eduardo coriolano de oliveira...planch & triana na neutralização de atividades biológicas...
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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
FACULDADE DE FARMÁCIA
PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS APLICADAS A PRODUTOS PARA SAÚDE
Avaliação de Extratos Vegetais de Clusia fluminensis
Planch & Triana na Neutralização de Atividades Biológicas
Provocadas pelo Veneno de Bothrops jararaca
Dissertação de Mestrado
EDUARDO CORIOLANO DE OLIVEIRA
Orientadora:
Profa. Dra. Selma Ribeiro de Paiva (UFF)
Co-orientador:
Prof. Dr. André Lopes Fuly (UFF)
NITERÓI
2011
II
Avaliação de Extratos Vegetais de Clusia fluminensis
Planch & Triana na Neutralização de Atividades Biológicas
Provocadas pelo Veneno de Bothrops jararaca
Por
Eduardo Coriolano de Oliveira
Orientadora: Profª. Drª Selma Ribeiro de Paiva
Co-Orientedor: Prof. Dr. André Lopes Fuly
NITERÓI
2011
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-
Graduação em Ciências Aplicadas a Produtos
para a Saúde da Universidade Federal
Fluminense, como requisito parcial para a
obtenção do grau de Mestre em Ciências.
Área de Concentração: Desenvolvimento de
Produtos para a Saúde.
III
048 Oliveira, Eduardo Coriolano de
Avaliação dos Extratos Vegetais de Clusia fluminensis
Planch & Triana na neutralização de atividades biológicas
provocadas pelo veneno de Bothrops jararaca / Eduardo
Coriolano de Oliveira; Orientadora: Selma Ribeiro de Paiva. _
Niterói, 2011.
73f.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal Fluminense,
2011
1. Jararaca (cobra) 2. Farmacoepidemiologia 3. Terapêutica
4. Ofidismo 5. Clusiaceae I. Paiva, Sema Ribeiro de II. Título
CDD 615.942
IV
Avaliação de Extratos Vegetais de Clusia fluminensis
Planch & Triana na Neutralização de Atividade Biológicas
Provocadas pelo Veneno de Bothrops jararaca
Por
Eduardo Coriolano de Oliveira
Aprovado em agosto de 2011.
Banca Examinadora
_______________________________________________________________
Dra. Selma Ribeiro de Paiva – Orientadora (UFF)
_______________________________________________________________
Drª. Luciana Moreira Chedier (UFJF)
_______________________________________________________________
Dr. Humberto Pinheiro de Araújo (FIOCRUZ)
NITERÓI
2011
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-
Graduação em Ciências Aplicadas a Produtos
para a Saúde da Universidade Federal
Fluminense, como requisito parcial para a
obtenção do grau de Mestre em Ciências.
Área de Concentração: Desenvolvimento de
Produtos para a Saúde.
V
“A nossa maior glória não reside no
fato de nunca cairmos, mas sim em
levantarmo-nos sempre depois
de cada queda.”
Confúcio
VI
Ao meu Filho Miguel,
Minha Esposa Aline
E aos meus Pais Serlio e Marcia,
Por todo amor e dedicação.
VII
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, por sempre mostrar o caminho, quando tudo
parece perdido.
À minha esposa Aline, por todo carinho, compreensão, amor e amizade,
fundamentais para a continuidade deste processo. E ao meu filho, Miguel, que me
impulsiona e motiva cada vez mais a superar os percalços da vida.
Aos meus pais, Serlio e Marcia, pelo amor, carinho e dedicação, sem vocês nada
disso seria possível.
À Ana Claudia Rodrigues e Mariane Assafim, pela amizade, carinho de sempre.
Aos colegas de laboratório, pela amizade, por toda ajuda, pela ótima convivência,
pelos bons momentos de descontração.
Aos meus orientadores Selma Ribeiro de Paiva e André Fuly por terem aceitado esta
orientação e por toda dedicação e paciência, para a realização deste trabalho. Sem dúvida
este trabalho não seria viável sem a ajuda de vocês. Muito obrigado!
Aos meus amigos por toda a força e confiança, mesmo quando eu não acreditava.
À mestre Maria Carolina por sempre estar disposta a ajudar, tirando minhas dúvidas,
e cedendo materiais (extratos e artigos).
À professora Drª. Kátia Lima, co-ordenadora da Pós-Graduação, por estar sempre a
disposição dos alunos.
Agradeço ao programa de pós-graduação em Ciências Aplicadas a Produtos para
Saúde, aos professores e alunos deste programa pelo constante apoio.
Agradeço aos professores da banca examinadora e a revisora da tese por terem
aceitado o convite.
A todas as pessoas que, direta e indiretamente, contribuíram para a realização deste
trabalho, principalmente aqueles que doaram e colheram sangue para os experimentos.
Aos animais de laboratório que, necessariamente, foram sacrificados para a
realização deste trabalho.
VIII
ÍNDICE
ÍNDICE DE FIGURAS..............................................................................................................X
ÍNDICE DE TABELAS.............................................................................................................XI
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ................................................................................XII
RESUMO ..............................................................................................................................XIII
ABSTRACT ..........................................................................................................................XIV
1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................................15
1.1 EPIDEMIOLOGIA DOS ACIDENTES OFÍDICOS ..........................................................16
1.2 ETIOLOGIA DOS ACIDENTES OFÍDICOS NO BRASIL ...............................................21
1.2.1 ESPÉCIE B. jararaca ....................................................................................................23
1.3 FUNÇÃO E COMPOSIÇÃO DO VENENO ....................................................................24
1.4 TRATAMENTO DOS ACIDENTES OFÍDICOS .............................................................28
1.5 PLANTAS MEDICINAIS ..................................................................................................31
1.5.1 Clusia fluminensis Planch & Triana ..............................................................................33
2. OBJETIVOS ......................................................................................................................35
2.1 OBJETIVO GERAL .........................................................................................................35
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ..........................................................................................35
3. METERIAL E MÉTODOS .................................................................................................36
3.1 MATERIAL ......................................................................................................................36
3.2 OBTENÇÃO DO VENENO DE Bothrops jararaca ........................................................36
3.3 ANIMAIS .........................................................................................................................36
3.4 EXTRATO VEGETAL .....................................................................................................36
3.5 PROTOCOLO DE NEUTRALIZAÇÃO ..........................................................................37
3.6 ATIVIDADES BIOLÓGICAS ..........................................................................................38
3.6.1 ATIVIDADE PROTEOLÍTICA .....................................................................................38
3.6.2 ATIVIDADE HEMOLÍTICA ..........................................................................................39
3.6.3 ATIVIDADE COAGULANTE .......................................................................................40
3.6.4 ATIVIDADE HEMORRÁGICA ....................................................................................40
3.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA ...............................................................................................41
4. RESULTADOS ................................................................................................................42
4.1 ATIVIDADE PROTEOLÍTICA ........................................................................................42
4.2 ATIVIDADE HEMOLÍTICA ............................................................................................45
4.3 ATIVIDADE COAGULANTE .........................................................................................47
4.4 ATIVIDADE HEMORRÁGICA ......................................................................................49
IX
4.5 COMPARATIVO DOS EFEITOS DOS EXTRATOS VEGETAIS SOBRE O
VENENO DE Bothrops jararaca ........................................................................................51
5. DISCUSSÃO ......................................................................................................................54
6. CONCLUSÃO ....................................................................................................................58
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................................59
8. ADENDO............................................................................................................................71
X
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1: Acidentes com animais peçonhentos no Brasil ...............................................16
Figura 2: Distribuição Global de Serpentes Venenosas ..................................................17
Figura 3: Distribuição de casos ofídicos e óbitos (Brasil, 2010) ....................................20
Figura 4: Sistema de distinção entre serpentes peçonhentas e não peçonhentas
................................................................................................................................................22
Figura 5: Distribuição geográfica das principais espécies do gênero Bothrops no
Brasil .....................................................................................................................................24
Figura 6: Foto da serpente B. jararaca e sua distribuição ...............................................25
Figura 7: Componentes presentes no veneno de serpentes ..........................................27
Figura 8: Estrutura geral de um anticorpo. Local de clivagem pela pepsina/papaína
................................................................................................................................................29
Figura 9: Fotos de Clusia fluminensis ...............................................................................34
Figura 10: Efeito dos extratos de C. fluminensis na atividade proteolítica provocada
pelo veneno de B. jararaca .................................................................................................43
Figura 11: Comparação entre o efeito do extrato hexânico da flor de C. fluminensis e a
benzofenona isolada deste extrato na atividade proteolítica provocada pelo veneno de
B. jararaca ............................................................................................................................44
Figura 12: Efeito dos extratos de C. fluminensis na atividade hemolítica provocada
pelo veneno de B. jararaca .................................................................................................46
Figura 13: Comparação entre o efeito do extrato Hexânico da Flor de C. fluminensis e
a benzofenona isolada deste extrato na atividade hemolítica provocada pelo veneno
de B. jararaca .......................................................................................................................47
Figura 14: Efeito dos extratos de C. fluminensis na atividade coagulante provocada
pelo veneno de B. jararaca .................................................................................................48
Figura 15: Comparação entre o efeito do extrato hexânico da flor de C. fluminensis e a
benzofenona isolada deste extrato na atividade coagulante provocada pelo veneno de
B. jararaca ............................................................................................................................49
Figura 16: Efeito dos extratos de C. fluminensis na atividade hemorrágica provocada
pelo veneno de B. jararaca .................................................................................................50
Figura 17: Comparação entre o efeito do extrato hexânico da flor de C. fluminensis e a
benzofenona isolada deste extrato na atividade coagulante provocada pelo veneno de
B. jararaca ............................................................................................................................51
XI
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1: Casos de Acidentes por serpentes, no Brasil, registrados pelo SINAN no
período de 2000 a 2010 .......................................................................................................18
Tabela 2: Casos de Acidentes por serpentes registrados pelo SINITOX para o ano de
2009 .......................................................................................................................................19
Tabela 3: Tratamento preconizado pelo Ministério da Saúde, de acordo com a espécie
causadora do acidente e a gravidade dos sintomas ........................................................30
Tabela 4: Quadro indicativo dos solventes e partes do vegetal utilizadas para o
preparo dos extratos e os códigos dos extratos utilizados no trabalho
................................................................................................................................................37
Tabela 5: Comparação dos efeitos dos extratos vegetais sobre o veneno de B.
jararaca.................................................................................................................................52
XII
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
CaCl2 – Cloreto de Cálcio
CE – Concentração Efetiva
CEUA – Comissão de Ética no Uso de Animais
DMC - Dose Mínima Coagulante
DMH – Dose Mínima Hemorrágica
DMSO - Dimetilsulfóxido
EDTA – Ácido Etilenodiamino Tetra-acético
F(ab) – Fragmento monovalente do anticorpo
F(ab‟)2 – Fragmento divalente do anticorpo
FUNED – Fundação Ezequiel Dias
HCl – Ácido Clorídrico
HIV – Vírus da Imunodeficiência Humana
IgGs – Imunoglubulina G
IVB – Instituto Vital Brazil
NaCl – Cloreto de Sódio
NAL – Núcleo de Animais de Laboratório
NaOH – Hidróxido de Sódio
OMS – Organização Mundial de Saúde
PLA2 – Fosfolipase A2
RPM – Rotações por Minuto
SAB – Soro Antibotrópico
SABL – Soro antibotrópico-laquético
SAC – Soro Anticrotálico
SAE – Soro Antielapídico
SE – Erro Padrão
SIH/SUS – Sistema de Informações Hospitalares do Sistema Único de Saúde
SIM – Sistema de Informação de Mortalidade
SINAN – Sistema de Informação de Agravos de Notificação
SINITOX – Sistema Nacional de Informações Tóxico Farmacológicas
TCA – Ácido tricloroacético
TRIS – Tris-hidroximetil Aminometano
XIII
RESUMO
O envenenamento ofídico, dentre os acidentes com animais peçonhentos é o mais
importante deles, pela sua frequência e gravidade. No Brasil, as serpentes do
gênero Bothrops são responsáveis por 90 % dos acidentes ofídicos. Os extratos
vegetais apresentam uma diversidade de moléculas com diversas ações
farmacológicas. As espécies de Clusia são de grande interesse paisagístico, porém
duas espécies deste gênero, C. torresii Standl. e C. palmana Standl. apresentam
propriedades antiofídicas contra o veneno de B. asper. O objetivo do nosso trabalho
foi avaliar as propriedades antiofídicas da espécie Clusia fluminensis Planch &
Triana, utilizando diferentes partes vegetais e solventes de diferentes polaridades
para o preparo dos extratos, assim como uma benzofenona isolada do extrato
hexânico da flor, frente atividades biológicas do veneno de B. jararaca. Ensaios in
vitro mostraram que os extratos hexânicos e metanólicos das folhas e frutos, na
proporção de 1:50 (veneno:extrato) foram capazes de inibir 100 % a atividade
proteolítica do veneno de B. jararaca (9 µg/mL), usando-se azocaseína como
substrato; com exceção do extrato hexânico do caule e da benzofenona que inibiram
cerca de 50 %. Na atividade hemolítica do veneno de B. jararaca (88 µg/mL), a
inibição foi de 40 %, nas proporções de 1:10 e 1:20. Por outro lado, os extratos
nestas mesmas proporções não foram capazes de neutralizar a coagulação do
plasma induzida pelo veneno de B. jararaca (22 µg/mL), de forma significativa. Em
ensaios in vivo (atividade hemorrágica) apenas o extrato acetônico do fruto, na
proporção de 1:20, foi capaz de reverter totalmente a hemorragia causada pelo
veneno de B. jararaca (16,7 µg/g). Sendo assim, nossos resultados mostram que a
planta C. fluminensis pode ser uma fonte de moléculas com propriedades
antiofídicas, especificamente contra o veneno de B. jararaca, e que este efeito
neutralizante está diretamente relacionado a parte do vegetal e a polaridade do
solvente utilizado na extração, Além disso podemos concluir que a benzofenona não
é responsável, isoladamente, pelos resultados obtidos.
Palavras-Chaves: Acidente Ofídico, Antiofídico, Bothrops jararaca, Extrato Vegetal,
Clusia Fluminensis.
XIV
ABSTRACT
Snake venom poisoning, among accidents with venomous animals is the most
important of them, by their frequency and severity. In Brazil, Bothrops are
responsible for 90 % of snake bites. The plant extracts have a variety of molecules
with several pharmacological actions. Clusia species are of great landscape interest,
but two species of this genus, C. torresii Standl. and C. palmana Standl. have
properties against snake venom B. asper. The aim of our study was to evaluate the
antivenom properties the species Clusia fluminensis Triana & Planch, using different
plant parts and solvents of different polarities for the preparation of extracts, as well
as a benzophenone isolated from the hexane extract of the flower, against biological
activity of the venom of B. jararaca. In vitro assays showed that the hexane and
methanolic extracts of leaves and fruits at a ratio of 1:50 (venom: extract) were able
to inhibit 100 % proteolytic activity of the venom of B.jararaca (9μg/mL), using
azocaseíne as substrate, with the exception of hexanic extract from stem and
benzophenone which inhibited about 50 %. In the hemolytic activity of the venom of
B. jararaca (88 µg/mL), inhibition was 40 %, the proportions of 1:10 and 1:20. On the
other hand, the same proportions in these extracts were not able to neutralize the
plasma coagulation induced by the venom of B. jararaca (22 μg/mL) significantly. In
vivo assays (hemorrhagic activity) only the acetone extract of the fruit was able to
totally reverse bleeding caused by the venom of B. jararaca (16,7 µg/g). Thus, our
results show that the plant C. fluminensis can be a source of molecules with
neutralizing properties of snake venom, specifically against the venom of B. jararaca,
and that the neutralizing effect is directly related to part of the plant and the polarity of
the solvent used in extraction, we can also conclude that benzophenone is not
responsible alone for the results.
Keywords: Snakebite, Antiophidian, Bothrops jararaca, Plant Extract, Clusia
fluminensis.
15
1. INTRODUÇÃO
Os envenenamentos provocados por picadas de animais peçonhentos em
humanos constituem importante problema de saúde pública, especialmente em
países tropicais e em desenvolvimento. As serpentes, escorpiões e aranhas são os
principais agentes causadores de envenenamentos no Brasil (Figura 1). Mais
recentemente, acidentes com lagartas do gênero Lonomia e envenenamentos
causados por abelhas têm merecido atenção devido à gravidade e a alta letalidade.
Contudo, segundo dados do Sistema de Informação de Agravos de Notificação
(SINAN), o acidente ofídico é o principal dentre esses, devido ao grande número de
pessoas atingidas e pela própria gravidade que encerram, pois apresentam índices
significantes de morbidade e mortalidade (FUNASA, 2001; de Paula, 2009; Fox e
Serrano, 2009; Lira-da-Silva et al., 2009; Fita et al., 2010).
O mundo das serpentes é fascinante e misterioso, podendo despertar tanto a
admiração quanto o medo na mesma intensidade. No antigo Egito, estes animais
eram adorados. Os imperadores romanos tinham suas coroas decoradas com
réplicas de serpentes. Na mitologia grega, Asclépio (Deus da Medicina) é
representado por um bastão e uma serpente entrelaçada, símbolo utilizado até hoje,
para representar a medicina. De forma geral a serpente está presente nos símbolos
que representam as profissões da área da saúde. Este encantamento decorre das
características próprias e também em função da enorme diversidade de cores,
tamanhos e comportamentos observados nesses animais. O medo provém da
complexidade de sintomas e sequelas causados pelo envenenamento resultante da
picada das serpentes, o que representa um problema de convivência com estes
animais desde a Idade Antiga (4000 a.C.) (Terruggi, 2004; Koh et al., 2006; de
Paula, 2009; Fox & Serrano, 2009).
16
Figura 1: Acidentes com animais peçonhentos no Brasil. Fonte: Modificado do SINAN (Disponível em: http://dtr2004.saude.gov.br/sinanweb/tabnet /dh?sinan/animaisp/bases/animaisbr.def Acesso:25/05/2011)
1.1 Epidemiologia dos Acidentes Ofídicos
Existem cerca de 3.000 espécies de serpentes catalogadas no mundo sendo
apenas 10 % a 15 % venenosas, sendo encontradas em quase todas as partes do
mundo (Figura 2). A real incidência do acidente ofídico em todo mundo e a morbi-
mortalidade associada a este envenenamento é difícil de ser retratado. Porém,
estima-se que 2.5 milhões de pessoas sejam acometidas por picadas de serpentes,
das quais cerca de 125 mil perdem suas vidas. Apesar do índice de letalidade
relativamente baixo (5 %), há um grande índice de sequelas deixadas por estes
acidentes, por exemplo, paralisia e até mesmo a amputação do membro afetado.
(Pinho & Pereira, 2001; Koh et al., 2006; Kasturiratne et al., 2008; Gutiérrez et al.,
2009). Dados da OMS (2007) indicam que em cada sete acidentados sobreviventes,
pelo menos um indivíduo fica com sequelas permanentes provenientes do
envenenamento ofídico.
17
Figura 2: Distribuição Global de Serpentes Venenosas. Fonte: OMS/2007
No Brasil existem aproximadamente 260 espécies de serpentes, sendo 56
peçonhentas, responsáveis por aproximadamente, 28 mil casos de envenenamento
por ano. Dados fornecidos pelo SINAN demonstram a ocorrência de 280.699 casos
de acidentes ofídicos (Tabela 1), durante os anos de 2000 a 2010 (média de 13,9
acidentes para cada 100.000 habitantes), sendo 2.163 fatais, o que representa 0,77
% dos casos (SINAN, 2011).
Estes acidentes são registrados por quatro sistemas de notificação vinculados
ao Ministério da Saúde: Sistema de Informação de Agravos de Notificação (SINAN),
Sistema de Nacional de Informações Tóxico-Farmacológicas (SINITOX/FIOCRUZ),
Sistema de Informações Hospitalares do Sistema Único de Saúde (SIH/SUS) e o
Sistema de Informações sobre Mortalidade (SIM). Apesar da existência destes
sistemas, os dados registrados provavelmente subestimam a real magnitude dos
acidentes ofídicos no país, devido a deficiências na coleta e subnotificação de
dados, e principalmente por dificuldades de acesso aos serviços de saúde de muitos
municípios brasileiros; além da visível falta de comunicação entre as esferas
Municipal, Estadual e Federal do governo.
18
Tabela 1: Casos de Acidentes por serpentes, no Brasil, registrados pelo SINAN no período de 2000 a 2010.
(Fonte SINAN - Disponível em: http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/tabela_caos_2000_2011_01_04_2011.pdf - acesso:25/05/2011)
Comparando a Tabela 1 e a Tabela 2 pode-se observar a deficiência destes
sistemas de notificação. Dados do SINITOX informam que em 2009 ocorreram 2.807
casos de envenenamentos ofídicos, número menor que os casos registrados
segundo o SINAN, apenas, na região Centro-Oeste do Brasil (2.959 casos), região
esta com o menor número de casos em todo o país (Lemos et al., 2009; Lira-da-
Silva et al., 2009; SINITOX, 2009; SINAN, 2011). Outro exemplo de subnotificação
foi publicado por Fiszon & Bochner (2008) onde eles descreveram que, apenas no
Estado do Rio de Janeiro, 1.181 casos não foram notificados ao SINAN no período
de 2001 a 2005, quando comparados com dados obtidos pela Secretaria Estadual
de Saúde do Rio de Janeiro.
19
Tabela 2: Casos de Acidentes por serpentes registrados pelo SINITOX para o ano de 2009.
Fonte: SINITOX/FIOCRUZ
(Disponível em: http://www.fiocruz.br/sinitox_ novo/media/tab01 _serpentes_2009.pdf - acesso:25/05/2011)
As regiões Norte, Nordeste e Sudeste apresentam o maior número de casos,
sendo a maior incidência nas regiões Norte e Centro-Oeste (49,1 e 19,5 casos por
100.000 habitantes, respectivamente) (Figura 3). Em 2010, as regiões Nordeste e
Sudeste apresentaram a maior taxa de letalidade do país, com 1,4 % e 1,1 % dos
casos, respectivamente (BRASIL, 2010). Os acidentes por animais peçonhentos
apresentam uma sazonalidade, no qual os acidentes ofídicos têm predomínio nos
meses quentes e chuvosos. Nas regiões Sul, Sudeste e Centro-Oeste observa-se
um aumento do número de acidentes no período de setembro a março. Entretanto,
na região Nordeste o maior número de casos é observado no período de Janeiro a
20
Maio, enquanto na região Norte os acidentes ocorrem uniformemente durante todo o
ano (Brasil, 2010; SINAN, 2011).
Figura 3: Distribuição de casos ofídicos e óbitos (Brasil, 2010).
A epidemiologia dos acidentes ofídicos revela um perfil que se mantém ao
longo dos últimos 100 anos no Brasil, onde estes ocorrem com maior frequência no
período de setembro a março, pois coincide com o aumento de trabalho no campo
(FUNASA, 2001; Bochner & Struchiner, 2003; Koh et al., 2006). Cerca de 75 % dos
acidentes ocorre nas zonas rurais, sendo mais acometidos os indivíduos do sexo
masculino. A maioria dos acidentados está em uma faixa etária entre 15 e 49 anos.
E, em aproximadamente, 70 % dos casos as picadas ocorrem nos membros
21
inferiores. A utilização de equipamentos de proteção individual como botas e
perneiras poderiam evitar tais acidentes, reduzindo assim as estatísticas destes
envenenamentos (Pinho & Pereira, 2001; FUNASA, 2001; Brasil, 2005).
Os acidentes ofídicos representam um problema de saúde pública grave em
países tropicais, tornando a pesquisa por agentes antiofídicos e o conhecimento de
seus efeitos tóxico-farmacológicos de grande relevância. Este problema também
leva a um transtorno sócio-econômico no país, pois por vezes a mordedura de uma
serpente gera sequelas irreversíveis que o impede o trabalhador de continuar sua
jornada vital de trabalho, ou até mesmo levando este indivíduo ao óbito, deixando
sua família sem proventos, já que muitas vezes essa família depende de sua força
de trabalho. (Koh et al., 2006).
1.2 Etiologia dos Acidentes Ofídicos no Brasil
Os acidentes ofídicos podem ser causados por serpentes peçonhentas ou
não peçonhentas. A diferença entre estas é a presença de um aparelho inoculador
conectado à glândula de veneno, que é responsável pela inoculação do veneno em
suas vítimas. Além da presença de presas, outras características permitem que se
diferenciem as serpentes peçonhentas das não peçonhentas, como por exemplo, a
fosseta loreal, presente nas serpentes da família Viperidae (Figura 4) (Pardal, et al.,
1997; Pinho & Pereira, 2001).
Das 3.000 serpentes catalogadas em todo o mundo, apenas algumas
centenas são venenosas e destas uma minoria é susceptível a causar
envenenamento significativo em seres humanos. Todas as serpentes venenosas são
encontradas em apenas quatro famílias: Colubridae, Astractaspidae, Elapidae e
Viperidae. No Brasil, apenas as duas últimas são de interesse médico, apesar de
haver relatos de algumas espécies pertencentes à família Colubridae (White, 2000;
FUNASA, 2001).
A família Elapidae é representada pelo gênero Micrurus, contendo 19
espécies em todo território nacional. Estas serpentes são conhecidas como corais
verdadeiras. Cerca de 0,4 % dos acidentes são causados pelas espécies deste
22
gênero (Feitosa et al., 1997; FUNASA, 2001; BRASIL, 2005; Bucaretchi, et al., 2006;
Corrêa-Neto, et al., 2011).
Figura 4: Sistema de distinção entre serpentes peçonhentas e não peçonhentas.
Fonte: BRASIL, 2005
A família Viperidae é representada por três gêneros: Crotalus, Lachesis e
Bothrops. O gênero Crotalus é representado pela espécie C. durissus dividida em
sete subespécies, com ampla distribuição geográfica. Esta espécie é identificada
pela presença de um guizo na cauda, sendo conhecida como cascavel. É
responsável pelo maior índice de letalidade (1,8 %) dentre os acidentes ofídicos
ocorridos no país (FUNASA, 2001; BRASIL, 2005; Boldrini-França et al., 2010).
O gênero Lachesis apresenta somente uma espécie, L. muta, conhecida
como surucucu ou surucucu pico-de-jaca. É a maior serpente venenosa das
Américas, podendo alcançar 3 metros de comprimento. Apesar da baixa incidência
de acidentes, possui uma taxa letal de 0,95 %, possivelmente devido ao grande
volume de peçonha injetada e pela diversidade dos efeitos biológicos provocados
por esta. Esta espécie é encontrada na região Amazônica e regiões de Mata
23
Atlântica (FUNASA, 2001; Fuly et al., 2002; Stephano et al., 2005; BRASIL, 2005; de
Paula, 2009).
As serpentes do gênero Bothrops são as principais responsáveis pelos
acidentes ofídicos no Brasil com um percentual aproximado de 90 % dos
envenenamentos (Feitosa et al., 1997; Gomes et al., 2009). Este gênero possui
cerca de 45 espécies, sendo encontrado principalmente na América do Sul. No
Brasil existem, aproximadamente, 30 espécies distribuídas em todo território
nacional. Tem uma vasta nomenclatura popular, sendo os principais nomes:
jararaca, jararacuçu, caiçara, urutu, entre outros. Habitam principalmente áreas
rurais e periferias de grandes cidades, com hábitos noturnos ou crepusculares. As
principais espécies são: B. atrox, encontrada principalmente na região Amazônica
(Figura 5A); B. erythromelas encontrada na região Nordeste (Figura 5B); B. jararaca
encontrada tanto em áreas agrícolas e periurbanas, como áreas silvestres. É a
espécie mais comum da região Sudeste (Figura 5C), sendo o principal agente
etiológico desta região; B. jararacussu é a maior serpente e a maior produtora de
veneno do gênero, encontrada nas regiões Sul e Sudeste (Figura 5D); B. alternatus
encontrada na região Centro-Oeste a Sul do país (Figura 5E) (Pinho & Pereira,
2001; BRASIL, 2005).
1.2.1 Espécie B. jararaca
A espécie Bothrops jararaca é encontrada nas regiões mais populosas do
Brasil, sendo responsável pelo maior número de casos nestas localidades. Por isso
o estudo de suas toxinas e de neutralização destas é de extrema importância
(Feitosa et al., 1997; Puzzi et al., 2008).
Bothrops jararaca (Figura 6) é uma serpente terrestre de tamanho médio
(1,20 m a 1,60 m), sendo as fêmeas maiores e mais volumosas que os machos. O
padrão de coloração desta espécie é bastante variado, apresentando desenhos
semelhantes a um “V” invertido de coloração marrom escura ao longo do dorso
(Campbell & Lamar, 2004; Puzzi et al., 2008).
24
Figura 5: Distribuição geográfica das principais espécies do gênero Bothrops no Brasil. A) B. atrox; B) B. erythromelas; C) B. jararaca; D) B. jararacussu; E) B. alternatus Fonte: FUNASA/2001
Esta espécie ocorre no Brasil, Argentina e Paraguai, apresentando maior
distribuição no território brasileiro (Figura 6), desde o Sul da Bahia até o Rio Grande
do Sul. Têm hábitos predominantemente noturnos ou crepusculares e quando
ameaçadas podem apresentar comportamento agressivo, desferindo botes sem
produzir ruídos. O veneno destas serpentes tem ação proteolítica, coagulante e
hemorrágica, sendo seus sinais e sintomas caracterizados por dor intensa, edema,
necrose, hemorragias locais e/ou sistêmicas, entre outros (Pinho & Pereira, 2001;
FUNASA, 2001; Brasil, 2005; Puzzi et al., 2008).
1.3 Função e Composição do Veneno
Os venenos das serpentes desempenham um papel de muita importância
para sua sobrevivência. São constituídos por toxinas que promovem a imobilização
A B C
D E
25
da presa e sua posterior digestão, além de servir como um excelente arsenal
defensivo (Fletcher & Jiang, 1998; Dhananjaya & D‟Souza, 2010; Isbister, 2010).
Figura 6: Foto da serpente B. jararaca e sua distribuição. (Fonte: OMS – Foto Mark O‟Shea)
A peçonha da serpente é uma mistura complexa de toxinas com natureza
química bastante diferenciada e com amplo espectro de ação. Sua composição varia
de acordo com a espécie, localização geográfica, idade, sexo, dentre outros fatores
(Markland, 1998; Junqueira de Azevedo & Ho, 2002; Oliveira et al., 2003;
Dhananjaya & D‟Souza, 2010; Isbister, 2010).
Essas secreções são concentrados de proteínas e peptídeos (90 % a 95 % do
peso seco do veneno). Porém também se encontram aminas vasoativas,
carboidratos, lipídeos, nucleotídeos e íons inorgânicos, como cálcio, zinco, sódio
entre outros (Figura 7), que interferem no sistema nervoso central, cardiovascular,
muscular, hemostático, renal e vascular (Markland, 1998; Koh et al., 2006).
26
Dentre as proteínas encontradas no veneno ofídico, destacam-se as
metaloproteases (Hite et al., 1994; Fox & Serrano, 2005, 2008; Escalante et al.,
2011; Takeda et al., 2011), fosfolipases A2 (PLA2) (Fuly et al., 1997, 2002; Tsai,
2007; Angulo & Lomonte, 2009; Doley & Kini, 2009; Galacci & Cavalcante, 2010;
Sun et al., 2010), serinoproteases (Koh et al., 2006; Angulo & Lomonte, 2009;
Teixeira et al., 2009), nucleotidases (Antunes et al., 2010; Dhananjaya & D‟Souza,
2010), dentre outras.
As metaloproteases presentes nos venenos das serpentes induzem intensa
hemorragia, sendo assim denominadas de hemorraginas. A hemorragia observada
ocorre pela ação direta das metaloproteases nos capilares, com destruição da
lâmina basal e degradação de proteínas da parede vascular, como integrinas,
laminina, fibronectina e colágeno. Além destes efeitos, estas proteínas promovem
alterações na coagulação sanguínea (Fox & Serrano, 2005, 2008; Escalante et al.,
2011).
As serinoproteases representam outra classe de enzimas que atuam
diretamente na coagulação sanguínea, conhecidas como trombina-símile. Estas
enzimas clivam o fibrinogênio gerando fibrina, porém não ativam o fator XIII da
coagulação, que o responsável pela estabilização do coágulo. Além da clivagem do
fibrinogênio, estas enzimas clivam outras proteínas da cascata da coagulação
sanguínea, gerando microcoágulos pelo organismo (Koh et al., 2006; Angulo &
Lomonte, 2009; Teixeira et al., 2009).
Outra classe de enzimas presentes nas secreções venenosas das serpentes
são as fosfolipases A2. Estas enzimas são responsáveis por diversas atividades
provocadas pelos venenos, dentre eles efeitos miotóxico, edematogênico, agregante
plaquetário, hemolítico e coagulante (Fuly et al., 1997, 2002; Tsai, 2007; Angulo &
Lomonte, 2009; Doley & Kini, 2009; Galacci & Cavalcante, 2010; Sun et al., 2010).
27
Figura 7: Componentes presentes no veneno de serpentes.
(Fonte: Ramos, 2001 apud de Paula, 2009, p. 15)
Algumas destas toxinas presentes no veneno de B. jararaca vêm sendo
identificadas e isoladas. Serrano e colaboradores (1999) isolaram a BJ-PLA2, uma
fosfolipase A2 com efeito inibitório da agregação plaquetária. Zingali e colaboradores
28
(1993) isolaram a bothrojaracina, uma enzima inibidora da trombina (anticoagulante).
Por outro lado, Berger e colaboradores (2008) purificaram bothrojaractivase, uma
metaloprotease pró-coagulante. Outras toxinas têm sido caracterizadas, como o
HF3, bothropasina (Oliveira et al., 2009), jararafibrases (I, II, III e IV) (Maruyama et
al., 2002), jarastatina (Coelho et al., 1999), entre outras.
É importante ressaltar que as manifestações clínicas do acidente ofídico estão
condicionadas a toxidez intrínseca e a quantidade de peçonha injetada (Matsui et al.,
2000; Koh et al., 2006).
1.4 Tratamento dos Acidentes Ofídicos
O tratamento indicado em todo o mundo é a administração intravenosa de
soro hiperimunizado (soroterapia), normalmente de cavalo. A produção de soro
antiveneno iniciou-se em 1894 por Calmette & Phisalix e Bertrand, impulsionado
pela soroterapia antitétano e antidiftérica. No Brasil, a produção de soro antiofídico
foi implantada por Vital Brazil, em 1901, utilizando o mesmo protocolo de Calmette
(Vilar et al., 2005; Gutiérrez & León, 2009).
O protocolo de produção do soro antiofídico é relativamente simples. Doses
de veneno são inoculadas em animais (equinos, normalmente), que produzem
anticorpos contra as proteínas imunogênicas do veneno. Esse animal é sangrado e
faz-se a separação do plasma e das hemácias, sendo estas devolvidas ao animal. A
fração de imunoglobulinas é precipitada com sulfato de amônia, podendo ser tratada
com pepsina ou papaína gerando fragmentos divalentes (F(ab‟)2) ou monovalentes
(Fab) das moléculas de anticorpo (Figura 8) que são responsáveis por neutralizar o
veneno (FUNASA, 2001; FIOCRUZ, 2002; Vilar et al., 2005; Gutiérrez & León,
2009). Esses passos de purificação se dão na tentativa de reduzir os riscos de
reações alergênicas, visto que o soro possui proteínas não-IgGs com alta incidência
de efeitos adversos (Gutiérrez & León, 2009).
29
Figura 8: Estrutura geral de um anticorpo. Local de clivagem pela pepsina/papaína. (Modificado de Nelson & Cox, 2002)
Os soros podem ser classificados em monovalentes ou polivalentes quando
para sua produção são utilizados venenos de uma única espécie ou espécies
diferentes, respectivamente. No Brasil é produzido soro com fragmentos F(ab‟)2, em
três principais centros: Fundação Ezequiel Dias (FUNED), em Belo Horizonte,
Instituto Vital Brazil, em Niterói e Instituto Butantan, em São Paulo (Araújo et al.,
2008). No Brasil, o soro antibotrópico (soro utilizado contra o envenenamento
causado por serpentes do gênero Bothrops) é produzido através da obtenção do
veneno de cinco espécies diferentes (Bothrops jararaca 50%, Bothrops jararacussu,
Bothrops alternatus, Bothrops moojeni e Bothrops neuwedii, 12,5% cada) (Araújo et
al., 2008; Gutiérrez & León, 2009).
Apesar de reverter com bastante eficácia os efeitos sistêmicos provocados
pelo veneno no organismo da vítima, diversos estudos têm demonstrado que a
soroterapia é pouco eficaz na neutralização dos efeitos locais, efeitos estes que na
maioria das vezes, são responsáveis pela morbidade observada nos acidentados.
(Da Silva et al., 2007a; Segura et al., 2010). Além disso, o alto custo e a
termolabilidade dos soros geram dificuldades na distribuição e na estocagem dos
mesmos, dificultando ainda mais o tratamento de vítimas em regiões distantes da
rede hospitalar (Morais & Massaldi, 2009; Wen et al., 2009). Além do que, certos
paciente que recebem a soroterapia podem desenvolver reações alérgicas como
febre e urticária, porém em raros casos pode ocorrer anafilaxia e levar o paciente ao
óbito.
30
A soroterapia deve ser realizada o mais rápido possível e a dose administrada
varia de acordo com o tipo e a gravidade do acidente (Tabela 3) (Brasil, 2005). De
acordo com o Ministério da Saúde (BRASIL, 2010) em 2009, dos 125 óbitos
registrados, 108 vitimados receberam o tratamento. De um modo geral, os
agravamentos são causados pela demora e pela baixa qualidade nos atendimentos.
Apesar de reverter com bastante eficácia os efeitos sistêmicos do veneno no
organismo da vítima, esta terapia se mostra pouco eficaz contra os efeitos locais,
que na maioria das vezes, são responsáveis pela morbidade observada nos
acidentados. Além disso, o alto custo e a termolabilidade dos soros geram
dificuldades na distribuição e na estocagem dos mesmos, dificultando ainda mais o
tratamento de vítimas em regiões distantes do polo produtor (região Sudeste)
(Morais & Massaldi, 2009; Wen et al., 2009). Além do que, certos paciente que
recebem a soroterapia podem desenvolver reações alérgicas, que podem gerar
febre e urticária e em poucos casos inclusive levar a óbito por choque anafilático.
Tabela 3: Tratamento preconizado pelo Ministério da Saúde, de acordo com a espécie causadora do acidente e a gravidade dos sintomas.
Fonte: Brasil, 2005
Tendo em vista a problemática descrita anteriormente, torna-se importante a
busca por novos tratamentos que possam complementar e/ou ser uma alternativa a
31
atual soroterapia para neutralização dos efeitos biológicos e toxicológicos do veneno
nas vítimas de acidentes com serpentes peçonhentas.
1.5 Plantas Medicinais
De acordo com a OMS (1998), planta medicinal é todo e qualquer vegetal que
possui, em um ou mais órgãos, substâncias que podem ser utilizadas com fins
terapêuticos ou que sejam precursores de fármacos semi-sintéticos.
O uso de plantas no tratamento e na cura de enfermidades é tão antigo
quanto a espécie humana. Entre as primeiras civilizações, como os sumérios e os
povos babilônicos, plantas como a canela e o coentro, já eram utilizadas com fins
terapêuticos sob a forma de decocto, infuso, vinho e emplastro (Castro, 2005; López,
2006).
Contudo, as primeiras descrições sobre plantas medicinais feitas pelo homem
remontam às sagradas escrituras e ao papiro de Ebers. Este papiro foi descoberto e
publicado por Georg Ebers, sendo traduzido pela primeira vez, em 1890, por H.
Joachin, onde enumera cerca de 100 doenças e descreve, aproximadamente, 800
receitas preparadas com diferentes plantas ou substâncias extraídas de espécies
vegetais (Pinto et al., 2002; Castro, 2005).
O século XVIII e o início do século XIX marcaram o início do processo de
isolamento de princípios ativos de plantas, como por exemplo, a morfina (analgésico,
sedativo) isolada da Papaver somniferum, quinina (antimalarial, antitérmico) isolada
da Cinchona officinalis e a tubocurarina (bloqueador neuromuscular) isolada da
Chondodendron tomentosum (Pinto et al., 2002; Castro, 2005).
Porém, com a revolução Industrial e Tecnológica houve um crescimento da
química experimental, permitindo a síntese laboratorial de novas substâncias
orgânicas, desencadeando a produção acelerada de novos medicamentos e a
medida que derivados mais puros e concentrados de plantas se tornaram
disponíveis, os médicos priorizaram os fármacos sintéticos e passaram a
desconsiderar o papel importante da fitoterapia (De França et al., 2008).
32
O avanço da tecnologia e o surgimento de novas metodologias de isolamento
de substâncias naturais farmacologicamente ativas despertaram o interesse pelas
fontes naturais para o desenvolvimento de novos fármacos (Calixto, 2003). Em
2000, o mercado fitoterápico faturou US$ 6,6 bilhões nos EUA e US$ 8,5 bilhões na
Europa, sendo a Alemanha, de longe, a maior consumidora de fitoterápicos. No
Brasil, em 2001, este segmento atingiu cerca de US$ 270 milhões, correspondendo
a 5,9 % do mercado brasileiro de medicamentos, superando a comercialização de
genéricos com US$ 226 milhões. Atualmente o segmento de fitoterápicos movimenta
anualmente, no mundo, cerca de US$ 22 bilhões com um crescimento de 12 % ao
ano (Pinto et al., 2002; Calixto, 2003).
Uma variedade de espécies vegetais de diferentes famílias vem sendo
avaliada com propriedade antiofídica. Acredita-se que cerca de 80 % da população
mundial usam plantas como a primeira ajuda terapêutica em casos de
envenenamento (Oliveira et al., 2005; Lomonte et al., 2009).
De acordo com Vilar e colaboradores (2005), na década de 70 do século XX
houve um expressivo avanço nos estudos sobre plantas medicinais antiofídicas
visando, não apenas citar os usos das plantas com base nas representações
populares. E, sim avaliar seus efeitos inibitórios através de experimentos
controlados, com validação científica.
Biondo e colaboradores (2003) descreveram o extrato aquoso de Mandevilla
velutina com propriedades antiofídicas. Este extrato inibiu atividades biológicas
provocadas pelos venenos de Crotalus durissus e Bothrops sp., além de neutralizar
a ação de toxinas isoladas destes venenos, como por exemplo crotoxina (isolada de
C. durissus) e botrhopstoxina I e II (B. jararacussu). Em outro trabalho este extrato
foi capaz de neutralizar as atividades hemolítica, hemorrágica, coagulante e
proteolítica provocadas pelo veneno de Lachesis muta (De Paula et al., 2009). Além
da M. velutina, outras espécies vegetais apresentam perfis antiofídicos. Eclipta
prostata se mostrou eficiente na neutralização da atividade miotóxica e neurotóxica
da serpente C. durissus (Mors et al., 1989), atividade miotóxica e hemorrágica das
serpentes B. jararaca, B. jararacussu e L. muta. (Melo et al., 1994). Casearia
sylvestris foi identificadas com potencial antiofídico frente aos venenos de Bothrops
sp. (Borges et al., 2001), L. muta (De Paula et al., 2009).
33
Mors e colaboradores (2000) associaram alguns metabólitos especiais de
plantas conhecidamente antiofídicas, com a sobrevivência de camundongos junto ao
envenenamento por B. jararaca. Dentre esses metabólitos podem-se citar os
terpenóides (triterpenos), esteróides, flavonóides, cumarinas, taninos e
pterocarpanos prenilados, sugerindo que a ação destas substâncias se deve a
capacidade de complexação com alvos macromoleculares (receptores e enzimas),
além de atividades quelantes de íons divalentes.
1.5.1 Clusia fluminensis Planch & Triana
A família Clusiaceae Lindley (Guttiferae Juss.) possui representantes nas
regiões semi-áridas da África, Ásia e Oceania, porém sua ampla distribuição ocorre
em regiões tropicais. De acordo com a classificação de Dahlgren (1980), esta família
é constituída por 50 gêneros e cerca de 1.200 espécies. No Brasil, está
representada por 19 gêneros com ampla distribuição, especialmente na região
Amazônica (Andrade et al., 2002; Gasparotto Junior, et al., 2005). No entanto de
acordo com Stevens (2011 onwards), a família Clusiaceae compreende apenas 14
gêneros.
Espécies de Clusia são de grande interesse paisagístico, no manejo
ambiental e reflorestamento de áreas de restinga (Correia et al., 1993), sendo alguns
representantes do gênero de grande importância na medicina popular, contra
hipertensão (García-Gonzáles & Matamoros, 1998), dores (Sanz-Biset et al., 2009),
úlceras e feridas (Langenheim, 2003).
Do ponto de vista químico a família apresenta-se caracterizada pela presença
de xantonas, benzofenonas, terpenóides, flavonóides, dentre outras classes de
metabólitos especiais, responsáveis por efeitos anti-hipertensivos, antibacterianos,
inibitório do vírus HIV e antiofídico (Castro et al., 1999; Gasparotto Junior, et al.,
2005; Noldin et al., 2006). Estudos com este gênero têm demonstrado a produção
de terpenóides e esteróides (lupenona, friedelina, sitosterol, entre outros) e algumas
benzofenonas (weddellianona A, clusianona e spiritona) (Nagen et al., 1993; Porto et
al., 2000).
34
C. fluminensis Planch & Triana possui folhas obovadas, carnosas e coriáceas
(Figura 9A) e suas flores são brancas com estames amarelos e anteras laranja
(Figura 9B). Seu tipo foi coletado no Rio de Janeiro por Gaudichaud em 1833. É uma
espécie bastante utilizada em paisagismos (Fernandes, 2007).
Castro e colaboradores (1999) descreveram duas espécies de Clusia, C.
palmana e C. torresii com propriedade anti-hemorrágica provocada pelo veneno de
B. asper. Contudo, nenhuma outra espécie deste gênero fora testada frente as
atividades biológicas provocadas por venenos de serpente.
Figura 9: Fotos de Clusia fluminensis. A) Detalhe das folhas. B) Detalhe da flor. Fonte: da Silva, 2011 (Fotos cedidas por Maria Carolina Anholeti da Silva)
A B
35
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Avaliar a capacidade do extrato vegetal e de uma substância pura isolada a
partir de C. fluminensis na neutralização do veneno de B. jararaca frente a atividades
proteolítica, hemolítica, coagulante e hemorrágica.
2.2. Objetivos Específicos
Avaliar o efeito de extratos brutos da planta Clusia fluminensis obtidos por
diferentes solventes e partes do vegetal na neutralização de atividades
biológicas:
o Atividade in vitro proteolítica.
o Atividade in vitro hemolítica.
o Atividade in vitro coagulante.
o Atividade in vivo hemorrágica.
Avaliar o potencial antiofídico da benzofenona isolada do extrato hexânico das
flores da Clusia fluminensis para as mesmas atividades acima.
36
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Material
Azocaseína, EDTA, citrato de sódio, tri-hidroximetil-aminometano (Tris),
cloreto de cálcio (CaCl2), ácido tricloroacético (TCA) foram obtido da Sigma
Chemical Co. (St. Louis, USA). Os demais reagentes foram obtidos no mais alto
nível de pureza disponível no mercado.
3.2 Obtenção do veneno de Bothrops jararaca
O veneno bruto da serpente B. jararaca liofilizado foi gentilmente cedido pelo
Prof. Eládio F. Sanchez, Fundação Ezequiel Dias (FUNED), Belo Horizonte, MG e
mantido a -20 ºC até o momento dos ensaios biológicos.
3.3 Animais
Os camundongos da linhagem BALB-C, independente do sexo, pesando entre
18-22 g foram provenientes do Núcleo de Animais de Laboratório (NAL) da
Universidade Federal Fluminense mantidos sob controle de luminosidade,
temperatura e com ração e água filtrada à vontade. Este projeto foi aprovado pela
Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) desta Universidade, sob o número
00029/2010.
3.4 Extrato vegetal
O material vegetal da Clusia fluminensis foi coletado no forte Barão do
Imbuhy, em Jurujuba, Niterói. Exemplares férteis foram coletados, herborizados e
37
identificados pelo Prof. Dr. Marcelo Guerra (FFP/UERJ), e encontram-se
depositados no Herbário da Faculdade de Formação de Professores da
Universidade do Estado do Rio de Janeiro sob o número de registro RFFP 9213.
Para a utilização nos ensaios, os extratos vegetais (Tabela 4) foram
preparados pela aluna de doutorado Maria Carolina Anholete da Silva, no
Laboratório de Botânica Estrutural e Funcional, sob coordenação da Professora Drª.
Selma Ribeiro de Paiva, do Instituto de Biologia, Universidade Federal Fluminense.
Os extratos foram preparados por maceração estática com trocas sucessivas dos
solventes até a exaustão. A benzofenona foi isolada a partir do extrato bruto das
flores por cromatografia contracorrente.
Os extratos foram ressuspensos em acetona, na concentração de 60 mg/mL e
armazenados a -20 ºC até o momento dos ensaios biológicos. A benzofenona foi
ressuspensa em DMSO, na concentração de 50 mg/mL e mantidos a temperatura
ambiente.
Tabela 4: Quadro indicativo dos solventes e partes do vegetal utilizadas para o preparo dos extratos e os códigos dos extratos utilizados no trabalho.
SOLVENTE PARTE DO VEGETAL CÓDIGO
HEXANO
FOLHA HEX. FOLHA
FRUTO HEX. FRUTO
CAULE HEX. CAULE
FLOR HEX. FLOR
METANOL
FOLHA MET. FOLHA
FRUTO MET. FRUTO
CAULE MET. CAULE
DICLOROMETANO FLOR DICLO. FLOR
ACETONA FRUTO ACET. FRUTO
CAULE ACET. CAULE
3.5 Protocolo de neutralização
Todos os ensaios de neutralização foram feitos usando diferentes proporções
(veneno:planta). O veneno de B. jararaca foi incubação por 30 ou 60 minutos a
38
temperatura ambiente com os extratos das plantas. Após este período, os ensaios
biológicos (proteolítica, hemolítica, coagulante e hemorrágica) foram realizadas
como descrito a seguir, mantendo os seguintes grupos:
Grupo a: Veneno bruto + salina (controle do veneno)
Grupo b: Veneno bruto + solvente (controle positivo)
Grupo c: Extratos/benzofenona + salina (controle negativo)
Grupo d: Veneno bruto + extratos/benzofenona
3.6 Atividades biológicas
3.6.1 Atividade Proteolítica
A atividade proteolítica do veneno de B. jararaca foi determinada usando-se
azocaseína como substrato (Garcia et al., 1978), com algumas modificações.
Alíquotas do veneno de B. jararaca foram incubadas com azocaseína 0,2 % (p/v) em
tampão 200 mM Tris-HCl, 20 mM CaCl2, pH 8,8. O volume final (1,2 mL) da reação
foi completado pela adição de 150 mM NaCl. Em seguida as amostras foram
incubadas a 37 ºC e após 90 minutos a reação foi interrompida pela adição de 0,4
mL TCA 10 %. Em seguida, os tubos foram centrifugados a 12.000 rpm por 5
minutos, e 1 mL do sobrenadante foi adicionado a 0,5 mL NaOH 2 N. A atividade
proteolítica foi quantificada em espectrofotômetro (Biospectro SP-22) em
absorbância A 420 nm e a Concentração Efetiva (CE) foi designada como a
quantidade de veneno (μg/mL) capaz de produzir uma variação de 0,2 em A 420 nm.
O efeito neutralizante dos extratos vegetais foi avaliado através da pré-
incubação dos extratos nas proporções de 1:5, 1:10, 1:20 e 1:50 (veneno:extrato)
com o veneno bruto por 30 minutos a temperatura ambiente, e em seguida, o ensaio
biológico foi realizado como descrito acima.
39
3.6.2 Atividade Hemolítica
A atividade hemolítica do veneno de B. jararaca foi determinada através da
hemólise indireta usando hemácias humanas lavadas e gema de ovo de galinha
como fonte de fosfolipídios como substrato (Fuly et al., 1997). A gema de ovo foi
diluída em NaCl (0,15 M) 1:1 (v/v), e em seguida a mistura foi centrifugada a 12.000
rpm por 60 minutos a 10 °C. O precipitado foi descartado e o sobrenadante contendo
os fosfolipídios foi utilizado como substrato no ensaio, que ocorreu em duas etapas:
A) incubação do veneno bruto de B. jararaca com o substrato e; B) avaliação da
atividade hemolítica através da liberação de hemoglobina pela produção de
lisolecitina gerada enzimaticamente na etapa anterior. Inicialmente, as amostras
contendo o veneno foram adicionados a um meio de reação contendo CaCl2 (8 mM,
concentração final) e gema de ovo (50 μL) em um volume final de 250 μL. Após 15
minutos a 37 °C, a reação enzimática foi interrompida com adição de EDTA
(concentração final, 10 mM). Em seguida 3,2 mL de NaCl (0,15 M) foram
adicionados aos tubos e 1,3 mL de uma suspensão a 2 % (v/v) de hemácias
humanas previamente lavadas por centrifugação com NaCl (0,15 M). Após 1 hora de
incubação a 37 °C, os tubos foram centrifugados a 2.000 rpm por 8 minutos a
temperatura ambiente e a hemoglobina liberada no sobrenadante quantificada em A
578 nm. A hemólise total (100 %) foi obtida na suspensão de eritrócitos após
completa lise com água destilada e comparada com o percentual de hemólise obtido
nos tubos contendo veneno ou os extratos vegetais. A quantidade de veneno
(μg/mL) que causou 70-80 % de hemólise foi usada nos experimentos de
neutralização e designada como Concentração Efetiva (CE).
O efeito neutralizante dos extratos vegetais na hemólise foi avaliado pré-
incubando os extratos aquosos com uma Concentração Efetiva (CE) do veneno
bruto por 30 minutos nas proporções de 1:10 e 1:20 e 60 minutos na proporção de
1:20 a temperatura ambiente, e em seguida o ensaio de hemólise realizado como
descrito acima.
40
3.6.3 Atividade Coagulante
O plasma utilizado foi obtido através de um „‟pool de plasma‟‟ citratado (0,3 %
v/v, concentração final) cedido pelo Hospital Universitário Antônio Pedro do banco
de sangue que seriam descartados, de doadores humanos sadios. Este plasma (100
μL) foi diluído em salina (1:1, v/v) e transferido para tubos plásticos. Após 1 minuto a
37 °C, alíquotas do veneno de B. jararaca foram adicionadas ao plasma citratado e o
tempo de coagulação (em segundos) foi observado através de um coagulômetro
digital modelo Amelung KC 4A. Uma Dose Mínima Coagulante (DMC) foi designada
como a menor concentração de veneno de B. jararaca (μg veneno/ensaio) capaz de
coagular o plasma em 60 segundos, e utilizada neste ensaio.
O efeito neutralizante dos extratos vegetais na atividade coagulante do
veneno de B. jararaca foi avaliado pré-incubando os extratos por 30 minutos nas
proporções de 1:10 e 1:20 e 60 minutos na proporção de 1:20 a temperatura
ambiente com o veneno bruto. Em seguida esta mistura foi adicionada ao plasma e
a coagulação monitorada como descrito acima. O tempo considerado como 100 %
de inibição foi de 10 minutos.
3.6.4 Atividade Hemorrágica
A atividade hemorrágica do veneno de B. jararaca foi determinada utilizando o
método de Kondo e col (1960) modificado. Cem microlitros (100 μL) das amostras
foram injetadas intradermicamente (i.d) na região do abdômen dos camundongos
(n=3), e duas horas após a injeção, os animais foram sacrificados por inalação de
isofluorano e a pele retirada, estirada e os locais de injeção foram analisados
macroscopicamente. A atividade hemorrágica foi quantificada pela formação e
mensuração de halo hemorrágico, em milímetros. Uma Dose Mínima Hemorrágica
(DMH) foi determinada como a dose de veneno (μg veneno/g) capaz de causar um
halo hemorrágico de 10 mm de diâmetro.
O efeito neutralizante dos extratos vegetais foi avaliado pré-incubando os
extratos por 30 minutos na proporção de 1:20 a temperatura ambiente com uma
41
DMH do veneno antes da injeção nos animais, sendo a hemorragia analisada como
descrito acima.
3.7 Análise estatística
Os experimentos foram representados graficamente utilizando-se o programa
Microcal Origin 6.0 e os valores demonstrados representam a média
± erro padrão (SE) utilizando Anova e teste T-Student com valores de p < 0,05.
42
4. RESULTADOS
4.1 Atividade Proteolítica
Com o objetivo de avaliar o extrato de C. fluminensis como agente
neutralizante sobre a atividade proteolítica de B. jararaca, os extratos (Tabela 4)
foram pré-incubados em diferentes razões (1:5, 1:10, 1:20 e 1:50 - veneno:planta)
com o veneno (9 µg/mL) por 30 minutos a temperatura ambiente e em seguida a
atividade foi realizada. A Figura 10 mostra que, de modo geral, os extratos na
proporção 1:5 (Figura 10A) não inibiram com eficácia a proteólise causada pelo
veneno, com exceção dos extratos metanólico e acetônico do fruto, com 42,5 % e
76,7 % de inibição, respectivamente. Na proporção de 1:10 (Figura 10B), o extrato
acetônico do fruto apresentou uma inibição de aproximadamente, 100 %; enquanto
que os demais extratos inibiram parcialmente a proteólise provocada pelo veneno,
cerca de 11 % o extrato hexânico do fruto e 56 % o extrato hexânico do flor. Na
razão de 1:20, os extratos se mostraram mais eficazes, com exceção dos extratos
hexânicos do fruto e caule, com 17,3 % e 29,1 % de inibição, respectivamente
(Figura 10C). Os demais obtiveram um percentual de inibição que variou de 50 a
100 %, com destaque para os extratos metanólicos do fruto e do caule, ambos com
96 % de inibição e o extrato acetônico do caule (81 %) e do fruto (100 %) da inibição
da atividade proteolítica. Na razão de 1:50 (Figura 10D), com exceção do extrato
hexânico do caule, com uma inibição de 37 % na neutralização da atividade
proteolítica provocada pelo veneno de B. jararaca, os extratos se mostraram bem
mais eficientes com destaque para o extrato hexânico do fruto (100 %), metanólico
da folha (100 %) e do fruto (100 %) e acetônico do fruto (aproximadamente 100 %).
Os extratos hexânicos da folha e da flor foram capazes de inibir 92 %, o extrato
metanólico do caule inibiu 84 %, o extrato diclorometânico da flor 63 % e o extrato
acetônico do caule 82 %.
43
Figura 10: Efeito dos extratos de C. fluminensis na atividade proteolítica provocada pelo veneno de B. jararaca. O veneno e os extratos foram pré-incubados durante 30 minutos a temperatura ambiente em diferentes proporções veneno:planta (1:5 (A); 1:10 (B); 1:20 (C) e 1:50 (D)).
*
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* *
* *
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* *
44
Os resultados expressam a média ± SE de três experimentos individuais (n= 3) com p < 0,05, valores comparados com o controle positivo (veneno + acetona) (dados não mostrados).
Além dos extratos brutos, também foi testado como inibidor da proteólise
causada pelo veneno da serpente B. jararaca uma benzofenona (clusianona) isolada
do extrato hexânico da flor, com as mesmas proporções utilizadas para os extratos
(Figura 11). Na proporção de 1:5 não houve inibição significativa. Entretanto, nas
demais proporções (1:10, 1:20 e 1:50) houve uma inibição em torno de 40 % a 50 %.
A benzofenona obteve uma resposta inibitória menor que a resposta para o extrato
bruto correspondente (Figura 11). Os extratos vegetais e a benzofenona quando
testados na ausência do veneno de B. jararaca não foram capazes de hidrolisar a
azocaseína; assim como o DMSO e a acetona testados com o veneno não inibiram
a atividade proteolítica provocada pelo mesmo (dados não mostrados).
HEX. FLOR
BENZOFENONA
0
20
40
60
80
100
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e I
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o d
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rote
ólis
e
Figura 11: Comparação entre o efeito do extrato hexânico da flor de C. fluminensis e a benzofenona isolada deste extrato na atividade proteolítica provocada pelo veneno de B. jararaca. O veneno e o extrato/benzofenona foram pré-incubados durante 30 minutos a temperatura ambiente em diferentes proporções veneno:planta (1:5, colunas brancas; 1:10, colunas com listras na horizontal; 1:20, colunas com listras na vertical e 1:50, colunas pretas). Os resultados expressam a média ± SE de três experimentos individuais (n= 3) com p < 0,05, valores comparados com o controle positivo (veneno + acetona/DMSO) (dados não mostrados).
*
*
*
* * *
45
4.2 Atividade Hemolítica
Para avaliar o efeito dos extratos de C. fluminensis sobre a atividade
hemolítica (Figura 12) causada pelo veneno de B. jararaca (88 µg/mL), inicialmente
os extratos foram pré-incubados em duas proporções diferentes (1:10 e 1:20) com o
veneno bruto por 30 minutos a temperatura ambiente e em seguida a atividade foi
realizada. Na proporção de 1:10, o extrato diclorometânico da flor não apresentou
inibição da hemólise provocada pelo veneno. Os extratos hexânico da flor e
metanólico do fruto apresentam uma inibição de 10 %, enquanto os demais extratos
inibiram entre 35 % a 43 % a hemólise. Na proporção de 1:20, o extrato metanólico
do caule apresentou uma inibição de 100 %. Os extratos hexânico da folha,
metanólico da folha e acetônico do caule inibiram 70 % a 88 % a hemólise.
Curiosamente, os extratos hexânico e acetônico do fruto na proporção 1:20
obtiveram uma inibição menor do que na proporção de 1:10, com inibições de 23 %
e 32 %, respectivamente (Figura 12). O extrato diclorometânico inibiu 4 %. Na
tentativa de melhorar o perfil inibitório dos extratos, estes foram préincubados com o
veneno, na proporção de 1:20, porém por 60 minutos a temperatura ambiente. Os
extratos hexânicos da folha, do fruto e da flor, o extrato metanólico do caule e o
extrato acetônico do fruto tiveram uma redução da inibição da hemólise, quando
comparado com a pré-incubação por 30 minutos na mesma proporção. Mesmo
assim, o extrato metanólico do caule obteve uma inibição de 96 %. Os extratos
hexânico do caule e metanólico do fruto melhoraram suas respostas inibitórias, com
percentuais 80 % de inibição. Apesar da melhora da inibição do extrato
diclorometânico da flor, a inibição não foi expressiva (18 %).
46
HEX. FOLHA
HEX. FRUTO
HEX. CAULE
HEX. FLOR
DICL. F
LOR
ACET. FRUTO
ACET. CAULE
MET. F
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MET. F
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0
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Figura 12: Efeito dos extratos de C. fluminensis na atividade hemolítica provocada pelo veneno de B. jararaca. O veneno e os extratos foram pré-incubados durante 30 minutos a temperatura ambiente nas proporções veneno:planta 1:10 e 1:20 (colunas brancas e colunas listradas, respectivamente) e pré-incubados por 60 minutos na proporção 1:20 (colunas pretas). Os resultados expressam a média ± SE de três experimentos individuais (n= 3) com p < 0,05, valores comparados com o controle positivo (veneno + acetona) (dados não mostrados).
Além dos extratos também foi testado como inibidor da hemólise provocada
pelo veneno de B. jararaca a benzofenona (Figura 13), nas mesmas proporções
descritas anteriormente, porém apenas com o tempo de pré-incubação de 30
minutos. Em ambas as proporções avaliadas não houve inibição da hemólise
provocada pelo veneno. Os extratos vegetais e a benzofenona isoladamente não
foram capazes de produzir hemólise; assim como o DMSO e a acetona
preincubados com o veneno não inibiram a atividade hemolítica provocada pelo
mesmo (dados não mostrados).
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*
* *
*
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*
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47
HEX. FLOR
BENZOFENONA
0
20
40
60
80
100
% d
e I
nib
içã
o d
a H
em
ólis
e
Figura 13: Comparação entre o efeito do extrato Hexânico da Flor de C. fluminensis e a benzofenona isolada deste extrato na atividade hemolítica provocada pelo veneno de B. jararaca. O veneno e o extrato/benzofenona foram pré-incubados durante 30 minutos a temperatura ambiente em diferentes proporções veneno:planta (1:10, colunas brancas; 1:20, colunas pretas). Os resultados expressam a média ± SE de três experimentos individuais (n= 3) com p < 0,05, valores comparados com o controle positivo (veneno + acetona/DMSO) (dados não mostrados).
4.3 Atividade Coagulante
Para avaliar o efeito dos extratos de C. fluminensis sobre a atividade
coagulante provocada pelo veneno de B. jararaca foi utilizado para este ensaio uma
Dose Mínima Coagulante (DMC) (32 µg/mL). Inicialmente os extratos foram pré-
incubados em duas proporções diferentes (1:10 e 1:20) com uma DMC de veneno
por 30 minutos a temperatura ambiente e em seguida a atividade foi realizada.
Nenhum dos extratos foi capaz de promover um aumento no tempo de coagulação
(Figura 14). Os extratos com melhores respostas foram os metanólico do caule e o
48
acetônico do caule, onde o tempo de coagulação foi prolongado por cerca de 2
vezes quando comparado com o controle.
CONTROLE
CONTROLE ACETONA
HEX. FOLHA
HEX. FRUTO
HEX. CAULE
HEX. FLOR
DICL. F
LOR
ACET. FRUTO
ACET. CAULE
MET. F
OLHA
MET. F
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MET. C
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Figura 14: Efeito dos extratos de C. fluminensis na atividade coagulante provocada pelo veneno de B. jararaca. O veneno e os extratos foram pré-incubados durante 30 minutos a temperatura ambiente nas proporções veneno:planta 1:10 e 1:20 (colunas brancas e colunas listradas, respectivamente) e pré-incubados por 60 minutos na proporção 1:20 (colunas pretas). CONTROLE: veneno + salina; CONTROLE ACETONA: veneno + acetona. Os resultados expressam a média ± SE de três experimentos individuais (n= 3) com p< 0,05, valores comparados com o controle positivo (veneno + acetona).
Do mesmo modo que na atividade hemolítica, na atividade coagulante foi
tentado um tempo maior, 60 minutos de pré-incubação dos extratos com o veneno e
na proporção de 1:20. Entretanto, não houve modificação no perfil inibitório (Figura
14).
A benzofenona também foi testada na atividade coagulante, numa proporção
de 1:10 (veneno:substância), assim como a maioria dos extratos a benzofenona não
foi capaz de prolongar, de maneira significativa, o tempo de coagulação plasmática
provocada pelo veneno de B. jararaca (Figura 15).
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* * *
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49
CONTROLE
CONTROLE ACETONA
HEX. FLOR
CONTROLE DM
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150
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Figura 15: Comparação entre o efeito do extrato hexânico da flor de C. fluminensis e a benzofenona isolada deste extrato na atividade coagulante provocada pelo veneno de B. jararaca. O veneno e o extrato/benzofenona foram pré-incubados durante 30 minutos a temperatura ambiente na proporção de 1:10 veneno:planta. CONTROLE: veneno + salina; CONTROLE ACETONA: veneno + acetona. Os resultados expressam a média ± SD de três experimentos individuais (n= 3) com p< 0,05, valores comparados com o controle positivo (veneno + acetona/DMSO).
Os extratos vegetais e a benzofenona isoladamente não coagularam o
plasma sanguíneo (dados não mostrados); assim como o DMSO e a acetona
preincubados com o veneno não prolongaram o tempo de coagulação provocada
pelo mesmo.
4.4 Atividade Hemorrágica
Com a finalidade de avaliar a ação dos extratos de C. fluminensis in vivo, foi
observada a hemorragia causada pela injeção subcutânea do veneno de B. jararaca
(16,7 µg/g) em camundongos. Os extratos foram pré-incubados com o veneno por
* *
50
30 minutos a temperatura ambiente, na proporção de 1:20. A Figura 16 mostra que o
extrato acetônico do fruto foi o único capaz de proteger os animais da hemorragia
causada pelo veneno. O extrato hexânico do fruto inibiu aproximadamente 45 % da
hemorragia provocada pelo veneno. Os demais extratos de C. fluminensis não
inibiram a hemorragia causada pelo veneno (Figura 16).
CONTROLE
CTR ACETONA
HEX. FOLHA
HEX. FRUTO
HEX. CAULE
HEX. FLOR
DICL. F
LOR
ACET. FRUTO
ACET. CAULE
MET. F
OLHA
MET. F
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(m
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Figura 16: Efeito dos extratos de C. fluminensis na atividade hemorrágica provocada pelo veneno de B. jararaca. O veneno e os extratos foram pré-incubados durante 30 minutos a temperatura ambiente na proporção veneno:planta de 1:20. CONTROLE: veneno + salina; CTR ACETONA: veneno + acetona. Os resultados expressam a média ± SD de três experimentos individuais (n= 3) com p< 0,05, valores comparados com o controle positivo (veneno + acetona).
A benzofenona também foi testada na tentativa de neutralizar a atividade
hemorrágica, na mesma proporção descrita anteriormente. Assim como a maioria
dos extratos a benzofenona não foi capaz neutralizar a hemorragia provocada pelo
veneno de B. jararaca (Figura 17). Os extratos vegetais e a benzofenona
isoladamente não provocaram hemorragia no animal (dados não mostrados); assim
como o DMSO e a acetona testada com o veneno não inibiram a hemorragia
provocada pelo mesmo.
*
*
51
CONTROLE
CONTROLE ACETONA
HEX. FLOR
CONTROLE DM
SO
BENZOFENONA
0
5
10
15
20
25
Tam
an
ho
do
Ha
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mm
)
Figura 17: Comparação entre o efeito do extrato hexânico da flor de C. fluminensis e a benzofenona isolada deste extrato na atividade coagulante provocada pelo veneno de B. jararaca. O veneno e o extrato/benzofenona foram pré-incubados durante 30 minutos a temperatura ambiente na proporção de 1:10 veneno:planta. CONTROLE: veneno + salina; CONTROLE ACETONA: veneno + acetona; CONTROLE DMSO: veneno + DMSO. Os resultados expressam a média ± SD de três experimentos individuais (n= 3) com p< 0,05, valores comparados com o controle positivo (veneno + acetona/DMSO).
4.5 Comparativo dos efeitos dos extratos vegetais sobre o veneno de
Bothrops jararaca.
A tabela 5 mostra o percentual de neutralização dos extratos vegetais e da
benzofenona testados sobre as atividades biológicas do veneno de B. jararaca. Os
valores da tabela são referentes aos ensaios biológicos realizados na proporção
veneno/planta de 1:20 e tempo de pré-incubação de 30 minutos, com exceção da
benzofenona na atividade coagulante, onde foi utilizada a proporção de 1:10.
52
Tabela 5: Comparação dos efeitos dos extratos vegetais sobre o veneno de B.
jararaca.
EXTRATOS
INIBIÇÃO DA
PROTEÓLISE
(%)
INIBIÇÃO DA
HEMÓLISE
(%)
ATIVIDADE
COAGULANTE
(vezes de
aumento)
INIBIÇÃO DA
HEMORRAGIA
(%)
1:20 1:20 1:20 1:20
HEX. FOLHA 44,15 73,5 1,06 0
HEX. FRUTO 18,45 23,6 1,11 38,9
HEX. CAULE 33,18 40,53 0,92 0
HEX. FLOR 76,73 37,99 1,32 0
MET. FOLHA 51,79 71,97 1,09 0
MET. FRUTO 97,03 59,64 1,25 0
MET. CAULE 96,31 99,86 1,89 0
DICLO. FLOR 47,84 4,61 1,20 0
ACET.FRUTO 100,00 32,43 1,35 100,0
ACET.CAULE 77,84 88,75 2,14 4,4
BENZOFENONA 47,08 0 1,29* 0
* Valor referente a proporção de1:10.
De acordo com os resultados obtidos, na proporção 1:20 (Tabela 5), podemos
observar que o extrato acetônico do fruto foi capaz de inibir totalmente a proteólise
provocada pelo veneno de B. jararaca, os extratos metanólico do fruto e caule,
obtiveram inibição próxima a 100%, e os extratos hexânico da flor e acetônico do
53
caule, inibições maiores de 75%. A atividade hemolítica provocada pelo veneno de
B. jararaca, foi inibida mais eficazmente pelo extrato metanólico do caule (99,86%),
seguido do extrato acetônico do caule com 88,75% de inibição e dos extratos
hexânico e metanólico da folha com 73,5% e 71,97%, respectivamente. O tempo de
coagulação causado pelo veneno de B. jararaca foi aumentado pelos extratos, com
destaque para os extratos metanólico e acetônico do caule, onde foram capazes de
dobrar, aproximadamente, o tempo de coagulação. O extrato acetônico do fruto foi
capaz de proteger totalmente os animais da hemorragia provocada pelo veneno de
B. jararaca. E o extrato hexânico do fruto protegeu parcialmente (38,9%) os animais
da hemorragia. Com isso, podemos destacar os extratos metanólico e acetônico do
caule, onde obtiveram resultados mais expressivos em pelo menos três atividades
testadas e o extrato acetônico do fruto, que foi capaz de inibir totalmente a proteólise
e a hemorragia provocadas pelo veneno de B. jararaca.
54
5. DISCUSSÃO
O envenenamento ofídico representa um grave problema de saúde pública,
principalmente nos países tropicais em desenvolvimento, gerando 125 mil mortes
por ano. (Pinho e Pereira, 2001; Koh et al., 2006; Kasturiratne et al., 2008; Gutiérrez
et al., 2009). E, segundo a OMS são considerados doenças negligenciadas. Não
obstante, cerca de 370 mil pessoas adquirem alguma sequela irreversível, gerando
um grave problema sócio-econômico para estes indivíduos (OMS, 2007). Estes
acidentes produzem síndromes complexas envolvendo distúrbios graves
hemodinâmicos atingindo os sistemas renal, pulmonar e cardíaco, além de afetar a
pele, os músculos e a vascularização no entorno do local da picada (Matsui et al.,
2000; Koh et al., 2006). Com melhoramento biotecnológico e a introdução de novas
metodologias de isolamento, purificação e sequenciamento de macro e
micromoléculas, diversas toxinas encontradas nos venenos de serpentes já foram
identificadas e seus mecanismos de ação elucidados (Fox & Serrano, 2005; Koh et
al., 2006; Angulo & Lomonte, 2009; Dhananjaya & D‟Souza, 2010). O entendimento
sobre a ação dessas toxinas facilita a tentativa de neutralizá-las.
A utilização da terapia antiveneno ocorre há mais de um século, e neste
tempo nenhuma alternativa para o tratamento foi efetivada. Dados de literatura
apontam que a busca por terapias alternativas tem se intensificado destacando-se a
busca por substâncias de origem natural, como a utilização de soros de serpentes e
de marsupiais como inibidores em potencial de toxinas presente nos venenos de
serpentes, além de diversos trabalhos utilizando extratos vegetais e substâncias
isoladas (Mors et al., 2000; Vilar et al., 2005; Assafim et al., 2011).
Extratos vegetais, assim como substâncias isoladas têm sido utilizados na
tentativa de neutralizar os efeitos provocados pelo envenenamento ofídico, tais
como: Pentaclethra macroloba e saponinas isoladas desta planta (da Silva et al.,
2005, 2007b), Mikania glomerata (Maiorano et al., 2005; de Paula et al., 2009), entre
55
outras. Mors e colaboradores (2000) listam algumas classes de metabólitos
especiais (terpenóides, flavonóides, além de outras substâncias fenólicas) como
responsáveis pelas inibições das toxinas de venenos.
Neste trabalho foram avaliados o efeito neutralizante de extratos da planta
Clusia fluminensis frente as atividades biológicas proteolítica, hemolítica, coagulante
e hemorrágica provocadas pelo veneno de B. jararaca, utilizando diferentes partes
do vegetal, bem como solventes de diferentes polaridades, com o intuito de avaliar
extratos contendo diferentes metabólitos especiais desta planta.
Os extratos em hexano apresentam substâncias de baixa polaridade como
hidrocarbonetos, terpenos e benzofenonas. Os extratos em acetona e diclorometano
apresentam substâncias de baixa a média polaridade como terpenos, benzofenonas,
ácidos graxos e substâncias fenólicas. Os extratos em metanol apresentam
substâncias de média a alta polaridade como substâncias fenólicas com destaque
para flavonóides (da Silva, 2011).
Os extratos testados neste trabalho foram capazes de neutralizar com
eficiência a proteólise in vitro provocada pelo veneno de B. jararaca. Porém a
inibição da atividade coagulante não foi observada. Borges e colaboradores (2001)
utilizando extrato aquoso de Casearia sylvestris encontraram resultados similares,
sugerindo uma possível especificidade sobre as metaloproteases.
O presente trabalho mostrou que o extrato acetônico do fruto foi capaz de
neutralizar totalmente a hemorragia provocada pelo veneno de B. jararaca e o
extrato hexânico dos frutos neutralizou parcialmente a hemorragia, sugerindo que
este gênero apresenta substâncias capazes de neutralizar as hemorraginas
presentes naquelas secreções, destacando os frutos de C. fluminensis como fonte
destes produtos. Compagnone e colaboradores (2008) descreveram a presença de
benzofenonas nos frutos de C. columnaris, porém os resultados obtidos neste
trabalho sugerem que a resposta inibitória da hemorragia não está diretamente
relacionada com esta classe de substância.
Da Silva (2011) demonstrou a presença de terpenóides e flavonóides nos
frutos de C. fluminensis, com um maior percentual de flavonóides encontrados no
extrato em acetona. Castro e colaboradores (1999) descrevem as espécies Clusia
torresii e Clusia palmana (folhas e frutos) como inibidores da hemorragia causada
56
pelo veneno de B. asper. A caracterização química dos extratos em acetato de etila
das folhas destas espécies demonstrou a presença da epicatequina (flavonóide)
como substância majoritária, sendo sugerida como responsável pela ação anti-
hemorrágica dos extratos (Castro et al., 1999).
Os extratos de C. fluminensis também foram capazes de neutralizar a
atividade fosfolipásica do veneno de B. jararaca, com destaque para os extratos
hexânico, metanólico e acetônico do caule, sugerindo a presença de metabólitos
especiais com características inibitórias de PLA2, destacando esta parte vegetal
como fonte destas substâncias. Da Silva (2011) identificou a presença de terpenos
neste extratos. Bernard e colaboradores (2001) descrevem o ácido betulínico e a
betulina (terpenóides) isolado da Betula alba, como inibidor de PLA2. Extratos de
diversas espécies vegetais Mandevilla velutina (Biondo et al., 2003), Rosmarinus
officinalis, Cordia verbenacea (Ticli et al., 2005), Pavo cristatus (Murari et al., 2005),
Stryphnodendron barbatiman, Mikania glomerata, Miconia sp (de Paula, 2009)
também apresentam capacidade inibitória frente a fosfolipases A2.
O mecanismo inibitório de ação dos extratos vegetais na neutralização das
toxinas ainda é pouco entendido. Porém é importante ressaltar que as proteases e
as PLA2 são dependentes de íons divalentes (Zn2+ e Ca2+). Dados de literatura
sugerem que estes metabólitos possam ser quelantes naturais desses íons
impedindo a catálise destas enzimas. Contudo, uma possível interação direta dos
componentes de extratos vegetais com as proteínas presentes nos venenos não
está descartada (Borges et al., 2001; Biondo et al., 2003).
Além dos extratos brutos, também foi testada uma benzofenona (clusianona)
isolada do extrato hexânico das flores de C. fluminensis, sendo esta a substância
majoritária deste extrato (Da Silva, 2011). Este metabólito obteve um perfil
neutralizante das atividades proteolítica, hemolítica e coagulante inferior ao extrato
bruto. A clusianona e o extrato hexânico da flor não foram capazes de inibir a
atividade hemorrágica, estes dados sugerem que a clusianona atua em sinergismo
com outras substâncias do extrato (ou não é a principal responsável pela inibição
das toxinas do veneno). Assafim e colaboradores (2011) utilizaram o extrato
etanólico de Hypericum brasiliense e um flavonóide (quercetina) isolado obtendo
resultados semelhantes com os obtidos neste trabalho. Borges e colaboradores
57
(2001) sugerem que o isolamento das substâncias pode ser problemático devido a
possível ação sinérgica entre os componentes do extrato, porém os autores
ressaltam que para um melhor entendimento do mecanismo de ação destas
substâncias é importante que se trabalhe com os produtos isolados.
Apesar do efeito inibitório observada neste trabalho de alguns extratos
vegetais de C. fluminensis sobre as atividades hemorrágica, coagulante, hemolítica
e proteolítica do veneno de B. jararaca, faz necessário avaliá-los frente a outras
atividades biológicas (edematogênica, nucleotidásica, miotóxica) e frente à
neutralização da letalidade promovida pela inoculação do veneno. Com isso pode-se
assegurar a propriedade antiofídica destes extratos (Gutiérrez & León, 2009).
Deve-se levar em consideração e atentar para o fato de que a composição
dos venenos de serpentes é influenciada por diferentes fatores inerentes as próprias
serpentes (sexo, idade, local, estação do ano) bem como o metabolismo do vegetal
que da mesma forma sofre influências similares. Este conjunto de fatores pode de
alguma forma interferir na capacidade neutralizante dos extratos vegetais, ou seja,
nas suas propriedades antiofídicas.
58
6. CONCLUSÃO
Os extratos de Clusia fluminensis inibiram significativamente a
proteólise provocada pelo veneno de B. jararaca, com exceção dos extratos
hexânico do caule e diclorometânico da flor.
Os extratos hexânicos da folha e caule, metanólicos da folha, fruto e
caule e o extrato acetônico do caule inibiram de maneira significante a hemólise
provocada pelo veneno de B. jararaca.
Os extratos de C. fluminensis não prolongaram eficazmente o tempo de
coagulação sanguínea provocada pelo veneno de B. jararaca.
O extrato acetônico do fruto foi o único capaz de inibir totalmente a
hemorragia causada pelo veneno de B. jararaca; o extrato hexânico do fruto inibiu
parcialmente esta hemorragia, indicando as substâncias presentes no fruto
importantes para a neutralização de metaloproteases hemorrágicas presentes no
veneno.
A parte vegetal, bem como o solvente utilizado no preparo dos extratos
deve ser considerada, sendo importante para o efeito neutralizante dos mesmos.
Os resultados mostram que a clusianona não é a responsável,
isoladamente, pelos efeitos observados contra as atividades do veneno de B.
jararaca.
Estudos posteriores a fim de identificar e isolar outros componentes
dos extratos vegetais que possam ser responsáveis por estes efeitos neutralizantes
nas atividades biológicas do veneno de B. jararaca, deveram ser realizados a fim de
compreender melhor o mecanismo de ação destes extratos sobre as toxinas do
veneno.
59
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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72
ADENDO
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# Manuscrito submetido à revista Memórias do Instituto Oswaldo Cruz
Evaluation of the Plant Clusia fluminensis Planch & Triana in Neutralization of
Biological Activity of Bothrops jararaca venom
Eduardo Coriolano de Oliveira1,2, Maria Carolina A. da Silva2, Camila N. Faioli1,
Thaísa F. S. Domingos1, Eládio F. Sanches3, Selma R. de Paiva2, André L. Fuly1
1Laboratório de Venenos e Toxinas de Animais e Avaliação de Inibidores,
Departamento de Biologia Celular e Molecular, Instituto de Biologia, Universidade
Federal Fluminense, Niterói, RJ, Brasil
2Laboratório de Botânica, Departamento de Biologia Geral, Instituto de Biologia,
Universidade Federal Fluminense, Niterói, RJ, Brasil
3Centro de Pesquisa e Desenvolvimento, Fundação Ezequiel Dias, Belo Horizonte,
MG, Brasil