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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
EFEITO DAS TOXINAS A E B DO Clostridium difficile SOBRE A VIA DE WNT/-CATENINA EM CÉLULAS EPITELIAIS INTESTINAIS
BRUNO BEZERRA LIMA
FORTALEZA 2014
BRUNO BEZERRA LIMA
EFEITO DAS TOXINAS A E B DO Clostridium difficile SOBRE A VIA DE WNT/-CATENINA EM CÉLULAS EPITELIAIS INTESTINAIS
Tese de Doutorado submetida à Coordenação do Programa de Pós-graduação em Farmacologia, da Universidade Federal do Ceará como requisito parcial para obtenção do grau de Doutor em Farmacologia. Orientadora: Profa Dra Gerly Anne de Castro Brito.
FORTALEZA 2014
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação Universidade Federal do Ceará Biblioteca de Ciências da Saúde
L696e Lima, Bruno Bezerra.
Efeito das toxinas A e B do Clostridium difficile sobre a via de Wnt/β-catenina em células epiteliais intestinais / Bruno Bezerra Lima. – 2014.
73 f. : il. color., enc. ; 30 cm. Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Ceará, Faculdade de Medicina, Departamento de
Fisiologia e Farmacologia, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Doutorado em Farmacologia, Fortaleza, 2014.
Área de concentração: Farmacologia e Toxicologia Pré-Clínica. Orientação: Profa. Dra. Gerly Anne de Castro Brito. 1. Clostridium difficile. 2. beta Catenina. 3. Caspases. I. Título.
CDD 615.373
“Dans les champs de l'observation,
le hasard ne favorise que les esprits preparés.”
- Louis Pasteur
AGRADECIMENTOS
A Deus por ter me concedido a oportunidade de aprendizado e evolução.
À professora Gerly Anne Brito, minha orientadora e que muitas vezes foi minha “mãe”, agradeço de coração o carinho e o empenho dedicado a mim e ao projeto durante todo este tempo. Agradeço pela confiança em mim, pela paciência nos momentos difíceis e agradeço também pelos ensinamentos, muitos dos quais levarei para a vida toda!
Ao professor José Garcia Abreu, gostaria de expressar meu profundo reconhecimento pela sua contribuição decisiva para a minha formação acadêmica e científica, pelo estímulo intelectual, por toda confiança em mim depositada, pela orientação dia-a-dia que recebi ao longo de todo o desenvolvimento deste trabalho, por todas as oportunidades oferecidas durante os anos de orientação, as quais jamais serão esquecidas no decorrer da minha caminhada, pelo apoio e incentivo que sempre garantiu.
À Bárbara, minha fiel amiga de todas as horas, lembrarei sempre da sua alegria e amizade, pela ajuda incondicional, meu agradecimento especial.
Ao professor Ronaldo de Albuquerque Ribeiro, exemplo de dedicação à pesquisa e profissionalismo.
Ao professor Manassés Claudino Fonteles, pelo incentivo e exemplo de competência e dedicação ao ensino.
Ao professor Vivaldo Moura Neto, pela pessoa simples e amiga, por ter aberto as portas da UFRJ para a criação do DINTER.
Ao Manuel Braga Neto, meu grande amigo, que sempre está contribuindo com seus importantes conselhos e por sua indicação pude escolher a professora Gerly como orientadora.
Ao pessoal do LEV, pela ajuda nos experimentos, pelas discussões construtivas e pela conversa cotidiana, coisas que me davam a força que eu precisava para continuar seguindo. Aos meus grandes amigas e amigos que fiz Nathália, Débora, Fábio, Fernanda, Celina, pela presença, pela amizade, pelo apoio e pelos momentos maravilhosos que me proporcionam!
Aos amigos do LAFICA/NEMPI, Angélica, Dani, Karol, Roberto, Deisy, Igor, Rosinha, entre vários, que sempre me apoiaram, escutaram e incentivaram na conquista deste sonho.
À Josy e ao Fábio Zuim pela constante ajuda e paciência em resolver as questões burocráticas e financeiras do projeto.
A todos os colegas, professores e funcionários, em especial à Aura Rhanes Farias Nogueira Yida, da Pós-graduação do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Universidade Federal do Ceará, minha perene gratidão.
Às minhas irmãs, Renata e Jéssica obrigado pela confiança, pela dedicação e pelo amor.
Ao meu amigo-irmão, Felipe, por ser exemplo profissional e pessoal, pela amizade, e infinita disponibilidade em abrir as portas da sua casa no Rio de Janeiro.
Aos meus pais, Gersivam e Inês, obrigado por sempre apoiarem e incentivarem a carreira que escolhi. Sem vocês, eu não estaria onde estou. Sem a educação e o cuidado de vocês, eu não seria quem eu sou.
À Débora Lima, gostaria de dedicar esta tese, pelo amor, companheirismo e imensurável apoio, além da indispensável ajuda durante todos os experimentos. Agradeço pelo carinho e apoio incondicional, pela PACIÊNCIA, pela compreensão nas horas de ausência, pelo incentivo em todos os momentos, e principalmente por me fazer acreditar que no final tudo dá certo.
Ao CNPq, CAPES, Funcap e Faperj, pelo suporte financeiro.
RESUMO Título: Efeito das toxinas A e B do Clostridium difficile sobre a via de Wnt/-catenina em células epiteliais intestinais As toxinas A e B do Clostridium difficile (TcdA e TcdB) são glicosiltransferases homólogas que
inibem um grupo de pequenas GTPases dentro da célula hospedeira, contudo, vários mecanismos
envolvidos na atividade patogênica dessas toxinas permanecem desconhecidos. No presente
estudo, avaliamos os efeitos das TcdA e TcdB na via de Wnt/-catenina que representa a força
motora principal responsável pela proliferação das células epiteliais nas criptas colônicas. Foram
utilizadas células IEC-6 (células epiteliais de criptas de Rattus novergicus) e RKO (células de
adenocarcinoma de cólon humano). Estas células foram estimuladas com meio condicionado
contendo Wnt3a e incubadas com 10, 50 ou 100 ng/mL de TcdA ou 1, 5 ou 10 ng/mL de TcdB
por 24h, resultando em uma inibição dose-dependente da via de sinalização canônica de Wnt,
como demonstrado pelo ensaio de repórter de fator de célula T (TCF). Esse resultado foi
corroborado pelos dados da imunofluorescência com marcação para a localização nuclear de -
catenina e por western blotting para -catenina e c-MYC (gene-alvo da via de Wnt). Além disso,
os dados do experimento de western blot evidenciaram uma diminuição dos níveis da proteína -
catenina, o qual foi prontamente revertido por z-VAD-fmk, um pan-inibidor de caspase.
Entretanto, a TcdA ainda foi capaz de inibir a via de Wnt/-catenina mesmo na presença do z-
VAD-fmk, cloreto de lítio (um inibidor de GSK3) ou plasmídeo de -catenina
constitutivamente ativo, como determinado pelo ensaio do TCF (TOPFlash/Luciferase). O estudo
evidenciou ainda que a pré-incubação de células RKO com TcdA por 12h também atenuou a
ativação da via de Wnt mediada por Wnt3a, o que sugere que a inativação de RhoGTPases,
particularmente Rac1, possui um papel nessa inibição. Em conclusão, esses achados sugerem que
a inibição da via canônica de Wnt pelas TcdA e TcdB representa um mecanismo importante da
sua patogênese e explica seus efeitos anti-proliferativos.
Palavras-chave: Clostridium difficile, Toxina A (TcdA), Toxina B (TcdB), via de Wnt/-
catenina, caspases
ABSTRACT
Title: Clostridium difficile toxins A and B effects over Wnt/-catenin pathway in intestinal epithelial cells
Clostridium difficile toxins A and B (TcdA and TcdB) are homologous glycosyltransferases that
inhibit a group of small GTPases within host cells, but several mechanisms underlying their
pathogenic activity remain unclear. Here, we evaluated the effects of TcdA and TcdB on the
Wnt/-catenin pathway, the major driving force behind the proliferation of epithelial cells in
colonic crypts. IEC-6 and RKO cells stimulated with Wnt3a-conditioned medium were incubated
with 10, 50 and 100 ng/mL of TcdA or TcdB for 24h, resulting in a dose-dependent inhibition of
the Wnt signaling, as demonstrated by a T-cell factor (TCF) reporter assay. This was further
confirmed by immunofluorescence staining for nuclear localization of -catenin and western
blotting for -catenin and c-Myc (encoded by a Wnt target gene). Moreover, our western blot
analysis showed a decrease in the -catenin protein levels, which was reversed by z-VAD-fmk, a
pan-caspase inhibitor. Nonetheless, TcdA was still able to inhibit the Wnt/-catenin pathway
even in the presence of z-VAD-fmk, lithium chloride (a GSK3 inhibitor), or constitutively
active -catenin, as determined by a TCF reporter assay. Furthermore, pre-incubation of RKO
cells with TcdA for 12h also attenuated Wnt3a-mediated activation of Wnt signaling, suggesting
that inactivation of Rho GTPases plays a significant role in that inhibition. Taken together, these
findings suggest that attenuation of the Wnt signaling by TcdA and TcdB is important for their
anti-proliferative effects.
Keywords: Clostridium difficile toxin A and toxin B (TcdA and TcdB), Wnt/-catenin pathway,
caspases
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Ac AMP
AMPc ANOVA
ATP oC
C. difficile CDAD
CDK cm
DMSO DNA
EPM et al.
IgG IL-1β
IL-6 IL-8
IL-10 IL-12
IFN-γ iNOS
i.p. kDa
Anticorpo
Adenosina monofosfato
Adenosina monofosfato cíclico
Análise de variância
Adenosina trifosfato
Graus centígrados
Clostridium difficile
Doença induzida pelo Clostridium difficile
Quinase dependente de Ciclina
Centímetro
Dimetil Sulfóxido
Ácido desoxirribonucleico
Erro padrão da média
E colaboradores
Imunoglobulina G
Interleucina 1 beta
Interleucina 6
Interleucina 8
Interleucina 10
Interleucina 12
Interferon gama
Óxido Nítrico Sintase induzível
Intaperitoneal
Kilodalton
kg KO
LiCl LPS
LTB4 M
min. µL
mg µg
µmol n
NF-κB nM
PAF PBS
pg PGE2
pH PLA2
P.M. nNOS
r.p.m. RNA
TLR TNF-α
TcdA TcdB
U Vs
Wnt
Kilograma
Knockout
Cloreto de Lítio
Lipopolissacarídeo
Leucotrieno B4
Molar
Minuto (s)
Microlitro
Miligrama
Micrograma
Micromol
Número
Fator nuclear kappa B
Nanomolar
Fator ativador plaquetário
Tampão fosfato-salino
Picograma
Prostaglandina E2
Potencial hidrogeniônico
Fosfolipase A2
Peso molecular
Óxido Nítrico Sintase neuronal
Rotação por minuto
Ácido ribonucléico
Receptor Toll like
Fator de necrose tumoral alfa
Toxina A do Clostridium difficile
Toxina B do Clostridium difficile
Unidade
Versus
Wingless
x z-VAD-fmk
Vezes
Carbobenzoxil-valil-alanil-aspartil-[O-metil]- fluorometillcetona
LISTA DE SÍMBOLOS
α
β γ
κ ®
± >
< %
Alfa
Beta
Gama
Capa
Marca registrada
Mais ou menos
Maior que
Menor que
Percentagem
SUMÁRIO
RESUMO 7
ABSTRACT 8 LISTA DE ABREVIATURAS 9
LISTA DE SÍMBOLOS 11
1. INTRODUÇÃO 1.1 C. difficile: considerações epidemiológicas 15
1.2 Patogênese do C. difficile 17 1.2.1 As toxinas A (TcdA) e B (TcdB): considerações gerais 17
1.2.2 Regulação da transcrição e características estruturais das TcdA e TcdB
18
1.2.3 Inibição das RhoGTPases: Rho, Rac1 e Cdc42 19 1.2.4 Apoptose induzida por TcdA e TcdB 21
1.2.5 Ciclo Celular 23
1.3 A via de Wnt/-catenina e a renovação do epitélio intestinal 26
2. JUSTIFICATIVA 29 3. OBJETIVOS 31
4. MATERIAIS & MÉTODOS 32 4.1 Reagentes 32
4.1.1 Toxinas A (TcdA) e B (TcdB) do C. difficile 32 4.1.2 Anticorpos 32
4.1.3 Plasmídeos 32 4.1.4 Drogas e soluções 34
4.2 Meios de Cultura 35
4.3 Cultura de Células 36 4.4 Protocolos 37
4.4.1 Preparação das células aderidas 37
4.4.2 Contagem das células intestinais em lâmina pela câmara de
Neubauer
38
4.4.3 Transfecção celular de plasmídeos e ensaio da luciferase 39
4.4.4 Western Blot 41 4.4.5 Imunofluorescência 42
4.5 Análise Estatística 43 5. RESULTADOS 44
5.1 TcdA e TcdB inibem a via de sinalização Wnt/-catenina em cultura de células epiteliais intestinais
44
5.2 A toxina A do Clostridium difficile diminui os níveis da proteína -catenina e previne a expressão de c-MYC induzida por Wnt3a
47
5.3 A toxina A do Clostridium difficile bloqueia o acúmulo de -catenina nuclear induzida por Wnt3a
49
5.4 A toxina A do Clostridium difficile bloqueia o acúmulo de -catenina nuclear induzida por Wnt3a
51
5.5 A toxina A do Clostridium difficile inibe a via de Wnt independentemente da atividade do complexo de destruição de -catenina
56
5.6 A pré-incubação de células RKO com a TcdA inibe a via de Wnt por ativação de Wnt3a
59
6. DISCUSSÃO 61 7. CONCLUSÕES 66
8. REFERÊNCIAS 67 9. ANEXOS 79
15
1. INTRODUÇÃO
1.1 Clostridium difficile: considerações epidemiológicas
Descrito pela primeira vez em 1935, o C. difficile consiste em uma bactéria gram-
positiva formadora de esporos, sendo encontrada com frequência no meio-ambiente e na flora
intestinal em 3% da população adulta (ARTEAGA et al., 2009). O indivíduo infectado pelo C.
difficile pode evoluir como portador assintomático ou progredir para formas mais graves como
colite pseudomembranosa, megacólon tóxico, sepse, choque e morte (KYNE et al., 2000). Hoje,
a doença induzida pelo C. difficile (CDAD) representa a principal causa de diarreia nosocomial
no mundo e estima-se que os custos econômicos associados a CDAD variam de 436 milhões a 3
bilhões de dólares só nos EUA (KELLY e LAMONT, 2008; DUBBERKE e WERTHEIMER,
2009).
Nos últimos anos, evidencia-se uma maior incidência da CDAD com crescimento da
morbimortalidade, da duração das internações e da elevação de custos hospitalares. Esse
fenômeno pode ser atribuído em parte ao surgimento da cepa hipervirulenta NAP1 (North
America Pulsed field type 1), tendo sido isolada nas fezes de pacientes com doença induzida pelo
C. difficile nos EUA (MCDONALD et al., 2005; MUSHER et al., 2006), Canadá (PEPIN et al.,
2005), Inglaterra (KUIJPER et al., 2007), Holanda (VAN STEENBERGEN et al., 2005),
Bélgica (DELMEE et al., 2006), França (TACHON et al., 2006) e Japão (KATO et al., 2007).
A NAP1/BI/027 produz a toxina binária, descrita mais recentemente, e possui uma
mutação no gene TcdC, cuja função é regular negativamente a produção das toxinas A e B
(POPOFF et al., 1988; MACCANNELL et al., 2006). Cepas com esta mutação produzem uma
maior quantidade de toxina A (TcdA) e B (TcdB), bem como uma toxina binária (CDT) por isso
esta cepa tem alta patogenicidade, além de ter maior capacidade de esporular e que lhe dá um
grande potencial epidêmico no âmbito hospitalar e da comunidade. (RUPNIK et al., 2005;
ARTEAGA et al., 2009). Um importante fator associado à disseminação da cepa NAP1/BI/027
tem sido a sua característica resistência às fluoroquinolonas, classe de antibióticos com uso
difundido em ambiente hospitalar (GAYNES et al., 2004; LOO et al., 2005; MUTO et al., 2005).
16
Outra importante mudança no perfil epidemiológico da CDAD foi o surgimento de
novas populações de risco. Relatos demonstram o aumento de casos da doença na comunidade,
isto é, em indivíduos não hospitalizados e que não tinham história de uso prévio de antibióticos,
bem como em mulheres jovens durante o periparto (DIAL et al., 2005). Pouco se sabe sobre as
espécies responsáveis por esses casos adquiridos na comunidade e sua origem, porém
ultimamente tem sido relatada contaminação de carne bovina e suína (RODRIGUEZ-
PALACIOS et al., 2007; RUPNIK, 2007), sugerindo que alimentos possam estar envolvidos na
transmissão do C. difficile de animais para humanos.
No Brasil, ainda existem poucos relatos na literatura sobre diarreia por C. difficile.
Este agente é provavelmente subnotificado no país porque poucos hospitais dispõem de métodos
moleculares para o seu diagnóstico e o método de Enzyme Linked Immunoabsorbent Assay
(ELISA) que é pouco sensível é o mais utilizado nos centros brasileiros. FERREIRA et al.
(2003) evidenciaram que o C. difficile foi isolado em 5,5% das crianças internadas com diarreia
aguda em São Paulo e que as crianças saudáveis não eram hospedeiras deste bacilo. PINTO et al.
(2003) investigaram a presença de cepas de C. difficile em crianças que estavam internadas ou
em tratamento ambulatorial com diarreia ou não, e isolou C. difficile em 6,7% das amostras de
fezes. Em estudo realizado no Hospital Universitário Clementino Fraga Filho da Universidade
Federal do Rio de Janeiro foram analisadas 70 amostras de fezes de pacientes internados,
identificados pelo método ELISA, sendo 27,1% dos casos de diarreia foram positivos para C.
difficile. Entretanto, apenas oito amostras foram positivas para os genes de toxinas pelo método
de PCR. Metade dessas amostras eram PCR-ribotipo 133 (típico no Brasil) e em duas amostras
foi identificado o PCR-ribotipo 233 (FERREIRA et al., 2004). No Hospital Universitário Walter
Cantídio da Universidade Federal do Ceará, LIMA et al. (1993) mostraram que o C. difficile é o
principal agente causador de diarreia hospitalar neste estabelecimento. Dados inéditos de
pesquisa do nosso grupo em andamento com pacientes com diarreia em Hospital oncológico,
mostram uma incidência em torno de 40% de positividade para infecção por C. difficile. As
cepas isoladas mostraram resistência às fluoroquinolonas, apresentaram gene e positividade para
toxinas A e B, mas não apresentaram gene para toxina binária, sendo portanto uma cepa
diferente da cepa hipervirulenta (NAP-1). A genotipagem demonstrou ser NAP 4. Análise de
virulência em animais estão sendo realizados. Esses dados são importantes para direcionar o
tratamento dos pacientes com metronidazol, além de sugerir medidas de controle de infecção
17
hospitalar voltadas para o controle da transmissão deste patógeno (comunicação pessoal dados
não publicados).
Surtos de C. difficile em unidades de terapia intensiva também já foram descritos no
Brasil (BALASSIANO et al., 2010; SOUZA DIAS et al., 2010; BALASSIANO et al., 2011).
Pacientes internados em unidades de terapia intensiva são pacientes críticos que têm vários
fatores de risco para diarreia por C. difficile como exposição a antibióticos, idade avançada,
hospitalização prolongada, doença de base grave, supressão de ácido gástrico e procedimentos
invasivos (MARCON et al., 2006; BALASSIANO et al., 2010). Até o momento a NAP1-027
ainda não foi descrita no Brasil. Mais uma vez este fato deve ser decorrente das dificuldades de
diagnóstico e acesso restrito aos métodos de cultura e tipagem molecular de anaeróbios no país.
1.2 Patogênese do Clostridium difficile
1.2.1 As toxinas A (TcdA) e B (TcdB): considerações gerais
Vários fatores de virulência foram associados ao desenvolvimento dessa doença,
porém os mais importantes são as exotoxinas A e B (TcdA e TcdB) (POXTON et al., 2001;
POPOFF e GENY, 2011). As TcdA e TcdB compõem um grande grupo das toxinas clostridiais
(LCTs), nas quais estão incluídas o TcsL e TcsH do Clostridium sordellii, TcnA de Clostridium
novyi e TcpL de Clostridium perfringens tipos B e C (JANK; GIESEMANN; AKTORIES, 2007;
THELESTAM; CHAVES-OLARTE, 2000).
Foi demonstrado, a partir da utilização de mutantes isogênicos de C. difficile para
tcdA e tcdB, que ambas as toxinas contribuem para a patogênese da doença em modelos animais
(LYRAS et al., 2009; KUEHNE et al., 2010). Em humanos, observou-se que a toxina B é uma
enterotoxina mais potente que a toxina A no tecido colônico (SAVIDGE et al., 2003). Além
disso, várias cepas humanas de C. difficile toxina A-negativa e toxina positiva emergiram e
foram associadas tanto a casos esporádicos, como epidêmicos de diarreia (DRUDY et al., 2007).
No entanto Kuehne et al., (2010) mostraram que a TcdA pode causar CDAD na ausência de
TcdB. Estes pesquisadores usaram um modelo de mutantes isogênicos do C. difficile produzindo
apenas TcdA ou TcdB e constataram que estas duas toxinas podem causar CDAD fulminante em
modelos de infecção em hamster. Através de um knockout inativando permanentemente os genes
da toxina, observou-se que o C. difficile produzindo uma ou ambas as toxinas teve uma atividade
18
citotóxica in vitro, restabelecendo a importância da TcdA e TcdB para CDAD (Kuehne et al.,
2010).
1.2.2 Regulação da transcrição e características estruturais das TcdA e TcdB
As TcdA e TcdB são produzidas durante o final da fase de crescimento logarítmico e
a fase estacionária. Elas são codificadas pelos genes tcdA e tcdB, respectivamente, que juntos
com três genes regulatórios (tcdC, tcdD e tcdE) formam o locus de patogenicidade no DNA do
C. difficile (POXTON et al., 2001; POPOFF e GENY, 2011). Sua produção depende de fatores
como os níveis de nutrientes, temperatura e presença de antibióticos em níveis subinibitórios
(DUPUY et al., 2008; SAXTON et al., 2009). A síntese das toxinas são reguladas pelas TcdC,
TcdR e agentes externos ao PaLoc, incluindo CodY (DINEEN et al., 2007). A toxina binária
(CDT) é composta por duas proteínas cdtA e cdtB, a cdtB se liga as células hospedeiras e
transloca cdtA no citosol, que é o componente catalítico (RUPNIK et al., 2009). Os genes que
codificam cdtA e cdtB estão localizados no locus da toxina binária (Cdtloc), juntamente com
outro gene regulador cdtR (CARTER et al., 2007). Mesmo com essas informações o papel do
CDT na CDAD não é bem esclarecido. Geric et al. (2006) mostraram que tipos selvagens de
cepas que produzem CDT mas não produzem TcdA e TcdB podem colonizar hamsters, mas não
matar. São necessários mais estudos a fim de esclarecer o papel da CDT na doença associada ao
C.difficile.
Figura 1. Domínio das toxinas do Clostridium difficile. As TcdA e TcdB são
compostas por quatro domínios respectivamente: A, domínio N-Terminal (vermelho);
C, domínio cisteína protease (azul); D, domínio hidrofóbico (amarelo) e B, domínio
C-terminal (verde). Adaptado de AKTORIES (2011).
19
TcdA e TcdB possuem estruturas primárias semelhantes e exercem suas atividades
enzimáticas em um terminal NH2 homólogo (Figura 1) (CHAVES-OLARTE et al., 1997). A
maioria das cepas toxigênicas do C. difficile produz ambas as toxinas, cujos mecanismos de ação
são análogos. Contudo, em modelos animais com murinos, a TcdA, mas não a TcdB, foi letal
quando injetada de forma intragástrica, além disso a toxina B purificada não causou nenhum
sintoma da doença a não ser que houvesse prévio dano à mucosa intestinal ou na
coadministração de TcdA (LYERLY et al., 1985; KELLY e KYNE, 2011).
1.2.3 Inibição das RhoGTPases: Rho, Rac1 e Cdc42
A toxinas A e B utilizam um mecanismo de ação bem definido para modular a
fisiologia celular e, consequentemente, alterar o ambiente do hospedeiro. Ambas as toxinas,
juntamente com outros membros da grande família de toxinas clostridiais, afetam o grupo de
pequenas GTPases da superfamília Ras, que acabam sendo modificadas por glicosilação. Essa
modificação irreversível, inativa essas pequenas proteínas regulatórias, levando à desregulação
de várias vias de sinalização vitais para a célula. Contudo, além da modificação enzimática dos
alvos específicos das toxinas, existem vários passos importantes para a entrada da toxina na
célula que também são importantes para sua patogênese (VOTH e BALLARD, 2005; LOO et al.,
2011).
As toxinas são liberadas no lúmen intestinal e internalizadas pelas células intestinais
por meio da ligação aos receptores de clatrina. Dentro das vesículas endossômicas, cujo pH
torna-se ácido por conta da fusão com lisossomos presentes no citoplasma, as toxinas sofrem
clivagem autocatalítica, e os fragmentos contendo os sítios ativos das toxinas se destacam para o
citosol, onde exercem suas funções. Como já mencionado, a TcdA e a TcdB têm seus efeitos
atribuídos à monoglicolisação das proteínas Rho, Rac e Cdc42, utilizando UDP-glicose como co-
substrato (Figura 2) (GENTH et al., 2008).
Rho, Rac e Cdc42 são pequenas GTPases intracelulares que exercem um papel
regulador primário sobre o citoesqueleto de actina e sobre a morfologia celular (POPOFF e
GENY, 2011). A monoglicosilação das RhoGTPases induzida pelas toxinas promove a
inativação dessas proteínas, resultando na condensação das fibras de actina, com consequente
desarranjo do citoesqueleto, arredondamento celular, marginalização do núcleo, perda da
integridade estrutural e, por fim, morte celular (JUST et al., 1995; POPOFF e GENY, 2011).
20
Além disso, a inativação das Rho GTPases induz a perda das zônulas de oclusão na barreira
epitelial intestinal, resultando no aumento da permeabilidade do epitélio intestinal (CHEN et al.,
2002). A alteração da integridade celular e o aumento da permeabilidade epitelial contribuem
para a migração neutrofílica e deflagração dos eventos inflamatórios observados na doença
(VOTH e BALLARD, 2005). Em um recente estudo, também foi demonstrado que a toxina B
possui efeitos anti-proliferativos em cultura de células-tronco intestinais (HT-29), o que pode
também contribuir para a diarreia observada por um mecanismo análogo ao de fármacos anti-
neoplásicos (LICA et al., 2011).
Figura 2. Internalização e mecanismo de ação das toxinas do Clostridium difficile. As toxinas ligam-se à célula-alvo através do domínio B sendo captadas por endocitose
mediada por clatrina. Após uma mudança no pH endossomal ocasionando mudanças
conformacionais da toxina, o domínio D forma um poro na membrana endossomal
permitindo translocação do domínio A para o citosol. Este sofre então a clivagem
autocatalítica através do domínio C ligação InsP6, sendo o domínio A liberado para o
citosol onde glicosila as Rho GTPases. Adaptado de AKTORIES (2011).
21
1.2.4 Apoptose induzida por TcdA e TcdB
A apoptose, uma série programada de eventos que leva a morte celular, desempenha
um importante papel no desenvolvimento e manutenção da homeostase dos tecidos em
organismos multicelulares, como também na resposta ao dano celular. As caspases, uma família
de cisteína proteases, são os principais fatores atuantes para morte celular. Uma cascata com
cerca de 9 caspases diferentes atuam na produção da apoptose, algumas atuam como papel de
iniciadores e outras são responsáveis pela fase efetora final da morte celular. Existem duas vias
principais para a apoptose, chamadas de via extrínseca (via receptores de morte) e a outra é a via
intríseca (a via mitocondrial). Ambas as vias ativam as capases iniciadoras e convergem para
uma via final comum de caspases efetoras (JIN e EL-DEIRY, 2005).
A apoptose é desencadeada por vários estímulos, os quais, então, ativam todo o
conjunto de elementos para execução da apoptose (HETTS, 1998). Nos enterócitos, os sinais que
induzem a apoptose incluem, drogas quimioterápicas, a privação de micronutrientes como a
glutamina (PAPACONSTANTINOU et al., 1998), radiação ionizante (POTTEN e BOOTH,
1997), microrganismos (MCCOLE et al., 1999), reações imunes (IWAMOTO et al., 1996).
Todos podem aumentar a taxa de apoptose das células intestinais epiteliais.
Esses estímulos ativam a família de cisteína aspartato proteases (caspases) que são
responsáveis pela execução da fase de apoptose (VAN DAMME et al., 2005). Nos mamíferos,
treze caspases foram identificadas e podem ser classificadas dentro de três subfamílias, com base
na homologia de suas sequências: a subfamília ICE (caspase 1, caspase 4 e caspase 5), a
subfamília CPP32 (caspase 3, caspase 6, caspase 7, caspase 8 e caspase 10) e subfamília ICH-1
(caspase 2 e caspase 9), ainda existem, porém não são muitos conhecidas e foram recém-
descobertas, as caspase 11, 12 e 13 (SIENDONES et al., 2005). Cada caspase é sintetizada e
sequestrada intracelularmente como pró-enzimas, e essas são ativadas por clivagem proteolítica,
que desta maneira, inicia o sinal apoptótico pela ativação de outras caspases em forma de
cascata. Como exemplo de caspases iniciadoras destacam-se a caspase 8 (ativada pela via
mediada pelo ligante Fas ou TNF) e a caspase 9 (ativada pelo citocromo c e Apaf) e das
caspases efetoras, as caspases 3 e 6 (MATES et al., 2006).
A via extrínseca ou via receptores de morte é mediada por um subgrupo da família
dos receptores do fator de necrose tumoral (TNF) chamada de receptores de morte (TNFR1, Fas
22
e TRAIL). A morte celular mediada por receptores é iniciada pelo recrutamento de proteínas
adaptadoras como FADD, as quais se ligam às pró-caspases para gerar o complexo de
sinalizações que induz a morte resultando na ativação da caspase 8. A caspase 8 cliva, e por sua
vez, ativa as caspases efetoras (caspase 3), enzima que executa a apoptose. Além disso, a
proteína Bid, proteína pró-apoptótica membro da família Bcl-2, amplifica a cascata de caspases
pela conexão da via dos receptores da morte com a via apoptótica mitocondrial, relacionando-se
via caspase 8 e caspase 9 (MATES et al., 2006).
A via intrínseca ou mitocondrial de morte celular pode ser ativada através de duas
vias principais: lesão do DNA e deprivação dos fatores de sobrevida celular. Na presença do
dano ao nível do DNA, cujo reparo não é possível, a proteína p53 (fator de transcrição proteico
que desencadeia a apoptose) ativa uma subvia envolvendo a via p21 (proteínas inibidoras de
quinases) e membros pró-apoptóticos da família da proteína Bcl-2 (Bax e Bak. A proteína Bid,
ativa Bax (pró-apoptótica) e Bak, e resulta na liberação do citocromo c no citosol. O citocromo c
liberado forma um complexo com a proteína Apaf-1 (fator de ativação de proteases apoptótico-
1), e os dois combinam-se então com a pró-caspase 9, ativando-a. A liberação do apoptossoma
(conjunto de três componentes composto do citocromo c, Apaf-1 e procaspase 9) gera
subsequentemente a ativação da caspase 3 com consequente morte da célula, podendo-se
observar características morfológicas e bioquímicas da morte celular, incluindo arredondamento
celular, contração do citoplasma, condensação da cromatina do núcleo, fragmentação do DNA,
levando a um estágio final de remoção das células por fagocitose pelos macrófagos (Figura 3)
(DENICOURT e DOWDY, 2004; MATES et al., 2006).
Apoptose tem sido apontada como um importante mecanismo da lesão induzida pelas
toxinas do C. difficile. A inativação das Rho GTPases em uma linhagem de células Caco-2
resultou em ativação das caspases 3 e 9, componentes chaves na via de morte celular programada
(CHAVES-OLARTE et al., 1997). Também foi observado que a TcdA induzia apoptose em
células intestinais humanas T84 via caspases 3, 6, 8, 9 e ativação do Bid, além do desarranjo do
potencial de membrana mitocondrial com liberação de citocromo c e que a apoptose era
secundária a inativação enzimática de Rho por TcdA (BRITO, FUJJI, et al., 2002). Confirmando
este dado, NOTTROTT et al. (2007) concluíram em seus trabalhos que a ativação das caspases
3, 8 e 9 é estritamente dependente da glicosilação das GTPases Rho pela TcdA, e o uso de um
inibidor dessas caspases aboliu a apoptose induzida pela TcdA. Outro possível mecanismo
23
responsável pela apoptose celular observada na enterite causada pela TcdA foi descrita por KIM
et al. (2007). Esse grupo concluiu que a liberação de prostaglandina E2 (PGE2) induzida pela
TcdA promove a ativação do fator nuclear NF-κB e do sistema Fas/FasL causando apoptose e
inflamação. DE ARAUJO JUNQUEIRA et al. (2011) evidenciou que a ativação de NF-B
também contribuía sobremaneira para a apoptose induzida por toxina A.
Figura 3. Diagrama representativo dos mecanismos da apoptose. Adaptado de
ROBBINS et al. (2007)
1.2.5 Ciclo Celular
O ciclo celular é uma série ordenada de eventos que está dividida em quatro fases:
gap 1 (intervalo) (G1), síntese (S), gap 2 (intervalo) (G2) e mitose (M). Cada fase é caracterizada
por distintos processos celulares que são requeridos para o processo de divisão celular e
formação de ciclinas, como também para a formação do complexo ciclina-quinases dependentes
ou proteínas quinases dependentes de ciclina (CDK) que regula as fases de transição, onde sua
ativação enzimática é promovida pela ligação às ciclinas. O complexo ciclina-CDK regula a
atividade de múltiplas proteínas envolvidas na replicação do DNA e na mitose, fosforilando-as
24
em sítios específicos, ativando algumas e inibindo outras para coordenar os eventos do ciclo
celular (WILLIAMS e STOEBER, 2012).
A passagem de cada uma destas fases é regulada pelos “pontos de controle”, um no
início da fase S e o segundo no início da fase M Então, para que as fases ocorram em uma
sequência determinada, o controle do ciclo celular por meio de “freios moleculares” pode parar o
ciclo em vários pontos de checagem, pontos específicos do ciclo que permitem o
desencadeamento do próximo passo somente após o término do estágio precedente (Figura 4)
(MALUMBRES e BARBACID, 2009).
Os complexos ciclinas-CDKSs podem ainda ter sua montagem ou atividade
bloqueada por proteínas inibidoras de CDK. Como por exemplo, na parada que ocorre no ponto
de checagem G1, quando o DNA está danificado; a proteína inibidora de CDK denominda p21 se
liga ao complexo ciclina-CDK de fase S, responsável pelo avanço para a fase S, bloqueando a
sua ação, então a célula não avançará enquanto o DNA não for reparado (HARBOUR e DEAN,
2000).
Estímulos externos, como nutrientes, e sinais internos, como por exemplo, o dano
celular ou a via de Wnt/-catenina, regula a formação de complexos inibidores de CDK, o qual
inclui a família cip/waf (proteínas inibidoras da ciclina-quinases dependente) (p21, p27, p57). A
família cip/waf interage com múltiplos complexos ciclinas-CDK e a família INK4 (inibidores de
quinases) (p15, p16, p18, p19), os quais especificamente inibem o complexo ciclina D-CDK
(WILLIAMS e STOEBER, 2012). Deste modo, a atividade das CDKs é regulada por inibidores
das CDKs.
No primeiro ponto de controle, a proteína Rb (retinoblastoma) atua como freio,
enquanto a ciclina D libera esta parada. A proteína Rb desepenha esta função através de sua
ligação aos fatores de transcrição E2F, que controlam a expressão dos genes que codificam a
ciclinas E e A e a DNA polimerase, entre outros elementos essenciais para a replicação do DNA
durante a fase S. Assim, a E2F ativa a transcrição de específicos genes, incluindo a ciclinas,
necessárias para a próxima fase de transcrição, como também as enzimas requeridas para a
síntese de DNA, como a timidina quinase e dihidrofolato redutase. Se houver alguma lesão do
DNA, os produtos dos genes de supressão tumoral p53 interrompem o ciclo no primeiro ponto de
controle, permitindo que haja o reparo, ativando a transcrição p21 para inibir a progressão
25
celular. Caso este processo falhe, inicia-se o processo de apoptose (morte celular progamada)
(MALUMBRES e BARBACID, 2009).
As toxinas A e B também alteram a expressão de genes envolvidos diretamente na
regulação do ciclo celular, dentre eles, diversas ciclinas e quinases dependentes de ciclinas
(CDKs). LICA et al. (2011) demonstram que as toxinas do C. difficile promovem uma parada do
ciclo celular na fase G1 ao bloquear a expressão de ciclina D1 e sua respectiva ligação à CDK4 e
CDK6, os quais são eventos limitantes durante a progressão para a fase de G1. Contudo, esses
dados não esclarecem satisfatoriamente qual é o mecanismo exato dessa inibição de ciclina D1.
O controle da transcrição gênica de ciclina D1 é extremamente complexo, sendo influenciado por
várias vias de sinalização intracelular, como: Ras-Raf-Mek-ERK, PI3K/Akt/mTOR e Wnt/-
catenina (WELSH et al., 2001; LICA et al., 2011).
Figura 4. Ciclo celular: as Ciclinas e as CDKs. As fases do ciclo celular nas quais
diferentes complexos de ciclinas e quinases dependentes de ciclinas (CDKs) estão
indicados (ANDRIETTA et al., 2001).
26
1.3 A via de Wnt/-catenina e a renovação do epitélio intestinal
A via de Wnt/-catenina constitui um instrumento fundamental para controlar o
desenvolvimento apropriado e a manutenção dos tecidos de embriões e adultos. Isso se dá por
meio de uma série de genes que promovem o controle espacial e temporal do crescimento,
movimentação e sobrevivência celular. Se esses genes forem expressos continuamente, ocorre
ativação aberrante da via de Wnt, provocando um crescimento descontrolado, que pode culminar
com desenvolvimento de câncer em tecidos como cólon, mama, pele e ovários (BARKER e
CLEVERS, 2006).
A ativação da via de Wnt depende da secreção de proteínas da família Wingless
(Wnt) que se ligam ao complexo Frizzled (Fzd) de receptores na superfície da célula-alvo para
ativar distintos mecanismos intracelulares por meio da via canônica ou de vias não-canônicas - a
composição específica do complexo Wnt/Fzd irá determinar qual delas será ativada (Figura 5)
(HUANG e HE, 2008).
A via canônica é a mais bem caracterizada dessas vias, sendo importante para a
renovação do epitélio intestinal e para o desenvolvimento de câncer (BARKER e CLEVERS,
2006). Basicamente, ela regula a capacidade da proteína catenina ativar genes-alvo
específicos por meio do seguinte mecanismo: na ausência do ligante Wnt, o ativador
transcricional catenina é continuamente degradado na célula pela ação de um conjunto de
proteínas denominado de “complexo de destruição”. Dentro dele, as proteínas Axina e APC
(adenomatous polyposis coli) formam uma base que engloba a catenina e facilita sua
fosforilação pelas enzimas caseína-quinase 1 (CK1) e glicogênio sintase quinase 3 (GSK3).
Subsequentemente, a catenina fosforilada recebe uma cauda de poli-ubiquitina, é reconhecida
e degradada pela enzima E3 ligase do sistema ubiquitina-proteassoma (ABERLE et al., 1997).
Com isso, os níveis de catenina permanecem baixos, o que permite que as proteínas TCF/Lef
(T-cell fator/Lymphoid enhancer fator) associadas ao DNA interajam com co-repressores para
bloquear a expressão gênica no núcleo. Clinicamente, observa-se que mutações germinativas no
gene APC (Polipose adenomatosa coli) são responsáveis pela ocorrência de polipose
adenomatosa familiar (PAF). Por sua vez, mutações somáticas levam à transformação maligna de
adenomas. (GRIGORYAN et al., 2008; HUANG e HE, 2008).
27
Por outro lado, na presença de Wnt, forma-se um complexo com o receptor Fzd e o
co-receptor LRP 5/6 (low-density lipoprotein receptor-related protein) que se liga a proteína
Dishevelled (Dvl), responsável por realocar a Axina do complexo de destruição para a membrana
celular. Isso impede que a catenina seja degradada e permite que ela se acumule no
citoplasma e entre no núcleo (HUANG e HE, 2008). Lá, ela interage com membros da família
TCF/Lef, convertendo as proteínas TCF em potentes ativadores transcricionais, ao recrutar
proteínas co-ativadoras, levando a uma eficiente ativação dos genes alvo da via de Wnt,
incluindo c-MYC, Ciclina-D1, survivina, bcl-2, Rac1, Rho, Cdc42, dentre outros (BARKER e
CLEVERS, 2006; BUONGIORNO et al., 2008; HUANG e HE, 2008).
Figura 5. Via de sinalização Wnt/β-catenina na presença e ausência do ligante Wnt. Modificado de He et al. (2009).
28
Há mais de vinte anos vêm-se estudando extensivamente a via de Wnt, porém, só
recentemente, após a descoberta de que Rac1 é importante para o transporte de catenina entre
o núcleo e o citoplasma, o papel das Rho GTPases nessa via vem sendo melhor compreendido
(HENDERSON e FAGOTTO, 2002). Em células de carcinoma de cólon humano que possuem a
via de Wnt constitutivamente ativada, o uso de dominante negativo de Rac1 foi capaz de inibir a
transcrição dos genes alvo de catenina (ESUFALI e BAPAT, 2004) e a inibição de um
regulador negativo de Rac1 (RacGAP50C) promoveu a sinalização canônica de Wnt em
embriões de Drosofila (JONES e BEJSOVEC, 2005). Além disso, sabe-se que a ativação de JNK
mediada por Rac1 culmina com fosforilação de catenina e sua translocação para o núcleo
(WU et al., 2008). Wnt3a (ligante da via de Wnt) foi descrito por promover a ligação de Rac1 ao
GTP e, após ativação da via pelo ligante, Tiam1 (regulador positivo de Rac1) foi encontrada co-
precipitada com catenina (BUONGIORNO et al., 2008). DOCK4, outro regulador de Rac1,
foi observado como um dos integrantes do complexo degradador de catenina (UPADHYAY
et al., 2008).
As Rho GTPases também são necessárias para a fosforilação do co-receptor LRP5/6,
imprescindível para a ativação da via de Wnt/catenina, e a síntese do lipídeo PIP2 está
envolvida neste processo (PAN et al., 2008; SCHLESSINGER et al., 2009). A síntese de PIP2
requer a atividade consecutiva de duas quinases, PIP4K e PIP5K, que, por sua vez, são ativadas
por Rho e Rac1 (SCHLESSINGER et al., 2009).
29
2. JUSTIFICATIVA
O Clostridium difficile tem como fatores de virulência a secreção das toxinas A & B,
as quais promovem apoptose, inflamação e destruição tecidual aguda em intestinos de animais
experimentais e de pacientes com a doença induzida por esta bactéria (REHG, 1980). O estudo
da patogênese da lesão induzida pelas TcdA e TcdB se reveste de grande importância no
contexto atual, onde se observa aumento da incidência e gravidade da doença induzida pelo C.
difficile, associado a relatos de recidiva após tratamento padrão (BLOSSOM & MCDONALD,
2007; MUSHER et al., 2005; PEPIN et al., 2005).
Haja vista a crescente incidência da infecção pelo C. difficile no Brasil
(BALASSIANO et al., 2010) e no Mundo (RUPNIK, 2007) e a seu potencial para recorrer no
mesmo paciente, vários grupos de pesquisa em todo o mundo estão empenhados em
compreender os diversos aspectos do mecanismo da doença e desenvolver tratamentos mais
eficazes. Nosso grupo de pesquisa, particularmente, se dedica ao estudo do papel das toxinas A e
B na patogênese da doença induzida pelo C. difficile, bem como sua possível modulação
farmacológica, tendo publicado vários trabalhos nesta área (BRITO, FUJJI, et al., 2002; BRITO,
SULLIVAN, et al., 2002; ALCANTARA et al., 2005; BRITO et al., 2005; NASCIMENTO et
al., 2005; CARNEIRO et al., 2006; CAVALCANTE et al., 2006; MACIEL et al., 2007;
BARRETO et al., 2008; DE ARAUJO JUNQUEIRA et al., 2011; MEDEIROS et al., 2011;
SANTOS et al., 2013; LIMA et al., 2014).
Um aspecto ainda inexplorado da fisiopatologia da doença consiste no efeito das
toxinas do C. difficile sobre a via de Wnt/-catenina. A renovação do epitélio colônico depende
de células progenitoras que residem na base das criptas colônicas e que, posteriormente, irão se
diferenciar em colonócitos maduros. Para que ocorra proliferação dessas células, a via de Wnt/-
catenina precisa estar ativada, levando ao aumento da expressão de moléculas-chave do ciclo
celular, como ciclina D1 e c-MYC (BARKER e CLEVERS, 2006; HUMPHRIES e WRIGHT,
2008). Portanto, visto que o C. difficile coloniza o cólon, bem como as criptas, seria esperado
que as toxinas A e B liberadas também afetassem essas células, inibindo a via de Wnt/-catenina
e, consequentemente, bloqueando sua proliferação (ou até mesmo induzindo apoptose em doses
30
maiores). Corroborando esta hipótese, um recente estudo demonstrou o efeito anti-proliferativo
in vitro das toxinas A e B em cultura de células intestinais, embora não tenha explorado o
mecanismo pelo qual isso ocorre (LICA et al., 2011).
A conexão entre o bloqueio da renovação epitelial e o aparecimento de síndrome
diarreica na quimioterapia do câncer já é bem estabelecida, sendo a diarreia um efeito colateral
frequente de diversas drogas antineoplásicas, que também possuem efeitos antiproliferativos
(HUMPHRIES e WRIGHT, 2008). Portanto, esse mecanismo representa um aspecto ainda não
investigado da fisiopatologia da doença associada ao C. difficile e que pode ser aproveitado
futuramente para o desenvolvimento de terapias mais eficientes.
31
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
Estudar o efeito das toxinas A e B do Clostridium difficile in vitro em células
epiteliais intestinais sobre a via de sinalização Wnt/-catenina e investigar o mecanismo
envolvido nessa inibição utilizando a TcdA.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Investigar o efeito das TcdA e TcdB sobre a atividade da via de Wnt/-catenina em
cultura de células de criptas intestinais (IEC-6) e neoplásicas (RKO), por meio da
ativação de gene-repórter (TOPFLASH – plasmídeo de TCF/Lef conjugado com
luciferase);
Avaliar o efeito da toxina A sobre a expressão de genes-alvo da via de Wnt em cultura de
células de criptas intestinais normais (IEC-6), investigando também a translocação
nuclear de -catenina (por western blot e imunofluorescência);
Estudar o efeito da ativação de caspases pela toxina A sobre a degradação de -catenina e
avaliar se a ativação de caspases contribui para a inibição da via canônica de Wnt;
Avaliar o efeito da inibição do complexo de destruição da -catenina sobre os efeitos da
toxina A na via canônica de Wnt;
32
4. MATERIAIS & MÉTODOS
4.1 Reagentes
4.1.1 Toxinas A (TcdA) e B (TcdB) do Clostridium difficile
TcdA e TcdB purificadas foram adquiridas comercialmente da Sigma (St. Louis,
MO, EUA). As toxinas foram preparadas em alíquota mãe de 100 g/mL e diluídas, antes de
cada experimento, para as concentrações de 1 a 100 ng/mL (dependendo do modelo
experimental) a partir de uma concentração estoque de 1,13 mg/mL, armazenada 2 a 8oC. As
toxinas foram diluídas em salina fosfatada tamponada (PBS) estéril e sempre filtradas em
ambiente estéril, dentro do fluxo laminar, imediatamente antes de serem utilizadas nos
experimentos.
4.1.2 Anticorpos
Foram utilizados, para os experimentos de western blot e imunofluorescência, os
seguintes anticorpos primários:
- Anticorpo de coelho anti--catenina (Sigma);
- Anticorpo de coelho anti-caspase-3 (Santa Cruz);
- Anticorpo de coelho anti-c-MYC (Sigma);
- Anticorpo de coelho anti--tubulina (Sigma);
- Anticorpo de coelho anti-Histona-3 (Santa Cruz).
4.1.3 Plasmídeos
Os vetores utilizados para transfecção de células de mamíferos e o vetor de expressão
utilizados nesse trabalho foram gentilmente cedidas por Xi He, PhD (Harvard Medical School,
Boston, MA, EUA) e estão detalhados abaixo: - TOPFlash/FOPFlash (TK-Luciferase Reporter): O TOPFlash consiste no plasmídeo repórter
do fator de célula T (TCF), contendo três cópias do sítio de ligação TCF selvagem acima do
promotor de Timidina Quinase (TK) e sítio de leitura da Luciferase. O FOPFlash, por sua vez,
contém um sítio de ligação do TCF mutado e é utilizado como controle negativo (Figura 6) (VAN
DER FLIER e CLEVERS, 2009).
33
Figura 6. Representação esquemática do vetor pTOPFlash. Plasmídeo repórter
TCF contendo 3 cópias do sítio de ligação TCF (selvagem) upstream ao promotor de
timidina quinase (TK prom.) e o sítio de leitura da Luciferase. Também presentes o
gene de resistência à ampicilina (amp) e o gene para Colicina E1 (ColE1), que inibe
outras cepas de E. coli. Adaptado de KWEIDER et al. (2011).
- pRLTK (Renilla Luciferase Reporter): O vetor repórter constitutivamente ativo pRL contém o
cDNA (Rluc) codificando a Renilla luciferase, originamente clonada do organismo marinho
Renilla reniformes, que é uma proteína monomérica de 56kDa que não necessita de modificação
pós-translacional. O pRLTK é utilizado como controle interno da transfecção e pode ser
transfectado em células de mamíferos juntamente com outros vetores (Figura 7) (VAN DER
FLIER e CLEVERS, 2009).
-catenina selvagem (pCS2+/-catenina): -catenina de Xenopus completa, reconstruída
tomando-se o fragmento do vetor Cla-SphI do XBC20 e a sequência do XBC24 (codificando o
porção c-terminal da -catenina). O pCS2+ é um vetor de expressão com múltiplas funções.
Embora tenha sido desenvolvido originalmente para expressar proteínas em embriões de Xenopus
para ambos RNA e DNA injetados, o pCS2+ também é útil para expressão transiente de alto-nível
em vários tipos de células de aves e mamíferos (LIU et al., 1999).
-catenina mutada S33A (pCS2+/-catenina-S33A): esta -catenina derivada de Xenopus
possui quatro mutações pontuais introduzidas no sítio de fosforilação de GSK3: S33A, S37A,
34
T41A, S45A, sendo assim resistente a fosforilação pelo GSK3 e não afetada pelo complexo de
destruição. Esse vetor é derivado do constructo XE-28 e foi linearizado, transcrito e utilizado
como está descrito na citação original (YOST et al., 1996).
Figura 7. Representação esquemática do vetor pRLTK. O vetor pRLTK contém o
promotor de timidina quinase do vírus herpes simplex (HSV TK), o cDNA
codificando Renilla luciferase (Rluc), o gene de resistência à ampicilina (amp) e o
vetor de vírus simian 40 (SV40). Adaptado de MOON (2001)
- Lef1-N-VP16 (cDNA3-Lef1-N-VP16): este vetor foi construído como uma quimera entre a
proteína LEF (lymphoid enhacing factor) humana truncada sem a região de ligação de -
catenina, sendo denominada LEFN, e a proteína do vírus herpes simplex VP16, a qual
determina a ativação constitutiva deste constructo. Com isso, este vetor ativa a via canônica de
Wnt constitutivamente sem a participação da-catenina (AOKI et al., 1999).
4.1.4 Reagentes e soluções
A solução de cloreto de lítio (LiCl), proveniente da Sigma (St. Louis, MO, EUA), e
de Carbobenzoxi-valil-alanil-aspartil-[O-metil]-fluorometilcetona (z-VAD-fmk), adquirida da
Promega (Madison, WI, EUA), foram preparadas em ambiente estéril dentro do fluxo laminar e a
alíquota-mãe (100 mM de LiCl e 1 mg/mL de z-VAD-fmk) foram diluídas com solução filtrada
35
de PBS, sendo posteriormente armazenadas a uma temperatura de 2 a 8°C até a realização do
experimento.
As soluções utilizadas no preparo dos meios de cultura dependeram de linhagens
celulares utilizadas no experimento (IEC-6, RKO ou Célula L), dentre elas, a solução de piruvato
de sódio 100nM (11,004 mg/L) (GIBCO, Grand Island, NY, EUA), a solução de aminoácidos
não essenciais (GIBCO, Grand Island, NY, EUA) 100nM sendo, estocadas de 2 a 8°C. Já o soro
fetal bovino (GIBCO, Grand Island, NY, EUA), insulina bovina (10mg/ml) (SIGMA, St Louis,
MO), a solução de tripsina-EDTA (0.25% tripsina, 1mM EDTA) (GIBCO, Grand Island, NY,
EUA) e a solução de penicilina (100UI/mL) e estreptomicina (100mg/mL) (GIBCO, Grand
Island, NY, EUA), contendo 10.000 unidades de penicilina (penicilina G) e 10.000 µg de
estreptomicina (sulfato de estreptomicina em 0,85% de salina) foram armazenadas a -5° a -20°C.
4.2 Meios de cultura
Meios de cultura são formulações químicas que fornecem o aporte nutricional para o
desenvolvimento e crescimento da cultura, e de um modo geral, os meios contêm em sua
composição de aminoácidos, vitaminas, sais inorgânicos e componentes orgânicos (DULBECCO
et al., 1973). Os meios de cultura utilizados foram meio essencial mínimo modificado por
Dulbecco - DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) (1x) contendo 4500 mg/L de glicose e
L-glutamina e sem piruvato de sódio (número de catálogo #11965- 092) e DMEM contendo
4500mg/L de glicose e piridoxina hidroxiclorídrica, sem L-glutamina e sem piruvato de sódio
(número de catálogo # 11960-044) (Gibco; Gaithersburg, MD, EUA) foram armazenadas a 2°C a
8°C. A formulação dos respectivos meios de cultura utilizados para cada tipo de célula intestinal
é diferente e está descrita nas tabelas abaixo.
Tabela 01 – Composição do meio de cultura para células IEC-6 Reagentes Volume
DMEMa 500mL 5% Soro Fetal Bovino 25mL 100 U/mL Penicilina e 100g/mL Estreptomicina 5mL Piruvato de Sódio 1mM 5mL Insulina Bovina 95% (10 g/mL; 500 mL=5000g) 5mg *O pH foi corrigido para 7,4 aPara os experimentos com meio-padrão, o número de catálogo do DMEM (#) foi 11965-092.
36
Tabela 02 – Composição do meio de cultura para células L e RKO Reagentes Volume
DMEMa 500mL 10% Soro Fetal Bovino 50mL 100 U/mL Penicilina e 100g/mL Estreptomicina 5mL Piruvato de Sódio 1mM 5mL Solução de aminoácidos não-essenciais 100nM, 100x (MEM) 5mL *O pH foi corrigido para 7,4 aPara os experimentos com meio-padrão, o número de catálogo do DMEM (#) foi 11965-092.
4.3 Cultura de Células Intestinais
Todos os manuseios referentes à cultura de células foram realizados dentro do fluxo
laminar, pois se faz necessário um ambiente estéril para manipulação das culturas de células. A
câmara de fluxo laminar é o principal equipamento utilizado para a manutenção da esterilidade
de materiais durante o manuseio e é onde se permite a remoção das partículas do ar originadas na
área de trabalho. Além disso, permite também uma proteção contra contaminação cruzada,
evitando que as partículas geradas na área de trabalho se desloquem lateralmente, contaminando
outros processos e produtos (BRYAN et al., 1984).
Em síntese, o funcionamento das câmaras de fluxo laminar consiste na entrada do ar
onde é succionado através dos pré-filtros por meio de ventilador centrífugo, depois atravessa um
filtro absoluto e é distribuído a uma velocidade constante (0,45m/s) (PINTO et al., 2002). O
Laboratório do Núcleo de Estudos em Microscopia e Processamento de Imagens (NEMPI) da
Universidade Federal do Ceará abriga uma câmara de fluxo laminar vertical classe II tipo A,
onde permite 70% de recirculação do ar e pode ser usada com microrganismo de risco 2 e 3,
substâncias químicas em pequenas quantidades e substâncias com traços de material radioativo.
O ar contaminado após filtragem pelo filtro HEPA do exaustor passa ao ambiente onde a cabine
está instalada com pelo menos 20 cm de afastamento do teto (MORGAN e DARLING, 1993).
Foram utilizadas duas linhagens de células intestinais, uma derivada da cripta do
jejuno de ratos normais (IEC-6), uma linha de células epitelial não diferenciada e um outro tipo
de células intestinais provenientes de células de adenocarcinoma de cólon humano (RKO, sendo
células intestinais mais diferenciadas.
37
A célula epitelial intestinal de Rattus novergicus (IEC- 6), derivada da cripta do
jejuno de ratos não-neoplásicas, foi obtida da American Type Culture Collection (ATCC,
Rockville, MD). Essa reconhecida linhagem de célula foi desenvolvida e caracterizada por
Quaroni e colaboradores em 1979, quando foram estabelecidas suas características por critérios
morfológicos e imunológicos de células não diferenciadas da cripta do intestino delgado.
Verificou-se a presença de numerosas microvilosidades cobrindo a superfície das células e a
presença de pseudópodes que se estendem pela superfície celular gerando a formação de contatos
intercelulares (QUARONI et al., 1979). Desta forma, essa linhagem celular é comumente
utilizada em modelos in vitro de monocamada de células para se avaliar, principalmente, a
migração celular e outros parâmetros, após recuperação do intestino (MCCORMACK et al.,
1992).
A células RKO são células de adenocarcinoma de cólon humano desenvolvidas por
Michal Brattain. As células RKO contém p53 selvagem, mas não expressam o receptor endógeno
para hormônio tireoidiano (THRB). As linhagens de células RKO utilizadas nesse trabalho foram
estavelmente transfectadas com pTOPFlash e pRLTK, sendo ideal para estudo da ativação da via
canônica de Wnt in vitro, e foram gentilmente cedidas pelo Prof. Dr. Xi He do Children’s
Hospital da Harvard Medical School (Boston, MA, EUA).
Também foram utilizados dois grupos de células L (linhagem permanente de células
epiteliais intestinais de camundongos), sendo um grupo secretor de Wnt3a e outro grupo controle
não-secretor de Wnt3a. Wnt3a é um peptídeo que funciona como um ligante clássico da via
canônica de Wnt. Dessa forma, o meio condicionado das células L secretoras é coletado e
utilizado para ativar a via de Wnt/-catenina nos grupos desejados, enquanto que o meio das
células L não-secretoras de Wnt3a é utilizado como controle.
4.4 Protocolos Experimentais
4.4.1 Preparação das células aderidas
Antes da realização da contagem, as células aderidas na placa de cultura confluente
eram “liberadas” da superfície em que se encontravam aderidas. Utilizou-se tripsina-EDTA
(0,05% de 1:250 de tripsina; isto é, tripsina que sob condições testadas pode digerir 250g de
substrato para cada 1g de tripsina adicionada e 0,02% de EDTA). O fundamento deste princípio
baseia-se no fato de que as proteínas de adesão destas células necessitam de magnésio para
38
exercerem sua função. Devido a estas características, a tripsina e o EDTA são utilizados em
conjunto. A tripsina age digerindo e clivando as proteínas de adesão; e o EDTA, por sua vez,
quela os cátions divalentes livres (PERES e CURI, 2005).
Portanto, para a liberação das células do substrato, o meio foi retirado, sendo então
adicionado 3-5mL de tripsina-EDTA permitindo que toda área em que as células se encontravam
ficasse em contato com a solução. Em seguida, a placa de cultura foi incubada a 37oC em
atmosfera umidificada contendo 5% de CO2 e 95% de ar atmosférico por 1 min para células IEC-
6 e 1-2 min para as células RKO e L. Após este período, a cultura foi examinada no microscópio
para verificar se as células foram removidas das duas superfícies de adesão da placa. Em seguida,
foram adicionados de 5 a 7 mL de meio de cultura com soro misturando suavemente a solução.
As proteínas do soro são clivadas pela tripsina e acabam competindo com as moléculas de adesão
das células, permanecendo viáveis para seguir com o experimento. Outro ponto importante neste
processo, é que a tripsina foi mantida em contato com as células por um curto período de tempo.
Após o recolhimento desta solução com células, meio e tripsina-EDTA em um tubo estéril, então
as células foram centrifugadas (1500 rpm por 5 min). A seguir, o sobrenadante contendo tripsina
foi desprezado, e o precipitado celular (pelet) foi lavado com solução salina estéril e filtrada
(PBS). A ressuspensão em PBS (10mL) foi feita suavemente para que não houvesse nenhum dano
às células e novamente foi centrifugada (1500 rpm por 5 min).
4.4.2 Contagem das células intestinais em lâmina pela câmara de Neubauer
Após a segunda centrifugação, foi retirado novamente o sobrenadante e acrescentou-
se 5ml de meio de cultura. Um pequeno volume da suspensão (100μL) foi retirado com pipeta
estéril e colocado em um tubo contendo meio (900μL) para realização da contagem. A contagem
foi realizada na câmara de Neubauer, uma lâmina de vidro que apresenta duas superfícies
separadas (cada uma dividida em um grid). O grid é composto por nove quadrados, onde cada
qual mede 1mm de lado e é limitado por três linhas muito próximas. Uma lamínula de vidro é
posicionada sobre a área central da câmara. O espaço formado entre a lamínula e a câmara é de
0,1mm. Por conseqüência, o volume é determinado por cada quadrado quando coberto pela
lamínula é equivalente a 1mm x 1 mm x 0,1 mm que é igual a 0,1 mm3 , ou seja, 0,1 μL. Então,
após a contagem das células existentes em um quadrado, o número de células contidas em 1mL é
igual a este valor mutiplicado por 104 (Freshney, 1994).
39
Nos experimentos, utilizamos a contagem pelos quatro quadrados e fizemos uma
média destes (a contagem de mais de um quadrado garante um resultado mais confiável),
entretanto poderia ser feita também utilizando apenas o quadrado central. A contagem foi
padronizada com critério de exclusão das células que estiveram sobre as linhas inferiores e da
direita. A concentração total de células na suspensão original foi calculada seguindo a fórmula
abaixo:
Número de células/mL = No total de células contadas x 104 x fator de diluição
Número de quadrados contados
Desta maneira, antes de iniciar os experimentos foi feita a tripsinização das células
aderidas nas placas de cultura, logo após a contagem das células para cada protocolo de
experimentação e, caso necessário, o ajuste para a concentração ideal.
4.4.3 Transfecção celular de plasmídeos e ensaio da luciferase
O TOPFlash é um ensaio com um gene repórter sensível ao TCF/Lef que codifica a
proteína luciferase (proteína quimioluminescente oriunda dos vagalumes) quando ocorre ativação
transcripcional mediada pela β-catenina (Figura 8) (KORINEK, 1997). As células IEC-6 e RKO
foram plaqueadas em uma concentração de 5x104 células/poço em placas de 96 poços 24h antes
da transfecção. Elas foram transfectadas por meio do uso de Lipofectamina com uma combinação
de vetores de expressão: sendo 30 ng de TOPFlash, contendo o gene da luciferase sob o controle
de sítios de ligação do TCF selvagem, ou de FOPFlash (Milipore), contendo o gene da luciferase
sob controle de um sítio de ligação de TCF mutante (Milipore), e 5ng de pRL-RK, o qual é o
vetor repórter da Renilla luciferase (Promega). As luciferases do TOP/FOPFlash e da Renilla são
proteínas monoméricas que não requerem modificações pós-traducionais para sua atividade. O
pFOPFlash funciona como um controle negativo para o pTOPFlash, enquanto que o pRLTK
como um controle interno da transfecção. Outros vetores foram utilizados em determinados
experimentos como a pcatenina selvagem (50ng), pcatenina mutante S33A (50ng) e LefN-
VP16 (50ng) também tendo sido transfectadas com Lipofectamina em 250 L de DMEM sem
soro de acordo com o protocolo do fabricante. Quatro horas depois, um adicional de 250 L de
DMEM contendo 5% de Soro Fetal Bovino será adicionado para as células. Após 8h da
40
transfecção, o meio original será trocado por meio novo, contendo DMEM com 5% de Soro Fetal
Bovino.
Figura 8. Protocolo para realização do ensaio TOPFlash. As células IEC-6 e RKO
transfectadas com TOP/FOPFlash e pRLTK (Renilla) são tratadas com TcdA ou TcdB e
estimuladas com meio condicionado contendo Wnt3a (meio L é usado como controle). Após 24h,
é feita a leitura em luminômetro, sendo calculada a relação TOPFlash:Renilla, compara-se então
os grupos com TcdA/TcdB com os sem toxina e observa-se se houve inibição da via de Wnt.
Adaptado de CLEVERS et al., 2006.
A produção da enzima luciferase foi determinada por meio do kit Luciferase Reporter
Gene Assay System. Para isso, 50 µL do extrato de proteínas foram pipetados em microplaca 96
poços-Lumitrac-Platte com fundo branco. O substrato luciferina foi preparado adicionando-se 10
mL do tampão de reação do kit com o pó do substrato. O substrato foi fornecido ao aparelho
luminômetro, o qual injetou automaticamente 100 µL do mesmo em cada amostra e a leitura foi
feita após 0,5 segundos com medidas de 3 segundos para emissão de luz. O fóton liberado durante
a reação de transformação da luciferina em oxiluciferina foi detectado e integrado pelo aparelho.
41
A enzima QuantiLum Recombinant Luciferase (14,6 mg/mL), parte do kit Luciferase
Reporter Gene Assay System, foi dissolvida em tampão de lise com BSA (1 mg/mL) para a
concentração final de 1 ng luciferase/15 µL tampão. A luciferase foi então incubada por uma hora
a temperatura ambiente com as substâncias-teste, sendo que 0,5 µL de solução a 10 mM origina
uma concentração final de 100 µM. Logo após, 15 µL da solução de reação em microplaca de 96
poços-Lumitrac-Platte com fundo branco receberam 50 µL da solução de substrato sob injeção
automática do luminômetro e a leitura foi efetuada. Os dados obtidos foram plotados em uma
tabela do Graphpad Prism e expressos como fração intensidade da TOPFlash luciferase sobre
intensidade de Renilla, para que haja normalização do resultado.
4.4.4 Western Blot
Amostras de células foram coletadas em cada experimento e imediatamente
congeladas em nitrogênio líquido, em seguida, foram armazenadas a -70˚C. Posteriormente, foi
realizada extração de proteínas e análise da expressão das proteínas de interesse (-catenina, c-
MYC e Caspase-3) por Western blot (Figura 9). As células foram lisadas por sonicação com
solução de lise celular (Triton X-100 1% e Nonidet P-40 0.2%) e EDTA (2mM), sendo
transferidas para tubos testes contendo inibidor de protease para posterior centrifugação a 14000
rpm a 4ºC. A concentração proteica do sobrenadante foi determinada pelo ensaio de BCA –
bicinchoninic acid (Pierce), em tubos eppendorf, com leitura em espectrofotômetro (absorbância
de 562 nm). Em seguida, foi feita a separação eletroforética (Bio Rad, Hercules, CA) das
amostras após desnaturação (por meio de ebolição) em gel de poliacrilamida 12,5% (SDS- Page),
com o marcador de proteína (Invitrogen). O gel foi, então, transferido para uma membrana de
PVDF - previamente ativada com metanol - “overnight” em aparelho de transferência 36v (Bio
Rad mini-transfercell) a 4º C. No dia seguinte, a membrana de PVDF foi bloqueada com leite
desnatado por 1h, a fim de bloquear outras proteases, seguindo de incubação com anticorpo
primário durante 1h e meia, diluição 1:500 em albumina bovina 5%. Após lavagens com tampão
contendo TRIS, glicina, Tween 20 e água destilada, a incubação com anticorpo secundário foi
realizada, diluído 1:500 em leite desnatado, durante 1 hora e meia, em plataforma oscilante.
Depois de lavar com o tampão de lavagem, foi feita a revelação da membrana de nitrocelulose
pela técnica de ECL, em filme radiográfico (Kodak, Rochester, NY), em sala escura.
42
Figura 9. Protocolo para avaliar ativação da via de Wnt/-catenina por Western Blot ou
Imunofluorescência.
4.4.5 Imunofluorescência
Para realizar uma análise do efeito das toxinas do C. difficile sobre a localização da
-catenina nas células, confeccionou-se imagens com o uso de microscopia confocal. As células
dos diferentes grupos experimentais foram fixadas com paraformaldeído a 3% por 15 min na
temperatura ambiente e permeabilizada com triton X-100 por 2 min. Em seguida, o anticorpo
monoclonal primário para -catenina (Sigma) feito em coelho foi aplicado por 90 min a 37º C,
sendo omitido no controle negativo. As lamínulas contendo as células foram então lavadas em
PBS/0,5% BSA, incubadas com anticorpo secundário anti-rabbit conjugado a Alexa-fluor
488nm “overnight” a 6º C, lavadas novamente com PBS, incubadas com DAPI por 10 min para
corar os núcleos e montadas com “Fluorsafe”. As lâminas foram examinadas em microscópio
confocal Olympus F-1000 com filtros 488nm (Alexa-fluor). As imagens adquiridas foram
analisadas com o software de domínio público ImageJ 4.5.1 (NIH, Bethesda, EUA) para se
quantificar a translocação nuclear de -catenina.
43
4.5 Análise Estatística
Os resultados foram mostrados como média ± erro padrão da média (EPM),
utilizando o GraphPad Prism (GraphPad, San Diego, CA). Diferenças entre os grupos
experimentais foram comparadas utilizando Análise de Variância (ANOVA), seguida do teste de
Bonferroni, com significância de 5%. Valores de p < 0,05 foram considerados estatisticamente
significantes.
44
5. RESULTADOS
5.1 TcdA e TcdB inibem a via de sinalização Wnt/-catenina em cultura de células
epiteliais intestinais
A expressão de vários genes Wnt, incluindo Wnt1 e Wnt3a, estabilizam a -catenina
em células de mamíferos. No presente estudo, utilizamos um modelo de cultura de células
reproduzível no qual foi investigado os efeitos das TcdA e TcdB sobre a via de Wnt/-catenina.
A incubação de células IEC-6 tanto com toxinas A quanto com toxina B por 24h resultou em
uma redução dose-dependente da resposta regulatória transcricional da -catenina induzida por
Wnt3a (Figuras 10A e 10B). Para confirmar que esta resposta não era restrita à linhagem de
células IEC-6, células epitéliais de jejuno de Rattus norvegicus, foram também estimuladas
células RKO, uma linhagem de adenocarcinoma de cólon humano, estavelmente co-transfectada
com os vetores pTOPFlash e pRLTK. Foi observado, de forma semelhante, uma inibição da via
de Wnt/-catenina de forma concentração-dependente pelas TcdA e TcdB, também foi
observado em células RKO (Figuras 10C e 10D).
Para dar mais suporte a estes dados, os tempos de exposição das células RKO à TcdA
(50ng/mL) foram variados para 6, 12 ou 24h (Figura 11A). Ainda assim, houve inibição
estatisticamente significante da resposta regulatória transcricional de -catenina, tanto em 6h
(p=0.011) como em 12h (p=0.002), os quais foram comparáveis ao grupo de 24h (p=0,006).
Além disso, células RKO foram pré-tratadas com Wnt3a por 12h, sendo, então, incubadas com
TcdA por 6, 12 ou 24h (Figura 11B). Este protocolo foi realizado para investigar se a pré-
ativação da via canônica de Wnt poderia interferir na inibição pela TcdA. Não obstante, a TcdA
continuou a inibir a via de Wnt/-catenina nos grupos incubados por 12 e 24h. Contudo, não
houve diferença estatisticamente significante para o grupo incubado por 6h.
45
Figura 10. As toxinas A e B do Clostridium difficile inibem a via canônica de Wnt de forma dose-dependente. Ensaio do repórter TOPFlash em células IEC-6 (A e B) e RKO (C e D)
estimuladas com Wnt3a que foram incubadas com 10, 50 ou 100 ng/mL de TcdA (A e C) ou 1, 5
ou 10 ng/mL de TcdB (B e D). As células IEC-6 e RKO foram co-transfectadas com os vetores-
repórter pTOPFlash (ou pFOPFlash). Vetores codificando pRLTK (Renilla) serviram como
controles internos da eficiência da transfecção e da toxicidade potencial dos tratamentos. Os
valores foram expressos como média ± SEM (n = 3). *P < 0,05 e **P<0,01 vs grupos tratados
com Wnt3a que não foram incubados com TcdA ou TcdB.
46
Figura 11. A toxina A do Clostridium difficile inibe a via canônica de Wnt em diferentes tempos de incubação. Ensaio
do repórter TOPFlash em células RKO (A) estimuladas com Wnt3a e incubadas com TcdA (50 ng/mL) por 6, 12 ou 24h. (B)
Células RKO foram pré-estimuladas com Wnt3a por 12h e então incubadas com TcdA (50 ng/mL) por 6, 12 ou 24h. As
células RKO foram co-transfectadas com os vetores-repórter pTOPFlash (ou pFOPFlash). Vetor codificando pRLTK
(Renilla) serviu como controle interno da eficiência da transfecção e da toxicidade potencial dos tratamentos. Os valores
foram expressos como média ± SEM (n = 3). *P < 0,05 e **P<0,01 vs grupos tratados com Wnt3a que não foram incubados
com TcdA.
47
5.2 A toxina A do Clostridium difficile diminui os níveis da proteína -catenina e previne a
expressão de c-MYC induzida por Wnt3a
Investigou-se o efeito da TcdA sobre estabilização de -catenina induzida por Wnt3a
em células IEC-6, visto que esta estabilização é fundamental para a ativação dos componentes
downstream a via canônica de Wnt. Portanto, realizou-se western blotting com extratos de
proteína total de células IEC-6 para avaliar os níveis celulares de -catenina em resposta a
Wnt3a em diferentes concentrações de TcdA (10, 50 e 100 ng/mL). Foi evidenciado que os
níveis da proteína -catenina diminuíram de forma diretamente proporcional à concentração de
TcdA (Figuras 12A e 12B).
Além disso, foram mensurados os níveis da proteína c-MYC nas mesmas amostras.
C-myc representa um dos genes-alvo do complexo -catenina/TCF-Lef e codifica um fator de
transcrição que possui função imprescindível para a progressão do ciclo celular e apoptose.
Portanto, a supraregulação de c-myc ocorre quando a -catenina é supraregulada (CLEVERS et
al., 2009). Como esperado, o pré-tratamento de células IEC-6 com Wnt3a por 24h aumentou
significantemente os níveis da proteína c-MYC em relação ao controle, estimulado apenas com
meio L, sem Wnt3a. Contudo, nos grupos expostos à TcdA juntamente com Wnt3a, os níveis de
c-MYC foram infra-regulados de maneira concentração-dependente (Figuras 12A e 12C).
Em suma, esses dados não apenas dão suporte aos resultados anteriores obtidos no
ensaio com o repórter TOPFlash, como dão suporte à hipótese de que talvez as toxinas A e B do
Clostridium difficile estejam promovendo a inibição da via canônica de Wnt, ao promover a
degradação de -catenina.
48
Figura 12. A toxina A do Clostridium difficile promove a degradação das
proteínas -catenina e diminuição de expressão de c-MYC. Extratos de proteína
total foram preparadas com células IEC-6 tratadas com TcdA (10, 50 ou 100 ng/mL)
na presença de Wnt3a ou meio L. A partir daí, foi realizada a análise pela técnica de
western blot com anticorpos primários anti-c-MYC e anti--catenina. As membranas
foram reavaliadas com anticorpo anti--tubulina como controle de loading. Os
valores foram expressos como média ± SEM (n = 3). *P < 0,05 e **P<0,01 vs grupos
tratados com Wnt3a que não foram incubados com TcdA.
49
5.3 A toxina A do Clostridium difficile bloqueia o acúmulo de -catenina nuclear induzida
por Wnt3a
Um passo crucial da via canônica de Wnt é o acúmulo de -catenina no núcleo, onde
ela pode, então, regular a expressão gênica ao ativar a transcrição do TCF/Lef. As imagens de
imunofluorescência de células IEC-6 revelaram acúmulo de -catenina na maior parte dos
núcleos celulares após tratamento com Wnt3A (Figura 13). Entretanto, quando incubou-se as
células com TcdA (50 ng/mL) a intensidade da -catenina nuclear foi reduzida drasticamente,
como determinado por imunofluorescência indireta. Em um subgrupo de células evidenciou-se
uma redução mais significante de -catenina enquanto ainda continuavam possuindo marcação
citoplasmática de -catenina. A inibição da translocação nuclear por TcdA é consistente com o
ensaio do repórter TOPFlash.
50
Figura 13. A toxina A do Clostridium difficile impede a translocação nuclear de -catenina induzida por Wnt3a.
Microscopia confocal por imunofluorescência de células IEC-6 tratadas com Wnt3a ± TcdA (50 ng/mL). (A) O sinal da -catenina
é vermelho enquanto o núcleo é corado em azul por DAPI. (B) A quantificação da imunomarcação de -catenina nuclear vs.
citoplasmática. O número de núcleos corados com DAPI em campos escolhidos randomicamente representa total de células e foi
utilizado para o cálculo da percentagem de células com marcação nuclear (N), citoplasmática (C) ou sem marcação (U). Os valores
foram expressos como média ± SEM (n = 3). *P < 0,05 e **P<0,01 vs grupos tratados com Wnt3a que não foram incubados com
TcdA.
51
5.4 A toxina A do Clostridium difficile bloqueia o acúmulo de -catenina nuclear induzida
por Wnt3a
A -catenina é vulnerável à degradação dependente de caspases, portanto foi
considerada a hipótese de que a perda de -catenina, após o tratamento com TcdA, seria uma
consequência da ativação de caspases. Para avaliar essa possibilidade, foi utilizado o z-VAD-
fmk, o qual é um pan inibidor de caspases.
Como esperado, o pré-tratamento com z-VAD-fmk preveniu a clivagem da caspase-3
pela TcdA em células IEC-6 (Figura 14), além de prevenir alterações morfológicas sugestivas de
apoptose como a picnose nuclear (Figura 15). A análise de pelo menos 3 experimentos
independentes de células IEC-6 pré-tratadas com z-VAD-fmk demonstrou um efeito protetor
estatisticamente significante sobre a degradação de -catenina induzida por toxina A (Figura 16).
Subsequentemente, foi avaliado se, ao prevenir-se a degradação de -catenina com o
z-VAD-fmk, a inibição da via de Wnt/-catenina pela TcdA seria revertida (Figura 17). Porém,
mesmo na presença de z-VAD-fmk, a toxina A demonstrou o efeito dose-dependente de inibição
da via canônica de Wnt em células IEC-6 no ensaio com o repórter TOPFlash. Isso confirma que
a inibição da via de Wnt/-catenina não ocorre somente em consequência da degradação de -
catenina caspase-dependente.
52
Figura 14. O pan inibidor de caspase z-VAD-fmk previne a clivagem de caspase 3 induzida por TcdA. (A e B) Extratos de proteína total foram preparadas com
células IEC-6 tratadas com TcdA (100 ng/mL). A partir daí, foi realizada a análise
pela técnica de western blot com anticorpo primário anti-caspase-3-clivada. As
membranas foram reavaliadas com anticorpo anti--tubulina como controle de
loading. Os valores foram expressos como média ± SEM (n = 3). *P < 0,05 e
**P<0,01 vs grupos incubados com TcdA.
53
Figura 15. O pan inibidor de caspase z-VAD-fmk previne a picnose nuclear induzida por TcdA. (A e B) Determinou-se a proporção de células apoptóticas ao contar-se
manualmente o número de núcleos picnóticos em campos randomizados. Os valores foram
expressos como média ± SEM (n = 3). *P < 0,05 vs grupos incubados com TcdA.
54
Figura 16. O pan inibidor de caspase z-VAD-fmk previne a clivagem de -
catenina induzida por TcdA. (A e B) Extratos de proteína total foram preparadas
com células IEC-6 tratadas com TcdA (100 ng/mL). A partir daí, foi realizada a
análise pela técnica de western blot com anticorpo primário anti--catenina. As
membranas foram reavaliadas com anticorpo anti--tubulina como controle de
loading. Os valores foram expressos como média ± SEM (n = 3). *P < 0,05 vs grupos
incubados com TcdA.
55
Figura 17. O pan inibidor de caspase z-VAD-fmk não reverte a inibição da via canônica de Wnt induzida por TcdA. Ensaio do repórter TOPFlash em células IEC-
6 estimuladas com Wnt3a que foram incubadas com 10, 50 ou 100 ng/mL de TcdA.
As células IEC-6 foram co-transfectadas com os vetores-repórter pTOPFlash e
pRLTK (Renilla), que serviu como controle interno da eficiência da transfecção e da
toxicidade potencial dos tratamentos. Os valores foram expressos como média ± SEM
(n = 3). *P < 0,05 vs grupos tratados com Wnt3a que não foram incubados com
TcdA.
56
5.5 A toxina A do Clostridium difficile inibe a via de Wnt independentemente da atividade
do complexo de destruição de -catenina
Os níveis intracelulares de -catenina são controlados primeiramente pela
fosforilação dependente de APC-GSK3, um evento chave para marcar a -catenina para
ubiquitinação e degradação proteossomal. Então, para investigar o mecanismo pelo qual a TcdA
inibe a via de sinalização Wnt, foi investigado o papel do complexo de destruição de -catenina.
Inicialmente, utilizou-se o LiCl, o qual mimetiza os membros da família Wnt de
proteínas sinalizadoras ao inibir a atividade de GSK3, causando acúmulo intracelular de -
catenina. As células RKO foram incubadas com LiCl e TcdA tanto com ou sem Wnt3a. Foi
mensurado a resposta regulatória transcricional de -catenina usando-se o ensaio repórter
TOPFlash (Figura 18). A incubação com TcdA ainda conseguiu bloquear a ativação da via de
Wnt pelo LiCl, mesmo na presença de Wnt3a. Isso sugere que a TcdA bloqueia a via de Wnt/-
catenina por um mecanismo independente do complexo de destruição APC-GSK3. Contudo,
LiCl é inespecífico e possui outros alvos intracelulares além de GSK3 que poderiam
potencialmente interferir na interpretação desses dados.
Por isso, foram tentadas formas diferentes de se estimular a via de Wnt ao transfectar
células RKO com plasmídeos codificando a -catenina constitutivamente ativa, tanto o subtipo
selvagem (p-catenina) quanto o subtipo resistente à fosforilação de GSK3 (p-catenina-
S33A). Também foi utilizado o plasmídeo codificando LEF-DeltaN-VP16-pcDNA3, o qual liga-
se ao DNA e ativa diretamente a expressão gênica mediada pelo complexo -catenina/TCF-Lef
sem a necessidade de -catenina. A partir daí, foi avaliada a atividade regulatória transcricional
da -catenina pelo ensaio repórter TOPFlash (Figura 19). A TcdA inibiu a via de sinalização
Wnt, mesmo na presença de p-catenina-S33A, confirmando que essa inibição ocorre
independentemente da ativação do complexo de destruição APC-GSK3. Entretanto, a toxina A
foi incapaz de inibir a resposta transcricional de TCF induzida por Lef-DeltaN-VP16
57
Figura 18. O LiCl, inibidor de GSK3 não previne a inibição da via canônica de
Wnt por TcdA. Ensaio do repórter TOPFlash em células RKO estimuladas com
Wnt3a que foram incubadas com TcdA (50 ng/mL) por 24h e tratadas com LiCl (20
mM) ± Wnt3a. As células RKO foram co-transfectadas com os vetores-repórter
pTOPFlash e pRLTK (Renilla), que serviu como controle interno da eficiência da
transfecção e da toxicidade potencial dos tratamentos. Os valores foram expressos
como média ± SEM (n = 3). *P < 0,05 vs grupos tratados com LiCl que não foram
incubados com TcdA.
58
Figura 19. A TcdA inibe a via canônica de Wnt induzida pela transfecção de vetores de
-catenina constitutivamente ativa. Ensaio do repórter TOPFlash em células RKO
estimuladas com Wnt3a que foram pré-incubadas com TcdA (50 ng/mL) por 24h, que foram
co-transfectadas com os vetores-repórter pTOPFlash e pRLTK (Renilla). Além desses
vetores, foram utilizados os vetores: p-catenina, p-catenina-S33A, PCS2+ e Lef-DeltaN-
VP16. Os valores foram expressos como média ± SEM (n = 3). *P < 0,05.
59
5.6 A pré-incubação de células RKO com a TcdA inibe a via de Wnt por ativação de Wnt3a
Para minimizar os efeitos da TcdA sobre a viabilidade celular, foi realizada a pré-
incubação de células RKO com TcdA e então, foi trocado o meio, e colocando meio
condicionado sem TcdA. Essa pré-incubação preveniu a transcrição mediada por -catenina/TCF
para diferentes concentrações para Wnt3a. Este resultado sugere fortemente que a inibição da via
de Wnt pela TcdA depende da inibição das Rho GTPases (Rho, Rac1 e Cdc42).
60
Figura 20. A pré-incubação com TcdA atenuou a transcrição mediada por -
catenina/TCF em células RKO. Ensaio do repórter TOPFlash em células RKO que foram
pré-incubadas com 50 ng/mL de TcdA por 12h antes da adição de meio condicionado
contendo diferentes concentrações de Wnt3a. A células RKO foram co-transfectadas com
os vetores-repórter pTOPFlash e pRLTK (Renilla), que serviu como controle interno da
eficiência da transfecção e da toxicidade potencial dos tratamentos. Os valores foram
expressos como média ± SEM (n = 3). *P < 0,05 vs grupos tratados com Wnt3a que não
foram incubados com TcdA.
61
6. DISCUSSÃO
No presente estudo, foi demonstrado que a TcdA e a TcdB inibem a via de Wnt/β-
catenina de uma forma dose-dependente em culturas de células epiteliais intestinais. Este
resultado foi demonstrado consistentemente por três técnicas diferentes: ensaio do repórter
TOPFlash/Luciferase, imunofluorescência para β-catenina e western blotting para c-MYC (um
gene-alvo da via de Wnt).
Estudos recentes vêm apontando que as TcdA e TcdB possuem importantes efeitos
anti-proliferativos. Em parte, isso se deve a desorganização da actina e inibição da formação do
anel contrátil na citocinese, desencadeada pela glicosilação das proteínas da família Rho. Nesse
caso, percebe-se alterações morfológicas características com presença de células binucleadas e
consequente parada do ciclo celular ao nível de G2-M. As toxinas A e B também bloqueiam a
transição G1-S, uma vez que a inibição concomitante de Rho, Rac e Cdc42 pelas TcdA e TcdB
bloqueiam a expressão de ciclina D1, prevenindo a progressão do ciclo celular pela fase G1.
Importante salientar que a parada em G1 ocorre mesmo com doses baixas de toxina, enquanto
que apenas com altas concentrações de toxinas (100 ng/mL para TcdA ou 10 ng/mL para TcdB)
tem-se a parada da divisão celular na fase G2-M (LICA et al., 2011).
A atividade da via de Wnt é crucial para manter a renovação rápida do epitélio
intestinal (VAN DER FLIER e CLEVERS, 2009). A inibição desta via pelas toxinas A e B é,
portanto, consistente com estudos prévios que evidenciaram que elas exercem efeitos anti-
proliferativos in vitro, induzindo parada do ciclo celular e downregulation de ciclina D1 (um dos
genes alvo para TCF/Lef) (WELSH et al., 2001; D'AURIA et al., 2012). Infelizmente, o
significado desses efeitos anti-proliferativos induzidos pelas TcdA e TcdB na patogênese da
CDAD ainda não são inteiramente compreendidos. Contudo, a inibição da renovação do epitélio
intestinal pelas toxinas do C. difficile está provavelmente ligado à diarreia (LICA et al., 2011).
Considerando-se que a camada de células que revestem o intestino humano é completamente
renovado a cada 3-4 dias, pode-se especular que o bloqueio dessa renovação celular
comprometeria a barreira epitelial, contribuindo para a aparição de diarreia em pacientes
afligidos por esta infecção (KIM et al., 2010; LICA et al., 2011; D'AURIA et al., 2012). De
forma similar, este mecanismo já está bem estabelecido na quimioterapia do câncer, uma vez que
62
a diarreia representa um efeito colateral frequente de várias drogas antineoplásicas, que também
suprimem a proliferação (GENTH et al., 2008).
A modulação da via de Wnt/β-catenina não é exclusiva das toxinas do C. difficile e
também ocorre com toxinas de outras bactérias, o que contribui sobremaneira para a patogênese
desses micro-organismos. Por exemplo, a interação da Salmonella com as células epiteliais
promove ativação da via de sinalização pro-inflamatória NF-B, a qual está associada à
degradação de β-catenina e supra-regulação de citocinas inflamatórias (IL-6, IL-8 e TNF-) em
camundongos infectados (SUN et al., 2005). KIM et al. (2007) mostraram que a TcdA induz a
liberação de prostagladina E2 que promove a ativação do fator NF-κB e do sistema Fas/FasL,
causando apoptose e inflamação de forma conjunta com os outros fatores anteriormente
mostrados. A ativação da via do NF-B pela TcdA foi também demonstrada em trabalho do
nosso grupo (DE ARAUJO JUNQUEIRA et al., 2011). Portanto, essa interação entre a via do
NF-B e a via de Wnt pode ser também de grande relevância para o C. difficile, visto que a
inflamação também possui um papel central na patogênese da CDAD. Outra toxina bacteriana
que atua inibindo a via canônica de Wnt é o fator de edema do Bacillus anthracis o qual inibe a
via de Wnt/β-catenina pela indução de proteína quinase A. Com isso, os níveis de GSK3β
fosforilado diminuem, permitindo então que esta molécula possa formar o complexo de
destruição de β-catenina para inativá-la e para prevenir que a β-catenina se ligue ao fator de
transcrição TCF/Lef (LARABEE et al., 2008).
As toxinas A e B notadamente induzem apoptose em células epiteliais intestinais de
forma dependente do tempo de incubação e da dose de TcdA ou TcdB utilizadas. Trabalho do
nosso grupo mostrava que o processo de apoptose foi completamente inibido pelo bloqueio da
atividade enzimática da toxina na Rho GTPases, utilizando uridina-5- difosfato-2,3- dialdeído e
parcialmente inibida quando se utilizava o z-VAD-fmk, um pan inibidor de caspases. Portanto,
as toxinas do C. difficile induzem a apoptose pelo mecanismo dependente da inativação de Rho,
ativação das caspases 3, 6, 8 e 9, Bid e por lesão mitocondrial (Brito et al., 2002).
No presente estudo, foi evidenciado, como já se esperava, que as toxinas do C.
difficile diminuem a viabilidade celular tanto por apoptose, mais comum, quanto necrose, sendo
constatada por alterações morfológicas como picnose nuclear na microscopia confocal bem
como pela ativação de caspases nos experimentos de western blotting. Com a finalidade de
63
diminuir a interferência da viabilidade celular nos nossos resultados utilizou-se o ensaio
TOPFlash/Luciferase o qual é extremamente sensível. Isso se deve ao fato de que os grupos além
de serem transfectados com o repórter pTOPFlash, que mede diretamente a ativação da via pela
β-catenina, foram também transfectados com pFOPFlash, que serve de controle negativo, e
pRLTK, que serve de controle de transfecção. Consequentemente, os resultados foram expressos
sempre como uma relação entre pTOPFlash/pRLTK ou TOP/FOP, normalizando os dados e
corrigindo eventuais desvios que possam ocorrer por conta de alterações na viabilidade celular.
Além disso, foram utilizados diferentes regimes de tratamento, variando tanto o tempo de
exposição, assim como a dose de toxina o que altera drasticamente o número de células
apoptóticas. BRITO et al. (2005) demonstraram através de ensaio Anexina V, que a percentagem
de células IEC-6 apoptóticas após 6 a 24h de exposição à TcdA (10-100ng/mL) varia de 6-25%.
No presente trabalho, encontramos que mesmo em concentrações tão baixas de TcdA quanto
10ng/mL, mesmo em 6h, o que corresponderia a menos de 10% de células apoptóticas,
demonstramos uma inibição significante da via de Wnt.
Não obstante, nossos resultados indicaram que a TcdA contribui para a diminuição
dos níveis de β-catenina por um mecanismo envolvendo a ativação de caspases. O z-VAD-fmk,
pan-inibidor de caspases, foi então utilizado e preveniu satisfatoriamente a degradação de β-
catenina induzida por TcdA. O z-VAD-fmk, além de inibir caspases, demonstra-se capaz de
inibir a ação do proteassoma, o que poderia estar contribuindo com o seu efeito protetor sobre a
degradação de β-catenina induzida por toxina A (CANU et al., 2000). Contudo, a diminuição da
concentração intracelular de β-catenina não pareceu ser o principal mecanismo pelo qual a TcdA
inibe a via de Wnt, uma vez que a inibição ocorreu mesmo quando houve supra-regulação de β-
catenina tanto por inativação de caspase pelo z-VAD-fmk quanto pela transfecção de vetores de
β-catenina constitutivamente ativos pelo ensaio TOPFlash. Em suma, esses dados indicaram que
a inibição da via de Wnt/β-catenina pela TcdA é apenas parcialmente por conta da degradação de
β-catenina induzida por caspases durante a apoptose. As caspases podem clivar a β-catenina e
desarranjar o contato intercelular durante a apoptose, enquanto deve haver outros mecanismos
induzidos pela TcdA que previnam a translocação de β-catenina para o núcleo e portanto iniba a
transcrição dos genes regulatórios TCF/Lef.
Além disso, o complexo de destruição de β-catenina não parece ter um papel
significante na inibição da via de Wnt induzida por TcdA. O LiCl, um inibidor de GSK3β, e a
64
transfecção do plasmídeo de β-catenina S33A que é resistente a GSK3β foram ambos incapazes
de prevenir os efeitos inibitórios da toxina A em células RKO. Em contraste, a expressão da
proteína de fusão Lef-DeltaN-VP16 estimulou fortemente a transcrição no promotor TCF/Lef e,
mais importante, essa ativação da via de Wnt não foi bloqueada pela TcdA. Essa proteína de
fusão não possui o sítio de ligação de β-catenina e ativa constitutivamente a transcrição dos
elementos ligadores de TCF/Lef (AOKI et al., 1999). Este achado sugeriu que a inibição das
RhoGTPases pelas TcdA e TcdB, analogamente, podem estar tendo um papel primordial nessa
inibição, além dos efeitos sobre a viabilidade celular, o que confirma que o efeito das TcdA e
TcdB são upstream à transcrição no sítio de ligação TCF/Lef.
Figura 21. Possíveis mecanismos que estariam contribuindo para a inibição da via canônica de Wnt pela TcdA.
Estes resultados, portanto, sugerem que outros possíveis mecanismos estariam
contribuindo para a inibição da via de Wnt/β-catenina pela TcdA (Figura 21). Foi realizada,
então, a pré-incubação de células RKO com TcdA (50ng/mL) ou sem TcdA como controle por
65
12h, sendo então realizada a troca do meio de cultura, agora sem TcdA, com a adição de Wnt3a
por 24h para posterior realização do ensaio TOPFlash. Percebeu-se que os grupos expostos
previamente à TcdA, continuou havendo inibição da via de Wnt mesmo após a retirada da
toxina. Especula-se, então, que essa inibição residual da via de Wnt deveu-se a concomitante
inativação de Rac1, Rho e Cdc42.
Recente estudo evidenciou que a inibição da expressão de Rac1, seja por siRNA ou
dominante-negativo de Rac1, em células ST2 impede a translocação nuclear de β-catenina
induzida por Wnt3a, de forma que a ativação dos genes-alvo do TCF/Lef não podem ocorrer
(WU et al., 2008). Portanto, uma vez que Rac1 é crítico para a translocação de β-catenina para o
núcleo, a sua glicosilação permanente e inativação seja pela toxina A ou B poderiam ser a
melhor hipótese para explicar nossos resultados até então. Corroborando dados da literatura, os
resultados referentes à imunofluorescência, demonstram que a TcdA realmente previne a
translocação nuclear de -catenina em células IEC-6, encontrando-se uma marcação menos
intensa de -catenina no núcleo de células tratadas em comparação com células não-tratadas, nas
quais foi evidenciada uma marcação nuclear de -catenina mais intensa.
Nosso estudo demonstrou pela primeira vez que as TcdA e TcdB inibem a via de
sinalização Wnt/β-catenina em cultura de células epiteliais intestinais, afetando os níveis
proteicos de β-catenina e prevenindo a expressão de c-MYC induzida por Wnt3a
independentemente do bloqueio do complexo de destruição por inibidores de GSK3β. Embora o
z-VAD-fmk tenha prevenido a degradação de β-catenina por TcdA, ele falhou em reverter a
inibição da via de Wnt pela TcdA no ensaio do TOPFlash/Luciferase. O papel das TcdA e TcdB
como inibidores de via de sinalização Wnt/β-catenina provê informações relevantes que devem
ser exploradas para o desenvolvimento de novos alvos terapêuticos.
66
7. CONCLUSÕES
As toxinas A e B do Clostridium difficile inibem de forma dose dependente a via de
sinalização Wnt/β-catenina em culturas de células epiteliais intestinais humanas (RKO) e
murinas (IEC-6);
A TcdA promove o downregulation de β-catenina através da ativação de caspases e o z-
VAD-fmk, pan-inibidor de caspase, consegue reverter esse efeito evidenciado nos
experimentos de western blot, porém a via de Wnt continua a ser inibida mesmo na
presença de z-VAD-fmk. Além disso, a inibição do complexo de destruição de β-catenina
também possui apenas um efeito modesto e não consegue reverter a inibição da via de
Wnt;
Sugerimos que a inibição das RhoGTPases (Rho, Rac1 e Cdc42) possuem efeito
imprescindível sobre a ativação via de Wnt, sendo necessária a ativação de Rac1 para que
ocorra a translocação de β-catenina do citoplasma para o núcleo;
A monoglicosilação das RhoGTPases, sobretudo Rac1, pelas toxinas do C. difficile,
parecem constituir um importante mecanismo de inibição da via de Wnt/β-catenina da
TcdA e TcdB.
67
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9. ANEXOS
Em anexo, cópia do artigo original publicado na revista Infection & Immunity,
intitulado:
Clostridium difficile toxin A attenuates Wnt/β-catenin signaling in intestinal epithelial cells. Lima BB, Fonseca BF, Amado ND, Lima DM, Ribeiro RA, Abreu JG, Brito GA. Infect Immun.
2014 Apr 7. [Epub ahead of print]