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EFEITO DAS CONDIÇÕES OPERACIONAIS DE SÍNTESE NA MORFOLOGIA DE NANOPARTÍCULAS DE POLI(ÁCIDO

LÁTICO)

Kátia C. S. Figueiredo1*, Cristiano P. Borges2, Tito L. M. Alves2

1 Universidade Federal de Viçosa – UFV, Departamento de Química - Viçosa-MG – [email protected]

2 Universidade Federal do Rio de Janeiro – Programa de Engenharia Química / COPPE – Rio de Janeiro - RJ

A síntese de nanopartículas poliméricas biodegradáveis foi avaliada visando o desenvolvimento de dispositivos para

liberação intraocular de drogas. Esferas nanométricas são fagocitadas pelas células da retina, maximizando a eficiência

do tratamento. O objetivo desta etapa do trabalho consistiu na avaliação da influência do tempo de sonificação, da razão

de fases óleo/água, o/a, da razão de solventes orgânicos e do tipo de surfactante na morfologia e no diâmetro médio das

partículas poliméricas. O método de síntese empregado foi a evaporação de solvente. O poli(álcool vinílico) apresentou

desempenho superior aos demais surfactantes investigados. Observou-se um valor ótimo de 10 minutos de sonificação

para a obtenção de partículas menores, enquanto a razão de fases o/a selecionada foi de 1:4. O parâmetro mais

significativo para a obtenção de partículas nanométricas foi a razão entre a acetona e o diclorometano. Um excesso de

acetona provocou a redução do diâmetro médio das partículas para 109 nm, provavelmente devido ao fato de o solvente

reduzir a pressão de vapor da mistura.

Palavras-chave: biopolímeros, nanopartículas, morfologia, liberação controlada de drogas.

The effect of operational conditions on the morphology of polylactide acid (PLA) nanoparticles

The synthesis of biodegradable polymeric nanoparticles was evaluated in this work aiming the development of devices

for intraocular drug release. Nanosized devices maximize the medical treatment of ocular diseases once the spheres may

be fagocited by retinal pigment epithelial cells. The effect of sonification time, oil/water (o/w) ratio, organic solvents

ratio and surfactant type in the form and average diameter of the particles were studied. The method used in the

synthesis of polymeric devices was solvent evaporation. Regarding the surfactants, polyvinyl alcohol, PVA, showed

better performance among the surfactants. The optimum value for the sonification time was set at 10 minutes, while the

o/w ratio selected was 1:4. The most important variable to reduce particles size was the ratio between acetone and

dichloromethane. An excess of acetone caused the reduction of the average diameter of the nanoparticles to 109 nm. It

was reasoned in terms of the reduction of the vapor pressure of the solvent mixture.

Keywords: biopolymers, nanoparticles, morphology, controlled drug release. Introdução

Os sistemas de liberação controlada de drogas visam o aumento da resistência espaço-

temporal destas substâncias, reduzindo os efeitos colaterais do aumento repentino da

concentração de fármacos; o direcionamento de uma droga através de uma rota sistêmica

ou a melhoria da permeação do medicamento através de uma membrana, um tecido ou um

órgão como a pele (Yasukawa et al., 2004). A utilização de sistemas de liberação de drogas

intraoculares é de grande interesse, considerando a dificuldade de penetração dos fármacos

no olho. O acesso de medicamentos por via tópica é bastante limitado devido à constante

produção de lágrimas. Além disso, o humor aquoso, que preenche as câmaras anterior e

posterior do segmento anterior dos olhos, é produzido no músculo ciliar e se difunde em

sentido contrário ao caminho a ser percorrido pelos fármacos. Já o tratamento por via

Anais do 10o Congresso Brasileiro de Polímeros – Foz do Iguaçu, PR – Outubro/2009

sistêmica também fica comprometido devido às diversas barreiras e reações a que o

medicamento deve ultrapassar e resistir até alcançar o tecido a ser tratado (Bourges et al.,

2006).

A determinação da funcionalidade dos implantes intraoculares depende do tamanho e da

biodegradabilidade dos dispositivos. Sistemas biodegradáveis, como o poli(ácido lático),

PLA, ou poli(ácido lático-co-ácido glicólico), PLGA, com diâmetro inferior a 150 µm

podem ser injetáveis, o que evita a necessidade de esclerotomia para aplicação, substituição

ou retirada dos implantes, garantindo maior conforto ao paciente (Yasukawa et al., 2004).

A utilização de nanopartículas pode aumentar a eficiência de liberação dos fármacos na

câmara posterior do olho, favorecendo a absorção da droga através da fagocitose das

partículas poliméricas contendo a droga (Qaddoumi et al., 2004). Este procedimento

maximiza a eficiência do tratamento, pois garante um maior direcionamento e

especificidade de ação medicamentosa.

Os procedimentos de síntese de micro ou nanoesferas poliméricas envolvem, em geral, uma

etapa de emulsificação (Song et al., 2008). No caso da dispersão da droga em polímeros

hidrofóbicos, a técnica comumente utilizada baseia-se na evaporação do solvente. De um

modo simplificado, o fármaco e o polímero são dissolvidos em um solvente adequado e

dispersos em uma fase contínua aquosa, na maioria das vezes, para permitir a

emulsificação. O sistema sofre, em seguida, uma mudança em uma de suas propriedades,

como temperatura ou pressão, de modo que o solvente orgânico seja evaporado e as

cápsulas sejam formadas. As partículas são lavadas para garantir que nenhum solvente

residual permaneça no sistema (Kim e Martin, 2006).

Os trabalhos disponíveis na literatura para a síntese de partículas de PLA e PLGA através

da técnica de evaporação do solvente apresentam uma grande variedade de parâmetros tais

como o método e o tempo de emulsificação, a razão de solventes, a concentração e tipo do

surfactante empregado, bem como a razão entre as fases (Cascone et al., 2002 a e b,

Gomes-Gaete et al., 2007). Estas variáveis afetam tanto a morfologia quanto o tamanho das

partículas e foram estudadas nesta etapa do trabalho.


O objetivo do trabalho consistiu na investigação do efeito do tempo de agitação para a

formação da emulsão, da razão entre os solventes utilizados, da razão entre as fases oleosa

e aquosa e do tipo de surfactante usado na forma e no tamanho das esferas poliméricas.

Experimental

Materiais

Poli(ácido lático-co-ácido glicólico), PLGA, com razão L:G e massas molares variadas e

poli(ácido lático), PLA, poli(álcool vinílico), PVA, com diferentes massas molares e graus

de hidrólise, poli(vinil pirrolidona), PVP (com massa molar de 10.000 e 360.000 Da),

foram adquiridos da Sigma-Aldrich. Acetona e diclorometano foram fornecidos pela Vetec.

A dextrana, com massa molar de 10.900 Da, foi obtida da Pharmacia.

Caracterização dos polímeros biodegradáveis

Testes de calorimetria diferencial de varredura, DSC (PerkinElmer DSC 7), foram

realizados para determinar a temperatura de transição vítrea do PLGA e do PLA com o

objetivo de inferir a respeito das mudanças conformacionais do polímero em função do teor

de lactídeo. Nestes ensaios, cerca de 15 mg do polímero foram aquecidos de 30 a 80oC, a

10oC/min e resfriados a 10

oC na taxa de 200

oC/min, seguidos de uma nova etapa de

aquecimento de 10 a 80oC, a 10

oC/min. A determinação da temperatura de transição vítrea

foi realizada utilizando o programa PyrisMath (PerkinElmer).

Síntese das partículas

A síntese das partículas foi investigada através do método de evaporação de solventes. A

solução aquosa do surfactante foi preparada dissolvendo-se 1 g do mesmo em água na

concentração de 5% em massa. A fase orgânica foi preparada através da dissolução de 100

mg do PLA em 5 mL da mistura de solventes, composta por acetona e diclorometano.

A fase orgânica foi gotejada sobre a fase aquosa e, em seguida, o sistema foi emulsionado,

através de um sonificador, durante 10 minutos, em banho de gelo. A potência usada foi de

50 W. A emulsão foi transferida para uma placa com agitação magnética dentro de uma


capela, onde a mistura de solventes orgânicos foi evaporada durante 15 horas, na

temperatura ambiente.

O sistema foi centrifugado a 3.500 rpm, por 30 minutos, a 25oC. O sobrenadante foi

descartado e as partículas poliméricas foram lavadas com 20 mL de água destilada, e

centrifugadas nas mesmas condições descritas acima. Este procedimento foi repetido até

um total de 3 lavagens. As partículas foram armazenadas em dessecador até a realização

dos testes de caracterização.

Caracterização das partículas quanto à morfologia e ao tamanho

A caracterização da morfologia e do tamanho médio das partículas foi realizada através de

microscopia eletrônica de varredura, MEV (FEI Quanta 200). As amostras foram secas em

dessecador, recobertas com uma fina camada de ouro e transferidas para o equipamento.

Uma estimativa do diâmetro médio das partículas foi realizada através dos recursos

computacionais do próprio equipamento.

Resultados e Discussão

A caracterização das propriedades térmicas dos polímeros biodegradáveis investigados

neste estudo foi realizada com o objetivo de determinar as alterações conformacionais

provenientes do aumento do teor de ácido lático no copolímero, já que existem diversos

tipos de PLGA no mercado, com razão molar L:G variando 0,5 a 1. A massa molar das

amostras neste teste variaram de 40 a 77 kDa.

Os valores de temperatura de transição vítrea, Tg, estimados a partir das curvas de DSC

obtidas são apresentados na Tabela 1. Os testes foram realizados em duplicata e os desvios

foram de +1oC para todas as amostras.

A comparação entre os valores de Tg mostra que somente a amostra correspondente a 50%

em mol de ácido lático possui valor diferente das demais, o que talvez explique a maior

taxa de erosão desta amostra em testes de liberação, conforme observado por Kunou et al.

(1995).


Com o intuito de avaliar o efeito da massa molar do polímero na Tg, novos ensaios foram

realizados e observou-se que, com a diminuição da massa molar média do PLGA 50:50 de

57 para 15 kDa, houve uma redução na Tg do polímero de 43 para 27oC, indicando que este

parâmetro está fortemente relacionado com o empacotamento. Desta forma, a síntese de

nanopartículas foi investigada para polímeros com massa molar na faixa de 40 a 77 kDa,

para permitir a extrapolação dos resultados.

Tabela 1: Variação da Tg com o aumento da razão L:G.

Polímero Tg (oC) ∆Cp (J/g.

oC)

PLGA 50:50 43 0,63

PLGA 65:35 46 0,49

PLGA 75:25 48 0,54

PLGA 85:15 47 0,71

PLA 47 0,74

A escolha do método de evaporação de solvente para a síntese de partículas poliméricas foi

baseada no maior número de trabalhos similares que utilizam esta rota de síntese. Esta

técnica consiste na formação de uma emulsão o/a através da utilização de um sonificador

ou de um equipamento similar com elevada rotação. Uma vez formada a emulsão, a

evaporação do solvente da fase orgânica dispersa é facilitada, dando origem às partículas.

Inicialmente, utilizou-se o turrax (IKA) para promover a emulsificação, com rotação na

faixa de 19.000 a 24.000 rpm. Entretanto, em todos os testes realizados, observou-se a

mudança de coloração da solução do polímero, provavelmente devido ao aquecimento do

sistema. Em outras palavras, o banho de gelo não foi suficiente para manter a baixa

temperatura da emulsão e a energia mecânica foi convertida em energia térmica. A

mudança de cor da solução indicou alterações significativas na estrutura química do PLGA,

o que foi confirmado por testes de infravermelho.

Os resultados evidenciaram a mudança na composição química da amostra ocasionada pelo

método de formação da emulsão, sobretudo no que diz respeito ao aumento do teor de

ligações duplas entre carbonos (absorção de 800 a 100 cm-1

), de álcoois secundários (picos

a 3330 e 1100 cm-1

) e de ácidos carboxílicos e ésteres (bandas de 1100 a 1300 cm-1

), como

decorrência do aumento de temperatura do sistema.

Como alternativa, a formação da emulsão foi realizada através do sonificador nos demais

ensaios para evitar a alteração química do polímero. Desta forma, a avaliação do efeito das


variáveis operacionais na morfologia e no tamanho das partículas foi conduzida. As

variáveis investigadas foram:

• tipo e concentração de surfactante;

• tempo de formação da emulsão;

• razão entre as fases oleosa e aquosa;

• razão entre solventes, acetona e diclorometano.

O tempo de sonificação para a formação da emulsão óleo/água foi variado de 5 a 25

minutos visando determinar um valor ótimo para obtenção de partículas menores. As

imagens obtidas por microscopia eletrônica são apresentadas na Figura 1. Vale ressaltar que

as condições fixadas para estes testes foram:

• fase aquosa: solução aquosa 5% em massa de PVA;

• fase orgânica: 2 g/mL de PLA (44-60 kDa) em mistura de acetona/diclorometano;

• razão de fases óleo/água = 1:4;

• razão mássica acetona/diclorometano = 1:1.

10 min.

a

25 min.

b

Figura 1: Imagens de microscopia para as partículas de PLA produzidas em diferentes tempos de sonificação.


De acordo com os resultados obtidos, as estimativas para o tamanho médio das partículas

foram de 3,55; 2,19; 2,47 e 3,78 µm, para as amostras correspondentes a 5, 10, 15 e 25

minutos de agitação, respectivamente. Portanto, há evidências de que a variação do tempo

de sonificação com o tamanho de partícula passa por um mínimo em torno de 10 minutos.

Este resultado pode ser explicado considerando que não há energia suficiente para a

formação das partículas pequenas com 5 minutos de sonificação e, por outro lado, ocorre

aglomeração das partículas preparadas em tempos superiores a 10 minutos.

Os resultados da variação da razão de fases óleo/água na morfologia e tamanho das

partículas são apresentados nas imagens de microscopia da Figura 2. As condições

utilizadas nos ensaios foram: fase aquosa constituída por solução 5% em massa de PVA,

fase orgânica composta por 2 g/mL de PLA (44-60 kDa) dissolvidos em

acetona/diclorometano 1:1 e 10 minutos de sonificação.

1:4

a

4:10

b

Figura 2: Efeito da razão de fases óleo/água na morfologia das partículas de PLA.

Considerando a amostra com razão o/a igual a 1:10, a quantidade de partículas foi muito

reduzida, sendo que o material apresentou-se bastante escasso na imagem, o que


comprometeu uma avaliação da distribuição de tamanhos. Para as demais condições

investigadas, ou seja, razão o/a de 1:4, 3:10 e 4:10, observou-se que o tamanho médio das

partículas foi de 2,2; 5,2 e 4,9 µm, respectivamente. Portanto, a melhor condição

experimental parece mesmo ser de 1:4, já que o acréscimo de fase oleosa provocou o

aumento do tamanho médio das partículas.

O estudo do efeito da razão entre os solventes orgânicos na morfologia das partículas de

PLA é apresentado na Figura 3. Nestes ensaios, foram mantidos fixos o tempo de

sonificação de 10 minutos, o PVA na concentração de 5% em massa em fase aquosa, a

razão de fases o/a de 1:4 e a concentração do PLA (44-60 kDa) de 2 g/mL na fase orgânica.

2:3

a

3:2

b

Figura 3: Efeito da razão de solventes acetona/diclorometano na morfologia das partículas de PLA.

A avaliação dos resultados obtidos sugere que o excesso de diclorometano favorece a

formação de partículas mais esféricas, enquanto o excesso de acetona leva à formação de

partículas com diâmetro médio menor, provavelmente devido à diminuição da pressão de

vapor da mistura de solventes. Na Tabela 2, são apresentadas as estimativas para o diâmetro

médio das partículas em função da razão de solventes empregada nos testes. Para a razão de


3:2, observou-se o menor diâmetro médio, igual a 109 nm. Este resultado demonstrou o

potencial da técnica de evaporação de solvente para a síntese de nanopartículas de PLGA.

Com o objetivo de avaliar o efeito do surfactante na formação das partículas de PLA, foram

investigadas três substâncias como surfactante: o poli(álcool vinílico), a poli(vinil

pirrolidona) e a dextrana. Entretanto, os melhores resultados foram obtidos para os sistemas

contendo PVA. Não foi possível formar uma emulsão estável com a solução orgânica de

PLA em acetona/diclorometano 1:1 utilizando a dextrana como agente tensoativo.

Tabela 2: Diâmetro médio das partículas em função da razão acetona/diclorometano.

Razão

acetona/diclorometano

Tamanho médio de partículas

(µm)

2:3 2,3

1:1 2,2

3:2 0,1

2:1 1,2

Apresenta-se, na Figura 4, uma imagem de microscopia eletrônica das partículas de PLA

obtidas através da utilização de uma solução aquosa de PVP K90, 5% em massa. Como o

tamanho médio das partículas foi maior que as partículas obtidas usando PVA, o emprego

de PVP como surfactante foi descartado em testes futuros.

Figura 4: Imagem de microscopia de partículas de PLA produzidas utilizando PVP como surfactante.

Desta forma, o PVA foi escolhido como surfactante e os efeitos da massa molar, do grau de

hidrólise e da concentração deste na fase aquosa sobre a morfologia e o tamanho das

partículas de PLA foram investigados. Os resultados indicaram que a utilização do PVA

com 110 kDa e 80% de hidrólise permitiu a formação das menores partículas de PLA, o

que motivou a seleção deste polímero como surfactante em testes futuros.


Conclusões

Os resultados obtidos nesta etapa do trabalho permitiram estabelecer um procedimento de

síntese de partículas nanométricas de PLA através da técnica de evaporação do solvente.

Comparando-se os resultados obtidos, foi possível verificar que a razão mássica entre a

acetona e o diclorometano foi o parâmetro mais significativo na redução do diâmetro médio

das partículas. O excesso de acetona na mistura permitiu a síntese de partículas

nanométricas, muito provavelmente devido à redução da pressão de vapor da mistura.

Também foram determinados o tempo de 10 minutos de sonificação e o uso do PVA como

surfactante como condições ótimas de síntese. Estes resultados revelam o potencial deste

sistema para a síntese de nanopartículas para a liberação controlada de drogas.

Agradecimentos

Os autores agradecem à Capes o apoio financeiro dado para o desenvolvimento desta

pesquisa. Kátia Figueiredo agradece ao Programa de Engenharia Química da COPPE pela

oportunidade de desenvolvimento desta pesquisa durante o programa Prodoc da Capes e à

Fapemig.

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