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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS

ESCOLA DE VETERINÁRIA E ZOOTECNIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL

EFEITO DEPRESSOR E TOXICIDADE DO EXTRATO ETANÓLICO

DA CASCA DE Aspidosperma subincanum (APOCYNACEAE) EM

CAMUNDONGOS

Luciana Silva de Carvalho

Orientador: Prof. Dr. Adilson Donizeti Damasceno

GOIÂNIA

2013

ii

TERMO DE CIÊNCIA E DE AUTORIZAÇÃO PARA DISPONIBILIZAR AS TESES E

DISSERTAÇÕES ELETRÔNICAS (TEDE) NA BIBLIOTECA DIGITAL DA UFG

Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade Federal de Goiás (UFG) a disponibilizar,

gratuitamente, por meio da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações (BDTD/UFG), sem ressarcimento dos direitos autorais, de

acordo com a Lei nº 9610/98, o documento conforme permissões assinaladas abaixo, para fins de leitura, impressão e/ou download,

a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.

1. Identificação do material bibliográfico: [ x ] Dissertação [ ] Tese 2. Identificação da Tese ou Dissertação

Autor (a): Luciana Silva de Carvalho

E-mail: [email protected]

Seu e-mail pode ser disponibilizado na página? [ x ]Sim [ ] Não

Vínculo empregatício do autor sim

Agência de fomento: não Sigla:

País: Brasil UF:GO CNPJ:

Título: EFEITO DEPRESSOR E TOXICIDADE DO EXTRATO ETANÓLICO DA CASCA DE Aspidosperma subincanum

(APOCYNACEAE) EM CAMUNDONGOS

Palavras-chave: Aspidosperma subincanum, farmacológico, toxicidade

Título em outra língua: DEPRESSOR EFFECT AND TOXICITY OF THE ETHANOLIC EXTRACT BARK OF Aspidosperma

subincanum (APOCYNACEAE) IN MICE

Palavras-chave em outra língua: Aspidosperma subincanum, pharmacological, toxicity

Área de concentração: PCC

Data defesa: (dd/mm/aaaa) 30/08/2013

Programa de Pós-Graduação: MESTRADO EM CIÊNCIA ANIMAL

Orientador (a): Prof. Dr. Adilson Donizeti Damasceno

E-mail: [email protected]

Co-orientador (a):* Profa. Dra. Veridiana M. B. D. de Moura - EVZ/UFG

Profa. Dra. Rosângela de O. A. Carvalho

E-mail: [email protected]; [email protected]

*Necessita do CPF quando não constar no SisPG

3. Informações de acesso ao documento:

Concorda com a liberação total do documento [ X ] SIM [ ] NÃO1

Havendo concordância com a disponibilização eletrônica, torna-se imprescindível o envio do(s) arquivo(s) em formato

digital PDF ou DOC da tese ou dissertação.

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as teses e ou dissertações, antes de sua disponibilização, receberão procedimentos de segurança, criptografia (para não permitir

cópia e extração de conteúdo, permitindo apenas impressão fraca) usando o padrão do Acrobat.

Luciana Silva de Carvalho Data: 07/09/2013

Assinatura do (a) autor (a)

1 Neste caso o documento será embargado por até um ano a partir da data de defesa. A extensão deste prazo

suscita justificativa junto à coordenação do curso. Os dados do documento não serão disponibilizados durante

o período de embargo.

mailto:[email protected]

LUCIANA SILVA DE CARVALHO

EFEITO DEPRESSOR E TOXICIDADE DO EXTRATO ETANÓLICO

DA CASCA DE Aspidosperma subincanum (APOCYNACEAE) EM

CAMUNDONGOS

Dissertação apresentada para

obtenção do título de Mestre em

Ciência Animal junto à Escola de

Veterinária e Zootecnia da

Universidade Federal de Goiás

Área de concentração:

Patologia, clínica e cirurgia animal

Orientador:

Prof. Dr. Adilson Donizeti Damasceno

Comitê de orientação:

Profa. Dra. Veridiana M. B. D. de Moura - EVZ/UFG

Profa. Dra. Rosângela de O. A. Carvalho - EVZ /UFG

GOIÂNIA

2013

v

AGRADECIMENTOS

Ao Criador, minha eterna gratidão pela oportunidade da vida, de poder

aprender e evoluir como ser humano.

Ao meu orientador, Prof. Dr. Adilson Donizeti Damasceno, agradeço

por todo o apoio, disponibilidade, colaboração e comprometimento com o projeto.

A Profa. Dra. Rosângela de O. A. Carvalho e Yandra Cássia Lobato do

Prado pela colaboração na correção deste trabalho visando uma melhora integral

desta dissertação.

Ao Prof. Dr. Fabiano José Ferreira de S'antana da Faculdade de

Agronomia e Veterinária da UnB, pelo inestimado auxílio em colaborar com a

confecção, leitura e fotografias das lâminas histológicas.

Aos professores da Escola de Veterinária e Zootecnia da UFG, pela

disponibilidade e pelo profissionalismo vivido.

Um especial agradecimento ao Helton Freires Oliveira, pelo

profissionalismo e disponibilidade em me auxiliar na realização dos exames

laboratoriais.

A Profa. Dra. Renata Mazaro e Costa do Departamento de Ciências

Fisiológicas-Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Goiás por

ter cedido o biotério e o laboratório para a realização do projeto.

Ao Adryano Augustto Valladão de Carvalho do Instituto de Ciências

Biológicas, Universidade Federal de Goiás pela instrução durante o projeto.

Ao Prof. Dr. Emmanuel Arnhold pela colaboração na análise estatística

deste experimento.

À minha companheira de vários momentos vividos durante o mestrado,

Thays Nascimento Costa, pelo apoio, colaboração e pela amizade cultivada

nestes anos.

Ao meu namorado Brunno Medeiros dos Santos pelo apoio, carinho e

colaboração na realização deste trabalho.

Ao meu irmão Flávio Silva de Carvalho por todo o apoio e auxílio

prestado desde o início deste estudo.

vi

À minha família, meus pais, meus irmãos, pelo apoio e pelo melhor que

me proporcionaram.

O meu respeito aos animais e plantas que contribuíram para a

realização deste trabalho científico.

Enfim, a todos que colaboraram direta ou indiretamente e que tiveram

importância na realização deste trabalho.

vii

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO .................................................................................................... 1

2 REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................... 3

2.1 Plantas medicinais ............................................................................................ 3

2.2 Aspidosperma subincanum .............................................................................. 7

2.3 Alcalóides ....................................................................................................... 10

2.4 Reações adversas às plantas medicinais ....................................................... 11

2.5 Avaliação da toxicidade das plantas medicinais ............................................. 12

3 Objetivos ........................................................................................................... 17

3.1 Geral ............................................................................................................... 17

3.2 Específicos ..................................................................................................... 17

4 MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................. 18

4.1 Local do experimento ..................................................................................... 18

4.2 Descrição dos animais ................................................................................... 18

4.3 Alojamento e manejo dos animais .................................................................. 18

4.4 Material botânico ............................................................................................ 19

4.4.1 Obtenção do extrato .................................................................................... 19

4.5 Ensaios toxicológicos ..................................................................................... 20

4.5.1 Determinação da toxicidade aguda dose única ........................................... 20

4.5.2 Determinação da toxicidade subcrônica em dose fixa ................................. 23

4.6 Ensaios farmacológicos .................................................................................. 24

4.6.1 Triagem farmacológica ................................................................................ 24

4.6.2 Avaliação da atividade no sistema nervoso central ..................................... 25

viii

4.7 Análise estatística ........................................................................................... 26

5 RESULTADOS .................................................................................................. 27

5.1 Determinação da toxicidade aguda dose única .............................................. 27

5.1.1 Screening Hipocrático ................................................................................. 27

5.1.2 Avaliação ponderal ...................................................................................... 28

5.1.3 Exames hematológicos e bioquímicos séricos ............................................ 29

5.1.4 Determinação da DL50 mediana ................................................................... 31

5.1.5 Avaliação anatomohistopatológica .............................................................. 31

5.2 Toxicidade subcrônica dose fixa..................................................................... 31

5.2.1 Screening Hipocrático ................................................................................. 31

5.2.2 Avaliação ponderal ...................................................................................... 33

5.2.3 Exames hematológicos e bioquímicos séricos ............................................ 34

5.2.4 Avaliação anatomohistopatológica .............................................................. 37

5.2.5 Avaliação dos índices dos órgãos ............................................................... 38

5.3. Triagem farmacológica .................................................................................. 38

5.3.1 Teste geral de atividade farmacológica em camundongos .......................... 38

5.3.2 Teste do campo aberto ................................................................................ 40

5.3.3 Potenciação do sono por barbitúrico ........................................................... 40

6 DISCUSSÃO ..................................................................................................... 42

7 CONCLUSÕES ................................................................................................. 49

8 CONSIDERAÇÕES FINAIS .............................................................................. 50

REFERÊNCIAS .................................................................................................... 52

ix

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 - Árvore da espécie Aspidosperma subincanum; (A) Vista geral; (B)

Aspecto da casca do caule. .................................................... 10

FIGURA 2 - Metodologia de ensaio de toxicidade aguda em dose única, a

partir da dose de 300 mg/kg em animais de laboratório; GHS=

Global Harmonized System; DL50= dose letal mediana. ......... 14

x

LISTA DE QUADROS

QUADRO 1 - Evolução cronológica de sinais de intoxicação aguda pelo

extrato etanólico da casca do caule de Aspidosperma

subincanum na dose única de 300 mg/kg, via oral, em

camundongos fêmeas Swiss (C1, C2 e C3) e a repetição (C1',

C2' e C3'). Goiânia, 2012. ....................................................... 28

QUADRO 2 - Evolução cronológica de sinais de intoxicação subcrônica pelo


subincanum, via oral na dose de 75 mg/kg, em camundongos

Swiss fêmeas (CF) e camundongos Swiss machos (CM) (n=5)

durante 28 dias e com solução de cloreto de sódio 0,9% (GT).

Goiânia, 2012.......................................................................... 32






Goiânia, 2012.......................................................................... 32






Goiânia, 2012.......................................................................... 33

QUADRO 5 - Relação entre as doses, via de aplicação e tempo em que se

manifestaram contorção, motilidade, convulsão clônica,

tremores grosseiros, fasciculações e cianose da orelha/pata em

camundongos submetidos a administração de 125, 250 e 500

xi

mg/kg de extrato etanólico de Aspidosperma subincanum.

Goiânia, 2012.......................................................................... 39

xii

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 - Média e desvios padrão dos pesos corporais (gramas) de

camundongos Swiss fêmeas (n=3) tratados via oral com 300

mg/kg e 2000 mg/kg de extrato etanólico da casca do caule de

Aspidosperma subincanum antes da exposição (M0d), sete

(M7d) e quatorze (M14d) dias após exposição. ......................... 29

TABELA 2 - Eritrograma e plaquetograma (média ± desvio padrão) de

camundongos Swiss fêmeas (n=3) tratadas com 300 e 2000

mg/kg de extrato etanólico da casca do caule de Aspidosperma

subincaum, administrado por via oral, dose única e com

solução de cloreto de sódio 0,9% (GT). Goiânia, 2012. .......... 29

TABELA 3 - Valores médios do leucograma (média ± desvio padrão) em

camundongos Swiss fêmeas (n=3) tratadas com extrato

etanólico da casca do caule de Aspidosperma subincanum na

dose de 300 mg/kg e 2000 mg/kg, via oral, dose única e com

solução de cloreto de sódio 0,9% (GT). Goiânia, 2012. .......... 30

TABELA 4 - Valores médios da dosagem sérica (média ± desvio padrão) de

AST, ALT, ureia e creatinina em camundongos Swiss fêmeas

(n=3) tratadas com extrato etanólico da casca do caule de

Aspidosperma subincanum na dose de 300 mg/kg e 2000

mg/kg, via oral, dose única e com solução de cloreto de sódio

0,9% (GT). Goiânia, 2012. ...................................................... 30


camundongos Swiss fêmeas (n=5) de GT75, GT150 e GT300,

tratados com extrato etanólico da casca do caule de


(M7d), quatorze (M14d), vinte e um (M21d) e vinte e oito (M28d)

dias após exposição. .............................................................. 33


camundongos Swiss machos (n=5) de GT75, GT150 e GT300,

xiii



(M7d), quatorze (M14d), vinte e um (M21d) e vinte e oito (M28d)

dias após exposição. .............................................................. 34


camundongos Swiss fêmeas (n=5) de GT75, GT150 e GT300


Aspidosperma subincaum, via oral, e com solução de cloreto

de sódio 0,9% (GT) 28 dias consecutivos. Goiânia, 2012. ..... 35


camundongos Swiss adultos machos (n=5) de GT75, GT150 e

GT300 tratados com extrato etanólico da casca do caule de

Aspidosperma subincaum, administrado por via oral, dose

única e com solução de cloreto de sódio 0,9% (grupo controle)

durante 28 dias consecutivos Goiânia, 2012. ......................... 35


camundongos Swiss adultos fêmeas (n=5) de GT75, GT150 e






camundongos Swiss adultos machos (n=5) de GT75, GT150 e






AST, ALT, ureia e creatinina em camundongos Swiss adultos

fêmeas (n=5) de GT75, GT150 e GT300 tratados com extrato

etanólico da casca do caule de Aspidosperma subincaum,

xiv

administrado por via oral, dose única e com solução de cloreto

de sódio 0,9% (grupo controle) durante 28 dias consecutivos

Goiânia, 2012.......................................................................... 37


AST, ALT, ureia e creatinina em camundongos Swiss adultos

machos (n=5) de GT75, GT150 e GT300 tratados com extrato


administrado por via oral, dose única e com solução de cloreto

de sódio 0,9% (grupo controle) durante 28 dias consecutivos.

Goiânia, 2012.......................................................................... 37

TABELA 13 - Peso relativo do encéfalo (média ± desvio padrão) de

camundongos machos e fêmeas de GT75, GT150 e GT300




durante 28 dias consecutivos. Goiânia, 2012. ........................ 38

TABELA 14 - Análise comparativa dos valores (média ± desvio padrão) dos

parâmetros do teste de campo aberto obtidos no GCAC,

GCA125, GCA250 e GCA500. Goiânia, 2012. ............................. 40

xv

RESUMO

O objetivo desta pesquisa foi estimar a toxicidade aguda, subcrônica e os efeitos

farmacológicos da casca do caule de guatambu (Aspidosperma subincanum) a

fim de verificar a possível ação do extrato etanólico desta planta no sistema

nervoso central de roedores. Para a determinação da toxicidade aguda foram

utilizados camundongos albinos (Mus musculus), fêmeas, que receberam por via

oral a dose única de 300 mg/kg e 2000 mg/kg do extrato. Para o teste da

toxicidade subcrônica foram avaliados camundongos albinos (Mus musculus)

machos e fêmeas que receberam por via oral a dose de 75 mg/kg, 150 mg/kg e

300 mg/kg do extrato, diariamente, durante 28 dias. Para a realização dos testes

farmacológicos, utilizou-se a dose de 125 mg/kg, 250 mg/kg e 500 mg/kg por via

oral em camundongos machos. Os animais apresentaram alguns sinais de

neurotoxicidade, tais como, tremores, alterações de marcha e convulsões. Tais

sinais tiveram a intensidade proporcional à concentração do extrato, e foram letais

na dose de 2.000 mg/kg. Observou-se que em condições agudas ou subcrônicas,

dependendo da dose administrada, do tempo e freqüência de exposição e das

vias de administração, o extrato etanólico de Aspidosperma subincanum deve ser

considerado um agente tóxico.

Palavras-chave: Aspidosperma subincanum, farmacológico, toxicidade.

xvi

ABSTRACT

The objective of this research was to estimate the acute toxicity, subchronic and

the pharmacological effects of the ethanol extract of the stem bark of guatambu

(Aspidosperma subincanum) in rodents. To carry out the acute toxicity it was used

albino female mice (Mus musculus) that received a single oral dose of 300 mg/kg

and 2000 mg/kg of the extract. As for the subchronic toxicity test were evaluated

mice (Mus musculus) males and females that received the oral dose of 75 mg/kg,

150 mg/kg and 300 mg/kg of the extract daily for 28 days. To achieve the

pharmacological tests, it was used a dose of 125 mg/kg, 250 mg/kg and 500

mg/kg orally in male mice.The animals showed some signs of neurotoxicity such

as tremors, changes in the gait and convulsions. Such signals have the intensity

proportional to the concentration of the extract, and were lethal in the dose of 2000

mg/kg.It was observed that in acute or subchronic conditions, depending on the

dose, the timing and frequency of exposure and routes of administration, the

ethanol extract of Aspidosperma subincanum should be considered a toxic agent.

Keywords: Aspidosperma subincanum, pharmacological, toxicity.

1 INTRODUÇÃO

A utilização de plantas medicinais provavelmente é tão antiga quanto o

aparecimento da civilização humana, que procurava no reino vegetal, os

alimentos, o abrigo e os meios para o alívio de suas dores e cura para doenças

(OLIVEIRA & AKISUE, 2000).

Com o advento dos estudos científicos, verificou-se que as plantas são

uma fonte de diversos princípios com grande valor medicinal. Assim, diante desse

potencial arsenal terapêutico, as indústrias farmacêuticas vêm investindo em

pesquisa na busca de novos produtos bioativos em plantas (MOLL, 2006). Apesar

do aumento no uso de medicamentos sintéticos nos últimos anos, as plantas

medicinais vêm sendo empregadas ainda por muitas populações, até mesmo

como única fonte de tratamento de enfermidades (HALBERSTEIN, 2005).

O hábito do emprego terapêutico das plantas advém do baixo valor

monetário envolvido para a obtenção da forma in natura para uso e da impressão

ou crença de que são destituídas de efeitos tóxicos ou que não fazem mal, o que

não é verdade (CARLINI et al., 1988; FONSECA & PEREIRA, 2004). Por se

tratarem de um agente xenobiótico, ou seja, um composto estranho ao organismo

humano podem ser biotransformados em metabólitos tóxicos, de ação imediata,

mas também com efeitos em longo prazo, que de forma assintomática, pode levar

a quadros clínicos severos ou a reações indesejáveis, algumas vezes fatais,

dependendo da dose e frequência de uso (LAPA et al., 1999).

Não obstante às observações populares sobre o uso e a eficácia das

espécies medicinais contribuirem de forma relevante para a divulgação das

virtudes terapêuticas dos vegetais e auxiliar na seleção de espécies para estudos

botânicos, farmacológicos e fitoquímicos, verifica-se que as informações baseadas

no conhecimento tradicional não são suficientes para validar as plantas medicinais

como medicamentos eficazes e seguros, sendo necessária a avaliação da relação

risco/benefício do seu uso por meio de estudos farmacológicos e toxicológicos

(MACIEL et al., 2002; FARIAS, 2007).

2

O Sistema Nacional de Informações Tóxico-Farmacológicas (SINITOX)

apresentou o registro de 85.925 pessoas intoxicadas por plantas no Brasil no ano

de 2008, dessas, 441 morreram (SINITOX, 2008). Diante dessas informações,

reforça-se a necessidade da implementação de estudos toxicológicos com plantas,

garantindo a segurança de seu uso (SCHENKEL et al., 2003), pois tais números

permitem considerar que as intoxicações por plantas são casos de saúde pública.

Assim exposto, propõem-se neste estudo avaliar a segurança do

extrato etanólico da casca do caule de Aspidosperma subincanum, por meio de

estudo da toxicidade aguda, toxicidade subcrônica e testes farmacológicos,

visando a avaliação da ação do extrato no sistema nervoso central (SNC). Tal

proposta se alicerça em três vertentes: (1) estudo etnobotânico realizado em

Goiânia e cidades vizinhas em 1995 e 1998 por TRESVENZOL et al. (2006),

revelou a grande utilização do guatambu no tratamento do diabetes mellitus e da

hipercolesterolemia; (2) KOBAYASHI et al. (2002) identificaram, isolaram e

caracterizaram a estrutura química de seis alcaloides na espécie Aspidosperma

subincanum e; (3) FONSECA & PEREIRA (2004) descreveram que os alcaloides

podem provocar carcinogênese, toxidade hepática, neurológica e renal, sendo que

muitos ainda não foram objeto de investigação científica, principalmente, quanto à

toxicidade.

3

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Plantas medicinais

A Organização Mundial da Saúde (OMS) define planta medicinal como

sendo "todo e qualquer vegetal que possui, em um ou mais órgãos, substâncias

que podem ser utilizadas com fins terapêuticos ou que sejam precursores de

fármacos semissintéticos" (WHO, 1998).

Os chineses, egípcios, hindus e gregos foram os primeiros a catalogar

as ervas medicinais, classificando-as de acordo com a sua forma, cor, sabor e

aroma, incluindo ainda ligações com os astros e, evidentemente, seus atributos

“mágicos” (LIMA, 2006). Há relatos, por exemplo, do uso de plantas com

finalidades terapêuticas por volta de 3.000 a.C. na obra Pen Ts’ao do chinês Shen

Nung (TYLER, 1996; KO, 1999). No ano 78 d.C., o botânico grego Pedanios

Dioscorides (40-90 d.C.) realizou a primeira compilação sistemática de plantas,

descrevendo 579 plantas medicinais e 4.700 usos e formas de atuação dessas

plantas em uma obra de cinco volumes, intitulada De Materia Medica. Esse tratado

foi de grande importância para a medicina europeia, até o século XVII, e

permaneceu como fonte de referência para as farmacopeias modernas

(ROBBERS et al., 1997), sendo que a partir do século XIX, começou-se a

investigar suas bases terapêuticas (ELVIN-LEWIS, 2001).

No Brasil, a utilização das plantas como fonte terapêutica teve início

com os primeiros habitantes a chegarem ao Brasil, por volta de 12 mil anos atrás.

No entanto, pouco se conhece sobre esse período, além das pinturas rupestres

(SILVA & CARVALHO, 2004).

A flora brasileira foi descoberta por cientistas estrangeiros,

especialmente os naturalistas, que realizavam grandes expedições científicas no

Brasil desde o descobrimento até ao final do século XIX (SILVA & CARVALHO,

2004). Padre José de Anchieta, de 1560 a 1580, detalhou em suas cartas aos

Superiores Geral da Companhia de Jesus, as plantas comestíveis e medicinais do

Brasil. As plantas medicinais especificamente mencionadas foram: capim rei,

4

ruibarbo do brejo, ipecacuanha-preta, cabriúva-vemelha, “erva boa”, hortelã-

pimenta, que eram utilizadas pelos indígenas contra indigestão, nevralgias,

reumatismos, doenças nervosas, além do uso como purgativos, bálsamos e

cicatrização de feridas (SILVA & CARVALHO, 2004).

Até a metade do século XIX, pelo menos 80% dos medicamentos eram

derivados de plantas, que continuavam despertando o interesse dos

pesquisadores, embora a indústria farmacêutica tenha voltado seus interesses

para os fármacos sintéticos após a Revolução Industrial (GILANI & RAHMAN,

2005). Muitos fármacos foram originalmente descobertos por meio do estudo de

usos tradicionais, sendo que alguns deles não puderam ser substituídos, apesar

do avanço na química sintética (GILANI & RAHMAN, 2005).

Após a década de 1960, observou-se um desinteresse da indústria

farmacêutica e dos institutos de pesquisa pela busca de novas substâncias de

origem vegetal, acreditando-se que já haviam isolado as principais substâncias

ativas das drogas vegetais conhecidas, bem como já haviam realizado todas as

possíveis modificações químicas de interesse das mesmas (SCHENKEL et al.,

2003). Com o advento da industrialização, da urbanização e avanço da tecnologia

voltada à elaboração de fármacos sintéticos, a utilização desses medicamentos

aumentou muito, principalmente na população de maior poder aquisitivo,

diminuindo a utilização de plantas medicinais (TOMAZZONI et al., 2006). As

pesquisas com ervas medicinais foram deixadas de lado pelo grande avanço das

formas sintéticas (FRANCESCHINI FILHO, 2004). Além disso, o crescimento do

poder econômico das indústrias farmacêuticas e a ausência de comprovações

científicas de eficácia das substâncias de origem vegetal aliada às dificuldades de

controle químico, físico-químico, farmacológico e toxicológico dos extratos

vegetais até então utilizados, impulsionaram a substituição desses por fármacos

sintéticos (RATES, 2001).

O interesse pelas plantas medicinais no Brasil se intensificou na década

de 1980, quando a alta dos custos de aquisição dos medicamentos e o difícil

acesso da população à assistência médica e farmacêutica fez com que uma

parcela voltasse a usar plantas medicinais para minorar seus problemas de saúde

5

(SIMÕES et al., 2003). Outra razão é o fato das plantas medicinais representarem

a única fonte de medicamentos, especialmente nos lugares mais isolados e

distantes (BERG, 1993). Ademais, a preferência na utilização das plantas

medicinais decorre da facilidade de obtenção e do baixo custo (SIMÕES et al.,

2003).

Assim, o comércio de plantas medicinais tornou-se um suporte para

muitas famílias pobres multiplicando-se tanto nas pequenas quanto nas grandes

cidades (BRANDÃO, 1994). Os avanços técnicos e o desenvolvimento de novos

métodos de isolamento de substâncias ativas, a partir de fontes naturais,

permitiram maior rapidez na identificação de substâncias em amostras complexas

como os extratos vegetais, ressurgindo o interesse pela pesquisa dessas

substâncias como protótipos para obtenção de fármacos com atividades

terapêuticas semelhantes à dos compostos originais (ROBBERS et al., 1997). Tal

fato é comprovado pela evidência de que cerca de 25% dos fármacos prescritos

no mundo são obtidos direta ou indiretamente de plantas. Além disso, muitos dos

fármacos desenvolvidos são obtidos a partir de produtos naturais, ou análogos

semi-sintéticos ou ainda compostos sintéticos baseados em produtos naturais

(KOEHN & CARTER, 2005).

O emprego das plantas extrapolou o seu uso popular e passou a ser

vista como matéria-prima para o isolamento de compostos ativos, como a morfina,

um alcalóide obtido do ópio extraído da Papaver somniferum (Papoula) no início

do século XIX, que marcou o início do processo de extração de princípios ativos

de plantas (BALUNAS & KINGHORN, 2005). A partir de então, outros alcaloides

foram isolados, como por exemplo, a quinina (isolada de espécies de Cinchona

sp., nativa dos Andes), em 1819; a atropina e a escopolamina da Atropa belladona

(plantas da família das Solanáceas empregadas pelos antigos gregos) em 1831 e;

a reserpina (isolada de Rauwolfia serpentina, de uso popular na Índia) (TYLER

1996; SCHULZ et al., 2001).

As plantas medicinais desempenham um papel muito importante na

medicina moderna, pois podem fornecer fármacos importantes, os quais

dificilmente seriam obtidos via síntese química. Além disso, as fontes naturais

6

fornecem compostos que podem ser levemente modificados, tornando-os mais

eficazes ou menos tóxicos (ROBBERS et al., 1997).

Segundo a OMS, 65 a 80% da população mundial, especialmente em

países em desenvolvimento, utilizam produtos à base de plantas medicinais no

tratamento de suas doenças (RAHMAN & SINGHAL, 2002), sendo que parte da

população no Brasil se volta às práticas naturais, inclusive na área de saúde,

valorizando e utilizando remédios naturais, considerados menos tóxicos e,

consequentemente, menos agressivos (BARBOSA et al., 2001). No entanto, a

aplicação terapêutica das plantas não dispensa as evidências científicas, os

requisitos de segurança, eficácia, qualidade e uso racional e sustentável

(ARAÚJO, 2008).

A crença na naturalidade inócua das plantas medicinais não é

facilmente contradita, pois as evidências científicas de ocorrência de intoxicações

e efeitos colaterais relacionados com o uso das mesmas consistem em

informações que dificilmente chegam ao alcance dos usuários (SILVA et al., 2006;

ALEXANDRE et al., 2008). Assim, muitos consumidores acreditam que os

remédios feitos a partir de plantas medicinais, por serem naturais, são

efetivamente seguros (VEIGA JÚNIOR et al., 2005). Contudo, o que torna esta

situação ainda mais comprometedora é o fato de que muitas pessoas utilizam as

plantas medicinais sem orientação médica, fator que só aumenta os riscos ao

paciente, porque o médico pode errar seu diagnóstico em função das muitas

interações possíveis entre as plantas e os medicamentos prescritos na medicina

convencional (BIN et al., 2007). Acrescenta-se que a utilização inadequada de um

produto, mesmo de baixa toxicidade, pode induzir problemas graves desde que

existam outros fatores de risco como o uso concomitante de outros medicamentos

(COELHO, 1998; CORDEIRO et al., 2005).

Contudo, para que seja registrado, o medicamento à base de plantas

precisa ser estudado cientificamente, seguindo os mesmos critérios empregados

para o desenvolvimento dos medicamentos sintéticos, utilizando-se protocolos

científicos rígidos, segundo critérios aceitos internacionalmente para confirmar sua

segurança e eficácia clínica (CALIXTO, 2000).

7

2.2 Aspidosperma subincanum

O Brasil é um país privilegiado, pois detêm 23% do total de espécies de

planta existentes no planeta (RATES, 2001) e apresenta 50 a 56 mil espécies

vegetais descritas, o que confirma sua fama de detentora de uma grande

diversidade biológica (PIRES, 1999).

Em relação ao Cerrado, verifica-se que ocupa uma área

correspondente a dois milhões de quilômetros quadrados, isto é 23,92% do

território brasileiro, se estendendo pelo planalto central, congregando vários

estados que juntos concentram a maior parte da população brasileira (BRANCO,

2000; RODRIGUES & CARVALHO, 2001; GUARIM NETO & MORAIS, 2003).

Nesse bioma ocorre mais de 600 espécies medicinais (PIRES, 1999;

GUARIM NETO & MORAIS, 2003), o que comprova o seu grande potencial

medicinal, reconhecido historicamente por populações indígenas e sertanejas

(RIBEIRO et al., 1999) e determina um excelente cenário para o desenvolvimento

de pesquisas que visam a descoberta de novos princípios a partir de espécies

nativas (LEITE, 2008). Como exemplo, observa-se que o fruto da cagaita é

empregado como laxante; as folhas do caju possuem efeito antidiarréico; o vinho

extraído do tronco do jatobá funciona como antibronquítico; a lobeira é usada no

controle do diabetes mellitus, asma, gripes, resfriados e reumatismo; o chá ou a

pomada da mama-cadela são aplicados contra o vitiligo; e a polpa do pequi e a

pimenta-de-macaco indicados na prisão de ventre e cólica renal; a piteira utilizada

em enfermidades dos rins e fígado, tratamento de sarna e diurética; araticum

utilizado no tratamento de diarreia crônica e reumatismo; carqueja empregada no

tratamento do diabetes mellitus, obesidade, obstruções do fígado e verminose

(ALMEIDA et al., 1998; RODRIGUES & CARVALHO , 2001). Contudo, apesar do

conhecimento acumulado sobre a flora do Cerrado, ainda faltam estudos

dedicados à identificação de outras plantas com potencial terapêutico

(RODRIGUES & CARVALHO, 2001; GUARIM NETO & MORAIS, 2003).

8

Neste sentido, a Aspidosperma subincanum pode ser considerada uma

planta com grande potencial medicinal, com muitos aspectos farmacológicos e

tóxicos a serem melhores caracterizados. Conforme CORRÊA (1978) e DE LA

CRUZ (1997), a Aspidosperma subincanum é popularmente conhecida como

Guatambu, Pau-pereiro, Pau-pereira-do-mato, Peroba-vermelha, Pau-peroba e

Perobinha. É uma árvore de porte médio (Figura 1A), de aproximadamente 15 a

20 metros de altura e tronco de 40 a 50 cm de largura, nativa da região do cerrado

mato-grossense do Brasil, podendo ser encontrada em alguns estados do Brasil

como São Paulo, Minas Gerais, Mato Grosso, Goiás e Mato Grosso do Sul. As

flores desta planta podem ser encontradas entre os meses de setembro e

novembro (CORRÊA, 1978; DE LA CRUZ, 1997).

Pertence à família Apocynaceae (Dicotyledonae), que possui cerca de

200 gêneros e 4000 espécies tropicais e subtropicais, sendo algumas poucas

registradas nas regiões temperadas. Inclui espécies arbustivas, herbáceas,

arbóreas, muitas das quais trepadeiras e suculentas. Os gêneros mais importantes

desta família são: Alstonia, Aspidosperma, Rauwolfia, Vinca, Tabernaemontana,

Mandevilla, Hancoria, Nerium, Catharanthus, Allamanda, Thevetia, Himatanthus,

Wrightia (CÔRREA, 1978; JOLY, 1998; GOMES & CAVALCANTI, 2001).

Apresentam grande importância tanto do ponto de vista econômico

como científico, pois além de serem fornecedoras de madeira nobre, com larga

aplicação na carpintaria (LORENZI, 1998), a maioria das espécies deste gênero

são objetos de extensas investigações na busca de novas substâncias com

atividades biológicas (DI STASI, 1996).

O gênero Aspidosperma é constituído por cerca de 260 espécies que

podem ser encontradas desde o México até a Argentina, e é caracterizado por ser

fonte de alcalóides indólicos, substâncias nitrogenadas com potentes ações

biológicas. Toda a planta é bastante amarga o que pode ser atribuído aos seus

alcalóides; esse amargor até certo ponto, facilita seu reconhecimento, mesmo

quando totalmente desfolhada ou sem flores ou frutos (JACOME et al., 2004). No

Brasil foram catalogadas cerca de 52 espécies desse gênero, praticamente

9

distribuídas em todos os ecossistemas (CORRÊA, 1978), tais como, caatinga,

cerrado e florestas (AMORIM et al., 2005).

Muitos destes alcalóides, típicos do gênero Aspidosperma, possuem

geralmente atividade biológica marcante, tendo sua importância farmacológica

relatada, devido sua atividade antitumoral, antiviral, antimicrobiana, analgésica,

antimalárica, e bloqueadores dos receptores α-2 adrenérgicos (OLIVEIRA, 1999).

São empregados largamente como hipotensor arterial, simpatolítico, diurético,

vasoconstrictor periférico, estimulante respiratório, anestésico, agente bloqueador

adrenérgico, espasmogênico intestinal, sedativo e relaxante do músculo

esquelético (GARRETT & GRISHAM, 1995).

As preparações na forma de infusos e decoctos da casca (Figura 1B)

do caule da Aspidosperma subincanum são largamente utilizadas pela população

para o tratamento de diabetes mellitus, hipercolesterolemia, distúrbios gástricos e

como emagrecedor (CORRÊA, 1978; GOMES & CAVALCANTI, 2001). Por meio

de estudos fitoquímicos, foram isolados das cascas o ácido oleico e os alcaloides

indólicos subincanidinos A-C, subincanidinos D-E e subincanidinos F

(KOBAYASHI et al., 2002; PORTO et al., 2004). O alcaloide guatambuína e o

ácido oleico foram isolados do Aspidosperma subincanum por CECHINEL FILHO

& YUNES (1998).

PORTO et al. (2004) realizaram uma investigação fitoquímica de

frações clorofórmicas resultantes dos extratos etanólicos do caule e raízes de

Aspidosperma subincanum, isolando três alcaloides indólicos pirocarbazóis.

Destes, um foi identificado como sendo a olivacina (1,5 dimetil-6H-piridol [4,3- b]

carbazol), uma substância com atividade antitumoral, de ocorrência comum no

gênero tendo sido previamente descrita nesta espécie. Outro alcalóide teve sua

estrutura determinada como sendo a guatambuína (Nb-metiltetraidroolivacina),

presente no gênero Aspidosperma. Para o terceiro alcalóide foi proposto por

PORTO et al. (2004), a estrutura do 2,11-dimetil-1OH-pirido[2,3-b-]carbazol.

10

FIGURA 1 - Árvore da espécie Aspidosperma subincanum; (A) Vista geral; (B)

Aspecto da casca do caule.

Fonte: (A) Goloni, 2005; (B) http://www.kew.org/science/tropamerica

/imagedatabase/large1/cat_single1-326.htm

2.3 Alcalóides

Os alcalóides são compostos nitrogenados que apresentam ação

farmacológica ou tóxica quando administrados em animais (HENRIQUES &

KERBER, 2001), sendo conhecidos pela acentuada ação sobre o sistema nervoso

central, sendo muitos deles utilizados como venenos ou alucinógenos (LUCA &

PIERRE, 2000).

Essas substâncias químicas, provavelmente produzidas pela planta

para proteção contra vírus, bactérias, fungos e animais predadores podem ser

tóxicas para o homem, provocando carcinogênese, toxidade hepática, neurológica

e renal, pois muitas ainda não foram objetos de investigação científica (FONSECA

& PEREIRA, 2004).

11

Os alcalóides possuem grande importância econômica devido às suas

atividades farmacológicas, podendo ser citadas a vincristina e a vimblastina, que

são antineoplásicos importantes; a ergotamina utilizada para enxaqueca; a

ajmalicina e a iombina, fármacos usados nos distúrbios do fluxo sanguíneo e a

reserpina como antidepressivo (SCHRIPSEMA et al., 2004). Além desses pode-se

citar emetina (amebicida e emético), atropina, hioscina e escopolamina

(anticolinérgicos), protoveratrina A (anti-hipertensivos), quinina (antimalárico),

captotecina (antitumoral), codeína e noscapina (antitussígenos), morfina

(hipnoanalgésico), quinidina (depressor cardíaco), cafeína (estimulante do SNC),

teobromina e teofilina (diuréticos), colchicina (tratamento da gota), tubocurarina

(miorrelaxante), efedrina (simpatomimético), castanospermina (antiviral),

galantamina (tratamento do mal de Alzheimer) entre muitos outros (HENRIQUES

et al., 2003; SCHRIPSEMA et al., 2004 ).

A quantidade de produtos descritos, sua diversidade estrutural e

variadas atividades farmacológicas fazem dos alcalóides, junto com os

antibióticos, um dos grupos mais importantes entre as substâncias naturais com

interesse terapêutico (CORDELL et al., 2001).

2.4 Reações adversas às plantas medicinais

Muitos consumidores acreditam que os remédios feitos a partir de

plantas medicinais, por serem naturais, são efetivamente seguros (VEIGA JÚNIOR

et al., 2005). No entanto, os efeitos dos princípios ativos existentes nas plantas

medicinais podem ser influenciados por diferentes fatores, e os experimentos

realizados devem ser cuidadosamente avaliados, considerando-se a dosagem e a

espécie vegetal usada experimentalmente (PEPATO et al., 1998).

Ocasionalmente uma mesma planta pode apresentar tanto ação

terapêutica quanto ação tóxica. A distinção entre as substâncias medicamentosas

e tóxicas existe somente em relação ao modo de preparo, à dose, à concentração,

ao estado de dispersão (forma e tamanho das partículas), à solubilidade nos

fluidos orgânicos e à afinidade ao tecido ou organismo (GOMES et al., 2001;

MORGAN, 2003; CAZARIN, et al. 2004). Além disso, fatores biológicos podem

12

estar relacionados ao desencadeamento do quadro tóxico, tais como, a idade,

peso corpóreo, fatores genéticos, estados nutricionais e patológicos (CAZARIN et

al., 2004).

Os diversos órgãos das plantas que são utilizados são: a raiz, o caule,

as cascas, o talo, as gemas, as folhas, os frutos, as flores e as sementes

(BRÜNING, 1993; MORGAN, 2003). Em relação à forma de preparo, existem

várias maneiras de se utilizar as plantas medicinais: chá, tintura, pó, vinho

medicinal (garrafada), xarope, lambedor, pomada, unguento, cataplasma,

compressa, gargarejo, banho, suco, salada, óleo medicado, inalação, extrato seco

e óleo essencial (BRUNING, 1993; MORGAN, 2003).

Detalhes tais como, identificação da planta, parte a ser usada,

preparação, padronização química e biológica do extrato, estabilidade do extrato,

dosagens terapêuticas, efeitos colaterais, interações medicamentosas e

alimentares e contra-indicações devem ser incorporados à farmacopeia nacional.

Além da identificação da planta, deve-se observar se a coleta foi adequada, se o

material é autêntico, não tóxico e de qualidade (WHO, 1998). A desobediência a

estas recomendações pode causar danos à saúde do consumidor (ESPÍNOLA &

BONFIM, 1998).

Os efeitos adversos associados a plantas medicinais são classificados

em intrínsecos e extrínsecos, sendo que as reações intrínsecas são aquelas

inerentes à constituição química, podendo ser do tipo A (toxicidade previsível,

overdose ou interação com outros fármacos) ou tipo B (reação idiossincrática)

(BENSOUSSAN & MYERS, 1996; PINN 2001).

2.5 Avaliação da toxicidade das plantas medicinais

Os testes toxicológicos são realizados para obter dados sobre as

condições em que os compostos químicos, seja um medicamento, um praguicida

ou um agente químico industrial, produzem efeitos tóxicos, qual a natureza desses

efeitos e quais os níveis seguros de exposição (LOOMIS & HAYES, 1996;

STOKES, 2002; MEYER, 2003). Estes estudos aplicados em animais de

13

laboratório, sob condições previamente estabelecidas, permitem determinar os

possíveis efeitos de substâncias em humanos ou animais expostos (BARROS &

DAVINO, 2003).

Para assegurar o uso seguro das plantas medicinais, deve-se submetê-

las a testes de eficácia e segurança por métodos recomendados pela legislação

(BRASIL, 2004). Alguns modelos de estudos toxicológicos in vivo incluem ensaios

de toxicidade aguda, toxicidade subcrônica, toxicidade crônica, abordando

aspectos como mutagenicidade, embriofetotoxicidade, alterações de fertilidade,

carcinogenicidade e indução de dependência (VILAS BOAS, 2006).

O teste de toxicidade aguda oral, segundo o Guia 423 das diretrizes da

Organization for Economic Cooperation and Development (OECD) (OECD, 2001),

é um efeito adverso que ocorre em um breve período da administração oral de

uma substância em dose única ou múltiplas doses fornecidas durante 24 horas,

sendo capaz de fornecer subsídios referentes aos riscos à saúde após uma

exposição de curta duração (BRITO, 1994; DIPASQUALE & HAYES, 2001). Este

protocolo experimental recomenda que se inicie o tratamento de três animais com

a dose de 300 mg/kg. Caso se observe um ou nenhum caso de morte, deve-se

repetir a dose e com a confirmação do resultado anterior, o composto deve ser

testado na dose de 2000 mg/kg para então, de acordo com o resultado obtido nos

testes ser classificado na sua respectiva categoria segundo a Globally Harmonized

Classification System (GHS). Porém, se ocorrer a morte de 2 ou 3 animais após a

administração da dose de 300 mg/kg deve-se diminuir a dose do composto

administrado para 50 mg/kg e se nessa dose também ocorrer morte de 2 ou 3

animais deve-se adotar a dose de 5 mg/kg para a realização do teste de

toxicidade aguda, como demonstrado na Figura 2.

14

FIGURA 2 - Metodologia de ensaio de toxicidade aguda em dose única, a partir da

dose de 300 mg/kg em animais de laboratório; GHS= Global

Harmonized System; DL50= dose letal mediana.

Fonte: OECD (2001)

A avaliação de toxicidade aguda também tem por objetivo caracterizar a

relação dose/resposta que conduz ao cálculo da DL50 (dose letal mediana), sendo

que além da letalidade, outros parâmetros devem ser investigados, tais como o

potencial tóxico em órgãos específicos, os indicativos sobre a toxicocinética e

mecanismos de ação e o estabelecimento das doses para estudos

complementares de toxicidade (VALADARES, 2006).

A toxicidade sub-crônica tem como objetivo observar se por um longo

período de tempo, o produto testado causa efeitos tóxicos (VALADARES, 2006).

Esse ensaio fornece informações acerca dos riscos potenciais sobre a saúde,

resultantes da exposição contínua, além de informações satisfatórias sobre os

níveis de exposição com segurança para o homem (DI STASI, 1996).

O peso corporal é um dos parâmetros mais empregados em avaliações

toxicológicas para indicar o aparecimento, muitas vezes precoce, de efeitos

tóxicos de uma determinada substância no organismo animal (DIXON, 1989;

15

ZECICK & CLEGG, 1989). Principalmente, na toxicidade subcrônica, os sinais de

toxicidade sistêmica são definidos a partir da redução do desenvolvimento

ponderal, além da redução nos consumos de água e ração, apatia, má condição

da pelagem, pelos arrepiados e alterações de comportamento (MELLO, 2001).

Os testes que avaliam a atividade do SNC têm por objetivo avaliar o

comportamento de animais após a administração de preparações à base de

plantas com possível ação neurotóxica (ALMEIDA et al., 1999). Nestes testes são

realizados o monitoramento de comportamento de modo a identificar alteração no

padrão normal que pode ser sugestiva de alteração na atividade do SNC

(ALMEIDA et al., 1999). Como exemplo desta categoria de teste de toxicidade,

destaca-se o modelo de campo aberto e o teste de sono induzido por barbitúrico.

O modelo de campo aberto é aplicado em uma arena circular e

historicamente está relacionado às pesquisas sobre emocionalidade e, por isso,

vem sendo utilizado para avaliar o potencial ansiolítico de drogas, por meio da

mensuração de variáveis comportamentais de camundongos, como, o número de

quadrados percorridos no tempo, imobilidade (freezing), número de vezes em que

utiliza as patas dianteiras para limpeza (auto-limpeza ou grooming),

comportamento de levantar-se nas patas posteriores (rearing) e o volume de fezes

(NAHAS, 1999; AZEVEDO, 2005).

O teste de sono induzido por barbitúrico é utilizado para verificação de

atividade depressora de extratos e /ou fármacos, e o mesmo se baseia no fato de

que, em geral, os fármacos depressores do SNC aumentam o tempo de sono

induzido por barbitúricos (BATISTA, 1993).

A triagem farmacológica (screening hipocrático) é um ensaio bastante

útil e comumente usado na triagem preliminar de plantas para detectar atividades

farmacológicas e toxicológicas por meio de uma metodologia que tem por objetivo

avaliar o comportamento de animais ante a administração de preparações à base

de plantas com possível atividade no SNC, de forma a permitir a seleção de

espécies que apresentaram resultado mais significativo (ALMEIDA et al, 1999;

LUCIO et al., 2000). Essas observações comportamentais fornecem uma

estimativa geral da toxicidade da substância sobre o estado consciente e

16

disposição geral, atividade e coordenação do sistema motor, reflexos e atividades

sobre o sistema nervoso central (MALONE & ROBICHAUD, 1983).

17

3 Objetivos

3.1 Geral

Avaliação da intoxicação experimental e dos efeitos farmacológicos do

extrato etanólico de Aspidosperma subincanum (guatambu) em camundongos

Swiss.

3.2 Específicos

Avaliação da neurotoxicidade aguda do extrato etanólico do guatambu em

camundongos

Avaliação da neurotoxicidade subcrônica do extrato etanólico do guatambu em

camundongos

Realização de ensaios farmacológicos para verificar a influência do extrato

etanólico do guatambu na atividade do sistema nervoso central de

camundongos pelos testes de triagem farmacológica (teste geral de atividades

farmacológicas em camundongos) e pelo teste do campo aberto; potenciação

do sono por barbitúrico.

18

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Local do experimento

O experimento foi realizado no Departamento de Ciências Fisiológicas

do Instituto de Ciências Biológicas II (ICB II) da Universidade Federal de Goiás

(UFG), Campus Samambaia, no período de janeiro de 2012 a julho de 2012.

Previamente à execução das atividades, o projeto foi submetido à aprovação da

Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA-UFG) (n°84/12) e desenvolvido

seguindo as normas de bem-estar e biossegurança na experimentação animal

propostas pela Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório

(SBCAL) e pelo CONCEA (Conselho Nacional de Controle de Experimentação

Animal).

4.2 Descrição dos animais

Foram utilizados camundongos (Mus muscullus), linhagem Swiss

(variedade albino), machos e fêmeas (nulíparas e não grávidas), saudáveis,

adultos e com peso corporal entre 20 e 40g, com aproximadamente três meses de

idade, doados pelo biotério de criação da Indústria Química de Goiás (IQUEGO).

Os animais passaram por um período de aclimatação de sete dias antes do início

do experimento para a certificação do estado de higidez, comportamento e hábitos

alimentares e fisiológicos normais.

4.3 Alojamento e manejo dos animais

Os animais foram mantidos em caixas de polipropileno com tampa em

aço inox, com ração comercial balanceada para roedores e água, fornecidas à

vontade, sendo que a iluminação da sala foi mantida em um ciclo claro/escuro de

12h, a fase clara iniciada às 7h. Durante todo o experimento, os animais

permaneceram em sala com temperatura controlada de 23 ± 2°C. Os

camundongos foram mantidos nessas condições por um período de adaptação de

19

no mínimo sete dias antes do inicio de cada ensaio. Os animais foram mantidos no

Biotério do ICB II.

4.4 Material botânico

4.4.1 Obtenção do extrato

Foram realizadas coletas de Aspidosperma subincanum em janeiro de

2010. A espécie vegetal encontrava-se em 707 m; S 15º00´05,3 e W 49º58´27,7

na região de Nova América, no estado de Goiás. A identificação do material

coletado foi feito com auxílio de microscópio estereoscópico, chaves para

identificação e literatura especializada.

Do material coletado foram retiradas amostras da casca do caule para a

preparação do extrato etanólico no Laboratório de Farmacognosia da Faculdade

de Farmácia da UFG, conforme descrito por ALVES (2007). As cascas do caule

foram selecionadas e limpas com auxílio de escovas de cerdas rígidas para

remoção de sujidades e contaminações. O material limpo foi submetido à

dessecação em estufa de ventilação forçada, a 40ºC por 72 horas, seguida de

trituração em moinho de faca com granulação padronizada para granulometria de

60 mesch (0,25mm). O pó resultante da moagem foi armazenado em sacos de

papel, acondicionado em sacos de polietileno e mantido sob temperatura de -

20°C.

Em seguida, o material pulverizado foi misturado a etanol a 95%, na

proporção de 1:4 (p/v), sob agitação mecânica por 5 horas, sendo posteriormente

filtrado em papel de filtro qualitativo. O procedimento foi repetido com o mesmo

material, por três vezes, para garantir a extração máxima das substâncias. Em

seguida, os filtrados foram misturados. A solução extrativa foi submetida à

evaporação em rotaevaporador a 40 ºC sob pressão reduzida até a remoção do

solvente, resultando o extrato etanólico bruto da casca de guatambu (FERRI,

1996), que foi então, armazenado entre 4 °C e 6 °C e protegido da luz em frasco

âmbar de boca larga. O extrato etanólico foi diluído em solução de cloreto de sódio

20

a 0,9% de acordo com as doses previstas para os diferentes testes, considerando

a capacidade gástrica dos camundongos de 1mL para cada 100 gramas.

4.5 Ensaios toxicológicos

4.5.1 Determinação da toxicidade aguda dose única

Os camundongos (n=6) foram alocados em dois grupos, nominados

grupo teste (GT) e grupo controle (GC), cada um contendo três fêmeas. Para

acompanhamento da evolução da intoxicação, os animais foram marcados, a

partir da base da cauda, com número de traços feitos com uma caneta marcadora

permanente correspondente aos números ordinais de um a três. Os animais de

GT receberam, por gavagem, uma dose única de extrato etanólico na quantidade

de 1 mL/100g de peso, correspondendo a uma dose de 300 mg/kg, como

preconizado pelo protocolo experimental Guideline 423 da OECD (OECD, 2001),

para o teste de toxicidade oral aguda (Figura 2). Os animais de GC receberam via

gavagem, em dose única, 1 mL/100g de peso de solução de cloreto de sódio

0,9%. Os animais foram privados da alimentação por duas horas antes do início

do experimento e por mais duas horas após a administração do extrato etanólico e

da solução de cloreto de sódio 0,9%. A água foi oferecida ad libitum até termino

dos experimentos. O período total de observação após administração da dose

única foi de 14 dias.

A toxicidade aguda em dose única no GC e no GT foi avaliada pelos

seguintes parâmetros:

a) Screening Hipocrático

A avaliação das alterações comportamentais nos animais baseou-se no

screening hipocrático, que considera os seguintes critérios comportamentais:

atividade geral; motilidade; frequência cardíaca; piloereção; exoftalmia; lamber

patas; hipnose; coçar focinho; morder cauda; convulsão clônica/tônica; tremores

21

finos/grosseiros; sialorréia; ereção da cauda (straub); tremor da cauda; sedação;

catatonia; analgesia; anestesia; perda do reflexo corneano; diâmetro pupilar;

lacrimação; ataxia; palidez, cianose e hiperemia na orelha; poliúria ou oligúria e

alteração na coloração da urina; além de outros efeitos como aumento da

defecação, presença de diarréia, contorção, reação de fuga, agressividade e

vocalização (frêmito vocal), aperto da cauda, força para agarrar, hipotermia e

morte.

As observações foram realizadas conforme as recomendações de

MALONE & ROBICHAUD (1983), após a administração dos compostos nos

seguintes momentos: cinco minutos, 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 60

minutos, 2h, 4h, 6h, 12h e 24h e a partir de então, diariamente, até o 14º dia.

b) Avaliação ponderal

Os animais foram pesados em balança semi-analítica antes da

administração do extrato ou solução fisiológica (M0d), após sete dias (M7d) e ao

final de 14 dias (M14d) após exposição. De posse dos dados, foi calculado o peso

médio dos animais.

c) Exames hematológicos e bioquímicos séricos

Para a execução destes exames foram colhidos de cada animal, no 14º

dia, amostras de 1 mL de sangue, por punção cardíaca, usando-se seringa de 1

mL. O sangue foi então transferido para tubos a vácuo, descartáveis, contendo

ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). As amostras foram homogeneizadas por

inversão, identificadas e armazenadas a 4°C até o processamento.

O hemograma, que consistiu na avaliação dos seguintes parâmetros:

número total de eritrócitos, hematócrito, índices hematimétricos (volume

corpuscular médio - VCM, hemoglobina corpuscular média - HCM e a

concentração de hemoglobina corpuscular média - CHCM); a contagem total de

leucócitos e a contagem de plaquetas foram executados em analisador

22

hematológico automatizado. Para a contagem diferencial de leucócitos foi

realizado um esfregaço sanguíneo e feita a leitura da lâmina em microscópio

óptico, em aumento de 100x.

Após a realização do hemograma as amostras foram centrifugadas por

cinco minutos a 3.000 rpm para obtenção do plasma. As amostras de plasma

foram separadas em microtubos de polipropileno de 1,5 ml e armazenadas a -

20°C até o momento de realização das provas bioquímicas: mensuração da

atividade sérica de alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase

(AST) e valores de ureia e creatinina. A determinação da atividade sérica de AST

e ALT foi realizada em ensaio cinético pelo método ultravioleta. A ureia foi dosada

por meio de método enzimático-colorimétrico, por reação com a urease. A

creatinina foi determinada em método cinético, por reação com picrato alcalino. As

dosagens plasmáticas foram realizadas em analisador bioquímico automatizado

empregando-se reagentes comerciais padronizados.

Todos os exames foram conduzidos no Laboratório Multiusuário do

Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal da EVZ/UFG.

d) Determinação da DL50 Mediana

A DL50 Mediana foi avaliada de acordo protocolo experimental Guideline

423 da OECD (OECD, 2001), que determina o valor conforme a dose empregada

do provável agente tóxico e o número de animais mortos, como apresentado na

Figura 2.

e) Avaliação anatomohistopatológica

No décimo quarto dia, os animais sobreviventes foram anestesiados

com uma associação de xilazina 2% (1mL) e cetamina 10% (0,5mL) diluídas em

solução de cloreto de sódio 0,9% (8,5 mL), aplicada por via intraperitoneal, na

quantidade de 0,1mL/10g, conforme protocolo sugerido pelo Comitê de Ética em

Experimentação Animal (CETEA) da Universidade Federal de Minas Gerais

23

(UFMG). Após certificação da anestesia, os animais foram submetidos à eutanásia

por deslocamento cervical.

Imediatamente após a eutanásia, procedeu-se a remoção e a análise

macroscópica do encéfalo para fixação em formalina tamponada 10%. O tecido foi

mantido na mesma solução por 30 dias quando se realizou o processamento

laboratorial com vistas ao exame microscópico recomendado pelo protocolo

experimental Guideline 423 da OECD (OECD, 2001).

Para a realização do exame microscópio, foi feito corte sagital mediano

de 1 cm de espessura do encéfalo, em que era possível observar desde o bulbo

olfatório até a medula oblonga e início da medula espinhal. As amostras foram

processadas no Laboratório de Patologia Veterinária da Universidade Federal de

Goiás, Campus Jataí, e consistiu de desidratação em séries crescentes de etanol

(70-100%), diafanização em xilol, seguido de inclusão em parafina histológica. Os

blocos de inclusão foram seccionados, em micrótomo convencional, em uma

espessura de 3,0 µm e os cortes obtidos foram submetidos ao processo de

coloração tradicional pela técnica da hematoxilina e eosina para serem

examinados em microscópio óptico quanto à presença de alterações

degenerativas, evidências de necrose e sinais de inflamação, e fotodocumentação

das eventuais alterações.

4.5.2 Determinação da toxicidade subcrônica em dose fixa

Para a avaliação da toxicidade subcrônica do extrato etanólico da casca

do caule de guatambu foi utilizada a metodologia descrita no Guia 407 das

diretrizes da OECD (OECD, 1999).

Neste teste, os camundongos (n=40) foram alocados em oito grupos,

nominados grupo teste 75 (GT75), grupo teste 150 (GT150), grupo teste 300 (GT300)

e grupo controle (GC), sendo cinco machos e cinco fêmeas nulíparas e não

grávidas, com aproximadamente 3 meses de idade e média de peso entre 25 e

40g em cada grupo. Os grupos GT75, GT150 e GT300 receberam extrato etanólico

da casca do caule de guatambu diluído em solução de cloreto de sódio 0,9%, via

24

gavagem. A quantidade foi de 1 mL/100g de peso, correspondente a 75 mg/kg,

150 mg/kg e 300 mg/kg, respectivamente, diariamente, durante 28 dias. Ajustes na

quantidade administrada foram realizados conforme o ganho de peso de modo a

garantir as doses fixadas para cada grupo. Os animais de GC receberam via

gavagem, 1 mL/100g de peso de solução de cloreto de sódio 0,9%, durante os 28

dias.

A toxicidade subcrônica foi analisada pelos mesmos parâmetros

empregados na avaliação da toxicidade aguda dose única, sem alteração na

metodologia. Contudo, acrescentou-se a análise do peso relativo do encéfalo

(peso do órgão (g)/peso do animal(g)), após a eutanásia, conforme proposto pelo

Guia 407 das diretrizes da OECD (OECD, 1999).

4.6 Ensaios farmacológicos

Os ensaios farmacológicos obedeceram à seguinte sequência: triagem

farmacológica (screening comportamental), teste do campo aberto e teste de

tempo de sono induzido por barbitúrico.

Nestes testes foi realizado o monitoramento de comportamentos, que

na maioria das vezes são exibidos normalmente pelos animais, de forma que

qualquer alteração no padrão normal de comportamento pode ser sugestiva de

atividade no SNC (ALMEIDA et al., 1999).

4.6.1 Triagem farmacológica

a) Teste geral de atividades farmacológicas em camundongos

Os camundongos foram alocados em três grupos, constituído por 4

animais cada, para admistração, via oral, via subcutânea e via intraperitoneal,

denominados GVO, GSC e GIP, respectivamente, de extrato etanólico de guatambu.

Dentro dos grupos, realizou-se a administração das doses de 125 mg/kg, 250

25

mg/kg, 500 mg/kg de extrato etanólico de guatambu, em dose única, em diferentes

animais. Para o grupo controle foi utilizado a solução de cloreto de sódio 0,9%.

Após a administração do extrato os animais foram observados quanto a

alterações no sistema nervoso autônomo (simpático e parassimpático) nos cinco

minutos (M5m), 10 minutos (M10m), 20 minutos (M20m), 30 minutos (M30m), 60

minutos (M60m), quatro horas (M4h), oito horas (M8h), 24 horas (M24h), 48 horas

(M48h), quatro dias (M4d) e sete dias (M7d). Os parâmetros observados que indicam

a estimulação do sitema nervoso autônomo são: aumento de motilidade, aumento

de frequência respiratória, piloereção, exoftalmia, movimentos estereotipados

(lamber patas, coçar focinho, morder cauda), convulsão, tremores finos, tremores

grosseiros, sialorréia, fasciculações, midríase, ereção de cauda, tremores de

cauda, diâmetro pupilar. Os parâmetros que indicam a depressão do sistema

nervoso autônomo são: diminuição de motilidade, diminuição de frequência

respiratória, sedação, catatonia, ptose palpebral, analgesia, anestesia, perda do

reflexo corneano, diminuição do diâmetro pupilar, ataxia, dispneia, passividade,

alienação ambiental, diminuição do tônus dorsal, perda da preensão da pata,

paralisia do trem posterior. Outros efeitos tais como palidez, cianose e hiperemia

de orelha; coloração da urina; diarreia, contorção, reação de fuga, agressividade e

chiados foram também avaliados.

No sétimo dia, todos os animais foram anestesiados conforme protocolo

sugerido pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal (CETEA) da

Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG) e, após certificação da anestesia,

submetidos à eutanásia por deslocamento cervical.

4.6.2 Avaliação da atividade no sistema nervoso central

a) Teste do campo aberto

Os camundongos foram alocados em quatro grupos, GCAC, GCA125,

GCA250, e GCA500 constituído por 10 animais cada, para administração via oral, de

extrato etanólico de guatambu nas seguintes doses de 125 mg/kg, 250 mg/kg e

26

500 mg/kg, respectivamente, preparado imediatamente antes do uso. Foi

administrado solução de cloreto de sódio 0,9% para o grupo controle.

Trinta minutos após a administração, os animais, individualmente, foram

colocados no centro da arena do campo aberto circular construído com paredes

de acrílico transparente de 5 mm e base de 30 cm de diâmetro feita de madeira

revestida por laminado de PVC autoadesivo e demarcada de modo a formar um

campo com oito áreas. Ao longo de um período de 5 minutos, os comportamentos

dos camundongos foram registrados por uma filmadora digital para posterior

análise. Os animais tiveram o desempenho avaliado nos seguintes parâmetros:

número de quadrados percorridos; tempo imobilizado (freezing); número de auto-

limpezas (grooming); e número de elevações do corpo sobre os membros pélvicos

(rearing). A defecação foi avaliada quanto ao número de pellets fecais evacuados

pelo animal durante a sessão experimental conforme proposto por AZEVEDO

(2005).

b) Potenciação do sono por barbitúrico

Após a realização do teste de campo aberto, os animais de GC, GT125,

GT250, e GT500 receberam pentobarbital sódico, na dose de 30 mg/kg por via

intraperitoneal. Foram avaliados o tempo de indução do sono (latência), que

corresponde ao período da aplicação do fármaco até a perda do reflexo postural e

o tempo de duração do sono, que compreende o intervalo de tempo entre a perda

do reflexo postural e a sua recuperação. O tempo de latência foi considerado

como parâmetro da atividade depressora central, expresso em minutos, conforme

proposto por (GONZALES-TRUJANO et al., 1998).

4.7 Análise estatística

A comparação entre os tratamentos foi feita pelo teste não paramétrico

de Kruskal-Wallis, seguido pelo teste de Student-Newman-Keuls para comparação

entre os grupos estatisticamente diferentes. As variáveis analisadas foram

expressas em média ± desvio padrão.

27

5 RESULTADOS

5.1 Determinação da toxicidade aguda dose única

5.1.1 Screening Hipocrático

Na avaliação aguda do extrato etanólico da casca do caule de

Aspidosperma subincanum em camundongos Swiss fêmeas na dose de 300

mg/kg, dose única, observadas durante 14 dias não houve morte de animais. Em

face de tal situação, realizou-se a repetição do procedimento na dose de

300mg/kg e como houve a confirmação do resultado obtido após a administração

da primeira dose de 300 mg/kg, empregou-se a dose de 2000 mg/kg conforme

orientação do protocolo experimental Guideline 423 da OECD (OECD, 2001)

apresentado na Figura 2. As variáveis, tremor fino, diminuição de motilidade e

movimentos estereotipados foram os parâmetros que se apresentaram nos

animais expostos à dose de 300 mg/kg (Quadro 1).

Os camundongos de GC mantiveram-se em condições normais ao

longo do período observacional.

O tremor fino, diminuição de motilidade, convulsão e morte foram os

parâmetros observados na intoxicação por 2000 mg/kg. Aos 10 minutos após

gavagem, um camundongo apresentou tremor fino e diminuição de motilidade aos

15 minutos, sendo que aos 20 minutos apresentou convulsão. Já um segundo

camundongo apresentou diminuição de motilidade, tremor fino e convulsão após

nove minutos da gavagem e morte aos 14 minutos. No terceiro camundongo foi

observado presença de diminuição de motilidade, tremor fino e convulsão aos oito

minutos e morte aos 22 minutos após a gavagem.

28

QUADRO 1 - Evolução cronológica de sinais de intoxicação aguda pelo extrato

etanólico da casca do caule de Aspidosperma subincanum na dose

única de 300 mg/kg, via oral, em camundongos fêmeas Swiss (C1,

C2 e C3) e a repetição (C1', C2' e C3'). Goiânia, 2012.

VARIÁVEL ANIMAL

TEMPO APÓS ADMINISTRAÇÃO (300 mg/kg)

MINUTOS HORAS

5 10 20 30 1 2 4 6 12 24

Tremor Fino

C1

+

C2

C3

C1'

C2'

C3'

+

Diminuição da Motilidade

C1

+

+ +

C2 + +

+ + +

C3

+

+ + + +

C1'

+ + +

C2'

+ + + +

C3'

+ + +

Movimentos Estereotipados

(coçar focinhos)

C1

C2

+

+

C3

C1'

+ +

+

C2'

+

C3'

+

5.1.2 Avaliação ponderal

Os resultados obtidos nas doses de 300 mg/kg demonstraram que o

extrato administrado pela via oral não interferiu no desenvolvimento ponderal dos

animais em M0d, M7d e M14d em GT. Quando GT foi comparado com GC, não

foram observadas diferenças significativas nos diferentes tempos considerados.

Por não ter ocorrido óbito em GT com o uso de 300 mg/kg, o teste foi repetido com

a dose de 2000 mg/kg, conforme preconizado pelo protocolo experimental

Guideline 423 da OECD (OECD, 2001). Do mesmo modo, não foram observadas

diferenças significativas nesse parâmetro em GT na dose de 2000 mg/kg dentro

do grupo e em comparação ao GC. Os resultados obtidos para as duas doses

estão apresentados na Tabela 1.

29


camundongos Swiss fêmeas (n=3) tratados via oral com 300

mg/kg e 2000 mg/kg de extrato etanólico da casca do caule de

Aspidosperma subincanum antes da exposição (M0d), sete (M7d) e

quatorze (M14d) dias após exposição.

Momento Grupos

p* Controle 300 mg/kg 2000 mg/kg

M0d 33,80 ± 5,71 33,07 ± 5,38 35,27 ± 4,92 0,676

M7d 33,94 ± 5,96 34,08 ± 5,15 38,30 ± 0,00 0,897

M14d 35,07 ± 6,77 35,01 ± 5,46 39,50 ± 0,00 0,796 *Teste Kruskall-Wallis

5.1.3 Exames hematológicos e bioquímicos séricos

O tratamento com extrato etanólico da casca do caule de guatambu, na

dose de 300 mg/kg e 2000 mg/kg, não induziu modificações nos parâmetros do

eritrograma e plaquetograma dos camundongos quando comparados aos animais

de GC. Os resultados obtidos para as duas doses encontram-se na Tabela 2.


camundongos Swiss fêmeas (n=3) tratadas com 300 e 2000

mg/kg de extrato etanólico da casca do caule de Aspidosperma

subincaum, administrado por via oral, dose única e com solução

de cloreto de sódio 0,9% (GT). Goiânia, 2012.

PARÂMETROS GRUPOS


Hemácias (x106/µL) 6,86 ± 0,74 7,63 ± 0,74 6,52 ± 1,33 0,300

Hematócrito (%) 33,07 ± 2,14 33,8 ± 2,88 30,4 ± 4,68 0,559

Hemoglobina (g/dL) 11,25 ± 1,33 12,12 ± 2,25 10,8 ± 2,19 0,633

VCM (fL) 47,73 ± 2,84 44,42 ± 2,60 47,03 ± 2,67 0,189

HCM (g/dL) 16,35 ± 0,80 15,72 ± 1,46 16,53 ± 0,11 0,819

CHCM (pg) 34,48 ± 3,03 35,64 ± 4,52 35,30 ± 1,97 0,763

Plaquetas(/µL) 409,83 ± 75,50 410,6 ± 214,69 531,00 ± 13,11 0,217

* Teste Kruskall-wallis

30

A contagem total e diferencial de leucócitos no teste agudo não

apresentou variações significativas entre os diferentes grupos (Tabela 3).

A análise dos resultados das provas bioquímicas determinadas para

avaliar função renal e hepática dos animais na toxicidade aguda, nas doses de

300 mg/kg e 2000 mg/kg, demonstrou não haver diferença entre os grupos

tratados com o extrato etanólico de guatambu e, entre os mesmos e o grupo

controle (Tabela 4).


camundongos Swiss fêmeas (n=3) tratadas com extrato etanólico

da casca do caule de Aspidosperma subincanum na dose de 300

mg/kg e 2000 mg/kg, via oral, dose única e com solução de cloreto

de sódio 0,9% (GT). Goiânia, 2012.

PARÂMETROS GRUPOS

p* Controle 300 2000

Leucócitos (/µL) 2050,00 ± 1532,00 2825,00 ± 830,20 3500,00 ± 2971,50 0,883

Bastonetes(/µL) 5,33 ± 13,06 19,00± 34,70 0 ± 0 0,720

Segmentados (/µL) 439,83 ± 356,18 467,00 ± 253, 46 415,30 ± 244,84 0,895

Eosinófilos (/µL) 10,83 ± 18,83 119,60 ± 83,30 170,30 ± 271,14 0,138

Linfócitos (/µL) 2027,50 ± 815,40 2685,60 ± 1472,20 2406,30 ± 1741,43 0,759

Monócitos (/µL) 466,50 ± 485,13 506,25 ± 36,75 508,00 ± 755,34 0,270


TABELA 4 - Valores médios da dosagem sérica (média ± desvio padrão) de AST,

ALT, ureia e creatinina em camundongos Swiss fêmeas (n=3)

tratadas com extrato etanólico da casca do caule de Aspidosperma

subincanum na dose de 300 mg/kg e 2000 mg/kg, via oral, dose

única e com solução de cloreto de sódio 0,9% (GT). Goiânia, 2012.

PARÂMETROS GRUPOS


AST (UI/L) 314, 18 ± 300,22 325,91 ± 221,75 763,90 ± 352,39 0,141

ALT (UI/L) 93,96 ± 140,70 54,72 ± 29,90 136, 85 ± 72,46 0,278

Ureia (mg/dL) 69,43 ± 9,29 68,08 ± 20,30 56,80 ± 7,59 0,188

Creatinina (mg/dL) 0,46 ± 0,10 0,57 ± 0,19 0,53 ± 0,23 0,576


31

5.1.4 Determinação da DL50 mediana

O extrato etanólico da casca do caule de guatambu foi considerado

tóxico de acordo com o método de classes preconizado pela OECD 423 (OECD,

2001), pois foi classificado na categoria 4 do GSH (Global System Harmonized) e

apresentou a DL50 igual a 1000 mg/kg (Figura 2).

5.1.5 Avaliação anatomohistopatológica

Não foram observadas alterações relacionadas ao tratamento com

extrato etanólico da casca do caule de guatambu para a toxicidade aguda, tanto

ao exame macroscópico quanto histopatológico dos encéfalos, sendo que os

tecidos apresentaram-se morfologicamente normais e semelhantes entre o grupo

controle e os animais tratados com o extrato etanólico de guatambu nas doses de

300mg/kg e 2000 mg/kg.

5.2 Toxicidade subcrônica dose fixa

5.2.1 Screening Hipocrático

Os sinais associados à intoxicação subcrônica, dose fixa, do extrato

etanólico da casca do caule de Aspidosperma subincanum em camundongos

Swiss, fêmeas e machos, em GT75, GT150 e GT300, via oral, ao longo de 28 dias de

observação estão apresentados, respectivamente, nos Quadros 2, 3 e 4. Os

animais de GC apresentaram-se em condições normais ao longo do período

observacional.

32


extrato etanólico da casca do caule de Aspidosperma subincanum,

via oral na dose de 75 mg/kg, em camundongos Swiss fêmeas

(CF) e camundongos Swiss machos (CM) (n=5) durante 28 dias e

com solução de cloreto de sódio 0,9% (GT). Goiânia, 2012.

GT75 PERÍODO DE OBSERVAÇÃO (DIAS)

1 4 5 6 7 9 10 11 12 13 15 17 18 19 20 21 23 24 25 26 27 28

CF1

CF2 6 6 6 6

CF3

CF4

CF5

CM1 6

CM2 6 6 6 6 6

CM3 6 6

CM4 6 6 6 6

CM5 6 6 6 6 6 6

Legenda: Diminuição de motilidade – 6 CF – camundongo fêmea; CM – camundongo macho






GT150 PERÍODO DE OBSERVAÇÃO (DIAS)

1 4 5 6 7 9 10 11 12 13 15 17 18 19 20 21 23 24 25 26 27 28

CF1 4 7

CF2 6 6 6 6 6 10 4,6

CF3 6

CF4 6 6 6 6 6

CF5 9

CM1 6 10 10

CM2

CM3 5,9

CM4 6 6 6 6 1,2,3,

5,6,8 5,9

CM5 6 6 6 10 7 6

Legenda: Andar rígido – 1; Cauda levantada – 2; Chiado – 3; Coçar focinho – 4; Convulsão – 5; Diminuição de motilidade – 6; Espasmos – 7; Mioclonia – 8; Morte – 9; Imobilidade – 10. CF – camundongo fêmea; CM – camundongo macho

33






GT300 PERÍODO DE OBSERVAÇÃO (DIAS) – DOSE 300 mg/kg

1 4 5 6 7 9 10 11 12 13 15 17 18 19 20 21 23 24 25 26 27 28

CF1 6 4 6 9

CF2

CF3 9

CF4 6 5,9

CF5 6 6 6 5,9

CM1 6

CM2 6 6 6 6 6 6 10 6

CM3 6 6 6 6 10

CM4 6 6 6 10

CM5 3,10 6

Legenda: Andar rígido – 1; Cauda levantada – 2; Chiado – 3; Coçar focinho – 4; Convulsão – 5; Diminuição de motilidade – 6; Espasmos – 7; Mioclonia – 8; Morte – 9; Imobilidade – 10. CF – camundongo fêmea; CM – camundongo macho

5.2.2 Avaliação ponderal

Os resultados referentes ao peso dos camundongos no GT75, GT150 e

GT300, para fêmeas e machos, estão apresentados na Tabela 5 e Tabela 6,

respectivamente. Como é possível verificar, embora tenha se observado uma

tendência de aumento de peso corpóreo nos animais dos grupos testes, esse

parâmetro não teve diferença significativa quando comparados aos grupos

controle.


camundongos Swiss fêmeas (n=5) de GT75, GT150 e GT300,


Aspidosperma subincanum antes da exposição (M0d), sete (M7d),

quatorze (M14d), vinte e um (M21d) e vinte e oito (M28d) dias após

exposição.

MOMENTO GRUPOS

p* GC GT75 GT150 GT300

M0d 29,72 ± 2,57 28,43 ± 2,30 28,32 ± 2,54 27,94 ± 1,16 0,773

M7d 30,40 ± 2,56 30,66 ± 2,26 29,55 ± 2,22 29,58 ± 0,66 0,802

M14d 31,46 ± 2,51 31,82 ± 1,69 29,45 ± 2,75 30,20 ± 0,00 0,243

M21d 33,40 ± 2,22 32,54 ± 2,04 30,50 ± 2,40 32,80 ± 0,00 0,153

M28d 34,40 ± 1,88 35,10 ± 2,59 33,14 ± 3,15 35,05 ± 0,00 0,649


34


camundongos Swiss machos (n=5) de GT75, GT150 e GT300, tratados com extrato

etanólico da casca do caule de Aspidosperma subincanum antes da exposição

(M0d), sete (M7d), quatorze (M14d), vinte e um (M21d) e vinte e oito (M28d) dias após

exposição.

MOMENTO GRUPOS


M0d 37,30 ± 3,60 31,00 ± 3,04 34,20 ± 2,95 34,30 ± 3,60 0,100

M7d 38,50 ± 5,26 32,60 ± 3,77 37,00 ± 4,60 37,30 ± 2,95 0,265

M14d 40,60 ± 5,26 33,40 ± 4,81 37,30 ± 4,66 38,70 ± 3,15 0,169

M21d 40,00 ± 4,55 35,10 ± 5,63 39,50 ± 4,27 40,50 ± 2,23 0,327

M28d 42,20 ± 4,02 34,20 ± 5,95 41,20 ± 3,76 42,30 ± 5,08 0,115


5.2.3 Exames hematológicos e bioquímicos séricos

Os parâmetros do eritrograma e plaquetograma dos camundongos

Swiss, fêmeas e machos, em GT75, GT150 e GT300 associados à intoxicação

subcrônica do extrato etanólico da casca do caule de Aspidosperma subincanum,

ao longo de 28 dias de tratamento estão apresentados, respectivamente, nas

Tabelas 7 e 8. Os animais de GC apresentaram-se em condições normais ao

longo do período observacional.

O tratamento com extrato etanólico da casca do caule de guatambu, de

forma geral, não induziu modificações nos parâmetros hematológicos analisados

dos camundongos machos quando comparados aos animais controle. Já para os

valores advindos do teste de toxicidade subcrônica em camundongos fêmeas

houve diferença no hematócrito entre o grupo que recebeu a maior dose do

extrato e o grupo controle e também entre o grupo que recebeu a menor dose (75

mg/kg) e o que recebeu a maior dose (300 mg/kg) do extrato. O HCM também

apresentou diferença para as fêmeas da toxicidade subcrônica que receberam a

maior dose do extrato e o grupo controle, e também entre o grupo que recebeu a

maior dose com o grupo que recebeu a dose intermediária de 150 mg/kg.

35


camundongos Swiss fêmeas (n=5) de GT75, GT150 e GT300 tratados com extrato

etanólico da casca do caule de Aspidosperma subincaum, via oral, e com solução

de cloreto de sódio 0,9% (GT) 28 dias consecutivos. Goiânia, 2012.

PARÂMETROS GRUPOS


Hemácias (x106/µL) 6,94 ± 0,25 6,26 ± 0,92 6,67 ± 0,79 7,77 ± 0,34 0,067

Hematócrito (%) 30,88 ± 0,69 a 27,14 ± 2,99

a 29,80 ± 3,37

ab 34,90 ± 5,37

b 0,024

Hemoglobina (g/dL) 11,76 ± 0,30 10,18 ± 1,34 11,32 ± 1,36 12,27 ± 0,74 0,094

VCM (fL) 44,36 ± 1,55 43,72 ± 1,80 44,32 ± 0,82 44,90 ± 5,74 0,850

HCM (g/dL) 17,20 ± 0,90 b 16,22 ± 0,41

ab 16,77 ± 0,20

b 15,73 ± 0,60

a 0,022

CHCM (pg) 36,22 ± 4,75 37,30 ± 1,38 37,80 ± 0,59 35,63 ± 5,40 0,788

Plaquetas(/µL) 459,40 ± 91,08 189,00 ± 191,97 300,50 ± 260,62 585,30 ± 277,44 0,185

* Teste Kruskall-wallis - Letras diferentes na mesma linha significam diferença estatística pelo teste Student-

Newman-Keuls (p< 0,05).


camundongos Swiss adultos machos (n=5) de GT75, GT150 e GT300


Aspidosperma subincaum, administrado por via oral, dose única e

com solução de cloreto de sódio 0,9% (grupo controle) durante 28

dias consecutivos Goiânia, 2012.

PARÂMETROS GRUPOS


Hemácias (x106/µL) 6,20 ± 0,80 6,50 ± 0,56 6,70 ± 0,63 7,48 ± 0,45 0,065

Hematócrito (%) 25,25 ± 4,14 27,5 ± 2,86 29,72 ± 0,84 30,86 ± 1,21 0,064

Hemoglobina (g/dL) 10,20 ± 1,17 10,22 ± 1,44 10,65 ± 1,38 12,02 ± 0,66 0,086

VCM (fL) 43,42 ± 0,98 42,46 ± 2,15 44,75 ± 4,74 41,38 ± 1,33 0,311

HCM (g/dL) 16,42 ± 0,39 15,66 ± 0,95 15,82 ± 0,96 16,02 ± 0,5 0,468

CHCM (pg) 36, 97 ± 0,75 36,96 ± 2,72 35,85 ± 5,11 38,88 ± 0,82 0,134

Plaquetas(/µL) 42 425,00 ± 356,47 377,80 ± 133,43 379,00 ± 152, 47 403,80 ± 253,81 0,996


A contagem total e diferencial de leucócitos no teste subcrônico não

apresentou variações significativas entre os diferentes grupos (Tabelas 9 e 10)

36


camundongos Swiss adultos fêmeas (n=5) de GT75, GT150 e GT300


Aspidosperma subincaum, administrado por via oral, dose única e

com solução de cloreto de sódio 0,9% (grupo controle) durante 28

dias consecutivos Goiânia, 2012.

PARÂMETROS GRUPOS


Leucócitos (/µL) 2940,00 ± 1285,70 3280,00 ± 1149,8 7375,00 ± 6040,10 7483, 30 ± 2576,01 0,106

Bastonetes (/µL) 0 ± 0 26,50 ± 30,7 64,00 ± 78,40 100,30 ± 101,01 0,291

Segmentados (/µL) 377,60 ± 193,24 354,50 ± 286,6 784,50 ± 528,8 1321,3 ± 926,5 0,117

Eosinófilos (/µL) 118,00 ± 150,19 66,50 ± 100,28 98,00 ± 151,84 98, 66 ± 170,9 0,968

Linfócitos (/µL) 2162 ± 969,60 2544 ± 800,01 5358,25 ± 4185,2 5319,67 ± 3265,35 0,154

Monócito s(/µL) 282,40 ± 140,37 333,5 ± 215,06 670,25 ± 450,82 643,30 ± 604,24 0,350



camundongos Swiss adultos machos (n=5) de GT75, GT150 e GT300

tratados com extrato etanólico da casca do caule de Aspidosperma

subincaum, administrado por via oral, dose única e com solução de

cloreto de sódio 0,9% (grupo controle) durante 28 dias

consecutivos Goiânia, 2012.

PARÂMETROS GRUPOS


Leucócitos (/µL) 3575,00 ± 512,35 4120,00 ± 1386,36 4825,00 ± 994, 57 3980,00 ± 1349,80 0,529

Bastonetes (/µL) 30,40 ± 67, 98 37,20 ± 83,18 112,00 ± 224,00 12,4 0 ± 27,72 0,991

Segmentados (/µL) 599,50 ± 199,37 766,00 ± 404,32 591,00± 229,95 663,20 ± 316,24 0,842

Eosinófilos (/µL) 73,60 ± 93,52 82,40 ± 113,90 127,00 ± 110,96 24,80 ± 55,45 0,534

Linfócitos (/µL) 2434,00 ± 471,67 2496,40 ± 976,24 3501,50 ± 604,56 2398,80 ± 823,20 0,196

Monócito s(/µL) 411,50 ± 73,65 738,00 ± 738,63 465,50 ± 132,32 893,20 ± 966,09 0,928


Não houve diferença significativa das avaliações das funções renal e

hepática de GT75, GT150 e GT300 em machos. Entretanto, nas fêmeas, observou-se

diferença significativa de AST entre os camundongos do grupo controle e os que

receberam a menor dose e também dose intermediária. Além deste parâmetro,

37

também apresentaram diferença significativa de ALT entre os camundongos do

grupo controle e os que receberam a dose intermediária (Tabela 11 e 12).


ALT, ureia e creatinina em camundongos Swiss adultos fêmeas

(n=5) de GT75, GT150 e GT300 tratados com extrato etanólico da

casca do caule de Aspidosperma subincaum, administrado por via

oral, dose única e com solução de cloreto de sódio 0,9% (grupo

controle) durante 28 dias consecutivos Goiânia, 2012.

PARÂMETROS GRUPOS


AST (UI/L) 94,1 ± 85,05 a 527,1 ± 139,7

b 598,4 ± 208,5

b 417,6 ± 63,6

ab 0,013

ALT (UI/L) 18,6 ± 20,7 a 54,7 ± 0,03

a 93,07 ± 36,75

b 63,8 ± 15,82

ab 0,011

Ureia (mg/dL) 29,3 ± 29,02 51,37 ± 8,6 51,7 ± 13,8 41,5 ± 4,5 0,180

Creatinina (mg/dL) 0,26 ± 0,3 0,45 ± 0,25 0,8 ± 0,49 0,6 ± 0,35 0,093




ALT, ureia e creatinina em camundongos Swiss adultos machos (n=5)

de GT75, GT150 e GT300 tratados com extrato etanólico da casca do

caule de Aspidosperma subincaum, administrado por via oral, dose


durante 28 dias consecutivos. Goiânia, 2012.

PARÂMETROS GRUPOS


AST (UI/L) 495,00 ± 181,26 ab

588,15 ± 246,16 a 259,80 ± 15,30

b 299,40 ± 69, 69

b 0,047

ALT (UI/L) 54,72 ± 0,03 115,00 ± 91,64 54,72 ± 0,03 60,20 ± 12,24 0,054

Ureia (mg/dL) 117,30 ± 96,76 61,40 ± 15,25 63,00 ± 15,70 78,40 ± 12,70 0,171

Creatinina (mg/dL) 0,44 ± 0,22 0,52 ± 0,23 0,53 ± 0,30 0,48 ± 0,10 0,862


5.2.4 Avaliação anatomohistopatológica

À exemplo da intoxicação aguda, na análise macroscópica, do encéfalo

não foi observado qualquer alteração macro e microscópica relacionadas ao

tratamento com extrato etanólico da casca do caule de guatambu.

38

5.2.5 Avaliação dos índices dos órgãos

As médias relacionadas com o peso relativo dos encéfalos de

camundongos machos e fêmeas de GT75, GT150 e GT300 tratados com extrato

etanólico da casca do caule de Aspidosperma subincanum, administrado por via

oral, dose única estão apresentadas nas tabela 13. Não foram encontradas

diferenças estatisticamente significativas no peso relativo do encéfalo nos animais

de ambos os sexos tratados com o extrato etanólico de guatambu do GT75, GT150,

GT300 e GC.

TABELA 13 - Peso relativo do encéfalo (média ± desvio padrão) de camundongos

machos e fêmeas de GT75, GT150 e GT300 tratados com extrato


administrado por via oral, dose única e com solução de cloreto de

sódio 0,9% (grupo controle) durante 28 dias consecutivos. Goiânia,

2012.

PARÂMETROS GRUPOS


MACHOS 0,43 ± 0,03 0,44 ± 0,03 0,43 ± 0,00 0,44 ± 0,03 0,986

FÊMEAS 0,46 ± 0,03 0,48 ± 0,01 0,44 ± 0,02 0,45 ± 0,00 0,098

*Teste Kruskall-wallis

5.3 Triagem farmacológica

5.3.1 Teste geral de atividade farmacológica em camundongos

Observou-se que a dose de 500 mg/kg por via intraperitoneal causou a

morte de um animal após doze minutos. Esse mesmo animal apresentou

convulsão clônica, tremores grosseiros, fasciculações, diminuição da motilidade e

cianose nas patas nos primeiros cinco minutos de observação (Quadro 5). A

mesma dosagem aplicada por via subcutânea provocou diminuição de motilidade

aos 30 minutos após a administração do extrato, a qual manteve-se diminuída até

39

oito horas do início do experimento. No teste realizado via oral com a dose de 500

mg/kg, os animais submetidos ao tratamento apresentaram diminuição da

resposta ao toque e diminuição de motilidade.

QUADRO 5 - Relação entre as doses, via de aplicação e tempo em que se

manifestaram contorção, motilidade, convulsão clônica, tremores

grosseiros, fasciculações e cianose da orelha/pata em

camundongos submetidos a administração de 125, 250 e 500

mg/kg de extrato etanólico de Aspidosperma subincanum.

Goiânia, 2012.

Dose/Via de acesso Parâmetros

Tempo após a administração

Minutos Horas Dias

5 10 20 30 60 4 8 24 2 4 7

125 mg/kg IP contorção X X X

250 mg/kg IP < motilidade X

250 mg/kg SC < motilidade X

500 mg/kg IP

convulsão clônica X

tremores grosseiros X

fasciculações X

< motilidade X

cianose orelha/pata X

500 mg/kg SC < motilidade X X X X

500 mg/kg VO < motilidade X

Legenda: IP – intraperitoneal; SC – subcutâneo; VO – via oral

Na dose intermediária, 250 mg/kg via intraperitoneal, observou-se

diminuição da motilidade após quatro horas da administração do extrato. A mesma

dose por via subcutânea causou diminuição da motilidade após 60 minutos,

enquanto pela via oral não se verificou alteração comportamental. Na menor dose

administrada, 125 mg/kg via intraperitoneal, constatou-se contorção aos cinco

40

minutos, meia hora e uma hora. Esta concentração administrada via subcutânea e

oral não causou alteração de comportamento.

5.3.2 Teste do campo aberto

No concernente ao número de quadrados invadidos no centro,

observou-se diferença significativa entre o GC e o GT500 e entre o GT125 em

relação ao GT500. Quanto ao número de quadrados invadidos na periferia,

verificou-se também diferença entre o GC e o GT500 e entre o GT125 e o GT500. O

número de levantadas dos camundongos também apresentou diferença entre o

GC e o GT250 e o GT500 e também entre o GT125 e o GT500. O tempo de imobilidade

houve diferença entre o GC e o GT500. Não houve alterações no número de bolos

fecais nem no número de auto-limpeza. Os valores obtidos para os parâmetros

analisados nos diferentes grupos e comparação entre os grupos estão

apresentados na Tabela 14.

TABELA 14 - Análise comparativa dos valores (média ± desvio padrão) dos

parâmetros do teste de campo aberto obtidos no GCAC, GCA125,

GCA250 e GCA500. Goiânia, 2012.

PARÂMETRO GCAC GCA125 GCA250 GCA500 p*

N° de quadrados centro 9,6 ± 6,14 a 7,6 ± 3,60

a 5,5 ± 3,31

ab 3,5 ± 3,57

b 0,026

N° de quadrados periferia 18,1 ± 9,46 a 26,6 ± 18,97

a 17,1 ± 12,37

ab 8,8 ± 9,35

b 0,030

N° de quadrados invadidos 27,7 ± 11,90 a 34,2 ± 21,75

a 22,6 ± 14,17

ab 12,3 ± 11,82

b 0,014

N° de levantadas 56,6 ± 10,04 a 51,6 ± 12,60

ab 44,4 ± 7,77

bc 25,6 ± 21,88

c 0,002

N° de auto-limpeza 1,2 ± 1,32 0,7 ± 0,82 1,1± 1,29 1,0 ± 1,63 0,787

Tempo parado (segundos) 2,3 ± 3,60 a 1,5 ± 2,37

a 10,0 ± 15,29

ab 63,6 ± 80,22

b 0,039

N° de bolos fecais 1,5 ± 0,97 2,4 ± 2,4 1,0 ± 0,94 1,2 ± 1,23 0,236

* Teste Kruskall-wallis - Letras diferentes na mesma linha siginificam diferança estatística pelo teste Student-


5.3.3 Potenciação do sono por barbitúrico

O extrato etanólico da casca do caule de Aspidosperma subincanum

demonstrou não possuir efeitos (p=0,461) no tempo de indução do sono em

41

camundongos de acordo com o teste de potenciação do sono induzido por

barbitúrico. Os camundongos de GC tiveram um tempo de indução do sono de

160,4±16,8s. Os animais de GT125, GT250, GT500 apresentaram tempos de indução

do sono de 158,1±18s, 156±12,06s e 143±27,34s, respectivamente.

Em relação ao tempo de recuperação do reflexo postural (duração do

sono), observou-se diferença significativa entre GC e GT500 e entre GT125 e GT500,

como pode ser observada na Tabela 15.

TABELA 15 - Tempo de recuperação do reflexo postural (duração do sono), em

minutos, (média ± desvio padrão) no teste de potenciação do sono

induzido por barbitúrico, em camundongos de GC, GT125, GT250,

GT500. Goiânia, 2012.

PARÂMETRO GRUPOS

P* GC GT125 GT250 GT500

Média ± DPM 77,40 ± 42,40 a 64,70 ± 21,14

a 91,10 ± 23,40

ab 109,40 ± 32,73

b 0,030



42

6 DISCUSSÃO

O teste de toxicidade aguda e subcrônica pelo extrato etanólico da

casca de guatambu foi conduzido empregando-se a via de administração oral, por

ser a forma na qual as pessoas normalmente fazem uso dos preparados de

plantas para fins medicinais, conforme YUNES & CALIXTO (2001).

Segundo o guia 423 da OECD (OECD, 2001), a toxicidade aguda é a

bioatividade capaz de causar efeitos adversos sobre os organismos-teste após a

administração oral de uma simples dose em curta duração. No teste de toxicidade

aguda utilizando-se a dose inicial indicada para uma análise preliminar de 300

mg/kg, observou-se a diminuição de motilidade em camundongos fêmeas,

diferentemente ao observado em camundongos machos por SANTOS (2005),

após a administração do extrato hidroalcóolico da entrecasca do caule de

guatambu, por mesma via e dose, e nenhum sinal de toxicidade ou alterações de

comportamento em camundongos foi verificado. Contudo, ressalta-se a diferença

no gênero dos animais testados em ambos os estudos e, por isso, a possibilidade

de uma maior toxicidade nos camundongos fêmea. Ademais, esta observação

pode ser decorrente da variação no solvente utilizado para a extração, pois

poderia ter ocorrido a extração de diferentes compostos, ou ainda, reforça os

dados que apontam para a existência de diferentes concentrações do princípio

nas diversas partes da planta. Outro fator que pode ter influenciado nesta

diferença, de acordo com BEUTLER et al. (2008), são as variedades da planta que

podem apresentar maior toxicidade quando comparadas a outras e essa diferença

provavelmente decorre do fato de que as plantas muitas vezes são classificadas

apenas quanto à espécie e não quanto à variedade.

ALVES (2007) investigando a toxicidade da casca do caule

Aspidosperma subincanum na intoxicação aguda em grupos de ratos tratados com

doses únicas do extrato etanólico nas concentrações de 500 mg/kg, 1000 mg/kg,

2000 mg/kg, 3000 mg/kg e 5000 mg/kg, não observou ao longo de 24 horas

qualquer sinal de toxicidade ou morte, e sugeriu que a casca do caule desta planta

43

é atóxica em exposição aguda e em altas doses na espécie, o que pode sugerir

uma maior sensibilidade dos camundongos em relação aos ratos.

SANTOS (2005) observou que os efeitos tóxicos ocorreram em

camundongos Swiss quando se empregou as doses de 500 mg/kg a 3000 mg/kg

do extrato hidroalcóolico da entrecasca do caule de guatambu e se caracterizaram

por sinais típicos de estimulação do sistema nervoso como piloereção, tremores e

convulsões, sendo a severidade dose-dependente, culminando com 100% de

morte com o uso de 2500 mg/kg, à semelhança do observado neste estudo, ao se

verificar o resultado do screening hipocrático, que apresentou morte (66%) durante

o período de observação nos camundongos tratados na dose de 2000 mg/kg.

Os efeitos tóxicos presentes na toxicidade aguda e subcrônica neste

estudo podem estar relacionados com a presença de alcaloides no extrato

etanólico de guatambu, pois estudos fitoquímicos preliminares de extrato

metanólico da entrecasca do caule de A. subincanum revelaram a presença e

isolamento de alcaloides indólicos quaternários (KOBAYASHI et al., 2002).

A DL50 mediana encontrada neste trabalho foi de 1000 mg/kg, pela via

oral, resultado semelhante ao determinado por SANTOS (2005) que administrou o

extrato hidroalcoolico da entrecasca do caule de guatambu em camundongos, via

oral, obtendo DL50 de 1129 ± 154 mg/kg.

No ensaio de toxicidade subcrônica em camundongos machos e

fêmeas na dose de 75 mg/kg, 150 mg/kg e 300 mg/kg, via oral, do extrato bruto

etanólico de guatambu, não houve alteração de forma significativa no ganho de

massa corporal. Contudo, observou-se uma tendência de ganho de peso em todos

os grupos, inclusive no grupo controle, ao longo do experimento, como também

verificado por ALVES (2007) com as doses de 125 mg/kg, 250 mg/kg e 500 mg/kg,

via oral, em ratos Wistar machos.

No ensaio de toxicidade subcrônica em camundongos machos e

fêmeas na dose de 75 mg/kg, 150 mg/kg e 300 mg/kg, por via oral, do extrato

bruto etanólico de guatambu foram observados alterações comportamentais, ao

passo que o ensaio realizado por ALVES (2007) com as doses de 125 mg/kg, 250

mg/kg e 500 mg/kg, via oral, em ratos Wistar machos ao longo de 30 dias não

44

produziu efeitos tóxicos, pois não foi observado qualquer sinal clínico de

toxicidade durante o tratamento. No ensaio de toxicidade subcrônica realizado por

SANTOS (2005) observou-se também ausência de alterações comportamentais

em ratos tratados por via oral durante 30 dias com as doses de 5 mg/kg e 100

mg/kg.

A explicação para esta diferença apresentada nos trabalhos pode estar

relacionada a influências biogeográficas sofridas pelas plantas utilizadas, pois a

não existência de toxicidade obtida ao avaliar extratos de origem vegetal pode

ocorrer devido a fatores inerentes à planta (localidade, fração avaliada, solvente

utilizado), bem como os períodos e tipos de avaliação realizados nos estudos de

toxicidade. Ainda que orientada pelas características genéticas da planta, a

síntese química das substâncias é controlada por fatores do ecossistema,

iluminação, calor, constituição do solo, umidade, dentre outros (LAPA, 1999).

Segundo HURST (1942), a toxicidade da planta pode variar devido a fatores

ambientais como área geográfica, clima e condições de crescimento, sendo que

em algumas plantas pode ser totalmente ausente (OELRICHS et al., 1985).

Na toxicidade subcrônica, os sinais de toxicidade sistêmica podem ser

caracterizados por alterações de comportamento, dentre outros, conforme MELLO

(2001). Sendo assim, já que os grupos tratados por via oral com o extrato

etanólico da casca do caule de guatambu (75 mg/kg, 150 mg/kg e 300 mg/kg), por

28 dias consecutivos, apresentaram alteração significativa nos parâmetros

comportamentais, de forma geral, o tratamento resultou em efeitos tóxicos em

camundongos Swiss adultos machos e fêmeas.

No estudo de toxicidade subcrônica realizado por ALVES (2007),

grupos de ratos tratados durante 30 dias consecutivos com o extrato etanólico de

guatambu nas doses de 125 mg/kg, 250 mg/kg, 500 mg/kg, foram observadas

alterações bioquímicas sutis, resultado também observado neste trabalho.

No teste geral de atividade farmacológica em camundongos observou-

se a presença de convulsão, tremores, diminuição da motilidade e morte, com

intensidade variando de acordo com a dose e a via empregada para o tratamento

com o extrato de guatambu. Resultados semelhantes foram obtidos por SANTOS

45

(2005) que ao realizar a administração intraperitoneal do extrato hidroalcoolico da

casca de guatambu em camundongos Swiss, observou a presença de piloereção

e tremores, começando com dose de 300 mg/kg. Com doses de 350 a 475 mg/kg,

foram observados piloereção, tremores, convulsões e cianose, havendo 100% de

mortalidade com o emprego da dose de 475 mg/kg .

Pelo teste geral de atividade farmacológica objetivou-se avaliar

preliminarmente a segurança da via de administração selecionada e das doses a

serem utilizadas nos demais ensaios in vivo, concluindo-se que a dose de 500

mg/kg do extrato etanólico de guatambu foi a que mais ocasionou alterações no

comportamento dos camundongos e, por sua vez, a via oral foi a que apresentou

uma maior margem de segurança, apresentando-se menos tóxica do que a sua

administração por via intraperitoneal. Isto se explica pelo fato de que a resposta

dos animais frente à administração por gavagem, não é a mesma daquela

observada quando utilizada a via intraperitoneal, devido às diferenças existentes

entre os perfis de absorção gástrica e intestinal como pH, superfície de absorção,

motilidade intestinal, irrigação sanguínea. Além disso, por via oral pode ocorrer

uma lenta absorção ou metabolização hepática, enquanto que por via

intraperitoneal ocorre uma absorção rápida e desta forma os efeitos tóxicos

mostram-se mais intensos e mais precoces (LOOMIS & HAYES, 1996;

KLAASSEN & WATKINS, 2001).

A observação dos animais submetidos ao screening comportamental

após tratamento via oral com extrato etanólico da casca do guatambu (125 mg/kg,

250 mg/kg ou 500 mg/kg), produziu decréscimo da motilidade com intensidades e

duração dose dependentes, indicando que o extrato testado apresenta perfil de

composto com ação no SNC e de que a casca da planta pode possuir atividade

sedativa seletiva na depressão do SNC (KANJANAPOTHI et al., 2004; OLIVEIRA

et al., 2008).

É sabido que dentre as células que constituem o tecido neural, os

neurônios são bastante sensíveis a alterações bioquímicas decorrentes de

intoxicações, com uma posterior alteração do aspecto morfológico (AVERSI-

FERREIRA et al., 2006), porém os resultados observados em diferentes regiões

46

do encéfalo não demonstraram alteração estrutural durante a exposição aguda e

subcrônica de camundongos machos e fêmeas ao extrato de guatambu via oral,

não havendo evidência de injúria neuronal como picnose e apoptose, o que indica

que no período de 28 dias, o extrato não promoveu alterações no tecido neural

ocasionado por distúrbios metabólicos e vasculares.

GOMES (2011) realizou o teste de toxicidade aguda com o extrato

hidroetanólico de outra planta do gênero Aspidosperma, a A. excelsum, em

camundongos, por via oral, sendo que, os resultados observados no exame

anátomo e histopatológico do tecido cerebral também não mostrou qualquer sinal

de toxicidade evidente com a dose de 5000 mg/kg.

Um aspecto relevante acerca de efeitos tóxicos do extrato de plantas

contendo alcaloides sobre o sistema neural é a barreira hematoencefálica, pois

pode haver uma possível proteção desta barreira, conforme descrito por

FAGUNDES et al (2005). Outra hipótese é a de que as concentrações alcançadas

não foram suficientes para efetivar danos morfológicos visíveis, o que não

descarta a possibilidade de danos funcionais conforme proposto por

NASCIMENTO (2008) em seu trabalho com Annona coriacea (araticum), pois a

presença de alcaloides indólicos no caule da Aspidosperma subincanum podem

ser os responsáveis por sinais de envolvimento encefálico, incluindo convulsões,

como observado neste estudo.

A avaliação hematológica representa uma importante área de estudo

sobre o estado de saúde dos animais e são descritas na literatura por ter alta

correlação em predizer toxicidade humana, ou seja, alterações no sistema

hematológico em animais por determinadas substâncias também são encontradas

em humanos na maioria das vezes (OLSON et al., 2000). Assim, sinais de

toxicidade podem se expressar por alterações hematológicas e bioquímicas

sanguíneas de acordo com GONZÁLEZ & SILVA (2003). O hemograma e a

análise bioquímica do sangue podem auxiliar o diagnóstico e o prognóstico de

diversas enfermidades (SWENSON, 1989; JAIN, 1993). Por meio dos parâmetros

hematológicos avaliados, pôde-se observar que o tratamento com este extrato não

afetou a hematopoiese no teste de toxicidade aguda e toxicidade subcrônica para

47

os camundongos, exceto nos camundongos fêmeas do teste subcrônico. Neste

último, o extrato etanólico da casca do caule de Aspidosperma subincanum

reduziu significativamente o hematócrito em GT75 e do HCM em GT300, contudo,

não foi encontrada nenhuma explicação para tais achados.

As concentrações de AST e ALT indicaram uma diferença significativa

entre as fêmeas do grupo controle e o grupo que recebeu 150 mg/kg do extrato no

teste de toxicidade subcrônica e a concentração de AST também apresentou

diferença entre o grupo controle e o de 75 mg/kg, sendo que o extrato etanólico de

guatambu nas doses citadas causou lesão hepática, uma vez que efeitos tóxicos

no fígado podem ser identificados pelas elevadas concentrações de

transaminases (SHANKER et al., 2002) e as concentrações normais dessas

enzimas descartam a presença de uma lesão hepática aguda (RODRIGUES et al.,

1998). Segundo MOTTA (2003), a AST e a ALT são enzimas presentes em altas

concentrações no músculo, fígado e cérebro, e a elevação da sua atividade no

sangue pode indicar necrose nesses tecidos. Contudo, a ausência de lesão

microscópica no encéfalo permite inferir que o aumento das enzimas não são

decorrentes de injúrias no tecido neural.

No teste do campo aberto observou-se que o extrato de guatambu

alterou a movimentação espontânea dos camundongos, havendo uma diminuição

do número total de invasão das áreas, que foi diminuindo à medida que a dose do

extrato aumentava. Tal fato pode ter ocorrido por uma ação do extrato na

atividade locomotora dos animais, pois o número total de invasões avalia a

atividade exploratória do animal, que pode ser afetada por fármacos com ação no

SNC conforme SIELGEL (1946) e ARCHER (1973).

Ainda de acordo com SIEGEL (1946) e ARCHER (1973), o número total

de levantadas, número de auto-limpeza e o tempo parado avaliam o grau de

sedação ou medo (ansiedade) nos animais, sendo que estes parâmetros podem

ser alterados por fármacos com atividade ansiolítica/ansiogênica. Assim sendo,

sugere-se que o extrato etanólico de guatambu nas doses administradas aos

camundongos por via oral tenha uma atividade depressora no SNC, sugerindo

uma ação ansiolítica, pois foi observado o aumento do tempo parado, diminuição

48

da exploração do ambiente e do número total de levantadas dos camundongos

neste teste. Desse modo, outros métodos de avaliação devem ser empregados,

como por exemplo, o labirinto em cruz elevado ou caixa claro/escuro.

PRUT & BELZUNG (2003) relataram essa diminuição da locomoção e

da frequência com que os camundongos permaneceram sobre as patas traseiras

como evidência de sedação. Os autores alegaram que o aumento do tempo

dispendido na parte central do campo aberto é indicação de ansiólise, parâmetro

este observado durante a administração do extrato etanólico de guatambu neste

estudo.

Nas maiores doses do extrato também foi observada a ausência de

movimento (tempo de parada), induzido muito provavelmente, pela ação

depressora do extrato, de acordo com HALL (1934). Quanto ao número de bolos

fecais, não houve diferença significativa entre os grupos, sendo este um

parâmetro que reflete o índice de emoção (HALL, 1934).

No modelo de indução de sono por barbitúrico, substâncias que

deprimem o SNC, em geral, aumentam a duração do sono produzido pelo

pentobarbital, podendo haver também uma redução na latência para o efeito do

barbitúrico utilizado (avaliado pela redução no tempo de indução), ou seja, desde

a aplicação do barbitúrico até a perda do reflexo postural pelo animal. Baseado

nos resultados obtidos, o extrato de guatambu tem ação depressora no SNC, pois

houve um aumento na duração do sono conforme LANCEL (1999).

A análise dos dados referentes a essa planta submetida aos testes

farmacológicos para avaliação de atividade no SNC, a partir do extrato etanólico,

permite inferir que a casca do caule de Aspidosperma subincanum possa conter

substâncias de efeitos psicoléptico (depressor) ou neuroléptico (tranquilizante)

conforme NAHAS (1999).

49

7 CONCLUSÕES

O extrato etanólico obtido da casca do caule de Aspidosperma subincanum foi

considerado tóxico quando administrado por via oral na dose de 300 mg/kg e de

2000 mg/kg na avaliação da toxicidade aguda em camundongos Swiss, assim

como na dose de 75 mg/kg, 250 mg/kg e 500 mg/kg na avaliação da toxicidade

subcrônica.

O extrato etanólico obtido da casca do caule de Aspidosperma subincanum

promove alterações comportamentais indicativas de uma possível ação

depressora no Sistema Nervoso Central (SNC) em camundongos, quando

administrado pela via oral, subcutânea e intraperitoneal na dose de 125 mg/kg,

250 mg/kg e 500 mg/kg.

O extrato etanólico obtido da casca do caule de Aspidosperma subincanum

promoveu um aumento da duração do sono produzido pelo pentobarbital,

sugerindo uma possível ação depressora deste extrato no Sistema Nervoso

Central (SNC).

50

8 CONSIDERAÇÕES FINAIS

Sabe-se que as plantas medicinais representam uma mistura complexa

de componentes químicos com atividades biológicas, que podem causar efeitos

adversos, tóxicos e interagir com outros medicamentos quando empregados

simultaneamente.

Na presente avaliação toxicológica e farmacológica foi utilizado o

extrato etanólico da casca do caule de guatambu (Aspidosperma subincanum) e

os resultados aqui apresentados contribuem para avaliação da segurança desta

parte da planta. Porém, os efeitos do uso popular de Aspidosperma subincanum

como planta medicinal em outras preparações permanecem obscuros. Embora

este extrato supostamente contenha muitos compostos presentes no caule “in

natura”, não podemos afirmar que os resultados aqui apresentados se repetiriam

em outros estudos, como por exemplo, em um modelo de consumo das folhas, na

administração de infusões ou outros modos de preparo.

Assim, levando-se em consideração o estágio de desenvolvimento que

já foi atingido pelos protocolos da OECD, ainda há dificuldades em se estabelecer

os testes mais adequados para os fitoterápicos, principalmente diante da

dificuldade de padronização dessas preparações.

O envolvimento de várias áreas do conhecimento como, nutrição,

agronomia, etnobotânica, química, farmácia, medicina, biologia e tantos outros é

muito importante, pois faz com que as informações se completem, ampliando o

conhecimento das plantas medicinais, seus efeitos tóxicos e colaterais, as

interações medicamentosas, além das medidas adequadas para o controle de

qualidade.

Os resultados obtidos neste estudo demonstraram o extrato etanólico

da casca de guatambu como um agente potencialmente tóxico, devendo ser

considerado como tal, dependendo da dose administrada ou absorvida, tempo e

frequência de exposição e vias de administração. Cabe ressaltar ainda, que de

acordo com os protocolos recomendados pela ANVISA para avaliação da

toxicidade de medicamentos fitoterápicos devem ser conduzidos mais estudos

51

toxicológicos pré-clínicos com este extrato de Aspidosperma subincanum, como

estudos de toxicidade crônica e de genotoxicidade. Além disso, obviamente,

deverão ser efetuados estudos clínicos para concluir a avaliação da segurança do

uso de Aspidosperma subincanum.

Com a constatação da possível ação depressora no SNC deste extrato

vegetal, esta pesquisa deve servir como base para o desenvolvimento de estudos

mais detalhados a respeito da ação da planta avaliada. O relato da existência de

alcaloides indólicos em Aspidosperma spp. em alguns trabalhos científicos,

justifica a realização de pesquisas para comprovar a eficácia desses metabólitos

secundários na cura e no tratamento de doenças.

Assim, devido à vasta aplicação popular de Aspidosperma spp. e ao

grande número de alcaloides até então identificados, observa-se que as

investigações das atividades biológicas que lhe são atribuídas, tais como potencial

agente antimalárico, antimicrobiano, anticancerígeno, antiinflamatório, no

tratamento do diabetes, como afrodisíaco, vasodilatador, e outras indicações,

merecem ter uma maior importância e estudo, objetivando a garantia de uma

alternativa terapêutica de qualidade, eficaz e segura para uso humano e

veterinário.

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efeito depressor e toxicidade do extrato … · tabela 8 - eritrograma e plaquetograma (média ±...

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