona durante o crescimento folicular. Em

comparao ao grupo BP, a menor concentrao de progesterona circulante nos animais do

grupo AP resultaria em maior frequncia dos pulsos de LH, estimulando o crescimento

folicular. Sessenta horas antes da induo da ovulao retirou-se o dispositivo de progesterona

e administrou-se mais uma injeo de prostaglandina nos animais do grupo AP. Para os

animais do grupo BP, esse procedimento ocorreu 12 horas depois (D-2,5 e D-2

respectivamente). Dessa forma, os folculos pr-ovulatrios dos animais do grupo AP tiveram

12 horas a mais para crescer na ausncia de progesterona. A ovulao foi induzida por

hormnio liberador de gonadotrofinas (GnRH; 1g de acetato de buserelina; Sincroforte;

Ourofino, Cravinhos, SP, Brasil) no D0. Em uma tentativa de obter maiores diferenas entre

dimetro de folculos pr-ovulatrios e corpos lteos subsequentes e concentraes de

progesterona no diestro um segundo protocolo foi realizado usando implantes de progesterona

de segundo uso. Alm disso, a retirada dos dispositivos intravaginais dos animais do grupo

alta progesterona ocorreu no mesmo momento, 60 a 48 horas antes da induo da ovulao,

porm os animais do grupo baixa progesterona tiveram os dispositivos removidos 12 a 24

horas depois dos animais do grupo AP, 48 a 30 horas antes da induo da ovulao. Os dois

protocolos levaram a semelhantes resultados quanto s variveis acessadas no experimento.

Crescimento folicular, ovulao, formao e tamanho do corpo lteo foram

acessados por exame ultrassonogrfico transretal a cada 24 horas a partir do D-2. Somente os

animais que ovularam em resposta ao GnRH foram includos nas anlises (n=36). No dia 7

aps a induo da ovulao os animais foram abatidos. O dia 7 aps a induo da ovulao foi

escolhido para a coleta de amostras teciduais por ser um momento crtico para a fertilidade de


vacas. o momento subsequente passagem do embrio do oviduto para o corno uterino. A

partir desse momento ocorre contato com o ambiente uterino cuja composio poder

interferir no sucesso gestacional. Alm disso, a composio de tal ambiente pode ser alterada

pelas concentraes de hormnios esteroides. Por exemplo, existe uma correlao positiva

linear entre a probabilidade de sucesso gestacional e a concentrao plasmtica de

progesterona no dia 7 ps-estro em vacas de leite e de corte (DEMETRIO et al., 2007;

FORDE et al., 2009).

Figura 2 - Protocolo-base do manejo reprodutivo experimental dos animais para obteno de amostras


Vacas Nelore, solteiras, cclicas foram pr-sincronizadas, e ento receberam nada (Grupo Baixa Progesterona;

BP) ou uma injeo de PGF2 (Grupo Alta Progesterona; AP) no momento da insero de dispositivo

intravaginal liberador de P4 (Sincrogest) de primeiro ou segundo uso. Benzoato de estradiol (BE).

Prostaglandina F2 (PGF). Asteriscos vermelhos indicam coleta de sangue para mensurao de P4 por RIE. A

retirada do implante de progesterona ocorreu de 60 a 42 horas antes da induo da ovulao com GnRH para os

animais do grupo AP e 48 a 30 horas antes da induo da ovulao para os animais do grupo BP.

3.1.1 Exames ultrassonogrficos

Os exames ultrassonogrficos foram feitos via transretal utilizando-se tanto um

aparato Aloka SSD-500 equipado com uma sonda linear de 5MHz quanto um aparato Esaote

MyLab 10 e com sonda multifrequencial e frequncia selecionada entre 6 e 7.5 MHz.

Considerou-se como ovulao o momento do desaparecimento do folculo dominante presente

no ovrio no ltimo exame e aparecimento do corpo lteo na mesma regio do ovrio. Os


dimetros dos folculos e dos corpos lteos foram determinados pela mdia de duas medidas

perpendiculares de cada estrutura. Foi considerado folculo pr-ovulatrio a ltima medida do

folculo dominante antes da ovulao.

3.2 OBTENO DAS AMOSTRAS

3.2.1 Plasma para Mensurao de Progesterona

Nos dias -10, -6 e -2 a 7 foi coletado sangue da veia jugular dos animais em tubos

vacuolizados contendo heparina. Imediatamente aps a coleta, o sangue foi armazenado em

gelo e centrifugado a 1500 x g por 30 minutos a 4C. O plasma foi aliquoted a armazenado a -

20C at a realizao do radioimunoensaio com kit coat-a-count progesterone (Siemens

Medical Solutions Diagnostics) validado previamente para amostras de plasma bovino

(GARBARINO et al., 2004).

3.2.2 Endomtrio para Anlises de Expresso Gnica e Proteica

Aps o abate dos animais, o tero foi removido e a regio intercaruncular do

endomtrio foi dissecada, sendo obtidas pores do tero mdio do corno ipsilateral ao ovrio

com corpo lteo. As amostras foram congeladas em nitrognio lquido, maceradas e

armazenadas em criotubos a -80C at processamento para extrao de RNA e protena.

3.2.3 Corpo Lteo, Dados Morfolgicos

Os ovrios foram removidos, pesados e o corpo lteo separado, pesado e medido

com paqumetro. Foram feitas trs medidas do corpo lteo, altura, largura e profundidade e a

mdia dessas trs medidas foi considerado como dimetro. Para clculo do volume do corpo

lteo foi utilizada a frmula aritmtica do volume da esfera (V = 4/3R3) sendo R o valor da

metade do dimetro calculado.

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3.2.4 tero para Imunohistoqumica

Um corte transversal com mdia de 2,5 cm de dimetro e aproximadamente 5 mm

de espessura da poro medial do corno uterino ipsilateral ao corpo lteo foi obtido e mantido

em formol tamponado a 4C por 24 horas. As amostras foram lavadas com PBS e

armazenadas nesta soluo a 4C e lavadas novamente com PBS a cada 24h. Para

emblocamento em parafina, as amostras foram armazenadas em lcool 70% e enviadas ao

Laboratrio de Histopatologia do Departamento de Patologia da FMVZ-USP, onde foram

includas em paraplast utilizando-se os mtodos convencionais. Cortes de 2 m foram

preparados e aderidos a lminas silanizadas at a conduo das anlises de

imunohistoqumica.

3.3 PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS

3.3.1 Extrao de RNA

cido ribonucleico (RNA) total foi extrado das amostras de tecido utilizando Kit

RNeasy mini (Qiagen Laboratories), seguindo o procedimento indicado pelo fabricante.

Para maximizar a lise celular, as suspenses de tecido foram passadas pelo menos 10 vezes

por uma agulha 20G e centrifugadas a 13.000 x g durante 3 minutos, o sobrenadante foi

utilizado para o processamento atravs das colunas de slica. As colunas foram eludas com 40

L de gua tratada sem RNase. A concentrao e pureza do RNA foram estimadas por

NanoDrop (http://nanodrop.com/) pela absorbncia 260nm e pelas razes 260/280 e 260/230

respectivamente. As amostras foram armazenadas a -80C at a sntese de cDNA.

3.3.2 Sntese de cDNA

As amostras de RNA foram submetidas a sntese de cido desoxirribonucleico

complementar (cDNA). Um micrograma de RNA total foi tratado com DNAse I (Life

http://nanodrop.com/


Technologies) em temperatura ambiente em uma reao de volume total de 10L. Aps 15

minutos, foi adicionado um microlitro de soluo de EDTA (25mM) e o tubo foi aquecido a

65C por 10 minutos para inativar a DNAse I. Imediatamente aps o tratamento com DNAse

foi iniciado o protocolo de transcrio reversa utilizando o kit High-Capacity cDNA Reverse

Transcription kit (Life Technologies) conforme instrues do fabricante.

3.3.3 Extrao de Protenas

Amostras de tecido endometrial congeladas foram submersas em nitrognio

lquido e maceradas. O macerado foi pesado e colocado em microtubo adicionado de soluo

de extrao (Tris-base 50 mM; NaCl 300 mM, EDTA 1 mM; EGTA 1 mM; DTT 1 mM;

PMSF 0,5 mM; Glicerol 10%; Inibidor de protease; Triton) numa proporo de 10 mg de

tecido para 100 L de soluo e armazenado em gelo por 30 minutos. O homogenato

resultante foi passado repetidas vezes por uma agulha 40x12 mm e depois por uma agulha

30x8 mm sempre usando uma seringa de cinco mililitros. O microtubo contendo o

homogenato foi centrifugado a 10.000xg por 10 minutos a 4C. O sobrenadante foi aliquotado

e armazenado a 20C. A quantificao de protenas foi feita pelo mtodo Bradford.

3.4 ANLISES LABORATORIAIS

3.4.1 Reao Polimerase em Cadeia em Tempo Real (qPCR):

Para obteno dos dados de expresso gnica, anlises por qPCR foram

executadas, utilizando-se o aparato StepOnePlus Applied Biosystem. Cada reao teve o

volume de 20L conforme Tabela 1. Foi utilizada placa de 96 poos e fita adesiva

transparente para selar placas. O protocolo da reao de desnaturao, anelamento e curva de

dissociao est representado na Figura 4. Para garantir a confiabilidade dos resultados de

expresso gnica, seguiu-se uma sistemtica analtica conforme ilustrado da Figura 3. Para as

etapas de validao, utilizou-se um pool de cDNA constitudo por volumes iguais de cDNA


de 22 amostras de endomtrio, originrias tanto do grupo AP quanto BP. O pool de cDNA foi

primeiramente diludo numa proporo de 1:80 para realizao do teste de concentrao dos

primers. Para as reaes de curva padro o pool de cDNA foi diludo conforme tabela 2.

Figura 3- Fluxograma da quanficao de transcritos por qPCR


Primeiramente foi feito o desenho dos primers especficos para cada gene selecionado. Primers foram avaliados

segundo critrios de qualidade e utilizados apenas aps a confirmao de resultados satisfatrios. Realizaram-se

testes de concentrao de primers e curva padro. Aps escolha da concentrao de primers para a reao de

comparao entre grupos, foi realizada a comparao de abundncia de transcritos entre os tecidos dos animais

do grupo alta progesterona aps a ovulao (AP) e baixa progesterona aps a ovulao (BP). Para confirmao

da amplificao especfica da regio delimitada pelo par de primers, o produto da reao de qPCR foi separado

por eletroforese em gel de agarose. Buscou-se visualizar banda nica e com o peso molecular esperado para o do

produto de PCR. Confirmao definitiva da identidade do produto de PCR foi obtida por sequenciamento.

Tabela 1- Volumes (L) e descrio de reagentes utilizados para procedimentos com qPCR para teste de

concentrao de primers, curva-padro e comparao entre grupos

Concentrao

de Primer

Reagente

Total SyBR

Green

Primer

Senso

Primer

Anti-Senso gua cDNA

150nM 10 0,3 0,3 5,4 4,0 20

300nM 10 0,6 0,6 4,8 4,0 20

600nM 10 1,2 1,2 2,6 4,0 20


Figura 4- Condio de corrida de qPCR para anlise de abundncia de transcritos em extratos de tecidos

endometriais de vacas Nelore

Fonte: (StepOne Plus)

Estgio de espera: 95C por 10 minutos. 40 Ciclos: Desnaturao, aumento de temperatura e separao da fita

dupla (95C por 15 segundos), Anelamento, primers se ligam a sua regio homloga no cDNA (60C por 1

minuto). Curva de dissociao. 1, 2 e 3 indicam as etapas de cada estgio.

3.4.2 Desenho de Primers e Validao

Para amplificao de um produto nico em uma reao de polimerase em cadeia

(PCR), necessrio que os oligonucleotdeos iniciadores (primers) senso e anti-senso sejam

especficos para o gene a ser detectado. Para isso, os genes de interesse foram localizados na

base de dados da NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene) e o identificador (Representative

Public ID) de cada gene foi obtido. A ferramenta PrimerQuestQM

(IDT;

http://idtdna.com/Scitools/Applications/Primerquest) foi utilizada para determinar as

sequncias de pares de primers pelo fornecimento da identificao de cada gene

(representative public ID; Quadro 1). Cada par de primer foi avaliado quanto probabilidade

de formao de hairpins, homodmeros e heterodmeros de primers utilizando o programa

Oligo Analyzer 3.1 (IDT; http://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/).

Tais sequncias foram testadas quanto a sua especificidade usando o software Basic Local

Alignment Search Tool (Blast; http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Os pares de primers

escolhidos foram sintetizados por laboratrio terceirizado (https://commerce.invitrogen.com).

Os primers chegaram ao laboratrio liofilizados. Uma primeira re-suspenso foi feita com

gua tratada com DEPC livre de nucleases, gerando uma soluo de estoque com

concentrao de 100 mM, armazenada a -20C. Uma alquota dessa soluo foi diluda em

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genehttp://idtdna.com/Scitools/Applications/Primerquesthttp://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi


gua para fazer a soluo de trabalho, com concentrao de 20 mM. Esta soluo tambm foi

armazenada a -20C. Para validao dos primers, reaes de qPCR com concentraes finais

de cada reao de primers senso:anti-senso de 150:150 nM, 300:300 nM e 600:600 nM de

primers foram testadas em duplicata com um pool de cDNA de endomtrio de vrios animais.

Para a comparao dos resultados para a escolha da concentrao de primers a ser usada, os

dados fornecidos pelo software do aparato StepOnePlus foram analisados pelo software

LinRegPCR (Ramakers et al., 2003;

http://www.genequantification.de/download.html#linregpcr). A escolha foi feita considerando

a concentrao de primers que gerou: (1) eficincia da reao mais prxima a 100%, dentro

de um intervalo de 85 a 110%, (2) curva de dissociao com pico nico de amplificao para

reaes com cDNA e sem picos para reaes controle, sem cDNA e (3) a menor concentrao

limiar (Ct). Aps a escolha da concentrao de primers para cada transcrito analisado,

elaborou-se uma curva padro. Diluies seriadas de pool de cDNA de endomtrio bovino

conforme a tabela 1 foram usadas em duplicata e a concentrao de primers usada foi a

escolhida no teste anterior. Para aceitao da curva, valores de inclinao da curva padro

(slope), coeficiente de determinao (r) e eficincia, fornecidos pelo software do aparato

StepOnePlus foram analisados. Foram aceitas curvas com eficincia entre 83 e 110% e r

prximo de 1 (Tabela 3). Aps a validao dos primers, testes de qPCR para a comparao da

abundncia de cada transcrito entre os grupos AP e BP foram feitos utilizando cDNA na

diluio de 1:80 de cada animal em triplicata e a ciclofilina foi utilizada como gene

constitutivo para correo dos resultados.

http://www.genequantification.de/download.html#linregpcr

Material e Mtodos

Quadro 1 - Caractersticas dos primers utilizados nas quantificaes de transcritos das SLCs selecionadas

(Continua)

Gene Smbolo

do Gene

Identificao

(Representative

ID)

Sequncia primer senso (5-3) Sequncia primer anti-senso (5-

3) Referncias

Solute Carrier

Family 2 member 1 SLC2A1

NM_174602.2

ATCATCTTCACCGTGCTCCTGGTT TGTCACTTTGACTTGCTCCTCCCT PrimerQuest

Solute Carrier

Family 2 member 3 SLC2A3 NM_174603.3 CCGATAGAGGACATTTTGGAGG GATGGCGAAGATCAGAGGTG PrimerQuest

Solute Carrier

Family 2 member 4

SLC2A4

NM_174604.1 AGTTCCTAAGACAAGATGCCG AGAATACGCCAAGGACCAAG PrimerQuest

Solute Carrier

Family 2 member 5 SLC2A5 NM_001101042.1 AGTCTCCTGGCAAACGAAGA AAGAAGGGCAGGAAGAGGAG PrimerQuest

Solute Carrier

Family 5 member 1 SLC5A1 NM_174606.2 TCACCGCCCTTTACACAATC CACCATACCCTCCCACTTC PrimerQuest

36

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_174603.3http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_174606.2

Material e Mtodos

(Concluso)

Gene Smbolo

do Gene

Identificao

(Representative

ID)

Sequncia primer senso (5-3) Sequncia primer anti-senso (5-

3) Referncias

Solute Carrier

Family 34 member 4 SLC37A4 NM_001193045.2 TACGCCATCAGCAAGTTTGTGAGC AGGAACCAGAGAGCAGCAAAGACA PrimerQuest

ATPase, Na+/K+

transporting, alpha 2

polypeptide

ATP1A2 NM_001081524.1 TCCAGGGACACACAGAATGAGCTT ACCAAGGCAGGTCTCCTAATGCTT PrimerQuest

ATPase, Na+/K+

transporting, beta 2

polypeptide

ATP1B2 NM_174677.2 CTATGGTTACAGCACTGGACAG GGAACATAACGAAGTTGCCG PrimerQuest

Ciclofilina NM_178320.2 GCCATGGAGCGCTTTGG CCACAGTCAGCAATGGTGATCT

(BETTEGOW

DA et al.,

2006)

37

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_174677.2

38

Material e Mtodos

Tabela 2 - Ingredientes para preparao da curva padro de cDNA obtido a partir de extratos de endomtrio de

vacas Nelore (volumes em L)

Padro Soluo de

Origem

Volume da soluo de

origem Volume de H2O Volume final

1 Pool cDNA 20 0 20

1:20 1 1 19 20

1:40 1:20 10 10 20

1:80 1:40 10 10 20

1:160 1:80 10 10 20

3.4.3 Eletroforese

Para visualizao dos produtos de qPCR, eletroforese foi feita. Para isso, agarose

foi diluda em TBE (Tris/Borato/EDTA) numa concentrao de 2%. A soluo foi aquecida

seguidas vezes em forno micro-ondas em potncia mxima at iniciar a fervura, entre um

aquecimento e outro a soluo foi homogeneizada, at que a agarose estivesse totalmente

diluda. Utilizou-se corante fluorescente de cidos nucleicos GelRedTM

(1L/100mL;

Biotium). Aps resfriar at 50C a soluo foi despejada lentamente no suporte para gel com

pente para oito poos evitando a formao de bolhas.

Aps solidificao do gel, o pente foi retirado lentamente e o suporte foi alocado

adequadamente na cuba para eletroforese (Hoefer HE33, mini submarine eletrophoresis unit)

com a extremidade onde se localizam os poos voltada para o eletrodo negativo. A cuba foi

preenchida com TBE 0,5x at cobrir o gel. Oito microlitros do produto de PCR foram

adicionados a dois microlitros de tampo de corrida 5x (loading buffer) e dez microlitros

desta soluo foi colocado em cada poo do gel. Para cada gene testado, foi feito um controle

positivo e um controle negativo. Para identificao do tamanho dos amplicons foi utilizado

padro de corrida de 100 pares de bases (Promega Corporation). A corrida do gel foi feita a

uma tenso de 150V por 45 minutos. Aps a corrida as bandas foram escaneadas usando

fotodocumentador (DNR Bio-Imaging Systems; MiniBis Camera) com luz UV e o software

GelCapture. Buscou-se identificar o peso molecular da banda em comparao ao padro de

corrida e o tamanho do amplicon esperado para confirmar a amplificao somente da regio

especfica delimitada pelos pares de primers. Alm disso, esperou-se que os poos contendo

amostras referentes ao controle negativo no apresentassem bandas.

39

Material e Mtodos

3.4.4 Sequenciamento de Produtos de PCR

Para sequenciamento da poro amplificada na reao, produtos de PCR foram

purificados utilizando QIAquick

PCR Purification Kit (Qiagen Laboratories). Os produtos

de PCR foram quantificados por NanoVue (GE Life Sciences). As amostras foram diludas e

acrescidas das solues dos respectivos primers (somente as solues com primers senso) e

encaminhadas para o Centro de Estudos do Genoma Humano da Universidade de So Paulo.

As sequncias dos resultados foram acessadas pelo software Chomas

(http://technelysium.com.au/) e testadas quanto a sua especificidade usando o software Basic

Local Alignment Search Tool (Blast; http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

3.4.5 Western Blot

Os extratos proteicos de quatro animais do grupo alta progesterona e de quatro

animais do grupo baixa progesterona foram diludos para a concentrao final de 3,34g/L.

Cinquenta microgramas de protena total de cada amostra foram fracionados

eletroforeticamente em gel de poliacrilamida a 10%. O fracionamento foi realizado em cuba

de eletroforese Bio-Rad durante 120 minutos, em tampo de corrida, em tenso de 160 volts.

Aps a eletroforese, o gel foi equilibrado em tampo de transferncia e submetido

transferncia de protenas para uma membrana de nitrocelulose. Utilizou-se membrana de

nitrocelulose (Amersham Hybond ECL Nitrocellulose Membrane, GE Healthcare) para a

transferncia mida, realizada em cuba de transferncia Bio-Rad, durante 14 horas, em

corrente de 60 mA. Aps a transferncia a membrana foi submetida ao bloqueio de ligaes

inespecficas sendo utilizada soluo de TBS contendo 0,1% de tween-20 e 5% de leite

desnatado por 90 minutos.

A membrana foi ento lavada em TBS-tween-20 (0,1% v/v) TBST, quatro vezes

por 10 minutos cada lavagem. A incubao com o anticorpo primrio foi feita por 1 hora, em

temperatura ambiente, usando-se os anticorpos anti Glut 1 (SLC2A1; Santa Cruz

Biotechnology, Inc; sc-1605) na diluio de 1:500 em TBST e 1% de BSA; anti Glut 4

(SLC2A4; Milipore; #07-1404) na diluio de 1:100 em TBST e 1% de BSA e Anti actina

(Monoclonal anti actin peroxidase produzida em camundongo; Sigma A3854) na diluio

de 1:100000 em TBST e 5% de leite. Posteriormente a membrana foi lavada com TBST,

quatro vezes por 10 minutos. Aps as lavagens as membranas foram incubadas em anticorpo

http://technelysium.com.au/http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

40

Material e Mtodos

secundrio (donkey anti goat, IgG-HRP; SC 2020, Santa Cruz Biotechnology) diluio

1:10000 (anticorpo primrio anti Glut 1), e anticorpo secundrio (goat anti rabbit IgG-HRP;

SC 2004, Santa Cruz Biotechnology), diluio 1:10000 (anticorpo primrio Glut 4) por 60

minutos. Nova lavagem foi realizada em TBST, quatro vezes por 10 minutos.

As membranas foram incubadas em soluo de quimioluminescente (ECLTM

Prime Western Blot Detection Reagent, GE Healthcare) na diluio 1:1, por 1 minuto. A

membrana ento foi exposta captao de quimioluminescncia em filme de raio X Kodak

MXG, durante 1 minuto.

As bandas foram identificadas conforme o peso esperado em Kilodaltons (Kd).

Foi utilizado o software ImageJ freeware (WS Rasband, National Institutes of

Health, Bethesda, MD; http://rsb.info.nih.gov/ij/) para avaliao da densitometria das bandas.

Uma caixa desenhada de forma que esta cubra a rea da maior banda do blot, incluindo o

mnimo possvel da rea em torno da banda. A mesma caixa utilizada para todas as bandas e

ainda para medir o background acima de cada banda. Este background utilizado para

corrigir o sinal da banda. O sinal corrigido da GLUT 1 dividido/normalizado pelo sinal

corrigido da -actina. Posteriormente, a mdia dos valores normalizados do grupo LP usada

para normalizar todos os valores individuais normalizados. Estes valores normalizados pela

mdia do grupo LP so utilizados para clculo da mdia, erro padro e comparao de mdias.

3.4.6 Imunohistoqumica

Lminas silanizadas foram desparafinadas em banhos de Xilol I e II e reidratadas

em banhos em gradiente de lcool (lcool absoluto I e II, lcool 90%, lcool 70%) e gua

destilada. Em seguida, as amostras foram mantidas em soluo de citrato (acido ctrico

monohidratado e citrato de sdio) por cinco minutos. Na sequncia, as lminas submersas em

soluo de citrato foram fervidas em forno micro-ondas, por 5 minutos em potncia alta por 3

vezes, a cada intervalo gua destilada era adicionada para compensar o volume evaporado.

Depois de retiradas do micro-ondas, as lminas permaneceram por 20 minutos em tampo

citrato, em temperatura ambiente, para resfriar. Foram ento realizadas duas lavagens em gua

destilada e uma em PBS com triton, com durao de 5 minutos cada lavagem. O bloqueio foi

feito com perxido de hidrognio em metanol, por 30 minutos. Aps o bloqueio foram feitas

3 lavagens em PBS com triton, de 5 minutos cada uma, com agitao. Aps as lavagens que

sucedem o bloqueio, as lminas foram encaixadas em placas (Shandon CoverplateTM

; Thermo

http://rsb.info.nih.gov/ij/

41

Material e Mtodos

Scientific). Aps 15 minutos em soluo bloqueadora de protena casena (Protein block

Serum-Free, X0909, Dako North America, Inc), 100 L da soluo de anticorpo (Quadro 2)

foi incubada em cmara mida a 4C por 22 horas. Aps perodo de incubao do anticorpo

primrio, foram feitas trs lavagens de 5 minutos com PBS com triton e na sequncia

procedeu-se a incubao do anticorpo secundrio universal biotinilado (Biotinylated Link; kit

Dako LSAB + System-HRP, K0679, Dako North America, Inc) por 15 minutos. Passado esse

tempo, foram feitas 3 lavagens de 5 minutos com PBS com triton seguidas por incubao da

soluo amplificadora estreptavidina-peroxidase (Streptavidin-HRP; kit Dako LSAB +

System-HRP, K0679, Dako North America, Inc) por 15 minutos. As lminas foras retiradas

dos suportes e mantidas em cmara mida para incubao com Diaminobenzidina (DAB;

DAB + Subtrate buffer; kit Dako LSAB + System-HRP, K0679, Dako North America, Inc).

Aps 5 minutos com DAB, as lminas foram submersas em gua destilada para retirar o

excesso e ento foram feitas 3 repeties de banho em gua destilada com agitao por 10

minutos cada. As lminas foram contracoradas em hematoxilina de Harris filtrada por 30

segundos e enxaguadas em gua corrente por 10 minutos. Aps a lavagem, as lminas foram

fixadas em gradiente de lcool (70%, 90%, absoluto I e II) e Xilol I e II por dois minutos em

cada soluo, e fechadas com permount e lamnula. Lminas referentes aos controles

negativos receberam o mesmo tratamento que as demais, porm foram incubadas com

PBS+Triton no lugar dos anticorpos primrios.

Quadro 2- Anticorpos usados na Imunohistoqumica

Anticorpo Isotipo Epitope Diluio Fornecedor

SLC2A1 IgG

Policlonal

Cabra

C-terminus 1:50 Santa Cruz

Biotechnology, Inc

(sc-1605)

SLC2A4 IgG

Policlonal

Coelho

C-Terminus 1:200 Milipore (#07-1404)

3.5 ANLISE ESTATSTICA

Os dados foram examinados para a normalidade dos resduos usando o teste

Shapiro-Wilk. Os dados que no seguiram a normalidade dos resduos foram transformados

42

Material e Mtodos

por rank. As concentraes de progesterona entre os dias 1 e 7 foram analisadas por anlise de

varincia (ANOVA) com medidas repetidas no tempo, considerando-se o efeito aleatrio de

vaca e os efeitos fixos de tratamento, dia e interao tratamento e dia utilizando-se o PROC

mixed do software SAS (Verso 9.2; SAS Institute). Teste t de student no pareado foi usado

para comparar mdias entre os dois grupos dentro de cada dia. O teste de DMS (Diferena

Mnima Significativa) foi utilizado para as comparaes entre dias dentro de cada grupo. Para

as variveis discretas (dimetro do folculo e CL, volume e peso do CL, taxa de aumento da

progesterona, progesterona no D7, diferenas entre expresso gnica relativa e abundncia de

protenas) as comparaes foram feitas pelo teste t Student.

43

Resultados e Discusso

4 RESULTADOS E DISCUSSO

4.1 MODELO ANIMAL

Primeiramente, as avaliaes realizadas visaram aferir a eficincia do manejo

reprodutivo e estabelecer o modelo experimental. Variveis relativas ao crescimento dos

folculos dominantes e corpos lteos e ainda as concentraes de progesterona aps a

ovulao foram avaliadas em cada grupo.

Em bovinos de corte, menores concentraes de progesterona durante o

crescimento do folculo dominante aumentam seu dimetro e capacidade estroidogenica.

Corpos lteos resultantes da ovulao de tais folculos apresentam maior volume e atividade

esteroidogenica (VASCONCELOS et al., 2001; PFEIFER et al., 2009).

Com base nessas informaes, o modelo animal utilizado nessa tese visou gerar

grupos de animais com distintos perfis endcrinos no perodo peri-ovulatrio. De fato, os

animais do grupo AP tiveram maior dimetro do folculo pr-ovulatrio comparado aos

animais do grupo BP. O maior dimetro do folculo pr-ovulatrio foi acompanhado pela

formao de um corpo lteo que no dia 7 apresentou maior dimetro, peso e volume (Figura

5).

No houve efeito do grupo na avaliao da dinmica temporal das alteraes de

progesterona do dia 1 ao dia 7 aps a induo da ovulao, porm houve efeito do dia e da

interao entre grupo e dia (P

44


Figura 5- Comparaes das medidas de folculo e corpo lteo entre os animais dos grupos alta progesterona aps

a ovulao (AP) e baixa progesterona aps a ovulao (BP)

Fonte: (LFEM, 2012)

(A) Comparao do dimetro do folculo pr-ovulatrio entre os grupos; (B) Comparao do dimetro do corpo

lteo no dia 7 (D0= dia da aplicao do GnRH) entre os grupos; (C) Comparao do volume do corpo lteo no

dia 7 entre os grupos; (D) Comparao do peso do corpo lteo no dia 7 entre os grupos (mdia erro padro da

mdia; asterisco: P < 0,05).

45


Figura 6- Dinmica temporal das alteraes das concentraes plasmticas de progesterona do dia 1 at o dia 7

dos animais dos grupos alta progesterona aps a ovulao (AP) e baixa progesterona aps a ovulao (BP)

Fonte: (LFEM, 2012)

Mdia erro padro da mdia; dois asteriscos: P

46


4.2 EXPRESSO GNICA

Primeiramente foi realizado o processo de validao dos primers. Pares de primers

que atingiram valores satisfatrios para os parmetros adotados (Quadro 3) foram utilizados

para reaes de qPCR para comparao da abundncia de transcritos entre os grupos.

Para confirmao da especificidade dos produtos amplificados nas reaes de

qPCR, tais produtos foram estudados em gis de agarose. Foram comparados os pesos

moleculares dos amplicons obtidos com os estimados durante o desenho dos primers (Figura

8).

Figura 8- Eletroforese em gis de agarose para separao de produtos de PCR de genes que codificam as SLCs


Bandas especficas indicam peso dos produtos de PCR dos genes SLC2A1 (A), SLC2A3 (B), SLC2A4 (C),

SLC2A5 (D), SLC5A1 (E), SLC37A4 (F), ATP1A2 (G) e ATP1B2 (H). Padro de corrida 100 pares de bases

(P). Controle Positivo (CP). Controle Negativo (CN). Pares de bases (pb).

Os resultados dos gis de agarose confirmam a amplificao das sequncias

referentes aos primers especificados, pois apresentaram banda nica e com o peso molecular

esperado.

47


Avaliou-se a abundncia de transcritos de genes relacionados ao transporte

facilitado de glicose, os membros da famlia SLC2A, que codificam as protenas da famlia

conhecida como GLUT. Os genes testados foram SLC2A1, SLC2A3, SLC2A4 e SLC2A5. A

abundncia de transcritos referentes a esses genes no foi alterada pela manipulao do

crescimento do folculo pr-ovulatrio e consequente diferena entre os grupos nas

concentraes de progesterona no dia 7 aps a induo da ovulao (p>0,05; Figura 9).

O segundo grupo de genes avaliados engloba um membro da famlia de

transportadores de glicose dependente de sdio, o SLC5A1, e outros genes relacionados ao

transporte de glicose, ATP1B2 e SLC37A4. A exposio de vacas ovariectomizadas a

progesterona foi capaz de promover um aumento na expresso gnica de SLC5A1 e ATP1B2

(SHIMIZU et al., 2010). A expresso desses dois genes provavelmente est relacionada, visto

que a SLC5A1 depende de sdio para realizar o transporte de glicose pela membrana celular,

enquanto a ATP1B2 fica responsvel por manter a homeostase inica durante o transporte de

solutos, neste caso a glicose, atravs de bomba de sdio/potssio.

As sequncias amplificadas pelo PCR determinadas pelo sequenciamento foram

especificamente homlogas somente aos genes testados com pelo menos 90% de homologia.

As sequncias referentes aos genes SLC2A4 e ATP1A2 no foram especficas para nenhum

gene, isso se deve provavelmente a uma falha na tcnica devido ao tamanho reduzido do

amplicon, porm como o tamanho da banda do produto de PCR foi confirmado por

eletroforese, os resultados foram considerados fidedignos. Novo sequenciamento ser

realizado para reavaliao dos resultados utilizando-se os primers senso e anti-senso, ao invs

de apenas os primers senso como na anlise atual. Caso seja ainda impossvel se determinar a

sequncia, novos primers sero desenhados visando-se obter amplicons de tamanho mais

adequado ao sequenciamento (>150 pb).

Estudos anteriores de outros grupos foram capazes de provocar diferenas na

expresso gnica de protenas transportadoras de glicose no endomtrio de ruminantes

(FORDE et al., 2009; SHIMIZU et al., 2010), porm atravs do uso de protocolos

farmacolgicos que em relao ao protocolo usado no presente estudo so menos semelhantes

a eventos fisiolgicos de oscilaes dos hormnios esteroides nos momentos que circundam a

ovulao.

48


Quadro 3-Caracterstica das reaes de amplificao e da curva-padro para validao de pares de

primers

Gene Smbolo

do Gene

Identificao

(Representative

ID)

Inclinao

curva-

padro

(Slope)

r

Eficincia

curva-

padro (%)

Eficincia

Amplificao

(%)

Solute Carrier

Family 2 member 1 SLC2A1

NM_174602.2

-3,536 0,99 91,77 88

Solute Carrier

Family 2 member 3 SLC2A3 NM_174603.3 -3,252 0,98 102,999 89

Solute Carrier

Family 2 member 4

SLC2A4

NM_174604.1 -3,43 0,94 95,668 84

Solute Carrier

Family 2 member 5 SLC2A5 NM_001101042.1 -3,42 0,99 96,072 89,2

Solute Carrier


Solute Carrier


A

efeito do ambiente endócrino peri-ovulatório na expressão gênica e

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