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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO E CULTURA
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA
ADELAIR HELENA DOS SANTOS
EFEITO DA UMIDADE RELATIVA NA ATIVIDADE OVICIDA
DE Metarhizium anisopliae EM Aedes aegypti
Orientador: Prof. Dr. W. Christian Luz
Tese de Doutorado
GOIÂNIA – GO, 2008
Termo de Ciência e de Autorização para Disponibilizar as Teses e Dissertações Eletrônicas (TEDE) na Biblioteca Digital da UFG
Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade Federal de Goiás–
UFG a disponibilizar gratuitamente através da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações – BDTD/UFG, sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o documento conforme permissões assinaladas abaixo, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.
1. Identificação do material bibliográfico: [ ] Dissertação [ X] Tese
2. Identificação da Tese ou Dissertação
Autor(a): Adelair Helena dos Santos CPF: E-mail: [email protected] Seu e-mail pode ser disponibilizado na página? [ x ]Sim [ ] Não
Vínculo Empregatício do autor Professor Agência de fomento: Sigla: País: Brasil UF: Go CNPJ: Título: Efeito da umidade relativa na atividade ovicida de Metarhizium anisopliae em Aedes
aegypti Palavras-chave: Aedes aegypti; ovo; controle biológico; Metarhizium anisopliae; umidade Título em outra língua: Effect of humidity on ovicidal activity of Metarhizium anisopliae in
Aedes aegypti Palavras-chave em outra língua: Egg, biological control, humidity Área de concentração: Parasitologia Data defesa: (dd/mm/aaaa) 03/06/2008 Programa de Pós-Graduação: Medicina Tropical – IPTSP/UFG Orientador(a): Wolf Christian Luz CPF: E-mail: [email protected] Co-orientador(a): CPF: E-mail: 3. Informações de acesso ao documento: Liberação para disponibilização?1 [ ] total [ x ] parcial Em caso de disponibilização parcial, assinale as permissões: [ ] Capítulos. Especifique: __________________________________________________ [X] Outras restrições: Manuscrito: Dependence of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae (Hypocreales: Clavicipitaceae), on high humidity for ovicidal activity of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae ________________________________________________
Havendo concordância com a disponibilização eletrônica, torna-se imprescindível o envio do(s) arquivo(s) em formato digital PDF ou DOC da tese ou dissertação. O Sistema da Biblioteca Digital de Teses e Dissertações garante aos autores, que os arquivos contendo eletronicamente as teses e ou dissertações, antes de sua disponibilização, receberão procedimentos de segurança, criptografia (para não permitir cópia e extração de conteúdo, permitindo apenas impressão fraca) usando o padrão do Acrobat.
Data: 10 / 06 / 2008 Assinatura do(a) autor(a)___________________________
1 Em caso de restrição, esta poderá ser mantida por até um ano a partir da data de defesa. A extensão deste prazo suscita justificativa junto à coordenação do curso. Todo resumo e metadados ficarão sempre disponibilizados.
ii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA
PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
ADELAIR HELENA DOS SANTOS
EFEITO DA UMIDADE RELATIVA NA ATIVIDADE OVICIDA
DE Metarhizium anisopliae EM Aedes aegypti
Orientador: Prof. Dr. W. Christian Luz
Tese apresentada ao programa de Pós
Graduação em Medicina Tropical do Instituto
de Patologia Tropical e Saúde Pública da
Universidade Federal de Goiás como
requisito parcial para obtenção do grau de
Doutor em Medicina Tropical – área de
concentração: Parasitologia.
GOIÂNIA – GO, 2008
iii
Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP)
(GPT/BC/UFG)
Santos, Adelair Helena dos. S237e Efeito da umidade relativa na atividade ovicida de
Metarhizium anisopliae em Aedes aegypti [manuscrito] / Adelair Helena dos Santos. – 2008. xii,76 f. : il., figs., Orientador: Prof. Dr. W. Christian Luz. Tese (Doutorado) – Universidade Federal de Goiás, Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, 2008. Bibliografia: f.54-74. Inclui lista de abreviaturas e de figuras. Anexos.
1. Aedes aegypti – Ovos - Controle biológico 2. Metarhizium anisopliae 3. umidade
I. Luz, W. Christian II. Universidade Federal de Goiás, Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública III. Título.
CDU: 595.771:582.288.4
iv
“Toda boa dádiva e todo dom perfeito é lá do alto,
descendo do Pai das luzes, em quem não pode
existir variações ou sombra de mudança”.
Tiago 1:17
v
“As pessoas mais felizes não têm as melhores coisas.
Elas sabem fazer o melhor das oportunidades que aparecem
em seus caminhos".
Clarice Lispector.
vi
Ao meu esposo Júnior, pelo apoio e carinho.
Aos meus filhos Thályta e Thaylor, dádivas de Deus,
que tornam minha caminhada mais suave!
vii
Aos meus pais Limirio e Helena (in memoriam)
Exemplos de sabedoria, fé e confiança.
“Os sábios educam pelo exemplo.
Nada há que avassale o espírito humano
mais suave e profundamente que o exemplo.”
Malba Tahan
viii
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela dádiva do dom da vida, pelas oportunidades de crescimento pessoal através da convivência frutífera de amizade e conhecimento com os meus semelhantes.
A minha família, pela presença, carinho e incentivo constantes. Ao meu irmão Ademir (in memoriam) companheiro de alegrias e
conquistas. Aos “meus irmãos mais velhos” Alvarindo e Ildo, pelo apoio e
compromisso em momentos decisivos. Ao Programa de Pós Graduação do Instituto de Patologia Tropical
e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás, pela oportunidade. Ao orientador, Prof. Dr. Christian Luz, pela orientação, incentivo,
dedicação e amizade. A Marina Hsiang Hua Tai pela inestimável ajuda, delicadeza,
profissionalismo e compromisso, favorecendo o desenvolvimento deste trabalho.
Aos colegas de Pós Graduação, Luiz Fernando Nunes Rocha e
Douglas Araújo Santos Albernaz, membros da equipe do Laboratório de Patologia de Invertebrados – IPTSP/UFG, pela amizade e auxílio.
À equipe do Laboratório de Biologia e Fisiologia de Insetos -
IPTSP/UFG - Profª Drª Heloísa Helena Garcia da Silva, técnicas Carmeci Natalina Elias e Taísia Izabel Vieira pelo fornecimento dos ovos utilizados nos experimentos.
Ao Dr. Richard A. Humber – ARSEF, USDA- Ithaca, NY pela
análise de manuscritos. Aos professores e funcionários do IPTSP/UFG que incentivaram e
apoiaram a realização desse trabalho.
ix
LISTA DE ABREVIATURAS
BDA –Batata Dextrose Agar
FAS – Febre Amarela Silvestre
FAU – Febre Amarela Urbana
FUNASA - Fundação Nacional de Saúde
MS - Ministério da Saúde
OMS – Organização Mundial da Saúde
OPAS –Organização Pan Americana da Saúde
PEAe – Programa de Erradicação do Aedes aegypti
PIACD – Programa Intensificação das Ações Controle da Dengue
PNCD - Programa Nacional de Controle da Dengue
SDAY - Sabouraud Dextrose Agar Yeast
SDY – Sabouraud Dextrose Yeast
UBV – Ultra Baixo Volume
UR – Umidade Relativa
x
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Esquema do ciclo das relações patógeno–hospedeiro entre fungos e
insetos ................................................................................................... 15
LISTA DE FIGURAS DO ARTIGO
Figura 1. Eclosão cumulativa de larvas de Aedes aegypti de ovos tratados com
Metarhizium anisopliae IP 46 e expostos a diferentes tempos e regimes de
umidade ................................................................................................ 21
LISTA DE FIGURAS DO MANUSCRITO
Legenda das figuras referentes a eclosão acumulada (%) de larvas de Aedes
aegypti, após 10 dias de submersão de ovos em água e incubação a 25º C ..... 47
Figura 1. Ovos tratados com 5 x 106 conídios ou corpos hifais de Metarhizium
anisopliae IP 46 / cm2 e incubados por 1, 2, 3, 5, 10, 15 e 25 d em UR > 98%. 48
Figura 2. Ovos tratados com 5 a 1.65 x 105 conídios ou corpos hifais de
Metarhizium anisopliae IP 46 /cm2 e incubados por 10, 15 e 25 dias em UR>
98% ...................................................................................................... 49
Figura 3. Ovos tratados com 5 x 106 conídios ou corpos hifais de Metarhizium
anisopliae IP 46 / cm2 e expostos por 0, 1, 2, 3, 5, 10, 15 e 25 dias em UR >
98% antes de serem transferidos para UR 75% até completar 25 dias ............ 50
Figura 4. Ovos tratados com 5 x 106 conídios de Metarhizium anisopliae IP 46 e
incubados por 15, 20, 25 e 30 dias em regime de alternância diária de umidade
com 0/24; 4/20; 8/16; 12/12; 16/8; 20/4 e 24/0 h em UR > 98/75% ........ 51
xi
LISTA DE TABELAS DO MANUSCRITO
Tabela 1. Concentrações médias com intervalo de confiança e erro padrão para
inibir 50% e 90% da eclosão de larvas de ovos de Aedes aegypti tratados com
conídios ou corpos hifais/cm2 Metarhizium anisopliae IP 46 ........................... 52
xii
RESUMO
A atividade ovicida do isolado IP 46 de Metarhizium anisopliae foi
estudada em Aedes aegypti. Os testes foram realizados em laboratório,
em diferentes regimes de umidade e tempos de exposição, a 25°C. Ovos,
tratados topicamente com conídios ou corpos hifais em suspensão aquosa,
foram incubados por até 25 dias em regime monofásico em umidade
relativa (UR) >98%, ou por até seis meses em UR de 43, 75, 86 ou
>98%. Em regimes de umidades bifásicos, ovos tratados foram expostos
a períodos crescentes (0, 1, 2, 3, 5, 10, 15 e 25 dias) em UR >98% antes
de serem transferidos para UR 75%, pelo período total de 25 dias. Foi
avaliada também a influência de alternâncias diárias (0/24; 4/20; 8/16;
12/12; 16/8; 20/4 e 24/0 horas) de exposição a UR > 98%/75% por até
30 dias. Após o período de incubação em umidade relativa, os ovos foram
examinados e submersos em água. A eclosão de larvas foi avaliada por 10
dias. Micélio e novos conídios foram observados em ovos tratados e
expostos a UR> 98% durante 10 a 15 dias ou 20 horas a UR > 98%
alternando com 4 h a UR 75%. Alternância diária entre UR >98% e 75%,
por até 30 dias, não teve efeito claro sobre a atividade ovicida. Não foi
observada diferença significativa de atividade entre conídios e corpos
hifais. Os valores de concentração de inibição de 50% de eclosão após 25
dias de incubação de ovos tratados com fungos em UR >98% foram 2.8
x102 conidios/cm2 e 9.8 x 102 corpos hifais/cm2. Após seis meses de
exposição a UR de 43, 75, 86 ou >98%, de ovos tratados e não tratados a
sobrevivência de larvas dentro dos ovos foi claramente afetada pela baixa
umidade ( UR 43%). A umidade foi um fator limitante para atividade
ovicida. M. anisopliae IP 46 foi efetivo somente em umidade perto da
saturação e tem potencial para ser usado no controle integrado de A.
aegypti. No campo, umidades favoráveis para o desenvolvimento fúngico
em criadouros são esperadas durante a estação chuvosa, mas também
durante a estação seca, quando muitas fêmeas ovipõem em criadouros
subterrâneos, com umidade elevada.
xiii
ABSTRACT
The ovicidal activity of Metarhizium anisopliae IP 46 was tested
in Aedes aegypti. Assays were done under laboratory conditions, at
differents humidity regimes and periods of exposition at 25º C. Ovos,
tratados topicamente com conídios ou corpos hifais em suspensão aquosa,
foram incubados por até 25 dias em regime monofásico em umidade
relativa (UR) >98%, ou por até seis meses em UR de 43, 75, 86 ou
>98%. Eggs, treated topically with conidia or hyphal bodies, suspended in
water, were incubated in a monophasic regime at relative humidity (RH) >
98%, for 25 d, or for up to a six months at RH 43, 75, 86 or > 98%.
Testing biphasic regimes, the eggs were exposed to increasing periods (0,
1, 2, 3, 5, 10, 15 and 25 d) to RH > 98% before transfer to RH 75%, for a
total of 25 d. Moreover, daily alternating exposures at RH > 98%/75%
(0/24; 4/20; 8/16; 12/12; 16/8; 20/4 and 24/0 h) up to 30 d, were
tested. Eggs were examined and then submerged in water. Eclosion of
larvae was evaluated daily for 10 d. Mycelium and new conidia were found
on treated eggs and held at RH > 98% for 10-15 d or 20 h at RH > 98%
alternating with 4 h at RH 75%. No consistant difference in activity was
found between conidia and hyphal bodies. Daily alternating humidities (RH
> 98% and 75%) up to 30 d had no clear effect on ovicidal activity.
Values of 50% eclosion-inhibiting concentration after 25 d incubation RH
> 98% of fungus-treated eggs at were 2,8 x102 conidia/cm2 and 9,8 x 102
hyphal bodies/cm2. Survival of larvae inside eggs, treated or control, after
prolonged exposure for up to a six months at RH 43, 75, 86 or > 98% at
25°C was clearly affected by the lowest humidity (RH 43%) tested.
Eclosion diminished at all humidities after increasing periods of exposure.
Moisture was shown to be a limiting factor for ovicidal activity. M.
anisopliae IP 46 had a strong ovicidal activity only at humidity close to
saturation and has potential for integrated control of A. aegypti. Favorable
humidities for fungal development on eggs can be expected in the field
during the rainy season but also during drier periods when numeous
females oviposit in subterranean habitats with elevated moisture.
xiv
SUMÁRIO
DEDICATÓRIA ............................................................................... iv AGRADECIMENTOS ........................................................................ viii LISTA DE ABREVIATURAS ................................................................. ix LISTA DE FIGURAS ........................................................................... x LISTA DE TABELAS .......................................................................... xi RESUMO ....................................................................................... xii ABSTRACT .................................................................................... xiii 1 INTRODUÇÃO .............................................................................. 1 2 REVISÃO DE LITERATURA ............................................................... 5 3 OBJETIVOS ................................................................................ 18 4 PRODUÇÃO CIENTÍFICA .............................................................. 19 4.1 Artigo: Impact of moisture on survival of Aedes aegypti eggs and ovicidal activity of Metarhizium anisopliae under laboratory conditions .................. 20 4.2 Manuscrito:Depence of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae (Hypocreales: Clavicipitaceae) on high humidity for activity of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) ...................................................... 22 5 CONCLUSÕES ............................................................................ 53 6 CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................. 54 7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................... 55 8 ANEXOS ..................................................................................... 73 8.1 Normas para publicação no Journal of Medical Entomology ................. 73
1
Efeito da umidade relativa na atividade ovicida de Metarhizium anisopliae em Aedes aegypti
1 INTRODUÇÃO
Fungos entomopatogênicos são amplamente utilizados no controle
biológico de pragas agrícolas (Onofre et al. 2002, Batista Filho et al. 2003,
Lacey & Shapiro–Ilan 2008). O interesse em controlar insetos de
importância médica como triatomíneos (Luz et al. 2003, 2004, 2005,
Lecuona et al. 2005) e mosquitos (Scholte et al. 2004, Kanzok e Lorena
2006) com fungos entomopatogênicos apresentou crescimento
significativo nos últimos anos. Geralmente, fungos entomopatogênicos
invadem o hospedeiro ativamente através do tegumento (St Leger 1991,
Inglis et al. 2001, Pedrini et al. 2007, Wang 2008), favorecendo a
utilização no controle de insetos picadores – sugadores, como vetores
hematófagos, os quais são dificilmente alcançados pela via oral com
outros patógenos, como vírus e bactérias.
A atividade de fungos no inseto é influenciada por fatores bióticos e
abióticos (Hajek & St Leger 1994). Fatores bióticos como a espécie,
linhagens com perfis genéticos diferentes, fases do desenvolvimento,
alimentação qualitativa e quantitativa e comportamento determinam a
especificidade do fungo e a suscetibilidade do inseto (Watanabe 1987,
Khachatourians 1991, Inglis et al. 2001). Fatores abióticos, especialmente
a umidade, temperatura e luz ultra violeta têm grande impacto sobre
ambos, fungo e hospedeiro no desenvolvimento da micose e epizootias
(Inglis et al. 2001, Rangel et al. 2004). As fases extra-tegumentares são
influenciadas pela umidade relativa no local de adesão e invasão sobre o
tegumento do inseto – alvo e também pela umidade no habitat do inseto.
A umidade varia com a estrutura do tegumento, perfil do habitat e com a
temperatura, exposição ao sol, vento e chuvas, conforme ciclos diários e
sazonais de uma região.
Substâncias da epicutícula determinam o reconhecimento
específico do hospedeiro, a adesão e posterior invasão do hospedeiro, por
2
muitos fungos (St Leger 1991, Hajek & St Leger 1994, Sosa-Gomez et al.
1997). Após a penetração de hifas, o fungo que consegue escapar dos
mecanismos de defesa do inseto, coloniza todo o organismo e pode causar
a morte em dias. Os efeitos patológicos envolvem ações mecânicas,
enzimáticas e toxicológicas específicas. No inseto morto pelo fungo, em
condições adequadas de umidade, as hifas emergem em pouco tempo
através de espiráculos e outras regiões da cutícula. Novos conídios
produzidos, sobretudo na superfície da cutícula, são disseminados no meio
ambiente.
Dentre os fungos entomopatogênicos, Metarhizium anisopliae é a
espécie mais estudada e utilizada em programas de controle biológico de
pragas (Alves & Lopes 2008). Apesar de não haver relatos da ocorrência
natural de M. anisopliae em culicídeos. recentemente, esse fungo foi
isolado em criadouros de mosquitos (López Lastra et al. 2002). Esse fungo
apresenta se como um dos mais promissores agentes para controle
biológico de insetos de importância em saúde pública,como os mosquitos,
em virtude de seu potencial larvicida e adulticida.
Em condições de laboratório, a atividade larvicida de M. anisopliae
para mosquitos dos gêneros Aedes, Culex e Anopheles é bastante
conhecida (Daoust et al. 1982, Daoust e Roberts 1983 a,b, Lacey et al.
1988, Alves et al. 2002, Scholte et al. 2004, Silva et al. 2004).
Recentemente, foi mostrado que esse fungo pode acometer além de
adultos (Knols & Thomas 2006, Scholte et al. 2007) também os ovos de
A. aegypti (Luz et al. 2007).
Há um grande número de estudos e conhecimentos sobre o efeito
de fungos entomopatogênicos em fases ativas de insetos e de outros
artrópodes, como larvas, ninfas, pupas ou adultos e o impacto de fatores
abióticos (St Leger et al. 1991, Benz 1991, Hajek & St Leger 1994, Inglis
et al. 2001). Informações sobre a atividade ovicida de fungos é restrita a
poucas pragas de lepidópteros e hemípteros (Riba et al. 1983, Maniania
1991, Romaña & Fargues 1992, Ekesi et al. 2002) dípteros (Sahagún et
al. 2005) e outros artrópodes (Gindin et al. 2002, Shi & Feng 2004, Garcia
et al. 2005, Wekesa et al. 2006).
3
Estudos sobre a atividade ovicida de M. anisopliae e outros fungos
em artrópodes de importância em saúde pública são relacionados
principalmente a carrapatos e helmintos. Ovos de Boophilus annulatus e
Rhipicephalus sanguineus foram afetados por M. anisopliae (Gindin et al.
2002), enquanto Beauveria bassiana apresentou atividade ovicida em
Rhodnius prolixus (Romaña & Fargues 1992) e ácaros (Shi & Feng 2004).
Atividade ovicida desses fungos foi demonstrada em helmintos
importantes como Ascaris suum (Jaborowska et al. 2006). Fungos dos
gêneros Duddingtonia e Verticillium apresentaram atividade ovicida em
Ascaris lumbricoides (Braga et al. 2007) e Toxocara canis (Gortari et al.
2007).
A atividade ovicida de fungos entomopatogênicos em mosquitos é
pouco estudada. No gênero Aedes, os ovos são a fase de maior resistência
no ciclo. No ambiente, durante a diapausa, os ovos estão expostos a
predação, ação de patógenos e variações de umidade relativa, durante o
dia ou à noite, ao longo das estações do ano. Em períodos com menor
índice pluviométrico, fêmeas de A. aegypti ovipoem principalmente em
criadouros permanentes ou subterrâneos (Russel et al. 2001). Nesses
ambientes, o microclima favorece o desenvolvimento de fungos
entomopatogênicos, que poderão atuar como inimigos naturais durante a
diapausa, inibindo a eclosão das larvas e reduzindo a densidade de A.
aegypti.
Em muitos criadouros de A. aegypti, protegidos da luz ultravioleta,
a umidade pode alcançar taxas elevadas nos locais de oviposição. Essa
condição garante a viabilidade prolongada dos ovos, mas também
favorece o desenvolvimento de fungos entomopatogênicos. As fêmeas
colocam os ovos nas paredes internas de criadouros, em lugares
sombreados, inundáveis, preferencialmente sobre áreas molhadas
(Madeira 2002). A embriogênese se completa em 24 a 48 horas. Sem
contato dos ovos com água, as larvas entram em diapausa e sobrevivem
por meses dentro dos ovos, até os mesmos serem submersos na água
(Silva et al. 1998). Durante a diapausa, os ovos estão expostos à
4
predação ou ação de patógenos. A estrutura rígida da casca de ovos do
gênero Aedes garante a resistência da larva no interior (Pereira et al.
2006) mas, permite a invasão de fungos (Luz et al. 2007). Efeitos da
umidade sobre a resistência das larvas de A. aegypti nos ovos ainda são
pouco conhecidos.
Em um primeiro estudo, Clark et al. (1968) não encontraram
atividade ovicida de B. bassiana em A. aegypti, mesmo após incubação
prolongada dos ovos tratados. Em outro estudo, Penicillium citrinum, um
fungo facultativamente patogênico de insetos, foi detectado sobre ovos
expostos em canalizações subterrâneas com umidade elevada (Russel et
al. 2001). Luz et al. (2007) mostraram pela primeira vez, a atividade
ovicida de Isaria farinosa, Paecilomyces carneus, P. marquandi, I.
fumosorosea, M. anisopliae, Penicillium sp, P. lilacinus, B. bassiana e
Evlakovaea kintrischica em ovos de A. aegypti, tratados com conídios ou
corpos hifais e incubados em umidade relativa perto da saturação,
durante 25 dias. Os trabalhos citados (Clark et al. 1968, Russel et al.
2001, Luz et al. 2007) sugerem que a umidade do ambiente tem papel
chave na atividade de fungos em ovos de A. aegypti. Luz et al. 2007
demonstraram atividade ovicidada de fungos entomopatogênicos em A.
aegypti em UR >98%. A umidade relativa elevada e tempos mínimos de
exposição à umidade alta, favorecem o desenvolvimento fúngico na
superfície da casca e podem determinar a dinâmica da micose em ovos.
O uso de agentes de controle biológico, que atuem em todos os
estágios do ciclo de A. aegypti, inclusive nos ovos, que estão dispersos
nos criadouros em todas as estações do ano, favorecerá o controle, além
de reduzir o impacto ambiental e a resistência de A. aegypti aos
inseticidas. Assim sendo, estudos de laboratório com simulações de
umidade e o impacto sobre a atividade ovicida e a viabilidade de ovos a
curto e logo prazos foram as propostas do presente trabalho. Esse estudo
se justifica na busca de conhecer a influência de diferentes regimes de
umidade na atividade de M. anisopliae sobre ovos de A. aegypti em
laboratório, como base para trabalhos de campo.
5
2 REVISÃO DE LITERATURA
Aedes aegypti
Os mosquitos são vetores de doenças humanas que apresentam
grande destaque, visto que, transmitem agentes etiológicos como
helmintos, protozoários e vírus, causando filarioses, malária e arboviroses.
Estão dispersos em ambientes silvestres, rurais ou urbanos, em diferentes
regiões do planeta. Dentre os mosquitos, a espécie A. aegypti (Diptera,
Culicidae) é um dos principais vetores de doenças humanas, sendo
encontrada no ambiente urbano, em mais de cem países tropicais e
subtropicais (Foley et al. 2007).
A. aegypti é o principal vetor da dengue, uma das arboviroses
humanas mais importantes atualmente, com aumento crescente do
número de casos, desde a década de 1980 (Halstead 1993, 2008, OMS
1997, Mackenzie et al. 2004, Siqueira Jr et al. 2005, Gubler 2005). A
Organização Mundial da Saúde (OMS) estima que entre 50 a 100 milhões
de pessoas se infectem anualmente e cerca de 20 mil morrem em
conseqüência da dengue. A circulação dos diferentes sorotipos virais da
dengue está condicionada à presença e densidade de A. aegypti (Braga &
Valle 2007). Assim, devido à ausência de substâncias ativas contra os
vírus bem como vacinas eficazes contra os diferentes sorotipos, a
eliminação do vetor continua sendo a única estratégia viável para controle
da doença. Outro agravante é o aumento do número de pessoas
sensibilizadas por um sorotipo e que estão expostas a outros sorotipos,
podendo desenvolver formas mais graves da doença, como a forma
neurológica, observada nos últimos anos no Brasil (Ferreira et al. 2005).
Acredita-se que o A. aegypti chegou ao Brasil, pela primeira vez,
durante o período de colonização, trazido de sua região de origem, na
África, a bordo de navios que faziam o tráfico de escravos. Após sua
adaptação ao litoral brasileiro, esse mosquito acompanhou o
desenvolvimento do País, se mostrando com grande capacidade
sinantrópica, colonizando ambientes urbanos, inicialmente nas cidades
6
portuárias e dispersando em seguida para outras regiões (Franco 1969,
Silva et al. 1991). No período compreendido entre o final do século XVII e
metade do século XX a importância do A. aegypti no Brasil estava restrita
à transmissão da febre amarela urbana (FAU). Durante esse período,
ocorreram epidemias da doença principalmente nas cidades portuárias do
Rio de Janeiro e Recife (Tauil 1986). No início do século XX, teve início na
cidade do Rio de Janeiro, sob a coordenação de Oswaldo Cruz, campanhas
anti-vetoriais visando a eliminação de criadouros do mosquito através de
saneamento básico e medidas educativas permanentes. Devido a um
trabalho rigoroso, em 1909, a FAU foi eliminada da cidade do Rio de
Janeiro e de cidades do Estado de São Paulo, que aderiram ao programa
(Tauil 1986, Rezende 2001). A partir dos resultados obtidos no controle
vetorial da FAU, foram criados serviços anti-amarílicos em outras áreas
urbanas com focos da doença. Essas medidas, entretanto, não foram
suficientes para conter o avanço da doença, e em 1920, foi registrado no
Estado de Pernambuco, o primeiro caso de febre amarela silvestre (FAS)
(Franco 1969). Em 1940, considerando a dispersão da doença e as
experiências adquiridas nas campanhas anteriores, foi proposta a
erradicação do A. aegypti a nível nacional, obtendo pleno êxito no ano de
1955. Em 1967, mais uma vez o vetor foi reintroduzido no Brasil (Franco
1969), sendo erradicado no ano de 1973, através de campanhas públicas
e uso de inseticidas (Ministério da Saúde 1994). Entretanto, a cooperação
nacional e internacional que foi essencial para o sucesso de todas as
campanhas públicas de erradicação do A. aegypti tornou-se fragmentada
no Brasil e outros países da América. Essa fragmentação, devida em parte
a erradicação da FAU, após desenvolvimento da vacina anti amarílica,
favoreceu a reintrodução do mosquito no Brasil no final da década de
1970 e sua dispersão por todo o País (Tauil 1986).
Apesar da FAU estar erradicada no Brasil desde 1942, o risco de
reurbanização da FAS é constante (Lima 1985). Indivíduos infectados no
ambiente silvestre por outros vetores poderão entrar em contato com A.
aegypti no ambiente urbano, ainda no período de incubação ou fase
7
virêmica da doença. Após infecção, A. aegypti poderá transmitir a FAU
para pessoas não imunizadas. Anualmente, a maior freqüência dos casos
de febre amarela silvestre ocorre entre os meses de dezembro a abril,
período com maior índice pluviométrico e maior atividade agrícola, aliado
ao grande número de turistas que visitam áreas endêmicas, sem estarem
devidamente imunizados. Este período corresponde ao aumento da
densidade do A. aegypti no ambiente urbano, em virtude de sua biologia.
Biologia do A. aegypti
A. aegypti é um mosquito que apresenta distribuição mundial entre
os paralelos 35º Norte e 35º Sul. É adaptado ao ambiente urbano, sendo
encontrado associado a aglomerações humanas (Maciel-de-Freitas et al.
2006, Tauil 2006, Braga & Valle 2007). As fêmeas têm preferência pelo
sangue humano e realizam hematofagia no período diurno, no interior do
domicílio. Após maturação dos ovos, as fêmeas se dispersam em busca de
criadouros para realizar a oviposição. Os criadouros preferenciais são
recipientes temporários encontrados no domicílio ou peridomicilio, como
materiais descartáveis, garrafas, latas, pneus usados, vasos de plantas,
calhas de telhado, contendo pequenas coleções de água parada, em áreas
sombreadas além de recipientes com água permanente como tanques,
caixas d´água e piscinas.
A seleção dos sítios de oviposição se dá através de estímulos
visuais e olfatórios envolvendo semioquímicos como feromônios e
apneumônios (Eiras 2001). Bactérias ou fungos saprobionticos e seus
metabólitos voláteis presentes, em águas poluídas ou em infusões à base
de gramíneas, têm papel importante como estímulos atraentes para
fêmeas de mosquitos, no momento da oviposição (Takken & Knols 1999,
Sivagnaname et al. 2001, Navarro et al. 2003, Geetha et al. 2003). Cada
fêmea de A. aegypti coloca em torno de 80 ovos, com intervalos de 4 a 5
dias, durante dois meses, no período diurno. A oviposição ocorre em todos
os meses do ano (Micieli & Campos 2003). Na estação chuvosa, a grande
disponibilidade de criadouros favorece o aumento da densidade vetorial
8
(Halstead 2008), enquanto na estação seca, as fêmeas ovipõem
principalmente em criadouros permanentes ou subterrâneos (Kay et al.
2000, Russell et al. 2001).
Os ovos são colocados individualmente, nas paredes internas de
depósitos, próximos à superfície da água ou sobre substratos adjacentes
da água (Madeira et al. 2002). Os ovos medem aproximadamente 1 mm
de comprimento e têm contorno alongado e fusiforme. São envolvidos por
uma casca composta de três camadas: o exocório, um envoltório externo,
fino e transparente, o endocório, situado logo abaixo, constituído por
quitina, um polímero de N-acetil glicosamina, resistente à tensão e
insolúvel em água e internamente, a membrana vitelina que envolve o
núcleo, citoplasma e vitelo (Pereira et al. 2006). A casca do ovo, sendo
uma estrutura rígida, serve como proteção mecânica e fisiológica além de
permitir a passagem de gases respiratórios (Valle 1993, Valle et al. 1999).
No momento da postura os ovos são brancos, mas, rapidamente,
adquirem cor negra brilhante. O desenvolvimento embrionário inicia-se
logo após a oviposição e se completa em até 48 horas em temperatura em
torno de 27º C e 80% de umidade relativa. Após embriogênese, os ovos
tornam - se resistentes à dessecação. (Silva & Silva 1999, Juliano et al.
2002). A capacidade de resistência dos ovos de A. aegypti à dessecação é
um sério obstáculo para sua erradicação. A resistência dos ovos é
favorecida pela rigidez da casca (Pereira et al. 2006) que reduz a
influência de fatores abióticos como umidade baixa, temperaturas
extremas, luz ultravioleta, além da ação de patógenos e substâncias
químicas como inseticidas. Durante a diapausa, ovos viáveis podem ser
transportados a grandes distâncias, em recipientes secos, tornando-se o
principal meio de dispersão do inseto. A diapausa é interrompida após
contato dos ovos com a água, através da submersão em água ou
agitação, variações de temperatura e devido a estímulos por metabólitos
de microrganismos (Livdahl et al. 1984, Edgerly & Marvier 1992).
Em contato com a água, as larvas eclodem, se alimentam de
matéria orgânica presente no criadouro, e em cerca de dez dias
9
completam os quatro estádios larvares chegando à fase de pupa e
emergência dos adultos. Por isso, no período chuvoso, quando as
condições ambientais são favoráveis, o aumento da densidade vetorial do
A. aegypti é significativo (Koenraadt & Harrington 2006).O
desenvolvimento larvário e pupal dependem principalmente da
temperatura. Para A. aegypti mantido a 27°C e 80% de UR os períodos de
interfase encontrados foram cerca de 7 dias para completar os estádios
larvares e 2,5 dias para pupas (Silva et al. 1994).
Programas de Controle de A. aegypti
Desde a década de 1980, após a reintrodução e dispersão do A.
aegypti no Brasil e registro de epidemias de dengue, o Ministério da
Saúde, através da Fundação Nacional de Saúde (FUNASA) implantou
diversos programas visando controlar a transmissão da doença (Ministério
da Saúde, FUNASA 2001). Inicialmente foi implantado o Programa de
Erradicação do A. aegypti (PEAa), cujo foco principal foi o controle da
densidade de A. aegypti através de campanhas para eliminação de
criadouros e uso de inseticidas químicos. Essa estratégia, comum aos
programas de controle de doenças transmitidas por vetor em todo o
mundo, mostrou-se absolutamente incapaz de responder à complexidade
epidemiológica da dengue e se observou a inviabilidade técnica de
erradicação do mosquito a curto e médio prazos (Lima & Aragão 1987).
Foram implantados novos programas como o Plano de Intensificação das
Ações de Controle da Dengue (PIACD), em 2001 e o Programa Nacional de
Controle da Dengue (PNCD), em 2002. Em todos os programas, foram
utilizadas campanhas para eliminação de criadouros associadas ao
emprego de inseticidas químicos.
Controle Químico
O organofosforado temephós (abate), na concentração de 1%, é o
único larvicida sintético recomendado pela OMS para tratamento focal em
depósitos domiciliares de água potável (Chavasse & Yap 1997), sendo
10
largamente utilizado no controle de A. aegypti. Aplicação espacial em Ultra
Baixo Volume (UBV) de organofosforados (malathion) ou piretróides, com
atividade adulticida é recomendada nos períodos de maior densidade
vetorial.
Inseticidas químicos, utilizados conforme proposto pelo Ministério
da Saúde, não se mostraram eficazes no controle do A. aegypti (Tauil
2006). Além de os inseticidas produzirem efeitos tóxicos em organismos
não alvos, o A. aegypti tem se adaptado a diferentes situações, tornando-
se resistente e exigindo aplicação de doses crescentes de inseticidas
(WHO 1992, Macoris et al. 1995, Camargo et al. 1998, Hemingway &
Ranson 2000, Lima et al. 2003, Cunha et al. 2005, Pridgeon et al. 2008)
mantendo taxas de densidade vetorial, acima dos índices considerados
seguros (OPAS 1995).
Outro agravante é que, apesar de inseticidas organofosforados
serem biodegradáveis e não se acumularem nos tecidos, pode ocorrer
intoxicação aguda em vertebrados, devido à inibição irreversível da
aceticolinesterase, gerando acúmulo de acetilcolina nos receptores e riscos
a saúde humana e animal (Braga & Valle 2007). Apesar dessas evidências,
as medidas efetivamente empregadas no controle da densidade de A.
aegypti, em períodos com altas taxas de transmissão de dengue, têm sido
basicamente o uso de inseticidas sintéticos com atividade larvicida
(temephós) e adulticida (malathion e piretróides) associados a campanhas
públicas para eliminação dos criadouros. Essas campanhas ocorrem
principalmente no período chuvoso. Durante a estação seca, criadouros
dispostos em locais sombreados, apresentam índices de umidade relativa
suficiente para a manutenção e dispersão de ovos viáveis.
Controle Integrado
O aumento contínuo do nível de resistência de A. aegypti a
inseticidas sintéticos aliado às dificuldades operacionais e falta de políticas
de controle constante de criadouros favorecem a manutenção da
densidade desse vetor em níveis elevados. Assim sendo, o interesse por
11
novas formas de controle integrado de vetores está sendo retomado
(Marzochi 1994, Fuxa 1995).
Os reguladores de crescimento são considerados uma alternativa
importante e são empregados há cerca de 40 anos, em programas de
controle de vetores (Spielman & Skaff 1967). São substâncias químicas
que atuam como inibidores da síntese de quitina ou análogos do hormônio
juvenil. Impedem a ecdise, ocasionando a morte larval (Borges et al.
2004). Como atuam em sítios específicos do inseto, apresentam riscos
reduzidos de toxicidade para vertebrados (Braga et al. 2005).
A pesquisa de princípios ativos com atividade inseticida em
extratos de plantas é também uma importante opção de controle vetorial
em países tropicais. Esses países possuem flora rica e diversificada,
favorecida pelas condições ambientais, além de serem grandes
consumidores de inseticidas sintéticos. Pesquisadores de diferentes partes
do mundo avaliaram o potencial de plantas nativas e a possibilidade de
isolar compostos ativos contra A. aegypti (Ciccia et al. 2000, Cheng et al.
2003, Silva et al. 2004, 2007, 2008, Coria et al. 2008, Silva et al. 2008,
Chapagain et al. 2008). Dentre as diferentes plantas estudadas foram
identificados compostos com atividade larvicida em A. aegypti. Mas, não
há produtos disponíveis para controle desse vetor, à base de extratos de
plantas.
Controle Biológico
O uso de organismos vivos, com atividade de predadores e
parasitas, se mostrou viável para o controle de vetores, por serem
efetivos e seguros para o homem e animais (Chapman 1974, Kaya &
Gaugler 1993, Legner 1995, Becker & Ascher 1998, Alves 1998).
Predadores aquáticos como peixes do gênero Gambusia (Hoy 1985),
mosquitos larvófagos como Toxorhynchites sp apresentam potencial para
controle de larvas de A. aegypti em criadouros permanentes. Espécies de
protozoários (Passos & Tadei 2008), nematódeos e vírus também
possuem atividade larvicida contra mosquitos. Entretanto, produções em
12
grande escala da maioria desses agentes tornam sua aplicação inviável
(Hajek et al. 2007). Assim sendo, os organismos vivos que apresentam
maiores viabilidades para utilização no controle biológico de A. aegypti são
bactérias e fungos entomopatogênicos, visto que já são registrados e
utilizados em diferentes programas no controle de pragas agrícolas ou
vetores de importância em saúde pública.
Bactérias entomopatogênicas
As bactérias entomopatogênicas Bacillus thuringiensis israelensis
(Bti), e Bacillus sphaericus (Bs) foram os primeiros agentes de controle
biológico efetivos,usados em larga escala, no controle larvário de
mosquitos (Panbangred et al. 1979, Becker & Ascher 1998) por
apresentarem ação rápida e seletiva. Essas bactérias produzem protoxinas
durante a esporulação (Aly et al. 1985), que após a ingestão pela larva,
são ativadas em endotoxinas protéicas (Cry) e destroem a parede do
intestino, causando a morte larval (Singh et al 1986, Khawaled et al.
1992, Fernández et al. 2005). O Bti é recomendado pela OMS, para uso
em água potável, para controle de larvas de A. aegypti, em substituição
ao temephós (Braga & Valle 2007, Araújo et al. 2007). Nos últimos anos,
entretanto, foi relatada a ocorrência de resistência de mosquitos ao Bti
(Ferré & VanRie 2002, Wirth et al. 2005). Técnicas de engenharia genética
estão sendo utilizadas para desenvolvimento de novos larvicidas, à base
de endotoxinas do Bti e Bs, como o uso da endotoxina recombinante
Cry1A que potencializa a toxicidade da endotoxina Cry, reduzindo a
resistência dos mosquitos ao Bs e Bti (Federici et al. 2007).
Fungos entomopatogênicos
Fungos entomopatogênicos foram os primeiros patógenos utilizados
no controle biológico de pragas. Muitos fungos são patógenos de largo
espectro e estão dispersos em diferentes ambientes, como solos, vegetais,
água e ar (Benz 1991, Hajek & St Leger 1994, Inglis et al. 2001). Os
fungos apresentam uma grande variabilidade genética, com número
13
elevado de linhagens virulentas e úteis no controle de insetos.
(Kachatourians 1991, 1998). São conhecidas cerca de 90 gêneros com
700 espécies de fungos entomopatogênicos. Esses causam em torno de
80% das doenças de insetos de interesse na agricultura ou saúde pública,
sendo que, cerca de vinte espécies de fungos entomopatogênicos incidem
sobre pragas de importância econômica (Alves 1998, Fernandes & Alves
1991). Nos últimos anos, o reino Fungi está sendo revisado e sofrendo
profundas alterações na nomenclatura, baseadas sobretudo, em estudos
moleculares. Em revisões recentemente publicadas, a maioria dos fungos
entomopatogênicos foi classificada como pertencente às classes
Sordariomycetes (Ascomycota) e Zygomycetes (Zygomycota) (Roy et al.
2006, Sung et al. 2007, Hibbet et al. 2007, Humber 2008). As espécies
mais estudadas e empregadas em programas de controle biológico de
pragas pertencem à família Clavicipitaceae (Sung et al. 2007).
O ciclo biológico de fungos entomopatogênicos, em insetos
terrestres, inicia com adesão de conídios ao tegumento do inseto (Fig 1).
A adesão é um processo complexo, na maioria dos fungos. Inicia
imediatamente após contato entre conídios e a cutícula do inseto e
envolve forças hidrofóbicas, eletrostáticas e interações moleculares entre
o patógeno e a superfície do hospedeiro (St Leger 1991, Hajek & St Leger
1994, Pedrini et al. 2007). A cutícula do inseto atua como barreira
mecânica e bioquímica de defesa contra a infecção fúngica (St Leger
1991) associada a barreiras comportamentais como a agregação de
insetos e hábitos higiênicos (Ugelvig & Cremer 2007, Yanagawa et al.
2008). Umidade relativa perto da saturação e tempos mínimos de
exposição a essa umidade ótima foram descritos como fatores – chave em
fases extra-tegumentares de Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae
durante a invasão do hospedeiro e após a morte de triatomíneos e outros
insetos (Daoust & Roberts 1983a, Luz & Fargues 1998, 1999, Fargues &
Luz 1998, 2000, Sosa-Gomez & Alves 2000, Inglis et al. 2001, Ekesi et al.
2003, Lazzarini et al. 2006, Pelizza et al. 2007). Após adesão, inicia-se a
germinação, que se completa entre doze e vinte horas, com formação do
14
tubo germinativo e hifas. Em alguns fungos há formação de apressório e
grampo de penetração (“clamp connection”). Após a germinação, as hifas
formadas penetram através do tegumento. A penetração é favorecida pela
pressão exercida pelas hifas em áreas membranosas ou esclerosadas
associadas a enzimas como proteases, quitinases, amilases e lipases,
produzidas durante a penetração (Goettel et al. 1988, Khachatourians
1998). Proteases (Moraes et al. 2003) e metabólitos secundários tóxicos
(St. Leger et al. 1991) são considerados fatores chave para a eficiência do
processo de invasão. Após a penetração das hifas, que dura entre seis e
doze horas, estas se ramificam e colonizam o tegumento do inseto e em
seguida atingem a hemocele. O inseto ativa mecanismos de defesa
interna, como estímulo da fagocitose, destruição de plasmócitos
infectados, encapsulação do fungo e formação de nódulos (Hajek & St.
Leger 1994), para evitar o crescimento fúngico. O fungo escapa do
sistema imune através da formação de estruturas como corpos hifais e
secreção de toxinas que suprimem a resposta imune de insetos (Pal et al.
2007). Essas toxinas, associadas a alterações patológicas na hemocele,
bloqueio mecânico do aparelho digestivo, devido ao crescimento do
micélio e início do processo de esporulação, causam a morte do inseto. No
cadáver, o fungo coloniza o corpo gorduroso, sistema digestivo, tubos de
Malpighi, hipoderme, sistema nervoso, músculos e traquéias. Em seguida,
as hifas emergem através de espiráculos e da cutícula. Associada ao
crescimento do micélio, ocorre a esporulação do fungo no cadáver e
disseminação de propágulos fúngicos no ambiente através da água,
ventos e animais, podendo contaminar e infectar novos insetos em
diferentes fases de desenvolvimento.
15
Figura 1. Ciclo das relações patógeno hospedeiro entre fungos e insetos
(Alves 1998)
Metarhizium anisopliae
M. anisopliae é um dos fungos entomopatogênicos mais estudados
e utilizados no controle biológico de pragas. Esse fungo foi descrito por
Metschnikoff e Sorokin no final do século XIX. Sua atividade
entomopatogênica foi demonstrada pelos mesmos pesquisadores, que
utilizaram esse fungo no controle de praga do trigo Anisopliae austriaca, e
de praga da beterraba Cleonus punctiventris. Posteriormente, sua
atividade foi demonstrada em outros insetos pertencentes às ordens
Orthoptera, Coleoptera, Homoptera, Hemiptera e Diptera (Alves 1998). É
um fungo que apresenta características importantes para seleção de um
agente para controle biológico (Zimmerman 1993, Almeida & Batista Filho
2001). Possui distribuição cosmopolita, é encontrado comumente em
solos, em clima temperado e tropical, podendo ser cultivado em meios
artificiais baratos (Shah et al. 2005). Seus conídios podem ser estocados
com facilidade e associados a formulações água – óleo (Batta 2003). Atua
em grande número de pragas (Destéfano 2003, Alves & Lopes 2008).
Infecta insetos e carrapatos através da combinação de estruturas
16
especializadas de penetração como a formação de apressório e liberação
de proteases que degradam a cutícula, além da secreção de toxinas
específicas como destruxinas e citocalasinas (Fargues et al. 1975, Inglis et
al. 2001, Garcia et al. 2003).
Não se conhecem danos ocasionados por M. anisopliae em
organismos não alvo (Alves et al. 1996, Butt et al. 1998), como
organismos do solo (Broza et al. 2001), peixes (Milner et al. 2002),
anfíbios (Genthener et al. 1998), répteis (Austwick, 1980), aves (Wasti et
al.1980) e o homem (Ignoffo 1973, Saik et al.1990, Siegel & Shadduck
1990, Zimmermann 1993, 2007, Goettel et al. 2001, Vestergard et al.
2003).
No Brasil, a partir da descrição de epizootias de M. anisopliae em
cigarrinhas da cana–de-açúcar, diversas pesquisas foram desenvolvidas,
visando selecionar linhagens mais adequadas desse fungo, para o controle
microbiano de pragas. M. anisopliae é o fungo entomopatogênico mais
utilizado em programas de controle biológico de pragas na agricultura
brasileira (Sosa-Gomez & Alves 1983, Alves 1998, Sosa-Gomez 1998,
Chernaki et al. 2007).
O potencial de M. anisopliae já foi demonstrado no controle de
cupins (Fernandes & Alves 1991), ectoparasitas de interesse veterinário,
especialmente carrapatos (Onofre et al. 2002, Brigues et al. 2006, Lopes
et al. 2007, Pirali et al. 2007, Leemon & Jonsson 2008), pulgas (de Melo
et al. 2006) e também moscas (Legner 1995, Wrigth et al 2004, Angel et
al. 2005) além de insetos de importância em saúde pública como
triatomíneos (Luz et al. 1998, 1999, Fargues & Luz 1998, 2000, Lazzarini
et al. 2006) e mosquitos (Silva et al. 2004, 2005, Scholte et al. 2004, Luz
et al. 2007).
Atividade de M. anisopliae em mosquitos
Em mosquitos da família Culicidae, a atividade larvicida de M.
anisopliae é bastante conhecida. Vários autores demonstraram que
linhagens desse fungo apresentam potencial para um bioinseticida,
17
matando rapidamente grande quantidade de larvas de mosquitos dos
gêneros Aedes, Culex e Anopheles (Daoust et al. 1982, Daoust & Roberts
1983a, b, Lacey et al. 1988, Alves et al. 2002, Kanzok & Lorena 2006)’’ e
adultos de A. aegypti e A. albopictus (Scholte et al. 2007). Larvas de A.
aegypti tratadas com conídios de M. anisopliae, morreram em poucas
horas, após o tratamento, devido a possíveis mecanismos de ação rápida,
como a liberação de metabólitos tóxicos (Silva et al. 2005); por asfixia,
devido ao bloqueio do sifão respiratório por micélio ou ainda por inanição,
com as escovas orais bloqueadas por grande quantidade de propágulos
(Silva et al. 2004). Scholte et al. (2004) revisaram literatura sobre fungos
entomopatogênicos com atividade em mosquito e relacionaram treze
gêneros, dentre os quais M. anisopliae se destaca, em virtude da atividade
larvicida e potencial para uso em outras fases do ciclo biológico de
mosquitos como adultos e ovos.
18
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
Contribuir para o desenvolvimento de métodos de controle
integrado de A. aegypti
3.2 Objetivos Específicos
• Avaliar a atividade ovicida de M. anisopliae IP 46 em A. aegypti
• Determinar tempos mínimos de exposição de ovos de A. aegypti a
M. anisopliae para atividade ovicida
• Avaliar o efeito da umidade relativa sobre a sobrevivência de larvas
nos ovos de A. aegypti tratados ou não com M. anisopliae durante a
diapausa.
19
4 PRODUÇÃO CIENTÍFICA
4.1 Artigo: Impact of moisture on survival of Aedes aegypti eggs and
ovicidal activity of Metarhizium anisopliae under laboratory conditions –
Memórias do Instituto Oswaldo Cruz 103: 214-215, 2008.
4.2 Manuscrito: Dependence of the entomopathogenic fungus
Metarhizium anisopliae (Hypocreales: Clavicipitaceae), on high humidity
for ovicidal activity of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Submetido ao
Journal of Medical Entomology (abril/2008).
20
Impact of moisture on survival of Aedes aegypti eggs and ovicidal activity of Metarhizium anisopliae under laboratory conditions
C Luz/+, MHH Tai, AH Santos, HHG Silva
DMIPP, Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, Universidade Federal de Goiás, 74001-970 Goiânia, GO, Brasil
The effect of relative humidity (43%, 75%, 86% and > 98%) on Aedes aegypti eggs treated with Metarhizium anisopliae or water only was tested for up to a six months exposure at 25°C. Survival of larvae inside eggs was clearly affected by the lowest humidity (43%) tested, and eclosion diminished at all humidities after increasing periods of exposure. M. anisopliae showed to have a strong ovicidal activity only at humidity close to saturation. No difference of activity was found between conidia and hyphal bodies tested. This fungus affected larvae inside eggs and has potential as a control agent of this important vector in breeding sites with high moisture.
Key words: entomopathogenic fungi - mosquito - egg - biological control
Aedes aegypti is the principal vector of dengue
viruses in tropical and subtropical regions throughout the world. This closely human-associated mosquito uses a great variety of large to small sized breeding sites and occurs year round even in semi-arid regions. Females oviposit mainly above the waterline on damp surfaces, and unhatched larvae have to hold out until immersion of eggs in water will permit eclosion and further development. Populations decline during the dryer and colder season but mosquitoes never disappear completely using subterranean and other breeding sites resulting from watering behavior by local residents (Varejão et al. 2005, Maciel-de-Freitas et al. 2007). Moreover, eggs out of water resist prolonged desiccation during distinct dry seasons, and the surviving larvae contribute to a reestablishment of vector populations at the beginning of the rainy season, thus increasing the risk of dengue epidemics (Sota & Mogi 1992, Silva & Silva 1999). Inside eggs, diapausing larvae are exposed to predation and infection by pathogens, particularly fungi that may invade eggs actively through the egg shell or affect larvae with toxic metabolites produced on the egg surface (Russell et al. 2001, Luz et al. 2007). Moisture is a limiting factor for both egg survival and fungal activity but there is still little information about the impact of relative humidity (RH) on the survival of larvae inside eggs or a possible effect of entomopathogenic fungi.
We report here on the impact of RH on egg survival and an ovicidal activity of M. anisopliae under laboratory conditions. This fungal species is pathogenic to larvae and adults of A. aegypti (Scholte et al. 2004, 2007, Silva et al. 2004, 2005), and recent studies indicated + Corresponding author: [email protected] Received 18 September 2007 Accepted 14 March 2008
that it is also effective against eggs of this vector (Luz et al. 2007). The fungal isolate tested here, IP 46, originated from a soil sample collected in 2001 in the Cerrado of Central Brazil and was stored at the IPTSP, UFG, Goiânia, Brazil. Conidia were collected from 15 days old sporulating cultures grown in Petri dishes (100 x 20 mm) at 25°C and 12 h photophase on potato-dextrose-agar; hyphal bodies were produced in liquid Sabouraud-dextrose-yeast extract medium (Goettel & Inglis 1997) for five days on a rotary shaker at 25°C and 240 rpm.
The population of A. aegypti originated from virus-free larvae, collected in 1991 in Goiânia, Brazil. Mosquitoes were reared under laboratory conditions as described by Silva et al. (1998). Eggs were prepared using the method related by Luz et al. (2007), and then topically treated with 50 µl water-suspended conidia or hyphal bodies, at 5x106 propagules/cm2 or with water only for the controls and incubated for up to six months at 25°C and 43%, 75%, 86% or > 98% RH regulated in the test chambers with saturated solutions of K2CO3, NaCl, KCl and K2SO4, respectively (Winston & Bates 1960). Each month, fungal development on eggs and egg viability were tested. Eggs were submerged in water and quantitative eclosion evaluated for the next 10 days (Luz et al. 2007). Four independent replicates, each test using different fungal cultures, were carried out. Rates of eclosion were arcsine-square root transformed and evaluated by analyses of variance and the Student-Newman-Keuls multiple range test for comparison of means. Means were considered not statistically different at p > 0.05.
At only the highest (> 98%) RH, mycelium and newly formed conidia of M. anisopliae were observed by the end of the first month of incubation. Control eggs held at the same humidity were found to be infested with saprobic fungi. There was a clear effect of moisture on cumulative eclosion of larvae 10 days after immersion of eggs in water regardless of the treatment (F3,28 = 23.2; p < 0.001). Eclosion was ≥ 80% after one month of exposure of eggs at 43–86% RH, but dropped to ≤ 1.3% at 43% RH, to ≤ 27.5% at 75% RH and to ≤ 20% at 86% RH,
21
six months after treatment for both fungus- and water-treated eggs (Figure). At > 98% RH eclosion differed clearly between fungus-treated and control eggs after the first month, with greater eclosion values for the controls than for fungus-treated eggs. Whereas eclosion of fungus-treated eggs incubated at > 98% RH for six months did not exceed 1.3%, eclosion in the control (water-treated) eggs reached up to 26.3% at the same time (Figure). No difference of quantitative eclosion was found between eggs treated with conidia or hyphal bodies. These results confirmed that moisture is a limiting
Cumulative eclosion of Aedes aegypti eggs treated with Metarhizium anisopliae IP 46 or water and exposure at different humidities and 25°C up to six months before submersion in water for 10 days.
factor for the survival of A. aegypti eggs, and that larvae inside eggs survived better at higher moisture levels. M. anisopliae had a strong ovicidal effect only at RH close to saturation. A high potential for biological control of A. aegypti can be expected during the rainy season and throughout the year in either subterranean breeding sites, man-made containers or plants with accumulated water where humidity is constantly high and where female mosquitoes preferentially oviposit.
ACknowLedGeMenTS
To Carmeci N. Elias for rearing the mosquitoes
and Richard A. Humber for the critical review of the manuscript.
REFERENCES
Goettel MS, Inglis GD 1997. Fungi: Hyphomycetes. In Manual
of Techniques in Insect Pathology. L Lawrence, Academic Press, New York, p. 213-250.
Luz C, Tai MHH, Santos AH, Rocha LFN, Albernaz DAS, Silva HHG 2007. Ovicidal activity of entomopathogenic Hyphomycetes on Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae) under laboratory conditions. J Med Entomol 44: 799-804.
Maciel-de-Freitas R, Marques WA, Peres RC, Cunha SP, Lourenço-de-Oliveira R 2007. Variation in Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) container productivity in a slum and a suburban district of Rio de Janeiro during dry and wet seasons. Mem Inst Oswaldo Cruz 102: 489-496.
Russell BM, Kay BH, Shipton W 2001. Survival of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) eggs in surface and subterranean breeding sites during the Northern Queensland dry season. J Med Entomol 38: 441-445.
Scholte EJ, Knols BGJ, Samson RA, Takken W 2004. Entomopatho-Entomopathogenic fungi for mosquito control: a review. J Insect Sci 4: 19.
Scholte EJ, Takken W, Knols BGJ 2007. Infection of adult Aedes aegypti and Ae. albopictus mosquitoes with the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae. Acta Trop 102: 151-158.
Silva HHG, Silva IG, Lira KS 1998. Metodologia de criação, manutenção de adultos e estocagem de ovos de Aedes aegypti (Linnaeus, 1762) em laboratório. Rev Patol Trop 27: 53-63.
Silva HHG, Silva IG 1999. Influência do período de quiescência dos ovos sobre o ciclo de vida de Aedes aegypti (Linnaeus, 1762) (Dipera, Culicidae) em condições de laboratório. Rev Soc Bras Med Trop 32: 349-355.
Silva RO, Silva HHG, Luz C 2004. Effect of Metarhizium anisopliae isolated from soil samples of the central Brazilian cerrado against Aedes aegypti larvae under laboratory conditions. Rev Pat Trop 33: 207-216.
Silva RO, Silva HHG, Ulhoa CJ, Luz C 2005. Is there a relationship between N-acetyl-beta-D-glucosaminidase activity of Metarhizium anisopliae (Metschn.) Sorokin (Hyphomycetes) isolates from peridomestic areas in Central Brazil and larvicidal effect on Aedes aegypti (L.) (Diptera, Culicidae)? J Appl Entomol 129: 158-164.
Sota T, Mogi M 1992. Survival time and resistance to desiccation of diapause and non-diapause eggs of temperate Aedes (Stegomyia) mosquitoes. Entomol Exp Appl 63: 155-161.
Varejão JBM, Santos CB, Rezende HR, Bevilacqua LC, Falqueto A 2005. Criadouros de Aedes (Stegomyia) aegypti (Linnaeus 1762) em bromélias nativas na cidade de Vitória, ES. Rev Soc Bras Med Trop 38: 238-240.
Winston PW, Bates DH 1960. Saturated solutions for the control of humidity in biological research. Ecology 41: 232-237.
22
Dependence of the entomopathogenic fungus Metarhizium
anisopliae (Hypocreales: Clavicipitaceae), on high humidity for
ovicidal activity of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae)
Adelair H. Santos, Marina H. H. Tai, Heloisa H. G. Silva and Christian
Luz1
DMIPP, Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, Universidade
Federal de Goiás, CP 131, 74001-970 Goiânia, GO, Brasil
1 Corresponding author Tel: (55) 62 3209 6113; Fax: (55) 62 3521
1839; E-mail address: [email protected]
23
ABSTRACT
The effect of mono- and biphasic humidity regimes on ovicidal
activity of Metarhizium anisopliae IP 46 against Aedes aegypti (L.)
(Diptera: Culicidae) was tested. Eggs were topically treated with
conidia or hyphal bodies. They were then incubated at >98% relative
humidity (RH) and 25°C for up to 25 d, and thereafter transferred
directly to water or were held in biphasic moisture regimes with
initially increasing exposure times to >98% RH followed by
decreasing exposures to 75% RH over a total of 25 d before
submersion in water. Finally, daily alternating exposures to relative
humidities of >98% and 75%, with increasing exposure times to
>98% RH over a total of 30 d were tested. Mycelium and newly
formed conidia were detected on treated eggs after 10-15-d
exposures to >98% RH or at daily 20 h at >98% RH alternating with
4 h at 75% RH for 20 d. Eclosion diminished with increasing
exposures of eggs at >98% RH whether eggs were treated with
conidia or hyphal bodies. Quantitative eclosion of larvae from eggs
treated with M. anisopliae was clearly affected after a minimal 5 d
incubation at >98% RH followed immediately by submersion of eggs
in water or after up to 25 d post-inoculation exposure of eggs to 75%
RH before submersion in water. Values of 50% eclosion-inhibiting
concentrations after 25 d incubation of fungus-treated eggs at >98%
RH were 2.8 x102 conidia/cm2 and 9.8 x 102 hyphal bodies/cm2. Daily
alternating >98% RH and 75% RH up to 30 d had no clear effect on
24
ovicidal activity. Moisture was shown to be a limiting factor for
ovicidal activity. Favorable humidities for fungal development on eggs
can be expected in the field during the rainy season but also during
drier periods when females oviposit in subterranean habitats with
elevated moisture levels. M. anisopliae, which is also effective against
larvae and adults of A. aegypti, has potential for integrated control of
this important vector.
Keywords: biological control, humidity, mosquito, eggs,
Hyphomycetes
25
There is worldwide concern about Aedes aegypti (L.) (Diptera:
Culicidae) as the vector for dengue epidemics, dengue hemorrhagic
fever and urban yellow fever. Control of this vector is based on the
destruction of breeding sites combined with application of synthetic
insecticides, mainly pyrethroids and organophosphates. Increasing
societal resistance against chemical pesticides and their harmful
impacts on the environment and human health emphasize the need
to reduce the use of insecticides and to search for more sustainable
control methods. The use of growth regulators, mosquito-eating
fishes, and entomopathogenic bacteria that pose little risk for non-
target arthropods or human health provided good results against A.
aegypti and other mosquitoes (Polanczyk et al. 2003, Braga et al.
2005, Kumar and Hwang 2006). Fungal entomopathogens such as
species of Lagenidium, Coelomomyces, Tolypocladium,
Culicinomyces, Beauveria and Metarhizium affect mosquitoes and also
have potential as biological control agents (Scholte et al. 2004).
Metarhizium anisopliae is a well-known fungus often used for pest
control that has repeatedly shown promise for use against
mosquitoes. This soil-borne entomopathogen was collected from
temporary and permanent ponds and from artificial containers used
by mosquitoes for breeding in Argentina (López Lastra et al. 2002)
but was not reported to be a natural pathogen of mosquitoes. In fact,
this species has been proven to have lethal activity against larvae
and adults of A. aegypti and other mosquito species under laboratory
26
conditions (Scholte et al. 2003, 2007, Alves et al. 2002, Silva et al.
2004, 2005, Kanzok and Lorena 2006) but there is very much less
information about the ovicidal activities of this M. anisopliae or other
fungi against mosquitoes. Clark et al. (1968) found no decrease in
eclosion from A. aegypti eggs exposed to B. bassiana conidia and
incubated for 15 d under laboratory conditions. Russell et al. (2001)
detected Penicillium citrinum and other potentially pathogenic fungi
on egg batches of A. aegypti in subterranean breeding sites with
elevated moisture in Australia after 15 d of exposure. They concluded
that toxic metabolites, especially those of P. citrinum, may have
contributed to reducing egg viability. Recently Luz et al. (2007)
showed for the first time a clear ovicidal activity of several
hyphomycete fungi including a M. anisopliae isolate. The eggs of
Culex and Anopheles are generally deposited on the water surface,
and their included larvae hatch quickly. However, the eggs of A.
aegypti are mostly deposited above the waterline on damp surfaces
where larvae will survive for prolonged periods and eclose only after
submersion of eggs in water. During this pre-submersion phase eggs
are potentially susceptible to infection by terrestrial fungi. Humidity
was shown to be a key factor for high and rapid kill of insects treated
with B. bassiana, M. anisopliae and other entomopathogenic fungi
and further development on cadavers (Luz and Fargues 1998, 1999,
Fargues and Luz 1998, 2000, El Damir 2006, Lazzarini et al. 2006,
Derakhshan et al. 2007). Because moisture is probably also an
27
important limiting factor for fungal development on the egg surfaces,
we investigated the impact of high humidity on ovicidal activity of M.
anisopliae against A. aegypti.
Materials and Methods
Origin and preparation of the fungus. The isolate M.
anisopliae IP 46 (IPTSP, UFG) used in this study was originally
obtained in 2001 from a soil sample collected in the southwestern
Cerrado of the State of Goiás, Central Brazil. The isolate was chosen
for evaluation because of its activity against larvae of A. aegypti
(Santos and Luz, personal communication). Before the reported tests,
IP 46 was host-passaged on third-instar nymphs of Triatoma
infestans (Klug) in order to stimulate its activity. Aerial conidia were
obtained from 15-d-old cultures grown in Petri dishes (100 x 20 mm)
at 25°C and 12 h photophase on PDA (potato-dextrose-agar) medium
(Luz et al. 2007). Conidia were harvested directly by scraping with a
spatula from the surface of the culture and suspended in 10 ml of
sterile 0.1 % Tween 80 (polyoxyethylene sorbitan monoleate). The
slurry was vortexed for 3 min with glass beads, filtered through
gauze and adjusted with water to defined concentrations based on
hemacytometer counts.
Hyphal bodies were produced using liquid SDY(Sabouraud-
dextrose-yeast extract) medium (Luz et al. 2007). Liquid cultures
were inoculated with 106 conidia/ml in 100 ml SDY in 250 ml
28
Erlenmeyer flasks and grown for 5 d at 25°C and 240 rpm on a rotary
incubator shaker (TE 422, Tecnal). Hyphal bodies were separated
from mycelial biomass by filtration through gauze, then centrifuged
for 5 min at 7,000 x g, washed twice with 50 ml deionized sterile
water, and finally adjusted to defined concentrations as mentioned
for conidia.
The viability of conidia and hyphal bodies (>95%) was
confirmed routinely inoculating 50 μl of suspended 106 propagules/ml
onto SDAY (SDY amended with 18 g agar/L); germination or hyphal
development of 100 propagules was quantified from four separate
areas on the solid medium, 6-24 h after incubation at 25°C and 12 h
photophase.
Origin of mosquitoes and bioassays. The population of A.
aegypti originated from virus-free larvae collected in 1991 in Goiânia,
Brazil, and was reared under laboratory conditions at the IPTSP as
described by Silva et al. (1998). Three to 5-d old eggs were carefully
detached with a hair-pencil from filter paper used by females for
oviposition, and 25 eggs arranged upon sterilized filter paper squares,
1 x 1 cm, folded up at the edges to a height of 1 mm before
sterilization. Prefolded papers with eggs were put on sterile filter
paper in the bottom of a Petri dish and then exposed to ultraviolet
light (UV-C) for 15 minutes in order to reduce microorganisms on
eggs. A harmful effect of UV-C on larvae inside eggs of A. aegypti and
29
their eclosion was excluded previously (Luz and Tai, personal
communication). Eggs were treated topically with 50 μl of suspended
fungal propagules routinely at a final dosage of 5x106
propagules/cm2, or water without added fungus for the controls.
Values of the 50% and 90% eclosion-inhibiting concentrations (EIC50
and EIC90) of conidia and hyphal bodies were obtained testing
concentrations between 5 and 1.65 x 105 propagules/cm2. Eggs were
then dried for one hour at 75 ± 5% relative humidity (RH) and 25°C
(Luz et al. 2007). The dishes were held in a test chamber (40 x 37 x
27 cm) at 25 ± 1°C with constant exposure to >98% RH, in biphasic
humidity regimes with >98% RH followed by 75% RH or with daily
alternations between >98% RH and 75% RH (with increasing
exposures to >98% RH). Relative humidities >98% and 75%, inside
the test chambers, were regulated with a saturated solution of K2SO4
and NaCl, respectively (Winston and Bates 1960). After 24 h pre-
incubation, eggs were examined at 80x magnification, and a total of 5
damaged or intact eggs were removed to leave each cup with 20
visibly intact eggs before continuing the experiments. In the
monophasic approach, egg cups were incubated for increasing periods
(1, 2, 3, 5, 10, 15 and 25 d) at >98% RH. In the biphasic approach
to studying the effects of humidity, eggs were incubated initially for
1, 2, 3, 5, 10 or 15 days at >98% RH and then moved to 75% RH for
the remainder of a total incubation period of 25 d. To test daily
30
alternating regimes of humidities, conidia-treated eggs were exposed
to 0/24; 4/20; 8/16; 12/12; 16/8; 20/4 and 24/0 h at >98/75% RH
for up to 30 d before submersion in water. In all tests, eggs were
checked microscopically for fungal growth before being transferred to
20 ml sterile water in dishes (3.5 cm diam x 5 cm deep). A small
amount of ground cat food (Black Jack, Alisul Alimentos S.A., São
Leopoldo, Rio Grande do Sul, Brazil) was dusted onto the water’s
surface, and containers were held at 25°C, 75 ± 5% RH and 12 h
photophase. Larvae were fed on alternate days as mentioned with
ground cat food; water levels in the cups were refilled to their original
levels daily. Eclosion of larvae was stimulated daily by incubating
cups for 15 minutes in a water bath at 37°C (Luz et al. 2007). The
presence of newly hatched larvae was evaluated 2 h later, and
development and survival of larvae and pupae was examined daily for
up to 10 d after submersion of eggs in water. Four independent
replicates, each replicate using different fungal cultures, were carried
out.
Data analysis. Data of eclosion were arcsine-square root
transformed and then analyzed by analyses of variance (ANOVA) and
the Student-Newman-Keuls (SNK) multiple range test for comparison
of means. Means were considered not statistically different at P
>0.05. Probit analyses to determine the values of EIC50 and EIC90
were conducted on cumulative eclosion.
31
Results
Immediately after treatment few eggs never exceeding a total
of 2 eggs for each batch showed partially eclosed, dead larvae.
Mycelium and newly formed conidia could be detected on eggs
treated with conidia and hyphal bodies, even at lower concentrations
of propagules, after 10 and especially 15 d of constant exposure at >
98% RH, respectively. After submersion of eggs, the first larvae
generally eclosed within a few minutes, and eclosion rates were
highest in the first days after transfer of eggs to water regardless of
treatment with conidia, hyphal bodies or water only or humidity
regimes during incubation (Fig. 1 and 3). Larvae that died after
submersion of eggs in water usually did so during eclosion if they
were not able to free themselves from the egg shell. Larval mortality
never exceeded 12.5%, except for larvae hatching from eggs treated
with hyphal bodies and incubated for 25 d at > 98% RH, where
mortality reached 45 ± 20%. Pupation generally started 5 d after
submerging eggs in water and no dead pupae were found, regardless
of the treatment.
Eclosion in monophasic humidity regime. Cumulative
eclosion 10 d after submersion of control eggs varied between 70 ±
9.4% (± standard error of the mean) (25 d at > 98% RH) and 87.5 ±
7.8% (15 d at > 98% RH), without significant differences among
values found for different lengths of incubation at > 98% RH (F6,21 =
0.67; P = 0.67; Fig. 1). Values of cumulative eclosion of larvae from
32
fungus-treated eggs at the same moment did not differ among each
other or from the controls when eggs were incubated at > 98% RH
for up to 5 d (treated with conidia) or 15 d (treated with hyphal
bodies). Cumulative eclosion of larvae from eggs treated with conidia
decreased significantly when incubated at > 98% RH from 88.8 ± 9.7
% (at 5 d p.i.) to 1.3 ± 1.3% (at 25 d p.i.) (F6,21 = 18.5; P < 0.001),
and for eggs treated with hyphal bodies from 71.3 ± 5.9% (at 15 d
p.i.) to 39 ± 9.9% (at 25 d p.i.) (F6,21 = 3.5; P = 0.014; Fig. 1).
Values of eclosion found for eggs, 10 d after submersion, differed
significantly among treatments with conidia, hyphal bodies or water
only at 15-d and 25-d exposures (F2,9 > 11.3; P ≤ 0.0035).
Eclosion at different concentrations of propagules.
Whereas cumulative eclosion 10 d after submerging eggs in water
was ≥ 68.8 ± 2.4% regardless of the type or concentration of fungal
propagules tested (5 to 1.65x105 propagules/cm2) when treated eggs
were incubated for 10 d at >98% RH, eclosion diminished at higher
concentrations of conidia or hyphal bodies after 15- and 25-d
exposures at >98% RH (Fig. 2). Values of 50% eclosion-inhibiting
concentrations (EIC50) of conidia found at a 15-d (1.4x104
conidia/cm2) and 25-d (2.8x102 conidia/cm2) exposure at > 98% RH
were significantly different from each other based on their values of
95% confidence intervals (Table 1). This was also found for hyphal
bodies with EIC50 values of 2.8x105 and 9.8x102 hyphal bodies/cm2 at
15 and 25 d, respectively. Values of EIC90 for both propagules varied
33
between 3.3x105 conidia/cm2 at 25 d and 3.9x109 hyphal bodies/cm2
at a 15-d exposure at > 98% RH (Table 1). Comparing EIC50 or EIC90
values with their respective 95% confidential intervals (95% C.I.)
obtained with conidia and hyphae, no difference among tested
propagules was found.
Eclosion in biphasic humidity regime. In the series of 25 d
biphasic exposures to periods of > 98% RH followed by 75% RH, the
eclosion of larvae from eggs treated with conidia or hyphal bodies
decreased significantly when eggs were exposed to high humidity for
≥ 10 d, compared to shorter periods, before being moved to low
humidity and then submerged in water (at day 25 post-treatment) for
up to 10 d more (F8,27 ≥ 15; P < 0.001). The lowest cumulative
eclosion rates were found for eggs treated with hyphal bodies and
incubated at >98% RH for the first 15 d (2.5 ± 1.4% eclosion) or for
25 d at > 98% RH (5 ± 2%) or with eggs treated by conidia and
incubated for 25 d at > 98% RH (23.8 ± 6.8%) (Fig. 3). No
significant effect of the propagule type on quantitative eclosion was
found for any of these biphasic humidity regimes (F1,7 = 1.3; P =
0.25).
Whereas there was no effect of humidity regimes (mono- and
biphasic) on the number of larvae eclosing from eggs treated with
conidia and incubated at 10-, 15- and 25-d exposures to >98% RH
(F1,22 = 3.6; P = 0.72), significantly lower values of eclosion were
found at the same periods of incubation at > 98% RH for eggs
34
treated with hyphal bodies and tested in biphasic rather than
monophasic humidity regimes (F1,22 = 44.7; P < 0.001).
Alternating humidities. With daily alternating humidity
regimes (> 98/75% RH) new mycelium developed on eggs incubated
at ≥16 h/d at > 98% RH for 15 d. Eggs held at 24 h/d at > 98% RH
during the same period were already covered with abundant conidia.
Conidia were also found on eggs incubated at 20 h/d at > 98% RH for
at least 20 d. Mycelium but no conidia was detected on eggs held for
16 h/d and 12 h/d at > 98% RH after a 30-d exposure.
Eclosion decreased significantly with increasing exposure time
of eggs at alternating humidities (F3,108 = 13.1; P < 0.0001). The
lowest eclosion values (50 ± 14.6 % and 13.8 ± 7.7% after 15- and
20-d exposures, respectively) were found at 24 h/d at > 98% RH
while eclosion of larvae eventually dropped to ≤1.3 ± 1.3% after 25
and 30 d (Fig. 4). Cumulative eclosion found for other alternating
humidity regimes (≤ 20 h/d at > 98% RH) was significantly higher
compared to values found at 24 h/d at > 98% RH with values varying
between ≥ 82.5% and ≥ 33.8% at 15 and 30 d of exposure,
respectively (F6,21 = 4.2; P > 0.002). These values did not differ
among each other or from the controls at constant 75% RH (93.8%
and 31.3%) and > 98% RH (97.5% and 60%) for the same exposure
times.
35
Discussion
M. anisopliae IP 46, which is effective against A. aegypti larvae
(Silva et al. 2004; Santos, and Luz, personal communication), also
showed strong ovicidal activity against that vector. This and other
fungi have been reported to be active against insect eggs, mainly of
lepidopteran and hemipteran pests (Riba et al. 1983, Maniania 1991,
Romaña and Fargues 1992, Ekesi et al. 2002, Samuels et al. 2002),
dipteran horn flies (Sahagún et al. 2005), mosquitoes (Luz et al.
2007) and also against eggs of mites and ticks (Gindin et al. 2002,
Shi and Feng 2004, Garcia et al. 2005, Wekesa et al. 2006). In other
studies, however, eclosion of mosquito larvae or the grasshopper
Melanoplus sanguinipes (Fab.) was unaffected by exposure of eggs to
B. bassiana (Clark et al. 1968, Inglis et al. 1995).
Activity of IP 46 against A. aegypti eggs depended on an initial
exposure time of treated eggs at relative humidity close to saturation
before submersion in water. An incubation period up to 5 d at high
humidity after application of fungal propagules on eggs was not
sufficient to affect eclosion or survival of larvae, whether or not eggs
were submerged immediately in water or exposed to 75% RH for a
total of 25 d. Under these conditions there was no difference between
treatments with conidia or hyphal bodies. Obviously, neither conidia,
which need about 12 h for high germination levels (Lazzarini et al.
2006), nor hyphal bodies, which may grow immediately and
penetrate the host quicker, had completed invasion of the eggs; the
36
further growth of these fungal stages was impeded by placing treated
eggs at a lower relative humidity. Larvae of A. aegypti exposed to
25°C are fully developed 16-24 h after oviposition and remain
protected inside eggs by a serosal cuticle, a dark endochorion formed
of highly packed flat fibrils, and a colourless exochorion with
tubercules on its surface (Hinton and Service 1969). The egg shell of
A. aegypti seemed to be a strong but penetrable barrier that may
retard fungal invasion compared to eggs of other arthropods. In
another study, eggs of the tick Rhipicephalus sanguineus (Latreille)
that have a distinctly more delicate chorion than aedine eggs were
found with germinating conidia on egg shells 18 h after inoculation of
M. anisopliae conidia and a high number of eggs (92.6%) shown to
be undergoing fungal penetrations after a 5-d exposure (Garcia et al.
2005). IP 46 needed at least 10 d exposure at high moisture in order
to emerge and to initiate new conidiogenesis on eggs. Conidia-treated
A. aegypti eggs after a 10-d exposure at > 98% RH were distinctly
being attacked by M. anisopliae, and the ovicidal activity increased
after longer periods of incubation. For hyphal bodies a clear negative
effect on eclosion could be observed after a 15-d exposure at high
humidity with immediate submersion in water that indicated that egg
penetrations by applied hyphal bodies needed more time at optimal
RH > 98% to affect larvae inside eggs than do conidia. In biphasic
humidity regime tests, treating eggs with either conidia or hyphal
bodies clearly affected eclosion after an initial incubation for ten or
37
more days to > 98% RH before transferring eggs to 75% RH and
then to water. However, in comparison to post-treatment incubations
at only a single relative humidity, activity in biphasic humidity regime
was clearly improved only for hyphal bodies. Demonstrated
differences in ovicidal activities between conidia and hyphal bodies
should be interpreted carefully because conidia were more infective in
monophasic humidity regimes than were hyphal bodies at longer
exposure periods, and no difference of activity related to
concentration could be detected for either propagule type tested at
the same conditions. Albernaz, Tai and Luz (personal communication)
testing oil-in-water formulated conidia and hyphal bodies of the same
isolate found no difference in ovicidal activity between propagules in
A. aegypti, too.
Fungal development on eggs held in alternating
optimal/suboptimal (> 98%/75% RH) regimes suggested that larvae
inside eggs can be negatively affected by daily exposures to 12 or
more hours to > 98% RH after longer periods of incubation before
submerging eggs in water. However, there was no clear effect of the
daily period of exposure to > 98% RH up to 30 d on cumulative
eclosion such as that shown by Fargues and Luz (1998, 2000) with B.
bassiana and Rhodnius prolixus Stål in which high and rapid mortality
of nymphs and fungal development on dead insects was obtained at
daily > 8 h at 97% RH alternating with lower humidities for 5 d.
Conditions of high moisture in deep emarginations on the crumpled
38
nymph integument, where propagules develop before penetrating the
cuticle, are probably maintained over a longer period after transfer of
the insects from humidity close to saturation to lower humidities than
this happen on the flatter surface of the egg shell, where fungal
propagules are exposed more directly to ambient humidity. Recent
studies showed an increased activity of oil-formulated conidia of IP 46
with a distinct reduction of eclosing larvae from A. aegypti eggs held
at minimal daily > 16 h at > 98% RH alternating with 75% RH for 10
d (Albernaz, Tai and Luz, personal communication).
Our results were based on evaluation of larval eclosion, and
the lack of eclosion does not disprove survival of a larva inside the
egg. Eclosion was generally highest in the first days after submersion
of eggs in water but rarely reached 100%, even in the control, within
10 d of submersion. About 10–30% of the larvae opted to remain
inside eggs, and this may have happen also with larvae in fungus-
treated eggs. Larvae inside eggs may perceive the fungus or fungal
metabolites on the egg shell, in the vicinity of oviposition or in the
water after submersion and retarded eclosing. The elevated larval
mortality (45 ± 20%) found for eggs treated with hyphal bodies and
incubated for 25 d at > 98% RH indicated that larvae may be infected
and hatch but succumb to fungal infection during subsequent post-
hatching development. It is noteworthy that eclosion was affected by
low concentrations of propagules but inhibition of hatching was not
total even at the highest concentrations and periods of exposure
39
tested. A total inhibition of eclosion of A. aegypti was found only with
oil-formulated IP 46 conidia applied on eggs and incubated at > 98%
RH for 25 d (Albernaz, Tai and Luz, personal communication). In
addition, other factors may influence whether larvae eclose after
contact of eggs with water. Hatching rates from Aedes spp eggs were
shown to depend on temperature, nutrients in the water, larval
density, microorganisms and changes in dissolved oxygen
concentration (Livdahl et al. 1984, Edgerly and Marvier 1992).
The results clearly showed that humidity is a limiting factor for
activity of M. anisopliae against A. aegypti eggs. Whereas exposure to
lower humidities (43%, 75%, 75% and 86% RH) had no effect on
eclosion of A. aegypti larvae from eggs treated with IP 46 even after
extended incubation up to 6 months (Luz et al. 2008) larvae inside
eggs were highly susceptible to fungal infection at a humidity close to
saturation. Prolonged high humidities in breeding sites can occur
routinely during the rainy season, but levels of humidities favorable
for fungal development on eggs may also exist in subterranean
canalizations where female aedines may tend to oviposit during
periods of low rainfall. Locations with high humidity that are also
protected from UV light and extreme temperatures where females
oviposit offer good conditions for the application and successful
activity of M. anisopliae and an effective biological control of A.
aegypti.
40
Acknowledgments
We thank Carmeci N. Elias for rearing the mosquitoes and
Richard A. Humber for the critical review of the manuscript.
References Cited
Alves, S.B., L.F.A. Alves, R.B. Lopes, R.M. Pereira and S.A Vieira.
2002. Potential of some Metarhizium anisopliae isolates for control of
Culex quinquefasciatus (Dipt., Culicidae). J. Appl. Entomol. 126: 504-
509.
Braga, I.A., C.B. Mello, I.R. Montella, J.B.P. Lima, A. de J. Martins
Júnior, P.F.V. Medeiros and D. Valle. 2005. Effectiveness of
methoprene, an insect growth regulator, against temephos-resistant
Aedes aegypti populations from different Brazilian localities, under
laboratory conditions. J. Med. Entomol. 42: 830-837.
Clark, T.B., W.R. Kellenellen, T. Fukuda and J.E. Lindgren. 1968. Field
and laboratory studies of the pathogenicity of the fungus Beauveria
bassiana to three genera of mosquitoes. J. Invertebr. Pathol. 11: 1-7.
Derakhshan, A., R.J. Rabindra and B. Ramanujam. 2007. Efficacy of
different isolates of entomopathogenic fungi against Brevicoryne
brassicae (Linnaeus) at different temperatures and humidities. J. Biol.
Control 21: 65-72.
41
Edgerly, J.S. and M.A. Marvier. 1992. To hatch or not to hatch ? Egg
hatch response to larval density and to larval contact in a treehole
mosquito. Ecol. Entomol. 17: 28-32.
Ekesi, S., R.S. Adamu and N.K. Maniania. 2002. Ovicidal activity of
entomopathogenic Hyphomycetes to the legume pod borer, Maruca
vitrata and the pod sucking bug, Clavigralla tomentosicollis. Crop
Prot. 21: 589-595.
El Damir, M. 2006. Variation in germination, virulence and conidial
production of single spore isolates of entomopathogenic fungi in
response to environmental heterogeneity. J. Biol. Sci. 6: 305-315.
Fargues, J. and C. Luz. 1998. Effects of fluctuating moisture and
temperature regimes on sporulation of Beauveria bassiana on
cadavers of Rhodnius prolixus. Biocontrol Sci. Technol. 8: 323-334.
Fargues, J. and C. Luz. 2000. Effects of fluctuating moisture and
temperature regimes on the infection potential of Beauveria bassiana
for Rhodnius prolixus. J. Invertebr. Pathol. 75: 202-211.
Garcia, M.V., A.C. Monteiro, S.M.J. Pablo, N. Prette and G.H. Bechara.
2005. Mechanism of infection and colonization of Rhipicephalus
sanguineus eggs by Metarhizium anisopliae as revealed by scanning
microscopy and histopathology. Braz. J. Microbiol. 36: 368-372.
42
Gindin, G., M. Samish, G. Zangi, A. Mishoutchenko and I. Glazer.
2002. The susceptibility of different species and stages of ticks to
entomopathogenic fungi. Exp. Appl. Acarol. 28: 283-288.
Hinton, H.E. and M.W. Service. 1969. The surface structure of aedine
eggs as seen with the scanning electron microscope. Ann. Trop. Med.
Parasitol. 63: 409-411.
Inglis, G.D., R.P. Feniuk, M.S. Goettel and D.L. Johnson. 1995. Mortality
of grasshoppers exposed to Beauveria bassiana during oviposition and
nymphal emergence. J. Invertebr. Pathol. 65: 139-146.
Kanzok, S.M. and M.J. Lorena. 2006. Entomopathogenic fungi as
biological insecticides to control malaria. Trends Parasitol. 22: 49-51.
Kumar, R. and J.S. Hwang. 2006. Larvicidal efficiency of aquatic
predators: a perspective for mosquito biocontrol. Zool. Stud. 45:
447-466.
Lazzarini, G.M.J., L.F.N. Rocha and C. Luz. 2006. Impact of moisture
on in vitro germination of Metarhizium anisopliae and Beauveria
bassiana and their activity in Triatoma infestans. Mycol. Res. 110:
458-492.
Livdahl, T.P., R.K. Koenekoop and S.G. Futterweit. 1984. The
complex hatching response of Aedes eggs to larval density. Ecol.
Entomol. 9: 437-442.
43
López Lastra, C.C., J.J. Garcia and M.V. Micieli. 2002. Microecology of
entomopathogenic fungi from aquatic environments. Doc. Embrapa
Soja 184: 83-85.
Luz, C. and J. Fargues. 1998. Factors affecting conidial production of
Beauveria bassiana from fungus-killed cadavers of Rhodnius prolixus.
J. Invertebr. Pathol. 72: 97-103.
Luz, C. and J. Fargues. 1999. Dependence of the entomopathogenic
fungus Beauveria bassiana, on high humidity for infection of Rhodnius
prolixus. Mycopathologia 146: 33-41.
Luz, C., M.H.H. Tai, A.H. Santos, L.F.N. Rocha, D.A.S. Albernaz and
H.H.G.Silva. 2007. Ovicidal activity of entomopathogenic
Hyphomycetes on Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) under laboratory
conditions. J. Med. Entomol. 44: 799-804.
Luz, C., M.H.H. Tai, A.H. Santos and H.H.G.Silva. 2008. Impact of
moisture on survival of Aedes aegypti eggs and ovicidal activity of
Metarhizium anisopliae under laboratory conditions. Mem. Inst.
Oswaldo Cruz 103: 214-215.
Maniania, N.K. 1991. Susceptibility of Chilo partellus Swinhoe (Lep.,
Pyralidae) eggs to entomopathogenic Hyphomycetes. J. Appl.
Entomol. 112: 53-58.
44
Polanczyk, R.A., M.O. Garcia and S.B. Alves. 2003. Potencial de
Bacillus thuringiensis israelensis Berliner no controle de Aedes
aegypti. Rev. Saúde Pub. 37: 813-816.
Riba, G., S. Marchandier, G. Richard and I. Larget. 1983. Sensibilité
de la pyrale du mais (Ostrinia nubilialis) (Lep.: Pyralidae) aux
Hyphomycetes entomopathogènes. Entomophaga 28: 55-64.
Romaña, C.A. and J. Fargues. 1992. Relative susceptibility of different
stages of Rhodnius prolixus to the entomopathogenic hyphomycete
Beauveria bassiana. Mem. Inst. Oswaldo Cruz 87: 363-368.
Russell, B.M., B.H. Kay and W. Shipton. 2001. Survival of Aedes
aegypti (Diptera: Culicidae) eggs in surface and subterranean
breeding sites during the Northern Queensland dry season. J. Med.
Entomol. 38: 441-445.
Sahagún, C.A.A., R.L. Gutiérrez, J.M. Ochoa, E.G. Velasco, M.L.
Edwards, O.R. Dominguez, C.C. Vázquez, W.P.R. Velázquez, S.R.
Skoda and J.E. Foster. 2005. Susceptibility of biological stages of the
horn fly, Haematobia irritans, to entomopathogenic fungi
(Hyphomycetes). J. Insect Science 5, 50, available online:
www.insectscience.org/papers/2005.
45
Samuels, R.I., D.L.A. Coracini, C.A.M. Santos and C.A.T. Gava. 2002.
Infection of Blissus antillus (Hemiptera: Lygaeidae) eggs by the
entomopathogenic fungi Metarhizium anisopliae and Beauveria
bassiana. Biol. Control 23: 269–273.
Scholte, E.J., B.N. Njiru, R.C. Smallegange, W. Takken and B.G.J.
Knols. 2003. Infection of malaria (Anopheles gambiae s.s.) and
filariasis (Culex quinquefasciatus) vectors with the entomopathogenic
fungus Metarhizium anisopliae. Malar. J. 2: 29-37.
Scholte, E.J., B.G.J. Knols, R.A. Samson and W. Takken. 2004.
Entomopathogenic fungi for mosquito control: A review. 24 pp. J.
Insect Sci. 4, 19, available online: www.insectscience.org/4.19.
Scholte, E.J., W. Takken and B.G.J. Knols. 2007. Infection of adult
Aedes aegypti and Ae. albopictus mosquitoes with the
entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae. Acta Trop. 102:
151-158.
Shi, W.B. and M.G. Feng. 2004. Lethal effect of Beauveria bassiana,
Metarhizium anisopliae, and Paecilomyces fumosoroseus on the eggs
of Tetranychus cinnabarinus (Acari: Tetranychidae) with a description
of a mite egg bioassay system. Biol. Control 30: 165–173.
Silva, H.H.G., I.G. Silva and K.S. Lira. 1998. Metodologia de criação,
manutenção de adultos e estocagem de ovos de Aedes aegypti
(Linnaeus, 1762) em laboratório. Rev. Pat. Trop. 27: 53-63.
46
Silva, R.O., H.H.G. Silva and C. Luz. 2004. Effect of Metarhizium
anisopliae isolated from soil samples of the central Brazilian Cerrado
against Aedes aegypti larvae under laboratory conditions. Rev. Pat.
Trop. 33: 207-216.
Silva, R.O., H.H.G. Silva, C.J. Ulhoa and C. Luz. 2005. Is there a
relationship between N-acetyl-beta-D-glucosaminidase activity of
Metarhizium anisopliae (Metschn.) Sorokin (Hyphomycetes) isolates
from peridomestic areas in Central Brazil and larvicidal effect on Aedes
aegypti (L.) (Diptera, Culicidae)? J. Appl. Entomol. 129: 158-164.
Wekesa, V.W., M. Knapp, N.K. Maniania and H.I. Boga. 2006. Effects
of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae on mortality,
fecundity and egg fertility of Tetranychus evansi. J. Appl. Entomol.
130: 155-159.
Winston, P.W. and D.H. Bates. 1960. Saturated solutions for the
control of humidity in biological research. Ecol. 41: 232-237.
47
Fig. 1. Eclosion (%) of Aedes aegypti larvae, up to 10 d after
submersion of eggs in water and incubation at 25°C. Eggs treated
with Metarhizium anisopliae IP 46 (5 x 106 conidia or hyphal
bodies/cm2) or water only (control) had been incubated before at
increasing periods (1, 2, 3, 5, 10, 15 and 25 d) at > 98% RH and
25°C and were then submerged in water.
Fig. 2. Cumulative eclosion (%) of Aedes aegypti larvae, 10 d after
submersion of eggs in water and incubation at 25°C. Eggs had been
treated before with conidia or hyphal bodies of Metarhizium anisopliae
IP 46 (5 up to 1.65 x 105 propagules/cm2) and incubated for 10, 15
and 25 d at > 98% RH and 25°C.
Fig. 3. Eclosion (%) of Aedes aegypti larvae, up to 10 d after
submersion of eggs in water and incubation at 25°C. Eggs treated
with Metarhizium anisopliae IP 46 (5 x 106 conidia or hyphal
bodies/cm2) were first exposed to increasing periods (0, 1, 2, 3, 5,
10, 15 and 25 d) at > 98% RH and then at 75% RH up to a total of
25 d before submersion in water.
Fig. 4. Cumulative eclosion (%) of Aedes aegypti larvae, 10 d after
submersion of eggs in water and incubation at 25°C. Eggs had been
treated before with conidia of Metarhizium anisopliae IP 46 (5 x 106
conidia/cm2) and incubated for 15, 20, 25 and 30 d at daily
alternating regimes of humidity with 0/24; 4/20; 8/16; 12/12; 16/8;
20/4; and 24/0 h at > 98/75% RH.
48
49
50
51
52
Table 1. Eclosion inhibiting concentrations (EIC50 and EIC90)
(conidia and hyphal bodies per cm2) with respective confidential
intervals (95% C.I.) and slopes (± standard error) to inhibit 50% or
90% eclosion of Aedes aegypti larvae, treated directly with
Metarhizium anisopliae IP 46, 15 and 25 days after exposure of eggs
to 25°C and > 98% relative humidity and subsequent submersion in
water for 10 days.
Days at >98%
RH Treatment EIC50 (95% C.I.) EIC90 (95% C.I.)
Slope ± SE
15 conidia 1.4 x 104 (5.7 x 103-4.8 x 104)
4.5 x 106 (6.6 x 105-1.6 x 108)
0.51 ± 0.08
hyphal bodies
2.8 x 105 (3.8 x 104-2.6 x 107)
3.9 x 109 (3.6 x 107-5.7 x 1014)
0.31 ± 0.07
25 conidia 2.8 x 102 (81.2-7.6 x 102)
3.3 x 105 (5.6 x 104-8.4 x 106)
0.42 ± 0.07
hyphal bodies
9.8 x 102 (3.8 x 102-2.4 x 103)
7.9 x 105 (2.1 x 105-5.5 x 106)
0.44 ± 0.05
20 eggs of four independent replicates each were topically treated
with 50 μl of suspended propagules (5 to 1.65 x 10 5
propagules/cm2); cumulative eclosion of control larvae from eggs
treated with water only was > 90%, 10 d after submersion in water.
53
5 CONCLUSÕES
Os resultados obtidos sugerem que M. anisopliae IP 46 tem
potencial para contribuir para o controle de A. aegypti.
A atividade ovicida de M. anisopliae em A. aegypti está limitada
pela umidade relativa, que deve ser considerada antes da aplicação.
O tempo de exposição de ovos tratados em UR > 98%, é também
um fator essencial na atividade ovicida.
Em umidades relativas < 98% esse fungo não teve atividade
ovicida, quando propágulos foram suspendidos em água, mesmo após
exposição prolongada. Outras medidas de controle devem ser
consideradas.
54
6 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Deve ser esclarecido se M. anisopliae pode atuar em larvas, dentro
dos ovos em umidades inferiores a 98% e > 86%.
Testes sobre as condições microclimáticas em criadouros
domiciliares e testes de campo em criadouros peridomiciliares com M.
anisopliae irão esclarecer melhor o potencial desse fungo para controle de
A. aegypti.
55
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Almeida JEM, Batista Filho A 2001. Banco de microrganismos entomopatogênicos. Rev Biotecnol Ciênc Desenvolvimento 20: 30-33. Alves SB 1998. Controle Microbiano de Insetos. Piracicaba FEALQ: pp 1163. Alves SB, Marchini LC, Pereira RM, Baumgratz LL 1996. Effects of some insect pathogens on the africanized honey bee, Apis mellifera L. (Hym., Apidae). J Appl Entomol 97: 127-129. Alves SB, Alves LFA, Lopes RB, Pereira RM, Vieira SA 2002. Potential of some Metarhizium anisopliae isolate for control of Culex quinquefasciatus (Dipt., Culicidae). J Appl Entomol 126: 504-509. Alves SB, Lopes RB 2008. Controle Microbiano de Pragas na América Latina Avanços e Desafios. Piracicaba FEALQ: pp 414. Aly C, Mulla MS, Federici BA 1985. Sporulation and toxin production by Bacillus thuringiensis var. israelensis in cadavers of mosquito larvae (Diptera: Culicidae). J Invertebr Pathol 46: 251-258. Angel SCA, Lezama GR, Molina OJ, Galindo VE, López EM, Rebolledo DO, Cruz VC, Reyes VWP, Skoda SR, Foster JE 2005. Susceptibility of biological stages of the horn fly, Haematobia irritans, to entomopathogenic fungi (Hyphomycetes). J Insect Sci 5: 50-55 Araújo AP, de Melo-Santos MAV, Carlos SO, Rios EMMM, Regis L 2007. Evaluation of an experimental product based on Bacillus thuringiensis sorovar. israelensis against Aedes aegypti larvae (Diptera: Culicidae). Biol Control 41: 339-347. Austwick PKC 1980. The pathogenic aspects of the use of fungi: The need for risk analysis and registration of fungi. Ecol Bull 31: 91-102. Batista Filho A, Almeida JEM, Santos AS, Machado LA, Alves SB. 2003. Eficiência de isolados de Metarhizium anisopliae no controle de cigarrinha
56
da raiz da cana de açúcar Mahanarva fimbriolata (Hom: Cercopidae). Arq Inst Biol São Paulo 70: 309-314 Batta YA 2003. Production and testing of novel formulations of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae (Metschinkoff) Sorokin (Deuteromycotina: Hyphomycetes). Crop Protection 22: 415-422. Becker N, Ascher KRS 1998. The use of Bacillus thuringiensis subsp. israelensis (Bti) against mosquitoes, with special emphasis on the ecological impact. Israel J Entomol 32: 63-69. Benz G 1991. Environment In: John Wiley and Sans editors. Epizoology of Insects Diseases 177- 214. Borges RA, Cavasin GMO, Silva IG, Arruda W, Oliveira ESF, Silva HHG, Martins F 2004. Mortalidade e alterações morfológicas provocadas pela ação inibidora do diflubenzuron na ecdise de larvas de Aedes aegypti (Diptera, Culicidae). Rev Pat Trop 33: 91-104. Braga FR, Araújo JV, Campos AK, Carvalho RO, Silva AR, Tavela AO, Maciel AS 2007. In vitro observation of the action of isolates of the fungi Duddingtonia flagrans, Monacrosporium thaumasium and Verticillium chlamydosporium on the eggs of Ascaris lumbricoides (Linnaeus, 1758). Rev Soc Bras Med Trop 40: 356-358. Braga IA, Mello CB, Reis I, Lima JBP, Martins Junior AJ, Medeiros PFV, Valle D 2005. Effectiveness of methoprene, an insect growth regulator, against temephos-resistant Aedes aegypti populations from different Brazilian localities, under laboratory conditions. J Med Entomol 42: 830-837. Braga IA, Valle D 2007. Aedes aegypti: inseticidas, mecanismos de ação e resistência. Epidemiol Serv Saúde 16: 279-293. Brigues LL, Colwell DD, Wall R 2006. Control of the cattle louse Bovicola bovis with the fungal pathogen Metarhizium anisopliae Vet Parasitol.142: 344-349. Broza M, Pereira RM, Stimac JL 2001. The nonssuscetibility of soil Collembola to insect pathogens and their potential as scavengers of microbial pesticides. Pedobiol 45: 523-534.
57
Butt TM, Carreck NL, Ibrahim L. Williams IH 1998. Honey bee mediated infection of polen beetle (Meligethes aeneus Fab.) by insect–pathogenic fungus Metarhizium anisopliae. Biocont Sci Technol 8:533-538. Camargo MF, Santos AH, Oliveira AWS, Abraão N, Alves RBN, Isac E 1998. Avaliação da ação residual do larvicida do temefos sobre o Aedes aegypti (Diptera, Culicidae) em diferentes tipos de recipientes. Rev Pat Trop 27: 65-70. Chapagain BP, Saharan V, Wiesman Z 2008. Larvicidal activity of saponins from Balanites aegyptiaca callus against Aedes aegypti mosquito. Bioresour Technol 99: 1165-1168. Chapman HC 1974. Biological control of mosquito larvae. Annu Rev Entomol 19: 33-59. Chavasse DC, Yap HH 1997. Chemical methods for the control of vectors and pests of public health importance. Geneve:WHO/CTD/WHOPES Cheng SS, Chang HT, Chang ST, Tsai KH, Chen WJ 2003. Bioactivity of selected plant essential oils against the yellow fever mosquito Aedes aegypti larvae. Bioresour Technol 89: 99-102. Chernaki AM, Sosa-Gomez DR, Almeida LM 2007. Selection for entomopathogenic fungi and LD50 of Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok. for the lesser mealworm Alphitobius diaperinus (Panzer) (Coleoptera: Tenebrionidae). Brazilian J Poult Sci 9: 187-191. Ciccia G, Coussio J, Mongelli E 2000. Insecticidal activity against Aedes aegypti larvae of some medicinal South American plants. J Ethnopharmacol 72: 185-189. Clark TB, Kellen WR, Fukuda T, Lindgren JE 1968. Field and laboratory studies of the pathogenicity of the fungus Beauveria bassiana to three genera of mosquitoes. J Invertebr Pathol 11: 1-7. Coria C, Almiron W, Valladares G, Carpinella C, Ludueña F, Defago M, Palacios S 2008. Larvicide and oviposition deterrent effects of fruit and leaf extracts from Melia azadarach L. on Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae). Bioresour Technol 9: 3066-3070.
58
Cunha MP, Lima JBP, Brogdon WG, Moya GE, Valle D 2005. Monitoring of resistance to the pyrethroid cypermethrin in Brazilian Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) populations collected between 2001 and 2003. Mem Inst Oswaldo Cruz 100: 441-444. Daoust RA, Ward MG, Roberts DW 1982. Effect of formulation on the virulence of Metarhizium anisopliae conidia against mosquito larvae. J Invertebr Pathol 40: 228-236. Daoust RA, Roberts DW 1983a. Studies on the prolonged storage of Metarhizium anisopliae conidia: effect of temperature and relative humidity on conidial viability and virulence against mosquitoes. J Invertebr Pathol 41: 143-150. Daoust RA, Roberts DW 1983b. Studies on the prolonged storage of Metarhizium anisopliae conidia: effect of growth substrate on conidial survival and virulence against mosquitoes. J Invertebr Pathol 41: 161-170. de Melo DR, Reis RC, Bittencourt VR 2006. In vitro patogenicity of the fungi Metarhizium anisopliae (Metschnikoff, 1879) Sorokin, 1883, on the tick Boophilus microplus (Canestrini 1887). Rev Bras Parasitol Vet 15: 157-162. Destéfano RHR 2003. Detecção e identificação de Metarhizium anisopliae em larvas de Diatraea saccharalis por primers específicos. Tese de Doutorado, Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz", Piracicaba, SP: pp 87. Edgerly JS, Marvier MA 1992. To hatch or not to hatch? Egg hatch response to larval density and to larval contact in a treehole mosquito. Ecol Entomol.17: 28-32. Eiras AE 2001. Mediadores químicos entre hospedeiros e insetos vetores de doenças médico – veterinárias In: Vilela EE & Della Lucia TMC editores. Feromônios de insetos: 99-112. Ekesi S, Adamu RS, Maniania NK 2002. Ovicidal activity of entomopathogenic Hyphomycetes to the legume pod borer, Maruca vitrata and the pod sucking bug, Clavigralla tomentosicollis Crop Prot 21: 589-592.
59
Ekesi S, Maniania NK, Lux AS 2003. Effect of soil temperature and moisture on survival and infectivity of Metarhizium anisopliae to four tephritid fruit fly puparia. J Invertebr Pathol 83: 157-167. Fargues J, Duriez T, Andriev S, Popeye R, Robert P 1975. Étude immunologique comparée de souches de Metarhizium anisopliae sien champignon hyphomycète entomopathogène. Comptes Rendus Hebd Séance l’Acad Sciences 281: 1781-1784. Fargues J, Luz C 1998. Effects of fluctuating moisture and temperature regimes on sporulation of Beauveria bassiana on cadavers of Rhodnius prolixus. Bio Science Tecnol 8: 323-334. Fargues J, Luz C 2000. Effects of fluctuating moisture and temperature regimes on the infection potential of Beauveria bassiana for Rhodnius prolixus. J Invertebr Pathol.75: 202-211. Federici BA, Park HW, Bideshi DK, Wirth MC, Johnson JJ, Sakano Y, Tang M 2007. Developing recombinant bacteria for control of mosquito larvae. J Am Mosq Control Assoc 23: 164-175. Fernandes PM, Alves SB 1991. Controle de Cornitermes cumulans (Kollar, 1832) Isoptera: Termitidae) com Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. e Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok. em condições de campo. An Soc Entomol Brasil 20: 45-49. Fernández LE, Pérez C, Segovia L, Rodríguez MH, Gill SS, Bravo A, Soberón M 2005. Cry11Aa toxin from Bacillus thuringiensis binds its receptor in Aedes aegypti mosquito larvae through loop α-8 of domain II. FEMS Letters 579: 3508-3514. Ferré J, Van Rie J 2002. Biochemistry and genetics of insect resistance to Bacillus thuringiensis. An Rev Entomol 47: 501-533. Ferreira ML, Cavalcanti CG, Coelho CA, Mesquita SD 2005. Neurological manifestations of dengue: study of 41 cases. Arq Neuropsiquiatr 63: 488-493. Foley DH, Rueda LM, Wilkerson RC 2007. Insight into global mosquito biogeography from country species records. J Med Entomol 44: 554-567.
60
Franco O 1969. A história da febre amarela no Brasil. Rev Bras Malariol Doenças Trop 21:317. Fundação Nacional de Saúde 2002. Programa Nacional de Controle da Dengue (PNCD). Brasília - DF Fuxa JR 1995. Ecological factors critical to the exploitation of entomopathogens in pest control. In: Hall FR, Barry JW, editores. Biorational pest control agents. Am Chemical Soc (ACS) Symposium Series 595, Washington, DC. 42-67. Garcia MV, Monteiro AC, Szabo MJP, Pretti N, Bechara GH 2005. Mechanism of infection and colonization of Rhipicephalus sanguineus eggs by Metarhizium anisopliae as revealed by scanning eletron microscopy and histopathology. Braz J Microbiol 36: 368-372. Geetha I, Paily KP, Padmanaban V, Balaraman K 2003. Oviposition response of the mosquito, Culex quinquefasciatus to the secondary metabolite(s) of the fungus, Trichoderma viride. Mem Inst Oswaldo Cruz 98: 223-226. Genthener FJ, Chancy CA, Couch JA, Foss SS, Middauugh DP, Geoge SE, Warren MA, Bantle JA 1998. Toxicity and pathogenicity testing of the insect pest control fungus Metarhizium anisopliae. Arch Environ Contam Toxicol.35: 317-324. Gindin G, Samish M, Zangi G, Mishoutchenko A, Glazer I 2002. The susceptibility of different species and stages of ticks to entomopathogenic fungi. Exp Appl Acarol 28: 283-288. Goettel MS 1988. Pathogenesis of the Hyphomycete Tolypocladium cilindrosporum in the mosquito Aedes aegypti.J Invertebr Pathol. 51: 259-274. Goettel MS, Hajek AE, Siegel JP, Evans HC 2001. Safety of fungal biocontrol agents. In: Butt TM, Jackson C, Magan N, editors. Fungi as biocontrol agents: progress, problems and potential: 347-376. Gortari C, Cazau C, Hours R 2007. Nematophagous fungi of Toxocara canis eggs in a public park of La Plata, Argentina. Rev Iberoam Micol 24: 24-28.
61
Gubler DJ 2005. The emergence of epidemic dengue fever and dengue hemorrhagic fever in the Americas: a case of failed public health policy. Pan Am J Pub Health 17: 22 -24. Hajek AE, St. Leger RJ 1994. Interactions between fungal pathogens and insects host. Annu Rev Entomol 39: 293-322. Hajek AE, Mc Manus ML, Junior ID 2007. A review of introductions of pathogens and nematods for classical biological control of insects and mites. Biol Control 41: 1-13 Halstead SB 1993. Global epidemiology of dengue: health systems in disarray. Trop Med 35: 137-146. Halstead SB 2008. Dengue virus-mosquito interactions. Annu Rev Entomol 53: 273-291. Hemingway J, Ranson H 2000. Insecticide resistance in vectors of human disease. Annu Rev Entomol 45: 371-391. Hibbet DS, Binder M, Bischoff JF, Blackwell M, Cannon PF, Eriksson OE, Huhndorf S, James T, Kirk PM, Lucking R, Lumbsch HT, Lutzoni F, Matheny PB, Mclaughlin DJ, Powel MJ, Redhead S, Schoch CL, Spatafora JW, Stalpers JA, Vilgalys R, Aime MC, Aproot A, Bauer R, Begerow D, Benny GL, Castlebury LA, Crous PW, Dai YC, Gams W, Geiser DM, Griffith GW, Gueidan C, Hawksworth DL, Hestmark G, Hosaka K, Humber RA, Hyde KD, Ironside JE, Köljalg U, Kurtzman CP, Larsson KH, Lichtwardt R, Longcore J, Miadlikowska J, Miller A, Moncalvo JM, Standridge SM, Oberwinkler F, Parmasto E, Reeb V, Rogers JD, Roux C, Ryvarden L, Sampaio JP, Schubler A, Sugiyama J, Thorn RG, Tibell L, Untereiner WA, Walker C, Wang Z, Weir A, Weiss M, White MM, Winka K, Yao YJ, Zhang N 2007. A higher – level phylogenetic classification of the Fungi. Mycol Research. 509 -547. Hoy JB 1985. Experimental mass-rearing of the mosquitofish, Gambusia affinis. J Am Mosq Control Assoc 1: 295-298. Humber RA 2008. Evolution of entomopathogenicity in fungi. J Invertebr Pathol doi:10.1016/j.jip.2008.02.017 Ignoffo CM 1973. Effects of entomopathogens on vertebrates. Ann New York Acad Sci 217: 141-172.
62
Inglis GD, Goettel MS, Butt TM, Strasser H 2001. Use of hyphomycetous fungi for managing insect pest. In: Butt TM, Jackson C, Magan N, editors. Fungi as biocontrol agents: progress, problems and potential: 23- 69.
Jaborowska M, Kuzna GW, Mazurkiewicz ZK 2006.The influence of the Metarhizium fungi on the embryonic development of Ascaris suum. Ann Acad Med Stetin 52: 19-23.
Juliano AS, O’Meara GF, Morrill Jr, Cutwa MM 2002. Desiccation and thermal tolerance of eggs and the coexistence of competing mosquitoes. Oecologia 130: 458-469.
Kanzok MS, Lorena JM 2006. Entomopathogenic fungi as biological insecticides to control malaria. Trends Parasitol 22: 1-3
Kay BH, Ryan PA, Russell BM, Holt JS, Lyons SA, Foley PN 2000. The importance of subterranean mosquito habitat to arbovirus vector control strategies in north Queensland, Australia. J Med Entomol 37: 846-853.
Kaya HK, Gaugler R 1993. Entomopathogenic nematodes. Annu Rev Entomol 38: 181-206.
Khachatourians GG 1991. Phisiology and genetics of entomopathogenic fungi In: Arora DKK, Ajello L, Hukesji KG editors: Handbook of Apllied Mycology Humans, Animals and Insects .613- 663.
Khachatourians GG 1998. Biochemistry and molecular biology of entomopathogenic fungi. In: Howard DH, Miller JD, editores. The Mycota, vol VI: Human and Animal Relationships. Berlin: 331-363.
Khawaled K, Cohen T, Zaritsky A 1992. Digestion of Bacillus thuringiensis var. israelensis spores by larvae of Aedes aegypti. J Invertebr Pathol 59: 186-189.
Knols BGJ, Thomas MB 2006. Fungal entomopathogens for adult mosquito control – a look at the prospect. Outlooks Pest Manag 17: 257-259.
Koenraadt CJM, Harrington 2006. Flushing effect of rain on container – inhabiting mosquitoes Aedes aegypti and Culex pipiens (Diptera: Culicidae) J Med Entomol 45: 28-35
63
Lacey CM, Lacey LA, Roberts DR 1988. Route of invasion and histopathology of Metarhizium anisopliae in Culex quinquefasciatus. J Invertebr Pathol 52: 108-118. Lacey CM, Shapiro – Ilan DI 2008. Microbial control of insect pests in temperate orchard systems: potential for incorporation into IPM. Annu Rev Entomol. 53: 121-124. Lazzarini GMJ, Rocha LFN, Luz C 2006. Impact of moisture on in vitro germination of Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana and their activity on Triatoma infestans. Mycol Res 110: 485-492. Lecuona RE, Rodriguez J, La Rossa FR 2005. Effect of constant and cyclical temperatures on the mortality of Triatoma infestans (Klug) (Hemiptera: Reduviidae) treated with Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. (Hyphomycetes). Neotrop Entomol 34: 675-679. Leemon DM, Jonsson NN 2008. Laboratory studies on Australian isolates of Metarhizium anisopliae as a biopesticide for the cattle tick Boophilus microplus. J Invertebr Pathol 97: 40-49. Legner EF 1995. Biological control of Diptera of medical and veterinary importance. J Vector Ecol 20: 59-120. Livdahl TP, Koenekoop RK, Futterweit SG 1984. The complex hatching response of Aedes eggs to larval density. Ecol Entomol 9: 437-442. Lima JTF 1985. Risco de reurbanização da febre amarela no Brasil. Cad Saúde Pública 1: 377-384 Lima JBP, Cunha MP, Carneiro-da-Silva R Jr, Galardo AK, Soares SS, Braga IA, Ramos RP, Valle D 2003. Aedes aegypti resistance to organophosphates in several localities at Rio de Janeiro and Espírito Santo States, Brazil. Am J Trop Med Hyg 68: 329-333. Lima MM, Aragão MB 1987. Tratamento focal e perifocal contra Aedes aegypti. Cad Saúde Pública 2:142-147.
64
Lopes RB, Alves SB, Padulla LF, Pérz CA 2007. Efficiency of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae formulations on Amblyomma cajennense (Fabricius, 1787) nymphae. Rev Bras Parasitol Vet 16: 27-31. López Lastra CC, Garcia JJ, Micieli MV 2002. Microecology of entomopathogenic fungi from aquatic environments. Doc Embrapa Soja 184: 83-85. Luz C, Fargues J 1998. Factors affecting conidial production of Beauveria bassiana from fungus killed cadavers of Rhodnius prolixus. J Invertebr Pathol 72: 97-103. Luz C, Fargues J 1999. Dependence of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana on high humidity for infection of Rhodnius prolixus. Mycopathol 146: 33-41. Luz C, Tigano MS, Silva IG, Cordeiro CMT, Aljanabi SM 1998. Selection of Beauveria bassiana and Metharizium anisopliae isolates to control Triatoma infestans. Mem Inst Oswaldo Cruz 93: 839-846. Luz C, Silva IG, Magalhães BP, Cordeiro CMT, Tigano MS 1999. Control of Triatoma infestans (Klug) (Reduviidae; Triatominae) with Beauveria bassiana (Bals) (Vuil). Preliminary assay on formulation and application in the field. An Soc Ent Brasil 28: 101-110. Luz C, Rocha LFN, Humber RA 2003. Record of Evlachovaea sp (Hyphomycetes) on Triatoma sordida in the State of Goiás, Brazil, and its activity against Triatoma infestans (Reduviidae, Triatominae). J Med Entomol 40: 451-454. Luz C, Rocha LFN, Nery GV, Magalhães BP, Tigano, MS 2004. Activity of oil – formulated Beauveria bassiana against Triatoma sordida in peridomestic áreas in Central Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz 99: 211-218. Luz C, Batagin I 2005. Potential of oil based formulations of Beauveria bassiana to control Triatoma infestans. Mycopathol 160: 51-62. Luz C, Tai MHH, Santos AH, Rocha LFN, Albernaz DAS, Silva HHG 2007. Ovicidal activity of entomopathogenic Hyphomycetes on Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) under laboratory conditions. J Med Entomol 44: 799-804.
65
Maciel-de-Freitas R, Neto RB, Gonçalves JM, Codeço CT, Lourenço-de-Oliveira R 2006. Movement of dengue vectors between the human modified environment and an urban forest in Rio de Janeiro. J Med Entomol 43: 1112-1120. Macoris MLG, Camargo MF, Silva IG, Takaku L, Andrighetti MT 1995. Modificação da suscetibilidade de Aedes (Stegomyia) aegypti ao Temephos. Rev Pat Trop 24: 31-40. Mackenzie JS, Gubler DJ, Petersen LR 2004. Emerging flaviviruses: the spread and resurgence of Japanese encephalitis, West Nile, and dengue viruses. Nat Med 10: 98-107. Madeira NG, Macharelli CA, Carvalho LR 2002. Variation of the oviposition preferences of Aedes aegypti in function of substratum and humidity. Mem Inst Oswaldo Cruz 97: 415-420. Maniania, NK 1991. Susceptibility of Chilo partellus Swinhoe (Lep., Pyralidae) eggs to entomopathogenic Hyphomycetes. J Appl Entomol 112: 53-58. Marzochi KBF 1994. Dengue in Brazil - Situation, transmission and control - A proposal for ecological control. Mem Inst Oswaldo Cruz 8: 235-245. Micieli MV, Campos RE 2003. Oviposition activity and seasonal pattern of a population of Aedes (Stegomyia) aegypti (L.) (Diptera: Culicidae) in subtropical Argentina. Mem Inst Oswaldo Cruz 98: 659-663. Milner RJ, Lim RP, Hunter DM 2002. Risks to the aquatic ecosystem from the application of Metarhizium anisopliae for locust control in Australia. Pest Manag Science 58: 718-723. Ministério da Saúde 1994. Fundação Nacional de Saúde. Histórico da presença do Aedes aegypti no Brasil. Brasília – DF. Ministério da Saúde-Programa Nacional de Controle da Dengue. http://portal.saude.gov.br/portal/saude/
66
Moraes C, Schrank A, Vainstein MH 2003. Regulation of extracellular chitinases and proteases in the entomopathogen and acaricide Metarhizium anisopliae. Curr Microbiol 46: 205-210. Navarro DMAF, Oliveira PES, Potting RPJ, Brito AC, Fital SJF 2003. The potential attractant or repellent effects of different water types on oviposition in Aedes aegypti L. (Dipt., Culicidae). J Appl Ent 127: 46-50. OMS (Organização Mundial da Saúde) 1997. Dengue Hemorrágico: Diagnóstico, tratamento e controle. Genebra. Onofre SB, Vargas, LRB, Rossato M, Barros NM, Boldo JT, Nunes ARF, Azevedo JL 2002. Controle biológico de pragas na agropecuária por meio de fungos entomopatogênicos. In: Biotecnologia: Avanços na Agricultura e Agroindústria. Caxias do Sul: 295-328. OPAS (Organização Panamericana de la Salud) 1995. Dengue y dengue hemorrágico en las Américas: guias para su prevención y control. Washington, DC: OPS. Pal S, St Leger RJ, Wu LP 2007. Fungal peptide destruxin A plays a specific role in suppressing the innate immune response in Drosophila melanogaster. J Biol Chem 282: 8969-8977. Panbangred W, Pantuwatana S, Bhumiratana A 1979. Toxicity of Bacillus thuringiensis toward Aedes aegypti larvae. J Invertebr Pathol 33: 340-347. Passos RA, Tadei WP 2008. Parasitism of Ascogregarina taiwanensis and Ascogregarina culicis (Apicomplexa: Lecudinidae) in larvae of Aedes albopictus and Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) from Manaus, Amazon region, Brazil. J Invertebr Pathol 97: 230-236. Pedrini N, Crespo R, Juárez MP 2007. Biochemistry of insect epicuticle degradation by entomopathogenic fungi. Comp Biochem Physiol. Toxicol Pharmacol 146: 124-137. Pelizza SA, López Lastra CC, Becnel JJ, Bisaro V, Garcia JJ 2007. Effects of temperature, pH and salinity on the infection of Leptolegnia chapmanii Seymour (Peronosporomycetes) in mosquito larvae. J Invertebr Pathol 96: 133-137.
67
Pereira ST, Secundino NFC, Botelho ACC, Pinheiro VC, Tadei WP, Pimenta PFB 2006. Role of eggs buster in hatching of Aedes aegypti scanning electron microscopy study. J Med Entomol 43: 68-72. Pirali KK, Haddadzadeh H, Razzaghi-Abyaneh M, Bokaie S, Zare R, Ghazavi M, Shams GM 2007. Biological control of Rhipicephalus (Boophilus) annulatus by different strains of Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana and Lecanicillium psalliotae fungi. Parasitol Res 100: 1297-1302. Pridgeon JW, Pereira RM, James J, Becnel JJ, Allan SA, Gary G, Clark GG, Linthicum KJ 2008. Susceptibility of Aedes aegypti, Culex quinquefasciatus Say, and Anopheles quadrimaculatus Say to 19 pesticides with different modes of action. J Med Entomol 45: 82-87. Rangel DE, Braga GU, Flint SD, Anderson AJ, Roberts DW 2004. Variations in UV-B tolerance and germination speed of Metarhizium anisopliae conidia produced on insects and artificial substrates. J Invertebr Pathol 87: 77-83. Rezende JM 2001. O Desafio da Febre Amarela - Caminhos da Medicina. http://usuarios. cultura.com.br/jmrezende. Riba GSM, Richard G, Larget I 1983. Sensibilité de la pyrale du mais (Ostrinia nubilialis) (Lep.: Pyralidae) aux Hyphomycetes entomopathogènes. Entomophaga 28: 55-64. Romaña CA, Fargues J 1992. Relative susceptibility of different stages of Rhodnius prolixus to the entomopathogenic hyphomycete Beauveria bassiana. Mem Inst Oswaldo Cruz 87: 363-368. Roy HE, Steinkraus DC, Eilenberg J, Hajek AE, Pell JK 2006. Bizarre interactions and endgames: Entomopathogenic fungi and their artropod hosts. Annu Rev Entomol 51: 331- 357. Russel BM, Kay BH, Shipton W 2001. Survival of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) eggs in surface on subterranean breeding sites during the northen Queensland dry season. J Med Entomol 38: 441-425. Sahagún CAA, Gutiérrez RL, Ochoa JM, Velasco EG, Edwards ML, Dominguez OR, Vázquez CC, Velázquez WPR, Skoda SR, Foster JE 2005. Susceptibility of biological stages of the horn fly, Haematobia irritans, to entomopathogenic fungi (Hyphomycetes). J Insect Sci 5: 50.
68
Saik JE, Lacey LA, Lacey CM 1990. Safety of microbial insecticides to vertebrates – domestics animals and wildlife. In: Laird M, Lacey CM, Davidson EW, editors. Safety of Microbial Insecticides: 115-132. Scholte EJ, Knols BGJ, Samson RA, Takken W 2004. Entomopathogenic fungi for mosquito control: A review. J Insect Sci 4: 1-24. Scholte EJ, Takken W, Knols BGJ 2007. Infection of adult Aedes aegypti and Ae. albopictus with the entomopahogenic fungus Metarhizium anisopliae. Acta Tropica 102: 151-158. Shah FA, Wang CS, Butt TM 2005. Nutrition influences growth and virulence of the insect-pathogenic fungus Metarhizium anisopliae. FEMS Microbiol Lett. 251: 259-266. Shi WB, Feng MG 2004. Lethal effect of Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, and Paecilomyces fumosoroseus on the eggs of Tetranychus cinnabarinus (Acari: Tetranychidae) with a description of a mite egg bioassay system. Bio Control. 30: 165-173. Siegel JP, Shadduck JA 1990. Safety of microbial insecticides to vertebrates – humans. In: Laird M, Lacey CM, Davidson EW, editors. Safety of Microbial Insecticides: 101-113. Silva HHG, Silva IG, Lira KS 1998. Metodologia de criação, manutenção de adultos e estocagem de ovos de Aedes aegypti (Linnaeus, 1762) em laboratório. Rev Pat Trop 27: 53-63. Silva HHG, Silva IG 1999. Influence of eggs quisecence period on the Aedes aegypti (Linnaeus, 1762) (Diptera: Culicidae) life cycle at laboratory conditions. Rev Soc Bras Med Trop 32: 349-355. Silva HHG, Silva IG, Santos RMG, Rodrigues Filho E, Elias CN 2004. Atividade larvicida de taninos isolados de Magonia pubescens St. Hil. (Sapindaceae) sobre Aedes aegypti (Diptera, Culicidae). Rev Soc Bras Med Trop 37: 396-399. Silva HHG, Geris R, Silva IG, Rodrigues Filho E 2007. Larvicidal activity of oil-resin fractions from the Brazilian medicinal plant Copaifera reticulata. Rev Soc Bras Med Trop 40: 264-267.
69
Silva IG, Araújo ESO, Silva HHG, Soares AW, Cantuaria PB 1991. Ocorrência de Aedes (Stegomyia) aegypti (Linnaeus 1762) (Diptera, Culicidae) em Goiânia. An Soc Ent Brasil 20: 459-460. Silva IG, Camargo MF, Elias CN, Isac E, Santos AH 1994. Metodologia de criação de Aedes (Stegomyia) aegypti (Linnaeus, 1762) (Diptera, Culicidae) em condições de laboratório. Rev Goiana Med 39: 23-26. Silva RO, Silva HHG, Luz C 2004. Effect of Metarhizium anisopliae isolated from soil samples of the central Brazilian cerrado against Aedes aegypti larvae under laboratory conditions. Rev Pat Trop 33: 207-216. Silva RO, Silva HHG, Ulhoa CJ, Luz C 2005. Is there a relationship between N-acetyl-beta-D-glucosaminidase activity of Metarhizium anisopliae (Metschn.) Sorokin (Hyphomycetes) isolates from peridomestic areas in Central Brazil and larvicidal effect on Aedes aegypti (L.) (Diptera, Culicidae) ? J Appl Entomol 129: 158-164. Silva WJ, Dória GAA, Maia RT, Nunes RS, Carvalho GA, Blank AF, Alves PB, Marçal RM, Cavalcanti SCH 2008. Effects of essential oils on Aedes aegypti larvae: Alternatives to environmentally safe insecticides. Bioresour Technol 9: 3251-3255. Singh GJP, Schouest LP, Gill SS 1986. The toxic action of Bacillus thuringiensis var. israelensis in Aedes aegypti in vivo. II. The relevance of skeletal muscle system lesions to its poisoning syndrome. Pest Bioch Physiol 26: 47-55. Siqueira Jr JB, Martelli CMT, Coelho GE, Simplício ACR, Hatch DL 2005. Dengue and Dengue Hemorrhagic Fever, Brasil, 1981-2002. Emerg Infect Dis. www.cdc.gov/eid 11: 48-53. Sivagnaname N, Amalraj DD, Kalyanasundaram M, Das PK 2001. Oviposition attractancy of an infusion from a wood inhabiting fungus for vector mosquitoes. Indian J Med Res 114: 18-24. Sosa-Gomez DR, Alves SB 1983. Caracterización once aislamient of Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok. I. Estandarización, virulencia y actividad enzimática. CIRPON. Rev Invest 1: 83-101.
70
Sosa-Gomez DR, Boucias DG, Nation JL 1997. Attachment os de Metarhizium anisopliae to the southern green stink bug Nezara viridula cuticle and fungistatic effect of cuticular lipids and aldehydes. J Invertebr Pathol 69: 31-39. Sosa-Gomez DR, Moscardi F 1998. Laboratory and field studies on the infection of stink bugs, Nezara viridula, Piezodorus guildinii, and Euschistus heros (Hemiptera: Pentatomidae) with Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana in Brazil. J Invertebr Pathol. 71:115-120. Sosa-Gomez DR, Alves SB 2000. Temperature and relative humidity requirements for conidiogenesis of Beauveria bassiana (Deuteromycetes: Moniliaceae). An Soc Entomol Brasil 29: 515-522. Spielman A, Skaff V 1967. Inhibition of metamorphosis and of ecdysis in mosquitoes. J Insect Physiol 3: 1087-1095. St Leger RJ, Goettel M, Roberts DW, Staples RC 1991. Prepenetration events during infection of host cuticle by Metarhizium anisopliae. J Invertebr Pathol 58: 168-179. Sung GH, Hywel–Jones NL, Sung JM, Luangsa-ard JJ, Shrestha B, Spatafora JW 2007.- Phylogenetic classification of Cordyceps and the clavicipitaceous fungi. Studies Mycol 57: 5-59. Takken W, Knols BGJ 1999. Odor-mediated behavior of afrotropical malaria mosquitoes. Annu Rev Entomol 44: 131-157. Tauil PL 1986. O problema do Aedes aegypti no Brasil. Rev Soc Bras Med Trop 19:1 3. Tauil PL 2006. Perspectivas de controle de doenças transmitidas por vetores no Brasil. Rev Soc Bras Med Trop 39: 275-277. Ugelvig LV, Cremer S 2007. Social prophylaxis: group interaction promotes collective immunity in ant colonies. Curr Biol 17: 1967-1971. Valle D 1993. Vitellogenesis in insects and other groups - A Review. Mem Inst Oswaldo Cruz 88: 1-26.
71
Valle D, Monnerat AT, Soares MJ, Rosa-Freitas MG, Pelajo MM, Vale BS, Lenzi HL, Galler R, Lima JBP 1999. Mosquito embryos and eggs: polarity and terminology of chorionic layers. J Insect Physiol 45: 701-708. Vestergard S, Cherry A, Keller S, Goettel M 2003. Safety of Hyphomycetes fungi as microbial control agents. In: Hokkanen HMT, Hajek AE, editors. Enviroment Impact Microbial Insect: 35-62. Wang C, Duan Z, St Leger RJ 2008. MOS1 osmosensor of Metarhizium anisopliae is required for adaptation to insect host hemolynph. Eukaryot Cell 7: 302-309. Watanabe H 1987. The host population. In: John Wiley and Sans editors. Epizoology of Insects Diseases: 71-112. Wekesa VW, Knapp M, Maniania NK, Boga HI 2006. Effects of Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae on mortality, fecundity and egg fertility of Tetranychus evansi. J Appl Entomol 130: 155-159. Wasti SS, Hartmann GC, Rousseau AJ 1980. Gypsy moth (Lymantria dispar) mycoses by 2 species of entomopatogenous fungi and an assessment of their avian toxicity. Parasitol 80: 419-424. WHO 1992. Vector resistance to pesticides. Fifteenth report of the expert Comitee on vector biology and control. In: WHO Tech Rep Ser 818: 1-55. Wirth MC, Jiannino JA, Federici BA, Walton WE 2005. Evolution of resistance toward Bacillus sphaericus or a mixture of B. sphaericus + Cyt1A from Bacillus thuringiensis, in the mosquito Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae). J Invertebr Pathol 88: 154-162. Wright C, Brooks A, Wall R 2004. Toxicity of the entomopathogenic fungus, Metarhizium anisopliae (Deuteromycotina: Hyphomycetes) to adult females of the blowfly Lucilia sericata (Diptera: Calliphoridae). Pest Manag Sci 60: 639-644. Yanagawa A, Yokohari F, Shimizu S 2008. Defense mechanism of the termite, Coptoterms formosanus Shiraki, to entomopathogenic fungi. J Invertebr Pathol 97: 165-170.
72
Zimmermann G 1993.The entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae and its potential as a biocontrol agent. Pestic Sci 37: 375-379. Zimmermann G 2007. Review on safety of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae. Biocontrol Sci Technol 17: 879-920.
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8 ANEXOS – Normas para publicação no Journal of Medical Entomology
Submit a Manuscript
To submit a manuscript for publication in one of the four ESA
journals, Annals of the Entomological Society of America, Environmental
Entomology, Journal of Economic Entomology, or Journal of Medical
Entomology, please see below.
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the specific submission requirements noted on each publication's home
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Journal Submissions
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articles, all of which are peer reviewed before being accepted for
publication. The manuscript review process is described in the "Publishing
Policies and Procedures" section. In addition to scientific research articles,
all four journals publish letters to the editor, interpretive or evaluative
articles that appear in a Forum section, and book and media reviews.
Manuscripts that describe entomological techniques and computer
software programs generally are not considered for publication in the
journals, although software programs can be covered in the book and
media reviews section.
Papers that are published in the Forum section are authored by
acknowledged leaders in the field. Forum articles are reviews of a research
area that include a stimulating, thought-provoking discussion and that
focus on important, and sometimes controversial, issues. They should
provide an innovative approach to current thought and speculate about
future research directions. Forum articles may also be written by invitation
of the journal editor-in-chief.
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Where to Submit
All articles should be submitted electronically using the ESA
web-based Rapid Review system. Go to http://www.rapidreview.com
and select the "Author Log On" button next to the ESA journal titles. All
authors using Rapid Review are required to set up an account by filling in
their contact information and determining their user name and password.
Once a paper is submitted through the system, the author can log on
subsequently and see the status of his or her manuscript.
General Submission Instructions
All manuscripts submitted to the Entomological Society of America
should be written with clarity and readability in mind. Manuscripts are
subject to editing to ensure conformity to editorial standards and journal
style. Consult the Council of Biology Editors' style manual, Scientific Style
and Format Manual for Authors, Editors, and Publishers, 6th ed., along
with recent issues of the journal for style and format. Follow the
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• Type all as double-spaced, with 1-inch margins, and do not right justify
text.
• Use the font Times (New) Roman with a size of 12 point.
• Left-justify the title, author line, affiliation lines, subheadings, text, and
References Cited.
• Insert tabs, not spaces, for paragraph indents.
• Use italicization only to indicate scientific names (including viruses),
symbols or variables, and words that are defined.
• Use quotation marks for quoted material only.
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• Use American English spelling throughout and follow Merriam-Webster's
New Collegiate Dictionary, 10th ed., for guidance on spelling.
• Number pages consecutively, beginning with the title page.
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following order: title page, abstract and key words (three to six words),
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