SERVICcedilO PUacuteBLICO FEDERAL
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARAacute NUacuteCLEO DE MEDICINA TROPICAL
PROGRAMA DE POacuteS- GRADUACcedilAtildeO EM MEDICINA TROPICAL
ANA MARIA ALMEIDA SOUZA
AUTOANTICORPOS CONTRA ANTIacuteGENOS CELULARES E SUA CORRELACcedilAtildeO COM O GENOacuteTIPO VIRAL EM PACIENTES COM INFECCcedilAtildeO PELO VIacuteRUS DA
HEPATITE C (HCV)
Beleacutem 2011
ANA MARIA ALMEIDA SOUZA
AUTOANTICORPOS CONTRA ANTIacuteGENOS CELULARES E SUA CORRELACcedilAtildeO
COM O GENOacuteTIPO VIRAL EM PACIENTES COM INFECCcedilAtildeO PELO VIacuteRUS DA HEPATITE C (HCV)
Dissertaccedilatildeo apresentada ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Doenccedilas Tropicais do Nuacutecleo de Medicina Tropical da Universidade Federal do Paraacute como requisito para obtenccedilatildeo do grau de mestre em Doenccedilas Tropicais Orientador Prof Dr Juarez Antonio
Simotildees Quaresma
Beleacutem 2011
Dados Internacionais de Catalogaccedilatildeo-na-Publicaccedilatildeo (CIP)
Souza Ana Maria Almeida
Autoanticorpos contra antiacutegenos celulares e sua correlaccedilatildeo com o Genoacutetipo viral em pacientes com infecccedilatildeo pelo viacuterus da Hepatite C (HCV) Ana Maria Almeida Souza orientador Juarez Antocircnio Simotildees Quaresma ndash Beleacutem 2011
72 f Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Medicina Tropical) ndash Universidade Federal do Paraacute Nuacutecleo
de Medicina Tropical Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Medicina Tropical Beleacutem 2011 1 Autoanticorpos 2 Hepatite C 3 Genoacutetipo Tiacutetulo
CDU 61636-002
Catalogaccedilatildeo na Fonte Luciene Dias Cavalcante - CRB21076
ANA MARIA ALMEIDA SOUZA
AUTOANTICORPOS CONTRA ANTIacuteGENOS CELULARES E SUA CORRELACcedilAtildeO COM O GENOacuteTIPO VIRAL EM PACIENTES COM INFECCcedilAtildeO PELO VIacuteRUS DA
HEPATITE C (HCV)
Dissertaccedilatildeo apresentada ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Doenccedilas Tropicais do Nuacutecleo de Medicina Tropical da Universidade Federal do Paraacute como requisito para obtenccedilatildeo do grau de mestre em Doenccedilas Tropicais Aacuterea Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais
Aprovada em _____________
BANCA EXAMINADORA
______________________________________ - Orientador Prof Dr Juarez Antonio Simotildees Quaresma Nuacutecleo de Medicina Tropical ndash UFPA ______________________________________ - Membro Profa Dra Clea Nazareacute Carneiro Bichara Centro de Ciecircncias Bioloacutegicas e da Sauacutede ndash UEPA ______________________________________ - Membro Prof Dr Lacy Cardoso de Brito Juacutenior Instituto Centro de Ciecircncias Bioloacutegicas ndash UFPA ______________________________________ - Membro Prof Dr Ismaelino Mauro Nunes Magno Centro Universitaacuterio do Paraacute - CESUPA
A DEUS QUE NA SUA SUPREMACIA E GRANDEZA PERMITIU A MINHA EXISTEcircNCIA
A MEU PAI EMMANOEL (IN MEMORIAM) QUE DENTRO DE SUA HUMILDADE E
SIMPLICIDADE SEMPRE ME PROPORCIONOU ENSINAMENTOS DE VIDA E QUE LEMBRO SEMPRE SUAS FRASES ldquoNUNCA DEcirc SUA RAZAtildeO A NINGUEacuteM PROCURE
SEMPRE FAZER AS COISAS CERTAS PARA QUE POSSAS ANDAR SEMPRE DE PEITO ABERTO E CABECcedilA ERGUIDArdquo
ldquoO ESTUDO Eacute A UacuteNICA HERANCcedilA QUE POSSO DEIXAR E QUE NINGUEacuteM VAI BRIGAR CONTIGO POR CAUSA DELArdquo
A MINHA MAtildeE SANCHA QUE SEMPRE FOI EXEMPLO DE BATALHA E VIGOR COM DOM
DE SER MAtildeE ESPOSA E PROFISSIONAL SEM PERDER NUNCA SUA CALMA TRANQUumlILIDADE E BONDADE PROCURANDO AJUDAR SEMPRE TODOS QUE A
RECORRIAM
AO RIBAMAR GRANDE AMOR DE MINHA VIDA MEU COMPANHEIRO DE 32 ANOS QUE DO SEU JEITO SEMPRE ME APOacuteIA NA REALIZACcedilAtildeO DOS MEUS SONHOS
AOS MEUS AMADOS FILHOS RODRIGO RAFAEL E ANA CAROLINA QUE SEMPRE ME
MOTIVARAM A LUTAR PELOS MEUS OBJETIVOS PARA ASSIM SERVIR DE INCENTIVO E EXEMPLO PARA ELES
AS MINHAS SOGRAS LOURDES E RAIMUNDA (IN MEMORIAM) QUE SEMPRE ESTIVERAM
AO MEU LADO AJUDANDO NA CRIACcedilAtildeO DOS MEUS FILHOS PARA QUE EU PUDESSE REALIZAR MINHAS TAREFAS E ALCANCcedilAR MEU CRESCIMENTO PROFISSIONAL
AGRADECIMENTOS
Ao Prof Dr Juarez Antonio Simotildees Quaresma meu orientador e incentivador pelos ensinamentos e orientaccedilatildeo para a conclusatildeo desta aacuterdua tarefa Ao meu cunhado Prof Dr Carlos Leocircnidas Silva Souza Sobrinho que sempre me incentivou nessa caminhada Aos amigos Dra Isabella e Dr Alberto Amaral que muito me ajudaram me apoiaram e permitiram minhas ausecircncias no laboratoacuterio para a conclusatildeo desta jornada Ao colega MS MD David Bichara que disponibilizou seu tempo para a realizaccedilatildeo dos testes de FAN de maior importacircncia para a execuccedilatildeo deste trabalho A colega Profa Dra Cleacutea Bichara que com seu apoio me deu animo para a execuccedilatildeo deste trabalho A colega Maria do Socorro de Oliveira Cardoso companheira de trabalho pelo incentivo e torcida para a concretizaccedilatildeo desta tarefa A todos os amigos do laboratoacuterio Amaral Costa pela incondicional torcida e apoio para que eu pudesse chegar ao final desta jornada A Profa Dra Luisa Caricio Martins pela sua ajuda incondicional na cedencia dos dados dos pacientes e liberaccedilatildeo das amostras do material bioloacutegica de sua soroteca sem a qual esse trabalho seria impossiacutevel de se realizar Ao futuro colega de profissatildeo doutorando Geraldo Duarte pelas contribuiccedilotildees na conclusatildeo estatiacutestica dos resultados encontrados Ao Prof Dr Ismaelino Mauro Nunes Magno que tem se empenhado me incentivando na conclusatildeo desta meta meu anjo auxiliar A todos os componentes da banca examinadora pelo comprometimento e a forma muito simples que no momento da qualificaccedilatildeo me fizeram vecirc e buscar as melhorias ao trabalho ora apresentado A Luciene Dias Cavalcante bibliotecaacuteria do HOL pela ajuda imprescindiacutevel na elaboraccedilatildeo desta dissertaccedilatildeo A todos que de forma direta ou indireta colaboraram para a realizaccedilatildeo deste sonho
CONFIE AS COISAS ACONTECEM NA HORA CERTA
EXATAMENTE QUANDO DEVEM ACONTECER MOMENTOS FELIZES LOUVE A DEUS
MOMENTOS DIFIacuteCEIS BUSQUE A DEUS MOMENTOS SILENCIOSOS ADORE A DEUS
MOMENTOS DOLOROSOS CONFIE EM DEUS CADA MOMENTO AGRADECcedilA A DEUS
ENTENDER A VONTADE DE DEUS NEM SEMPRE Eacute
FAacuteCIL MAS CRER QUE ELE ESTAacute NO COMANDO E TEM
UM PLANO PARA NOSSA VIDA FAZ A CAMINHADA VALER
Agrave PENA
(DESCONHECIDO)
RESUMO
As inflamaccedilotildees do fiacutegado provocadas pelos viacuterus hepatotroacutepicos atingem milhotildees de
pessoas e representa significativo problema de sauacutede puacuteblica em todo o mundo
Existem interaccedilotildees entre viroses hepatotroacutepicas e o sistema imunoloacutegico do hospedeiro
que podem influenciar na patogenicidade da agressatildeo hepaacutetica O objetivo deste
trabalho foi investigar a frequumlecircncia de auto-anticorpos em pacientes portadores do viacuterus
da hepatite C e sua correlaccedilatildeo com os genoacutetipos encontrados Foram estudados 51
pacientes com diagnoacutestico confirmado pelo PCR de infecccedilatildeo pelo viacuterus da hepatite C e
um grupo de 100 doadores de sangue com todos os exames soroloacutegico para doenccedilas
infecto-contagiosas negativos Os 51 pacientes portadores do viacuterus C apresentavam
idade meacutedia de 43 anos +- 113 em fase preacute-tratamento 34 (667) eram do gecircnero
masculino e 17 (333) do gecircnero feminino Desses 13 (255) apresentaram FAN
positivo 45 (882) eram genoacutetipo tipo 1 e 118 genoacutetipo tipo 3 Os pacientes que se
apresentaram com anticorpos detectaacuteveis natildeo apresentavam niacuteveis de AST ALT
ASTALT γ-GT e fosfatase alcalina significativamente diferente daqueles com auto-
anticorpos negativos Desta forma conclui-se que os anticorpos presentes na amostra
do estudo satildeo independentes da evoluccedilatildeo da doenccedila e do prognoacutestico do paciente
entretanto parece estar ligada ao genoacutetipo tipo 1
Palavras-chave Hepatite C Auto-anticorpos Genoacutetipo
ABSTRACT
Inflammation of the liver caused by hepatotropic viruses affect millions of people and
represents a significant public health problem worldwide There are interactions between
hepatotropic viruses and the host immune system that can influence the pathogenesis of
liver injury The objective of this study was to investigate the frequency of autoantibodies
in patients with hepatitis C virus and its correlation with the genotypes found We
studied 51 patients diagnosed by PCR of infection with hepatitis C and a group of 100
blood donors with all serological tests for infectious diseases negative The 51 patients
with virus C had an average age of 43 years + - 113 in the pre-treatment 34 (667)
were male and 17 (333) were female Of these 13 (255) were ANA positive 45
(882) were with genotype 1 and 118 with genotype 3 Patients who presented with
antibodies had no detectable levels of AST ALT AST ALT γ-GT and alkaline
phosphatase significantly different from those with negative antibody titers Thus we
conclude that the antibodies present in the study sample are independent of disease
progression and patient prognosis though seems to be linked with genotype 1
Keywords Hepatitis C Auto-antibodies genotype
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Padrotildees de fluorescecircncia encontrados em maior frequumlecircncia e
patologias relacionadas 34
Quadro 2 - Anti-ena - auto-anticorpos contra antiacutegenos extraiacutedos do nuacutecleo e
relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 34
Quadro 3 ndash Padrotildees de FAN nuclear e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 35
Quadro 4 - Padrotildees de FAN citoplasmaacuteticos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 36
Quadro 5 - Padrotildees de FAN mistos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 37
Quadro 6 - Padrotildees de FAN nucleolares e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 37
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos pacientes segundo as caracteriacutesticas demograacuteficas janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 48
Tabela 2 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes conforme os resultados laboratoriais de FAN citoplasmaacutetico e genotipagem janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 49
Tabela 3 ndash Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 49
Tabela 4 - Relaccedilatildeo da genotipagem de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 50
Tabela 5 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e faixa etaacuteria - janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 50
Tabela 6 - Estudo descritivo da idade dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e presenccedila do FAN citoplasmaacutetico janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 51
Tabela 7- Distribuiccedilatildeo dos genoacutetipos dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 51
Tabela 8 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 52
Tabela 9 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico segundo a presenccedila ou ausecircncia de infecccedilatildeo por HCV janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 52
Tabela 10 - Distribuiccedilatildeo do FAN de acordo com o genoacutetipo viral janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 53
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
AAN Anticorpos antinucleares
aCL Anticorpos anticardiolipina
AIDS Sindrome da Imunodeficiecircncia Adquirida
ALT Alanina aminotransferase
ANCA Anticorpos anti-citoplasma de neutroacutefilos
Anti-CCP Antipeptiacutedeo citrulinado ciacuteclico
Anti-β2GPI Anticorpos anti-β2 glicoproteiacutena I
Cdna DNA complementar
CEP Comitecirc em Eacutetica e Pesquisa
CHC Carcinoma hepatocelular
CIC Complexos imunes circulantes
DDTC Doenccedilas difusas do tecido conjuntivo
DMTC Doenccedila mista do tecido conjuntivo
E1 Proteiacutena do envoltoacuterio
ENH Eritema Nodoso Hansecircnico
ESP Esclerose sistecircmica progressive
FAN Fator Anti-nuacutecleo
FR Fator reumatoacuteide
HBV Viacuterus da hepatite B
HCV Viacuterus da Hepatite C
HEMOPA Fundaccedilatildeo Centro de Hemoterapia e Hematologia do Paraacute
HIV Viacuterus da imunodeficiecircncia humana
HIV-1 Viacuterus da imunodeficiecircncia humana1
IAH Iacutendice de atividade histoloacutegica
LE Lupus Eritematoso
LES Luacutepus eritematoso sistecircmico
MS Ministeacuterio da Sauacutede
mtDNA DNA mitrocondrial
NANBH Hepatite natildeo-A natildeo-B
NMT Nuacutecleo de Medicina Tropical
OMS Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede
PCR Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia
Rh Tipo sanguiacuteneo
RNA Aacutecido ribonucleacuteico
RT-PCR Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia-em tempo real
SAF Siacutendrome antifosfoliacutepide
SIDA Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida
SS Siacutendrome de Sjoumlgren
UFPA Universidade Federal do Paraacute
UV ultravioleta
VHA Viacuterus da Hepatite A
VHC Viacuterus da Hepatite C
VHCHCV Hepatite C
VV Hanseniacutease generalizada
SUMAacuteRIO 1 INTRODUCcedilAtildeO 15 11 HEPATITE C (VHCHCV) 15 111 Consideraccedilotildees Gerais 15 112 Agente Etioloacutegico 16 113 Epidemiologia 17 114 Modo de Transmissatildeo 18 115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica 19 116 Diagnoacutestico 23 12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC 25
13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC 26
14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE 27
15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES AGUDAS VIRAIS 31
16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN 32 2 JUSTIFICATIVA 39 21 ASPECTOS EacuteTICOS 39 3 OBJETIVOS 40
31 OBJETIVO GERAL 40
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 40 4 MATERIAL E MEacuteTODOS 41 41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO) 41 411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C 41 412 Grupo de natildeo infectados 41 42 MEacuteTODO 42 421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico 42 422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C 42 423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia
molecular 43
424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem) 45 425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas
HEp-2 46 43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 47 5 RESULTADOS 48 6 DISCUSSAtildeO 54 7 CONCLUSOtildeES 59 REFEREcircNCIAS 60 APEcircNDICES 67 ANEXOS 70
15
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 HEPATITE C (VHCHCV)
111 Consideraccedilotildees Gerais
As hepatites virais satildeo doenccedilas causadas por diferentes agentes
etioloacutegicos de distribuiccedilotildees universais que tecircm em comum o hepatotropismo
Possuem semelhanccedilas do ponto de vista cliacutenico-laboratorial mas apresentam
importantes diferenccedilas epidemioloacutegicas quanto agrave sua evoluccedilatildeo (FERREIRA
SILVEIRA 2004) Desde a descriccedilatildeo e definiccedilatildeo em 1989 (CHOO et al 1989 apud
RIBEIRO et al 2007) tornou-se evidente sua associaccedilatildeo com uma grande
variedade de manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas desordens reumaacuteticas e auto-imunes
(ALMEIDA 2010)
A infecccedilatildeo pelo VHCHCV acarreta inflamaccedilatildeo hepaacutetica e esteatose
podendo evoluir para fibrose hepaacutetica e cirrose em indiviacuteduos cronicamente
infectados estes com grande risco de desenvolvimento de carcinoma hepatocelular
(RIBEIRO et al 2007) Essas complicaccedilotildees tardias ocorrem em um periacuteodo em
geral superior a 20 anos apoacutes o iniacutecio da infecccedilatildeo A avaliaccedilatildeo filogeneacutetica das
sequumlecircncias do VHCHCV investigadas em vaacuterias regiotildees geograacuteficas sugere que
existam pelo menos seis genoacutetipos principais designados pelos nuacutemeros de 1 a 6 e
pelo menos 30 subtipos designados por letras minuacutesculas Nos Estados Unidos
prevalecem os genoacutetipos 1a (60) e 1b (20) Os tipos 5 e 6 satildeo mais encontrados
no sudeste e sul da Aacutefrica O tipo 4 eacute predominante na Aacutefrica Central e no Oriente
Meacutedio No Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b (63) e 3a (313) (BASSIT et
al 1999 apud RIBEIRO et al 2007) As informaccedilotildees sobre as causas que
determinam o curso evolutivo da doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos
progressos que haacute no campo do diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHCHCV Uma
questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo genoacutetipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de
lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o genoacutetipo 1 (1b) cursa com lesotildees
histoloacutegicas mais graves
As uacuteltimas deacutecadas foram de notaacuteveis conquistas no que se refere agrave
prevenccedilatildeo e ao controle das hepatites virais Entre as doenccedilas endecircmico-
epidecircmicas que representam problemas importantes de sauacutede puacuteblica no Brasil
16
salientam-se as Hepatites Virais cujo comportamento epidemioloacutegico no nosso paiacutes
e no mundo tem sofrido grandes mudanccedilas nos uacuteltimos anos
Antes da seleccedilatildeo rigorosa dos doadores de sangue em 1991 o
VHCHCV era a maior causa de hepatite poacutes-transfusional Atualmente permanece
como tal em casos esporaacutedicos (CONTE 2000) Os grupos considerados de risco
satildeo pessoas que receberam transfusatildeo de sangue antes de 1992 usuaacuterios de
drogas injetaacuteveis profissionais de sauacutede que lidam com sangue pacientes de
hemodiaacutelise e com menor risco pessoas tatuadas ou com piercings (CLEMENTE
ONO-NITA 2007)
A melhoria das condiccedilotildees de higiene e de saneamento das populaccedilotildees a
vacinaccedilatildeo contra a Hepatite B (HBV) e as novas teacutecnicas moleculares de diagnoacutestico
do viacuterus da Hepatite estatildeo entre esses avanccedilos importantes (BRASIL 2008)
112 Agente Etioloacutegico
O VHCHCV um viacuterus aacutecido ribonucleacuteico (RNA) da famiacutelia Flaviviridae
representa a principal causa da previamente denominada hepatite natildeo-A natildeo-B
(SANTOS 2009) Foi identificado e isolado a partir de um clone derivado de um
genoma NANBH semelhante aos togaviridae ou flaviviridae (SAADE 2008) e
visualizado a imunoeletromicroscopia como partiacutecula de 55 a 65 nm de diacircmetro
com projeccedilotildees espiculares e de morfologia muito semelhante aos flaviviridae Aleacutem
disso estas partiacuteculas reagiram especificamente com anticorpos mono e policlonais
do conteuacutedo proteacuteico do envelope do VHC (HIRANUMA et al 1994 apud CONTE
2000)
O agente etioloacutegico do HCV natildeo eacute uma partiacutecula homogecircnea e apresenta
uma taxa alta de mutaccedilatildeo levando-o a uma heterogeneicidade genocircmica cujo
resultado eacute um grande nuacutemero de genoacutetipos (1a 1b 2a 2b 3a 3b 4 5 6)
(AUGUSTO LOBATO 2003) Natildeo haacute evidecircncias de variantes natildeo patogecircnicas O
genoacutetipo 1b eacute o que apresenta maior virulecircncia e pior resposta ao tratamento
(LAUER WALKER 2001 apud SOUZA 2007) No Brasil dados obtidos a partir de
casos isolados e estudos de pequenas amostragens indicam que o genoacutetipo 1b
ocorre em cerca de 30 a 40 dos casos o 1a em cerca de 20 1a e 1b em 20
o 3a em cerca de 28 (FOCACCIA 2004)
17
113 Epidemiologia
De acordo com a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) a HCV eacute uma
questatildeo de sauacutede puacuteblica e tambeacutem a principal causa de transplante de fiacutegado no
Brasil (SOCIEDADE BRASILEIRA DE HEPATOLOGIA 2005) Eacute estimada uma
prevalecircncia em torno de 10 para a infecccedilatildeo pelo VHC na populaccedilatildeo mundial
(KILLEMBERG 2000) Nos Estados Unidos cerca de 27 milhotildees de pessoas estatildeo
infectadas pelo viacuterus (BRASIL 2006)
De acordo com Ferreira e Silveira (2004) no Brasil o nuacutemero de pacientes
infectados eacute incerto relacionado geralmente a alguns estados e municiacutepios e o
esclarecimento dos agentes causadores das hepatites cuja identificaccedilatildeo requer
teacutecnicas laboratoriais complexas de biologia molecular eacute realizado de maneira
insuficiente Por outro lado a progressiva integraccedilatildeo entre as instacircncias gestoras
dos programas de vigilacircncia e controle das doenccedilas com grupos de pesquisa e
desses com os serviccedilos (FERREIRA SILVEIRA 2004 p 473) e a disponibilidade
dos bancos de dados nacionais mais confiaacuteveis apontam para novos e melhores
caminhos (BRASIL 2005b)
A OMS alerta que o Paiacutes deve se preparar para uma ldquoexplosatildeordquo da
epidemia a partir de 2011 (BRASIL 2005b) Outra preocupaccedilatildeo eacute que as pessoas
que receberam sangue antes de 1992 tecircm mais chances de estarem infectadas na
eacutepoca o sangue destinado agraves transfusotildees natildeo era analisado para detecccedilatildeo da HCV
porque o viacuterus natildeo era conhecido e natildeo havia exames especiacuteficos (BRASIL 2005b)
A prevalecircncia da infecccedilatildeo nos doadores de sangue sadios varia de 001-002 no
Reino Unido e no norte da Europa 1-15 no sul da Europa 65 na Aacutefrica
equatorial e de ateacute 20 no Egito (CONTE 2000)
De acordo com a OMS a cada grupo de 50 pessoas no Brasil uma tem
hepatite e de dez portadores apenas um sabe (STRAUSS 2001) Satildeo dois milhotildees
de infectados no Paiacutes Denominada epidemia silenciosa calcula-se que 170 milhotildees
de indiviacuteduos no mundo estejam contaminados pelo viacuterus C a forma mais grave da
doenccedila Ainda de acordo com a OMS o nuacutemero de brasileiros viacutetimas da
enfermidade eacute bem maior do que o estimado pelo Ministeacuterio da Sauacutede (TRINDADE
2005)
18
Por ocasiatildeo da Conferecircncia Internacional de Consenso sobre HCV em Paris
(LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999) concluiu-se que a hepatite crocircnica por viacuterus
C eacute um problema grave de sauacutede puacuteblica sendo sua prevalecircncia mundial estimada
em 3 (de 01 a 5 segundo os vaacuterios paiacuteses) por tanto havendo no mundo
todo cerca de 150 milhotildees de portadores crocircnicos do VHCHCV 4 milhotildees nos EUA
e 5 milhotildees na Europa Ocidental Na Europa Oriental a prevalecircncia eacute maior ainda
114 Modo de Transmissatildeo
A HCV eacute transmitida pelo sangue Natildeo haacute comprovaccedilatildeo de contaacutegio por
meio de fluidos corporais como saliva suor laacutegrimas secircmen ou leite materno
Tambeacutem deixa de ocorrer por meio de abraccedilos beijos uso dos mesmos copos ou
roupas Especialistas afirmam que a contaminaccedilatildeo atraveacutes de relaccedilotildees sexuais eacute
possiacutevel mas rara Quando detectada de maneira precoce a enfermidade tem
tratamento inclusive gratuito aleacutem de cura (BRASIL 2006)
Dentre os fatores de risco para transmissatildeo outros aleacutem da transfusatildeo de
sangue o uso de drogas iliacutecitas o comportamento sexual de alto risco e variaacuteveis
socioeconocircmicas representadas pelo grau de escolaridade e renda familiar Natildeo foi
observada associaccedilatildeo entre o risco de infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas
designadas por gecircnero idade e raccedila (ALTER 2007) O risco de transmissatildeo sexual
do VHCHCV eacute miacutenimo A contaminaccedilatildeo intrafamilial natildeo-sexual eacute consideraacutevel
particularmente quando um dos enfermos tem hepatopatia grave e ou carga viral
elevada (risco 110) (CONTE 2000)
A praacutetica de tatuagem fornece dados conflitantes sabendo-se que os
liacutequidos usados para esterilizar os instrumentos usados satildeo ineficazes
Karmochkine et al (1998 apud CONTE 2000) observaram que
aproximadamente 80 dos pacientes contraem o viacuterus atraveacutes da toxicomania
intravenosa ou transfusotildees de sangue ou de derivados Os restantes meios de
transmissatildeo e de contaacutegio satildeo a hemodiaacutelise os transplantes de oacutergatildeos picadas
acidentais profissionais e transmissatildeo vertical matildee-crianccedila Em 20 a 40 dos
casos natildeo se consegue determinar o modo de contaminaccedilatildeo A transmissatildeo da
hepatite crocircnica por viacuterus C pode ser prevenida (KARMOCHKINE et al 1998 apud
CONTE 2000)
19
As duas fontes de contaminaccedilatildeo satildeo a toxicomania endovenosa e a
administraccedilatildeo de produtos de origem sanguumliacutenea Esta uacuteltima praticamente
eliminada desde 1991 com a introduccedilatildeo dos testes ELISA 2 na seleccedilatildeo
aprimorada de doadores de sangue (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998
apud CONTE 2000)
A transmissatildeo sexual eacute rara com menos de 3 em parceiros estaacuteveis e
ocorre principalmente em pessoas com muacuteltiplos parceiros e com praacutetica sexual de
risco (sem uso de preservativo) ndash para os indiviacuteduos com parceiros muacuteltiplos o uso
de preservativos eacute indicado (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998 apud
CONTE 2000)
A gravidez natildeo estaacute contra-indicada nas mulheres infectadas pelo
VHCHCV A transmissatildeo vertical matildee-crianccedila eacute rara (menor de 6) O tipo de parto
(natural ou cesaacuterea) natildeo tem influecircncia O aleitamento eacute permitido A transmissatildeo
nosocomial eacute prevenida eficazmente de modo convencional (KARMOCHKINE et
al 1998 apud CONTE 2000)
115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica
A infecccedilatildeo aguda pode passar clinicamente despercebida ou evoluir para
hepatite fulminante Aproximadamente 850 das pessoas infectadas agudamente
vatildeo desenvolver uma viremia persistente tornando-se dessa forma indiviacuteduos
infectados crocircnicos Depressatildeo irritabilidade dores no corpo mal-estar febre
naacuteuseas e falta de apetite satildeo alguns dos sintomas mais frequumlentes embora a
maioria dos casos natildeo apresente nenhum sintoma (ALTER 2007)
A cirrose eacute pouco observada em pessoas que apresentam niacuteveis
persistentemente baixos das transaminases mas a elevaccedilatildeo destas natildeo eacute
representativa do grau de fibrose hepaacutetica Dessa forma a bioacutepsia hepaacutetica
representa o melhor indicador do estaacutegio de evoluccedilatildeo da doenccedila uma vez que
gradua os componentes inflamatoacuterios e o estaacutegio de fibrose (AGMON-LEVIN et al
2009 BLOCK SCHIANO 1999)
Alter et al (1992) dizem que em 82 de 130 pacientes seguidos durante
muitos anos apoacutes surto agudo de hepatite natildeo-A natildeo-B apresentam anti-VHCHCV
ou VHCHCV RNA sendo que 62 deles desenvolveram hepatite crocircnica e
concluem que os pacientes que adquiriram HCV tiveram alto grau de hepatite
20
crocircnica sendo que o VHCHCV pode ser a maior causa de doenccedila crocircnica de fiacutegado
nos EUA e que na maioria dos pacientes a infecccedilatildeo pelo VHCHCV parece persistir
por muitos anos mesmo na ausecircncia de doenccedila hepaacutetica ativa
Almeida et al (1999) determinaram a prevalecircncia da infecccedilatildeo em
doadores de sangue assim como avaliaram o grau de comprometimento hepaacutetico
numa populaccedilatildeo de 37335 doadores durante o biecircnio 93-94 em Porto Alegre - RS
utilizando o teste anti-VHC ELISA 2 Selecionaram 60 deles para a biopsia hepaacutetica
com agulha de Menghini encontrando prevalecircncia de 174 com comprometimento
hepatico e 39 deles apresentavam cirrose hepaacutetica Sendo a hepatopatia crocircnica de
graus variaacuteveis observadas em 80 deles na sua grande maioria com lesotildees leves
e miacutenimas Foi observada forte associaccedilatildeo entre elevaccedilatildeo de alanina
aminotransferase (ALT) e a presenccedila de hepatopatia crocircnica embora a intensidade
desta elevaccedilatildeo natildeo se correlacione com a gravidade da lesatildeo histoloacutegica
Jaacute na experiecircncia de Mutimer et al (1995) cerca de 80 dos doadores
soro-positivos analisados exaustivamente inclusive com biopsia de fiacutegado
mostraram evidecircncias de alteraccedilotildees histoloacutegicas e ou viroloacutegicas de infecccedilatildeo
persistente sem no entanto atingir graus mais avanccedilados de hepatopatia crocircnica
quase todos permanecendo na categoria moderada
Nos paiacuteses industrializados a HCV eacute responsaacutevel por 20 dos casos de
hepatite aguda 70 dos casos de hepatite crocircnica 40 dos casos de cirrose
descompensada 60 dos carcinomas hepatocelulares e 30 dos transplantes
hepaacuteticos (LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999)
Cerca de 40 do total de pacientes curam-se ou tecircm doenccedila crocircnica de
natureza benigna Os restantes 60 cursam com atividade aumentada de
aminotransferase denotando evoluccedilatildeo crocircnica da doenccedila Dentre estes a maioria
tem lesotildees necro inflamatoacuterias discretas e fibrose miacutenima ou ausente O prognoacutestico
em longo prazo eacute mal conhecido no entanto provavelmente a maioria deles natildeo viraacute
a falecer da doenccedila hepaacutetica em curso Cerca de 20 deles depois de 10-20 anos
de evoluccedilatildeo desenvolveratildeo cirrose hepaacutetica passiacutevel de transplante Assim a
hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila que ocasiona a morte de um pequeno nuacutemero
de pacientes sem no entanto afetar a duraccedilatildeo da vida meacutedia da maioria deles
(CONTE 2000 FERREIRA SILVEIRA 2004)
Apoacutes infecccedilatildeo aguda somente 10 dos pacientes desenvolve doenccedila
cliacutenica com icteriacutecia A infecccedilatildeo sub-cliacutenica eacute a regra e assim passa despercebida
21
Cerca de 25 deles tecircm infecccedilatildeo crocircnica sintomaacutetica com aminotransferases
normais e lesotildees inflamatoacuterias histoloacutegicas miacutenimas (RESENDE et al 2010)
A remissatildeo espontacircnea acontece em cerca de 15 dos casos Na grande
minoria dos casos a progressatildeo da doenccedila aguda pode levar agrave insuficiecircncia
hepaacutetica aguda
Observaccedilotildees feitas pelo irlandecircs Kenny-Walsh (1999) comprovam a
natureza e a evoluccedilatildeo cliacutenica da afecccedilatildeo em causa O autor acompanhou durante 17
anos 376 mulheres que receberam injeccedilotildees de imunoglobulinas anti-D
contaminadas com VHC provenientes de doador uacutenico num programa de
isoimunizaccedilatildeo Rh Destas 81 apresentaram sintomatologia mais frequumlentemente
fadiga (66) ALT ligeiramente elevada (de 40 a 99 UL) em 47 e igual ou maior de
100 UL em 8 A biopsia hepaacutetica mostrou inflamaccedilatildeo em 98 delas na maioria
das vezes leves (41) e moderadas (52) fibrose presente em 51 no entanto
somente em sete pacientes (2) houve sinais de cirrose provaacutevel ou definitiva Em
uma delas havia acentuado alcoolismo
A hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila de evoluccedilatildeo variaacutevel De maneira
geral sua evoluccedilatildeo eacute lenta insidiosa e progressiva
Os pacientes que natildeo apresentam evidecircncias bioquiacutemicas de lesatildeo
hepaacutetica podem constituir em subgrupo de casos mais benignos no curso natural
da doenccedila Muitos co-fatores tecircm papel importante no desenvolvimento da cirrose
nesses pacientes como por exemplo a idade no momento da infecccedilatildeo (os
contaminados de idade mais avanccedilada tecircm evoluccedilatildeo mais raacutepida da doenccedila
enquanto que os mais jovens a tecircm mais lenta) o alcoolismo (eacute de consenso geral
que o abuso de aacutelcool favorece o aparecimento da cirrose) e a co-infecccedilatildeo com o
Viacuterus da Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida (SIDA) e da HVB
A incidecircncia anual de carcinoma hepatocelular (CHC) eacute de 1 a 4 nos
pacientes cirroacuteticos o que justifica plenamente o controle ecograacutefico do fiacutegado e a
dosagem seacuterica de alfa-fetoproteiacutena nesses pacientes a cada 1-2 anos Por outro
lado nos pacientes com hepatite crocircnica por viacuterus C sem cirrose o CHC eacute muito
raro (LOPES 2010)
Nos casos de cura a atividade das transaminases cessa e os viacuterus natildeo
satildeo detectados (VHC RNA) no soro Nos casos de cronificaccedilatildeo acontece o
contraacuterio ou seja as alteraccedilotildees bioquiacutemicas existem com flutuaccedilotildees e os viacuterus satildeo
detectaacuteveis na grande maioria dos casos Fazem exceccedilatildeo agravequeles pacientes com
22
viremia baixa que por isso mesmo fogem aos limites dos meacutetodos de detecccedilatildeo viral
ou devido agraves flutuaccedilotildees proacuteprias desses niacuteveis virecircmicos (HAYDON et al 1998)
Nos pacientes anti-VHC positivos com enzimas circulantes normais a
falta de VHC RNA no soro tem sido interpretada como sinal de cura completa No
entanto Haydon et al (1998) alteraram essa interpretaccedilatildeo Estes autores
demonstraram a presenccedila de VHC RNA no fiacutegado desses pacientes que eram
negativos no soro independente das alteraccedilotildees bioquiacutemicas positivas ou negativas
do soro ou seja mesmo naqueles casos anteriormente considerados como curados
Assim os niacuteveis de viacuterus intra-hepaacuteticos natildeo satildeo determinados pelos fatores
hospedeiro (idade modo e duraccedilatildeo da infecccedilatildeo) ou virais (VHC genoacutetipos) pois
mesmo as repetidamente Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia-em tempo real (RT-
PCR) negativos para VHC RNA no soro podem ter viacuterus da HCV albergados no
fiacutegado Entretanto existem limitaccedilotildees metodoloacutegicas que devem ser consideradas
nessa interpretaccedilatildeo como por exemplo as limitaccedilotildees do RIBA 3 e do RT-PCR
Mais importante eacute o seguimento dos pacientes ao longo do tempo Assim
Seef et al (1992) em 568 pacientes de hepatite poacutes-transfusional e dois grupos
controles pareados que receberam transfusotildees sem desenvolver hepatite apoacutes 18
anos de seguimento encontraram 33 de mortalidade no grupo 1 e 15 no grupo
controle sendo que a maioria das mortes ocorreu nos pacientes com alcoolismo
associado Evidenciando que a maioria dos que desenvolve doenccedila crocircnica o faz
muito lentamente
Existem ainda no curso natural da doenccedila flutuaccedilotildees intensas e muito
frequumlentes que dependem dos viacuterus e dos hospedeiros a saber niacuteveis da viremia
genoacutetipos 1b graus de diversidade geneacutetica dos viacuterus vias de transmissatildeo (os
inoculados via transfusatildeo apresentam lesotildees hepatocelulares mais ativas)
(GORDON et al 1993 GORDON BAYATI SILVERMAN 1998) deficiecircncias
imunes alcoolismo e co-infecccedilatildeo com HBV e delta ou o Viacuterus da imunodeficiecircncia
humana (HIV) (LOPES 2010) Nestes uacuteltimos casos a co-infecccedilatildeo com muacuteltiplos
viacuterus das hepatites estaacute associada com mais graves lesotildees histoloacutegicas do fiacutegado do
que nos casos de VHC isoladas
Importa saber se os resultados obtidos com os controles feitos se mantecircm
por longos periacuteodos Ou seja como exemplos a atividade da ALT persistentemente
normal a variabilidade do RT-PCR a detecccedilatildeo de VHC RNA pela teacutecnica Reaccedilatildeo
de polimerase em cadeia (PCR) que pode ser negativa devido agrave inadequada
23
armazenagem das amostras agrave contaminaccedilatildeo do soro com substacircncias que
interferem na leitura entre outras causas de erro
As informaccedilotildees sobre as causas que determinam o curso evolutivo da
doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos progressos havidos no campo do
diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHC Uma questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo
genotipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o
genotipo 1 (1b) cursa com lesotildees histoloacutegicas mais graves independentemente da
carga viral Ainda mais os VHC RNA negativos no soro mesmo apoacutes anos de
cura podem recair pois neles persistem os viacuterus no fiacutegado em regime de
replicaccedilatildeo muito baixa indetectaacutevel pelos meacutetodos atuais Ao contraacuterio os negativos
no soro e no fiacutegado tecircm demonstrado respostas boas e sustentadas inclusive no
sentido de se fazer prognoacutestico de cura real e verdadeira infelizmente na grande
minoria dos casos
116 Diagnoacutestico
Quanto mais cedo o diagnoacutestico maiores as chances de detectar a
doenccedila Por isso eacute importante que as pessoas faccedilam o exame especiacutefico porque soacute
esse exame eacute que detecta a HCV E as mulheres tecircm que ter uma atenccedilatildeo em
especial Tempos atraacutes o Correio Braziliense (2003) publicou uma grande mateacuteria
sobre a quantidade de mulheres que vecircm sendo infectadas com a HCV Cuja causa
estava na esterelizaccedilatildeo mal feita dos equipamentos das manicures Uma soluccedilatildeo
praacutetica eacute as mulheres terem seu proacuteprio material pra fazer as unhas e natildeo deixar
mais ningueacutem utilizar (nem matildee nem irmatilde etc) Bem e quem tiver passado por
transfusatildeo dentistas manicures operaccedilotildees etc deve fazer o exame
(KARMOCHKINE et al 1998 apud CONTE 2000 KEER et al 1997)
A HCV natildeo eacute como a Siacutendrome da Imunodeficiecircncia Adquirida (AIDS)
que possui drogas com grande tecnologia e o doente pode viver por muitos e muitos
anos Com a HCV o paciente soacute tem chance de ficar bem se a doenccedila for
diagnosticada e tratada antes dela se manifestar Atualmente o tratamento usa uma
associaccedilatildeo de duas drogas ndash o Interferon e a Ribavirina ldquoAs chances de cura em
meacutedia satildeo de 50rdquo
Barbaro et al (1999) verificaram que os pacientes VHC genoacutetipos 1b
frequumlentemente apresentavam alteraccedilotildees ultraestruturais das mitococircndrias com
24
depleccedilatildeo do mtDNA podendo comprometer o processo de fosforilizaccedilatildeo oxidativa
Sendo assim a produccedilatildeo aumentada de radicais livres nos pacientes VHC genoacutetipos
1b poderia atuar de modo negativo na evoluccedilatildeo da doenccedila hepaacutetica aumentando o
efeito citopaacuteticos do VHC Nesses pacientes haveria portanto aumento de
hiperoxidaccedilatildeo com consequumlente resistecircncia agrave accedilatildeo dos interferons e pior evoluccedilatildeo
da doenccedila hepaacutetica A ser confirmado este fato novas estrateacutegias terapecircuticas
poderatildeo vir a ser desenvolvidas no combate a essa doenccedila
Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila
poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses
autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis
vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo
hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja
quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a
concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave
hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em
parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)
Dos fatos acima expostos decorrem implicaccedilotildees tais como as respostas
CD8-CTL aos antiacutegenos VHC restritas aos complexos de histocompatibilidade
principais (MHC I) com inibiccedilatildeo ou mesmo insuficiente produccedilatildeo de complexo
peptiacutedeo VHC-MHC inibiccedilatildeo direta das ceacutelulas CTLK e a falta de resposta as
citoquininas entre outras dos vaacuterios mecanismos de escape existentes Dentro
desse contexto o niacutevel de morte celular natildeo seria alcanccedilado e a lesatildeo hepatocelular
consequumlente seria portanto miacutenima
Outra implicaccedilatildeo resultante consiste na induccedilatildeo de resposta imune
celular T Helper mediadas a partir de peptide vacinas contra o VHC Estas novas
vacinas tecircm a capacidade de gerar linfoacutecitos T citotoacutexico os CTLs contra o VHC em
camundongo imunizados com peptiacutedeos CTL e ceacutelulas HT epiacutetomes do core VHC
Esses estudos recente em animais de laboratoacuterio vecircm progredindo rapidamente
esperando-se em breve novos recursos no tratamento dessa doenccedila (AGNELLO et
al 1998)
25
12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC
O VHC constitui-se em uma famiacutelia heterogecircnea de viacuterus com no miacutenimo
seis genoacutetipos e inuacutemeros subtipos (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT
SANTOS SILVA 1999) Embora o meacutetodo de maior acuraacutecia para a determinaccedilatildeo
do genoacutetipo do VHC seja a identificaccedilatildeo completa da sequumlecircncia dos 9500
nucleotiacutedeos e a construccedilatildeo de uma aacutervore filogeneacutetica esse meacutetodo soacute pode ser
utilizado em laboratoacuterios de pesquisa (BARBOSA SILVA MARTINS 2005) e natildeo
em laboratoacuterios cliacutenicos Assim foram desenvolvidos meacutetodos para genotipagem
utilizando apenas as regiotildees mais conservadas do genoma como a proteiacutena do
envoltoacuterio (E1) a proteiacutena core e a proteiacutena natildeo estrutural NS5B A sequumlecircncia dos
nucleotiacutedeos dentro dessas regiotildees relativamente conservadas eacute genoacutetipo-
especiacutefico e os isolados podem ser genotipados independentemente da regiatildeo que
for utilizada para anaacutelise (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS
SILVA 1999) Para uso em laboratoacuterios cliacutenicos foram desenvolvidas basicamente
duas metodologias que se valem de teacutecnicas de biologia molecular (genotipagem)
ou citoloacutegicas (serotipagem)
Os meacutetodos que adotam teacutecnica de biologia molecular para genotipagem
utilizando porccedilotildees do genoma incluem a PCR aninhada (nested PCR) (BASSIT
SANTOS SILVA 1999) a teacutecnica de restriction fragment length polymorphism
(RFLP) (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS SILVA 1999) a
hibridizaccedilatildeo reversa (BASSIT SANTOS SILVA 1999) (INNO-LiPA Innogenetics
Beacutelgica Gen Eti DEIA HCV Sorin Biomedica Itaacutelia) e o sequumlenciamento direto da
regiatildeo natildeo-codificante 5 (TruGene Visible Genetics Canadaacute) Suas principais
vantagens satildeo a informaccedilatildeo direta sobre sequumlecircncia dos nucleotiacutedeos do genoma
viral a alta sensibilidade por se basearem na PCR e a possibilidade de identificar o
subtipo viral (BARBOSA SILVA MARTINS 2005)
Os meacutetodos para determinaccedilatildeo do genoacutetipo que utilizam serotipagem
baseiam-se na detecccedilatildeo de anticorpos genoacutetipos-especiacuteficos contra epiacutetopos do
VHC (por exemplo proteiacutenas da regiatildeo do core) (BLOCK SCHIANO 1999) Os
testes comercializados utilizam diferentes teacutecnicas ELISA competitivos ou
immunoblot (Murex-HC1-6 Murex Diagnostics Ltd Reino Unido RIBA HCV
Serotyping Assay Chiron Diagnostics Estados Unidos) As principais vantagens da
teacutecnica de serotipagem satildeo o baixo custo e maior facilidade de realizaccedilatildeo em
26
comparaccedilatildeo com os testes de biologia molecular (BLOCK SCHIANO 1999 De
LARANAGA et al 2000)
A determinaccedilatildeo do genoacutetipo anteriormente utilizada em pesquisas mas
sem maior utilidade na praacutetica meacutedica atualmente eacute recomendada para uso cliacutenico
Como jaacute mencionado os pacientes infectados pelo genoacutetipo 1 do VHC devem ser
tratados por 12 meses enquanto os demais por 6 meses (BASSIT SANTOS SILVA
1999)
A determinaccedilatildeo do genoacutetipo do VHC pode ser feita por PCR ou
serotipagem A primeira teacutecnica eacute mais sensiacutevel e possibilita a identificaccedilatildeo de
subtipos do VHC Contudo a segunda eacute de mais faacutecil realizaccedilatildeo e mais barata
razatildeo pela que eacute importante que a teacutecnica seja aprimorada
Oliveira et al (1999) investigaram os padrotildees de distribuiccedilatildeo dos
genoacutetipos do VHC estudando 250 pacientes anti-VHC positivos atraveacutes da
detecccedilatildeo VHC RNA pelo RT-PCR e encontraram prevalecircncia de 72 para o VHC 1
253 para o tipo 3 2 para o 2 e 07 para o 4 semelhantes aos das vaacuterias
regiotildees mundiais
13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC
As manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo pelo VHC satildeo as mais
variadas possiacuteveis A diversidade de resposta do hospedeiro ao agente infeccioso
variando desde quadros assintomaacuteticos ateacute aqueles com evoluccedilatildeo grave fatal ou
incapacitante tem estimulado a busca por justificativas de tais discrepacircncias
cliacutenicas sobretudo na imunomodulaccedilatildeo Dentre as infecccedilotildees mais bem estudadas
destacam-se aquelas pelos Viacuterus da hepatite C Viacuterus da imunodeficiecircncia humana1
(HIV-1) pelo Herpes viacuterus humano 4 (viacuterus do Epstein Baar) e pelo Mycobacterium
leprae (ABBAS LICHTMAN 2005)
A agressatildeo hepaacutetica por auto-imunidade eacute um fenocircmeno reconhecido em
vaacuterias doenccedilas do fiacutegado inclusive nas de etiologia viral Aleacutem do agente agressor e
de sua interaccedilatildeo com o sistema imunoloacutegico do hospedeiro fatores ambientais ou
hormonais estatildeo aparentemente envolvidos no surgimento de auto-imunidade
hepaacutetica como se supotildee acontecer na hepatite auto-imune em indiviacuteduos
geneticamente suscetiacuteveis (CODES et al 2002)
27
A lesatildeo hepatocelular relacionada agrave infecccedilatildeo pelos viacuterus hepatotroacutepicos e
pelos herpes viacuterus (citomegaloviacuterus e Epstein-Barr) eacute secundaacuteria a uma resposta
auto-imune do hospedeiro Estes viacuterus natildeo parecem ser diretamente citopaacuteticos
mas desencadeiam lesatildeo hepaacutetica atraveacutes da resposta imune do hospedeiro contra
ceacutelulas hepaacuteticas infectadas (MALOY POWRIE 2001)
Existem estudos que focalizam alteraccedilotildees imunoloacutegicas em hepatites
virais entretanto a maioria deles mostra resultados pontuais sem seguimento na
fase aguda da doenccedila (BLOCK SCHIANO 1999 McFARLONE et al 1990) Aleacutem
disso ainda natildeo se estabeleceu uma associaccedilatildeo entre as reaccedilotildees auto-imunes
transitoacuterias induzidas por viroses hepatotroacutepicas e agravamento do dano tecidual na
hepatite viral
A infecccedilatildeo crocircnica estaacute fortemente associada agrave crioglobulinemia mista
essencial glomerulonefrite membrano-proliferativa e porfiria cutacircnea tardia De
forma menos impressiva encontra-se tambeacutem associada agrave uacutelcera corneana de
Mooren liacutequen plano e fibrose pulmonar (KILLENBERG 2000 WENER et al 1996)
A ocorrecircncia de anticorpos antitireoidianos e hipotireoidismo tem sido relatada em
associaccedilatildeo com a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC em mulheres (KILLENBERG 2000
CACOUB et al 1999)
A associaccedilatildeo entre a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC a presenccedila do fator
reumatoacuteide e do anticorpo antinuclear (FAN) o fenocircmeno de Raynaud e doenccedilas
difusas do tecido conjuntivo (DDTC) como artrite reumatoacuteide luacutepus eritematoso
sistecircmico siacutendrome de Sjoumlgren e vasculites sistecircmicas eacute relatada em alguns
trabalhos (CACOUB et al 1999 LOVY STARKEBAUM UBEROI 1996 STAUB
1998 WENER et al 1996)
14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE
A associaccedilatildeo entre doenccedilas infecciosas e autoimunidade apresentando-
se com manifestaccedilotildees cliacutenicas ou detectadas apenas pelo desenvolvimento de auto-
anticorpos tem sido amplamente documentado Infecccedilotildees virais bacterianas e
parasitaacuterias podem estar envolvidas no desenvolvimento recidivas e ateacute mesmo na
prevenccedilatildeo de doenccedilas auto-imunes (KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)
Ribeiro e Proietti (2004) avaliaram a frequumlecircncia de FR anticorpos
antipeptiacutedeo citrulinado ciacuteclico (anti-CCP) AAN anticorpos anti-citoplasma de
28
neutroacutefilos (ANCA) anticorpos anticardiolipina (aCL) e anticorpos anti-β2
glicoproteiacutena I (anti-β2GPI) em pacientes com hanseniacutease Existe estudo
demonstrando pacientes que apresentavam manifestaccedilotildees articulares comparados
aos que natildeo apresentavam envolvimento articular e um grupo controle de indiviacuteduos
saudaacuteveis com idade e gecircnero semelhantes aos dos pacientes estudados e que
residiam na mesma aacuterea geograacutefica A maioria dos pacientes nos dois grupos (com
e sem envolvimento articular) apresentava hanseniacutease generalizada Entretanto
observaram uma baixa frequumlecircncia que natildeo foi significativamente diferente de FR
anti-CCP AAN e ANCA em pacientes com hanseniacutease (nos dois grupos) e normal
dos controles Mas a prevalecircncia de anticorpos aCL e anti-β2GPI estava
significativamente elevada nos pacientes com hanseniacutease quando comparados com
o grupo controle apesar de natildeo haver associaccedilatildeo significativa com o envolvimento
articular O isoacutetopo predominante dos dois autoanticorpos foi a IgM (487) dos
pacientes com hanseniacutease apresentava pelo menos um anticorpo antifosfoliacutepide
Aleacutem disso os autores observaram uma associaccedilatildeo entre a positividade para aCL e
as manifestaccedilotildees cliacutenicas jaacute que os pacientes com anticorpos aCL apresentavam
doenccedila Hanseniacutease generalizada (VV) com mais frequumlecircncia (p= 0002) Natildeo houve
associaccedilatildeo entre a presenccedila de anticorpos aCL ou anti-β2GPI e episoacutedios
reacionais poreacutem entre os pacientes com esses episoacutedios aqueles com anticorpos
aCL apresentavam eritema nodoso hansecircnico (ENH) em 100 dos casos enquanto
entre os pacientes negativos para aCL 57 apresentavam ENH Apesar de uma
alta taxa de concordacircncia para a presenccedila de anticorpos aCL e anti-β2GPI ter sido
observada manifestaccedilotildees tromboemboacutelicas natildeo foram observadas (RIBEIRO
PROIETTI 2004 2005)
Horimoto e Costa (2009) avaliaram pacientes com Leishmania
(leishmaniose visceral e leishmaniose cutacircnea) para a presenccedila de anticorpos anti-
Leishmania assim como FR AAN anti-DNA anti-Sm anti-RNP anti-Ro anti-La
aCL e complemento (C3 e C4) Como esperado os pacientes com leishmaniose
visceral apresentava anticorpos anti-Leishmania Tiacutetulos significativamente elevados
de AANs na maioria dos pacientes o anti-DNA foi detectado em poucos pacientes
com doenccedila visceral assim como tiacutetulos elevados de anticorpos aCL (isotipo IgG)
quando comparados com os pacientes com leishmaniose cutacircnea Niacuteveis reduzidos
de complemento tambeacutem satildeo evidentes na doenccedila visceral assim como niacuteveis
significativamente reduzidos de C3 Outros estudos comparam e discutem os
29
resultados em relaccedilatildeo agrave crescente evidecircncia na literatura da presenccedila de
autoanticorpos em ambas as doenccedilas Em geral a prevalecircncia variaacutevel de auto-
anticorpos relatada assim como relatos preacutevios na literatura podem estar
relacionados a diferenccedilas metodoloacutegicas como o tipo de ensaio utilizado a
definiccedilatildeo dos pontos de corte inativaccedilatildeo dos soros pelo calor seleccedilatildeo de pacientes
e variaccedilotildees eacutetnicas e geograacuteficas nos grupos de pacientes Mas um dos resultados
consistentes foi a frequumlecircncia significativamente mais elevada de anticorpos
antifosfoliacutepide aCL e anti-β2GPI em pacientes com hanseniacutease enquanto
anticorpos AAN e aCL foram detectados com mais frequumlecircncia nos pacientes com
leishmaniose visceral A incidecircncia aumentada de anticorpos AAN e aCL nos
pacientes com leishmaniose visceral eacute compatiacutevel com outros estudos (OSSADRON
et al 2006 SAKKAS et al 2008 VOULGARI et al 2004) e demonstra
semelhanccedilas das manifestaccedilotildees cliacutenicas e laboratoriais entre a leishmaniose
visceral e o luacutepus eritematoso sistecircmico (LES) Aleacutem disso a reatividade cruzada
entre AAN e anticorpos anti-Leishmania jaacute foi tambeacutem relatada (GRANEL et al
2000)
Diversos grupos documentaram niacuteveis elevados de anticorpos
antifosfoliacutepide (aCL anti-β2GPI e anti-protrombina) em diversas doenccedilas
infecciosas como a siacutefilis doenccedilas virais (incluindo a hepatite C Parvoviacuterus B19 e
HIV) malaacuteria e hanseniacutease sem as manifestaccedilotildees cliacutenicas da siacutendrome
antifosfoliacutepide (SAF) (ZANDMAN-GODDARD BLANK SHOENFELD 2002) Os
tiacutetulos elevados geralmente satildeo transitoacuterios diminuindo e desaparecendo apoacutes a
resoluccedilatildeo da infecccedilatildeo (LOIZOU et al 2003 ZANDMAN-GODDARD BLANK
SHOENFELD 2002) Mas em uma minoria dos pacientes a associaccedilatildeo entre
doenccedilas infecciosas e anticorpos antifosfoliacutepide pode levar a complicaccedilotildees severas
frequumlentemente fatais ou seja SAF catastroacutefica (ZANDMAN-GODDARD BLANK
SHOENFELD 2002)
Os resultados de Ribeiro e Proietti (2005) mostrando um aumento da
incidecircncia de anticorpos anti-β2-GPI em pacientes com hanseniacutease associados aos
dados de outros grupos (De LARANAGA et al 2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK
et al 1994 LOIZOU et al 2003) que tambeacutem documentaram niacuteveis elevados de
anticorpos anti-2βGPI lanccedilam duacutevidas sobre a noccedilatildeo de que os anticorpos aCL
associados a infecccedilotildees satildeo independentes dos anticorpos anti-β2GPI e natildeo
dependentes desses anticorpos como nas doenccedilas auto-imunes Em conjunto
30
esses resultados apoacuteiam a noccedilatildeo de que na presenccedila de infecccedilotildees anticorpos aCL
satildeo heterogecircneos em relaccedilatildeo agrave sua dependecircncia da 2GPI (De LARANAGA et al
2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK et al 1994 LOIZOU et al 2003) e as infecccedilotildees
podem desencadear a induccedilatildeo de anticorpos antifosfoliacutepide patogecircnicos em
indiviacuteduos predispostos (LOIZOU et al 2003)
A produccedilatildeo de autoanticorpos na hanseniacutease e leishmaniose pode ser
explicada por diversos mecanismos Na forma mais generalizada dessas doenccedilas
(hanseniacutease VV e leishmaniose visceral) os pacientes apresentam
hipergamaglobulinemia difusa semelhante agrave vista em outras infecccedilotildees como
Schistosoma mansoni T cruzi e Plasmodium A induccedilatildeo de autoanticorpos pode ser
atribuiacuteda agrave ativaccedilatildeo policlonal e proliferaccedilatildeo das ceacutelulas B algumas com auto-
reatividade pertencentes agrave biblioteca de anticorpos naturais em indiviacuteduos normais
(ARGOV et al 1989) Na leishmaniose antiacutegenos soluacuteveis derivados da L major e
L donovani satildeo mitogecircnicos e desencadeiam a produccedilatildeo de imunoglobulinas com
auto-reatividade (ARGOV et al 1989) Crioglobulinemia mista induzida pelo HCV eacute
outro exemplo de ativaccedilatildeo policlonal persistente levando a uma mistura de
autoanticorpos policlonais e monoclonais os quais causam doenccedilas auto-imunes
(AGMON-LEVIN et al 2009)
Mimetismo molecular ou homologias estruturais entre infecccedilotildees e
componentes do hospedeiro podem ser agrave base da produccedilatildeo de autoanticorpos
como no caso da febre reumaacutetica onde o componente M da membrana do
estreptococo apresenta homologia com peptiacutedeos cardiacuteacos cerebrais e sinoviais A
associaccedilatildeo da siacutendrome de Guillain-Barreacute com a infecccedilatildeo pelo Campylobacter
jejeuni representa outro exemplo de mimetismo molecular como base de uma
manifestaccedilatildeo auto-imune A reatividade cruzada entre agentes infecciosos e auto-
antiacutegenos jaacute foi demonstrada para o M leprae (McADAM MUDD SHOENFELD
1984) e M tuberculosis (SHOENFELD et al 1986) e a inibiccedilatildeo de anticorpos anti-
Sm anti-RNP e anti-SSB por promastigotas intactas de Leishmania apoacuteia a
homologia entre antiacutegenos nucleares e a Leishmania (ARGOV et al 1989)
A disseminaccedilatildeo de epiacutetopos a emergecircncia de novos anticorpos ou a
resposta de ceacutelulas T a um novo epiacutetopo (subdominante ou criacuteptico) no mesmo
antiacutegeno ou em outro antiacutegeno foi demonstrada em modelos experimentais e na
doenccedila humana alguns autores demonstraram a disseminaccedilatildeo molecular do
antiacutegeno Sm para reatividade anti-RNP (STAUB 1998) no LES enquanto na febre
31
reumaacutetica o estado de autoimunidade crocircnica que afeta as vaacutelvulas cardiacuteacas pode
resultar em uma resposta imunoloacutegica contra o colaacutegeno e laminina (KIVITY et al
2009 PORDEUS et al 2008) As infecccedilotildees tambeacutem podem desempenhar um papel
importante na induccedilatildeo da autoimunidade atraveacutes da liberaccedilatildeo de antiacutegenos
sequumlestrados apoacutes lesatildeo tecidual ou aumentando a exibiccedilatildeo de epiacutetopos criacutepticos
no meio inflamatoacuterio apresentando assim novos antiacutegenos ao sistema imunoloacutegico
(KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)
15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES
AGUDAS VIRAIS
O conceito de auto-imunidade induzida por viacuterus natildeo eacute exclusivo para
doenccedilas hepaacuteticas O viacuterus Coxsackie do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um
terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite infecciosa e estaacute implicado nas miocardites
auto-imunes reagindo contra a miosina cardiacuteaca (GIST BELL 1974) Niwa et al
(1984) encontraram elevaccedilatildeo transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator
reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas
virais comuns como varicela sarampo influenza caxumba herpes zoster e
exantema suacutebito
A patogecircnia da infecccedilatildeo viral inclui pelo menos trecircs tipos de interaccedilotildees
com o hospedeiro vertebrado 1) o efeito do agente sobre as ceacutelulas 2) a maneira
de disseminaccedilatildeo do agente no organismo infectado 3) a resposta imunoloacutegica e a
sua influencia no processo infeccioso Destacam-se dois tipos principais da
interaccedilatildeo a destruiccedilatildeo celular e a resposta imunoloacutegica (FIGUEIREDO 1999
CATALAN-SOARES PROIETTI CARNEIRO-PROIETTI 2006) O viacuterus Coxsackie
do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite
infecciosa e estaacute implicado nas miocardites auto-imunes reagindo contra a miosina
cardiacuteaca (GERSHON KONDO 1971) Niwa et al (1984) encontraram elevaccedilatildeo
transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo
anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas virais comuns como varicela sarampo
influenza caxumba herpes zoster e exantema suacutebito
32
16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN
De acordo com o II Consenso Brasileiro de FAN em HEp 2
(DELLAVANCE et al 2003) os AAN satildeo encontrados comumente em uma
variedade de doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Satildeo uacuteteis na investigaccedilatildeo dessas
doenccedilas auxiliando no diagnoacutestico de patologias como LES esclerose sistecircmica
progressiva (ESP) doenccedila mista do tecido conjuntivo (DMTC) siacutendrome de Sjoumlgren
(SS) polimiosite e dermatomiosite
Eles podem estar presentes em um pequeno percentual da populaccedilatildeo
aparentemente sadia essa frequumlecircncia eacute maior em mulheres e aumenta com a idade
Segundo a literatura a positividade entre 20 a 60 anos varia entre percentuais mais
altos (133) para tiacutetulos baixos e mais baixos (33) para tiacutetulos mais elevados
(DELLAVANCE et al 2003)
A pesquisa dos anticorpos antinucleares pode ser realizada por diferentes
teacutecnicas a imunofluorescecircncia indireta eacute a mais utilizada por sua sensibilidade
reprodutibilidade e facilidade de execuccedilatildeo A sensibilidade aumenta
significativamente quando se utiliza como substrato lacircminas com ceacutelulas Hep 2
(ceacutelulas de carcinoma de laringe humana) por causa da maior expressatildeo de
antiacutegenos na superfiacutecie dessas ceacutelulas comparados aos expressos nas ceacutelulas de
fiacutegado ou de rins de camundongos que se utilizavam anteriormente
Em geral eacute possiacutevel detectar melhor a presenccedila de AAN por associaccedilatildeo
de trecircs anti-soros isotipos especiacuteficos (anti-IgG anti-IgA e anti-IgM) A pesquisa
realizada por essa teacutecnica serve de triagem inicial para a presenccedila de AAN Eacute
normalmente denominada pesquisa de FAN ou AAN
A realizaccedilatildeo de outras metodologias tais como as imunoenzimaacuteticas
permite uma avaliaccedilatildeo isolada dos diferentes auto-anticorpos sugeridos pelos
padrotildees de fluorescecircncia encontrados no FAN A identificaccedilatildeo desses AAN permite
um diagnoacutestico mais preciso e eles podem ser utilizados em muitos casos como
marcador para uma das diferentes doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Muitas dessas
patologias apresentam um perfil distinto de auto-anticorpos que auxilia o diagnoacutestico
A presenccedila de FAN positivo em pessoas aparentemente sadias pode ser
devida a algumas situaccedilotildees
minus Doenccedila auto-imune precoce ainda natildeo expressa clinicamente
33
minus distuacuterbio imunoloacutegico transitoacuterio causado por doenccedila natildeo-imune
tais como infecccedilotildees principalmente virais
minus uso de medicamentos e neoplasias
minus manifestaccedilatildeo incompleta de uma siacutendrome ou seja o paciente
sintetiza o anticorpo poreacutem esse quadro natildeo evolui para doenccedila
minus fenocircmeno auto-imune fisioloacutegico
O resultado do FAN eacute expresso em tiacutetulo e padratildeo uma vez que ambos
os paracircmetros tecircm importacircncia para a avaliaccedilatildeo do significado cliacutenico do exame O
tiacutetulo do FAN corresponde agrave maior diluiccedilatildeo capaz de demonstrar fluorescecircncia
inequiacutevoca e didaticamente pode ser dividido em
minus Baixo menor 180
minus Moderado 1160
minus Moderadamente elevado 1320
minus Alto maior 1640
Nas pesquisas realizadas por imunofluorescecircncia indireta os resultados
satildeo expressos em tiacutetulos segundo as diluiccedilotildees empregadas Eacute possiacutevel trabalhar
utilizando-se como limite tiacutetulos de 140 que permitem maior sensibilidade ou de
180 que permitem maior especificidade ou seja um menor nuacutemero de falso-
positivos
Na praacutetica cliacutenica satildeo considerados significativos tiacutetulos superiores a
1160 Os resultados com tiacutetulos positivos satildeo acompanhados pela descriccedilatildeo do
padratildeo de fluorescecircncia encontrado que serve como orientaccedilatildeo da presenccedila de um
antiacutegeno especiacutefico e em alguns casos como padratildeo diagnoacutestico Em determinadas
situaccedilotildees em especial no LES em atividade pode ocorrer agrave observaccedilatildeo de mais de
um padratildeo de fluorescecircncia
O padratildeo do FAN a seu turno aponta uma probabilidade maior ou menor
de doenccedila auto-imune e ateacute mesmo sugere o antiacutegeno nuclear envolvido e por
consequumlecircncia a afecccedilatildeo com ele mais relacionada Os padrotildees homogecircneo
centromeacuterico e pontilhado grosso satildeo os mais indicativos de processos de
autoimunidade uma vez que se associam a diversas condiccedilotildees reumaacuteticas
especialmente ao LES e agrave esclerose sistecircmica e tambeacutem a enfermidades hepaacuteticas
tais como a cirrose biliar primaacuteria e a hepatite auto-imune (KILLENBERG 2000)
34
Jaacute o pontilhado fino o pontilhado grosso reticulado e a membrana nuclear
tecircm maior significado quando encontrados em tiacutetulos altos uma vez que podem
estar presentes em tiacutetulos baixos em indiviacuteduos hiacutegidos Por sua vez o pontilhado
fino denso mesmo quando elevado em pessoas assintomaacuteticas soacute guarda relaccedilatildeo
com alguma doenccedila em cerca de 20 dos casos (DELLAVANCE et al 2003)
O padratildeo pontilhado pode tambeacutem ser referido como padratildeo salpicado
Outros padrotildees de fluorescecircncia podem ser encontrados em menor frequumlecircncia Os
pontilhados citoplasmaacutetico grossos ou reticulares associados agrave presenccedila de
anticorpos antimitococircndrias em pacientes com cirrose biliar primaacuteria o
citoplasmaacutetico homogecircneo relacionado a proteiacutenas ribossocircmicas em pacientes com
LES e o padratildeo pontilhado fino citoplasmaacutetico que pode estar associado agrave
presenccedila de anticorpos anti-JO-1 anti-PCNA e proteiacutenas da membrana celular em
pacientes com LES outras patologias do tecido conjuntivo e hepatopatias auto-
imunes (DELLAVANCE et al 2003)
Quadro 1 - Padrotildees de fluorescecircncia encontrados em maior frequumlecircncia e patologias relacionadas
Padrotildees de Fluorececircncia Antiacutegenos Patologias Relacionadas
Perifeacuterico DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES
Homogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA
LES AR lupus induzido por drogas
Perifeacutericohomogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES
Pontilhado grosso SM RNP LES DMTC
Pontilhado fino nuclear SS-A (RO) SS-B (La) SS LES
Nucleolar Proteiacutenas Nucleolares ESP Centromeacuterico Proteiacutenas de centrocircmeros Siacutendrome de CREST
Fonte Dellavance et al 2003 Quadro 2 - Anti-ena - auto-anticorpos contra antiacutegenos extraiacutedos do nuacutecleo e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleares Patologias Relacionadas SM LES RNP DMTC LES ESP AR e Polimiosite
SS-A (Ro) SS LES lupus neonatal e forma cutacircnea subaguda
SS-B (La) SS LES luacutepus neonatal e forma cutacircnea subaguda
Scl 70 ESP Jo -1 Polimiosite e dermatomiosite Fonte Dellavance et al 2003
35
Quadro 3 ndash Padrotildees de FAN nuclear e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes
Padrotildees Nucleares Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos
Nuclear Pontilhado Centromeacuterico Anticorpo anti-centrocircmero Esclerose Sistecircmica forma CREST Cirrose Biliar Primaacuteria
Nuclear homogecircneo Anticorpo anti-DNA nativo Lupus Eritematoso Sistecircmico (LES) Anticorpo anti-Histoma LES induzido por drogas LES idiopaacutetico Anticorpo anti-cromatina (DNAHistona Nucleossomo) Artrite Reumatoacuteide (AR) Artrite Idiopaacutetica Juvenil importante associaccedilatildeo com uveiacutete na forma oligoarticular Siacutendrome de Felty Cirrose Billar Primaacuteria
Nuclear tipo membrana nuclear contiacutenua Anticorpo anti-Iamin e contra envelope nuclear - Iamins Hepatites auto-imunes Raramente associado a doenccedilas reumaacuteticas (algumas formas de LES e esclerodermia linear)
Nuclear pontilhado pleomoacuterficoPCNA Anticorpo contra nuacutecleo de ceacutelulas em proliferaccedilatildeo LES
Nuclear pontilhado fino denso Anticorpo anti-proteina p 75 kDa pode ser encontrado em indiviacuteduos saudaacuteveis processos inflamatoacuterios inespeciacuteficos doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Cistite Intersticial Dermatite Atoacutepica Psoriacutease e Asma
Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos
Anticorpo anti-p80 coilina natildeo apresenta associaccedilatildeo cliacutenica definida
Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos
Anticorpo anti-Sp100 (anti-p95) Cirrose Biliar Primaacuteria pode ocorrer em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas
Nuclear pontilhado grosso Anticorpo anti-Sm LES Anticorpo anti-RNP criteacuterio obrigatoacuterio no diagnostico da doenccedila mista do Tecido conjuntivo (DMTC) tambeacutem ocorre no LES Esclerose Sistecircmica (ES) e AR
Nuclear pontilhado fino Anticorpo anti SSARo Siacutendrome de Sjogren Primaacuteria (SS) LES Lupus neonatal e Lupus Cutacircneo Subagudo Anticorpo anti-SSBLa Lupus neonatal LES SS Anticorpo anti-Mi-2 Dermatomiosite embora raramente ocorra na polimiosite do adulto
Fonte Dellavance et al 2003
36
Quadro 4 - Padrotildees de FAN citoplasmaacuteticos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes
Padrotildees Citoplasmaacuteticos e Relacionados ao Aparelho Mitoacutetico Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos
Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina Hepatite auto-imune Cirrose Anticorpo anti-miosine Hepatite C Hepatocarcionoma Miastenia Gravis Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida
Citoplasmaacutetico Fibrilar Segmentar Anti actinina anti--vinculina e anti-tropomiose Miastenia Gravis Doenccedila de Crohn e Colite ulcerativa Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia cliacutenica definida
Citoplasmaacutetico Pontilhado Polar Anticorpo Anti-golginas (cisternas do aparelho de Golgi) raro no LES SS e outras doenccedilas auto-imunes sistecircmicas Relato na Ataxia Cerebelar Idiopaacutetica Degeneraccedilatildeo Cerebelar Paraneoplaacutesica infecccedilotildees virais pelo Epstein Barr (EBV) e pelo viacuterus da imunodeficiecircncia Humana (HIV) Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida
Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Anticorpo anti-Histidill t RNA sintetase (Jo-1) anticorpo marcador de Polimiosite no adulto Descrito raramente na Dermatomiosite
Citoplasmaacutetico Pontilhado com Pontos Isolados
Anticorpo anti-EEA1 e anti-fosfatidilserina natildeo haacute associaccedilotildees clinicas bem definida Anticorpo anti-GWBSS tambeacutem encontrado em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas
Citoplasmaacutetico Pontilhado Reticulado Anticorpo anti-mitococircndria Cirrose Biliar Primaacuteria Esclerose Sistecircmica Eacute relativamente comum o encontro deste padratildeo na ausecircncia de anticorpos anti-mitococircndria
Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Denso Anti PL7PL12 Raramente associado a Polimiosite Anticorpo P-ribossomal Este padratildeo ocorre no LES se a associaccedilatildeo eacute com anti-proteina P ribossomal
Citoplasmaacutetico Fibrilar Filamentar Anticorpo anti-vimentina e anti-queratina Anti-queratina eacute o anticorpo mais importante em doenccedila hepaacutetica alcooacutelica Descritos em vaacuterias doenccedilas inflamatoacuterias e infecciosas Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida
Aparelho mitoacutetico Tipo Centriacuteolo Anticorpo anti-enolase em baixos tiacutetulos natildeo tem associaccedilatildeo cliacutenica definida Em altos tiacutetulos eacute sugestivo de Esclerose Sistecircmica
Aparelho mitoacutetico Tipo ponte Intercelular
Anticorpo anti Tubulina Pode ser encontrado no LES e na DMTC outros anticorpos ainda natildeo bem definidos podem gerar o mesmo padratildeo
Aparelho mitoacutetico Tipo NuMa2 Anticorpo anti-HsEg5 diversas condiccedilotildees auto-imunes com baixa especificidade
Fonte Dellavance et al 2003
37
Quadro 5 - Padrotildees de FAN mistos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Mistos Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos
Misto do tipo nucleolar homogecircneo e nuclear pontilhado grosso com placa metafaacutesica decorada em anel (cromossomos negativos)
Anticorpo anti-Ku Superposiccedilatildeo Polimiose e Esclerose Sistecircmica Podem ocorrer no LES e Esclerodermia
Misto do tipo nuclear e nucleolar pontilhado com placa metafaacutesica positiva
Anticorpo anti-topoisomerase (Scl-70) ES forma difusa Mais raramente pode ocorrer na Siacutendrome CREST e superposiccedilatildeo PolimiositeEsclerodermia
Misto do tipo Citoplasmaacutetico pontilhado fino denso e homogecircneo e nucleolar homogecircneo
Anticorpo anti rRNP LES frequumlentemente relacionado agrave Psicose Luacutepica
Misto do tipo nuclear pontilhado fino com fluorescecircncia do aparelho mitoacutetico
Anticorpo anti-NuMA1SS pode ocorrer tambeacutem em outras condiccedilotildees auto-imunes ou inflamatoacuterias crocircnicas
Fonte Dellavance et al 2003
Quadro 6 - Padrotildees de FAN nucleolares e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleolares Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos
Nucleolar Aglomerado
Anticorpo anti-Fibrilarina (U3-nRNP) Esclerose Sistecircmica (ES) especialmente com comprometimento visceral grave entre eles a hipertensatildeo pulmonar
Nucleolar Pontilhado
Anticorpo anti-NOR-90 ES tambeacutem descrito em outras doenccedilas do tecido conjuntivo poreacutem sem relevacircncia clinica definida Anticorpos anti-RNA polimerase I ES de forma difusa com tendecircncia para comprometimento visceral mais frequumlente e grave
Nucleolar Homogecircneo
Anticorpo anti-PMScl Siacutendrome de Superposiccedilatildeo de Polimiosite com Esclerose Sistecircmica Raramente encontrado em casos de Polimiosite ou Esclerose Sistecircmica sem superposiccedilatildeo cliacutenica Outros auto-anticorpos mais raros podem apresentar esse padratildeo
Fonte Dellavance et al 2003
De acordo com o 3deg Consenso (DELLAVANCE et al 2009) foram
comunicados dois novos padrotildees de fluorescecircncia por participantes Vaacuterios outros
membros testemunharam jaacute haver observado esses padrotildees O primeiro trata-se de
um padratildeo nuclear pontilhado fino aproximando-se da textura homogecircnea e com
placa metafaacutesica corada da mesma forma Sua associaccedilatildeo cliacutenica e identidade
imunoloacutegica natildeo estatildeo definidas Sua importacircncia deriva do fato de que pode ser
facilmente confundido com o padratildeo pontilhado fino denso e com o padratildeo
homogecircneo O segundo trata-se de um padratildeo citoplasmaacutetico em forma de
pequenos bastotildees (rods) e ciacuterculos (rings) que aparentemente estaacute associado agrave
38
infecccedilatildeo pelo HCV Haacute estudos em curso por alguns grupos de pesquisa com a
finalidade de estabelecer sua identidade imunoloacutegica
Como ainda natildeo estatildeo definitivamente caracterizados esses dois novos
padrotildees foram considerados preliminares e o 3deg Consenso recomendou que os
mesmos fossem completamente caracterizados e apresentados na proacutexima versatildeo
do Consenso (DELLAVANCE et al 2009)
39
2 JUSTIFICATIVA
As inflamaccedilotildees do fiacutegado provocadas pelos viacuterus hepatotroacutepicos atingem
milhotildees de pessoas e representam significativos problemas de sauacutede puacuteblica em
todo o mundo No Brasil a Regiatildeo Norte responde por um significativo percentual
dos portadores de hepatite C Dentre as manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo
pelo viacuterus C as doenccedilas autoimunes tecircm significativo impacto na evoluccedilatildeo cliacutenica
desses pacientes A presenccedila de anticorpo antinuacutecleo eacute um marcador importante de
autoimunidade e apesar de existirem trabalhos relatando a pesquisa desse fator em
portadores de viacuterus C tais estudos ainda natildeo foram realizados na nossa regiatildeo
sobretudo correlacionando-se com o genoacutetipo do viacuterus responsaacutevel pela infecccedilatildeo
considerando que o genoacutetipo eacute um marcador de resposta ao tratamento ou
considerando que pacientes portadores do genoacutetipo 1 natildeo respondem
satisfatoriamente ao tratamento instituiacutedo pelo protocolo atual
21 ASPECTOS EacuteTICOS
A pesquisa a ser realizada apresenta relevacircncia social e natildeo perde o
sentido de sua destinaccedilatildeo soacutecio-humanitaacuteria (justiccedila e equidade)
Este trabalho adequa-se aos princiacutepios cientiacuteficos que o justificam e
apresenta possibilidade concreta de responder a incertezas tais como FAN e o
genoacutetipo viral em pacientes com infecccedilatildeo pelo viacuterus da hepatite C ldquoestatildeo
relacionadosrdquo
Segue rigorosamente os procedimentos descritos na Resoluccedilatildeo 19696-
CNSMS (BRASIL 1996) assegurando a confidenciabilidade e proteccedilatildeo da
identidade do sujeito da pesquisa no momento da afericcedilatildeo dos dados e sua
posterior utilizaccedilatildeo
Por tratar-se de um estudo que faraacute somente revisatildeo de soroteca os
participantes natildeo seratildeo submetidos a riscos de origem orgacircnica eou quiacutemica
40
3 OBJETIVOS
31 OBJETIVO GERAL
Estabelecer associaccedilatildeo entre a presenccedila de teste de FAN e o genoacutetipo
viral em pacientes portadores de infecccedilatildeo pelo HCV
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
I Identificar o padratildeo de fluorescecircncia do FAN em pacientes com diagnoacutestico
laboratorial de infecccedilatildeo pelo HCV
II Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados
pelo HCV de acordo com o gecircnero e a idade
III Identificar a prevalecircncia de FAN em pacientes infectados pelo HCV e natildeo
infectados
IV Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados
pelo HCV de acordo com as alteraccedilotildees bioquiacutemicas
41
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO)
Foi realizado um estudo transversal analiacutetico no Serviccedilo do Nuacutecleo de
Medicina Tropical da Universidade Federal do Paraacute (NMTUFPA) utilizando-se
pacientes oriundos da Fundaccedilatildeo Centro de Hemoterapia e Hematologia do Paraacute
(HEMOPA) e Plano de Assistecircncia ao Servidor (PASIASEP) com coleta de material
bioloacutegico para reconfirmaccedilatildeo do diagnoacutestico de hepatite C no periacuteodo de janeiro de
2009 a maio de 2010
411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C
A populaccedilatildeo de estudo consistiu de 51 pacientes admitidos no NMTUFPA
para reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica tratamento cliacutenico e acompanhamento ambulatorial
de ambos os gecircneros e independente da idade sem exclusatildeo dos pacientes com a
presenccedila de patologias associadas agrave condiccedilatildeo maior (motivadora da pesquisa)
oriundos da Fundaccedilatildeo HEMOPA e PAS
A amostra do grupo foi selecionada a partir da relaccedilatildeo dos prontuaacuterios
catalogados no laboratoacuterio de patologia do NMTUFPA
Os dados foram coletados atraveacutes dos resultados dos exames realizados
no soro de cada paciente O protocolo de coleta teve enfoque na identificaccedilatildeo
individual do paciente bem como a avaliaccedilatildeo cliacutenica dos resultados
412 Grupo de natildeo infectados
Foi utilizado um grupo controle de 100 amostras de soro de indiviacuteduos
doadores de sangue com sorologias negativas para HIV 1 e 2 HTLV 1 e 2 Siacutefilis
Doenccedilas de Chagas Hepatite B e para Hepatite C procedentes da fundaccedilatildeo
HEMOPA
42
42 MEacuteTODO
421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico
Foram colhidos em frasco sem anticoagulante 10ml de sangue perifeacuterico
dos 51 pacientes participantes da pesquisa A amostra sanguiacutenea de cada paciente
foi centrifugada o soro foi separado e colocado em frasco esteacuteril devidamente
identificado armazenado e resfriado de 2 a 8ordmC
Foi realizada no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais a
pesquisa soroloacutegica de anticorpos IgG anti-HCV por teste imunoenzimaacutetico (ELISA)
e os pacientes que apresentaram positividade tiveram seus resultados confirmados
atraveacutes de teacutecnicas moleculares (RT-PCR) e com identificaccedilatildeo do genoacutetipo viral
(genotipagem)
Foi realizado no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa a pesquisa
de FAN dos 51 pacientes selecionados utilizando as amostras existentes na
soroteca
422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C
Foram empregados testes soroloacutegicos de ELISA (Ensaio
Imunoenzimaacutetico) de 3ordf geraccedilatildeo utilizando-se de kits comerciais (kit ETI-AB-HCVK-
4 DiaSorin Itaacutelia) para detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos anti-HCV no soro dos
pacientes
As tiras (poccedilos) necessaacuterias para as reaccedilotildees foram retiradas da geladeira
com antecedecircncia de uma hora e deixadas agrave temperatura ambiente e os reagentes
homogeneizados rapidamente no voacutertex
O primeiro poccedilo da placa ficou o branco da reaccedilatildeo na sequecircncia da
microplaca de ELISA foi dispensado 200 microL do controle negativo em triplicata (trecircs
poccedilos) 200 microL do calibrador em duplicata (dois poccedilos) e 200 microL do controle positivo
em amostra uacutenica (um poccedilo)
Adicionou-se 200 microL do Diluente de Amostra em todos os poccedilos que
continham as amostras dos pacientes a serem dosadas na placa de ELISA
tomando cuidado para natildeo contaminar os poccedilos adjacentes
43
Dispensou-se 50 microL do Diluente do Reagente em todos os poccedilos de
controles calibradores e amostras cobrimos com adesivo para evitar evaporaccedilatildeo e
contaminaccedilatildeo das amostras e incubamos a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC
Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com
300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem diluiacuteda
Pipetou-se 100 microL de Conjugado Enzimaacutetico exceto no poccedilo do branco e
incubou-se a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se
cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com 300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem
diluiacuteda
Pipetou-se 100 microL de CromoacutegenoSubstrato em todos os poccedilos
Incubamos a microplaca protegendo-a de luz intensa e direta agrave temperatura
ambiente (18-24ordmC) por 15 min
Pipetou-se 100 microL de Aacutecido Sulfuacuterico em todos os poccedilos para ldquopararrdquo a
reaccedilatildeo enzimaacutetica e mediu-se a absorbacircncia da soluccedilatildeo obtida em leitor de ELISA
com filtro de 450 nM
O teste foi validado de acordo com os valores do controle de qualidade
preconizados pelo fabricante e que devem tanger os valores para o branco da
reaccedilatildeo le 0100 controle negativo le 0050 controle positivo ge 1000 e calibrador ge
1100 Para as amostras testadas os valores reagentes e natildeo reagentes para
pesquisa de anticorpos anti-HCV satildeo interpretados da seguinte maneira natildeo
reagentes com valores le 09 reagentes com valores ge 11 e indeterminados entre
os valores 09 ndash 11
423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia molecular
Nas amostras positivas pela sorologia (ELISA) realizou-se extraccedilatildeo do
RNA viral presente no soro do paciente utilizando kit comercial (QIAmp Viral RNA
kit Quiagen Alemanha) seguindo a teacutecnica adaptada no Laboratoacuterio de Patologia
Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais
Pipetou-se 560 microL de tampatildeo AVL (lise) contendo RNA em tubo de
centriacutefuga de 15 ml identificado adicionou-se 140 microL da amostra e homogenizou-se
em voacutertex por 15s incubando a temperatura ambiente (15-25degC) por 10 min Apoacutes
incubaccedilatildeo centrifugou-se rapidamente o tubo para remover partiacuteculas dispersas
44
Adicionou-se 560 microL de etanol (96-100) na amostra e homogenizou-se
no voacutertex por 15s centrifugando-se rapidamente para remover partiacuteculas dispersas
Depois cuidadosamente transferiu-se 630 microL para as colunas devidamente
identificadas centrifugou-se a 14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo
ficando soacute com a coluna para encaixar em outro tubo
Colocou-se o resto das amostras nas colunas devidas centrifugou-se a
14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo ficando soacute com a coluna para
encaixar em outro tubo Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW1) e
centrifugou-se por 1 min mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo
Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW2) e centrifugou-se por 4 min
mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo
Identificados os tubos para RNA colocou-se as colunas Adicionou-se 60
microL de tampatildeo para eluir (AVE) em cada amostra e centrifugou-se por 1 min
descartando a coluna e ficando com o tubo Colocou-se em banho-maria por 10 min
a 65degC centrifugado rapidamente e colocado no gelo As amostras extraiacutedas foram
congeladas e armazenadas em freezer a -20ordmC
O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado de acordo com a teacutecnica de
RT-PCR qualitativa com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das
Doenccedilas Tropicais da seguinte maneira para o Mix de uma amostra Tampatildeo 12
microL primer ou iniciador k10 1microL primer ou iniciador k11 1microL aacutegua ultrapura livre de
DNAse e RNAse 5 microL Enzima Taq polymerase One-Step (Invitrogen) 1 microL O
primer k10 constitui-se da sequecircncia GGC GAC ACT CCA CCA TRR e o primer k11
da sequecircncia GGT GCA CGG TCT ACG AGA CC
O volume do mix por amostra eacute de 20 microL e o volume da amostra (produto
da extraccedilatildeo) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As amostras
foram colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo eacute realizada a 42ordmC por 45 minutos
temperatura inicial de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 2 minutos seguida de 35 ciclos com
temperatura de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 54ordmC por 30
segundos de extensatildeo a 72ordmC por 45 segundos e temperatura de extensatildeo final de
72ordmC por 7 minutos e um hold de 4ordmC
Para visualizaccedilatildeo do produto dessa 1ordf PCR (RT-PCR) eacute feito um gel de
agarose a 1 (1g de agarose para 100mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de
etidium) que migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os
resultados foram visualizados atraveacutes de luz ultravioleta (UV) Os pacientes
45
positivos que apresentarem ldquobandardquo devem continuar os procedimentos e os
negativos que natildeo apresentarem ldquobandasrdquo deveratildeo ser liberados como
indetectaacuteveis por este meacutetodo
A 2ordf PCR (RFLP) foi responsaacutevel por fazer a amplificaccedilatildeo do cDNA
produto da 1ordf PCR Para esta etapa tambeacutem com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio
de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais foram necessaacuterios para o Mix de uma
amostra Tampatildeo 10X 25 microL DNTP 4 microL MgCl2 15 microL primer ou iniciador k15 1
microL primer ou iniciador k16 1 microL aacutegua ultrapura livre de DNAse e RNAse 125 microL
Enzima Taq platinum (Invitrogen) 05 microL O primer k15 constitui-se da sequecircncia
ACC ATR RAT CAC TCC CCT GT e o primer k16 da sequecircncia CAA GCA CCC TAT
CAG GCA GT
O volume do mix por amostra foi de 23 microL e o volume da amostra
(produto da 1ordf PCR) de 2 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As
amostras satildeo colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo se realiza a temperatura inicial
de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 4 minutos seguida de 35 ciclos com temperatura de
desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 55ordmC por 45 segundos de
extensatildeo a 72ordmC por 1 minuto e temperatura de extensatildeo final de 72ordmC por 7
minutos e um hold de 4ordmC
O produto da 2ordf PCR eacute observado atraveacutes de um gel de agarose a 1 (1g
de agarose para 100 mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que
migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os resultados
foram visualizados atraveacutes de luz UV (ultravioleta) Os pacientes positivos que
apresentaram ldquobandardquo (fragmento amplificado) se continuou os procedimentos e os
negativos que natildeo apresentaram ldquobandasrdquo foram repetidos para o procedimento da
2ordf PCR
424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem)
Os pacientes positivos para a 2ordf PCR foram submetidos agrave genotipagem
do viacuterus atraveacutes do meacutetodo de RFLP utilizando um par de enzimas de restriccedilatildeo
AVA II e RSA I Essa teacutecnica tambeacutem foi adaptada no Laboratoacuterio de Patologia
Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais
46
Na determinaccedilatildeo do genoacutetipo cada amostra eacute utilizada duas vezes
sendo uma reaccedilatildeo para AVA II e uma para RSA I portanto cada amostra teve dois
tubos correspondentes
Para a preparaccedilatildeo do mix de uma amostra para a enzima de restriccedilatildeo
AVA II (Promega) foram utilizados Buffer C X 30 2 microL aacutegua ultrapura livre de
DNAse e RNAse 125 microL AVA II 05 microL Para o mix de uma amostra de RSA I
(Invitrogen) satildeo necessaacuterios React 1 10X 2 microL aacutegua ultrapura libre de DNAse e
RNAse 11 microL RSA I 2 microL
O volume do mix por amostra foi de 15 microL e o volume da amostra
(produto da 2ordf PCR) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 20 microL para
cada frasco correspondente a sua enzima de restriccedilatildeo As amostras formatildeo ldquoparesrdquo
de tubos AVA II e RSA I e satildeo colocadas em banho-maria a 37ordmC overnight para
digerir (cortar) os fragmentos
Para visualizaccedilatildeo do produto da digestatildeo (RFLP) e verificaccedilatildeo dos
genoacutetipos foi preparado um gel de agarose a 2 (2g de agarose para 100 mL de
tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que migrou em cuba de eletroforese
com 100V 500A por 60 minutos Os resultados foram visualizados atraveacutes de luz UV
(ultravioleta) Os pacientes positivos apresentam ldquobandasrdquo (fragmentos) de
tamanhos diferentes O nuacutemero de bandas e sua disposiccedilatildeo no gel formaram
padrotildees de combinaccedilotildees correspondentes a cada genoacutetipo viral
425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas HEp-2
A pesquisa de auto-anticorpo contra antiacutegenos celulares foi realizada no
Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa pela teacutecnica de imunofluorescecircncia
indireta que os identifica atraveacutes da ligaccedilatildeo destes auto-anticorpos aos antiacutegenos do
substrato sendo esta ligaccedilatildeo revelada pela adiccedilatildeo de um soro com atividade Anti-
IgG conjugado agrave fluoresceiacutena
As amostras foram testadas utilizando-se um conjunto diagnoacutestico
comercial Antinuclear Antibody HEp-2 da Hemagen Diagnostics
Na primeira fase da reaccedilatildeo os soros diluiacutedos 140 colocados em contato
com o substrato durante 20 minutos seguido de lavagem com soluccedilatildeo salina
tamponada por 10 minutos Na segunda fase aplicacou-se a substacircncia
47
fluorescente sendo o conjugado diluiacutedo 130 deixando-se por 10 minutos seguida
de nova lavagem de 10 minutos e montagem da lacircmina com glicerina tamponada
Em cada lacircmina foram utilizados controle positivo e controle negativo
A leitura das lacircminas foi realizada em microscoacutepio de imunofluorescecircncia
marca Nikon modelo Eclipse E-200
Os criteacuterios morfoloacutegicos observados durante a leitura foram
a) aspecto da matriz nuclear
b) aspecto do nucleacuteolo
c) observaccedilatildeo de todos os estaacutegios de divisatildeo nuclear
d) aspecto do fuso mitoacutetico
e) aspecto do citoplasma
43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados coletados foram estruturados em um banco de dados no qual
tambeacutem foram confeccionadas tabelas e graacuteficos para representaccedilatildeo dos dados
Posteriormente foram analisados no programa Bioestat 50 para a geraccedilatildeo de
resultados estatiacutesticos que comprovassem a associaccedilatildeo de variaacuteveis pertinentes ao
estudo considerando o intervalo de confianccedila (IC) 95 e niacutevel α 5 (p-valor le 005)
isto eacute um achado seraacute considerado estatisticamente significante se valor de ldquoprdquo for
menor ou igual a 005 e seraacute considerado sem significacircncia estatiacutestica se esse valor
de ldquoprdquo for maior que 005
Nas variaacuteveis quantitativas foram realizadas as medidas de tendecircncia
central sendo calculado a meacutedia e a mediana com seus respectivos desvios
padrotildees O teste t foi usado para comparar as idades entre as amostras
O teste do Qui-quadrado e o teste G foram aplicados nas comparaccedilotildees de
n amostras independentes cujas proporccedilotildees observadas nas diversas modalidades
estiveram dispostas em tabelas de contigecircncia l x c onde se determinou as
proporccedilotildees observadas nas diferentes categorias e se estas tinham alguma
associaccedilatildeo
48
5 RESULTADOS
O Padratildeo de FAN em 100 dos 51 pacientes infectados pelo HCV e em
2 dos natildeo infectados pelo HCV ocorreu Citoplasmaacutetico
Com relaccedilatildeo agrave distribuiccedilatildeo dos pacientes por gecircnero observou-se uma
predominacircncia do gecircnero masculino (667) A faixa etaacuteria predominante foi a de 30
a 50 anos de idade (628) seguida da faixa etaacuteria compreendida entre 51 e 60
anos (196) No que diz respeito agrave naturalidade houve uma predominacircncia de
paraenses em 922 da amostra A maioria dos pacientes incluiacutedos no estudo foi
proveniente da Fundaccedilatildeo HEMOPA (98) por se tratarem de candidatos a doaccedilatildeo
de sangue (Tabela 1)
Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV segundo as caracteriacutesticas demograacuteficas janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Caracteriacutesticas demograacuteficas n Teste estatiacutestico Gecircnero
Masculino 34 667 Qui-quadrado Feminino 17 333 p = 00251
Total 51 1000
Idade (anos) lt 30 6 118 Qui-quadrado
30 a 40 16 314 p = 00094 41 a 50 16 314 51 a 60 10 196
gt 60 3 59 Total 51 1000
Naturalidade
Paraense 47 922 Qui-quadrado Macapaense 1 20 p lt 00001 Maranhense 1 20
Pernambucano 1 20 Gauacutecho 1 20
Total 51 1000
Procedecircncia Qui-quadrado HEMOPA 50 980 p lt 00001
IASEP 1 20 Total 51 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
49
Identificou-se no estudo a predominacircncia do genoacutetipo viral do tipo 1
(882) estando o genoacutetipo 3 presente em 118 dos casos Em 255 dos
pacientes foi observado uma positividade para FAN sendo que todos apresentaram
o padratildeo citoplasmaacutetico (Tabela 2)
Tabela 2 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV conforme os resultados laboratoriais de FAN citoplasmaacutetico e genotipagem janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Exames laboratoriais n Teste estatiacutestico
Genoacutetipo viral - HCV
Tipo 1 45 882 Qui-quadrado
Tipo3 6 118 p lt 00001
Total 51 1000
FAN Qui-quadrado
Positivo (citoplasmaacutetico) 13 255 p = 00008
Negativo 38 745 Total 51 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
Observou-se uma baixa positividade para o FAN tanto no gecircnero
masculino (294) quanto no gecircnero feminino (176) Natildeo houve diferenccedila
estatiacutestica significante entre os gecircneros e a anaacutelise do FAN (p = 05652) Isto eacute
independendo do gecircnero do paciente nada se poderaacute inferir se o mesmo teraacute maior
ou menor chance de possuir um FAN positivo ou negativo (Tabela 3)
Tabela 3 ndash Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
FAN (citoplasmaacutetico)
Gecircnero Teste estatiacutestico
(Teste G) Masculino Feminino
N N
Positivo 10 294 3 176
Negativo 24 706 14 824 p = 05652
Total 34 1000 17 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
Dentre os pacientes infectados o genoacutetipo viral tipo 1 e o tipo 3
predominaram no gecircnero masculino embora natildeo havendo diferenccedila significativa
entre os grupos (p=06376)(Tabela 4)
50
Tabela 4 - Relaccedilatildeo da genotipagem de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Gecircnero
Grupos estudados Teste estatiacutestico
(Teste G) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3
n n Masculino 29 644 5 833 p=06376 Feminino 16 356 1 167
Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa
Na faixa etaacuteria de 30 a 50 anos foi observada uma maior proporccedilatildeo (667)
do genoacutetipo viral do tipo 3 enquanto que para o genoacutetipo tipo 1 foi de 628 natildeo
tendo essa diferenccedila significacircncia estatiacutestica (Tabela 5)
Tabela 5 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e faixa etaacuteria - janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)
Idade (anos) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n
lt 30 04 118 0 00
30 a 40 15 314 3 500 p = 06401
41 a 50 15 314 1 167
51 a 60 08 196 2 333
gt 60 03 59 0 00 Total 45 1000 6 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
A anaacutelise descritiva das idades dos pacientes demonstrou que a meacutedia e
a mediana foi de 43 anos para aqueles com genoacutetipo viral tipo 1 no entanto para o
genoacutetipo viral tipo 3 a meacutedia foi de 44 e a mediana de 42 anos Observou-se que a
idade miacutenima dos pacientes com genoacutetipo viral-HCV do tipo 1 e 3 foi
respectivamente de 20 e 32 anos e a maacutexima foi de 68 e 57 anos perfazendo uma
amplitude total de 48 e 25 anos respectivamente Natildeo houve significacircncia estatiacutestica
entre as idades encontradas nos genoacutetipos 1 e 3 (Tabela 6 )
De acordo com o FAN citoplasmaacutetico a idade miacutenima dos pacientes com
FAN positivo e negativo foi respectivamente de 30 e 20 anos e a maacutexima foi de 53 e
68 anos perfazendo uma amplitude total de 23 e 48 anos respectivamente As
idades meacutedia e mediana foram respectivamente 435 e 46 anos nos pacientes com
o FAN positivo e meacutedia de 43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN
51
negativo Natildeo houve diferenccedila estatisticamente significativa entre as idades
encontradas nos pacientes com FAN positivo e negativo (Tabela 6)
Tabela 6 - Estudo descritivo da idade dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e presenccedila do FAN citoplasmaacutetico janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Grupos Estudados Genoacutetipo viral - HCV Auto anticorpo
Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 FAN (+) FAN (-) IDADE
Tamanho da amostra 45 6 13 38
Idade miacutenima 20 32 30 20
Idade maacutexima 68 57 53 68
Amplitude Total 48 25 23 48
Meacutedia Aritmeacutetica 43 44 435 43
Mediana 43 42 46 42
Desvio Padratildeo 107 93 78 113
Teste t p = 08363 p = 08809 Fonte Protocolo da pesquisa
Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos em que foram analisados AST
ALT ASTALT γ-GT e fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo
semelhantes dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e 3 natildeo
atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos
(Tabela 7)
Tabela 7- Distribuiccedilatildeo dos genoacutetipos dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Paracircmetros bioquiacutemicos
Genoacutetipo viral - HCV Teste estatiacutestico
(Teste t) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3
micro plusmn DP micro plusmn DP
AST 353 plusmn 219 328 plusmn 137 p = 07907
ALT 372 plusmn 321 288 plusmn 136 p = 05355
ASTALT 12 plusmn 07 14 plusmn 11 p = 06110
γ-GT 403 plusmn 38 302 plusmn 138 p = 02194
Fosfatase alcalina 1126 plusmn 443 1087 plusmn 376 p = 08349
Fonte Protocolo da pesquisa
Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos de AST ALT ASTALT γ-GT e
fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os
52
pacientes com FAN positivo e negativo natildeo sendo observada significacircncia
estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos de FAN (Tabela 8)
Tabela 8 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Paracircmetros bioquiacutemicos Auto anticorpos
Teste estatiacutestico (Teste t) Positivo Negativo
micro plusmn DP micro plusmn DP
AST 419 plusmn 238 326 plusmn 197 p = 01704
ALT 408 plusmn 29 346 plusmn 312 p = 05347
ASTALT 13 plusmn 08 12 plusmn 07 p = 05732
γ-GT 34 plusmn 21 409 plusmn 40 p = 04369
Fosfatase alcalina 1073 plusmn 345 1138 plusmn 462 p = 06431 Fonte Protocolo da pesquisa
Na comparaccedilatildeo entre resultados positivos e negativos do FAN
citoplasmaacutetico observou-se uma maior prevalecircncia da negatividade tanto em
pacientes natildeo infectados (98) como em pacientes infectados (745) pelo HCV
sendo essa diferenccedila estatisticamente significativa (plt00001) o que representa
uma natildeo associaccedilatildeo entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV
(Tabela 9)
Tabela 9 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico segundo a presenccedila ou ausecircncia de infecccedilatildeo por HCV janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
FAN (citoplasmaacutetico)
Pacientes Teste estatiacutestico (Teste G)
Infectados Natildeo infectados
N n
Positivo 13 255 2 2
Negativo 38 745 98 98 p lt 00001
Total 51 1000 100 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
Comparando-se os resultados do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos
viras observa-se que o resultado negativo eacute superior ao positivo em ambos os
genoacutetipos virais sendo 711 para o genoacutetipo viral 1 e 100 para o genoacutetipo viral 3
No entanto esta diferenccedila observada natildeo eacute estatisticamente significativa (p=02573)
(Tabela 10)
53
Tabela 10 - Distribuiccedilatildeo do FAN de acordo com o genoacutetipo viral janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
FAN (citoplasmaacutetico)
Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)
Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n
Positivo 13 289 0 00 p=02573 Negativo 32 711 6 1000
Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa
54
6 DISCUSSAtildeO
Desde o primeiro marcador soroloacutegico para diagnoacutestico do Lupus
Eritematoso Sistecircmico (LES) a ceacutelula LE descrita por Hargraves (1948) vaacuterios
substratos antigecircnicos foram utilizados para o estudo dos auto-anticorpos os quais
terminaram amplamente substituiacutedos pelas ceacutelulas HEp-2 Estas apresentam
significativas vantagens sobre os demais pela sua sensibilidade variedade de
antiacutegenos presentes e pelas facilidades morfoloacutegicas para o seu estudo
O uso da imunofluorescecircncia indireta para a visualizaccedilatildeo dos anticorpos
antinucleares nas ceacutelulas HEp-2 permite o reconhecimento de mais de 30 diferentes
padrotildees de fluorescecircncia como nucleares nucleolares da membrana nuclear do
aparelho mitoacutetico e citoplasmaacutetico todos satildeo proporcionados por diferentes auto-
anticorpos
A partir do 1deg Consenso Brasileiro para Padronizaccedilatildeo dos Laudos de FAN
(HEp-2) os criteacuterios para o preparo interpretaccedilatildeo da fluorescecircncia e nomenclatura
dos resultados passaram a ser normatizados Alguns padrotildees de fluorescecircncia satildeo
relativamente inespeciacuteficos outros satildeo ocasionados por uma gama restrita de auto-
anticorpos e outros ainda por um uacutenico auto-anticorpo (DELLAVANCE et al
2002) Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a tornaacute-las
imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo (DE
LARANAGA et al 2000)
Apesar do padratildeo de fluorescecircncia na maioria das vezes natildeo se pode
identificar o anticorpo presente ele pode sugerir ao cliacutenico qual o proacuteximo passo a
ser dado na investigaccedilatildeo da sua especificidade Os resultados encontrados devem
estar em associaccedilatildeo com a cliacutenica os padrotildees de fluorescecircncia e os tiacutetulos
alcanccedilados com a diluiccedilatildeo preacutevia (DELLAVANCE et al 2003)
No presente estudo a analise de 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo Viacuterus da
Hepatite C esteve presente o anticorpo-antinuclear (ANA FAN) em 13 (255) dos
pacientes e todos eram padratildeo citoplasmaacutetico corroborando com outros estudos
encontrados na literatura como
Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de
pacientes infectados pelo viacuterus HIV com Hanseniacutease e co-infectados com
Hanseniacutease HIV Ela obteve respectivamente as seguintes taxas de prevalecircncias
32 333 e 478 Em todos os grupos neste estudo houve predomiacutenio do
55
padratildeo citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear soacute foi observado entre os pacientes com
hanseniacutease (91) e co-infectados (237)
Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de
pacientes infectados pelo viacuterus da Dengue e viacuterus linfotroacutepico de ceacutelulas T humanas
HTLV-12 e controle Normais e obteve respectivamente as seguintes taxas de
prevalecircncias 40 40 e 2 Em todos os grupos houve predomiacutenio do padratildeo
citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear foi observado entre os pacientes com dengue
(67) e HTLV 12 (133)
Segundo Andrade et al (2002) Dellavance et al (2005) Dellavance e
Andrade et al (2007) o predomiacutenio do padratildeo de FAN do tipo citoplasmaacutetico indica
que determinados padrotildees de fluorescecircncia satildeo mais especiacuteficos de doenccedila auto-
imune enquanto outros ocorrem em indiviacuteduos com enfermidades natildeo auto-imunes
por ser o citoplasma celular rico em proteiacutenas para as quais auto-anticorpos naturais
apresentam afinidade moderada eacute comum observar positividade para FAN em
indiviacuteduos sadios cujo significado ainda natildeo eacute entendido completamente
O padratildeo Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina que pode ser
encontrado em Hepatite auto-imune Cirrose Hepatite C Hepatocarcionoma entre
outros Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica
definida Um resultado positivo pode estar ou natildeo associado a uma patologia assim
como poderaacute ou natildeo vir a apresentar uma doenccedila auto-imune com o passar do
tempo (DELLAVANCE et al 2003) Neste estudo natildeo foi feito avaliaccedilatildeo prospectiva
dos resultados embora todos sejam FAN citoplasmaacuteticos
Os achados de FAN positivo em populaccedilotildees sadias ou sem doenccedilas auto-
imunes tambeacutem jaacute observado por Leser et al (2004) que em 394 pacientes com
FAN-HEp-2 positivo natildeo encontraram nenhum paciente com doenccedila auto-imune
Outro exemplo estaacute no padratildeo citoplasmaacutetico de pontos isolados
estudado por Laurino et al (2006) presente em indiviacuteduos sem evidecircncia de auto-
imunidade mas tambeacutem em indiviacuteduos com acometimento de doenccedilas auto-imunes
sistecircmicas e natildeo-especiacuteficas
Os dados apresentados corroboram com este estudo em que foi
observado a presenccedila do auto-anticorpo em 2 (2 ) dos 100 indiviacuteduos sadios do
grupo controle todos com padratildeo citoplasmaacutetico
56
Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a
tornaacute-las imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo
(DE LARANAGA et al 2000)
Nas Infecccedilotildees agudas espera-se que a resposta auto-imune diminua a
medida que os viacuterus satildeo eliminados Entretanto alguns trabalhos sugerem que em
indiviacuteduos geneticamente susceptiacuteveis as reaccedilotildees auto-imunes possam persistir
apesar do clareamento viral uma vez que o gatilho imunoloacutegico foi ativado e natildeo
houve desativaccedilatildeo (DE LARANAGA et al 2000 SAKKAS et al 2008)
Ramos-Casals et al (2009) no estudo Doenccedilas Sistecircmica Auto-Imunes
em Pacientes com Infecccedilatildeo pelo (72) dos pacientes eram do gecircnero feminino e
(28) do masculino(ANA FAN) em 61 dos pacientes o que se diferem deste
trabalho eacute que dos 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo (667) eram do gecircnero
masculino e (333) eram do gecircnero feminino com meacutedia de idade de 430 (plusmn107)
anos com presenccedila de anticorpo-antinuclear em 13 (255) com meacutedia e mediana
respectivamente de 435 e 46 anos nos pacientes com o FAN positivo e meacutedia de
43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN negativo
Alter (1995) em sua pesquisa natildeo observou associaccedilatildeo entre o risco de
infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas designadas por gecircnero idade e raccedila Na
referida pesquisa foram estudados 51 pacientes com idade meacutedia de 430 (+- 107)
anos 34 (667) eram do gecircnero masculino e 17 (333) do gecircnero feminino todos
em fase preacute-tratamento assintomaacuteticos natildeo permitindo avaliar os risco da
infecccedilatildeoSegundo Pordeus et al (2008) a ocorrecircncia destes auto-anticorpos
indicaria um prognoacutestico desfavoraacutevel Perperas Mcfarlane e Mcsorley (1986)
sugeriram que os auto-anticorpos poderiam estar envolvidos na progressatildeo ou no
desenvolvimento de hepatites crocircnicas possivelmente por um distuacuterbio no controle
da auto-reatividade Outros estudos questionam a participaccedilatildeo dos auto-anticorpos
no processo de transiccedilatildeo para cronicidade das hepatites agudas virais poreacutem os
resultados natildeo satildeo convincentes (SHOENFELD ROSE 2004)
Lopez Seia e Roy (1998) demonstraram a presenccedila de anticorpo anti-
actina em baixos tiacutetulos em crianccedilas com hepatite aguda por curto periacuteodo de
tempo poreacutem nenhuma associaccedilatildeo com gravidade da agressatildeo hepaacutetica foi
descrita
Neste estudo a presenccedila dos auto-anticorpos em (255) dos pacientes
com infecccedilatildeo pelo HCV natildeo puderam ser relacionada com a gravidade da doenccedila
57
pois este estudo foi realizado em pacientes receacutem diagnosticados entatildeo seria
necessaacuterio um acompanhamento destes por um periacuteodo maior de tempo com a
finalidade de concluir esta afirmativa Apesar da presenccedila transitoacuteria de auto-
anticorpos jaacute ter sido descrita em doenccedilas virais comuns a associaccedilatildeo entre a
presenccedila de auto-anticorpos e a gravidade das doenccedilas necessita de comprovaccedilatildeo
Passaleva Massai e Leoncini (1983) avaliaram 302 pacientes com
hepatites agudas virais e encontraram complexos imunes circulantes (CIC) em
516 dos pacientes com frequumlecircncia significativamente maior em hepatite aguda
Nenhuma associaccedilatildeo entre a presenccedila de imuno-complexos e o niacutevel de
aminotransferases ou bilirrubina foi encontrada Segundo Andrade et al (2002)
Dellavance et al (2005) Andrade et al (2007) nos pacientes do estudo foi feita a
relaccedilatildeo entre a presenccedila dos auto-anticorpos e niacuteveis de aminotransferases e as
elevaccedilotildees natildeo tiveram significacircncia poreacutem houve associaccedilatildeo do genotipo viral 1
Nos paracircmetros bioquiacutemicos analisados em relaccedilatildeo aos genoacutetipos houve uma
distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e
3 natildeo atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os
grupos Segundo Wilson (1997) trecircs estudos mostraram correlaccedilatildeo entre niacuteveis
altos de alanina aminotransferase e atividade histoloacutegica da doenccedila hepaacutetica
Poreacutem nos pacientes considerados individualmente o valor preditivo dessa
associaccedilatildeo foi baixo enquanto muitos deles com enzimas normais apresentavam
graves alteraccedilotildees histoloacutegicas No presente estudo natildeo foi observada associaccedilatildeo entre os niacuteveis de
aminotransferases e a cronificaccedilatildeo da hepatite viral pois nem todos os pacientes do
estudo apresentavam resultado de bioacutepsia hepaacutetica
Alter et al (1999) afirmam que no Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b
(63) e 3a (313) em estudo realizado em Goiacircnia onde foi observada uma
maior prevalecircncia do genoacutetipo 1 seguida do genoacutetipo 3 em doadores de sangue e
hemofiacutelicos (DELLAVANCE ANDRADE et al 2007) Estando esses dados em
acordo com esta pesquisa que com genotipagem do viacuterus da hepatite C que
identificou o genoacutetipo 1 em 45 (882) seguidos pelo genoacutetipo 3 que foi
identificado em 6 (118) dos pacientes com infecccedilatildeo pelo HCV Em um estudo realizado na Franccedila com 13 pacientes luacutepicas infectadas
pelo viacuterus C 8 apresentavam o RNA viral sendo o genoacutetipo 1 presente em cinco
58
(625) casos seguido do genoacutetipo 3 (375) (PERLEMUTER et al 2000) dados
que se assemelham aos do presente estudo embora o estudo natildeo tenha incluiacutedo
pacientes com outras infecccedilotildees associadas ao HCV Eacute importante ressaltar que
estudos sobre genotipagem do HCV em indiviacuteduos com doenccedilas reumaacuteticas satildeo
raros
No presente estudo houve uma frequumlecircncia baixa de positividade para o
FAN nos pacientes com genoacutetipo 1 e genoacutetipo 3 Natildeo havendo significacircncia
estatiacutestica entre os pacientes com genoacutetipo 1 e 3
Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter
implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave menor
resposta agrave terapia antiviral (BRUNO et al1997) o que natildeo foi avaliado neste estudo
pois apesar de (882) dos pacientes serem genoacutetipo 1 todos estavam em fase de
reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica seja preacute- tratamento Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila
poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses
autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis
vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo
hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja
quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a
concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave
hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em
parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)
59
7 CONCLUSOtildeES
minus O padratildeo dos auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares encontrados nos
dois grupos estudados foi o citoplasmaacutetico
minus A prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares no grupo com
infecccedilatildeo pelo VHC foi significativamente maior do que no grupo controle
minus Nos resultados de FAN citoplasmaacutetico haacute uma maior prevalecircncia da
negatividade em pacientes infectados pelo HCV e natildeo infectados sendo
essa diferenccedila estatisticamente significativa conferindo a natildeo associaccedilatildeo
entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV
minus Os resultados negativos do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos viras eacute
superior aos positivos em ambos os genoacutetipos virais entretanto esta diferenccedila
natildeo eacute estatisticamente significativa
minus Houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos
celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado
minus Natildeo houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos
celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado com
relaccedilatildeo ao gecircnero onde predominou o gecircnero masculino nos dois grupos
minus Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter
implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave
menor resposta agrave terapia antiviral o que natildeo foi avaliado neste estudo pois
os pacientes estavam em fase preacute tratamento sugerindo que estes pacientes
sejam avaliados futuramente
minus A formaccedilatildeo dos auto-anticorpos parece ser mais uma consequumlecircncia do que
uma causa da agressatildeo hepaacutetica
minus A negatividade do FAN ndash Hep 2 foi maior que a positividade mas todos os
FAN positivos pertenciam ao genoacutetipo viral tipo 1 nos pacientes infectados
pelo HCV
minus Nesta pesquisa os resultados de PCR o RNA-HCV de reconfirmaccedilatildeo foi
positivo para o anti-HCV em todos os soros analisados mostrando assim
que estes pacientes eram portadores de infecccedilatildeo por viacuterus C ou seja natildeo
houve falso positivo anteriormente poreacutem todos eram assintomaacuteticos
dificultando a conclusatildeo de ser ou natildeo uma infecccedilatildeo persistente
60
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APEcircNDICES
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APEcircNDICE A - TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Vocecirc estaacute sendo convidado para fazer parte de uma pesquisa que estaacute sendo desenvolvida pela Universidade Federal do Paraacute no Nuacutecleo de Medicina Tropical intitulada AUTOANTICORPOS CONTRA ANTIacuteGENOS CELULARES E SUA CORRELACcedilAtildeO COM O GENOacuteTIPO VIRAL EM PACIENTES COM INFECCcedilAtildeO PELO VIacuteRUS DA HEPATITE C (HCV)
O Objetivo da pesquisa eacute fazer uma correlaccedilatildeo do anticorpo antinuacutecleo (FAN) e o genoacutetipo viral em pacientes com hepatite C e o estaacutegio da doenccedila hepaacutetica a partir da histologia sempre que permitidos e correlacionar ao diagnoacutestico
Caso vocecirc participe da pesquisa seraacute necessaacuterio que forneccedila uma amostra de sangue (2ml)
O uacutenico inconveniente que vocecirc poderaacute experimentar eacute a dor provocada pela agulha na hora da coleta de sangue bem como pequenos hematomas que possam vir a ocorrer e que natildeo causam danos
Essa pesquisa natildeo oferece riscos as praacuteticas satildeo de uso rotineiro e seratildeo utilizados materiais esterilizados e descartaacuteveis como agulhas seringas etc
Estaacute garantido a vocecirc todas as informaccedilotildees que vocecirc queira antes durante e depois da pesquisa
A sua participaccedilatildeo neste estudo eacute voluntaacuteria Vocecirc tem a liberdade de recusar participar da pesquisa a qualquer momento
As informaccedilotildees relacionadas agrave pesquisa poderatildeo ser inspecionadas pelos pesquisadores que executam a pesquisa e pelas autoridades legais no entanto se qualquer informaccedilatildeo for divulgada em relatoacuterio publicaccedilatildeo ou qualquer outro meio isto seraacute feito de forma codificada para manter o caraacuteter confidencial
Todas as despesas necessaacuterias para a realizaccedilatildeo do estudo natildeo satildeo de sua responsabilidade assim como a sua participaccedilatildeo na pesquisa na seraacute remunerada (vocecirc natildeo receberaacute qualquer valor em dinheiro)
Quando os resultados forem divulgados natildeo apareceraacute seu nome e sim um coacutedigo
_____________________________________
Assinatura do Pesquisador Responsaacutevel NomeAna Maria Almeida Souza EndRodovia Maacuterio Covas 1426 ndash Cond Green Garden casa 41 Fone(91) 32352665 81197217 RegConselhoCRM 1508
69
APEcircNDICE B - CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Declaro que li as informaccedilotildees acima sobre a pesquisa que me sinto
perfeitamente esclarecido sobre o conteuacutedo da mesma assim como seus riscos e
benefiacutecios Declaro ainda que por minha livre vontade aceito participar da pesquisa
cooperando com a coleta de material para exame
Beleacutem _________
_________________________________________
Assinatura do sujeito da pesquisa ou do
responsaacutevel
70
ANEXOS
71
- Assinatura do Pesquisador Responsaacutevel
-
- Beleacutem _________
-
ANA MARIA ALMEIDA SOUZA
AUTOANTICORPOS CONTRA ANTIacuteGENOS CELULARES E SUA CORRELACcedilAtildeO
COM O GENOacuteTIPO VIRAL EM PACIENTES COM INFECCcedilAtildeO PELO VIacuteRUS DA HEPATITE C (HCV)
Dissertaccedilatildeo apresentada ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Doenccedilas Tropicais do Nuacutecleo de Medicina Tropical da Universidade Federal do Paraacute como requisito para obtenccedilatildeo do grau de mestre em Doenccedilas Tropicais Orientador Prof Dr Juarez Antonio
Simotildees Quaresma
Beleacutem 2011
Dados Internacionais de Catalogaccedilatildeo-na-Publicaccedilatildeo (CIP)
Souza Ana Maria Almeida
Autoanticorpos contra antiacutegenos celulares e sua correlaccedilatildeo com o Genoacutetipo viral em pacientes com infecccedilatildeo pelo viacuterus da Hepatite C (HCV) Ana Maria Almeida Souza orientador Juarez Antocircnio Simotildees Quaresma ndash Beleacutem 2011
72 f Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Medicina Tropical) ndash Universidade Federal do Paraacute Nuacutecleo
de Medicina Tropical Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Medicina Tropical Beleacutem 2011 1 Autoanticorpos 2 Hepatite C 3 Genoacutetipo Tiacutetulo
CDU 61636-002
Catalogaccedilatildeo na Fonte Luciene Dias Cavalcante - CRB21076
ANA MARIA ALMEIDA SOUZA
AUTOANTICORPOS CONTRA ANTIacuteGENOS CELULARES E SUA CORRELACcedilAtildeO COM O GENOacuteTIPO VIRAL EM PACIENTES COM INFECCcedilAtildeO PELO VIacuteRUS DA
HEPATITE C (HCV)
Dissertaccedilatildeo apresentada ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Doenccedilas Tropicais do Nuacutecleo de Medicina Tropical da Universidade Federal do Paraacute como requisito para obtenccedilatildeo do grau de mestre em Doenccedilas Tropicais Aacuterea Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais
Aprovada em _____________
BANCA EXAMINADORA
______________________________________ - Orientador Prof Dr Juarez Antonio Simotildees Quaresma Nuacutecleo de Medicina Tropical ndash UFPA ______________________________________ - Membro Profa Dra Clea Nazareacute Carneiro Bichara Centro de Ciecircncias Bioloacutegicas e da Sauacutede ndash UEPA ______________________________________ - Membro Prof Dr Lacy Cardoso de Brito Juacutenior Instituto Centro de Ciecircncias Bioloacutegicas ndash UFPA ______________________________________ - Membro Prof Dr Ismaelino Mauro Nunes Magno Centro Universitaacuterio do Paraacute - CESUPA
A DEUS QUE NA SUA SUPREMACIA E GRANDEZA PERMITIU A MINHA EXISTEcircNCIA
A MEU PAI EMMANOEL (IN MEMORIAM) QUE DENTRO DE SUA HUMILDADE E
SIMPLICIDADE SEMPRE ME PROPORCIONOU ENSINAMENTOS DE VIDA E QUE LEMBRO SEMPRE SUAS FRASES ldquoNUNCA DEcirc SUA RAZAtildeO A NINGUEacuteM PROCURE
SEMPRE FAZER AS COISAS CERTAS PARA QUE POSSAS ANDAR SEMPRE DE PEITO ABERTO E CABECcedilA ERGUIDArdquo
ldquoO ESTUDO Eacute A UacuteNICA HERANCcedilA QUE POSSO DEIXAR E QUE NINGUEacuteM VAI BRIGAR CONTIGO POR CAUSA DELArdquo
A MINHA MAtildeE SANCHA QUE SEMPRE FOI EXEMPLO DE BATALHA E VIGOR COM DOM
DE SER MAtildeE ESPOSA E PROFISSIONAL SEM PERDER NUNCA SUA CALMA TRANQUumlILIDADE E BONDADE PROCURANDO AJUDAR SEMPRE TODOS QUE A
RECORRIAM
AO RIBAMAR GRANDE AMOR DE MINHA VIDA MEU COMPANHEIRO DE 32 ANOS QUE DO SEU JEITO SEMPRE ME APOacuteIA NA REALIZACcedilAtildeO DOS MEUS SONHOS
AOS MEUS AMADOS FILHOS RODRIGO RAFAEL E ANA CAROLINA QUE SEMPRE ME
MOTIVARAM A LUTAR PELOS MEUS OBJETIVOS PARA ASSIM SERVIR DE INCENTIVO E EXEMPLO PARA ELES
AS MINHAS SOGRAS LOURDES E RAIMUNDA (IN MEMORIAM) QUE SEMPRE ESTIVERAM
AO MEU LADO AJUDANDO NA CRIACcedilAtildeO DOS MEUS FILHOS PARA QUE EU PUDESSE REALIZAR MINHAS TAREFAS E ALCANCcedilAR MEU CRESCIMENTO PROFISSIONAL
AGRADECIMENTOS
Ao Prof Dr Juarez Antonio Simotildees Quaresma meu orientador e incentivador pelos ensinamentos e orientaccedilatildeo para a conclusatildeo desta aacuterdua tarefa Ao meu cunhado Prof Dr Carlos Leocircnidas Silva Souza Sobrinho que sempre me incentivou nessa caminhada Aos amigos Dra Isabella e Dr Alberto Amaral que muito me ajudaram me apoiaram e permitiram minhas ausecircncias no laboratoacuterio para a conclusatildeo desta jornada Ao colega MS MD David Bichara que disponibilizou seu tempo para a realizaccedilatildeo dos testes de FAN de maior importacircncia para a execuccedilatildeo deste trabalho A colega Profa Dra Cleacutea Bichara que com seu apoio me deu animo para a execuccedilatildeo deste trabalho A colega Maria do Socorro de Oliveira Cardoso companheira de trabalho pelo incentivo e torcida para a concretizaccedilatildeo desta tarefa A todos os amigos do laboratoacuterio Amaral Costa pela incondicional torcida e apoio para que eu pudesse chegar ao final desta jornada A Profa Dra Luisa Caricio Martins pela sua ajuda incondicional na cedencia dos dados dos pacientes e liberaccedilatildeo das amostras do material bioloacutegica de sua soroteca sem a qual esse trabalho seria impossiacutevel de se realizar Ao futuro colega de profissatildeo doutorando Geraldo Duarte pelas contribuiccedilotildees na conclusatildeo estatiacutestica dos resultados encontrados Ao Prof Dr Ismaelino Mauro Nunes Magno que tem se empenhado me incentivando na conclusatildeo desta meta meu anjo auxiliar A todos os componentes da banca examinadora pelo comprometimento e a forma muito simples que no momento da qualificaccedilatildeo me fizeram vecirc e buscar as melhorias ao trabalho ora apresentado A Luciene Dias Cavalcante bibliotecaacuteria do HOL pela ajuda imprescindiacutevel na elaboraccedilatildeo desta dissertaccedilatildeo A todos que de forma direta ou indireta colaboraram para a realizaccedilatildeo deste sonho
CONFIE AS COISAS ACONTECEM NA HORA CERTA
EXATAMENTE QUANDO DEVEM ACONTECER MOMENTOS FELIZES LOUVE A DEUS
MOMENTOS DIFIacuteCEIS BUSQUE A DEUS MOMENTOS SILENCIOSOS ADORE A DEUS
MOMENTOS DOLOROSOS CONFIE EM DEUS CADA MOMENTO AGRADECcedilA A DEUS
ENTENDER A VONTADE DE DEUS NEM SEMPRE Eacute
FAacuteCIL MAS CRER QUE ELE ESTAacute NO COMANDO E TEM
UM PLANO PARA NOSSA VIDA FAZ A CAMINHADA VALER
Agrave PENA
(DESCONHECIDO)
RESUMO
As inflamaccedilotildees do fiacutegado provocadas pelos viacuterus hepatotroacutepicos atingem milhotildees de
pessoas e representa significativo problema de sauacutede puacuteblica em todo o mundo
Existem interaccedilotildees entre viroses hepatotroacutepicas e o sistema imunoloacutegico do hospedeiro
que podem influenciar na patogenicidade da agressatildeo hepaacutetica O objetivo deste
trabalho foi investigar a frequumlecircncia de auto-anticorpos em pacientes portadores do viacuterus
da hepatite C e sua correlaccedilatildeo com os genoacutetipos encontrados Foram estudados 51
pacientes com diagnoacutestico confirmado pelo PCR de infecccedilatildeo pelo viacuterus da hepatite C e
um grupo de 100 doadores de sangue com todos os exames soroloacutegico para doenccedilas
infecto-contagiosas negativos Os 51 pacientes portadores do viacuterus C apresentavam
idade meacutedia de 43 anos +- 113 em fase preacute-tratamento 34 (667) eram do gecircnero
masculino e 17 (333) do gecircnero feminino Desses 13 (255) apresentaram FAN
positivo 45 (882) eram genoacutetipo tipo 1 e 118 genoacutetipo tipo 3 Os pacientes que se
apresentaram com anticorpos detectaacuteveis natildeo apresentavam niacuteveis de AST ALT
ASTALT γ-GT e fosfatase alcalina significativamente diferente daqueles com auto-
anticorpos negativos Desta forma conclui-se que os anticorpos presentes na amostra
do estudo satildeo independentes da evoluccedilatildeo da doenccedila e do prognoacutestico do paciente
entretanto parece estar ligada ao genoacutetipo tipo 1
Palavras-chave Hepatite C Auto-anticorpos Genoacutetipo
ABSTRACT
Inflammation of the liver caused by hepatotropic viruses affect millions of people and
represents a significant public health problem worldwide There are interactions between
hepatotropic viruses and the host immune system that can influence the pathogenesis of
liver injury The objective of this study was to investigate the frequency of autoantibodies
in patients with hepatitis C virus and its correlation with the genotypes found We
studied 51 patients diagnosed by PCR of infection with hepatitis C and a group of 100
blood donors with all serological tests for infectious diseases negative The 51 patients
with virus C had an average age of 43 years + - 113 in the pre-treatment 34 (667)
were male and 17 (333) were female Of these 13 (255) were ANA positive 45
(882) were with genotype 1 and 118 with genotype 3 Patients who presented with
antibodies had no detectable levels of AST ALT AST ALT γ-GT and alkaline
phosphatase significantly different from those with negative antibody titers Thus we
conclude that the antibodies present in the study sample are independent of disease
progression and patient prognosis though seems to be linked with genotype 1
Keywords Hepatitis C Auto-antibodies genotype
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Padrotildees de fluorescecircncia encontrados em maior frequumlecircncia e
patologias relacionadas 34
Quadro 2 - Anti-ena - auto-anticorpos contra antiacutegenos extraiacutedos do nuacutecleo e
relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 34
Quadro 3 ndash Padrotildees de FAN nuclear e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 35
Quadro 4 - Padrotildees de FAN citoplasmaacuteticos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 36
Quadro 5 - Padrotildees de FAN mistos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 37
Quadro 6 - Padrotildees de FAN nucleolares e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 37
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos pacientes segundo as caracteriacutesticas demograacuteficas janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 48
Tabela 2 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes conforme os resultados laboratoriais de FAN citoplasmaacutetico e genotipagem janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 49
Tabela 3 ndash Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 49
Tabela 4 - Relaccedilatildeo da genotipagem de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 50
Tabela 5 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e faixa etaacuteria - janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 50
Tabela 6 - Estudo descritivo da idade dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e presenccedila do FAN citoplasmaacutetico janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 51
Tabela 7- Distribuiccedilatildeo dos genoacutetipos dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 51
Tabela 8 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 52
Tabela 9 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico segundo a presenccedila ou ausecircncia de infecccedilatildeo por HCV janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 52
Tabela 10 - Distribuiccedilatildeo do FAN de acordo com o genoacutetipo viral janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 53
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
AAN Anticorpos antinucleares
aCL Anticorpos anticardiolipina
AIDS Sindrome da Imunodeficiecircncia Adquirida
ALT Alanina aminotransferase
ANCA Anticorpos anti-citoplasma de neutroacutefilos
Anti-CCP Antipeptiacutedeo citrulinado ciacuteclico
Anti-β2GPI Anticorpos anti-β2 glicoproteiacutena I
Cdna DNA complementar
CEP Comitecirc em Eacutetica e Pesquisa
CHC Carcinoma hepatocelular
CIC Complexos imunes circulantes
DDTC Doenccedilas difusas do tecido conjuntivo
DMTC Doenccedila mista do tecido conjuntivo
E1 Proteiacutena do envoltoacuterio
ENH Eritema Nodoso Hansecircnico
ESP Esclerose sistecircmica progressive
FAN Fator Anti-nuacutecleo
FR Fator reumatoacuteide
HBV Viacuterus da hepatite B
HCV Viacuterus da Hepatite C
HEMOPA Fundaccedilatildeo Centro de Hemoterapia e Hematologia do Paraacute
HIV Viacuterus da imunodeficiecircncia humana
HIV-1 Viacuterus da imunodeficiecircncia humana1
IAH Iacutendice de atividade histoloacutegica
LE Lupus Eritematoso
LES Luacutepus eritematoso sistecircmico
MS Ministeacuterio da Sauacutede
mtDNA DNA mitrocondrial
NANBH Hepatite natildeo-A natildeo-B
NMT Nuacutecleo de Medicina Tropical
OMS Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede
PCR Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia
Rh Tipo sanguiacuteneo
RNA Aacutecido ribonucleacuteico
RT-PCR Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia-em tempo real
SAF Siacutendrome antifosfoliacutepide
SIDA Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida
SS Siacutendrome de Sjoumlgren
UFPA Universidade Federal do Paraacute
UV ultravioleta
VHA Viacuterus da Hepatite A
VHC Viacuterus da Hepatite C
VHCHCV Hepatite C
VV Hanseniacutease generalizada
SUMAacuteRIO 1 INTRODUCcedilAtildeO 15 11 HEPATITE C (VHCHCV) 15 111 Consideraccedilotildees Gerais 15 112 Agente Etioloacutegico 16 113 Epidemiologia 17 114 Modo de Transmissatildeo 18 115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica 19 116 Diagnoacutestico 23 12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC 25
13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC 26
14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE 27
15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES AGUDAS VIRAIS 31
16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN 32 2 JUSTIFICATIVA 39 21 ASPECTOS EacuteTICOS 39 3 OBJETIVOS 40
31 OBJETIVO GERAL 40
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 40 4 MATERIAL E MEacuteTODOS 41 41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO) 41 411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C 41 412 Grupo de natildeo infectados 41 42 MEacuteTODO 42 421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico 42 422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C 42 423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia
molecular 43
424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem) 45 425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas
HEp-2 46 43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 47 5 RESULTADOS 48 6 DISCUSSAtildeO 54 7 CONCLUSOtildeES 59 REFEREcircNCIAS 60 APEcircNDICES 67 ANEXOS 70
15
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 HEPATITE C (VHCHCV)
111 Consideraccedilotildees Gerais
As hepatites virais satildeo doenccedilas causadas por diferentes agentes
etioloacutegicos de distribuiccedilotildees universais que tecircm em comum o hepatotropismo
Possuem semelhanccedilas do ponto de vista cliacutenico-laboratorial mas apresentam
importantes diferenccedilas epidemioloacutegicas quanto agrave sua evoluccedilatildeo (FERREIRA
SILVEIRA 2004) Desde a descriccedilatildeo e definiccedilatildeo em 1989 (CHOO et al 1989 apud
RIBEIRO et al 2007) tornou-se evidente sua associaccedilatildeo com uma grande
variedade de manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas desordens reumaacuteticas e auto-imunes
(ALMEIDA 2010)
A infecccedilatildeo pelo VHCHCV acarreta inflamaccedilatildeo hepaacutetica e esteatose
podendo evoluir para fibrose hepaacutetica e cirrose em indiviacuteduos cronicamente
infectados estes com grande risco de desenvolvimento de carcinoma hepatocelular
(RIBEIRO et al 2007) Essas complicaccedilotildees tardias ocorrem em um periacuteodo em
geral superior a 20 anos apoacutes o iniacutecio da infecccedilatildeo A avaliaccedilatildeo filogeneacutetica das
sequumlecircncias do VHCHCV investigadas em vaacuterias regiotildees geograacuteficas sugere que
existam pelo menos seis genoacutetipos principais designados pelos nuacutemeros de 1 a 6 e
pelo menos 30 subtipos designados por letras minuacutesculas Nos Estados Unidos
prevalecem os genoacutetipos 1a (60) e 1b (20) Os tipos 5 e 6 satildeo mais encontrados
no sudeste e sul da Aacutefrica O tipo 4 eacute predominante na Aacutefrica Central e no Oriente
Meacutedio No Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b (63) e 3a (313) (BASSIT et
al 1999 apud RIBEIRO et al 2007) As informaccedilotildees sobre as causas que
determinam o curso evolutivo da doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos
progressos que haacute no campo do diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHCHCV Uma
questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo genoacutetipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de
lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o genoacutetipo 1 (1b) cursa com lesotildees
histoloacutegicas mais graves
As uacuteltimas deacutecadas foram de notaacuteveis conquistas no que se refere agrave
prevenccedilatildeo e ao controle das hepatites virais Entre as doenccedilas endecircmico-
epidecircmicas que representam problemas importantes de sauacutede puacuteblica no Brasil
16
salientam-se as Hepatites Virais cujo comportamento epidemioloacutegico no nosso paiacutes
e no mundo tem sofrido grandes mudanccedilas nos uacuteltimos anos
Antes da seleccedilatildeo rigorosa dos doadores de sangue em 1991 o
VHCHCV era a maior causa de hepatite poacutes-transfusional Atualmente permanece
como tal em casos esporaacutedicos (CONTE 2000) Os grupos considerados de risco
satildeo pessoas que receberam transfusatildeo de sangue antes de 1992 usuaacuterios de
drogas injetaacuteveis profissionais de sauacutede que lidam com sangue pacientes de
hemodiaacutelise e com menor risco pessoas tatuadas ou com piercings (CLEMENTE
ONO-NITA 2007)
A melhoria das condiccedilotildees de higiene e de saneamento das populaccedilotildees a
vacinaccedilatildeo contra a Hepatite B (HBV) e as novas teacutecnicas moleculares de diagnoacutestico
do viacuterus da Hepatite estatildeo entre esses avanccedilos importantes (BRASIL 2008)
112 Agente Etioloacutegico
O VHCHCV um viacuterus aacutecido ribonucleacuteico (RNA) da famiacutelia Flaviviridae
representa a principal causa da previamente denominada hepatite natildeo-A natildeo-B
(SANTOS 2009) Foi identificado e isolado a partir de um clone derivado de um
genoma NANBH semelhante aos togaviridae ou flaviviridae (SAADE 2008) e
visualizado a imunoeletromicroscopia como partiacutecula de 55 a 65 nm de diacircmetro
com projeccedilotildees espiculares e de morfologia muito semelhante aos flaviviridae Aleacutem
disso estas partiacuteculas reagiram especificamente com anticorpos mono e policlonais
do conteuacutedo proteacuteico do envelope do VHC (HIRANUMA et al 1994 apud CONTE
2000)
O agente etioloacutegico do HCV natildeo eacute uma partiacutecula homogecircnea e apresenta
uma taxa alta de mutaccedilatildeo levando-o a uma heterogeneicidade genocircmica cujo
resultado eacute um grande nuacutemero de genoacutetipos (1a 1b 2a 2b 3a 3b 4 5 6)
(AUGUSTO LOBATO 2003) Natildeo haacute evidecircncias de variantes natildeo patogecircnicas O
genoacutetipo 1b eacute o que apresenta maior virulecircncia e pior resposta ao tratamento
(LAUER WALKER 2001 apud SOUZA 2007) No Brasil dados obtidos a partir de
casos isolados e estudos de pequenas amostragens indicam que o genoacutetipo 1b
ocorre em cerca de 30 a 40 dos casos o 1a em cerca de 20 1a e 1b em 20
o 3a em cerca de 28 (FOCACCIA 2004)
17
113 Epidemiologia
De acordo com a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) a HCV eacute uma
questatildeo de sauacutede puacuteblica e tambeacutem a principal causa de transplante de fiacutegado no
Brasil (SOCIEDADE BRASILEIRA DE HEPATOLOGIA 2005) Eacute estimada uma
prevalecircncia em torno de 10 para a infecccedilatildeo pelo VHC na populaccedilatildeo mundial
(KILLEMBERG 2000) Nos Estados Unidos cerca de 27 milhotildees de pessoas estatildeo
infectadas pelo viacuterus (BRASIL 2006)
De acordo com Ferreira e Silveira (2004) no Brasil o nuacutemero de pacientes
infectados eacute incerto relacionado geralmente a alguns estados e municiacutepios e o
esclarecimento dos agentes causadores das hepatites cuja identificaccedilatildeo requer
teacutecnicas laboratoriais complexas de biologia molecular eacute realizado de maneira
insuficiente Por outro lado a progressiva integraccedilatildeo entre as instacircncias gestoras
dos programas de vigilacircncia e controle das doenccedilas com grupos de pesquisa e
desses com os serviccedilos (FERREIRA SILVEIRA 2004 p 473) e a disponibilidade
dos bancos de dados nacionais mais confiaacuteveis apontam para novos e melhores
caminhos (BRASIL 2005b)
A OMS alerta que o Paiacutes deve se preparar para uma ldquoexplosatildeordquo da
epidemia a partir de 2011 (BRASIL 2005b) Outra preocupaccedilatildeo eacute que as pessoas
que receberam sangue antes de 1992 tecircm mais chances de estarem infectadas na
eacutepoca o sangue destinado agraves transfusotildees natildeo era analisado para detecccedilatildeo da HCV
porque o viacuterus natildeo era conhecido e natildeo havia exames especiacuteficos (BRASIL 2005b)
A prevalecircncia da infecccedilatildeo nos doadores de sangue sadios varia de 001-002 no
Reino Unido e no norte da Europa 1-15 no sul da Europa 65 na Aacutefrica
equatorial e de ateacute 20 no Egito (CONTE 2000)
De acordo com a OMS a cada grupo de 50 pessoas no Brasil uma tem
hepatite e de dez portadores apenas um sabe (STRAUSS 2001) Satildeo dois milhotildees
de infectados no Paiacutes Denominada epidemia silenciosa calcula-se que 170 milhotildees
de indiviacuteduos no mundo estejam contaminados pelo viacuterus C a forma mais grave da
doenccedila Ainda de acordo com a OMS o nuacutemero de brasileiros viacutetimas da
enfermidade eacute bem maior do que o estimado pelo Ministeacuterio da Sauacutede (TRINDADE
2005)
18
Por ocasiatildeo da Conferecircncia Internacional de Consenso sobre HCV em Paris
(LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999) concluiu-se que a hepatite crocircnica por viacuterus
C eacute um problema grave de sauacutede puacuteblica sendo sua prevalecircncia mundial estimada
em 3 (de 01 a 5 segundo os vaacuterios paiacuteses) por tanto havendo no mundo
todo cerca de 150 milhotildees de portadores crocircnicos do VHCHCV 4 milhotildees nos EUA
e 5 milhotildees na Europa Ocidental Na Europa Oriental a prevalecircncia eacute maior ainda
114 Modo de Transmissatildeo
A HCV eacute transmitida pelo sangue Natildeo haacute comprovaccedilatildeo de contaacutegio por
meio de fluidos corporais como saliva suor laacutegrimas secircmen ou leite materno
Tambeacutem deixa de ocorrer por meio de abraccedilos beijos uso dos mesmos copos ou
roupas Especialistas afirmam que a contaminaccedilatildeo atraveacutes de relaccedilotildees sexuais eacute
possiacutevel mas rara Quando detectada de maneira precoce a enfermidade tem
tratamento inclusive gratuito aleacutem de cura (BRASIL 2006)
Dentre os fatores de risco para transmissatildeo outros aleacutem da transfusatildeo de
sangue o uso de drogas iliacutecitas o comportamento sexual de alto risco e variaacuteveis
socioeconocircmicas representadas pelo grau de escolaridade e renda familiar Natildeo foi
observada associaccedilatildeo entre o risco de infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas
designadas por gecircnero idade e raccedila (ALTER 2007) O risco de transmissatildeo sexual
do VHCHCV eacute miacutenimo A contaminaccedilatildeo intrafamilial natildeo-sexual eacute consideraacutevel
particularmente quando um dos enfermos tem hepatopatia grave e ou carga viral
elevada (risco 110) (CONTE 2000)
A praacutetica de tatuagem fornece dados conflitantes sabendo-se que os
liacutequidos usados para esterilizar os instrumentos usados satildeo ineficazes
Karmochkine et al (1998 apud CONTE 2000) observaram que
aproximadamente 80 dos pacientes contraem o viacuterus atraveacutes da toxicomania
intravenosa ou transfusotildees de sangue ou de derivados Os restantes meios de
transmissatildeo e de contaacutegio satildeo a hemodiaacutelise os transplantes de oacutergatildeos picadas
acidentais profissionais e transmissatildeo vertical matildee-crianccedila Em 20 a 40 dos
casos natildeo se consegue determinar o modo de contaminaccedilatildeo A transmissatildeo da
hepatite crocircnica por viacuterus C pode ser prevenida (KARMOCHKINE et al 1998 apud
CONTE 2000)
19
As duas fontes de contaminaccedilatildeo satildeo a toxicomania endovenosa e a
administraccedilatildeo de produtos de origem sanguumliacutenea Esta uacuteltima praticamente
eliminada desde 1991 com a introduccedilatildeo dos testes ELISA 2 na seleccedilatildeo
aprimorada de doadores de sangue (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998
apud CONTE 2000)
A transmissatildeo sexual eacute rara com menos de 3 em parceiros estaacuteveis e
ocorre principalmente em pessoas com muacuteltiplos parceiros e com praacutetica sexual de
risco (sem uso de preservativo) ndash para os indiviacuteduos com parceiros muacuteltiplos o uso
de preservativos eacute indicado (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998 apud
CONTE 2000)
A gravidez natildeo estaacute contra-indicada nas mulheres infectadas pelo
VHCHCV A transmissatildeo vertical matildee-crianccedila eacute rara (menor de 6) O tipo de parto
(natural ou cesaacuterea) natildeo tem influecircncia O aleitamento eacute permitido A transmissatildeo
nosocomial eacute prevenida eficazmente de modo convencional (KARMOCHKINE et
al 1998 apud CONTE 2000)
115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica
A infecccedilatildeo aguda pode passar clinicamente despercebida ou evoluir para
hepatite fulminante Aproximadamente 850 das pessoas infectadas agudamente
vatildeo desenvolver uma viremia persistente tornando-se dessa forma indiviacuteduos
infectados crocircnicos Depressatildeo irritabilidade dores no corpo mal-estar febre
naacuteuseas e falta de apetite satildeo alguns dos sintomas mais frequumlentes embora a
maioria dos casos natildeo apresente nenhum sintoma (ALTER 2007)
A cirrose eacute pouco observada em pessoas que apresentam niacuteveis
persistentemente baixos das transaminases mas a elevaccedilatildeo destas natildeo eacute
representativa do grau de fibrose hepaacutetica Dessa forma a bioacutepsia hepaacutetica
representa o melhor indicador do estaacutegio de evoluccedilatildeo da doenccedila uma vez que
gradua os componentes inflamatoacuterios e o estaacutegio de fibrose (AGMON-LEVIN et al
2009 BLOCK SCHIANO 1999)
Alter et al (1992) dizem que em 82 de 130 pacientes seguidos durante
muitos anos apoacutes surto agudo de hepatite natildeo-A natildeo-B apresentam anti-VHCHCV
ou VHCHCV RNA sendo que 62 deles desenvolveram hepatite crocircnica e
concluem que os pacientes que adquiriram HCV tiveram alto grau de hepatite
20
crocircnica sendo que o VHCHCV pode ser a maior causa de doenccedila crocircnica de fiacutegado
nos EUA e que na maioria dos pacientes a infecccedilatildeo pelo VHCHCV parece persistir
por muitos anos mesmo na ausecircncia de doenccedila hepaacutetica ativa
Almeida et al (1999) determinaram a prevalecircncia da infecccedilatildeo em
doadores de sangue assim como avaliaram o grau de comprometimento hepaacutetico
numa populaccedilatildeo de 37335 doadores durante o biecircnio 93-94 em Porto Alegre - RS
utilizando o teste anti-VHC ELISA 2 Selecionaram 60 deles para a biopsia hepaacutetica
com agulha de Menghini encontrando prevalecircncia de 174 com comprometimento
hepatico e 39 deles apresentavam cirrose hepaacutetica Sendo a hepatopatia crocircnica de
graus variaacuteveis observadas em 80 deles na sua grande maioria com lesotildees leves
e miacutenimas Foi observada forte associaccedilatildeo entre elevaccedilatildeo de alanina
aminotransferase (ALT) e a presenccedila de hepatopatia crocircnica embora a intensidade
desta elevaccedilatildeo natildeo se correlacione com a gravidade da lesatildeo histoloacutegica
Jaacute na experiecircncia de Mutimer et al (1995) cerca de 80 dos doadores
soro-positivos analisados exaustivamente inclusive com biopsia de fiacutegado
mostraram evidecircncias de alteraccedilotildees histoloacutegicas e ou viroloacutegicas de infecccedilatildeo
persistente sem no entanto atingir graus mais avanccedilados de hepatopatia crocircnica
quase todos permanecendo na categoria moderada
Nos paiacuteses industrializados a HCV eacute responsaacutevel por 20 dos casos de
hepatite aguda 70 dos casos de hepatite crocircnica 40 dos casos de cirrose
descompensada 60 dos carcinomas hepatocelulares e 30 dos transplantes
hepaacuteticos (LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999)
Cerca de 40 do total de pacientes curam-se ou tecircm doenccedila crocircnica de
natureza benigna Os restantes 60 cursam com atividade aumentada de
aminotransferase denotando evoluccedilatildeo crocircnica da doenccedila Dentre estes a maioria
tem lesotildees necro inflamatoacuterias discretas e fibrose miacutenima ou ausente O prognoacutestico
em longo prazo eacute mal conhecido no entanto provavelmente a maioria deles natildeo viraacute
a falecer da doenccedila hepaacutetica em curso Cerca de 20 deles depois de 10-20 anos
de evoluccedilatildeo desenvolveratildeo cirrose hepaacutetica passiacutevel de transplante Assim a
hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila que ocasiona a morte de um pequeno nuacutemero
de pacientes sem no entanto afetar a duraccedilatildeo da vida meacutedia da maioria deles
(CONTE 2000 FERREIRA SILVEIRA 2004)
Apoacutes infecccedilatildeo aguda somente 10 dos pacientes desenvolve doenccedila
cliacutenica com icteriacutecia A infecccedilatildeo sub-cliacutenica eacute a regra e assim passa despercebida
21
Cerca de 25 deles tecircm infecccedilatildeo crocircnica sintomaacutetica com aminotransferases
normais e lesotildees inflamatoacuterias histoloacutegicas miacutenimas (RESENDE et al 2010)
A remissatildeo espontacircnea acontece em cerca de 15 dos casos Na grande
minoria dos casos a progressatildeo da doenccedila aguda pode levar agrave insuficiecircncia
hepaacutetica aguda
Observaccedilotildees feitas pelo irlandecircs Kenny-Walsh (1999) comprovam a
natureza e a evoluccedilatildeo cliacutenica da afecccedilatildeo em causa O autor acompanhou durante 17
anos 376 mulheres que receberam injeccedilotildees de imunoglobulinas anti-D
contaminadas com VHC provenientes de doador uacutenico num programa de
isoimunizaccedilatildeo Rh Destas 81 apresentaram sintomatologia mais frequumlentemente
fadiga (66) ALT ligeiramente elevada (de 40 a 99 UL) em 47 e igual ou maior de
100 UL em 8 A biopsia hepaacutetica mostrou inflamaccedilatildeo em 98 delas na maioria
das vezes leves (41) e moderadas (52) fibrose presente em 51 no entanto
somente em sete pacientes (2) houve sinais de cirrose provaacutevel ou definitiva Em
uma delas havia acentuado alcoolismo
A hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila de evoluccedilatildeo variaacutevel De maneira
geral sua evoluccedilatildeo eacute lenta insidiosa e progressiva
Os pacientes que natildeo apresentam evidecircncias bioquiacutemicas de lesatildeo
hepaacutetica podem constituir em subgrupo de casos mais benignos no curso natural
da doenccedila Muitos co-fatores tecircm papel importante no desenvolvimento da cirrose
nesses pacientes como por exemplo a idade no momento da infecccedilatildeo (os
contaminados de idade mais avanccedilada tecircm evoluccedilatildeo mais raacutepida da doenccedila
enquanto que os mais jovens a tecircm mais lenta) o alcoolismo (eacute de consenso geral
que o abuso de aacutelcool favorece o aparecimento da cirrose) e a co-infecccedilatildeo com o
Viacuterus da Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida (SIDA) e da HVB
A incidecircncia anual de carcinoma hepatocelular (CHC) eacute de 1 a 4 nos
pacientes cirroacuteticos o que justifica plenamente o controle ecograacutefico do fiacutegado e a
dosagem seacuterica de alfa-fetoproteiacutena nesses pacientes a cada 1-2 anos Por outro
lado nos pacientes com hepatite crocircnica por viacuterus C sem cirrose o CHC eacute muito
raro (LOPES 2010)
Nos casos de cura a atividade das transaminases cessa e os viacuterus natildeo
satildeo detectados (VHC RNA) no soro Nos casos de cronificaccedilatildeo acontece o
contraacuterio ou seja as alteraccedilotildees bioquiacutemicas existem com flutuaccedilotildees e os viacuterus satildeo
detectaacuteveis na grande maioria dos casos Fazem exceccedilatildeo agravequeles pacientes com
22
viremia baixa que por isso mesmo fogem aos limites dos meacutetodos de detecccedilatildeo viral
ou devido agraves flutuaccedilotildees proacuteprias desses niacuteveis virecircmicos (HAYDON et al 1998)
Nos pacientes anti-VHC positivos com enzimas circulantes normais a
falta de VHC RNA no soro tem sido interpretada como sinal de cura completa No
entanto Haydon et al (1998) alteraram essa interpretaccedilatildeo Estes autores
demonstraram a presenccedila de VHC RNA no fiacutegado desses pacientes que eram
negativos no soro independente das alteraccedilotildees bioquiacutemicas positivas ou negativas
do soro ou seja mesmo naqueles casos anteriormente considerados como curados
Assim os niacuteveis de viacuterus intra-hepaacuteticos natildeo satildeo determinados pelos fatores
hospedeiro (idade modo e duraccedilatildeo da infecccedilatildeo) ou virais (VHC genoacutetipos) pois
mesmo as repetidamente Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia-em tempo real (RT-
PCR) negativos para VHC RNA no soro podem ter viacuterus da HCV albergados no
fiacutegado Entretanto existem limitaccedilotildees metodoloacutegicas que devem ser consideradas
nessa interpretaccedilatildeo como por exemplo as limitaccedilotildees do RIBA 3 e do RT-PCR
Mais importante eacute o seguimento dos pacientes ao longo do tempo Assim
Seef et al (1992) em 568 pacientes de hepatite poacutes-transfusional e dois grupos
controles pareados que receberam transfusotildees sem desenvolver hepatite apoacutes 18
anos de seguimento encontraram 33 de mortalidade no grupo 1 e 15 no grupo
controle sendo que a maioria das mortes ocorreu nos pacientes com alcoolismo
associado Evidenciando que a maioria dos que desenvolve doenccedila crocircnica o faz
muito lentamente
Existem ainda no curso natural da doenccedila flutuaccedilotildees intensas e muito
frequumlentes que dependem dos viacuterus e dos hospedeiros a saber niacuteveis da viremia
genoacutetipos 1b graus de diversidade geneacutetica dos viacuterus vias de transmissatildeo (os
inoculados via transfusatildeo apresentam lesotildees hepatocelulares mais ativas)
(GORDON et al 1993 GORDON BAYATI SILVERMAN 1998) deficiecircncias
imunes alcoolismo e co-infecccedilatildeo com HBV e delta ou o Viacuterus da imunodeficiecircncia
humana (HIV) (LOPES 2010) Nestes uacuteltimos casos a co-infecccedilatildeo com muacuteltiplos
viacuterus das hepatites estaacute associada com mais graves lesotildees histoloacutegicas do fiacutegado do
que nos casos de VHC isoladas
Importa saber se os resultados obtidos com os controles feitos se mantecircm
por longos periacuteodos Ou seja como exemplos a atividade da ALT persistentemente
normal a variabilidade do RT-PCR a detecccedilatildeo de VHC RNA pela teacutecnica Reaccedilatildeo
de polimerase em cadeia (PCR) que pode ser negativa devido agrave inadequada
23
armazenagem das amostras agrave contaminaccedilatildeo do soro com substacircncias que
interferem na leitura entre outras causas de erro
As informaccedilotildees sobre as causas que determinam o curso evolutivo da
doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos progressos havidos no campo do
diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHC Uma questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo
genotipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o
genotipo 1 (1b) cursa com lesotildees histoloacutegicas mais graves independentemente da
carga viral Ainda mais os VHC RNA negativos no soro mesmo apoacutes anos de
cura podem recair pois neles persistem os viacuterus no fiacutegado em regime de
replicaccedilatildeo muito baixa indetectaacutevel pelos meacutetodos atuais Ao contraacuterio os negativos
no soro e no fiacutegado tecircm demonstrado respostas boas e sustentadas inclusive no
sentido de se fazer prognoacutestico de cura real e verdadeira infelizmente na grande
minoria dos casos
116 Diagnoacutestico
Quanto mais cedo o diagnoacutestico maiores as chances de detectar a
doenccedila Por isso eacute importante que as pessoas faccedilam o exame especiacutefico porque soacute
esse exame eacute que detecta a HCV E as mulheres tecircm que ter uma atenccedilatildeo em
especial Tempos atraacutes o Correio Braziliense (2003) publicou uma grande mateacuteria
sobre a quantidade de mulheres que vecircm sendo infectadas com a HCV Cuja causa
estava na esterelizaccedilatildeo mal feita dos equipamentos das manicures Uma soluccedilatildeo
praacutetica eacute as mulheres terem seu proacuteprio material pra fazer as unhas e natildeo deixar
mais ningueacutem utilizar (nem matildee nem irmatilde etc) Bem e quem tiver passado por
transfusatildeo dentistas manicures operaccedilotildees etc deve fazer o exame
(KARMOCHKINE et al 1998 apud CONTE 2000 KEER et al 1997)
A HCV natildeo eacute como a Siacutendrome da Imunodeficiecircncia Adquirida (AIDS)
que possui drogas com grande tecnologia e o doente pode viver por muitos e muitos
anos Com a HCV o paciente soacute tem chance de ficar bem se a doenccedila for
diagnosticada e tratada antes dela se manifestar Atualmente o tratamento usa uma
associaccedilatildeo de duas drogas ndash o Interferon e a Ribavirina ldquoAs chances de cura em
meacutedia satildeo de 50rdquo
Barbaro et al (1999) verificaram que os pacientes VHC genoacutetipos 1b
frequumlentemente apresentavam alteraccedilotildees ultraestruturais das mitococircndrias com
24
depleccedilatildeo do mtDNA podendo comprometer o processo de fosforilizaccedilatildeo oxidativa
Sendo assim a produccedilatildeo aumentada de radicais livres nos pacientes VHC genoacutetipos
1b poderia atuar de modo negativo na evoluccedilatildeo da doenccedila hepaacutetica aumentando o
efeito citopaacuteticos do VHC Nesses pacientes haveria portanto aumento de
hiperoxidaccedilatildeo com consequumlente resistecircncia agrave accedilatildeo dos interferons e pior evoluccedilatildeo
da doenccedila hepaacutetica A ser confirmado este fato novas estrateacutegias terapecircuticas
poderatildeo vir a ser desenvolvidas no combate a essa doenccedila
Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila
poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses
autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis
vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo
hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja
quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a
concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave
hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em
parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)
Dos fatos acima expostos decorrem implicaccedilotildees tais como as respostas
CD8-CTL aos antiacutegenos VHC restritas aos complexos de histocompatibilidade
principais (MHC I) com inibiccedilatildeo ou mesmo insuficiente produccedilatildeo de complexo
peptiacutedeo VHC-MHC inibiccedilatildeo direta das ceacutelulas CTLK e a falta de resposta as
citoquininas entre outras dos vaacuterios mecanismos de escape existentes Dentro
desse contexto o niacutevel de morte celular natildeo seria alcanccedilado e a lesatildeo hepatocelular
consequumlente seria portanto miacutenima
Outra implicaccedilatildeo resultante consiste na induccedilatildeo de resposta imune
celular T Helper mediadas a partir de peptide vacinas contra o VHC Estas novas
vacinas tecircm a capacidade de gerar linfoacutecitos T citotoacutexico os CTLs contra o VHC em
camundongo imunizados com peptiacutedeos CTL e ceacutelulas HT epiacutetomes do core VHC
Esses estudos recente em animais de laboratoacuterio vecircm progredindo rapidamente
esperando-se em breve novos recursos no tratamento dessa doenccedila (AGNELLO et
al 1998)
25
12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC
O VHC constitui-se em uma famiacutelia heterogecircnea de viacuterus com no miacutenimo
seis genoacutetipos e inuacutemeros subtipos (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT
SANTOS SILVA 1999) Embora o meacutetodo de maior acuraacutecia para a determinaccedilatildeo
do genoacutetipo do VHC seja a identificaccedilatildeo completa da sequumlecircncia dos 9500
nucleotiacutedeos e a construccedilatildeo de uma aacutervore filogeneacutetica esse meacutetodo soacute pode ser
utilizado em laboratoacuterios de pesquisa (BARBOSA SILVA MARTINS 2005) e natildeo
em laboratoacuterios cliacutenicos Assim foram desenvolvidos meacutetodos para genotipagem
utilizando apenas as regiotildees mais conservadas do genoma como a proteiacutena do
envoltoacuterio (E1) a proteiacutena core e a proteiacutena natildeo estrutural NS5B A sequumlecircncia dos
nucleotiacutedeos dentro dessas regiotildees relativamente conservadas eacute genoacutetipo-
especiacutefico e os isolados podem ser genotipados independentemente da regiatildeo que
for utilizada para anaacutelise (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS
SILVA 1999) Para uso em laboratoacuterios cliacutenicos foram desenvolvidas basicamente
duas metodologias que se valem de teacutecnicas de biologia molecular (genotipagem)
ou citoloacutegicas (serotipagem)
Os meacutetodos que adotam teacutecnica de biologia molecular para genotipagem
utilizando porccedilotildees do genoma incluem a PCR aninhada (nested PCR) (BASSIT
SANTOS SILVA 1999) a teacutecnica de restriction fragment length polymorphism
(RFLP) (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS SILVA 1999) a
hibridizaccedilatildeo reversa (BASSIT SANTOS SILVA 1999) (INNO-LiPA Innogenetics
Beacutelgica Gen Eti DEIA HCV Sorin Biomedica Itaacutelia) e o sequumlenciamento direto da
regiatildeo natildeo-codificante 5 (TruGene Visible Genetics Canadaacute) Suas principais
vantagens satildeo a informaccedilatildeo direta sobre sequumlecircncia dos nucleotiacutedeos do genoma
viral a alta sensibilidade por se basearem na PCR e a possibilidade de identificar o
subtipo viral (BARBOSA SILVA MARTINS 2005)
Os meacutetodos para determinaccedilatildeo do genoacutetipo que utilizam serotipagem
baseiam-se na detecccedilatildeo de anticorpos genoacutetipos-especiacuteficos contra epiacutetopos do
VHC (por exemplo proteiacutenas da regiatildeo do core) (BLOCK SCHIANO 1999) Os
testes comercializados utilizam diferentes teacutecnicas ELISA competitivos ou
immunoblot (Murex-HC1-6 Murex Diagnostics Ltd Reino Unido RIBA HCV
Serotyping Assay Chiron Diagnostics Estados Unidos) As principais vantagens da
teacutecnica de serotipagem satildeo o baixo custo e maior facilidade de realizaccedilatildeo em
26
comparaccedilatildeo com os testes de biologia molecular (BLOCK SCHIANO 1999 De
LARANAGA et al 2000)
A determinaccedilatildeo do genoacutetipo anteriormente utilizada em pesquisas mas
sem maior utilidade na praacutetica meacutedica atualmente eacute recomendada para uso cliacutenico
Como jaacute mencionado os pacientes infectados pelo genoacutetipo 1 do VHC devem ser
tratados por 12 meses enquanto os demais por 6 meses (BASSIT SANTOS SILVA
1999)
A determinaccedilatildeo do genoacutetipo do VHC pode ser feita por PCR ou
serotipagem A primeira teacutecnica eacute mais sensiacutevel e possibilita a identificaccedilatildeo de
subtipos do VHC Contudo a segunda eacute de mais faacutecil realizaccedilatildeo e mais barata
razatildeo pela que eacute importante que a teacutecnica seja aprimorada
Oliveira et al (1999) investigaram os padrotildees de distribuiccedilatildeo dos
genoacutetipos do VHC estudando 250 pacientes anti-VHC positivos atraveacutes da
detecccedilatildeo VHC RNA pelo RT-PCR e encontraram prevalecircncia de 72 para o VHC 1
253 para o tipo 3 2 para o 2 e 07 para o 4 semelhantes aos das vaacuterias
regiotildees mundiais
13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC
As manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo pelo VHC satildeo as mais
variadas possiacuteveis A diversidade de resposta do hospedeiro ao agente infeccioso
variando desde quadros assintomaacuteticos ateacute aqueles com evoluccedilatildeo grave fatal ou
incapacitante tem estimulado a busca por justificativas de tais discrepacircncias
cliacutenicas sobretudo na imunomodulaccedilatildeo Dentre as infecccedilotildees mais bem estudadas
destacam-se aquelas pelos Viacuterus da hepatite C Viacuterus da imunodeficiecircncia humana1
(HIV-1) pelo Herpes viacuterus humano 4 (viacuterus do Epstein Baar) e pelo Mycobacterium
leprae (ABBAS LICHTMAN 2005)
A agressatildeo hepaacutetica por auto-imunidade eacute um fenocircmeno reconhecido em
vaacuterias doenccedilas do fiacutegado inclusive nas de etiologia viral Aleacutem do agente agressor e
de sua interaccedilatildeo com o sistema imunoloacutegico do hospedeiro fatores ambientais ou
hormonais estatildeo aparentemente envolvidos no surgimento de auto-imunidade
hepaacutetica como se supotildee acontecer na hepatite auto-imune em indiviacuteduos
geneticamente suscetiacuteveis (CODES et al 2002)
27
A lesatildeo hepatocelular relacionada agrave infecccedilatildeo pelos viacuterus hepatotroacutepicos e
pelos herpes viacuterus (citomegaloviacuterus e Epstein-Barr) eacute secundaacuteria a uma resposta
auto-imune do hospedeiro Estes viacuterus natildeo parecem ser diretamente citopaacuteticos
mas desencadeiam lesatildeo hepaacutetica atraveacutes da resposta imune do hospedeiro contra
ceacutelulas hepaacuteticas infectadas (MALOY POWRIE 2001)
Existem estudos que focalizam alteraccedilotildees imunoloacutegicas em hepatites
virais entretanto a maioria deles mostra resultados pontuais sem seguimento na
fase aguda da doenccedila (BLOCK SCHIANO 1999 McFARLONE et al 1990) Aleacutem
disso ainda natildeo se estabeleceu uma associaccedilatildeo entre as reaccedilotildees auto-imunes
transitoacuterias induzidas por viroses hepatotroacutepicas e agravamento do dano tecidual na
hepatite viral
A infecccedilatildeo crocircnica estaacute fortemente associada agrave crioglobulinemia mista
essencial glomerulonefrite membrano-proliferativa e porfiria cutacircnea tardia De
forma menos impressiva encontra-se tambeacutem associada agrave uacutelcera corneana de
Mooren liacutequen plano e fibrose pulmonar (KILLENBERG 2000 WENER et al 1996)
A ocorrecircncia de anticorpos antitireoidianos e hipotireoidismo tem sido relatada em
associaccedilatildeo com a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC em mulheres (KILLENBERG 2000
CACOUB et al 1999)
A associaccedilatildeo entre a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC a presenccedila do fator
reumatoacuteide e do anticorpo antinuclear (FAN) o fenocircmeno de Raynaud e doenccedilas
difusas do tecido conjuntivo (DDTC) como artrite reumatoacuteide luacutepus eritematoso
sistecircmico siacutendrome de Sjoumlgren e vasculites sistecircmicas eacute relatada em alguns
trabalhos (CACOUB et al 1999 LOVY STARKEBAUM UBEROI 1996 STAUB
1998 WENER et al 1996)
14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE
A associaccedilatildeo entre doenccedilas infecciosas e autoimunidade apresentando-
se com manifestaccedilotildees cliacutenicas ou detectadas apenas pelo desenvolvimento de auto-
anticorpos tem sido amplamente documentado Infecccedilotildees virais bacterianas e
parasitaacuterias podem estar envolvidas no desenvolvimento recidivas e ateacute mesmo na
prevenccedilatildeo de doenccedilas auto-imunes (KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)
Ribeiro e Proietti (2004) avaliaram a frequumlecircncia de FR anticorpos
antipeptiacutedeo citrulinado ciacuteclico (anti-CCP) AAN anticorpos anti-citoplasma de
28
neutroacutefilos (ANCA) anticorpos anticardiolipina (aCL) e anticorpos anti-β2
glicoproteiacutena I (anti-β2GPI) em pacientes com hanseniacutease Existe estudo
demonstrando pacientes que apresentavam manifestaccedilotildees articulares comparados
aos que natildeo apresentavam envolvimento articular e um grupo controle de indiviacuteduos
saudaacuteveis com idade e gecircnero semelhantes aos dos pacientes estudados e que
residiam na mesma aacuterea geograacutefica A maioria dos pacientes nos dois grupos (com
e sem envolvimento articular) apresentava hanseniacutease generalizada Entretanto
observaram uma baixa frequumlecircncia que natildeo foi significativamente diferente de FR
anti-CCP AAN e ANCA em pacientes com hanseniacutease (nos dois grupos) e normal
dos controles Mas a prevalecircncia de anticorpos aCL e anti-β2GPI estava
significativamente elevada nos pacientes com hanseniacutease quando comparados com
o grupo controle apesar de natildeo haver associaccedilatildeo significativa com o envolvimento
articular O isoacutetopo predominante dos dois autoanticorpos foi a IgM (487) dos
pacientes com hanseniacutease apresentava pelo menos um anticorpo antifosfoliacutepide
Aleacutem disso os autores observaram uma associaccedilatildeo entre a positividade para aCL e
as manifestaccedilotildees cliacutenicas jaacute que os pacientes com anticorpos aCL apresentavam
doenccedila Hanseniacutease generalizada (VV) com mais frequumlecircncia (p= 0002) Natildeo houve
associaccedilatildeo entre a presenccedila de anticorpos aCL ou anti-β2GPI e episoacutedios
reacionais poreacutem entre os pacientes com esses episoacutedios aqueles com anticorpos
aCL apresentavam eritema nodoso hansecircnico (ENH) em 100 dos casos enquanto
entre os pacientes negativos para aCL 57 apresentavam ENH Apesar de uma
alta taxa de concordacircncia para a presenccedila de anticorpos aCL e anti-β2GPI ter sido
observada manifestaccedilotildees tromboemboacutelicas natildeo foram observadas (RIBEIRO
PROIETTI 2004 2005)
Horimoto e Costa (2009) avaliaram pacientes com Leishmania
(leishmaniose visceral e leishmaniose cutacircnea) para a presenccedila de anticorpos anti-
Leishmania assim como FR AAN anti-DNA anti-Sm anti-RNP anti-Ro anti-La
aCL e complemento (C3 e C4) Como esperado os pacientes com leishmaniose
visceral apresentava anticorpos anti-Leishmania Tiacutetulos significativamente elevados
de AANs na maioria dos pacientes o anti-DNA foi detectado em poucos pacientes
com doenccedila visceral assim como tiacutetulos elevados de anticorpos aCL (isotipo IgG)
quando comparados com os pacientes com leishmaniose cutacircnea Niacuteveis reduzidos
de complemento tambeacutem satildeo evidentes na doenccedila visceral assim como niacuteveis
significativamente reduzidos de C3 Outros estudos comparam e discutem os
29
resultados em relaccedilatildeo agrave crescente evidecircncia na literatura da presenccedila de
autoanticorpos em ambas as doenccedilas Em geral a prevalecircncia variaacutevel de auto-
anticorpos relatada assim como relatos preacutevios na literatura podem estar
relacionados a diferenccedilas metodoloacutegicas como o tipo de ensaio utilizado a
definiccedilatildeo dos pontos de corte inativaccedilatildeo dos soros pelo calor seleccedilatildeo de pacientes
e variaccedilotildees eacutetnicas e geograacuteficas nos grupos de pacientes Mas um dos resultados
consistentes foi a frequumlecircncia significativamente mais elevada de anticorpos
antifosfoliacutepide aCL e anti-β2GPI em pacientes com hanseniacutease enquanto
anticorpos AAN e aCL foram detectados com mais frequumlecircncia nos pacientes com
leishmaniose visceral A incidecircncia aumentada de anticorpos AAN e aCL nos
pacientes com leishmaniose visceral eacute compatiacutevel com outros estudos (OSSADRON
et al 2006 SAKKAS et al 2008 VOULGARI et al 2004) e demonstra
semelhanccedilas das manifestaccedilotildees cliacutenicas e laboratoriais entre a leishmaniose
visceral e o luacutepus eritematoso sistecircmico (LES) Aleacutem disso a reatividade cruzada
entre AAN e anticorpos anti-Leishmania jaacute foi tambeacutem relatada (GRANEL et al
2000)
Diversos grupos documentaram niacuteveis elevados de anticorpos
antifosfoliacutepide (aCL anti-β2GPI e anti-protrombina) em diversas doenccedilas
infecciosas como a siacutefilis doenccedilas virais (incluindo a hepatite C Parvoviacuterus B19 e
HIV) malaacuteria e hanseniacutease sem as manifestaccedilotildees cliacutenicas da siacutendrome
antifosfoliacutepide (SAF) (ZANDMAN-GODDARD BLANK SHOENFELD 2002) Os
tiacutetulos elevados geralmente satildeo transitoacuterios diminuindo e desaparecendo apoacutes a
resoluccedilatildeo da infecccedilatildeo (LOIZOU et al 2003 ZANDMAN-GODDARD BLANK
SHOENFELD 2002) Mas em uma minoria dos pacientes a associaccedilatildeo entre
doenccedilas infecciosas e anticorpos antifosfoliacutepide pode levar a complicaccedilotildees severas
frequumlentemente fatais ou seja SAF catastroacutefica (ZANDMAN-GODDARD BLANK
SHOENFELD 2002)
Os resultados de Ribeiro e Proietti (2005) mostrando um aumento da
incidecircncia de anticorpos anti-β2-GPI em pacientes com hanseniacutease associados aos
dados de outros grupos (De LARANAGA et al 2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK
et al 1994 LOIZOU et al 2003) que tambeacutem documentaram niacuteveis elevados de
anticorpos anti-2βGPI lanccedilam duacutevidas sobre a noccedilatildeo de que os anticorpos aCL
associados a infecccedilotildees satildeo independentes dos anticorpos anti-β2GPI e natildeo
dependentes desses anticorpos como nas doenccedilas auto-imunes Em conjunto
30
esses resultados apoacuteiam a noccedilatildeo de que na presenccedila de infecccedilotildees anticorpos aCL
satildeo heterogecircneos em relaccedilatildeo agrave sua dependecircncia da 2GPI (De LARANAGA et al
2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK et al 1994 LOIZOU et al 2003) e as infecccedilotildees
podem desencadear a induccedilatildeo de anticorpos antifosfoliacutepide patogecircnicos em
indiviacuteduos predispostos (LOIZOU et al 2003)
A produccedilatildeo de autoanticorpos na hanseniacutease e leishmaniose pode ser
explicada por diversos mecanismos Na forma mais generalizada dessas doenccedilas
(hanseniacutease VV e leishmaniose visceral) os pacientes apresentam
hipergamaglobulinemia difusa semelhante agrave vista em outras infecccedilotildees como
Schistosoma mansoni T cruzi e Plasmodium A induccedilatildeo de autoanticorpos pode ser
atribuiacuteda agrave ativaccedilatildeo policlonal e proliferaccedilatildeo das ceacutelulas B algumas com auto-
reatividade pertencentes agrave biblioteca de anticorpos naturais em indiviacuteduos normais
(ARGOV et al 1989) Na leishmaniose antiacutegenos soluacuteveis derivados da L major e
L donovani satildeo mitogecircnicos e desencadeiam a produccedilatildeo de imunoglobulinas com
auto-reatividade (ARGOV et al 1989) Crioglobulinemia mista induzida pelo HCV eacute
outro exemplo de ativaccedilatildeo policlonal persistente levando a uma mistura de
autoanticorpos policlonais e monoclonais os quais causam doenccedilas auto-imunes
(AGMON-LEVIN et al 2009)
Mimetismo molecular ou homologias estruturais entre infecccedilotildees e
componentes do hospedeiro podem ser agrave base da produccedilatildeo de autoanticorpos
como no caso da febre reumaacutetica onde o componente M da membrana do
estreptococo apresenta homologia com peptiacutedeos cardiacuteacos cerebrais e sinoviais A
associaccedilatildeo da siacutendrome de Guillain-Barreacute com a infecccedilatildeo pelo Campylobacter
jejeuni representa outro exemplo de mimetismo molecular como base de uma
manifestaccedilatildeo auto-imune A reatividade cruzada entre agentes infecciosos e auto-
antiacutegenos jaacute foi demonstrada para o M leprae (McADAM MUDD SHOENFELD
1984) e M tuberculosis (SHOENFELD et al 1986) e a inibiccedilatildeo de anticorpos anti-
Sm anti-RNP e anti-SSB por promastigotas intactas de Leishmania apoacuteia a
homologia entre antiacutegenos nucleares e a Leishmania (ARGOV et al 1989)
A disseminaccedilatildeo de epiacutetopos a emergecircncia de novos anticorpos ou a
resposta de ceacutelulas T a um novo epiacutetopo (subdominante ou criacuteptico) no mesmo
antiacutegeno ou em outro antiacutegeno foi demonstrada em modelos experimentais e na
doenccedila humana alguns autores demonstraram a disseminaccedilatildeo molecular do
antiacutegeno Sm para reatividade anti-RNP (STAUB 1998) no LES enquanto na febre
31
reumaacutetica o estado de autoimunidade crocircnica que afeta as vaacutelvulas cardiacuteacas pode
resultar em uma resposta imunoloacutegica contra o colaacutegeno e laminina (KIVITY et al
2009 PORDEUS et al 2008) As infecccedilotildees tambeacutem podem desempenhar um papel
importante na induccedilatildeo da autoimunidade atraveacutes da liberaccedilatildeo de antiacutegenos
sequumlestrados apoacutes lesatildeo tecidual ou aumentando a exibiccedilatildeo de epiacutetopos criacutepticos
no meio inflamatoacuterio apresentando assim novos antiacutegenos ao sistema imunoloacutegico
(KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)
15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES
AGUDAS VIRAIS
O conceito de auto-imunidade induzida por viacuterus natildeo eacute exclusivo para
doenccedilas hepaacuteticas O viacuterus Coxsackie do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um
terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite infecciosa e estaacute implicado nas miocardites
auto-imunes reagindo contra a miosina cardiacuteaca (GIST BELL 1974) Niwa et al
(1984) encontraram elevaccedilatildeo transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator
reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas
virais comuns como varicela sarampo influenza caxumba herpes zoster e
exantema suacutebito
A patogecircnia da infecccedilatildeo viral inclui pelo menos trecircs tipos de interaccedilotildees
com o hospedeiro vertebrado 1) o efeito do agente sobre as ceacutelulas 2) a maneira
de disseminaccedilatildeo do agente no organismo infectado 3) a resposta imunoloacutegica e a
sua influencia no processo infeccioso Destacam-se dois tipos principais da
interaccedilatildeo a destruiccedilatildeo celular e a resposta imunoloacutegica (FIGUEIREDO 1999
CATALAN-SOARES PROIETTI CARNEIRO-PROIETTI 2006) O viacuterus Coxsackie
do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite
infecciosa e estaacute implicado nas miocardites auto-imunes reagindo contra a miosina
cardiacuteaca (GERSHON KONDO 1971) Niwa et al (1984) encontraram elevaccedilatildeo
transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo
anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas virais comuns como varicela sarampo
influenza caxumba herpes zoster e exantema suacutebito
32
16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN
De acordo com o II Consenso Brasileiro de FAN em HEp 2
(DELLAVANCE et al 2003) os AAN satildeo encontrados comumente em uma
variedade de doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Satildeo uacuteteis na investigaccedilatildeo dessas
doenccedilas auxiliando no diagnoacutestico de patologias como LES esclerose sistecircmica
progressiva (ESP) doenccedila mista do tecido conjuntivo (DMTC) siacutendrome de Sjoumlgren
(SS) polimiosite e dermatomiosite
Eles podem estar presentes em um pequeno percentual da populaccedilatildeo
aparentemente sadia essa frequumlecircncia eacute maior em mulheres e aumenta com a idade
Segundo a literatura a positividade entre 20 a 60 anos varia entre percentuais mais
altos (133) para tiacutetulos baixos e mais baixos (33) para tiacutetulos mais elevados
(DELLAVANCE et al 2003)
A pesquisa dos anticorpos antinucleares pode ser realizada por diferentes
teacutecnicas a imunofluorescecircncia indireta eacute a mais utilizada por sua sensibilidade
reprodutibilidade e facilidade de execuccedilatildeo A sensibilidade aumenta
significativamente quando se utiliza como substrato lacircminas com ceacutelulas Hep 2
(ceacutelulas de carcinoma de laringe humana) por causa da maior expressatildeo de
antiacutegenos na superfiacutecie dessas ceacutelulas comparados aos expressos nas ceacutelulas de
fiacutegado ou de rins de camundongos que se utilizavam anteriormente
Em geral eacute possiacutevel detectar melhor a presenccedila de AAN por associaccedilatildeo
de trecircs anti-soros isotipos especiacuteficos (anti-IgG anti-IgA e anti-IgM) A pesquisa
realizada por essa teacutecnica serve de triagem inicial para a presenccedila de AAN Eacute
normalmente denominada pesquisa de FAN ou AAN
A realizaccedilatildeo de outras metodologias tais como as imunoenzimaacuteticas
permite uma avaliaccedilatildeo isolada dos diferentes auto-anticorpos sugeridos pelos
padrotildees de fluorescecircncia encontrados no FAN A identificaccedilatildeo desses AAN permite
um diagnoacutestico mais preciso e eles podem ser utilizados em muitos casos como
marcador para uma das diferentes doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Muitas dessas
patologias apresentam um perfil distinto de auto-anticorpos que auxilia o diagnoacutestico
A presenccedila de FAN positivo em pessoas aparentemente sadias pode ser
devida a algumas situaccedilotildees
minus Doenccedila auto-imune precoce ainda natildeo expressa clinicamente
33
minus distuacuterbio imunoloacutegico transitoacuterio causado por doenccedila natildeo-imune
tais como infecccedilotildees principalmente virais
minus uso de medicamentos e neoplasias
minus manifestaccedilatildeo incompleta de uma siacutendrome ou seja o paciente
sintetiza o anticorpo poreacutem esse quadro natildeo evolui para doenccedila
minus fenocircmeno auto-imune fisioloacutegico
O resultado do FAN eacute expresso em tiacutetulo e padratildeo uma vez que ambos
os paracircmetros tecircm importacircncia para a avaliaccedilatildeo do significado cliacutenico do exame O
tiacutetulo do FAN corresponde agrave maior diluiccedilatildeo capaz de demonstrar fluorescecircncia
inequiacutevoca e didaticamente pode ser dividido em
minus Baixo menor 180
minus Moderado 1160
minus Moderadamente elevado 1320
minus Alto maior 1640
Nas pesquisas realizadas por imunofluorescecircncia indireta os resultados
satildeo expressos em tiacutetulos segundo as diluiccedilotildees empregadas Eacute possiacutevel trabalhar
utilizando-se como limite tiacutetulos de 140 que permitem maior sensibilidade ou de
180 que permitem maior especificidade ou seja um menor nuacutemero de falso-
positivos
Na praacutetica cliacutenica satildeo considerados significativos tiacutetulos superiores a
1160 Os resultados com tiacutetulos positivos satildeo acompanhados pela descriccedilatildeo do
padratildeo de fluorescecircncia encontrado que serve como orientaccedilatildeo da presenccedila de um
antiacutegeno especiacutefico e em alguns casos como padratildeo diagnoacutestico Em determinadas
situaccedilotildees em especial no LES em atividade pode ocorrer agrave observaccedilatildeo de mais de
um padratildeo de fluorescecircncia
O padratildeo do FAN a seu turno aponta uma probabilidade maior ou menor
de doenccedila auto-imune e ateacute mesmo sugere o antiacutegeno nuclear envolvido e por
consequumlecircncia a afecccedilatildeo com ele mais relacionada Os padrotildees homogecircneo
centromeacuterico e pontilhado grosso satildeo os mais indicativos de processos de
autoimunidade uma vez que se associam a diversas condiccedilotildees reumaacuteticas
especialmente ao LES e agrave esclerose sistecircmica e tambeacutem a enfermidades hepaacuteticas
tais como a cirrose biliar primaacuteria e a hepatite auto-imune (KILLENBERG 2000)
34
Jaacute o pontilhado fino o pontilhado grosso reticulado e a membrana nuclear
tecircm maior significado quando encontrados em tiacutetulos altos uma vez que podem
estar presentes em tiacutetulos baixos em indiviacuteduos hiacutegidos Por sua vez o pontilhado
fino denso mesmo quando elevado em pessoas assintomaacuteticas soacute guarda relaccedilatildeo
com alguma doenccedila em cerca de 20 dos casos (DELLAVANCE et al 2003)
O padratildeo pontilhado pode tambeacutem ser referido como padratildeo salpicado
Outros padrotildees de fluorescecircncia podem ser encontrados em menor frequumlecircncia Os
pontilhados citoplasmaacutetico grossos ou reticulares associados agrave presenccedila de
anticorpos antimitococircndrias em pacientes com cirrose biliar primaacuteria o
citoplasmaacutetico homogecircneo relacionado a proteiacutenas ribossocircmicas em pacientes com
LES e o padratildeo pontilhado fino citoplasmaacutetico que pode estar associado agrave
presenccedila de anticorpos anti-JO-1 anti-PCNA e proteiacutenas da membrana celular em
pacientes com LES outras patologias do tecido conjuntivo e hepatopatias auto-
imunes (DELLAVANCE et al 2003)
Quadro 1 - Padrotildees de fluorescecircncia encontrados em maior frequumlecircncia e patologias relacionadas
Padrotildees de Fluorececircncia Antiacutegenos Patologias Relacionadas
Perifeacuterico DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES
Homogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA
LES AR lupus induzido por drogas
Perifeacutericohomogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES
Pontilhado grosso SM RNP LES DMTC
Pontilhado fino nuclear SS-A (RO) SS-B (La) SS LES
Nucleolar Proteiacutenas Nucleolares ESP Centromeacuterico Proteiacutenas de centrocircmeros Siacutendrome de CREST
Fonte Dellavance et al 2003 Quadro 2 - Anti-ena - auto-anticorpos contra antiacutegenos extraiacutedos do nuacutecleo e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleares Patologias Relacionadas SM LES RNP DMTC LES ESP AR e Polimiosite
SS-A (Ro) SS LES lupus neonatal e forma cutacircnea subaguda
SS-B (La) SS LES luacutepus neonatal e forma cutacircnea subaguda
Scl 70 ESP Jo -1 Polimiosite e dermatomiosite Fonte Dellavance et al 2003
35
Quadro 3 ndash Padrotildees de FAN nuclear e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes
Padrotildees Nucleares Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos
Nuclear Pontilhado Centromeacuterico Anticorpo anti-centrocircmero Esclerose Sistecircmica forma CREST Cirrose Biliar Primaacuteria
Nuclear homogecircneo Anticorpo anti-DNA nativo Lupus Eritematoso Sistecircmico (LES) Anticorpo anti-Histoma LES induzido por drogas LES idiopaacutetico Anticorpo anti-cromatina (DNAHistona Nucleossomo) Artrite Reumatoacuteide (AR) Artrite Idiopaacutetica Juvenil importante associaccedilatildeo com uveiacutete na forma oligoarticular Siacutendrome de Felty Cirrose Billar Primaacuteria
Nuclear tipo membrana nuclear contiacutenua Anticorpo anti-Iamin e contra envelope nuclear - Iamins Hepatites auto-imunes Raramente associado a doenccedilas reumaacuteticas (algumas formas de LES e esclerodermia linear)
Nuclear pontilhado pleomoacuterficoPCNA Anticorpo contra nuacutecleo de ceacutelulas em proliferaccedilatildeo LES
Nuclear pontilhado fino denso Anticorpo anti-proteina p 75 kDa pode ser encontrado em indiviacuteduos saudaacuteveis processos inflamatoacuterios inespeciacuteficos doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Cistite Intersticial Dermatite Atoacutepica Psoriacutease e Asma
Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos
Anticorpo anti-p80 coilina natildeo apresenta associaccedilatildeo cliacutenica definida
Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos
Anticorpo anti-Sp100 (anti-p95) Cirrose Biliar Primaacuteria pode ocorrer em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas
Nuclear pontilhado grosso Anticorpo anti-Sm LES Anticorpo anti-RNP criteacuterio obrigatoacuterio no diagnostico da doenccedila mista do Tecido conjuntivo (DMTC) tambeacutem ocorre no LES Esclerose Sistecircmica (ES) e AR
Nuclear pontilhado fino Anticorpo anti SSARo Siacutendrome de Sjogren Primaacuteria (SS) LES Lupus neonatal e Lupus Cutacircneo Subagudo Anticorpo anti-SSBLa Lupus neonatal LES SS Anticorpo anti-Mi-2 Dermatomiosite embora raramente ocorra na polimiosite do adulto
Fonte Dellavance et al 2003
36
Quadro 4 - Padrotildees de FAN citoplasmaacuteticos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes
Padrotildees Citoplasmaacuteticos e Relacionados ao Aparelho Mitoacutetico Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos
Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina Hepatite auto-imune Cirrose Anticorpo anti-miosine Hepatite C Hepatocarcionoma Miastenia Gravis Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida
Citoplasmaacutetico Fibrilar Segmentar Anti actinina anti--vinculina e anti-tropomiose Miastenia Gravis Doenccedila de Crohn e Colite ulcerativa Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia cliacutenica definida
Citoplasmaacutetico Pontilhado Polar Anticorpo Anti-golginas (cisternas do aparelho de Golgi) raro no LES SS e outras doenccedilas auto-imunes sistecircmicas Relato na Ataxia Cerebelar Idiopaacutetica Degeneraccedilatildeo Cerebelar Paraneoplaacutesica infecccedilotildees virais pelo Epstein Barr (EBV) e pelo viacuterus da imunodeficiecircncia Humana (HIV) Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida
Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Anticorpo anti-Histidill t RNA sintetase (Jo-1) anticorpo marcador de Polimiosite no adulto Descrito raramente na Dermatomiosite
Citoplasmaacutetico Pontilhado com Pontos Isolados
Anticorpo anti-EEA1 e anti-fosfatidilserina natildeo haacute associaccedilotildees clinicas bem definida Anticorpo anti-GWBSS tambeacutem encontrado em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas
Citoplasmaacutetico Pontilhado Reticulado Anticorpo anti-mitococircndria Cirrose Biliar Primaacuteria Esclerose Sistecircmica Eacute relativamente comum o encontro deste padratildeo na ausecircncia de anticorpos anti-mitococircndria
Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Denso Anti PL7PL12 Raramente associado a Polimiosite Anticorpo P-ribossomal Este padratildeo ocorre no LES se a associaccedilatildeo eacute com anti-proteina P ribossomal
Citoplasmaacutetico Fibrilar Filamentar Anticorpo anti-vimentina e anti-queratina Anti-queratina eacute o anticorpo mais importante em doenccedila hepaacutetica alcooacutelica Descritos em vaacuterias doenccedilas inflamatoacuterias e infecciosas Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida
Aparelho mitoacutetico Tipo Centriacuteolo Anticorpo anti-enolase em baixos tiacutetulos natildeo tem associaccedilatildeo cliacutenica definida Em altos tiacutetulos eacute sugestivo de Esclerose Sistecircmica
Aparelho mitoacutetico Tipo ponte Intercelular
Anticorpo anti Tubulina Pode ser encontrado no LES e na DMTC outros anticorpos ainda natildeo bem definidos podem gerar o mesmo padratildeo
Aparelho mitoacutetico Tipo NuMa2 Anticorpo anti-HsEg5 diversas condiccedilotildees auto-imunes com baixa especificidade
Fonte Dellavance et al 2003
37
Quadro 5 - Padrotildees de FAN mistos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Mistos Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos
Misto do tipo nucleolar homogecircneo e nuclear pontilhado grosso com placa metafaacutesica decorada em anel (cromossomos negativos)
Anticorpo anti-Ku Superposiccedilatildeo Polimiose e Esclerose Sistecircmica Podem ocorrer no LES e Esclerodermia
Misto do tipo nuclear e nucleolar pontilhado com placa metafaacutesica positiva
Anticorpo anti-topoisomerase (Scl-70) ES forma difusa Mais raramente pode ocorrer na Siacutendrome CREST e superposiccedilatildeo PolimiositeEsclerodermia
Misto do tipo Citoplasmaacutetico pontilhado fino denso e homogecircneo e nucleolar homogecircneo
Anticorpo anti rRNP LES frequumlentemente relacionado agrave Psicose Luacutepica
Misto do tipo nuclear pontilhado fino com fluorescecircncia do aparelho mitoacutetico
Anticorpo anti-NuMA1SS pode ocorrer tambeacutem em outras condiccedilotildees auto-imunes ou inflamatoacuterias crocircnicas
Fonte Dellavance et al 2003
Quadro 6 - Padrotildees de FAN nucleolares e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleolares Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos
Nucleolar Aglomerado
Anticorpo anti-Fibrilarina (U3-nRNP) Esclerose Sistecircmica (ES) especialmente com comprometimento visceral grave entre eles a hipertensatildeo pulmonar
Nucleolar Pontilhado
Anticorpo anti-NOR-90 ES tambeacutem descrito em outras doenccedilas do tecido conjuntivo poreacutem sem relevacircncia clinica definida Anticorpos anti-RNA polimerase I ES de forma difusa com tendecircncia para comprometimento visceral mais frequumlente e grave
Nucleolar Homogecircneo
Anticorpo anti-PMScl Siacutendrome de Superposiccedilatildeo de Polimiosite com Esclerose Sistecircmica Raramente encontrado em casos de Polimiosite ou Esclerose Sistecircmica sem superposiccedilatildeo cliacutenica Outros auto-anticorpos mais raros podem apresentar esse padratildeo
Fonte Dellavance et al 2003
De acordo com o 3deg Consenso (DELLAVANCE et al 2009) foram
comunicados dois novos padrotildees de fluorescecircncia por participantes Vaacuterios outros
membros testemunharam jaacute haver observado esses padrotildees O primeiro trata-se de
um padratildeo nuclear pontilhado fino aproximando-se da textura homogecircnea e com
placa metafaacutesica corada da mesma forma Sua associaccedilatildeo cliacutenica e identidade
imunoloacutegica natildeo estatildeo definidas Sua importacircncia deriva do fato de que pode ser
facilmente confundido com o padratildeo pontilhado fino denso e com o padratildeo
homogecircneo O segundo trata-se de um padratildeo citoplasmaacutetico em forma de
pequenos bastotildees (rods) e ciacuterculos (rings) que aparentemente estaacute associado agrave
38
infecccedilatildeo pelo HCV Haacute estudos em curso por alguns grupos de pesquisa com a
finalidade de estabelecer sua identidade imunoloacutegica
Como ainda natildeo estatildeo definitivamente caracterizados esses dois novos
padrotildees foram considerados preliminares e o 3deg Consenso recomendou que os
mesmos fossem completamente caracterizados e apresentados na proacutexima versatildeo
do Consenso (DELLAVANCE et al 2009)
39
2 JUSTIFICATIVA
As inflamaccedilotildees do fiacutegado provocadas pelos viacuterus hepatotroacutepicos atingem
milhotildees de pessoas e representam significativos problemas de sauacutede puacuteblica em
todo o mundo No Brasil a Regiatildeo Norte responde por um significativo percentual
dos portadores de hepatite C Dentre as manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo
pelo viacuterus C as doenccedilas autoimunes tecircm significativo impacto na evoluccedilatildeo cliacutenica
desses pacientes A presenccedila de anticorpo antinuacutecleo eacute um marcador importante de
autoimunidade e apesar de existirem trabalhos relatando a pesquisa desse fator em
portadores de viacuterus C tais estudos ainda natildeo foram realizados na nossa regiatildeo
sobretudo correlacionando-se com o genoacutetipo do viacuterus responsaacutevel pela infecccedilatildeo
considerando que o genoacutetipo eacute um marcador de resposta ao tratamento ou
considerando que pacientes portadores do genoacutetipo 1 natildeo respondem
satisfatoriamente ao tratamento instituiacutedo pelo protocolo atual
21 ASPECTOS EacuteTICOS
A pesquisa a ser realizada apresenta relevacircncia social e natildeo perde o
sentido de sua destinaccedilatildeo soacutecio-humanitaacuteria (justiccedila e equidade)
Este trabalho adequa-se aos princiacutepios cientiacuteficos que o justificam e
apresenta possibilidade concreta de responder a incertezas tais como FAN e o
genoacutetipo viral em pacientes com infecccedilatildeo pelo viacuterus da hepatite C ldquoestatildeo
relacionadosrdquo
Segue rigorosamente os procedimentos descritos na Resoluccedilatildeo 19696-
CNSMS (BRASIL 1996) assegurando a confidenciabilidade e proteccedilatildeo da
identidade do sujeito da pesquisa no momento da afericcedilatildeo dos dados e sua
posterior utilizaccedilatildeo
Por tratar-se de um estudo que faraacute somente revisatildeo de soroteca os
participantes natildeo seratildeo submetidos a riscos de origem orgacircnica eou quiacutemica
40
3 OBJETIVOS
31 OBJETIVO GERAL
Estabelecer associaccedilatildeo entre a presenccedila de teste de FAN e o genoacutetipo
viral em pacientes portadores de infecccedilatildeo pelo HCV
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
I Identificar o padratildeo de fluorescecircncia do FAN em pacientes com diagnoacutestico
laboratorial de infecccedilatildeo pelo HCV
II Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados
pelo HCV de acordo com o gecircnero e a idade
III Identificar a prevalecircncia de FAN em pacientes infectados pelo HCV e natildeo
infectados
IV Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados
pelo HCV de acordo com as alteraccedilotildees bioquiacutemicas
41
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO)
Foi realizado um estudo transversal analiacutetico no Serviccedilo do Nuacutecleo de
Medicina Tropical da Universidade Federal do Paraacute (NMTUFPA) utilizando-se
pacientes oriundos da Fundaccedilatildeo Centro de Hemoterapia e Hematologia do Paraacute
(HEMOPA) e Plano de Assistecircncia ao Servidor (PASIASEP) com coleta de material
bioloacutegico para reconfirmaccedilatildeo do diagnoacutestico de hepatite C no periacuteodo de janeiro de
2009 a maio de 2010
411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C
A populaccedilatildeo de estudo consistiu de 51 pacientes admitidos no NMTUFPA
para reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica tratamento cliacutenico e acompanhamento ambulatorial
de ambos os gecircneros e independente da idade sem exclusatildeo dos pacientes com a
presenccedila de patologias associadas agrave condiccedilatildeo maior (motivadora da pesquisa)
oriundos da Fundaccedilatildeo HEMOPA e PAS
A amostra do grupo foi selecionada a partir da relaccedilatildeo dos prontuaacuterios
catalogados no laboratoacuterio de patologia do NMTUFPA
Os dados foram coletados atraveacutes dos resultados dos exames realizados
no soro de cada paciente O protocolo de coleta teve enfoque na identificaccedilatildeo
individual do paciente bem como a avaliaccedilatildeo cliacutenica dos resultados
412 Grupo de natildeo infectados
Foi utilizado um grupo controle de 100 amostras de soro de indiviacuteduos
doadores de sangue com sorologias negativas para HIV 1 e 2 HTLV 1 e 2 Siacutefilis
Doenccedilas de Chagas Hepatite B e para Hepatite C procedentes da fundaccedilatildeo
HEMOPA
42
42 MEacuteTODO
421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico
Foram colhidos em frasco sem anticoagulante 10ml de sangue perifeacuterico
dos 51 pacientes participantes da pesquisa A amostra sanguiacutenea de cada paciente
foi centrifugada o soro foi separado e colocado em frasco esteacuteril devidamente
identificado armazenado e resfriado de 2 a 8ordmC
Foi realizada no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais a
pesquisa soroloacutegica de anticorpos IgG anti-HCV por teste imunoenzimaacutetico (ELISA)
e os pacientes que apresentaram positividade tiveram seus resultados confirmados
atraveacutes de teacutecnicas moleculares (RT-PCR) e com identificaccedilatildeo do genoacutetipo viral
(genotipagem)
Foi realizado no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa a pesquisa
de FAN dos 51 pacientes selecionados utilizando as amostras existentes na
soroteca
422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C
Foram empregados testes soroloacutegicos de ELISA (Ensaio
Imunoenzimaacutetico) de 3ordf geraccedilatildeo utilizando-se de kits comerciais (kit ETI-AB-HCVK-
4 DiaSorin Itaacutelia) para detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos anti-HCV no soro dos
pacientes
As tiras (poccedilos) necessaacuterias para as reaccedilotildees foram retiradas da geladeira
com antecedecircncia de uma hora e deixadas agrave temperatura ambiente e os reagentes
homogeneizados rapidamente no voacutertex
O primeiro poccedilo da placa ficou o branco da reaccedilatildeo na sequecircncia da
microplaca de ELISA foi dispensado 200 microL do controle negativo em triplicata (trecircs
poccedilos) 200 microL do calibrador em duplicata (dois poccedilos) e 200 microL do controle positivo
em amostra uacutenica (um poccedilo)
Adicionou-se 200 microL do Diluente de Amostra em todos os poccedilos que
continham as amostras dos pacientes a serem dosadas na placa de ELISA
tomando cuidado para natildeo contaminar os poccedilos adjacentes
43
Dispensou-se 50 microL do Diluente do Reagente em todos os poccedilos de
controles calibradores e amostras cobrimos com adesivo para evitar evaporaccedilatildeo e
contaminaccedilatildeo das amostras e incubamos a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC
Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com
300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem diluiacuteda
Pipetou-se 100 microL de Conjugado Enzimaacutetico exceto no poccedilo do branco e
incubou-se a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se
cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com 300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem
diluiacuteda
Pipetou-se 100 microL de CromoacutegenoSubstrato em todos os poccedilos
Incubamos a microplaca protegendo-a de luz intensa e direta agrave temperatura
ambiente (18-24ordmC) por 15 min
Pipetou-se 100 microL de Aacutecido Sulfuacuterico em todos os poccedilos para ldquopararrdquo a
reaccedilatildeo enzimaacutetica e mediu-se a absorbacircncia da soluccedilatildeo obtida em leitor de ELISA
com filtro de 450 nM
O teste foi validado de acordo com os valores do controle de qualidade
preconizados pelo fabricante e que devem tanger os valores para o branco da
reaccedilatildeo le 0100 controle negativo le 0050 controle positivo ge 1000 e calibrador ge
1100 Para as amostras testadas os valores reagentes e natildeo reagentes para
pesquisa de anticorpos anti-HCV satildeo interpretados da seguinte maneira natildeo
reagentes com valores le 09 reagentes com valores ge 11 e indeterminados entre
os valores 09 ndash 11
423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia molecular
Nas amostras positivas pela sorologia (ELISA) realizou-se extraccedilatildeo do
RNA viral presente no soro do paciente utilizando kit comercial (QIAmp Viral RNA
kit Quiagen Alemanha) seguindo a teacutecnica adaptada no Laboratoacuterio de Patologia
Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais
Pipetou-se 560 microL de tampatildeo AVL (lise) contendo RNA em tubo de
centriacutefuga de 15 ml identificado adicionou-se 140 microL da amostra e homogenizou-se
em voacutertex por 15s incubando a temperatura ambiente (15-25degC) por 10 min Apoacutes
incubaccedilatildeo centrifugou-se rapidamente o tubo para remover partiacuteculas dispersas
44
Adicionou-se 560 microL de etanol (96-100) na amostra e homogenizou-se
no voacutertex por 15s centrifugando-se rapidamente para remover partiacuteculas dispersas
Depois cuidadosamente transferiu-se 630 microL para as colunas devidamente
identificadas centrifugou-se a 14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo
ficando soacute com a coluna para encaixar em outro tubo
Colocou-se o resto das amostras nas colunas devidas centrifugou-se a
14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo ficando soacute com a coluna para
encaixar em outro tubo Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW1) e
centrifugou-se por 1 min mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo
Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW2) e centrifugou-se por 4 min
mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo
Identificados os tubos para RNA colocou-se as colunas Adicionou-se 60
microL de tampatildeo para eluir (AVE) em cada amostra e centrifugou-se por 1 min
descartando a coluna e ficando com o tubo Colocou-se em banho-maria por 10 min
a 65degC centrifugado rapidamente e colocado no gelo As amostras extraiacutedas foram
congeladas e armazenadas em freezer a -20ordmC
O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado de acordo com a teacutecnica de
RT-PCR qualitativa com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das
Doenccedilas Tropicais da seguinte maneira para o Mix de uma amostra Tampatildeo 12
microL primer ou iniciador k10 1microL primer ou iniciador k11 1microL aacutegua ultrapura livre de
DNAse e RNAse 5 microL Enzima Taq polymerase One-Step (Invitrogen) 1 microL O
primer k10 constitui-se da sequecircncia GGC GAC ACT CCA CCA TRR e o primer k11
da sequecircncia GGT GCA CGG TCT ACG AGA CC
O volume do mix por amostra eacute de 20 microL e o volume da amostra (produto
da extraccedilatildeo) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As amostras
foram colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo eacute realizada a 42ordmC por 45 minutos
temperatura inicial de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 2 minutos seguida de 35 ciclos com
temperatura de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 54ordmC por 30
segundos de extensatildeo a 72ordmC por 45 segundos e temperatura de extensatildeo final de
72ordmC por 7 minutos e um hold de 4ordmC
Para visualizaccedilatildeo do produto dessa 1ordf PCR (RT-PCR) eacute feito um gel de
agarose a 1 (1g de agarose para 100mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de
etidium) que migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os
resultados foram visualizados atraveacutes de luz ultravioleta (UV) Os pacientes
45
positivos que apresentarem ldquobandardquo devem continuar os procedimentos e os
negativos que natildeo apresentarem ldquobandasrdquo deveratildeo ser liberados como
indetectaacuteveis por este meacutetodo
A 2ordf PCR (RFLP) foi responsaacutevel por fazer a amplificaccedilatildeo do cDNA
produto da 1ordf PCR Para esta etapa tambeacutem com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio
de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais foram necessaacuterios para o Mix de uma
amostra Tampatildeo 10X 25 microL DNTP 4 microL MgCl2 15 microL primer ou iniciador k15 1
microL primer ou iniciador k16 1 microL aacutegua ultrapura livre de DNAse e RNAse 125 microL
Enzima Taq platinum (Invitrogen) 05 microL O primer k15 constitui-se da sequecircncia
ACC ATR RAT CAC TCC CCT GT e o primer k16 da sequecircncia CAA GCA CCC TAT
CAG GCA GT
O volume do mix por amostra foi de 23 microL e o volume da amostra
(produto da 1ordf PCR) de 2 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As
amostras satildeo colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo se realiza a temperatura inicial
de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 4 minutos seguida de 35 ciclos com temperatura de
desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 55ordmC por 45 segundos de
extensatildeo a 72ordmC por 1 minuto e temperatura de extensatildeo final de 72ordmC por 7
minutos e um hold de 4ordmC
O produto da 2ordf PCR eacute observado atraveacutes de um gel de agarose a 1 (1g
de agarose para 100 mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que
migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os resultados
foram visualizados atraveacutes de luz UV (ultravioleta) Os pacientes positivos que
apresentaram ldquobandardquo (fragmento amplificado) se continuou os procedimentos e os
negativos que natildeo apresentaram ldquobandasrdquo foram repetidos para o procedimento da
2ordf PCR
424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem)
Os pacientes positivos para a 2ordf PCR foram submetidos agrave genotipagem
do viacuterus atraveacutes do meacutetodo de RFLP utilizando um par de enzimas de restriccedilatildeo
AVA II e RSA I Essa teacutecnica tambeacutem foi adaptada no Laboratoacuterio de Patologia
Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais
46
Na determinaccedilatildeo do genoacutetipo cada amostra eacute utilizada duas vezes
sendo uma reaccedilatildeo para AVA II e uma para RSA I portanto cada amostra teve dois
tubos correspondentes
Para a preparaccedilatildeo do mix de uma amostra para a enzima de restriccedilatildeo
AVA II (Promega) foram utilizados Buffer C X 30 2 microL aacutegua ultrapura livre de
DNAse e RNAse 125 microL AVA II 05 microL Para o mix de uma amostra de RSA I
(Invitrogen) satildeo necessaacuterios React 1 10X 2 microL aacutegua ultrapura libre de DNAse e
RNAse 11 microL RSA I 2 microL
O volume do mix por amostra foi de 15 microL e o volume da amostra
(produto da 2ordf PCR) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 20 microL para
cada frasco correspondente a sua enzima de restriccedilatildeo As amostras formatildeo ldquoparesrdquo
de tubos AVA II e RSA I e satildeo colocadas em banho-maria a 37ordmC overnight para
digerir (cortar) os fragmentos
Para visualizaccedilatildeo do produto da digestatildeo (RFLP) e verificaccedilatildeo dos
genoacutetipos foi preparado um gel de agarose a 2 (2g de agarose para 100 mL de
tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que migrou em cuba de eletroforese
com 100V 500A por 60 minutos Os resultados foram visualizados atraveacutes de luz UV
(ultravioleta) Os pacientes positivos apresentam ldquobandasrdquo (fragmentos) de
tamanhos diferentes O nuacutemero de bandas e sua disposiccedilatildeo no gel formaram
padrotildees de combinaccedilotildees correspondentes a cada genoacutetipo viral
425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas HEp-2
A pesquisa de auto-anticorpo contra antiacutegenos celulares foi realizada no
Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa pela teacutecnica de imunofluorescecircncia
indireta que os identifica atraveacutes da ligaccedilatildeo destes auto-anticorpos aos antiacutegenos do
substrato sendo esta ligaccedilatildeo revelada pela adiccedilatildeo de um soro com atividade Anti-
IgG conjugado agrave fluoresceiacutena
As amostras foram testadas utilizando-se um conjunto diagnoacutestico
comercial Antinuclear Antibody HEp-2 da Hemagen Diagnostics
Na primeira fase da reaccedilatildeo os soros diluiacutedos 140 colocados em contato
com o substrato durante 20 minutos seguido de lavagem com soluccedilatildeo salina
tamponada por 10 minutos Na segunda fase aplicacou-se a substacircncia
47
fluorescente sendo o conjugado diluiacutedo 130 deixando-se por 10 minutos seguida
de nova lavagem de 10 minutos e montagem da lacircmina com glicerina tamponada
Em cada lacircmina foram utilizados controle positivo e controle negativo
A leitura das lacircminas foi realizada em microscoacutepio de imunofluorescecircncia
marca Nikon modelo Eclipse E-200
Os criteacuterios morfoloacutegicos observados durante a leitura foram
a) aspecto da matriz nuclear
b) aspecto do nucleacuteolo
c) observaccedilatildeo de todos os estaacutegios de divisatildeo nuclear
d) aspecto do fuso mitoacutetico
e) aspecto do citoplasma
43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados coletados foram estruturados em um banco de dados no qual
tambeacutem foram confeccionadas tabelas e graacuteficos para representaccedilatildeo dos dados
Posteriormente foram analisados no programa Bioestat 50 para a geraccedilatildeo de
resultados estatiacutesticos que comprovassem a associaccedilatildeo de variaacuteveis pertinentes ao
estudo considerando o intervalo de confianccedila (IC) 95 e niacutevel α 5 (p-valor le 005)
isto eacute um achado seraacute considerado estatisticamente significante se valor de ldquoprdquo for
menor ou igual a 005 e seraacute considerado sem significacircncia estatiacutestica se esse valor
de ldquoprdquo for maior que 005
Nas variaacuteveis quantitativas foram realizadas as medidas de tendecircncia
central sendo calculado a meacutedia e a mediana com seus respectivos desvios
padrotildees O teste t foi usado para comparar as idades entre as amostras
O teste do Qui-quadrado e o teste G foram aplicados nas comparaccedilotildees de
n amostras independentes cujas proporccedilotildees observadas nas diversas modalidades
estiveram dispostas em tabelas de contigecircncia l x c onde se determinou as
proporccedilotildees observadas nas diferentes categorias e se estas tinham alguma
associaccedilatildeo
48
5 RESULTADOS
O Padratildeo de FAN em 100 dos 51 pacientes infectados pelo HCV e em
2 dos natildeo infectados pelo HCV ocorreu Citoplasmaacutetico
Com relaccedilatildeo agrave distribuiccedilatildeo dos pacientes por gecircnero observou-se uma
predominacircncia do gecircnero masculino (667) A faixa etaacuteria predominante foi a de 30
a 50 anos de idade (628) seguida da faixa etaacuteria compreendida entre 51 e 60
anos (196) No que diz respeito agrave naturalidade houve uma predominacircncia de
paraenses em 922 da amostra A maioria dos pacientes incluiacutedos no estudo foi
proveniente da Fundaccedilatildeo HEMOPA (98) por se tratarem de candidatos a doaccedilatildeo
de sangue (Tabela 1)
Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV segundo as caracteriacutesticas demograacuteficas janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Caracteriacutesticas demograacuteficas n Teste estatiacutestico Gecircnero
Masculino 34 667 Qui-quadrado Feminino 17 333 p = 00251
Total 51 1000
Idade (anos) lt 30 6 118 Qui-quadrado
30 a 40 16 314 p = 00094 41 a 50 16 314 51 a 60 10 196
gt 60 3 59 Total 51 1000
Naturalidade
Paraense 47 922 Qui-quadrado Macapaense 1 20 p lt 00001 Maranhense 1 20
Pernambucano 1 20 Gauacutecho 1 20
Total 51 1000
Procedecircncia Qui-quadrado HEMOPA 50 980 p lt 00001
IASEP 1 20 Total 51 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
49
Identificou-se no estudo a predominacircncia do genoacutetipo viral do tipo 1
(882) estando o genoacutetipo 3 presente em 118 dos casos Em 255 dos
pacientes foi observado uma positividade para FAN sendo que todos apresentaram
o padratildeo citoplasmaacutetico (Tabela 2)
Tabela 2 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV conforme os resultados laboratoriais de FAN citoplasmaacutetico e genotipagem janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Exames laboratoriais n Teste estatiacutestico
Genoacutetipo viral - HCV
Tipo 1 45 882 Qui-quadrado
Tipo3 6 118 p lt 00001
Total 51 1000
FAN Qui-quadrado
Positivo (citoplasmaacutetico) 13 255 p = 00008
Negativo 38 745 Total 51 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
Observou-se uma baixa positividade para o FAN tanto no gecircnero
masculino (294) quanto no gecircnero feminino (176) Natildeo houve diferenccedila
estatiacutestica significante entre os gecircneros e a anaacutelise do FAN (p = 05652) Isto eacute
independendo do gecircnero do paciente nada se poderaacute inferir se o mesmo teraacute maior
ou menor chance de possuir um FAN positivo ou negativo (Tabela 3)
Tabela 3 ndash Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
FAN (citoplasmaacutetico)
Gecircnero Teste estatiacutestico
(Teste G) Masculino Feminino
N N
Positivo 10 294 3 176
Negativo 24 706 14 824 p = 05652
Total 34 1000 17 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
Dentre os pacientes infectados o genoacutetipo viral tipo 1 e o tipo 3
predominaram no gecircnero masculino embora natildeo havendo diferenccedila significativa
entre os grupos (p=06376)(Tabela 4)
50
Tabela 4 - Relaccedilatildeo da genotipagem de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Gecircnero
Grupos estudados Teste estatiacutestico
(Teste G) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3
n n Masculino 29 644 5 833 p=06376 Feminino 16 356 1 167
Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa
Na faixa etaacuteria de 30 a 50 anos foi observada uma maior proporccedilatildeo (667)
do genoacutetipo viral do tipo 3 enquanto que para o genoacutetipo tipo 1 foi de 628 natildeo
tendo essa diferenccedila significacircncia estatiacutestica (Tabela 5)
Tabela 5 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e faixa etaacuteria - janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)
Idade (anos) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n
lt 30 04 118 0 00
30 a 40 15 314 3 500 p = 06401
41 a 50 15 314 1 167
51 a 60 08 196 2 333
gt 60 03 59 0 00 Total 45 1000 6 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
A anaacutelise descritiva das idades dos pacientes demonstrou que a meacutedia e
a mediana foi de 43 anos para aqueles com genoacutetipo viral tipo 1 no entanto para o
genoacutetipo viral tipo 3 a meacutedia foi de 44 e a mediana de 42 anos Observou-se que a
idade miacutenima dos pacientes com genoacutetipo viral-HCV do tipo 1 e 3 foi
respectivamente de 20 e 32 anos e a maacutexima foi de 68 e 57 anos perfazendo uma
amplitude total de 48 e 25 anos respectivamente Natildeo houve significacircncia estatiacutestica
entre as idades encontradas nos genoacutetipos 1 e 3 (Tabela 6 )
De acordo com o FAN citoplasmaacutetico a idade miacutenima dos pacientes com
FAN positivo e negativo foi respectivamente de 30 e 20 anos e a maacutexima foi de 53 e
68 anos perfazendo uma amplitude total de 23 e 48 anos respectivamente As
idades meacutedia e mediana foram respectivamente 435 e 46 anos nos pacientes com
o FAN positivo e meacutedia de 43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN
51
negativo Natildeo houve diferenccedila estatisticamente significativa entre as idades
encontradas nos pacientes com FAN positivo e negativo (Tabela 6)
Tabela 6 - Estudo descritivo da idade dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e presenccedila do FAN citoplasmaacutetico janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Grupos Estudados Genoacutetipo viral - HCV Auto anticorpo
Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 FAN (+) FAN (-) IDADE
Tamanho da amostra 45 6 13 38
Idade miacutenima 20 32 30 20
Idade maacutexima 68 57 53 68
Amplitude Total 48 25 23 48
Meacutedia Aritmeacutetica 43 44 435 43
Mediana 43 42 46 42
Desvio Padratildeo 107 93 78 113
Teste t p = 08363 p = 08809 Fonte Protocolo da pesquisa
Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos em que foram analisados AST
ALT ASTALT γ-GT e fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo
semelhantes dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e 3 natildeo
atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos
(Tabela 7)
Tabela 7- Distribuiccedilatildeo dos genoacutetipos dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Paracircmetros bioquiacutemicos
Genoacutetipo viral - HCV Teste estatiacutestico
(Teste t) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3
micro plusmn DP micro plusmn DP
AST 353 plusmn 219 328 plusmn 137 p = 07907
ALT 372 plusmn 321 288 plusmn 136 p = 05355
ASTALT 12 plusmn 07 14 plusmn 11 p = 06110
γ-GT 403 plusmn 38 302 plusmn 138 p = 02194
Fosfatase alcalina 1126 plusmn 443 1087 plusmn 376 p = 08349
Fonte Protocolo da pesquisa
Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos de AST ALT ASTALT γ-GT e
fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os
52
pacientes com FAN positivo e negativo natildeo sendo observada significacircncia
estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos de FAN (Tabela 8)
Tabela 8 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Paracircmetros bioquiacutemicos Auto anticorpos
Teste estatiacutestico (Teste t) Positivo Negativo
micro plusmn DP micro plusmn DP
AST 419 plusmn 238 326 plusmn 197 p = 01704
ALT 408 plusmn 29 346 plusmn 312 p = 05347
ASTALT 13 plusmn 08 12 plusmn 07 p = 05732
γ-GT 34 plusmn 21 409 plusmn 40 p = 04369
Fosfatase alcalina 1073 plusmn 345 1138 plusmn 462 p = 06431 Fonte Protocolo da pesquisa
Na comparaccedilatildeo entre resultados positivos e negativos do FAN
citoplasmaacutetico observou-se uma maior prevalecircncia da negatividade tanto em
pacientes natildeo infectados (98) como em pacientes infectados (745) pelo HCV
sendo essa diferenccedila estatisticamente significativa (plt00001) o que representa
uma natildeo associaccedilatildeo entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV
(Tabela 9)
Tabela 9 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico segundo a presenccedila ou ausecircncia de infecccedilatildeo por HCV janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
FAN (citoplasmaacutetico)
Pacientes Teste estatiacutestico (Teste G)
Infectados Natildeo infectados
N n
Positivo 13 255 2 2
Negativo 38 745 98 98 p lt 00001
Total 51 1000 100 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
Comparando-se os resultados do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos
viras observa-se que o resultado negativo eacute superior ao positivo em ambos os
genoacutetipos virais sendo 711 para o genoacutetipo viral 1 e 100 para o genoacutetipo viral 3
No entanto esta diferenccedila observada natildeo eacute estatisticamente significativa (p=02573)
(Tabela 10)
53
Tabela 10 - Distribuiccedilatildeo do FAN de acordo com o genoacutetipo viral janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
FAN (citoplasmaacutetico)
Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)
Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n
Positivo 13 289 0 00 p=02573 Negativo 32 711 6 1000
Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa
54
6 DISCUSSAtildeO
Desde o primeiro marcador soroloacutegico para diagnoacutestico do Lupus
Eritematoso Sistecircmico (LES) a ceacutelula LE descrita por Hargraves (1948) vaacuterios
substratos antigecircnicos foram utilizados para o estudo dos auto-anticorpos os quais
terminaram amplamente substituiacutedos pelas ceacutelulas HEp-2 Estas apresentam
significativas vantagens sobre os demais pela sua sensibilidade variedade de
antiacutegenos presentes e pelas facilidades morfoloacutegicas para o seu estudo
O uso da imunofluorescecircncia indireta para a visualizaccedilatildeo dos anticorpos
antinucleares nas ceacutelulas HEp-2 permite o reconhecimento de mais de 30 diferentes
padrotildees de fluorescecircncia como nucleares nucleolares da membrana nuclear do
aparelho mitoacutetico e citoplasmaacutetico todos satildeo proporcionados por diferentes auto-
anticorpos
A partir do 1deg Consenso Brasileiro para Padronizaccedilatildeo dos Laudos de FAN
(HEp-2) os criteacuterios para o preparo interpretaccedilatildeo da fluorescecircncia e nomenclatura
dos resultados passaram a ser normatizados Alguns padrotildees de fluorescecircncia satildeo
relativamente inespeciacuteficos outros satildeo ocasionados por uma gama restrita de auto-
anticorpos e outros ainda por um uacutenico auto-anticorpo (DELLAVANCE et al
2002) Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a tornaacute-las
imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo (DE
LARANAGA et al 2000)
Apesar do padratildeo de fluorescecircncia na maioria das vezes natildeo se pode
identificar o anticorpo presente ele pode sugerir ao cliacutenico qual o proacuteximo passo a
ser dado na investigaccedilatildeo da sua especificidade Os resultados encontrados devem
estar em associaccedilatildeo com a cliacutenica os padrotildees de fluorescecircncia e os tiacutetulos
alcanccedilados com a diluiccedilatildeo preacutevia (DELLAVANCE et al 2003)
No presente estudo a analise de 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo Viacuterus da
Hepatite C esteve presente o anticorpo-antinuclear (ANA FAN) em 13 (255) dos
pacientes e todos eram padratildeo citoplasmaacutetico corroborando com outros estudos
encontrados na literatura como
Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de
pacientes infectados pelo viacuterus HIV com Hanseniacutease e co-infectados com
Hanseniacutease HIV Ela obteve respectivamente as seguintes taxas de prevalecircncias
32 333 e 478 Em todos os grupos neste estudo houve predomiacutenio do
55
padratildeo citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear soacute foi observado entre os pacientes com
hanseniacutease (91) e co-infectados (237)
Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de
pacientes infectados pelo viacuterus da Dengue e viacuterus linfotroacutepico de ceacutelulas T humanas
HTLV-12 e controle Normais e obteve respectivamente as seguintes taxas de
prevalecircncias 40 40 e 2 Em todos os grupos houve predomiacutenio do padratildeo
citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear foi observado entre os pacientes com dengue
(67) e HTLV 12 (133)
Segundo Andrade et al (2002) Dellavance et al (2005) Dellavance e
Andrade et al (2007) o predomiacutenio do padratildeo de FAN do tipo citoplasmaacutetico indica
que determinados padrotildees de fluorescecircncia satildeo mais especiacuteficos de doenccedila auto-
imune enquanto outros ocorrem em indiviacuteduos com enfermidades natildeo auto-imunes
por ser o citoplasma celular rico em proteiacutenas para as quais auto-anticorpos naturais
apresentam afinidade moderada eacute comum observar positividade para FAN em
indiviacuteduos sadios cujo significado ainda natildeo eacute entendido completamente
O padratildeo Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina que pode ser
encontrado em Hepatite auto-imune Cirrose Hepatite C Hepatocarcionoma entre
outros Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica
definida Um resultado positivo pode estar ou natildeo associado a uma patologia assim
como poderaacute ou natildeo vir a apresentar uma doenccedila auto-imune com o passar do
tempo (DELLAVANCE et al 2003) Neste estudo natildeo foi feito avaliaccedilatildeo prospectiva
dos resultados embora todos sejam FAN citoplasmaacuteticos
Os achados de FAN positivo em populaccedilotildees sadias ou sem doenccedilas auto-
imunes tambeacutem jaacute observado por Leser et al (2004) que em 394 pacientes com
FAN-HEp-2 positivo natildeo encontraram nenhum paciente com doenccedila auto-imune
Outro exemplo estaacute no padratildeo citoplasmaacutetico de pontos isolados
estudado por Laurino et al (2006) presente em indiviacuteduos sem evidecircncia de auto-
imunidade mas tambeacutem em indiviacuteduos com acometimento de doenccedilas auto-imunes
sistecircmicas e natildeo-especiacuteficas
Os dados apresentados corroboram com este estudo em que foi
observado a presenccedila do auto-anticorpo em 2 (2 ) dos 100 indiviacuteduos sadios do
grupo controle todos com padratildeo citoplasmaacutetico
56
Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a
tornaacute-las imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo
(DE LARANAGA et al 2000)
Nas Infecccedilotildees agudas espera-se que a resposta auto-imune diminua a
medida que os viacuterus satildeo eliminados Entretanto alguns trabalhos sugerem que em
indiviacuteduos geneticamente susceptiacuteveis as reaccedilotildees auto-imunes possam persistir
apesar do clareamento viral uma vez que o gatilho imunoloacutegico foi ativado e natildeo
houve desativaccedilatildeo (DE LARANAGA et al 2000 SAKKAS et al 2008)
Ramos-Casals et al (2009) no estudo Doenccedilas Sistecircmica Auto-Imunes
em Pacientes com Infecccedilatildeo pelo (72) dos pacientes eram do gecircnero feminino e
(28) do masculino(ANA FAN) em 61 dos pacientes o que se diferem deste
trabalho eacute que dos 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo (667) eram do gecircnero
masculino e (333) eram do gecircnero feminino com meacutedia de idade de 430 (plusmn107)
anos com presenccedila de anticorpo-antinuclear em 13 (255) com meacutedia e mediana
respectivamente de 435 e 46 anos nos pacientes com o FAN positivo e meacutedia de
43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN negativo
Alter (1995) em sua pesquisa natildeo observou associaccedilatildeo entre o risco de
infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas designadas por gecircnero idade e raccedila Na
referida pesquisa foram estudados 51 pacientes com idade meacutedia de 430 (+- 107)
anos 34 (667) eram do gecircnero masculino e 17 (333) do gecircnero feminino todos
em fase preacute-tratamento assintomaacuteticos natildeo permitindo avaliar os risco da
infecccedilatildeoSegundo Pordeus et al (2008) a ocorrecircncia destes auto-anticorpos
indicaria um prognoacutestico desfavoraacutevel Perperas Mcfarlane e Mcsorley (1986)
sugeriram que os auto-anticorpos poderiam estar envolvidos na progressatildeo ou no
desenvolvimento de hepatites crocircnicas possivelmente por um distuacuterbio no controle
da auto-reatividade Outros estudos questionam a participaccedilatildeo dos auto-anticorpos
no processo de transiccedilatildeo para cronicidade das hepatites agudas virais poreacutem os
resultados natildeo satildeo convincentes (SHOENFELD ROSE 2004)
Lopez Seia e Roy (1998) demonstraram a presenccedila de anticorpo anti-
actina em baixos tiacutetulos em crianccedilas com hepatite aguda por curto periacuteodo de
tempo poreacutem nenhuma associaccedilatildeo com gravidade da agressatildeo hepaacutetica foi
descrita
Neste estudo a presenccedila dos auto-anticorpos em (255) dos pacientes
com infecccedilatildeo pelo HCV natildeo puderam ser relacionada com a gravidade da doenccedila
57
pois este estudo foi realizado em pacientes receacutem diagnosticados entatildeo seria
necessaacuterio um acompanhamento destes por um periacuteodo maior de tempo com a
finalidade de concluir esta afirmativa Apesar da presenccedila transitoacuteria de auto-
anticorpos jaacute ter sido descrita em doenccedilas virais comuns a associaccedilatildeo entre a
presenccedila de auto-anticorpos e a gravidade das doenccedilas necessita de comprovaccedilatildeo
Passaleva Massai e Leoncini (1983) avaliaram 302 pacientes com
hepatites agudas virais e encontraram complexos imunes circulantes (CIC) em
516 dos pacientes com frequumlecircncia significativamente maior em hepatite aguda
Nenhuma associaccedilatildeo entre a presenccedila de imuno-complexos e o niacutevel de
aminotransferases ou bilirrubina foi encontrada Segundo Andrade et al (2002)
Dellavance et al (2005) Andrade et al (2007) nos pacientes do estudo foi feita a
relaccedilatildeo entre a presenccedila dos auto-anticorpos e niacuteveis de aminotransferases e as
elevaccedilotildees natildeo tiveram significacircncia poreacutem houve associaccedilatildeo do genotipo viral 1
Nos paracircmetros bioquiacutemicos analisados em relaccedilatildeo aos genoacutetipos houve uma
distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e
3 natildeo atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os
grupos Segundo Wilson (1997) trecircs estudos mostraram correlaccedilatildeo entre niacuteveis
altos de alanina aminotransferase e atividade histoloacutegica da doenccedila hepaacutetica
Poreacutem nos pacientes considerados individualmente o valor preditivo dessa
associaccedilatildeo foi baixo enquanto muitos deles com enzimas normais apresentavam
graves alteraccedilotildees histoloacutegicas No presente estudo natildeo foi observada associaccedilatildeo entre os niacuteveis de
aminotransferases e a cronificaccedilatildeo da hepatite viral pois nem todos os pacientes do
estudo apresentavam resultado de bioacutepsia hepaacutetica
Alter et al (1999) afirmam que no Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b
(63) e 3a (313) em estudo realizado em Goiacircnia onde foi observada uma
maior prevalecircncia do genoacutetipo 1 seguida do genoacutetipo 3 em doadores de sangue e
hemofiacutelicos (DELLAVANCE ANDRADE et al 2007) Estando esses dados em
acordo com esta pesquisa que com genotipagem do viacuterus da hepatite C que
identificou o genoacutetipo 1 em 45 (882) seguidos pelo genoacutetipo 3 que foi
identificado em 6 (118) dos pacientes com infecccedilatildeo pelo HCV Em um estudo realizado na Franccedila com 13 pacientes luacutepicas infectadas
pelo viacuterus C 8 apresentavam o RNA viral sendo o genoacutetipo 1 presente em cinco
58
(625) casos seguido do genoacutetipo 3 (375) (PERLEMUTER et al 2000) dados
que se assemelham aos do presente estudo embora o estudo natildeo tenha incluiacutedo
pacientes com outras infecccedilotildees associadas ao HCV Eacute importante ressaltar que
estudos sobre genotipagem do HCV em indiviacuteduos com doenccedilas reumaacuteticas satildeo
raros
No presente estudo houve uma frequumlecircncia baixa de positividade para o
FAN nos pacientes com genoacutetipo 1 e genoacutetipo 3 Natildeo havendo significacircncia
estatiacutestica entre os pacientes com genoacutetipo 1 e 3
Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter
implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave menor
resposta agrave terapia antiviral (BRUNO et al1997) o que natildeo foi avaliado neste estudo
pois apesar de (882) dos pacientes serem genoacutetipo 1 todos estavam em fase de
reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica seja preacute- tratamento Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila
poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses
autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis
vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo
hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja
quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a
concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave
hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em
parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)
59
7 CONCLUSOtildeES
minus O padratildeo dos auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares encontrados nos
dois grupos estudados foi o citoplasmaacutetico
minus A prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares no grupo com
infecccedilatildeo pelo VHC foi significativamente maior do que no grupo controle
minus Nos resultados de FAN citoplasmaacutetico haacute uma maior prevalecircncia da
negatividade em pacientes infectados pelo HCV e natildeo infectados sendo
essa diferenccedila estatisticamente significativa conferindo a natildeo associaccedilatildeo
entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV
minus Os resultados negativos do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos viras eacute
superior aos positivos em ambos os genoacutetipos virais entretanto esta diferenccedila
natildeo eacute estatisticamente significativa
minus Houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos
celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado
minus Natildeo houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos
celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado com
relaccedilatildeo ao gecircnero onde predominou o gecircnero masculino nos dois grupos
minus Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter
implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave
menor resposta agrave terapia antiviral o que natildeo foi avaliado neste estudo pois
os pacientes estavam em fase preacute tratamento sugerindo que estes pacientes
sejam avaliados futuramente
minus A formaccedilatildeo dos auto-anticorpos parece ser mais uma consequumlecircncia do que
uma causa da agressatildeo hepaacutetica
minus A negatividade do FAN ndash Hep 2 foi maior que a positividade mas todos os
FAN positivos pertenciam ao genoacutetipo viral tipo 1 nos pacientes infectados
pelo HCV
minus Nesta pesquisa os resultados de PCR o RNA-HCV de reconfirmaccedilatildeo foi
positivo para o anti-HCV em todos os soros analisados mostrando assim
que estes pacientes eram portadores de infecccedilatildeo por viacuterus C ou seja natildeo
houve falso positivo anteriormente poreacutem todos eram assintomaacuteticos
dificultando a conclusatildeo de ser ou natildeo uma infecccedilatildeo persistente
60
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APEcircNDICES
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APEcircNDICE A - TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Vocecirc estaacute sendo convidado para fazer parte de uma pesquisa que estaacute sendo desenvolvida pela Universidade Federal do Paraacute no Nuacutecleo de Medicina Tropical intitulada AUTOANTICORPOS CONTRA ANTIacuteGENOS CELULARES E SUA CORRELACcedilAtildeO COM O GENOacuteTIPO VIRAL EM PACIENTES COM INFECCcedilAtildeO PELO VIacuteRUS DA HEPATITE C (HCV)
O Objetivo da pesquisa eacute fazer uma correlaccedilatildeo do anticorpo antinuacutecleo (FAN) e o genoacutetipo viral em pacientes com hepatite C e o estaacutegio da doenccedila hepaacutetica a partir da histologia sempre que permitidos e correlacionar ao diagnoacutestico
Caso vocecirc participe da pesquisa seraacute necessaacuterio que forneccedila uma amostra de sangue (2ml)
O uacutenico inconveniente que vocecirc poderaacute experimentar eacute a dor provocada pela agulha na hora da coleta de sangue bem como pequenos hematomas que possam vir a ocorrer e que natildeo causam danos
Essa pesquisa natildeo oferece riscos as praacuteticas satildeo de uso rotineiro e seratildeo utilizados materiais esterilizados e descartaacuteveis como agulhas seringas etc
Estaacute garantido a vocecirc todas as informaccedilotildees que vocecirc queira antes durante e depois da pesquisa
A sua participaccedilatildeo neste estudo eacute voluntaacuteria Vocecirc tem a liberdade de recusar participar da pesquisa a qualquer momento
As informaccedilotildees relacionadas agrave pesquisa poderatildeo ser inspecionadas pelos pesquisadores que executam a pesquisa e pelas autoridades legais no entanto se qualquer informaccedilatildeo for divulgada em relatoacuterio publicaccedilatildeo ou qualquer outro meio isto seraacute feito de forma codificada para manter o caraacuteter confidencial
Todas as despesas necessaacuterias para a realizaccedilatildeo do estudo natildeo satildeo de sua responsabilidade assim como a sua participaccedilatildeo na pesquisa na seraacute remunerada (vocecirc natildeo receberaacute qualquer valor em dinheiro)
Quando os resultados forem divulgados natildeo apareceraacute seu nome e sim um coacutedigo
_____________________________________
Assinatura do Pesquisador Responsaacutevel NomeAna Maria Almeida Souza EndRodovia Maacuterio Covas 1426 ndash Cond Green Garden casa 41 Fone(91) 32352665 81197217 RegConselhoCRM 1508
69
APEcircNDICE B - CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Declaro que li as informaccedilotildees acima sobre a pesquisa que me sinto
perfeitamente esclarecido sobre o conteuacutedo da mesma assim como seus riscos e
benefiacutecios Declaro ainda que por minha livre vontade aceito participar da pesquisa
cooperando com a coleta de material para exame
Beleacutem _________
_________________________________________
Assinatura do sujeito da pesquisa ou do
responsaacutevel
70
ANEXOS
71
- Assinatura do Pesquisador Responsaacutevel
-
- Beleacutem _________
-
Dados Internacionais de Catalogaccedilatildeo-na-Publicaccedilatildeo (CIP)
Souza Ana Maria Almeida
Autoanticorpos contra antiacutegenos celulares e sua correlaccedilatildeo com o Genoacutetipo viral em pacientes com infecccedilatildeo pelo viacuterus da Hepatite C (HCV) Ana Maria Almeida Souza orientador Juarez Antocircnio Simotildees Quaresma ndash Beleacutem 2011
72 f Dissertaccedilatildeo (Mestrado em Medicina Tropical) ndash Universidade Federal do Paraacute Nuacutecleo
de Medicina Tropical Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Medicina Tropical Beleacutem 2011 1 Autoanticorpos 2 Hepatite C 3 Genoacutetipo Tiacutetulo
CDU 61636-002
Catalogaccedilatildeo na Fonte Luciene Dias Cavalcante - CRB21076
ANA MARIA ALMEIDA SOUZA
AUTOANTICORPOS CONTRA ANTIacuteGENOS CELULARES E SUA CORRELACcedilAtildeO COM O GENOacuteTIPO VIRAL EM PACIENTES COM INFECCcedilAtildeO PELO VIacuteRUS DA
HEPATITE C (HCV)
Dissertaccedilatildeo apresentada ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Doenccedilas Tropicais do Nuacutecleo de Medicina Tropical da Universidade Federal do Paraacute como requisito para obtenccedilatildeo do grau de mestre em Doenccedilas Tropicais Aacuterea Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais
Aprovada em _____________
BANCA EXAMINADORA
______________________________________ - Orientador Prof Dr Juarez Antonio Simotildees Quaresma Nuacutecleo de Medicina Tropical ndash UFPA ______________________________________ - Membro Profa Dra Clea Nazareacute Carneiro Bichara Centro de Ciecircncias Bioloacutegicas e da Sauacutede ndash UEPA ______________________________________ - Membro Prof Dr Lacy Cardoso de Brito Juacutenior Instituto Centro de Ciecircncias Bioloacutegicas ndash UFPA ______________________________________ - Membro Prof Dr Ismaelino Mauro Nunes Magno Centro Universitaacuterio do Paraacute - CESUPA
A DEUS QUE NA SUA SUPREMACIA E GRANDEZA PERMITIU A MINHA EXISTEcircNCIA
A MEU PAI EMMANOEL (IN MEMORIAM) QUE DENTRO DE SUA HUMILDADE E
SIMPLICIDADE SEMPRE ME PROPORCIONOU ENSINAMENTOS DE VIDA E QUE LEMBRO SEMPRE SUAS FRASES ldquoNUNCA DEcirc SUA RAZAtildeO A NINGUEacuteM PROCURE
SEMPRE FAZER AS COISAS CERTAS PARA QUE POSSAS ANDAR SEMPRE DE PEITO ABERTO E CABECcedilA ERGUIDArdquo
ldquoO ESTUDO Eacute A UacuteNICA HERANCcedilA QUE POSSO DEIXAR E QUE NINGUEacuteM VAI BRIGAR CONTIGO POR CAUSA DELArdquo
A MINHA MAtildeE SANCHA QUE SEMPRE FOI EXEMPLO DE BATALHA E VIGOR COM DOM
DE SER MAtildeE ESPOSA E PROFISSIONAL SEM PERDER NUNCA SUA CALMA TRANQUumlILIDADE E BONDADE PROCURANDO AJUDAR SEMPRE TODOS QUE A
RECORRIAM
AO RIBAMAR GRANDE AMOR DE MINHA VIDA MEU COMPANHEIRO DE 32 ANOS QUE DO SEU JEITO SEMPRE ME APOacuteIA NA REALIZACcedilAtildeO DOS MEUS SONHOS
AOS MEUS AMADOS FILHOS RODRIGO RAFAEL E ANA CAROLINA QUE SEMPRE ME
MOTIVARAM A LUTAR PELOS MEUS OBJETIVOS PARA ASSIM SERVIR DE INCENTIVO E EXEMPLO PARA ELES
AS MINHAS SOGRAS LOURDES E RAIMUNDA (IN MEMORIAM) QUE SEMPRE ESTIVERAM
AO MEU LADO AJUDANDO NA CRIACcedilAtildeO DOS MEUS FILHOS PARA QUE EU PUDESSE REALIZAR MINHAS TAREFAS E ALCANCcedilAR MEU CRESCIMENTO PROFISSIONAL
AGRADECIMENTOS
Ao Prof Dr Juarez Antonio Simotildees Quaresma meu orientador e incentivador pelos ensinamentos e orientaccedilatildeo para a conclusatildeo desta aacuterdua tarefa Ao meu cunhado Prof Dr Carlos Leocircnidas Silva Souza Sobrinho que sempre me incentivou nessa caminhada Aos amigos Dra Isabella e Dr Alberto Amaral que muito me ajudaram me apoiaram e permitiram minhas ausecircncias no laboratoacuterio para a conclusatildeo desta jornada Ao colega MS MD David Bichara que disponibilizou seu tempo para a realizaccedilatildeo dos testes de FAN de maior importacircncia para a execuccedilatildeo deste trabalho A colega Profa Dra Cleacutea Bichara que com seu apoio me deu animo para a execuccedilatildeo deste trabalho A colega Maria do Socorro de Oliveira Cardoso companheira de trabalho pelo incentivo e torcida para a concretizaccedilatildeo desta tarefa A todos os amigos do laboratoacuterio Amaral Costa pela incondicional torcida e apoio para que eu pudesse chegar ao final desta jornada A Profa Dra Luisa Caricio Martins pela sua ajuda incondicional na cedencia dos dados dos pacientes e liberaccedilatildeo das amostras do material bioloacutegica de sua soroteca sem a qual esse trabalho seria impossiacutevel de se realizar Ao futuro colega de profissatildeo doutorando Geraldo Duarte pelas contribuiccedilotildees na conclusatildeo estatiacutestica dos resultados encontrados Ao Prof Dr Ismaelino Mauro Nunes Magno que tem se empenhado me incentivando na conclusatildeo desta meta meu anjo auxiliar A todos os componentes da banca examinadora pelo comprometimento e a forma muito simples que no momento da qualificaccedilatildeo me fizeram vecirc e buscar as melhorias ao trabalho ora apresentado A Luciene Dias Cavalcante bibliotecaacuteria do HOL pela ajuda imprescindiacutevel na elaboraccedilatildeo desta dissertaccedilatildeo A todos que de forma direta ou indireta colaboraram para a realizaccedilatildeo deste sonho
CONFIE AS COISAS ACONTECEM NA HORA CERTA
EXATAMENTE QUANDO DEVEM ACONTECER MOMENTOS FELIZES LOUVE A DEUS
MOMENTOS DIFIacuteCEIS BUSQUE A DEUS MOMENTOS SILENCIOSOS ADORE A DEUS
MOMENTOS DOLOROSOS CONFIE EM DEUS CADA MOMENTO AGRADECcedilA A DEUS
ENTENDER A VONTADE DE DEUS NEM SEMPRE Eacute
FAacuteCIL MAS CRER QUE ELE ESTAacute NO COMANDO E TEM
UM PLANO PARA NOSSA VIDA FAZ A CAMINHADA VALER
Agrave PENA
(DESCONHECIDO)
RESUMO
As inflamaccedilotildees do fiacutegado provocadas pelos viacuterus hepatotroacutepicos atingem milhotildees de
pessoas e representa significativo problema de sauacutede puacuteblica em todo o mundo
Existem interaccedilotildees entre viroses hepatotroacutepicas e o sistema imunoloacutegico do hospedeiro
que podem influenciar na patogenicidade da agressatildeo hepaacutetica O objetivo deste
trabalho foi investigar a frequumlecircncia de auto-anticorpos em pacientes portadores do viacuterus
da hepatite C e sua correlaccedilatildeo com os genoacutetipos encontrados Foram estudados 51
pacientes com diagnoacutestico confirmado pelo PCR de infecccedilatildeo pelo viacuterus da hepatite C e
um grupo de 100 doadores de sangue com todos os exames soroloacutegico para doenccedilas
infecto-contagiosas negativos Os 51 pacientes portadores do viacuterus C apresentavam
idade meacutedia de 43 anos +- 113 em fase preacute-tratamento 34 (667) eram do gecircnero
masculino e 17 (333) do gecircnero feminino Desses 13 (255) apresentaram FAN
positivo 45 (882) eram genoacutetipo tipo 1 e 118 genoacutetipo tipo 3 Os pacientes que se
apresentaram com anticorpos detectaacuteveis natildeo apresentavam niacuteveis de AST ALT
ASTALT γ-GT e fosfatase alcalina significativamente diferente daqueles com auto-
anticorpos negativos Desta forma conclui-se que os anticorpos presentes na amostra
do estudo satildeo independentes da evoluccedilatildeo da doenccedila e do prognoacutestico do paciente
entretanto parece estar ligada ao genoacutetipo tipo 1
Palavras-chave Hepatite C Auto-anticorpos Genoacutetipo
ABSTRACT
Inflammation of the liver caused by hepatotropic viruses affect millions of people and
represents a significant public health problem worldwide There are interactions between
hepatotropic viruses and the host immune system that can influence the pathogenesis of
liver injury The objective of this study was to investigate the frequency of autoantibodies
in patients with hepatitis C virus and its correlation with the genotypes found We
studied 51 patients diagnosed by PCR of infection with hepatitis C and a group of 100
blood donors with all serological tests for infectious diseases negative The 51 patients
with virus C had an average age of 43 years + - 113 in the pre-treatment 34 (667)
were male and 17 (333) were female Of these 13 (255) were ANA positive 45
(882) were with genotype 1 and 118 with genotype 3 Patients who presented with
antibodies had no detectable levels of AST ALT AST ALT γ-GT and alkaline
phosphatase significantly different from those with negative antibody titers Thus we
conclude that the antibodies present in the study sample are independent of disease
progression and patient prognosis though seems to be linked with genotype 1
Keywords Hepatitis C Auto-antibodies genotype
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Padrotildees de fluorescecircncia encontrados em maior frequumlecircncia e
patologias relacionadas 34
Quadro 2 - Anti-ena - auto-anticorpos contra antiacutegenos extraiacutedos do nuacutecleo e
relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 34
Quadro 3 ndash Padrotildees de FAN nuclear e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 35
Quadro 4 - Padrotildees de FAN citoplasmaacuteticos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 36
Quadro 5 - Padrotildees de FAN mistos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 37
Quadro 6 - Padrotildees de FAN nucleolares e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 37
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos pacientes segundo as caracteriacutesticas demograacuteficas janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 48
Tabela 2 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes conforme os resultados laboratoriais de FAN citoplasmaacutetico e genotipagem janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 49
Tabela 3 ndash Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 49
Tabela 4 - Relaccedilatildeo da genotipagem de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 50
Tabela 5 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e faixa etaacuteria - janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 50
Tabela 6 - Estudo descritivo da idade dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e presenccedila do FAN citoplasmaacutetico janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 51
Tabela 7- Distribuiccedilatildeo dos genoacutetipos dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 51
Tabela 8 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 52
Tabela 9 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico segundo a presenccedila ou ausecircncia de infecccedilatildeo por HCV janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 52
Tabela 10 - Distribuiccedilatildeo do FAN de acordo com o genoacutetipo viral janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 53
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
AAN Anticorpos antinucleares
aCL Anticorpos anticardiolipina
AIDS Sindrome da Imunodeficiecircncia Adquirida
ALT Alanina aminotransferase
ANCA Anticorpos anti-citoplasma de neutroacutefilos
Anti-CCP Antipeptiacutedeo citrulinado ciacuteclico
Anti-β2GPI Anticorpos anti-β2 glicoproteiacutena I
Cdna DNA complementar
CEP Comitecirc em Eacutetica e Pesquisa
CHC Carcinoma hepatocelular
CIC Complexos imunes circulantes
DDTC Doenccedilas difusas do tecido conjuntivo
DMTC Doenccedila mista do tecido conjuntivo
E1 Proteiacutena do envoltoacuterio
ENH Eritema Nodoso Hansecircnico
ESP Esclerose sistecircmica progressive
FAN Fator Anti-nuacutecleo
FR Fator reumatoacuteide
HBV Viacuterus da hepatite B
HCV Viacuterus da Hepatite C
HEMOPA Fundaccedilatildeo Centro de Hemoterapia e Hematologia do Paraacute
HIV Viacuterus da imunodeficiecircncia humana
HIV-1 Viacuterus da imunodeficiecircncia humana1
IAH Iacutendice de atividade histoloacutegica
LE Lupus Eritematoso
LES Luacutepus eritematoso sistecircmico
MS Ministeacuterio da Sauacutede
mtDNA DNA mitrocondrial
NANBH Hepatite natildeo-A natildeo-B
NMT Nuacutecleo de Medicina Tropical
OMS Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede
PCR Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia
Rh Tipo sanguiacuteneo
RNA Aacutecido ribonucleacuteico
RT-PCR Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia-em tempo real
SAF Siacutendrome antifosfoliacutepide
SIDA Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida
SS Siacutendrome de Sjoumlgren
UFPA Universidade Federal do Paraacute
UV ultravioleta
VHA Viacuterus da Hepatite A
VHC Viacuterus da Hepatite C
VHCHCV Hepatite C
VV Hanseniacutease generalizada
SUMAacuteRIO 1 INTRODUCcedilAtildeO 15 11 HEPATITE C (VHCHCV) 15 111 Consideraccedilotildees Gerais 15 112 Agente Etioloacutegico 16 113 Epidemiologia 17 114 Modo de Transmissatildeo 18 115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica 19 116 Diagnoacutestico 23 12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC 25
13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC 26
14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE 27
15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES AGUDAS VIRAIS 31
16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN 32 2 JUSTIFICATIVA 39 21 ASPECTOS EacuteTICOS 39 3 OBJETIVOS 40
31 OBJETIVO GERAL 40
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 40 4 MATERIAL E MEacuteTODOS 41 41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO) 41 411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C 41 412 Grupo de natildeo infectados 41 42 MEacuteTODO 42 421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico 42 422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C 42 423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia
molecular 43
424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem) 45 425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas
HEp-2 46 43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 47 5 RESULTADOS 48 6 DISCUSSAtildeO 54 7 CONCLUSOtildeES 59 REFEREcircNCIAS 60 APEcircNDICES 67 ANEXOS 70
15
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 HEPATITE C (VHCHCV)
111 Consideraccedilotildees Gerais
As hepatites virais satildeo doenccedilas causadas por diferentes agentes
etioloacutegicos de distribuiccedilotildees universais que tecircm em comum o hepatotropismo
Possuem semelhanccedilas do ponto de vista cliacutenico-laboratorial mas apresentam
importantes diferenccedilas epidemioloacutegicas quanto agrave sua evoluccedilatildeo (FERREIRA
SILVEIRA 2004) Desde a descriccedilatildeo e definiccedilatildeo em 1989 (CHOO et al 1989 apud
RIBEIRO et al 2007) tornou-se evidente sua associaccedilatildeo com uma grande
variedade de manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas desordens reumaacuteticas e auto-imunes
(ALMEIDA 2010)
A infecccedilatildeo pelo VHCHCV acarreta inflamaccedilatildeo hepaacutetica e esteatose
podendo evoluir para fibrose hepaacutetica e cirrose em indiviacuteduos cronicamente
infectados estes com grande risco de desenvolvimento de carcinoma hepatocelular
(RIBEIRO et al 2007) Essas complicaccedilotildees tardias ocorrem em um periacuteodo em
geral superior a 20 anos apoacutes o iniacutecio da infecccedilatildeo A avaliaccedilatildeo filogeneacutetica das
sequumlecircncias do VHCHCV investigadas em vaacuterias regiotildees geograacuteficas sugere que
existam pelo menos seis genoacutetipos principais designados pelos nuacutemeros de 1 a 6 e
pelo menos 30 subtipos designados por letras minuacutesculas Nos Estados Unidos
prevalecem os genoacutetipos 1a (60) e 1b (20) Os tipos 5 e 6 satildeo mais encontrados
no sudeste e sul da Aacutefrica O tipo 4 eacute predominante na Aacutefrica Central e no Oriente
Meacutedio No Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b (63) e 3a (313) (BASSIT et
al 1999 apud RIBEIRO et al 2007) As informaccedilotildees sobre as causas que
determinam o curso evolutivo da doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos
progressos que haacute no campo do diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHCHCV Uma
questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo genoacutetipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de
lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o genoacutetipo 1 (1b) cursa com lesotildees
histoloacutegicas mais graves
As uacuteltimas deacutecadas foram de notaacuteveis conquistas no que se refere agrave
prevenccedilatildeo e ao controle das hepatites virais Entre as doenccedilas endecircmico-
epidecircmicas que representam problemas importantes de sauacutede puacuteblica no Brasil
16
salientam-se as Hepatites Virais cujo comportamento epidemioloacutegico no nosso paiacutes
e no mundo tem sofrido grandes mudanccedilas nos uacuteltimos anos
Antes da seleccedilatildeo rigorosa dos doadores de sangue em 1991 o
VHCHCV era a maior causa de hepatite poacutes-transfusional Atualmente permanece
como tal em casos esporaacutedicos (CONTE 2000) Os grupos considerados de risco
satildeo pessoas que receberam transfusatildeo de sangue antes de 1992 usuaacuterios de
drogas injetaacuteveis profissionais de sauacutede que lidam com sangue pacientes de
hemodiaacutelise e com menor risco pessoas tatuadas ou com piercings (CLEMENTE
ONO-NITA 2007)
A melhoria das condiccedilotildees de higiene e de saneamento das populaccedilotildees a
vacinaccedilatildeo contra a Hepatite B (HBV) e as novas teacutecnicas moleculares de diagnoacutestico
do viacuterus da Hepatite estatildeo entre esses avanccedilos importantes (BRASIL 2008)
112 Agente Etioloacutegico
O VHCHCV um viacuterus aacutecido ribonucleacuteico (RNA) da famiacutelia Flaviviridae
representa a principal causa da previamente denominada hepatite natildeo-A natildeo-B
(SANTOS 2009) Foi identificado e isolado a partir de um clone derivado de um
genoma NANBH semelhante aos togaviridae ou flaviviridae (SAADE 2008) e
visualizado a imunoeletromicroscopia como partiacutecula de 55 a 65 nm de diacircmetro
com projeccedilotildees espiculares e de morfologia muito semelhante aos flaviviridae Aleacutem
disso estas partiacuteculas reagiram especificamente com anticorpos mono e policlonais
do conteuacutedo proteacuteico do envelope do VHC (HIRANUMA et al 1994 apud CONTE
2000)
O agente etioloacutegico do HCV natildeo eacute uma partiacutecula homogecircnea e apresenta
uma taxa alta de mutaccedilatildeo levando-o a uma heterogeneicidade genocircmica cujo
resultado eacute um grande nuacutemero de genoacutetipos (1a 1b 2a 2b 3a 3b 4 5 6)
(AUGUSTO LOBATO 2003) Natildeo haacute evidecircncias de variantes natildeo patogecircnicas O
genoacutetipo 1b eacute o que apresenta maior virulecircncia e pior resposta ao tratamento
(LAUER WALKER 2001 apud SOUZA 2007) No Brasil dados obtidos a partir de
casos isolados e estudos de pequenas amostragens indicam que o genoacutetipo 1b
ocorre em cerca de 30 a 40 dos casos o 1a em cerca de 20 1a e 1b em 20
o 3a em cerca de 28 (FOCACCIA 2004)
17
113 Epidemiologia
De acordo com a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) a HCV eacute uma
questatildeo de sauacutede puacuteblica e tambeacutem a principal causa de transplante de fiacutegado no
Brasil (SOCIEDADE BRASILEIRA DE HEPATOLOGIA 2005) Eacute estimada uma
prevalecircncia em torno de 10 para a infecccedilatildeo pelo VHC na populaccedilatildeo mundial
(KILLEMBERG 2000) Nos Estados Unidos cerca de 27 milhotildees de pessoas estatildeo
infectadas pelo viacuterus (BRASIL 2006)
De acordo com Ferreira e Silveira (2004) no Brasil o nuacutemero de pacientes
infectados eacute incerto relacionado geralmente a alguns estados e municiacutepios e o
esclarecimento dos agentes causadores das hepatites cuja identificaccedilatildeo requer
teacutecnicas laboratoriais complexas de biologia molecular eacute realizado de maneira
insuficiente Por outro lado a progressiva integraccedilatildeo entre as instacircncias gestoras
dos programas de vigilacircncia e controle das doenccedilas com grupos de pesquisa e
desses com os serviccedilos (FERREIRA SILVEIRA 2004 p 473) e a disponibilidade
dos bancos de dados nacionais mais confiaacuteveis apontam para novos e melhores
caminhos (BRASIL 2005b)
A OMS alerta que o Paiacutes deve se preparar para uma ldquoexplosatildeordquo da
epidemia a partir de 2011 (BRASIL 2005b) Outra preocupaccedilatildeo eacute que as pessoas
que receberam sangue antes de 1992 tecircm mais chances de estarem infectadas na
eacutepoca o sangue destinado agraves transfusotildees natildeo era analisado para detecccedilatildeo da HCV
porque o viacuterus natildeo era conhecido e natildeo havia exames especiacuteficos (BRASIL 2005b)
A prevalecircncia da infecccedilatildeo nos doadores de sangue sadios varia de 001-002 no
Reino Unido e no norte da Europa 1-15 no sul da Europa 65 na Aacutefrica
equatorial e de ateacute 20 no Egito (CONTE 2000)
De acordo com a OMS a cada grupo de 50 pessoas no Brasil uma tem
hepatite e de dez portadores apenas um sabe (STRAUSS 2001) Satildeo dois milhotildees
de infectados no Paiacutes Denominada epidemia silenciosa calcula-se que 170 milhotildees
de indiviacuteduos no mundo estejam contaminados pelo viacuterus C a forma mais grave da
doenccedila Ainda de acordo com a OMS o nuacutemero de brasileiros viacutetimas da
enfermidade eacute bem maior do que o estimado pelo Ministeacuterio da Sauacutede (TRINDADE
2005)
18
Por ocasiatildeo da Conferecircncia Internacional de Consenso sobre HCV em Paris
(LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999) concluiu-se que a hepatite crocircnica por viacuterus
C eacute um problema grave de sauacutede puacuteblica sendo sua prevalecircncia mundial estimada
em 3 (de 01 a 5 segundo os vaacuterios paiacuteses) por tanto havendo no mundo
todo cerca de 150 milhotildees de portadores crocircnicos do VHCHCV 4 milhotildees nos EUA
e 5 milhotildees na Europa Ocidental Na Europa Oriental a prevalecircncia eacute maior ainda
114 Modo de Transmissatildeo
A HCV eacute transmitida pelo sangue Natildeo haacute comprovaccedilatildeo de contaacutegio por
meio de fluidos corporais como saliva suor laacutegrimas secircmen ou leite materno
Tambeacutem deixa de ocorrer por meio de abraccedilos beijos uso dos mesmos copos ou
roupas Especialistas afirmam que a contaminaccedilatildeo atraveacutes de relaccedilotildees sexuais eacute
possiacutevel mas rara Quando detectada de maneira precoce a enfermidade tem
tratamento inclusive gratuito aleacutem de cura (BRASIL 2006)
Dentre os fatores de risco para transmissatildeo outros aleacutem da transfusatildeo de
sangue o uso de drogas iliacutecitas o comportamento sexual de alto risco e variaacuteveis
socioeconocircmicas representadas pelo grau de escolaridade e renda familiar Natildeo foi
observada associaccedilatildeo entre o risco de infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas
designadas por gecircnero idade e raccedila (ALTER 2007) O risco de transmissatildeo sexual
do VHCHCV eacute miacutenimo A contaminaccedilatildeo intrafamilial natildeo-sexual eacute consideraacutevel
particularmente quando um dos enfermos tem hepatopatia grave e ou carga viral
elevada (risco 110) (CONTE 2000)
A praacutetica de tatuagem fornece dados conflitantes sabendo-se que os
liacutequidos usados para esterilizar os instrumentos usados satildeo ineficazes
Karmochkine et al (1998 apud CONTE 2000) observaram que
aproximadamente 80 dos pacientes contraem o viacuterus atraveacutes da toxicomania
intravenosa ou transfusotildees de sangue ou de derivados Os restantes meios de
transmissatildeo e de contaacutegio satildeo a hemodiaacutelise os transplantes de oacutergatildeos picadas
acidentais profissionais e transmissatildeo vertical matildee-crianccedila Em 20 a 40 dos
casos natildeo se consegue determinar o modo de contaminaccedilatildeo A transmissatildeo da
hepatite crocircnica por viacuterus C pode ser prevenida (KARMOCHKINE et al 1998 apud
CONTE 2000)
19
As duas fontes de contaminaccedilatildeo satildeo a toxicomania endovenosa e a
administraccedilatildeo de produtos de origem sanguumliacutenea Esta uacuteltima praticamente
eliminada desde 1991 com a introduccedilatildeo dos testes ELISA 2 na seleccedilatildeo
aprimorada de doadores de sangue (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998
apud CONTE 2000)
A transmissatildeo sexual eacute rara com menos de 3 em parceiros estaacuteveis e
ocorre principalmente em pessoas com muacuteltiplos parceiros e com praacutetica sexual de
risco (sem uso de preservativo) ndash para os indiviacuteduos com parceiros muacuteltiplos o uso
de preservativos eacute indicado (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998 apud
CONTE 2000)
A gravidez natildeo estaacute contra-indicada nas mulheres infectadas pelo
VHCHCV A transmissatildeo vertical matildee-crianccedila eacute rara (menor de 6) O tipo de parto
(natural ou cesaacuterea) natildeo tem influecircncia O aleitamento eacute permitido A transmissatildeo
nosocomial eacute prevenida eficazmente de modo convencional (KARMOCHKINE et
al 1998 apud CONTE 2000)
115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica
A infecccedilatildeo aguda pode passar clinicamente despercebida ou evoluir para
hepatite fulminante Aproximadamente 850 das pessoas infectadas agudamente
vatildeo desenvolver uma viremia persistente tornando-se dessa forma indiviacuteduos
infectados crocircnicos Depressatildeo irritabilidade dores no corpo mal-estar febre
naacuteuseas e falta de apetite satildeo alguns dos sintomas mais frequumlentes embora a
maioria dos casos natildeo apresente nenhum sintoma (ALTER 2007)
A cirrose eacute pouco observada em pessoas que apresentam niacuteveis
persistentemente baixos das transaminases mas a elevaccedilatildeo destas natildeo eacute
representativa do grau de fibrose hepaacutetica Dessa forma a bioacutepsia hepaacutetica
representa o melhor indicador do estaacutegio de evoluccedilatildeo da doenccedila uma vez que
gradua os componentes inflamatoacuterios e o estaacutegio de fibrose (AGMON-LEVIN et al
2009 BLOCK SCHIANO 1999)
Alter et al (1992) dizem que em 82 de 130 pacientes seguidos durante
muitos anos apoacutes surto agudo de hepatite natildeo-A natildeo-B apresentam anti-VHCHCV
ou VHCHCV RNA sendo que 62 deles desenvolveram hepatite crocircnica e
concluem que os pacientes que adquiriram HCV tiveram alto grau de hepatite
20
crocircnica sendo que o VHCHCV pode ser a maior causa de doenccedila crocircnica de fiacutegado
nos EUA e que na maioria dos pacientes a infecccedilatildeo pelo VHCHCV parece persistir
por muitos anos mesmo na ausecircncia de doenccedila hepaacutetica ativa
Almeida et al (1999) determinaram a prevalecircncia da infecccedilatildeo em
doadores de sangue assim como avaliaram o grau de comprometimento hepaacutetico
numa populaccedilatildeo de 37335 doadores durante o biecircnio 93-94 em Porto Alegre - RS
utilizando o teste anti-VHC ELISA 2 Selecionaram 60 deles para a biopsia hepaacutetica
com agulha de Menghini encontrando prevalecircncia de 174 com comprometimento
hepatico e 39 deles apresentavam cirrose hepaacutetica Sendo a hepatopatia crocircnica de
graus variaacuteveis observadas em 80 deles na sua grande maioria com lesotildees leves
e miacutenimas Foi observada forte associaccedilatildeo entre elevaccedilatildeo de alanina
aminotransferase (ALT) e a presenccedila de hepatopatia crocircnica embora a intensidade
desta elevaccedilatildeo natildeo se correlacione com a gravidade da lesatildeo histoloacutegica
Jaacute na experiecircncia de Mutimer et al (1995) cerca de 80 dos doadores
soro-positivos analisados exaustivamente inclusive com biopsia de fiacutegado
mostraram evidecircncias de alteraccedilotildees histoloacutegicas e ou viroloacutegicas de infecccedilatildeo
persistente sem no entanto atingir graus mais avanccedilados de hepatopatia crocircnica
quase todos permanecendo na categoria moderada
Nos paiacuteses industrializados a HCV eacute responsaacutevel por 20 dos casos de
hepatite aguda 70 dos casos de hepatite crocircnica 40 dos casos de cirrose
descompensada 60 dos carcinomas hepatocelulares e 30 dos transplantes
hepaacuteticos (LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999)
Cerca de 40 do total de pacientes curam-se ou tecircm doenccedila crocircnica de
natureza benigna Os restantes 60 cursam com atividade aumentada de
aminotransferase denotando evoluccedilatildeo crocircnica da doenccedila Dentre estes a maioria
tem lesotildees necro inflamatoacuterias discretas e fibrose miacutenima ou ausente O prognoacutestico
em longo prazo eacute mal conhecido no entanto provavelmente a maioria deles natildeo viraacute
a falecer da doenccedila hepaacutetica em curso Cerca de 20 deles depois de 10-20 anos
de evoluccedilatildeo desenvolveratildeo cirrose hepaacutetica passiacutevel de transplante Assim a
hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila que ocasiona a morte de um pequeno nuacutemero
de pacientes sem no entanto afetar a duraccedilatildeo da vida meacutedia da maioria deles
(CONTE 2000 FERREIRA SILVEIRA 2004)
Apoacutes infecccedilatildeo aguda somente 10 dos pacientes desenvolve doenccedila
cliacutenica com icteriacutecia A infecccedilatildeo sub-cliacutenica eacute a regra e assim passa despercebida
21
Cerca de 25 deles tecircm infecccedilatildeo crocircnica sintomaacutetica com aminotransferases
normais e lesotildees inflamatoacuterias histoloacutegicas miacutenimas (RESENDE et al 2010)
A remissatildeo espontacircnea acontece em cerca de 15 dos casos Na grande
minoria dos casos a progressatildeo da doenccedila aguda pode levar agrave insuficiecircncia
hepaacutetica aguda
Observaccedilotildees feitas pelo irlandecircs Kenny-Walsh (1999) comprovam a
natureza e a evoluccedilatildeo cliacutenica da afecccedilatildeo em causa O autor acompanhou durante 17
anos 376 mulheres que receberam injeccedilotildees de imunoglobulinas anti-D
contaminadas com VHC provenientes de doador uacutenico num programa de
isoimunizaccedilatildeo Rh Destas 81 apresentaram sintomatologia mais frequumlentemente
fadiga (66) ALT ligeiramente elevada (de 40 a 99 UL) em 47 e igual ou maior de
100 UL em 8 A biopsia hepaacutetica mostrou inflamaccedilatildeo em 98 delas na maioria
das vezes leves (41) e moderadas (52) fibrose presente em 51 no entanto
somente em sete pacientes (2) houve sinais de cirrose provaacutevel ou definitiva Em
uma delas havia acentuado alcoolismo
A hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila de evoluccedilatildeo variaacutevel De maneira
geral sua evoluccedilatildeo eacute lenta insidiosa e progressiva
Os pacientes que natildeo apresentam evidecircncias bioquiacutemicas de lesatildeo
hepaacutetica podem constituir em subgrupo de casos mais benignos no curso natural
da doenccedila Muitos co-fatores tecircm papel importante no desenvolvimento da cirrose
nesses pacientes como por exemplo a idade no momento da infecccedilatildeo (os
contaminados de idade mais avanccedilada tecircm evoluccedilatildeo mais raacutepida da doenccedila
enquanto que os mais jovens a tecircm mais lenta) o alcoolismo (eacute de consenso geral
que o abuso de aacutelcool favorece o aparecimento da cirrose) e a co-infecccedilatildeo com o
Viacuterus da Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida (SIDA) e da HVB
A incidecircncia anual de carcinoma hepatocelular (CHC) eacute de 1 a 4 nos
pacientes cirroacuteticos o que justifica plenamente o controle ecograacutefico do fiacutegado e a
dosagem seacuterica de alfa-fetoproteiacutena nesses pacientes a cada 1-2 anos Por outro
lado nos pacientes com hepatite crocircnica por viacuterus C sem cirrose o CHC eacute muito
raro (LOPES 2010)
Nos casos de cura a atividade das transaminases cessa e os viacuterus natildeo
satildeo detectados (VHC RNA) no soro Nos casos de cronificaccedilatildeo acontece o
contraacuterio ou seja as alteraccedilotildees bioquiacutemicas existem com flutuaccedilotildees e os viacuterus satildeo
detectaacuteveis na grande maioria dos casos Fazem exceccedilatildeo agravequeles pacientes com
22
viremia baixa que por isso mesmo fogem aos limites dos meacutetodos de detecccedilatildeo viral
ou devido agraves flutuaccedilotildees proacuteprias desses niacuteveis virecircmicos (HAYDON et al 1998)
Nos pacientes anti-VHC positivos com enzimas circulantes normais a
falta de VHC RNA no soro tem sido interpretada como sinal de cura completa No
entanto Haydon et al (1998) alteraram essa interpretaccedilatildeo Estes autores
demonstraram a presenccedila de VHC RNA no fiacutegado desses pacientes que eram
negativos no soro independente das alteraccedilotildees bioquiacutemicas positivas ou negativas
do soro ou seja mesmo naqueles casos anteriormente considerados como curados
Assim os niacuteveis de viacuterus intra-hepaacuteticos natildeo satildeo determinados pelos fatores
hospedeiro (idade modo e duraccedilatildeo da infecccedilatildeo) ou virais (VHC genoacutetipos) pois
mesmo as repetidamente Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia-em tempo real (RT-
PCR) negativos para VHC RNA no soro podem ter viacuterus da HCV albergados no
fiacutegado Entretanto existem limitaccedilotildees metodoloacutegicas que devem ser consideradas
nessa interpretaccedilatildeo como por exemplo as limitaccedilotildees do RIBA 3 e do RT-PCR
Mais importante eacute o seguimento dos pacientes ao longo do tempo Assim
Seef et al (1992) em 568 pacientes de hepatite poacutes-transfusional e dois grupos
controles pareados que receberam transfusotildees sem desenvolver hepatite apoacutes 18
anos de seguimento encontraram 33 de mortalidade no grupo 1 e 15 no grupo
controle sendo que a maioria das mortes ocorreu nos pacientes com alcoolismo
associado Evidenciando que a maioria dos que desenvolve doenccedila crocircnica o faz
muito lentamente
Existem ainda no curso natural da doenccedila flutuaccedilotildees intensas e muito
frequumlentes que dependem dos viacuterus e dos hospedeiros a saber niacuteveis da viremia
genoacutetipos 1b graus de diversidade geneacutetica dos viacuterus vias de transmissatildeo (os
inoculados via transfusatildeo apresentam lesotildees hepatocelulares mais ativas)
(GORDON et al 1993 GORDON BAYATI SILVERMAN 1998) deficiecircncias
imunes alcoolismo e co-infecccedilatildeo com HBV e delta ou o Viacuterus da imunodeficiecircncia
humana (HIV) (LOPES 2010) Nestes uacuteltimos casos a co-infecccedilatildeo com muacuteltiplos
viacuterus das hepatites estaacute associada com mais graves lesotildees histoloacutegicas do fiacutegado do
que nos casos de VHC isoladas
Importa saber se os resultados obtidos com os controles feitos se mantecircm
por longos periacuteodos Ou seja como exemplos a atividade da ALT persistentemente
normal a variabilidade do RT-PCR a detecccedilatildeo de VHC RNA pela teacutecnica Reaccedilatildeo
de polimerase em cadeia (PCR) que pode ser negativa devido agrave inadequada
23
armazenagem das amostras agrave contaminaccedilatildeo do soro com substacircncias que
interferem na leitura entre outras causas de erro
As informaccedilotildees sobre as causas que determinam o curso evolutivo da
doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos progressos havidos no campo do
diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHC Uma questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo
genotipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o
genotipo 1 (1b) cursa com lesotildees histoloacutegicas mais graves independentemente da
carga viral Ainda mais os VHC RNA negativos no soro mesmo apoacutes anos de
cura podem recair pois neles persistem os viacuterus no fiacutegado em regime de
replicaccedilatildeo muito baixa indetectaacutevel pelos meacutetodos atuais Ao contraacuterio os negativos
no soro e no fiacutegado tecircm demonstrado respostas boas e sustentadas inclusive no
sentido de se fazer prognoacutestico de cura real e verdadeira infelizmente na grande
minoria dos casos
116 Diagnoacutestico
Quanto mais cedo o diagnoacutestico maiores as chances de detectar a
doenccedila Por isso eacute importante que as pessoas faccedilam o exame especiacutefico porque soacute
esse exame eacute que detecta a HCV E as mulheres tecircm que ter uma atenccedilatildeo em
especial Tempos atraacutes o Correio Braziliense (2003) publicou uma grande mateacuteria
sobre a quantidade de mulheres que vecircm sendo infectadas com a HCV Cuja causa
estava na esterelizaccedilatildeo mal feita dos equipamentos das manicures Uma soluccedilatildeo
praacutetica eacute as mulheres terem seu proacuteprio material pra fazer as unhas e natildeo deixar
mais ningueacutem utilizar (nem matildee nem irmatilde etc) Bem e quem tiver passado por
transfusatildeo dentistas manicures operaccedilotildees etc deve fazer o exame
(KARMOCHKINE et al 1998 apud CONTE 2000 KEER et al 1997)
A HCV natildeo eacute como a Siacutendrome da Imunodeficiecircncia Adquirida (AIDS)
que possui drogas com grande tecnologia e o doente pode viver por muitos e muitos
anos Com a HCV o paciente soacute tem chance de ficar bem se a doenccedila for
diagnosticada e tratada antes dela se manifestar Atualmente o tratamento usa uma
associaccedilatildeo de duas drogas ndash o Interferon e a Ribavirina ldquoAs chances de cura em
meacutedia satildeo de 50rdquo
Barbaro et al (1999) verificaram que os pacientes VHC genoacutetipos 1b
frequumlentemente apresentavam alteraccedilotildees ultraestruturais das mitococircndrias com
24
depleccedilatildeo do mtDNA podendo comprometer o processo de fosforilizaccedilatildeo oxidativa
Sendo assim a produccedilatildeo aumentada de radicais livres nos pacientes VHC genoacutetipos
1b poderia atuar de modo negativo na evoluccedilatildeo da doenccedila hepaacutetica aumentando o
efeito citopaacuteticos do VHC Nesses pacientes haveria portanto aumento de
hiperoxidaccedilatildeo com consequumlente resistecircncia agrave accedilatildeo dos interferons e pior evoluccedilatildeo
da doenccedila hepaacutetica A ser confirmado este fato novas estrateacutegias terapecircuticas
poderatildeo vir a ser desenvolvidas no combate a essa doenccedila
Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila
poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses
autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis
vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo
hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja
quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a
concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave
hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em
parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)
Dos fatos acima expostos decorrem implicaccedilotildees tais como as respostas
CD8-CTL aos antiacutegenos VHC restritas aos complexos de histocompatibilidade
principais (MHC I) com inibiccedilatildeo ou mesmo insuficiente produccedilatildeo de complexo
peptiacutedeo VHC-MHC inibiccedilatildeo direta das ceacutelulas CTLK e a falta de resposta as
citoquininas entre outras dos vaacuterios mecanismos de escape existentes Dentro
desse contexto o niacutevel de morte celular natildeo seria alcanccedilado e a lesatildeo hepatocelular
consequumlente seria portanto miacutenima
Outra implicaccedilatildeo resultante consiste na induccedilatildeo de resposta imune
celular T Helper mediadas a partir de peptide vacinas contra o VHC Estas novas
vacinas tecircm a capacidade de gerar linfoacutecitos T citotoacutexico os CTLs contra o VHC em
camundongo imunizados com peptiacutedeos CTL e ceacutelulas HT epiacutetomes do core VHC
Esses estudos recente em animais de laboratoacuterio vecircm progredindo rapidamente
esperando-se em breve novos recursos no tratamento dessa doenccedila (AGNELLO et
al 1998)
25
12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC
O VHC constitui-se em uma famiacutelia heterogecircnea de viacuterus com no miacutenimo
seis genoacutetipos e inuacutemeros subtipos (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT
SANTOS SILVA 1999) Embora o meacutetodo de maior acuraacutecia para a determinaccedilatildeo
do genoacutetipo do VHC seja a identificaccedilatildeo completa da sequumlecircncia dos 9500
nucleotiacutedeos e a construccedilatildeo de uma aacutervore filogeneacutetica esse meacutetodo soacute pode ser
utilizado em laboratoacuterios de pesquisa (BARBOSA SILVA MARTINS 2005) e natildeo
em laboratoacuterios cliacutenicos Assim foram desenvolvidos meacutetodos para genotipagem
utilizando apenas as regiotildees mais conservadas do genoma como a proteiacutena do
envoltoacuterio (E1) a proteiacutena core e a proteiacutena natildeo estrutural NS5B A sequumlecircncia dos
nucleotiacutedeos dentro dessas regiotildees relativamente conservadas eacute genoacutetipo-
especiacutefico e os isolados podem ser genotipados independentemente da regiatildeo que
for utilizada para anaacutelise (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS
SILVA 1999) Para uso em laboratoacuterios cliacutenicos foram desenvolvidas basicamente
duas metodologias que se valem de teacutecnicas de biologia molecular (genotipagem)
ou citoloacutegicas (serotipagem)
Os meacutetodos que adotam teacutecnica de biologia molecular para genotipagem
utilizando porccedilotildees do genoma incluem a PCR aninhada (nested PCR) (BASSIT
SANTOS SILVA 1999) a teacutecnica de restriction fragment length polymorphism
(RFLP) (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS SILVA 1999) a
hibridizaccedilatildeo reversa (BASSIT SANTOS SILVA 1999) (INNO-LiPA Innogenetics
Beacutelgica Gen Eti DEIA HCV Sorin Biomedica Itaacutelia) e o sequumlenciamento direto da
regiatildeo natildeo-codificante 5 (TruGene Visible Genetics Canadaacute) Suas principais
vantagens satildeo a informaccedilatildeo direta sobre sequumlecircncia dos nucleotiacutedeos do genoma
viral a alta sensibilidade por se basearem na PCR e a possibilidade de identificar o
subtipo viral (BARBOSA SILVA MARTINS 2005)
Os meacutetodos para determinaccedilatildeo do genoacutetipo que utilizam serotipagem
baseiam-se na detecccedilatildeo de anticorpos genoacutetipos-especiacuteficos contra epiacutetopos do
VHC (por exemplo proteiacutenas da regiatildeo do core) (BLOCK SCHIANO 1999) Os
testes comercializados utilizam diferentes teacutecnicas ELISA competitivos ou
immunoblot (Murex-HC1-6 Murex Diagnostics Ltd Reino Unido RIBA HCV
Serotyping Assay Chiron Diagnostics Estados Unidos) As principais vantagens da
teacutecnica de serotipagem satildeo o baixo custo e maior facilidade de realizaccedilatildeo em
26
comparaccedilatildeo com os testes de biologia molecular (BLOCK SCHIANO 1999 De
LARANAGA et al 2000)
A determinaccedilatildeo do genoacutetipo anteriormente utilizada em pesquisas mas
sem maior utilidade na praacutetica meacutedica atualmente eacute recomendada para uso cliacutenico
Como jaacute mencionado os pacientes infectados pelo genoacutetipo 1 do VHC devem ser
tratados por 12 meses enquanto os demais por 6 meses (BASSIT SANTOS SILVA
1999)
A determinaccedilatildeo do genoacutetipo do VHC pode ser feita por PCR ou
serotipagem A primeira teacutecnica eacute mais sensiacutevel e possibilita a identificaccedilatildeo de
subtipos do VHC Contudo a segunda eacute de mais faacutecil realizaccedilatildeo e mais barata
razatildeo pela que eacute importante que a teacutecnica seja aprimorada
Oliveira et al (1999) investigaram os padrotildees de distribuiccedilatildeo dos
genoacutetipos do VHC estudando 250 pacientes anti-VHC positivos atraveacutes da
detecccedilatildeo VHC RNA pelo RT-PCR e encontraram prevalecircncia de 72 para o VHC 1
253 para o tipo 3 2 para o 2 e 07 para o 4 semelhantes aos das vaacuterias
regiotildees mundiais
13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC
As manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo pelo VHC satildeo as mais
variadas possiacuteveis A diversidade de resposta do hospedeiro ao agente infeccioso
variando desde quadros assintomaacuteticos ateacute aqueles com evoluccedilatildeo grave fatal ou
incapacitante tem estimulado a busca por justificativas de tais discrepacircncias
cliacutenicas sobretudo na imunomodulaccedilatildeo Dentre as infecccedilotildees mais bem estudadas
destacam-se aquelas pelos Viacuterus da hepatite C Viacuterus da imunodeficiecircncia humana1
(HIV-1) pelo Herpes viacuterus humano 4 (viacuterus do Epstein Baar) e pelo Mycobacterium
leprae (ABBAS LICHTMAN 2005)
A agressatildeo hepaacutetica por auto-imunidade eacute um fenocircmeno reconhecido em
vaacuterias doenccedilas do fiacutegado inclusive nas de etiologia viral Aleacutem do agente agressor e
de sua interaccedilatildeo com o sistema imunoloacutegico do hospedeiro fatores ambientais ou
hormonais estatildeo aparentemente envolvidos no surgimento de auto-imunidade
hepaacutetica como se supotildee acontecer na hepatite auto-imune em indiviacuteduos
geneticamente suscetiacuteveis (CODES et al 2002)
27
A lesatildeo hepatocelular relacionada agrave infecccedilatildeo pelos viacuterus hepatotroacutepicos e
pelos herpes viacuterus (citomegaloviacuterus e Epstein-Barr) eacute secundaacuteria a uma resposta
auto-imune do hospedeiro Estes viacuterus natildeo parecem ser diretamente citopaacuteticos
mas desencadeiam lesatildeo hepaacutetica atraveacutes da resposta imune do hospedeiro contra
ceacutelulas hepaacuteticas infectadas (MALOY POWRIE 2001)
Existem estudos que focalizam alteraccedilotildees imunoloacutegicas em hepatites
virais entretanto a maioria deles mostra resultados pontuais sem seguimento na
fase aguda da doenccedila (BLOCK SCHIANO 1999 McFARLONE et al 1990) Aleacutem
disso ainda natildeo se estabeleceu uma associaccedilatildeo entre as reaccedilotildees auto-imunes
transitoacuterias induzidas por viroses hepatotroacutepicas e agravamento do dano tecidual na
hepatite viral
A infecccedilatildeo crocircnica estaacute fortemente associada agrave crioglobulinemia mista
essencial glomerulonefrite membrano-proliferativa e porfiria cutacircnea tardia De
forma menos impressiva encontra-se tambeacutem associada agrave uacutelcera corneana de
Mooren liacutequen plano e fibrose pulmonar (KILLENBERG 2000 WENER et al 1996)
A ocorrecircncia de anticorpos antitireoidianos e hipotireoidismo tem sido relatada em
associaccedilatildeo com a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC em mulheres (KILLENBERG 2000
CACOUB et al 1999)
A associaccedilatildeo entre a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC a presenccedila do fator
reumatoacuteide e do anticorpo antinuclear (FAN) o fenocircmeno de Raynaud e doenccedilas
difusas do tecido conjuntivo (DDTC) como artrite reumatoacuteide luacutepus eritematoso
sistecircmico siacutendrome de Sjoumlgren e vasculites sistecircmicas eacute relatada em alguns
trabalhos (CACOUB et al 1999 LOVY STARKEBAUM UBEROI 1996 STAUB
1998 WENER et al 1996)
14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE
A associaccedilatildeo entre doenccedilas infecciosas e autoimunidade apresentando-
se com manifestaccedilotildees cliacutenicas ou detectadas apenas pelo desenvolvimento de auto-
anticorpos tem sido amplamente documentado Infecccedilotildees virais bacterianas e
parasitaacuterias podem estar envolvidas no desenvolvimento recidivas e ateacute mesmo na
prevenccedilatildeo de doenccedilas auto-imunes (KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)
Ribeiro e Proietti (2004) avaliaram a frequumlecircncia de FR anticorpos
antipeptiacutedeo citrulinado ciacuteclico (anti-CCP) AAN anticorpos anti-citoplasma de
28
neutroacutefilos (ANCA) anticorpos anticardiolipina (aCL) e anticorpos anti-β2
glicoproteiacutena I (anti-β2GPI) em pacientes com hanseniacutease Existe estudo
demonstrando pacientes que apresentavam manifestaccedilotildees articulares comparados
aos que natildeo apresentavam envolvimento articular e um grupo controle de indiviacuteduos
saudaacuteveis com idade e gecircnero semelhantes aos dos pacientes estudados e que
residiam na mesma aacuterea geograacutefica A maioria dos pacientes nos dois grupos (com
e sem envolvimento articular) apresentava hanseniacutease generalizada Entretanto
observaram uma baixa frequumlecircncia que natildeo foi significativamente diferente de FR
anti-CCP AAN e ANCA em pacientes com hanseniacutease (nos dois grupos) e normal
dos controles Mas a prevalecircncia de anticorpos aCL e anti-β2GPI estava
significativamente elevada nos pacientes com hanseniacutease quando comparados com
o grupo controle apesar de natildeo haver associaccedilatildeo significativa com o envolvimento
articular O isoacutetopo predominante dos dois autoanticorpos foi a IgM (487) dos
pacientes com hanseniacutease apresentava pelo menos um anticorpo antifosfoliacutepide
Aleacutem disso os autores observaram uma associaccedilatildeo entre a positividade para aCL e
as manifestaccedilotildees cliacutenicas jaacute que os pacientes com anticorpos aCL apresentavam
doenccedila Hanseniacutease generalizada (VV) com mais frequumlecircncia (p= 0002) Natildeo houve
associaccedilatildeo entre a presenccedila de anticorpos aCL ou anti-β2GPI e episoacutedios
reacionais poreacutem entre os pacientes com esses episoacutedios aqueles com anticorpos
aCL apresentavam eritema nodoso hansecircnico (ENH) em 100 dos casos enquanto
entre os pacientes negativos para aCL 57 apresentavam ENH Apesar de uma
alta taxa de concordacircncia para a presenccedila de anticorpos aCL e anti-β2GPI ter sido
observada manifestaccedilotildees tromboemboacutelicas natildeo foram observadas (RIBEIRO
PROIETTI 2004 2005)
Horimoto e Costa (2009) avaliaram pacientes com Leishmania
(leishmaniose visceral e leishmaniose cutacircnea) para a presenccedila de anticorpos anti-
Leishmania assim como FR AAN anti-DNA anti-Sm anti-RNP anti-Ro anti-La
aCL e complemento (C3 e C4) Como esperado os pacientes com leishmaniose
visceral apresentava anticorpos anti-Leishmania Tiacutetulos significativamente elevados
de AANs na maioria dos pacientes o anti-DNA foi detectado em poucos pacientes
com doenccedila visceral assim como tiacutetulos elevados de anticorpos aCL (isotipo IgG)
quando comparados com os pacientes com leishmaniose cutacircnea Niacuteveis reduzidos
de complemento tambeacutem satildeo evidentes na doenccedila visceral assim como niacuteveis
significativamente reduzidos de C3 Outros estudos comparam e discutem os
29
resultados em relaccedilatildeo agrave crescente evidecircncia na literatura da presenccedila de
autoanticorpos em ambas as doenccedilas Em geral a prevalecircncia variaacutevel de auto-
anticorpos relatada assim como relatos preacutevios na literatura podem estar
relacionados a diferenccedilas metodoloacutegicas como o tipo de ensaio utilizado a
definiccedilatildeo dos pontos de corte inativaccedilatildeo dos soros pelo calor seleccedilatildeo de pacientes
e variaccedilotildees eacutetnicas e geograacuteficas nos grupos de pacientes Mas um dos resultados
consistentes foi a frequumlecircncia significativamente mais elevada de anticorpos
antifosfoliacutepide aCL e anti-β2GPI em pacientes com hanseniacutease enquanto
anticorpos AAN e aCL foram detectados com mais frequumlecircncia nos pacientes com
leishmaniose visceral A incidecircncia aumentada de anticorpos AAN e aCL nos
pacientes com leishmaniose visceral eacute compatiacutevel com outros estudos (OSSADRON
et al 2006 SAKKAS et al 2008 VOULGARI et al 2004) e demonstra
semelhanccedilas das manifestaccedilotildees cliacutenicas e laboratoriais entre a leishmaniose
visceral e o luacutepus eritematoso sistecircmico (LES) Aleacutem disso a reatividade cruzada
entre AAN e anticorpos anti-Leishmania jaacute foi tambeacutem relatada (GRANEL et al
2000)
Diversos grupos documentaram niacuteveis elevados de anticorpos
antifosfoliacutepide (aCL anti-β2GPI e anti-protrombina) em diversas doenccedilas
infecciosas como a siacutefilis doenccedilas virais (incluindo a hepatite C Parvoviacuterus B19 e
HIV) malaacuteria e hanseniacutease sem as manifestaccedilotildees cliacutenicas da siacutendrome
antifosfoliacutepide (SAF) (ZANDMAN-GODDARD BLANK SHOENFELD 2002) Os
tiacutetulos elevados geralmente satildeo transitoacuterios diminuindo e desaparecendo apoacutes a
resoluccedilatildeo da infecccedilatildeo (LOIZOU et al 2003 ZANDMAN-GODDARD BLANK
SHOENFELD 2002) Mas em uma minoria dos pacientes a associaccedilatildeo entre
doenccedilas infecciosas e anticorpos antifosfoliacutepide pode levar a complicaccedilotildees severas
frequumlentemente fatais ou seja SAF catastroacutefica (ZANDMAN-GODDARD BLANK
SHOENFELD 2002)
Os resultados de Ribeiro e Proietti (2005) mostrando um aumento da
incidecircncia de anticorpos anti-β2-GPI em pacientes com hanseniacutease associados aos
dados de outros grupos (De LARANAGA et al 2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK
et al 1994 LOIZOU et al 2003) que tambeacutem documentaram niacuteveis elevados de
anticorpos anti-2βGPI lanccedilam duacutevidas sobre a noccedilatildeo de que os anticorpos aCL
associados a infecccedilotildees satildeo independentes dos anticorpos anti-β2GPI e natildeo
dependentes desses anticorpos como nas doenccedilas auto-imunes Em conjunto
30
esses resultados apoacuteiam a noccedilatildeo de que na presenccedila de infecccedilotildees anticorpos aCL
satildeo heterogecircneos em relaccedilatildeo agrave sua dependecircncia da 2GPI (De LARANAGA et al
2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK et al 1994 LOIZOU et al 2003) e as infecccedilotildees
podem desencadear a induccedilatildeo de anticorpos antifosfoliacutepide patogecircnicos em
indiviacuteduos predispostos (LOIZOU et al 2003)
A produccedilatildeo de autoanticorpos na hanseniacutease e leishmaniose pode ser
explicada por diversos mecanismos Na forma mais generalizada dessas doenccedilas
(hanseniacutease VV e leishmaniose visceral) os pacientes apresentam
hipergamaglobulinemia difusa semelhante agrave vista em outras infecccedilotildees como
Schistosoma mansoni T cruzi e Plasmodium A induccedilatildeo de autoanticorpos pode ser
atribuiacuteda agrave ativaccedilatildeo policlonal e proliferaccedilatildeo das ceacutelulas B algumas com auto-
reatividade pertencentes agrave biblioteca de anticorpos naturais em indiviacuteduos normais
(ARGOV et al 1989) Na leishmaniose antiacutegenos soluacuteveis derivados da L major e
L donovani satildeo mitogecircnicos e desencadeiam a produccedilatildeo de imunoglobulinas com
auto-reatividade (ARGOV et al 1989) Crioglobulinemia mista induzida pelo HCV eacute
outro exemplo de ativaccedilatildeo policlonal persistente levando a uma mistura de
autoanticorpos policlonais e monoclonais os quais causam doenccedilas auto-imunes
(AGMON-LEVIN et al 2009)
Mimetismo molecular ou homologias estruturais entre infecccedilotildees e
componentes do hospedeiro podem ser agrave base da produccedilatildeo de autoanticorpos
como no caso da febre reumaacutetica onde o componente M da membrana do
estreptococo apresenta homologia com peptiacutedeos cardiacuteacos cerebrais e sinoviais A
associaccedilatildeo da siacutendrome de Guillain-Barreacute com a infecccedilatildeo pelo Campylobacter
jejeuni representa outro exemplo de mimetismo molecular como base de uma
manifestaccedilatildeo auto-imune A reatividade cruzada entre agentes infecciosos e auto-
antiacutegenos jaacute foi demonstrada para o M leprae (McADAM MUDD SHOENFELD
1984) e M tuberculosis (SHOENFELD et al 1986) e a inibiccedilatildeo de anticorpos anti-
Sm anti-RNP e anti-SSB por promastigotas intactas de Leishmania apoacuteia a
homologia entre antiacutegenos nucleares e a Leishmania (ARGOV et al 1989)
A disseminaccedilatildeo de epiacutetopos a emergecircncia de novos anticorpos ou a
resposta de ceacutelulas T a um novo epiacutetopo (subdominante ou criacuteptico) no mesmo
antiacutegeno ou em outro antiacutegeno foi demonstrada em modelos experimentais e na
doenccedila humana alguns autores demonstraram a disseminaccedilatildeo molecular do
antiacutegeno Sm para reatividade anti-RNP (STAUB 1998) no LES enquanto na febre
31
reumaacutetica o estado de autoimunidade crocircnica que afeta as vaacutelvulas cardiacuteacas pode
resultar em uma resposta imunoloacutegica contra o colaacutegeno e laminina (KIVITY et al
2009 PORDEUS et al 2008) As infecccedilotildees tambeacutem podem desempenhar um papel
importante na induccedilatildeo da autoimunidade atraveacutes da liberaccedilatildeo de antiacutegenos
sequumlestrados apoacutes lesatildeo tecidual ou aumentando a exibiccedilatildeo de epiacutetopos criacutepticos
no meio inflamatoacuterio apresentando assim novos antiacutegenos ao sistema imunoloacutegico
(KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)
15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES
AGUDAS VIRAIS
O conceito de auto-imunidade induzida por viacuterus natildeo eacute exclusivo para
doenccedilas hepaacuteticas O viacuterus Coxsackie do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um
terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite infecciosa e estaacute implicado nas miocardites
auto-imunes reagindo contra a miosina cardiacuteaca (GIST BELL 1974) Niwa et al
(1984) encontraram elevaccedilatildeo transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator
reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas
virais comuns como varicela sarampo influenza caxumba herpes zoster e
exantema suacutebito
A patogecircnia da infecccedilatildeo viral inclui pelo menos trecircs tipos de interaccedilotildees
com o hospedeiro vertebrado 1) o efeito do agente sobre as ceacutelulas 2) a maneira
de disseminaccedilatildeo do agente no organismo infectado 3) a resposta imunoloacutegica e a
sua influencia no processo infeccioso Destacam-se dois tipos principais da
interaccedilatildeo a destruiccedilatildeo celular e a resposta imunoloacutegica (FIGUEIREDO 1999
CATALAN-SOARES PROIETTI CARNEIRO-PROIETTI 2006) O viacuterus Coxsackie
do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite
infecciosa e estaacute implicado nas miocardites auto-imunes reagindo contra a miosina
cardiacuteaca (GERSHON KONDO 1971) Niwa et al (1984) encontraram elevaccedilatildeo
transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo
anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas virais comuns como varicela sarampo
influenza caxumba herpes zoster e exantema suacutebito
32
16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN
De acordo com o II Consenso Brasileiro de FAN em HEp 2
(DELLAVANCE et al 2003) os AAN satildeo encontrados comumente em uma
variedade de doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Satildeo uacuteteis na investigaccedilatildeo dessas
doenccedilas auxiliando no diagnoacutestico de patologias como LES esclerose sistecircmica
progressiva (ESP) doenccedila mista do tecido conjuntivo (DMTC) siacutendrome de Sjoumlgren
(SS) polimiosite e dermatomiosite
Eles podem estar presentes em um pequeno percentual da populaccedilatildeo
aparentemente sadia essa frequumlecircncia eacute maior em mulheres e aumenta com a idade
Segundo a literatura a positividade entre 20 a 60 anos varia entre percentuais mais
altos (133) para tiacutetulos baixos e mais baixos (33) para tiacutetulos mais elevados
(DELLAVANCE et al 2003)
A pesquisa dos anticorpos antinucleares pode ser realizada por diferentes
teacutecnicas a imunofluorescecircncia indireta eacute a mais utilizada por sua sensibilidade
reprodutibilidade e facilidade de execuccedilatildeo A sensibilidade aumenta
significativamente quando se utiliza como substrato lacircminas com ceacutelulas Hep 2
(ceacutelulas de carcinoma de laringe humana) por causa da maior expressatildeo de
antiacutegenos na superfiacutecie dessas ceacutelulas comparados aos expressos nas ceacutelulas de
fiacutegado ou de rins de camundongos que se utilizavam anteriormente
Em geral eacute possiacutevel detectar melhor a presenccedila de AAN por associaccedilatildeo
de trecircs anti-soros isotipos especiacuteficos (anti-IgG anti-IgA e anti-IgM) A pesquisa
realizada por essa teacutecnica serve de triagem inicial para a presenccedila de AAN Eacute
normalmente denominada pesquisa de FAN ou AAN
A realizaccedilatildeo de outras metodologias tais como as imunoenzimaacuteticas
permite uma avaliaccedilatildeo isolada dos diferentes auto-anticorpos sugeridos pelos
padrotildees de fluorescecircncia encontrados no FAN A identificaccedilatildeo desses AAN permite
um diagnoacutestico mais preciso e eles podem ser utilizados em muitos casos como
marcador para uma das diferentes doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Muitas dessas
patologias apresentam um perfil distinto de auto-anticorpos que auxilia o diagnoacutestico
A presenccedila de FAN positivo em pessoas aparentemente sadias pode ser
devida a algumas situaccedilotildees
minus Doenccedila auto-imune precoce ainda natildeo expressa clinicamente
33
minus distuacuterbio imunoloacutegico transitoacuterio causado por doenccedila natildeo-imune
tais como infecccedilotildees principalmente virais
minus uso de medicamentos e neoplasias
minus manifestaccedilatildeo incompleta de uma siacutendrome ou seja o paciente
sintetiza o anticorpo poreacutem esse quadro natildeo evolui para doenccedila
minus fenocircmeno auto-imune fisioloacutegico
O resultado do FAN eacute expresso em tiacutetulo e padratildeo uma vez que ambos
os paracircmetros tecircm importacircncia para a avaliaccedilatildeo do significado cliacutenico do exame O
tiacutetulo do FAN corresponde agrave maior diluiccedilatildeo capaz de demonstrar fluorescecircncia
inequiacutevoca e didaticamente pode ser dividido em
minus Baixo menor 180
minus Moderado 1160
minus Moderadamente elevado 1320
minus Alto maior 1640
Nas pesquisas realizadas por imunofluorescecircncia indireta os resultados
satildeo expressos em tiacutetulos segundo as diluiccedilotildees empregadas Eacute possiacutevel trabalhar
utilizando-se como limite tiacutetulos de 140 que permitem maior sensibilidade ou de
180 que permitem maior especificidade ou seja um menor nuacutemero de falso-
positivos
Na praacutetica cliacutenica satildeo considerados significativos tiacutetulos superiores a
1160 Os resultados com tiacutetulos positivos satildeo acompanhados pela descriccedilatildeo do
padratildeo de fluorescecircncia encontrado que serve como orientaccedilatildeo da presenccedila de um
antiacutegeno especiacutefico e em alguns casos como padratildeo diagnoacutestico Em determinadas
situaccedilotildees em especial no LES em atividade pode ocorrer agrave observaccedilatildeo de mais de
um padratildeo de fluorescecircncia
O padratildeo do FAN a seu turno aponta uma probabilidade maior ou menor
de doenccedila auto-imune e ateacute mesmo sugere o antiacutegeno nuclear envolvido e por
consequumlecircncia a afecccedilatildeo com ele mais relacionada Os padrotildees homogecircneo
centromeacuterico e pontilhado grosso satildeo os mais indicativos de processos de
autoimunidade uma vez que se associam a diversas condiccedilotildees reumaacuteticas
especialmente ao LES e agrave esclerose sistecircmica e tambeacutem a enfermidades hepaacuteticas
tais como a cirrose biliar primaacuteria e a hepatite auto-imune (KILLENBERG 2000)
34
Jaacute o pontilhado fino o pontilhado grosso reticulado e a membrana nuclear
tecircm maior significado quando encontrados em tiacutetulos altos uma vez que podem
estar presentes em tiacutetulos baixos em indiviacuteduos hiacutegidos Por sua vez o pontilhado
fino denso mesmo quando elevado em pessoas assintomaacuteticas soacute guarda relaccedilatildeo
com alguma doenccedila em cerca de 20 dos casos (DELLAVANCE et al 2003)
O padratildeo pontilhado pode tambeacutem ser referido como padratildeo salpicado
Outros padrotildees de fluorescecircncia podem ser encontrados em menor frequumlecircncia Os
pontilhados citoplasmaacutetico grossos ou reticulares associados agrave presenccedila de
anticorpos antimitococircndrias em pacientes com cirrose biliar primaacuteria o
citoplasmaacutetico homogecircneo relacionado a proteiacutenas ribossocircmicas em pacientes com
LES e o padratildeo pontilhado fino citoplasmaacutetico que pode estar associado agrave
presenccedila de anticorpos anti-JO-1 anti-PCNA e proteiacutenas da membrana celular em
pacientes com LES outras patologias do tecido conjuntivo e hepatopatias auto-
imunes (DELLAVANCE et al 2003)
Quadro 1 - Padrotildees de fluorescecircncia encontrados em maior frequumlecircncia e patologias relacionadas
Padrotildees de Fluorececircncia Antiacutegenos Patologias Relacionadas
Perifeacuterico DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES
Homogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA
LES AR lupus induzido por drogas
Perifeacutericohomogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES
Pontilhado grosso SM RNP LES DMTC
Pontilhado fino nuclear SS-A (RO) SS-B (La) SS LES
Nucleolar Proteiacutenas Nucleolares ESP Centromeacuterico Proteiacutenas de centrocircmeros Siacutendrome de CREST
Fonte Dellavance et al 2003 Quadro 2 - Anti-ena - auto-anticorpos contra antiacutegenos extraiacutedos do nuacutecleo e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleares Patologias Relacionadas SM LES RNP DMTC LES ESP AR e Polimiosite
SS-A (Ro) SS LES lupus neonatal e forma cutacircnea subaguda
SS-B (La) SS LES luacutepus neonatal e forma cutacircnea subaguda
Scl 70 ESP Jo -1 Polimiosite e dermatomiosite Fonte Dellavance et al 2003
35
Quadro 3 ndash Padrotildees de FAN nuclear e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes
Padrotildees Nucleares Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos
Nuclear Pontilhado Centromeacuterico Anticorpo anti-centrocircmero Esclerose Sistecircmica forma CREST Cirrose Biliar Primaacuteria
Nuclear homogecircneo Anticorpo anti-DNA nativo Lupus Eritematoso Sistecircmico (LES) Anticorpo anti-Histoma LES induzido por drogas LES idiopaacutetico Anticorpo anti-cromatina (DNAHistona Nucleossomo) Artrite Reumatoacuteide (AR) Artrite Idiopaacutetica Juvenil importante associaccedilatildeo com uveiacutete na forma oligoarticular Siacutendrome de Felty Cirrose Billar Primaacuteria
Nuclear tipo membrana nuclear contiacutenua Anticorpo anti-Iamin e contra envelope nuclear - Iamins Hepatites auto-imunes Raramente associado a doenccedilas reumaacuteticas (algumas formas de LES e esclerodermia linear)
Nuclear pontilhado pleomoacuterficoPCNA Anticorpo contra nuacutecleo de ceacutelulas em proliferaccedilatildeo LES
Nuclear pontilhado fino denso Anticorpo anti-proteina p 75 kDa pode ser encontrado em indiviacuteduos saudaacuteveis processos inflamatoacuterios inespeciacuteficos doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Cistite Intersticial Dermatite Atoacutepica Psoriacutease e Asma
Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos
Anticorpo anti-p80 coilina natildeo apresenta associaccedilatildeo cliacutenica definida
Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos
Anticorpo anti-Sp100 (anti-p95) Cirrose Biliar Primaacuteria pode ocorrer em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas
Nuclear pontilhado grosso Anticorpo anti-Sm LES Anticorpo anti-RNP criteacuterio obrigatoacuterio no diagnostico da doenccedila mista do Tecido conjuntivo (DMTC) tambeacutem ocorre no LES Esclerose Sistecircmica (ES) e AR
Nuclear pontilhado fino Anticorpo anti SSARo Siacutendrome de Sjogren Primaacuteria (SS) LES Lupus neonatal e Lupus Cutacircneo Subagudo Anticorpo anti-SSBLa Lupus neonatal LES SS Anticorpo anti-Mi-2 Dermatomiosite embora raramente ocorra na polimiosite do adulto
Fonte Dellavance et al 2003
36
Quadro 4 - Padrotildees de FAN citoplasmaacuteticos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes
Padrotildees Citoplasmaacuteticos e Relacionados ao Aparelho Mitoacutetico Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos
Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina Hepatite auto-imune Cirrose Anticorpo anti-miosine Hepatite C Hepatocarcionoma Miastenia Gravis Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida
Citoplasmaacutetico Fibrilar Segmentar Anti actinina anti--vinculina e anti-tropomiose Miastenia Gravis Doenccedila de Crohn e Colite ulcerativa Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia cliacutenica definida
Citoplasmaacutetico Pontilhado Polar Anticorpo Anti-golginas (cisternas do aparelho de Golgi) raro no LES SS e outras doenccedilas auto-imunes sistecircmicas Relato na Ataxia Cerebelar Idiopaacutetica Degeneraccedilatildeo Cerebelar Paraneoplaacutesica infecccedilotildees virais pelo Epstein Barr (EBV) e pelo viacuterus da imunodeficiecircncia Humana (HIV) Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida
Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Anticorpo anti-Histidill t RNA sintetase (Jo-1) anticorpo marcador de Polimiosite no adulto Descrito raramente na Dermatomiosite
Citoplasmaacutetico Pontilhado com Pontos Isolados
Anticorpo anti-EEA1 e anti-fosfatidilserina natildeo haacute associaccedilotildees clinicas bem definida Anticorpo anti-GWBSS tambeacutem encontrado em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas
Citoplasmaacutetico Pontilhado Reticulado Anticorpo anti-mitococircndria Cirrose Biliar Primaacuteria Esclerose Sistecircmica Eacute relativamente comum o encontro deste padratildeo na ausecircncia de anticorpos anti-mitococircndria
Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Denso Anti PL7PL12 Raramente associado a Polimiosite Anticorpo P-ribossomal Este padratildeo ocorre no LES se a associaccedilatildeo eacute com anti-proteina P ribossomal
Citoplasmaacutetico Fibrilar Filamentar Anticorpo anti-vimentina e anti-queratina Anti-queratina eacute o anticorpo mais importante em doenccedila hepaacutetica alcooacutelica Descritos em vaacuterias doenccedilas inflamatoacuterias e infecciosas Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida
Aparelho mitoacutetico Tipo Centriacuteolo Anticorpo anti-enolase em baixos tiacutetulos natildeo tem associaccedilatildeo cliacutenica definida Em altos tiacutetulos eacute sugestivo de Esclerose Sistecircmica
Aparelho mitoacutetico Tipo ponte Intercelular
Anticorpo anti Tubulina Pode ser encontrado no LES e na DMTC outros anticorpos ainda natildeo bem definidos podem gerar o mesmo padratildeo
Aparelho mitoacutetico Tipo NuMa2 Anticorpo anti-HsEg5 diversas condiccedilotildees auto-imunes com baixa especificidade
Fonte Dellavance et al 2003
37
Quadro 5 - Padrotildees de FAN mistos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Mistos Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos
Misto do tipo nucleolar homogecircneo e nuclear pontilhado grosso com placa metafaacutesica decorada em anel (cromossomos negativos)
Anticorpo anti-Ku Superposiccedilatildeo Polimiose e Esclerose Sistecircmica Podem ocorrer no LES e Esclerodermia
Misto do tipo nuclear e nucleolar pontilhado com placa metafaacutesica positiva
Anticorpo anti-topoisomerase (Scl-70) ES forma difusa Mais raramente pode ocorrer na Siacutendrome CREST e superposiccedilatildeo PolimiositeEsclerodermia
Misto do tipo Citoplasmaacutetico pontilhado fino denso e homogecircneo e nucleolar homogecircneo
Anticorpo anti rRNP LES frequumlentemente relacionado agrave Psicose Luacutepica
Misto do tipo nuclear pontilhado fino com fluorescecircncia do aparelho mitoacutetico
Anticorpo anti-NuMA1SS pode ocorrer tambeacutem em outras condiccedilotildees auto-imunes ou inflamatoacuterias crocircnicas
Fonte Dellavance et al 2003
Quadro 6 - Padrotildees de FAN nucleolares e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleolares Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos
Nucleolar Aglomerado
Anticorpo anti-Fibrilarina (U3-nRNP) Esclerose Sistecircmica (ES) especialmente com comprometimento visceral grave entre eles a hipertensatildeo pulmonar
Nucleolar Pontilhado
Anticorpo anti-NOR-90 ES tambeacutem descrito em outras doenccedilas do tecido conjuntivo poreacutem sem relevacircncia clinica definida Anticorpos anti-RNA polimerase I ES de forma difusa com tendecircncia para comprometimento visceral mais frequumlente e grave
Nucleolar Homogecircneo
Anticorpo anti-PMScl Siacutendrome de Superposiccedilatildeo de Polimiosite com Esclerose Sistecircmica Raramente encontrado em casos de Polimiosite ou Esclerose Sistecircmica sem superposiccedilatildeo cliacutenica Outros auto-anticorpos mais raros podem apresentar esse padratildeo
Fonte Dellavance et al 2003
De acordo com o 3deg Consenso (DELLAVANCE et al 2009) foram
comunicados dois novos padrotildees de fluorescecircncia por participantes Vaacuterios outros
membros testemunharam jaacute haver observado esses padrotildees O primeiro trata-se de
um padratildeo nuclear pontilhado fino aproximando-se da textura homogecircnea e com
placa metafaacutesica corada da mesma forma Sua associaccedilatildeo cliacutenica e identidade
imunoloacutegica natildeo estatildeo definidas Sua importacircncia deriva do fato de que pode ser
facilmente confundido com o padratildeo pontilhado fino denso e com o padratildeo
homogecircneo O segundo trata-se de um padratildeo citoplasmaacutetico em forma de
pequenos bastotildees (rods) e ciacuterculos (rings) que aparentemente estaacute associado agrave
38
infecccedilatildeo pelo HCV Haacute estudos em curso por alguns grupos de pesquisa com a
finalidade de estabelecer sua identidade imunoloacutegica
Como ainda natildeo estatildeo definitivamente caracterizados esses dois novos
padrotildees foram considerados preliminares e o 3deg Consenso recomendou que os
mesmos fossem completamente caracterizados e apresentados na proacutexima versatildeo
do Consenso (DELLAVANCE et al 2009)
39
2 JUSTIFICATIVA
As inflamaccedilotildees do fiacutegado provocadas pelos viacuterus hepatotroacutepicos atingem
milhotildees de pessoas e representam significativos problemas de sauacutede puacuteblica em
todo o mundo No Brasil a Regiatildeo Norte responde por um significativo percentual
dos portadores de hepatite C Dentre as manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo
pelo viacuterus C as doenccedilas autoimunes tecircm significativo impacto na evoluccedilatildeo cliacutenica
desses pacientes A presenccedila de anticorpo antinuacutecleo eacute um marcador importante de
autoimunidade e apesar de existirem trabalhos relatando a pesquisa desse fator em
portadores de viacuterus C tais estudos ainda natildeo foram realizados na nossa regiatildeo
sobretudo correlacionando-se com o genoacutetipo do viacuterus responsaacutevel pela infecccedilatildeo
considerando que o genoacutetipo eacute um marcador de resposta ao tratamento ou
considerando que pacientes portadores do genoacutetipo 1 natildeo respondem
satisfatoriamente ao tratamento instituiacutedo pelo protocolo atual
21 ASPECTOS EacuteTICOS
A pesquisa a ser realizada apresenta relevacircncia social e natildeo perde o
sentido de sua destinaccedilatildeo soacutecio-humanitaacuteria (justiccedila e equidade)
Este trabalho adequa-se aos princiacutepios cientiacuteficos que o justificam e
apresenta possibilidade concreta de responder a incertezas tais como FAN e o
genoacutetipo viral em pacientes com infecccedilatildeo pelo viacuterus da hepatite C ldquoestatildeo
relacionadosrdquo
Segue rigorosamente os procedimentos descritos na Resoluccedilatildeo 19696-
CNSMS (BRASIL 1996) assegurando a confidenciabilidade e proteccedilatildeo da
identidade do sujeito da pesquisa no momento da afericcedilatildeo dos dados e sua
posterior utilizaccedilatildeo
Por tratar-se de um estudo que faraacute somente revisatildeo de soroteca os
participantes natildeo seratildeo submetidos a riscos de origem orgacircnica eou quiacutemica
40
3 OBJETIVOS
31 OBJETIVO GERAL
Estabelecer associaccedilatildeo entre a presenccedila de teste de FAN e o genoacutetipo
viral em pacientes portadores de infecccedilatildeo pelo HCV
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
I Identificar o padratildeo de fluorescecircncia do FAN em pacientes com diagnoacutestico
laboratorial de infecccedilatildeo pelo HCV
II Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados
pelo HCV de acordo com o gecircnero e a idade
III Identificar a prevalecircncia de FAN em pacientes infectados pelo HCV e natildeo
infectados
IV Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados
pelo HCV de acordo com as alteraccedilotildees bioquiacutemicas
41
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO)
Foi realizado um estudo transversal analiacutetico no Serviccedilo do Nuacutecleo de
Medicina Tropical da Universidade Federal do Paraacute (NMTUFPA) utilizando-se
pacientes oriundos da Fundaccedilatildeo Centro de Hemoterapia e Hematologia do Paraacute
(HEMOPA) e Plano de Assistecircncia ao Servidor (PASIASEP) com coleta de material
bioloacutegico para reconfirmaccedilatildeo do diagnoacutestico de hepatite C no periacuteodo de janeiro de
2009 a maio de 2010
411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C
A populaccedilatildeo de estudo consistiu de 51 pacientes admitidos no NMTUFPA
para reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica tratamento cliacutenico e acompanhamento ambulatorial
de ambos os gecircneros e independente da idade sem exclusatildeo dos pacientes com a
presenccedila de patologias associadas agrave condiccedilatildeo maior (motivadora da pesquisa)
oriundos da Fundaccedilatildeo HEMOPA e PAS
A amostra do grupo foi selecionada a partir da relaccedilatildeo dos prontuaacuterios
catalogados no laboratoacuterio de patologia do NMTUFPA
Os dados foram coletados atraveacutes dos resultados dos exames realizados
no soro de cada paciente O protocolo de coleta teve enfoque na identificaccedilatildeo
individual do paciente bem como a avaliaccedilatildeo cliacutenica dos resultados
412 Grupo de natildeo infectados
Foi utilizado um grupo controle de 100 amostras de soro de indiviacuteduos
doadores de sangue com sorologias negativas para HIV 1 e 2 HTLV 1 e 2 Siacutefilis
Doenccedilas de Chagas Hepatite B e para Hepatite C procedentes da fundaccedilatildeo
HEMOPA
42
42 MEacuteTODO
421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico
Foram colhidos em frasco sem anticoagulante 10ml de sangue perifeacuterico
dos 51 pacientes participantes da pesquisa A amostra sanguiacutenea de cada paciente
foi centrifugada o soro foi separado e colocado em frasco esteacuteril devidamente
identificado armazenado e resfriado de 2 a 8ordmC
Foi realizada no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais a
pesquisa soroloacutegica de anticorpos IgG anti-HCV por teste imunoenzimaacutetico (ELISA)
e os pacientes que apresentaram positividade tiveram seus resultados confirmados
atraveacutes de teacutecnicas moleculares (RT-PCR) e com identificaccedilatildeo do genoacutetipo viral
(genotipagem)
Foi realizado no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa a pesquisa
de FAN dos 51 pacientes selecionados utilizando as amostras existentes na
soroteca
422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C
Foram empregados testes soroloacutegicos de ELISA (Ensaio
Imunoenzimaacutetico) de 3ordf geraccedilatildeo utilizando-se de kits comerciais (kit ETI-AB-HCVK-
4 DiaSorin Itaacutelia) para detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos anti-HCV no soro dos
pacientes
As tiras (poccedilos) necessaacuterias para as reaccedilotildees foram retiradas da geladeira
com antecedecircncia de uma hora e deixadas agrave temperatura ambiente e os reagentes
homogeneizados rapidamente no voacutertex
O primeiro poccedilo da placa ficou o branco da reaccedilatildeo na sequecircncia da
microplaca de ELISA foi dispensado 200 microL do controle negativo em triplicata (trecircs
poccedilos) 200 microL do calibrador em duplicata (dois poccedilos) e 200 microL do controle positivo
em amostra uacutenica (um poccedilo)
Adicionou-se 200 microL do Diluente de Amostra em todos os poccedilos que
continham as amostras dos pacientes a serem dosadas na placa de ELISA
tomando cuidado para natildeo contaminar os poccedilos adjacentes
43
Dispensou-se 50 microL do Diluente do Reagente em todos os poccedilos de
controles calibradores e amostras cobrimos com adesivo para evitar evaporaccedilatildeo e
contaminaccedilatildeo das amostras e incubamos a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC
Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com
300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem diluiacuteda
Pipetou-se 100 microL de Conjugado Enzimaacutetico exceto no poccedilo do branco e
incubou-se a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se
cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com 300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem
diluiacuteda
Pipetou-se 100 microL de CromoacutegenoSubstrato em todos os poccedilos
Incubamos a microplaca protegendo-a de luz intensa e direta agrave temperatura
ambiente (18-24ordmC) por 15 min
Pipetou-se 100 microL de Aacutecido Sulfuacuterico em todos os poccedilos para ldquopararrdquo a
reaccedilatildeo enzimaacutetica e mediu-se a absorbacircncia da soluccedilatildeo obtida em leitor de ELISA
com filtro de 450 nM
O teste foi validado de acordo com os valores do controle de qualidade
preconizados pelo fabricante e que devem tanger os valores para o branco da
reaccedilatildeo le 0100 controle negativo le 0050 controle positivo ge 1000 e calibrador ge
1100 Para as amostras testadas os valores reagentes e natildeo reagentes para
pesquisa de anticorpos anti-HCV satildeo interpretados da seguinte maneira natildeo
reagentes com valores le 09 reagentes com valores ge 11 e indeterminados entre
os valores 09 ndash 11
423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia molecular
Nas amostras positivas pela sorologia (ELISA) realizou-se extraccedilatildeo do
RNA viral presente no soro do paciente utilizando kit comercial (QIAmp Viral RNA
kit Quiagen Alemanha) seguindo a teacutecnica adaptada no Laboratoacuterio de Patologia
Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais
Pipetou-se 560 microL de tampatildeo AVL (lise) contendo RNA em tubo de
centriacutefuga de 15 ml identificado adicionou-se 140 microL da amostra e homogenizou-se
em voacutertex por 15s incubando a temperatura ambiente (15-25degC) por 10 min Apoacutes
incubaccedilatildeo centrifugou-se rapidamente o tubo para remover partiacuteculas dispersas
44
Adicionou-se 560 microL de etanol (96-100) na amostra e homogenizou-se
no voacutertex por 15s centrifugando-se rapidamente para remover partiacuteculas dispersas
Depois cuidadosamente transferiu-se 630 microL para as colunas devidamente
identificadas centrifugou-se a 14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo
ficando soacute com a coluna para encaixar em outro tubo
Colocou-se o resto das amostras nas colunas devidas centrifugou-se a
14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo ficando soacute com a coluna para
encaixar em outro tubo Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW1) e
centrifugou-se por 1 min mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo
Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW2) e centrifugou-se por 4 min
mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo
Identificados os tubos para RNA colocou-se as colunas Adicionou-se 60
microL de tampatildeo para eluir (AVE) em cada amostra e centrifugou-se por 1 min
descartando a coluna e ficando com o tubo Colocou-se em banho-maria por 10 min
a 65degC centrifugado rapidamente e colocado no gelo As amostras extraiacutedas foram
congeladas e armazenadas em freezer a -20ordmC
O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado de acordo com a teacutecnica de
RT-PCR qualitativa com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das
Doenccedilas Tropicais da seguinte maneira para o Mix de uma amostra Tampatildeo 12
microL primer ou iniciador k10 1microL primer ou iniciador k11 1microL aacutegua ultrapura livre de
DNAse e RNAse 5 microL Enzima Taq polymerase One-Step (Invitrogen) 1 microL O
primer k10 constitui-se da sequecircncia GGC GAC ACT CCA CCA TRR e o primer k11
da sequecircncia GGT GCA CGG TCT ACG AGA CC
O volume do mix por amostra eacute de 20 microL e o volume da amostra (produto
da extraccedilatildeo) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As amostras
foram colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo eacute realizada a 42ordmC por 45 minutos
temperatura inicial de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 2 minutos seguida de 35 ciclos com
temperatura de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 54ordmC por 30
segundos de extensatildeo a 72ordmC por 45 segundos e temperatura de extensatildeo final de
72ordmC por 7 minutos e um hold de 4ordmC
Para visualizaccedilatildeo do produto dessa 1ordf PCR (RT-PCR) eacute feito um gel de
agarose a 1 (1g de agarose para 100mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de
etidium) que migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os
resultados foram visualizados atraveacutes de luz ultravioleta (UV) Os pacientes
45
positivos que apresentarem ldquobandardquo devem continuar os procedimentos e os
negativos que natildeo apresentarem ldquobandasrdquo deveratildeo ser liberados como
indetectaacuteveis por este meacutetodo
A 2ordf PCR (RFLP) foi responsaacutevel por fazer a amplificaccedilatildeo do cDNA
produto da 1ordf PCR Para esta etapa tambeacutem com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio
de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais foram necessaacuterios para o Mix de uma
amostra Tampatildeo 10X 25 microL DNTP 4 microL MgCl2 15 microL primer ou iniciador k15 1
microL primer ou iniciador k16 1 microL aacutegua ultrapura livre de DNAse e RNAse 125 microL
Enzima Taq platinum (Invitrogen) 05 microL O primer k15 constitui-se da sequecircncia
ACC ATR RAT CAC TCC CCT GT e o primer k16 da sequecircncia CAA GCA CCC TAT
CAG GCA GT
O volume do mix por amostra foi de 23 microL e o volume da amostra
(produto da 1ordf PCR) de 2 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As
amostras satildeo colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo se realiza a temperatura inicial
de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 4 minutos seguida de 35 ciclos com temperatura de
desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 55ordmC por 45 segundos de
extensatildeo a 72ordmC por 1 minuto e temperatura de extensatildeo final de 72ordmC por 7
minutos e um hold de 4ordmC
O produto da 2ordf PCR eacute observado atraveacutes de um gel de agarose a 1 (1g
de agarose para 100 mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que
migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os resultados
foram visualizados atraveacutes de luz UV (ultravioleta) Os pacientes positivos que
apresentaram ldquobandardquo (fragmento amplificado) se continuou os procedimentos e os
negativos que natildeo apresentaram ldquobandasrdquo foram repetidos para o procedimento da
2ordf PCR
424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem)
Os pacientes positivos para a 2ordf PCR foram submetidos agrave genotipagem
do viacuterus atraveacutes do meacutetodo de RFLP utilizando um par de enzimas de restriccedilatildeo
AVA II e RSA I Essa teacutecnica tambeacutem foi adaptada no Laboratoacuterio de Patologia
Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais
46
Na determinaccedilatildeo do genoacutetipo cada amostra eacute utilizada duas vezes
sendo uma reaccedilatildeo para AVA II e uma para RSA I portanto cada amostra teve dois
tubos correspondentes
Para a preparaccedilatildeo do mix de uma amostra para a enzima de restriccedilatildeo
AVA II (Promega) foram utilizados Buffer C X 30 2 microL aacutegua ultrapura livre de
DNAse e RNAse 125 microL AVA II 05 microL Para o mix de uma amostra de RSA I
(Invitrogen) satildeo necessaacuterios React 1 10X 2 microL aacutegua ultrapura libre de DNAse e
RNAse 11 microL RSA I 2 microL
O volume do mix por amostra foi de 15 microL e o volume da amostra
(produto da 2ordf PCR) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 20 microL para
cada frasco correspondente a sua enzima de restriccedilatildeo As amostras formatildeo ldquoparesrdquo
de tubos AVA II e RSA I e satildeo colocadas em banho-maria a 37ordmC overnight para
digerir (cortar) os fragmentos
Para visualizaccedilatildeo do produto da digestatildeo (RFLP) e verificaccedilatildeo dos
genoacutetipos foi preparado um gel de agarose a 2 (2g de agarose para 100 mL de
tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que migrou em cuba de eletroforese
com 100V 500A por 60 minutos Os resultados foram visualizados atraveacutes de luz UV
(ultravioleta) Os pacientes positivos apresentam ldquobandasrdquo (fragmentos) de
tamanhos diferentes O nuacutemero de bandas e sua disposiccedilatildeo no gel formaram
padrotildees de combinaccedilotildees correspondentes a cada genoacutetipo viral
425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas HEp-2
A pesquisa de auto-anticorpo contra antiacutegenos celulares foi realizada no
Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa pela teacutecnica de imunofluorescecircncia
indireta que os identifica atraveacutes da ligaccedilatildeo destes auto-anticorpos aos antiacutegenos do
substrato sendo esta ligaccedilatildeo revelada pela adiccedilatildeo de um soro com atividade Anti-
IgG conjugado agrave fluoresceiacutena
As amostras foram testadas utilizando-se um conjunto diagnoacutestico
comercial Antinuclear Antibody HEp-2 da Hemagen Diagnostics
Na primeira fase da reaccedilatildeo os soros diluiacutedos 140 colocados em contato
com o substrato durante 20 minutos seguido de lavagem com soluccedilatildeo salina
tamponada por 10 minutos Na segunda fase aplicacou-se a substacircncia
47
fluorescente sendo o conjugado diluiacutedo 130 deixando-se por 10 minutos seguida
de nova lavagem de 10 minutos e montagem da lacircmina com glicerina tamponada
Em cada lacircmina foram utilizados controle positivo e controle negativo
A leitura das lacircminas foi realizada em microscoacutepio de imunofluorescecircncia
marca Nikon modelo Eclipse E-200
Os criteacuterios morfoloacutegicos observados durante a leitura foram
a) aspecto da matriz nuclear
b) aspecto do nucleacuteolo
c) observaccedilatildeo de todos os estaacutegios de divisatildeo nuclear
d) aspecto do fuso mitoacutetico
e) aspecto do citoplasma
43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados coletados foram estruturados em um banco de dados no qual
tambeacutem foram confeccionadas tabelas e graacuteficos para representaccedilatildeo dos dados
Posteriormente foram analisados no programa Bioestat 50 para a geraccedilatildeo de
resultados estatiacutesticos que comprovassem a associaccedilatildeo de variaacuteveis pertinentes ao
estudo considerando o intervalo de confianccedila (IC) 95 e niacutevel α 5 (p-valor le 005)
isto eacute um achado seraacute considerado estatisticamente significante se valor de ldquoprdquo for
menor ou igual a 005 e seraacute considerado sem significacircncia estatiacutestica se esse valor
de ldquoprdquo for maior que 005
Nas variaacuteveis quantitativas foram realizadas as medidas de tendecircncia
central sendo calculado a meacutedia e a mediana com seus respectivos desvios
padrotildees O teste t foi usado para comparar as idades entre as amostras
O teste do Qui-quadrado e o teste G foram aplicados nas comparaccedilotildees de
n amostras independentes cujas proporccedilotildees observadas nas diversas modalidades
estiveram dispostas em tabelas de contigecircncia l x c onde se determinou as
proporccedilotildees observadas nas diferentes categorias e se estas tinham alguma
associaccedilatildeo
48
5 RESULTADOS
O Padratildeo de FAN em 100 dos 51 pacientes infectados pelo HCV e em
2 dos natildeo infectados pelo HCV ocorreu Citoplasmaacutetico
Com relaccedilatildeo agrave distribuiccedilatildeo dos pacientes por gecircnero observou-se uma
predominacircncia do gecircnero masculino (667) A faixa etaacuteria predominante foi a de 30
a 50 anos de idade (628) seguida da faixa etaacuteria compreendida entre 51 e 60
anos (196) No que diz respeito agrave naturalidade houve uma predominacircncia de
paraenses em 922 da amostra A maioria dos pacientes incluiacutedos no estudo foi
proveniente da Fundaccedilatildeo HEMOPA (98) por se tratarem de candidatos a doaccedilatildeo
de sangue (Tabela 1)
Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV segundo as caracteriacutesticas demograacuteficas janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Caracteriacutesticas demograacuteficas n Teste estatiacutestico Gecircnero
Masculino 34 667 Qui-quadrado Feminino 17 333 p = 00251
Total 51 1000
Idade (anos) lt 30 6 118 Qui-quadrado
30 a 40 16 314 p = 00094 41 a 50 16 314 51 a 60 10 196
gt 60 3 59 Total 51 1000
Naturalidade
Paraense 47 922 Qui-quadrado Macapaense 1 20 p lt 00001 Maranhense 1 20
Pernambucano 1 20 Gauacutecho 1 20
Total 51 1000
Procedecircncia Qui-quadrado HEMOPA 50 980 p lt 00001
IASEP 1 20 Total 51 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
49
Identificou-se no estudo a predominacircncia do genoacutetipo viral do tipo 1
(882) estando o genoacutetipo 3 presente em 118 dos casos Em 255 dos
pacientes foi observado uma positividade para FAN sendo que todos apresentaram
o padratildeo citoplasmaacutetico (Tabela 2)
Tabela 2 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV conforme os resultados laboratoriais de FAN citoplasmaacutetico e genotipagem janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Exames laboratoriais n Teste estatiacutestico
Genoacutetipo viral - HCV
Tipo 1 45 882 Qui-quadrado
Tipo3 6 118 p lt 00001
Total 51 1000
FAN Qui-quadrado
Positivo (citoplasmaacutetico) 13 255 p = 00008
Negativo 38 745 Total 51 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
Observou-se uma baixa positividade para o FAN tanto no gecircnero
masculino (294) quanto no gecircnero feminino (176) Natildeo houve diferenccedila
estatiacutestica significante entre os gecircneros e a anaacutelise do FAN (p = 05652) Isto eacute
independendo do gecircnero do paciente nada se poderaacute inferir se o mesmo teraacute maior
ou menor chance de possuir um FAN positivo ou negativo (Tabela 3)
Tabela 3 ndash Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
FAN (citoplasmaacutetico)
Gecircnero Teste estatiacutestico
(Teste G) Masculino Feminino
N N
Positivo 10 294 3 176
Negativo 24 706 14 824 p = 05652
Total 34 1000 17 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
Dentre os pacientes infectados o genoacutetipo viral tipo 1 e o tipo 3
predominaram no gecircnero masculino embora natildeo havendo diferenccedila significativa
entre os grupos (p=06376)(Tabela 4)
50
Tabela 4 - Relaccedilatildeo da genotipagem de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Gecircnero
Grupos estudados Teste estatiacutestico
(Teste G) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3
n n Masculino 29 644 5 833 p=06376 Feminino 16 356 1 167
Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa
Na faixa etaacuteria de 30 a 50 anos foi observada uma maior proporccedilatildeo (667)
do genoacutetipo viral do tipo 3 enquanto que para o genoacutetipo tipo 1 foi de 628 natildeo
tendo essa diferenccedila significacircncia estatiacutestica (Tabela 5)
Tabela 5 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e faixa etaacuteria - janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)
Idade (anos) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n
lt 30 04 118 0 00
30 a 40 15 314 3 500 p = 06401
41 a 50 15 314 1 167
51 a 60 08 196 2 333
gt 60 03 59 0 00 Total 45 1000 6 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
A anaacutelise descritiva das idades dos pacientes demonstrou que a meacutedia e
a mediana foi de 43 anos para aqueles com genoacutetipo viral tipo 1 no entanto para o
genoacutetipo viral tipo 3 a meacutedia foi de 44 e a mediana de 42 anos Observou-se que a
idade miacutenima dos pacientes com genoacutetipo viral-HCV do tipo 1 e 3 foi
respectivamente de 20 e 32 anos e a maacutexima foi de 68 e 57 anos perfazendo uma
amplitude total de 48 e 25 anos respectivamente Natildeo houve significacircncia estatiacutestica
entre as idades encontradas nos genoacutetipos 1 e 3 (Tabela 6 )
De acordo com o FAN citoplasmaacutetico a idade miacutenima dos pacientes com
FAN positivo e negativo foi respectivamente de 30 e 20 anos e a maacutexima foi de 53 e
68 anos perfazendo uma amplitude total de 23 e 48 anos respectivamente As
idades meacutedia e mediana foram respectivamente 435 e 46 anos nos pacientes com
o FAN positivo e meacutedia de 43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN
51
negativo Natildeo houve diferenccedila estatisticamente significativa entre as idades
encontradas nos pacientes com FAN positivo e negativo (Tabela 6)
Tabela 6 - Estudo descritivo da idade dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e presenccedila do FAN citoplasmaacutetico janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Grupos Estudados Genoacutetipo viral - HCV Auto anticorpo
Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 FAN (+) FAN (-) IDADE
Tamanho da amostra 45 6 13 38
Idade miacutenima 20 32 30 20
Idade maacutexima 68 57 53 68
Amplitude Total 48 25 23 48
Meacutedia Aritmeacutetica 43 44 435 43
Mediana 43 42 46 42
Desvio Padratildeo 107 93 78 113
Teste t p = 08363 p = 08809 Fonte Protocolo da pesquisa
Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos em que foram analisados AST
ALT ASTALT γ-GT e fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo
semelhantes dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e 3 natildeo
atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos
(Tabela 7)
Tabela 7- Distribuiccedilatildeo dos genoacutetipos dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Paracircmetros bioquiacutemicos
Genoacutetipo viral - HCV Teste estatiacutestico
(Teste t) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3
micro plusmn DP micro plusmn DP
AST 353 plusmn 219 328 plusmn 137 p = 07907
ALT 372 plusmn 321 288 plusmn 136 p = 05355
ASTALT 12 plusmn 07 14 plusmn 11 p = 06110
γ-GT 403 plusmn 38 302 plusmn 138 p = 02194
Fosfatase alcalina 1126 plusmn 443 1087 plusmn 376 p = 08349
Fonte Protocolo da pesquisa
Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos de AST ALT ASTALT γ-GT e
fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os
52
pacientes com FAN positivo e negativo natildeo sendo observada significacircncia
estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos de FAN (Tabela 8)
Tabela 8 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Paracircmetros bioquiacutemicos Auto anticorpos
Teste estatiacutestico (Teste t) Positivo Negativo
micro plusmn DP micro plusmn DP
AST 419 plusmn 238 326 plusmn 197 p = 01704
ALT 408 plusmn 29 346 plusmn 312 p = 05347
ASTALT 13 plusmn 08 12 plusmn 07 p = 05732
γ-GT 34 plusmn 21 409 plusmn 40 p = 04369
Fosfatase alcalina 1073 plusmn 345 1138 plusmn 462 p = 06431 Fonte Protocolo da pesquisa
Na comparaccedilatildeo entre resultados positivos e negativos do FAN
citoplasmaacutetico observou-se uma maior prevalecircncia da negatividade tanto em
pacientes natildeo infectados (98) como em pacientes infectados (745) pelo HCV
sendo essa diferenccedila estatisticamente significativa (plt00001) o que representa
uma natildeo associaccedilatildeo entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV
(Tabela 9)
Tabela 9 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico segundo a presenccedila ou ausecircncia de infecccedilatildeo por HCV janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
FAN (citoplasmaacutetico)
Pacientes Teste estatiacutestico (Teste G)
Infectados Natildeo infectados
N n
Positivo 13 255 2 2
Negativo 38 745 98 98 p lt 00001
Total 51 1000 100 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
Comparando-se os resultados do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos
viras observa-se que o resultado negativo eacute superior ao positivo em ambos os
genoacutetipos virais sendo 711 para o genoacutetipo viral 1 e 100 para o genoacutetipo viral 3
No entanto esta diferenccedila observada natildeo eacute estatisticamente significativa (p=02573)
(Tabela 10)
53
Tabela 10 - Distribuiccedilatildeo do FAN de acordo com o genoacutetipo viral janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
FAN (citoplasmaacutetico)
Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)
Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n
Positivo 13 289 0 00 p=02573 Negativo 32 711 6 1000
Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa
54
6 DISCUSSAtildeO
Desde o primeiro marcador soroloacutegico para diagnoacutestico do Lupus
Eritematoso Sistecircmico (LES) a ceacutelula LE descrita por Hargraves (1948) vaacuterios
substratos antigecircnicos foram utilizados para o estudo dos auto-anticorpos os quais
terminaram amplamente substituiacutedos pelas ceacutelulas HEp-2 Estas apresentam
significativas vantagens sobre os demais pela sua sensibilidade variedade de
antiacutegenos presentes e pelas facilidades morfoloacutegicas para o seu estudo
O uso da imunofluorescecircncia indireta para a visualizaccedilatildeo dos anticorpos
antinucleares nas ceacutelulas HEp-2 permite o reconhecimento de mais de 30 diferentes
padrotildees de fluorescecircncia como nucleares nucleolares da membrana nuclear do
aparelho mitoacutetico e citoplasmaacutetico todos satildeo proporcionados por diferentes auto-
anticorpos
A partir do 1deg Consenso Brasileiro para Padronizaccedilatildeo dos Laudos de FAN
(HEp-2) os criteacuterios para o preparo interpretaccedilatildeo da fluorescecircncia e nomenclatura
dos resultados passaram a ser normatizados Alguns padrotildees de fluorescecircncia satildeo
relativamente inespeciacuteficos outros satildeo ocasionados por uma gama restrita de auto-
anticorpos e outros ainda por um uacutenico auto-anticorpo (DELLAVANCE et al
2002) Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a tornaacute-las
imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo (DE
LARANAGA et al 2000)
Apesar do padratildeo de fluorescecircncia na maioria das vezes natildeo se pode
identificar o anticorpo presente ele pode sugerir ao cliacutenico qual o proacuteximo passo a
ser dado na investigaccedilatildeo da sua especificidade Os resultados encontrados devem
estar em associaccedilatildeo com a cliacutenica os padrotildees de fluorescecircncia e os tiacutetulos
alcanccedilados com a diluiccedilatildeo preacutevia (DELLAVANCE et al 2003)
No presente estudo a analise de 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo Viacuterus da
Hepatite C esteve presente o anticorpo-antinuclear (ANA FAN) em 13 (255) dos
pacientes e todos eram padratildeo citoplasmaacutetico corroborando com outros estudos
encontrados na literatura como
Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de
pacientes infectados pelo viacuterus HIV com Hanseniacutease e co-infectados com
Hanseniacutease HIV Ela obteve respectivamente as seguintes taxas de prevalecircncias
32 333 e 478 Em todos os grupos neste estudo houve predomiacutenio do
55
padratildeo citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear soacute foi observado entre os pacientes com
hanseniacutease (91) e co-infectados (237)
Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de
pacientes infectados pelo viacuterus da Dengue e viacuterus linfotroacutepico de ceacutelulas T humanas
HTLV-12 e controle Normais e obteve respectivamente as seguintes taxas de
prevalecircncias 40 40 e 2 Em todos os grupos houve predomiacutenio do padratildeo
citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear foi observado entre os pacientes com dengue
(67) e HTLV 12 (133)
Segundo Andrade et al (2002) Dellavance et al (2005) Dellavance e
Andrade et al (2007) o predomiacutenio do padratildeo de FAN do tipo citoplasmaacutetico indica
que determinados padrotildees de fluorescecircncia satildeo mais especiacuteficos de doenccedila auto-
imune enquanto outros ocorrem em indiviacuteduos com enfermidades natildeo auto-imunes
por ser o citoplasma celular rico em proteiacutenas para as quais auto-anticorpos naturais
apresentam afinidade moderada eacute comum observar positividade para FAN em
indiviacuteduos sadios cujo significado ainda natildeo eacute entendido completamente
O padratildeo Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina que pode ser
encontrado em Hepatite auto-imune Cirrose Hepatite C Hepatocarcionoma entre
outros Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica
definida Um resultado positivo pode estar ou natildeo associado a uma patologia assim
como poderaacute ou natildeo vir a apresentar uma doenccedila auto-imune com o passar do
tempo (DELLAVANCE et al 2003) Neste estudo natildeo foi feito avaliaccedilatildeo prospectiva
dos resultados embora todos sejam FAN citoplasmaacuteticos
Os achados de FAN positivo em populaccedilotildees sadias ou sem doenccedilas auto-
imunes tambeacutem jaacute observado por Leser et al (2004) que em 394 pacientes com
FAN-HEp-2 positivo natildeo encontraram nenhum paciente com doenccedila auto-imune
Outro exemplo estaacute no padratildeo citoplasmaacutetico de pontos isolados
estudado por Laurino et al (2006) presente em indiviacuteduos sem evidecircncia de auto-
imunidade mas tambeacutem em indiviacuteduos com acometimento de doenccedilas auto-imunes
sistecircmicas e natildeo-especiacuteficas
Os dados apresentados corroboram com este estudo em que foi
observado a presenccedila do auto-anticorpo em 2 (2 ) dos 100 indiviacuteduos sadios do
grupo controle todos com padratildeo citoplasmaacutetico
56
Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a
tornaacute-las imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo
(DE LARANAGA et al 2000)
Nas Infecccedilotildees agudas espera-se que a resposta auto-imune diminua a
medida que os viacuterus satildeo eliminados Entretanto alguns trabalhos sugerem que em
indiviacuteduos geneticamente susceptiacuteveis as reaccedilotildees auto-imunes possam persistir
apesar do clareamento viral uma vez que o gatilho imunoloacutegico foi ativado e natildeo
houve desativaccedilatildeo (DE LARANAGA et al 2000 SAKKAS et al 2008)
Ramos-Casals et al (2009) no estudo Doenccedilas Sistecircmica Auto-Imunes
em Pacientes com Infecccedilatildeo pelo (72) dos pacientes eram do gecircnero feminino e
(28) do masculino(ANA FAN) em 61 dos pacientes o que se diferem deste
trabalho eacute que dos 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo (667) eram do gecircnero
masculino e (333) eram do gecircnero feminino com meacutedia de idade de 430 (plusmn107)
anos com presenccedila de anticorpo-antinuclear em 13 (255) com meacutedia e mediana
respectivamente de 435 e 46 anos nos pacientes com o FAN positivo e meacutedia de
43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN negativo
Alter (1995) em sua pesquisa natildeo observou associaccedilatildeo entre o risco de
infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas designadas por gecircnero idade e raccedila Na
referida pesquisa foram estudados 51 pacientes com idade meacutedia de 430 (+- 107)
anos 34 (667) eram do gecircnero masculino e 17 (333) do gecircnero feminino todos
em fase preacute-tratamento assintomaacuteticos natildeo permitindo avaliar os risco da
infecccedilatildeoSegundo Pordeus et al (2008) a ocorrecircncia destes auto-anticorpos
indicaria um prognoacutestico desfavoraacutevel Perperas Mcfarlane e Mcsorley (1986)
sugeriram que os auto-anticorpos poderiam estar envolvidos na progressatildeo ou no
desenvolvimento de hepatites crocircnicas possivelmente por um distuacuterbio no controle
da auto-reatividade Outros estudos questionam a participaccedilatildeo dos auto-anticorpos
no processo de transiccedilatildeo para cronicidade das hepatites agudas virais poreacutem os
resultados natildeo satildeo convincentes (SHOENFELD ROSE 2004)
Lopez Seia e Roy (1998) demonstraram a presenccedila de anticorpo anti-
actina em baixos tiacutetulos em crianccedilas com hepatite aguda por curto periacuteodo de
tempo poreacutem nenhuma associaccedilatildeo com gravidade da agressatildeo hepaacutetica foi
descrita
Neste estudo a presenccedila dos auto-anticorpos em (255) dos pacientes
com infecccedilatildeo pelo HCV natildeo puderam ser relacionada com a gravidade da doenccedila
57
pois este estudo foi realizado em pacientes receacutem diagnosticados entatildeo seria
necessaacuterio um acompanhamento destes por um periacuteodo maior de tempo com a
finalidade de concluir esta afirmativa Apesar da presenccedila transitoacuteria de auto-
anticorpos jaacute ter sido descrita em doenccedilas virais comuns a associaccedilatildeo entre a
presenccedila de auto-anticorpos e a gravidade das doenccedilas necessita de comprovaccedilatildeo
Passaleva Massai e Leoncini (1983) avaliaram 302 pacientes com
hepatites agudas virais e encontraram complexos imunes circulantes (CIC) em
516 dos pacientes com frequumlecircncia significativamente maior em hepatite aguda
Nenhuma associaccedilatildeo entre a presenccedila de imuno-complexos e o niacutevel de
aminotransferases ou bilirrubina foi encontrada Segundo Andrade et al (2002)
Dellavance et al (2005) Andrade et al (2007) nos pacientes do estudo foi feita a
relaccedilatildeo entre a presenccedila dos auto-anticorpos e niacuteveis de aminotransferases e as
elevaccedilotildees natildeo tiveram significacircncia poreacutem houve associaccedilatildeo do genotipo viral 1
Nos paracircmetros bioquiacutemicos analisados em relaccedilatildeo aos genoacutetipos houve uma
distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e
3 natildeo atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os
grupos Segundo Wilson (1997) trecircs estudos mostraram correlaccedilatildeo entre niacuteveis
altos de alanina aminotransferase e atividade histoloacutegica da doenccedila hepaacutetica
Poreacutem nos pacientes considerados individualmente o valor preditivo dessa
associaccedilatildeo foi baixo enquanto muitos deles com enzimas normais apresentavam
graves alteraccedilotildees histoloacutegicas No presente estudo natildeo foi observada associaccedilatildeo entre os niacuteveis de
aminotransferases e a cronificaccedilatildeo da hepatite viral pois nem todos os pacientes do
estudo apresentavam resultado de bioacutepsia hepaacutetica
Alter et al (1999) afirmam que no Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b
(63) e 3a (313) em estudo realizado em Goiacircnia onde foi observada uma
maior prevalecircncia do genoacutetipo 1 seguida do genoacutetipo 3 em doadores de sangue e
hemofiacutelicos (DELLAVANCE ANDRADE et al 2007) Estando esses dados em
acordo com esta pesquisa que com genotipagem do viacuterus da hepatite C que
identificou o genoacutetipo 1 em 45 (882) seguidos pelo genoacutetipo 3 que foi
identificado em 6 (118) dos pacientes com infecccedilatildeo pelo HCV Em um estudo realizado na Franccedila com 13 pacientes luacutepicas infectadas
pelo viacuterus C 8 apresentavam o RNA viral sendo o genoacutetipo 1 presente em cinco
58
(625) casos seguido do genoacutetipo 3 (375) (PERLEMUTER et al 2000) dados
que se assemelham aos do presente estudo embora o estudo natildeo tenha incluiacutedo
pacientes com outras infecccedilotildees associadas ao HCV Eacute importante ressaltar que
estudos sobre genotipagem do HCV em indiviacuteduos com doenccedilas reumaacuteticas satildeo
raros
No presente estudo houve uma frequumlecircncia baixa de positividade para o
FAN nos pacientes com genoacutetipo 1 e genoacutetipo 3 Natildeo havendo significacircncia
estatiacutestica entre os pacientes com genoacutetipo 1 e 3
Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter
implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave menor
resposta agrave terapia antiviral (BRUNO et al1997) o que natildeo foi avaliado neste estudo
pois apesar de (882) dos pacientes serem genoacutetipo 1 todos estavam em fase de
reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica seja preacute- tratamento Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila
poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses
autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis
vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo
hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja
quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a
concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave
hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em
parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)
59
7 CONCLUSOtildeES
minus O padratildeo dos auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares encontrados nos
dois grupos estudados foi o citoplasmaacutetico
minus A prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares no grupo com
infecccedilatildeo pelo VHC foi significativamente maior do que no grupo controle
minus Nos resultados de FAN citoplasmaacutetico haacute uma maior prevalecircncia da
negatividade em pacientes infectados pelo HCV e natildeo infectados sendo
essa diferenccedila estatisticamente significativa conferindo a natildeo associaccedilatildeo
entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV
minus Os resultados negativos do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos viras eacute
superior aos positivos em ambos os genoacutetipos virais entretanto esta diferenccedila
natildeo eacute estatisticamente significativa
minus Houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos
celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado
minus Natildeo houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos
celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado com
relaccedilatildeo ao gecircnero onde predominou o gecircnero masculino nos dois grupos
minus Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter
implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave
menor resposta agrave terapia antiviral o que natildeo foi avaliado neste estudo pois
os pacientes estavam em fase preacute tratamento sugerindo que estes pacientes
sejam avaliados futuramente
minus A formaccedilatildeo dos auto-anticorpos parece ser mais uma consequumlecircncia do que
uma causa da agressatildeo hepaacutetica
minus A negatividade do FAN ndash Hep 2 foi maior que a positividade mas todos os
FAN positivos pertenciam ao genoacutetipo viral tipo 1 nos pacientes infectados
pelo HCV
minus Nesta pesquisa os resultados de PCR o RNA-HCV de reconfirmaccedilatildeo foi
positivo para o anti-HCV em todos os soros analisados mostrando assim
que estes pacientes eram portadores de infecccedilatildeo por viacuterus C ou seja natildeo
houve falso positivo anteriormente poreacutem todos eram assintomaacuteticos
dificultando a conclusatildeo de ser ou natildeo uma infecccedilatildeo persistente
60
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68
APEcircNDICE A - TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Vocecirc estaacute sendo convidado para fazer parte de uma pesquisa que estaacute sendo desenvolvida pela Universidade Federal do Paraacute no Nuacutecleo de Medicina Tropical intitulada AUTOANTICORPOS CONTRA ANTIacuteGENOS CELULARES E SUA CORRELACcedilAtildeO COM O GENOacuteTIPO VIRAL EM PACIENTES COM INFECCcedilAtildeO PELO VIacuteRUS DA HEPATITE C (HCV)
O Objetivo da pesquisa eacute fazer uma correlaccedilatildeo do anticorpo antinuacutecleo (FAN) e o genoacutetipo viral em pacientes com hepatite C e o estaacutegio da doenccedila hepaacutetica a partir da histologia sempre que permitidos e correlacionar ao diagnoacutestico
Caso vocecirc participe da pesquisa seraacute necessaacuterio que forneccedila uma amostra de sangue (2ml)
O uacutenico inconveniente que vocecirc poderaacute experimentar eacute a dor provocada pela agulha na hora da coleta de sangue bem como pequenos hematomas que possam vir a ocorrer e que natildeo causam danos
Essa pesquisa natildeo oferece riscos as praacuteticas satildeo de uso rotineiro e seratildeo utilizados materiais esterilizados e descartaacuteveis como agulhas seringas etc
Estaacute garantido a vocecirc todas as informaccedilotildees que vocecirc queira antes durante e depois da pesquisa
A sua participaccedilatildeo neste estudo eacute voluntaacuteria Vocecirc tem a liberdade de recusar participar da pesquisa a qualquer momento
As informaccedilotildees relacionadas agrave pesquisa poderatildeo ser inspecionadas pelos pesquisadores que executam a pesquisa e pelas autoridades legais no entanto se qualquer informaccedilatildeo for divulgada em relatoacuterio publicaccedilatildeo ou qualquer outro meio isto seraacute feito de forma codificada para manter o caraacuteter confidencial
Todas as despesas necessaacuterias para a realizaccedilatildeo do estudo natildeo satildeo de sua responsabilidade assim como a sua participaccedilatildeo na pesquisa na seraacute remunerada (vocecirc natildeo receberaacute qualquer valor em dinheiro)
Quando os resultados forem divulgados natildeo apareceraacute seu nome e sim um coacutedigo
_____________________________________
Assinatura do Pesquisador Responsaacutevel NomeAna Maria Almeida Souza EndRodovia Maacuterio Covas 1426 ndash Cond Green Garden casa 41 Fone(91) 32352665 81197217 RegConselhoCRM 1508
69
APEcircNDICE B - CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Declaro que li as informaccedilotildees acima sobre a pesquisa que me sinto
perfeitamente esclarecido sobre o conteuacutedo da mesma assim como seus riscos e
benefiacutecios Declaro ainda que por minha livre vontade aceito participar da pesquisa
cooperando com a coleta de material para exame
Beleacutem _________
_________________________________________
Assinatura do sujeito da pesquisa ou do
responsaacutevel
70
ANEXOS
71
- Assinatura do Pesquisador Responsaacutevel
-
- Beleacutem _________
-
ANA MARIA ALMEIDA SOUZA
AUTOANTICORPOS CONTRA ANTIacuteGENOS CELULARES E SUA CORRELACcedilAtildeO COM O GENOacuteTIPO VIRAL EM PACIENTES COM INFECCcedilAtildeO PELO VIacuteRUS DA
HEPATITE C (HCV)
Dissertaccedilatildeo apresentada ao Programa de Poacutes-Graduaccedilatildeo em Doenccedilas Tropicais do Nuacutecleo de Medicina Tropical da Universidade Federal do Paraacute como requisito para obtenccedilatildeo do grau de mestre em Doenccedilas Tropicais Aacuterea Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais
Aprovada em _____________
BANCA EXAMINADORA
______________________________________ - Orientador Prof Dr Juarez Antonio Simotildees Quaresma Nuacutecleo de Medicina Tropical ndash UFPA ______________________________________ - Membro Profa Dra Clea Nazareacute Carneiro Bichara Centro de Ciecircncias Bioloacutegicas e da Sauacutede ndash UEPA ______________________________________ - Membro Prof Dr Lacy Cardoso de Brito Juacutenior Instituto Centro de Ciecircncias Bioloacutegicas ndash UFPA ______________________________________ - Membro Prof Dr Ismaelino Mauro Nunes Magno Centro Universitaacuterio do Paraacute - CESUPA
A DEUS QUE NA SUA SUPREMACIA E GRANDEZA PERMITIU A MINHA EXISTEcircNCIA
A MEU PAI EMMANOEL (IN MEMORIAM) QUE DENTRO DE SUA HUMILDADE E
SIMPLICIDADE SEMPRE ME PROPORCIONOU ENSINAMENTOS DE VIDA E QUE LEMBRO SEMPRE SUAS FRASES ldquoNUNCA DEcirc SUA RAZAtildeO A NINGUEacuteM PROCURE
SEMPRE FAZER AS COISAS CERTAS PARA QUE POSSAS ANDAR SEMPRE DE PEITO ABERTO E CABECcedilA ERGUIDArdquo
ldquoO ESTUDO Eacute A UacuteNICA HERANCcedilA QUE POSSO DEIXAR E QUE NINGUEacuteM VAI BRIGAR CONTIGO POR CAUSA DELArdquo
A MINHA MAtildeE SANCHA QUE SEMPRE FOI EXEMPLO DE BATALHA E VIGOR COM DOM
DE SER MAtildeE ESPOSA E PROFISSIONAL SEM PERDER NUNCA SUA CALMA TRANQUumlILIDADE E BONDADE PROCURANDO AJUDAR SEMPRE TODOS QUE A
RECORRIAM
AO RIBAMAR GRANDE AMOR DE MINHA VIDA MEU COMPANHEIRO DE 32 ANOS QUE DO SEU JEITO SEMPRE ME APOacuteIA NA REALIZACcedilAtildeO DOS MEUS SONHOS
AOS MEUS AMADOS FILHOS RODRIGO RAFAEL E ANA CAROLINA QUE SEMPRE ME
MOTIVARAM A LUTAR PELOS MEUS OBJETIVOS PARA ASSIM SERVIR DE INCENTIVO E EXEMPLO PARA ELES
AS MINHAS SOGRAS LOURDES E RAIMUNDA (IN MEMORIAM) QUE SEMPRE ESTIVERAM
AO MEU LADO AJUDANDO NA CRIACcedilAtildeO DOS MEUS FILHOS PARA QUE EU PUDESSE REALIZAR MINHAS TAREFAS E ALCANCcedilAR MEU CRESCIMENTO PROFISSIONAL
AGRADECIMENTOS
Ao Prof Dr Juarez Antonio Simotildees Quaresma meu orientador e incentivador pelos ensinamentos e orientaccedilatildeo para a conclusatildeo desta aacuterdua tarefa Ao meu cunhado Prof Dr Carlos Leocircnidas Silva Souza Sobrinho que sempre me incentivou nessa caminhada Aos amigos Dra Isabella e Dr Alberto Amaral que muito me ajudaram me apoiaram e permitiram minhas ausecircncias no laboratoacuterio para a conclusatildeo desta jornada Ao colega MS MD David Bichara que disponibilizou seu tempo para a realizaccedilatildeo dos testes de FAN de maior importacircncia para a execuccedilatildeo deste trabalho A colega Profa Dra Cleacutea Bichara que com seu apoio me deu animo para a execuccedilatildeo deste trabalho A colega Maria do Socorro de Oliveira Cardoso companheira de trabalho pelo incentivo e torcida para a concretizaccedilatildeo desta tarefa A todos os amigos do laboratoacuterio Amaral Costa pela incondicional torcida e apoio para que eu pudesse chegar ao final desta jornada A Profa Dra Luisa Caricio Martins pela sua ajuda incondicional na cedencia dos dados dos pacientes e liberaccedilatildeo das amostras do material bioloacutegica de sua soroteca sem a qual esse trabalho seria impossiacutevel de se realizar Ao futuro colega de profissatildeo doutorando Geraldo Duarte pelas contribuiccedilotildees na conclusatildeo estatiacutestica dos resultados encontrados Ao Prof Dr Ismaelino Mauro Nunes Magno que tem se empenhado me incentivando na conclusatildeo desta meta meu anjo auxiliar A todos os componentes da banca examinadora pelo comprometimento e a forma muito simples que no momento da qualificaccedilatildeo me fizeram vecirc e buscar as melhorias ao trabalho ora apresentado A Luciene Dias Cavalcante bibliotecaacuteria do HOL pela ajuda imprescindiacutevel na elaboraccedilatildeo desta dissertaccedilatildeo A todos que de forma direta ou indireta colaboraram para a realizaccedilatildeo deste sonho
CONFIE AS COISAS ACONTECEM NA HORA CERTA
EXATAMENTE QUANDO DEVEM ACONTECER MOMENTOS FELIZES LOUVE A DEUS
MOMENTOS DIFIacuteCEIS BUSQUE A DEUS MOMENTOS SILENCIOSOS ADORE A DEUS
MOMENTOS DOLOROSOS CONFIE EM DEUS CADA MOMENTO AGRADECcedilA A DEUS
ENTENDER A VONTADE DE DEUS NEM SEMPRE Eacute
FAacuteCIL MAS CRER QUE ELE ESTAacute NO COMANDO E TEM
UM PLANO PARA NOSSA VIDA FAZ A CAMINHADA VALER
Agrave PENA
(DESCONHECIDO)
RESUMO
As inflamaccedilotildees do fiacutegado provocadas pelos viacuterus hepatotroacutepicos atingem milhotildees de
pessoas e representa significativo problema de sauacutede puacuteblica em todo o mundo
Existem interaccedilotildees entre viroses hepatotroacutepicas e o sistema imunoloacutegico do hospedeiro
que podem influenciar na patogenicidade da agressatildeo hepaacutetica O objetivo deste
trabalho foi investigar a frequumlecircncia de auto-anticorpos em pacientes portadores do viacuterus
da hepatite C e sua correlaccedilatildeo com os genoacutetipos encontrados Foram estudados 51
pacientes com diagnoacutestico confirmado pelo PCR de infecccedilatildeo pelo viacuterus da hepatite C e
um grupo de 100 doadores de sangue com todos os exames soroloacutegico para doenccedilas
infecto-contagiosas negativos Os 51 pacientes portadores do viacuterus C apresentavam
idade meacutedia de 43 anos +- 113 em fase preacute-tratamento 34 (667) eram do gecircnero
masculino e 17 (333) do gecircnero feminino Desses 13 (255) apresentaram FAN
positivo 45 (882) eram genoacutetipo tipo 1 e 118 genoacutetipo tipo 3 Os pacientes que se
apresentaram com anticorpos detectaacuteveis natildeo apresentavam niacuteveis de AST ALT
ASTALT γ-GT e fosfatase alcalina significativamente diferente daqueles com auto-
anticorpos negativos Desta forma conclui-se que os anticorpos presentes na amostra
do estudo satildeo independentes da evoluccedilatildeo da doenccedila e do prognoacutestico do paciente
entretanto parece estar ligada ao genoacutetipo tipo 1
Palavras-chave Hepatite C Auto-anticorpos Genoacutetipo
ABSTRACT
Inflammation of the liver caused by hepatotropic viruses affect millions of people and
represents a significant public health problem worldwide There are interactions between
hepatotropic viruses and the host immune system that can influence the pathogenesis of
liver injury The objective of this study was to investigate the frequency of autoantibodies
in patients with hepatitis C virus and its correlation with the genotypes found We
studied 51 patients diagnosed by PCR of infection with hepatitis C and a group of 100
blood donors with all serological tests for infectious diseases negative The 51 patients
with virus C had an average age of 43 years + - 113 in the pre-treatment 34 (667)
were male and 17 (333) were female Of these 13 (255) were ANA positive 45
(882) were with genotype 1 and 118 with genotype 3 Patients who presented with
antibodies had no detectable levels of AST ALT AST ALT γ-GT and alkaline
phosphatase significantly different from those with negative antibody titers Thus we
conclude that the antibodies present in the study sample are independent of disease
progression and patient prognosis though seems to be linked with genotype 1
Keywords Hepatitis C Auto-antibodies genotype
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Padrotildees de fluorescecircncia encontrados em maior frequumlecircncia e
patologias relacionadas 34
Quadro 2 - Anti-ena - auto-anticorpos contra antiacutegenos extraiacutedos do nuacutecleo e
relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 34
Quadro 3 ndash Padrotildees de FAN nuclear e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 35
Quadro 4 - Padrotildees de FAN citoplasmaacuteticos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 36
Quadro 5 - Padrotildees de FAN mistos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 37
Quadro 6 - Padrotildees de FAN nucleolares e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 37
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos pacientes segundo as caracteriacutesticas demograacuteficas janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 48
Tabela 2 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes conforme os resultados laboratoriais de FAN citoplasmaacutetico e genotipagem janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 49
Tabela 3 ndash Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 49
Tabela 4 - Relaccedilatildeo da genotipagem de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 50
Tabela 5 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e faixa etaacuteria - janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 50
Tabela 6 - Estudo descritivo da idade dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e presenccedila do FAN citoplasmaacutetico janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 51
Tabela 7- Distribuiccedilatildeo dos genoacutetipos dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 51
Tabela 8 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 52
Tabela 9 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico segundo a presenccedila ou ausecircncia de infecccedilatildeo por HCV janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 52
Tabela 10 - Distribuiccedilatildeo do FAN de acordo com o genoacutetipo viral janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 53
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
AAN Anticorpos antinucleares
aCL Anticorpos anticardiolipina
AIDS Sindrome da Imunodeficiecircncia Adquirida
ALT Alanina aminotransferase
ANCA Anticorpos anti-citoplasma de neutroacutefilos
Anti-CCP Antipeptiacutedeo citrulinado ciacuteclico
Anti-β2GPI Anticorpos anti-β2 glicoproteiacutena I
Cdna DNA complementar
CEP Comitecirc em Eacutetica e Pesquisa
CHC Carcinoma hepatocelular
CIC Complexos imunes circulantes
DDTC Doenccedilas difusas do tecido conjuntivo
DMTC Doenccedila mista do tecido conjuntivo
E1 Proteiacutena do envoltoacuterio
ENH Eritema Nodoso Hansecircnico
ESP Esclerose sistecircmica progressive
FAN Fator Anti-nuacutecleo
FR Fator reumatoacuteide
HBV Viacuterus da hepatite B
HCV Viacuterus da Hepatite C
HEMOPA Fundaccedilatildeo Centro de Hemoterapia e Hematologia do Paraacute
HIV Viacuterus da imunodeficiecircncia humana
HIV-1 Viacuterus da imunodeficiecircncia humana1
IAH Iacutendice de atividade histoloacutegica
LE Lupus Eritematoso
LES Luacutepus eritematoso sistecircmico
MS Ministeacuterio da Sauacutede
mtDNA DNA mitrocondrial
NANBH Hepatite natildeo-A natildeo-B
NMT Nuacutecleo de Medicina Tropical
OMS Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede
PCR Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia
Rh Tipo sanguiacuteneo
RNA Aacutecido ribonucleacuteico
RT-PCR Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia-em tempo real
SAF Siacutendrome antifosfoliacutepide
SIDA Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida
SS Siacutendrome de Sjoumlgren
UFPA Universidade Federal do Paraacute
UV ultravioleta
VHA Viacuterus da Hepatite A
VHC Viacuterus da Hepatite C
VHCHCV Hepatite C
VV Hanseniacutease generalizada
SUMAacuteRIO 1 INTRODUCcedilAtildeO 15 11 HEPATITE C (VHCHCV) 15 111 Consideraccedilotildees Gerais 15 112 Agente Etioloacutegico 16 113 Epidemiologia 17 114 Modo de Transmissatildeo 18 115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica 19 116 Diagnoacutestico 23 12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC 25
13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC 26
14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE 27
15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES AGUDAS VIRAIS 31
16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN 32 2 JUSTIFICATIVA 39 21 ASPECTOS EacuteTICOS 39 3 OBJETIVOS 40
31 OBJETIVO GERAL 40
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 40 4 MATERIAL E MEacuteTODOS 41 41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO) 41 411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C 41 412 Grupo de natildeo infectados 41 42 MEacuteTODO 42 421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico 42 422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C 42 423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia
molecular 43
424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem) 45 425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas
HEp-2 46 43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 47 5 RESULTADOS 48 6 DISCUSSAtildeO 54 7 CONCLUSOtildeES 59 REFEREcircNCIAS 60 APEcircNDICES 67 ANEXOS 70
15
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 HEPATITE C (VHCHCV)
111 Consideraccedilotildees Gerais
As hepatites virais satildeo doenccedilas causadas por diferentes agentes
etioloacutegicos de distribuiccedilotildees universais que tecircm em comum o hepatotropismo
Possuem semelhanccedilas do ponto de vista cliacutenico-laboratorial mas apresentam
importantes diferenccedilas epidemioloacutegicas quanto agrave sua evoluccedilatildeo (FERREIRA
SILVEIRA 2004) Desde a descriccedilatildeo e definiccedilatildeo em 1989 (CHOO et al 1989 apud
RIBEIRO et al 2007) tornou-se evidente sua associaccedilatildeo com uma grande
variedade de manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas desordens reumaacuteticas e auto-imunes
(ALMEIDA 2010)
A infecccedilatildeo pelo VHCHCV acarreta inflamaccedilatildeo hepaacutetica e esteatose
podendo evoluir para fibrose hepaacutetica e cirrose em indiviacuteduos cronicamente
infectados estes com grande risco de desenvolvimento de carcinoma hepatocelular
(RIBEIRO et al 2007) Essas complicaccedilotildees tardias ocorrem em um periacuteodo em
geral superior a 20 anos apoacutes o iniacutecio da infecccedilatildeo A avaliaccedilatildeo filogeneacutetica das
sequumlecircncias do VHCHCV investigadas em vaacuterias regiotildees geograacuteficas sugere que
existam pelo menos seis genoacutetipos principais designados pelos nuacutemeros de 1 a 6 e
pelo menos 30 subtipos designados por letras minuacutesculas Nos Estados Unidos
prevalecem os genoacutetipos 1a (60) e 1b (20) Os tipos 5 e 6 satildeo mais encontrados
no sudeste e sul da Aacutefrica O tipo 4 eacute predominante na Aacutefrica Central e no Oriente
Meacutedio No Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b (63) e 3a (313) (BASSIT et
al 1999 apud RIBEIRO et al 2007) As informaccedilotildees sobre as causas que
determinam o curso evolutivo da doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos
progressos que haacute no campo do diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHCHCV Uma
questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo genoacutetipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de
lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o genoacutetipo 1 (1b) cursa com lesotildees
histoloacutegicas mais graves
As uacuteltimas deacutecadas foram de notaacuteveis conquistas no que se refere agrave
prevenccedilatildeo e ao controle das hepatites virais Entre as doenccedilas endecircmico-
epidecircmicas que representam problemas importantes de sauacutede puacuteblica no Brasil
16
salientam-se as Hepatites Virais cujo comportamento epidemioloacutegico no nosso paiacutes
e no mundo tem sofrido grandes mudanccedilas nos uacuteltimos anos
Antes da seleccedilatildeo rigorosa dos doadores de sangue em 1991 o
VHCHCV era a maior causa de hepatite poacutes-transfusional Atualmente permanece
como tal em casos esporaacutedicos (CONTE 2000) Os grupos considerados de risco
satildeo pessoas que receberam transfusatildeo de sangue antes de 1992 usuaacuterios de
drogas injetaacuteveis profissionais de sauacutede que lidam com sangue pacientes de
hemodiaacutelise e com menor risco pessoas tatuadas ou com piercings (CLEMENTE
ONO-NITA 2007)
A melhoria das condiccedilotildees de higiene e de saneamento das populaccedilotildees a
vacinaccedilatildeo contra a Hepatite B (HBV) e as novas teacutecnicas moleculares de diagnoacutestico
do viacuterus da Hepatite estatildeo entre esses avanccedilos importantes (BRASIL 2008)
112 Agente Etioloacutegico
O VHCHCV um viacuterus aacutecido ribonucleacuteico (RNA) da famiacutelia Flaviviridae
representa a principal causa da previamente denominada hepatite natildeo-A natildeo-B
(SANTOS 2009) Foi identificado e isolado a partir de um clone derivado de um
genoma NANBH semelhante aos togaviridae ou flaviviridae (SAADE 2008) e
visualizado a imunoeletromicroscopia como partiacutecula de 55 a 65 nm de diacircmetro
com projeccedilotildees espiculares e de morfologia muito semelhante aos flaviviridae Aleacutem
disso estas partiacuteculas reagiram especificamente com anticorpos mono e policlonais
do conteuacutedo proteacuteico do envelope do VHC (HIRANUMA et al 1994 apud CONTE
2000)
O agente etioloacutegico do HCV natildeo eacute uma partiacutecula homogecircnea e apresenta
uma taxa alta de mutaccedilatildeo levando-o a uma heterogeneicidade genocircmica cujo
resultado eacute um grande nuacutemero de genoacutetipos (1a 1b 2a 2b 3a 3b 4 5 6)
(AUGUSTO LOBATO 2003) Natildeo haacute evidecircncias de variantes natildeo patogecircnicas O
genoacutetipo 1b eacute o que apresenta maior virulecircncia e pior resposta ao tratamento
(LAUER WALKER 2001 apud SOUZA 2007) No Brasil dados obtidos a partir de
casos isolados e estudos de pequenas amostragens indicam que o genoacutetipo 1b
ocorre em cerca de 30 a 40 dos casos o 1a em cerca de 20 1a e 1b em 20
o 3a em cerca de 28 (FOCACCIA 2004)
17
113 Epidemiologia
De acordo com a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) a HCV eacute uma
questatildeo de sauacutede puacuteblica e tambeacutem a principal causa de transplante de fiacutegado no
Brasil (SOCIEDADE BRASILEIRA DE HEPATOLOGIA 2005) Eacute estimada uma
prevalecircncia em torno de 10 para a infecccedilatildeo pelo VHC na populaccedilatildeo mundial
(KILLEMBERG 2000) Nos Estados Unidos cerca de 27 milhotildees de pessoas estatildeo
infectadas pelo viacuterus (BRASIL 2006)
De acordo com Ferreira e Silveira (2004) no Brasil o nuacutemero de pacientes
infectados eacute incerto relacionado geralmente a alguns estados e municiacutepios e o
esclarecimento dos agentes causadores das hepatites cuja identificaccedilatildeo requer
teacutecnicas laboratoriais complexas de biologia molecular eacute realizado de maneira
insuficiente Por outro lado a progressiva integraccedilatildeo entre as instacircncias gestoras
dos programas de vigilacircncia e controle das doenccedilas com grupos de pesquisa e
desses com os serviccedilos (FERREIRA SILVEIRA 2004 p 473) e a disponibilidade
dos bancos de dados nacionais mais confiaacuteveis apontam para novos e melhores
caminhos (BRASIL 2005b)
A OMS alerta que o Paiacutes deve se preparar para uma ldquoexplosatildeordquo da
epidemia a partir de 2011 (BRASIL 2005b) Outra preocupaccedilatildeo eacute que as pessoas
que receberam sangue antes de 1992 tecircm mais chances de estarem infectadas na
eacutepoca o sangue destinado agraves transfusotildees natildeo era analisado para detecccedilatildeo da HCV
porque o viacuterus natildeo era conhecido e natildeo havia exames especiacuteficos (BRASIL 2005b)
A prevalecircncia da infecccedilatildeo nos doadores de sangue sadios varia de 001-002 no
Reino Unido e no norte da Europa 1-15 no sul da Europa 65 na Aacutefrica
equatorial e de ateacute 20 no Egito (CONTE 2000)
De acordo com a OMS a cada grupo de 50 pessoas no Brasil uma tem
hepatite e de dez portadores apenas um sabe (STRAUSS 2001) Satildeo dois milhotildees
de infectados no Paiacutes Denominada epidemia silenciosa calcula-se que 170 milhotildees
de indiviacuteduos no mundo estejam contaminados pelo viacuterus C a forma mais grave da
doenccedila Ainda de acordo com a OMS o nuacutemero de brasileiros viacutetimas da
enfermidade eacute bem maior do que o estimado pelo Ministeacuterio da Sauacutede (TRINDADE
2005)
18
Por ocasiatildeo da Conferecircncia Internacional de Consenso sobre HCV em Paris
(LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999) concluiu-se que a hepatite crocircnica por viacuterus
C eacute um problema grave de sauacutede puacuteblica sendo sua prevalecircncia mundial estimada
em 3 (de 01 a 5 segundo os vaacuterios paiacuteses) por tanto havendo no mundo
todo cerca de 150 milhotildees de portadores crocircnicos do VHCHCV 4 milhotildees nos EUA
e 5 milhotildees na Europa Ocidental Na Europa Oriental a prevalecircncia eacute maior ainda
114 Modo de Transmissatildeo
A HCV eacute transmitida pelo sangue Natildeo haacute comprovaccedilatildeo de contaacutegio por
meio de fluidos corporais como saliva suor laacutegrimas secircmen ou leite materno
Tambeacutem deixa de ocorrer por meio de abraccedilos beijos uso dos mesmos copos ou
roupas Especialistas afirmam que a contaminaccedilatildeo atraveacutes de relaccedilotildees sexuais eacute
possiacutevel mas rara Quando detectada de maneira precoce a enfermidade tem
tratamento inclusive gratuito aleacutem de cura (BRASIL 2006)
Dentre os fatores de risco para transmissatildeo outros aleacutem da transfusatildeo de
sangue o uso de drogas iliacutecitas o comportamento sexual de alto risco e variaacuteveis
socioeconocircmicas representadas pelo grau de escolaridade e renda familiar Natildeo foi
observada associaccedilatildeo entre o risco de infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas
designadas por gecircnero idade e raccedila (ALTER 2007) O risco de transmissatildeo sexual
do VHCHCV eacute miacutenimo A contaminaccedilatildeo intrafamilial natildeo-sexual eacute consideraacutevel
particularmente quando um dos enfermos tem hepatopatia grave e ou carga viral
elevada (risco 110) (CONTE 2000)
A praacutetica de tatuagem fornece dados conflitantes sabendo-se que os
liacutequidos usados para esterilizar os instrumentos usados satildeo ineficazes
Karmochkine et al (1998 apud CONTE 2000) observaram que
aproximadamente 80 dos pacientes contraem o viacuterus atraveacutes da toxicomania
intravenosa ou transfusotildees de sangue ou de derivados Os restantes meios de
transmissatildeo e de contaacutegio satildeo a hemodiaacutelise os transplantes de oacutergatildeos picadas
acidentais profissionais e transmissatildeo vertical matildee-crianccedila Em 20 a 40 dos
casos natildeo se consegue determinar o modo de contaminaccedilatildeo A transmissatildeo da
hepatite crocircnica por viacuterus C pode ser prevenida (KARMOCHKINE et al 1998 apud
CONTE 2000)
19
As duas fontes de contaminaccedilatildeo satildeo a toxicomania endovenosa e a
administraccedilatildeo de produtos de origem sanguumliacutenea Esta uacuteltima praticamente
eliminada desde 1991 com a introduccedilatildeo dos testes ELISA 2 na seleccedilatildeo
aprimorada de doadores de sangue (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998
apud CONTE 2000)
A transmissatildeo sexual eacute rara com menos de 3 em parceiros estaacuteveis e
ocorre principalmente em pessoas com muacuteltiplos parceiros e com praacutetica sexual de
risco (sem uso de preservativo) ndash para os indiviacuteduos com parceiros muacuteltiplos o uso
de preservativos eacute indicado (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998 apud
CONTE 2000)
A gravidez natildeo estaacute contra-indicada nas mulheres infectadas pelo
VHCHCV A transmissatildeo vertical matildee-crianccedila eacute rara (menor de 6) O tipo de parto
(natural ou cesaacuterea) natildeo tem influecircncia O aleitamento eacute permitido A transmissatildeo
nosocomial eacute prevenida eficazmente de modo convencional (KARMOCHKINE et
al 1998 apud CONTE 2000)
115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica
A infecccedilatildeo aguda pode passar clinicamente despercebida ou evoluir para
hepatite fulminante Aproximadamente 850 das pessoas infectadas agudamente
vatildeo desenvolver uma viremia persistente tornando-se dessa forma indiviacuteduos
infectados crocircnicos Depressatildeo irritabilidade dores no corpo mal-estar febre
naacuteuseas e falta de apetite satildeo alguns dos sintomas mais frequumlentes embora a
maioria dos casos natildeo apresente nenhum sintoma (ALTER 2007)
A cirrose eacute pouco observada em pessoas que apresentam niacuteveis
persistentemente baixos das transaminases mas a elevaccedilatildeo destas natildeo eacute
representativa do grau de fibrose hepaacutetica Dessa forma a bioacutepsia hepaacutetica
representa o melhor indicador do estaacutegio de evoluccedilatildeo da doenccedila uma vez que
gradua os componentes inflamatoacuterios e o estaacutegio de fibrose (AGMON-LEVIN et al
2009 BLOCK SCHIANO 1999)
Alter et al (1992) dizem que em 82 de 130 pacientes seguidos durante
muitos anos apoacutes surto agudo de hepatite natildeo-A natildeo-B apresentam anti-VHCHCV
ou VHCHCV RNA sendo que 62 deles desenvolveram hepatite crocircnica e
concluem que os pacientes que adquiriram HCV tiveram alto grau de hepatite
20
crocircnica sendo que o VHCHCV pode ser a maior causa de doenccedila crocircnica de fiacutegado
nos EUA e que na maioria dos pacientes a infecccedilatildeo pelo VHCHCV parece persistir
por muitos anos mesmo na ausecircncia de doenccedila hepaacutetica ativa
Almeida et al (1999) determinaram a prevalecircncia da infecccedilatildeo em
doadores de sangue assim como avaliaram o grau de comprometimento hepaacutetico
numa populaccedilatildeo de 37335 doadores durante o biecircnio 93-94 em Porto Alegre - RS
utilizando o teste anti-VHC ELISA 2 Selecionaram 60 deles para a biopsia hepaacutetica
com agulha de Menghini encontrando prevalecircncia de 174 com comprometimento
hepatico e 39 deles apresentavam cirrose hepaacutetica Sendo a hepatopatia crocircnica de
graus variaacuteveis observadas em 80 deles na sua grande maioria com lesotildees leves
e miacutenimas Foi observada forte associaccedilatildeo entre elevaccedilatildeo de alanina
aminotransferase (ALT) e a presenccedila de hepatopatia crocircnica embora a intensidade
desta elevaccedilatildeo natildeo se correlacione com a gravidade da lesatildeo histoloacutegica
Jaacute na experiecircncia de Mutimer et al (1995) cerca de 80 dos doadores
soro-positivos analisados exaustivamente inclusive com biopsia de fiacutegado
mostraram evidecircncias de alteraccedilotildees histoloacutegicas e ou viroloacutegicas de infecccedilatildeo
persistente sem no entanto atingir graus mais avanccedilados de hepatopatia crocircnica
quase todos permanecendo na categoria moderada
Nos paiacuteses industrializados a HCV eacute responsaacutevel por 20 dos casos de
hepatite aguda 70 dos casos de hepatite crocircnica 40 dos casos de cirrose
descompensada 60 dos carcinomas hepatocelulares e 30 dos transplantes
hepaacuteticos (LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999)
Cerca de 40 do total de pacientes curam-se ou tecircm doenccedila crocircnica de
natureza benigna Os restantes 60 cursam com atividade aumentada de
aminotransferase denotando evoluccedilatildeo crocircnica da doenccedila Dentre estes a maioria
tem lesotildees necro inflamatoacuterias discretas e fibrose miacutenima ou ausente O prognoacutestico
em longo prazo eacute mal conhecido no entanto provavelmente a maioria deles natildeo viraacute
a falecer da doenccedila hepaacutetica em curso Cerca de 20 deles depois de 10-20 anos
de evoluccedilatildeo desenvolveratildeo cirrose hepaacutetica passiacutevel de transplante Assim a
hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila que ocasiona a morte de um pequeno nuacutemero
de pacientes sem no entanto afetar a duraccedilatildeo da vida meacutedia da maioria deles
(CONTE 2000 FERREIRA SILVEIRA 2004)
Apoacutes infecccedilatildeo aguda somente 10 dos pacientes desenvolve doenccedila
cliacutenica com icteriacutecia A infecccedilatildeo sub-cliacutenica eacute a regra e assim passa despercebida
21
Cerca de 25 deles tecircm infecccedilatildeo crocircnica sintomaacutetica com aminotransferases
normais e lesotildees inflamatoacuterias histoloacutegicas miacutenimas (RESENDE et al 2010)
A remissatildeo espontacircnea acontece em cerca de 15 dos casos Na grande
minoria dos casos a progressatildeo da doenccedila aguda pode levar agrave insuficiecircncia
hepaacutetica aguda
Observaccedilotildees feitas pelo irlandecircs Kenny-Walsh (1999) comprovam a
natureza e a evoluccedilatildeo cliacutenica da afecccedilatildeo em causa O autor acompanhou durante 17
anos 376 mulheres que receberam injeccedilotildees de imunoglobulinas anti-D
contaminadas com VHC provenientes de doador uacutenico num programa de
isoimunizaccedilatildeo Rh Destas 81 apresentaram sintomatologia mais frequumlentemente
fadiga (66) ALT ligeiramente elevada (de 40 a 99 UL) em 47 e igual ou maior de
100 UL em 8 A biopsia hepaacutetica mostrou inflamaccedilatildeo em 98 delas na maioria
das vezes leves (41) e moderadas (52) fibrose presente em 51 no entanto
somente em sete pacientes (2) houve sinais de cirrose provaacutevel ou definitiva Em
uma delas havia acentuado alcoolismo
A hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila de evoluccedilatildeo variaacutevel De maneira
geral sua evoluccedilatildeo eacute lenta insidiosa e progressiva
Os pacientes que natildeo apresentam evidecircncias bioquiacutemicas de lesatildeo
hepaacutetica podem constituir em subgrupo de casos mais benignos no curso natural
da doenccedila Muitos co-fatores tecircm papel importante no desenvolvimento da cirrose
nesses pacientes como por exemplo a idade no momento da infecccedilatildeo (os
contaminados de idade mais avanccedilada tecircm evoluccedilatildeo mais raacutepida da doenccedila
enquanto que os mais jovens a tecircm mais lenta) o alcoolismo (eacute de consenso geral
que o abuso de aacutelcool favorece o aparecimento da cirrose) e a co-infecccedilatildeo com o
Viacuterus da Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida (SIDA) e da HVB
A incidecircncia anual de carcinoma hepatocelular (CHC) eacute de 1 a 4 nos
pacientes cirroacuteticos o que justifica plenamente o controle ecograacutefico do fiacutegado e a
dosagem seacuterica de alfa-fetoproteiacutena nesses pacientes a cada 1-2 anos Por outro
lado nos pacientes com hepatite crocircnica por viacuterus C sem cirrose o CHC eacute muito
raro (LOPES 2010)
Nos casos de cura a atividade das transaminases cessa e os viacuterus natildeo
satildeo detectados (VHC RNA) no soro Nos casos de cronificaccedilatildeo acontece o
contraacuterio ou seja as alteraccedilotildees bioquiacutemicas existem com flutuaccedilotildees e os viacuterus satildeo
detectaacuteveis na grande maioria dos casos Fazem exceccedilatildeo agravequeles pacientes com
22
viremia baixa que por isso mesmo fogem aos limites dos meacutetodos de detecccedilatildeo viral
ou devido agraves flutuaccedilotildees proacuteprias desses niacuteveis virecircmicos (HAYDON et al 1998)
Nos pacientes anti-VHC positivos com enzimas circulantes normais a
falta de VHC RNA no soro tem sido interpretada como sinal de cura completa No
entanto Haydon et al (1998) alteraram essa interpretaccedilatildeo Estes autores
demonstraram a presenccedila de VHC RNA no fiacutegado desses pacientes que eram
negativos no soro independente das alteraccedilotildees bioquiacutemicas positivas ou negativas
do soro ou seja mesmo naqueles casos anteriormente considerados como curados
Assim os niacuteveis de viacuterus intra-hepaacuteticos natildeo satildeo determinados pelos fatores
hospedeiro (idade modo e duraccedilatildeo da infecccedilatildeo) ou virais (VHC genoacutetipos) pois
mesmo as repetidamente Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia-em tempo real (RT-
PCR) negativos para VHC RNA no soro podem ter viacuterus da HCV albergados no
fiacutegado Entretanto existem limitaccedilotildees metodoloacutegicas que devem ser consideradas
nessa interpretaccedilatildeo como por exemplo as limitaccedilotildees do RIBA 3 e do RT-PCR
Mais importante eacute o seguimento dos pacientes ao longo do tempo Assim
Seef et al (1992) em 568 pacientes de hepatite poacutes-transfusional e dois grupos
controles pareados que receberam transfusotildees sem desenvolver hepatite apoacutes 18
anos de seguimento encontraram 33 de mortalidade no grupo 1 e 15 no grupo
controle sendo que a maioria das mortes ocorreu nos pacientes com alcoolismo
associado Evidenciando que a maioria dos que desenvolve doenccedila crocircnica o faz
muito lentamente
Existem ainda no curso natural da doenccedila flutuaccedilotildees intensas e muito
frequumlentes que dependem dos viacuterus e dos hospedeiros a saber niacuteveis da viremia
genoacutetipos 1b graus de diversidade geneacutetica dos viacuterus vias de transmissatildeo (os
inoculados via transfusatildeo apresentam lesotildees hepatocelulares mais ativas)
(GORDON et al 1993 GORDON BAYATI SILVERMAN 1998) deficiecircncias
imunes alcoolismo e co-infecccedilatildeo com HBV e delta ou o Viacuterus da imunodeficiecircncia
humana (HIV) (LOPES 2010) Nestes uacuteltimos casos a co-infecccedilatildeo com muacuteltiplos
viacuterus das hepatites estaacute associada com mais graves lesotildees histoloacutegicas do fiacutegado do
que nos casos de VHC isoladas
Importa saber se os resultados obtidos com os controles feitos se mantecircm
por longos periacuteodos Ou seja como exemplos a atividade da ALT persistentemente
normal a variabilidade do RT-PCR a detecccedilatildeo de VHC RNA pela teacutecnica Reaccedilatildeo
de polimerase em cadeia (PCR) que pode ser negativa devido agrave inadequada
23
armazenagem das amostras agrave contaminaccedilatildeo do soro com substacircncias que
interferem na leitura entre outras causas de erro
As informaccedilotildees sobre as causas que determinam o curso evolutivo da
doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos progressos havidos no campo do
diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHC Uma questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo
genotipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o
genotipo 1 (1b) cursa com lesotildees histoloacutegicas mais graves independentemente da
carga viral Ainda mais os VHC RNA negativos no soro mesmo apoacutes anos de
cura podem recair pois neles persistem os viacuterus no fiacutegado em regime de
replicaccedilatildeo muito baixa indetectaacutevel pelos meacutetodos atuais Ao contraacuterio os negativos
no soro e no fiacutegado tecircm demonstrado respostas boas e sustentadas inclusive no
sentido de se fazer prognoacutestico de cura real e verdadeira infelizmente na grande
minoria dos casos
116 Diagnoacutestico
Quanto mais cedo o diagnoacutestico maiores as chances de detectar a
doenccedila Por isso eacute importante que as pessoas faccedilam o exame especiacutefico porque soacute
esse exame eacute que detecta a HCV E as mulheres tecircm que ter uma atenccedilatildeo em
especial Tempos atraacutes o Correio Braziliense (2003) publicou uma grande mateacuteria
sobre a quantidade de mulheres que vecircm sendo infectadas com a HCV Cuja causa
estava na esterelizaccedilatildeo mal feita dos equipamentos das manicures Uma soluccedilatildeo
praacutetica eacute as mulheres terem seu proacuteprio material pra fazer as unhas e natildeo deixar
mais ningueacutem utilizar (nem matildee nem irmatilde etc) Bem e quem tiver passado por
transfusatildeo dentistas manicures operaccedilotildees etc deve fazer o exame
(KARMOCHKINE et al 1998 apud CONTE 2000 KEER et al 1997)
A HCV natildeo eacute como a Siacutendrome da Imunodeficiecircncia Adquirida (AIDS)
que possui drogas com grande tecnologia e o doente pode viver por muitos e muitos
anos Com a HCV o paciente soacute tem chance de ficar bem se a doenccedila for
diagnosticada e tratada antes dela se manifestar Atualmente o tratamento usa uma
associaccedilatildeo de duas drogas ndash o Interferon e a Ribavirina ldquoAs chances de cura em
meacutedia satildeo de 50rdquo
Barbaro et al (1999) verificaram que os pacientes VHC genoacutetipos 1b
frequumlentemente apresentavam alteraccedilotildees ultraestruturais das mitococircndrias com
24
depleccedilatildeo do mtDNA podendo comprometer o processo de fosforilizaccedilatildeo oxidativa
Sendo assim a produccedilatildeo aumentada de radicais livres nos pacientes VHC genoacutetipos
1b poderia atuar de modo negativo na evoluccedilatildeo da doenccedila hepaacutetica aumentando o
efeito citopaacuteticos do VHC Nesses pacientes haveria portanto aumento de
hiperoxidaccedilatildeo com consequumlente resistecircncia agrave accedilatildeo dos interferons e pior evoluccedilatildeo
da doenccedila hepaacutetica A ser confirmado este fato novas estrateacutegias terapecircuticas
poderatildeo vir a ser desenvolvidas no combate a essa doenccedila
Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila
poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses
autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis
vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo
hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja
quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a
concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave
hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em
parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)
Dos fatos acima expostos decorrem implicaccedilotildees tais como as respostas
CD8-CTL aos antiacutegenos VHC restritas aos complexos de histocompatibilidade
principais (MHC I) com inibiccedilatildeo ou mesmo insuficiente produccedilatildeo de complexo
peptiacutedeo VHC-MHC inibiccedilatildeo direta das ceacutelulas CTLK e a falta de resposta as
citoquininas entre outras dos vaacuterios mecanismos de escape existentes Dentro
desse contexto o niacutevel de morte celular natildeo seria alcanccedilado e a lesatildeo hepatocelular
consequumlente seria portanto miacutenima
Outra implicaccedilatildeo resultante consiste na induccedilatildeo de resposta imune
celular T Helper mediadas a partir de peptide vacinas contra o VHC Estas novas
vacinas tecircm a capacidade de gerar linfoacutecitos T citotoacutexico os CTLs contra o VHC em
camundongo imunizados com peptiacutedeos CTL e ceacutelulas HT epiacutetomes do core VHC
Esses estudos recente em animais de laboratoacuterio vecircm progredindo rapidamente
esperando-se em breve novos recursos no tratamento dessa doenccedila (AGNELLO et
al 1998)
25
12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC
O VHC constitui-se em uma famiacutelia heterogecircnea de viacuterus com no miacutenimo
seis genoacutetipos e inuacutemeros subtipos (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT
SANTOS SILVA 1999) Embora o meacutetodo de maior acuraacutecia para a determinaccedilatildeo
do genoacutetipo do VHC seja a identificaccedilatildeo completa da sequumlecircncia dos 9500
nucleotiacutedeos e a construccedilatildeo de uma aacutervore filogeneacutetica esse meacutetodo soacute pode ser
utilizado em laboratoacuterios de pesquisa (BARBOSA SILVA MARTINS 2005) e natildeo
em laboratoacuterios cliacutenicos Assim foram desenvolvidos meacutetodos para genotipagem
utilizando apenas as regiotildees mais conservadas do genoma como a proteiacutena do
envoltoacuterio (E1) a proteiacutena core e a proteiacutena natildeo estrutural NS5B A sequumlecircncia dos
nucleotiacutedeos dentro dessas regiotildees relativamente conservadas eacute genoacutetipo-
especiacutefico e os isolados podem ser genotipados independentemente da regiatildeo que
for utilizada para anaacutelise (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS
SILVA 1999) Para uso em laboratoacuterios cliacutenicos foram desenvolvidas basicamente
duas metodologias que se valem de teacutecnicas de biologia molecular (genotipagem)
ou citoloacutegicas (serotipagem)
Os meacutetodos que adotam teacutecnica de biologia molecular para genotipagem
utilizando porccedilotildees do genoma incluem a PCR aninhada (nested PCR) (BASSIT
SANTOS SILVA 1999) a teacutecnica de restriction fragment length polymorphism
(RFLP) (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS SILVA 1999) a
hibridizaccedilatildeo reversa (BASSIT SANTOS SILVA 1999) (INNO-LiPA Innogenetics
Beacutelgica Gen Eti DEIA HCV Sorin Biomedica Itaacutelia) e o sequumlenciamento direto da
regiatildeo natildeo-codificante 5 (TruGene Visible Genetics Canadaacute) Suas principais
vantagens satildeo a informaccedilatildeo direta sobre sequumlecircncia dos nucleotiacutedeos do genoma
viral a alta sensibilidade por se basearem na PCR e a possibilidade de identificar o
subtipo viral (BARBOSA SILVA MARTINS 2005)
Os meacutetodos para determinaccedilatildeo do genoacutetipo que utilizam serotipagem
baseiam-se na detecccedilatildeo de anticorpos genoacutetipos-especiacuteficos contra epiacutetopos do
VHC (por exemplo proteiacutenas da regiatildeo do core) (BLOCK SCHIANO 1999) Os
testes comercializados utilizam diferentes teacutecnicas ELISA competitivos ou
immunoblot (Murex-HC1-6 Murex Diagnostics Ltd Reino Unido RIBA HCV
Serotyping Assay Chiron Diagnostics Estados Unidos) As principais vantagens da
teacutecnica de serotipagem satildeo o baixo custo e maior facilidade de realizaccedilatildeo em
26
comparaccedilatildeo com os testes de biologia molecular (BLOCK SCHIANO 1999 De
LARANAGA et al 2000)
A determinaccedilatildeo do genoacutetipo anteriormente utilizada em pesquisas mas
sem maior utilidade na praacutetica meacutedica atualmente eacute recomendada para uso cliacutenico
Como jaacute mencionado os pacientes infectados pelo genoacutetipo 1 do VHC devem ser
tratados por 12 meses enquanto os demais por 6 meses (BASSIT SANTOS SILVA
1999)
A determinaccedilatildeo do genoacutetipo do VHC pode ser feita por PCR ou
serotipagem A primeira teacutecnica eacute mais sensiacutevel e possibilita a identificaccedilatildeo de
subtipos do VHC Contudo a segunda eacute de mais faacutecil realizaccedilatildeo e mais barata
razatildeo pela que eacute importante que a teacutecnica seja aprimorada
Oliveira et al (1999) investigaram os padrotildees de distribuiccedilatildeo dos
genoacutetipos do VHC estudando 250 pacientes anti-VHC positivos atraveacutes da
detecccedilatildeo VHC RNA pelo RT-PCR e encontraram prevalecircncia de 72 para o VHC 1
253 para o tipo 3 2 para o 2 e 07 para o 4 semelhantes aos das vaacuterias
regiotildees mundiais
13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC
As manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo pelo VHC satildeo as mais
variadas possiacuteveis A diversidade de resposta do hospedeiro ao agente infeccioso
variando desde quadros assintomaacuteticos ateacute aqueles com evoluccedilatildeo grave fatal ou
incapacitante tem estimulado a busca por justificativas de tais discrepacircncias
cliacutenicas sobretudo na imunomodulaccedilatildeo Dentre as infecccedilotildees mais bem estudadas
destacam-se aquelas pelos Viacuterus da hepatite C Viacuterus da imunodeficiecircncia humana1
(HIV-1) pelo Herpes viacuterus humano 4 (viacuterus do Epstein Baar) e pelo Mycobacterium
leprae (ABBAS LICHTMAN 2005)
A agressatildeo hepaacutetica por auto-imunidade eacute um fenocircmeno reconhecido em
vaacuterias doenccedilas do fiacutegado inclusive nas de etiologia viral Aleacutem do agente agressor e
de sua interaccedilatildeo com o sistema imunoloacutegico do hospedeiro fatores ambientais ou
hormonais estatildeo aparentemente envolvidos no surgimento de auto-imunidade
hepaacutetica como se supotildee acontecer na hepatite auto-imune em indiviacuteduos
geneticamente suscetiacuteveis (CODES et al 2002)
27
A lesatildeo hepatocelular relacionada agrave infecccedilatildeo pelos viacuterus hepatotroacutepicos e
pelos herpes viacuterus (citomegaloviacuterus e Epstein-Barr) eacute secundaacuteria a uma resposta
auto-imune do hospedeiro Estes viacuterus natildeo parecem ser diretamente citopaacuteticos
mas desencadeiam lesatildeo hepaacutetica atraveacutes da resposta imune do hospedeiro contra
ceacutelulas hepaacuteticas infectadas (MALOY POWRIE 2001)
Existem estudos que focalizam alteraccedilotildees imunoloacutegicas em hepatites
virais entretanto a maioria deles mostra resultados pontuais sem seguimento na
fase aguda da doenccedila (BLOCK SCHIANO 1999 McFARLONE et al 1990) Aleacutem
disso ainda natildeo se estabeleceu uma associaccedilatildeo entre as reaccedilotildees auto-imunes
transitoacuterias induzidas por viroses hepatotroacutepicas e agravamento do dano tecidual na
hepatite viral
A infecccedilatildeo crocircnica estaacute fortemente associada agrave crioglobulinemia mista
essencial glomerulonefrite membrano-proliferativa e porfiria cutacircnea tardia De
forma menos impressiva encontra-se tambeacutem associada agrave uacutelcera corneana de
Mooren liacutequen plano e fibrose pulmonar (KILLENBERG 2000 WENER et al 1996)
A ocorrecircncia de anticorpos antitireoidianos e hipotireoidismo tem sido relatada em
associaccedilatildeo com a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC em mulheres (KILLENBERG 2000
CACOUB et al 1999)
A associaccedilatildeo entre a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC a presenccedila do fator
reumatoacuteide e do anticorpo antinuclear (FAN) o fenocircmeno de Raynaud e doenccedilas
difusas do tecido conjuntivo (DDTC) como artrite reumatoacuteide luacutepus eritematoso
sistecircmico siacutendrome de Sjoumlgren e vasculites sistecircmicas eacute relatada em alguns
trabalhos (CACOUB et al 1999 LOVY STARKEBAUM UBEROI 1996 STAUB
1998 WENER et al 1996)
14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE
A associaccedilatildeo entre doenccedilas infecciosas e autoimunidade apresentando-
se com manifestaccedilotildees cliacutenicas ou detectadas apenas pelo desenvolvimento de auto-
anticorpos tem sido amplamente documentado Infecccedilotildees virais bacterianas e
parasitaacuterias podem estar envolvidas no desenvolvimento recidivas e ateacute mesmo na
prevenccedilatildeo de doenccedilas auto-imunes (KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)
Ribeiro e Proietti (2004) avaliaram a frequumlecircncia de FR anticorpos
antipeptiacutedeo citrulinado ciacuteclico (anti-CCP) AAN anticorpos anti-citoplasma de
28
neutroacutefilos (ANCA) anticorpos anticardiolipina (aCL) e anticorpos anti-β2
glicoproteiacutena I (anti-β2GPI) em pacientes com hanseniacutease Existe estudo
demonstrando pacientes que apresentavam manifestaccedilotildees articulares comparados
aos que natildeo apresentavam envolvimento articular e um grupo controle de indiviacuteduos
saudaacuteveis com idade e gecircnero semelhantes aos dos pacientes estudados e que
residiam na mesma aacuterea geograacutefica A maioria dos pacientes nos dois grupos (com
e sem envolvimento articular) apresentava hanseniacutease generalizada Entretanto
observaram uma baixa frequumlecircncia que natildeo foi significativamente diferente de FR
anti-CCP AAN e ANCA em pacientes com hanseniacutease (nos dois grupos) e normal
dos controles Mas a prevalecircncia de anticorpos aCL e anti-β2GPI estava
significativamente elevada nos pacientes com hanseniacutease quando comparados com
o grupo controle apesar de natildeo haver associaccedilatildeo significativa com o envolvimento
articular O isoacutetopo predominante dos dois autoanticorpos foi a IgM (487) dos
pacientes com hanseniacutease apresentava pelo menos um anticorpo antifosfoliacutepide
Aleacutem disso os autores observaram uma associaccedilatildeo entre a positividade para aCL e
as manifestaccedilotildees cliacutenicas jaacute que os pacientes com anticorpos aCL apresentavam
doenccedila Hanseniacutease generalizada (VV) com mais frequumlecircncia (p= 0002) Natildeo houve
associaccedilatildeo entre a presenccedila de anticorpos aCL ou anti-β2GPI e episoacutedios
reacionais poreacutem entre os pacientes com esses episoacutedios aqueles com anticorpos
aCL apresentavam eritema nodoso hansecircnico (ENH) em 100 dos casos enquanto
entre os pacientes negativos para aCL 57 apresentavam ENH Apesar de uma
alta taxa de concordacircncia para a presenccedila de anticorpos aCL e anti-β2GPI ter sido
observada manifestaccedilotildees tromboemboacutelicas natildeo foram observadas (RIBEIRO
PROIETTI 2004 2005)
Horimoto e Costa (2009) avaliaram pacientes com Leishmania
(leishmaniose visceral e leishmaniose cutacircnea) para a presenccedila de anticorpos anti-
Leishmania assim como FR AAN anti-DNA anti-Sm anti-RNP anti-Ro anti-La
aCL e complemento (C3 e C4) Como esperado os pacientes com leishmaniose
visceral apresentava anticorpos anti-Leishmania Tiacutetulos significativamente elevados
de AANs na maioria dos pacientes o anti-DNA foi detectado em poucos pacientes
com doenccedila visceral assim como tiacutetulos elevados de anticorpos aCL (isotipo IgG)
quando comparados com os pacientes com leishmaniose cutacircnea Niacuteveis reduzidos
de complemento tambeacutem satildeo evidentes na doenccedila visceral assim como niacuteveis
significativamente reduzidos de C3 Outros estudos comparam e discutem os
29
resultados em relaccedilatildeo agrave crescente evidecircncia na literatura da presenccedila de
autoanticorpos em ambas as doenccedilas Em geral a prevalecircncia variaacutevel de auto-
anticorpos relatada assim como relatos preacutevios na literatura podem estar
relacionados a diferenccedilas metodoloacutegicas como o tipo de ensaio utilizado a
definiccedilatildeo dos pontos de corte inativaccedilatildeo dos soros pelo calor seleccedilatildeo de pacientes
e variaccedilotildees eacutetnicas e geograacuteficas nos grupos de pacientes Mas um dos resultados
consistentes foi a frequumlecircncia significativamente mais elevada de anticorpos
antifosfoliacutepide aCL e anti-β2GPI em pacientes com hanseniacutease enquanto
anticorpos AAN e aCL foram detectados com mais frequumlecircncia nos pacientes com
leishmaniose visceral A incidecircncia aumentada de anticorpos AAN e aCL nos
pacientes com leishmaniose visceral eacute compatiacutevel com outros estudos (OSSADRON
et al 2006 SAKKAS et al 2008 VOULGARI et al 2004) e demonstra
semelhanccedilas das manifestaccedilotildees cliacutenicas e laboratoriais entre a leishmaniose
visceral e o luacutepus eritematoso sistecircmico (LES) Aleacutem disso a reatividade cruzada
entre AAN e anticorpos anti-Leishmania jaacute foi tambeacutem relatada (GRANEL et al
2000)
Diversos grupos documentaram niacuteveis elevados de anticorpos
antifosfoliacutepide (aCL anti-β2GPI e anti-protrombina) em diversas doenccedilas
infecciosas como a siacutefilis doenccedilas virais (incluindo a hepatite C Parvoviacuterus B19 e
HIV) malaacuteria e hanseniacutease sem as manifestaccedilotildees cliacutenicas da siacutendrome
antifosfoliacutepide (SAF) (ZANDMAN-GODDARD BLANK SHOENFELD 2002) Os
tiacutetulos elevados geralmente satildeo transitoacuterios diminuindo e desaparecendo apoacutes a
resoluccedilatildeo da infecccedilatildeo (LOIZOU et al 2003 ZANDMAN-GODDARD BLANK
SHOENFELD 2002) Mas em uma minoria dos pacientes a associaccedilatildeo entre
doenccedilas infecciosas e anticorpos antifosfoliacutepide pode levar a complicaccedilotildees severas
frequumlentemente fatais ou seja SAF catastroacutefica (ZANDMAN-GODDARD BLANK
SHOENFELD 2002)
Os resultados de Ribeiro e Proietti (2005) mostrando um aumento da
incidecircncia de anticorpos anti-β2-GPI em pacientes com hanseniacutease associados aos
dados de outros grupos (De LARANAGA et al 2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK
et al 1994 LOIZOU et al 2003) que tambeacutem documentaram niacuteveis elevados de
anticorpos anti-2βGPI lanccedilam duacutevidas sobre a noccedilatildeo de que os anticorpos aCL
associados a infecccedilotildees satildeo independentes dos anticorpos anti-β2GPI e natildeo
dependentes desses anticorpos como nas doenccedilas auto-imunes Em conjunto
30
esses resultados apoacuteiam a noccedilatildeo de que na presenccedila de infecccedilotildees anticorpos aCL
satildeo heterogecircneos em relaccedilatildeo agrave sua dependecircncia da 2GPI (De LARANAGA et al
2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK et al 1994 LOIZOU et al 2003) e as infecccedilotildees
podem desencadear a induccedilatildeo de anticorpos antifosfoliacutepide patogecircnicos em
indiviacuteduos predispostos (LOIZOU et al 2003)
A produccedilatildeo de autoanticorpos na hanseniacutease e leishmaniose pode ser
explicada por diversos mecanismos Na forma mais generalizada dessas doenccedilas
(hanseniacutease VV e leishmaniose visceral) os pacientes apresentam
hipergamaglobulinemia difusa semelhante agrave vista em outras infecccedilotildees como
Schistosoma mansoni T cruzi e Plasmodium A induccedilatildeo de autoanticorpos pode ser
atribuiacuteda agrave ativaccedilatildeo policlonal e proliferaccedilatildeo das ceacutelulas B algumas com auto-
reatividade pertencentes agrave biblioteca de anticorpos naturais em indiviacuteduos normais
(ARGOV et al 1989) Na leishmaniose antiacutegenos soluacuteveis derivados da L major e
L donovani satildeo mitogecircnicos e desencadeiam a produccedilatildeo de imunoglobulinas com
auto-reatividade (ARGOV et al 1989) Crioglobulinemia mista induzida pelo HCV eacute
outro exemplo de ativaccedilatildeo policlonal persistente levando a uma mistura de
autoanticorpos policlonais e monoclonais os quais causam doenccedilas auto-imunes
(AGMON-LEVIN et al 2009)
Mimetismo molecular ou homologias estruturais entre infecccedilotildees e
componentes do hospedeiro podem ser agrave base da produccedilatildeo de autoanticorpos
como no caso da febre reumaacutetica onde o componente M da membrana do
estreptococo apresenta homologia com peptiacutedeos cardiacuteacos cerebrais e sinoviais A
associaccedilatildeo da siacutendrome de Guillain-Barreacute com a infecccedilatildeo pelo Campylobacter
jejeuni representa outro exemplo de mimetismo molecular como base de uma
manifestaccedilatildeo auto-imune A reatividade cruzada entre agentes infecciosos e auto-
antiacutegenos jaacute foi demonstrada para o M leprae (McADAM MUDD SHOENFELD
1984) e M tuberculosis (SHOENFELD et al 1986) e a inibiccedilatildeo de anticorpos anti-
Sm anti-RNP e anti-SSB por promastigotas intactas de Leishmania apoacuteia a
homologia entre antiacutegenos nucleares e a Leishmania (ARGOV et al 1989)
A disseminaccedilatildeo de epiacutetopos a emergecircncia de novos anticorpos ou a
resposta de ceacutelulas T a um novo epiacutetopo (subdominante ou criacuteptico) no mesmo
antiacutegeno ou em outro antiacutegeno foi demonstrada em modelos experimentais e na
doenccedila humana alguns autores demonstraram a disseminaccedilatildeo molecular do
antiacutegeno Sm para reatividade anti-RNP (STAUB 1998) no LES enquanto na febre
31
reumaacutetica o estado de autoimunidade crocircnica que afeta as vaacutelvulas cardiacuteacas pode
resultar em uma resposta imunoloacutegica contra o colaacutegeno e laminina (KIVITY et al
2009 PORDEUS et al 2008) As infecccedilotildees tambeacutem podem desempenhar um papel
importante na induccedilatildeo da autoimunidade atraveacutes da liberaccedilatildeo de antiacutegenos
sequumlestrados apoacutes lesatildeo tecidual ou aumentando a exibiccedilatildeo de epiacutetopos criacutepticos
no meio inflamatoacuterio apresentando assim novos antiacutegenos ao sistema imunoloacutegico
(KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)
15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES
AGUDAS VIRAIS
O conceito de auto-imunidade induzida por viacuterus natildeo eacute exclusivo para
doenccedilas hepaacuteticas O viacuterus Coxsackie do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um
terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite infecciosa e estaacute implicado nas miocardites
auto-imunes reagindo contra a miosina cardiacuteaca (GIST BELL 1974) Niwa et al
(1984) encontraram elevaccedilatildeo transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator
reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas
virais comuns como varicela sarampo influenza caxumba herpes zoster e
exantema suacutebito
A patogecircnia da infecccedilatildeo viral inclui pelo menos trecircs tipos de interaccedilotildees
com o hospedeiro vertebrado 1) o efeito do agente sobre as ceacutelulas 2) a maneira
de disseminaccedilatildeo do agente no organismo infectado 3) a resposta imunoloacutegica e a
sua influencia no processo infeccioso Destacam-se dois tipos principais da
interaccedilatildeo a destruiccedilatildeo celular e a resposta imunoloacutegica (FIGUEIREDO 1999
CATALAN-SOARES PROIETTI CARNEIRO-PROIETTI 2006) O viacuterus Coxsackie
do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite
infecciosa e estaacute implicado nas miocardites auto-imunes reagindo contra a miosina
cardiacuteaca (GERSHON KONDO 1971) Niwa et al (1984) encontraram elevaccedilatildeo
transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo
anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas virais comuns como varicela sarampo
influenza caxumba herpes zoster e exantema suacutebito
32
16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN
De acordo com o II Consenso Brasileiro de FAN em HEp 2
(DELLAVANCE et al 2003) os AAN satildeo encontrados comumente em uma
variedade de doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Satildeo uacuteteis na investigaccedilatildeo dessas
doenccedilas auxiliando no diagnoacutestico de patologias como LES esclerose sistecircmica
progressiva (ESP) doenccedila mista do tecido conjuntivo (DMTC) siacutendrome de Sjoumlgren
(SS) polimiosite e dermatomiosite
Eles podem estar presentes em um pequeno percentual da populaccedilatildeo
aparentemente sadia essa frequumlecircncia eacute maior em mulheres e aumenta com a idade
Segundo a literatura a positividade entre 20 a 60 anos varia entre percentuais mais
altos (133) para tiacutetulos baixos e mais baixos (33) para tiacutetulos mais elevados
(DELLAVANCE et al 2003)
A pesquisa dos anticorpos antinucleares pode ser realizada por diferentes
teacutecnicas a imunofluorescecircncia indireta eacute a mais utilizada por sua sensibilidade
reprodutibilidade e facilidade de execuccedilatildeo A sensibilidade aumenta
significativamente quando se utiliza como substrato lacircminas com ceacutelulas Hep 2
(ceacutelulas de carcinoma de laringe humana) por causa da maior expressatildeo de
antiacutegenos na superfiacutecie dessas ceacutelulas comparados aos expressos nas ceacutelulas de
fiacutegado ou de rins de camundongos que se utilizavam anteriormente
Em geral eacute possiacutevel detectar melhor a presenccedila de AAN por associaccedilatildeo
de trecircs anti-soros isotipos especiacuteficos (anti-IgG anti-IgA e anti-IgM) A pesquisa
realizada por essa teacutecnica serve de triagem inicial para a presenccedila de AAN Eacute
normalmente denominada pesquisa de FAN ou AAN
A realizaccedilatildeo de outras metodologias tais como as imunoenzimaacuteticas
permite uma avaliaccedilatildeo isolada dos diferentes auto-anticorpos sugeridos pelos
padrotildees de fluorescecircncia encontrados no FAN A identificaccedilatildeo desses AAN permite
um diagnoacutestico mais preciso e eles podem ser utilizados em muitos casos como
marcador para uma das diferentes doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Muitas dessas
patologias apresentam um perfil distinto de auto-anticorpos que auxilia o diagnoacutestico
A presenccedila de FAN positivo em pessoas aparentemente sadias pode ser
devida a algumas situaccedilotildees
minus Doenccedila auto-imune precoce ainda natildeo expressa clinicamente
33
minus distuacuterbio imunoloacutegico transitoacuterio causado por doenccedila natildeo-imune
tais como infecccedilotildees principalmente virais
minus uso de medicamentos e neoplasias
minus manifestaccedilatildeo incompleta de uma siacutendrome ou seja o paciente
sintetiza o anticorpo poreacutem esse quadro natildeo evolui para doenccedila
minus fenocircmeno auto-imune fisioloacutegico
O resultado do FAN eacute expresso em tiacutetulo e padratildeo uma vez que ambos
os paracircmetros tecircm importacircncia para a avaliaccedilatildeo do significado cliacutenico do exame O
tiacutetulo do FAN corresponde agrave maior diluiccedilatildeo capaz de demonstrar fluorescecircncia
inequiacutevoca e didaticamente pode ser dividido em
minus Baixo menor 180
minus Moderado 1160
minus Moderadamente elevado 1320
minus Alto maior 1640
Nas pesquisas realizadas por imunofluorescecircncia indireta os resultados
satildeo expressos em tiacutetulos segundo as diluiccedilotildees empregadas Eacute possiacutevel trabalhar
utilizando-se como limite tiacutetulos de 140 que permitem maior sensibilidade ou de
180 que permitem maior especificidade ou seja um menor nuacutemero de falso-
positivos
Na praacutetica cliacutenica satildeo considerados significativos tiacutetulos superiores a
1160 Os resultados com tiacutetulos positivos satildeo acompanhados pela descriccedilatildeo do
padratildeo de fluorescecircncia encontrado que serve como orientaccedilatildeo da presenccedila de um
antiacutegeno especiacutefico e em alguns casos como padratildeo diagnoacutestico Em determinadas
situaccedilotildees em especial no LES em atividade pode ocorrer agrave observaccedilatildeo de mais de
um padratildeo de fluorescecircncia
O padratildeo do FAN a seu turno aponta uma probabilidade maior ou menor
de doenccedila auto-imune e ateacute mesmo sugere o antiacutegeno nuclear envolvido e por
consequumlecircncia a afecccedilatildeo com ele mais relacionada Os padrotildees homogecircneo
centromeacuterico e pontilhado grosso satildeo os mais indicativos de processos de
autoimunidade uma vez que se associam a diversas condiccedilotildees reumaacuteticas
especialmente ao LES e agrave esclerose sistecircmica e tambeacutem a enfermidades hepaacuteticas
tais como a cirrose biliar primaacuteria e a hepatite auto-imune (KILLENBERG 2000)
34
Jaacute o pontilhado fino o pontilhado grosso reticulado e a membrana nuclear
tecircm maior significado quando encontrados em tiacutetulos altos uma vez que podem
estar presentes em tiacutetulos baixos em indiviacuteduos hiacutegidos Por sua vez o pontilhado
fino denso mesmo quando elevado em pessoas assintomaacuteticas soacute guarda relaccedilatildeo
com alguma doenccedila em cerca de 20 dos casos (DELLAVANCE et al 2003)
O padratildeo pontilhado pode tambeacutem ser referido como padratildeo salpicado
Outros padrotildees de fluorescecircncia podem ser encontrados em menor frequumlecircncia Os
pontilhados citoplasmaacutetico grossos ou reticulares associados agrave presenccedila de
anticorpos antimitococircndrias em pacientes com cirrose biliar primaacuteria o
citoplasmaacutetico homogecircneo relacionado a proteiacutenas ribossocircmicas em pacientes com
LES e o padratildeo pontilhado fino citoplasmaacutetico que pode estar associado agrave
presenccedila de anticorpos anti-JO-1 anti-PCNA e proteiacutenas da membrana celular em
pacientes com LES outras patologias do tecido conjuntivo e hepatopatias auto-
imunes (DELLAVANCE et al 2003)
Quadro 1 - Padrotildees de fluorescecircncia encontrados em maior frequumlecircncia e patologias relacionadas
Padrotildees de Fluorececircncia Antiacutegenos Patologias Relacionadas
Perifeacuterico DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES
Homogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA
LES AR lupus induzido por drogas
Perifeacutericohomogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES
Pontilhado grosso SM RNP LES DMTC
Pontilhado fino nuclear SS-A (RO) SS-B (La) SS LES
Nucleolar Proteiacutenas Nucleolares ESP Centromeacuterico Proteiacutenas de centrocircmeros Siacutendrome de CREST
Fonte Dellavance et al 2003 Quadro 2 - Anti-ena - auto-anticorpos contra antiacutegenos extraiacutedos do nuacutecleo e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleares Patologias Relacionadas SM LES RNP DMTC LES ESP AR e Polimiosite
SS-A (Ro) SS LES lupus neonatal e forma cutacircnea subaguda
SS-B (La) SS LES luacutepus neonatal e forma cutacircnea subaguda
Scl 70 ESP Jo -1 Polimiosite e dermatomiosite Fonte Dellavance et al 2003
35
Quadro 3 ndash Padrotildees de FAN nuclear e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes
Padrotildees Nucleares Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos
Nuclear Pontilhado Centromeacuterico Anticorpo anti-centrocircmero Esclerose Sistecircmica forma CREST Cirrose Biliar Primaacuteria
Nuclear homogecircneo Anticorpo anti-DNA nativo Lupus Eritematoso Sistecircmico (LES) Anticorpo anti-Histoma LES induzido por drogas LES idiopaacutetico Anticorpo anti-cromatina (DNAHistona Nucleossomo) Artrite Reumatoacuteide (AR) Artrite Idiopaacutetica Juvenil importante associaccedilatildeo com uveiacutete na forma oligoarticular Siacutendrome de Felty Cirrose Billar Primaacuteria
Nuclear tipo membrana nuclear contiacutenua Anticorpo anti-Iamin e contra envelope nuclear - Iamins Hepatites auto-imunes Raramente associado a doenccedilas reumaacuteticas (algumas formas de LES e esclerodermia linear)
Nuclear pontilhado pleomoacuterficoPCNA Anticorpo contra nuacutecleo de ceacutelulas em proliferaccedilatildeo LES
Nuclear pontilhado fino denso Anticorpo anti-proteina p 75 kDa pode ser encontrado em indiviacuteduos saudaacuteveis processos inflamatoacuterios inespeciacuteficos doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Cistite Intersticial Dermatite Atoacutepica Psoriacutease e Asma
Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos
Anticorpo anti-p80 coilina natildeo apresenta associaccedilatildeo cliacutenica definida
Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos
Anticorpo anti-Sp100 (anti-p95) Cirrose Biliar Primaacuteria pode ocorrer em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas
Nuclear pontilhado grosso Anticorpo anti-Sm LES Anticorpo anti-RNP criteacuterio obrigatoacuterio no diagnostico da doenccedila mista do Tecido conjuntivo (DMTC) tambeacutem ocorre no LES Esclerose Sistecircmica (ES) e AR
Nuclear pontilhado fino Anticorpo anti SSARo Siacutendrome de Sjogren Primaacuteria (SS) LES Lupus neonatal e Lupus Cutacircneo Subagudo Anticorpo anti-SSBLa Lupus neonatal LES SS Anticorpo anti-Mi-2 Dermatomiosite embora raramente ocorra na polimiosite do adulto
Fonte Dellavance et al 2003
36
Quadro 4 - Padrotildees de FAN citoplasmaacuteticos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes
Padrotildees Citoplasmaacuteticos e Relacionados ao Aparelho Mitoacutetico Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos
Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina Hepatite auto-imune Cirrose Anticorpo anti-miosine Hepatite C Hepatocarcionoma Miastenia Gravis Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida
Citoplasmaacutetico Fibrilar Segmentar Anti actinina anti--vinculina e anti-tropomiose Miastenia Gravis Doenccedila de Crohn e Colite ulcerativa Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia cliacutenica definida
Citoplasmaacutetico Pontilhado Polar Anticorpo Anti-golginas (cisternas do aparelho de Golgi) raro no LES SS e outras doenccedilas auto-imunes sistecircmicas Relato na Ataxia Cerebelar Idiopaacutetica Degeneraccedilatildeo Cerebelar Paraneoplaacutesica infecccedilotildees virais pelo Epstein Barr (EBV) e pelo viacuterus da imunodeficiecircncia Humana (HIV) Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida
Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Anticorpo anti-Histidill t RNA sintetase (Jo-1) anticorpo marcador de Polimiosite no adulto Descrito raramente na Dermatomiosite
Citoplasmaacutetico Pontilhado com Pontos Isolados
Anticorpo anti-EEA1 e anti-fosfatidilserina natildeo haacute associaccedilotildees clinicas bem definida Anticorpo anti-GWBSS tambeacutem encontrado em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas
Citoplasmaacutetico Pontilhado Reticulado Anticorpo anti-mitococircndria Cirrose Biliar Primaacuteria Esclerose Sistecircmica Eacute relativamente comum o encontro deste padratildeo na ausecircncia de anticorpos anti-mitococircndria
Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Denso Anti PL7PL12 Raramente associado a Polimiosite Anticorpo P-ribossomal Este padratildeo ocorre no LES se a associaccedilatildeo eacute com anti-proteina P ribossomal
Citoplasmaacutetico Fibrilar Filamentar Anticorpo anti-vimentina e anti-queratina Anti-queratina eacute o anticorpo mais importante em doenccedila hepaacutetica alcooacutelica Descritos em vaacuterias doenccedilas inflamatoacuterias e infecciosas Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida
Aparelho mitoacutetico Tipo Centriacuteolo Anticorpo anti-enolase em baixos tiacutetulos natildeo tem associaccedilatildeo cliacutenica definida Em altos tiacutetulos eacute sugestivo de Esclerose Sistecircmica
Aparelho mitoacutetico Tipo ponte Intercelular
Anticorpo anti Tubulina Pode ser encontrado no LES e na DMTC outros anticorpos ainda natildeo bem definidos podem gerar o mesmo padratildeo
Aparelho mitoacutetico Tipo NuMa2 Anticorpo anti-HsEg5 diversas condiccedilotildees auto-imunes com baixa especificidade
Fonte Dellavance et al 2003
37
Quadro 5 - Padrotildees de FAN mistos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Mistos Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos
Misto do tipo nucleolar homogecircneo e nuclear pontilhado grosso com placa metafaacutesica decorada em anel (cromossomos negativos)
Anticorpo anti-Ku Superposiccedilatildeo Polimiose e Esclerose Sistecircmica Podem ocorrer no LES e Esclerodermia
Misto do tipo nuclear e nucleolar pontilhado com placa metafaacutesica positiva
Anticorpo anti-topoisomerase (Scl-70) ES forma difusa Mais raramente pode ocorrer na Siacutendrome CREST e superposiccedilatildeo PolimiositeEsclerodermia
Misto do tipo Citoplasmaacutetico pontilhado fino denso e homogecircneo e nucleolar homogecircneo
Anticorpo anti rRNP LES frequumlentemente relacionado agrave Psicose Luacutepica
Misto do tipo nuclear pontilhado fino com fluorescecircncia do aparelho mitoacutetico
Anticorpo anti-NuMA1SS pode ocorrer tambeacutem em outras condiccedilotildees auto-imunes ou inflamatoacuterias crocircnicas
Fonte Dellavance et al 2003
Quadro 6 - Padrotildees de FAN nucleolares e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleolares Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos
Nucleolar Aglomerado
Anticorpo anti-Fibrilarina (U3-nRNP) Esclerose Sistecircmica (ES) especialmente com comprometimento visceral grave entre eles a hipertensatildeo pulmonar
Nucleolar Pontilhado
Anticorpo anti-NOR-90 ES tambeacutem descrito em outras doenccedilas do tecido conjuntivo poreacutem sem relevacircncia clinica definida Anticorpos anti-RNA polimerase I ES de forma difusa com tendecircncia para comprometimento visceral mais frequumlente e grave
Nucleolar Homogecircneo
Anticorpo anti-PMScl Siacutendrome de Superposiccedilatildeo de Polimiosite com Esclerose Sistecircmica Raramente encontrado em casos de Polimiosite ou Esclerose Sistecircmica sem superposiccedilatildeo cliacutenica Outros auto-anticorpos mais raros podem apresentar esse padratildeo
Fonte Dellavance et al 2003
De acordo com o 3deg Consenso (DELLAVANCE et al 2009) foram
comunicados dois novos padrotildees de fluorescecircncia por participantes Vaacuterios outros
membros testemunharam jaacute haver observado esses padrotildees O primeiro trata-se de
um padratildeo nuclear pontilhado fino aproximando-se da textura homogecircnea e com
placa metafaacutesica corada da mesma forma Sua associaccedilatildeo cliacutenica e identidade
imunoloacutegica natildeo estatildeo definidas Sua importacircncia deriva do fato de que pode ser
facilmente confundido com o padratildeo pontilhado fino denso e com o padratildeo
homogecircneo O segundo trata-se de um padratildeo citoplasmaacutetico em forma de
pequenos bastotildees (rods) e ciacuterculos (rings) que aparentemente estaacute associado agrave
38
infecccedilatildeo pelo HCV Haacute estudos em curso por alguns grupos de pesquisa com a
finalidade de estabelecer sua identidade imunoloacutegica
Como ainda natildeo estatildeo definitivamente caracterizados esses dois novos
padrotildees foram considerados preliminares e o 3deg Consenso recomendou que os
mesmos fossem completamente caracterizados e apresentados na proacutexima versatildeo
do Consenso (DELLAVANCE et al 2009)
39
2 JUSTIFICATIVA
As inflamaccedilotildees do fiacutegado provocadas pelos viacuterus hepatotroacutepicos atingem
milhotildees de pessoas e representam significativos problemas de sauacutede puacuteblica em
todo o mundo No Brasil a Regiatildeo Norte responde por um significativo percentual
dos portadores de hepatite C Dentre as manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo
pelo viacuterus C as doenccedilas autoimunes tecircm significativo impacto na evoluccedilatildeo cliacutenica
desses pacientes A presenccedila de anticorpo antinuacutecleo eacute um marcador importante de
autoimunidade e apesar de existirem trabalhos relatando a pesquisa desse fator em
portadores de viacuterus C tais estudos ainda natildeo foram realizados na nossa regiatildeo
sobretudo correlacionando-se com o genoacutetipo do viacuterus responsaacutevel pela infecccedilatildeo
considerando que o genoacutetipo eacute um marcador de resposta ao tratamento ou
considerando que pacientes portadores do genoacutetipo 1 natildeo respondem
satisfatoriamente ao tratamento instituiacutedo pelo protocolo atual
21 ASPECTOS EacuteTICOS
A pesquisa a ser realizada apresenta relevacircncia social e natildeo perde o
sentido de sua destinaccedilatildeo soacutecio-humanitaacuteria (justiccedila e equidade)
Este trabalho adequa-se aos princiacutepios cientiacuteficos que o justificam e
apresenta possibilidade concreta de responder a incertezas tais como FAN e o
genoacutetipo viral em pacientes com infecccedilatildeo pelo viacuterus da hepatite C ldquoestatildeo
relacionadosrdquo
Segue rigorosamente os procedimentos descritos na Resoluccedilatildeo 19696-
CNSMS (BRASIL 1996) assegurando a confidenciabilidade e proteccedilatildeo da
identidade do sujeito da pesquisa no momento da afericcedilatildeo dos dados e sua
posterior utilizaccedilatildeo
Por tratar-se de um estudo que faraacute somente revisatildeo de soroteca os
participantes natildeo seratildeo submetidos a riscos de origem orgacircnica eou quiacutemica
40
3 OBJETIVOS
31 OBJETIVO GERAL
Estabelecer associaccedilatildeo entre a presenccedila de teste de FAN e o genoacutetipo
viral em pacientes portadores de infecccedilatildeo pelo HCV
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
I Identificar o padratildeo de fluorescecircncia do FAN em pacientes com diagnoacutestico
laboratorial de infecccedilatildeo pelo HCV
II Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados
pelo HCV de acordo com o gecircnero e a idade
III Identificar a prevalecircncia de FAN em pacientes infectados pelo HCV e natildeo
infectados
IV Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados
pelo HCV de acordo com as alteraccedilotildees bioquiacutemicas
41
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO)
Foi realizado um estudo transversal analiacutetico no Serviccedilo do Nuacutecleo de
Medicina Tropical da Universidade Federal do Paraacute (NMTUFPA) utilizando-se
pacientes oriundos da Fundaccedilatildeo Centro de Hemoterapia e Hematologia do Paraacute
(HEMOPA) e Plano de Assistecircncia ao Servidor (PASIASEP) com coleta de material
bioloacutegico para reconfirmaccedilatildeo do diagnoacutestico de hepatite C no periacuteodo de janeiro de
2009 a maio de 2010
411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C
A populaccedilatildeo de estudo consistiu de 51 pacientes admitidos no NMTUFPA
para reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica tratamento cliacutenico e acompanhamento ambulatorial
de ambos os gecircneros e independente da idade sem exclusatildeo dos pacientes com a
presenccedila de patologias associadas agrave condiccedilatildeo maior (motivadora da pesquisa)
oriundos da Fundaccedilatildeo HEMOPA e PAS
A amostra do grupo foi selecionada a partir da relaccedilatildeo dos prontuaacuterios
catalogados no laboratoacuterio de patologia do NMTUFPA
Os dados foram coletados atraveacutes dos resultados dos exames realizados
no soro de cada paciente O protocolo de coleta teve enfoque na identificaccedilatildeo
individual do paciente bem como a avaliaccedilatildeo cliacutenica dos resultados
412 Grupo de natildeo infectados
Foi utilizado um grupo controle de 100 amostras de soro de indiviacuteduos
doadores de sangue com sorologias negativas para HIV 1 e 2 HTLV 1 e 2 Siacutefilis
Doenccedilas de Chagas Hepatite B e para Hepatite C procedentes da fundaccedilatildeo
HEMOPA
42
42 MEacuteTODO
421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico
Foram colhidos em frasco sem anticoagulante 10ml de sangue perifeacuterico
dos 51 pacientes participantes da pesquisa A amostra sanguiacutenea de cada paciente
foi centrifugada o soro foi separado e colocado em frasco esteacuteril devidamente
identificado armazenado e resfriado de 2 a 8ordmC
Foi realizada no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais a
pesquisa soroloacutegica de anticorpos IgG anti-HCV por teste imunoenzimaacutetico (ELISA)
e os pacientes que apresentaram positividade tiveram seus resultados confirmados
atraveacutes de teacutecnicas moleculares (RT-PCR) e com identificaccedilatildeo do genoacutetipo viral
(genotipagem)
Foi realizado no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa a pesquisa
de FAN dos 51 pacientes selecionados utilizando as amostras existentes na
soroteca
422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C
Foram empregados testes soroloacutegicos de ELISA (Ensaio
Imunoenzimaacutetico) de 3ordf geraccedilatildeo utilizando-se de kits comerciais (kit ETI-AB-HCVK-
4 DiaSorin Itaacutelia) para detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos anti-HCV no soro dos
pacientes
As tiras (poccedilos) necessaacuterias para as reaccedilotildees foram retiradas da geladeira
com antecedecircncia de uma hora e deixadas agrave temperatura ambiente e os reagentes
homogeneizados rapidamente no voacutertex
O primeiro poccedilo da placa ficou o branco da reaccedilatildeo na sequecircncia da
microplaca de ELISA foi dispensado 200 microL do controle negativo em triplicata (trecircs
poccedilos) 200 microL do calibrador em duplicata (dois poccedilos) e 200 microL do controle positivo
em amostra uacutenica (um poccedilo)
Adicionou-se 200 microL do Diluente de Amostra em todos os poccedilos que
continham as amostras dos pacientes a serem dosadas na placa de ELISA
tomando cuidado para natildeo contaminar os poccedilos adjacentes
43
Dispensou-se 50 microL do Diluente do Reagente em todos os poccedilos de
controles calibradores e amostras cobrimos com adesivo para evitar evaporaccedilatildeo e
contaminaccedilatildeo das amostras e incubamos a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC
Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com
300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem diluiacuteda
Pipetou-se 100 microL de Conjugado Enzimaacutetico exceto no poccedilo do branco e
incubou-se a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se
cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com 300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem
diluiacuteda
Pipetou-se 100 microL de CromoacutegenoSubstrato em todos os poccedilos
Incubamos a microplaca protegendo-a de luz intensa e direta agrave temperatura
ambiente (18-24ordmC) por 15 min
Pipetou-se 100 microL de Aacutecido Sulfuacuterico em todos os poccedilos para ldquopararrdquo a
reaccedilatildeo enzimaacutetica e mediu-se a absorbacircncia da soluccedilatildeo obtida em leitor de ELISA
com filtro de 450 nM
O teste foi validado de acordo com os valores do controle de qualidade
preconizados pelo fabricante e que devem tanger os valores para o branco da
reaccedilatildeo le 0100 controle negativo le 0050 controle positivo ge 1000 e calibrador ge
1100 Para as amostras testadas os valores reagentes e natildeo reagentes para
pesquisa de anticorpos anti-HCV satildeo interpretados da seguinte maneira natildeo
reagentes com valores le 09 reagentes com valores ge 11 e indeterminados entre
os valores 09 ndash 11
423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia molecular
Nas amostras positivas pela sorologia (ELISA) realizou-se extraccedilatildeo do
RNA viral presente no soro do paciente utilizando kit comercial (QIAmp Viral RNA
kit Quiagen Alemanha) seguindo a teacutecnica adaptada no Laboratoacuterio de Patologia
Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais
Pipetou-se 560 microL de tampatildeo AVL (lise) contendo RNA em tubo de
centriacutefuga de 15 ml identificado adicionou-se 140 microL da amostra e homogenizou-se
em voacutertex por 15s incubando a temperatura ambiente (15-25degC) por 10 min Apoacutes
incubaccedilatildeo centrifugou-se rapidamente o tubo para remover partiacuteculas dispersas
44
Adicionou-se 560 microL de etanol (96-100) na amostra e homogenizou-se
no voacutertex por 15s centrifugando-se rapidamente para remover partiacuteculas dispersas
Depois cuidadosamente transferiu-se 630 microL para as colunas devidamente
identificadas centrifugou-se a 14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo
ficando soacute com a coluna para encaixar em outro tubo
Colocou-se o resto das amostras nas colunas devidas centrifugou-se a
14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo ficando soacute com a coluna para
encaixar em outro tubo Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW1) e
centrifugou-se por 1 min mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo
Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW2) e centrifugou-se por 4 min
mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo
Identificados os tubos para RNA colocou-se as colunas Adicionou-se 60
microL de tampatildeo para eluir (AVE) em cada amostra e centrifugou-se por 1 min
descartando a coluna e ficando com o tubo Colocou-se em banho-maria por 10 min
a 65degC centrifugado rapidamente e colocado no gelo As amostras extraiacutedas foram
congeladas e armazenadas em freezer a -20ordmC
O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado de acordo com a teacutecnica de
RT-PCR qualitativa com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das
Doenccedilas Tropicais da seguinte maneira para o Mix de uma amostra Tampatildeo 12
microL primer ou iniciador k10 1microL primer ou iniciador k11 1microL aacutegua ultrapura livre de
DNAse e RNAse 5 microL Enzima Taq polymerase One-Step (Invitrogen) 1 microL O
primer k10 constitui-se da sequecircncia GGC GAC ACT CCA CCA TRR e o primer k11
da sequecircncia GGT GCA CGG TCT ACG AGA CC
O volume do mix por amostra eacute de 20 microL e o volume da amostra (produto
da extraccedilatildeo) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As amostras
foram colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo eacute realizada a 42ordmC por 45 minutos
temperatura inicial de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 2 minutos seguida de 35 ciclos com
temperatura de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 54ordmC por 30
segundos de extensatildeo a 72ordmC por 45 segundos e temperatura de extensatildeo final de
72ordmC por 7 minutos e um hold de 4ordmC
Para visualizaccedilatildeo do produto dessa 1ordf PCR (RT-PCR) eacute feito um gel de
agarose a 1 (1g de agarose para 100mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de
etidium) que migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os
resultados foram visualizados atraveacutes de luz ultravioleta (UV) Os pacientes
45
positivos que apresentarem ldquobandardquo devem continuar os procedimentos e os
negativos que natildeo apresentarem ldquobandasrdquo deveratildeo ser liberados como
indetectaacuteveis por este meacutetodo
A 2ordf PCR (RFLP) foi responsaacutevel por fazer a amplificaccedilatildeo do cDNA
produto da 1ordf PCR Para esta etapa tambeacutem com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio
de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais foram necessaacuterios para o Mix de uma
amostra Tampatildeo 10X 25 microL DNTP 4 microL MgCl2 15 microL primer ou iniciador k15 1
microL primer ou iniciador k16 1 microL aacutegua ultrapura livre de DNAse e RNAse 125 microL
Enzima Taq platinum (Invitrogen) 05 microL O primer k15 constitui-se da sequecircncia
ACC ATR RAT CAC TCC CCT GT e o primer k16 da sequecircncia CAA GCA CCC TAT
CAG GCA GT
O volume do mix por amostra foi de 23 microL e o volume da amostra
(produto da 1ordf PCR) de 2 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As
amostras satildeo colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo se realiza a temperatura inicial
de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 4 minutos seguida de 35 ciclos com temperatura de
desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 55ordmC por 45 segundos de
extensatildeo a 72ordmC por 1 minuto e temperatura de extensatildeo final de 72ordmC por 7
minutos e um hold de 4ordmC
O produto da 2ordf PCR eacute observado atraveacutes de um gel de agarose a 1 (1g
de agarose para 100 mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que
migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os resultados
foram visualizados atraveacutes de luz UV (ultravioleta) Os pacientes positivos que
apresentaram ldquobandardquo (fragmento amplificado) se continuou os procedimentos e os
negativos que natildeo apresentaram ldquobandasrdquo foram repetidos para o procedimento da
2ordf PCR
424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem)
Os pacientes positivos para a 2ordf PCR foram submetidos agrave genotipagem
do viacuterus atraveacutes do meacutetodo de RFLP utilizando um par de enzimas de restriccedilatildeo
AVA II e RSA I Essa teacutecnica tambeacutem foi adaptada no Laboratoacuterio de Patologia
Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais
46
Na determinaccedilatildeo do genoacutetipo cada amostra eacute utilizada duas vezes
sendo uma reaccedilatildeo para AVA II e uma para RSA I portanto cada amostra teve dois
tubos correspondentes
Para a preparaccedilatildeo do mix de uma amostra para a enzima de restriccedilatildeo
AVA II (Promega) foram utilizados Buffer C X 30 2 microL aacutegua ultrapura livre de
DNAse e RNAse 125 microL AVA II 05 microL Para o mix de uma amostra de RSA I
(Invitrogen) satildeo necessaacuterios React 1 10X 2 microL aacutegua ultrapura libre de DNAse e
RNAse 11 microL RSA I 2 microL
O volume do mix por amostra foi de 15 microL e o volume da amostra
(produto da 2ordf PCR) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 20 microL para
cada frasco correspondente a sua enzima de restriccedilatildeo As amostras formatildeo ldquoparesrdquo
de tubos AVA II e RSA I e satildeo colocadas em banho-maria a 37ordmC overnight para
digerir (cortar) os fragmentos
Para visualizaccedilatildeo do produto da digestatildeo (RFLP) e verificaccedilatildeo dos
genoacutetipos foi preparado um gel de agarose a 2 (2g de agarose para 100 mL de
tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que migrou em cuba de eletroforese
com 100V 500A por 60 minutos Os resultados foram visualizados atraveacutes de luz UV
(ultravioleta) Os pacientes positivos apresentam ldquobandasrdquo (fragmentos) de
tamanhos diferentes O nuacutemero de bandas e sua disposiccedilatildeo no gel formaram
padrotildees de combinaccedilotildees correspondentes a cada genoacutetipo viral
425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas HEp-2
A pesquisa de auto-anticorpo contra antiacutegenos celulares foi realizada no
Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa pela teacutecnica de imunofluorescecircncia
indireta que os identifica atraveacutes da ligaccedilatildeo destes auto-anticorpos aos antiacutegenos do
substrato sendo esta ligaccedilatildeo revelada pela adiccedilatildeo de um soro com atividade Anti-
IgG conjugado agrave fluoresceiacutena
As amostras foram testadas utilizando-se um conjunto diagnoacutestico
comercial Antinuclear Antibody HEp-2 da Hemagen Diagnostics
Na primeira fase da reaccedilatildeo os soros diluiacutedos 140 colocados em contato
com o substrato durante 20 minutos seguido de lavagem com soluccedilatildeo salina
tamponada por 10 minutos Na segunda fase aplicacou-se a substacircncia
47
fluorescente sendo o conjugado diluiacutedo 130 deixando-se por 10 minutos seguida
de nova lavagem de 10 minutos e montagem da lacircmina com glicerina tamponada
Em cada lacircmina foram utilizados controle positivo e controle negativo
A leitura das lacircminas foi realizada em microscoacutepio de imunofluorescecircncia
marca Nikon modelo Eclipse E-200
Os criteacuterios morfoloacutegicos observados durante a leitura foram
a) aspecto da matriz nuclear
b) aspecto do nucleacuteolo
c) observaccedilatildeo de todos os estaacutegios de divisatildeo nuclear
d) aspecto do fuso mitoacutetico
e) aspecto do citoplasma
43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados coletados foram estruturados em um banco de dados no qual
tambeacutem foram confeccionadas tabelas e graacuteficos para representaccedilatildeo dos dados
Posteriormente foram analisados no programa Bioestat 50 para a geraccedilatildeo de
resultados estatiacutesticos que comprovassem a associaccedilatildeo de variaacuteveis pertinentes ao
estudo considerando o intervalo de confianccedila (IC) 95 e niacutevel α 5 (p-valor le 005)
isto eacute um achado seraacute considerado estatisticamente significante se valor de ldquoprdquo for
menor ou igual a 005 e seraacute considerado sem significacircncia estatiacutestica se esse valor
de ldquoprdquo for maior que 005
Nas variaacuteveis quantitativas foram realizadas as medidas de tendecircncia
central sendo calculado a meacutedia e a mediana com seus respectivos desvios
padrotildees O teste t foi usado para comparar as idades entre as amostras
O teste do Qui-quadrado e o teste G foram aplicados nas comparaccedilotildees de
n amostras independentes cujas proporccedilotildees observadas nas diversas modalidades
estiveram dispostas em tabelas de contigecircncia l x c onde se determinou as
proporccedilotildees observadas nas diferentes categorias e se estas tinham alguma
associaccedilatildeo
48
5 RESULTADOS
O Padratildeo de FAN em 100 dos 51 pacientes infectados pelo HCV e em
2 dos natildeo infectados pelo HCV ocorreu Citoplasmaacutetico
Com relaccedilatildeo agrave distribuiccedilatildeo dos pacientes por gecircnero observou-se uma
predominacircncia do gecircnero masculino (667) A faixa etaacuteria predominante foi a de 30
a 50 anos de idade (628) seguida da faixa etaacuteria compreendida entre 51 e 60
anos (196) No que diz respeito agrave naturalidade houve uma predominacircncia de
paraenses em 922 da amostra A maioria dos pacientes incluiacutedos no estudo foi
proveniente da Fundaccedilatildeo HEMOPA (98) por se tratarem de candidatos a doaccedilatildeo
de sangue (Tabela 1)
Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV segundo as caracteriacutesticas demograacuteficas janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Caracteriacutesticas demograacuteficas n Teste estatiacutestico Gecircnero
Masculino 34 667 Qui-quadrado Feminino 17 333 p = 00251
Total 51 1000
Idade (anos) lt 30 6 118 Qui-quadrado
30 a 40 16 314 p = 00094 41 a 50 16 314 51 a 60 10 196
gt 60 3 59 Total 51 1000
Naturalidade
Paraense 47 922 Qui-quadrado Macapaense 1 20 p lt 00001 Maranhense 1 20
Pernambucano 1 20 Gauacutecho 1 20
Total 51 1000
Procedecircncia Qui-quadrado HEMOPA 50 980 p lt 00001
IASEP 1 20 Total 51 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
49
Identificou-se no estudo a predominacircncia do genoacutetipo viral do tipo 1
(882) estando o genoacutetipo 3 presente em 118 dos casos Em 255 dos
pacientes foi observado uma positividade para FAN sendo que todos apresentaram
o padratildeo citoplasmaacutetico (Tabela 2)
Tabela 2 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV conforme os resultados laboratoriais de FAN citoplasmaacutetico e genotipagem janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Exames laboratoriais n Teste estatiacutestico
Genoacutetipo viral - HCV
Tipo 1 45 882 Qui-quadrado
Tipo3 6 118 p lt 00001
Total 51 1000
FAN Qui-quadrado
Positivo (citoplasmaacutetico) 13 255 p = 00008
Negativo 38 745 Total 51 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
Observou-se uma baixa positividade para o FAN tanto no gecircnero
masculino (294) quanto no gecircnero feminino (176) Natildeo houve diferenccedila
estatiacutestica significante entre os gecircneros e a anaacutelise do FAN (p = 05652) Isto eacute
independendo do gecircnero do paciente nada se poderaacute inferir se o mesmo teraacute maior
ou menor chance de possuir um FAN positivo ou negativo (Tabela 3)
Tabela 3 ndash Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
FAN (citoplasmaacutetico)
Gecircnero Teste estatiacutestico
(Teste G) Masculino Feminino
N N
Positivo 10 294 3 176
Negativo 24 706 14 824 p = 05652
Total 34 1000 17 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
Dentre os pacientes infectados o genoacutetipo viral tipo 1 e o tipo 3
predominaram no gecircnero masculino embora natildeo havendo diferenccedila significativa
entre os grupos (p=06376)(Tabela 4)
50
Tabela 4 - Relaccedilatildeo da genotipagem de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Gecircnero
Grupos estudados Teste estatiacutestico
(Teste G) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3
n n Masculino 29 644 5 833 p=06376 Feminino 16 356 1 167
Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa
Na faixa etaacuteria de 30 a 50 anos foi observada uma maior proporccedilatildeo (667)
do genoacutetipo viral do tipo 3 enquanto que para o genoacutetipo tipo 1 foi de 628 natildeo
tendo essa diferenccedila significacircncia estatiacutestica (Tabela 5)
Tabela 5 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e faixa etaacuteria - janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)
Idade (anos) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n
lt 30 04 118 0 00
30 a 40 15 314 3 500 p = 06401
41 a 50 15 314 1 167
51 a 60 08 196 2 333
gt 60 03 59 0 00 Total 45 1000 6 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
A anaacutelise descritiva das idades dos pacientes demonstrou que a meacutedia e
a mediana foi de 43 anos para aqueles com genoacutetipo viral tipo 1 no entanto para o
genoacutetipo viral tipo 3 a meacutedia foi de 44 e a mediana de 42 anos Observou-se que a
idade miacutenima dos pacientes com genoacutetipo viral-HCV do tipo 1 e 3 foi
respectivamente de 20 e 32 anos e a maacutexima foi de 68 e 57 anos perfazendo uma
amplitude total de 48 e 25 anos respectivamente Natildeo houve significacircncia estatiacutestica
entre as idades encontradas nos genoacutetipos 1 e 3 (Tabela 6 )
De acordo com o FAN citoplasmaacutetico a idade miacutenima dos pacientes com
FAN positivo e negativo foi respectivamente de 30 e 20 anos e a maacutexima foi de 53 e
68 anos perfazendo uma amplitude total de 23 e 48 anos respectivamente As
idades meacutedia e mediana foram respectivamente 435 e 46 anos nos pacientes com
o FAN positivo e meacutedia de 43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN
51
negativo Natildeo houve diferenccedila estatisticamente significativa entre as idades
encontradas nos pacientes com FAN positivo e negativo (Tabela 6)
Tabela 6 - Estudo descritivo da idade dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e presenccedila do FAN citoplasmaacutetico janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Grupos Estudados Genoacutetipo viral - HCV Auto anticorpo
Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 FAN (+) FAN (-) IDADE
Tamanho da amostra 45 6 13 38
Idade miacutenima 20 32 30 20
Idade maacutexima 68 57 53 68
Amplitude Total 48 25 23 48
Meacutedia Aritmeacutetica 43 44 435 43
Mediana 43 42 46 42
Desvio Padratildeo 107 93 78 113
Teste t p = 08363 p = 08809 Fonte Protocolo da pesquisa
Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos em que foram analisados AST
ALT ASTALT γ-GT e fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo
semelhantes dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e 3 natildeo
atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos
(Tabela 7)
Tabela 7- Distribuiccedilatildeo dos genoacutetipos dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Paracircmetros bioquiacutemicos
Genoacutetipo viral - HCV Teste estatiacutestico
(Teste t) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3
micro plusmn DP micro plusmn DP
AST 353 plusmn 219 328 plusmn 137 p = 07907
ALT 372 plusmn 321 288 plusmn 136 p = 05355
ASTALT 12 plusmn 07 14 plusmn 11 p = 06110
γ-GT 403 plusmn 38 302 plusmn 138 p = 02194
Fosfatase alcalina 1126 plusmn 443 1087 plusmn 376 p = 08349
Fonte Protocolo da pesquisa
Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos de AST ALT ASTALT γ-GT e
fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os
52
pacientes com FAN positivo e negativo natildeo sendo observada significacircncia
estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos de FAN (Tabela 8)
Tabela 8 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Paracircmetros bioquiacutemicos Auto anticorpos
Teste estatiacutestico (Teste t) Positivo Negativo
micro plusmn DP micro plusmn DP
AST 419 plusmn 238 326 plusmn 197 p = 01704
ALT 408 plusmn 29 346 plusmn 312 p = 05347
ASTALT 13 plusmn 08 12 plusmn 07 p = 05732
γ-GT 34 plusmn 21 409 plusmn 40 p = 04369
Fosfatase alcalina 1073 plusmn 345 1138 plusmn 462 p = 06431 Fonte Protocolo da pesquisa
Na comparaccedilatildeo entre resultados positivos e negativos do FAN
citoplasmaacutetico observou-se uma maior prevalecircncia da negatividade tanto em
pacientes natildeo infectados (98) como em pacientes infectados (745) pelo HCV
sendo essa diferenccedila estatisticamente significativa (plt00001) o que representa
uma natildeo associaccedilatildeo entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV
(Tabela 9)
Tabela 9 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico segundo a presenccedila ou ausecircncia de infecccedilatildeo por HCV janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
FAN (citoplasmaacutetico)
Pacientes Teste estatiacutestico (Teste G)
Infectados Natildeo infectados
N n
Positivo 13 255 2 2
Negativo 38 745 98 98 p lt 00001
Total 51 1000 100 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
Comparando-se os resultados do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos
viras observa-se que o resultado negativo eacute superior ao positivo em ambos os
genoacutetipos virais sendo 711 para o genoacutetipo viral 1 e 100 para o genoacutetipo viral 3
No entanto esta diferenccedila observada natildeo eacute estatisticamente significativa (p=02573)
(Tabela 10)
53
Tabela 10 - Distribuiccedilatildeo do FAN de acordo com o genoacutetipo viral janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
FAN (citoplasmaacutetico)
Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)
Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n
Positivo 13 289 0 00 p=02573 Negativo 32 711 6 1000
Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa
54
6 DISCUSSAtildeO
Desde o primeiro marcador soroloacutegico para diagnoacutestico do Lupus
Eritematoso Sistecircmico (LES) a ceacutelula LE descrita por Hargraves (1948) vaacuterios
substratos antigecircnicos foram utilizados para o estudo dos auto-anticorpos os quais
terminaram amplamente substituiacutedos pelas ceacutelulas HEp-2 Estas apresentam
significativas vantagens sobre os demais pela sua sensibilidade variedade de
antiacutegenos presentes e pelas facilidades morfoloacutegicas para o seu estudo
O uso da imunofluorescecircncia indireta para a visualizaccedilatildeo dos anticorpos
antinucleares nas ceacutelulas HEp-2 permite o reconhecimento de mais de 30 diferentes
padrotildees de fluorescecircncia como nucleares nucleolares da membrana nuclear do
aparelho mitoacutetico e citoplasmaacutetico todos satildeo proporcionados por diferentes auto-
anticorpos
A partir do 1deg Consenso Brasileiro para Padronizaccedilatildeo dos Laudos de FAN
(HEp-2) os criteacuterios para o preparo interpretaccedilatildeo da fluorescecircncia e nomenclatura
dos resultados passaram a ser normatizados Alguns padrotildees de fluorescecircncia satildeo
relativamente inespeciacuteficos outros satildeo ocasionados por uma gama restrita de auto-
anticorpos e outros ainda por um uacutenico auto-anticorpo (DELLAVANCE et al
2002) Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a tornaacute-las
imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo (DE
LARANAGA et al 2000)
Apesar do padratildeo de fluorescecircncia na maioria das vezes natildeo se pode
identificar o anticorpo presente ele pode sugerir ao cliacutenico qual o proacuteximo passo a
ser dado na investigaccedilatildeo da sua especificidade Os resultados encontrados devem
estar em associaccedilatildeo com a cliacutenica os padrotildees de fluorescecircncia e os tiacutetulos
alcanccedilados com a diluiccedilatildeo preacutevia (DELLAVANCE et al 2003)
No presente estudo a analise de 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo Viacuterus da
Hepatite C esteve presente o anticorpo-antinuclear (ANA FAN) em 13 (255) dos
pacientes e todos eram padratildeo citoplasmaacutetico corroborando com outros estudos
encontrados na literatura como
Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de
pacientes infectados pelo viacuterus HIV com Hanseniacutease e co-infectados com
Hanseniacutease HIV Ela obteve respectivamente as seguintes taxas de prevalecircncias
32 333 e 478 Em todos os grupos neste estudo houve predomiacutenio do
55
padratildeo citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear soacute foi observado entre os pacientes com
hanseniacutease (91) e co-infectados (237)
Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de
pacientes infectados pelo viacuterus da Dengue e viacuterus linfotroacutepico de ceacutelulas T humanas
HTLV-12 e controle Normais e obteve respectivamente as seguintes taxas de
prevalecircncias 40 40 e 2 Em todos os grupos houve predomiacutenio do padratildeo
citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear foi observado entre os pacientes com dengue
(67) e HTLV 12 (133)
Segundo Andrade et al (2002) Dellavance et al (2005) Dellavance e
Andrade et al (2007) o predomiacutenio do padratildeo de FAN do tipo citoplasmaacutetico indica
que determinados padrotildees de fluorescecircncia satildeo mais especiacuteficos de doenccedila auto-
imune enquanto outros ocorrem em indiviacuteduos com enfermidades natildeo auto-imunes
por ser o citoplasma celular rico em proteiacutenas para as quais auto-anticorpos naturais
apresentam afinidade moderada eacute comum observar positividade para FAN em
indiviacuteduos sadios cujo significado ainda natildeo eacute entendido completamente
O padratildeo Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina que pode ser
encontrado em Hepatite auto-imune Cirrose Hepatite C Hepatocarcionoma entre
outros Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica
definida Um resultado positivo pode estar ou natildeo associado a uma patologia assim
como poderaacute ou natildeo vir a apresentar uma doenccedila auto-imune com o passar do
tempo (DELLAVANCE et al 2003) Neste estudo natildeo foi feito avaliaccedilatildeo prospectiva
dos resultados embora todos sejam FAN citoplasmaacuteticos
Os achados de FAN positivo em populaccedilotildees sadias ou sem doenccedilas auto-
imunes tambeacutem jaacute observado por Leser et al (2004) que em 394 pacientes com
FAN-HEp-2 positivo natildeo encontraram nenhum paciente com doenccedila auto-imune
Outro exemplo estaacute no padratildeo citoplasmaacutetico de pontos isolados
estudado por Laurino et al (2006) presente em indiviacuteduos sem evidecircncia de auto-
imunidade mas tambeacutem em indiviacuteduos com acometimento de doenccedilas auto-imunes
sistecircmicas e natildeo-especiacuteficas
Os dados apresentados corroboram com este estudo em que foi
observado a presenccedila do auto-anticorpo em 2 (2 ) dos 100 indiviacuteduos sadios do
grupo controle todos com padratildeo citoplasmaacutetico
56
Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a
tornaacute-las imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo
(DE LARANAGA et al 2000)
Nas Infecccedilotildees agudas espera-se que a resposta auto-imune diminua a
medida que os viacuterus satildeo eliminados Entretanto alguns trabalhos sugerem que em
indiviacuteduos geneticamente susceptiacuteveis as reaccedilotildees auto-imunes possam persistir
apesar do clareamento viral uma vez que o gatilho imunoloacutegico foi ativado e natildeo
houve desativaccedilatildeo (DE LARANAGA et al 2000 SAKKAS et al 2008)
Ramos-Casals et al (2009) no estudo Doenccedilas Sistecircmica Auto-Imunes
em Pacientes com Infecccedilatildeo pelo (72) dos pacientes eram do gecircnero feminino e
(28) do masculino(ANA FAN) em 61 dos pacientes o que se diferem deste
trabalho eacute que dos 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo (667) eram do gecircnero
masculino e (333) eram do gecircnero feminino com meacutedia de idade de 430 (plusmn107)
anos com presenccedila de anticorpo-antinuclear em 13 (255) com meacutedia e mediana
respectivamente de 435 e 46 anos nos pacientes com o FAN positivo e meacutedia de
43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN negativo
Alter (1995) em sua pesquisa natildeo observou associaccedilatildeo entre o risco de
infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas designadas por gecircnero idade e raccedila Na
referida pesquisa foram estudados 51 pacientes com idade meacutedia de 430 (+- 107)
anos 34 (667) eram do gecircnero masculino e 17 (333) do gecircnero feminino todos
em fase preacute-tratamento assintomaacuteticos natildeo permitindo avaliar os risco da
infecccedilatildeoSegundo Pordeus et al (2008) a ocorrecircncia destes auto-anticorpos
indicaria um prognoacutestico desfavoraacutevel Perperas Mcfarlane e Mcsorley (1986)
sugeriram que os auto-anticorpos poderiam estar envolvidos na progressatildeo ou no
desenvolvimento de hepatites crocircnicas possivelmente por um distuacuterbio no controle
da auto-reatividade Outros estudos questionam a participaccedilatildeo dos auto-anticorpos
no processo de transiccedilatildeo para cronicidade das hepatites agudas virais poreacutem os
resultados natildeo satildeo convincentes (SHOENFELD ROSE 2004)
Lopez Seia e Roy (1998) demonstraram a presenccedila de anticorpo anti-
actina em baixos tiacutetulos em crianccedilas com hepatite aguda por curto periacuteodo de
tempo poreacutem nenhuma associaccedilatildeo com gravidade da agressatildeo hepaacutetica foi
descrita
Neste estudo a presenccedila dos auto-anticorpos em (255) dos pacientes
com infecccedilatildeo pelo HCV natildeo puderam ser relacionada com a gravidade da doenccedila
57
pois este estudo foi realizado em pacientes receacutem diagnosticados entatildeo seria
necessaacuterio um acompanhamento destes por um periacuteodo maior de tempo com a
finalidade de concluir esta afirmativa Apesar da presenccedila transitoacuteria de auto-
anticorpos jaacute ter sido descrita em doenccedilas virais comuns a associaccedilatildeo entre a
presenccedila de auto-anticorpos e a gravidade das doenccedilas necessita de comprovaccedilatildeo
Passaleva Massai e Leoncini (1983) avaliaram 302 pacientes com
hepatites agudas virais e encontraram complexos imunes circulantes (CIC) em
516 dos pacientes com frequumlecircncia significativamente maior em hepatite aguda
Nenhuma associaccedilatildeo entre a presenccedila de imuno-complexos e o niacutevel de
aminotransferases ou bilirrubina foi encontrada Segundo Andrade et al (2002)
Dellavance et al (2005) Andrade et al (2007) nos pacientes do estudo foi feita a
relaccedilatildeo entre a presenccedila dos auto-anticorpos e niacuteveis de aminotransferases e as
elevaccedilotildees natildeo tiveram significacircncia poreacutem houve associaccedilatildeo do genotipo viral 1
Nos paracircmetros bioquiacutemicos analisados em relaccedilatildeo aos genoacutetipos houve uma
distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e
3 natildeo atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os
grupos Segundo Wilson (1997) trecircs estudos mostraram correlaccedilatildeo entre niacuteveis
altos de alanina aminotransferase e atividade histoloacutegica da doenccedila hepaacutetica
Poreacutem nos pacientes considerados individualmente o valor preditivo dessa
associaccedilatildeo foi baixo enquanto muitos deles com enzimas normais apresentavam
graves alteraccedilotildees histoloacutegicas No presente estudo natildeo foi observada associaccedilatildeo entre os niacuteveis de
aminotransferases e a cronificaccedilatildeo da hepatite viral pois nem todos os pacientes do
estudo apresentavam resultado de bioacutepsia hepaacutetica
Alter et al (1999) afirmam que no Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b
(63) e 3a (313) em estudo realizado em Goiacircnia onde foi observada uma
maior prevalecircncia do genoacutetipo 1 seguida do genoacutetipo 3 em doadores de sangue e
hemofiacutelicos (DELLAVANCE ANDRADE et al 2007) Estando esses dados em
acordo com esta pesquisa que com genotipagem do viacuterus da hepatite C que
identificou o genoacutetipo 1 em 45 (882) seguidos pelo genoacutetipo 3 que foi
identificado em 6 (118) dos pacientes com infecccedilatildeo pelo HCV Em um estudo realizado na Franccedila com 13 pacientes luacutepicas infectadas
pelo viacuterus C 8 apresentavam o RNA viral sendo o genoacutetipo 1 presente em cinco
58
(625) casos seguido do genoacutetipo 3 (375) (PERLEMUTER et al 2000) dados
que se assemelham aos do presente estudo embora o estudo natildeo tenha incluiacutedo
pacientes com outras infecccedilotildees associadas ao HCV Eacute importante ressaltar que
estudos sobre genotipagem do HCV em indiviacuteduos com doenccedilas reumaacuteticas satildeo
raros
No presente estudo houve uma frequumlecircncia baixa de positividade para o
FAN nos pacientes com genoacutetipo 1 e genoacutetipo 3 Natildeo havendo significacircncia
estatiacutestica entre os pacientes com genoacutetipo 1 e 3
Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter
implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave menor
resposta agrave terapia antiviral (BRUNO et al1997) o que natildeo foi avaliado neste estudo
pois apesar de (882) dos pacientes serem genoacutetipo 1 todos estavam em fase de
reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica seja preacute- tratamento Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila
poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses
autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis
vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo
hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja
quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a
concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave
hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em
parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)
59
7 CONCLUSOtildeES
minus O padratildeo dos auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares encontrados nos
dois grupos estudados foi o citoplasmaacutetico
minus A prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares no grupo com
infecccedilatildeo pelo VHC foi significativamente maior do que no grupo controle
minus Nos resultados de FAN citoplasmaacutetico haacute uma maior prevalecircncia da
negatividade em pacientes infectados pelo HCV e natildeo infectados sendo
essa diferenccedila estatisticamente significativa conferindo a natildeo associaccedilatildeo
entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV
minus Os resultados negativos do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos viras eacute
superior aos positivos em ambos os genoacutetipos virais entretanto esta diferenccedila
natildeo eacute estatisticamente significativa
minus Houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos
celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado
minus Natildeo houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos
celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado com
relaccedilatildeo ao gecircnero onde predominou o gecircnero masculino nos dois grupos
minus Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter
implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave
menor resposta agrave terapia antiviral o que natildeo foi avaliado neste estudo pois
os pacientes estavam em fase preacute tratamento sugerindo que estes pacientes
sejam avaliados futuramente
minus A formaccedilatildeo dos auto-anticorpos parece ser mais uma consequumlecircncia do que
uma causa da agressatildeo hepaacutetica
minus A negatividade do FAN ndash Hep 2 foi maior que a positividade mas todos os
FAN positivos pertenciam ao genoacutetipo viral tipo 1 nos pacientes infectados
pelo HCV
minus Nesta pesquisa os resultados de PCR o RNA-HCV de reconfirmaccedilatildeo foi
positivo para o anti-HCV em todos os soros analisados mostrando assim
que estes pacientes eram portadores de infecccedilatildeo por viacuterus C ou seja natildeo
houve falso positivo anteriormente poreacutem todos eram assintomaacuteticos
dificultando a conclusatildeo de ser ou natildeo uma infecccedilatildeo persistente
60
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APEcircNDICES
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APEcircNDICE A - TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Vocecirc estaacute sendo convidado para fazer parte de uma pesquisa que estaacute sendo desenvolvida pela Universidade Federal do Paraacute no Nuacutecleo de Medicina Tropical intitulada AUTOANTICORPOS CONTRA ANTIacuteGENOS CELULARES E SUA CORRELACcedilAtildeO COM O GENOacuteTIPO VIRAL EM PACIENTES COM INFECCcedilAtildeO PELO VIacuteRUS DA HEPATITE C (HCV)
O Objetivo da pesquisa eacute fazer uma correlaccedilatildeo do anticorpo antinuacutecleo (FAN) e o genoacutetipo viral em pacientes com hepatite C e o estaacutegio da doenccedila hepaacutetica a partir da histologia sempre que permitidos e correlacionar ao diagnoacutestico
Caso vocecirc participe da pesquisa seraacute necessaacuterio que forneccedila uma amostra de sangue (2ml)
O uacutenico inconveniente que vocecirc poderaacute experimentar eacute a dor provocada pela agulha na hora da coleta de sangue bem como pequenos hematomas que possam vir a ocorrer e que natildeo causam danos
Essa pesquisa natildeo oferece riscos as praacuteticas satildeo de uso rotineiro e seratildeo utilizados materiais esterilizados e descartaacuteveis como agulhas seringas etc
Estaacute garantido a vocecirc todas as informaccedilotildees que vocecirc queira antes durante e depois da pesquisa
A sua participaccedilatildeo neste estudo eacute voluntaacuteria Vocecirc tem a liberdade de recusar participar da pesquisa a qualquer momento
As informaccedilotildees relacionadas agrave pesquisa poderatildeo ser inspecionadas pelos pesquisadores que executam a pesquisa e pelas autoridades legais no entanto se qualquer informaccedilatildeo for divulgada em relatoacuterio publicaccedilatildeo ou qualquer outro meio isto seraacute feito de forma codificada para manter o caraacuteter confidencial
Todas as despesas necessaacuterias para a realizaccedilatildeo do estudo natildeo satildeo de sua responsabilidade assim como a sua participaccedilatildeo na pesquisa na seraacute remunerada (vocecirc natildeo receberaacute qualquer valor em dinheiro)
Quando os resultados forem divulgados natildeo apareceraacute seu nome e sim um coacutedigo
_____________________________________
Assinatura do Pesquisador Responsaacutevel NomeAna Maria Almeida Souza EndRodovia Maacuterio Covas 1426 ndash Cond Green Garden casa 41 Fone(91) 32352665 81197217 RegConselhoCRM 1508
69
APEcircNDICE B - CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Declaro que li as informaccedilotildees acima sobre a pesquisa que me sinto
perfeitamente esclarecido sobre o conteuacutedo da mesma assim como seus riscos e
benefiacutecios Declaro ainda que por minha livre vontade aceito participar da pesquisa
cooperando com a coleta de material para exame
Beleacutem _________
_________________________________________
Assinatura do sujeito da pesquisa ou do
responsaacutevel
70
ANEXOS
71
- Assinatura do Pesquisador Responsaacutevel
-
- Beleacutem _________
-
A DEUS QUE NA SUA SUPREMACIA E GRANDEZA PERMITIU A MINHA EXISTEcircNCIA
A MEU PAI EMMANOEL (IN MEMORIAM) QUE DENTRO DE SUA HUMILDADE E
SIMPLICIDADE SEMPRE ME PROPORCIONOU ENSINAMENTOS DE VIDA E QUE LEMBRO SEMPRE SUAS FRASES ldquoNUNCA DEcirc SUA RAZAtildeO A NINGUEacuteM PROCURE
SEMPRE FAZER AS COISAS CERTAS PARA QUE POSSAS ANDAR SEMPRE DE PEITO ABERTO E CABECcedilA ERGUIDArdquo
ldquoO ESTUDO Eacute A UacuteNICA HERANCcedilA QUE POSSO DEIXAR E QUE NINGUEacuteM VAI BRIGAR CONTIGO POR CAUSA DELArdquo
A MINHA MAtildeE SANCHA QUE SEMPRE FOI EXEMPLO DE BATALHA E VIGOR COM DOM
DE SER MAtildeE ESPOSA E PROFISSIONAL SEM PERDER NUNCA SUA CALMA TRANQUumlILIDADE E BONDADE PROCURANDO AJUDAR SEMPRE TODOS QUE A
RECORRIAM
AO RIBAMAR GRANDE AMOR DE MINHA VIDA MEU COMPANHEIRO DE 32 ANOS QUE DO SEU JEITO SEMPRE ME APOacuteIA NA REALIZACcedilAtildeO DOS MEUS SONHOS
AOS MEUS AMADOS FILHOS RODRIGO RAFAEL E ANA CAROLINA QUE SEMPRE ME
MOTIVARAM A LUTAR PELOS MEUS OBJETIVOS PARA ASSIM SERVIR DE INCENTIVO E EXEMPLO PARA ELES
AS MINHAS SOGRAS LOURDES E RAIMUNDA (IN MEMORIAM) QUE SEMPRE ESTIVERAM
AO MEU LADO AJUDANDO NA CRIACcedilAtildeO DOS MEUS FILHOS PARA QUE EU PUDESSE REALIZAR MINHAS TAREFAS E ALCANCcedilAR MEU CRESCIMENTO PROFISSIONAL
AGRADECIMENTOS
Ao Prof Dr Juarez Antonio Simotildees Quaresma meu orientador e incentivador pelos ensinamentos e orientaccedilatildeo para a conclusatildeo desta aacuterdua tarefa Ao meu cunhado Prof Dr Carlos Leocircnidas Silva Souza Sobrinho que sempre me incentivou nessa caminhada Aos amigos Dra Isabella e Dr Alberto Amaral que muito me ajudaram me apoiaram e permitiram minhas ausecircncias no laboratoacuterio para a conclusatildeo desta jornada Ao colega MS MD David Bichara que disponibilizou seu tempo para a realizaccedilatildeo dos testes de FAN de maior importacircncia para a execuccedilatildeo deste trabalho A colega Profa Dra Cleacutea Bichara que com seu apoio me deu animo para a execuccedilatildeo deste trabalho A colega Maria do Socorro de Oliveira Cardoso companheira de trabalho pelo incentivo e torcida para a concretizaccedilatildeo desta tarefa A todos os amigos do laboratoacuterio Amaral Costa pela incondicional torcida e apoio para que eu pudesse chegar ao final desta jornada A Profa Dra Luisa Caricio Martins pela sua ajuda incondicional na cedencia dos dados dos pacientes e liberaccedilatildeo das amostras do material bioloacutegica de sua soroteca sem a qual esse trabalho seria impossiacutevel de se realizar Ao futuro colega de profissatildeo doutorando Geraldo Duarte pelas contribuiccedilotildees na conclusatildeo estatiacutestica dos resultados encontrados Ao Prof Dr Ismaelino Mauro Nunes Magno que tem se empenhado me incentivando na conclusatildeo desta meta meu anjo auxiliar A todos os componentes da banca examinadora pelo comprometimento e a forma muito simples que no momento da qualificaccedilatildeo me fizeram vecirc e buscar as melhorias ao trabalho ora apresentado A Luciene Dias Cavalcante bibliotecaacuteria do HOL pela ajuda imprescindiacutevel na elaboraccedilatildeo desta dissertaccedilatildeo A todos que de forma direta ou indireta colaboraram para a realizaccedilatildeo deste sonho
CONFIE AS COISAS ACONTECEM NA HORA CERTA
EXATAMENTE QUANDO DEVEM ACONTECER MOMENTOS FELIZES LOUVE A DEUS
MOMENTOS DIFIacuteCEIS BUSQUE A DEUS MOMENTOS SILENCIOSOS ADORE A DEUS
MOMENTOS DOLOROSOS CONFIE EM DEUS CADA MOMENTO AGRADECcedilA A DEUS
ENTENDER A VONTADE DE DEUS NEM SEMPRE Eacute
FAacuteCIL MAS CRER QUE ELE ESTAacute NO COMANDO E TEM
UM PLANO PARA NOSSA VIDA FAZ A CAMINHADA VALER
Agrave PENA
(DESCONHECIDO)
RESUMO
As inflamaccedilotildees do fiacutegado provocadas pelos viacuterus hepatotroacutepicos atingem milhotildees de
pessoas e representa significativo problema de sauacutede puacuteblica em todo o mundo
Existem interaccedilotildees entre viroses hepatotroacutepicas e o sistema imunoloacutegico do hospedeiro
que podem influenciar na patogenicidade da agressatildeo hepaacutetica O objetivo deste
trabalho foi investigar a frequumlecircncia de auto-anticorpos em pacientes portadores do viacuterus
da hepatite C e sua correlaccedilatildeo com os genoacutetipos encontrados Foram estudados 51
pacientes com diagnoacutestico confirmado pelo PCR de infecccedilatildeo pelo viacuterus da hepatite C e
um grupo de 100 doadores de sangue com todos os exames soroloacutegico para doenccedilas
infecto-contagiosas negativos Os 51 pacientes portadores do viacuterus C apresentavam
idade meacutedia de 43 anos +- 113 em fase preacute-tratamento 34 (667) eram do gecircnero
masculino e 17 (333) do gecircnero feminino Desses 13 (255) apresentaram FAN
positivo 45 (882) eram genoacutetipo tipo 1 e 118 genoacutetipo tipo 3 Os pacientes que se
apresentaram com anticorpos detectaacuteveis natildeo apresentavam niacuteveis de AST ALT
ASTALT γ-GT e fosfatase alcalina significativamente diferente daqueles com auto-
anticorpos negativos Desta forma conclui-se que os anticorpos presentes na amostra
do estudo satildeo independentes da evoluccedilatildeo da doenccedila e do prognoacutestico do paciente
entretanto parece estar ligada ao genoacutetipo tipo 1
Palavras-chave Hepatite C Auto-anticorpos Genoacutetipo
ABSTRACT
Inflammation of the liver caused by hepatotropic viruses affect millions of people and
represents a significant public health problem worldwide There are interactions between
hepatotropic viruses and the host immune system that can influence the pathogenesis of
liver injury The objective of this study was to investigate the frequency of autoantibodies
in patients with hepatitis C virus and its correlation with the genotypes found We
studied 51 patients diagnosed by PCR of infection with hepatitis C and a group of 100
blood donors with all serological tests for infectious diseases negative The 51 patients
with virus C had an average age of 43 years + - 113 in the pre-treatment 34 (667)
were male and 17 (333) were female Of these 13 (255) were ANA positive 45
(882) were with genotype 1 and 118 with genotype 3 Patients who presented with
antibodies had no detectable levels of AST ALT AST ALT γ-GT and alkaline
phosphatase significantly different from those with negative antibody titers Thus we
conclude that the antibodies present in the study sample are independent of disease
progression and patient prognosis though seems to be linked with genotype 1
Keywords Hepatitis C Auto-antibodies genotype
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Padrotildees de fluorescecircncia encontrados em maior frequumlecircncia e
patologias relacionadas 34
Quadro 2 - Anti-ena - auto-anticorpos contra antiacutegenos extraiacutedos do nuacutecleo e
relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 34
Quadro 3 ndash Padrotildees de FAN nuclear e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 35
Quadro 4 - Padrotildees de FAN citoplasmaacuteticos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 36
Quadro 5 - Padrotildees de FAN mistos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 37
Quadro 6 - Padrotildees de FAN nucleolares e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 37
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos pacientes segundo as caracteriacutesticas demograacuteficas janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 48
Tabela 2 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes conforme os resultados laboratoriais de FAN citoplasmaacutetico e genotipagem janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 49
Tabela 3 ndash Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 49
Tabela 4 - Relaccedilatildeo da genotipagem de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 50
Tabela 5 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e faixa etaacuteria - janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 50
Tabela 6 - Estudo descritivo da idade dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e presenccedila do FAN citoplasmaacutetico janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 51
Tabela 7- Distribuiccedilatildeo dos genoacutetipos dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 51
Tabela 8 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 52
Tabela 9 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico segundo a presenccedila ou ausecircncia de infecccedilatildeo por HCV janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 52
Tabela 10 - Distribuiccedilatildeo do FAN de acordo com o genoacutetipo viral janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 53
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
AAN Anticorpos antinucleares
aCL Anticorpos anticardiolipina
AIDS Sindrome da Imunodeficiecircncia Adquirida
ALT Alanina aminotransferase
ANCA Anticorpos anti-citoplasma de neutroacutefilos
Anti-CCP Antipeptiacutedeo citrulinado ciacuteclico
Anti-β2GPI Anticorpos anti-β2 glicoproteiacutena I
Cdna DNA complementar
CEP Comitecirc em Eacutetica e Pesquisa
CHC Carcinoma hepatocelular
CIC Complexos imunes circulantes
DDTC Doenccedilas difusas do tecido conjuntivo
DMTC Doenccedila mista do tecido conjuntivo
E1 Proteiacutena do envoltoacuterio
ENH Eritema Nodoso Hansecircnico
ESP Esclerose sistecircmica progressive
FAN Fator Anti-nuacutecleo
FR Fator reumatoacuteide
HBV Viacuterus da hepatite B
HCV Viacuterus da Hepatite C
HEMOPA Fundaccedilatildeo Centro de Hemoterapia e Hematologia do Paraacute
HIV Viacuterus da imunodeficiecircncia humana
HIV-1 Viacuterus da imunodeficiecircncia humana1
IAH Iacutendice de atividade histoloacutegica
LE Lupus Eritematoso
LES Luacutepus eritematoso sistecircmico
MS Ministeacuterio da Sauacutede
mtDNA DNA mitrocondrial
NANBH Hepatite natildeo-A natildeo-B
NMT Nuacutecleo de Medicina Tropical
OMS Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede
PCR Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia
Rh Tipo sanguiacuteneo
RNA Aacutecido ribonucleacuteico
RT-PCR Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia-em tempo real
SAF Siacutendrome antifosfoliacutepide
SIDA Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida
SS Siacutendrome de Sjoumlgren
UFPA Universidade Federal do Paraacute
UV ultravioleta
VHA Viacuterus da Hepatite A
VHC Viacuterus da Hepatite C
VHCHCV Hepatite C
VV Hanseniacutease generalizada
SUMAacuteRIO 1 INTRODUCcedilAtildeO 15 11 HEPATITE C (VHCHCV) 15 111 Consideraccedilotildees Gerais 15 112 Agente Etioloacutegico 16 113 Epidemiologia 17 114 Modo de Transmissatildeo 18 115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica 19 116 Diagnoacutestico 23 12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC 25
13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC 26
14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE 27
15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES AGUDAS VIRAIS 31
16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN 32 2 JUSTIFICATIVA 39 21 ASPECTOS EacuteTICOS 39 3 OBJETIVOS 40
31 OBJETIVO GERAL 40
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 40 4 MATERIAL E MEacuteTODOS 41 41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO) 41 411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C 41 412 Grupo de natildeo infectados 41 42 MEacuteTODO 42 421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico 42 422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C 42 423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia
molecular 43
424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem) 45 425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas
HEp-2 46 43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 47 5 RESULTADOS 48 6 DISCUSSAtildeO 54 7 CONCLUSOtildeES 59 REFEREcircNCIAS 60 APEcircNDICES 67 ANEXOS 70
15
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 HEPATITE C (VHCHCV)
111 Consideraccedilotildees Gerais
As hepatites virais satildeo doenccedilas causadas por diferentes agentes
etioloacutegicos de distribuiccedilotildees universais que tecircm em comum o hepatotropismo
Possuem semelhanccedilas do ponto de vista cliacutenico-laboratorial mas apresentam
importantes diferenccedilas epidemioloacutegicas quanto agrave sua evoluccedilatildeo (FERREIRA
SILVEIRA 2004) Desde a descriccedilatildeo e definiccedilatildeo em 1989 (CHOO et al 1989 apud
RIBEIRO et al 2007) tornou-se evidente sua associaccedilatildeo com uma grande
variedade de manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas desordens reumaacuteticas e auto-imunes
(ALMEIDA 2010)
A infecccedilatildeo pelo VHCHCV acarreta inflamaccedilatildeo hepaacutetica e esteatose
podendo evoluir para fibrose hepaacutetica e cirrose em indiviacuteduos cronicamente
infectados estes com grande risco de desenvolvimento de carcinoma hepatocelular
(RIBEIRO et al 2007) Essas complicaccedilotildees tardias ocorrem em um periacuteodo em
geral superior a 20 anos apoacutes o iniacutecio da infecccedilatildeo A avaliaccedilatildeo filogeneacutetica das
sequumlecircncias do VHCHCV investigadas em vaacuterias regiotildees geograacuteficas sugere que
existam pelo menos seis genoacutetipos principais designados pelos nuacutemeros de 1 a 6 e
pelo menos 30 subtipos designados por letras minuacutesculas Nos Estados Unidos
prevalecem os genoacutetipos 1a (60) e 1b (20) Os tipos 5 e 6 satildeo mais encontrados
no sudeste e sul da Aacutefrica O tipo 4 eacute predominante na Aacutefrica Central e no Oriente
Meacutedio No Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b (63) e 3a (313) (BASSIT et
al 1999 apud RIBEIRO et al 2007) As informaccedilotildees sobre as causas que
determinam o curso evolutivo da doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos
progressos que haacute no campo do diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHCHCV Uma
questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo genoacutetipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de
lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o genoacutetipo 1 (1b) cursa com lesotildees
histoloacutegicas mais graves
As uacuteltimas deacutecadas foram de notaacuteveis conquistas no que se refere agrave
prevenccedilatildeo e ao controle das hepatites virais Entre as doenccedilas endecircmico-
epidecircmicas que representam problemas importantes de sauacutede puacuteblica no Brasil
16
salientam-se as Hepatites Virais cujo comportamento epidemioloacutegico no nosso paiacutes
e no mundo tem sofrido grandes mudanccedilas nos uacuteltimos anos
Antes da seleccedilatildeo rigorosa dos doadores de sangue em 1991 o
VHCHCV era a maior causa de hepatite poacutes-transfusional Atualmente permanece
como tal em casos esporaacutedicos (CONTE 2000) Os grupos considerados de risco
satildeo pessoas que receberam transfusatildeo de sangue antes de 1992 usuaacuterios de
drogas injetaacuteveis profissionais de sauacutede que lidam com sangue pacientes de
hemodiaacutelise e com menor risco pessoas tatuadas ou com piercings (CLEMENTE
ONO-NITA 2007)
A melhoria das condiccedilotildees de higiene e de saneamento das populaccedilotildees a
vacinaccedilatildeo contra a Hepatite B (HBV) e as novas teacutecnicas moleculares de diagnoacutestico
do viacuterus da Hepatite estatildeo entre esses avanccedilos importantes (BRASIL 2008)
112 Agente Etioloacutegico
O VHCHCV um viacuterus aacutecido ribonucleacuteico (RNA) da famiacutelia Flaviviridae
representa a principal causa da previamente denominada hepatite natildeo-A natildeo-B
(SANTOS 2009) Foi identificado e isolado a partir de um clone derivado de um
genoma NANBH semelhante aos togaviridae ou flaviviridae (SAADE 2008) e
visualizado a imunoeletromicroscopia como partiacutecula de 55 a 65 nm de diacircmetro
com projeccedilotildees espiculares e de morfologia muito semelhante aos flaviviridae Aleacutem
disso estas partiacuteculas reagiram especificamente com anticorpos mono e policlonais
do conteuacutedo proteacuteico do envelope do VHC (HIRANUMA et al 1994 apud CONTE
2000)
O agente etioloacutegico do HCV natildeo eacute uma partiacutecula homogecircnea e apresenta
uma taxa alta de mutaccedilatildeo levando-o a uma heterogeneicidade genocircmica cujo
resultado eacute um grande nuacutemero de genoacutetipos (1a 1b 2a 2b 3a 3b 4 5 6)
(AUGUSTO LOBATO 2003) Natildeo haacute evidecircncias de variantes natildeo patogecircnicas O
genoacutetipo 1b eacute o que apresenta maior virulecircncia e pior resposta ao tratamento
(LAUER WALKER 2001 apud SOUZA 2007) No Brasil dados obtidos a partir de
casos isolados e estudos de pequenas amostragens indicam que o genoacutetipo 1b
ocorre em cerca de 30 a 40 dos casos o 1a em cerca de 20 1a e 1b em 20
o 3a em cerca de 28 (FOCACCIA 2004)
17
113 Epidemiologia
De acordo com a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) a HCV eacute uma
questatildeo de sauacutede puacuteblica e tambeacutem a principal causa de transplante de fiacutegado no
Brasil (SOCIEDADE BRASILEIRA DE HEPATOLOGIA 2005) Eacute estimada uma
prevalecircncia em torno de 10 para a infecccedilatildeo pelo VHC na populaccedilatildeo mundial
(KILLEMBERG 2000) Nos Estados Unidos cerca de 27 milhotildees de pessoas estatildeo
infectadas pelo viacuterus (BRASIL 2006)
De acordo com Ferreira e Silveira (2004) no Brasil o nuacutemero de pacientes
infectados eacute incerto relacionado geralmente a alguns estados e municiacutepios e o
esclarecimento dos agentes causadores das hepatites cuja identificaccedilatildeo requer
teacutecnicas laboratoriais complexas de biologia molecular eacute realizado de maneira
insuficiente Por outro lado a progressiva integraccedilatildeo entre as instacircncias gestoras
dos programas de vigilacircncia e controle das doenccedilas com grupos de pesquisa e
desses com os serviccedilos (FERREIRA SILVEIRA 2004 p 473) e a disponibilidade
dos bancos de dados nacionais mais confiaacuteveis apontam para novos e melhores
caminhos (BRASIL 2005b)
A OMS alerta que o Paiacutes deve se preparar para uma ldquoexplosatildeordquo da
epidemia a partir de 2011 (BRASIL 2005b) Outra preocupaccedilatildeo eacute que as pessoas
que receberam sangue antes de 1992 tecircm mais chances de estarem infectadas na
eacutepoca o sangue destinado agraves transfusotildees natildeo era analisado para detecccedilatildeo da HCV
porque o viacuterus natildeo era conhecido e natildeo havia exames especiacuteficos (BRASIL 2005b)
A prevalecircncia da infecccedilatildeo nos doadores de sangue sadios varia de 001-002 no
Reino Unido e no norte da Europa 1-15 no sul da Europa 65 na Aacutefrica
equatorial e de ateacute 20 no Egito (CONTE 2000)
De acordo com a OMS a cada grupo de 50 pessoas no Brasil uma tem
hepatite e de dez portadores apenas um sabe (STRAUSS 2001) Satildeo dois milhotildees
de infectados no Paiacutes Denominada epidemia silenciosa calcula-se que 170 milhotildees
de indiviacuteduos no mundo estejam contaminados pelo viacuterus C a forma mais grave da
doenccedila Ainda de acordo com a OMS o nuacutemero de brasileiros viacutetimas da
enfermidade eacute bem maior do que o estimado pelo Ministeacuterio da Sauacutede (TRINDADE
2005)
18
Por ocasiatildeo da Conferecircncia Internacional de Consenso sobre HCV em Paris
(LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999) concluiu-se que a hepatite crocircnica por viacuterus
C eacute um problema grave de sauacutede puacuteblica sendo sua prevalecircncia mundial estimada
em 3 (de 01 a 5 segundo os vaacuterios paiacuteses) por tanto havendo no mundo
todo cerca de 150 milhotildees de portadores crocircnicos do VHCHCV 4 milhotildees nos EUA
e 5 milhotildees na Europa Ocidental Na Europa Oriental a prevalecircncia eacute maior ainda
114 Modo de Transmissatildeo
A HCV eacute transmitida pelo sangue Natildeo haacute comprovaccedilatildeo de contaacutegio por
meio de fluidos corporais como saliva suor laacutegrimas secircmen ou leite materno
Tambeacutem deixa de ocorrer por meio de abraccedilos beijos uso dos mesmos copos ou
roupas Especialistas afirmam que a contaminaccedilatildeo atraveacutes de relaccedilotildees sexuais eacute
possiacutevel mas rara Quando detectada de maneira precoce a enfermidade tem
tratamento inclusive gratuito aleacutem de cura (BRASIL 2006)
Dentre os fatores de risco para transmissatildeo outros aleacutem da transfusatildeo de
sangue o uso de drogas iliacutecitas o comportamento sexual de alto risco e variaacuteveis
socioeconocircmicas representadas pelo grau de escolaridade e renda familiar Natildeo foi
observada associaccedilatildeo entre o risco de infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas
designadas por gecircnero idade e raccedila (ALTER 2007) O risco de transmissatildeo sexual
do VHCHCV eacute miacutenimo A contaminaccedilatildeo intrafamilial natildeo-sexual eacute consideraacutevel
particularmente quando um dos enfermos tem hepatopatia grave e ou carga viral
elevada (risco 110) (CONTE 2000)
A praacutetica de tatuagem fornece dados conflitantes sabendo-se que os
liacutequidos usados para esterilizar os instrumentos usados satildeo ineficazes
Karmochkine et al (1998 apud CONTE 2000) observaram que
aproximadamente 80 dos pacientes contraem o viacuterus atraveacutes da toxicomania
intravenosa ou transfusotildees de sangue ou de derivados Os restantes meios de
transmissatildeo e de contaacutegio satildeo a hemodiaacutelise os transplantes de oacutergatildeos picadas
acidentais profissionais e transmissatildeo vertical matildee-crianccedila Em 20 a 40 dos
casos natildeo se consegue determinar o modo de contaminaccedilatildeo A transmissatildeo da
hepatite crocircnica por viacuterus C pode ser prevenida (KARMOCHKINE et al 1998 apud
CONTE 2000)
19
As duas fontes de contaminaccedilatildeo satildeo a toxicomania endovenosa e a
administraccedilatildeo de produtos de origem sanguumliacutenea Esta uacuteltima praticamente
eliminada desde 1991 com a introduccedilatildeo dos testes ELISA 2 na seleccedilatildeo
aprimorada de doadores de sangue (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998
apud CONTE 2000)
A transmissatildeo sexual eacute rara com menos de 3 em parceiros estaacuteveis e
ocorre principalmente em pessoas com muacuteltiplos parceiros e com praacutetica sexual de
risco (sem uso de preservativo) ndash para os indiviacuteduos com parceiros muacuteltiplos o uso
de preservativos eacute indicado (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998 apud
CONTE 2000)
A gravidez natildeo estaacute contra-indicada nas mulheres infectadas pelo
VHCHCV A transmissatildeo vertical matildee-crianccedila eacute rara (menor de 6) O tipo de parto
(natural ou cesaacuterea) natildeo tem influecircncia O aleitamento eacute permitido A transmissatildeo
nosocomial eacute prevenida eficazmente de modo convencional (KARMOCHKINE et
al 1998 apud CONTE 2000)
115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica
A infecccedilatildeo aguda pode passar clinicamente despercebida ou evoluir para
hepatite fulminante Aproximadamente 850 das pessoas infectadas agudamente
vatildeo desenvolver uma viremia persistente tornando-se dessa forma indiviacuteduos
infectados crocircnicos Depressatildeo irritabilidade dores no corpo mal-estar febre
naacuteuseas e falta de apetite satildeo alguns dos sintomas mais frequumlentes embora a
maioria dos casos natildeo apresente nenhum sintoma (ALTER 2007)
A cirrose eacute pouco observada em pessoas que apresentam niacuteveis
persistentemente baixos das transaminases mas a elevaccedilatildeo destas natildeo eacute
representativa do grau de fibrose hepaacutetica Dessa forma a bioacutepsia hepaacutetica
representa o melhor indicador do estaacutegio de evoluccedilatildeo da doenccedila uma vez que
gradua os componentes inflamatoacuterios e o estaacutegio de fibrose (AGMON-LEVIN et al
2009 BLOCK SCHIANO 1999)
Alter et al (1992) dizem que em 82 de 130 pacientes seguidos durante
muitos anos apoacutes surto agudo de hepatite natildeo-A natildeo-B apresentam anti-VHCHCV
ou VHCHCV RNA sendo que 62 deles desenvolveram hepatite crocircnica e
concluem que os pacientes que adquiriram HCV tiveram alto grau de hepatite
20
crocircnica sendo que o VHCHCV pode ser a maior causa de doenccedila crocircnica de fiacutegado
nos EUA e que na maioria dos pacientes a infecccedilatildeo pelo VHCHCV parece persistir
por muitos anos mesmo na ausecircncia de doenccedila hepaacutetica ativa
Almeida et al (1999) determinaram a prevalecircncia da infecccedilatildeo em
doadores de sangue assim como avaliaram o grau de comprometimento hepaacutetico
numa populaccedilatildeo de 37335 doadores durante o biecircnio 93-94 em Porto Alegre - RS
utilizando o teste anti-VHC ELISA 2 Selecionaram 60 deles para a biopsia hepaacutetica
com agulha de Menghini encontrando prevalecircncia de 174 com comprometimento
hepatico e 39 deles apresentavam cirrose hepaacutetica Sendo a hepatopatia crocircnica de
graus variaacuteveis observadas em 80 deles na sua grande maioria com lesotildees leves
e miacutenimas Foi observada forte associaccedilatildeo entre elevaccedilatildeo de alanina
aminotransferase (ALT) e a presenccedila de hepatopatia crocircnica embora a intensidade
desta elevaccedilatildeo natildeo se correlacione com a gravidade da lesatildeo histoloacutegica
Jaacute na experiecircncia de Mutimer et al (1995) cerca de 80 dos doadores
soro-positivos analisados exaustivamente inclusive com biopsia de fiacutegado
mostraram evidecircncias de alteraccedilotildees histoloacutegicas e ou viroloacutegicas de infecccedilatildeo
persistente sem no entanto atingir graus mais avanccedilados de hepatopatia crocircnica
quase todos permanecendo na categoria moderada
Nos paiacuteses industrializados a HCV eacute responsaacutevel por 20 dos casos de
hepatite aguda 70 dos casos de hepatite crocircnica 40 dos casos de cirrose
descompensada 60 dos carcinomas hepatocelulares e 30 dos transplantes
hepaacuteticos (LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999)
Cerca de 40 do total de pacientes curam-se ou tecircm doenccedila crocircnica de
natureza benigna Os restantes 60 cursam com atividade aumentada de
aminotransferase denotando evoluccedilatildeo crocircnica da doenccedila Dentre estes a maioria
tem lesotildees necro inflamatoacuterias discretas e fibrose miacutenima ou ausente O prognoacutestico
em longo prazo eacute mal conhecido no entanto provavelmente a maioria deles natildeo viraacute
a falecer da doenccedila hepaacutetica em curso Cerca de 20 deles depois de 10-20 anos
de evoluccedilatildeo desenvolveratildeo cirrose hepaacutetica passiacutevel de transplante Assim a
hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila que ocasiona a morte de um pequeno nuacutemero
de pacientes sem no entanto afetar a duraccedilatildeo da vida meacutedia da maioria deles
(CONTE 2000 FERREIRA SILVEIRA 2004)
Apoacutes infecccedilatildeo aguda somente 10 dos pacientes desenvolve doenccedila
cliacutenica com icteriacutecia A infecccedilatildeo sub-cliacutenica eacute a regra e assim passa despercebida
21
Cerca de 25 deles tecircm infecccedilatildeo crocircnica sintomaacutetica com aminotransferases
normais e lesotildees inflamatoacuterias histoloacutegicas miacutenimas (RESENDE et al 2010)
A remissatildeo espontacircnea acontece em cerca de 15 dos casos Na grande
minoria dos casos a progressatildeo da doenccedila aguda pode levar agrave insuficiecircncia
hepaacutetica aguda
Observaccedilotildees feitas pelo irlandecircs Kenny-Walsh (1999) comprovam a
natureza e a evoluccedilatildeo cliacutenica da afecccedilatildeo em causa O autor acompanhou durante 17
anos 376 mulheres que receberam injeccedilotildees de imunoglobulinas anti-D
contaminadas com VHC provenientes de doador uacutenico num programa de
isoimunizaccedilatildeo Rh Destas 81 apresentaram sintomatologia mais frequumlentemente
fadiga (66) ALT ligeiramente elevada (de 40 a 99 UL) em 47 e igual ou maior de
100 UL em 8 A biopsia hepaacutetica mostrou inflamaccedilatildeo em 98 delas na maioria
das vezes leves (41) e moderadas (52) fibrose presente em 51 no entanto
somente em sete pacientes (2) houve sinais de cirrose provaacutevel ou definitiva Em
uma delas havia acentuado alcoolismo
A hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila de evoluccedilatildeo variaacutevel De maneira
geral sua evoluccedilatildeo eacute lenta insidiosa e progressiva
Os pacientes que natildeo apresentam evidecircncias bioquiacutemicas de lesatildeo
hepaacutetica podem constituir em subgrupo de casos mais benignos no curso natural
da doenccedila Muitos co-fatores tecircm papel importante no desenvolvimento da cirrose
nesses pacientes como por exemplo a idade no momento da infecccedilatildeo (os
contaminados de idade mais avanccedilada tecircm evoluccedilatildeo mais raacutepida da doenccedila
enquanto que os mais jovens a tecircm mais lenta) o alcoolismo (eacute de consenso geral
que o abuso de aacutelcool favorece o aparecimento da cirrose) e a co-infecccedilatildeo com o
Viacuterus da Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida (SIDA) e da HVB
A incidecircncia anual de carcinoma hepatocelular (CHC) eacute de 1 a 4 nos
pacientes cirroacuteticos o que justifica plenamente o controle ecograacutefico do fiacutegado e a
dosagem seacuterica de alfa-fetoproteiacutena nesses pacientes a cada 1-2 anos Por outro
lado nos pacientes com hepatite crocircnica por viacuterus C sem cirrose o CHC eacute muito
raro (LOPES 2010)
Nos casos de cura a atividade das transaminases cessa e os viacuterus natildeo
satildeo detectados (VHC RNA) no soro Nos casos de cronificaccedilatildeo acontece o
contraacuterio ou seja as alteraccedilotildees bioquiacutemicas existem com flutuaccedilotildees e os viacuterus satildeo
detectaacuteveis na grande maioria dos casos Fazem exceccedilatildeo agravequeles pacientes com
22
viremia baixa que por isso mesmo fogem aos limites dos meacutetodos de detecccedilatildeo viral
ou devido agraves flutuaccedilotildees proacuteprias desses niacuteveis virecircmicos (HAYDON et al 1998)
Nos pacientes anti-VHC positivos com enzimas circulantes normais a
falta de VHC RNA no soro tem sido interpretada como sinal de cura completa No
entanto Haydon et al (1998) alteraram essa interpretaccedilatildeo Estes autores
demonstraram a presenccedila de VHC RNA no fiacutegado desses pacientes que eram
negativos no soro independente das alteraccedilotildees bioquiacutemicas positivas ou negativas
do soro ou seja mesmo naqueles casos anteriormente considerados como curados
Assim os niacuteveis de viacuterus intra-hepaacuteticos natildeo satildeo determinados pelos fatores
hospedeiro (idade modo e duraccedilatildeo da infecccedilatildeo) ou virais (VHC genoacutetipos) pois
mesmo as repetidamente Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia-em tempo real (RT-
PCR) negativos para VHC RNA no soro podem ter viacuterus da HCV albergados no
fiacutegado Entretanto existem limitaccedilotildees metodoloacutegicas que devem ser consideradas
nessa interpretaccedilatildeo como por exemplo as limitaccedilotildees do RIBA 3 e do RT-PCR
Mais importante eacute o seguimento dos pacientes ao longo do tempo Assim
Seef et al (1992) em 568 pacientes de hepatite poacutes-transfusional e dois grupos
controles pareados que receberam transfusotildees sem desenvolver hepatite apoacutes 18
anos de seguimento encontraram 33 de mortalidade no grupo 1 e 15 no grupo
controle sendo que a maioria das mortes ocorreu nos pacientes com alcoolismo
associado Evidenciando que a maioria dos que desenvolve doenccedila crocircnica o faz
muito lentamente
Existem ainda no curso natural da doenccedila flutuaccedilotildees intensas e muito
frequumlentes que dependem dos viacuterus e dos hospedeiros a saber niacuteveis da viremia
genoacutetipos 1b graus de diversidade geneacutetica dos viacuterus vias de transmissatildeo (os
inoculados via transfusatildeo apresentam lesotildees hepatocelulares mais ativas)
(GORDON et al 1993 GORDON BAYATI SILVERMAN 1998) deficiecircncias
imunes alcoolismo e co-infecccedilatildeo com HBV e delta ou o Viacuterus da imunodeficiecircncia
humana (HIV) (LOPES 2010) Nestes uacuteltimos casos a co-infecccedilatildeo com muacuteltiplos
viacuterus das hepatites estaacute associada com mais graves lesotildees histoloacutegicas do fiacutegado do
que nos casos de VHC isoladas
Importa saber se os resultados obtidos com os controles feitos se mantecircm
por longos periacuteodos Ou seja como exemplos a atividade da ALT persistentemente
normal a variabilidade do RT-PCR a detecccedilatildeo de VHC RNA pela teacutecnica Reaccedilatildeo
de polimerase em cadeia (PCR) que pode ser negativa devido agrave inadequada
23
armazenagem das amostras agrave contaminaccedilatildeo do soro com substacircncias que
interferem na leitura entre outras causas de erro
As informaccedilotildees sobre as causas que determinam o curso evolutivo da
doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos progressos havidos no campo do
diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHC Uma questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo
genotipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o
genotipo 1 (1b) cursa com lesotildees histoloacutegicas mais graves independentemente da
carga viral Ainda mais os VHC RNA negativos no soro mesmo apoacutes anos de
cura podem recair pois neles persistem os viacuterus no fiacutegado em regime de
replicaccedilatildeo muito baixa indetectaacutevel pelos meacutetodos atuais Ao contraacuterio os negativos
no soro e no fiacutegado tecircm demonstrado respostas boas e sustentadas inclusive no
sentido de se fazer prognoacutestico de cura real e verdadeira infelizmente na grande
minoria dos casos
116 Diagnoacutestico
Quanto mais cedo o diagnoacutestico maiores as chances de detectar a
doenccedila Por isso eacute importante que as pessoas faccedilam o exame especiacutefico porque soacute
esse exame eacute que detecta a HCV E as mulheres tecircm que ter uma atenccedilatildeo em
especial Tempos atraacutes o Correio Braziliense (2003) publicou uma grande mateacuteria
sobre a quantidade de mulheres que vecircm sendo infectadas com a HCV Cuja causa
estava na esterelizaccedilatildeo mal feita dos equipamentos das manicures Uma soluccedilatildeo
praacutetica eacute as mulheres terem seu proacuteprio material pra fazer as unhas e natildeo deixar
mais ningueacutem utilizar (nem matildee nem irmatilde etc) Bem e quem tiver passado por
transfusatildeo dentistas manicures operaccedilotildees etc deve fazer o exame
(KARMOCHKINE et al 1998 apud CONTE 2000 KEER et al 1997)
A HCV natildeo eacute como a Siacutendrome da Imunodeficiecircncia Adquirida (AIDS)
que possui drogas com grande tecnologia e o doente pode viver por muitos e muitos
anos Com a HCV o paciente soacute tem chance de ficar bem se a doenccedila for
diagnosticada e tratada antes dela se manifestar Atualmente o tratamento usa uma
associaccedilatildeo de duas drogas ndash o Interferon e a Ribavirina ldquoAs chances de cura em
meacutedia satildeo de 50rdquo
Barbaro et al (1999) verificaram que os pacientes VHC genoacutetipos 1b
frequumlentemente apresentavam alteraccedilotildees ultraestruturais das mitococircndrias com
24
depleccedilatildeo do mtDNA podendo comprometer o processo de fosforilizaccedilatildeo oxidativa
Sendo assim a produccedilatildeo aumentada de radicais livres nos pacientes VHC genoacutetipos
1b poderia atuar de modo negativo na evoluccedilatildeo da doenccedila hepaacutetica aumentando o
efeito citopaacuteticos do VHC Nesses pacientes haveria portanto aumento de
hiperoxidaccedilatildeo com consequumlente resistecircncia agrave accedilatildeo dos interferons e pior evoluccedilatildeo
da doenccedila hepaacutetica A ser confirmado este fato novas estrateacutegias terapecircuticas
poderatildeo vir a ser desenvolvidas no combate a essa doenccedila
Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila
poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses
autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis
vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo
hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja
quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a
concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave
hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em
parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)
Dos fatos acima expostos decorrem implicaccedilotildees tais como as respostas
CD8-CTL aos antiacutegenos VHC restritas aos complexos de histocompatibilidade
principais (MHC I) com inibiccedilatildeo ou mesmo insuficiente produccedilatildeo de complexo
peptiacutedeo VHC-MHC inibiccedilatildeo direta das ceacutelulas CTLK e a falta de resposta as
citoquininas entre outras dos vaacuterios mecanismos de escape existentes Dentro
desse contexto o niacutevel de morte celular natildeo seria alcanccedilado e a lesatildeo hepatocelular
consequumlente seria portanto miacutenima
Outra implicaccedilatildeo resultante consiste na induccedilatildeo de resposta imune
celular T Helper mediadas a partir de peptide vacinas contra o VHC Estas novas
vacinas tecircm a capacidade de gerar linfoacutecitos T citotoacutexico os CTLs contra o VHC em
camundongo imunizados com peptiacutedeos CTL e ceacutelulas HT epiacutetomes do core VHC
Esses estudos recente em animais de laboratoacuterio vecircm progredindo rapidamente
esperando-se em breve novos recursos no tratamento dessa doenccedila (AGNELLO et
al 1998)
25
12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC
O VHC constitui-se em uma famiacutelia heterogecircnea de viacuterus com no miacutenimo
seis genoacutetipos e inuacutemeros subtipos (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT
SANTOS SILVA 1999) Embora o meacutetodo de maior acuraacutecia para a determinaccedilatildeo
do genoacutetipo do VHC seja a identificaccedilatildeo completa da sequumlecircncia dos 9500
nucleotiacutedeos e a construccedilatildeo de uma aacutervore filogeneacutetica esse meacutetodo soacute pode ser
utilizado em laboratoacuterios de pesquisa (BARBOSA SILVA MARTINS 2005) e natildeo
em laboratoacuterios cliacutenicos Assim foram desenvolvidos meacutetodos para genotipagem
utilizando apenas as regiotildees mais conservadas do genoma como a proteiacutena do
envoltoacuterio (E1) a proteiacutena core e a proteiacutena natildeo estrutural NS5B A sequumlecircncia dos
nucleotiacutedeos dentro dessas regiotildees relativamente conservadas eacute genoacutetipo-
especiacutefico e os isolados podem ser genotipados independentemente da regiatildeo que
for utilizada para anaacutelise (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS
SILVA 1999) Para uso em laboratoacuterios cliacutenicos foram desenvolvidas basicamente
duas metodologias que se valem de teacutecnicas de biologia molecular (genotipagem)
ou citoloacutegicas (serotipagem)
Os meacutetodos que adotam teacutecnica de biologia molecular para genotipagem
utilizando porccedilotildees do genoma incluem a PCR aninhada (nested PCR) (BASSIT
SANTOS SILVA 1999) a teacutecnica de restriction fragment length polymorphism
(RFLP) (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS SILVA 1999) a
hibridizaccedilatildeo reversa (BASSIT SANTOS SILVA 1999) (INNO-LiPA Innogenetics
Beacutelgica Gen Eti DEIA HCV Sorin Biomedica Itaacutelia) e o sequumlenciamento direto da
regiatildeo natildeo-codificante 5 (TruGene Visible Genetics Canadaacute) Suas principais
vantagens satildeo a informaccedilatildeo direta sobre sequumlecircncia dos nucleotiacutedeos do genoma
viral a alta sensibilidade por se basearem na PCR e a possibilidade de identificar o
subtipo viral (BARBOSA SILVA MARTINS 2005)
Os meacutetodos para determinaccedilatildeo do genoacutetipo que utilizam serotipagem
baseiam-se na detecccedilatildeo de anticorpos genoacutetipos-especiacuteficos contra epiacutetopos do
VHC (por exemplo proteiacutenas da regiatildeo do core) (BLOCK SCHIANO 1999) Os
testes comercializados utilizam diferentes teacutecnicas ELISA competitivos ou
immunoblot (Murex-HC1-6 Murex Diagnostics Ltd Reino Unido RIBA HCV
Serotyping Assay Chiron Diagnostics Estados Unidos) As principais vantagens da
teacutecnica de serotipagem satildeo o baixo custo e maior facilidade de realizaccedilatildeo em
26
comparaccedilatildeo com os testes de biologia molecular (BLOCK SCHIANO 1999 De
LARANAGA et al 2000)
A determinaccedilatildeo do genoacutetipo anteriormente utilizada em pesquisas mas
sem maior utilidade na praacutetica meacutedica atualmente eacute recomendada para uso cliacutenico
Como jaacute mencionado os pacientes infectados pelo genoacutetipo 1 do VHC devem ser
tratados por 12 meses enquanto os demais por 6 meses (BASSIT SANTOS SILVA
1999)
A determinaccedilatildeo do genoacutetipo do VHC pode ser feita por PCR ou
serotipagem A primeira teacutecnica eacute mais sensiacutevel e possibilita a identificaccedilatildeo de
subtipos do VHC Contudo a segunda eacute de mais faacutecil realizaccedilatildeo e mais barata
razatildeo pela que eacute importante que a teacutecnica seja aprimorada
Oliveira et al (1999) investigaram os padrotildees de distribuiccedilatildeo dos
genoacutetipos do VHC estudando 250 pacientes anti-VHC positivos atraveacutes da
detecccedilatildeo VHC RNA pelo RT-PCR e encontraram prevalecircncia de 72 para o VHC 1
253 para o tipo 3 2 para o 2 e 07 para o 4 semelhantes aos das vaacuterias
regiotildees mundiais
13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC
As manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo pelo VHC satildeo as mais
variadas possiacuteveis A diversidade de resposta do hospedeiro ao agente infeccioso
variando desde quadros assintomaacuteticos ateacute aqueles com evoluccedilatildeo grave fatal ou
incapacitante tem estimulado a busca por justificativas de tais discrepacircncias
cliacutenicas sobretudo na imunomodulaccedilatildeo Dentre as infecccedilotildees mais bem estudadas
destacam-se aquelas pelos Viacuterus da hepatite C Viacuterus da imunodeficiecircncia humana1
(HIV-1) pelo Herpes viacuterus humano 4 (viacuterus do Epstein Baar) e pelo Mycobacterium
leprae (ABBAS LICHTMAN 2005)
A agressatildeo hepaacutetica por auto-imunidade eacute um fenocircmeno reconhecido em
vaacuterias doenccedilas do fiacutegado inclusive nas de etiologia viral Aleacutem do agente agressor e
de sua interaccedilatildeo com o sistema imunoloacutegico do hospedeiro fatores ambientais ou
hormonais estatildeo aparentemente envolvidos no surgimento de auto-imunidade
hepaacutetica como se supotildee acontecer na hepatite auto-imune em indiviacuteduos
geneticamente suscetiacuteveis (CODES et al 2002)
27
A lesatildeo hepatocelular relacionada agrave infecccedilatildeo pelos viacuterus hepatotroacutepicos e
pelos herpes viacuterus (citomegaloviacuterus e Epstein-Barr) eacute secundaacuteria a uma resposta
auto-imune do hospedeiro Estes viacuterus natildeo parecem ser diretamente citopaacuteticos
mas desencadeiam lesatildeo hepaacutetica atraveacutes da resposta imune do hospedeiro contra
ceacutelulas hepaacuteticas infectadas (MALOY POWRIE 2001)
Existem estudos que focalizam alteraccedilotildees imunoloacutegicas em hepatites
virais entretanto a maioria deles mostra resultados pontuais sem seguimento na
fase aguda da doenccedila (BLOCK SCHIANO 1999 McFARLONE et al 1990) Aleacutem
disso ainda natildeo se estabeleceu uma associaccedilatildeo entre as reaccedilotildees auto-imunes
transitoacuterias induzidas por viroses hepatotroacutepicas e agravamento do dano tecidual na
hepatite viral
A infecccedilatildeo crocircnica estaacute fortemente associada agrave crioglobulinemia mista
essencial glomerulonefrite membrano-proliferativa e porfiria cutacircnea tardia De
forma menos impressiva encontra-se tambeacutem associada agrave uacutelcera corneana de
Mooren liacutequen plano e fibrose pulmonar (KILLENBERG 2000 WENER et al 1996)
A ocorrecircncia de anticorpos antitireoidianos e hipotireoidismo tem sido relatada em
associaccedilatildeo com a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC em mulheres (KILLENBERG 2000
CACOUB et al 1999)
A associaccedilatildeo entre a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC a presenccedila do fator
reumatoacuteide e do anticorpo antinuclear (FAN) o fenocircmeno de Raynaud e doenccedilas
difusas do tecido conjuntivo (DDTC) como artrite reumatoacuteide luacutepus eritematoso
sistecircmico siacutendrome de Sjoumlgren e vasculites sistecircmicas eacute relatada em alguns
trabalhos (CACOUB et al 1999 LOVY STARKEBAUM UBEROI 1996 STAUB
1998 WENER et al 1996)
14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE
A associaccedilatildeo entre doenccedilas infecciosas e autoimunidade apresentando-
se com manifestaccedilotildees cliacutenicas ou detectadas apenas pelo desenvolvimento de auto-
anticorpos tem sido amplamente documentado Infecccedilotildees virais bacterianas e
parasitaacuterias podem estar envolvidas no desenvolvimento recidivas e ateacute mesmo na
prevenccedilatildeo de doenccedilas auto-imunes (KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)
Ribeiro e Proietti (2004) avaliaram a frequumlecircncia de FR anticorpos
antipeptiacutedeo citrulinado ciacuteclico (anti-CCP) AAN anticorpos anti-citoplasma de
28
neutroacutefilos (ANCA) anticorpos anticardiolipina (aCL) e anticorpos anti-β2
glicoproteiacutena I (anti-β2GPI) em pacientes com hanseniacutease Existe estudo
demonstrando pacientes que apresentavam manifestaccedilotildees articulares comparados
aos que natildeo apresentavam envolvimento articular e um grupo controle de indiviacuteduos
saudaacuteveis com idade e gecircnero semelhantes aos dos pacientes estudados e que
residiam na mesma aacuterea geograacutefica A maioria dos pacientes nos dois grupos (com
e sem envolvimento articular) apresentava hanseniacutease generalizada Entretanto
observaram uma baixa frequumlecircncia que natildeo foi significativamente diferente de FR
anti-CCP AAN e ANCA em pacientes com hanseniacutease (nos dois grupos) e normal
dos controles Mas a prevalecircncia de anticorpos aCL e anti-β2GPI estava
significativamente elevada nos pacientes com hanseniacutease quando comparados com
o grupo controle apesar de natildeo haver associaccedilatildeo significativa com o envolvimento
articular O isoacutetopo predominante dos dois autoanticorpos foi a IgM (487) dos
pacientes com hanseniacutease apresentava pelo menos um anticorpo antifosfoliacutepide
Aleacutem disso os autores observaram uma associaccedilatildeo entre a positividade para aCL e
as manifestaccedilotildees cliacutenicas jaacute que os pacientes com anticorpos aCL apresentavam
doenccedila Hanseniacutease generalizada (VV) com mais frequumlecircncia (p= 0002) Natildeo houve
associaccedilatildeo entre a presenccedila de anticorpos aCL ou anti-β2GPI e episoacutedios
reacionais poreacutem entre os pacientes com esses episoacutedios aqueles com anticorpos
aCL apresentavam eritema nodoso hansecircnico (ENH) em 100 dos casos enquanto
entre os pacientes negativos para aCL 57 apresentavam ENH Apesar de uma
alta taxa de concordacircncia para a presenccedila de anticorpos aCL e anti-β2GPI ter sido
observada manifestaccedilotildees tromboemboacutelicas natildeo foram observadas (RIBEIRO
PROIETTI 2004 2005)
Horimoto e Costa (2009) avaliaram pacientes com Leishmania
(leishmaniose visceral e leishmaniose cutacircnea) para a presenccedila de anticorpos anti-
Leishmania assim como FR AAN anti-DNA anti-Sm anti-RNP anti-Ro anti-La
aCL e complemento (C3 e C4) Como esperado os pacientes com leishmaniose
visceral apresentava anticorpos anti-Leishmania Tiacutetulos significativamente elevados
de AANs na maioria dos pacientes o anti-DNA foi detectado em poucos pacientes
com doenccedila visceral assim como tiacutetulos elevados de anticorpos aCL (isotipo IgG)
quando comparados com os pacientes com leishmaniose cutacircnea Niacuteveis reduzidos
de complemento tambeacutem satildeo evidentes na doenccedila visceral assim como niacuteveis
significativamente reduzidos de C3 Outros estudos comparam e discutem os
29
resultados em relaccedilatildeo agrave crescente evidecircncia na literatura da presenccedila de
autoanticorpos em ambas as doenccedilas Em geral a prevalecircncia variaacutevel de auto-
anticorpos relatada assim como relatos preacutevios na literatura podem estar
relacionados a diferenccedilas metodoloacutegicas como o tipo de ensaio utilizado a
definiccedilatildeo dos pontos de corte inativaccedilatildeo dos soros pelo calor seleccedilatildeo de pacientes
e variaccedilotildees eacutetnicas e geograacuteficas nos grupos de pacientes Mas um dos resultados
consistentes foi a frequumlecircncia significativamente mais elevada de anticorpos
antifosfoliacutepide aCL e anti-β2GPI em pacientes com hanseniacutease enquanto
anticorpos AAN e aCL foram detectados com mais frequumlecircncia nos pacientes com
leishmaniose visceral A incidecircncia aumentada de anticorpos AAN e aCL nos
pacientes com leishmaniose visceral eacute compatiacutevel com outros estudos (OSSADRON
et al 2006 SAKKAS et al 2008 VOULGARI et al 2004) e demonstra
semelhanccedilas das manifestaccedilotildees cliacutenicas e laboratoriais entre a leishmaniose
visceral e o luacutepus eritematoso sistecircmico (LES) Aleacutem disso a reatividade cruzada
entre AAN e anticorpos anti-Leishmania jaacute foi tambeacutem relatada (GRANEL et al
2000)
Diversos grupos documentaram niacuteveis elevados de anticorpos
antifosfoliacutepide (aCL anti-β2GPI e anti-protrombina) em diversas doenccedilas
infecciosas como a siacutefilis doenccedilas virais (incluindo a hepatite C Parvoviacuterus B19 e
HIV) malaacuteria e hanseniacutease sem as manifestaccedilotildees cliacutenicas da siacutendrome
antifosfoliacutepide (SAF) (ZANDMAN-GODDARD BLANK SHOENFELD 2002) Os
tiacutetulos elevados geralmente satildeo transitoacuterios diminuindo e desaparecendo apoacutes a
resoluccedilatildeo da infecccedilatildeo (LOIZOU et al 2003 ZANDMAN-GODDARD BLANK
SHOENFELD 2002) Mas em uma minoria dos pacientes a associaccedilatildeo entre
doenccedilas infecciosas e anticorpos antifosfoliacutepide pode levar a complicaccedilotildees severas
frequumlentemente fatais ou seja SAF catastroacutefica (ZANDMAN-GODDARD BLANK
SHOENFELD 2002)
Os resultados de Ribeiro e Proietti (2005) mostrando um aumento da
incidecircncia de anticorpos anti-β2-GPI em pacientes com hanseniacutease associados aos
dados de outros grupos (De LARANAGA et al 2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK
et al 1994 LOIZOU et al 2003) que tambeacutem documentaram niacuteveis elevados de
anticorpos anti-2βGPI lanccedilam duacutevidas sobre a noccedilatildeo de que os anticorpos aCL
associados a infecccedilotildees satildeo independentes dos anticorpos anti-β2GPI e natildeo
dependentes desses anticorpos como nas doenccedilas auto-imunes Em conjunto
30
esses resultados apoacuteiam a noccedilatildeo de que na presenccedila de infecccedilotildees anticorpos aCL
satildeo heterogecircneos em relaccedilatildeo agrave sua dependecircncia da 2GPI (De LARANAGA et al
2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK et al 1994 LOIZOU et al 2003) e as infecccedilotildees
podem desencadear a induccedilatildeo de anticorpos antifosfoliacutepide patogecircnicos em
indiviacuteduos predispostos (LOIZOU et al 2003)
A produccedilatildeo de autoanticorpos na hanseniacutease e leishmaniose pode ser
explicada por diversos mecanismos Na forma mais generalizada dessas doenccedilas
(hanseniacutease VV e leishmaniose visceral) os pacientes apresentam
hipergamaglobulinemia difusa semelhante agrave vista em outras infecccedilotildees como
Schistosoma mansoni T cruzi e Plasmodium A induccedilatildeo de autoanticorpos pode ser
atribuiacuteda agrave ativaccedilatildeo policlonal e proliferaccedilatildeo das ceacutelulas B algumas com auto-
reatividade pertencentes agrave biblioteca de anticorpos naturais em indiviacuteduos normais
(ARGOV et al 1989) Na leishmaniose antiacutegenos soluacuteveis derivados da L major e
L donovani satildeo mitogecircnicos e desencadeiam a produccedilatildeo de imunoglobulinas com
auto-reatividade (ARGOV et al 1989) Crioglobulinemia mista induzida pelo HCV eacute
outro exemplo de ativaccedilatildeo policlonal persistente levando a uma mistura de
autoanticorpos policlonais e monoclonais os quais causam doenccedilas auto-imunes
(AGMON-LEVIN et al 2009)
Mimetismo molecular ou homologias estruturais entre infecccedilotildees e
componentes do hospedeiro podem ser agrave base da produccedilatildeo de autoanticorpos
como no caso da febre reumaacutetica onde o componente M da membrana do
estreptococo apresenta homologia com peptiacutedeos cardiacuteacos cerebrais e sinoviais A
associaccedilatildeo da siacutendrome de Guillain-Barreacute com a infecccedilatildeo pelo Campylobacter
jejeuni representa outro exemplo de mimetismo molecular como base de uma
manifestaccedilatildeo auto-imune A reatividade cruzada entre agentes infecciosos e auto-
antiacutegenos jaacute foi demonstrada para o M leprae (McADAM MUDD SHOENFELD
1984) e M tuberculosis (SHOENFELD et al 1986) e a inibiccedilatildeo de anticorpos anti-
Sm anti-RNP e anti-SSB por promastigotas intactas de Leishmania apoacuteia a
homologia entre antiacutegenos nucleares e a Leishmania (ARGOV et al 1989)
A disseminaccedilatildeo de epiacutetopos a emergecircncia de novos anticorpos ou a
resposta de ceacutelulas T a um novo epiacutetopo (subdominante ou criacuteptico) no mesmo
antiacutegeno ou em outro antiacutegeno foi demonstrada em modelos experimentais e na
doenccedila humana alguns autores demonstraram a disseminaccedilatildeo molecular do
antiacutegeno Sm para reatividade anti-RNP (STAUB 1998) no LES enquanto na febre
31
reumaacutetica o estado de autoimunidade crocircnica que afeta as vaacutelvulas cardiacuteacas pode
resultar em uma resposta imunoloacutegica contra o colaacutegeno e laminina (KIVITY et al
2009 PORDEUS et al 2008) As infecccedilotildees tambeacutem podem desempenhar um papel
importante na induccedilatildeo da autoimunidade atraveacutes da liberaccedilatildeo de antiacutegenos
sequumlestrados apoacutes lesatildeo tecidual ou aumentando a exibiccedilatildeo de epiacutetopos criacutepticos
no meio inflamatoacuterio apresentando assim novos antiacutegenos ao sistema imunoloacutegico
(KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)
15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES
AGUDAS VIRAIS
O conceito de auto-imunidade induzida por viacuterus natildeo eacute exclusivo para
doenccedilas hepaacuteticas O viacuterus Coxsackie do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um
terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite infecciosa e estaacute implicado nas miocardites
auto-imunes reagindo contra a miosina cardiacuteaca (GIST BELL 1974) Niwa et al
(1984) encontraram elevaccedilatildeo transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator
reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas
virais comuns como varicela sarampo influenza caxumba herpes zoster e
exantema suacutebito
A patogecircnia da infecccedilatildeo viral inclui pelo menos trecircs tipos de interaccedilotildees
com o hospedeiro vertebrado 1) o efeito do agente sobre as ceacutelulas 2) a maneira
de disseminaccedilatildeo do agente no organismo infectado 3) a resposta imunoloacutegica e a
sua influencia no processo infeccioso Destacam-se dois tipos principais da
interaccedilatildeo a destruiccedilatildeo celular e a resposta imunoloacutegica (FIGUEIREDO 1999
CATALAN-SOARES PROIETTI CARNEIRO-PROIETTI 2006) O viacuterus Coxsackie
do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite
infecciosa e estaacute implicado nas miocardites auto-imunes reagindo contra a miosina
cardiacuteaca (GERSHON KONDO 1971) Niwa et al (1984) encontraram elevaccedilatildeo
transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo
anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas virais comuns como varicela sarampo
influenza caxumba herpes zoster e exantema suacutebito
32
16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN
De acordo com o II Consenso Brasileiro de FAN em HEp 2
(DELLAVANCE et al 2003) os AAN satildeo encontrados comumente em uma
variedade de doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Satildeo uacuteteis na investigaccedilatildeo dessas
doenccedilas auxiliando no diagnoacutestico de patologias como LES esclerose sistecircmica
progressiva (ESP) doenccedila mista do tecido conjuntivo (DMTC) siacutendrome de Sjoumlgren
(SS) polimiosite e dermatomiosite
Eles podem estar presentes em um pequeno percentual da populaccedilatildeo
aparentemente sadia essa frequumlecircncia eacute maior em mulheres e aumenta com a idade
Segundo a literatura a positividade entre 20 a 60 anos varia entre percentuais mais
altos (133) para tiacutetulos baixos e mais baixos (33) para tiacutetulos mais elevados
(DELLAVANCE et al 2003)
A pesquisa dos anticorpos antinucleares pode ser realizada por diferentes
teacutecnicas a imunofluorescecircncia indireta eacute a mais utilizada por sua sensibilidade
reprodutibilidade e facilidade de execuccedilatildeo A sensibilidade aumenta
significativamente quando se utiliza como substrato lacircminas com ceacutelulas Hep 2
(ceacutelulas de carcinoma de laringe humana) por causa da maior expressatildeo de
antiacutegenos na superfiacutecie dessas ceacutelulas comparados aos expressos nas ceacutelulas de
fiacutegado ou de rins de camundongos que se utilizavam anteriormente
Em geral eacute possiacutevel detectar melhor a presenccedila de AAN por associaccedilatildeo
de trecircs anti-soros isotipos especiacuteficos (anti-IgG anti-IgA e anti-IgM) A pesquisa
realizada por essa teacutecnica serve de triagem inicial para a presenccedila de AAN Eacute
normalmente denominada pesquisa de FAN ou AAN
A realizaccedilatildeo de outras metodologias tais como as imunoenzimaacuteticas
permite uma avaliaccedilatildeo isolada dos diferentes auto-anticorpos sugeridos pelos
padrotildees de fluorescecircncia encontrados no FAN A identificaccedilatildeo desses AAN permite
um diagnoacutestico mais preciso e eles podem ser utilizados em muitos casos como
marcador para uma das diferentes doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Muitas dessas
patologias apresentam um perfil distinto de auto-anticorpos que auxilia o diagnoacutestico
A presenccedila de FAN positivo em pessoas aparentemente sadias pode ser
devida a algumas situaccedilotildees
minus Doenccedila auto-imune precoce ainda natildeo expressa clinicamente
33
minus distuacuterbio imunoloacutegico transitoacuterio causado por doenccedila natildeo-imune
tais como infecccedilotildees principalmente virais
minus uso de medicamentos e neoplasias
minus manifestaccedilatildeo incompleta de uma siacutendrome ou seja o paciente
sintetiza o anticorpo poreacutem esse quadro natildeo evolui para doenccedila
minus fenocircmeno auto-imune fisioloacutegico
O resultado do FAN eacute expresso em tiacutetulo e padratildeo uma vez que ambos
os paracircmetros tecircm importacircncia para a avaliaccedilatildeo do significado cliacutenico do exame O
tiacutetulo do FAN corresponde agrave maior diluiccedilatildeo capaz de demonstrar fluorescecircncia
inequiacutevoca e didaticamente pode ser dividido em
minus Baixo menor 180
minus Moderado 1160
minus Moderadamente elevado 1320
minus Alto maior 1640
Nas pesquisas realizadas por imunofluorescecircncia indireta os resultados
satildeo expressos em tiacutetulos segundo as diluiccedilotildees empregadas Eacute possiacutevel trabalhar
utilizando-se como limite tiacutetulos de 140 que permitem maior sensibilidade ou de
180 que permitem maior especificidade ou seja um menor nuacutemero de falso-
positivos
Na praacutetica cliacutenica satildeo considerados significativos tiacutetulos superiores a
1160 Os resultados com tiacutetulos positivos satildeo acompanhados pela descriccedilatildeo do
padratildeo de fluorescecircncia encontrado que serve como orientaccedilatildeo da presenccedila de um
antiacutegeno especiacutefico e em alguns casos como padratildeo diagnoacutestico Em determinadas
situaccedilotildees em especial no LES em atividade pode ocorrer agrave observaccedilatildeo de mais de
um padratildeo de fluorescecircncia
O padratildeo do FAN a seu turno aponta uma probabilidade maior ou menor
de doenccedila auto-imune e ateacute mesmo sugere o antiacutegeno nuclear envolvido e por
consequumlecircncia a afecccedilatildeo com ele mais relacionada Os padrotildees homogecircneo
centromeacuterico e pontilhado grosso satildeo os mais indicativos de processos de
autoimunidade uma vez que se associam a diversas condiccedilotildees reumaacuteticas
especialmente ao LES e agrave esclerose sistecircmica e tambeacutem a enfermidades hepaacuteticas
tais como a cirrose biliar primaacuteria e a hepatite auto-imune (KILLENBERG 2000)
34
Jaacute o pontilhado fino o pontilhado grosso reticulado e a membrana nuclear
tecircm maior significado quando encontrados em tiacutetulos altos uma vez que podem
estar presentes em tiacutetulos baixos em indiviacuteduos hiacutegidos Por sua vez o pontilhado
fino denso mesmo quando elevado em pessoas assintomaacuteticas soacute guarda relaccedilatildeo
com alguma doenccedila em cerca de 20 dos casos (DELLAVANCE et al 2003)
O padratildeo pontilhado pode tambeacutem ser referido como padratildeo salpicado
Outros padrotildees de fluorescecircncia podem ser encontrados em menor frequumlecircncia Os
pontilhados citoplasmaacutetico grossos ou reticulares associados agrave presenccedila de
anticorpos antimitococircndrias em pacientes com cirrose biliar primaacuteria o
citoplasmaacutetico homogecircneo relacionado a proteiacutenas ribossocircmicas em pacientes com
LES e o padratildeo pontilhado fino citoplasmaacutetico que pode estar associado agrave
presenccedila de anticorpos anti-JO-1 anti-PCNA e proteiacutenas da membrana celular em
pacientes com LES outras patologias do tecido conjuntivo e hepatopatias auto-
imunes (DELLAVANCE et al 2003)
Quadro 1 - Padrotildees de fluorescecircncia encontrados em maior frequumlecircncia e patologias relacionadas
Padrotildees de Fluorececircncia Antiacutegenos Patologias Relacionadas
Perifeacuterico DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES
Homogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA
LES AR lupus induzido por drogas
Perifeacutericohomogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES
Pontilhado grosso SM RNP LES DMTC
Pontilhado fino nuclear SS-A (RO) SS-B (La) SS LES
Nucleolar Proteiacutenas Nucleolares ESP Centromeacuterico Proteiacutenas de centrocircmeros Siacutendrome de CREST
Fonte Dellavance et al 2003 Quadro 2 - Anti-ena - auto-anticorpos contra antiacutegenos extraiacutedos do nuacutecleo e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleares Patologias Relacionadas SM LES RNP DMTC LES ESP AR e Polimiosite
SS-A (Ro) SS LES lupus neonatal e forma cutacircnea subaguda
SS-B (La) SS LES luacutepus neonatal e forma cutacircnea subaguda
Scl 70 ESP Jo -1 Polimiosite e dermatomiosite Fonte Dellavance et al 2003
35
Quadro 3 ndash Padrotildees de FAN nuclear e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes
Padrotildees Nucleares Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos
Nuclear Pontilhado Centromeacuterico Anticorpo anti-centrocircmero Esclerose Sistecircmica forma CREST Cirrose Biliar Primaacuteria
Nuclear homogecircneo Anticorpo anti-DNA nativo Lupus Eritematoso Sistecircmico (LES) Anticorpo anti-Histoma LES induzido por drogas LES idiopaacutetico Anticorpo anti-cromatina (DNAHistona Nucleossomo) Artrite Reumatoacuteide (AR) Artrite Idiopaacutetica Juvenil importante associaccedilatildeo com uveiacutete na forma oligoarticular Siacutendrome de Felty Cirrose Billar Primaacuteria
Nuclear tipo membrana nuclear contiacutenua Anticorpo anti-Iamin e contra envelope nuclear - Iamins Hepatites auto-imunes Raramente associado a doenccedilas reumaacuteticas (algumas formas de LES e esclerodermia linear)
Nuclear pontilhado pleomoacuterficoPCNA Anticorpo contra nuacutecleo de ceacutelulas em proliferaccedilatildeo LES
Nuclear pontilhado fino denso Anticorpo anti-proteina p 75 kDa pode ser encontrado em indiviacuteduos saudaacuteveis processos inflamatoacuterios inespeciacuteficos doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Cistite Intersticial Dermatite Atoacutepica Psoriacutease e Asma
Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos
Anticorpo anti-p80 coilina natildeo apresenta associaccedilatildeo cliacutenica definida
Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos
Anticorpo anti-Sp100 (anti-p95) Cirrose Biliar Primaacuteria pode ocorrer em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas
Nuclear pontilhado grosso Anticorpo anti-Sm LES Anticorpo anti-RNP criteacuterio obrigatoacuterio no diagnostico da doenccedila mista do Tecido conjuntivo (DMTC) tambeacutem ocorre no LES Esclerose Sistecircmica (ES) e AR
Nuclear pontilhado fino Anticorpo anti SSARo Siacutendrome de Sjogren Primaacuteria (SS) LES Lupus neonatal e Lupus Cutacircneo Subagudo Anticorpo anti-SSBLa Lupus neonatal LES SS Anticorpo anti-Mi-2 Dermatomiosite embora raramente ocorra na polimiosite do adulto
Fonte Dellavance et al 2003
36
Quadro 4 - Padrotildees de FAN citoplasmaacuteticos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes
Padrotildees Citoplasmaacuteticos e Relacionados ao Aparelho Mitoacutetico Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos
Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina Hepatite auto-imune Cirrose Anticorpo anti-miosine Hepatite C Hepatocarcionoma Miastenia Gravis Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida
Citoplasmaacutetico Fibrilar Segmentar Anti actinina anti--vinculina e anti-tropomiose Miastenia Gravis Doenccedila de Crohn e Colite ulcerativa Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia cliacutenica definida
Citoplasmaacutetico Pontilhado Polar Anticorpo Anti-golginas (cisternas do aparelho de Golgi) raro no LES SS e outras doenccedilas auto-imunes sistecircmicas Relato na Ataxia Cerebelar Idiopaacutetica Degeneraccedilatildeo Cerebelar Paraneoplaacutesica infecccedilotildees virais pelo Epstein Barr (EBV) e pelo viacuterus da imunodeficiecircncia Humana (HIV) Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida
Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Anticorpo anti-Histidill t RNA sintetase (Jo-1) anticorpo marcador de Polimiosite no adulto Descrito raramente na Dermatomiosite
Citoplasmaacutetico Pontilhado com Pontos Isolados
Anticorpo anti-EEA1 e anti-fosfatidilserina natildeo haacute associaccedilotildees clinicas bem definida Anticorpo anti-GWBSS tambeacutem encontrado em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas
Citoplasmaacutetico Pontilhado Reticulado Anticorpo anti-mitococircndria Cirrose Biliar Primaacuteria Esclerose Sistecircmica Eacute relativamente comum o encontro deste padratildeo na ausecircncia de anticorpos anti-mitococircndria
Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Denso Anti PL7PL12 Raramente associado a Polimiosite Anticorpo P-ribossomal Este padratildeo ocorre no LES se a associaccedilatildeo eacute com anti-proteina P ribossomal
Citoplasmaacutetico Fibrilar Filamentar Anticorpo anti-vimentina e anti-queratina Anti-queratina eacute o anticorpo mais importante em doenccedila hepaacutetica alcooacutelica Descritos em vaacuterias doenccedilas inflamatoacuterias e infecciosas Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida
Aparelho mitoacutetico Tipo Centriacuteolo Anticorpo anti-enolase em baixos tiacutetulos natildeo tem associaccedilatildeo cliacutenica definida Em altos tiacutetulos eacute sugestivo de Esclerose Sistecircmica
Aparelho mitoacutetico Tipo ponte Intercelular
Anticorpo anti Tubulina Pode ser encontrado no LES e na DMTC outros anticorpos ainda natildeo bem definidos podem gerar o mesmo padratildeo
Aparelho mitoacutetico Tipo NuMa2 Anticorpo anti-HsEg5 diversas condiccedilotildees auto-imunes com baixa especificidade
Fonte Dellavance et al 2003
37
Quadro 5 - Padrotildees de FAN mistos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Mistos Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos
Misto do tipo nucleolar homogecircneo e nuclear pontilhado grosso com placa metafaacutesica decorada em anel (cromossomos negativos)
Anticorpo anti-Ku Superposiccedilatildeo Polimiose e Esclerose Sistecircmica Podem ocorrer no LES e Esclerodermia
Misto do tipo nuclear e nucleolar pontilhado com placa metafaacutesica positiva
Anticorpo anti-topoisomerase (Scl-70) ES forma difusa Mais raramente pode ocorrer na Siacutendrome CREST e superposiccedilatildeo PolimiositeEsclerodermia
Misto do tipo Citoplasmaacutetico pontilhado fino denso e homogecircneo e nucleolar homogecircneo
Anticorpo anti rRNP LES frequumlentemente relacionado agrave Psicose Luacutepica
Misto do tipo nuclear pontilhado fino com fluorescecircncia do aparelho mitoacutetico
Anticorpo anti-NuMA1SS pode ocorrer tambeacutem em outras condiccedilotildees auto-imunes ou inflamatoacuterias crocircnicas
Fonte Dellavance et al 2003
Quadro 6 - Padrotildees de FAN nucleolares e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleolares Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos
Nucleolar Aglomerado
Anticorpo anti-Fibrilarina (U3-nRNP) Esclerose Sistecircmica (ES) especialmente com comprometimento visceral grave entre eles a hipertensatildeo pulmonar
Nucleolar Pontilhado
Anticorpo anti-NOR-90 ES tambeacutem descrito em outras doenccedilas do tecido conjuntivo poreacutem sem relevacircncia clinica definida Anticorpos anti-RNA polimerase I ES de forma difusa com tendecircncia para comprometimento visceral mais frequumlente e grave
Nucleolar Homogecircneo
Anticorpo anti-PMScl Siacutendrome de Superposiccedilatildeo de Polimiosite com Esclerose Sistecircmica Raramente encontrado em casos de Polimiosite ou Esclerose Sistecircmica sem superposiccedilatildeo cliacutenica Outros auto-anticorpos mais raros podem apresentar esse padratildeo
Fonte Dellavance et al 2003
De acordo com o 3deg Consenso (DELLAVANCE et al 2009) foram
comunicados dois novos padrotildees de fluorescecircncia por participantes Vaacuterios outros
membros testemunharam jaacute haver observado esses padrotildees O primeiro trata-se de
um padratildeo nuclear pontilhado fino aproximando-se da textura homogecircnea e com
placa metafaacutesica corada da mesma forma Sua associaccedilatildeo cliacutenica e identidade
imunoloacutegica natildeo estatildeo definidas Sua importacircncia deriva do fato de que pode ser
facilmente confundido com o padratildeo pontilhado fino denso e com o padratildeo
homogecircneo O segundo trata-se de um padratildeo citoplasmaacutetico em forma de
pequenos bastotildees (rods) e ciacuterculos (rings) que aparentemente estaacute associado agrave
38
infecccedilatildeo pelo HCV Haacute estudos em curso por alguns grupos de pesquisa com a
finalidade de estabelecer sua identidade imunoloacutegica
Como ainda natildeo estatildeo definitivamente caracterizados esses dois novos
padrotildees foram considerados preliminares e o 3deg Consenso recomendou que os
mesmos fossem completamente caracterizados e apresentados na proacutexima versatildeo
do Consenso (DELLAVANCE et al 2009)
39
2 JUSTIFICATIVA
As inflamaccedilotildees do fiacutegado provocadas pelos viacuterus hepatotroacutepicos atingem
milhotildees de pessoas e representam significativos problemas de sauacutede puacuteblica em
todo o mundo No Brasil a Regiatildeo Norte responde por um significativo percentual
dos portadores de hepatite C Dentre as manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo
pelo viacuterus C as doenccedilas autoimunes tecircm significativo impacto na evoluccedilatildeo cliacutenica
desses pacientes A presenccedila de anticorpo antinuacutecleo eacute um marcador importante de
autoimunidade e apesar de existirem trabalhos relatando a pesquisa desse fator em
portadores de viacuterus C tais estudos ainda natildeo foram realizados na nossa regiatildeo
sobretudo correlacionando-se com o genoacutetipo do viacuterus responsaacutevel pela infecccedilatildeo
considerando que o genoacutetipo eacute um marcador de resposta ao tratamento ou
considerando que pacientes portadores do genoacutetipo 1 natildeo respondem
satisfatoriamente ao tratamento instituiacutedo pelo protocolo atual
21 ASPECTOS EacuteTICOS
A pesquisa a ser realizada apresenta relevacircncia social e natildeo perde o
sentido de sua destinaccedilatildeo soacutecio-humanitaacuteria (justiccedila e equidade)
Este trabalho adequa-se aos princiacutepios cientiacuteficos que o justificam e
apresenta possibilidade concreta de responder a incertezas tais como FAN e o
genoacutetipo viral em pacientes com infecccedilatildeo pelo viacuterus da hepatite C ldquoestatildeo
relacionadosrdquo
Segue rigorosamente os procedimentos descritos na Resoluccedilatildeo 19696-
CNSMS (BRASIL 1996) assegurando a confidenciabilidade e proteccedilatildeo da
identidade do sujeito da pesquisa no momento da afericcedilatildeo dos dados e sua
posterior utilizaccedilatildeo
Por tratar-se de um estudo que faraacute somente revisatildeo de soroteca os
participantes natildeo seratildeo submetidos a riscos de origem orgacircnica eou quiacutemica
40
3 OBJETIVOS
31 OBJETIVO GERAL
Estabelecer associaccedilatildeo entre a presenccedila de teste de FAN e o genoacutetipo
viral em pacientes portadores de infecccedilatildeo pelo HCV
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
I Identificar o padratildeo de fluorescecircncia do FAN em pacientes com diagnoacutestico
laboratorial de infecccedilatildeo pelo HCV
II Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados
pelo HCV de acordo com o gecircnero e a idade
III Identificar a prevalecircncia de FAN em pacientes infectados pelo HCV e natildeo
infectados
IV Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados
pelo HCV de acordo com as alteraccedilotildees bioquiacutemicas
41
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO)
Foi realizado um estudo transversal analiacutetico no Serviccedilo do Nuacutecleo de
Medicina Tropical da Universidade Federal do Paraacute (NMTUFPA) utilizando-se
pacientes oriundos da Fundaccedilatildeo Centro de Hemoterapia e Hematologia do Paraacute
(HEMOPA) e Plano de Assistecircncia ao Servidor (PASIASEP) com coleta de material
bioloacutegico para reconfirmaccedilatildeo do diagnoacutestico de hepatite C no periacuteodo de janeiro de
2009 a maio de 2010
411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C
A populaccedilatildeo de estudo consistiu de 51 pacientes admitidos no NMTUFPA
para reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica tratamento cliacutenico e acompanhamento ambulatorial
de ambos os gecircneros e independente da idade sem exclusatildeo dos pacientes com a
presenccedila de patologias associadas agrave condiccedilatildeo maior (motivadora da pesquisa)
oriundos da Fundaccedilatildeo HEMOPA e PAS
A amostra do grupo foi selecionada a partir da relaccedilatildeo dos prontuaacuterios
catalogados no laboratoacuterio de patologia do NMTUFPA
Os dados foram coletados atraveacutes dos resultados dos exames realizados
no soro de cada paciente O protocolo de coleta teve enfoque na identificaccedilatildeo
individual do paciente bem como a avaliaccedilatildeo cliacutenica dos resultados
412 Grupo de natildeo infectados
Foi utilizado um grupo controle de 100 amostras de soro de indiviacuteduos
doadores de sangue com sorologias negativas para HIV 1 e 2 HTLV 1 e 2 Siacutefilis
Doenccedilas de Chagas Hepatite B e para Hepatite C procedentes da fundaccedilatildeo
HEMOPA
42
42 MEacuteTODO
421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico
Foram colhidos em frasco sem anticoagulante 10ml de sangue perifeacuterico
dos 51 pacientes participantes da pesquisa A amostra sanguiacutenea de cada paciente
foi centrifugada o soro foi separado e colocado em frasco esteacuteril devidamente
identificado armazenado e resfriado de 2 a 8ordmC
Foi realizada no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais a
pesquisa soroloacutegica de anticorpos IgG anti-HCV por teste imunoenzimaacutetico (ELISA)
e os pacientes que apresentaram positividade tiveram seus resultados confirmados
atraveacutes de teacutecnicas moleculares (RT-PCR) e com identificaccedilatildeo do genoacutetipo viral
(genotipagem)
Foi realizado no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa a pesquisa
de FAN dos 51 pacientes selecionados utilizando as amostras existentes na
soroteca
422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C
Foram empregados testes soroloacutegicos de ELISA (Ensaio
Imunoenzimaacutetico) de 3ordf geraccedilatildeo utilizando-se de kits comerciais (kit ETI-AB-HCVK-
4 DiaSorin Itaacutelia) para detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos anti-HCV no soro dos
pacientes
As tiras (poccedilos) necessaacuterias para as reaccedilotildees foram retiradas da geladeira
com antecedecircncia de uma hora e deixadas agrave temperatura ambiente e os reagentes
homogeneizados rapidamente no voacutertex
O primeiro poccedilo da placa ficou o branco da reaccedilatildeo na sequecircncia da
microplaca de ELISA foi dispensado 200 microL do controle negativo em triplicata (trecircs
poccedilos) 200 microL do calibrador em duplicata (dois poccedilos) e 200 microL do controle positivo
em amostra uacutenica (um poccedilo)
Adicionou-se 200 microL do Diluente de Amostra em todos os poccedilos que
continham as amostras dos pacientes a serem dosadas na placa de ELISA
tomando cuidado para natildeo contaminar os poccedilos adjacentes
43
Dispensou-se 50 microL do Diluente do Reagente em todos os poccedilos de
controles calibradores e amostras cobrimos com adesivo para evitar evaporaccedilatildeo e
contaminaccedilatildeo das amostras e incubamos a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC
Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com
300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem diluiacuteda
Pipetou-se 100 microL de Conjugado Enzimaacutetico exceto no poccedilo do branco e
incubou-se a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se
cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com 300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem
diluiacuteda
Pipetou-se 100 microL de CromoacutegenoSubstrato em todos os poccedilos
Incubamos a microplaca protegendo-a de luz intensa e direta agrave temperatura
ambiente (18-24ordmC) por 15 min
Pipetou-se 100 microL de Aacutecido Sulfuacuterico em todos os poccedilos para ldquopararrdquo a
reaccedilatildeo enzimaacutetica e mediu-se a absorbacircncia da soluccedilatildeo obtida em leitor de ELISA
com filtro de 450 nM
O teste foi validado de acordo com os valores do controle de qualidade
preconizados pelo fabricante e que devem tanger os valores para o branco da
reaccedilatildeo le 0100 controle negativo le 0050 controle positivo ge 1000 e calibrador ge
1100 Para as amostras testadas os valores reagentes e natildeo reagentes para
pesquisa de anticorpos anti-HCV satildeo interpretados da seguinte maneira natildeo
reagentes com valores le 09 reagentes com valores ge 11 e indeterminados entre
os valores 09 ndash 11
423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia molecular
Nas amostras positivas pela sorologia (ELISA) realizou-se extraccedilatildeo do
RNA viral presente no soro do paciente utilizando kit comercial (QIAmp Viral RNA
kit Quiagen Alemanha) seguindo a teacutecnica adaptada no Laboratoacuterio de Patologia
Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais
Pipetou-se 560 microL de tampatildeo AVL (lise) contendo RNA em tubo de
centriacutefuga de 15 ml identificado adicionou-se 140 microL da amostra e homogenizou-se
em voacutertex por 15s incubando a temperatura ambiente (15-25degC) por 10 min Apoacutes
incubaccedilatildeo centrifugou-se rapidamente o tubo para remover partiacuteculas dispersas
44
Adicionou-se 560 microL de etanol (96-100) na amostra e homogenizou-se
no voacutertex por 15s centrifugando-se rapidamente para remover partiacuteculas dispersas
Depois cuidadosamente transferiu-se 630 microL para as colunas devidamente
identificadas centrifugou-se a 14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo
ficando soacute com a coluna para encaixar em outro tubo
Colocou-se o resto das amostras nas colunas devidas centrifugou-se a
14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo ficando soacute com a coluna para
encaixar em outro tubo Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW1) e
centrifugou-se por 1 min mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo
Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW2) e centrifugou-se por 4 min
mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo
Identificados os tubos para RNA colocou-se as colunas Adicionou-se 60
microL de tampatildeo para eluir (AVE) em cada amostra e centrifugou-se por 1 min
descartando a coluna e ficando com o tubo Colocou-se em banho-maria por 10 min
a 65degC centrifugado rapidamente e colocado no gelo As amostras extraiacutedas foram
congeladas e armazenadas em freezer a -20ordmC
O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado de acordo com a teacutecnica de
RT-PCR qualitativa com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das
Doenccedilas Tropicais da seguinte maneira para o Mix de uma amostra Tampatildeo 12
microL primer ou iniciador k10 1microL primer ou iniciador k11 1microL aacutegua ultrapura livre de
DNAse e RNAse 5 microL Enzima Taq polymerase One-Step (Invitrogen) 1 microL O
primer k10 constitui-se da sequecircncia GGC GAC ACT CCA CCA TRR e o primer k11
da sequecircncia GGT GCA CGG TCT ACG AGA CC
O volume do mix por amostra eacute de 20 microL e o volume da amostra (produto
da extraccedilatildeo) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As amostras
foram colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo eacute realizada a 42ordmC por 45 minutos
temperatura inicial de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 2 minutos seguida de 35 ciclos com
temperatura de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 54ordmC por 30
segundos de extensatildeo a 72ordmC por 45 segundos e temperatura de extensatildeo final de
72ordmC por 7 minutos e um hold de 4ordmC
Para visualizaccedilatildeo do produto dessa 1ordf PCR (RT-PCR) eacute feito um gel de
agarose a 1 (1g de agarose para 100mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de
etidium) que migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os
resultados foram visualizados atraveacutes de luz ultravioleta (UV) Os pacientes
45
positivos que apresentarem ldquobandardquo devem continuar os procedimentos e os
negativos que natildeo apresentarem ldquobandasrdquo deveratildeo ser liberados como
indetectaacuteveis por este meacutetodo
A 2ordf PCR (RFLP) foi responsaacutevel por fazer a amplificaccedilatildeo do cDNA
produto da 1ordf PCR Para esta etapa tambeacutem com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio
de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais foram necessaacuterios para o Mix de uma
amostra Tampatildeo 10X 25 microL DNTP 4 microL MgCl2 15 microL primer ou iniciador k15 1
microL primer ou iniciador k16 1 microL aacutegua ultrapura livre de DNAse e RNAse 125 microL
Enzima Taq platinum (Invitrogen) 05 microL O primer k15 constitui-se da sequecircncia
ACC ATR RAT CAC TCC CCT GT e o primer k16 da sequecircncia CAA GCA CCC TAT
CAG GCA GT
O volume do mix por amostra foi de 23 microL e o volume da amostra
(produto da 1ordf PCR) de 2 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As
amostras satildeo colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo se realiza a temperatura inicial
de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 4 minutos seguida de 35 ciclos com temperatura de
desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 55ordmC por 45 segundos de
extensatildeo a 72ordmC por 1 minuto e temperatura de extensatildeo final de 72ordmC por 7
minutos e um hold de 4ordmC
O produto da 2ordf PCR eacute observado atraveacutes de um gel de agarose a 1 (1g
de agarose para 100 mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que
migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os resultados
foram visualizados atraveacutes de luz UV (ultravioleta) Os pacientes positivos que
apresentaram ldquobandardquo (fragmento amplificado) se continuou os procedimentos e os
negativos que natildeo apresentaram ldquobandasrdquo foram repetidos para o procedimento da
2ordf PCR
424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem)
Os pacientes positivos para a 2ordf PCR foram submetidos agrave genotipagem
do viacuterus atraveacutes do meacutetodo de RFLP utilizando um par de enzimas de restriccedilatildeo
AVA II e RSA I Essa teacutecnica tambeacutem foi adaptada no Laboratoacuterio de Patologia
Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais
46
Na determinaccedilatildeo do genoacutetipo cada amostra eacute utilizada duas vezes
sendo uma reaccedilatildeo para AVA II e uma para RSA I portanto cada amostra teve dois
tubos correspondentes
Para a preparaccedilatildeo do mix de uma amostra para a enzima de restriccedilatildeo
AVA II (Promega) foram utilizados Buffer C X 30 2 microL aacutegua ultrapura livre de
DNAse e RNAse 125 microL AVA II 05 microL Para o mix de uma amostra de RSA I
(Invitrogen) satildeo necessaacuterios React 1 10X 2 microL aacutegua ultrapura libre de DNAse e
RNAse 11 microL RSA I 2 microL
O volume do mix por amostra foi de 15 microL e o volume da amostra
(produto da 2ordf PCR) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 20 microL para
cada frasco correspondente a sua enzima de restriccedilatildeo As amostras formatildeo ldquoparesrdquo
de tubos AVA II e RSA I e satildeo colocadas em banho-maria a 37ordmC overnight para
digerir (cortar) os fragmentos
Para visualizaccedilatildeo do produto da digestatildeo (RFLP) e verificaccedilatildeo dos
genoacutetipos foi preparado um gel de agarose a 2 (2g de agarose para 100 mL de
tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que migrou em cuba de eletroforese
com 100V 500A por 60 minutos Os resultados foram visualizados atraveacutes de luz UV
(ultravioleta) Os pacientes positivos apresentam ldquobandasrdquo (fragmentos) de
tamanhos diferentes O nuacutemero de bandas e sua disposiccedilatildeo no gel formaram
padrotildees de combinaccedilotildees correspondentes a cada genoacutetipo viral
425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas HEp-2
A pesquisa de auto-anticorpo contra antiacutegenos celulares foi realizada no
Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa pela teacutecnica de imunofluorescecircncia
indireta que os identifica atraveacutes da ligaccedilatildeo destes auto-anticorpos aos antiacutegenos do
substrato sendo esta ligaccedilatildeo revelada pela adiccedilatildeo de um soro com atividade Anti-
IgG conjugado agrave fluoresceiacutena
As amostras foram testadas utilizando-se um conjunto diagnoacutestico
comercial Antinuclear Antibody HEp-2 da Hemagen Diagnostics
Na primeira fase da reaccedilatildeo os soros diluiacutedos 140 colocados em contato
com o substrato durante 20 minutos seguido de lavagem com soluccedilatildeo salina
tamponada por 10 minutos Na segunda fase aplicacou-se a substacircncia
47
fluorescente sendo o conjugado diluiacutedo 130 deixando-se por 10 minutos seguida
de nova lavagem de 10 minutos e montagem da lacircmina com glicerina tamponada
Em cada lacircmina foram utilizados controle positivo e controle negativo
A leitura das lacircminas foi realizada em microscoacutepio de imunofluorescecircncia
marca Nikon modelo Eclipse E-200
Os criteacuterios morfoloacutegicos observados durante a leitura foram
a) aspecto da matriz nuclear
b) aspecto do nucleacuteolo
c) observaccedilatildeo de todos os estaacutegios de divisatildeo nuclear
d) aspecto do fuso mitoacutetico
e) aspecto do citoplasma
43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados coletados foram estruturados em um banco de dados no qual
tambeacutem foram confeccionadas tabelas e graacuteficos para representaccedilatildeo dos dados
Posteriormente foram analisados no programa Bioestat 50 para a geraccedilatildeo de
resultados estatiacutesticos que comprovassem a associaccedilatildeo de variaacuteveis pertinentes ao
estudo considerando o intervalo de confianccedila (IC) 95 e niacutevel α 5 (p-valor le 005)
isto eacute um achado seraacute considerado estatisticamente significante se valor de ldquoprdquo for
menor ou igual a 005 e seraacute considerado sem significacircncia estatiacutestica se esse valor
de ldquoprdquo for maior que 005
Nas variaacuteveis quantitativas foram realizadas as medidas de tendecircncia
central sendo calculado a meacutedia e a mediana com seus respectivos desvios
padrotildees O teste t foi usado para comparar as idades entre as amostras
O teste do Qui-quadrado e o teste G foram aplicados nas comparaccedilotildees de
n amostras independentes cujas proporccedilotildees observadas nas diversas modalidades
estiveram dispostas em tabelas de contigecircncia l x c onde se determinou as
proporccedilotildees observadas nas diferentes categorias e se estas tinham alguma
associaccedilatildeo
48
5 RESULTADOS
O Padratildeo de FAN em 100 dos 51 pacientes infectados pelo HCV e em
2 dos natildeo infectados pelo HCV ocorreu Citoplasmaacutetico
Com relaccedilatildeo agrave distribuiccedilatildeo dos pacientes por gecircnero observou-se uma
predominacircncia do gecircnero masculino (667) A faixa etaacuteria predominante foi a de 30
a 50 anos de idade (628) seguida da faixa etaacuteria compreendida entre 51 e 60
anos (196) No que diz respeito agrave naturalidade houve uma predominacircncia de
paraenses em 922 da amostra A maioria dos pacientes incluiacutedos no estudo foi
proveniente da Fundaccedilatildeo HEMOPA (98) por se tratarem de candidatos a doaccedilatildeo
de sangue (Tabela 1)
Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV segundo as caracteriacutesticas demograacuteficas janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Caracteriacutesticas demograacuteficas n Teste estatiacutestico Gecircnero
Masculino 34 667 Qui-quadrado Feminino 17 333 p = 00251
Total 51 1000
Idade (anos) lt 30 6 118 Qui-quadrado
30 a 40 16 314 p = 00094 41 a 50 16 314 51 a 60 10 196
gt 60 3 59 Total 51 1000
Naturalidade
Paraense 47 922 Qui-quadrado Macapaense 1 20 p lt 00001 Maranhense 1 20
Pernambucano 1 20 Gauacutecho 1 20
Total 51 1000
Procedecircncia Qui-quadrado HEMOPA 50 980 p lt 00001
IASEP 1 20 Total 51 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
49
Identificou-se no estudo a predominacircncia do genoacutetipo viral do tipo 1
(882) estando o genoacutetipo 3 presente em 118 dos casos Em 255 dos
pacientes foi observado uma positividade para FAN sendo que todos apresentaram
o padratildeo citoplasmaacutetico (Tabela 2)
Tabela 2 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV conforme os resultados laboratoriais de FAN citoplasmaacutetico e genotipagem janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Exames laboratoriais n Teste estatiacutestico
Genoacutetipo viral - HCV
Tipo 1 45 882 Qui-quadrado
Tipo3 6 118 p lt 00001
Total 51 1000
FAN Qui-quadrado
Positivo (citoplasmaacutetico) 13 255 p = 00008
Negativo 38 745 Total 51 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
Observou-se uma baixa positividade para o FAN tanto no gecircnero
masculino (294) quanto no gecircnero feminino (176) Natildeo houve diferenccedila
estatiacutestica significante entre os gecircneros e a anaacutelise do FAN (p = 05652) Isto eacute
independendo do gecircnero do paciente nada se poderaacute inferir se o mesmo teraacute maior
ou menor chance de possuir um FAN positivo ou negativo (Tabela 3)
Tabela 3 ndash Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
FAN (citoplasmaacutetico)
Gecircnero Teste estatiacutestico
(Teste G) Masculino Feminino
N N
Positivo 10 294 3 176
Negativo 24 706 14 824 p = 05652
Total 34 1000 17 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
Dentre os pacientes infectados o genoacutetipo viral tipo 1 e o tipo 3
predominaram no gecircnero masculino embora natildeo havendo diferenccedila significativa
entre os grupos (p=06376)(Tabela 4)
50
Tabela 4 - Relaccedilatildeo da genotipagem de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Gecircnero
Grupos estudados Teste estatiacutestico
(Teste G) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3
n n Masculino 29 644 5 833 p=06376 Feminino 16 356 1 167
Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa
Na faixa etaacuteria de 30 a 50 anos foi observada uma maior proporccedilatildeo (667)
do genoacutetipo viral do tipo 3 enquanto que para o genoacutetipo tipo 1 foi de 628 natildeo
tendo essa diferenccedila significacircncia estatiacutestica (Tabela 5)
Tabela 5 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e faixa etaacuteria - janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)
Idade (anos) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n
lt 30 04 118 0 00
30 a 40 15 314 3 500 p = 06401
41 a 50 15 314 1 167
51 a 60 08 196 2 333
gt 60 03 59 0 00 Total 45 1000 6 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
A anaacutelise descritiva das idades dos pacientes demonstrou que a meacutedia e
a mediana foi de 43 anos para aqueles com genoacutetipo viral tipo 1 no entanto para o
genoacutetipo viral tipo 3 a meacutedia foi de 44 e a mediana de 42 anos Observou-se que a
idade miacutenima dos pacientes com genoacutetipo viral-HCV do tipo 1 e 3 foi
respectivamente de 20 e 32 anos e a maacutexima foi de 68 e 57 anos perfazendo uma
amplitude total de 48 e 25 anos respectivamente Natildeo houve significacircncia estatiacutestica
entre as idades encontradas nos genoacutetipos 1 e 3 (Tabela 6 )
De acordo com o FAN citoplasmaacutetico a idade miacutenima dos pacientes com
FAN positivo e negativo foi respectivamente de 30 e 20 anos e a maacutexima foi de 53 e
68 anos perfazendo uma amplitude total de 23 e 48 anos respectivamente As
idades meacutedia e mediana foram respectivamente 435 e 46 anos nos pacientes com
o FAN positivo e meacutedia de 43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN
51
negativo Natildeo houve diferenccedila estatisticamente significativa entre as idades
encontradas nos pacientes com FAN positivo e negativo (Tabela 6)
Tabela 6 - Estudo descritivo da idade dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e presenccedila do FAN citoplasmaacutetico janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Grupos Estudados Genoacutetipo viral - HCV Auto anticorpo
Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 FAN (+) FAN (-) IDADE
Tamanho da amostra 45 6 13 38
Idade miacutenima 20 32 30 20
Idade maacutexima 68 57 53 68
Amplitude Total 48 25 23 48
Meacutedia Aritmeacutetica 43 44 435 43
Mediana 43 42 46 42
Desvio Padratildeo 107 93 78 113
Teste t p = 08363 p = 08809 Fonte Protocolo da pesquisa
Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos em que foram analisados AST
ALT ASTALT γ-GT e fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo
semelhantes dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e 3 natildeo
atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos
(Tabela 7)
Tabela 7- Distribuiccedilatildeo dos genoacutetipos dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Paracircmetros bioquiacutemicos
Genoacutetipo viral - HCV Teste estatiacutestico
(Teste t) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3
micro plusmn DP micro plusmn DP
AST 353 plusmn 219 328 plusmn 137 p = 07907
ALT 372 plusmn 321 288 plusmn 136 p = 05355
ASTALT 12 plusmn 07 14 plusmn 11 p = 06110
γ-GT 403 plusmn 38 302 plusmn 138 p = 02194
Fosfatase alcalina 1126 plusmn 443 1087 plusmn 376 p = 08349
Fonte Protocolo da pesquisa
Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos de AST ALT ASTALT γ-GT e
fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os
52
pacientes com FAN positivo e negativo natildeo sendo observada significacircncia
estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos de FAN (Tabela 8)
Tabela 8 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Paracircmetros bioquiacutemicos Auto anticorpos
Teste estatiacutestico (Teste t) Positivo Negativo
micro plusmn DP micro plusmn DP
AST 419 plusmn 238 326 plusmn 197 p = 01704
ALT 408 plusmn 29 346 plusmn 312 p = 05347
ASTALT 13 plusmn 08 12 plusmn 07 p = 05732
γ-GT 34 plusmn 21 409 plusmn 40 p = 04369
Fosfatase alcalina 1073 plusmn 345 1138 plusmn 462 p = 06431 Fonte Protocolo da pesquisa
Na comparaccedilatildeo entre resultados positivos e negativos do FAN
citoplasmaacutetico observou-se uma maior prevalecircncia da negatividade tanto em
pacientes natildeo infectados (98) como em pacientes infectados (745) pelo HCV
sendo essa diferenccedila estatisticamente significativa (plt00001) o que representa
uma natildeo associaccedilatildeo entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV
(Tabela 9)
Tabela 9 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico segundo a presenccedila ou ausecircncia de infecccedilatildeo por HCV janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
FAN (citoplasmaacutetico)
Pacientes Teste estatiacutestico (Teste G)
Infectados Natildeo infectados
N n
Positivo 13 255 2 2
Negativo 38 745 98 98 p lt 00001
Total 51 1000 100 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
Comparando-se os resultados do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos
viras observa-se que o resultado negativo eacute superior ao positivo em ambos os
genoacutetipos virais sendo 711 para o genoacutetipo viral 1 e 100 para o genoacutetipo viral 3
No entanto esta diferenccedila observada natildeo eacute estatisticamente significativa (p=02573)
(Tabela 10)
53
Tabela 10 - Distribuiccedilatildeo do FAN de acordo com o genoacutetipo viral janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
FAN (citoplasmaacutetico)
Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)
Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n
Positivo 13 289 0 00 p=02573 Negativo 32 711 6 1000
Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa
54
6 DISCUSSAtildeO
Desde o primeiro marcador soroloacutegico para diagnoacutestico do Lupus
Eritematoso Sistecircmico (LES) a ceacutelula LE descrita por Hargraves (1948) vaacuterios
substratos antigecircnicos foram utilizados para o estudo dos auto-anticorpos os quais
terminaram amplamente substituiacutedos pelas ceacutelulas HEp-2 Estas apresentam
significativas vantagens sobre os demais pela sua sensibilidade variedade de
antiacutegenos presentes e pelas facilidades morfoloacutegicas para o seu estudo
O uso da imunofluorescecircncia indireta para a visualizaccedilatildeo dos anticorpos
antinucleares nas ceacutelulas HEp-2 permite o reconhecimento de mais de 30 diferentes
padrotildees de fluorescecircncia como nucleares nucleolares da membrana nuclear do
aparelho mitoacutetico e citoplasmaacutetico todos satildeo proporcionados por diferentes auto-
anticorpos
A partir do 1deg Consenso Brasileiro para Padronizaccedilatildeo dos Laudos de FAN
(HEp-2) os criteacuterios para o preparo interpretaccedilatildeo da fluorescecircncia e nomenclatura
dos resultados passaram a ser normatizados Alguns padrotildees de fluorescecircncia satildeo
relativamente inespeciacuteficos outros satildeo ocasionados por uma gama restrita de auto-
anticorpos e outros ainda por um uacutenico auto-anticorpo (DELLAVANCE et al
2002) Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a tornaacute-las
imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo (DE
LARANAGA et al 2000)
Apesar do padratildeo de fluorescecircncia na maioria das vezes natildeo se pode
identificar o anticorpo presente ele pode sugerir ao cliacutenico qual o proacuteximo passo a
ser dado na investigaccedilatildeo da sua especificidade Os resultados encontrados devem
estar em associaccedilatildeo com a cliacutenica os padrotildees de fluorescecircncia e os tiacutetulos
alcanccedilados com a diluiccedilatildeo preacutevia (DELLAVANCE et al 2003)
No presente estudo a analise de 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo Viacuterus da
Hepatite C esteve presente o anticorpo-antinuclear (ANA FAN) em 13 (255) dos
pacientes e todos eram padratildeo citoplasmaacutetico corroborando com outros estudos
encontrados na literatura como
Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de
pacientes infectados pelo viacuterus HIV com Hanseniacutease e co-infectados com
Hanseniacutease HIV Ela obteve respectivamente as seguintes taxas de prevalecircncias
32 333 e 478 Em todos os grupos neste estudo houve predomiacutenio do
55
padratildeo citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear soacute foi observado entre os pacientes com
hanseniacutease (91) e co-infectados (237)
Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de
pacientes infectados pelo viacuterus da Dengue e viacuterus linfotroacutepico de ceacutelulas T humanas
HTLV-12 e controle Normais e obteve respectivamente as seguintes taxas de
prevalecircncias 40 40 e 2 Em todos os grupos houve predomiacutenio do padratildeo
citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear foi observado entre os pacientes com dengue
(67) e HTLV 12 (133)
Segundo Andrade et al (2002) Dellavance et al (2005) Dellavance e
Andrade et al (2007) o predomiacutenio do padratildeo de FAN do tipo citoplasmaacutetico indica
que determinados padrotildees de fluorescecircncia satildeo mais especiacuteficos de doenccedila auto-
imune enquanto outros ocorrem em indiviacuteduos com enfermidades natildeo auto-imunes
por ser o citoplasma celular rico em proteiacutenas para as quais auto-anticorpos naturais
apresentam afinidade moderada eacute comum observar positividade para FAN em
indiviacuteduos sadios cujo significado ainda natildeo eacute entendido completamente
O padratildeo Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina que pode ser
encontrado em Hepatite auto-imune Cirrose Hepatite C Hepatocarcionoma entre
outros Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica
definida Um resultado positivo pode estar ou natildeo associado a uma patologia assim
como poderaacute ou natildeo vir a apresentar uma doenccedila auto-imune com o passar do
tempo (DELLAVANCE et al 2003) Neste estudo natildeo foi feito avaliaccedilatildeo prospectiva
dos resultados embora todos sejam FAN citoplasmaacuteticos
Os achados de FAN positivo em populaccedilotildees sadias ou sem doenccedilas auto-
imunes tambeacutem jaacute observado por Leser et al (2004) que em 394 pacientes com
FAN-HEp-2 positivo natildeo encontraram nenhum paciente com doenccedila auto-imune
Outro exemplo estaacute no padratildeo citoplasmaacutetico de pontos isolados
estudado por Laurino et al (2006) presente em indiviacuteduos sem evidecircncia de auto-
imunidade mas tambeacutem em indiviacuteduos com acometimento de doenccedilas auto-imunes
sistecircmicas e natildeo-especiacuteficas
Os dados apresentados corroboram com este estudo em que foi
observado a presenccedila do auto-anticorpo em 2 (2 ) dos 100 indiviacuteduos sadios do
grupo controle todos com padratildeo citoplasmaacutetico
56
Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a
tornaacute-las imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo
(DE LARANAGA et al 2000)
Nas Infecccedilotildees agudas espera-se que a resposta auto-imune diminua a
medida que os viacuterus satildeo eliminados Entretanto alguns trabalhos sugerem que em
indiviacuteduos geneticamente susceptiacuteveis as reaccedilotildees auto-imunes possam persistir
apesar do clareamento viral uma vez que o gatilho imunoloacutegico foi ativado e natildeo
houve desativaccedilatildeo (DE LARANAGA et al 2000 SAKKAS et al 2008)
Ramos-Casals et al (2009) no estudo Doenccedilas Sistecircmica Auto-Imunes
em Pacientes com Infecccedilatildeo pelo (72) dos pacientes eram do gecircnero feminino e
(28) do masculino(ANA FAN) em 61 dos pacientes o que se diferem deste
trabalho eacute que dos 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo (667) eram do gecircnero
masculino e (333) eram do gecircnero feminino com meacutedia de idade de 430 (plusmn107)
anos com presenccedila de anticorpo-antinuclear em 13 (255) com meacutedia e mediana
respectivamente de 435 e 46 anos nos pacientes com o FAN positivo e meacutedia de
43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN negativo
Alter (1995) em sua pesquisa natildeo observou associaccedilatildeo entre o risco de
infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas designadas por gecircnero idade e raccedila Na
referida pesquisa foram estudados 51 pacientes com idade meacutedia de 430 (+- 107)
anos 34 (667) eram do gecircnero masculino e 17 (333) do gecircnero feminino todos
em fase preacute-tratamento assintomaacuteticos natildeo permitindo avaliar os risco da
infecccedilatildeoSegundo Pordeus et al (2008) a ocorrecircncia destes auto-anticorpos
indicaria um prognoacutestico desfavoraacutevel Perperas Mcfarlane e Mcsorley (1986)
sugeriram que os auto-anticorpos poderiam estar envolvidos na progressatildeo ou no
desenvolvimento de hepatites crocircnicas possivelmente por um distuacuterbio no controle
da auto-reatividade Outros estudos questionam a participaccedilatildeo dos auto-anticorpos
no processo de transiccedilatildeo para cronicidade das hepatites agudas virais poreacutem os
resultados natildeo satildeo convincentes (SHOENFELD ROSE 2004)
Lopez Seia e Roy (1998) demonstraram a presenccedila de anticorpo anti-
actina em baixos tiacutetulos em crianccedilas com hepatite aguda por curto periacuteodo de
tempo poreacutem nenhuma associaccedilatildeo com gravidade da agressatildeo hepaacutetica foi
descrita
Neste estudo a presenccedila dos auto-anticorpos em (255) dos pacientes
com infecccedilatildeo pelo HCV natildeo puderam ser relacionada com a gravidade da doenccedila
57
pois este estudo foi realizado em pacientes receacutem diagnosticados entatildeo seria
necessaacuterio um acompanhamento destes por um periacuteodo maior de tempo com a
finalidade de concluir esta afirmativa Apesar da presenccedila transitoacuteria de auto-
anticorpos jaacute ter sido descrita em doenccedilas virais comuns a associaccedilatildeo entre a
presenccedila de auto-anticorpos e a gravidade das doenccedilas necessita de comprovaccedilatildeo
Passaleva Massai e Leoncini (1983) avaliaram 302 pacientes com
hepatites agudas virais e encontraram complexos imunes circulantes (CIC) em
516 dos pacientes com frequumlecircncia significativamente maior em hepatite aguda
Nenhuma associaccedilatildeo entre a presenccedila de imuno-complexos e o niacutevel de
aminotransferases ou bilirrubina foi encontrada Segundo Andrade et al (2002)
Dellavance et al (2005) Andrade et al (2007) nos pacientes do estudo foi feita a
relaccedilatildeo entre a presenccedila dos auto-anticorpos e niacuteveis de aminotransferases e as
elevaccedilotildees natildeo tiveram significacircncia poreacutem houve associaccedilatildeo do genotipo viral 1
Nos paracircmetros bioquiacutemicos analisados em relaccedilatildeo aos genoacutetipos houve uma
distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e
3 natildeo atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os
grupos Segundo Wilson (1997) trecircs estudos mostraram correlaccedilatildeo entre niacuteveis
altos de alanina aminotransferase e atividade histoloacutegica da doenccedila hepaacutetica
Poreacutem nos pacientes considerados individualmente o valor preditivo dessa
associaccedilatildeo foi baixo enquanto muitos deles com enzimas normais apresentavam
graves alteraccedilotildees histoloacutegicas No presente estudo natildeo foi observada associaccedilatildeo entre os niacuteveis de
aminotransferases e a cronificaccedilatildeo da hepatite viral pois nem todos os pacientes do
estudo apresentavam resultado de bioacutepsia hepaacutetica
Alter et al (1999) afirmam que no Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b
(63) e 3a (313) em estudo realizado em Goiacircnia onde foi observada uma
maior prevalecircncia do genoacutetipo 1 seguida do genoacutetipo 3 em doadores de sangue e
hemofiacutelicos (DELLAVANCE ANDRADE et al 2007) Estando esses dados em
acordo com esta pesquisa que com genotipagem do viacuterus da hepatite C que
identificou o genoacutetipo 1 em 45 (882) seguidos pelo genoacutetipo 3 que foi
identificado em 6 (118) dos pacientes com infecccedilatildeo pelo HCV Em um estudo realizado na Franccedila com 13 pacientes luacutepicas infectadas
pelo viacuterus C 8 apresentavam o RNA viral sendo o genoacutetipo 1 presente em cinco
58
(625) casos seguido do genoacutetipo 3 (375) (PERLEMUTER et al 2000) dados
que se assemelham aos do presente estudo embora o estudo natildeo tenha incluiacutedo
pacientes com outras infecccedilotildees associadas ao HCV Eacute importante ressaltar que
estudos sobre genotipagem do HCV em indiviacuteduos com doenccedilas reumaacuteticas satildeo
raros
No presente estudo houve uma frequumlecircncia baixa de positividade para o
FAN nos pacientes com genoacutetipo 1 e genoacutetipo 3 Natildeo havendo significacircncia
estatiacutestica entre os pacientes com genoacutetipo 1 e 3
Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter
implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave menor
resposta agrave terapia antiviral (BRUNO et al1997) o que natildeo foi avaliado neste estudo
pois apesar de (882) dos pacientes serem genoacutetipo 1 todos estavam em fase de
reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica seja preacute- tratamento Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila
poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses
autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis
vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo
hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja
quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a
concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave
hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em
parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)
59
7 CONCLUSOtildeES
minus O padratildeo dos auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares encontrados nos
dois grupos estudados foi o citoplasmaacutetico
minus A prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares no grupo com
infecccedilatildeo pelo VHC foi significativamente maior do que no grupo controle
minus Nos resultados de FAN citoplasmaacutetico haacute uma maior prevalecircncia da
negatividade em pacientes infectados pelo HCV e natildeo infectados sendo
essa diferenccedila estatisticamente significativa conferindo a natildeo associaccedilatildeo
entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV
minus Os resultados negativos do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos viras eacute
superior aos positivos em ambos os genoacutetipos virais entretanto esta diferenccedila
natildeo eacute estatisticamente significativa
minus Houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos
celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado
minus Natildeo houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos
celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado com
relaccedilatildeo ao gecircnero onde predominou o gecircnero masculino nos dois grupos
minus Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter
implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave
menor resposta agrave terapia antiviral o que natildeo foi avaliado neste estudo pois
os pacientes estavam em fase preacute tratamento sugerindo que estes pacientes
sejam avaliados futuramente
minus A formaccedilatildeo dos auto-anticorpos parece ser mais uma consequumlecircncia do que
uma causa da agressatildeo hepaacutetica
minus A negatividade do FAN ndash Hep 2 foi maior que a positividade mas todos os
FAN positivos pertenciam ao genoacutetipo viral tipo 1 nos pacientes infectados
pelo HCV
minus Nesta pesquisa os resultados de PCR o RNA-HCV de reconfirmaccedilatildeo foi
positivo para o anti-HCV em todos os soros analisados mostrando assim
que estes pacientes eram portadores de infecccedilatildeo por viacuterus C ou seja natildeo
houve falso positivo anteriormente poreacutem todos eram assintomaacuteticos
dificultando a conclusatildeo de ser ou natildeo uma infecccedilatildeo persistente
60
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APEcircNDICES
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APEcircNDICE A - TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Vocecirc estaacute sendo convidado para fazer parte de uma pesquisa que estaacute sendo desenvolvida pela Universidade Federal do Paraacute no Nuacutecleo de Medicina Tropical intitulada AUTOANTICORPOS CONTRA ANTIacuteGENOS CELULARES E SUA CORRELACcedilAtildeO COM O GENOacuteTIPO VIRAL EM PACIENTES COM INFECCcedilAtildeO PELO VIacuteRUS DA HEPATITE C (HCV)
O Objetivo da pesquisa eacute fazer uma correlaccedilatildeo do anticorpo antinuacutecleo (FAN) e o genoacutetipo viral em pacientes com hepatite C e o estaacutegio da doenccedila hepaacutetica a partir da histologia sempre que permitidos e correlacionar ao diagnoacutestico
Caso vocecirc participe da pesquisa seraacute necessaacuterio que forneccedila uma amostra de sangue (2ml)
O uacutenico inconveniente que vocecirc poderaacute experimentar eacute a dor provocada pela agulha na hora da coleta de sangue bem como pequenos hematomas que possam vir a ocorrer e que natildeo causam danos
Essa pesquisa natildeo oferece riscos as praacuteticas satildeo de uso rotineiro e seratildeo utilizados materiais esterilizados e descartaacuteveis como agulhas seringas etc
Estaacute garantido a vocecirc todas as informaccedilotildees que vocecirc queira antes durante e depois da pesquisa
A sua participaccedilatildeo neste estudo eacute voluntaacuteria Vocecirc tem a liberdade de recusar participar da pesquisa a qualquer momento
As informaccedilotildees relacionadas agrave pesquisa poderatildeo ser inspecionadas pelos pesquisadores que executam a pesquisa e pelas autoridades legais no entanto se qualquer informaccedilatildeo for divulgada em relatoacuterio publicaccedilatildeo ou qualquer outro meio isto seraacute feito de forma codificada para manter o caraacuteter confidencial
Todas as despesas necessaacuterias para a realizaccedilatildeo do estudo natildeo satildeo de sua responsabilidade assim como a sua participaccedilatildeo na pesquisa na seraacute remunerada (vocecirc natildeo receberaacute qualquer valor em dinheiro)
Quando os resultados forem divulgados natildeo apareceraacute seu nome e sim um coacutedigo
_____________________________________
Assinatura do Pesquisador Responsaacutevel NomeAna Maria Almeida Souza EndRodovia Maacuterio Covas 1426 ndash Cond Green Garden casa 41 Fone(91) 32352665 81197217 RegConselhoCRM 1508
69
APEcircNDICE B - CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Declaro que li as informaccedilotildees acima sobre a pesquisa que me sinto
perfeitamente esclarecido sobre o conteuacutedo da mesma assim como seus riscos e
benefiacutecios Declaro ainda que por minha livre vontade aceito participar da pesquisa
cooperando com a coleta de material para exame
Beleacutem _________
_________________________________________
Assinatura do sujeito da pesquisa ou do
responsaacutevel
70
ANEXOS
71
- Assinatura do Pesquisador Responsaacutevel
-
- Beleacutem _________
-
AGRADECIMENTOS
Ao Prof Dr Juarez Antonio Simotildees Quaresma meu orientador e incentivador pelos ensinamentos e orientaccedilatildeo para a conclusatildeo desta aacuterdua tarefa Ao meu cunhado Prof Dr Carlos Leocircnidas Silva Souza Sobrinho que sempre me incentivou nessa caminhada Aos amigos Dra Isabella e Dr Alberto Amaral que muito me ajudaram me apoiaram e permitiram minhas ausecircncias no laboratoacuterio para a conclusatildeo desta jornada Ao colega MS MD David Bichara que disponibilizou seu tempo para a realizaccedilatildeo dos testes de FAN de maior importacircncia para a execuccedilatildeo deste trabalho A colega Profa Dra Cleacutea Bichara que com seu apoio me deu animo para a execuccedilatildeo deste trabalho A colega Maria do Socorro de Oliveira Cardoso companheira de trabalho pelo incentivo e torcida para a concretizaccedilatildeo desta tarefa A todos os amigos do laboratoacuterio Amaral Costa pela incondicional torcida e apoio para que eu pudesse chegar ao final desta jornada A Profa Dra Luisa Caricio Martins pela sua ajuda incondicional na cedencia dos dados dos pacientes e liberaccedilatildeo das amostras do material bioloacutegica de sua soroteca sem a qual esse trabalho seria impossiacutevel de se realizar Ao futuro colega de profissatildeo doutorando Geraldo Duarte pelas contribuiccedilotildees na conclusatildeo estatiacutestica dos resultados encontrados Ao Prof Dr Ismaelino Mauro Nunes Magno que tem se empenhado me incentivando na conclusatildeo desta meta meu anjo auxiliar A todos os componentes da banca examinadora pelo comprometimento e a forma muito simples que no momento da qualificaccedilatildeo me fizeram vecirc e buscar as melhorias ao trabalho ora apresentado A Luciene Dias Cavalcante bibliotecaacuteria do HOL pela ajuda imprescindiacutevel na elaboraccedilatildeo desta dissertaccedilatildeo A todos que de forma direta ou indireta colaboraram para a realizaccedilatildeo deste sonho
CONFIE AS COISAS ACONTECEM NA HORA CERTA
EXATAMENTE QUANDO DEVEM ACONTECER MOMENTOS FELIZES LOUVE A DEUS
MOMENTOS DIFIacuteCEIS BUSQUE A DEUS MOMENTOS SILENCIOSOS ADORE A DEUS
MOMENTOS DOLOROSOS CONFIE EM DEUS CADA MOMENTO AGRADECcedilA A DEUS
ENTENDER A VONTADE DE DEUS NEM SEMPRE Eacute
FAacuteCIL MAS CRER QUE ELE ESTAacute NO COMANDO E TEM
UM PLANO PARA NOSSA VIDA FAZ A CAMINHADA VALER
Agrave PENA
(DESCONHECIDO)
RESUMO
As inflamaccedilotildees do fiacutegado provocadas pelos viacuterus hepatotroacutepicos atingem milhotildees de
pessoas e representa significativo problema de sauacutede puacuteblica em todo o mundo
Existem interaccedilotildees entre viroses hepatotroacutepicas e o sistema imunoloacutegico do hospedeiro
que podem influenciar na patogenicidade da agressatildeo hepaacutetica O objetivo deste
trabalho foi investigar a frequumlecircncia de auto-anticorpos em pacientes portadores do viacuterus
da hepatite C e sua correlaccedilatildeo com os genoacutetipos encontrados Foram estudados 51
pacientes com diagnoacutestico confirmado pelo PCR de infecccedilatildeo pelo viacuterus da hepatite C e
um grupo de 100 doadores de sangue com todos os exames soroloacutegico para doenccedilas
infecto-contagiosas negativos Os 51 pacientes portadores do viacuterus C apresentavam
idade meacutedia de 43 anos +- 113 em fase preacute-tratamento 34 (667) eram do gecircnero
masculino e 17 (333) do gecircnero feminino Desses 13 (255) apresentaram FAN
positivo 45 (882) eram genoacutetipo tipo 1 e 118 genoacutetipo tipo 3 Os pacientes que se
apresentaram com anticorpos detectaacuteveis natildeo apresentavam niacuteveis de AST ALT
ASTALT γ-GT e fosfatase alcalina significativamente diferente daqueles com auto-
anticorpos negativos Desta forma conclui-se que os anticorpos presentes na amostra
do estudo satildeo independentes da evoluccedilatildeo da doenccedila e do prognoacutestico do paciente
entretanto parece estar ligada ao genoacutetipo tipo 1
Palavras-chave Hepatite C Auto-anticorpos Genoacutetipo
ABSTRACT
Inflammation of the liver caused by hepatotropic viruses affect millions of people and
represents a significant public health problem worldwide There are interactions between
hepatotropic viruses and the host immune system that can influence the pathogenesis of
liver injury The objective of this study was to investigate the frequency of autoantibodies
in patients with hepatitis C virus and its correlation with the genotypes found We
studied 51 patients diagnosed by PCR of infection with hepatitis C and a group of 100
blood donors with all serological tests for infectious diseases negative The 51 patients
with virus C had an average age of 43 years + - 113 in the pre-treatment 34 (667)
were male and 17 (333) were female Of these 13 (255) were ANA positive 45
(882) were with genotype 1 and 118 with genotype 3 Patients who presented with
antibodies had no detectable levels of AST ALT AST ALT γ-GT and alkaline
phosphatase significantly different from those with negative antibody titers Thus we
conclude that the antibodies present in the study sample are independent of disease
progression and patient prognosis though seems to be linked with genotype 1
Keywords Hepatitis C Auto-antibodies genotype
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Padrotildees de fluorescecircncia encontrados em maior frequumlecircncia e
patologias relacionadas 34
Quadro 2 - Anti-ena - auto-anticorpos contra antiacutegenos extraiacutedos do nuacutecleo e
relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 34
Quadro 3 ndash Padrotildees de FAN nuclear e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 35
Quadro 4 - Padrotildees de FAN citoplasmaacuteticos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 36
Quadro 5 - Padrotildees de FAN mistos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 37
Quadro 6 - Padrotildees de FAN nucleolares e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 37
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos pacientes segundo as caracteriacutesticas demograacuteficas janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 48
Tabela 2 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes conforme os resultados laboratoriais de FAN citoplasmaacutetico e genotipagem janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 49
Tabela 3 ndash Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 49
Tabela 4 - Relaccedilatildeo da genotipagem de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 50
Tabela 5 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e faixa etaacuteria - janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 50
Tabela 6 - Estudo descritivo da idade dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e presenccedila do FAN citoplasmaacutetico janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 51
Tabela 7- Distribuiccedilatildeo dos genoacutetipos dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 51
Tabela 8 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 52
Tabela 9 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico segundo a presenccedila ou ausecircncia de infecccedilatildeo por HCV janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 52
Tabela 10 - Distribuiccedilatildeo do FAN de acordo com o genoacutetipo viral janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 53
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
AAN Anticorpos antinucleares
aCL Anticorpos anticardiolipina
AIDS Sindrome da Imunodeficiecircncia Adquirida
ALT Alanina aminotransferase
ANCA Anticorpos anti-citoplasma de neutroacutefilos
Anti-CCP Antipeptiacutedeo citrulinado ciacuteclico
Anti-β2GPI Anticorpos anti-β2 glicoproteiacutena I
Cdna DNA complementar
CEP Comitecirc em Eacutetica e Pesquisa
CHC Carcinoma hepatocelular
CIC Complexos imunes circulantes
DDTC Doenccedilas difusas do tecido conjuntivo
DMTC Doenccedila mista do tecido conjuntivo
E1 Proteiacutena do envoltoacuterio
ENH Eritema Nodoso Hansecircnico
ESP Esclerose sistecircmica progressive
FAN Fator Anti-nuacutecleo
FR Fator reumatoacuteide
HBV Viacuterus da hepatite B
HCV Viacuterus da Hepatite C
HEMOPA Fundaccedilatildeo Centro de Hemoterapia e Hematologia do Paraacute
HIV Viacuterus da imunodeficiecircncia humana
HIV-1 Viacuterus da imunodeficiecircncia humana1
IAH Iacutendice de atividade histoloacutegica
LE Lupus Eritematoso
LES Luacutepus eritematoso sistecircmico
MS Ministeacuterio da Sauacutede
mtDNA DNA mitrocondrial
NANBH Hepatite natildeo-A natildeo-B
NMT Nuacutecleo de Medicina Tropical
OMS Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede
PCR Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia
Rh Tipo sanguiacuteneo
RNA Aacutecido ribonucleacuteico
RT-PCR Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia-em tempo real
SAF Siacutendrome antifosfoliacutepide
SIDA Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida
SS Siacutendrome de Sjoumlgren
UFPA Universidade Federal do Paraacute
UV ultravioleta
VHA Viacuterus da Hepatite A
VHC Viacuterus da Hepatite C
VHCHCV Hepatite C
VV Hanseniacutease generalizada
SUMAacuteRIO 1 INTRODUCcedilAtildeO 15 11 HEPATITE C (VHCHCV) 15 111 Consideraccedilotildees Gerais 15 112 Agente Etioloacutegico 16 113 Epidemiologia 17 114 Modo de Transmissatildeo 18 115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica 19 116 Diagnoacutestico 23 12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC 25
13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC 26
14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE 27
15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES AGUDAS VIRAIS 31
16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN 32 2 JUSTIFICATIVA 39 21 ASPECTOS EacuteTICOS 39 3 OBJETIVOS 40
31 OBJETIVO GERAL 40
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 40 4 MATERIAL E MEacuteTODOS 41 41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO) 41 411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C 41 412 Grupo de natildeo infectados 41 42 MEacuteTODO 42 421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico 42 422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C 42 423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia
molecular 43
424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem) 45 425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas
HEp-2 46 43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 47 5 RESULTADOS 48 6 DISCUSSAtildeO 54 7 CONCLUSOtildeES 59 REFEREcircNCIAS 60 APEcircNDICES 67 ANEXOS 70
15
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 HEPATITE C (VHCHCV)
111 Consideraccedilotildees Gerais
As hepatites virais satildeo doenccedilas causadas por diferentes agentes
etioloacutegicos de distribuiccedilotildees universais que tecircm em comum o hepatotropismo
Possuem semelhanccedilas do ponto de vista cliacutenico-laboratorial mas apresentam
importantes diferenccedilas epidemioloacutegicas quanto agrave sua evoluccedilatildeo (FERREIRA
SILVEIRA 2004) Desde a descriccedilatildeo e definiccedilatildeo em 1989 (CHOO et al 1989 apud
RIBEIRO et al 2007) tornou-se evidente sua associaccedilatildeo com uma grande
variedade de manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas desordens reumaacuteticas e auto-imunes
(ALMEIDA 2010)
A infecccedilatildeo pelo VHCHCV acarreta inflamaccedilatildeo hepaacutetica e esteatose
podendo evoluir para fibrose hepaacutetica e cirrose em indiviacuteduos cronicamente
infectados estes com grande risco de desenvolvimento de carcinoma hepatocelular
(RIBEIRO et al 2007) Essas complicaccedilotildees tardias ocorrem em um periacuteodo em
geral superior a 20 anos apoacutes o iniacutecio da infecccedilatildeo A avaliaccedilatildeo filogeneacutetica das
sequumlecircncias do VHCHCV investigadas em vaacuterias regiotildees geograacuteficas sugere que
existam pelo menos seis genoacutetipos principais designados pelos nuacutemeros de 1 a 6 e
pelo menos 30 subtipos designados por letras minuacutesculas Nos Estados Unidos
prevalecem os genoacutetipos 1a (60) e 1b (20) Os tipos 5 e 6 satildeo mais encontrados
no sudeste e sul da Aacutefrica O tipo 4 eacute predominante na Aacutefrica Central e no Oriente
Meacutedio No Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b (63) e 3a (313) (BASSIT et
al 1999 apud RIBEIRO et al 2007) As informaccedilotildees sobre as causas que
determinam o curso evolutivo da doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos
progressos que haacute no campo do diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHCHCV Uma
questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo genoacutetipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de
lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o genoacutetipo 1 (1b) cursa com lesotildees
histoloacutegicas mais graves
As uacuteltimas deacutecadas foram de notaacuteveis conquistas no que se refere agrave
prevenccedilatildeo e ao controle das hepatites virais Entre as doenccedilas endecircmico-
epidecircmicas que representam problemas importantes de sauacutede puacuteblica no Brasil
16
salientam-se as Hepatites Virais cujo comportamento epidemioloacutegico no nosso paiacutes
e no mundo tem sofrido grandes mudanccedilas nos uacuteltimos anos
Antes da seleccedilatildeo rigorosa dos doadores de sangue em 1991 o
VHCHCV era a maior causa de hepatite poacutes-transfusional Atualmente permanece
como tal em casos esporaacutedicos (CONTE 2000) Os grupos considerados de risco
satildeo pessoas que receberam transfusatildeo de sangue antes de 1992 usuaacuterios de
drogas injetaacuteveis profissionais de sauacutede que lidam com sangue pacientes de
hemodiaacutelise e com menor risco pessoas tatuadas ou com piercings (CLEMENTE
ONO-NITA 2007)
A melhoria das condiccedilotildees de higiene e de saneamento das populaccedilotildees a
vacinaccedilatildeo contra a Hepatite B (HBV) e as novas teacutecnicas moleculares de diagnoacutestico
do viacuterus da Hepatite estatildeo entre esses avanccedilos importantes (BRASIL 2008)
112 Agente Etioloacutegico
O VHCHCV um viacuterus aacutecido ribonucleacuteico (RNA) da famiacutelia Flaviviridae
representa a principal causa da previamente denominada hepatite natildeo-A natildeo-B
(SANTOS 2009) Foi identificado e isolado a partir de um clone derivado de um
genoma NANBH semelhante aos togaviridae ou flaviviridae (SAADE 2008) e
visualizado a imunoeletromicroscopia como partiacutecula de 55 a 65 nm de diacircmetro
com projeccedilotildees espiculares e de morfologia muito semelhante aos flaviviridae Aleacutem
disso estas partiacuteculas reagiram especificamente com anticorpos mono e policlonais
do conteuacutedo proteacuteico do envelope do VHC (HIRANUMA et al 1994 apud CONTE
2000)
O agente etioloacutegico do HCV natildeo eacute uma partiacutecula homogecircnea e apresenta
uma taxa alta de mutaccedilatildeo levando-o a uma heterogeneicidade genocircmica cujo
resultado eacute um grande nuacutemero de genoacutetipos (1a 1b 2a 2b 3a 3b 4 5 6)
(AUGUSTO LOBATO 2003) Natildeo haacute evidecircncias de variantes natildeo patogecircnicas O
genoacutetipo 1b eacute o que apresenta maior virulecircncia e pior resposta ao tratamento
(LAUER WALKER 2001 apud SOUZA 2007) No Brasil dados obtidos a partir de
casos isolados e estudos de pequenas amostragens indicam que o genoacutetipo 1b
ocorre em cerca de 30 a 40 dos casos o 1a em cerca de 20 1a e 1b em 20
o 3a em cerca de 28 (FOCACCIA 2004)
17
113 Epidemiologia
De acordo com a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) a HCV eacute uma
questatildeo de sauacutede puacuteblica e tambeacutem a principal causa de transplante de fiacutegado no
Brasil (SOCIEDADE BRASILEIRA DE HEPATOLOGIA 2005) Eacute estimada uma
prevalecircncia em torno de 10 para a infecccedilatildeo pelo VHC na populaccedilatildeo mundial
(KILLEMBERG 2000) Nos Estados Unidos cerca de 27 milhotildees de pessoas estatildeo
infectadas pelo viacuterus (BRASIL 2006)
De acordo com Ferreira e Silveira (2004) no Brasil o nuacutemero de pacientes
infectados eacute incerto relacionado geralmente a alguns estados e municiacutepios e o
esclarecimento dos agentes causadores das hepatites cuja identificaccedilatildeo requer
teacutecnicas laboratoriais complexas de biologia molecular eacute realizado de maneira
insuficiente Por outro lado a progressiva integraccedilatildeo entre as instacircncias gestoras
dos programas de vigilacircncia e controle das doenccedilas com grupos de pesquisa e
desses com os serviccedilos (FERREIRA SILVEIRA 2004 p 473) e a disponibilidade
dos bancos de dados nacionais mais confiaacuteveis apontam para novos e melhores
caminhos (BRASIL 2005b)
A OMS alerta que o Paiacutes deve se preparar para uma ldquoexplosatildeordquo da
epidemia a partir de 2011 (BRASIL 2005b) Outra preocupaccedilatildeo eacute que as pessoas
que receberam sangue antes de 1992 tecircm mais chances de estarem infectadas na
eacutepoca o sangue destinado agraves transfusotildees natildeo era analisado para detecccedilatildeo da HCV
porque o viacuterus natildeo era conhecido e natildeo havia exames especiacuteficos (BRASIL 2005b)
A prevalecircncia da infecccedilatildeo nos doadores de sangue sadios varia de 001-002 no
Reino Unido e no norte da Europa 1-15 no sul da Europa 65 na Aacutefrica
equatorial e de ateacute 20 no Egito (CONTE 2000)
De acordo com a OMS a cada grupo de 50 pessoas no Brasil uma tem
hepatite e de dez portadores apenas um sabe (STRAUSS 2001) Satildeo dois milhotildees
de infectados no Paiacutes Denominada epidemia silenciosa calcula-se que 170 milhotildees
de indiviacuteduos no mundo estejam contaminados pelo viacuterus C a forma mais grave da
doenccedila Ainda de acordo com a OMS o nuacutemero de brasileiros viacutetimas da
enfermidade eacute bem maior do que o estimado pelo Ministeacuterio da Sauacutede (TRINDADE
2005)
18
Por ocasiatildeo da Conferecircncia Internacional de Consenso sobre HCV em Paris
(LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999) concluiu-se que a hepatite crocircnica por viacuterus
C eacute um problema grave de sauacutede puacuteblica sendo sua prevalecircncia mundial estimada
em 3 (de 01 a 5 segundo os vaacuterios paiacuteses) por tanto havendo no mundo
todo cerca de 150 milhotildees de portadores crocircnicos do VHCHCV 4 milhotildees nos EUA
e 5 milhotildees na Europa Ocidental Na Europa Oriental a prevalecircncia eacute maior ainda
114 Modo de Transmissatildeo
A HCV eacute transmitida pelo sangue Natildeo haacute comprovaccedilatildeo de contaacutegio por
meio de fluidos corporais como saliva suor laacutegrimas secircmen ou leite materno
Tambeacutem deixa de ocorrer por meio de abraccedilos beijos uso dos mesmos copos ou
roupas Especialistas afirmam que a contaminaccedilatildeo atraveacutes de relaccedilotildees sexuais eacute
possiacutevel mas rara Quando detectada de maneira precoce a enfermidade tem
tratamento inclusive gratuito aleacutem de cura (BRASIL 2006)
Dentre os fatores de risco para transmissatildeo outros aleacutem da transfusatildeo de
sangue o uso de drogas iliacutecitas o comportamento sexual de alto risco e variaacuteveis
socioeconocircmicas representadas pelo grau de escolaridade e renda familiar Natildeo foi
observada associaccedilatildeo entre o risco de infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas
designadas por gecircnero idade e raccedila (ALTER 2007) O risco de transmissatildeo sexual
do VHCHCV eacute miacutenimo A contaminaccedilatildeo intrafamilial natildeo-sexual eacute consideraacutevel
particularmente quando um dos enfermos tem hepatopatia grave e ou carga viral
elevada (risco 110) (CONTE 2000)
A praacutetica de tatuagem fornece dados conflitantes sabendo-se que os
liacutequidos usados para esterilizar os instrumentos usados satildeo ineficazes
Karmochkine et al (1998 apud CONTE 2000) observaram que
aproximadamente 80 dos pacientes contraem o viacuterus atraveacutes da toxicomania
intravenosa ou transfusotildees de sangue ou de derivados Os restantes meios de
transmissatildeo e de contaacutegio satildeo a hemodiaacutelise os transplantes de oacutergatildeos picadas
acidentais profissionais e transmissatildeo vertical matildee-crianccedila Em 20 a 40 dos
casos natildeo se consegue determinar o modo de contaminaccedilatildeo A transmissatildeo da
hepatite crocircnica por viacuterus C pode ser prevenida (KARMOCHKINE et al 1998 apud
CONTE 2000)
19
As duas fontes de contaminaccedilatildeo satildeo a toxicomania endovenosa e a
administraccedilatildeo de produtos de origem sanguumliacutenea Esta uacuteltima praticamente
eliminada desde 1991 com a introduccedilatildeo dos testes ELISA 2 na seleccedilatildeo
aprimorada de doadores de sangue (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998
apud CONTE 2000)
A transmissatildeo sexual eacute rara com menos de 3 em parceiros estaacuteveis e
ocorre principalmente em pessoas com muacuteltiplos parceiros e com praacutetica sexual de
risco (sem uso de preservativo) ndash para os indiviacuteduos com parceiros muacuteltiplos o uso
de preservativos eacute indicado (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998 apud
CONTE 2000)
A gravidez natildeo estaacute contra-indicada nas mulheres infectadas pelo
VHCHCV A transmissatildeo vertical matildee-crianccedila eacute rara (menor de 6) O tipo de parto
(natural ou cesaacuterea) natildeo tem influecircncia O aleitamento eacute permitido A transmissatildeo
nosocomial eacute prevenida eficazmente de modo convencional (KARMOCHKINE et
al 1998 apud CONTE 2000)
115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica
A infecccedilatildeo aguda pode passar clinicamente despercebida ou evoluir para
hepatite fulminante Aproximadamente 850 das pessoas infectadas agudamente
vatildeo desenvolver uma viremia persistente tornando-se dessa forma indiviacuteduos
infectados crocircnicos Depressatildeo irritabilidade dores no corpo mal-estar febre
naacuteuseas e falta de apetite satildeo alguns dos sintomas mais frequumlentes embora a
maioria dos casos natildeo apresente nenhum sintoma (ALTER 2007)
A cirrose eacute pouco observada em pessoas que apresentam niacuteveis
persistentemente baixos das transaminases mas a elevaccedilatildeo destas natildeo eacute
representativa do grau de fibrose hepaacutetica Dessa forma a bioacutepsia hepaacutetica
representa o melhor indicador do estaacutegio de evoluccedilatildeo da doenccedila uma vez que
gradua os componentes inflamatoacuterios e o estaacutegio de fibrose (AGMON-LEVIN et al
2009 BLOCK SCHIANO 1999)
Alter et al (1992) dizem que em 82 de 130 pacientes seguidos durante
muitos anos apoacutes surto agudo de hepatite natildeo-A natildeo-B apresentam anti-VHCHCV
ou VHCHCV RNA sendo que 62 deles desenvolveram hepatite crocircnica e
concluem que os pacientes que adquiriram HCV tiveram alto grau de hepatite
20
crocircnica sendo que o VHCHCV pode ser a maior causa de doenccedila crocircnica de fiacutegado
nos EUA e que na maioria dos pacientes a infecccedilatildeo pelo VHCHCV parece persistir
por muitos anos mesmo na ausecircncia de doenccedila hepaacutetica ativa
Almeida et al (1999) determinaram a prevalecircncia da infecccedilatildeo em
doadores de sangue assim como avaliaram o grau de comprometimento hepaacutetico
numa populaccedilatildeo de 37335 doadores durante o biecircnio 93-94 em Porto Alegre - RS
utilizando o teste anti-VHC ELISA 2 Selecionaram 60 deles para a biopsia hepaacutetica
com agulha de Menghini encontrando prevalecircncia de 174 com comprometimento
hepatico e 39 deles apresentavam cirrose hepaacutetica Sendo a hepatopatia crocircnica de
graus variaacuteveis observadas em 80 deles na sua grande maioria com lesotildees leves
e miacutenimas Foi observada forte associaccedilatildeo entre elevaccedilatildeo de alanina
aminotransferase (ALT) e a presenccedila de hepatopatia crocircnica embora a intensidade
desta elevaccedilatildeo natildeo se correlacione com a gravidade da lesatildeo histoloacutegica
Jaacute na experiecircncia de Mutimer et al (1995) cerca de 80 dos doadores
soro-positivos analisados exaustivamente inclusive com biopsia de fiacutegado
mostraram evidecircncias de alteraccedilotildees histoloacutegicas e ou viroloacutegicas de infecccedilatildeo
persistente sem no entanto atingir graus mais avanccedilados de hepatopatia crocircnica
quase todos permanecendo na categoria moderada
Nos paiacuteses industrializados a HCV eacute responsaacutevel por 20 dos casos de
hepatite aguda 70 dos casos de hepatite crocircnica 40 dos casos de cirrose
descompensada 60 dos carcinomas hepatocelulares e 30 dos transplantes
hepaacuteticos (LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999)
Cerca de 40 do total de pacientes curam-se ou tecircm doenccedila crocircnica de
natureza benigna Os restantes 60 cursam com atividade aumentada de
aminotransferase denotando evoluccedilatildeo crocircnica da doenccedila Dentre estes a maioria
tem lesotildees necro inflamatoacuterias discretas e fibrose miacutenima ou ausente O prognoacutestico
em longo prazo eacute mal conhecido no entanto provavelmente a maioria deles natildeo viraacute
a falecer da doenccedila hepaacutetica em curso Cerca de 20 deles depois de 10-20 anos
de evoluccedilatildeo desenvolveratildeo cirrose hepaacutetica passiacutevel de transplante Assim a
hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila que ocasiona a morte de um pequeno nuacutemero
de pacientes sem no entanto afetar a duraccedilatildeo da vida meacutedia da maioria deles
(CONTE 2000 FERREIRA SILVEIRA 2004)
Apoacutes infecccedilatildeo aguda somente 10 dos pacientes desenvolve doenccedila
cliacutenica com icteriacutecia A infecccedilatildeo sub-cliacutenica eacute a regra e assim passa despercebida
21
Cerca de 25 deles tecircm infecccedilatildeo crocircnica sintomaacutetica com aminotransferases
normais e lesotildees inflamatoacuterias histoloacutegicas miacutenimas (RESENDE et al 2010)
A remissatildeo espontacircnea acontece em cerca de 15 dos casos Na grande
minoria dos casos a progressatildeo da doenccedila aguda pode levar agrave insuficiecircncia
hepaacutetica aguda
Observaccedilotildees feitas pelo irlandecircs Kenny-Walsh (1999) comprovam a
natureza e a evoluccedilatildeo cliacutenica da afecccedilatildeo em causa O autor acompanhou durante 17
anos 376 mulheres que receberam injeccedilotildees de imunoglobulinas anti-D
contaminadas com VHC provenientes de doador uacutenico num programa de
isoimunizaccedilatildeo Rh Destas 81 apresentaram sintomatologia mais frequumlentemente
fadiga (66) ALT ligeiramente elevada (de 40 a 99 UL) em 47 e igual ou maior de
100 UL em 8 A biopsia hepaacutetica mostrou inflamaccedilatildeo em 98 delas na maioria
das vezes leves (41) e moderadas (52) fibrose presente em 51 no entanto
somente em sete pacientes (2) houve sinais de cirrose provaacutevel ou definitiva Em
uma delas havia acentuado alcoolismo
A hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila de evoluccedilatildeo variaacutevel De maneira
geral sua evoluccedilatildeo eacute lenta insidiosa e progressiva
Os pacientes que natildeo apresentam evidecircncias bioquiacutemicas de lesatildeo
hepaacutetica podem constituir em subgrupo de casos mais benignos no curso natural
da doenccedila Muitos co-fatores tecircm papel importante no desenvolvimento da cirrose
nesses pacientes como por exemplo a idade no momento da infecccedilatildeo (os
contaminados de idade mais avanccedilada tecircm evoluccedilatildeo mais raacutepida da doenccedila
enquanto que os mais jovens a tecircm mais lenta) o alcoolismo (eacute de consenso geral
que o abuso de aacutelcool favorece o aparecimento da cirrose) e a co-infecccedilatildeo com o
Viacuterus da Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida (SIDA) e da HVB
A incidecircncia anual de carcinoma hepatocelular (CHC) eacute de 1 a 4 nos
pacientes cirroacuteticos o que justifica plenamente o controle ecograacutefico do fiacutegado e a
dosagem seacuterica de alfa-fetoproteiacutena nesses pacientes a cada 1-2 anos Por outro
lado nos pacientes com hepatite crocircnica por viacuterus C sem cirrose o CHC eacute muito
raro (LOPES 2010)
Nos casos de cura a atividade das transaminases cessa e os viacuterus natildeo
satildeo detectados (VHC RNA) no soro Nos casos de cronificaccedilatildeo acontece o
contraacuterio ou seja as alteraccedilotildees bioquiacutemicas existem com flutuaccedilotildees e os viacuterus satildeo
detectaacuteveis na grande maioria dos casos Fazem exceccedilatildeo agravequeles pacientes com
22
viremia baixa que por isso mesmo fogem aos limites dos meacutetodos de detecccedilatildeo viral
ou devido agraves flutuaccedilotildees proacuteprias desses niacuteveis virecircmicos (HAYDON et al 1998)
Nos pacientes anti-VHC positivos com enzimas circulantes normais a
falta de VHC RNA no soro tem sido interpretada como sinal de cura completa No
entanto Haydon et al (1998) alteraram essa interpretaccedilatildeo Estes autores
demonstraram a presenccedila de VHC RNA no fiacutegado desses pacientes que eram
negativos no soro independente das alteraccedilotildees bioquiacutemicas positivas ou negativas
do soro ou seja mesmo naqueles casos anteriormente considerados como curados
Assim os niacuteveis de viacuterus intra-hepaacuteticos natildeo satildeo determinados pelos fatores
hospedeiro (idade modo e duraccedilatildeo da infecccedilatildeo) ou virais (VHC genoacutetipos) pois
mesmo as repetidamente Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia-em tempo real (RT-
PCR) negativos para VHC RNA no soro podem ter viacuterus da HCV albergados no
fiacutegado Entretanto existem limitaccedilotildees metodoloacutegicas que devem ser consideradas
nessa interpretaccedilatildeo como por exemplo as limitaccedilotildees do RIBA 3 e do RT-PCR
Mais importante eacute o seguimento dos pacientes ao longo do tempo Assim
Seef et al (1992) em 568 pacientes de hepatite poacutes-transfusional e dois grupos
controles pareados que receberam transfusotildees sem desenvolver hepatite apoacutes 18
anos de seguimento encontraram 33 de mortalidade no grupo 1 e 15 no grupo
controle sendo que a maioria das mortes ocorreu nos pacientes com alcoolismo
associado Evidenciando que a maioria dos que desenvolve doenccedila crocircnica o faz
muito lentamente
Existem ainda no curso natural da doenccedila flutuaccedilotildees intensas e muito
frequumlentes que dependem dos viacuterus e dos hospedeiros a saber niacuteveis da viremia
genoacutetipos 1b graus de diversidade geneacutetica dos viacuterus vias de transmissatildeo (os
inoculados via transfusatildeo apresentam lesotildees hepatocelulares mais ativas)
(GORDON et al 1993 GORDON BAYATI SILVERMAN 1998) deficiecircncias
imunes alcoolismo e co-infecccedilatildeo com HBV e delta ou o Viacuterus da imunodeficiecircncia
humana (HIV) (LOPES 2010) Nestes uacuteltimos casos a co-infecccedilatildeo com muacuteltiplos
viacuterus das hepatites estaacute associada com mais graves lesotildees histoloacutegicas do fiacutegado do
que nos casos de VHC isoladas
Importa saber se os resultados obtidos com os controles feitos se mantecircm
por longos periacuteodos Ou seja como exemplos a atividade da ALT persistentemente
normal a variabilidade do RT-PCR a detecccedilatildeo de VHC RNA pela teacutecnica Reaccedilatildeo
de polimerase em cadeia (PCR) que pode ser negativa devido agrave inadequada
23
armazenagem das amostras agrave contaminaccedilatildeo do soro com substacircncias que
interferem na leitura entre outras causas de erro
As informaccedilotildees sobre as causas que determinam o curso evolutivo da
doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos progressos havidos no campo do
diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHC Uma questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo
genotipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o
genotipo 1 (1b) cursa com lesotildees histoloacutegicas mais graves independentemente da
carga viral Ainda mais os VHC RNA negativos no soro mesmo apoacutes anos de
cura podem recair pois neles persistem os viacuterus no fiacutegado em regime de
replicaccedilatildeo muito baixa indetectaacutevel pelos meacutetodos atuais Ao contraacuterio os negativos
no soro e no fiacutegado tecircm demonstrado respostas boas e sustentadas inclusive no
sentido de se fazer prognoacutestico de cura real e verdadeira infelizmente na grande
minoria dos casos
116 Diagnoacutestico
Quanto mais cedo o diagnoacutestico maiores as chances de detectar a
doenccedila Por isso eacute importante que as pessoas faccedilam o exame especiacutefico porque soacute
esse exame eacute que detecta a HCV E as mulheres tecircm que ter uma atenccedilatildeo em
especial Tempos atraacutes o Correio Braziliense (2003) publicou uma grande mateacuteria
sobre a quantidade de mulheres que vecircm sendo infectadas com a HCV Cuja causa
estava na esterelizaccedilatildeo mal feita dos equipamentos das manicures Uma soluccedilatildeo
praacutetica eacute as mulheres terem seu proacuteprio material pra fazer as unhas e natildeo deixar
mais ningueacutem utilizar (nem matildee nem irmatilde etc) Bem e quem tiver passado por
transfusatildeo dentistas manicures operaccedilotildees etc deve fazer o exame
(KARMOCHKINE et al 1998 apud CONTE 2000 KEER et al 1997)
A HCV natildeo eacute como a Siacutendrome da Imunodeficiecircncia Adquirida (AIDS)
que possui drogas com grande tecnologia e o doente pode viver por muitos e muitos
anos Com a HCV o paciente soacute tem chance de ficar bem se a doenccedila for
diagnosticada e tratada antes dela se manifestar Atualmente o tratamento usa uma
associaccedilatildeo de duas drogas ndash o Interferon e a Ribavirina ldquoAs chances de cura em
meacutedia satildeo de 50rdquo
Barbaro et al (1999) verificaram que os pacientes VHC genoacutetipos 1b
frequumlentemente apresentavam alteraccedilotildees ultraestruturais das mitococircndrias com
24
depleccedilatildeo do mtDNA podendo comprometer o processo de fosforilizaccedilatildeo oxidativa
Sendo assim a produccedilatildeo aumentada de radicais livres nos pacientes VHC genoacutetipos
1b poderia atuar de modo negativo na evoluccedilatildeo da doenccedila hepaacutetica aumentando o
efeito citopaacuteticos do VHC Nesses pacientes haveria portanto aumento de
hiperoxidaccedilatildeo com consequumlente resistecircncia agrave accedilatildeo dos interferons e pior evoluccedilatildeo
da doenccedila hepaacutetica A ser confirmado este fato novas estrateacutegias terapecircuticas
poderatildeo vir a ser desenvolvidas no combate a essa doenccedila
Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila
poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses
autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis
vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo
hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja
quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a
concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave
hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em
parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)
Dos fatos acima expostos decorrem implicaccedilotildees tais como as respostas
CD8-CTL aos antiacutegenos VHC restritas aos complexos de histocompatibilidade
principais (MHC I) com inibiccedilatildeo ou mesmo insuficiente produccedilatildeo de complexo
peptiacutedeo VHC-MHC inibiccedilatildeo direta das ceacutelulas CTLK e a falta de resposta as
citoquininas entre outras dos vaacuterios mecanismos de escape existentes Dentro
desse contexto o niacutevel de morte celular natildeo seria alcanccedilado e a lesatildeo hepatocelular
consequumlente seria portanto miacutenima
Outra implicaccedilatildeo resultante consiste na induccedilatildeo de resposta imune
celular T Helper mediadas a partir de peptide vacinas contra o VHC Estas novas
vacinas tecircm a capacidade de gerar linfoacutecitos T citotoacutexico os CTLs contra o VHC em
camundongo imunizados com peptiacutedeos CTL e ceacutelulas HT epiacutetomes do core VHC
Esses estudos recente em animais de laboratoacuterio vecircm progredindo rapidamente
esperando-se em breve novos recursos no tratamento dessa doenccedila (AGNELLO et
al 1998)
25
12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC
O VHC constitui-se em uma famiacutelia heterogecircnea de viacuterus com no miacutenimo
seis genoacutetipos e inuacutemeros subtipos (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT
SANTOS SILVA 1999) Embora o meacutetodo de maior acuraacutecia para a determinaccedilatildeo
do genoacutetipo do VHC seja a identificaccedilatildeo completa da sequumlecircncia dos 9500
nucleotiacutedeos e a construccedilatildeo de uma aacutervore filogeneacutetica esse meacutetodo soacute pode ser
utilizado em laboratoacuterios de pesquisa (BARBOSA SILVA MARTINS 2005) e natildeo
em laboratoacuterios cliacutenicos Assim foram desenvolvidos meacutetodos para genotipagem
utilizando apenas as regiotildees mais conservadas do genoma como a proteiacutena do
envoltoacuterio (E1) a proteiacutena core e a proteiacutena natildeo estrutural NS5B A sequumlecircncia dos
nucleotiacutedeos dentro dessas regiotildees relativamente conservadas eacute genoacutetipo-
especiacutefico e os isolados podem ser genotipados independentemente da regiatildeo que
for utilizada para anaacutelise (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS
SILVA 1999) Para uso em laboratoacuterios cliacutenicos foram desenvolvidas basicamente
duas metodologias que se valem de teacutecnicas de biologia molecular (genotipagem)
ou citoloacutegicas (serotipagem)
Os meacutetodos que adotam teacutecnica de biologia molecular para genotipagem
utilizando porccedilotildees do genoma incluem a PCR aninhada (nested PCR) (BASSIT
SANTOS SILVA 1999) a teacutecnica de restriction fragment length polymorphism
(RFLP) (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS SILVA 1999) a
hibridizaccedilatildeo reversa (BASSIT SANTOS SILVA 1999) (INNO-LiPA Innogenetics
Beacutelgica Gen Eti DEIA HCV Sorin Biomedica Itaacutelia) e o sequumlenciamento direto da
regiatildeo natildeo-codificante 5 (TruGene Visible Genetics Canadaacute) Suas principais
vantagens satildeo a informaccedilatildeo direta sobre sequumlecircncia dos nucleotiacutedeos do genoma
viral a alta sensibilidade por se basearem na PCR e a possibilidade de identificar o
subtipo viral (BARBOSA SILVA MARTINS 2005)
Os meacutetodos para determinaccedilatildeo do genoacutetipo que utilizam serotipagem
baseiam-se na detecccedilatildeo de anticorpos genoacutetipos-especiacuteficos contra epiacutetopos do
VHC (por exemplo proteiacutenas da regiatildeo do core) (BLOCK SCHIANO 1999) Os
testes comercializados utilizam diferentes teacutecnicas ELISA competitivos ou
immunoblot (Murex-HC1-6 Murex Diagnostics Ltd Reino Unido RIBA HCV
Serotyping Assay Chiron Diagnostics Estados Unidos) As principais vantagens da
teacutecnica de serotipagem satildeo o baixo custo e maior facilidade de realizaccedilatildeo em
26
comparaccedilatildeo com os testes de biologia molecular (BLOCK SCHIANO 1999 De
LARANAGA et al 2000)
A determinaccedilatildeo do genoacutetipo anteriormente utilizada em pesquisas mas
sem maior utilidade na praacutetica meacutedica atualmente eacute recomendada para uso cliacutenico
Como jaacute mencionado os pacientes infectados pelo genoacutetipo 1 do VHC devem ser
tratados por 12 meses enquanto os demais por 6 meses (BASSIT SANTOS SILVA
1999)
A determinaccedilatildeo do genoacutetipo do VHC pode ser feita por PCR ou
serotipagem A primeira teacutecnica eacute mais sensiacutevel e possibilita a identificaccedilatildeo de
subtipos do VHC Contudo a segunda eacute de mais faacutecil realizaccedilatildeo e mais barata
razatildeo pela que eacute importante que a teacutecnica seja aprimorada
Oliveira et al (1999) investigaram os padrotildees de distribuiccedilatildeo dos
genoacutetipos do VHC estudando 250 pacientes anti-VHC positivos atraveacutes da
detecccedilatildeo VHC RNA pelo RT-PCR e encontraram prevalecircncia de 72 para o VHC 1
253 para o tipo 3 2 para o 2 e 07 para o 4 semelhantes aos das vaacuterias
regiotildees mundiais
13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC
As manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo pelo VHC satildeo as mais
variadas possiacuteveis A diversidade de resposta do hospedeiro ao agente infeccioso
variando desde quadros assintomaacuteticos ateacute aqueles com evoluccedilatildeo grave fatal ou
incapacitante tem estimulado a busca por justificativas de tais discrepacircncias
cliacutenicas sobretudo na imunomodulaccedilatildeo Dentre as infecccedilotildees mais bem estudadas
destacam-se aquelas pelos Viacuterus da hepatite C Viacuterus da imunodeficiecircncia humana1
(HIV-1) pelo Herpes viacuterus humano 4 (viacuterus do Epstein Baar) e pelo Mycobacterium
leprae (ABBAS LICHTMAN 2005)
A agressatildeo hepaacutetica por auto-imunidade eacute um fenocircmeno reconhecido em
vaacuterias doenccedilas do fiacutegado inclusive nas de etiologia viral Aleacutem do agente agressor e
de sua interaccedilatildeo com o sistema imunoloacutegico do hospedeiro fatores ambientais ou
hormonais estatildeo aparentemente envolvidos no surgimento de auto-imunidade
hepaacutetica como se supotildee acontecer na hepatite auto-imune em indiviacuteduos
geneticamente suscetiacuteveis (CODES et al 2002)
27
A lesatildeo hepatocelular relacionada agrave infecccedilatildeo pelos viacuterus hepatotroacutepicos e
pelos herpes viacuterus (citomegaloviacuterus e Epstein-Barr) eacute secundaacuteria a uma resposta
auto-imune do hospedeiro Estes viacuterus natildeo parecem ser diretamente citopaacuteticos
mas desencadeiam lesatildeo hepaacutetica atraveacutes da resposta imune do hospedeiro contra
ceacutelulas hepaacuteticas infectadas (MALOY POWRIE 2001)
Existem estudos que focalizam alteraccedilotildees imunoloacutegicas em hepatites
virais entretanto a maioria deles mostra resultados pontuais sem seguimento na
fase aguda da doenccedila (BLOCK SCHIANO 1999 McFARLONE et al 1990) Aleacutem
disso ainda natildeo se estabeleceu uma associaccedilatildeo entre as reaccedilotildees auto-imunes
transitoacuterias induzidas por viroses hepatotroacutepicas e agravamento do dano tecidual na
hepatite viral
A infecccedilatildeo crocircnica estaacute fortemente associada agrave crioglobulinemia mista
essencial glomerulonefrite membrano-proliferativa e porfiria cutacircnea tardia De
forma menos impressiva encontra-se tambeacutem associada agrave uacutelcera corneana de
Mooren liacutequen plano e fibrose pulmonar (KILLENBERG 2000 WENER et al 1996)
A ocorrecircncia de anticorpos antitireoidianos e hipotireoidismo tem sido relatada em
associaccedilatildeo com a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC em mulheres (KILLENBERG 2000
CACOUB et al 1999)
A associaccedilatildeo entre a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC a presenccedila do fator
reumatoacuteide e do anticorpo antinuclear (FAN) o fenocircmeno de Raynaud e doenccedilas
difusas do tecido conjuntivo (DDTC) como artrite reumatoacuteide luacutepus eritematoso
sistecircmico siacutendrome de Sjoumlgren e vasculites sistecircmicas eacute relatada em alguns
trabalhos (CACOUB et al 1999 LOVY STARKEBAUM UBEROI 1996 STAUB
1998 WENER et al 1996)
14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE
A associaccedilatildeo entre doenccedilas infecciosas e autoimunidade apresentando-
se com manifestaccedilotildees cliacutenicas ou detectadas apenas pelo desenvolvimento de auto-
anticorpos tem sido amplamente documentado Infecccedilotildees virais bacterianas e
parasitaacuterias podem estar envolvidas no desenvolvimento recidivas e ateacute mesmo na
prevenccedilatildeo de doenccedilas auto-imunes (KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)
Ribeiro e Proietti (2004) avaliaram a frequumlecircncia de FR anticorpos
antipeptiacutedeo citrulinado ciacuteclico (anti-CCP) AAN anticorpos anti-citoplasma de
28
neutroacutefilos (ANCA) anticorpos anticardiolipina (aCL) e anticorpos anti-β2
glicoproteiacutena I (anti-β2GPI) em pacientes com hanseniacutease Existe estudo
demonstrando pacientes que apresentavam manifestaccedilotildees articulares comparados
aos que natildeo apresentavam envolvimento articular e um grupo controle de indiviacuteduos
saudaacuteveis com idade e gecircnero semelhantes aos dos pacientes estudados e que
residiam na mesma aacuterea geograacutefica A maioria dos pacientes nos dois grupos (com
e sem envolvimento articular) apresentava hanseniacutease generalizada Entretanto
observaram uma baixa frequumlecircncia que natildeo foi significativamente diferente de FR
anti-CCP AAN e ANCA em pacientes com hanseniacutease (nos dois grupos) e normal
dos controles Mas a prevalecircncia de anticorpos aCL e anti-β2GPI estava
significativamente elevada nos pacientes com hanseniacutease quando comparados com
o grupo controle apesar de natildeo haver associaccedilatildeo significativa com o envolvimento
articular O isoacutetopo predominante dos dois autoanticorpos foi a IgM (487) dos
pacientes com hanseniacutease apresentava pelo menos um anticorpo antifosfoliacutepide
Aleacutem disso os autores observaram uma associaccedilatildeo entre a positividade para aCL e
as manifestaccedilotildees cliacutenicas jaacute que os pacientes com anticorpos aCL apresentavam
doenccedila Hanseniacutease generalizada (VV) com mais frequumlecircncia (p= 0002) Natildeo houve
associaccedilatildeo entre a presenccedila de anticorpos aCL ou anti-β2GPI e episoacutedios
reacionais poreacutem entre os pacientes com esses episoacutedios aqueles com anticorpos
aCL apresentavam eritema nodoso hansecircnico (ENH) em 100 dos casos enquanto
entre os pacientes negativos para aCL 57 apresentavam ENH Apesar de uma
alta taxa de concordacircncia para a presenccedila de anticorpos aCL e anti-β2GPI ter sido
observada manifestaccedilotildees tromboemboacutelicas natildeo foram observadas (RIBEIRO
PROIETTI 2004 2005)
Horimoto e Costa (2009) avaliaram pacientes com Leishmania
(leishmaniose visceral e leishmaniose cutacircnea) para a presenccedila de anticorpos anti-
Leishmania assim como FR AAN anti-DNA anti-Sm anti-RNP anti-Ro anti-La
aCL e complemento (C3 e C4) Como esperado os pacientes com leishmaniose
visceral apresentava anticorpos anti-Leishmania Tiacutetulos significativamente elevados
de AANs na maioria dos pacientes o anti-DNA foi detectado em poucos pacientes
com doenccedila visceral assim como tiacutetulos elevados de anticorpos aCL (isotipo IgG)
quando comparados com os pacientes com leishmaniose cutacircnea Niacuteveis reduzidos
de complemento tambeacutem satildeo evidentes na doenccedila visceral assim como niacuteveis
significativamente reduzidos de C3 Outros estudos comparam e discutem os
29
resultados em relaccedilatildeo agrave crescente evidecircncia na literatura da presenccedila de
autoanticorpos em ambas as doenccedilas Em geral a prevalecircncia variaacutevel de auto-
anticorpos relatada assim como relatos preacutevios na literatura podem estar
relacionados a diferenccedilas metodoloacutegicas como o tipo de ensaio utilizado a
definiccedilatildeo dos pontos de corte inativaccedilatildeo dos soros pelo calor seleccedilatildeo de pacientes
e variaccedilotildees eacutetnicas e geograacuteficas nos grupos de pacientes Mas um dos resultados
consistentes foi a frequumlecircncia significativamente mais elevada de anticorpos
antifosfoliacutepide aCL e anti-β2GPI em pacientes com hanseniacutease enquanto
anticorpos AAN e aCL foram detectados com mais frequumlecircncia nos pacientes com
leishmaniose visceral A incidecircncia aumentada de anticorpos AAN e aCL nos
pacientes com leishmaniose visceral eacute compatiacutevel com outros estudos (OSSADRON
et al 2006 SAKKAS et al 2008 VOULGARI et al 2004) e demonstra
semelhanccedilas das manifestaccedilotildees cliacutenicas e laboratoriais entre a leishmaniose
visceral e o luacutepus eritematoso sistecircmico (LES) Aleacutem disso a reatividade cruzada
entre AAN e anticorpos anti-Leishmania jaacute foi tambeacutem relatada (GRANEL et al
2000)
Diversos grupos documentaram niacuteveis elevados de anticorpos
antifosfoliacutepide (aCL anti-β2GPI e anti-protrombina) em diversas doenccedilas
infecciosas como a siacutefilis doenccedilas virais (incluindo a hepatite C Parvoviacuterus B19 e
HIV) malaacuteria e hanseniacutease sem as manifestaccedilotildees cliacutenicas da siacutendrome
antifosfoliacutepide (SAF) (ZANDMAN-GODDARD BLANK SHOENFELD 2002) Os
tiacutetulos elevados geralmente satildeo transitoacuterios diminuindo e desaparecendo apoacutes a
resoluccedilatildeo da infecccedilatildeo (LOIZOU et al 2003 ZANDMAN-GODDARD BLANK
SHOENFELD 2002) Mas em uma minoria dos pacientes a associaccedilatildeo entre
doenccedilas infecciosas e anticorpos antifosfoliacutepide pode levar a complicaccedilotildees severas
frequumlentemente fatais ou seja SAF catastroacutefica (ZANDMAN-GODDARD BLANK
SHOENFELD 2002)
Os resultados de Ribeiro e Proietti (2005) mostrando um aumento da
incidecircncia de anticorpos anti-β2-GPI em pacientes com hanseniacutease associados aos
dados de outros grupos (De LARANAGA et al 2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK
et al 1994 LOIZOU et al 2003) que tambeacutem documentaram niacuteveis elevados de
anticorpos anti-2βGPI lanccedilam duacutevidas sobre a noccedilatildeo de que os anticorpos aCL
associados a infecccedilotildees satildeo independentes dos anticorpos anti-β2GPI e natildeo
dependentes desses anticorpos como nas doenccedilas auto-imunes Em conjunto
30
esses resultados apoacuteiam a noccedilatildeo de que na presenccedila de infecccedilotildees anticorpos aCL
satildeo heterogecircneos em relaccedilatildeo agrave sua dependecircncia da 2GPI (De LARANAGA et al
2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK et al 1994 LOIZOU et al 2003) e as infecccedilotildees
podem desencadear a induccedilatildeo de anticorpos antifosfoliacutepide patogecircnicos em
indiviacuteduos predispostos (LOIZOU et al 2003)
A produccedilatildeo de autoanticorpos na hanseniacutease e leishmaniose pode ser
explicada por diversos mecanismos Na forma mais generalizada dessas doenccedilas
(hanseniacutease VV e leishmaniose visceral) os pacientes apresentam
hipergamaglobulinemia difusa semelhante agrave vista em outras infecccedilotildees como
Schistosoma mansoni T cruzi e Plasmodium A induccedilatildeo de autoanticorpos pode ser
atribuiacuteda agrave ativaccedilatildeo policlonal e proliferaccedilatildeo das ceacutelulas B algumas com auto-
reatividade pertencentes agrave biblioteca de anticorpos naturais em indiviacuteduos normais
(ARGOV et al 1989) Na leishmaniose antiacutegenos soluacuteveis derivados da L major e
L donovani satildeo mitogecircnicos e desencadeiam a produccedilatildeo de imunoglobulinas com
auto-reatividade (ARGOV et al 1989) Crioglobulinemia mista induzida pelo HCV eacute
outro exemplo de ativaccedilatildeo policlonal persistente levando a uma mistura de
autoanticorpos policlonais e monoclonais os quais causam doenccedilas auto-imunes
(AGMON-LEVIN et al 2009)
Mimetismo molecular ou homologias estruturais entre infecccedilotildees e
componentes do hospedeiro podem ser agrave base da produccedilatildeo de autoanticorpos
como no caso da febre reumaacutetica onde o componente M da membrana do
estreptococo apresenta homologia com peptiacutedeos cardiacuteacos cerebrais e sinoviais A
associaccedilatildeo da siacutendrome de Guillain-Barreacute com a infecccedilatildeo pelo Campylobacter
jejeuni representa outro exemplo de mimetismo molecular como base de uma
manifestaccedilatildeo auto-imune A reatividade cruzada entre agentes infecciosos e auto-
antiacutegenos jaacute foi demonstrada para o M leprae (McADAM MUDD SHOENFELD
1984) e M tuberculosis (SHOENFELD et al 1986) e a inibiccedilatildeo de anticorpos anti-
Sm anti-RNP e anti-SSB por promastigotas intactas de Leishmania apoacuteia a
homologia entre antiacutegenos nucleares e a Leishmania (ARGOV et al 1989)
A disseminaccedilatildeo de epiacutetopos a emergecircncia de novos anticorpos ou a
resposta de ceacutelulas T a um novo epiacutetopo (subdominante ou criacuteptico) no mesmo
antiacutegeno ou em outro antiacutegeno foi demonstrada em modelos experimentais e na
doenccedila humana alguns autores demonstraram a disseminaccedilatildeo molecular do
antiacutegeno Sm para reatividade anti-RNP (STAUB 1998) no LES enquanto na febre
31
reumaacutetica o estado de autoimunidade crocircnica que afeta as vaacutelvulas cardiacuteacas pode
resultar em uma resposta imunoloacutegica contra o colaacutegeno e laminina (KIVITY et al
2009 PORDEUS et al 2008) As infecccedilotildees tambeacutem podem desempenhar um papel
importante na induccedilatildeo da autoimunidade atraveacutes da liberaccedilatildeo de antiacutegenos
sequumlestrados apoacutes lesatildeo tecidual ou aumentando a exibiccedilatildeo de epiacutetopos criacutepticos
no meio inflamatoacuterio apresentando assim novos antiacutegenos ao sistema imunoloacutegico
(KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)
15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES
AGUDAS VIRAIS
O conceito de auto-imunidade induzida por viacuterus natildeo eacute exclusivo para
doenccedilas hepaacuteticas O viacuterus Coxsackie do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um
terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite infecciosa e estaacute implicado nas miocardites
auto-imunes reagindo contra a miosina cardiacuteaca (GIST BELL 1974) Niwa et al
(1984) encontraram elevaccedilatildeo transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator
reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas
virais comuns como varicela sarampo influenza caxumba herpes zoster e
exantema suacutebito
A patogecircnia da infecccedilatildeo viral inclui pelo menos trecircs tipos de interaccedilotildees
com o hospedeiro vertebrado 1) o efeito do agente sobre as ceacutelulas 2) a maneira
de disseminaccedilatildeo do agente no organismo infectado 3) a resposta imunoloacutegica e a
sua influencia no processo infeccioso Destacam-se dois tipos principais da
interaccedilatildeo a destruiccedilatildeo celular e a resposta imunoloacutegica (FIGUEIREDO 1999
CATALAN-SOARES PROIETTI CARNEIRO-PROIETTI 2006) O viacuterus Coxsackie
do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite
infecciosa e estaacute implicado nas miocardites auto-imunes reagindo contra a miosina
cardiacuteaca (GERSHON KONDO 1971) Niwa et al (1984) encontraram elevaccedilatildeo
transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo
anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas virais comuns como varicela sarampo
influenza caxumba herpes zoster e exantema suacutebito
32
16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN
De acordo com o II Consenso Brasileiro de FAN em HEp 2
(DELLAVANCE et al 2003) os AAN satildeo encontrados comumente em uma
variedade de doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Satildeo uacuteteis na investigaccedilatildeo dessas
doenccedilas auxiliando no diagnoacutestico de patologias como LES esclerose sistecircmica
progressiva (ESP) doenccedila mista do tecido conjuntivo (DMTC) siacutendrome de Sjoumlgren
(SS) polimiosite e dermatomiosite
Eles podem estar presentes em um pequeno percentual da populaccedilatildeo
aparentemente sadia essa frequumlecircncia eacute maior em mulheres e aumenta com a idade
Segundo a literatura a positividade entre 20 a 60 anos varia entre percentuais mais
altos (133) para tiacutetulos baixos e mais baixos (33) para tiacutetulos mais elevados
(DELLAVANCE et al 2003)
A pesquisa dos anticorpos antinucleares pode ser realizada por diferentes
teacutecnicas a imunofluorescecircncia indireta eacute a mais utilizada por sua sensibilidade
reprodutibilidade e facilidade de execuccedilatildeo A sensibilidade aumenta
significativamente quando se utiliza como substrato lacircminas com ceacutelulas Hep 2
(ceacutelulas de carcinoma de laringe humana) por causa da maior expressatildeo de
antiacutegenos na superfiacutecie dessas ceacutelulas comparados aos expressos nas ceacutelulas de
fiacutegado ou de rins de camundongos que se utilizavam anteriormente
Em geral eacute possiacutevel detectar melhor a presenccedila de AAN por associaccedilatildeo
de trecircs anti-soros isotipos especiacuteficos (anti-IgG anti-IgA e anti-IgM) A pesquisa
realizada por essa teacutecnica serve de triagem inicial para a presenccedila de AAN Eacute
normalmente denominada pesquisa de FAN ou AAN
A realizaccedilatildeo de outras metodologias tais como as imunoenzimaacuteticas
permite uma avaliaccedilatildeo isolada dos diferentes auto-anticorpos sugeridos pelos
padrotildees de fluorescecircncia encontrados no FAN A identificaccedilatildeo desses AAN permite
um diagnoacutestico mais preciso e eles podem ser utilizados em muitos casos como
marcador para uma das diferentes doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Muitas dessas
patologias apresentam um perfil distinto de auto-anticorpos que auxilia o diagnoacutestico
A presenccedila de FAN positivo em pessoas aparentemente sadias pode ser
devida a algumas situaccedilotildees
minus Doenccedila auto-imune precoce ainda natildeo expressa clinicamente
33
minus distuacuterbio imunoloacutegico transitoacuterio causado por doenccedila natildeo-imune
tais como infecccedilotildees principalmente virais
minus uso de medicamentos e neoplasias
minus manifestaccedilatildeo incompleta de uma siacutendrome ou seja o paciente
sintetiza o anticorpo poreacutem esse quadro natildeo evolui para doenccedila
minus fenocircmeno auto-imune fisioloacutegico
O resultado do FAN eacute expresso em tiacutetulo e padratildeo uma vez que ambos
os paracircmetros tecircm importacircncia para a avaliaccedilatildeo do significado cliacutenico do exame O
tiacutetulo do FAN corresponde agrave maior diluiccedilatildeo capaz de demonstrar fluorescecircncia
inequiacutevoca e didaticamente pode ser dividido em
minus Baixo menor 180
minus Moderado 1160
minus Moderadamente elevado 1320
minus Alto maior 1640
Nas pesquisas realizadas por imunofluorescecircncia indireta os resultados
satildeo expressos em tiacutetulos segundo as diluiccedilotildees empregadas Eacute possiacutevel trabalhar
utilizando-se como limite tiacutetulos de 140 que permitem maior sensibilidade ou de
180 que permitem maior especificidade ou seja um menor nuacutemero de falso-
positivos
Na praacutetica cliacutenica satildeo considerados significativos tiacutetulos superiores a
1160 Os resultados com tiacutetulos positivos satildeo acompanhados pela descriccedilatildeo do
padratildeo de fluorescecircncia encontrado que serve como orientaccedilatildeo da presenccedila de um
antiacutegeno especiacutefico e em alguns casos como padratildeo diagnoacutestico Em determinadas
situaccedilotildees em especial no LES em atividade pode ocorrer agrave observaccedilatildeo de mais de
um padratildeo de fluorescecircncia
O padratildeo do FAN a seu turno aponta uma probabilidade maior ou menor
de doenccedila auto-imune e ateacute mesmo sugere o antiacutegeno nuclear envolvido e por
consequumlecircncia a afecccedilatildeo com ele mais relacionada Os padrotildees homogecircneo
centromeacuterico e pontilhado grosso satildeo os mais indicativos de processos de
autoimunidade uma vez que se associam a diversas condiccedilotildees reumaacuteticas
especialmente ao LES e agrave esclerose sistecircmica e tambeacutem a enfermidades hepaacuteticas
tais como a cirrose biliar primaacuteria e a hepatite auto-imune (KILLENBERG 2000)
34
Jaacute o pontilhado fino o pontilhado grosso reticulado e a membrana nuclear
tecircm maior significado quando encontrados em tiacutetulos altos uma vez que podem
estar presentes em tiacutetulos baixos em indiviacuteduos hiacutegidos Por sua vez o pontilhado
fino denso mesmo quando elevado em pessoas assintomaacuteticas soacute guarda relaccedilatildeo
com alguma doenccedila em cerca de 20 dos casos (DELLAVANCE et al 2003)
O padratildeo pontilhado pode tambeacutem ser referido como padratildeo salpicado
Outros padrotildees de fluorescecircncia podem ser encontrados em menor frequumlecircncia Os
pontilhados citoplasmaacutetico grossos ou reticulares associados agrave presenccedila de
anticorpos antimitococircndrias em pacientes com cirrose biliar primaacuteria o
citoplasmaacutetico homogecircneo relacionado a proteiacutenas ribossocircmicas em pacientes com
LES e o padratildeo pontilhado fino citoplasmaacutetico que pode estar associado agrave
presenccedila de anticorpos anti-JO-1 anti-PCNA e proteiacutenas da membrana celular em
pacientes com LES outras patologias do tecido conjuntivo e hepatopatias auto-
imunes (DELLAVANCE et al 2003)
Quadro 1 - Padrotildees de fluorescecircncia encontrados em maior frequumlecircncia e patologias relacionadas
Padrotildees de Fluorececircncia Antiacutegenos Patologias Relacionadas
Perifeacuterico DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES
Homogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA
LES AR lupus induzido por drogas
Perifeacutericohomogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES
Pontilhado grosso SM RNP LES DMTC
Pontilhado fino nuclear SS-A (RO) SS-B (La) SS LES
Nucleolar Proteiacutenas Nucleolares ESP Centromeacuterico Proteiacutenas de centrocircmeros Siacutendrome de CREST
Fonte Dellavance et al 2003 Quadro 2 - Anti-ena - auto-anticorpos contra antiacutegenos extraiacutedos do nuacutecleo e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleares Patologias Relacionadas SM LES RNP DMTC LES ESP AR e Polimiosite
SS-A (Ro) SS LES lupus neonatal e forma cutacircnea subaguda
SS-B (La) SS LES luacutepus neonatal e forma cutacircnea subaguda
Scl 70 ESP Jo -1 Polimiosite e dermatomiosite Fonte Dellavance et al 2003
35
Quadro 3 ndash Padrotildees de FAN nuclear e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes
Padrotildees Nucleares Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos
Nuclear Pontilhado Centromeacuterico Anticorpo anti-centrocircmero Esclerose Sistecircmica forma CREST Cirrose Biliar Primaacuteria
Nuclear homogecircneo Anticorpo anti-DNA nativo Lupus Eritematoso Sistecircmico (LES) Anticorpo anti-Histoma LES induzido por drogas LES idiopaacutetico Anticorpo anti-cromatina (DNAHistona Nucleossomo) Artrite Reumatoacuteide (AR) Artrite Idiopaacutetica Juvenil importante associaccedilatildeo com uveiacutete na forma oligoarticular Siacutendrome de Felty Cirrose Billar Primaacuteria
Nuclear tipo membrana nuclear contiacutenua Anticorpo anti-Iamin e contra envelope nuclear - Iamins Hepatites auto-imunes Raramente associado a doenccedilas reumaacuteticas (algumas formas de LES e esclerodermia linear)
Nuclear pontilhado pleomoacuterficoPCNA Anticorpo contra nuacutecleo de ceacutelulas em proliferaccedilatildeo LES
Nuclear pontilhado fino denso Anticorpo anti-proteina p 75 kDa pode ser encontrado em indiviacuteduos saudaacuteveis processos inflamatoacuterios inespeciacuteficos doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Cistite Intersticial Dermatite Atoacutepica Psoriacutease e Asma
Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos
Anticorpo anti-p80 coilina natildeo apresenta associaccedilatildeo cliacutenica definida
Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos
Anticorpo anti-Sp100 (anti-p95) Cirrose Biliar Primaacuteria pode ocorrer em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas
Nuclear pontilhado grosso Anticorpo anti-Sm LES Anticorpo anti-RNP criteacuterio obrigatoacuterio no diagnostico da doenccedila mista do Tecido conjuntivo (DMTC) tambeacutem ocorre no LES Esclerose Sistecircmica (ES) e AR
Nuclear pontilhado fino Anticorpo anti SSARo Siacutendrome de Sjogren Primaacuteria (SS) LES Lupus neonatal e Lupus Cutacircneo Subagudo Anticorpo anti-SSBLa Lupus neonatal LES SS Anticorpo anti-Mi-2 Dermatomiosite embora raramente ocorra na polimiosite do adulto
Fonte Dellavance et al 2003
36
Quadro 4 - Padrotildees de FAN citoplasmaacuteticos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes
Padrotildees Citoplasmaacuteticos e Relacionados ao Aparelho Mitoacutetico Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos
Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina Hepatite auto-imune Cirrose Anticorpo anti-miosine Hepatite C Hepatocarcionoma Miastenia Gravis Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida
Citoplasmaacutetico Fibrilar Segmentar Anti actinina anti--vinculina e anti-tropomiose Miastenia Gravis Doenccedila de Crohn e Colite ulcerativa Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia cliacutenica definida
Citoplasmaacutetico Pontilhado Polar Anticorpo Anti-golginas (cisternas do aparelho de Golgi) raro no LES SS e outras doenccedilas auto-imunes sistecircmicas Relato na Ataxia Cerebelar Idiopaacutetica Degeneraccedilatildeo Cerebelar Paraneoplaacutesica infecccedilotildees virais pelo Epstein Barr (EBV) e pelo viacuterus da imunodeficiecircncia Humana (HIV) Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida
Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Anticorpo anti-Histidill t RNA sintetase (Jo-1) anticorpo marcador de Polimiosite no adulto Descrito raramente na Dermatomiosite
Citoplasmaacutetico Pontilhado com Pontos Isolados
Anticorpo anti-EEA1 e anti-fosfatidilserina natildeo haacute associaccedilotildees clinicas bem definida Anticorpo anti-GWBSS tambeacutem encontrado em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas
Citoplasmaacutetico Pontilhado Reticulado Anticorpo anti-mitococircndria Cirrose Biliar Primaacuteria Esclerose Sistecircmica Eacute relativamente comum o encontro deste padratildeo na ausecircncia de anticorpos anti-mitococircndria
Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Denso Anti PL7PL12 Raramente associado a Polimiosite Anticorpo P-ribossomal Este padratildeo ocorre no LES se a associaccedilatildeo eacute com anti-proteina P ribossomal
Citoplasmaacutetico Fibrilar Filamentar Anticorpo anti-vimentina e anti-queratina Anti-queratina eacute o anticorpo mais importante em doenccedila hepaacutetica alcooacutelica Descritos em vaacuterias doenccedilas inflamatoacuterias e infecciosas Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida
Aparelho mitoacutetico Tipo Centriacuteolo Anticorpo anti-enolase em baixos tiacutetulos natildeo tem associaccedilatildeo cliacutenica definida Em altos tiacutetulos eacute sugestivo de Esclerose Sistecircmica
Aparelho mitoacutetico Tipo ponte Intercelular
Anticorpo anti Tubulina Pode ser encontrado no LES e na DMTC outros anticorpos ainda natildeo bem definidos podem gerar o mesmo padratildeo
Aparelho mitoacutetico Tipo NuMa2 Anticorpo anti-HsEg5 diversas condiccedilotildees auto-imunes com baixa especificidade
Fonte Dellavance et al 2003
37
Quadro 5 - Padrotildees de FAN mistos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Mistos Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos
Misto do tipo nucleolar homogecircneo e nuclear pontilhado grosso com placa metafaacutesica decorada em anel (cromossomos negativos)
Anticorpo anti-Ku Superposiccedilatildeo Polimiose e Esclerose Sistecircmica Podem ocorrer no LES e Esclerodermia
Misto do tipo nuclear e nucleolar pontilhado com placa metafaacutesica positiva
Anticorpo anti-topoisomerase (Scl-70) ES forma difusa Mais raramente pode ocorrer na Siacutendrome CREST e superposiccedilatildeo PolimiositeEsclerodermia
Misto do tipo Citoplasmaacutetico pontilhado fino denso e homogecircneo e nucleolar homogecircneo
Anticorpo anti rRNP LES frequumlentemente relacionado agrave Psicose Luacutepica
Misto do tipo nuclear pontilhado fino com fluorescecircncia do aparelho mitoacutetico
Anticorpo anti-NuMA1SS pode ocorrer tambeacutem em outras condiccedilotildees auto-imunes ou inflamatoacuterias crocircnicas
Fonte Dellavance et al 2003
Quadro 6 - Padrotildees de FAN nucleolares e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleolares Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos
Nucleolar Aglomerado
Anticorpo anti-Fibrilarina (U3-nRNP) Esclerose Sistecircmica (ES) especialmente com comprometimento visceral grave entre eles a hipertensatildeo pulmonar
Nucleolar Pontilhado
Anticorpo anti-NOR-90 ES tambeacutem descrito em outras doenccedilas do tecido conjuntivo poreacutem sem relevacircncia clinica definida Anticorpos anti-RNA polimerase I ES de forma difusa com tendecircncia para comprometimento visceral mais frequumlente e grave
Nucleolar Homogecircneo
Anticorpo anti-PMScl Siacutendrome de Superposiccedilatildeo de Polimiosite com Esclerose Sistecircmica Raramente encontrado em casos de Polimiosite ou Esclerose Sistecircmica sem superposiccedilatildeo cliacutenica Outros auto-anticorpos mais raros podem apresentar esse padratildeo
Fonte Dellavance et al 2003
De acordo com o 3deg Consenso (DELLAVANCE et al 2009) foram
comunicados dois novos padrotildees de fluorescecircncia por participantes Vaacuterios outros
membros testemunharam jaacute haver observado esses padrotildees O primeiro trata-se de
um padratildeo nuclear pontilhado fino aproximando-se da textura homogecircnea e com
placa metafaacutesica corada da mesma forma Sua associaccedilatildeo cliacutenica e identidade
imunoloacutegica natildeo estatildeo definidas Sua importacircncia deriva do fato de que pode ser
facilmente confundido com o padratildeo pontilhado fino denso e com o padratildeo
homogecircneo O segundo trata-se de um padratildeo citoplasmaacutetico em forma de
pequenos bastotildees (rods) e ciacuterculos (rings) que aparentemente estaacute associado agrave
38
infecccedilatildeo pelo HCV Haacute estudos em curso por alguns grupos de pesquisa com a
finalidade de estabelecer sua identidade imunoloacutegica
Como ainda natildeo estatildeo definitivamente caracterizados esses dois novos
padrotildees foram considerados preliminares e o 3deg Consenso recomendou que os
mesmos fossem completamente caracterizados e apresentados na proacutexima versatildeo
do Consenso (DELLAVANCE et al 2009)
39
2 JUSTIFICATIVA
As inflamaccedilotildees do fiacutegado provocadas pelos viacuterus hepatotroacutepicos atingem
milhotildees de pessoas e representam significativos problemas de sauacutede puacuteblica em
todo o mundo No Brasil a Regiatildeo Norte responde por um significativo percentual
dos portadores de hepatite C Dentre as manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo
pelo viacuterus C as doenccedilas autoimunes tecircm significativo impacto na evoluccedilatildeo cliacutenica
desses pacientes A presenccedila de anticorpo antinuacutecleo eacute um marcador importante de
autoimunidade e apesar de existirem trabalhos relatando a pesquisa desse fator em
portadores de viacuterus C tais estudos ainda natildeo foram realizados na nossa regiatildeo
sobretudo correlacionando-se com o genoacutetipo do viacuterus responsaacutevel pela infecccedilatildeo
considerando que o genoacutetipo eacute um marcador de resposta ao tratamento ou
considerando que pacientes portadores do genoacutetipo 1 natildeo respondem
satisfatoriamente ao tratamento instituiacutedo pelo protocolo atual
21 ASPECTOS EacuteTICOS
A pesquisa a ser realizada apresenta relevacircncia social e natildeo perde o
sentido de sua destinaccedilatildeo soacutecio-humanitaacuteria (justiccedila e equidade)
Este trabalho adequa-se aos princiacutepios cientiacuteficos que o justificam e
apresenta possibilidade concreta de responder a incertezas tais como FAN e o
genoacutetipo viral em pacientes com infecccedilatildeo pelo viacuterus da hepatite C ldquoestatildeo
relacionadosrdquo
Segue rigorosamente os procedimentos descritos na Resoluccedilatildeo 19696-
CNSMS (BRASIL 1996) assegurando a confidenciabilidade e proteccedilatildeo da
identidade do sujeito da pesquisa no momento da afericcedilatildeo dos dados e sua
posterior utilizaccedilatildeo
Por tratar-se de um estudo que faraacute somente revisatildeo de soroteca os
participantes natildeo seratildeo submetidos a riscos de origem orgacircnica eou quiacutemica
40
3 OBJETIVOS
31 OBJETIVO GERAL
Estabelecer associaccedilatildeo entre a presenccedila de teste de FAN e o genoacutetipo
viral em pacientes portadores de infecccedilatildeo pelo HCV
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
I Identificar o padratildeo de fluorescecircncia do FAN em pacientes com diagnoacutestico
laboratorial de infecccedilatildeo pelo HCV
II Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados
pelo HCV de acordo com o gecircnero e a idade
III Identificar a prevalecircncia de FAN em pacientes infectados pelo HCV e natildeo
infectados
IV Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados
pelo HCV de acordo com as alteraccedilotildees bioquiacutemicas
41
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO)
Foi realizado um estudo transversal analiacutetico no Serviccedilo do Nuacutecleo de
Medicina Tropical da Universidade Federal do Paraacute (NMTUFPA) utilizando-se
pacientes oriundos da Fundaccedilatildeo Centro de Hemoterapia e Hematologia do Paraacute
(HEMOPA) e Plano de Assistecircncia ao Servidor (PASIASEP) com coleta de material
bioloacutegico para reconfirmaccedilatildeo do diagnoacutestico de hepatite C no periacuteodo de janeiro de
2009 a maio de 2010
411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C
A populaccedilatildeo de estudo consistiu de 51 pacientes admitidos no NMTUFPA
para reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica tratamento cliacutenico e acompanhamento ambulatorial
de ambos os gecircneros e independente da idade sem exclusatildeo dos pacientes com a
presenccedila de patologias associadas agrave condiccedilatildeo maior (motivadora da pesquisa)
oriundos da Fundaccedilatildeo HEMOPA e PAS
A amostra do grupo foi selecionada a partir da relaccedilatildeo dos prontuaacuterios
catalogados no laboratoacuterio de patologia do NMTUFPA
Os dados foram coletados atraveacutes dos resultados dos exames realizados
no soro de cada paciente O protocolo de coleta teve enfoque na identificaccedilatildeo
individual do paciente bem como a avaliaccedilatildeo cliacutenica dos resultados
412 Grupo de natildeo infectados
Foi utilizado um grupo controle de 100 amostras de soro de indiviacuteduos
doadores de sangue com sorologias negativas para HIV 1 e 2 HTLV 1 e 2 Siacutefilis
Doenccedilas de Chagas Hepatite B e para Hepatite C procedentes da fundaccedilatildeo
HEMOPA
42
42 MEacuteTODO
421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico
Foram colhidos em frasco sem anticoagulante 10ml de sangue perifeacuterico
dos 51 pacientes participantes da pesquisa A amostra sanguiacutenea de cada paciente
foi centrifugada o soro foi separado e colocado em frasco esteacuteril devidamente
identificado armazenado e resfriado de 2 a 8ordmC
Foi realizada no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais a
pesquisa soroloacutegica de anticorpos IgG anti-HCV por teste imunoenzimaacutetico (ELISA)
e os pacientes que apresentaram positividade tiveram seus resultados confirmados
atraveacutes de teacutecnicas moleculares (RT-PCR) e com identificaccedilatildeo do genoacutetipo viral
(genotipagem)
Foi realizado no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa a pesquisa
de FAN dos 51 pacientes selecionados utilizando as amostras existentes na
soroteca
422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C
Foram empregados testes soroloacutegicos de ELISA (Ensaio
Imunoenzimaacutetico) de 3ordf geraccedilatildeo utilizando-se de kits comerciais (kit ETI-AB-HCVK-
4 DiaSorin Itaacutelia) para detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos anti-HCV no soro dos
pacientes
As tiras (poccedilos) necessaacuterias para as reaccedilotildees foram retiradas da geladeira
com antecedecircncia de uma hora e deixadas agrave temperatura ambiente e os reagentes
homogeneizados rapidamente no voacutertex
O primeiro poccedilo da placa ficou o branco da reaccedilatildeo na sequecircncia da
microplaca de ELISA foi dispensado 200 microL do controle negativo em triplicata (trecircs
poccedilos) 200 microL do calibrador em duplicata (dois poccedilos) e 200 microL do controle positivo
em amostra uacutenica (um poccedilo)
Adicionou-se 200 microL do Diluente de Amostra em todos os poccedilos que
continham as amostras dos pacientes a serem dosadas na placa de ELISA
tomando cuidado para natildeo contaminar os poccedilos adjacentes
43
Dispensou-se 50 microL do Diluente do Reagente em todos os poccedilos de
controles calibradores e amostras cobrimos com adesivo para evitar evaporaccedilatildeo e
contaminaccedilatildeo das amostras e incubamos a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC
Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com
300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem diluiacuteda
Pipetou-se 100 microL de Conjugado Enzimaacutetico exceto no poccedilo do branco e
incubou-se a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se
cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com 300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem
diluiacuteda
Pipetou-se 100 microL de CromoacutegenoSubstrato em todos os poccedilos
Incubamos a microplaca protegendo-a de luz intensa e direta agrave temperatura
ambiente (18-24ordmC) por 15 min
Pipetou-se 100 microL de Aacutecido Sulfuacuterico em todos os poccedilos para ldquopararrdquo a
reaccedilatildeo enzimaacutetica e mediu-se a absorbacircncia da soluccedilatildeo obtida em leitor de ELISA
com filtro de 450 nM
O teste foi validado de acordo com os valores do controle de qualidade
preconizados pelo fabricante e que devem tanger os valores para o branco da
reaccedilatildeo le 0100 controle negativo le 0050 controle positivo ge 1000 e calibrador ge
1100 Para as amostras testadas os valores reagentes e natildeo reagentes para
pesquisa de anticorpos anti-HCV satildeo interpretados da seguinte maneira natildeo
reagentes com valores le 09 reagentes com valores ge 11 e indeterminados entre
os valores 09 ndash 11
423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia molecular
Nas amostras positivas pela sorologia (ELISA) realizou-se extraccedilatildeo do
RNA viral presente no soro do paciente utilizando kit comercial (QIAmp Viral RNA
kit Quiagen Alemanha) seguindo a teacutecnica adaptada no Laboratoacuterio de Patologia
Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais
Pipetou-se 560 microL de tampatildeo AVL (lise) contendo RNA em tubo de
centriacutefuga de 15 ml identificado adicionou-se 140 microL da amostra e homogenizou-se
em voacutertex por 15s incubando a temperatura ambiente (15-25degC) por 10 min Apoacutes
incubaccedilatildeo centrifugou-se rapidamente o tubo para remover partiacuteculas dispersas
44
Adicionou-se 560 microL de etanol (96-100) na amostra e homogenizou-se
no voacutertex por 15s centrifugando-se rapidamente para remover partiacuteculas dispersas
Depois cuidadosamente transferiu-se 630 microL para as colunas devidamente
identificadas centrifugou-se a 14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo
ficando soacute com a coluna para encaixar em outro tubo
Colocou-se o resto das amostras nas colunas devidas centrifugou-se a
14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo ficando soacute com a coluna para
encaixar em outro tubo Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW1) e
centrifugou-se por 1 min mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo
Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW2) e centrifugou-se por 4 min
mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo
Identificados os tubos para RNA colocou-se as colunas Adicionou-se 60
microL de tampatildeo para eluir (AVE) em cada amostra e centrifugou-se por 1 min
descartando a coluna e ficando com o tubo Colocou-se em banho-maria por 10 min
a 65degC centrifugado rapidamente e colocado no gelo As amostras extraiacutedas foram
congeladas e armazenadas em freezer a -20ordmC
O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado de acordo com a teacutecnica de
RT-PCR qualitativa com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das
Doenccedilas Tropicais da seguinte maneira para o Mix de uma amostra Tampatildeo 12
microL primer ou iniciador k10 1microL primer ou iniciador k11 1microL aacutegua ultrapura livre de
DNAse e RNAse 5 microL Enzima Taq polymerase One-Step (Invitrogen) 1 microL O
primer k10 constitui-se da sequecircncia GGC GAC ACT CCA CCA TRR e o primer k11
da sequecircncia GGT GCA CGG TCT ACG AGA CC
O volume do mix por amostra eacute de 20 microL e o volume da amostra (produto
da extraccedilatildeo) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As amostras
foram colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo eacute realizada a 42ordmC por 45 minutos
temperatura inicial de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 2 minutos seguida de 35 ciclos com
temperatura de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 54ordmC por 30
segundos de extensatildeo a 72ordmC por 45 segundos e temperatura de extensatildeo final de
72ordmC por 7 minutos e um hold de 4ordmC
Para visualizaccedilatildeo do produto dessa 1ordf PCR (RT-PCR) eacute feito um gel de
agarose a 1 (1g de agarose para 100mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de
etidium) que migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os
resultados foram visualizados atraveacutes de luz ultravioleta (UV) Os pacientes
45
positivos que apresentarem ldquobandardquo devem continuar os procedimentos e os
negativos que natildeo apresentarem ldquobandasrdquo deveratildeo ser liberados como
indetectaacuteveis por este meacutetodo
A 2ordf PCR (RFLP) foi responsaacutevel por fazer a amplificaccedilatildeo do cDNA
produto da 1ordf PCR Para esta etapa tambeacutem com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio
de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais foram necessaacuterios para o Mix de uma
amostra Tampatildeo 10X 25 microL DNTP 4 microL MgCl2 15 microL primer ou iniciador k15 1
microL primer ou iniciador k16 1 microL aacutegua ultrapura livre de DNAse e RNAse 125 microL
Enzima Taq platinum (Invitrogen) 05 microL O primer k15 constitui-se da sequecircncia
ACC ATR RAT CAC TCC CCT GT e o primer k16 da sequecircncia CAA GCA CCC TAT
CAG GCA GT
O volume do mix por amostra foi de 23 microL e o volume da amostra
(produto da 1ordf PCR) de 2 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As
amostras satildeo colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo se realiza a temperatura inicial
de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 4 minutos seguida de 35 ciclos com temperatura de
desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 55ordmC por 45 segundos de
extensatildeo a 72ordmC por 1 minuto e temperatura de extensatildeo final de 72ordmC por 7
minutos e um hold de 4ordmC
O produto da 2ordf PCR eacute observado atraveacutes de um gel de agarose a 1 (1g
de agarose para 100 mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que
migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os resultados
foram visualizados atraveacutes de luz UV (ultravioleta) Os pacientes positivos que
apresentaram ldquobandardquo (fragmento amplificado) se continuou os procedimentos e os
negativos que natildeo apresentaram ldquobandasrdquo foram repetidos para o procedimento da
2ordf PCR
424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem)
Os pacientes positivos para a 2ordf PCR foram submetidos agrave genotipagem
do viacuterus atraveacutes do meacutetodo de RFLP utilizando um par de enzimas de restriccedilatildeo
AVA II e RSA I Essa teacutecnica tambeacutem foi adaptada no Laboratoacuterio de Patologia
Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais
46
Na determinaccedilatildeo do genoacutetipo cada amostra eacute utilizada duas vezes
sendo uma reaccedilatildeo para AVA II e uma para RSA I portanto cada amostra teve dois
tubos correspondentes
Para a preparaccedilatildeo do mix de uma amostra para a enzima de restriccedilatildeo
AVA II (Promega) foram utilizados Buffer C X 30 2 microL aacutegua ultrapura livre de
DNAse e RNAse 125 microL AVA II 05 microL Para o mix de uma amostra de RSA I
(Invitrogen) satildeo necessaacuterios React 1 10X 2 microL aacutegua ultrapura libre de DNAse e
RNAse 11 microL RSA I 2 microL
O volume do mix por amostra foi de 15 microL e o volume da amostra
(produto da 2ordf PCR) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 20 microL para
cada frasco correspondente a sua enzima de restriccedilatildeo As amostras formatildeo ldquoparesrdquo
de tubos AVA II e RSA I e satildeo colocadas em banho-maria a 37ordmC overnight para
digerir (cortar) os fragmentos
Para visualizaccedilatildeo do produto da digestatildeo (RFLP) e verificaccedilatildeo dos
genoacutetipos foi preparado um gel de agarose a 2 (2g de agarose para 100 mL de
tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que migrou em cuba de eletroforese
com 100V 500A por 60 minutos Os resultados foram visualizados atraveacutes de luz UV
(ultravioleta) Os pacientes positivos apresentam ldquobandasrdquo (fragmentos) de
tamanhos diferentes O nuacutemero de bandas e sua disposiccedilatildeo no gel formaram
padrotildees de combinaccedilotildees correspondentes a cada genoacutetipo viral
425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas HEp-2
A pesquisa de auto-anticorpo contra antiacutegenos celulares foi realizada no
Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa pela teacutecnica de imunofluorescecircncia
indireta que os identifica atraveacutes da ligaccedilatildeo destes auto-anticorpos aos antiacutegenos do
substrato sendo esta ligaccedilatildeo revelada pela adiccedilatildeo de um soro com atividade Anti-
IgG conjugado agrave fluoresceiacutena
As amostras foram testadas utilizando-se um conjunto diagnoacutestico
comercial Antinuclear Antibody HEp-2 da Hemagen Diagnostics
Na primeira fase da reaccedilatildeo os soros diluiacutedos 140 colocados em contato
com o substrato durante 20 minutos seguido de lavagem com soluccedilatildeo salina
tamponada por 10 minutos Na segunda fase aplicacou-se a substacircncia
47
fluorescente sendo o conjugado diluiacutedo 130 deixando-se por 10 minutos seguida
de nova lavagem de 10 minutos e montagem da lacircmina com glicerina tamponada
Em cada lacircmina foram utilizados controle positivo e controle negativo
A leitura das lacircminas foi realizada em microscoacutepio de imunofluorescecircncia
marca Nikon modelo Eclipse E-200
Os criteacuterios morfoloacutegicos observados durante a leitura foram
a) aspecto da matriz nuclear
b) aspecto do nucleacuteolo
c) observaccedilatildeo de todos os estaacutegios de divisatildeo nuclear
d) aspecto do fuso mitoacutetico
e) aspecto do citoplasma
43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados coletados foram estruturados em um banco de dados no qual
tambeacutem foram confeccionadas tabelas e graacuteficos para representaccedilatildeo dos dados
Posteriormente foram analisados no programa Bioestat 50 para a geraccedilatildeo de
resultados estatiacutesticos que comprovassem a associaccedilatildeo de variaacuteveis pertinentes ao
estudo considerando o intervalo de confianccedila (IC) 95 e niacutevel α 5 (p-valor le 005)
isto eacute um achado seraacute considerado estatisticamente significante se valor de ldquoprdquo for
menor ou igual a 005 e seraacute considerado sem significacircncia estatiacutestica se esse valor
de ldquoprdquo for maior que 005
Nas variaacuteveis quantitativas foram realizadas as medidas de tendecircncia
central sendo calculado a meacutedia e a mediana com seus respectivos desvios
padrotildees O teste t foi usado para comparar as idades entre as amostras
O teste do Qui-quadrado e o teste G foram aplicados nas comparaccedilotildees de
n amostras independentes cujas proporccedilotildees observadas nas diversas modalidades
estiveram dispostas em tabelas de contigecircncia l x c onde se determinou as
proporccedilotildees observadas nas diferentes categorias e se estas tinham alguma
associaccedilatildeo
48
5 RESULTADOS
O Padratildeo de FAN em 100 dos 51 pacientes infectados pelo HCV e em
2 dos natildeo infectados pelo HCV ocorreu Citoplasmaacutetico
Com relaccedilatildeo agrave distribuiccedilatildeo dos pacientes por gecircnero observou-se uma
predominacircncia do gecircnero masculino (667) A faixa etaacuteria predominante foi a de 30
a 50 anos de idade (628) seguida da faixa etaacuteria compreendida entre 51 e 60
anos (196) No que diz respeito agrave naturalidade houve uma predominacircncia de
paraenses em 922 da amostra A maioria dos pacientes incluiacutedos no estudo foi
proveniente da Fundaccedilatildeo HEMOPA (98) por se tratarem de candidatos a doaccedilatildeo
de sangue (Tabela 1)
Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV segundo as caracteriacutesticas demograacuteficas janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Caracteriacutesticas demograacuteficas n Teste estatiacutestico Gecircnero
Masculino 34 667 Qui-quadrado Feminino 17 333 p = 00251
Total 51 1000
Idade (anos) lt 30 6 118 Qui-quadrado
30 a 40 16 314 p = 00094 41 a 50 16 314 51 a 60 10 196
gt 60 3 59 Total 51 1000
Naturalidade
Paraense 47 922 Qui-quadrado Macapaense 1 20 p lt 00001 Maranhense 1 20
Pernambucano 1 20 Gauacutecho 1 20
Total 51 1000
Procedecircncia Qui-quadrado HEMOPA 50 980 p lt 00001
IASEP 1 20 Total 51 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
49
Identificou-se no estudo a predominacircncia do genoacutetipo viral do tipo 1
(882) estando o genoacutetipo 3 presente em 118 dos casos Em 255 dos
pacientes foi observado uma positividade para FAN sendo que todos apresentaram
o padratildeo citoplasmaacutetico (Tabela 2)
Tabela 2 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV conforme os resultados laboratoriais de FAN citoplasmaacutetico e genotipagem janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Exames laboratoriais n Teste estatiacutestico
Genoacutetipo viral - HCV
Tipo 1 45 882 Qui-quadrado
Tipo3 6 118 p lt 00001
Total 51 1000
FAN Qui-quadrado
Positivo (citoplasmaacutetico) 13 255 p = 00008
Negativo 38 745 Total 51 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
Observou-se uma baixa positividade para o FAN tanto no gecircnero
masculino (294) quanto no gecircnero feminino (176) Natildeo houve diferenccedila
estatiacutestica significante entre os gecircneros e a anaacutelise do FAN (p = 05652) Isto eacute
independendo do gecircnero do paciente nada se poderaacute inferir se o mesmo teraacute maior
ou menor chance de possuir um FAN positivo ou negativo (Tabela 3)
Tabela 3 ndash Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
FAN (citoplasmaacutetico)
Gecircnero Teste estatiacutestico
(Teste G) Masculino Feminino
N N
Positivo 10 294 3 176
Negativo 24 706 14 824 p = 05652
Total 34 1000 17 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
Dentre os pacientes infectados o genoacutetipo viral tipo 1 e o tipo 3
predominaram no gecircnero masculino embora natildeo havendo diferenccedila significativa
entre os grupos (p=06376)(Tabela 4)
50
Tabela 4 - Relaccedilatildeo da genotipagem de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Gecircnero
Grupos estudados Teste estatiacutestico
(Teste G) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3
n n Masculino 29 644 5 833 p=06376 Feminino 16 356 1 167
Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa
Na faixa etaacuteria de 30 a 50 anos foi observada uma maior proporccedilatildeo (667)
do genoacutetipo viral do tipo 3 enquanto que para o genoacutetipo tipo 1 foi de 628 natildeo
tendo essa diferenccedila significacircncia estatiacutestica (Tabela 5)
Tabela 5 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e faixa etaacuteria - janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)
Idade (anos) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n
lt 30 04 118 0 00
30 a 40 15 314 3 500 p = 06401
41 a 50 15 314 1 167
51 a 60 08 196 2 333
gt 60 03 59 0 00 Total 45 1000 6 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
A anaacutelise descritiva das idades dos pacientes demonstrou que a meacutedia e
a mediana foi de 43 anos para aqueles com genoacutetipo viral tipo 1 no entanto para o
genoacutetipo viral tipo 3 a meacutedia foi de 44 e a mediana de 42 anos Observou-se que a
idade miacutenima dos pacientes com genoacutetipo viral-HCV do tipo 1 e 3 foi
respectivamente de 20 e 32 anos e a maacutexima foi de 68 e 57 anos perfazendo uma
amplitude total de 48 e 25 anos respectivamente Natildeo houve significacircncia estatiacutestica
entre as idades encontradas nos genoacutetipos 1 e 3 (Tabela 6 )
De acordo com o FAN citoplasmaacutetico a idade miacutenima dos pacientes com
FAN positivo e negativo foi respectivamente de 30 e 20 anos e a maacutexima foi de 53 e
68 anos perfazendo uma amplitude total de 23 e 48 anos respectivamente As
idades meacutedia e mediana foram respectivamente 435 e 46 anos nos pacientes com
o FAN positivo e meacutedia de 43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN
51
negativo Natildeo houve diferenccedila estatisticamente significativa entre as idades
encontradas nos pacientes com FAN positivo e negativo (Tabela 6)
Tabela 6 - Estudo descritivo da idade dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e presenccedila do FAN citoplasmaacutetico janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Grupos Estudados Genoacutetipo viral - HCV Auto anticorpo
Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 FAN (+) FAN (-) IDADE
Tamanho da amostra 45 6 13 38
Idade miacutenima 20 32 30 20
Idade maacutexima 68 57 53 68
Amplitude Total 48 25 23 48
Meacutedia Aritmeacutetica 43 44 435 43
Mediana 43 42 46 42
Desvio Padratildeo 107 93 78 113
Teste t p = 08363 p = 08809 Fonte Protocolo da pesquisa
Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos em que foram analisados AST
ALT ASTALT γ-GT e fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo
semelhantes dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e 3 natildeo
atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos
(Tabela 7)
Tabela 7- Distribuiccedilatildeo dos genoacutetipos dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Paracircmetros bioquiacutemicos
Genoacutetipo viral - HCV Teste estatiacutestico
(Teste t) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3
micro plusmn DP micro plusmn DP
AST 353 plusmn 219 328 plusmn 137 p = 07907
ALT 372 plusmn 321 288 plusmn 136 p = 05355
ASTALT 12 plusmn 07 14 plusmn 11 p = 06110
γ-GT 403 plusmn 38 302 plusmn 138 p = 02194
Fosfatase alcalina 1126 plusmn 443 1087 plusmn 376 p = 08349
Fonte Protocolo da pesquisa
Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos de AST ALT ASTALT γ-GT e
fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os
52
pacientes com FAN positivo e negativo natildeo sendo observada significacircncia
estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos de FAN (Tabela 8)
Tabela 8 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Paracircmetros bioquiacutemicos Auto anticorpos
Teste estatiacutestico (Teste t) Positivo Negativo
micro plusmn DP micro plusmn DP
AST 419 plusmn 238 326 plusmn 197 p = 01704
ALT 408 plusmn 29 346 plusmn 312 p = 05347
ASTALT 13 plusmn 08 12 plusmn 07 p = 05732
γ-GT 34 plusmn 21 409 plusmn 40 p = 04369
Fosfatase alcalina 1073 plusmn 345 1138 plusmn 462 p = 06431 Fonte Protocolo da pesquisa
Na comparaccedilatildeo entre resultados positivos e negativos do FAN
citoplasmaacutetico observou-se uma maior prevalecircncia da negatividade tanto em
pacientes natildeo infectados (98) como em pacientes infectados (745) pelo HCV
sendo essa diferenccedila estatisticamente significativa (plt00001) o que representa
uma natildeo associaccedilatildeo entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV
(Tabela 9)
Tabela 9 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico segundo a presenccedila ou ausecircncia de infecccedilatildeo por HCV janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
FAN (citoplasmaacutetico)
Pacientes Teste estatiacutestico (Teste G)
Infectados Natildeo infectados
N n
Positivo 13 255 2 2
Negativo 38 745 98 98 p lt 00001
Total 51 1000 100 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
Comparando-se os resultados do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos
viras observa-se que o resultado negativo eacute superior ao positivo em ambos os
genoacutetipos virais sendo 711 para o genoacutetipo viral 1 e 100 para o genoacutetipo viral 3
No entanto esta diferenccedila observada natildeo eacute estatisticamente significativa (p=02573)
(Tabela 10)
53
Tabela 10 - Distribuiccedilatildeo do FAN de acordo com o genoacutetipo viral janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
FAN (citoplasmaacutetico)
Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)
Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n
Positivo 13 289 0 00 p=02573 Negativo 32 711 6 1000
Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa
54
6 DISCUSSAtildeO
Desde o primeiro marcador soroloacutegico para diagnoacutestico do Lupus
Eritematoso Sistecircmico (LES) a ceacutelula LE descrita por Hargraves (1948) vaacuterios
substratos antigecircnicos foram utilizados para o estudo dos auto-anticorpos os quais
terminaram amplamente substituiacutedos pelas ceacutelulas HEp-2 Estas apresentam
significativas vantagens sobre os demais pela sua sensibilidade variedade de
antiacutegenos presentes e pelas facilidades morfoloacutegicas para o seu estudo
O uso da imunofluorescecircncia indireta para a visualizaccedilatildeo dos anticorpos
antinucleares nas ceacutelulas HEp-2 permite o reconhecimento de mais de 30 diferentes
padrotildees de fluorescecircncia como nucleares nucleolares da membrana nuclear do
aparelho mitoacutetico e citoplasmaacutetico todos satildeo proporcionados por diferentes auto-
anticorpos
A partir do 1deg Consenso Brasileiro para Padronizaccedilatildeo dos Laudos de FAN
(HEp-2) os criteacuterios para o preparo interpretaccedilatildeo da fluorescecircncia e nomenclatura
dos resultados passaram a ser normatizados Alguns padrotildees de fluorescecircncia satildeo
relativamente inespeciacuteficos outros satildeo ocasionados por uma gama restrita de auto-
anticorpos e outros ainda por um uacutenico auto-anticorpo (DELLAVANCE et al
2002) Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a tornaacute-las
imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo (DE
LARANAGA et al 2000)
Apesar do padratildeo de fluorescecircncia na maioria das vezes natildeo se pode
identificar o anticorpo presente ele pode sugerir ao cliacutenico qual o proacuteximo passo a
ser dado na investigaccedilatildeo da sua especificidade Os resultados encontrados devem
estar em associaccedilatildeo com a cliacutenica os padrotildees de fluorescecircncia e os tiacutetulos
alcanccedilados com a diluiccedilatildeo preacutevia (DELLAVANCE et al 2003)
No presente estudo a analise de 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo Viacuterus da
Hepatite C esteve presente o anticorpo-antinuclear (ANA FAN) em 13 (255) dos
pacientes e todos eram padratildeo citoplasmaacutetico corroborando com outros estudos
encontrados na literatura como
Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de
pacientes infectados pelo viacuterus HIV com Hanseniacutease e co-infectados com
Hanseniacutease HIV Ela obteve respectivamente as seguintes taxas de prevalecircncias
32 333 e 478 Em todos os grupos neste estudo houve predomiacutenio do
55
padratildeo citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear soacute foi observado entre os pacientes com
hanseniacutease (91) e co-infectados (237)
Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de
pacientes infectados pelo viacuterus da Dengue e viacuterus linfotroacutepico de ceacutelulas T humanas
HTLV-12 e controle Normais e obteve respectivamente as seguintes taxas de
prevalecircncias 40 40 e 2 Em todos os grupos houve predomiacutenio do padratildeo
citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear foi observado entre os pacientes com dengue
(67) e HTLV 12 (133)
Segundo Andrade et al (2002) Dellavance et al (2005) Dellavance e
Andrade et al (2007) o predomiacutenio do padratildeo de FAN do tipo citoplasmaacutetico indica
que determinados padrotildees de fluorescecircncia satildeo mais especiacuteficos de doenccedila auto-
imune enquanto outros ocorrem em indiviacuteduos com enfermidades natildeo auto-imunes
por ser o citoplasma celular rico em proteiacutenas para as quais auto-anticorpos naturais
apresentam afinidade moderada eacute comum observar positividade para FAN em
indiviacuteduos sadios cujo significado ainda natildeo eacute entendido completamente
O padratildeo Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina que pode ser
encontrado em Hepatite auto-imune Cirrose Hepatite C Hepatocarcionoma entre
outros Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica
definida Um resultado positivo pode estar ou natildeo associado a uma patologia assim
como poderaacute ou natildeo vir a apresentar uma doenccedila auto-imune com o passar do
tempo (DELLAVANCE et al 2003) Neste estudo natildeo foi feito avaliaccedilatildeo prospectiva
dos resultados embora todos sejam FAN citoplasmaacuteticos
Os achados de FAN positivo em populaccedilotildees sadias ou sem doenccedilas auto-
imunes tambeacutem jaacute observado por Leser et al (2004) que em 394 pacientes com
FAN-HEp-2 positivo natildeo encontraram nenhum paciente com doenccedila auto-imune
Outro exemplo estaacute no padratildeo citoplasmaacutetico de pontos isolados
estudado por Laurino et al (2006) presente em indiviacuteduos sem evidecircncia de auto-
imunidade mas tambeacutem em indiviacuteduos com acometimento de doenccedilas auto-imunes
sistecircmicas e natildeo-especiacuteficas
Os dados apresentados corroboram com este estudo em que foi
observado a presenccedila do auto-anticorpo em 2 (2 ) dos 100 indiviacuteduos sadios do
grupo controle todos com padratildeo citoplasmaacutetico
56
Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a
tornaacute-las imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo
(DE LARANAGA et al 2000)
Nas Infecccedilotildees agudas espera-se que a resposta auto-imune diminua a
medida que os viacuterus satildeo eliminados Entretanto alguns trabalhos sugerem que em
indiviacuteduos geneticamente susceptiacuteveis as reaccedilotildees auto-imunes possam persistir
apesar do clareamento viral uma vez que o gatilho imunoloacutegico foi ativado e natildeo
houve desativaccedilatildeo (DE LARANAGA et al 2000 SAKKAS et al 2008)
Ramos-Casals et al (2009) no estudo Doenccedilas Sistecircmica Auto-Imunes
em Pacientes com Infecccedilatildeo pelo (72) dos pacientes eram do gecircnero feminino e
(28) do masculino(ANA FAN) em 61 dos pacientes o que se diferem deste
trabalho eacute que dos 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo (667) eram do gecircnero
masculino e (333) eram do gecircnero feminino com meacutedia de idade de 430 (plusmn107)
anos com presenccedila de anticorpo-antinuclear em 13 (255) com meacutedia e mediana
respectivamente de 435 e 46 anos nos pacientes com o FAN positivo e meacutedia de
43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN negativo
Alter (1995) em sua pesquisa natildeo observou associaccedilatildeo entre o risco de
infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas designadas por gecircnero idade e raccedila Na
referida pesquisa foram estudados 51 pacientes com idade meacutedia de 430 (+- 107)
anos 34 (667) eram do gecircnero masculino e 17 (333) do gecircnero feminino todos
em fase preacute-tratamento assintomaacuteticos natildeo permitindo avaliar os risco da
infecccedilatildeoSegundo Pordeus et al (2008) a ocorrecircncia destes auto-anticorpos
indicaria um prognoacutestico desfavoraacutevel Perperas Mcfarlane e Mcsorley (1986)
sugeriram que os auto-anticorpos poderiam estar envolvidos na progressatildeo ou no
desenvolvimento de hepatites crocircnicas possivelmente por um distuacuterbio no controle
da auto-reatividade Outros estudos questionam a participaccedilatildeo dos auto-anticorpos
no processo de transiccedilatildeo para cronicidade das hepatites agudas virais poreacutem os
resultados natildeo satildeo convincentes (SHOENFELD ROSE 2004)
Lopez Seia e Roy (1998) demonstraram a presenccedila de anticorpo anti-
actina em baixos tiacutetulos em crianccedilas com hepatite aguda por curto periacuteodo de
tempo poreacutem nenhuma associaccedilatildeo com gravidade da agressatildeo hepaacutetica foi
descrita
Neste estudo a presenccedila dos auto-anticorpos em (255) dos pacientes
com infecccedilatildeo pelo HCV natildeo puderam ser relacionada com a gravidade da doenccedila
57
pois este estudo foi realizado em pacientes receacutem diagnosticados entatildeo seria
necessaacuterio um acompanhamento destes por um periacuteodo maior de tempo com a
finalidade de concluir esta afirmativa Apesar da presenccedila transitoacuteria de auto-
anticorpos jaacute ter sido descrita em doenccedilas virais comuns a associaccedilatildeo entre a
presenccedila de auto-anticorpos e a gravidade das doenccedilas necessita de comprovaccedilatildeo
Passaleva Massai e Leoncini (1983) avaliaram 302 pacientes com
hepatites agudas virais e encontraram complexos imunes circulantes (CIC) em
516 dos pacientes com frequumlecircncia significativamente maior em hepatite aguda
Nenhuma associaccedilatildeo entre a presenccedila de imuno-complexos e o niacutevel de
aminotransferases ou bilirrubina foi encontrada Segundo Andrade et al (2002)
Dellavance et al (2005) Andrade et al (2007) nos pacientes do estudo foi feita a
relaccedilatildeo entre a presenccedila dos auto-anticorpos e niacuteveis de aminotransferases e as
elevaccedilotildees natildeo tiveram significacircncia poreacutem houve associaccedilatildeo do genotipo viral 1
Nos paracircmetros bioquiacutemicos analisados em relaccedilatildeo aos genoacutetipos houve uma
distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e
3 natildeo atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os
grupos Segundo Wilson (1997) trecircs estudos mostraram correlaccedilatildeo entre niacuteveis
altos de alanina aminotransferase e atividade histoloacutegica da doenccedila hepaacutetica
Poreacutem nos pacientes considerados individualmente o valor preditivo dessa
associaccedilatildeo foi baixo enquanto muitos deles com enzimas normais apresentavam
graves alteraccedilotildees histoloacutegicas No presente estudo natildeo foi observada associaccedilatildeo entre os niacuteveis de
aminotransferases e a cronificaccedilatildeo da hepatite viral pois nem todos os pacientes do
estudo apresentavam resultado de bioacutepsia hepaacutetica
Alter et al (1999) afirmam que no Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b
(63) e 3a (313) em estudo realizado em Goiacircnia onde foi observada uma
maior prevalecircncia do genoacutetipo 1 seguida do genoacutetipo 3 em doadores de sangue e
hemofiacutelicos (DELLAVANCE ANDRADE et al 2007) Estando esses dados em
acordo com esta pesquisa que com genotipagem do viacuterus da hepatite C que
identificou o genoacutetipo 1 em 45 (882) seguidos pelo genoacutetipo 3 que foi
identificado em 6 (118) dos pacientes com infecccedilatildeo pelo HCV Em um estudo realizado na Franccedila com 13 pacientes luacutepicas infectadas
pelo viacuterus C 8 apresentavam o RNA viral sendo o genoacutetipo 1 presente em cinco
58
(625) casos seguido do genoacutetipo 3 (375) (PERLEMUTER et al 2000) dados
que se assemelham aos do presente estudo embora o estudo natildeo tenha incluiacutedo
pacientes com outras infecccedilotildees associadas ao HCV Eacute importante ressaltar que
estudos sobre genotipagem do HCV em indiviacuteduos com doenccedilas reumaacuteticas satildeo
raros
No presente estudo houve uma frequumlecircncia baixa de positividade para o
FAN nos pacientes com genoacutetipo 1 e genoacutetipo 3 Natildeo havendo significacircncia
estatiacutestica entre os pacientes com genoacutetipo 1 e 3
Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter
implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave menor
resposta agrave terapia antiviral (BRUNO et al1997) o que natildeo foi avaliado neste estudo
pois apesar de (882) dos pacientes serem genoacutetipo 1 todos estavam em fase de
reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica seja preacute- tratamento Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila
poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses
autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis
vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo
hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja
quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a
concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave
hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em
parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)
59
7 CONCLUSOtildeES
minus O padratildeo dos auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares encontrados nos
dois grupos estudados foi o citoplasmaacutetico
minus A prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares no grupo com
infecccedilatildeo pelo VHC foi significativamente maior do que no grupo controle
minus Nos resultados de FAN citoplasmaacutetico haacute uma maior prevalecircncia da
negatividade em pacientes infectados pelo HCV e natildeo infectados sendo
essa diferenccedila estatisticamente significativa conferindo a natildeo associaccedilatildeo
entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV
minus Os resultados negativos do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos viras eacute
superior aos positivos em ambos os genoacutetipos virais entretanto esta diferenccedila
natildeo eacute estatisticamente significativa
minus Houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos
celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado
minus Natildeo houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos
celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado com
relaccedilatildeo ao gecircnero onde predominou o gecircnero masculino nos dois grupos
minus Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter
implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave
menor resposta agrave terapia antiviral o que natildeo foi avaliado neste estudo pois
os pacientes estavam em fase preacute tratamento sugerindo que estes pacientes
sejam avaliados futuramente
minus A formaccedilatildeo dos auto-anticorpos parece ser mais uma consequumlecircncia do que
uma causa da agressatildeo hepaacutetica
minus A negatividade do FAN ndash Hep 2 foi maior que a positividade mas todos os
FAN positivos pertenciam ao genoacutetipo viral tipo 1 nos pacientes infectados
pelo HCV
minus Nesta pesquisa os resultados de PCR o RNA-HCV de reconfirmaccedilatildeo foi
positivo para o anti-HCV em todos os soros analisados mostrando assim
que estes pacientes eram portadores de infecccedilatildeo por viacuterus C ou seja natildeo
houve falso positivo anteriormente poreacutem todos eram assintomaacuteticos
dificultando a conclusatildeo de ser ou natildeo uma infecccedilatildeo persistente
60
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APEcircNDICES
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APEcircNDICE A - TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Vocecirc estaacute sendo convidado para fazer parte de uma pesquisa que estaacute sendo desenvolvida pela Universidade Federal do Paraacute no Nuacutecleo de Medicina Tropical intitulada AUTOANTICORPOS CONTRA ANTIacuteGENOS CELULARES E SUA CORRELACcedilAtildeO COM O GENOacuteTIPO VIRAL EM PACIENTES COM INFECCcedilAtildeO PELO VIacuteRUS DA HEPATITE C (HCV)
O Objetivo da pesquisa eacute fazer uma correlaccedilatildeo do anticorpo antinuacutecleo (FAN) e o genoacutetipo viral em pacientes com hepatite C e o estaacutegio da doenccedila hepaacutetica a partir da histologia sempre que permitidos e correlacionar ao diagnoacutestico
Caso vocecirc participe da pesquisa seraacute necessaacuterio que forneccedila uma amostra de sangue (2ml)
O uacutenico inconveniente que vocecirc poderaacute experimentar eacute a dor provocada pela agulha na hora da coleta de sangue bem como pequenos hematomas que possam vir a ocorrer e que natildeo causam danos
Essa pesquisa natildeo oferece riscos as praacuteticas satildeo de uso rotineiro e seratildeo utilizados materiais esterilizados e descartaacuteveis como agulhas seringas etc
Estaacute garantido a vocecirc todas as informaccedilotildees que vocecirc queira antes durante e depois da pesquisa
A sua participaccedilatildeo neste estudo eacute voluntaacuteria Vocecirc tem a liberdade de recusar participar da pesquisa a qualquer momento
As informaccedilotildees relacionadas agrave pesquisa poderatildeo ser inspecionadas pelos pesquisadores que executam a pesquisa e pelas autoridades legais no entanto se qualquer informaccedilatildeo for divulgada em relatoacuterio publicaccedilatildeo ou qualquer outro meio isto seraacute feito de forma codificada para manter o caraacuteter confidencial
Todas as despesas necessaacuterias para a realizaccedilatildeo do estudo natildeo satildeo de sua responsabilidade assim como a sua participaccedilatildeo na pesquisa na seraacute remunerada (vocecirc natildeo receberaacute qualquer valor em dinheiro)
Quando os resultados forem divulgados natildeo apareceraacute seu nome e sim um coacutedigo
_____________________________________
Assinatura do Pesquisador Responsaacutevel NomeAna Maria Almeida Souza EndRodovia Maacuterio Covas 1426 ndash Cond Green Garden casa 41 Fone(91) 32352665 81197217 RegConselhoCRM 1508
69
APEcircNDICE B - CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Declaro que li as informaccedilotildees acima sobre a pesquisa que me sinto
perfeitamente esclarecido sobre o conteuacutedo da mesma assim como seus riscos e
benefiacutecios Declaro ainda que por minha livre vontade aceito participar da pesquisa
cooperando com a coleta de material para exame
Beleacutem _________
_________________________________________
Assinatura do sujeito da pesquisa ou do
responsaacutevel
70
ANEXOS
71
- Assinatura do Pesquisador Responsaacutevel
-
- Beleacutem _________
-
CONFIE AS COISAS ACONTECEM NA HORA CERTA
EXATAMENTE QUANDO DEVEM ACONTECER MOMENTOS FELIZES LOUVE A DEUS
MOMENTOS DIFIacuteCEIS BUSQUE A DEUS MOMENTOS SILENCIOSOS ADORE A DEUS
MOMENTOS DOLOROSOS CONFIE EM DEUS CADA MOMENTO AGRADECcedilA A DEUS
ENTENDER A VONTADE DE DEUS NEM SEMPRE Eacute
FAacuteCIL MAS CRER QUE ELE ESTAacute NO COMANDO E TEM
UM PLANO PARA NOSSA VIDA FAZ A CAMINHADA VALER
Agrave PENA
(DESCONHECIDO)
RESUMO
As inflamaccedilotildees do fiacutegado provocadas pelos viacuterus hepatotroacutepicos atingem milhotildees de
pessoas e representa significativo problema de sauacutede puacuteblica em todo o mundo
Existem interaccedilotildees entre viroses hepatotroacutepicas e o sistema imunoloacutegico do hospedeiro
que podem influenciar na patogenicidade da agressatildeo hepaacutetica O objetivo deste
trabalho foi investigar a frequumlecircncia de auto-anticorpos em pacientes portadores do viacuterus
da hepatite C e sua correlaccedilatildeo com os genoacutetipos encontrados Foram estudados 51
pacientes com diagnoacutestico confirmado pelo PCR de infecccedilatildeo pelo viacuterus da hepatite C e
um grupo de 100 doadores de sangue com todos os exames soroloacutegico para doenccedilas
infecto-contagiosas negativos Os 51 pacientes portadores do viacuterus C apresentavam
idade meacutedia de 43 anos +- 113 em fase preacute-tratamento 34 (667) eram do gecircnero
masculino e 17 (333) do gecircnero feminino Desses 13 (255) apresentaram FAN
positivo 45 (882) eram genoacutetipo tipo 1 e 118 genoacutetipo tipo 3 Os pacientes que se
apresentaram com anticorpos detectaacuteveis natildeo apresentavam niacuteveis de AST ALT
ASTALT γ-GT e fosfatase alcalina significativamente diferente daqueles com auto-
anticorpos negativos Desta forma conclui-se que os anticorpos presentes na amostra
do estudo satildeo independentes da evoluccedilatildeo da doenccedila e do prognoacutestico do paciente
entretanto parece estar ligada ao genoacutetipo tipo 1
Palavras-chave Hepatite C Auto-anticorpos Genoacutetipo
ABSTRACT
Inflammation of the liver caused by hepatotropic viruses affect millions of people and
represents a significant public health problem worldwide There are interactions between
hepatotropic viruses and the host immune system that can influence the pathogenesis of
liver injury The objective of this study was to investigate the frequency of autoantibodies
in patients with hepatitis C virus and its correlation with the genotypes found We
studied 51 patients diagnosed by PCR of infection with hepatitis C and a group of 100
blood donors with all serological tests for infectious diseases negative The 51 patients
with virus C had an average age of 43 years + - 113 in the pre-treatment 34 (667)
were male and 17 (333) were female Of these 13 (255) were ANA positive 45
(882) were with genotype 1 and 118 with genotype 3 Patients who presented with
antibodies had no detectable levels of AST ALT AST ALT γ-GT and alkaline
phosphatase significantly different from those with negative antibody titers Thus we
conclude that the antibodies present in the study sample are independent of disease
progression and patient prognosis though seems to be linked with genotype 1
Keywords Hepatitis C Auto-antibodies genotype
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Padrotildees de fluorescecircncia encontrados em maior frequumlecircncia e
patologias relacionadas 34
Quadro 2 - Anti-ena - auto-anticorpos contra antiacutegenos extraiacutedos do nuacutecleo e
relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 34
Quadro 3 ndash Padrotildees de FAN nuclear e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 35
Quadro 4 - Padrotildees de FAN citoplasmaacuteticos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 36
Quadro 5 - Padrotildees de FAN mistos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 37
Quadro 6 - Padrotildees de FAN nucleolares e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 37
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos pacientes segundo as caracteriacutesticas demograacuteficas janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 48
Tabela 2 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes conforme os resultados laboratoriais de FAN citoplasmaacutetico e genotipagem janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 49
Tabela 3 ndash Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 49
Tabela 4 - Relaccedilatildeo da genotipagem de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 50
Tabela 5 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e faixa etaacuteria - janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 50
Tabela 6 - Estudo descritivo da idade dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e presenccedila do FAN citoplasmaacutetico janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 51
Tabela 7- Distribuiccedilatildeo dos genoacutetipos dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 51
Tabela 8 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 52
Tabela 9 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico segundo a presenccedila ou ausecircncia de infecccedilatildeo por HCV janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 52
Tabela 10 - Distribuiccedilatildeo do FAN de acordo com o genoacutetipo viral janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 53
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
AAN Anticorpos antinucleares
aCL Anticorpos anticardiolipina
AIDS Sindrome da Imunodeficiecircncia Adquirida
ALT Alanina aminotransferase
ANCA Anticorpos anti-citoplasma de neutroacutefilos
Anti-CCP Antipeptiacutedeo citrulinado ciacuteclico
Anti-β2GPI Anticorpos anti-β2 glicoproteiacutena I
Cdna DNA complementar
CEP Comitecirc em Eacutetica e Pesquisa
CHC Carcinoma hepatocelular
CIC Complexos imunes circulantes
DDTC Doenccedilas difusas do tecido conjuntivo
DMTC Doenccedila mista do tecido conjuntivo
E1 Proteiacutena do envoltoacuterio
ENH Eritema Nodoso Hansecircnico
ESP Esclerose sistecircmica progressive
FAN Fator Anti-nuacutecleo
FR Fator reumatoacuteide
HBV Viacuterus da hepatite B
HCV Viacuterus da Hepatite C
HEMOPA Fundaccedilatildeo Centro de Hemoterapia e Hematologia do Paraacute
HIV Viacuterus da imunodeficiecircncia humana
HIV-1 Viacuterus da imunodeficiecircncia humana1
IAH Iacutendice de atividade histoloacutegica
LE Lupus Eritematoso
LES Luacutepus eritematoso sistecircmico
MS Ministeacuterio da Sauacutede
mtDNA DNA mitrocondrial
NANBH Hepatite natildeo-A natildeo-B
NMT Nuacutecleo de Medicina Tropical
OMS Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede
PCR Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia
Rh Tipo sanguiacuteneo
RNA Aacutecido ribonucleacuteico
RT-PCR Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia-em tempo real
SAF Siacutendrome antifosfoliacutepide
SIDA Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida
SS Siacutendrome de Sjoumlgren
UFPA Universidade Federal do Paraacute
UV ultravioleta
VHA Viacuterus da Hepatite A
VHC Viacuterus da Hepatite C
VHCHCV Hepatite C
VV Hanseniacutease generalizada
SUMAacuteRIO 1 INTRODUCcedilAtildeO 15 11 HEPATITE C (VHCHCV) 15 111 Consideraccedilotildees Gerais 15 112 Agente Etioloacutegico 16 113 Epidemiologia 17 114 Modo de Transmissatildeo 18 115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica 19 116 Diagnoacutestico 23 12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC 25
13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC 26
14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE 27
15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES AGUDAS VIRAIS 31
16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN 32 2 JUSTIFICATIVA 39 21 ASPECTOS EacuteTICOS 39 3 OBJETIVOS 40
31 OBJETIVO GERAL 40
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 40 4 MATERIAL E MEacuteTODOS 41 41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO) 41 411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C 41 412 Grupo de natildeo infectados 41 42 MEacuteTODO 42 421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico 42 422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C 42 423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia
molecular 43
424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem) 45 425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas
HEp-2 46 43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 47 5 RESULTADOS 48 6 DISCUSSAtildeO 54 7 CONCLUSOtildeES 59 REFEREcircNCIAS 60 APEcircNDICES 67 ANEXOS 70
15
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 HEPATITE C (VHCHCV)
111 Consideraccedilotildees Gerais
As hepatites virais satildeo doenccedilas causadas por diferentes agentes
etioloacutegicos de distribuiccedilotildees universais que tecircm em comum o hepatotropismo
Possuem semelhanccedilas do ponto de vista cliacutenico-laboratorial mas apresentam
importantes diferenccedilas epidemioloacutegicas quanto agrave sua evoluccedilatildeo (FERREIRA
SILVEIRA 2004) Desde a descriccedilatildeo e definiccedilatildeo em 1989 (CHOO et al 1989 apud
RIBEIRO et al 2007) tornou-se evidente sua associaccedilatildeo com uma grande
variedade de manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas desordens reumaacuteticas e auto-imunes
(ALMEIDA 2010)
A infecccedilatildeo pelo VHCHCV acarreta inflamaccedilatildeo hepaacutetica e esteatose
podendo evoluir para fibrose hepaacutetica e cirrose em indiviacuteduos cronicamente
infectados estes com grande risco de desenvolvimento de carcinoma hepatocelular
(RIBEIRO et al 2007) Essas complicaccedilotildees tardias ocorrem em um periacuteodo em
geral superior a 20 anos apoacutes o iniacutecio da infecccedilatildeo A avaliaccedilatildeo filogeneacutetica das
sequumlecircncias do VHCHCV investigadas em vaacuterias regiotildees geograacuteficas sugere que
existam pelo menos seis genoacutetipos principais designados pelos nuacutemeros de 1 a 6 e
pelo menos 30 subtipos designados por letras minuacutesculas Nos Estados Unidos
prevalecem os genoacutetipos 1a (60) e 1b (20) Os tipos 5 e 6 satildeo mais encontrados
no sudeste e sul da Aacutefrica O tipo 4 eacute predominante na Aacutefrica Central e no Oriente
Meacutedio No Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b (63) e 3a (313) (BASSIT et
al 1999 apud RIBEIRO et al 2007) As informaccedilotildees sobre as causas que
determinam o curso evolutivo da doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos
progressos que haacute no campo do diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHCHCV Uma
questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo genoacutetipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de
lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o genoacutetipo 1 (1b) cursa com lesotildees
histoloacutegicas mais graves
As uacuteltimas deacutecadas foram de notaacuteveis conquistas no que se refere agrave
prevenccedilatildeo e ao controle das hepatites virais Entre as doenccedilas endecircmico-
epidecircmicas que representam problemas importantes de sauacutede puacuteblica no Brasil
16
salientam-se as Hepatites Virais cujo comportamento epidemioloacutegico no nosso paiacutes
e no mundo tem sofrido grandes mudanccedilas nos uacuteltimos anos
Antes da seleccedilatildeo rigorosa dos doadores de sangue em 1991 o
VHCHCV era a maior causa de hepatite poacutes-transfusional Atualmente permanece
como tal em casos esporaacutedicos (CONTE 2000) Os grupos considerados de risco
satildeo pessoas que receberam transfusatildeo de sangue antes de 1992 usuaacuterios de
drogas injetaacuteveis profissionais de sauacutede que lidam com sangue pacientes de
hemodiaacutelise e com menor risco pessoas tatuadas ou com piercings (CLEMENTE
ONO-NITA 2007)
A melhoria das condiccedilotildees de higiene e de saneamento das populaccedilotildees a
vacinaccedilatildeo contra a Hepatite B (HBV) e as novas teacutecnicas moleculares de diagnoacutestico
do viacuterus da Hepatite estatildeo entre esses avanccedilos importantes (BRASIL 2008)
112 Agente Etioloacutegico
O VHCHCV um viacuterus aacutecido ribonucleacuteico (RNA) da famiacutelia Flaviviridae
representa a principal causa da previamente denominada hepatite natildeo-A natildeo-B
(SANTOS 2009) Foi identificado e isolado a partir de um clone derivado de um
genoma NANBH semelhante aos togaviridae ou flaviviridae (SAADE 2008) e
visualizado a imunoeletromicroscopia como partiacutecula de 55 a 65 nm de diacircmetro
com projeccedilotildees espiculares e de morfologia muito semelhante aos flaviviridae Aleacutem
disso estas partiacuteculas reagiram especificamente com anticorpos mono e policlonais
do conteuacutedo proteacuteico do envelope do VHC (HIRANUMA et al 1994 apud CONTE
2000)
O agente etioloacutegico do HCV natildeo eacute uma partiacutecula homogecircnea e apresenta
uma taxa alta de mutaccedilatildeo levando-o a uma heterogeneicidade genocircmica cujo
resultado eacute um grande nuacutemero de genoacutetipos (1a 1b 2a 2b 3a 3b 4 5 6)
(AUGUSTO LOBATO 2003) Natildeo haacute evidecircncias de variantes natildeo patogecircnicas O
genoacutetipo 1b eacute o que apresenta maior virulecircncia e pior resposta ao tratamento
(LAUER WALKER 2001 apud SOUZA 2007) No Brasil dados obtidos a partir de
casos isolados e estudos de pequenas amostragens indicam que o genoacutetipo 1b
ocorre em cerca de 30 a 40 dos casos o 1a em cerca de 20 1a e 1b em 20
o 3a em cerca de 28 (FOCACCIA 2004)
17
113 Epidemiologia
De acordo com a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) a HCV eacute uma
questatildeo de sauacutede puacuteblica e tambeacutem a principal causa de transplante de fiacutegado no
Brasil (SOCIEDADE BRASILEIRA DE HEPATOLOGIA 2005) Eacute estimada uma
prevalecircncia em torno de 10 para a infecccedilatildeo pelo VHC na populaccedilatildeo mundial
(KILLEMBERG 2000) Nos Estados Unidos cerca de 27 milhotildees de pessoas estatildeo
infectadas pelo viacuterus (BRASIL 2006)
De acordo com Ferreira e Silveira (2004) no Brasil o nuacutemero de pacientes
infectados eacute incerto relacionado geralmente a alguns estados e municiacutepios e o
esclarecimento dos agentes causadores das hepatites cuja identificaccedilatildeo requer
teacutecnicas laboratoriais complexas de biologia molecular eacute realizado de maneira
insuficiente Por outro lado a progressiva integraccedilatildeo entre as instacircncias gestoras
dos programas de vigilacircncia e controle das doenccedilas com grupos de pesquisa e
desses com os serviccedilos (FERREIRA SILVEIRA 2004 p 473) e a disponibilidade
dos bancos de dados nacionais mais confiaacuteveis apontam para novos e melhores
caminhos (BRASIL 2005b)
A OMS alerta que o Paiacutes deve se preparar para uma ldquoexplosatildeordquo da
epidemia a partir de 2011 (BRASIL 2005b) Outra preocupaccedilatildeo eacute que as pessoas
que receberam sangue antes de 1992 tecircm mais chances de estarem infectadas na
eacutepoca o sangue destinado agraves transfusotildees natildeo era analisado para detecccedilatildeo da HCV
porque o viacuterus natildeo era conhecido e natildeo havia exames especiacuteficos (BRASIL 2005b)
A prevalecircncia da infecccedilatildeo nos doadores de sangue sadios varia de 001-002 no
Reino Unido e no norte da Europa 1-15 no sul da Europa 65 na Aacutefrica
equatorial e de ateacute 20 no Egito (CONTE 2000)
De acordo com a OMS a cada grupo de 50 pessoas no Brasil uma tem
hepatite e de dez portadores apenas um sabe (STRAUSS 2001) Satildeo dois milhotildees
de infectados no Paiacutes Denominada epidemia silenciosa calcula-se que 170 milhotildees
de indiviacuteduos no mundo estejam contaminados pelo viacuterus C a forma mais grave da
doenccedila Ainda de acordo com a OMS o nuacutemero de brasileiros viacutetimas da
enfermidade eacute bem maior do que o estimado pelo Ministeacuterio da Sauacutede (TRINDADE
2005)
18
Por ocasiatildeo da Conferecircncia Internacional de Consenso sobre HCV em Paris
(LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999) concluiu-se que a hepatite crocircnica por viacuterus
C eacute um problema grave de sauacutede puacuteblica sendo sua prevalecircncia mundial estimada
em 3 (de 01 a 5 segundo os vaacuterios paiacuteses) por tanto havendo no mundo
todo cerca de 150 milhotildees de portadores crocircnicos do VHCHCV 4 milhotildees nos EUA
e 5 milhotildees na Europa Ocidental Na Europa Oriental a prevalecircncia eacute maior ainda
114 Modo de Transmissatildeo
A HCV eacute transmitida pelo sangue Natildeo haacute comprovaccedilatildeo de contaacutegio por
meio de fluidos corporais como saliva suor laacutegrimas secircmen ou leite materno
Tambeacutem deixa de ocorrer por meio de abraccedilos beijos uso dos mesmos copos ou
roupas Especialistas afirmam que a contaminaccedilatildeo atraveacutes de relaccedilotildees sexuais eacute
possiacutevel mas rara Quando detectada de maneira precoce a enfermidade tem
tratamento inclusive gratuito aleacutem de cura (BRASIL 2006)
Dentre os fatores de risco para transmissatildeo outros aleacutem da transfusatildeo de
sangue o uso de drogas iliacutecitas o comportamento sexual de alto risco e variaacuteveis
socioeconocircmicas representadas pelo grau de escolaridade e renda familiar Natildeo foi
observada associaccedilatildeo entre o risco de infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas
designadas por gecircnero idade e raccedila (ALTER 2007) O risco de transmissatildeo sexual
do VHCHCV eacute miacutenimo A contaminaccedilatildeo intrafamilial natildeo-sexual eacute consideraacutevel
particularmente quando um dos enfermos tem hepatopatia grave e ou carga viral
elevada (risco 110) (CONTE 2000)
A praacutetica de tatuagem fornece dados conflitantes sabendo-se que os
liacutequidos usados para esterilizar os instrumentos usados satildeo ineficazes
Karmochkine et al (1998 apud CONTE 2000) observaram que
aproximadamente 80 dos pacientes contraem o viacuterus atraveacutes da toxicomania
intravenosa ou transfusotildees de sangue ou de derivados Os restantes meios de
transmissatildeo e de contaacutegio satildeo a hemodiaacutelise os transplantes de oacutergatildeos picadas
acidentais profissionais e transmissatildeo vertical matildee-crianccedila Em 20 a 40 dos
casos natildeo se consegue determinar o modo de contaminaccedilatildeo A transmissatildeo da
hepatite crocircnica por viacuterus C pode ser prevenida (KARMOCHKINE et al 1998 apud
CONTE 2000)
19
As duas fontes de contaminaccedilatildeo satildeo a toxicomania endovenosa e a
administraccedilatildeo de produtos de origem sanguumliacutenea Esta uacuteltima praticamente
eliminada desde 1991 com a introduccedilatildeo dos testes ELISA 2 na seleccedilatildeo
aprimorada de doadores de sangue (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998
apud CONTE 2000)
A transmissatildeo sexual eacute rara com menos de 3 em parceiros estaacuteveis e
ocorre principalmente em pessoas com muacuteltiplos parceiros e com praacutetica sexual de
risco (sem uso de preservativo) ndash para os indiviacuteduos com parceiros muacuteltiplos o uso
de preservativos eacute indicado (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998 apud
CONTE 2000)
A gravidez natildeo estaacute contra-indicada nas mulheres infectadas pelo
VHCHCV A transmissatildeo vertical matildee-crianccedila eacute rara (menor de 6) O tipo de parto
(natural ou cesaacuterea) natildeo tem influecircncia O aleitamento eacute permitido A transmissatildeo
nosocomial eacute prevenida eficazmente de modo convencional (KARMOCHKINE et
al 1998 apud CONTE 2000)
115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica
A infecccedilatildeo aguda pode passar clinicamente despercebida ou evoluir para
hepatite fulminante Aproximadamente 850 das pessoas infectadas agudamente
vatildeo desenvolver uma viremia persistente tornando-se dessa forma indiviacuteduos
infectados crocircnicos Depressatildeo irritabilidade dores no corpo mal-estar febre
naacuteuseas e falta de apetite satildeo alguns dos sintomas mais frequumlentes embora a
maioria dos casos natildeo apresente nenhum sintoma (ALTER 2007)
A cirrose eacute pouco observada em pessoas que apresentam niacuteveis
persistentemente baixos das transaminases mas a elevaccedilatildeo destas natildeo eacute
representativa do grau de fibrose hepaacutetica Dessa forma a bioacutepsia hepaacutetica
representa o melhor indicador do estaacutegio de evoluccedilatildeo da doenccedila uma vez que
gradua os componentes inflamatoacuterios e o estaacutegio de fibrose (AGMON-LEVIN et al
2009 BLOCK SCHIANO 1999)
Alter et al (1992) dizem que em 82 de 130 pacientes seguidos durante
muitos anos apoacutes surto agudo de hepatite natildeo-A natildeo-B apresentam anti-VHCHCV
ou VHCHCV RNA sendo que 62 deles desenvolveram hepatite crocircnica e
concluem que os pacientes que adquiriram HCV tiveram alto grau de hepatite
20
crocircnica sendo que o VHCHCV pode ser a maior causa de doenccedila crocircnica de fiacutegado
nos EUA e que na maioria dos pacientes a infecccedilatildeo pelo VHCHCV parece persistir
por muitos anos mesmo na ausecircncia de doenccedila hepaacutetica ativa
Almeida et al (1999) determinaram a prevalecircncia da infecccedilatildeo em
doadores de sangue assim como avaliaram o grau de comprometimento hepaacutetico
numa populaccedilatildeo de 37335 doadores durante o biecircnio 93-94 em Porto Alegre - RS
utilizando o teste anti-VHC ELISA 2 Selecionaram 60 deles para a biopsia hepaacutetica
com agulha de Menghini encontrando prevalecircncia de 174 com comprometimento
hepatico e 39 deles apresentavam cirrose hepaacutetica Sendo a hepatopatia crocircnica de
graus variaacuteveis observadas em 80 deles na sua grande maioria com lesotildees leves
e miacutenimas Foi observada forte associaccedilatildeo entre elevaccedilatildeo de alanina
aminotransferase (ALT) e a presenccedila de hepatopatia crocircnica embora a intensidade
desta elevaccedilatildeo natildeo se correlacione com a gravidade da lesatildeo histoloacutegica
Jaacute na experiecircncia de Mutimer et al (1995) cerca de 80 dos doadores
soro-positivos analisados exaustivamente inclusive com biopsia de fiacutegado
mostraram evidecircncias de alteraccedilotildees histoloacutegicas e ou viroloacutegicas de infecccedilatildeo
persistente sem no entanto atingir graus mais avanccedilados de hepatopatia crocircnica
quase todos permanecendo na categoria moderada
Nos paiacuteses industrializados a HCV eacute responsaacutevel por 20 dos casos de
hepatite aguda 70 dos casos de hepatite crocircnica 40 dos casos de cirrose
descompensada 60 dos carcinomas hepatocelulares e 30 dos transplantes
hepaacuteticos (LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999)
Cerca de 40 do total de pacientes curam-se ou tecircm doenccedila crocircnica de
natureza benigna Os restantes 60 cursam com atividade aumentada de
aminotransferase denotando evoluccedilatildeo crocircnica da doenccedila Dentre estes a maioria
tem lesotildees necro inflamatoacuterias discretas e fibrose miacutenima ou ausente O prognoacutestico
em longo prazo eacute mal conhecido no entanto provavelmente a maioria deles natildeo viraacute
a falecer da doenccedila hepaacutetica em curso Cerca de 20 deles depois de 10-20 anos
de evoluccedilatildeo desenvolveratildeo cirrose hepaacutetica passiacutevel de transplante Assim a
hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila que ocasiona a morte de um pequeno nuacutemero
de pacientes sem no entanto afetar a duraccedilatildeo da vida meacutedia da maioria deles
(CONTE 2000 FERREIRA SILVEIRA 2004)
Apoacutes infecccedilatildeo aguda somente 10 dos pacientes desenvolve doenccedila
cliacutenica com icteriacutecia A infecccedilatildeo sub-cliacutenica eacute a regra e assim passa despercebida
21
Cerca de 25 deles tecircm infecccedilatildeo crocircnica sintomaacutetica com aminotransferases
normais e lesotildees inflamatoacuterias histoloacutegicas miacutenimas (RESENDE et al 2010)
A remissatildeo espontacircnea acontece em cerca de 15 dos casos Na grande
minoria dos casos a progressatildeo da doenccedila aguda pode levar agrave insuficiecircncia
hepaacutetica aguda
Observaccedilotildees feitas pelo irlandecircs Kenny-Walsh (1999) comprovam a
natureza e a evoluccedilatildeo cliacutenica da afecccedilatildeo em causa O autor acompanhou durante 17
anos 376 mulheres que receberam injeccedilotildees de imunoglobulinas anti-D
contaminadas com VHC provenientes de doador uacutenico num programa de
isoimunizaccedilatildeo Rh Destas 81 apresentaram sintomatologia mais frequumlentemente
fadiga (66) ALT ligeiramente elevada (de 40 a 99 UL) em 47 e igual ou maior de
100 UL em 8 A biopsia hepaacutetica mostrou inflamaccedilatildeo em 98 delas na maioria
das vezes leves (41) e moderadas (52) fibrose presente em 51 no entanto
somente em sete pacientes (2) houve sinais de cirrose provaacutevel ou definitiva Em
uma delas havia acentuado alcoolismo
A hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila de evoluccedilatildeo variaacutevel De maneira
geral sua evoluccedilatildeo eacute lenta insidiosa e progressiva
Os pacientes que natildeo apresentam evidecircncias bioquiacutemicas de lesatildeo
hepaacutetica podem constituir em subgrupo de casos mais benignos no curso natural
da doenccedila Muitos co-fatores tecircm papel importante no desenvolvimento da cirrose
nesses pacientes como por exemplo a idade no momento da infecccedilatildeo (os
contaminados de idade mais avanccedilada tecircm evoluccedilatildeo mais raacutepida da doenccedila
enquanto que os mais jovens a tecircm mais lenta) o alcoolismo (eacute de consenso geral
que o abuso de aacutelcool favorece o aparecimento da cirrose) e a co-infecccedilatildeo com o
Viacuterus da Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida (SIDA) e da HVB
A incidecircncia anual de carcinoma hepatocelular (CHC) eacute de 1 a 4 nos
pacientes cirroacuteticos o que justifica plenamente o controle ecograacutefico do fiacutegado e a
dosagem seacuterica de alfa-fetoproteiacutena nesses pacientes a cada 1-2 anos Por outro
lado nos pacientes com hepatite crocircnica por viacuterus C sem cirrose o CHC eacute muito
raro (LOPES 2010)
Nos casos de cura a atividade das transaminases cessa e os viacuterus natildeo
satildeo detectados (VHC RNA) no soro Nos casos de cronificaccedilatildeo acontece o
contraacuterio ou seja as alteraccedilotildees bioquiacutemicas existem com flutuaccedilotildees e os viacuterus satildeo
detectaacuteveis na grande maioria dos casos Fazem exceccedilatildeo agravequeles pacientes com
22
viremia baixa que por isso mesmo fogem aos limites dos meacutetodos de detecccedilatildeo viral
ou devido agraves flutuaccedilotildees proacuteprias desses niacuteveis virecircmicos (HAYDON et al 1998)
Nos pacientes anti-VHC positivos com enzimas circulantes normais a
falta de VHC RNA no soro tem sido interpretada como sinal de cura completa No
entanto Haydon et al (1998) alteraram essa interpretaccedilatildeo Estes autores
demonstraram a presenccedila de VHC RNA no fiacutegado desses pacientes que eram
negativos no soro independente das alteraccedilotildees bioquiacutemicas positivas ou negativas
do soro ou seja mesmo naqueles casos anteriormente considerados como curados
Assim os niacuteveis de viacuterus intra-hepaacuteticos natildeo satildeo determinados pelos fatores
hospedeiro (idade modo e duraccedilatildeo da infecccedilatildeo) ou virais (VHC genoacutetipos) pois
mesmo as repetidamente Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia-em tempo real (RT-
PCR) negativos para VHC RNA no soro podem ter viacuterus da HCV albergados no
fiacutegado Entretanto existem limitaccedilotildees metodoloacutegicas que devem ser consideradas
nessa interpretaccedilatildeo como por exemplo as limitaccedilotildees do RIBA 3 e do RT-PCR
Mais importante eacute o seguimento dos pacientes ao longo do tempo Assim
Seef et al (1992) em 568 pacientes de hepatite poacutes-transfusional e dois grupos
controles pareados que receberam transfusotildees sem desenvolver hepatite apoacutes 18
anos de seguimento encontraram 33 de mortalidade no grupo 1 e 15 no grupo
controle sendo que a maioria das mortes ocorreu nos pacientes com alcoolismo
associado Evidenciando que a maioria dos que desenvolve doenccedila crocircnica o faz
muito lentamente
Existem ainda no curso natural da doenccedila flutuaccedilotildees intensas e muito
frequumlentes que dependem dos viacuterus e dos hospedeiros a saber niacuteveis da viremia
genoacutetipos 1b graus de diversidade geneacutetica dos viacuterus vias de transmissatildeo (os
inoculados via transfusatildeo apresentam lesotildees hepatocelulares mais ativas)
(GORDON et al 1993 GORDON BAYATI SILVERMAN 1998) deficiecircncias
imunes alcoolismo e co-infecccedilatildeo com HBV e delta ou o Viacuterus da imunodeficiecircncia
humana (HIV) (LOPES 2010) Nestes uacuteltimos casos a co-infecccedilatildeo com muacuteltiplos
viacuterus das hepatites estaacute associada com mais graves lesotildees histoloacutegicas do fiacutegado do
que nos casos de VHC isoladas
Importa saber se os resultados obtidos com os controles feitos se mantecircm
por longos periacuteodos Ou seja como exemplos a atividade da ALT persistentemente
normal a variabilidade do RT-PCR a detecccedilatildeo de VHC RNA pela teacutecnica Reaccedilatildeo
de polimerase em cadeia (PCR) que pode ser negativa devido agrave inadequada
23
armazenagem das amostras agrave contaminaccedilatildeo do soro com substacircncias que
interferem na leitura entre outras causas de erro
As informaccedilotildees sobre as causas que determinam o curso evolutivo da
doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos progressos havidos no campo do
diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHC Uma questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo
genotipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o
genotipo 1 (1b) cursa com lesotildees histoloacutegicas mais graves independentemente da
carga viral Ainda mais os VHC RNA negativos no soro mesmo apoacutes anos de
cura podem recair pois neles persistem os viacuterus no fiacutegado em regime de
replicaccedilatildeo muito baixa indetectaacutevel pelos meacutetodos atuais Ao contraacuterio os negativos
no soro e no fiacutegado tecircm demonstrado respostas boas e sustentadas inclusive no
sentido de se fazer prognoacutestico de cura real e verdadeira infelizmente na grande
minoria dos casos
116 Diagnoacutestico
Quanto mais cedo o diagnoacutestico maiores as chances de detectar a
doenccedila Por isso eacute importante que as pessoas faccedilam o exame especiacutefico porque soacute
esse exame eacute que detecta a HCV E as mulheres tecircm que ter uma atenccedilatildeo em
especial Tempos atraacutes o Correio Braziliense (2003) publicou uma grande mateacuteria
sobre a quantidade de mulheres que vecircm sendo infectadas com a HCV Cuja causa
estava na esterelizaccedilatildeo mal feita dos equipamentos das manicures Uma soluccedilatildeo
praacutetica eacute as mulheres terem seu proacuteprio material pra fazer as unhas e natildeo deixar
mais ningueacutem utilizar (nem matildee nem irmatilde etc) Bem e quem tiver passado por
transfusatildeo dentistas manicures operaccedilotildees etc deve fazer o exame
(KARMOCHKINE et al 1998 apud CONTE 2000 KEER et al 1997)
A HCV natildeo eacute como a Siacutendrome da Imunodeficiecircncia Adquirida (AIDS)
que possui drogas com grande tecnologia e o doente pode viver por muitos e muitos
anos Com a HCV o paciente soacute tem chance de ficar bem se a doenccedila for
diagnosticada e tratada antes dela se manifestar Atualmente o tratamento usa uma
associaccedilatildeo de duas drogas ndash o Interferon e a Ribavirina ldquoAs chances de cura em
meacutedia satildeo de 50rdquo
Barbaro et al (1999) verificaram que os pacientes VHC genoacutetipos 1b
frequumlentemente apresentavam alteraccedilotildees ultraestruturais das mitococircndrias com
24
depleccedilatildeo do mtDNA podendo comprometer o processo de fosforilizaccedilatildeo oxidativa
Sendo assim a produccedilatildeo aumentada de radicais livres nos pacientes VHC genoacutetipos
1b poderia atuar de modo negativo na evoluccedilatildeo da doenccedila hepaacutetica aumentando o
efeito citopaacuteticos do VHC Nesses pacientes haveria portanto aumento de
hiperoxidaccedilatildeo com consequumlente resistecircncia agrave accedilatildeo dos interferons e pior evoluccedilatildeo
da doenccedila hepaacutetica A ser confirmado este fato novas estrateacutegias terapecircuticas
poderatildeo vir a ser desenvolvidas no combate a essa doenccedila
Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila
poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses
autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis
vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo
hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja
quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a
concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave
hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em
parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)
Dos fatos acima expostos decorrem implicaccedilotildees tais como as respostas
CD8-CTL aos antiacutegenos VHC restritas aos complexos de histocompatibilidade
principais (MHC I) com inibiccedilatildeo ou mesmo insuficiente produccedilatildeo de complexo
peptiacutedeo VHC-MHC inibiccedilatildeo direta das ceacutelulas CTLK e a falta de resposta as
citoquininas entre outras dos vaacuterios mecanismos de escape existentes Dentro
desse contexto o niacutevel de morte celular natildeo seria alcanccedilado e a lesatildeo hepatocelular
consequumlente seria portanto miacutenima
Outra implicaccedilatildeo resultante consiste na induccedilatildeo de resposta imune
celular T Helper mediadas a partir de peptide vacinas contra o VHC Estas novas
vacinas tecircm a capacidade de gerar linfoacutecitos T citotoacutexico os CTLs contra o VHC em
camundongo imunizados com peptiacutedeos CTL e ceacutelulas HT epiacutetomes do core VHC
Esses estudos recente em animais de laboratoacuterio vecircm progredindo rapidamente
esperando-se em breve novos recursos no tratamento dessa doenccedila (AGNELLO et
al 1998)
25
12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC
O VHC constitui-se em uma famiacutelia heterogecircnea de viacuterus com no miacutenimo
seis genoacutetipos e inuacutemeros subtipos (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT
SANTOS SILVA 1999) Embora o meacutetodo de maior acuraacutecia para a determinaccedilatildeo
do genoacutetipo do VHC seja a identificaccedilatildeo completa da sequumlecircncia dos 9500
nucleotiacutedeos e a construccedilatildeo de uma aacutervore filogeneacutetica esse meacutetodo soacute pode ser
utilizado em laboratoacuterios de pesquisa (BARBOSA SILVA MARTINS 2005) e natildeo
em laboratoacuterios cliacutenicos Assim foram desenvolvidos meacutetodos para genotipagem
utilizando apenas as regiotildees mais conservadas do genoma como a proteiacutena do
envoltoacuterio (E1) a proteiacutena core e a proteiacutena natildeo estrutural NS5B A sequumlecircncia dos
nucleotiacutedeos dentro dessas regiotildees relativamente conservadas eacute genoacutetipo-
especiacutefico e os isolados podem ser genotipados independentemente da regiatildeo que
for utilizada para anaacutelise (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS
SILVA 1999) Para uso em laboratoacuterios cliacutenicos foram desenvolvidas basicamente
duas metodologias que se valem de teacutecnicas de biologia molecular (genotipagem)
ou citoloacutegicas (serotipagem)
Os meacutetodos que adotam teacutecnica de biologia molecular para genotipagem
utilizando porccedilotildees do genoma incluem a PCR aninhada (nested PCR) (BASSIT
SANTOS SILVA 1999) a teacutecnica de restriction fragment length polymorphism
(RFLP) (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS SILVA 1999) a
hibridizaccedilatildeo reversa (BASSIT SANTOS SILVA 1999) (INNO-LiPA Innogenetics
Beacutelgica Gen Eti DEIA HCV Sorin Biomedica Itaacutelia) e o sequumlenciamento direto da
regiatildeo natildeo-codificante 5 (TruGene Visible Genetics Canadaacute) Suas principais
vantagens satildeo a informaccedilatildeo direta sobre sequumlecircncia dos nucleotiacutedeos do genoma
viral a alta sensibilidade por se basearem na PCR e a possibilidade de identificar o
subtipo viral (BARBOSA SILVA MARTINS 2005)
Os meacutetodos para determinaccedilatildeo do genoacutetipo que utilizam serotipagem
baseiam-se na detecccedilatildeo de anticorpos genoacutetipos-especiacuteficos contra epiacutetopos do
VHC (por exemplo proteiacutenas da regiatildeo do core) (BLOCK SCHIANO 1999) Os
testes comercializados utilizam diferentes teacutecnicas ELISA competitivos ou
immunoblot (Murex-HC1-6 Murex Diagnostics Ltd Reino Unido RIBA HCV
Serotyping Assay Chiron Diagnostics Estados Unidos) As principais vantagens da
teacutecnica de serotipagem satildeo o baixo custo e maior facilidade de realizaccedilatildeo em
26
comparaccedilatildeo com os testes de biologia molecular (BLOCK SCHIANO 1999 De
LARANAGA et al 2000)
A determinaccedilatildeo do genoacutetipo anteriormente utilizada em pesquisas mas
sem maior utilidade na praacutetica meacutedica atualmente eacute recomendada para uso cliacutenico
Como jaacute mencionado os pacientes infectados pelo genoacutetipo 1 do VHC devem ser
tratados por 12 meses enquanto os demais por 6 meses (BASSIT SANTOS SILVA
1999)
A determinaccedilatildeo do genoacutetipo do VHC pode ser feita por PCR ou
serotipagem A primeira teacutecnica eacute mais sensiacutevel e possibilita a identificaccedilatildeo de
subtipos do VHC Contudo a segunda eacute de mais faacutecil realizaccedilatildeo e mais barata
razatildeo pela que eacute importante que a teacutecnica seja aprimorada
Oliveira et al (1999) investigaram os padrotildees de distribuiccedilatildeo dos
genoacutetipos do VHC estudando 250 pacientes anti-VHC positivos atraveacutes da
detecccedilatildeo VHC RNA pelo RT-PCR e encontraram prevalecircncia de 72 para o VHC 1
253 para o tipo 3 2 para o 2 e 07 para o 4 semelhantes aos das vaacuterias
regiotildees mundiais
13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC
As manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo pelo VHC satildeo as mais
variadas possiacuteveis A diversidade de resposta do hospedeiro ao agente infeccioso
variando desde quadros assintomaacuteticos ateacute aqueles com evoluccedilatildeo grave fatal ou
incapacitante tem estimulado a busca por justificativas de tais discrepacircncias
cliacutenicas sobretudo na imunomodulaccedilatildeo Dentre as infecccedilotildees mais bem estudadas
destacam-se aquelas pelos Viacuterus da hepatite C Viacuterus da imunodeficiecircncia humana1
(HIV-1) pelo Herpes viacuterus humano 4 (viacuterus do Epstein Baar) e pelo Mycobacterium
leprae (ABBAS LICHTMAN 2005)
A agressatildeo hepaacutetica por auto-imunidade eacute um fenocircmeno reconhecido em
vaacuterias doenccedilas do fiacutegado inclusive nas de etiologia viral Aleacutem do agente agressor e
de sua interaccedilatildeo com o sistema imunoloacutegico do hospedeiro fatores ambientais ou
hormonais estatildeo aparentemente envolvidos no surgimento de auto-imunidade
hepaacutetica como se supotildee acontecer na hepatite auto-imune em indiviacuteduos
geneticamente suscetiacuteveis (CODES et al 2002)
27
A lesatildeo hepatocelular relacionada agrave infecccedilatildeo pelos viacuterus hepatotroacutepicos e
pelos herpes viacuterus (citomegaloviacuterus e Epstein-Barr) eacute secundaacuteria a uma resposta
auto-imune do hospedeiro Estes viacuterus natildeo parecem ser diretamente citopaacuteticos
mas desencadeiam lesatildeo hepaacutetica atraveacutes da resposta imune do hospedeiro contra
ceacutelulas hepaacuteticas infectadas (MALOY POWRIE 2001)
Existem estudos que focalizam alteraccedilotildees imunoloacutegicas em hepatites
virais entretanto a maioria deles mostra resultados pontuais sem seguimento na
fase aguda da doenccedila (BLOCK SCHIANO 1999 McFARLONE et al 1990) Aleacutem
disso ainda natildeo se estabeleceu uma associaccedilatildeo entre as reaccedilotildees auto-imunes
transitoacuterias induzidas por viroses hepatotroacutepicas e agravamento do dano tecidual na
hepatite viral
A infecccedilatildeo crocircnica estaacute fortemente associada agrave crioglobulinemia mista
essencial glomerulonefrite membrano-proliferativa e porfiria cutacircnea tardia De
forma menos impressiva encontra-se tambeacutem associada agrave uacutelcera corneana de
Mooren liacutequen plano e fibrose pulmonar (KILLENBERG 2000 WENER et al 1996)
A ocorrecircncia de anticorpos antitireoidianos e hipotireoidismo tem sido relatada em
associaccedilatildeo com a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC em mulheres (KILLENBERG 2000
CACOUB et al 1999)
A associaccedilatildeo entre a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC a presenccedila do fator
reumatoacuteide e do anticorpo antinuclear (FAN) o fenocircmeno de Raynaud e doenccedilas
difusas do tecido conjuntivo (DDTC) como artrite reumatoacuteide luacutepus eritematoso
sistecircmico siacutendrome de Sjoumlgren e vasculites sistecircmicas eacute relatada em alguns
trabalhos (CACOUB et al 1999 LOVY STARKEBAUM UBEROI 1996 STAUB
1998 WENER et al 1996)
14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE
A associaccedilatildeo entre doenccedilas infecciosas e autoimunidade apresentando-
se com manifestaccedilotildees cliacutenicas ou detectadas apenas pelo desenvolvimento de auto-
anticorpos tem sido amplamente documentado Infecccedilotildees virais bacterianas e
parasitaacuterias podem estar envolvidas no desenvolvimento recidivas e ateacute mesmo na
prevenccedilatildeo de doenccedilas auto-imunes (KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)
Ribeiro e Proietti (2004) avaliaram a frequumlecircncia de FR anticorpos
antipeptiacutedeo citrulinado ciacuteclico (anti-CCP) AAN anticorpos anti-citoplasma de
28
neutroacutefilos (ANCA) anticorpos anticardiolipina (aCL) e anticorpos anti-β2
glicoproteiacutena I (anti-β2GPI) em pacientes com hanseniacutease Existe estudo
demonstrando pacientes que apresentavam manifestaccedilotildees articulares comparados
aos que natildeo apresentavam envolvimento articular e um grupo controle de indiviacuteduos
saudaacuteveis com idade e gecircnero semelhantes aos dos pacientes estudados e que
residiam na mesma aacuterea geograacutefica A maioria dos pacientes nos dois grupos (com
e sem envolvimento articular) apresentava hanseniacutease generalizada Entretanto
observaram uma baixa frequumlecircncia que natildeo foi significativamente diferente de FR
anti-CCP AAN e ANCA em pacientes com hanseniacutease (nos dois grupos) e normal
dos controles Mas a prevalecircncia de anticorpos aCL e anti-β2GPI estava
significativamente elevada nos pacientes com hanseniacutease quando comparados com
o grupo controle apesar de natildeo haver associaccedilatildeo significativa com o envolvimento
articular O isoacutetopo predominante dos dois autoanticorpos foi a IgM (487) dos
pacientes com hanseniacutease apresentava pelo menos um anticorpo antifosfoliacutepide
Aleacutem disso os autores observaram uma associaccedilatildeo entre a positividade para aCL e
as manifestaccedilotildees cliacutenicas jaacute que os pacientes com anticorpos aCL apresentavam
doenccedila Hanseniacutease generalizada (VV) com mais frequumlecircncia (p= 0002) Natildeo houve
associaccedilatildeo entre a presenccedila de anticorpos aCL ou anti-β2GPI e episoacutedios
reacionais poreacutem entre os pacientes com esses episoacutedios aqueles com anticorpos
aCL apresentavam eritema nodoso hansecircnico (ENH) em 100 dos casos enquanto
entre os pacientes negativos para aCL 57 apresentavam ENH Apesar de uma
alta taxa de concordacircncia para a presenccedila de anticorpos aCL e anti-β2GPI ter sido
observada manifestaccedilotildees tromboemboacutelicas natildeo foram observadas (RIBEIRO
PROIETTI 2004 2005)
Horimoto e Costa (2009) avaliaram pacientes com Leishmania
(leishmaniose visceral e leishmaniose cutacircnea) para a presenccedila de anticorpos anti-
Leishmania assim como FR AAN anti-DNA anti-Sm anti-RNP anti-Ro anti-La
aCL e complemento (C3 e C4) Como esperado os pacientes com leishmaniose
visceral apresentava anticorpos anti-Leishmania Tiacutetulos significativamente elevados
de AANs na maioria dos pacientes o anti-DNA foi detectado em poucos pacientes
com doenccedila visceral assim como tiacutetulos elevados de anticorpos aCL (isotipo IgG)
quando comparados com os pacientes com leishmaniose cutacircnea Niacuteveis reduzidos
de complemento tambeacutem satildeo evidentes na doenccedila visceral assim como niacuteveis
significativamente reduzidos de C3 Outros estudos comparam e discutem os
29
resultados em relaccedilatildeo agrave crescente evidecircncia na literatura da presenccedila de
autoanticorpos em ambas as doenccedilas Em geral a prevalecircncia variaacutevel de auto-
anticorpos relatada assim como relatos preacutevios na literatura podem estar
relacionados a diferenccedilas metodoloacutegicas como o tipo de ensaio utilizado a
definiccedilatildeo dos pontos de corte inativaccedilatildeo dos soros pelo calor seleccedilatildeo de pacientes
e variaccedilotildees eacutetnicas e geograacuteficas nos grupos de pacientes Mas um dos resultados
consistentes foi a frequumlecircncia significativamente mais elevada de anticorpos
antifosfoliacutepide aCL e anti-β2GPI em pacientes com hanseniacutease enquanto
anticorpos AAN e aCL foram detectados com mais frequumlecircncia nos pacientes com
leishmaniose visceral A incidecircncia aumentada de anticorpos AAN e aCL nos
pacientes com leishmaniose visceral eacute compatiacutevel com outros estudos (OSSADRON
et al 2006 SAKKAS et al 2008 VOULGARI et al 2004) e demonstra
semelhanccedilas das manifestaccedilotildees cliacutenicas e laboratoriais entre a leishmaniose
visceral e o luacutepus eritematoso sistecircmico (LES) Aleacutem disso a reatividade cruzada
entre AAN e anticorpos anti-Leishmania jaacute foi tambeacutem relatada (GRANEL et al
2000)
Diversos grupos documentaram niacuteveis elevados de anticorpos
antifosfoliacutepide (aCL anti-β2GPI e anti-protrombina) em diversas doenccedilas
infecciosas como a siacutefilis doenccedilas virais (incluindo a hepatite C Parvoviacuterus B19 e
HIV) malaacuteria e hanseniacutease sem as manifestaccedilotildees cliacutenicas da siacutendrome
antifosfoliacutepide (SAF) (ZANDMAN-GODDARD BLANK SHOENFELD 2002) Os
tiacutetulos elevados geralmente satildeo transitoacuterios diminuindo e desaparecendo apoacutes a
resoluccedilatildeo da infecccedilatildeo (LOIZOU et al 2003 ZANDMAN-GODDARD BLANK
SHOENFELD 2002) Mas em uma minoria dos pacientes a associaccedilatildeo entre
doenccedilas infecciosas e anticorpos antifosfoliacutepide pode levar a complicaccedilotildees severas
frequumlentemente fatais ou seja SAF catastroacutefica (ZANDMAN-GODDARD BLANK
SHOENFELD 2002)
Os resultados de Ribeiro e Proietti (2005) mostrando um aumento da
incidecircncia de anticorpos anti-β2-GPI em pacientes com hanseniacutease associados aos
dados de outros grupos (De LARANAGA et al 2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK
et al 1994 LOIZOU et al 2003) que tambeacutem documentaram niacuteveis elevados de
anticorpos anti-2βGPI lanccedilam duacutevidas sobre a noccedilatildeo de que os anticorpos aCL
associados a infecccedilotildees satildeo independentes dos anticorpos anti-β2GPI e natildeo
dependentes desses anticorpos como nas doenccedilas auto-imunes Em conjunto
30
esses resultados apoacuteiam a noccedilatildeo de que na presenccedila de infecccedilotildees anticorpos aCL
satildeo heterogecircneos em relaccedilatildeo agrave sua dependecircncia da 2GPI (De LARANAGA et al
2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK et al 1994 LOIZOU et al 2003) e as infecccedilotildees
podem desencadear a induccedilatildeo de anticorpos antifosfoliacutepide patogecircnicos em
indiviacuteduos predispostos (LOIZOU et al 2003)
A produccedilatildeo de autoanticorpos na hanseniacutease e leishmaniose pode ser
explicada por diversos mecanismos Na forma mais generalizada dessas doenccedilas
(hanseniacutease VV e leishmaniose visceral) os pacientes apresentam
hipergamaglobulinemia difusa semelhante agrave vista em outras infecccedilotildees como
Schistosoma mansoni T cruzi e Plasmodium A induccedilatildeo de autoanticorpos pode ser
atribuiacuteda agrave ativaccedilatildeo policlonal e proliferaccedilatildeo das ceacutelulas B algumas com auto-
reatividade pertencentes agrave biblioteca de anticorpos naturais em indiviacuteduos normais
(ARGOV et al 1989) Na leishmaniose antiacutegenos soluacuteveis derivados da L major e
L donovani satildeo mitogecircnicos e desencadeiam a produccedilatildeo de imunoglobulinas com
auto-reatividade (ARGOV et al 1989) Crioglobulinemia mista induzida pelo HCV eacute
outro exemplo de ativaccedilatildeo policlonal persistente levando a uma mistura de
autoanticorpos policlonais e monoclonais os quais causam doenccedilas auto-imunes
(AGMON-LEVIN et al 2009)
Mimetismo molecular ou homologias estruturais entre infecccedilotildees e
componentes do hospedeiro podem ser agrave base da produccedilatildeo de autoanticorpos
como no caso da febre reumaacutetica onde o componente M da membrana do
estreptococo apresenta homologia com peptiacutedeos cardiacuteacos cerebrais e sinoviais A
associaccedilatildeo da siacutendrome de Guillain-Barreacute com a infecccedilatildeo pelo Campylobacter
jejeuni representa outro exemplo de mimetismo molecular como base de uma
manifestaccedilatildeo auto-imune A reatividade cruzada entre agentes infecciosos e auto-
antiacutegenos jaacute foi demonstrada para o M leprae (McADAM MUDD SHOENFELD
1984) e M tuberculosis (SHOENFELD et al 1986) e a inibiccedilatildeo de anticorpos anti-
Sm anti-RNP e anti-SSB por promastigotas intactas de Leishmania apoacuteia a
homologia entre antiacutegenos nucleares e a Leishmania (ARGOV et al 1989)
A disseminaccedilatildeo de epiacutetopos a emergecircncia de novos anticorpos ou a
resposta de ceacutelulas T a um novo epiacutetopo (subdominante ou criacuteptico) no mesmo
antiacutegeno ou em outro antiacutegeno foi demonstrada em modelos experimentais e na
doenccedila humana alguns autores demonstraram a disseminaccedilatildeo molecular do
antiacutegeno Sm para reatividade anti-RNP (STAUB 1998) no LES enquanto na febre
31
reumaacutetica o estado de autoimunidade crocircnica que afeta as vaacutelvulas cardiacuteacas pode
resultar em uma resposta imunoloacutegica contra o colaacutegeno e laminina (KIVITY et al
2009 PORDEUS et al 2008) As infecccedilotildees tambeacutem podem desempenhar um papel
importante na induccedilatildeo da autoimunidade atraveacutes da liberaccedilatildeo de antiacutegenos
sequumlestrados apoacutes lesatildeo tecidual ou aumentando a exibiccedilatildeo de epiacutetopos criacutepticos
no meio inflamatoacuterio apresentando assim novos antiacutegenos ao sistema imunoloacutegico
(KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)
15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES
AGUDAS VIRAIS
O conceito de auto-imunidade induzida por viacuterus natildeo eacute exclusivo para
doenccedilas hepaacuteticas O viacuterus Coxsackie do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um
terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite infecciosa e estaacute implicado nas miocardites
auto-imunes reagindo contra a miosina cardiacuteaca (GIST BELL 1974) Niwa et al
(1984) encontraram elevaccedilatildeo transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator
reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas
virais comuns como varicela sarampo influenza caxumba herpes zoster e
exantema suacutebito
A patogecircnia da infecccedilatildeo viral inclui pelo menos trecircs tipos de interaccedilotildees
com o hospedeiro vertebrado 1) o efeito do agente sobre as ceacutelulas 2) a maneira
de disseminaccedilatildeo do agente no organismo infectado 3) a resposta imunoloacutegica e a
sua influencia no processo infeccioso Destacam-se dois tipos principais da
interaccedilatildeo a destruiccedilatildeo celular e a resposta imunoloacutegica (FIGUEIREDO 1999
CATALAN-SOARES PROIETTI CARNEIRO-PROIETTI 2006) O viacuterus Coxsackie
do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite
infecciosa e estaacute implicado nas miocardites auto-imunes reagindo contra a miosina
cardiacuteaca (GERSHON KONDO 1971) Niwa et al (1984) encontraram elevaccedilatildeo
transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo
anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas virais comuns como varicela sarampo
influenza caxumba herpes zoster e exantema suacutebito
32
16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN
De acordo com o II Consenso Brasileiro de FAN em HEp 2
(DELLAVANCE et al 2003) os AAN satildeo encontrados comumente em uma
variedade de doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Satildeo uacuteteis na investigaccedilatildeo dessas
doenccedilas auxiliando no diagnoacutestico de patologias como LES esclerose sistecircmica
progressiva (ESP) doenccedila mista do tecido conjuntivo (DMTC) siacutendrome de Sjoumlgren
(SS) polimiosite e dermatomiosite
Eles podem estar presentes em um pequeno percentual da populaccedilatildeo
aparentemente sadia essa frequumlecircncia eacute maior em mulheres e aumenta com a idade
Segundo a literatura a positividade entre 20 a 60 anos varia entre percentuais mais
altos (133) para tiacutetulos baixos e mais baixos (33) para tiacutetulos mais elevados
(DELLAVANCE et al 2003)
A pesquisa dos anticorpos antinucleares pode ser realizada por diferentes
teacutecnicas a imunofluorescecircncia indireta eacute a mais utilizada por sua sensibilidade
reprodutibilidade e facilidade de execuccedilatildeo A sensibilidade aumenta
significativamente quando se utiliza como substrato lacircminas com ceacutelulas Hep 2
(ceacutelulas de carcinoma de laringe humana) por causa da maior expressatildeo de
antiacutegenos na superfiacutecie dessas ceacutelulas comparados aos expressos nas ceacutelulas de
fiacutegado ou de rins de camundongos que se utilizavam anteriormente
Em geral eacute possiacutevel detectar melhor a presenccedila de AAN por associaccedilatildeo
de trecircs anti-soros isotipos especiacuteficos (anti-IgG anti-IgA e anti-IgM) A pesquisa
realizada por essa teacutecnica serve de triagem inicial para a presenccedila de AAN Eacute
normalmente denominada pesquisa de FAN ou AAN
A realizaccedilatildeo de outras metodologias tais como as imunoenzimaacuteticas
permite uma avaliaccedilatildeo isolada dos diferentes auto-anticorpos sugeridos pelos
padrotildees de fluorescecircncia encontrados no FAN A identificaccedilatildeo desses AAN permite
um diagnoacutestico mais preciso e eles podem ser utilizados em muitos casos como
marcador para uma das diferentes doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Muitas dessas
patologias apresentam um perfil distinto de auto-anticorpos que auxilia o diagnoacutestico
A presenccedila de FAN positivo em pessoas aparentemente sadias pode ser
devida a algumas situaccedilotildees
minus Doenccedila auto-imune precoce ainda natildeo expressa clinicamente
33
minus distuacuterbio imunoloacutegico transitoacuterio causado por doenccedila natildeo-imune
tais como infecccedilotildees principalmente virais
minus uso de medicamentos e neoplasias
minus manifestaccedilatildeo incompleta de uma siacutendrome ou seja o paciente
sintetiza o anticorpo poreacutem esse quadro natildeo evolui para doenccedila
minus fenocircmeno auto-imune fisioloacutegico
O resultado do FAN eacute expresso em tiacutetulo e padratildeo uma vez que ambos
os paracircmetros tecircm importacircncia para a avaliaccedilatildeo do significado cliacutenico do exame O
tiacutetulo do FAN corresponde agrave maior diluiccedilatildeo capaz de demonstrar fluorescecircncia
inequiacutevoca e didaticamente pode ser dividido em
minus Baixo menor 180
minus Moderado 1160
minus Moderadamente elevado 1320
minus Alto maior 1640
Nas pesquisas realizadas por imunofluorescecircncia indireta os resultados
satildeo expressos em tiacutetulos segundo as diluiccedilotildees empregadas Eacute possiacutevel trabalhar
utilizando-se como limite tiacutetulos de 140 que permitem maior sensibilidade ou de
180 que permitem maior especificidade ou seja um menor nuacutemero de falso-
positivos
Na praacutetica cliacutenica satildeo considerados significativos tiacutetulos superiores a
1160 Os resultados com tiacutetulos positivos satildeo acompanhados pela descriccedilatildeo do
padratildeo de fluorescecircncia encontrado que serve como orientaccedilatildeo da presenccedila de um
antiacutegeno especiacutefico e em alguns casos como padratildeo diagnoacutestico Em determinadas
situaccedilotildees em especial no LES em atividade pode ocorrer agrave observaccedilatildeo de mais de
um padratildeo de fluorescecircncia
O padratildeo do FAN a seu turno aponta uma probabilidade maior ou menor
de doenccedila auto-imune e ateacute mesmo sugere o antiacutegeno nuclear envolvido e por
consequumlecircncia a afecccedilatildeo com ele mais relacionada Os padrotildees homogecircneo
centromeacuterico e pontilhado grosso satildeo os mais indicativos de processos de
autoimunidade uma vez que se associam a diversas condiccedilotildees reumaacuteticas
especialmente ao LES e agrave esclerose sistecircmica e tambeacutem a enfermidades hepaacuteticas
tais como a cirrose biliar primaacuteria e a hepatite auto-imune (KILLENBERG 2000)
34
Jaacute o pontilhado fino o pontilhado grosso reticulado e a membrana nuclear
tecircm maior significado quando encontrados em tiacutetulos altos uma vez que podem
estar presentes em tiacutetulos baixos em indiviacuteduos hiacutegidos Por sua vez o pontilhado
fino denso mesmo quando elevado em pessoas assintomaacuteticas soacute guarda relaccedilatildeo
com alguma doenccedila em cerca de 20 dos casos (DELLAVANCE et al 2003)
O padratildeo pontilhado pode tambeacutem ser referido como padratildeo salpicado
Outros padrotildees de fluorescecircncia podem ser encontrados em menor frequumlecircncia Os
pontilhados citoplasmaacutetico grossos ou reticulares associados agrave presenccedila de
anticorpos antimitococircndrias em pacientes com cirrose biliar primaacuteria o
citoplasmaacutetico homogecircneo relacionado a proteiacutenas ribossocircmicas em pacientes com
LES e o padratildeo pontilhado fino citoplasmaacutetico que pode estar associado agrave
presenccedila de anticorpos anti-JO-1 anti-PCNA e proteiacutenas da membrana celular em
pacientes com LES outras patologias do tecido conjuntivo e hepatopatias auto-
imunes (DELLAVANCE et al 2003)
Quadro 1 - Padrotildees de fluorescecircncia encontrados em maior frequumlecircncia e patologias relacionadas
Padrotildees de Fluorececircncia Antiacutegenos Patologias Relacionadas
Perifeacuterico DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES
Homogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA
LES AR lupus induzido por drogas
Perifeacutericohomogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES
Pontilhado grosso SM RNP LES DMTC
Pontilhado fino nuclear SS-A (RO) SS-B (La) SS LES
Nucleolar Proteiacutenas Nucleolares ESP Centromeacuterico Proteiacutenas de centrocircmeros Siacutendrome de CREST
Fonte Dellavance et al 2003 Quadro 2 - Anti-ena - auto-anticorpos contra antiacutegenos extraiacutedos do nuacutecleo e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleares Patologias Relacionadas SM LES RNP DMTC LES ESP AR e Polimiosite
SS-A (Ro) SS LES lupus neonatal e forma cutacircnea subaguda
SS-B (La) SS LES luacutepus neonatal e forma cutacircnea subaguda
Scl 70 ESP Jo -1 Polimiosite e dermatomiosite Fonte Dellavance et al 2003
35
Quadro 3 ndash Padrotildees de FAN nuclear e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes
Padrotildees Nucleares Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos
Nuclear Pontilhado Centromeacuterico Anticorpo anti-centrocircmero Esclerose Sistecircmica forma CREST Cirrose Biliar Primaacuteria
Nuclear homogecircneo Anticorpo anti-DNA nativo Lupus Eritematoso Sistecircmico (LES) Anticorpo anti-Histoma LES induzido por drogas LES idiopaacutetico Anticorpo anti-cromatina (DNAHistona Nucleossomo) Artrite Reumatoacuteide (AR) Artrite Idiopaacutetica Juvenil importante associaccedilatildeo com uveiacutete na forma oligoarticular Siacutendrome de Felty Cirrose Billar Primaacuteria
Nuclear tipo membrana nuclear contiacutenua Anticorpo anti-Iamin e contra envelope nuclear - Iamins Hepatites auto-imunes Raramente associado a doenccedilas reumaacuteticas (algumas formas de LES e esclerodermia linear)
Nuclear pontilhado pleomoacuterficoPCNA Anticorpo contra nuacutecleo de ceacutelulas em proliferaccedilatildeo LES
Nuclear pontilhado fino denso Anticorpo anti-proteina p 75 kDa pode ser encontrado em indiviacuteduos saudaacuteveis processos inflamatoacuterios inespeciacuteficos doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Cistite Intersticial Dermatite Atoacutepica Psoriacutease e Asma
Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos
Anticorpo anti-p80 coilina natildeo apresenta associaccedilatildeo cliacutenica definida
Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos
Anticorpo anti-Sp100 (anti-p95) Cirrose Biliar Primaacuteria pode ocorrer em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas
Nuclear pontilhado grosso Anticorpo anti-Sm LES Anticorpo anti-RNP criteacuterio obrigatoacuterio no diagnostico da doenccedila mista do Tecido conjuntivo (DMTC) tambeacutem ocorre no LES Esclerose Sistecircmica (ES) e AR
Nuclear pontilhado fino Anticorpo anti SSARo Siacutendrome de Sjogren Primaacuteria (SS) LES Lupus neonatal e Lupus Cutacircneo Subagudo Anticorpo anti-SSBLa Lupus neonatal LES SS Anticorpo anti-Mi-2 Dermatomiosite embora raramente ocorra na polimiosite do adulto
Fonte Dellavance et al 2003
36
Quadro 4 - Padrotildees de FAN citoplasmaacuteticos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes
Padrotildees Citoplasmaacuteticos e Relacionados ao Aparelho Mitoacutetico Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos
Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina Hepatite auto-imune Cirrose Anticorpo anti-miosine Hepatite C Hepatocarcionoma Miastenia Gravis Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida
Citoplasmaacutetico Fibrilar Segmentar Anti actinina anti--vinculina e anti-tropomiose Miastenia Gravis Doenccedila de Crohn e Colite ulcerativa Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia cliacutenica definida
Citoplasmaacutetico Pontilhado Polar Anticorpo Anti-golginas (cisternas do aparelho de Golgi) raro no LES SS e outras doenccedilas auto-imunes sistecircmicas Relato na Ataxia Cerebelar Idiopaacutetica Degeneraccedilatildeo Cerebelar Paraneoplaacutesica infecccedilotildees virais pelo Epstein Barr (EBV) e pelo viacuterus da imunodeficiecircncia Humana (HIV) Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida
Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Anticorpo anti-Histidill t RNA sintetase (Jo-1) anticorpo marcador de Polimiosite no adulto Descrito raramente na Dermatomiosite
Citoplasmaacutetico Pontilhado com Pontos Isolados
Anticorpo anti-EEA1 e anti-fosfatidilserina natildeo haacute associaccedilotildees clinicas bem definida Anticorpo anti-GWBSS tambeacutem encontrado em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas
Citoplasmaacutetico Pontilhado Reticulado Anticorpo anti-mitococircndria Cirrose Biliar Primaacuteria Esclerose Sistecircmica Eacute relativamente comum o encontro deste padratildeo na ausecircncia de anticorpos anti-mitococircndria
Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Denso Anti PL7PL12 Raramente associado a Polimiosite Anticorpo P-ribossomal Este padratildeo ocorre no LES se a associaccedilatildeo eacute com anti-proteina P ribossomal
Citoplasmaacutetico Fibrilar Filamentar Anticorpo anti-vimentina e anti-queratina Anti-queratina eacute o anticorpo mais importante em doenccedila hepaacutetica alcooacutelica Descritos em vaacuterias doenccedilas inflamatoacuterias e infecciosas Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida
Aparelho mitoacutetico Tipo Centriacuteolo Anticorpo anti-enolase em baixos tiacutetulos natildeo tem associaccedilatildeo cliacutenica definida Em altos tiacutetulos eacute sugestivo de Esclerose Sistecircmica
Aparelho mitoacutetico Tipo ponte Intercelular
Anticorpo anti Tubulina Pode ser encontrado no LES e na DMTC outros anticorpos ainda natildeo bem definidos podem gerar o mesmo padratildeo
Aparelho mitoacutetico Tipo NuMa2 Anticorpo anti-HsEg5 diversas condiccedilotildees auto-imunes com baixa especificidade
Fonte Dellavance et al 2003
37
Quadro 5 - Padrotildees de FAN mistos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Mistos Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos
Misto do tipo nucleolar homogecircneo e nuclear pontilhado grosso com placa metafaacutesica decorada em anel (cromossomos negativos)
Anticorpo anti-Ku Superposiccedilatildeo Polimiose e Esclerose Sistecircmica Podem ocorrer no LES e Esclerodermia
Misto do tipo nuclear e nucleolar pontilhado com placa metafaacutesica positiva
Anticorpo anti-topoisomerase (Scl-70) ES forma difusa Mais raramente pode ocorrer na Siacutendrome CREST e superposiccedilatildeo PolimiositeEsclerodermia
Misto do tipo Citoplasmaacutetico pontilhado fino denso e homogecircneo e nucleolar homogecircneo
Anticorpo anti rRNP LES frequumlentemente relacionado agrave Psicose Luacutepica
Misto do tipo nuclear pontilhado fino com fluorescecircncia do aparelho mitoacutetico
Anticorpo anti-NuMA1SS pode ocorrer tambeacutem em outras condiccedilotildees auto-imunes ou inflamatoacuterias crocircnicas
Fonte Dellavance et al 2003
Quadro 6 - Padrotildees de FAN nucleolares e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleolares Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos
Nucleolar Aglomerado
Anticorpo anti-Fibrilarina (U3-nRNP) Esclerose Sistecircmica (ES) especialmente com comprometimento visceral grave entre eles a hipertensatildeo pulmonar
Nucleolar Pontilhado
Anticorpo anti-NOR-90 ES tambeacutem descrito em outras doenccedilas do tecido conjuntivo poreacutem sem relevacircncia clinica definida Anticorpos anti-RNA polimerase I ES de forma difusa com tendecircncia para comprometimento visceral mais frequumlente e grave
Nucleolar Homogecircneo
Anticorpo anti-PMScl Siacutendrome de Superposiccedilatildeo de Polimiosite com Esclerose Sistecircmica Raramente encontrado em casos de Polimiosite ou Esclerose Sistecircmica sem superposiccedilatildeo cliacutenica Outros auto-anticorpos mais raros podem apresentar esse padratildeo
Fonte Dellavance et al 2003
De acordo com o 3deg Consenso (DELLAVANCE et al 2009) foram
comunicados dois novos padrotildees de fluorescecircncia por participantes Vaacuterios outros
membros testemunharam jaacute haver observado esses padrotildees O primeiro trata-se de
um padratildeo nuclear pontilhado fino aproximando-se da textura homogecircnea e com
placa metafaacutesica corada da mesma forma Sua associaccedilatildeo cliacutenica e identidade
imunoloacutegica natildeo estatildeo definidas Sua importacircncia deriva do fato de que pode ser
facilmente confundido com o padratildeo pontilhado fino denso e com o padratildeo
homogecircneo O segundo trata-se de um padratildeo citoplasmaacutetico em forma de
pequenos bastotildees (rods) e ciacuterculos (rings) que aparentemente estaacute associado agrave
38
infecccedilatildeo pelo HCV Haacute estudos em curso por alguns grupos de pesquisa com a
finalidade de estabelecer sua identidade imunoloacutegica
Como ainda natildeo estatildeo definitivamente caracterizados esses dois novos
padrotildees foram considerados preliminares e o 3deg Consenso recomendou que os
mesmos fossem completamente caracterizados e apresentados na proacutexima versatildeo
do Consenso (DELLAVANCE et al 2009)
39
2 JUSTIFICATIVA
As inflamaccedilotildees do fiacutegado provocadas pelos viacuterus hepatotroacutepicos atingem
milhotildees de pessoas e representam significativos problemas de sauacutede puacuteblica em
todo o mundo No Brasil a Regiatildeo Norte responde por um significativo percentual
dos portadores de hepatite C Dentre as manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo
pelo viacuterus C as doenccedilas autoimunes tecircm significativo impacto na evoluccedilatildeo cliacutenica
desses pacientes A presenccedila de anticorpo antinuacutecleo eacute um marcador importante de
autoimunidade e apesar de existirem trabalhos relatando a pesquisa desse fator em
portadores de viacuterus C tais estudos ainda natildeo foram realizados na nossa regiatildeo
sobretudo correlacionando-se com o genoacutetipo do viacuterus responsaacutevel pela infecccedilatildeo
considerando que o genoacutetipo eacute um marcador de resposta ao tratamento ou
considerando que pacientes portadores do genoacutetipo 1 natildeo respondem
satisfatoriamente ao tratamento instituiacutedo pelo protocolo atual
21 ASPECTOS EacuteTICOS
A pesquisa a ser realizada apresenta relevacircncia social e natildeo perde o
sentido de sua destinaccedilatildeo soacutecio-humanitaacuteria (justiccedila e equidade)
Este trabalho adequa-se aos princiacutepios cientiacuteficos que o justificam e
apresenta possibilidade concreta de responder a incertezas tais como FAN e o
genoacutetipo viral em pacientes com infecccedilatildeo pelo viacuterus da hepatite C ldquoestatildeo
relacionadosrdquo
Segue rigorosamente os procedimentos descritos na Resoluccedilatildeo 19696-
CNSMS (BRASIL 1996) assegurando a confidenciabilidade e proteccedilatildeo da
identidade do sujeito da pesquisa no momento da afericcedilatildeo dos dados e sua
posterior utilizaccedilatildeo
Por tratar-se de um estudo que faraacute somente revisatildeo de soroteca os
participantes natildeo seratildeo submetidos a riscos de origem orgacircnica eou quiacutemica
40
3 OBJETIVOS
31 OBJETIVO GERAL
Estabelecer associaccedilatildeo entre a presenccedila de teste de FAN e o genoacutetipo
viral em pacientes portadores de infecccedilatildeo pelo HCV
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
I Identificar o padratildeo de fluorescecircncia do FAN em pacientes com diagnoacutestico
laboratorial de infecccedilatildeo pelo HCV
II Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados
pelo HCV de acordo com o gecircnero e a idade
III Identificar a prevalecircncia de FAN em pacientes infectados pelo HCV e natildeo
infectados
IV Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados
pelo HCV de acordo com as alteraccedilotildees bioquiacutemicas
41
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO)
Foi realizado um estudo transversal analiacutetico no Serviccedilo do Nuacutecleo de
Medicina Tropical da Universidade Federal do Paraacute (NMTUFPA) utilizando-se
pacientes oriundos da Fundaccedilatildeo Centro de Hemoterapia e Hematologia do Paraacute
(HEMOPA) e Plano de Assistecircncia ao Servidor (PASIASEP) com coleta de material
bioloacutegico para reconfirmaccedilatildeo do diagnoacutestico de hepatite C no periacuteodo de janeiro de
2009 a maio de 2010
411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C
A populaccedilatildeo de estudo consistiu de 51 pacientes admitidos no NMTUFPA
para reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica tratamento cliacutenico e acompanhamento ambulatorial
de ambos os gecircneros e independente da idade sem exclusatildeo dos pacientes com a
presenccedila de patologias associadas agrave condiccedilatildeo maior (motivadora da pesquisa)
oriundos da Fundaccedilatildeo HEMOPA e PAS
A amostra do grupo foi selecionada a partir da relaccedilatildeo dos prontuaacuterios
catalogados no laboratoacuterio de patologia do NMTUFPA
Os dados foram coletados atraveacutes dos resultados dos exames realizados
no soro de cada paciente O protocolo de coleta teve enfoque na identificaccedilatildeo
individual do paciente bem como a avaliaccedilatildeo cliacutenica dos resultados
412 Grupo de natildeo infectados
Foi utilizado um grupo controle de 100 amostras de soro de indiviacuteduos
doadores de sangue com sorologias negativas para HIV 1 e 2 HTLV 1 e 2 Siacutefilis
Doenccedilas de Chagas Hepatite B e para Hepatite C procedentes da fundaccedilatildeo
HEMOPA
42
42 MEacuteTODO
421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico
Foram colhidos em frasco sem anticoagulante 10ml de sangue perifeacuterico
dos 51 pacientes participantes da pesquisa A amostra sanguiacutenea de cada paciente
foi centrifugada o soro foi separado e colocado em frasco esteacuteril devidamente
identificado armazenado e resfriado de 2 a 8ordmC
Foi realizada no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais a
pesquisa soroloacutegica de anticorpos IgG anti-HCV por teste imunoenzimaacutetico (ELISA)
e os pacientes que apresentaram positividade tiveram seus resultados confirmados
atraveacutes de teacutecnicas moleculares (RT-PCR) e com identificaccedilatildeo do genoacutetipo viral
(genotipagem)
Foi realizado no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa a pesquisa
de FAN dos 51 pacientes selecionados utilizando as amostras existentes na
soroteca
422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C
Foram empregados testes soroloacutegicos de ELISA (Ensaio
Imunoenzimaacutetico) de 3ordf geraccedilatildeo utilizando-se de kits comerciais (kit ETI-AB-HCVK-
4 DiaSorin Itaacutelia) para detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos anti-HCV no soro dos
pacientes
As tiras (poccedilos) necessaacuterias para as reaccedilotildees foram retiradas da geladeira
com antecedecircncia de uma hora e deixadas agrave temperatura ambiente e os reagentes
homogeneizados rapidamente no voacutertex
O primeiro poccedilo da placa ficou o branco da reaccedilatildeo na sequecircncia da
microplaca de ELISA foi dispensado 200 microL do controle negativo em triplicata (trecircs
poccedilos) 200 microL do calibrador em duplicata (dois poccedilos) e 200 microL do controle positivo
em amostra uacutenica (um poccedilo)
Adicionou-se 200 microL do Diluente de Amostra em todos os poccedilos que
continham as amostras dos pacientes a serem dosadas na placa de ELISA
tomando cuidado para natildeo contaminar os poccedilos adjacentes
43
Dispensou-se 50 microL do Diluente do Reagente em todos os poccedilos de
controles calibradores e amostras cobrimos com adesivo para evitar evaporaccedilatildeo e
contaminaccedilatildeo das amostras e incubamos a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC
Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com
300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem diluiacuteda
Pipetou-se 100 microL de Conjugado Enzimaacutetico exceto no poccedilo do branco e
incubou-se a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se
cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com 300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem
diluiacuteda
Pipetou-se 100 microL de CromoacutegenoSubstrato em todos os poccedilos
Incubamos a microplaca protegendo-a de luz intensa e direta agrave temperatura
ambiente (18-24ordmC) por 15 min
Pipetou-se 100 microL de Aacutecido Sulfuacuterico em todos os poccedilos para ldquopararrdquo a
reaccedilatildeo enzimaacutetica e mediu-se a absorbacircncia da soluccedilatildeo obtida em leitor de ELISA
com filtro de 450 nM
O teste foi validado de acordo com os valores do controle de qualidade
preconizados pelo fabricante e que devem tanger os valores para o branco da
reaccedilatildeo le 0100 controle negativo le 0050 controle positivo ge 1000 e calibrador ge
1100 Para as amostras testadas os valores reagentes e natildeo reagentes para
pesquisa de anticorpos anti-HCV satildeo interpretados da seguinte maneira natildeo
reagentes com valores le 09 reagentes com valores ge 11 e indeterminados entre
os valores 09 ndash 11
423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia molecular
Nas amostras positivas pela sorologia (ELISA) realizou-se extraccedilatildeo do
RNA viral presente no soro do paciente utilizando kit comercial (QIAmp Viral RNA
kit Quiagen Alemanha) seguindo a teacutecnica adaptada no Laboratoacuterio de Patologia
Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais
Pipetou-se 560 microL de tampatildeo AVL (lise) contendo RNA em tubo de
centriacutefuga de 15 ml identificado adicionou-se 140 microL da amostra e homogenizou-se
em voacutertex por 15s incubando a temperatura ambiente (15-25degC) por 10 min Apoacutes
incubaccedilatildeo centrifugou-se rapidamente o tubo para remover partiacuteculas dispersas
44
Adicionou-se 560 microL de etanol (96-100) na amostra e homogenizou-se
no voacutertex por 15s centrifugando-se rapidamente para remover partiacuteculas dispersas
Depois cuidadosamente transferiu-se 630 microL para as colunas devidamente
identificadas centrifugou-se a 14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo
ficando soacute com a coluna para encaixar em outro tubo
Colocou-se o resto das amostras nas colunas devidas centrifugou-se a
14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo ficando soacute com a coluna para
encaixar em outro tubo Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW1) e
centrifugou-se por 1 min mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo
Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW2) e centrifugou-se por 4 min
mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo
Identificados os tubos para RNA colocou-se as colunas Adicionou-se 60
microL de tampatildeo para eluir (AVE) em cada amostra e centrifugou-se por 1 min
descartando a coluna e ficando com o tubo Colocou-se em banho-maria por 10 min
a 65degC centrifugado rapidamente e colocado no gelo As amostras extraiacutedas foram
congeladas e armazenadas em freezer a -20ordmC
O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado de acordo com a teacutecnica de
RT-PCR qualitativa com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das
Doenccedilas Tropicais da seguinte maneira para o Mix de uma amostra Tampatildeo 12
microL primer ou iniciador k10 1microL primer ou iniciador k11 1microL aacutegua ultrapura livre de
DNAse e RNAse 5 microL Enzima Taq polymerase One-Step (Invitrogen) 1 microL O
primer k10 constitui-se da sequecircncia GGC GAC ACT CCA CCA TRR e o primer k11
da sequecircncia GGT GCA CGG TCT ACG AGA CC
O volume do mix por amostra eacute de 20 microL e o volume da amostra (produto
da extraccedilatildeo) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As amostras
foram colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo eacute realizada a 42ordmC por 45 minutos
temperatura inicial de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 2 minutos seguida de 35 ciclos com
temperatura de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 54ordmC por 30
segundos de extensatildeo a 72ordmC por 45 segundos e temperatura de extensatildeo final de
72ordmC por 7 minutos e um hold de 4ordmC
Para visualizaccedilatildeo do produto dessa 1ordf PCR (RT-PCR) eacute feito um gel de
agarose a 1 (1g de agarose para 100mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de
etidium) que migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os
resultados foram visualizados atraveacutes de luz ultravioleta (UV) Os pacientes
45
positivos que apresentarem ldquobandardquo devem continuar os procedimentos e os
negativos que natildeo apresentarem ldquobandasrdquo deveratildeo ser liberados como
indetectaacuteveis por este meacutetodo
A 2ordf PCR (RFLP) foi responsaacutevel por fazer a amplificaccedilatildeo do cDNA
produto da 1ordf PCR Para esta etapa tambeacutem com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio
de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais foram necessaacuterios para o Mix de uma
amostra Tampatildeo 10X 25 microL DNTP 4 microL MgCl2 15 microL primer ou iniciador k15 1
microL primer ou iniciador k16 1 microL aacutegua ultrapura livre de DNAse e RNAse 125 microL
Enzima Taq platinum (Invitrogen) 05 microL O primer k15 constitui-se da sequecircncia
ACC ATR RAT CAC TCC CCT GT e o primer k16 da sequecircncia CAA GCA CCC TAT
CAG GCA GT
O volume do mix por amostra foi de 23 microL e o volume da amostra
(produto da 1ordf PCR) de 2 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As
amostras satildeo colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo se realiza a temperatura inicial
de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 4 minutos seguida de 35 ciclos com temperatura de
desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 55ordmC por 45 segundos de
extensatildeo a 72ordmC por 1 minuto e temperatura de extensatildeo final de 72ordmC por 7
minutos e um hold de 4ordmC
O produto da 2ordf PCR eacute observado atraveacutes de um gel de agarose a 1 (1g
de agarose para 100 mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que
migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os resultados
foram visualizados atraveacutes de luz UV (ultravioleta) Os pacientes positivos que
apresentaram ldquobandardquo (fragmento amplificado) se continuou os procedimentos e os
negativos que natildeo apresentaram ldquobandasrdquo foram repetidos para o procedimento da
2ordf PCR
424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem)
Os pacientes positivos para a 2ordf PCR foram submetidos agrave genotipagem
do viacuterus atraveacutes do meacutetodo de RFLP utilizando um par de enzimas de restriccedilatildeo
AVA II e RSA I Essa teacutecnica tambeacutem foi adaptada no Laboratoacuterio de Patologia
Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais
46
Na determinaccedilatildeo do genoacutetipo cada amostra eacute utilizada duas vezes
sendo uma reaccedilatildeo para AVA II e uma para RSA I portanto cada amostra teve dois
tubos correspondentes
Para a preparaccedilatildeo do mix de uma amostra para a enzima de restriccedilatildeo
AVA II (Promega) foram utilizados Buffer C X 30 2 microL aacutegua ultrapura livre de
DNAse e RNAse 125 microL AVA II 05 microL Para o mix de uma amostra de RSA I
(Invitrogen) satildeo necessaacuterios React 1 10X 2 microL aacutegua ultrapura libre de DNAse e
RNAse 11 microL RSA I 2 microL
O volume do mix por amostra foi de 15 microL e o volume da amostra
(produto da 2ordf PCR) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 20 microL para
cada frasco correspondente a sua enzima de restriccedilatildeo As amostras formatildeo ldquoparesrdquo
de tubos AVA II e RSA I e satildeo colocadas em banho-maria a 37ordmC overnight para
digerir (cortar) os fragmentos
Para visualizaccedilatildeo do produto da digestatildeo (RFLP) e verificaccedilatildeo dos
genoacutetipos foi preparado um gel de agarose a 2 (2g de agarose para 100 mL de
tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que migrou em cuba de eletroforese
com 100V 500A por 60 minutos Os resultados foram visualizados atraveacutes de luz UV
(ultravioleta) Os pacientes positivos apresentam ldquobandasrdquo (fragmentos) de
tamanhos diferentes O nuacutemero de bandas e sua disposiccedilatildeo no gel formaram
padrotildees de combinaccedilotildees correspondentes a cada genoacutetipo viral
425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas HEp-2
A pesquisa de auto-anticorpo contra antiacutegenos celulares foi realizada no
Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa pela teacutecnica de imunofluorescecircncia
indireta que os identifica atraveacutes da ligaccedilatildeo destes auto-anticorpos aos antiacutegenos do
substrato sendo esta ligaccedilatildeo revelada pela adiccedilatildeo de um soro com atividade Anti-
IgG conjugado agrave fluoresceiacutena
As amostras foram testadas utilizando-se um conjunto diagnoacutestico
comercial Antinuclear Antibody HEp-2 da Hemagen Diagnostics
Na primeira fase da reaccedilatildeo os soros diluiacutedos 140 colocados em contato
com o substrato durante 20 minutos seguido de lavagem com soluccedilatildeo salina
tamponada por 10 minutos Na segunda fase aplicacou-se a substacircncia
47
fluorescente sendo o conjugado diluiacutedo 130 deixando-se por 10 minutos seguida
de nova lavagem de 10 minutos e montagem da lacircmina com glicerina tamponada
Em cada lacircmina foram utilizados controle positivo e controle negativo
A leitura das lacircminas foi realizada em microscoacutepio de imunofluorescecircncia
marca Nikon modelo Eclipse E-200
Os criteacuterios morfoloacutegicos observados durante a leitura foram
a) aspecto da matriz nuclear
b) aspecto do nucleacuteolo
c) observaccedilatildeo de todos os estaacutegios de divisatildeo nuclear
d) aspecto do fuso mitoacutetico
e) aspecto do citoplasma
43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados coletados foram estruturados em um banco de dados no qual
tambeacutem foram confeccionadas tabelas e graacuteficos para representaccedilatildeo dos dados
Posteriormente foram analisados no programa Bioestat 50 para a geraccedilatildeo de
resultados estatiacutesticos que comprovassem a associaccedilatildeo de variaacuteveis pertinentes ao
estudo considerando o intervalo de confianccedila (IC) 95 e niacutevel α 5 (p-valor le 005)
isto eacute um achado seraacute considerado estatisticamente significante se valor de ldquoprdquo for
menor ou igual a 005 e seraacute considerado sem significacircncia estatiacutestica se esse valor
de ldquoprdquo for maior que 005
Nas variaacuteveis quantitativas foram realizadas as medidas de tendecircncia
central sendo calculado a meacutedia e a mediana com seus respectivos desvios
padrotildees O teste t foi usado para comparar as idades entre as amostras
O teste do Qui-quadrado e o teste G foram aplicados nas comparaccedilotildees de
n amostras independentes cujas proporccedilotildees observadas nas diversas modalidades
estiveram dispostas em tabelas de contigecircncia l x c onde se determinou as
proporccedilotildees observadas nas diferentes categorias e se estas tinham alguma
associaccedilatildeo
48
5 RESULTADOS
O Padratildeo de FAN em 100 dos 51 pacientes infectados pelo HCV e em
2 dos natildeo infectados pelo HCV ocorreu Citoplasmaacutetico
Com relaccedilatildeo agrave distribuiccedilatildeo dos pacientes por gecircnero observou-se uma
predominacircncia do gecircnero masculino (667) A faixa etaacuteria predominante foi a de 30
a 50 anos de idade (628) seguida da faixa etaacuteria compreendida entre 51 e 60
anos (196) No que diz respeito agrave naturalidade houve uma predominacircncia de
paraenses em 922 da amostra A maioria dos pacientes incluiacutedos no estudo foi
proveniente da Fundaccedilatildeo HEMOPA (98) por se tratarem de candidatos a doaccedilatildeo
de sangue (Tabela 1)
Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV segundo as caracteriacutesticas demograacuteficas janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Caracteriacutesticas demograacuteficas n Teste estatiacutestico Gecircnero
Masculino 34 667 Qui-quadrado Feminino 17 333 p = 00251
Total 51 1000
Idade (anos) lt 30 6 118 Qui-quadrado
30 a 40 16 314 p = 00094 41 a 50 16 314 51 a 60 10 196
gt 60 3 59 Total 51 1000
Naturalidade
Paraense 47 922 Qui-quadrado Macapaense 1 20 p lt 00001 Maranhense 1 20
Pernambucano 1 20 Gauacutecho 1 20
Total 51 1000
Procedecircncia Qui-quadrado HEMOPA 50 980 p lt 00001
IASEP 1 20 Total 51 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
49
Identificou-se no estudo a predominacircncia do genoacutetipo viral do tipo 1
(882) estando o genoacutetipo 3 presente em 118 dos casos Em 255 dos
pacientes foi observado uma positividade para FAN sendo que todos apresentaram
o padratildeo citoplasmaacutetico (Tabela 2)
Tabela 2 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV conforme os resultados laboratoriais de FAN citoplasmaacutetico e genotipagem janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Exames laboratoriais n Teste estatiacutestico
Genoacutetipo viral - HCV
Tipo 1 45 882 Qui-quadrado
Tipo3 6 118 p lt 00001
Total 51 1000
FAN Qui-quadrado
Positivo (citoplasmaacutetico) 13 255 p = 00008
Negativo 38 745 Total 51 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
Observou-se uma baixa positividade para o FAN tanto no gecircnero
masculino (294) quanto no gecircnero feminino (176) Natildeo houve diferenccedila
estatiacutestica significante entre os gecircneros e a anaacutelise do FAN (p = 05652) Isto eacute
independendo do gecircnero do paciente nada se poderaacute inferir se o mesmo teraacute maior
ou menor chance de possuir um FAN positivo ou negativo (Tabela 3)
Tabela 3 ndash Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
FAN (citoplasmaacutetico)
Gecircnero Teste estatiacutestico
(Teste G) Masculino Feminino
N N
Positivo 10 294 3 176
Negativo 24 706 14 824 p = 05652
Total 34 1000 17 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
Dentre os pacientes infectados o genoacutetipo viral tipo 1 e o tipo 3
predominaram no gecircnero masculino embora natildeo havendo diferenccedila significativa
entre os grupos (p=06376)(Tabela 4)
50
Tabela 4 - Relaccedilatildeo da genotipagem de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Gecircnero
Grupos estudados Teste estatiacutestico
(Teste G) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3
n n Masculino 29 644 5 833 p=06376 Feminino 16 356 1 167
Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa
Na faixa etaacuteria de 30 a 50 anos foi observada uma maior proporccedilatildeo (667)
do genoacutetipo viral do tipo 3 enquanto que para o genoacutetipo tipo 1 foi de 628 natildeo
tendo essa diferenccedila significacircncia estatiacutestica (Tabela 5)
Tabela 5 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e faixa etaacuteria - janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)
Idade (anos) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n
lt 30 04 118 0 00
30 a 40 15 314 3 500 p = 06401
41 a 50 15 314 1 167
51 a 60 08 196 2 333
gt 60 03 59 0 00 Total 45 1000 6 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
A anaacutelise descritiva das idades dos pacientes demonstrou que a meacutedia e
a mediana foi de 43 anos para aqueles com genoacutetipo viral tipo 1 no entanto para o
genoacutetipo viral tipo 3 a meacutedia foi de 44 e a mediana de 42 anos Observou-se que a
idade miacutenima dos pacientes com genoacutetipo viral-HCV do tipo 1 e 3 foi
respectivamente de 20 e 32 anos e a maacutexima foi de 68 e 57 anos perfazendo uma
amplitude total de 48 e 25 anos respectivamente Natildeo houve significacircncia estatiacutestica
entre as idades encontradas nos genoacutetipos 1 e 3 (Tabela 6 )
De acordo com o FAN citoplasmaacutetico a idade miacutenima dos pacientes com
FAN positivo e negativo foi respectivamente de 30 e 20 anos e a maacutexima foi de 53 e
68 anos perfazendo uma amplitude total de 23 e 48 anos respectivamente As
idades meacutedia e mediana foram respectivamente 435 e 46 anos nos pacientes com
o FAN positivo e meacutedia de 43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN
51
negativo Natildeo houve diferenccedila estatisticamente significativa entre as idades
encontradas nos pacientes com FAN positivo e negativo (Tabela 6)
Tabela 6 - Estudo descritivo da idade dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e presenccedila do FAN citoplasmaacutetico janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Grupos Estudados Genoacutetipo viral - HCV Auto anticorpo
Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 FAN (+) FAN (-) IDADE
Tamanho da amostra 45 6 13 38
Idade miacutenima 20 32 30 20
Idade maacutexima 68 57 53 68
Amplitude Total 48 25 23 48
Meacutedia Aritmeacutetica 43 44 435 43
Mediana 43 42 46 42
Desvio Padratildeo 107 93 78 113
Teste t p = 08363 p = 08809 Fonte Protocolo da pesquisa
Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos em que foram analisados AST
ALT ASTALT γ-GT e fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo
semelhantes dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e 3 natildeo
atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos
(Tabela 7)
Tabela 7- Distribuiccedilatildeo dos genoacutetipos dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Paracircmetros bioquiacutemicos
Genoacutetipo viral - HCV Teste estatiacutestico
(Teste t) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3
micro plusmn DP micro plusmn DP
AST 353 plusmn 219 328 plusmn 137 p = 07907
ALT 372 plusmn 321 288 plusmn 136 p = 05355
ASTALT 12 plusmn 07 14 plusmn 11 p = 06110
γ-GT 403 plusmn 38 302 plusmn 138 p = 02194
Fosfatase alcalina 1126 plusmn 443 1087 plusmn 376 p = 08349
Fonte Protocolo da pesquisa
Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos de AST ALT ASTALT γ-GT e
fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os
52
pacientes com FAN positivo e negativo natildeo sendo observada significacircncia
estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos de FAN (Tabela 8)
Tabela 8 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Paracircmetros bioquiacutemicos Auto anticorpos
Teste estatiacutestico (Teste t) Positivo Negativo
micro plusmn DP micro plusmn DP
AST 419 plusmn 238 326 plusmn 197 p = 01704
ALT 408 plusmn 29 346 plusmn 312 p = 05347
ASTALT 13 plusmn 08 12 plusmn 07 p = 05732
γ-GT 34 plusmn 21 409 plusmn 40 p = 04369
Fosfatase alcalina 1073 plusmn 345 1138 plusmn 462 p = 06431 Fonte Protocolo da pesquisa
Na comparaccedilatildeo entre resultados positivos e negativos do FAN
citoplasmaacutetico observou-se uma maior prevalecircncia da negatividade tanto em
pacientes natildeo infectados (98) como em pacientes infectados (745) pelo HCV
sendo essa diferenccedila estatisticamente significativa (plt00001) o que representa
uma natildeo associaccedilatildeo entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV
(Tabela 9)
Tabela 9 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico segundo a presenccedila ou ausecircncia de infecccedilatildeo por HCV janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
FAN (citoplasmaacutetico)
Pacientes Teste estatiacutestico (Teste G)
Infectados Natildeo infectados
N n
Positivo 13 255 2 2
Negativo 38 745 98 98 p lt 00001
Total 51 1000 100 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
Comparando-se os resultados do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos
viras observa-se que o resultado negativo eacute superior ao positivo em ambos os
genoacutetipos virais sendo 711 para o genoacutetipo viral 1 e 100 para o genoacutetipo viral 3
No entanto esta diferenccedila observada natildeo eacute estatisticamente significativa (p=02573)
(Tabela 10)
53
Tabela 10 - Distribuiccedilatildeo do FAN de acordo com o genoacutetipo viral janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
FAN (citoplasmaacutetico)
Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)
Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n
Positivo 13 289 0 00 p=02573 Negativo 32 711 6 1000
Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa
54
6 DISCUSSAtildeO
Desde o primeiro marcador soroloacutegico para diagnoacutestico do Lupus
Eritematoso Sistecircmico (LES) a ceacutelula LE descrita por Hargraves (1948) vaacuterios
substratos antigecircnicos foram utilizados para o estudo dos auto-anticorpos os quais
terminaram amplamente substituiacutedos pelas ceacutelulas HEp-2 Estas apresentam
significativas vantagens sobre os demais pela sua sensibilidade variedade de
antiacutegenos presentes e pelas facilidades morfoloacutegicas para o seu estudo
O uso da imunofluorescecircncia indireta para a visualizaccedilatildeo dos anticorpos
antinucleares nas ceacutelulas HEp-2 permite o reconhecimento de mais de 30 diferentes
padrotildees de fluorescecircncia como nucleares nucleolares da membrana nuclear do
aparelho mitoacutetico e citoplasmaacutetico todos satildeo proporcionados por diferentes auto-
anticorpos
A partir do 1deg Consenso Brasileiro para Padronizaccedilatildeo dos Laudos de FAN
(HEp-2) os criteacuterios para o preparo interpretaccedilatildeo da fluorescecircncia e nomenclatura
dos resultados passaram a ser normatizados Alguns padrotildees de fluorescecircncia satildeo
relativamente inespeciacuteficos outros satildeo ocasionados por uma gama restrita de auto-
anticorpos e outros ainda por um uacutenico auto-anticorpo (DELLAVANCE et al
2002) Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a tornaacute-las
imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo (DE
LARANAGA et al 2000)
Apesar do padratildeo de fluorescecircncia na maioria das vezes natildeo se pode
identificar o anticorpo presente ele pode sugerir ao cliacutenico qual o proacuteximo passo a
ser dado na investigaccedilatildeo da sua especificidade Os resultados encontrados devem
estar em associaccedilatildeo com a cliacutenica os padrotildees de fluorescecircncia e os tiacutetulos
alcanccedilados com a diluiccedilatildeo preacutevia (DELLAVANCE et al 2003)
No presente estudo a analise de 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo Viacuterus da
Hepatite C esteve presente o anticorpo-antinuclear (ANA FAN) em 13 (255) dos
pacientes e todos eram padratildeo citoplasmaacutetico corroborando com outros estudos
encontrados na literatura como
Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de
pacientes infectados pelo viacuterus HIV com Hanseniacutease e co-infectados com
Hanseniacutease HIV Ela obteve respectivamente as seguintes taxas de prevalecircncias
32 333 e 478 Em todos os grupos neste estudo houve predomiacutenio do
55
padratildeo citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear soacute foi observado entre os pacientes com
hanseniacutease (91) e co-infectados (237)
Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de
pacientes infectados pelo viacuterus da Dengue e viacuterus linfotroacutepico de ceacutelulas T humanas
HTLV-12 e controle Normais e obteve respectivamente as seguintes taxas de
prevalecircncias 40 40 e 2 Em todos os grupos houve predomiacutenio do padratildeo
citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear foi observado entre os pacientes com dengue
(67) e HTLV 12 (133)
Segundo Andrade et al (2002) Dellavance et al (2005) Dellavance e
Andrade et al (2007) o predomiacutenio do padratildeo de FAN do tipo citoplasmaacutetico indica
que determinados padrotildees de fluorescecircncia satildeo mais especiacuteficos de doenccedila auto-
imune enquanto outros ocorrem em indiviacuteduos com enfermidades natildeo auto-imunes
por ser o citoplasma celular rico em proteiacutenas para as quais auto-anticorpos naturais
apresentam afinidade moderada eacute comum observar positividade para FAN em
indiviacuteduos sadios cujo significado ainda natildeo eacute entendido completamente
O padratildeo Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina que pode ser
encontrado em Hepatite auto-imune Cirrose Hepatite C Hepatocarcionoma entre
outros Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica
definida Um resultado positivo pode estar ou natildeo associado a uma patologia assim
como poderaacute ou natildeo vir a apresentar uma doenccedila auto-imune com o passar do
tempo (DELLAVANCE et al 2003) Neste estudo natildeo foi feito avaliaccedilatildeo prospectiva
dos resultados embora todos sejam FAN citoplasmaacuteticos
Os achados de FAN positivo em populaccedilotildees sadias ou sem doenccedilas auto-
imunes tambeacutem jaacute observado por Leser et al (2004) que em 394 pacientes com
FAN-HEp-2 positivo natildeo encontraram nenhum paciente com doenccedila auto-imune
Outro exemplo estaacute no padratildeo citoplasmaacutetico de pontos isolados
estudado por Laurino et al (2006) presente em indiviacuteduos sem evidecircncia de auto-
imunidade mas tambeacutem em indiviacuteduos com acometimento de doenccedilas auto-imunes
sistecircmicas e natildeo-especiacuteficas
Os dados apresentados corroboram com este estudo em que foi
observado a presenccedila do auto-anticorpo em 2 (2 ) dos 100 indiviacuteduos sadios do
grupo controle todos com padratildeo citoplasmaacutetico
56
Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a
tornaacute-las imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo
(DE LARANAGA et al 2000)
Nas Infecccedilotildees agudas espera-se que a resposta auto-imune diminua a
medida que os viacuterus satildeo eliminados Entretanto alguns trabalhos sugerem que em
indiviacuteduos geneticamente susceptiacuteveis as reaccedilotildees auto-imunes possam persistir
apesar do clareamento viral uma vez que o gatilho imunoloacutegico foi ativado e natildeo
houve desativaccedilatildeo (DE LARANAGA et al 2000 SAKKAS et al 2008)
Ramos-Casals et al (2009) no estudo Doenccedilas Sistecircmica Auto-Imunes
em Pacientes com Infecccedilatildeo pelo (72) dos pacientes eram do gecircnero feminino e
(28) do masculino(ANA FAN) em 61 dos pacientes o que se diferem deste
trabalho eacute que dos 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo (667) eram do gecircnero
masculino e (333) eram do gecircnero feminino com meacutedia de idade de 430 (plusmn107)
anos com presenccedila de anticorpo-antinuclear em 13 (255) com meacutedia e mediana
respectivamente de 435 e 46 anos nos pacientes com o FAN positivo e meacutedia de
43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN negativo
Alter (1995) em sua pesquisa natildeo observou associaccedilatildeo entre o risco de
infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas designadas por gecircnero idade e raccedila Na
referida pesquisa foram estudados 51 pacientes com idade meacutedia de 430 (+- 107)
anos 34 (667) eram do gecircnero masculino e 17 (333) do gecircnero feminino todos
em fase preacute-tratamento assintomaacuteticos natildeo permitindo avaliar os risco da
infecccedilatildeoSegundo Pordeus et al (2008) a ocorrecircncia destes auto-anticorpos
indicaria um prognoacutestico desfavoraacutevel Perperas Mcfarlane e Mcsorley (1986)
sugeriram que os auto-anticorpos poderiam estar envolvidos na progressatildeo ou no
desenvolvimento de hepatites crocircnicas possivelmente por um distuacuterbio no controle
da auto-reatividade Outros estudos questionam a participaccedilatildeo dos auto-anticorpos
no processo de transiccedilatildeo para cronicidade das hepatites agudas virais poreacutem os
resultados natildeo satildeo convincentes (SHOENFELD ROSE 2004)
Lopez Seia e Roy (1998) demonstraram a presenccedila de anticorpo anti-
actina em baixos tiacutetulos em crianccedilas com hepatite aguda por curto periacuteodo de
tempo poreacutem nenhuma associaccedilatildeo com gravidade da agressatildeo hepaacutetica foi
descrita
Neste estudo a presenccedila dos auto-anticorpos em (255) dos pacientes
com infecccedilatildeo pelo HCV natildeo puderam ser relacionada com a gravidade da doenccedila
57
pois este estudo foi realizado em pacientes receacutem diagnosticados entatildeo seria
necessaacuterio um acompanhamento destes por um periacuteodo maior de tempo com a
finalidade de concluir esta afirmativa Apesar da presenccedila transitoacuteria de auto-
anticorpos jaacute ter sido descrita em doenccedilas virais comuns a associaccedilatildeo entre a
presenccedila de auto-anticorpos e a gravidade das doenccedilas necessita de comprovaccedilatildeo
Passaleva Massai e Leoncini (1983) avaliaram 302 pacientes com
hepatites agudas virais e encontraram complexos imunes circulantes (CIC) em
516 dos pacientes com frequumlecircncia significativamente maior em hepatite aguda
Nenhuma associaccedilatildeo entre a presenccedila de imuno-complexos e o niacutevel de
aminotransferases ou bilirrubina foi encontrada Segundo Andrade et al (2002)
Dellavance et al (2005) Andrade et al (2007) nos pacientes do estudo foi feita a
relaccedilatildeo entre a presenccedila dos auto-anticorpos e niacuteveis de aminotransferases e as
elevaccedilotildees natildeo tiveram significacircncia poreacutem houve associaccedilatildeo do genotipo viral 1
Nos paracircmetros bioquiacutemicos analisados em relaccedilatildeo aos genoacutetipos houve uma
distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e
3 natildeo atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os
grupos Segundo Wilson (1997) trecircs estudos mostraram correlaccedilatildeo entre niacuteveis
altos de alanina aminotransferase e atividade histoloacutegica da doenccedila hepaacutetica
Poreacutem nos pacientes considerados individualmente o valor preditivo dessa
associaccedilatildeo foi baixo enquanto muitos deles com enzimas normais apresentavam
graves alteraccedilotildees histoloacutegicas No presente estudo natildeo foi observada associaccedilatildeo entre os niacuteveis de
aminotransferases e a cronificaccedilatildeo da hepatite viral pois nem todos os pacientes do
estudo apresentavam resultado de bioacutepsia hepaacutetica
Alter et al (1999) afirmam que no Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b
(63) e 3a (313) em estudo realizado em Goiacircnia onde foi observada uma
maior prevalecircncia do genoacutetipo 1 seguida do genoacutetipo 3 em doadores de sangue e
hemofiacutelicos (DELLAVANCE ANDRADE et al 2007) Estando esses dados em
acordo com esta pesquisa que com genotipagem do viacuterus da hepatite C que
identificou o genoacutetipo 1 em 45 (882) seguidos pelo genoacutetipo 3 que foi
identificado em 6 (118) dos pacientes com infecccedilatildeo pelo HCV Em um estudo realizado na Franccedila com 13 pacientes luacutepicas infectadas
pelo viacuterus C 8 apresentavam o RNA viral sendo o genoacutetipo 1 presente em cinco
58
(625) casos seguido do genoacutetipo 3 (375) (PERLEMUTER et al 2000) dados
que se assemelham aos do presente estudo embora o estudo natildeo tenha incluiacutedo
pacientes com outras infecccedilotildees associadas ao HCV Eacute importante ressaltar que
estudos sobre genotipagem do HCV em indiviacuteduos com doenccedilas reumaacuteticas satildeo
raros
No presente estudo houve uma frequumlecircncia baixa de positividade para o
FAN nos pacientes com genoacutetipo 1 e genoacutetipo 3 Natildeo havendo significacircncia
estatiacutestica entre os pacientes com genoacutetipo 1 e 3
Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter
implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave menor
resposta agrave terapia antiviral (BRUNO et al1997) o que natildeo foi avaliado neste estudo
pois apesar de (882) dos pacientes serem genoacutetipo 1 todos estavam em fase de
reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica seja preacute- tratamento Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila
poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses
autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis
vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo
hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja
quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a
concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave
hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em
parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)
59
7 CONCLUSOtildeES
minus O padratildeo dos auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares encontrados nos
dois grupos estudados foi o citoplasmaacutetico
minus A prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares no grupo com
infecccedilatildeo pelo VHC foi significativamente maior do que no grupo controle
minus Nos resultados de FAN citoplasmaacutetico haacute uma maior prevalecircncia da
negatividade em pacientes infectados pelo HCV e natildeo infectados sendo
essa diferenccedila estatisticamente significativa conferindo a natildeo associaccedilatildeo
entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV
minus Os resultados negativos do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos viras eacute
superior aos positivos em ambos os genoacutetipos virais entretanto esta diferenccedila
natildeo eacute estatisticamente significativa
minus Houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos
celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado
minus Natildeo houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos
celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado com
relaccedilatildeo ao gecircnero onde predominou o gecircnero masculino nos dois grupos
minus Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter
implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave
menor resposta agrave terapia antiviral o que natildeo foi avaliado neste estudo pois
os pacientes estavam em fase preacute tratamento sugerindo que estes pacientes
sejam avaliados futuramente
minus A formaccedilatildeo dos auto-anticorpos parece ser mais uma consequumlecircncia do que
uma causa da agressatildeo hepaacutetica
minus A negatividade do FAN ndash Hep 2 foi maior que a positividade mas todos os
FAN positivos pertenciam ao genoacutetipo viral tipo 1 nos pacientes infectados
pelo HCV
minus Nesta pesquisa os resultados de PCR o RNA-HCV de reconfirmaccedilatildeo foi
positivo para o anti-HCV em todos os soros analisados mostrando assim
que estes pacientes eram portadores de infecccedilatildeo por viacuterus C ou seja natildeo
houve falso positivo anteriormente poreacutem todos eram assintomaacuteticos
dificultando a conclusatildeo de ser ou natildeo uma infecccedilatildeo persistente
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APEcircNDICES
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APEcircNDICE A - TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Vocecirc estaacute sendo convidado para fazer parte de uma pesquisa que estaacute sendo desenvolvida pela Universidade Federal do Paraacute no Nuacutecleo de Medicina Tropical intitulada AUTOANTICORPOS CONTRA ANTIacuteGENOS CELULARES E SUA CORRELACcedilAtildeO COM O GENOacuteTIPO VIRAL EM PACIENTES COM INFECCcedilAtildeO PELO VIacuteRUS DA HEPATITE C (HCV)
O Objetivo da pesquisa eacute fazer uma correlaccedilatildeo do anticorpo antinuacutecleo (FAN) e o genoacutetipo viral em pacientes com hepatite C e o estaacutegio da doenccedila hepaacutetica a partir da histologia sempre que permitidos e correlacionar ao diagnoacutestico
Caso vocecirc participe da pesquisa seraacute necessaacuterio que forneccedila uma amostra de sangue (2ml)
O uacutenico inconveniente que vocecirc poderaacute experimentar eacute a dor provocada pela agulha na hora da coleta de sangue bem como pequenos hematomas que possam vir a ocorrer e que natildeo causam danos
Essa pesquisa natildeo oferece riscos as praacuteticas satildeo de uso rotineiro e seratildeo utilizados materiais esterilizados e descartaacuteveis como agulhas seringas etc
Estaacute garantido a vocecirc todas as informaccedilotildees que vocecirc queira antes durante e depois da pesquisa
A sua participaccedilatildeo neste estudo eacute voluntaacuteria Vocecirc tem a liberdade de recusar participar da pesquisa a qualquer momento
As informaccedilotildees relacionadas agrave pesquisa poderatildeo ser inspecionadas pelos pesquisadores que executam a pesquisa e pelas autoridades legais no entanto se qualquer informaccedilatildeo for divulgada em relatoacuterio publicaccedilatildeo ou qualquer outro meio isto seraacute feito de forma codificada para manter o caraacuteter confidencial
Todas as despesas necessaacuterias para a realizaccedilatildeo do estudo natildeo satildeo de sua responsabilidade assim como a sua participaccedilatildeo na pesquisa na seraacute remunerada (vocecirc natildeo receberaacute qualquer valor em dinheiro)
Quando os resultados forem divulgados natildeo apareceraacute seu nome e sim um coacutedigo
_____________________________________
Assinatura do Pesquisador Responsaacutevel NomeAna Maria Almeida Souza EndRodovia Maacuterio Covas 1426 ndash Cond Green Garden casa 41 Fone(91) 32352665 81197217 RegConselhoCRM 1508
69
APEcircNDICE B - CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Declaro que li as informaccedilotildees acima sobre a pesquisa que me sinto
perfeitamente esclarecido sobre o conteuacutedo da mesma assim como seus riscos e
benefiacutecios Declaro ainda que por minha livre vontade aceito participar da pesquisa
cooperando com a coleta de material para exame
Beleacutem _________
_________________________________________
Assinatura do sujeito da pesquisa ou do
responsaacutevel
70
ANEXOS
71
- Assinatura do Pesquisador Responsaacutevel
-
- Beleacutem _________
-
RESUMO
As inflamaccedilotildees do fiacutegado provocadas pelos viacuterus hepatotroacutepicos atingem milhotildees de
pessoas e representa significativo problema de sauacutede puacuteblica em todo o mundo
Existem interaccedilotildees entre viroses hepatotroacutepicas e o sistema imunoloacutegico do hospedeiro
que podem influenciar na patogenicidade da agressatildeo hepaacutetica O objetivo deste
trabalho foi investigar a frequumlecircncia de auto-anticorpos em pacientes portadores do viacuterus
da hepatite C e sua correlaccedilatildeo com os genoacutetipos encontrados Foram estudados 51
pacientes com diagnoacutestico confirmado pelo PCR de infecccedilatildeo pelo viacuterus da hepatite C e
um grupo de 100 doadores de sangue com todos os exames soroloacutegico para doenccedilas
infecto-contagiosas negativos Os 51 pacientes portadores do viacuterus C apresentavam
idade meacutedia de 43 anos +- 113 em fase preacute-tratamento 34 (667) eram do gecircnero
masculino e 17 (333) do gecircnero feminino Desses 13 (255) apresentaram FAN
positivo 45 (882) eram genoacutetipo tipo 1 e 118 genoacutetipo tipo 3 Os pacientes que se
apresentaram com anticorpos detectaacuteveis natildeo apresentavam niacuteveis de AST ALT
ASTALT γ-GT e fosfatase alcalina significativamente diferente daqueles com auto-
anticorpos negativos Desta forma conclui-se que os anticorpos presentes na amostra
do estudo satildeo independentes da evoluccedilatildeo da doenccedila e do prognoacutestico do paciente
entretanto parece estar ligada ao genoacutetipo tipo 1
Palavras-chave Hepatite C Auto-anticorpos Genoacutetipo
ABSTRACT
Inflammation of the liver caused by hepatotropic viruses affect millions of people and
represents a significant public health problem worldwide There are interactions between
hepatotropic viruses and the host immune system that can influence the pathogenesis of
liver injury The objective of this study was to investigate the frequency of autoantibodies
in patients with hepatitis C virus and its correlation with the genotypes found We
studied 51 patients diagnosed by PCR of infection with hepatitis C and a group of 100
blood donors with all serological tests for infectious diseases negative The 51 patients
with virus C had an average age of 43 years + - 113 in the pre-treatment 34 (667)
were male and 17 (333) were female Of these 13 (255) were ANA positive 45
(882) were with genotype 1 and 118 with genotype 3 Patients who presented with
antibodies had no detectable levels of AST ALT AST ALT γ-GT and alkaline
phosphatase significantly different from those with negative antibody titers Thus we
conclude that the antibodies present in the study sample are independent of disease
progression and patient prognosis though seems to be linked with genotype 1
Keywords Hepatitis C Auto-antibodies genotype
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Padrotildees de fluorescecircncia encontrados em maior frequumlecircncia e
patologias relacionadas 34
Quadro 2 - Anti-ena - auto-anticorpos contra antiacutegenos extraiacutedos do nuacutecleo e
relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 34
Quadro 3 ndash Padrotildees de FAN nuclear e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 35
Quadro 4 - Padrotildees de FAN citoplasmaacuteticos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 36
Quadro 5 - Padrotildees de FAN mistos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 37
Quadro 6 - Padrotildees de FAN nucleolares e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 37
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos pacientes segundo as caracteriacutesticas demograacuteficas janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 48
Tabela 2 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes conforme os resultados laboratoriais de FAN citoplasmaacutetico e genotipagem janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 49
Tabela 3 ndash Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 49
Tabela 4 - Relaccedilatildeo da genotipagem de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 50
Tabela 5 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e faixa etaacuteria - janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 50
Tabela 6 - Estudo descritivo da idade dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e presenccedila do FAN citoplasmaacutetico janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 51
Tabela 7- Distribuiccedilatildeo dos genoacutetipos dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 51
Tabela 8 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 52
Tabela 9 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico segundo a presenccedila ou ausecircncia de infecccedilatildeo por HCV janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 52
Tabela 10 - Distribuiccedilatildeo do FAN de acordo com o genoacutetipo viral janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 53
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
AAN Anticorpos antinucleares
aCL Anticorpos anticardiolipina
AIDS Sindrome da Imunodeficiecircncia Adquirida
ALT Alanina aminotransferase
ANCA Anticorpos anti-citoplasma de neutroacutefilos
Anti-CCP Antipeptiacutedeo citrulinado ciacuteclico
Anti-β2GPI Anticorpos anti-β2 glicoproteiacutena I
Cdna DNA complementar
CEP Comitecirc em Eacutetica e Pesquisa
CHC Carcinoma hepatocelular
CIC Complexos imunes circulantes
DDTC Doenccedilas difusas do tecido conjuntivo
DMTC Doenccedila mista do tecido conjuntivo
E1 Proteiacutena do envoltoacuterio
ENH Eritema Nodoso Hansecircnico
ESP Esclerose sistecircmica progressive
FAN Fator Anti-nuacutecleo
FR Fator reumatoacuteide
HBV Viacuterus da hepatite B
HCV Viacuterus da Hepatite C
HEMOPA Fundaccedilatildeo Centro de Hemoterapia e Hematologia do Paraacute
HIV Viacuterus da imunodeficiecircncia humana
HIV-1 Viacuterus da imunodeficiecircncia humana1
IAH Iacutendice de atividade histoloacutegica
LE Lupus Eritematoso
LES Luacutepus eritematoso sistecircmico
MS Ministeacuterio da Sauacutede
mtDNA DNA mitrocondrial
NANBH Hepatite natildeo-A natildeo-B
NMT Nuacutecleo de Medicina Tropical
OMS Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede
PCR Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia
Rh Tipo sanguiacuteneo
RNA Aacutecido ribonucleacuteico
RT-PCR Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia-em tempo real
SAF Siacutendrome antifosfoliacutepide
SIDA Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida
SS Siacutendrome de Sjoumlgren
UFPA Universidade Federal do Paraacute
UV ultravioleta
VHA Viacuterus da Hepatite A
VHC Viacuterus da Hepatite C
VHCHCV Hepatite C
VV Hanseniacutease generalizada
SUMAacuteRIO 1 INTRODUCcedilAtildeO 15 11 HEPATITE C (VHCHCV) 15 111 Consideraccedilotildees Gerais 15 112 Agente Etioloacutegico 16 113 Epidemiologia 17 114 Modo de Transmissatildeo 18 115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica 19 116 Diagnoacutestico 23 12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC 25
13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC 26
14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE 27
15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES AGUDAS VIRAIS 31
16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN 32 2 JUSTIFICATIVA 39 21 ASPECTOS EacuteTICOS 39 3 OBJETIVOS 40
31 OBJETIVO GERAL 40
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 40 4 MATERIAL E MEacuteTODOS 41 41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO) 41 411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C 41 412 Grupo de natildeo infectados 41 42 MEacuteTODO 42 421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico 42 422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C 42 423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia
molecular 43
424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem) 45 425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas
HEp-2 46 43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 47 5 RESULTADOS 48 6 DISCUSSAtildeO 54 7 CONCLUSOtildeES 59 REFEREcircNCIAS 60 APEcircNDICES 67 ANEXOS 70
15
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 HEPATITE C (VHCHCV)
111 Consideraccedilotildees Gerais
As hepatites virais satildeo doenccedilas causadas por diferentes agentes
etioloacutegicos de distribuiccedilotildees universais que tecircm em comum o hepatotropismo
Possuem semelhanccedilas do ponto de vista cliacutenico-laboratorial mas apresentam
importantes diferenccedilas epidemioloacutegicas quanto agrave sua evoluccedilatildeo (FERREIRA
SILVEIRA 2004) Desde a descriccedilatildeo e definiccedilatildeo em 1989 (CHOO et al 1989 apud
RIBEIRO et al 2007) tornou-se evidente sua associaccedilatildeo com uma grande
variedade de manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas desordens reumaacuteticas e auto-imunes
(ALMEIDA 2010)
A infecccedilatildeo pelo VHCHCV acarreta inflamaccedilatildeo hepaacutetica e esteatose
podendo evoluir para fibrose hepaacutetica e cirrose em indiviacuteduos cronicamente
infectados estes com grande risco de desenvolvimento de carcinoma hepatocelular
(RIBEIRO et al 2007) Essas complicaccedilotildees tardias ocorrem em um periacuteodo em
geral superior a 20 anos apoacutes o iniacutecio da infecccedilatildeo A avaliaccedilatildeo filogeneacutetica das
sequumlecircncias do VHCHCV investigadas em vaacuterias regiotildees geograacuteficas sugere que
existam pelo menos seis genoacutetipos principais designados pelos nuacutemeros de 1 a 6 e
pelo menos 30 subtipos designados por letras minuacutesculas Nos Estados Unidos
prevalecem os genoacutetipos 1a (60) e 1b (20) Os tipos 5 e 6 satildeo mais encontrados
no sudeste e sul da Aacutefrica O tipo 4 eacute predominante na Aacutefrica Central e no Oriente
Meacutedio No Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b (63) e 3a (313) (BASSIT et
al 1999 apud RIBEIRO et al 2007) As informaccedilotildees sobre as causas que
determinam o curso evolutivo da doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos
progressos que haacute no campo do diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHCHCV Uma
questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo genoacutetipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de
lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o genoacutetipo 1 (1b) cursa com lesotildees
histoloacutegicas mais graves
As uacuteltimas deacutecadas foram de notaacuteveis conquistas no que se refere agrave
prevenccedilatildeo e ao controle das hepatites virais Entre as doenccedilas endecircmico-
epidecircmicas que representam problemas importantes de sauacutede puacuteblica no Brasil
16
salientam-se as Hepatites Virais cujo comportamento epidemioloacutegico no nosso paiacutes
e no mundo tem sofrido grandes mudanccedilas nos uacuteltimos anos
Antes da seleccedilatildeo rigorosa dos doadores de sangue em 1991 o
VHCHCV era a maior causa de hepatite poacutes-transfusional Atualmente permanece
como tal em casos esporaacutedicos (CONTE 2000) Os grupos considerados de risco
satildeo pessoas que receberam transfusatildeo de sangue antes de 1992 usuaacuterios de
drogas injetaacuteveis profissionais de sauacutede que lidam com sangue pacientes de
hemodiaacutelise e com menor risco pessoas tatuadas ou com piercings (CLEMENTE
ONO-NITA 2007)
A melhoria das condiccedilotildees de higiene e de saneamento das populaccedilotildees a
vacinaccedilatildeo contra a Hepatite B (HBV) e as novas teacutecnicas moleculares de diagnoacutestico
do viacuterus da Hepatite estatildeo entre esses avanccedilos importantes (BRASIL 2008)
112 Agente Etioloacutegico
O VHCHCV um viacuterus aacutecido ribonucleacuteico (RNA) da famiacutelia Flaviviridae
representa a principal causa da previamente denominada hepatite natildeo-A natildeo-B
(SANTOS 2009) Foi identificado e isolado a partir de um clone derivado de um
genoma NANBH semelhante aos togaviridae ou flaviviridae (SAADE 2008) e
visualizado a imunoeletromicroscopia como partiacutecula de 55 a 65 nm de diacircmetro
com projeccedilotildees espiculares e de morfologia muito semelhante aos flaviviridae Aleacutem
disso estas partiacuteculas reagiram especificamente com anticorpos mono e policlonais
do conteuacutedo proteacuteico do envelope do VHC (HIRANUMA et al 1994 apud CONTE
2000)
O agente etioloacutegico do HCV natildeo eacute uma partiacutecula homogecircnea e apresenta
uma taxa alta de mutaccedilatildeo levando-o a uma heterogeneicidade genocircmica cujo
resultado eacute um grande nuacutemero de genoacutetipos (1a 1b 2a 2b 3a 3b 4 5 6)
(AUGUSTO LOBATO 2003) Natildeo haacute evidecircncias de variantes natildeo patogecircnicas O
genoacutetipo 1b eacute o que apresenta maior virulecircncia e pior resposta ao tratamento
(LAUER WALKER 2001 apud SOUZA 2007) No Brasil dados obtidos a partir de
casos isolados e estudos de pequenas amostragens indicam que o genoacutetipo 1b
ocorre em cerca de 30 a 40 dos casos o 1a em cerca de 20 1a e 1b em 20
o 3a em cerca de 28 (FOCACCIA 2004)
17
113 Epidemiologia
De acordo com a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) a HCV eacute uma
questatildeo de sauacutede puacuteblica e tambeacutem a principal causa de transplante de fiacutegado no
Brasil (SOCIEDADE BRASILEIRA DE HEPATOLOGIA 2005) Eacute estimada uma
prevalecircncia em torno de 10 para a infecccedilatildeo pelo VHC na populaccedilatildeo mundial
(KILLEMBERG 2000) Nos Estados Unidos cerca de 27 milhotildees de pessoas estatildeo
infectadas pelo viacuterus (BRASIL 2006)
De acordo com Ferreira e Silveira (2004) no Brasil o nuacutemero de pacientes
infectados eacute incerto relacionado geralmente a alguns estados e municiacutepios e o
esclarecimento dos agentes causadores das hepatites cuja identificaccedilatildeo requer
teacutecnicas laboratoriais complexas de biologia molecular eacute realizado de maneira
insuficiente Por outro lado a progressiva integraccedilatildeo entre as instacircncias gestoras
dos programas de vigilacircncia e controle das doenccedilas com grupos de pesquisa e
desses com os serviccedilos (FERREIRA SILVEIRA 2004 p 473) e a disponibilidade
dos bancos de dados nacionais mais confiaacuteveis apontam para novos e melhores
caminhos (BRASIL 2005b)
A OMS alerta que o Paiacutes deve se preparar para uma ldquoexplosatildeordquo da
epidemia a partir de 2011 (BRASIL 2005b) Outra preocupaccedilatildeo eacute que as pessoas
que receberam sangue antes de 1992 tecircm mais chances de estarem infectadas na
eacutepoca o sangue destinado agraves transfusotildees natildeo era analisado para detecccedilatildeo da HCV
porque o viacuterus natildeo era conhecido e natildeo havia exames especiacuteficos (BRASIL 2005b)
A prevalecircncia da infecccedilatildeo nos doadores de sangue sadios varia de 001-002 no
Reino Unido e no norte da Europa 1-15 no sul da Europa 65 na Aacutefrica
equatorial e de ateacute 20 no Egito (CONTE 2000)
De acordo com a OMS a cada grupo de 50 pessoas no Brasil uma tem
hepatite e de dez portadores apenas um sabe (STRAUSS 2001) Satildeo dois milhotildees
de infectados no Paiacutes Denominada epidemia silenciosa calcula-se que 170 milhotildees
de indiviacuteduos no mundo estejam contaminados pelo viacuterus C a forma mais grave da
doenccedila Ainda de acordo com a OMS o nuacutemero de brasileiros viacutetimas da
enfermidade eacute bem maior do que o estimado pelo Ministeacuterio da Sauacutede (TRINDADE
2005)
18
Por ocasiatildeo da Conferecircncia Internacional de Consenso sobre HCV em Paris
(LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999) concluiu-se que a hepatite crocircnica por viacuterus
C eacute um problema grave de sauacutede puacuteblica sendo sua prevalecircncia mundial estimada
em 3 (de 01 a 5 segundo os vaacuterios paiacuteses) por tanto havendo no mundo
todo cerca de 150 milhotildees de portadores crocircnicos do VHCHCV 4 milhotildees nos EUA
e 5 milhotildees na Europa Ocidental Na Europa Oriental a prevalecircncia eacute maior ainda
114 Modo de Transmissatildeo
A HCV eacute transmitida pelo sangue Natildeo haacute comprovaccedilatildeo de contaacutegio por
meio de fluidos corporais como saliva suor laacutegrimas secircmen ou leite materno
Tambeacutem deixa de ocorrer por meio de abraccedilos beijos uso dos mesmos copos ou
roupas Especialistas afirmam que a contaminaccedilatildeo atraveacutes de relaccedilotildees sexuais eacute
possiacutevel mas rara Quando detectada de maneira precoce a enfermidade tem
tratamento inclusive gratuito aleacutem de cura (BRASIL 2006)
Dentre os fatores de risco para transmissatildeo outros aleacutem da transfusatildeo de
sangue o uso de drogas iliacutecitas o comportamento sexual de alto risco e variaacuteveis
socioeconocircmicas representadas pelo grau de escolaridade e renda familiar Natildeo foi
observada associaccedilatildeo entre o risco de infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas
designadas por gecircnero idade e raccedila (ALTER 2007) O risco de transmissatildeo sexual
do VHCHCV eacute miacutenimo A contaminaccedilatildeo intrafamilial natildeo-sexual eacute consideraacutevel
particularmente quando um dos enfermos tem hepatopatia grave e ou carga viral
elevada (risco 110) (CONTE 2000)
A praacutetica de tatuagem fornece dados conflitantes sabendo-se que os
liacutequidos usados para esterilizar os instrumentos usados satildeo ineficazes
Karmochkine et al (1998 apud CONTE 2000) observaram que
aproximadamente 80 dos pacientes contraem o viacuterus atraveacutes da toxicomania
intravenosa ou transfusotildees de sangue ou de derivados Os restantes meios de
transmissatildeo e de contaacutegio satildeo a hemodiaacutelise os transplantes de oacutergatildeos picadas
acidentais profissionais e transmissatildeo vertical matildee-crianccedila Em 20 a 40 dos
casos natildeo se consegue determinar o modo de contaminaccedilatildeo A transmissatildeo da
hepatite crocircnica por viacuterus C pode ser prevenida (KARMOCHKINE et al 1998 apud
CONTE 2000)
19
As duas fontes de contaminaccedilatildeo satildeo a toxicomania endovenosa e a
administraccedilatildeo de produtos de origem sanguumliacutenea Esta uacuteltima praticamente
eliminada desde 1991 com a introduccedilatildeo dos testes ELISA 2 na seleccedilatildeo
aprimorada de doadores de sangue (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998
apud CONTE 2000)
A transmissatildeo sexual eacute rara com menos de 3 em parceiros estaacuteveis e
ocorre principalmente em pessoas com muacuteltiplos parceiros e com praacutetica sexual de
risco (sem uso de preservativo) ndash para os indiviacuteduos com parceiros muacuteltiplos o uso
de preservativos eacute indicado (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998 apud
CONTE 2000)
A gravidez natildeo estaacute contra-indicada nas mulheres infectadas pelo
VHCHCV A transmissatildeo vertical matildee-crianccedila eacute rara (menor de 6) O tipo de parto
(natural ou cesaacuterea) natildeo tem influecircncia O aleitamento eacute permitido A transmissatildeo
nosocomial eacute prevenida eficazmente de modo convencional (KARMOCHKINE et
al 1998 apud CONTE 2000)
115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica
A infecccedilatildeo aguda pode passar clinicamente despercebida ou evoluir para
hepatite fulminante Aproximadamente 850 das pessoas infectadas agudamente
vatildeo desenvolver uma viremia persistente tornando-se dessa forma indiviacuteduos
infectados crocircnicos Depressatildeo irritabilidade dores no corpo mal-estar febre
naacuteuseas e falta de apetite satildeo alguns dos sintomas mais frequumlentes embora a
maioria dos casos natildeo apresente nenhum sintoma (ALTER 2007)
A cirrose eacute pouco observada em pessoas que apresentam niacuteveis
persistentemente baixos das transaminases mas a elevaccedilatildeo destas natildeo eacute
representativa do grau de fibrose hepaacutetica Dessa forma a bioacutepsia hepaacutetica
representa o melhor indicador do estaacutegio de evoluccedilatildeo da doenccedila uma vez que
gradua os componentes inflamatoacuterios e o estaacutegio de fibrose (AGMON-LEVIN et al
2009 BLOCK SCHIANO 1999)
Alter et al (1992) dizem que em 82 de 130 pacientes seguidos durante
muitos anos apoacutes surto agudo de hepatite natildeo-A natildeo-B apresentam anti-VHCHCV
ou VHCHCV RNA sendo que 62 deles desenvolveram hepatite crocircnica e
concluem que os pacientes que adquiriram HCV tiveram alto grau de hepatite
20
crocircnica sendo que o VHCHCV pode ser a maior causa de doenccedila crocircnica de fiacutegado
nos EUA e que na maioria dos pacientes a infecccedilatildeo pelo VHCHCV parece persistir
por muitos anos mesmo na ausecircncia de doenccedila hepaacutetica ativa
Almeida et al (1999) determinaram a prevalecircncia da infecccedilatildeo em
doadores de sangue assim como avaliaram o grau de comprometimento hepaacutetico
numa populaccedilatildeo de 37335 doadores durante o biecircnio 93-94 em Porto Alegre - RS
utilizando o teste anti-VHC ELISA 2 Selecionaram 60 deles para a biopsia hepaacutetica
com agulha de Menghini encontrando prevalecircncia de 174 com comprometimento
hepatico e 39 deles apresentavam cirrose hepaacutetica Sendo a hepatopatia crocircnica de
graus variaacuteveis observadas em 80 deles na sua grande maioria com lesotildees leves
e miacutenimas Foi observada forte associaccedilatildeo entre elevaccedilatildeo de alanina
aminotransferase (ALT) e a presenccedila de hepatopatia crocircnica embora a intensidade
desta elevaccedilatildeo natildeo se correlacione com a gravidade da lesatildeo histoloacutegica
Jaacute na experiecircncia de Mutimer et al (1995) cerca de 80 dos doadores
soro-positivos analisados exaustivamente inclusive com biopsia de fiacutegado
mostraram evidecircncias de alteraccedilotildees histoloacutegicas e ou viroloacutegicas de infecccedilatildeo
persistente sem no entanto atingir graus mais avanccedilados de hepatopatia crocircnica
quase todos permanecendo na categoria moderada
Nos paiacuteses industrializados a HCV eacute responsaacutevel por 20 dos casos de
hepatite aguda 70 dos casos de hepatite crocircnica 40 dos casos de cirrose
descompensada 60 dos carcinomas hepatocelulares e 30 dos transplantes
hepaacuteticos (LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999)
Cerca de 40 do total de pacientes curam-se ou tecircm doenccedila crocircnica de
natureza benigna Os restantes 60 cursam com atividade aumentada de
aminotransferase denotando evoluccedilatildeo crocircnica da doenccedila Dentre estes a maioria
tem lesotildees necro inflamatoacuterias discretas e fibrose miacutenima ou ausente O prognoacutestico
em longo prazo eacute mal conhecido no entanto provavelmente a maioria deles natildeo viraacute
a falecer da doenccedila hepaacutetica em curso Cerca de 20 deles depois de 10-20 anos
de evoluccedilatildeo desenvolveratildeo cirrose hepaacutetica passiacutevel de transplante Assim a
hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila que ocasiona a morte de um pequeno nuacutemero
de pacientes sem no entanto afetar a duraccedilatildeo da vida meacutedia da maioria deles
(CONTE 2000 FERREIRA SILVEIRA 2004)
Apoacutes infecccedilatildeo aguda somente 10 dos pacientes desenvolve doenccedila
cliacutenica com icteriacutecia A infecccedilatildeo sub-cliacutenica eacute a regra e assim passa despercebida
21
Cerca de 25 deles tecircm infecccedilatildeo crocircnica sintomaacutetica com aminotransferases
normais e lesotildees inflamatoacuterias histoloacutegicas miacutenimas (RESENDE et al 2010)
A remissatildeo espontacircnea acontece em cerca de 15 dos casos Na grande
minoria dos casos a progressatildeo da doenccedila aguda pode levar agrave insuficiecircncia
hepaacutetica aguda
Observaccedilotildees feitas pelo irlandecircs Kenny-Walsh (1999) comprovam a
natureza e a evoluccedilatildeo cliacutenica da afecccedilatildeo em causa O autor acompanhou durante 17
anos 376 mulheres que receberam injeccedilotildees de imunoglobulinas anti-D
contaminadas com VHC provenientes de doador uacutenico num programa de
isoimunizaccedilatildeo Rh Destas 81 apresentaram sintomatologia mais frequumlentemente
fadiga (66) ALT ligeiramente elevada (de 40 a 99 UL) em 47 e igual ou maior de
100 UL em 8 A biopsia hepaacutetica mostrou inflamaccedilatildeo em 98 delas na maioria
das vezes leves (41) e moderadas (52) fibrose presente em 51 no entanto
somente em sete pacientes (2) houve sinais de cirrose provaacutevel ou definitiva Em
uma delas havia acentuado alcoolismo
A hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila de evoluccedilatildeo variaacutevel De maneira
geral sua evoluccedilatildeo eacute lenta insidiosa e progressiva
Os pacientes que natildeo apresentam evidecircncias bioquiacutemicas de lesatildeo
hepaacutetica podem constituir em subgrupo de casos mais benignos no curso natural
da doenccedila Muitos co-fatores tecircm papel importante no desenvolvimento da cirrose
nesses pacientes como por exemplo a idade no momento da infecccedilatildeo (os
contaminados de idade mais avanccedilada tecircm evoluccedilatildeo mais raacutepida da doenccedila
enquanto que os mais jovens a tecircm mais lenta) o alcoolismo (eacute de consenso geral
que o abuso de aacutelcool favorece o aparecimento da cirrose) e a co-infecccedilatildeo com o
Viacuterus da Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida (SIDA) e da HVB
A incidecircncia anual de carcinoma hepatocelular (CHC) eacute de 1 a 4 nos
pacientes cirroacuteticos o que justifica plenamente o controle ecograacutefico do fiacutegado e a
dosagem seacuterica de alfa-fetoproteiacutena nesses pacientes a cada 1-2 anos Por outro
lado nos pacientes com hepatite crocircnica por viacuterus C sem cirrose o CHC eacute muito
raro (LOPES 2010)
Nos casos de cura a atividade das transaminases cessa e os viacuterus natildeo
satildeo detectados (VHC RNA) no soro Nos casos de cronificaccedilatildeo acontece o
contraacuterio ou seja as alteraccedilotildees bioquiacutemicas existem com flutuaccedilotildees e os viacuterus satildeo
detectaacuteveis na grande maioria dos casos Fazem exceccedilatildeo agravequeles pacientes com
22
viremia baixa que por isso mesmo fogem aos limites dos meacutetodos de detecccedilatildeo viral
ou devido agraves flutuaccedilotildees proacuteprias desses niacuteveis virecircmicos (HAYDON et al 1998)
Nos pacientes anti-VHC positivos com enzimas circulantes normais a
falta de VHC RNA no soro tem sido interpretada como sinal de cura completa No
entanto Haydon et al (1998) alteraram essa interpretaccedilatildeo Estes autores
demonstraram a presenccedila de VHC RNA no fiacutegado desses pacientes que eram
negativos no soro independente das alteraccedilotildees bioquiacutemicas positivas ou negativas
do soro ou seja mesmo naqueles casos anteriormente considerados como curados
Assim os niacuteveis de viacuterus intra-hepaacuteticos natildeo satildeo determinados pelos fatores
hospedeiro (idade modo e duraccedilatildeo da infecccedilatildeo) ou virais (VHC genoacutetipos) pois
mesmo as repetidamente Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia-em tempo real (RT-
PCR) negativos para VHC RNA no soro podem ter viacuterus da HCV albergados no
fiacutegado Entretanto existem limitaccedilotildees metodoloacutegicas que devem ser consideradas
nessa interpretaccedilatildeo como por exemplo as limitaccedilotildees do RIBA 3 e do RT-PCR
Mais importante eacute o seguimento dos pacientes ao longo do tempo Assim
Seef et al (1992) em 568 pacientes de hepatite poacutes-transfusional e dois grupos
controles pareados que receberam transfusotildees sem desenvolver hepatite apoacutes 18
anos de seguimento encontraram 33 de mortalidade no grupo 1 e 15 no grupo
controle sendo que a maioria das mortes ocorreu nos pacientes com alcoolismo
associado Evidenciando que a maioria dos que desenvolve doenccedila crocircnica o faz
muito lentamente
Existem ainda no curso natural da doenccedila flutuaccedilotildees intensas e muito
frequumlentes que dependem dos viacuterus e dos hospedeiros a saber niacuteveis da viremia
genoacutetipos 1b graus de diversidade geneacutetica dos viacuterus vias de transmissatildeo (os
inoculados via transfusatildeo apresentam lesotildees hepatocelulares mais ativas)
(GORDON et al 1993 GORDON BAYATI SILVERMAN 1998) deficiecircncias
imunes alcoolismo e co-infecccedilatildeo com HBV e delta ou o Viacuterus da imunodeficiecircncia
humana (HIV) (LOPES 2010) Nestes uacuteltimos casos a co-infecccedilatildeo com muacuteltiplos
viacuterus das hepatites estaacute associada com mais graves lesotildees histoloacutegicas do fiacutegado do
que nos casos de VHC isoladas
Importa saber se os resultados obtidos com os controles feitos se mantecircm
por longos periacuteodos Ou seja como exemplos a atividade da ALT persistentemente
normal a variabilidade do RT-PCR a detecccedilatildeo de VHC RNA pela teacutecnica Reaccedilatildeo
de polimerase em cadeia (PCR) que pode ser negativa devido agrave inadequada
23
armazenagem das amostras agrave contaminaccedilatildeo do soro com substacircncias que
interferem na leitura entre outras causas de erro
As informaccedilotildees sobre as causas que determinam o curso evolutivo da
doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos progressos havidos no campo do
diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHC Uma questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo
genotipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o
genotipo 1 (1b) cursa com lesotildees histoloacutegicas mais graves independentemente da
carga viral Ainda mais os VHC RNA negativos no soro mesmo apoacutes anos de
cura podem recair pois neles persistem os viacuterus no fiacutegado em regime de
replicaccedilatildeo muito baixa indetectaacutevel pelos meacutetodos atuais Ao contraacuterio os negativos
no soro e no fiacutegado tecircm demonstrado respostas boas e sustentadas inclusive no
sentido de se fazer prognoacutestico de cura real e verdadeira infelizmente na grande
minoria dos casos
116 Diagnoacutestico
Quanto mais cedo o diagnoacutestico maiores as chances de detectar a
doenccedila Por isso eacute importante que as pessoas faccedilam o exame especiacutefico porque soacute
esse exame eacute que detecta a HCV E as mulheres tecircm que ter uma atenccedilatildeo em
especial Tempos atraacutes o Correio Braziliense (2003) publicou uma grande mateacuteria
sobre a quantidade de mulheres que vecircm sendo infectadas com a HCV Cuja causa
estava na esterelizaccedilatildeo mal feita dos equipamentos das manicures Uma soluccedilatildeo
praacutetica eacute as mulheres terem seu proacuteprio material pra fazer as unhas e natildeo deixar
mais ningueacutem utilizar (nem matildee nem irmatilde etc) Bem e quem tiver passado por
transfusatildeo dentistas manicures operaccedilotildees etc deve fazer o exame
(KARMOCHKINE et al 1998 apud CONTE 2000 KEER et al 1997)
A HCV natildeo eacute como a Siacutendrome da Imunodeficiecircncia Adquirida (AIDS)
que possui drogas com grande tecnologia e o doente pode viver por muitos e muitos
anos Com a HCV o paciente soacute tem chance de ficar bem se a doenccedila for
diagnosticada e tratada antes dela se manifestar Atualmente o tratamento usa uma
associaccedilatildeo de duas drogas ndash o Interferon e a Ribavirina ldquoAs chances de cura em
meacutedia satildeo de 50rdquo
Barbaro et al (1999) verificaram que os pacientes VHC genoacutetipos 1b
frequumlentemente apresentavam alteraccedilotildees ultraestruturais das mitococircndrias com
24
depleccedilatildeo do mtDNA podendo comprometer o processo de fosforilizaccedilatildeo oxidativa
Sendo assim a produccedilatildeo aumentada de radicais livres nos pacientes VHC genoacutetipos
1b poderia atuar de modo negativo na evoluccedilatildeo da doenccedila hepaacutetica aumentando o
efeito citopaacuteticos do VHC Nesses pacientes haveria portanto aumento de
hiperoxidaccedilatildeo com consequumlente resistecircncia agrave accedilatildeo dos interferons e pior evoluccedilatildeo
da doenccedila hepaacutetica A ser confirmado este fato novas estrateacutegias terapecircuticas
poderatildeo vir a ser desenvolvidas no combate a essa doenccedila
Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila
poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses
autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis
vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo
hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja
quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a
concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave
hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em
parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)
Dos fatos acima expostos decorrem implicaccedilotildees tais como as respostas
CD8-CTL aos antiacutegenos VHC restritas aos complexos de histocompatibilidade
principais (MHC I) com inibiccedilatildeo ou mesmo insuficiente produccedilatildeo de complexo
peptiacutedeo VHC-MHC inibiccedilatildeo direta das ceacutelulas CTLK e a falta de resposta as
citoquininas entre outras dos vaacuterios mecanismos de escape existentes Dentro
desse contexto o niacutevel de morte celular natildeo seria alcanccedilado e a lesatildeo hepatocelular
consequumlente seria portanto miacutenima
Outra implicaccedilatildeo resultante consiste na induccedilatildeo de resposta imune
celular T Helper mediadas a partir de peptide vacinas contra o VHC Estas novas
vacinas tecircm a capacidade de gerar linfoacutecitos T citotoacutexico os CTLs contra o VHC em
camundongo imunizados com peptiacutedeos CTL e ceacutelulas HT epiacutetomes do core VHC
Esses estudos recente em animais de laboratoacuterio vecircm progredindo rapidamente
esperando-se em breve novos recursos no tratamento dessa doenccedila (AGNELLO et
al 1998)
25
12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC
O VHC constitui-se em uma famiacutelia heterogecircnea de viacuterus com no miacutenimo
seis genoacutetipos e inuacutemeros subtipos (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT
SANTOS SILVA 1999) Embora o meacutetodo de maior acuraacutecia para a determinaccedilatildeo
do genoacutetipo do VHC seja a identificaccedilatildeo completa da sequumlecircncia dos 9500
nucleotiacutedeos e a construccedilatildeo de uma aacutervore filogeneacutetica esse meacutetodo soacute pode ser
utilizado em laboratoacuterios de pesquisa (BARBOSA SILVA MARTINS 2005) e natildeo
em laboratoacuterios cliacutenicos Assim foram desenvolvidos meacutetodos para genotipagem
utilizando apenas as regiotildees mais conservadas do genoma como a proteiacutena do
envoltoacuterio (E1) a proteiacutena core e a proteiacutena natildeo estrutural NS5B A sequumlecircncia dos
nucleotiacutedeos dentro dessas regiotildees relativamente conservadas eacute genoacutetipo-
especiacutefico e os isolados podem ser genotipados independentemente da regiatildeo que
for utilizada para anaacutelise (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS
SILVA 1999) Para uso em laboratoacuterios cliacutenicos foram desenvolvidas basicamente
duas metodologias que se valem de teacutecnicas de biologia molecular (genotipagem)
ou citoloacutegicas (serotipagem)
Os meacutetodos que adotam teacutecnica de biologia molecular para genotipagem
utilizando porccedilotildees do genoma incluem a PCR aninhada (nested PCR) (BASSIT
SANTOS SILVA 1999) a teacutecnica de restriction fragment length polymorphism
(RFLP) (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS SILVA 1999) a
hibridizaccedilatildeo reversa (BASSIT SANTOS SILVA 1999) (INNO-LiPA Innogenetics
Beacutelgica Gen Eti DEIA HCV Sorin Biomedica Itaacutelia) e o sequumlenciamento direto da
regiatildeo natildeo-codificante 5 (TruGene Visible Genetics Canadaacute) Suas principais
vantagens satildeo a informaccedilatildeo direta sobre sequumlecircncia dos nucleotiacutedeos do genoma
viral a alta sensibilidade por se basearem na PCR e a possibilidade de identificar o
subtipo viral (BARBOSA SILVA MARTINS 2005)
Os meacutetodos para determinaccedilatildeo do genoacutetipo que utilizam serotipagem
baseiam-se na detecccedilatildeo de anticorpos genoacutetipos-especiacuteficos contra epiacutetopos do
VHC (por exemplo proteiacutenas da regiatildeo do core) (BLOCK SCHIANO 1999) Os
testes comercializados utilizam diferentes teacutecnicas ELISA competitivos ou
immunoblot (Murex-HC1-6 Murex Diagnostics Ltd Reino Unido RIBA HCV
Serotyping Assay Chiron Diagnostics Estados Unidos) As principais vantagens da
teacutecnica de serotipagem satildeo o baixo custo e maior facilidade de realizaccedilatildeo em
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comparaccedilatildeo com os testes de biologia molecular (BLOCK SCHIANO 1999 De
LARANAGA et al 2000)
A determinaccedilatildeo do genoacutetipo anteriormente utilizada em pesquisas mas
sem maior utilidade na praacutetica meacutedica atualmente eacute recomendada para uso cliacutenico
Como jaacute mencionado os pacientes infectados pelo genoacutetipo 1 do VHC devem ser
tratados por 12 meses enquanto os demais por 6 meses (BASSIT SANTOS SILVA
1999)
A determinaccedilatildeo do genoacutetipo do VHC pode ser feita por PCR ou
serotipagem A primeira teacutecnica eacute mais sensiacutevel e possibilita a identificaccedilatildeo de
subtipos do VHC Contudo a segunda eacute de mais faacutecil realizaccedilatildeo e mais barata
razatildeo pela que eacute importante que a teacutecnica seja aprimorada
Oliveira et al (1999) investigaram os padrotildees de distribuiccedilatildeo dos
genoacutetipos do VHC estudando 250 pacientes anti-VHC positivos atraveacutes da
detecccedilatildeo VHC RNA pelo RT-PCR e encontraram prevalecircncia de 72 para o VHC 1
253 para o tipo 3 2 para o 2 e 07 para o 4 semelhantes aos das vaacuterias
regiotildees mundiais
13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC
As manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo pelo VHC satildeo as mais
variadas possiacuteveis A diversidade de resposta do hospedeiro ao agente infeccioso
variando desde quadros assintomaacuteticos ateacute aqueles com evoluccedilatildeo grave fatal ou
incapacitante tem estimulado a busca por justificativas de tais discrepacircncias
cliacutenicas sobretudo na imunomodulaccedilatildeo Dentre as infecccedilotildees mais bem estudadas
destacam-se aquelas pelos Viacuterus da hepatite C Viacuterus da imunodeficiecircncia humana1
(HIV-1) pelo Herpes viacuterus humano 4 (viacuterus do Epstein Baar) e pelo Mycobacterium
leprae (ABBAS LICHTMAN 2005)
A agressatildeo hepaacutetica por auto-imunidade eacute um fenocircmeno reconhecido em
vaacuterias doenccedilas do fiacutegado inclusive nas de etiologia viral Aleacutem do agente agressor e
de sua interaccedilatildeo com o sistema imunoloacutegico do hospedeiro fatores ambientais ou
hormonais estatildeo aparentemente envolvidos no surgimento de auto-imunidade
hepaacutetica como se supotildee acontecer na hepatite auto-imune em indiviacuteduos
geneticamente suscetiacuteveis (CODES et al 2002)
27
A lesatildeo hepatocelular relacionada agrave infecccedilatildeo pelos viacuterus hepatotroacutepicos e
pelos herpes viacuterus (citomegaloviacuterus e Epstein-Barr) eacute secundaacuteria a uma resposta
auto-imune do hospedeiro Estes viacuterus natildeo parecem ser diretamente citopaacuteticos
mas desencadeiam lesatildeo hepaacutetica atraveacutes da resposta imune do hospedeiro contra
ceacutelulas hepaacuteticas infectadas (MALOY POWRIE 2001)
Existem estudos que focalizam alteraccedilotildees imunoloacutegicas em hepatites
virais entretanto a maioria deles mostra resultados pontuais sem seguimento na
fase aguda da doenccedila (BLOCK SCHIANO 1999 McFARLONE et al 1990) Aleacutem
disso ainda natildeo se estabeleceu uma associaccedilatildeo entre as reaccedilotildees auto-imunes
transitoacuterias induzidas por viroses hepatotroacutepicas e agravamento do dano tecidual na
hepatite viral
A infecccedilatildeo crocircnica estaacute fortemente associada agrave crioglobulinemia mista
essencial glomerulonefrite membrano-proliferativa e porfiria cutacircnea tardia De
forma menos impressiva encontra-se tambeacutem associada agrave uacutelcera corneana de
Mooren liacutequen plano e fibrose pulmonar (KILLENBERG 2000 WENER et al 1996)
A ocorrecircncia de anticorpos antitireoidianos e hipotireoidismo tem sido relatada em
associaccedilatildeo com a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC em mulheres (KILLENBERG 2000
CACOUB et al 1999)
A associaccedilatildeo entre a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC a presenccedila do fator
reumatoacuteide e do anticorpo antinuclear (FAN) o fenocircmeno de Raynaud e doenccedilas
difusas do tecido conjuntivo (DDTC) como artrite reumatoacuteide luacutepus eritematoso
sistecircmico siacutendrome de Sjoumlgren e vasculites sistecircmicas eacute relatada em alguns
trabalhos (CACOUB et al 1999 LOVY STARKEBAUM UBEROI 1996 STAUB
1998 WENER et al 1996)
14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE
A associaccedilatildeo entre doenccedilas infecciosas e autoimunidade apresentando-
se com manifestaccedilotildees cliacutenicas ou detectadas apenas pelo desenvolvimento de auto-
anticorpos tem sido amplamente documentado Infecccedilotildees virais bacterianas e
parasitaacuterias podem estar envolvidas no desenvolvimento recidivas e ateacute mesmo na
prevenccedilatildeo de doenccedilas auto-imunes (KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)
Ribeiro e Proietti (2004) avaliaram a frequumlecircncia de FR anticorpos
antipeptiacutedeo citrulinado ciacuteclico (anti-CCP) AAN anticorpos anti-citoplasma de
28
neutroacutefilos (ANCA) anticorpos anticardiolipina (aCL) e anticorpos anti-β2
glicoproteiacutena I (anti-β2GPI) em pacientes com hanseniacutease Existe estudo
demonstrando pacientes que apresentavam manifestaccedilotildees articulares comparados
aos que natildeo apresentavam envolvimento articular e um grupo controle de indiviacuteduos
saudaacuteveis com idade e gecircnero semelhantes aos dos pacientes estudados e que
residiam na mesma aacuterea geograacutefica A maioria dos pacientes nos dois grupos (com
e sem envolvimento articular) apresentava hanseniacutease generalizada Entretanto
observaram uma baixa frequumlecircncia que natildeo foi significativamente diferente de FR
anti-CCP AAN e ANCA em pacientes com hanseniacutease (nos dois grupos) e normal
dos controles Mas a prevalecircncia de anticorpos aCL e anti-β2GPI estava
significativamente elevada nos pacientes com hanseniacutease quando comparados com
o grupo controle apesar de natildeo haver associaccedilatildeo significativa com o envolvimento
articular O isoacutetopo predominante dos dois autoanticorpos foi a IgM (487) dos
pacientes com hanseniacutease apresentava pelo menos um anticorpo antifosfoliacutepide
Aleacutem disso os autores observaram uma associaccedilatildeo entre a positividade para aCL e
as manifestaccedilotildees cliacutenicas jaacute que os pacientes com anticorpos aCL apresentavam
doenccedila Hanseniacutease generalizada (VV) com mais frequumlecircncia (p= 0002) Natildeo houve
associaccedilatildeo entre a presenccedila de anticorpos aCL ou anti-β2GPI e episoacutedios
reacionais poreacutem entre os pacientes com esses episoacutedios aqueles com anticorpos
aCL apresentavam eritema nodoso hansecircnico (ENH) em 100 dos casos enquanto
entre os pacientes negativos para aCL 57 apresentavam ENH Apesar de uma
alta taxa de concordacircncia para a presenccedila de anticorpos aCL e anti-β2GPI ter sido
observada manifestaccedilotildees tromboemboacutelicas natildeo foram observadas (RIBEIRO
PROIETTI 2004 2005)
Horimoto e Costa (2009) avaliaram pacientes com Leishmania
(leishmaniose visceral e leishmaniose cutacircnea) para a presenccedila de anticorpos anti-
Leishmania assim como FR AAN anti-DNA anti-Sm anti-RNP anti-Ro anti-La
aCL e complemento (C3 e C4) Como esperado os pacientes com leishmaniose
visceral apresentava anticorpos anti-Leishmania Tiacutetulos significativamente elevados
de AANs na maioria dos pacientes o anti-DNA foi detectado em poucos pacientes
com doenccedila visceral assim como tiacutetulos elevados de anticorpos aCL (isotipo IgG)
quando comparados com os pacientes com leishmaniose cutacircnea Niacuteveis reduzidos
de complemento tambeacutem satildeo evidentes na doenccedila visceral assim como niacuteveis
significativamente reduzidos de C3 Outros estudos comparam e discutem os
29
resultados em relaccedilatildeo agrave crescente evidecircncia na literatura da presenccedila de
autoanticorpos em ambas as doenccedilas Em geral a prevalecircncia variaacutevel de auto-
anticorpos relatada assim como relatos preacutevios na literatura podem estar
relacionados a diferenccedilas metodoloacutegicas como o tipo de ensaio utilizado a
definiccedilatildeo dos pontos de corte inativaccedilatildeo dos soros pelo calor seleccedilatildeo de pacientes
e variaccedilotildees eacutetnicas e geograacuteficas nos grupos de pacientes Mas um dos resultados
consistentes foi a frequumlecircncia significativamente mais elevada de anticorpos
antifosfoliacutepide aCL e anti-β2GPI em pacientes com hanseniacutease enquanto
anticorpos AAN e aCL foram detectados com mais frequumlecircncia nos pacientes com
leishmaniose visceral A incidecircncia aumentada de anticorpos AAN e aCL nos
pacientes com leishmaniose visceral eacute compatiacutevel com outros estudos (OSSADRON
et al 2006 SAKKAS et al 2008 VOULGARI et al 2004) e demonstra
semelhanccedilas das manifestaccedilotildees cliacutenicas e laboratoriais entre a leishmaniose
visceral e o luacutepus eritematoso sistecircmico (LES) Aleacutem disso a reatividade cruzada
entre AAN e anticorpos anti-Leishmania jaacute foi tambeacutem relatada (GRANEL et al
2000)
Diversos grupos documentaram niacuteveis elevados de anticorpos
antifosfoliacutepide (aCL anti-β2GPI e anti-protrombina) em diversas doenccedilas
infecciosas como a siacutefilis doenccedilas virais (incluindo a hepatite C Parvoviacuterus B19 e
HIV) malaacuteria e hanseniacutease sem as manifestaccedilotildees cliacutenicas da siacutendrome
antifosfoliacutepide (SAF) (ZANDMAN-GODDARD BLANK SHOENFELD 2002) Os
tiacutetulos elevados geralmente satildeo transitoacuterios diminuindo e desaparecendo apoacutes a
resoluccedilatildeo da infecccedilatildeo (LOIZOU et al 2003 ZANDMAN-GODDARD BLANK
SHOENFELD 2002) Mas em uma minoria dos pacientes a associaccedilatildeo entre
doenccedilas infecciosas e anticorpos antifosfoliacutepide pode levar a complicaccedilotildees severas
frequumlentemente fatais ou seja SAF catastroacutefica (ZANDMAN-GODDARD BLANK
SHOENFELD 2002)
Os resultados de Ribeiro e Proietti (2005) mostrando um aumento da
incidecircncia de anticorpos anti-β2-GPI em pacientes com hanseniacutease associados aos
dados de outros grupos (De LARANAGA et al 2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK
et al 1994 LOIZOU et al 2003) que tambeacutem documentaram niacuteveis elevados de
anticorpos anti-2βGPI lanccedilam duacutevidas sobre a noccedilatildeo de que os anticorpos aCL
associados a infecccedilotildees satildeo independentes dos anticorpos anti-β2GPI e natildeo
dependentes desses anticorpos como nas doenccedilas auto-imunes Em conjunto
30
esses resultados apoacuteiam a noccedilatildeo de que na presenccedila de infecccedilotildees anticorpos aCL
satildeo heterogecircneos em relaccedilatildeo agrave sua dependecircncia da 2GPI (De LARANAGA et al
2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK et al 1994 LOIZOU et al 2003) e as infecccedilotildees
podem desencadear a induccedilatildeo de anticorpos antifosfoliacutepide patogecircnicos em
indiviacuteduos predispostos (LOIZOU et al 2003)
A produccedilatildeo de autoanticorpos na hanseniacutease e leishmaniose pode ser
explicada por diversos mecanismos Na forma mais generalizada dessas doenccedilas
(hanseniacutease VV e leishmaniose visceral) os pacientes apresentam
hipergamaglobulinemia difusa semelhante agrave vista em outras infecccedilotildees como
Schistosoma mansoni T cruzi e Plasmodium A induccedilatildeo de autoanticorpos pode ser
atribuiacuteda agrave ativaccedilatildeo policlonal e proliferaccedilatildeo das ceacutelulas B algumas com auto-
reatividade pertencentes agrave biblioteca de anticorpos naturais em indiviacuteduos normais
(ARGOV et al 1989) Na leishmaniose antiacutegenos soluacuteveis derivados da L major e
L donovani satildeo mitogecircnicos e desencadeiam a produccedilatildeo de imunoglobulinas com
auto-reatividade (ARGOV et al 1989) Crioglobulinemia mista induzida pelo HCV eacute
outro exemplo de ativaccedilatildeo policlonal persistente levando a uma mistura de
autoanticorpos policlonais e monoclonais os quais causam doenccedilas auto-imunes
(AGMON-LEVIN et al 2009)
Mimetismo molecular ou homologias estruturais entre infecccedilotildees e
componentes do hospedeiro podem ser agrave base da produccedilatildeo de autoanticorpos
como no caso da febre reumaacutetica onde o componente M da membrana do
estreptococo apresenta homologia com peptiacutedeos cardiacuteacos cerebrais e sinoviais A
associaccedilatildeo da siacutendrome de Guillain-Barreacute com a infecccedilatildeo pelo Campylobacter
jejeuni representa outro exemplo de mimetismo molecular como base de uma
manifestaccedilatildeo auto-imune A reatividade cruzada entre agentes infecciosos e auto-
antiacutegenos jaacute foi demonstrada para o M leprae (McADAM MUDD SHOENFELD
1984) e M tuberculosis (SHOENFELD et al 1986) e a inibiccedilatildeo de anticorpos anti-
Sm anti-RNP e anti-SSB por promastigotas intactas de Leishmania apoacuteia a
homologia entre antiacutegenos nucleares e a Leishmania (ARGOV et al 1989)
A disseminaccedilatildeo de epiacutetopos a emergecircncia de novos anticorpos ou a
resposta de ceacutelulas T a um novo epiacutetopo (subdominante ou criacuteptico) no mesmo
antiacutegeno ou em outro antiacutegeno foi demonstrada em modelos experimentais e na
doenccedila humana alguns autores demonstraram a disseminaccedilatildeo molecular do
antiacutegeno Sm para reatividade anti-RNP (STAUB 1998) no LES enquanto na febre
31
reumaacutetica o estado de autoimunidade crocircnica que afeta as vaacutelvulas cardiacuteacas pode
resultar em uma resposta imunoloacutegica contra o colaacutegeno e laminina (KIVITY et al
2009 PORDEUS et al 2008) As infecccedilotildees tambeacutem podem desempenhar um papel
importante na induccedilatildeo da autoimunidade atraveacutes da liberaccedilatildeo de antiacutegenos
sequumlestrados apoacutes lesatildeo tecidual ou aumentando a exibiccedilatildeo de epiacutetopos criacutepticos
no meio inflamatoacuterio apresentando assim novos antiacutegenos ao sistema imunoloacutegico
(KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)
15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES
AGUDAS VIRAIS
O conceito de auto-imunidade induzida por viacuterus natildeo eacute exclusivo para
doenccedilas hepaacuteticas O viacuterus Coxsackie do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um
terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite infecciosa e estaacute implicado nas miocardites
auto-imunes reagindo contra a miosina cardiacuteaca (GIST BELL 1974) Niwa et al
(1984) encontraram elevaccedilatildeo transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator
reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas
virais comuns como varicela sarampo influenza caxumba herpes zoster e
exantema suacutebito
A patogecircnia da infecccedilatildeo viral inclui pelo menos trecircs tipos de interaccedilotildees
com o hospedeiro vertebrado 1) o efeito do agente sobre as ceacutelulas 2) a maneira
de disseminaccedilatildeo do agente no organismo infectado 3) a resposta imunoloacutegica e a
sua influencia no processo infeccioso Destacam-se dois tipos principais da
interaccedilatildeo a destruiccedilatildeo celular e a resposta imunoloacutegica (FIGUEIREDO 1999
CATALAN-SOARES PROIETTI CARNEIRO-PROIETTI 2006) O viacuterus Coxsackie
do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite
infecciosa e estaacute implicado nas miocardites auto-imunes reagindo contra a miosina
cardiacuteaca (GERSHON KONDO 1971) Niwa et al (1984) encontraram elevaccedilatildeo
transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo
anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas virais comuns como varicela sarampo
influenza caxumba herpes zoster e exantema suacutebito
32
16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN
De acordo com o II Consenso Brasileiro de FAN em HEp 2
(DELLAVANCE et al 2003) os AAN satildeo encontrados comumente em uma
variedade de doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Satildeo uacuteteis na investigaccedilatildeo dessas
doenccedilas auxiliando no diagnoacutestico de patologias como LES esclerose sistecircmica
progressiva (ESP) doenccedila mista do tecido conjuntivo (DMTC) siacutendrome de Sjoumlgren
(SS) polimiosite e dermatomiosite
Eles podem estar presentes em um pequeno percentual da populaccedilatildeo
aparentemente sadia essa frequumlecircncia eacute maior em mulheres e aumenta com a idade
Segundo a literatura a positividade entre 20 a 60 anos varia entre percentuais mais
altos (133) para tiacutetulos baixos e mais baixos (33) para tiacutetulos mais elevados
(DELLAVANCE et al 2003)
A pesquisa dos anticorpos antinucleares pode ser realizada por diferentes
teacutecnicas a imunofluorescecircncia indireta eacute a mais utilizada por sua sensibilidade
reprodutibilidade e facilidade de execuccedilatildeo A sensibilidade aumenta
significativamente quando se utiliza como substrato lacircminas com ceacutelulas Hep 2
(ceacutelulas de carcinoma de laringe humana) por causa da maior expressatildeo de
antiacutegenos na superfiacutecie dessas ceacutelulas comparados aos expressos nas ceacutelulas de
fiacutegado ou de rins de camundongos que se utilizavam anteriormente
Em geral eacute possiacutevel detectar melhor a presenccedila de AAN por associaccedilatildeo
de trecircs anti-soros isotipos especiacuteficos (anti-IgG anti-IgA e anti-IgM) A pesquisa
realizada por essa teacutecnica serve de triagem inicial para a presenccedila de AAN Eacute
normalmente denominada pesquisa de FAN ou AAN
A realizaccedilatildeo de outras metodologias tais como as imunoenzimaacuteticas
permite uma avaliaccedilatildeo isolada dos diferentes auto-anticorpos sugeridos pelos
padrotildees de fluorescecircncia encontrados no FAN A identificaccedilatildeo desses AAN permite
um diagnoacutestico mais preciso e eles podem ser utilizados em muitos casos como
marcador para uma das diferentes doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Muitas dessas
patologias apresentam um perfil distinto de auto-anticorpos que auxilia o diagnoacutestico
A presenccedila de FAN positivo em pessoas aparentemente sadias pode ser
devida a algumas situaccedilotildees
minus Doenccedila auto-imune precoce ainda natildeo expressa clinicamente
33
minus distuacuterbio imunoloacutegico transitoacuterio causado por doenccedila natildeo-imune
tais como infecccedilotildees principalmente virais
minus uso de medicamentos e neoplasias
minus manifestaccedilatildeo incompleta de uma siacutendrome ou seja o paciente
sintetiza o anticorpo poreacutem esse quadro natildeo evolui para doenccedila
minus fenocircmeno auto-imune fisioloacutegico
O resultado do FAN eacute expresso em tiacutetulo e padratildeo uma vez que ambos
os paracircmetros tecircm importacircncia para a avaliaccedilatildeo do significado cliacutenico do exame O
tiacutetulo do FAN corresponde agrave maior diluiccedilatildeo capaz de demonstrar fluorescecircncia
inequiacutevoca e didaticamente pode ser dividido em
minus Baixo menor 180
minus Moderado 1160
minus Moderadamente elevado 1320
minus Alto maior 1640
Nas pesquisas realizadas por imunofluorescecircncia indireta os resultados
satildeo expressos em tiacutetulos segundo as diluiccedilotildees empregadas Eacute possiacutevel trabalhar
utilizando-se como limite tiacutetulos de 140 que permitem maior sensibilidade ou de
180 que permitem maior especificidade ou seja um menor nuacutemero de falso-
positivos
Na praacutetica cliacutenica satildeo considerados significativos tiacutetulos superiores a
1160 Os resultados com tiacutetulos positivos satildeo acompanhados pela descriccedilatildeo do
padratildeo de fluorescecircncia encontrado que serve como orientaccedilatildeo da presenccedila de um
antiacutegeno especiacutefico e em alguns casos como padratildeo diagnoacutestico Em determinadas
situaccedilotildees em especial no LES em atividade pode ocorrer agrave observaccedilatildeo de mais de
um padratildeo de fluorescecircncia
O padratildeo do FAN a seu turno aponta uma probabilidade maior ou menor
de doenccedila auto-imune e ateacute mesmo sugere o antiacutegeno nuclear envolvido e por
consequumlecircncia a afecccedilatildeo com ele mais relacionada Os padrotildees homogecircneo
centromeacuterico e pontilhado grosso satildeo os mais indicativos de processos de
autoimunidade uma vez que se associam a diversas condiccedilotildees reumaacuteticas
especialmente ao LES e agrave esclerose sistecircmica e tambeacutem a enfermidades hepaacuteticas
tais como a cirrose biliar primaacuteria e a hepatite auto-imune (KILLENBERG 2000)
34
Jaacute o pontilhado fino o pontilhado grosso reticulado e a membrana nuclear
tecircm maior significado quando encontrados em tiacutetulos altos uma vez que podem
estar presentes em tiacutetulos baixos em indiviacuteduos hiacutegidos Por sua vez o pontilhado
fino denso mesmo quando elevado em pessoas assintomaacuteticas soacute guarda relaccedilatildeo
com alguma doenccedila em cerca de 20 dos casos (DELLAVANCE et al 2003)
O padratildeo pontilhado pode tambeacutem ser referido como padratildeo salpicado
Outros padrotildees de fluorescecircncia podem ser encontrados em menor frequumlecircncia Os
pontilhados citoplasmaacutetico grossos ou reticulares associados agrave presenccedila de
anticorpos antimitococircndrias em pacientes com cirrose biliar primaacuteria o
citoplasmaacutetico homogecircneo relacionado a proteiacutenas ribossocircmicas em pacientes com
LES e o padratildeo pontilhado fino citoplasmaacutetico que pode estar associado agrave
presenccedila de anticorpos anti-JO-1 anti-PCNA e proteiacutenas da membrana celular em
pacientes com LES outras patologias do tecido conjuntivo e hepatopatias auto-
imunes (DELLAVANCE et al 2003)
Quadro 1 - Padrotildees de fluorescecircncia encontrados em maior frequumlecircncia e patologias relacionadas
Padrotildees de Fluorececircncia Antiacutegenos Patologias Relacionadas
Perifeacuterico DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES
Homogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA
LES AR lupus induzido por drogas
Perifeacutericohomogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES
Pontilhado grosso SM RNP LES DMTC
Pontilhado fino nuclear SS-A (RO) SS-B (La) SS LES
Nucleolar Proteiacutenas Nucleolares ESP Centromeacuterico Proteiacutenas de centrocircmeros Siacutendrome de CREST
Fonte Dellavance et al 2003 Quadro 2 - Anti-ena - auto-anticorpos contra antiacutegenos extraiacutedos do nuacutecleo e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleares Patologias Relacionadas SM LES RNP DMTC LES ESP AR e Polimiosite
SS-A (Ro) SS LES lupus neonatal e forma cutacircnea subaguda
SS-B (La) SS LES luacutepus neonatal e forma cutacircnea subaguda
Scl 70 ESP Jo -1 Polimiosite e dermatomiosite Fonte Dellavance et al 2003
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Quadro 3 ndash Padrotildees de FAN nuclear e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes
Padrotildees Nucleares Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos
Nuclear Pontilhado Centromeacuterico Anticorpo anti-centrocircmero Esclerose Sistecircmica forma CREST Cirrose Biliar Primaacuteria
Nuclear homogecircneo Anticorpo anti-DNA nativo Lupus Eritematoso Sistecircmico (LES) Anticorpo anti-Histoma LES induzido por drogas LES idiopaacutetico Anticorpo anti-cromatina (DNAHistona Nucleossomo) Artrite Reumatoacuteide (AR) Artrite Idiopaacutetica Juvenil importante associaccedilatildeo com uveiacutete na forma oligoarticular Siacutendrome de Felty Cirrose Billar Primaacuteria
Nuclear tipo membrana nuclear contiacutenua Anticorpo anti-Iamin e contra envelope nuclear - Iamins Hepatites auto-imunes Raramente associado a doenccedilas reumaacuteticas (algumas formas de LES e esclerodermia linear)
Nuclear pontilhado pleomoacuterficoPCNA Anticorpo contra nuacutecleo de ceacutelulas em proliferaccedilatildeo LES
Nuclear pontilhado fino denso Anticorpo anti-proteina p 75 kDa pode ser encontrado em indiviacuteduos saudaacuteveis processos inflamatoacuterios inespeciacuteficos doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Cistite Intersticial Dermatite Atoacutepica Psoriacutease e Asma
Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos
Anticorpo anti-p80 coilina natildeo apresenta associaccedilatildeo cliacutenica definida
Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos
Anticorpo anti-Sp100 (anti-p95) Cirrose Biliar Primaacuteria pode ocorrer em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas
Nuclear pontilhado grosso Anticorpo anti-Sm LES Anticorpo anti-RNP criteacuterio obrigatoacuterio no diagnostico da doenccedila mista do Tecido conjuntivo (DMTC) tambeacutem ocorre no LES Esclerose Sistecircmica (ES) e AR
Nuclear pontilhado fino Anticorpo anti SSARo Siacutendrome de Sjogren Primaacuteria (SS) LES Lupus neonatal e Lupus Cutacircneo Subagudo Anticorpo anti-SSBLa Lupus neonatal LES SS Anticorpo anti-Mi-2 Dermatomiosite embora raramente ocorra na polimiosite do adulto
Fonte Dellavance et al 2003
36
Quadro 4 - Padrotildees de FAN citoplasmaacuteticos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes
Padrotildees Citoplasmaacuteticos e Relacionados ao Aparelho Mitoacutetico Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos
Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina Hepatite auto-imune Cirrose Anticorpo anti-miosine Hepatite C Hepatocarcionoma Miastenia Gravis Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida
Citoplasmaacutetico Fibrilar Segmentar Anti actinina anti--vinculina e anti-tropomiose Miastenia Gravis Doenccedila de Crohn e Colite ulcerativa Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia cliacutenica definida
Citoplasmaacutetico Pontilhado Polar Anticorpo Anti-golginas (cisternas do aparelho de Golgi) raro no LES SS e outras doenccedilas auto-imunes sistecircmicas Relato na Ataxia Cerebelar Idiopaacutetica Degeneraccedilatildeo Cerebelar Paraneoplaacutesica infecccedilotildees virais pelo Epstein Barr (EBV) e pelo viacuterus da imunodeficiecircncia Humana (HIV) Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida
Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Anticorpo anti-Histidill t RNA sintetase (Jo-1) anticorpo marcador de Polimiosite no adulto Descrito raramente na Dermatomiosite
Citoplasmaacutetico Pontilhado com Pontos Isolados
Anticorpo anti-EEA1 e anti-fosfatidilserina natildeo haacute associaccedilotildees clinicas bem definida Anticorpo anti-GWBSS tambeacutem encontrado em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas
Citoplasmaacutetico Pontilhado Reticulado Anticorpo anti-mitococircndria Cirrose Biliar Primaacuteria Esclerose Sistecircmica Eacute relativamente comum o encontro deste padratildeo na ausecircncia de anticorpos anti-mitococircndria
Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Denso Anti PL7PL12 Raramente associado a Polimiosite Anticorpo P-ribossomal Este padratildeo ocorre no LES se a associaccedilatildeo eacute com anti-proteina P ribossomal
Citoplasmaacutetico Fibrilar Filamentar Anticorpo anti-vimentina e anti-queratina Anti-queratina eacute o anticorpo mais importante em doenccedila hepaacutetica alcooacutelica Descritos em vaacuterias doenccedilas inflamatoacuterias e infecciosas Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida
Aparelho mitoacutetico Tipo Centriacuteolo Anticorpo anti-enolase em baixos tiacutetulos natildeo tem associaccedilatildeo cliacutenica definida Em altos tiacutetulos eacute sugestivo de Esclerose Sistecircmica
Aparelho mitoacutetico Tipo ponte Intercelular
Anticorpo anti Tubulina Pode ser encontrado no LES e na DMTC outros anticorpos ainda natildeo bem definidos podem gerar o mesmo padratildeo
Aparelho mitoacutetico Tipo NuMa2 Anticorpo anti-HsEg5 diversas condiccedilotildees auto-imunes com baixa especificidade
Fonte Dellavance et al 2003
37
Quadro 5 - Padrotildees de FAN mistos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Mistos Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos
Misto do tipo nucleolar homogecircneo e nuclear pontilhado grosso com placa metafaacutesica decorada em anel (cromossomos negativos)
Anticorpo anti-Ku Superposiccedilatildeo Polimiose e Esclerose Sistecircmica Podem ocorrer no LES e Esclerodermia
Misto do tipo nuclear e nucleolar pontilhado com placa metafaacutesica positiva
Anticorpo anti-topoisomerase (Scl-70) ES forma difusa Mais raramente pode ocorrer na Siacutendrome CREST e superposiccedilatildeo PolimiositeEsclerodermia
Misto do tipo Citoplasmaacutetico pontilhado fino denso e homogecircneo e nucleolar homogecircneo
Anticorpo anti rRNP LES frequumlentemente relacionado agrave Psicose Luacutepica
Misto do tipo nuclear pontilhado fino com fluorescecircncia do aparelho mitoacutetico
Anticorpo anti-NuMA1SS pode ocorrer tambeacutem em outras condiccedilotildees auto-imunes ou inflamatoacuterias crocircnicas
Fonte Dellavance et al 2003
Quadro 6 - Padrotildees de FAN nucleolares e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleolares Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos
Nucleolar Aglomerado
Anticorpo anti-Fibrilarina (U3-nRNP) Esclerose Sistecircmica (ES) especialmente com comprometimento visceral grave entre eles a hipertensatildeo pulmonar
Nucleolar Pontilhado
Anticorpo anti-NOR-90 ES tambeacutem descrito em outras doenccedilas do tecido conjuntivo poreacutem sem relevacircncia clinica definida Anticorpos anti-RNA polimerase I ES de forma difusa com tendecircncia para comprometimento visceral mais frequumlente e grave
Nucleolar Homogecircneo
Anticorpo anti-PMScl Siacutendrome de Superposiccedilatildeo de Polimiosite com Esclerose Sistecircmica Raramente encontrado em casos de Polimiosite ou Esclerose Sistecircmica sem superposiccedilatildeo cliacutenica Outros auto-anticorpos mais raros podem apresentar esse padratildeo
Fonte Dellavance et al 2003
De acordo com o 3deg Consenso (DELLAVANCE et al 2009) foram
comunicados dois novos padrotildees de fluorescecircncia por participantes Vaacuterios outros
membros testemunharam jaacute haver observado esses padrotildees O primeiro trata-se de
um padratildeo nuclear pontilhado fino aproximando-se da textura homogecircnea e com
placa metafaacutesica corada da mesma forma Sua associaccedilatildeo cliacutenica e identidade
imunoloacutegica natildeo estatildeo definidas Sua importacircncia deriva do fato de que pode ser
facilmente confundido com o padratildeo pontilhado fino denso e com o padratildeo
homogecircneo O segundo trata-se de um padratildeo citoplasmaacutetico em forma de
pequenos bastotildees (rods) e ciacuterculos (rings) que aparentemente estaacute associado agrave
38
infecccedilatildeo pelo HCV Haacute estudos em curso por alguns grupos de pesquisa com a
finalidade de estabelecer sua identidade imunoloacutegica
Como ainda natildeo estatildeo definitivamente caracterizados esses dois novos
padrotildees foram considerados preliminares e o 3deg Consenso recomendou que os
mesmos fossem completamente caracterizados e apresentados na proacutexima versatildeo
do Consenso (DELLAVANCE et al 2009)
39
2 JUSTIFICATIVA
As inflamaccedilotildees do fiacutegado provocadas pelos viacuterus hepatotroacutepicos atingem
milhotildees de pessoas e representam significativos problemas de sauacutede puacuteblica em
todo o mundo No Brasil a Regiatildeo Norte responde por um significativo percentual
dos portadores de hepatite C Dentre as manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo
pelo viacuterus C as doenccedilas autoimunes tecircm significativo impacto na evoluccedilatildeo cliacutenica
desses pacientes A presenccedila de anticorpo antinuacutecleo eacute um marcador importante de
autoimunidade e apesar de existirem trabalhos relatando a pesquisa desse fator em
portadores de viacuterus C tais estudos ainda natildeo foram realizados na nossa regiatildeo
sobretudo correlacionando-se com o genoacutetipo do viacuterus responsaacutevel pela infecccedilatildeo
considerando que o genoacutetipo eacute um marcador de resposta ao tratamento ou
considerando que pacientes portadores do genoacutetipo 1 natildeo respondem
satisfatoriamente ao tratamento instituiacutedo pelo protocolo atual
21 ASPECTOS EacuteTICOS
A pesquisa a ser realizada apresenta relevacircncia social e natildeo perde o
sentido de sua destinaccedilatildeo soacutecio-humanitaacuteria (justiccedila e equidade)
Este trabalho adequa-se aos princiacutepios cientiacuteficos que o justificam e
apresenta possibilidade concreta de responder a incertezas tais como FAN e o
genoacutetipo viral em pacientes com infecccedilatildeo pelo viacuterus da hepatite C ldquoestatildeo
relacionadosrdquo
Segue rigorosamente os procedimentos descritos na Resoluccedilatildeo 19696-
CNSMS (BRASIL 1996) assegurando a confidenciabilidade e proteccedilatildeo da
identidade do sujeito da pesquisa no momento da afericcedilatildeo dos dados e sua
posterior utilizaccedilatildeo
Por tratar-se de um estudo que faraacute somente revisatildeo de soroteca os
participantes natildeo seratildeo submetidos a riscos de origem orgacircnica eou quiacutemica
40
3 OBJETIVOS
31 OBJETIVO GERAL
Estabelecer associaccedilatildeo entre a presenccedila de teste de FAN e o genoacutetipo
viral em pacientes portadores de infecccedilatildeo pelo HCV
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
I Identificar o padratildeo de fluorescecircncia do FAN em pacientes com diagnoacutestico
laboratorial de infecccedilatildeo pelo HCV
II Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados
pelo HCV de acordo com o gecircnero e a idade
III Identificar a prevalecircncia de FAN em pacientes infectados pelo HCV e natildeo
infectados
IV Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados
pelo HCV de acordo com as alteraccedilotildees bioquiacutemicas
41
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO)
Foi realizado um estudo transversal analiacutetico no Serviccedilo do Nuacutecleo de
Medicina Tropical da Universidade Federal do Paraacute (NMTUFPA) utilizando-se
pacientes oriundos da Fundaccedilatildeo Centro de Hemoterapia e Hematologia do Paraacute
(HEMOPA) e Plano de Assistecircncia ao Servidor (PASIASEP) com coleta de material
bioloacutegico para reconfirmaccedilatildeo do diagnoacutestico de hepatite C no periacuteodo de janeiro de
2009 a maio de 2010
411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C
A populaccedilatildeo de estudo consistiu de 51 pacientes admitidos no NMTUFPA
para reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica tratamento cliacutenico e acompanhamento ambulatorial
de ambos os gecircneros e independente da idade sem exclusatildeo dos pacientes com a
presenccedila de patologias associadas agrave condiccedilatildeo maior (motivadora da pesquisa)
oriundos da Fundaccedilatildeo HEMOPA e PAS
A amostra do grupo foi selecionada a partir da relaccedilatildeo dos prontuaacuterios
catalogados no laboratoacuterio de patologia do NMTUFPA
Os dados foram coletados atraveacutes dos resultados dos exames realizados
no soro de cada paciente O protocolo de coleta teve enfoque na identificaccedilatildeo
individual do paciente bem como a avaliaccedilatildeo cliacutenica dos resultados
412 Grupo de natildeo infectados
Foi utilizado um grupo controle de 100 amostras de soro de indiviacuteduos
doadores de sangue com sorologias negativas para HIV 1 e 2 HTLV 1 e 2 Siacutefilis
Doenccedilas de Chagas Hepatite B e para Hepatite C procedentes da fundaccedilatildeo
HEMOPA
42
42 MEacuteTODO
421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico
Foram colhidos em frasco sem anticoagulante 10ml de sangue perifeacuterico
dos 51 pacientes participantes da pesquisa A amostra sanguiacutenea de cada paciente
foi centrifugada o soro foi separado e colocado em frasco esteacuteril devidamente
identificado armazenado e resfriado de 2 a 8ordmC
Foi realizada no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais a
pesquisa soroloacutegica de anticorpos IgG anti-HCV por teste imunoenzimaacutetico (ELISA)
e os pacientes que apresentaram positividade tiveram seus resultados confirmados
atraveacutes de teacutecnicas moleculares (RT-PCR) e com identificaccedilatildeo do genoacutetipo viral
(genotipagem)
Foi realizado no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa a pesquisa
de FAN dos 51 pacientes selecionados utilizando as amostras existentes na
soroteca
422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C
Foram empregados testes soroloacutegicos de ELISA (Ensaio
Imunoenzimaacutetico) de 3ordf geraccedilatildeo utilizando-se de kits comerciais (kit ETI-AB-HCVK-
4 DiaSorin Itaacutelia) para detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos anti-HCV no soro dos
pacientes
As tiras (poccedilos) necessaacuterias para as reaccedilotildees foram retiradas da geladeira
com antecedecircncia de uma hora e deixadas agrave temperatura ambiente e os reagentes
homogeneizados rapidamente no voacutertex
O primeiro poccedilo da placa ficou o branco da reaccedilatildeo na sequecircncia da
microplaca de ELISA foi dispensado 200 microL do controle negativo em triplicata (trecircs
poccedilos) 200 microL do calibrador em duplicata (dois poccedilos) e 200 microL do controle positivo
em amostra uacutenica (um poccedilo)
Adicionou-se 200 microL do Diluente de Amostra em todos os poccedilos que
continham as amostras dos pacientes a serem dosadas na placa de ELISA
tomando cuidado para natildeo contaminar os poccedilos adjacentes
43
Dispensou-se 50 microL do Diluente do Reagente em todos os poccedilos de
controles calibradores e amostras cobrimos com adesivo para evitar evaporaccedilatildeo e
contaminaccedilatildeo das amostras e incubamos a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC
Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com
300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem diluiacuteda
Pipetou-se 100 microL de Conjugado Enzimaacutetico exceto no poccedilo do branco e
incubou-se a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se
cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com 300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem
diluiacuteda
Pipetou-se 100 microL de CromoacutegenoSubstrato em todos os poccedilos
Incubamos a microplaca protegendo-a de luz intensa e direta agrave temperatura
ambiente (18-24ordmC) por 15 min
Pipetou-se 100 microL de Aacutecido Sulfuacuterico em todos os poccedilos para ldquopararrdquo a
reaccedilatildeo enzimaacutetica e mediu-se a absorbacircncia da soluccedilatildeo obtida em leitor de ELISA
com filtro de 450 nM
O teste foi validado de acordo com os valores do controle de qualidade
preconizados pelo fabricante e que devem tanger os valores para o branco da
reaccedilatildeo le 0100 controle negativo le 0050 controle positivo ge 1000 e calibrador ge
1100 Para as amostras testadas os valores reagentes e natildeo reagentes para
pesquisa de anticorpos anti-HCV satildeo interpretados da seguinte maneira natildeo
reagentes com valores le 09 reagentes com valores ge 11 e indeterminados entre
os valores 09 ndash 11
423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia molecular
Nas amostras positivas pela sorologia (ELISA) realizou-se extraccedilatildeo do
RNA viral presente no soro do paciente utilizando kit comercial (QIAmp Viral RNA
kit Quiagen Alemanha) seguindo a teacutecnica adaptada no Laboratoacuterio de Patologia
Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais
Pipetou-se 560 microL de tampatildeo AVL (lise) contendo RNA em tubo de
centriacutefuga de 15 ml identificado adicionou-se 140 microL da amostra e homogenizou-se
em voacutertex por 15s incubando a temperatura ambiente (15-25degC) por 10 min Apoacutes
incubaccedilatildeo centrifugou-se rapidamente o tubo para remover partiacuteculas dispersas
44
Adicionou-se 560 microL de etanol (96-100) na amostra e homogenizou-se
no voacutertex por 15s centrifugando-se rapidamente para remover partiacuteculas dispersas
Depois cuidadosamente transferiu-se 630 microL para as colunas devidamente
identificadas centrifugou-se a 14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo
ficando soacute com a coluna para encaixar em outro tubo
Colocou-se o resto das amostras nas colunas devidas centrifugou-se a
14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo ficando soacute com a coluna para
encaixar em outro tubo Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW1) e
centrifugou-se por 1 min mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo
Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW2) e centrifugou-se por 4 min
mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo
Identificados os tubos para RNA colocou-se as colunas Adicionou-se 60
microL de tampatildeo para eluir (AVE) em cada amostra e centrifugou-se por 1 min
descartando a coluna e ficando com o tubo Colocou-se em banho-maria por 10 min
a 65degC centrifugado rapidamente e colocado no gelo As amostras extraiacutedas foram
congeladas e armazenadas em freezer a -20ordmC
O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado de acordo com a teacutecnica de
RT-PCR qualitativa com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das
Doenccedilas Tropicais da seguinte maneira para o Mix de uma amostra Tampatildeo 12
microL primer ou iniciador k10 1microL primer ou iniciador k11 1microL aacutegua ultrapura livre de
DNAse e RNAse 5 microL Enzima Taq polymerase One-Step (Invitrogen) 1 microL O
primer k10 constitui-se da sequecircncia GGC GAC ACT CCA CCA TRR e o primer k11
da sequecircncia GGT GCA CGG TCT ACG AGA CC
O volume do mix por amostra eacute de 20 microL e o volume da amostra (produto
da extraccedilatildeo) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As amostras
foram colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo eacute realizada a 42ordmC por 45 minutos
temperatura inicial de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 2 minutos seguida de 35 ciclos com
temperatura de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 54ordmC por 30
segundos de extensatildeo a 72ordmC por 45 segundos e temperatura de extensatildeo final de
72ordmC por 7 minutos e um hold de 4ordmC
Para visualizaccedilatildeo do produto dessa 1ordf PCR (RT-PCR) eacute feito um gel de
agarose a 1 (1g de agarose para 100mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de
etidium) que migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os
resultados foram visualizados atraveacutes de luz ultravioleta (UV) Os pacientes
45
positivos que apresentarem ldquobandardquo devem continuar os procedimentos e os
negativos que natildeo apresentarem ldquobandasrdquo deveratildeo ser liberados como
indetectaacuteveis por este meacutetodo
A 2ordf PCR (RFLP) foi responsaacutevel por fazer a amplificaccedilatildeo do cDNA
produto da 1ordf PCR Para esta etapa tambeacutem com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio
de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais foram necessaacuterios para o Mix de uma
amostra Tampatildeo 10X 25 microL DNTP 4 microL MgCl2 15 microL primer ou iniciador k15 1
microL primer ou iniciador k16 1 microL aacutegua ultrapura livre de DNAse e RNAse 125 microL
Enzima Taq platinum (Invitrogen) 05 microL O primer k15 constitui-se da sequecircncia
ACC ATR RAT CAC TCC CCT GT e o primer k16 da sequecircncia CAA GCA CCC TAT
CAG GCA GT
O volume do mix por amostra foi de 23 microL e o volume da amostra
(produto da 1ordf PCR) de 2 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As
amostras satildeo colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo se realiza a temperatura inicial
de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 4 minutos seguida de 35 ciclos com temperatura de
desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 55ordmC por 45 segundos de
extensatildeo a 72ordmC por 1 minuto e temperatura de extensatildeo final de 72ordmC por 7
minutos e um hold de 4ordmC
O produto da 2ordf PCR eacute observado atraveacutes de um gel de agarose a 1 (1g
de agarose para 100 mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que
migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os resultados
foram visualizados atraveacutes de luz UV (ultravioleta) Os pacientes positivos que
apresentaram ldquobandardquo (fragmento amplificado) se continuou os procedimentos e os
negativos que natildeo apresentaram ldquobandasrdquo foram repetidos para o procedimento da
2ordf PCR
424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem)
Os pacientes positivos para a 2ordf PCR foram submetidos agrave genotipagem
do viacuterus atraveacutes do meacutetodo de RFLP utilizando um par de enzimas de restriccedilatildeo
AVA II e RSA I Essa teacutecnica tambeacutem foi adaptada no Laboratoacuterio de Patologia
Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais
46
Na determinaccedilatildeo do genoacutetipo cada amostra eacute utilizada duas vezes
sendo uma reaccedilatildeo para AVA II e uma para RSA I portanto cada amostra teve dois
tubos correspondentes
Para a preparaccedilatildeo do mix de uma amostra para a enzima de restriccedilatildeo
AVA II (Promega) foram utilizados Buffer C X 30 2 microL aacutegua ultrapura livre de
DNAse e RNAse 125 microL AVA II 05 microL Para o mix de uma amostra de RSA I
(Invitrogen) satildeo necessaacuterios React 1 10X 2 microL aacutegua ultrapura libre de DNAse e
RNAse 11 microL RSA I 2 microL
O volume do mix por amostra foi de 15 microL e o volume da amostra
(produto da 2ordf PCR) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 20 microL para
cada frasco correspondente a sua enzima de restriccedilatildeo As amostras formatildeo ldquoparesrdquo
de tubos AVA II e RSA I e satildeo colocadas em banho-maria a 37ordmC overnight para
digerir (cortar) os fragmentos
Para visualizaccedilatildeo do produto da digestatildeo (RFLP) e verificaccedilatildeo dos
genoacutetipos foi preparado um gel de agarose a 2 (2g de agarose para 100 mL de
tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que migrou em cuba de eletroforese
com 100V 500A por 60 minutos Os resultados foram visualizados atraveacutes de luz UV
(ultravioleta) Os pacientes positivos apresentam ldquobandasrdquo (fragmentos) de
tamanhos diferentes O nuacutemero de bandas e sua disposiccedilatildeo no gel formaram
padrotildees de combinaccedilotildees correspondentes a cada genoacutetipo viral
425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas HEp-2
A pesquisa de auto-anticorpo contra antiacutegenos celulares foi realizada no
Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa pela teacutecnica de imunofluorescecircncia
indireta que os identifica atraveacutes da ligaccedilatildeo destes auto-anticorpos aos antiacutegenos do
substrato sendo esta ligaccedilatildeo revelada pela adiccedilatildeo de um soro com atividade Anti-
IgG conjugado agrave fluoresceiacutena
As amostras foram testadas utilizando-se um conjunto diagnoacutestico
comercial Antinuclear Antibody HEp-2 da Hemagen Diagnostics
Na primeira fase da reaccedilatildeo os soros diluiacutedos 140 colocados em contato
com o substrato durante 20 minutos seguido de lavagem com soluccedilatildeo salina
tamponada por 10 minutos Na segunda fase aplicacou-se a substacircncia
47
fluorescente sendo o conjugado diluiacutedo 130 deixando-se por 10 minutos seguida
de nova lavagem de 10 minutos e montagem da lacircmina com glicerina tamponada
Em cada lacircmina foram utilizados controle positivo e controle negativo
A leitura das lacircminas foi realizada em microscoacutepio de imunofluorescecircncia
marca Nikon modelo Eclipse E-200
Os criteacuterios morfoloacutegicos observados durante a leitura foram
a) aspecto da matriz nuclear
b) aspecto do nucleacuteolo
c) observaccedilatildeo de todos os estaacutegios de divisatildeo nuclear
d) aspecto do fuso mitoacutetico
e) aspecto do citoplasma
43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados coletados foram estruturados em um banco de dados no qual
tambeacutem foram confeccionadas tabelas e graacuteficos para representaccedilatildeo dos dados
Posteriormente foram analisados no programa Bioestat 50 para a geraccedilatildeo de
resultados estatiacutesticos que comprovassem a associaccedilatildeo de variaacuteveis pertinentes ao
estudo considerando o intervalo de confianccedila (IC) 95 e niacutevel α 5 (p-valor le 005)
isto eacute um achado seraacute considerado estatisticamente significante se valor de ldquoprdquo for
menor ou igual a 005 e seraacute considerado sem significacircncia estatiacutestica se esse valor
de ldquoprdquo for maior que 005
Nas variaacuteveis quantitativas foram realizadas as medidas de tendecircncia
central sendo calculado a meacutedia e a mediana com seus respectivos desvios
padrotildees O teste t foi usado para comparar as idades entre as amostras
O teste do Qui-quadrado e o teste G foram aplicados nas comparaccedilotildees de
n amostras independentes cujas proporccedilotildees observadas nas diversas modalidades
estiveram dispostas em tabelas de contigecircncia l x c onde se determinou as
proporccedilotildees observadas nas diferentes categorias e se estas tinham alguma
associaccedilatildeo
48
5 RESULTADOS
O Padratildeo de FAN em 100 dos 51 pacientes infectados pelo HCV e em
2 dos natildeo infectados pelo HCV ocorreu Citoplasmaacutetico
Com relaccedilatildeo agrave distribuiccedilatildeo dos pacientes por gecircnero observou-se uma
predominacircncia do gecircnero masculino (667) A faixa etaacuteria predominante foi a de 30
a 50 anos de idade (628) seguida da faixa etaacuteria compreendida entre 51 e 60
anos (196) No que diz respeito agrave naturalidade houve uma predominacircncia de
paraenses em 922 da amostra A maioria dos pacientes incluiacutedos no estudo foi
proveniente da Fundaccedilatildeo HEMOPA (98) por se tratarem de candidatos a doaccedilatildeo
de sangue (Tabela 1)
Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV segundo as caracteriacutesticas demograacuteficas janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Caracteriacutesticas demograacuteficas n Teste estatiacutestico Gecircnero
Masculino 34 667 Qui-quadrado Feminino 17 333 p = 00251
Total 51 1000
Idade (anos) lt 30 6 118 Qui-quadrado
30 a 40 16 314 p = 00094 41 a 50 16 314 51 a 60 10 196
gt 60 3 59 Total 51 1000
Naturalidade
Paraense 47 922 Qui-quadrado Macapaense 1 20 p lt 00001 Maranhense 1 20
Pernambucano 1 20 Gauacutecho 1 20
Total 51 1000
Procedecircncia Qui-quadrado HEMOPA 50 980 p lt 00001
IASEP 1 20 Total 51 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
49
Identificou-se no estudo a predominacircncia do genoacutetipo viral do tipo 1
(882) estando o genoacutetipo 3 presente em 118 dos casos Em 255 dos
pacientes foi observado uma positividade para FAN sendo que todos apresentaram
o padratildeo citoplasmaacutetico (Tabela 2)
Tabela 2 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV conforme os resultados laboratoriais de FAN citoplasmaacutetico e genotipagem janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Exames laboratoriais n Teste estatiacutestico
Genoacutetipo viral - HCV
Tipo 1 45 882 Qui-quadrado
Tipo3 6 118 p lt 00001
Total 51 1000
FAN Qui-quadrado
Positivo (citoplasmaacutetico) 13 255 p = 00008
Negativo 38 745 Total 51 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
Observou-se uma baixa positividade para o FAN tanto no gecircnero
masculino (294) quanto no gecircnero feminino (176) Natildeo houve diferenccedila
estatiacutestica significante entre os gecircneros e a anaacutelise do FAN (p = 05652) Isto eacute
independendo do gecircnero do paciente nada se poderaacute inferir se o mesmo teraacute maior
ou menor chance de possuir um FAN positivo ou negativo (Tabela 3)
Tabela 3 ndash Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
FAN (citoplasmaacutetico)
Gecircnero Teste estatiacutestico
(Teste G) Masculino Feminino
N N
Positivo 10 294 3 176
Negativo 24 706 14 824 p = 05652
Total 34 1000 17 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
Dentre os pacientes infectados o genoacutetipo viral tipo 1 e o tipo 3
predominaram no gecircnero masculino embora natildeo havendo diferenccedila significativa
entre os grupos (p=06376)(Tabela 4)
50
Tabela 4 - Relaccedilatildeo da genotipagem de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Gecircnero
Grupos estudados Teste estatiacutestico
(Teste G) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3
n n Masculino 29 644 5 833 p=06376 Feminino 16 356 1 167
Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa
Na faixa etaacuteria de 30 a 50 anos foi observada uma maior proporccedilatildeo (667)
do genoacutetipo viral do tipo 3 enquanto que para o genoacutetipo tipo 1 foi de 628 natildeo
tendo essa diferenccedila significacircncia estatiacutestica (Tabela 5)
Tabela 5 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e faixa etaacuteria - janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)
Idade (anos) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n
lt 30 04 118 0 00
30 a 40 15 314 3 500 p = 06401
41 a 50 15 314 1 167
51 a 60 08 196 2 333
gt 60 03 59 0 00 Total 45 1000 6 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
A anaacutelise descritiva das idades dos pacientes demonstrou que a meacutedia e
a mediana foi de 43 anos para aqueles com genoacutetipo viral tipo 1 no entanto para o
genoacutetipo viral tipo 3 a meacutedia foi de 44 e a mediana de 42 anos Observou-se que a
idade miacutenima dos pacientes com genoacutetipo viral-HCV do tipo 1 e 3 foi
respectivamente de 20 e 32 anos e a maacutexima foi de 68 e 57 anos perfazendo uma
amplitude total de 48 e 25 anos respectivamente Natildeo houve significacircncia estatiacutestica
entre as idades encontradas nos genoacutetipos 1 e 3 (Tabela 6 )
De acordo com o FAN citoplasmaacutetico a idade miacutenima dos pacientes com
FAN positivo e negativo foi respectivamente de 30 e 20 anos e a maacutexima foi de 53 e
68 anos perfazendo uma amplitude total de 23 e 48 anos respectivamente As
idades meacutedia e mediana foram respectivamente 435 e 46 anos nos pacientes com
o FAN positivo e meacutedia de 43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN
51
negativo Natildeo houve diferenccedila estatisticamente significativa entre as idades
encontradas nos pacientes com FAN positivo e negativo (Tabela 6)
Tabela 6 - Estudo descritivo da idade dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e presenccedila do FAN citoplasmaacutetico janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Grupos Estudados Genoacutetipo viral - HCV Auto anticorpo
Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 FAN (+) FAN (-) IDADE
Tamanho da amostra 45 6 13 38
Idade miacutenima 20 32 30 20
Idade maacutexima 68 57 53 68
Amplitude Total 48 25 23 48
Meacutedia Aritmeacutetica 43 44 435 43
Mediana 43 42 46 42
Desvio Padratildeo 107 93 78 113
Teste t p = 08363 p = 08809 Fonte Protocolo da pesquisa
Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos em que foram analisados AST
ALT ASTALT γ-GT e fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo
semelhantes dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e 3 natildeo
atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos
(Tabela 7)
Tabela 7- Distribuiccedilatildeo dos genoacutetipos dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Paracircmetros bioquiacutemicos
Genoacutetipo viral - HCV Teste estatiacutestico
(Teste t) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3
micro plusmn DP micro plusmn DP
AST 353 plusmn 219 328 plusmn 137 p = 07907
ALT 372 plusmn 321 288 plusmn 136 p = 05355
ASTALT 12 plusmn 07 14 plusmn 11 p = 06110
γ-GT 403 plusmn 38 302 plusmn 138 p = 02194
Fosfatase alcalina 1126 plusmn 443 1087 plusmn 376 p = 08349
Fonte Protocolo da pesquisa
Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos de AST ALT ASTALT γ-GT e
fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os
52
pacientes com FAN positivo e negativo natildeo sendo observada significacircncia
estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos de FAN (Tabela 8)
Tabela 8 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Paracircmetros bioquiacutemicos Auto anticorpos
Teste estatiacutestico (Teste t) Positivo Negativo
micro plusmn DP micro plusmn DP
AST 419 plusmn 238 326 plusmn 197 p = 01704
ALT 408 plusmn 29 346 plusmn 312 p = 05347
ASTALT 13 plusmn 08 12 plusmn 07 p = 05732
γ-GT 34 plusmn 21 409 plusmn 40 p = 04369
Fosfatase alcalina 1073 plusmn 345 1138 plusmn 462 p = 06431 Fonte Protocolo da pesquisa
Na comparaccedilatildeo entre resultados positivos e negativos do FAN
citoplasmaacutetico observou-se uma maior prevalecircncia da negatividade tanto em
pacientes natildeo infectados (98) como em pacientes infectados (745) pelo HCV
sendo essa diferenccedila estatisticamente significativa (plt00001) o que representa
uma natildeo associaccedilatildeo entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV
(Tabela 9)
Tabela 9 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico segundo a presenccedila ou ausecircncia de infecccedilatildeo por HCV janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
FAN (citoplasmaacutetico)
Pacientes Teste estatiacutestico (Teste G)
Infectados Natildeo infectados
N n
Positivo 13 255 2 2
Negativo 38 745 98 98 p lt 00001
Total 51 1000 100 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
Comparando-se os resultados do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos
viras observa-se que o resultado negativo eacute superior ao positivo em ambos os
genoacutetipos virais sendo 711 para o genoacutetipo viral 1 e 100 para o genoacutetipo viral 3
No entanto esta diferenccedila observada natildeo eacute estatisticamente significativa (p=02573)
(Tabela 10)
53
Tabela 10 - Distribuiccedilatildeo do FAN de acordo com o genoacutetipo viral janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
FAN (citoplasmaacutetico)
Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)
Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n
Positivo 13 289 0 00 p=02573 Negativo 32 711 6 1000
Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa
54
6 DISCUSSAtildeO
Desde o primeiro marcador soroloacutegico para diagnoacutestico do Lupus
Eritematoso Sistecircmico (LES) a ceacutelula LE descrita por Hargraves (1948) vaacuterios
substratos antigecircnicos foram utilizados para o estudo dos auto-anticorpos os quais
terminaram amplamente substituiacutedos pelas ceacutelulas HEp-2 Estas apresentam
significativas vantagens sobre os demais pela sua sensibilidade variedade de
antiacutegenos presentes e pelas facilidades morfoloacutegicas para o seu estudo
O uso da imunofluorescecircncia indireta para a visualizaccedilatildeo dos anticorpos
antinucleares nas ceacutelulas HEp-2 permite o reconhecimento de mais de 30 diferentes
padrotildees de fluorescecircncia como nucleares nucleolares da membrana nuclear do
aparelho mitoacutetico e citoplasmaacutetico todos satildeo proporcionados por diferentes auto-
anticorpos
A partir do 1deg Consenso Brasileiro para Padronizaccedilatildeo dos Laudos de FAN
(HEp-2) os criteacuterios para o preparo interpretaccedilatildeo da fluorescecircncia e nomenclatura
dos resultados passaram a ser normatizados Alguns padrotildees de fluorescecircncia satildeo
relativamente inespeciacuteficos outros satildeo ocasionados por uma gama restrita de auto-
anticorpos e outros ainda por um uacutenico auto-anticorpo (DELLAVANCE et al
2002) Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a tornaacute-las
imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo (DE
LARANAGA et al 2000)
Apesar do padratildeo de fluorescecircncia na maioria das vezes natildeo se pode
identificar o anticorpo presente ele pode sugerir ao cliacutenico qual o proacuteximo passo a
ser dado na investigaccedilatildeo da sua especificidade Os resultados encontrados devem
estar em associaccedilatildeo com a cliacutenica os padrotildees de fluorescecircncia e os tiacutetulos
alcanccedilados com a diluiccedilatildeo preacutevia (DELLAVANCE et al 2003)
No presente estudo a analise de 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo Viacuterus da
Hepatite C esteve presente o anticorpo-antinuclear (ANA FAN) em 13 (255) dos
pacientes e todos eram padratildeo citoplasmaacutetico corroborando com outros estudos
encontrados na literatura como
Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de
pacientes infectados pelo viacuterus HIV com Hanseniacutease e co-infectados com
Hanseniacutease HIV Ela obteve respectivamente as seguintes taxas de prevalecircncias
32 333 e 478 Em todos os grupos neste estudo houve predomiacutenio do
55
padratildeo citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear soacute foi observado entre os pacientes com
hanseniacutease (91) e co-infectados (237)
Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de
pacientes infectados pelo viacuterus da Dengue e viacuterus linfotroacutepico de ceacutelulas T humanas
HTLV-12 e controle Normais e obteve respectivamente as seguintes taxas de
prevalecircncias 40 40 e 2 Em todos os grupos houve predomiacutenio do padratildeo
citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear foi observado entre os pacientes com dengue
(67) e HTLV 12 (133)
Segundo Andrade et al (2002) Dellavance et al (2005) Dellavance e
Andrade et al (2007) o predomiacutenio do padratildeo de FAN do tipo citoplasmaacutetico indica
que determinados padrotildees de fluorescecircncia satildeo mais especiacuteficos de doenccedila auto-
imune enquanto outros ocorrem em indiviacuteduos com enfermidades natildeo auto-imunes
por ser o citoplasma celular rico em proteiacutenas para as quais auto-anticorpos naturais
apresentam afinidade moderada eacute comum observar positividade para FAN em
indiviacuteduos sadios cujo significado ainda natildeo eacute entendido completamente
O padratildeo Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina que pode ser
encontrado em Hepatite auto-imune Cirrose Hepatite C Hepatocarcionoma entre
outros Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica
definida Um resultado positivo pode estar ou natildeo associado a uma patologia assim
como poderaacute ou natildeo vir a apresentar uma doenccedila auto-imune com o passar do
tempo (DELLAVANCE et al 2003) Neste estudo natildeo foi feito avaliaccedilatildeo prospectiva
dos resultados embora todos sejam FAN citoplasmaacuteticos
Os achados de FAN positivo em populaccedilotildees sadias ou sem doenccedilas auto-
imunes tambeacutem jaacute observado por Leser et al (2004) que em 394 pacientes com
FAN-HEp-2 positivo natildeo encontraram nenhum paciente com doenccedila auto-imune
Outro exemplo estaacute no padratildeo citoplasmaacutetico de pontos isolados
estudado por Laurino et al (2006) presente em indiviacuteduos sem evidecircncia de auto-
imunidade mas tambeacutem em indiviacuteduos com acometimento de doenccedilas auto-imunes
sistecircmicas e natildeo-especiacuteficas
Os dados apresentados corroboram com este estudo em que foi
observado a presenccedila do auto-anticorpo em 2 (2 ) dos 100 indiviacuteduos sadios do
grupo controle todos com padratildeo citoplasmaacutetico
56
Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a
tornaacute-las imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo
(DE LARANAGA et al 2000)
Nas Infecccedilotildees agudas espera-se que a resposta auto-imune diminua a
medida que os viacuterus satildeo eliminados Entretanto alguns trabalhos sugerem que em
indiviacuteduos geneticamente susceptiacuteveis as reaccedilotildees auto-imunes possam persistir
apesar do clareamento viral uma vez que o gatilho imunoloacutegico foi ativado e natildeo
houve desativaccedilatildeo (DE LARANAGA et al 2000 SAKKAS et al 2008)
Ramos-Casals et al (2009) no estudo Doenccedilas Sistecircmica Auto-Imunes
em Pacientes com Infecccedilatildeo pelo (72) dos pacientes eram do gecircnero feminino e
(28) do masculino(ANA FAN) em 61 dos pacientes o que se diferem deste
trabalho eacute que dos 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo (667) eram do gecircnero
masculino e (333) eram do gecircnero feminino com meacutedia de idade de 430 (plusmn107)
anos com presenccedila de anticorpo-antinuclear em 13 (255) com meacutedia e mediana
respectivamente de 435 e 46 anos nos pacientes com o FAN positivo e meacutedia de
43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN negativo
Alter (1995) em sua pesquisa natildeo observou associaccedilatildeo entre o risco de
infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas designadas por gecircnero idade e raccedila Na
referida pesquisa foram estudados 51 pacientes com idade meacutedia de 430 (+- 107)
anos 34 (667) eram do gecircnero masculino e 17 (333) do gecircnero feminino todos
em fase preacute-tratamento assintomaacuteticos natildeo permitindo avaliar os risco da
infecccedilatildeoSegundo Pordeus et al (2008) a ocorrecircncia destes auto-anticorpos
indicaria um prognoacutestico desfavoraacutevel Perperas Mcfarlane e Mcsorley (1986)
sugeriram que os auto-anticorpos poderiam estar envolvidos na progressatildeo ou no
desenvolvimento de hepatites crocircnicas possivelmente por um distuacuterbio no controle
da auto-reatividade Outros estudos questionam a participaccedilatildeo dos auto-anticorpos
no processo de transiccedilatildeo para cronicidade das hepatites agudas virais poreacutem os
resultados natildeo satildeo convincentes (SHOENFELD ROSE 2004)
Lopez Seia e Roy (1998) demonstraram a presenccedila de anticorpo anti-
actina em baixos tiacutetulos em crianccedilas com hepatite aguda por curto periacuteodo de
tempo poreacutem nenhuma associaccedilatildeo com gravidade da agressatildeo hepaacutetica foi
descrita
Neste estudo a presenccedila dos auto-anticorpos em (255) dos pacientes
com infecccedilatildeo pelo HCV natildeo puderam ser relacionada com a gravidade da doenccedila
57
pois este estudo foi realizado em pacientes receacutem diagnosticados entatildeo seria
necessaacuterio um acompanhamento destes por um periacuteodo maior de tempo com a
finalidade de concluir esta afirmativa Apesar da presenccedila transitoacuteria de auto-
anticorpos jaacute ter sido descrita em doenccedilas virais comuns a associaccedilatildeo entre a
presenccedila de auto-anticorpos e a gravidade das doenccedilas necessita de comprovaccedilatildeo
Passaleva Massai e Leoncini (1983) avaliaram 302 pacientes com
hepatites agudas virais e encontraram complexos imunes circulantes (CIC) em
516 dos pacientes com frequumlecircncia significativamente maior em hepatite aguda
Nenhuma associaccedilatildeo entre a presenccedila de imuno-complexos e o niacutevel de
aminotransferases ou bilirrubina foi encontrada Segundo Andrade et al (2002)
Dellavance et al (2005) Andrade et al (2007) nos pacientes do estudo foi feita a
relaccedilatildeo entre a presenccedila dos auto-anticorpos e niacuteveis de aminotransferases e as
elevaccedilotildees natildeo tiveram significacircncia poreacutem houve associaccedilatildeo do genotipo viral 1
Nos paracircmetros bioquiacutemicos analisados em relaccedilatildeo aos genoacutetipos houve uma
distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e
3 natildeo atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os
grupos Segundo Wilson (1997) trecircs estudos mostraram correlaccedilatildeo entre niacuteveis
altos de alanina aminotransferase e atividade histoloacutegica da doenccedila hepaacutetica
Poreacutem nos pacientes considerados individualmente o valor preditivo dessa
associaccedilatildeo foi baixo enquanto muitos deles com enzimas normais apresentavam
graves alteraccedilotildees histoloacutegicas No presente estudo natildeo foi observada associaccedilatildeo entre os niacuteveis de
aminotransferases e a cronificaccedilatildeo da hepatite viral pois nem todos os pacientes do
estudo apresentavam resultado de bioacutepsia hepaacutetica
Alter et al (1999) afirmam que no Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b
(63) e 3a (313) em estudo realizado em Goiacircnia onde foi observada uma
maior prevalecircncia do genoacutetipo 1 seguida do genoacutetipo 3 em doadores de sangue e
hemofiacutelicos (DELLAVANCE ANDRADE et al 2007) Estando esses dados em
acordo com esta pesquisa que com genotipagem do viacuterus da hepatite C que
identificou o genoacutetipo 1 em 45 (882) seguidos pelo genoacutetipo 3 que foi
identificado em 6 (118) dos pacientes com infecccedilatildeo pelo HCV Em um estudo realizado na Franccedila com 13 pacientes luacutepicas infectadas
pelo viacuterus C 8 apresentavam o RNA viral sendo o genoacutetipo 1 presente em cinco
58
(625) casos seguido do genoacutetipo 3 (375) (PERLEMUTER et al 2000) dados
que se assemelham aos do presente estudo embora o estudo natildeo tenha incluiacutedo
pacientes com outras infecccedilotildees associadas ao HCV Eacute importante ressaltar que
estudos sobre genotipagem do HCV em indiviacuteduos com doenccedilas reumaacuteticas satildeo
raros
No presente estudo houve uma frequumlecircncia baixa de positividade para o
FAN nos pacientes com genoacutetipo 1 e genoacutetipo 3 Natildeo havendo significacircncia
estatiacutestica entre os pacientes com genoacutetipo 1 e 3
Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter
implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave menor
resposta agrave terapia antiviral (BRUNO et al1997) o que natildeo foi avaliado neste estudo
pois apesar de (882) dos pacientes serem genoacutetipo 1 todos estavam em fase de
reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica seja preacute- tratamento Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila
poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses
autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis
vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo
hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja
quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a
concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave
hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em
parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)
59
7 CONCLUSOtildeES
minus O padratildeo dos auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares encontrados nos
dois grupos estudados foi o citoplasmaacutetico
minus A prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares no grupo com
infecccedilatildeo pelo VHC foi significativamente maior do que no grupo controle
minus Nos resultados de FAN citoplasmaacutetico haacute uma maior prevalecircncia da
negatividade em pacientes infectados pelo HCV e natildeo infectados sendo
essa diferenccedila estatisticamente significativa conferindo a natildeo associaccedilatildeo
entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV
minus Os resultados negativos do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos viras eacute
superior aos positivos em ambos os genoacutetipos virais entretanto esta diferenccedila
natildeo eacute estatisticamente significativa
minus Houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos
celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado
minus Natildeo houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos
celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado com
relaccedilatildeo ao gecircnero onde predominou o gecircnero masculino nos dois grupos
minus Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter
implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave
menor resposta agrave terapia antiviral o que natildeo foi avaliado neste estudo pois
os pacientes estavam em fase preacute tratamento sugerindo que estes pacientes
sejam avaliados futuramente
minus A formaccedilatildeo dos auto-anticorpos parece ser mais uma consequumlecircncia do que
uma causa da agressatildeo hepaacutetica
minus A negatividade do FAN ndash Hep 2 foi maior que a positividade mas todos os
FAN positivos pertenciam ao genoacutetipo viral tipo 1 nos pacientes infectados
pelo HCV
minus Nesta pesquisa os resultados de PCR o RNA-HCV de reconfirmaccedilatildeo foi
positivo para o anti-HCV em todos os soros analisados mostrando assim
que estes pacientes eram portadores de infecccedilatildeo por viacuterus C ou seja natildeo
houve falso positivo anteriormente poreacutem todos eram assintomaacuteticos
dificultando a conclusatildeo de ser ou natildeo uma infecccedilatildeo persistente
60
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67
APEcircNDICES
68
APEcircNDICE A - TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Vocecirc estaacute sendo convidado para fazer parte de uma pesquisa que estaacute sendo desenvolvida pela Universidade Federal do Paraacute no Nuacutecleo de Medicina Tropical intitulada AUTOANTICORPOS CONTRA ANTIacuteGENOS CELULARES E SUA CORRELACcedilAtildeO COM O GENOacuteTIPO VIRAL EM PACIENTES COM INFECCcedilAtildeO PELO VIacuteRUS DA HEPATITE C (HCV)
O Objetivo da pesquisa eacute fazer uma correlaccedilatildeo do anticorpo antinuacutecleo (FAN) e o genoacutetipo viral em pacientes com hepatite C e o estaacutegio da doenccedila hepaacutetica a partir da histologia sempre que permitidos e correlacionar ao diagnoacutestico
Caso vocecirc participe da pesquisa seraacute necessaacuterio que forneccedila uma amostra de sangue (2ml)
O uacutenico inconveniente que vocecirc poderaacute experimentar eacute a dor provocada pela agulha na hora da coleta de sangue bem como pequenos hematomas que possam vir a ocorrer e que natildeo causam danos
Essa pesquisa natildeo oferece riscos as praacuteticas satildeo de uso rotineiro e seratildeo utilizados materiais esterilizados e descartaacuteveis como agulhas seringas etc
Estaacute garantido a vocecirc todas as informaccedilotildees que vocecirc queira antes durante e depois da pesquisa
A sua participaccedilatildeo neste estudo eacute voluntaacuteria Vocecirc tem a liberdade de recusar participar da pesquisa a qualquer momento
As informaccedilotildees relacionadas agrave pesquisa poderatildeo ser inspecionadas pelos pesquisadores que executam a pesquisa e pelas autoridades legais no entanto se qualquer informaccedilatildeo for divulgada em relatoacuterio publicaccedilatildeo ou qualquer outro meio isto seraacute feito de forma codificada para manter o caraacuteter confidencial
Todas as despesas necessaacuterias para a realizaccedilatildeo do estudo natildeo satildeo de sua responsabilidade assim como a sua participaccedilatildeo na pesquisa na seraacute remunerada (vocecirc natildeo receberaacute qualquer valor em dinheiro)
Quando os resultados forem divulgados natildeo apareceraacute seu nome e sim um coacutedigo
_____________________________________
Assinatura do Pesquisador Responsaacutevel NomeAna Maria Almeida Souza EndRodovia Maacuterio Covas 1426 ndash Cond Green Garden casa 41 Fone(91) 32352665 81197217 RegConselhoCRM 1508
69
APEcircNDICE B - CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Declaro que li as informaccedilotildees acima sobre a pesquisa que me sinto
perfeitamente esclarecido sobre o conteuacutedo da mesma assim como seus riscos e
benefiacutecios Declaro ainda que por minha livre vontade aceito participar da pesquisa
cooperando com a coleta de material para exame
Beleacutem _________
_________________________________________
Assinatura do sujeito da pesquisa ou do
responsaacutevel
70
ANEXOS
71
- Assinatura do Pesquisador Responsaacutevel
-
- Beleacutem _________
-
ABSTRACT
Inflammation of the liver caused by hepatotropic viruses affect millions of people and
represents a significant public health problem worldwide There are interactions between
hepatotropic viruses and the host immune system that can influence the pathogenesis of
liver injury The objective of this study was to investigate the frequency of autoantibodies
in patients with hepatitis C virus and its correlation with the genotypes found We
studied 51 patients diagnosed by PCR of infection with hepatitis C and a group of 100
blood donors with all serological tests for infectious diseases negative The 51 patients
with virus C had an average age of 43 years + - 113 in the pre-treatment 34 (667)
were male and 17 (333) were female Of these 13 (255) were ANA positive 45
(882) were with genotype 1 and 118 with genotype 3 Patients who presented with
antibodies had no detectable levels of AST ALT AST ALT γ-GT and alkaline
phosphatase significantly different from those with negative antibody titers Thus we
conclude that the antibodies present in the study sample are independent of disease
progression and patient prognosis though seems to be linked with genotype 1
Keywords Hepatitis C Auto-antibodies genotype
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Padrotildees de fluorescecircncia encontrados em maior frequumlecircncia e
patologias relacionadas 34
Quadro 2 - Anti-ena - auto-anticorpos contra antiacutegenos extraiacutedos do nuacutecleo e
relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 34
Quadro 3 ndash Padrotildees de FAN nuclear e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 35
Quadro 4 - Padrotildees de FAN citoplasmaacuteticos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 36
Quadro 5 - Padrotildees de FAN mistos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 37
Quadro 6 - Padrotildees de FAN nucleolares e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 37
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos pacientes segundo as caracteriacutesticas demograacuteficas janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 48
Tabela 2 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes conforme os resultados laboratoriais de FAN citoplasmaacutetico e genotipagem janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 49
Tabela 3 ndash Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 49
Tabela 4 - Relaccedilatildeo da genotipagem de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 50
Tabela 5 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e faixa etaacuteria - janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 50
Tabela 6 - Estudo descritivo da idade dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e presenccedila do FAN citoplasmaacutetico janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 51
Tabela 7- Distribuiccedilatildeo dos genoacutetipos dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 51
Tabela 8 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 52
Tabela 9 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico segundo a presenccedila ou ausecircncia de infecccedilatildeo por HCV janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 52
Tabela 10 - Distribuiccedilatildeo do FAN de acordo com o genoacutetipo viral janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 53
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
AAN Anticorpos antinucleares
aCL Anticorpos anticardiolipina
AIDS Sindrome da Imunodeficiecircncia Adquirida
ALT Alanina aminotransferase
ANCA Anticorpos anti-citoplasma de neutroacutefilos
Anti-CCP Antipeptiacutedeo citrulinado ciacuteclico
Anti-β2GPI Anticorpos anti-β2 glicoproteiacutena I
Cdna DNA complementar
CEP Comitecirc em Eacutetica e Pesquisa
CHC Carcinoma hepatocelular
CIC Complexos imunes circulantes
DDTC Doenccedilas difusas do tecido conjuntivo
DMTC Doenccedila mista do tecido conjuntivo
E1 Proteiacutena do envoltoacuterio
ENH Eritema Nodoso Hansecircnico
ESP Esclerose sistecircmica progressive
FAN Fator Anti-nuacutecleo
FR Fator reumatoacuteide
HBV Viacuterus da hepatite B
HCV Viacuterus da Hepatite C
HEMOPA Fundaccedilatildeo Centro de Hemoterapia e Hematologia do Paraacute
HIV Viacuterus da imunodeficiecircncia humana
HIV-1 Viacuterus da imunodeficiecircncia humana1
IAH Iacutendice de atividade histoloacutegica
LE Lupus Eritematoso
LES Luacutepus eritematoso sistecircmico
MS Ministeacuterio da Sauacutede
mtDNA DNA mitrocondrial
NANBH Hepatite natildeo-A natildeo-B
NMT Nuacutecleo de Medicina Tropical
OMS Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede
PCR Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia
Rh Tipo sanguiacuteneo
RNA Aacutecido ribonucleacuteico
RT-PCR Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia-em tempo real
SAF Siacutendrome antifosfoliacutepide
SIDA Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida
SS Siacutendrome de Sjoumlgren
UFPA Universidade Federal do Paraacute
UV ultravioleta
VHA Viacuterus da Hepatite A
VHC Viacuterus da Hepatite C
VHCHCV Hepatite C
VV Hanseniacutease generalizada
SUMAacuteRIO 1 INTRODUCcedilAtildeO 15 11 HEPATITE C (VHCHCV) 15 111 Consideraccedilotildees Gerais 15 112 Agente Etioloacutegico 16 113 Epidemiologia 17 114 Modo de Transmissatildeo 18 115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica 19 116 Diagnoacutestico 23 12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC 25
13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC 26
14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE 27
15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES AGUDAS VIRAIS 31
16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN 32 2 JUSTIFICATIVA 39 21 ASPECTOS EacuteTICOS 39 3 OBJETIVOS 40
31 OBJETIVO GERAL 40
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 40 4 MATERIAL E MEacuteTODOS 41 41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO) 41 411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C 41 412 Grupo de natildeo infectados 41 42 MEacuteTODO 42 421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico 42 422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C 42 423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia
molecular 43
424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem) 45 425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas
HEp-2 46 43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 47 5 RESULTADOS 48 6 DISCUSSAtildeO 54 7 CONCLUSOtildeES 59 REFEREcircNCIAS 60 APEcircNDICES 67 ANEXOS 70
15
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 HEPATITE C (VHCHCV)
111 Consideraccedilotildees Gerais
As hepatites virais satildeo doenccedilas causadas por diferentes agentes
etioloacutegicos de distribuiccedilotildees universais que tecircm em comum o hepatotropismo
Possuem semelhanccedilas do ponto de vista cliacutenico-laboratorial mas apresentam
importantes diferenccedilas epidemioloacutegicas quanto agrave sua evoluccedilatildeo (FERREIRA
SILVEIRA 2004) Desde a descriccedilatildeo e definiccedilatildeo em 1989 (CHOO et al 1989 apud
RIBEIRO et al 2007) tornou-se evidente sua associaccedilatildeo com uma grande
variedade de manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas desordens reumaacuteticas e auto-imunes
(ALMEIDA 2010)
A infecccedilatildeo pelo VHCHCV acarreta inflamaccedilatildeo hepaacutetica e esteatose
podendo evoluir para fibrose hepaacutetica e cirrose em indiviacuteduos cronicamente
infectados estes com grande risco de desenvolvimento de carcinoma hepatocelular
(RIBEIRO et al 2007) Essas complicaccedilotildees tardias ocorrem em um periacuteodo em
geral superior a 20 anos apoacutes o iniacutecio da infecccedilatildeo A avaliaccedilatildeo filogeneacutetica das
sequumlecircncias do VHCHCV investigadas em vaacuterias regiotildees geograacuteficas sugere que
existam pelo menos seis genoacutetipos principais designados pelos nuacutemeros de 1 a 6 e
pelo menos 30 subtipos designados por letras minuacutesculas Nos Estados Unidos
prevalecem os genoacutetipos 1a (60) e 1b (20) Os tipos 5 e 6 satildeo mais encontrados
no sudeste e sul da Aacutefrica O tipo 4 eacute predominante na Aacutefrica Central e no Oriente
Meacutedio No Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b (63) e 3a (313) (BASSIT et
al 1999 apud RIBEIRO et al 2007) As informaccedilotildees sobre as causas que
determinam o curso evolutivo da doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos
progressos que haacute no campo do diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHCHCV Uma
questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo genoacutetipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de
lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o genoacutetipo 1 (1b) cursa com lesotildees
histoloacutegicas mais graves
As uacuteltimas deacutecadas foram de notaacuteveis conquistas no que se refere agrave
prevenccedilatildeo e ao controle das hepatites virais Entre as doenccedilas endecircmico-
epidecircmicas que representam problemas importantes de sauacutede puacuteblica no Brasil
16
salientam-se as Hepatites Virais cujo comportamento epidemioloacutegico no nosso paiacutes
e no mundo tem sofrido grandes mudanccedilas nos uacuteltimos anos
Antes da seleccedilatildeo rigorosa dos doadores de sangue em 1991 o
VHCHCV era a maior causa de hepatite poacutes-transfusional Atualmente permanece
como tal em casos esporaacutedicos (CONTE 2000) Os grupos considerados de risco
satildeo pessoas que receberam transfusatildeo de sangue antes de 1992 usuaacuterios de
drogas injetaacuteveis profissionais de sauacutede que lidam com sangue pacientes de
hemodiaacutelise e com menor risco pessoas tatuadas ou com piercings (CLEMENTE
ONO-NITA 2007)
A melhoria das condiccedilotildees de higiene e de saneamento das populaccedilotildees a
vacinaccedilatildeo contra a Hepatite B (HBV) e as novas teacutecnicas moleculares de diagnoacutestico
do viacuterus da Hepatite estatildeo entre esses avanccedilos importantes (BRASIL 2008)
112 Agente Etioloacutegico
O VHCHCV um viacuterus aacutecido ribonucleacuteico (RNA) da famiacutelia Flaviviridae
representa a principal causa da previamente denominada hepatite natildeo-A natildeo-B
(SANTOS 2009) Foi identificado e isolado a partir de um clone derivado de um
genoma NANBH semelhante aos togaviridae ou flaviviridae (SAADE 2008) e
visualizado a imunoeletromicroscopia como partiacutecula de 55 a 65 nm de diacircmetro
com projeccedilotildees espiculares e de morfologia muito semelhante aos flaviviridae Aleacutem
disso estas partiacuteculas reagiram especificamente com anticorpos mono e policlonais
do conteuacutedo proteacuteico do envelope do VHC (HIRANUMA et al 1994 apud CONTE
2000)
O agente etioloacutegico do HCV natildeo eacute uma partiacutecula homogecircnea e apresenta
uma taxa alta de mutaccedilatildeo levando-o a uma heterogeneicidade genocircmica cujo
resultado eacute um grande nuacutemero de genoacutetipos (1a 1b 2a 2b 3a 3b 4 5 6)
(AUGUSTO LOBATO 2003) Natildeo haacute evidecircncias de variantes natildeo patogecircnicas O
genoacutetipo 1b eacute o que apresenta maior virulecircncia e pior resposta ao tratamento
(LAUER WALKER 2001 apud SOUZA 2007) No Brasil dados obtidos a partir de
casos isolados e estudos de pequenas amostragens indicam que o genoacutetipo 1b
ocorre em cerca de 30 a 40 dos casos o 1a em cerca de 20 1a e 1b em 20
o 3a em cerca de 28 (FOCACCIA 2004)
17
113 Epidemiologia
De acordo com a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) a HCV eacute uma
questatildeo de sauacutede puacuteblica e tambeacutem a principal causa de transplante de fiacutegado no
Brasil (SOCIEDADE BRASILEIRA DE HEPATOLOGIA 2005) Eacute estimada uma
prevalecircncia em torno de 10 para a infecccedilatildeo pelo VHC na populaccedilatildeo mundial
(KILLEMBERG 2000) Nos Estados Unidos cerca de 27 milhotildees de pessoas estatildeo
infectadas pelo viacuterus (BRASIL 2006)
De acordo com Ferreira e Silveira (2004) no Brasil o nuacutemero de pacientes
infectados eacute incerto relacionado geralmente a alguns estados e municiacutepios e o
esclarecimento dos agentes causadores das hepatites cuja identificaccedilatildeo requer
teacutecnicas laboratoriais complexas de biologia molecular eacute realizado de maneira
insuficiente Por outro lado a progressiva integraccedilatildeo entre as instacircncias gestoras
dos programas de vigilacircncia e controle das doenccedilas com grupos de pesquisa e
desses com os serviccedilos (FERREIRA SILVEIRA 2004 p 473) e a disponibilidade
dos bancos de dados nacionais mais confiaacuteveis apontam para novos e melhores
caminhos (BRASIL 2005b)
A OMS alerta que o Paiacutes deve se preparar para uma ldquoexplosatildeordquo da
epidemia a partir de 2011 (BRASIL 2005b) Outra preocupaccedilatildeo eacute que as pessoas
que receberam sangue antes de 1992 tecircm mais chances de estarem infectadas na
eacutepoca o sangue destinado agraves transfusotildees natildeo era analisado para detecccedilatildeo da HCV
porque o viacuterus natildeo era conhecido e natildeo havia exames especiacuteficos (BRASIL 2005b)
A prevalecircncia da infecccedilatildeo nos doadores de sangue sadios varia de 001-002 no
Reino Unido e no norte da Europa 1-15 no sul da Europa 65 na Aacutefrica
equatorial e de ateacute 20 no Egito (CONTE 2000)
De acordo com a OMS a cada grupo de 50 pessoas no Brasil uma tem
hepatite e de dez portadores apenas um sabe (STRAUSS 2001) Satildeo dois milhotildees
de infectados no Paiacutes Denominada epidemia silenciosa calcula-se que 170 milhotildees
de indiviacuteduos no mundo estejam contaminados pelo viacuterus C a forma mais grave da
doenccedila Ainda de acordo com a OMS o nuacutemero de brasileiros viacutetimas da
enfermidade eacute bem maior do que o estimado pelo Ministeacuterio da Sauacutede (TRINDADE
2005)
18
Por ocasiatildeo da Conferecircncia Internacional de Consenso sobre HCV em Paris
(LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999) concluiu-se que a hepatite crocircnica por viacuterus
C eacute um problema grave de sauacutede puacuteblica sendo sua prevalecircncia mundial estimada
em 3 (de 01 a 5 segundo os vaacuterios paiacuteses) por tanto havendo no mundo
todo cerca de 150 milhotildees de portadores crocircnicos do VHCHCV 4 milhotildees nos EUA
e 5 milhotildees na Europa Ocidental Na Europa Oriental a prevalecircncia eacute maior ainda
114 Modo de Transmissatildeo
A HCV eacute transmitida pelo sangue Natildeo haacute comprovaccedilatildeo de contaacutegio por
meio de fluidos corporais como saliva suor laacutegrimas secircmen ou leite materno
Tambeacutem deixa de ocorrer por meio de abraccedilos beijos uso dos mesmos copos ou
roupas Especialistas afirmam que a contaminaccedilatildeo atraveacutes de relaccedilotildees sexuais eacute
possiacutevel mas rara Quando detectada de maneira precoce a enfermidade tem
tratamento inclusive gratuito aleacutem de cura (BRASIL 2006)
Dentre os fatores de risco para transmissatildeo outros aleacutem da transfusatildeo de
sangue o uso de drogas iliacutecitas o comportamento sexual de alto risco e variaacuteveis
socioeconocircmicas representadas pelo grau de escolaridade e renda familiar Natildeo foi
observada associaccedilatildeo entre o risco de infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas
designadas por gecircnero idade e raccedila (ALTER 2007) O risco de transmissatildeo sexual
do VHCHCV eacute miacutenimo A contaminaccedilatildeo intrafamilial natildeo-sexual eacute consideraacutevel
particularmente quando um dos enfermos tem hepatopatia grave e ou carga viral
elevada (risco 110) (CONTE 2000)
A praacutetica de tatuagem fornece dados conflitantes sabendo-se que os
liacutequidos usados para esterilizar os instrumentos usados satildeo ineficazes
Karmochkine et al (1998 apud CONTE 2000) observaram que
aproximadamente 80 dos pacientes contraem o viacuterus atraveacutes da toxicomania
intravenosa ou transfusotildees de sangue ou de derivados Os restantes meios de
transmissatildeo e de contaacutegio satildeo a hemodiaacutelise os transplantes de oacutergatildeos picadas
acidentais profissionais e transmissatildeo vertical matildee-crianccedila Em 20 a 40 dos
casos natildeo se consegue determinar o modo de contaminaccedilatildeo A transmissatildeo da
hepatite crocircnica por viacuterus C pode ser prevenida (KARMOCHKINE et al 1998 apud
CONTE 2000)
19
As duas fontes de contaminaccedilatildeo satildeo a toxicomania endovenosa e a
administraccedilatildeo de produtos de origem sanguumliacutenea Esta uacuteltima praticamente
eliminada desde 1991 com a introduccedilatildeo dos testes ELISA 2 na seleccedilatildeo
aprimorada de doadores de sangue (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998
apud CONTE 2000)
A transmissatildeo sexual eacute rara com menos de 3 em parceiros estaacuteveis e
ocorre principalmente em pessoas com muacuteltiplos parceiros e com praacutetica sexual de
risco (sem uso de preservativo) ndash para os indiviacuteduos com parceiros muacuteltiplos o uso
de preservativos eacute indicado (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998 apud
CONTE 2000)
A gravidez natildeo estaacute contra-indicada nas mulheres infectadas pelo
VHCHCV A transmissatildeo vertical matildee-crianccedila eacute rara (menor de 6) O tipo de parto
(natural ou cesaacuterea) natildeo tem influecircncia O aleitamento eacute permitido A transmissatildeo
nosocomial eacute prevenida eficazmente de modo convencional (KARMOCHKINE et
al 1998 apud CONTE 2000)
115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica
A infecccedilatildeo aguda pode passar clinicamente despercebida ou evoluir para
hepatite fulminante Aproximadamente 850 das pessoas infectadas agudamente
vatildeo desenvolver uma viremia persistente tornando-se dessa forma indiviacuteduos
infectados crocircnicos Depressatildeo irritabilidade dores no corpo mal-estar febre
naacuteuseas e falta de apetite satildeo alguns dos sintomas mais frequumlentes embora a
maioria dos casos natildeo apresente nenhum sintoma (ALTER 2007)
A cirrose eacute pouco observada em pessoas que apresentam niacuteveis
persistentemente baixos das transaminases mas a elevaccedilatildeo destas natildeo eacute
representativa do grau de fibrose hepaacutetica Dessa forma a bioacutepsia hepaacutetica
representa o melhor indicador do estaacutegio de evoluccedilatildeo da doenccedila uma vez que
gradua os componentes inflamatoacuterios e o estaacutegio de fibrose (AGMON-LEVIN et al
2009 BLOCK SCHIANO 1999)
Alter et al (1992) dizem que em 82 de 130 pacientes seguidos durante
muitos anos apoacutes surto agudo de hepatite natildeo-A natildeo-B apresentam anti-VHCHCV
ou VHCHCV RNA sendo que 62 deles desenvolveram hepatite crocircnica e
concluem que os pacientes que adquiriram HCV tiveram alto grau de hepatite
20
crocircnica sendo que o VHCHCV pode ser a maior causa de doenccedila crocircnica de fiacutegado
nos EUA e que na maioria dos pacientes a infecccedilatildeo pelo VHCHCV parece persistir
por muitos anos mesmo na ausecircncia de doenccedila hepaacutetica ativa
Almeida et al (1999) determinaram a prevalecircncia da infecccedilatildeo em
doadores de sangue assim como avaliaram o grau de comprometimento hepaacutetico
numa populaccedilatildeo de 37335 doadores durante o biecircnio 93-94 em Porto Alegre - RS
utilizando o teste anti-VHC ELISA 2 Selecionaram 60 deles para a biopsia hepaacutetica
com agulha de Menghini encontrando prevalecircncia de 174 com comprometimento
hepatico e 39 deles apresentavam cirrose hepaacutetica Sendo a hepatopatia crocircnica de
graus variaacuteveis observadas em 80 deles na sua grande maioria com lesotildees leves
e miacutenimas Foi observada forte associaccedilatildeo entre elevaccedilatildeo de alanina
aminotransferase (ALT) e a presenccedila de hepatopatia crocircnica embora a intensidade
desta elevaccedilatildeo natildeo se correlacione com a gravidade da lesatildeo histoloacutegica
Jaacute na experiecircncia de Mutimer et al (1995) cerca de 80 dos doadores
soro-positivos analisados exaustivamente inclusive com biopsia de fiacutegado
mostraram evidecircncias de alteraccedilotildees histoloacutegicas e ou viroloacutegicas de infecccedilatildeo
persistente sem no entanto atingir graus mais avanccedilados de hepatopatia crocircnica
quase todos permanecendo na categoria moderada
Nos paiacuteses industrializados a HCV eacute responsaacutevel por 20 dos casos de
hepatite aguda 70 dos casos de hepatite crocircnica 40 dos casos de cirrose
descompensada 60 dos carcinomas hepatocelulares e 30 dos transplantes
hepaacuteticos (LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999)
Cerca de 40 do total de pacientes curam-se ou tecircm doenccedila crocircnica de
natureza benigna Os restantes 60 cursam com atividade aumentada de
aminotransferase denotando evoluccedilatildeo crocircnica da doenccedila Dentre estes a maioria
tem lesotildees necro inflamatoacuterias discretas e fibrose miacutenima ou ausente O prognoacutestico
em longo prazo eacute mal conhecido no entanto provavelmente a maioria deles natildeo viraacute
a falecer da doenccedila hepaacutetica em curso Cerca de 20 deles depois de 10-20 anos
de evoluccedilatildeo desenvolveratildeo cirrose hepaacutetica passiacutevel de transplante Assim a
hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila que ocasiona a morte de um pequeno nuacutemero
de pacientes sem no entanto afetar a duraccedilatildeo da vida meacutedia da maioria deles
(CONTE 2000 FERREIRA SILVEIRA 2004)
Apoacutes infecccedilatildeo aguda somente 10 dos pacientes desenvolve doenccedila
cliacutenica com icteriacutecia A infecccedilatildeo sub-cliacutenica eacute a regra e assim passa despercebida
21
Cerca de 25 deles tecircm infecccedilatildeo crocircnica sintomaacutetica com aminotransferases
normais e lesotildees inflamatoacuterias histoloacutegicas miacutenimas (RESENDE et al 2010)
A remissatildeo espontacircnea acontece em cerca de 15 dos casos Na grande
minoria dos casos a progressatildeo da doenccedila aguda pode levar agrave insuficiecircncia
hepaacutetica aguda
Observaccedilotildees feitas pelo irlandecircs Kenny-Walsh (1999) comprovam a
natureza e a evoluccedilatildeo cliacutenica da afecccedilatildeo em causa O autor acompanhou durante 17
anos 376 mulheres que receberam injeccedilotildees de imunoglobulinas anti-D
contaminadas com VHC provenientes de doador uacutenico num programa de
isoimunizaccedilatildeo Rh Destas 81 apresentaram sintomatologia mais frequumlentemente
fadiga (66) ALT ligeiramente elevada (de 40 a 99 UL) em 47 e igual ou maior de
100 UL em 8 A biopsia hepaacutetica mostrou inflamaccedilatildeo em 98 delas na maioria
das vezes leves (41) e moderadas (52) fibrose presente em 51 no entanto
somente em sete pacientes (2) houve sinais de cirrose provaacutevel ou definitiva Em
uma delas havia acentuado alcoolismo
A hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila de evoluccedilatildeo variaacutevel De maneira
geral sua evoluccedilatildeo eacute lenta insidiosa e progressiva
Os pacientes que natildeo apresentam evidecircncias bioquiacutemicas de lesatildeo
hepaacutetica podem constituir em subgrupo de casos mais benignos no curso natural
da doenccedila Muitos co-fatores tecircm papel importante no desenvolvimento da cirrose
nesses pacientes como por exemplo a idade no momento da infecccedilatildeo (os
contaminados de idade mais avanccedilada tecircm evoluccedilatildeo mais raacutepida da doenccedila
enquanto que os mais jovens a tecircm mais lenta) o alcoolismo (eacute de consenso geral
que o abuso de aacutelcool favorece o aparecimento da cirrose) e a co-infecccedilatildeo com o
Viacuterus da Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida (SIDA) e da HVB
A incidecircncia anual de carcinoma hepatocelular (CHC) eacute de 1 a 4 nos
pacientes cirroacuteticos o que justifica plenamente o controle ecograacutefico do fiacutegado e a
dosagem seacuterica de alfa-fetoproteiacutena nesses pacientes a cada 1-2 anos Por outro
lado nos pacientes com hepatite crocircnica por viacuterus C sem cirrose o CHC eacute muito
raro (LOPES 2010)
Nos casos de cura a atividade das transaminases cessa e os viacuterus natildeo
satildeo detectados (VHC RNA) no soro Nos casos de cronificaccedilatildeo acontece o
contraacuterio ou seja as alteraccedilotildees bioquiacutemicas existem com flutuaccedilotildees e os viacuterus satildeo
detectaacuteveis na grande maioria dos casos Fazem exceccedilatildeo agravequeles pacientes com
22
viremia baixa que por isso mesmo fogem aos limites dos meacutetodos de detecccedilatildeo viral
ou devido agraves flutuaccedilotildees proacuteprias desses niacuteveis virecircmicos (HAYDON et al 1998)
Nos pacientes anti-VHC positivos com enzimas circulantes normais a
falta de VHC RNA no soro tem sido interpretada como sinal de cura completa No
entanto Haydon et al (1998) alteraram essa interpretaccedilatildeo Estes autores
demonstraram a presenccedila de VHC RNA no fiacutegado desses pacientes que eram
negativos no soro independente das alteraccedilotildees bioquiacutemicas positivas ou negativas
do soro ou seja mesmo naqueles casos anteriormente considerados como curados
Assim os niacuteveis de viacuterus intra-hepaacuteticos natildeo satildeo determinados pelos fatores
hospedeiro (idade modo e duraccedilatildeo da infecccedilatildeo) ou virais (VHC genoacutetipos) pois
mesmo as repetidamente Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia-em tempo real (RT-
PCR) negativos para VHC RNA no soro podem ter viacuterus da HCV albergados no
fiacutegado Entretanto existem limitaccedilotildees metodoloacutegicas que devem ser consideradas
nessa interpretaccedilatildeo como por exemplo as limitaccedilotildees do RIBA 3 e do RT-PCR
Mais importante eacute o seguimento dos pacientes ao longo do tempo Assim
Seef et al (1992) em 568 pacientes de hepatite poacutes-transfusional e dois grupos
controles pareados que receberam transfusotildees sem desenvolver hepatite apoacutes 18
anos de seguimento encontraram 33 de mortalidade no grupo 1 e 15 no grupo
controle sendo que a maioria das mortes ocorreu nos pacientes com alcoolismo
associado Evidenciando que a maioria dos que desenvolve doenccedila crocircnica o faz
muito lentamente
Existem ainda no curso natural da doenccedila flutuaccedilotildees intensas e muito
frequumlentes que dependem dos viacuterus e dos hospedeiros a saber niacuteveis da viremia
genoacutetipos 1b graus de diversidade geneacutetica dos viacuterus vias de transmissatildeo (os
inoculados via transfusatildeo apresentam lesotildees hepatocelulares mais ativas)
(GORDON et al 1993 GORDON BAYATI SILVERMAN 1998) deficiecircncias
imunes alcoolismo e co-infecccedilatildeo com HBV e delta ou o Viacuterus da imunodeficiecircncia
humana (HIV) (LOPES 2010) Nestes uacuteltimos casos a co-infecccedilatildeo com muacuteltiplos
viacuterus das hepatites estaacute associada com mais graves lesotildees histoloacutegicas do fiacutegado do
que nos casos de VHC isoladas
Importa saber se os resultados obtidos com os controles feitos se mantecircm
por longos periacuteodos Ou seja como exemplos a atividade da ALT persistentemente
normal a variabilidade do RT-PCR a detecccedilatildeo de VHC RNA pela teacutecnica Reaccedilatildeo
de polimerase em cadeia (PCR) que pode ser negativa devido agrave inadequada
23
armazenagem das amostras agrave contaminaccedilatildeo do soro com substacircncias que
interferem na leitura entre outras causas de erro
As informaccedilotildees sobre as causas que determinam o curso evolutivo da
doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos progressos havidos no campo do
diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHC Uma questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo
genotipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o
genotipo 1 (1b) cursa com lesotildees histoloacutegicas mais graves independentemente da
carga viral Ainda mais os VHC RNA negativos no soro mesmo apoacutes anos de
cura podem recair pois neles persistem os viacuterus no fiacutegado em regime de
replicaccedilatildeo muito baixa indetectaacutevel pelos meacutetodos atuais Ao contraacuterio os negativos
no soro e no fiacutegado tecircm demonstrado respostas boas e sustentadas inclusive no
sentido de se fazer prognoacutestico de cura real e verdadeira infelizmente na grande
minoria dos casos
116 Diagnoacutestico
Quanto mais cedo o diagnoacutestico maiores as chances de detectar a
doenccedila Por isso eacute importante que as pessoas faccedilam o exame especiacutefico porque soacute
esse exame eacute que detecta a HCV E as mulheres tecircm que ter uma atenccedilatildeo em
especial Tempos atraacutes o Correio Braziliense (2003) publicou uma grande mateacuteria
sobre a quantidade de mulheres que vecircm sendo infectadas com a HCV Cuja causa
estava na esterelizaccedilatildeo mal feita dos equipamentos das manicures Uma soluccedilatildeo
praacutetica eacute as mulheres terem seu proacuteprio material pra fazer as unhas e natildeo deixar
mais ningueacutem utilizar (nem matildee nem irmatilde etc) Bem e quem tiver passado por
transfusatildeo dentistas manicures operaccedilotildees etc deve fazer o exame
(KARMOCHKINE et al 1998 apud CONTE 2000 KEER et al 1997)
A HCV natildeo eacute como a Siacutendrome da Imunodeficiecircncia Adquirida (AIDS)
que possui drogas com grande tecnologia e o doente pode viver por muitos e muitos
anos Com a HCV o paciente soacute tem chance de ficar bem se a doenccedila for
diagnosticada e tratada antes dela se manifestar Atualmente o tratamento usa uma
associaccedilatildeo de duas drogas ndash o Interferon e a Ribavirina ldquoAs chances de cura em
meacutedia satildeo de 50rdquo
Barbaro et al (1999) verificaram que os pacientes VHC genoacutetipos 1b
frequumlentemente apresentavam alteraccedilotildees ultraestruturais das mitococircndrias com
24
depleccedilatildeo do mtDNA podendo comprometer o processo de fosforilizaccedilatildeo oxidativa
Sendo assim a produccedilatildeo aumentada de radicais livres nos pacientes VHC genoacutetipos
1b poderia atuar de modo negativo na evoluccedilatildeo da doenccedila hepaacutetica aumentando o
efeito citopaacuteticos do VHC Nesses pacientes haveria portanto aumento de
hiperoxidaccedilatildeo com consequumlente resistecircncia agrave accedilatildeo dos interferons e pior evoluccedilatildeo
da doenccedila hepaacutetica A ser confirmado este fato novas estrateacutegias terapecircuticas
poderatildeo vir a ser desenvolvidas no combate a essa doenccedila
Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila
poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses
autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis
vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo
hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja
quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a
concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave
hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em
parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)
Dos fatos acima expostos decorrem implicaccedilotildees tais como as respostas
CD8-CTL aos antiacutegenos VHC restritas aos complexos de histocompatibilidade
principais (MHC I) com inibiccedilatildeo ou mesmo insuficiente produccedilatildeo de complexo
peptiacutedeo VHC-MHC inibiccedilatildeo direta das ceacutelulas CTLK e a falta de resposta as
citoquininas entre outras dos vaacuterios mecanismos de escape existentes Dentro
desse contexto o niacutevel de morte celular natildeo seria alcanccedilado e a lesatildeo hepatocelular
consequumlente seria portanto miacutenima
Outra implicaccedilatildeo resultante consiste na induccedilatildeo de resposta imune
celular T Helper mediadas a partir de peptide vacinas contra o VHC Estas novas
vacinas tecircm a capacidade de gerar linfoacutecitos T citotoacutexico os CTLs contra o VHC em
camundongo imunizados com peptiacutedeos CTL e ceacutelulas HT epiacutetomes do core VHC
Esses estudos recente em animais de laboratoacuterio vecircm progredindo rapidamente
esperando-se em breve novos recursos no tratamento dessa doenccedila (AGNELLO et
al 1998)
25
12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC
O VHC constitui-se em uma famiacutelia heterogecircnea de viacuterus com no miacutenimo
seis genoacutetipos e inuacutemeros subtipos (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT
SANTOS SILVA 1999) Embora o meacutetodo de maior acuraacutecia para a determinaccedilatildeo
do genoacutetipo do VHC seja a identificaccedilatildeo completa da sequumlecircncia dos 9500
nucleotiacutedeos e a construccedilatildeo de uma aacutervore filogeneacutetica esse meacutetodo soacute pode ser
utilizado em laboratoacuterios de pesquisa (BARBOSA SILVA MARTINS 2005) e natildeo
em laboratoacuterios cliacutenicos Assim foram desenvolvidos meacutetodos para genotipagem
utilizando apenas as regiotildees mais conservadas do genoma como a proteiacutena do
envoltoacuterio (E1) a proteiacutena core e a proteiacutena natildeo estrutural NS5B A sequumlecircncia dos
nucleotiacutedeos dentro dessas regiotildees relativamente conservadas eacute genoacutetipo-
especiacutefico e os isolados podem ser genotipados independentemente da regiatildeo que
for utilizada para anaacutelise (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS
SILVA 1999) Para uso em laboratoacuterios cliacutenicos foram desenvolvidas basicamente
duas metodologias que se valem de teacutecnicas de biologia molecular (genotipagem)
ou citoloacutegicas (serotipagem)
Os meacutetodos que adotam teacutecnica de biologia molecular para genotipagem
utilizando porccedilotildees do genoma incluem a PCR aninhada (nested PCR) (BASSIT
SANTOS SILVA 1999) a teacutecnica de restriction fragment length polymorphism
(RFLP) (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS SILVA 1999) a
hibridizaccedilatildeo reversa (BASSIT SANTOS SILVA 1999) (INNO-LiPA Innogenetics
Beacutelgica Gen Eti DEIA HCV Sorin Biomedica Itaacutelia) e o sequumlenciamento direto da
regiatildeo natildeo-codificante 5 (TruGene Visible Genetics Canadaacute) Suas principais
vantagens satildeo a informaccedilatildeo direta sobre sequumlecircncia dos nucleotiacutedeos do genoma
viral a alta sensibilidade por se basearem na PCR e a possibilidade de identificar o
subtipo viral (BARBOSA SILVA MARTINS 2005)
Os meacutetodos para determinaccedilatildeo do genoacutetipo que utilizam serotipagem
baseiam-se na detecccedilatildeo de anticorpos genoacutetipos-especiacuteficos contra epiacutetopos do
VHC (por exemplo proteiacutenas da regiatildeo do core) (BLOCK SCHIANO 1999) Os
testes comercializados utilizam diferentes teacutecnicas ELISA competitivos ou
immunoblot (Murex-HC1-6 Murex Diagnostics Ltd Reino Unido RIBA HCV
Serotyping Assay Chiron Diagnostics Estados Unidos) As principais vantagens da
teacutecnica de serotipagem satildeo o baixo custo e maior facilidade de realizaccedilatildeo em
26
comparaccedilatildeo com os testes de biologia molecular (BLOCK SCHIANO 1999 De
LARANAGA et al 2000)
A determinaccedilatildeo do genoacutetipo anteriormente utilizada em pesquisas mas
sem maior utilidade na praacutetica meacutedica atualmente eacute recomendada para uso cliacutenico
Como jaacute mencionado os pacientes infectados pelo genoacutetipo 1 do VHC devem ser
tratados por 12 meses enquanto os demais por 6 meses (BASSIT SANTOS SILVA
1999)
A determinaccedilatildeo do genoacutetipo do VHC pode ser feita por PCR ou
serotipagem A primeira teacutecnica eacute mais sensiacutevel e possibilita a identificaccedilatildeo de
subtipos do VHC Contudo a segunda eacute de mais faacutecil realizaccedilatildeo e mais barata
razatildeo pela que eacute importante que a teacutecnica seja aprimorada
Oliveira et al (1999) investigaram os padrotildees de distribuiccedilatildeo dos
genoacutetipos do VHC estudando 250 pacientes anti-VHC positivos atraveacutes da
detecccedilatildeo VHC RNA pelo RT-PCR e encontraram prevalecircncia de 72 para o VHC 1
253 para o tipo 3 2 para o 2 e 07 para o 4 semelhantes aos das vaacuterias
regiotildees mundiais
13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC
As manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo pelo VHC satildeo as mais
variadas possiacuteveis A diversidade de resposta do hospedeiro ao agente infeccioso
variando desde quadros assintomaacuteticos ateacute aqueles com evoluccedilatildeo grave fatal ou
incapacitante tem estimulado a busca por justificativas de tais discrepacircncias
cliacutenicas sobretudo na imunomodulaccedilatildeo Dentre as infecccedilotildees mais bem estudadas
destacam-se aquelas pelos Viacuterus da hepatite C Viacuterus da imunodeficiecircncia humana1
(HIV-1) pelo Herpes viacuterus humano 4 (viacuterus do Epstein Baar) e pelo Mycobacterium
leprae (ABBAS LICHTMAN 2005)
A agressatildeo hepaacutetica por auto-imunidade eacute um fenocircmeno reconhecido em
vaacuterias doenccedilas do fiacutegado inclusive nas de etiologia viral Aleacutem do agente agressor e
de sua interaccedilatildeo com o sistema imunoloacutegico do hospedeiro fatores ambientais ou
hormonais estatildeo aparentemente envolvidos no surgimento de auto-imunidade
hepaacutetica como se supotildee acontecer na hepatite auto-imune em indiviacuteduos
geneticamente suscetiacuteveis (CODES et al 2002)
27
A lesatildeo hepatocelular relacionada agrave infecccedilatildeo pelos viacuterus hepatotroacutepicos e
pelos herpes viacuterus (citomegaloviacuterus e Epstein-Barr) eacute secundaacuteria a uma resposta
auto-imune do hospedeiro Estes viacuterus natildeo parecem ser diretamente citopaacuteticos
mas desencadeiam lesatildeo hepaacutetica atraveacutes da resposta imune do hospedeiro contra
ceacutelulas hepaacuteticas infectadas (MALOY POWRIE 2001)
Existem estudos que focalizam alteraccedilotildees imunoloacutegicas em hepatites
virais entretanto a maioria deles mostra resultados pontuais sem seguimento na
fase aguda da doenccedila (BLOCK SCHIANO 1999 McFARLONE et al 1990) Aleacutem
disso ainda natildeo se estabeleceu uma associaccedilatildeo entre as reaccedilotildees auto-imunes
transitoacuterias induzidas por viroses hepatotroacutepicas e agravamento do dano tecidual na
hepatite viral
A infecccedilatildeo crocircnica estaacute fortemente associada agrave crioglobulinemia mista
essencial glomerulonefrite membrano-proliferativa e porfiria cutacircnea tardia De
forma menos impressiva encontra-se tambeacutem associada agrave uacutelcera corneana de
Mooren liacutequen plano e fibrose pulmonar (KILLENBERG 2000 WENER et al 1996)
A ocorrecircncia de anticorpos antitireoidianos e hipotireoidismo tem sido relatada em
associaccedilatildeo com a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC em mulheres (KILLENBERG 2000
CACOUB et al 1999)
A associaccedilatildeo entre a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC a presenccedila do fator
reumatoacuteide e do anticorpo antinuclear (FAN) o fenocircmeno de Raynaud e doenccedilas
difusas do tecido conjuntivo (DDTC) como artrite reumatoacuteide luacutepus eritematoso
sistecircmico siacutendrome de Sjoumlgren e vasculites sistecircmicas eacute relatada em alguns
trabalhos (CACOUB et al 1999 LOVY STARKEBAUM UBEROI 1996 STAUB
1998 WENER et al 1996)
14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE
A associaccedilatildeo entre doenccedilas infecciosas e autoimunidade apresentando-
se com manifestaccedilotildees cliacutenicas ou detectadas apenas pelo desenvolvimento de auto-
anticorpos tem sido amplamente documentado Infecccedilotildees virais bacterianas e
parasitaacuterias podem estar envolvidas no desenvolvimento recidivas e ateacute mesmo na
prevenccedilatildeo de doenccedilas auto-imunes (KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)
Ribeiro e Proietti (2004) avaliaram a frequumlecircncia de FR anticorpos
antipeptiacutedeo citrulinado ciacuteclico (anti-CCP) AAN anticorpos anti-citoplasma de
28
neutroacutefilos (ANCA) anticorpos anticardiolipina (aCL) e anticorpos anti-β2
glicoproteiacutena I (anti-β2GPI) em pacientes com hanseniacutease Existe estudo
demonstrando pacientes que apresentavam manifestaccedilotildees articulares comparados
aos que natildeo apresentavam envolvimento articular e um grupo controle de indiviacuteduos
saudaacuteveis com idade e gecircnero semelhantes aos dos pacientes estudados e que
residiam na mesma aacuterea geograacutefica A maioria dos pacientes nos dois grupos (com
e sem envolvimento articular) apresentava hanseniacutease generalizada Entretanto
observaram uma baixa frequumlecircncia que natildeo foi significativamente diferente de FR
anti-CCP AAN e ANCA em pacientes com hanseniacutease (nos dois grupos) e normal
dos controles Mas a prevalecircncia de anticorpos aCL e anti-β2GPI estava
significativamente elevada nos pacientes com hanseniacutease quando comparados com
o grupo controle apesar de natildeo haver associaccedilatildeo significativa com o envolvimento
articular O isoacutetopo predominante dos dois autoanticorpos foi a IgM (487) dos
pacientes com hanseniacutease apresentava pelo menos um anticorpo antifosfoliacutepide
Aleacutem disso os autores observaram uma associaccedilatildeo entre a positividade para aCL e
as manifestaccedilotildees cliacutenicas jaacute que os pacientes com anticorpos aCL apresentavam
doenccedila Hanseniacutease generalizada (VV) com mais frequumlecircncia (p= 0002) Natildeo houve
associaccedilatildeo entre a presenccedila de anticorpos aCL ou anti-β2GPI e episoacutedios
reacionais poreacutem entre os pacientes com esses episoacutedios aqueles com anticorpos
aCL apresentavam eritema nodoso hansecircnico (ENH) em 100 dos casos enquanto
entre os pacientes negativos para aCL 57 apresentavam ENH Apesar de uma
alta taxa de concordacircncia para a presenccedila de anticorpos aCL e anti-β2GPI ter sido
observada manifestaccedilotildees tromboemboacutelicas natildeo foram observadas (RIBEIRO
PROIETTI 2004 2005)
Horimoto e Costa (2009) avaliaram pacientes com Leishmania
(leishmaniose visceral e leishmaniose cutacircnea) para a presenccedila de anticorpos anti-
Leishmania assim como FR AAN anti-DNA anti-Sm anti-RNP anti-Ro anti-La
aCL e complemento (C3 e C4) Como esperado os pacientes com leishmaniose
visceral apresentava anticorpos anti-Leishmania Tiacutetulos significativamente elevados
de AANs na maioria dos pacientes o anti-DNA foi detectado em poucos pacientes
com doenccedila visceral assim como tiacutetulos elevados de anticorpos aCL (isotipo IgG)
quando comparados com os pacientes com leishmaniose cutacircnea Niacuteveis reduzidos
de complemento tambeacutem satildeo evidentes na doenccedila visceral assim como niacuteveis
significativamente reduzidos de C3 Outros estudos comparam e discutem os
29
resultados em relaccedilatildeo agrave crescente evidecircncia na literatura da presenccedila de
autoanticorpos em ambas as doenccedilas Em geral a prevalecircncia variaacutevel de auto-
anticorpos relatada assim como relatos preacutevios na literatura podem estar
relacionados a diferenccedilas metodoloacutegicas como o tipo de ensaio utilizado a
definiccedilatildeo dos pontos de corte inativaccedilatildeo dos soros pelo calor seleccedilatildeo de pacientes
e variaccedilotildees eacutetnicas e geograacuteficas nos grupos de pacientes Mas um dos resultados
consistentes foi a frequumlecircncia significativamente mais elevada de anticorpos
antifosfoliacutepide aCL e anti-β2GPI em pacientes com hanseniacutease enquanto
anticorpos AAN e aCL foram detectados com mais frequumlecircncia nos pacientes com
leishmaniose visceral A incidecircncia aumentada de anticorpos AAN e aCL nos
pacientes com leishmaniose visceral eacute compatiacutevel com outros estudos (OSSADRON
et al 2006 SAKKAS et al 2008 VOULGARI et al 2004) e demonstra
semelhanccedilas das manifestaccedilotildees cliacutenicas e laboratoriais entre a leishmaniose
visceral e o luacutepus eritematoso sistecircmico (LES) Aleacutem disso a reatividade cruzada
entre AAN e anticorpos anti-Leishmania jaacute foi tambeacutem relatada (GRANEL et al
2000)
Diversos grupos documentaram niacuteveis elevados de anticorpos
antifosfoliacutepide (aCL anti-β2GPI e anti-protrombina) em diversas doenccedilas
infecciosas como a siacutefilis doenccedilas virais (incluindo a hepatite C Parvoviacuterus B19 e
HIV) malaacuteria e hanseniacutease sem as manifestaccedilotildees cliacutenicas da siacutendrome
antifosfoliacutepide (SAF) (ZANDMAN-GODDARD BLANK SHOENFELD 2002) Os
tiacutetulos elevados geralmente satildeo transitoacuterios diminuindo e desaparecendo apoacutes a
resoluccedilatildeo da infecccedilatildeo (LOIZOU et al 2003 ZANDMAN-GODDARD BLANK
SHOENFELD 2002) Mas em uma minoria dos pacientes a associaccedilatildeo entre
doenccedilas infecciosas e anticorpos antifosfoliacutepide pode levar a complicaccedilotildees severas
frequumlentemente fatais ou seja SAF catastroacutefica (ZANDMAN-GODDARD BLANK
SHOENFELD 2002)
Os resultados de Ribeiro e Proietti (2005) mostrando um aumento da
incidecircncia de anticorpos anti-β2-GPI em pacientes com hanseniacutease associados aos
dados de outros grupos (De LARANAGA et al 2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK
et al 1994 LOIZOU et al 2003) que tambeacutem documentaram niacuteveis elevados de
anticorpos anti-2βGPI lanccedilam duacutevidas sobre a noccedilatildeo de que os anticorpos aCL
associados a infecccedilotildees satildeo independentes dos anticorpos anti-β2GPI e natildeo
dependentes desses anticorpos como nas doenccedilas auto-imunes Em conjunto
30
esses resultados apoacuteiam a noccedilatildeo de que na presenccedila de infecccedilotildees anticorpos aCL
satildeo heterogecircneos em relaccedilatildeo agrave sua dependecircncia da 2GPI (De LARANAGA et al
2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK et al 1994 LOIZOU et al 2003) e as infecccedilotildees
podem desencadear a induccedilatildeo de anticorpos antifosfoliacutepide patogecircnicos em
indiviacuteduos predispostos (LOIZOU et al 2003)
A produccedilatildeo de autoanticorpos na hanseniacutease e leishmaniose pode ser
explicada por diversos mecanismos Na forma mais generalizada dessas doenccedilas
(hanseniacutease VV e leishmaniose visceral) os pacientes apresentam
hipergamaglobulinemia difusa semelhante agrave vista em outras infecccedilotildees como
Schistosoma mansoni T cruzi e Plasmodium A induccedilatildeo de autoanticorpos pode ser
atribuiacuteda agrave ativaccedilatildeo policlonal e proliferaccedilatildeo das ceacutelulas B algumas com auto-
reatividade pertencentes agrave biblioteca de anticorpos naturais em indiviacuteduos normais
(ARGOV et al 1989) Na leishmaniose antiacutegenos soluacuteveis derivados da L major e
L donovani satildeo mitogecircnicos e desencadeiam a produccedilatildeo de imunoglobulinas com
auto-reatividade (ARGOV et al 1989) Crioglobulinemia mista induzida pelo HCV eacute
outro exemplo de ativaccedilatildeo policlonal persistente levando a uma mistura de
autoanticorpos policlonais e monoclonais os quais causam doenccedilas auto-imunes
(AGMON-LEVIN et al 2009)
Mimetismo molecular ou homologias estruturais entre infecccedilotildees e
componentes do hospedeiro podem ser agrave base da produccedilatildeo de autoanticorpos
como no caso da febre reumaacutetica onde o componente M da membrana do
estreptococo apresenta homologia com peptiacutedeos cardiacuteacos cerebrais e sinoviais A
associaccedilatildeo da siacutendrome de Guillain-Barreacute com a infecccedilatildeo pelo Campylobacter
jejeuni representa outro exemplo de mimetismo molecular como base de uma
manifestaccedilatildeo auto-imune A reatividade cruzada entre agentes infecciosos e auto-
antiacutegenos jaacute foi demonstrada para o M leprae (McADAM MUDD SHOENFELD
1984) e M tuberculosis (SHOENFELD et al 1986) e a inibiccedilatildeo de anticorpos anti-
Sm anti-RNP e anti-SSB por promastigotas intactas de Leishmania apoacuteia a
homologia entre antiacutegenos nucleares e a Leishmania (ARGOV et al 1989)
A disseminaccedilatildeo de epiacutetopos a emergecircncia de novos anticorpos ou a
resposta de ceacutelulas T a um novo epiacutetopo (subdominante ou criacuteptico) no mesmo
antiacutegeno ou em outro antiacutegeno foi demonstrada em modelos experimentais e na
doenccedila humana alguns autores demonstraram a disseminaccedilatildeo molecular do
antiacutegeno Sm para reatividade anti-RNP (STAUB 1998) no LES enquanto na febre
31
reumaacutetica o estado de autoimunidade crocircnica que afeta as vaacutelvulas cardiacuteacas pode
resultar em uma resposta imunoloacutegica contra o colaacutegeno e laminina (KIVITY et al
2009 PORDEUS et al 2008) As infecccedilotildees tambeacutem podem desempenhar um papel
importante na induccedilatildeo da autoimunidade atraveacutes da liberaccedilatildeo de antiacutegenos
sequumlestrados apoacutes lesatildeo tecidual ou aumentando a exibiccedilatildeo de epiacutetopos criacutepticos
no meio inflamatoacuterio apresentando assim novos antiacutegenos ao sistema imunoloacutegico
(KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)
15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES
AGUDAS VIRAIS
O conceito de auto-imunidade induzida por viacuterus natildeo eacute exclusivo para
doenccedilas hepaacuteticas O viacuterus Coxsackie do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um
terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite infecciosa e estaacute implicado nas miocardites
auto-imunes reagindo contra a miosina cardiacuteaca (GIST BELL 1974) Niwa et al
(1984) encontraram elevaccedilatildeo transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator
reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas
virais comuns como varicela sarampo influenza caxumba herpes zoster e
exantema suacutebito
A patogecircnia da infecccedilatildeo viral inclui pelo menos trecircs tipos de interaccedilotildees
com o hospedeiro vertebrado 1) o efeito do agente sobre as ceacutelulas 2) a maneira
de disseminaccedilatildeo do agente no organismo infectado 3) a resposta imunoloacutegica e a
sua influencia no processo infeccioso Destacam-se dois tipos principais da
interaccedilatildeo a destruiccedilatildeo celular e a resposta imunoloacutegica (FIGUEIREDO 1999
CATALAN-SOARES PROIETTI CARNEIRO-PROIETTI 2006) O viacuterus Coxsackie
do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite
infecciosa e estaacute implicado nas miocardites auto-imunes reagindo contra a miosina
cardiacuteaca (GERSHON KONDO 1971) Niwa et al (1984) encontraram elevaccedilatildeo
transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo
anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas virais comuns como varicela sarampo
influenza caxumba herpes zoster e exantema suacutebito
32
16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN
De acordo com o II Consenso Brasileiro de FAN em HEp 2
(DELLAVANCE et al 2003) os AAN satildeo encontrados comumente em uma
variedade de doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Satildeo uacuteteis na investigaccedilatildeo dessas
doenccedilas auxiliando no diagnoacutestico de patologias como LES esclerose sistecircmica
progressiva (ESP) doenccedila mista do tecido conjuntivo (DMTC) siacutendrome de Sjoumlgren
(SS) polimiosite e dermatomiosite
Eles podem estar presentes em um pequeno percentual da populaccedilatildeo
aparentemente sadia essa frequumlecircncia eacute maior em mulheres e aumenta com a idade
Segundo a literatura a positividade entre 20 a 60 anos varia entre percentuais mais
altos (133) para tiacutetulos baixos e mais baixos (33) para tiacutetulos mais elevados
(DELLAVANCE et al 2003)
A pesquisa dos anticorpos antinucleares pode ser realizada por diferentes
teacutecnicas a imunofluorescecircncia indireta eacute a mais utilizada por sua sensibilidade
reprodutibilidade e facilidade de execuccedilatildeo A sensibilidade aumenta
significativamente quando se utiliza como substrato lacircminas com ceacutelulas Hep 2
(ceacutelulas de carcinoma de laringe humana) por causa da maior expressatildeo de
antiacutegenos na superfiacutecie dessas ceacutelulas comparados aos expressos nas ceacutelulas de
fiacutegado ou de rins de camundongos que se utilizavam anteriormente
Em geral eacute possiacutevel detectar melhor a presenccedila de AAN por associaccedilatildeo
de trecircs anti-soros isotipos especiacuteficos (anti-IgG anti-IgA e anti-IgM) A pesquisa
realizada por essa teacutecnica serve de triagem inicial para a presenccedila de AAN Eacute
normalmente denominada pesquisa de FAN ou AAN
A realizaccedilatildeo de outras metodologias tais como as imunoenzimaacuteticas
permite uma avaliaccedilatildeo isolada dos diferentes auto-anticorpos sugeridos pelos
padrotildees de fluorescecircncia encontrados no FAN A identificaccedilatildeo desses AAN permite
um diagnoacutestico mais preciso e eles podem ser utilizados em muitos casos como
marcador para uma das diferentes doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Muitas dessas
patologias apresentam um perfil distinto de auto-anticorpos que auxilia o diagnoacutestico
A presenccedila de FAN positivo em pessoas aparentemente sadias pode ser
devida a algumas situaccedilotildees
minus Doenccedila auto-imune precoce ainda natildeo expressa clinicamente
33
minus distuacuterbio imunoloacutegico transitoacuterio causado por doenccedila natildeo-imune
tais como infecccedilotildees principalmente virais
minus uso de medicamentos e neoplasias
minus manifestaccedilatildeo incompleta de uma siacutendrome ou seja o paciente
sintetiza o anticorpo poreacutem esse quadro natildeo evolui para doenccedila
minus fenocircmeno auto-imune fisioloacutegico
O resultado do FAN eacute expresso em tiacutetulo e padratildeo uma vez que ambos
os paracircmetros tecircm importacircncia para a avaliaccedilatildeo do significado cliacutenico do exame O
tiacutetulo do FAN corresponde agrave maior diluiccedilatildeo capaz de demonstrar fluorescecircncia
inequiacutevoca e didaticamente pode ser dividido em
minus Baixo menor 180
minus Moderado 1160
minus Moderadamente elevado 1320
minus Alto maior 1640
Nas pesquisas realizadas por imunofluorescecircncia indireta os resultados
satildeo expressos em tiacutetulos segundo as diluiccedilotildees empregadas Eacute possiacutevel trabalhar
utilizando-se como limite tiacutetulos de 140 que permitem maior sensibilidade ou de
180 que permitem maior especificidade ou seja um menor nuacutemero de falso-
positivos
Na praacutetica cliacutenica satildeo considerados significativos tiacutetulos superiores a
1160 Os resultados com tiacutetulos positivos satildeo acompanhados pela descriccedilatildeo do
padratildeo de fluorescecircncia encontrado que serve como orientaccedilatildeo da presenccedila de um
antiacutegeno especiacutefico e em alguns casos como padratildeo diagnoacutestico Em determinadas
situaccedilotildees em especial no LES em atividade pode ocorrer agrave observaccedilatildeo de mais de
um padratildeo de fluorescecircncia
O padratildeo do FAN a seu turno aponta uma probabilidade maior ou menor
de doenccedila auto-imune e ateacute mesmo sugere o antiacutegeno nuclear envolvido e por
consequumlecircncia a afecccedilatildeo com ele mais relacionada Os padrotildees homogecircneo
centromeacuterico e pontilhado grosso satildeo os mais indicativos de processos de
autoimunidade uma vez que se associam a diversas condiccedilotildees reumaacuteticas
especialmente ao LES e agrave esclerose sistecircmica e tambeacutem a enfermidades hepaacuteticas
tais como a cirrose biliar primaacuteria e a hepatite auto-imune (KILLENBERG 2000)
34
Jaacute o pontilhado fino o pontilhado grosso reticulado e a membrana nuclear
tecircm maior significado quando encontrados em tiacutetulos altos uma vez que podem
estar presentes em tiacutetulos baixos em indiviacuteduos hiacutegidos Por sua vez o pontilhado
fino denso mesmo quando elevado em pessoas assintomaacuteticas soacute guarda relaccedilatildeo
com alguma doenccedila em cerca de 20 dos casos (DELLAVANCE et al 2003)
O padratildeo pontilhado pode tambeacutem ser referido como padratildeo salpicado
Outros padrotildees de fluorescecircncia podem ser encontrados em menor frequumlecircncia Os
pontilhados citoplasmaacutetico grossos ou reticulares associados agrave presenccedila de
anticorpos antimitococircndrias em pacientes com cirrose biliar primaacuteria o
citoplasmaacutetico homogecircneo relacionado a proteiacutenas ribossocircmicas em pacientes com
LES e o padratildeo pontilhado fino citoplasmaacutetico que pode estar associado agrave
presenccedila de anticorpos anti-JO-1 anti-PCNA e proteiacutenas da membrana celular em
pacientes com LES outras patologias do tecido conjuntivo e hepatopatias auto-
imunes (DELLAVANCE et al 2003)
Quadro 1 - Padrotildees de fluorescecircncia encontrados em maior frequumlecircncia e patologias relacionadas
Padrotildees de Fluorececircncia Antiacutegenos Patologias Relacionadas
Perifeacuterico DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES
Homogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA
LES AR lupus induzido por drogas
Perifeacutericohomogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES
Pontilhado grosso SM RNP LES DMTC
Pontilhado fino nuclear SS-A (RO) SS-B (La) SS LES
Nucleolar Proteiacutenas Nucleolares ESP Centromeacuterico Proteiacutenas de centrocircmeros Siacutendrome de CREST
Fonte Dellavance et al 2003 Quadro 2 - Anti-ena - auto-anticorpos contra antiacutegenos extraiacutedos do nuacutecleo e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleares Patologias Relacionadas SM LES RNP DMTC LES ESP AR e Polimiosite
SS-A (Ro) SS LES lupus neonatal e forma cutacircnea subaguda
SS-B (La) SS LES luacutepus neonatal e forma cutacircnea subaguda
Scl 70 ESP Jo -1 Polimiosite e dermatomiosite Fonte Dellavance et al 2003
35
Quadro 3 ndash Padrotildees de FAN nuclear e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes
Padrotildees Nucleares Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos
Nuclear Pontilhado Centromeacuterico Anticorpo anti-centrocircmero Esclerose Sistecircmica forma CREST Cirrose Biliar Primaacuteria
Nuclear homogecircneo Anticorpo anti-DNA nativo Lupus Eritematoso Sistecircmico (LES) Anticorpo anti-Histoma LES induzido por drogas LES idiopaacutetico Anticorpo anti-cromatina (DNAHistona Nucleossomo) Artrite Reumatoacuteide (AR) Artrite Idiopaacutetica Juvenil importante associaccedilatildeo com uveiacutete na forma oligoarticular Siacutendrome de Felty Cirrose Billar Primaacuteria
Nuclear tipo membrana nuclear contiacutenua Anticorpo anti-Iamin e contra envelope nuclear - Iamins Hepatites auto-imunes Raramente associado a doenccedilas reumaacuteticas (algumas formas de LES e esclerodermia linear)
Nuclear pontilhado pleomoacuterficoPCNA Anticorpo contra nuacutecleo de ceacutelulas em proliferaccedilatildeo LES
Nuclear pontilhado fino denso Anticorpo anti-proteina p 75 kDa pode ser encontrado em indiviacuteduos saudaacuteveis processos inflamatoacuterios inespeciacuteficos doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Cistite Intersticial Dermatite Atoacutepica Psoriacutease e Asma
Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos
Anticorpo anti-p80 coilina natildeo apresenta associaccedilatildeo cliacutenica definida
Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos
Anticorpo anti-Sp100 (anti-p95) Cirrose Biliar Primaacuteria pode ocorrer em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas
Nuclear pontilhado grosso Anticorpo anti-Sm LES Anticorpo anti-RNP criteacuterio obrigatoacuterio no diagnostico da doenccedila mista do Tecido conjuntivo (DMTC) tambeacutem ocorre no LES Esclerose Sistecircmica (ES) e AR
Nuclear pontilhado fino Anticorpo anti SSARo Siacutendrome de Sjogren Primaacuteria (SS) LES Lupus neonatal e Lupus Cutacircneo Subagudo Anticorpo anti-SSBLa Lupus neonatal LES SS Anticorpo anti-Mi-2 Dermatomiosite embora raramente ocorra na polimiosite do adulto
Fonte Dellavance et al 2003
36
Quadro 4 - Padrotildees de FAN citoplasmaacuteticos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes
Padrotildees Citoplasmaacuteticos e Relacionados ao Aparelho Mitoacutetico Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos
Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina Hepatite auto-imune Cirrose Anticorpo anti-miosine Hepatite C Hepatocarcionoma Miastenia Gravis Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida
Citoplasmaacutetico Fibrilar Segmentar Anti actinina anti--vinculina e anti-tropomiose Miastenia Gravis Doenccedila de Crohn e Colite ulcerativa Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia cliacutenica definida
Citoplasmaacutetico Pontilhado Polar Anticorpo Anti-golginas (cisternas do aparelho de Golgi) raro no LES SS e outras doenccedilas auto-imunes sistecircmicas Relato na Ataxia Cerebelar Idiopaacutetica Degeneraccedilatildeo Cerebelar Paraneoplaacutesica infecccedilotildees virais pelo Epstein Barr (EBV) e pelo viacuterus da imunodeficiecircncia Humana (HIV) Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida
Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Anticorpo anti-Histidill t RNA sintetase (Jo-1) anticorpo marcador de Polimiosite no adulto Descrito raramente na Dermatomiosite
Citoplasmaacutetico Pontilhado com Pontos Isolados
Anticorpo anti-EEA1 e anti-fosfatidilserina natildeo haacute associaccedilotildees clinicas bem definida Anticorpo anti-GWBSS tambeacutem encontrado em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas
Citoplasmaacutetico Pontilhado Reticulado Anticorpo anti-mitococircndria Cirrose Biliar Primaacuteria Esclerose Sistecircmica Eacute relativamente comum o encontro deste padratildeo na ausecircncia de anticorpos anti-mitococircndria
Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Denso Anti PL7PL12 Raramente associado a Polimiosite Anticorpo P-ribossomal Este padratildeo ocorre no LES se a associaccedilatildeo eacute com anti-proteina P ribossomal
Citoplasmaacutetico Fibrilar Filamentar Anticorpo anti-vimentina e anti-queratina Anti-queratina eacute o anticorpo mais importante em doenccedila hepaacutetica alcooacutelica Descritos em vaacuterias doenccedilas inflamatoacuterias e infecciosas Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida
Aparelho mitoacutetico Tipo Centriacuteolo Anticorpo anti-enolase em baixos tiacutetulos natildeo tem associaccedilatildeo cliacutenica definida Em altos tiacutetulos eacute sugestivo de Esclerose Sistecircmica
Aparelho mitoacutetico Tipo ponte Intercelular
Anticorpo anti Tubulina Pode ser encontrado no LES e na DMTC outros anticorpos ainda natildeo bem definidos podem gerar o mesmo padratildeo
Aparelho mitoacutetico Tipo NuMa2 Anticorpo anti-HsEg5 diversas condiccedilotildees auto-imunes com baixa especificidade
Fonte Dellavance et al 2003
37
Quadro 5 - Padrotildees de FAN mistos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Mistos Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos
Misto do tipo nucleolar homogecircneo e nuclear pontilhado grosso com placa metafaacutesica decorada em anel (cromossomos negativos)
Anticorpo anti-Ku Superposiccedilatildeo Polimiose e Esclerose Sistecircmica Podem ocorrer no LES e Esclerodermia
Misto do tipo nuclear e nucleolar pontilhado com placa metafaacutesica positiva
Anticorpo anti-topoisomerase (Scl-70) ES forma difusa Mais raramente pode ocorrer na Siacutendrome CREST e superposiccedilatildeo PolimiositeEsclerodermia
Misto do tipo Citoplasmaacutetico pontilhado fino denso e homogecircneo e nucleolar homogecircneo
Anticorpo anti rRNP LES frequumlentemente relacionado agrave Psicose Luacutepica
Misto do tipo nuclear pontilhado fino com fluorescecircncia do aparelho mitoacutetico
Anticorpo anti-NuMA1SS pode ocorrer tambeacutem em outras condiccedilotildees auto-imunes ou inflamatoacuterias crocircnicas
Fonte Dellavance et al 2003
Quadro 6 - Padrotildees de FAN nucleolares e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleolares Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos
Nucleolar Aglomerado
Anticorpo anti-Fibrilarina (U3-nRNP) Esclerose Sistecircmica (ES) especialmente com comprometimento visceral grave entre eles a hipertensatildeo pulmonar
Nucleolar Pontilhado
Anticorpo anti-NOR-90 ES tambeacutem descrito em outras doenccedilas do tecido conjuntivo poreacutem sem relevacircncia clinica definida Anticorpos anti-RNA polimerase I ES de forma difusa com tendecircncia para comprometimento visceral mais frequumlente e grave
Nucleolar Homogecircneo
Anticorpo anti-PMScl Siacutendrome de Superposiccedilatildeo de Polimiosite com Esclerose Sistecircmica Raramente encontrado em casos de Polimiosite ou Esclerose Sistecircmica sem superposiccedilatildeo cliacutenica Outros auto-anticorpos mais raros podem apresentar esse padratildeo
Fonte Dellavance et al 2003
De acordo com o 3deg Consenso (DELLAVANCE et al 2009) foram
comunicados dois novos padrotildees de fluorescecircncia por participantes Vaacuterios outros
membros testemunharam jaacute haver observado esses padrotildees O primeiro trata-se de
um padratildeo nuclear pontilhado fino aproximando-se da textura homogecircnea e com
placa metafaacutesica corada da mesma forma Sua associaccedilatildeo cliacutenica e identidade
imunoloacutegica natildeo estatildeo definidas Sua importacircncia deriva do fato de que pode ser
facilmente confundido com o padratildeo pontilhado fino denso e com o padratildeo
homogecircneo O segundo trata-se de um padratildeo citoplasmaacutetico em forma de
pequenos bastotildees (rods) e ciacuterculos (rings) que aparentemente estaacute associado agrave
38
infecccedilatildeo pelo HCV Haacute estudos em curso por alguns grupos de pesquisa com a
finalidade de estabelecer sua identidade imunoloacutegica
Como ainda natildeo estatildeo definitivamente caracterizados esses dois novos
padrotildees foram considerados preliminares e o 3deg Consenso recomendou que os
mesmos fossem completamente caracterizados e apresentados na proacutexima versatildeo
do Consenso (DELLAVANCE et al 2009)
39
2 JUSTIFICATIVA
As inflamaccedilotildees do fiacutegado provocadas pelos viacuterus hepatotroacutepicos atingem
milhotildees de pessoas e representam significativos problemas de sauacutede puacuteblica em
todo o mundo No Brasil a Regiatildeo Norte responde por um significativo percentual
dos portadores de hepatite C Dentre as manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo
pelo viacuterus C as doenccedilas autoimunes tecircm significativo impacto na evoluccedilatildeo cliacutenica
desses pacientes A presenccedila de anticorpo antinuacutecleo eacute um marcador importante de
autoimunidade e apesar de existirem trabalhos relatando a pesquisa desse fator em
portadores de viacuterus C tais estudos ainda natildeo foram realizados na nossa regiatildeo
sobretudo correlacionando-se com o genoacutetipo do viacuterus responsaacutevel pela infecccedilatildeo
considerando que o genoacutetipo eacute um marcador de resposta ao tratamento ou
considerando que pacientes portadores do genoacutetipo 1 natildeo respondem
satisfatoriamente ao tratamento instituiacutedo pelo protocolo atual
21 ASPECTOS EacuteTICOS
A pesquisa a ser realizada apresenta relevacircncia social e natildeo perde o
sentido de sua destinaccedilatildeo soacutecio-humanitaacuteria (justiccedila e equidade)
Este trabalho adequa-se aos princiacutepios cientiacuteficos que o justificam e
apresenta possibilidade concreta de responder a incertezas tais como FAN e o
genoacutetipo viral em pacientes com infecccedilatildeo pelo viacuterus da hepatite C ldquoestatildeo
relacionadosrdquo
Segue rigorosamente os procedimentos descritos na Resoluccedilatildeo 19696-
CNSMS (BRASIL 1996) assegurando a confidenciabilidade e proteccedilatildeo da
identidade do sujeito da pesquisa no momento da afericcedilatildeo dos dados e sua
posterior utilizaccedilatildeo
Por tratar-se de um estudo que faraacute somente revisatildeo de soroteca os
participantes natildeo seratildeo submetidos a riscos de origem orgacircnica eou quiacutemica
40
3 OBJETIVOS
31 OBJETIVO GERAL
Estabelecer associaccedilatildeo entre a presenccedila de teste de FAN e o genoacutetipo
viral em pacientes portadores de infecccedilatildeo pelo HCV
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
I Identificar o padratildeo de fluorescecircncia do FAN em pacientes com diagnoacutestico
laboratorial de infecccedilatildeo pelo HCV
II Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados
pelo HCV de acordo com o gecircnero e a idade
III Identificar a prevalecircncia de FAN em pacientes infectados pelo HCV e natildeo
infectados
IV Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados
pelo HCV de acordo com as alteraccedilotildees bioquiacutemicas
41
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO)
Foi realizado um estudo transversal analiacutetico no Serviccedilo do Nuacutecleo de
Medicina Tropical da Universidade Federal do Paraacute (NMTUFPA) utilizando-se
pacientes oriundos da Fundaccedilatildeo Centro de Hemoterapia e Hematologia do Paraacute
(HEMOPA) e Plano de Assistecircncia ao Servidor (PASIASEP) com coleta de material
bioloacutegico para reconfirmaccedilatildeo do diagnoacutestico de hepatite C no periacuteodo de janeiro de
2009 a maio de 2010
411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C
A populaccedilatildeo de estudo consistiu de 51 pacientes admitidos no NMTUFPA
para reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica tratamento cliacutenico e acompanhamento ambulatorial
de ambos os gecircneros e independente da idade sem exclusatildeo dos pacientes com a
presenccedila de patologias associadas agrave condiccedilatildeo maior (motivadora da pesquisa)
oriundos da Fundaccedilatildeo HEMOPA e PAS
A amostra do grupo foi selecionada a partir da relaccedilatildeo dos prontuaacuterios
catalogados no laboratoacuterio de patologia do NMTUFPA
Os dados foram coletados atraveacutes dos resultados dos exames realizados
no soro de cada paciente O protocolo de coleta teve enfoque na identificaccedilatildeo
individual do paciente bem como a avaliaccedilatildeo cliacutenica dos resultados
412 Grupo de natildeo infectados
Foi utilizado um grupo controle de 100 amostras de soro de indiviacuteduos
doadores de sangue com sorologias negativas para HIV 1 e 2 HTLV 1 e 2 Siacutefilis
Doenccedilas de Chagas Hepatite B e para Hepatite C procedentes da fundaccedilatildeo
HEMOPA
42
42 MEacuteTODO
421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico
Foram colhidos em frasco sem anticoagulante 10ml de sangue perifeacuterico
dos 51 pacientes participantes da pesquisa A amostra sanguiacutenea de cada paciente
foi centrifugada o soro foi separado e colocado em frasco esteacuteril devidamente
identificado armazenado e resfriado de 2 a 8ordmC
Foi realizada no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais a
pesquisa soroloacutegica de anticorpos IgG anti-HCV por teste imunoenzimaacutetico (ELISA)
e os pacientes que apresentaram positividade tiveram seus resultados confirmados
atraveacutes de teacutecnicas moleculares (RT-PCR) e com identificaccedilatildeo do genoacutetipo viral
(genotipagem)
Foi realizado no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa a pesquisa
de FAN dos 51 pacientes selecionados utilizando as amostras existentes na
soroteca
422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C
Foram empregados testes soroloacutegicos de ELISA (Ensaio
Imunoenzimaacutetico) de 3ordf geraccedilatildeo utilizando-se de kits comerciais (kit ETI-AB-HCVK-
4 DiaSorin Itaacutelia) para detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos anti-HCV no soro dos
pacientes
As tiras (poccedilos) necessaacuterias para as reaccedilotildees foram retiradas da geladeira
com antecedecircncia de uma hora e deixadas agrave temperatura ambiente e os reagentes
homogeneizados rapidamente no voacutertex
O primeiro poccedilo da placa ficou o branco da reaccedilatildeo na sequecircncia da
microplaca de ELISA foi dispensado 200 microL do controle negativo em triplicata (trecircs
poccedilos) 200 microL do calibrador em duplicata (dois poccedilos) e 200 microL do controle positivo
em amostra uacutenica (um poccedilo)
Adicionou-se 200 microL do Diluente de Amostra em todos os poccedilos que
continham as amostras dos pacientes a serem dosadas na placa de ELISA
tomando cuidado para natildeo contaminar os poccedilos adjacentes
43
Dispensou-se 50 microL do Diluente do Reagente em todos os poccedilos de
controles calibradores e amostras cobrimos com adesivo para evitar evaporaccedilatildeo e
contaminaccedilatildeo das amostras e incubamos a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC
Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com
300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem diluiacuteda
Pipetou-se 100 microL de Conjugado Enzimaacutetico exceto no poccedilo do branco e
incubou-se a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se
cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com 300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem
diluiacuteda
Pipetou-se 100 microL de CromoacutegenoSubstrato em todos os poccedilos
Incubamos a microplaca protegendo-a de luz intensa e direta agrave temperatura
ambiente (18-24ordmC) por 15 min
Pipetou-se 100 microL de Aacutecido Sulfuacuterico em todos os poccedilos para ldquopararrdquo a
reaccedilatildeo enzimaacutetica e mediu-se a absorbacircncia da soluccedilatildeo obtida em leitor de ELISA
com filtro de 450 nM
O teste foi validado de acordo com os valores do controle de qualidade
preconizados pelo fabricante e que devem tanger os valores para o branco da
reaccedilatildeo le 0100 controle negativo le 0050 controle positivo ge 1000 e calibrador ge
1100 Para as amostras testadas os valores reagentes e natildeo reagentes para
pesquisa de anticorpos anti-HCV satildeo interpretados da seguinte maneira natildeo
reagentes com valores le 09 reagentes com valores ge 11 e indeterminados entre
os valores 09 ndash 11
423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia molecular
Nas amostras positivas pela sorologia (ELISA) realizou-se extraccedilatildeo do
RNA viral presente no soro do paciente utilizando kit comercial (QIAmp Viral RNA
kit Quiagen Alemanha) seguindo a teacutecnica adaptada no Laboratoacuterio de Patologia
Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais
Pipetou-se 560 microL de tampatildeo AVL (lise) contendo RNA em tubo de
centriacutefuga de 15 ml identificado adicionou-se 140 microL da amostra e homogenizou-se
em voacutertex por 15s incubando a temperatura ambiente (15-25degC) por 10 min Apoacutes
incubaccedilatildeo centrifugou-se rapidamente o tubo para remover partiacuteculas dispersas
44
Adicionou-se 560 microL de etanol (96-100) na amostra e homogenizou-se
no voacutertex por 15s centrifugando-se rapidamente para remover partiacuteculas dispersas
Depois cuidadosamente transferiu-se 630 microL para as colunas devidamente
identificadas centrifugou-se a 14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo
ficando soacute com a coluna para encaixar em outro tubo
Colocou-se o resto das amostras nas colunas devidas centrifugou-se a
14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo ficando soacute com a coluna para
encaixar em outro tubo Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW1) e
centrifugou-se por 1 min mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo
Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW2) e centrifugou-se por 4 min
mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo
Identificados os tubos para RNA colocou-se as colunas Adicionou-se 60
microL de tampatildeo para eluir (AVE) em cada amostra e centrifugou-se por 1 min
descartando a coluna e ficando com o tubo Colocou-se em banho-maria por 10 min
a 65degC centrifugado rapidamente e colocado no gelo As amostras extraiacutedas foram
congeladas e armazenadas em freezer a -20ordmC
O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado de acordo com a teacutecnica de
RT-PCR qualitativa com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das
Doenccedilas Tropicais da seguinte maneira para o Mix de uma amostra Tampatildeo 12
microL primer ou iniciador k10 1microL primer ou iniciador k11 1microL aacutegua ultrapura livre de
DNAse e RNAse 5 microL Enzima Taq polymerase One-Step (Invitrogen) 1 microL O
primer k10 constitui-se da sequecircncia GGC GAC ACT CCA CCA TRR e o primer k11
da sequecircncia GGT GCA CGG TCT ACG AGA CC
O volume do mix por amostra eacute de 20 microL e o volume da amostra (produto
da extraccedilatildeo) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As amostras
foram colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo eacute realizada a 42ordmC por 45 minutos
temperatura inicial de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 2 minutos seguida de 35 ciclos com
temperatura de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 54ordmC por 30
segundos de extensatildeo a 72ordmC por 45 segundos e temperatura de extensatildeo final de
72ordmC por 7 minutos e um hold de 4ordmC
Para visualizaccedilatildeo do produto dessa 1ordf PCR (RT-PCR) eacute feito um gel de
agarose a 1 (1g de agarose para 100mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de
etidium) que migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os
resultados foram visualizados atraveacutes de luz ultravioleta (UV) Os pacientes
45
positivos que apresentarem ldquobandardquo devem continuar os procedimentos e os
negativos que natildeo apresentarem ldquobandasrdquo deveratildeo ser liberados como
indetectaacuteveis por este meacutetodo
A 2ordf PCR (RFLP) foi responsaacutevel por fazer a amplificaccedilatildeo do cDNA
produto da 1ordf PCR Para esta etapa tambeacutem com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio
de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais foram necessaacuterios para o Mix de uma
amostra Tampatildeo 10X 25 microL DNTP 4 microL MgCl2 15 microL primer ou iniciador k15 1
microL primer ou iniciador k16 1 microL aacutegua ultrapura livre de DNAse e RNAse 125 microL
Enzima Taq platinum (Invitrogen) 05 microL O primer k15 constitui-se da sequecircncia
ACC ATR RAT CAC TCC CCT GT e o primer k16 da sequecircncia CAA GCA CCC TAT
CAG GCA GT
O volume do mix por amostra foi de 23 microL e o volume da amostra
(produto da 1ordf PCR) de 2 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As
amostras satildeo colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo se realiza a temperatura inicial
de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 4 minutos seguida de 35 ciclos com temperatura de
desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 55ordmC por 45 segundos de
extensatildeo a 72ordmC por 1 minuto e temperatura de extensatildeo final de 72ordmC por 7
minutos e um hold de 4ordmC
O produto da 2ordf PCR eacute observado atraveacutes de um gel de agarose a 1 (1g
de agarose para 100 mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que
migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os resultados
foram visualizados atraveacutes de luz UV (ultravioleta) Os pacientes positivos que
apresentaram ldquobandardquo (fragmento amplificado) se continuou os procedimentos e os
negativos que natildeo apresentaram ldquobandasrdquo foram repetidos para o procedimento da
2ordf PCR
424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem)
Os pacientes positivos para a 2ordf PCR foram submetidos agrave genotipagem
do viacuterus atraveacutes do meacutetodo de RFLP utilizando um par de enzimas de restriccedilatildeo
AVA II e RSA I Essa teacutecnica tambeacutem foi adaptada no Laboratoacuterio de Patologia
Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais
46
Na determinaccedilatildeo do genoacutetipo cada amostra eacute utilizada duas vezes
sendo uma reaccedilatildeo para AVA II e uma para RSA I portanto cada amostra teve dois
tubos correspondentes
Para a preparaccedilatildeo do mix de uma amostra para a enzima de restriccedilatildeo
AVA II (Promega) foram utilizados Buffer C X 30 2 microL aacutegua ultrapura livre de
DNAse e RNAse 125 microL AVA II 05 microL Para o mix de uma amostra de RSA I
(Invitrogen) satildeo necessaacuterios React 1 10X 2 microL aacutegua ultrapura libre de DNAse e
RNAse 11 microL RSA I 2 microL
O volume do mix por amostra foi de 15 microL e o volume da amostra
(produto da 2ordf PCR) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 20 microL para
cada frasco correspondente a sua enzima de restriccedilatildeo As amostras formatildeo ldquoparesrdquo
de tubos AVA II e RSA I e satildeo colocadas em banho-maria a 37ordmC overnight para
digerir (cortar) os fragmentos
Para visualizaccedilatildeo do produto da digestatildeo (RFLP) e verificaccedilatildeo dos
genoacutetipos foi preparado um gel de agarose a 2 (2g de agarose para 100 mL de
tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que migrou em cuba de eletroforese
com 100V 500A por 60 minutos Os resultados foram visualizados atraveacutes de luz UV
(ultravioleta) Os pacientes positivos apresentam ldquobandasrdquo (fragmentos) de
tamanhos diferentes O nuacutemero de bandas e sua disposiccedilatildeo no gel formaram
padrotildees de combinaccedilotildees correspondentes a cada genoacutetipo viral
425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas HEp-2
A pesquisa de auto-anticorpo contra antiacutegenos celulares foi realizada no
Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa pela teacutecnica de imunofluorescecircncia
indireta que os identifica atraveacutes da ligaccedilatildeo destes auto-anticorpos aos antiacutegenos do
substrato sendo esta ligaccedilatildeo revelada pela adiccedilatildeo de um soro com atividade Anti-
IgG conjugado agrave fluoresceiacutena
As amostras foram testadas utilizando-se um conjunto diagnoacutestico
comercial Antinuclear Antibody HEp-2 da Hemagen Diagnostics
Na primeira fase da reaccedilatildeo os soros diluiacutedos 140 colocados em contato
com o substrato durante 20 minutos seguido de lavagem com soluccedilatildeo salina
tamponada por 10 minutos Na segunda fase aplicacou-se a substacircncia
47
fluorescente sendo o conjugado diluiacutedo 130 deixando-se por 10 minutos seguida
de nova lavagem de 10 minutos e montagem da lacircmina com glicerina tamponada
Em cada lacircmina foram utilizados controle positivo e controle negativo
A leitura das lacircminas foi realizada em microscoacutepio de imunofluorescecircncia
marca Nikon modelo Eclipse E-200
Os criteacuterios morfoloacutegicos observados durante a leitura foram
a) aspecto da matriz nuclear
b) aspecto do nucleacuteolo
c) observaccedilatildeo de todos os estaacutegios de divisatildeo nuclear
d) aspecto do fuso mitoacutetico
e) aspecto do citoplasma
43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados coletados foram estruturados em um banco de dados no qual
tambeacutem foram confeccionadas tabelas e graacuteficos para representaccedilatildeo dos dados
Posteriormente foram analisados no programa Bioestat 50 para a geraccedilatildeo de
resultados estatiacutesticos que comprovassem a associaccedilatildeo de variaacuteveis pertinentes ao
estudo considerando o intervalo de confianccedila (IC) 95 e niacutevel α 5 (p-valor le 005)
isto eacute um achado seraacute considerado estatisticamente significante se valor de ldquoprdquo for
menor ou igual a 005 e seraacute considerado sem significacircncia estatiacutestica se esse valor
de ldquoprdquo for maior que 005
Nas variaacuteveis quantitativas foram realizadas as medidas de tendecircncia
central sendo calculado a meacutedia e a mediana com seus respectivos desvios
padrotildees O teste t foi usado para comparar as idades entre as amostras
O teste do Qui-quadrado e o teste G foram aplicados nas comparaccedilotildees de
n amostras independentes cujas proporccedilotildees observadas nas diversas modalidades
estiveram dispostas em tabelas de contigecircncia l x c onde se determinou as
proporccedilotildees observadas nas diferentes categorias e se estas tinham alguma
associaccedilatildeo
48
5 RESULTADOS
O Padratildeo de FAN em 100 dos 51 pacientes infectados pelo HCV e em
2 dos natildeo infectados pelo HCV ocorreu Citoplasmaacutetico
Com relaccedilatildeo agrave distribuiccedilatildeo dos pacientes por gecircnero observou-se uma
predominacircncia do gecircnero masculino (667) A faixa etaacuteria predominante foi a de 30
a 50 anos de idade (628) seguida da faixa etaacuteria compreendida entre 51 e 60
anos (196) No que diz respeito agrave naturalidade houve uma predominacircncia de
paraenses em 922 da amostra A maioria dos pacientes incluiacutedos no estudo foi
proveniente da Fundaccedilatildeo HEMOPA (98) por se tratarem de candidatos a doaccedilatildeo
de sangue (Tabela 1)
Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV segundo as caracteriacutesticas demograacuteficas janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Caracteriacutesticas demograacuteficas n Teste estatiacutestico Gecircnero
Masculino 34 667 Qui-quadrado Feminino 17 333 p = 00251
Total 51 1000
Idade (anos) lt 30 6 118 Qui-quadrado
30 a 40 16 314 p = 00094 41 a 50 16 314 51 a 60 10 196
gt 60 3 59 Total 51 1000
Naturalidade
Paraense 47 922 Qui-quadrado Macapaense 1 20 p lt 00001 Maranhense 1 20
Pernambucano 1 20 Gauacutecho 1 20
Total 51 1000
Procedecircncia Qui-quadrado HEMOPA 50 980 p lt 00001
IASEP 1 20 Total 51 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
49
Identificou-se no estudo a predominacircncia do genoacutetipo viral do tipo 1
(882) estando o genoacutetipo 3 presente em 118 dos casos Em 255 dos
pacientes foi observado uma positividade para FAN sendo que todos apresentaram
o padratildeo citoplasmaacutetico (Tabela 2)
Tabela 2 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV conforme os resultados laboratoriais de FAN citoplasmaacutetico e genotipagem janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Exames laboratoriais n Teste estatiacutestico
Genoacutetipo viral - HCV
Tipo 1 45 882 Qui-quadrado
Tipo3 6 118 p lt 00001
Total 51 1000
FAN Qui-quadrado
Positivo (citoplasmaacutetico) 13 255 p = 00008
Negativo 38 745 Total 51 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
Observou-se uma baixa positividade para o FAN tanto no gecircnero
masculino (294) quanto no gecircnero feminino (176) Natildeo houve diferenccedila
estatiacutestica significante entre os gecircneros e a anaacutelise do FAN (p = 05652) Isto eacute
independendo do gecircnero do paciente nada se poderaacute inferir se o mesmo teraacute maior
ou menor chance de possuir um FAN positivo ou negativo (Tabela 3)
Tabela 3 ndash Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
FAN (citoplasmaacutetico)
Gecircnero Teste estatiacutestico
(Teste G) Masculino Feminino
N N
Positivo 10 294 3 176
Negativo 24 706 14 824 p = 05652
Total 34 1000 17 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
Dentre os pacientes infectados o genoacutetipo viral tipo 1 e o tipo 3
predominaram no gecircnero masculino embora natildeo havendo diferenccedila significativa
entre os grupos (p=06376)(Tabela 4)
50
Tabela 4 - Relaccedilatildeo da genotipagem de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Gecircnero
Grupos estudados Teste estatiacutestico
(Teste G) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3
n n Masculino 29 644 5 833 p=06376 Feminino 16 356 1 167
Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa
Na faixa etaacuteria de 30 a 50 anos foi observada uma maior proporccedilatildeo (667)
do genoacutetipo viral do tipo 3 enquanto que para o genoacutetipo tipo 1 foi de 628 natildeo
tendo essa diferenccedila significacircncia estatiacutestica (Tabela 5)
Tabela 5 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e faixa etaacuteria - janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)
Idade (anos) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n
lt 30 04 118 0 00
30 a 40 15 314 3 500 p = 06401
41 a 50 15 314 1 167
51 a 60 08 196 2 333
gt 60 03 59 0 00 Total 45 1000 6 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
A anaacutelise descritiva das idades dos pacientes demonstrou que a meacutedia e
a mediana foi de 43 anos para aqueles com genoacutetipo viral tipo 1 no entanto para o
genoacutetipo viral tipo 3 a meacutedia foi de 44 e a mediana de 42 anos Observou-se que a
idade miacutenima dos pacientes com genoacutetipo viral-HCV do tipo 1 e 3 foi
respectivamente de 20 e 32 anos e a maacutexima foi de 68 e 57 anos perfazendo uma
amplitude total de 48 e 25 anos respectivamente Natildeo houve significacircncia estatiacutestica
entre as idades encontradas nos genoacutetipos 1 e 3 (Tabela 6 )
De acordo com o FAN citoplasmaacutetico a idade miacutenima dos pacientes com
FAN positivo e negativo foi respectivamente de 30 e 20 anos e a maacutexima foi de 53 e
68 anos perfazendo uma amplitude total de 23 e 48 anos respectivamente As
idades meacutedia e mediana foram respectivamente 435 e 46 anos nos pacientes com
o FAN positivo e meacutedia de 43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN
51
negativo Natildeo houve diferenccedila estatisticamente significativa entre as idades
encontradas nos pacientes com FAN positivo e negativo (Tabela 6)
Tabela 6 - Estudo descritivo da idade dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e presenccedila do FAN citoplasmaacutetico janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Grupos Estudados Genoacutetipo viral - HCV Auto anticorpo
Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 FAN (+) FAN (-) IDADE
Tamanho da amostra 45 6 13 38
Idade miacutenima 20 32 30 20
Idade maacutexima 68 57 53 68
Amplitude Total 48 25 23 48
Meacutedia Aritmeacutetica 43 44 435 43
Mediana 43 42 46 42
Desvio Padratildeo 107 93 78 113
Teste t p = 08363 p = 08809 Fonte Protocolo da pesquisa
Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos em que foram analisados AST
ALT ASTALT γ-GT e fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo
semelhantes dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e 3 natildeo
atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos
(Tabela 7)
Tabela 7- Distribuiccedilatildeo dos genoacutetipos dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Paracircmetros bioquiacutemicos
Genoacutetipo viral - HCV Teste estatiacutestico
(Teste t) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3
micro plusmn DP micro plusmn DP
AST 353 plusmn 219 328 plusmn 137 p = 07907
ALT 372 plusmn 321 288 plusmn 136 p = 05355
ASTALT 12 plusmn 07 14 plusmn 11 p = 06110
γ-GT 403 plusmn 38 302 plusmn 138 p = 02194
Fosfatase alcalina 1126 plusmn 443 1087 plusmn 376 p = 08349
Fonte Protocolo da pesquisa
Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos de AST ALT ASTALT γ-GT e
fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os
52
pacientes com FAN positivo e negativo natildeo sendo observada significacircncia
estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos de FAN (Tabela 8)
Tabela 8 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Paracircmetros bioquiacutemicos Auto anticorpos
Teste estatiacutestico (Teste t) Positivo Negativo
micro plusmn DP micro plusmn DP
AST 419 plusmn 238 326 plusmn 197 p = 01704
ALT 408 plusmn 29 346 plusmn 312 p = 05347
ASTALT 13 plusmn 08 12 plusmn 07 p = 05732
γ-GT 34 plusmn 21 409 plusmn 40 p = 04369
Fosfatase alcalina 1073 plusmn 345 1138 plusmn 462 p = 06431 Fonte Protocolo da pesquisa
Na comparaccedilatildeo entre resultados positivos e negativos do FAN
citoplasmaacutetico observou-se uma maior prevalecircncia da negatividade tanto em
pacientes natildeo infectados (98) como em pacientes infectados (745) pelo HCV
sendo essa diferenccedila estatisticamente significativa (plt00001) o que representa
uma natildeo associaccedilatildeo entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV
(Tabela 9)
Tabela 9 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico segundo a presenccedila ou ausecircncia de infecccedilatildeo por HCV janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
FAN (citoplasmaacutetico)
Pacientes Teste estatiacutestico (Teste G)
Infectados Natildeo infectados
N n
Positivo 13 255 2 2
Negativo 38 745 98 98 p lt 00001
Total 51 1000 100 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
Comparando-se os resultados do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos
viras observa-se que o resultado negativo eacute superior ao positivo em ambos os
genoacutetipos virais sendo 711 para o genoacutetipo viral 1 e 100 para o genoacutetipo viral 3
No entanto esta diferenccedila observada natildeo eacute estatisticamente significativa (p=02573)
(Tabela 10)
53
Tabela 10 - Distribuiccedilatildeo do FAN de acordo com o genoacutetipo viral janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
FAN (citoplasmaacutetico)
Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)
Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n
Positivo 13 289 0 00 p=02573 Negativo 32 711 6 1000
Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa
54
6 DISCUSSAtildeO
Desde o primeiro marcador soroloacutegico para diagnoacutestico do Lupus
Eritematoso Sistecircmico (LES) a ceacutelula LE descrita por Hargraves (1948) vaacuterios
substratos antigecircnicos foram utilizados para o estudo dos auto-anticorpos os quais
terminaram amplamente substituiacutedos pelas ceacutelulas HEp-2 Estas apresentam
significativas vantagens sobre os demais pela sua sensibilidade variedade de
antiacutegenos presentes e pelas facilidades morfoloacutegicas para o seu estudo
O uso da imunofluorescecircncia indireta para a visualizaccedilatildeo dos anticorpos
antinucleares nas ceacutelulas HEp-2 permite o reconhecimento de mais de 30 diferentes
padrotildees de fluorescecircncia como nucleares nucleolares da membrana nuclear do
aparelho mitoacutetico e citoplasmaacutetico todos satildeo proporcionados por diferentes auto-
anticorpos
A partir do 1deg Consenso Brasileiro para Padronizaccedilatildeo dos Laudos de FAN
(HEp-2) os criteacuterios para o preparo interpretaccedilatildeo da fluorescecircncia e nomenclatura
dos resultados passaram a ser normatizados Alguns padrotildees de fluorescecircncia satildeo
relativamente inespeciacuteficos outros satildeo ocasionados por uma gama restrita de auto-
anticorpos e outros ainda por um uacutenico auto-anticorpo (DELLAVANCE et al
2002) Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a tornaacute-las
imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo (DE
LARANAGA et al 2000)
Apesar do padratildeo de fluorescecircncia na maioria das vezes natildeo se pode
identificar o anticorpo presente ele pode sugerir ao cliacutenico qual o proacuteximo passo a
ser dado na investigaccedilatildeo da sua especificidade Os resultados encontrados devem
estar em associaccedilatildeo com a cliacutenica os padrotildees de fluorescecircncia e os tiacutetulos
alcanccedilados com a diluiccedilatildeo preacutevia (DELLAVANCE et al 2003)
No presente estudo a analise de 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo Viacuterus da
Hepatite C esteve presente o anticorpo-antinuclear (ANA FAN) em 13 (255) dos
pacientes e todos eram padratildeo citoplasmaacutetico corroborando com outros estudos
encontrados na literatura como
Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de
pacientes infectados pelo viacuterus HIV com Hanseniacutease e co-infectados com
Hanseniacutease HIV Ela obteve respectivamente as seguintes taxas de prevalecircncias
32 333 e 478 Em todos os grupos neste estudo houve predomiacutenio do
55
padratildeo citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear soacute foi observado entre os pacientes com
hanseniacutease (91) e co-infectados (237)
Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de
pacientes infectados pelo viacuterus da Dengue e viacuterus linfotroacutepico de ceacutelulas T humanas
HTLV-12 e controle Normais e obteve respectivamente as seguintes taxas de
prevalecircncias 40 40 e 2 Em todos os grupos houve predomiacutenio do padratildeo
citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear foi observado entre os pacientes com dengue
(67) e HTLV 12 (133)
Segundo Andrade et al (2002) Dellavance et al (2005) Dellavance e
Andrade et al (2007) o predomiacutenio do padratildeo de FAN do tipo citoplasmaacutetico indica
que determinados padrotildees de fluorescecircncia satildeo mais especiacuteficos de doenccedila auto-
imune enquanto outros ocorrem em indiviacuteduos com enfermidades natildeo auto-imunes
por ser o citoplasma celular rico em proteiacutenas para as quais auto-anticorpos naturais
apresentam afinidade moderada eacute comum observar positividade para FAN em
indiviacuteduos sadios cujo significado ainda natildeo eacute entendido completamente
O padratildeo Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina que pode ser
encontrado em Hepatite auto-imune Cirrose Hepatite C Hepatocarcionoma entre
outros Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica
definida Um resultado positivo pode estar ou natildeo associado a uma patologia assim
como poderaacute ou natildeo vir a apresentar uma doenccedila auto-imune com o passar do
tempo (DELLAVANCE et al 2003) Neste estudo natildeo foi feito avaliaccedilatildeo prospectiva
dos resultados embora todos sejam FAN citoplasmaacuteticos
Os achados de FAN positivo em populaccedilotildees sadias ou sem doenccedilas auto-
imunes tambeacutem jaacute observado por Leser et al (2004) que em 394 pacientes com
FAN-HEp-2 positivo natildeo encontraram nenhum paciente com doenccedila auto-imune
Outro exemplo estaacute no padratildeo citoplasmaacutetico de pontos isolados
estudado por Laurino et al (2006) presente em indiviacuteduos sem evidecircncia de auto-
imunidade mas tambeacutem em indiviacuteduos com acometimento de doenccedilas auto-imunes
sistecircmicas e natildeo-especiacuteficas
Os dados apresentados corroboram com este estudo em que foi
observado a presenccedila do auto-anticorpo em 2 (2 ) dos 100 indiviacuteduos sadios do
grupo controle todos com padratildeo citoplasmaacutetico
56
Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a
tornaacute-las imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo
(DE LARANAGA et al 2000)
Nas Infecccedilotildees agudas espera-se que a resposta auto-imune diminua a
medida que os viacuterus satildeo eliminados Entretanto alguns trabalhos sugerem que em
indiviacuteduos geneticamente susceptiacuteveis as reaccedilotildees auto-imunes possam persistir
apesar do clareamento viral uma vez que o gatilho imunoloacutegico foi ativado e natildeo
houve desativaccedilatildeo (DE LARANAGA et al 2000 SAKKAS et al 2008)
Ramos-Casals et al (2009) no estudo Doenccedilas Sistecircmica Auto-Imunes
em Pacientes com Infecccedilatildeo pelo (72) dos pacientes eram do gecircnero feminino e
(28) do masculino(ANA FAN) em 61 dos pacientes o que se diferem deste
trabalho eacute que dos 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo (667) eram do gecircnero
masculino e (333) eram do gecircnero feminino com meacutedia de idade de 430 (plusmn107)
anos com presenccedila de anticorpo-antinuclear em 13 (255) com meacutedia e mediana
respectivamente de 435 e 46 anos nos pacientes com o FAN positivo e meacutedia de
43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN negativo
Alter (1995) em sua pesquisa natildeo observou associaccedilatildeo entre o risco de
infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas designadas por gecircnero idade e raccedila Na
referida pesquisa foram estudados 51 pacientes com idade meacutedia de 430 (+- 107)
anos 34 (667) eram do gecircnero masculino e 17 (333) do gecircnero feminino todos
em fase preacute-tratamento assintomaacuteticos natildeo permitindo avaliar os risco da
infecccedilatildeoSegundo Pordeus et al (2008) a ocorrecircncia destes auto-anticorpos
indicaria um prognoacutestico desfavoraacutevel Perperas Mcfarlane e Mcsorley (1986)
sugeriram que os auto-anticorpos poderiam estar envolvidos na progressatildeo ou no
desenvolvimento de hepatites crocircnicas possivelmente por um distuacuterbio no controle
da auto-reatividade Outros estudos questionam a participaccedilatildeo dos auto-anticorpos
no processo de transiccedilatildeo para cronicidade das hepatites agudas virais poreacutem os
resultados natildeo satildeo convincentes (SHOENFELD ROSE 2004)
Lopez Seia e Roy (1998) demonstraram a presenccedila de anticorpo anti-
actina em baixos tiacutetulos em crianccedilas com hepatite aguda por curto periacuteodo de
tempo poreacutem nenhuma associaccedilatildeo com gravidade da agressatildeo hepaacutetica foi
descrita
Neste estudo a presenccedila dos auto-anticorpos em (255) dos pacientes
com infecccedilatildeo pelo HCV natildeo puderam ser relacionada com a gravidade da doenccedila
57
pois este estudo foi realizado em pacientes receacutem diagnosticados entatildeo seria
necessaacuterio um acompanhamento destes por um periacuteodo maior de tempo com a
finalidade de concluir esta afirmativa Apesar da presenccedila transitoacuteria de auto-
anticorpos jaacute ter sido descrita em doenccedilas virais comuns a associaccedilatildeo entre a
presenccedila de auto-anticorpos e a gravidade das doenccedilas necessita de comprovaccedilatildeo
Passaleva Massai e Leoncini (1983) avaliaram 302 pacientes com
hepatites agudas virais e encontraram complexos imunes circulantes (CIC) em
516 dos pacientes com frequumlecircncia significativamente maior em hepatite aguda
Nenhuma associaccedilatildeo entre a presenccedila de imuno-complexos e o niacutevel de
aminotransferases ou bilirrubina foi encontrada Segundo Andrade et al (2002)
Dellavance et al (2005) Andrade et al (2007) nos pacientes do estudo foi feita a
relaccedilatildeo entre a presenccedila dos auto-anticorpos e niacuteveis de aminotransferases e as
elevaccedilotildees natildeo tiveram significacircncia poreacutem houve associaccedilatildeo do genotipo viral 1
Nos paracircmetros bioquiacutemicos analisados em relaccedilatildeo aos genoacutetipos houve uma
distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e
3 natildeo atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os
grupos Segundo Wilson (1997) trecircs estudos mostraram correlaccedilatildeo entre niacuteveis
altos de alanina aminotransferase e atividade histoloacutegica da doenccedila hepaacutetica
Poreacutem nos pacientes considerados individualmente o valor preditivo dessa
associaccedilatildeo foi baixo enquanto muitos deles com enzimas normais apresentavam
graves alteraccedilotildees histoloacutegicas No presente estudo natildeo foi observada associaccedilatildeo entre os niacuteveis de
aminotransferases e a cronificaccedilatildeo da hepatite viral pois nem todos os pacientes do
estudo apresentavam resultado de bioacutepsia hepaacutetica
Alter et al (1999) afirmam que no Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b
(63) e 3a (313) em estudo realizado em Goiacircnia onde foi observada uma
maior prevalecircncia do genoacutetipo 1 seguida do genoacutetipo 3 em doadores de sangue e
hemofiacutelicos (DELLAVANCE ANDRADE et al 2007) Estando esses dados em
acordo com esta pesquisa que com genotipagem do viacuterus da hepatite C que
identificou o genoacutetipo 1 em 45 (882) seguidos pelo genoacutetipo 3 que foi
identificado em 6 (118) dos pacientes com infecccedilatildeo pelo HCV Em um estudo realizado na Franccedila com 13 pacientes luacutepicas infectadas
pelo viacuterus C 8 apresentavam o RNA viral sendo o genoacutetipo 1 presente em cinco
58
(625) casos seguido do genoacutetipo 3 (375) (PERLEMUTER et al 2000) dados
que se assemelham aos do presente estudo embora o estudo natildeo tenha incluiacutedo
pacientes com outras infecccedilotildees associadas ao HCV Eacute importante ressaltar que
estudos sobre genotipagem do HCV em indiviacuteduos com doenccedilas reumaacuteticas satildeo
raros
No presente estudo houve uma frequumlecircncia baixa de positividade para o
FAN nos pacientes com genoacutetipo 1 e genoacutetipo 3 Natildeo havendo significacircncia
estatiacutestica entre os pacientes com genoacutetipo 1 e 3
Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter
implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave menor
resposta agrave terapia antiviral (BRUNO et al1997) o que natildeo foi avaliado neste estudo
pois apesar de (882) dos pacientes serem genoacutetipo 1 todos estavam em fase de
reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica seja preacute- tratamento Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila
poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses
autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis
vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo
hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja
quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a
concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave
hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em
parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)
59
7 CONCLUSOtildeES
minus O padratildeo dos auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares encontrados nos
dois grupos estudados foi o citoplasmaacutetico
minus A prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares no grupo com
infecccedilatildeo pelo VHC foi significativamente maior do que no grupo controle
minus Nos resultados de FAN citoplasmaacutetico haacute uma maior prevalecircncia da
negatividade em pacientes infectados pelo HCV e natildeo infectados sendo
essa diferenccedila estatisticamente significativa conferindo a natildeo associaccedilatildeo
entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV
minus Os resultados negativos do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos viras eacute
superior aos positivos em ambos os genoacutetipos virais entretanto esta diferenccedila
natildeo eacute estatisticamente significativa
minus Houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos
celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado
minus Natildeo houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos
celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado com
relaccedilatildeo ao gecircnero onde predominou o gecircnero masculino nos dois grupos
minus Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter
implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave
menor resposta agrave terapia antiviral o que natildeo foi avaliado neste estudo pois
os pacientes estavam em fase preacute tratamento sugerindo que estes pacientes
sejam avaliados futuramente
minus A formaccedilatildeo dos auto-anticorpos parece ser mais uma consequumlecircncia do que
uma causa da agressatildeo hepaacutetica
minus A negatividade do FAN ndash Hep 2 foi maior que a positividade mas todos os
FAN positivos pertenciam ao genoacutetipo viral tipo 1 nos pacientes infectados
pelo HCV
minus Nesta pesquisa os resultados de PCR o RNA-HCV de reconfirmaccedilatildeo foi
positivo para o anti-HCV em todos os soros analisados mostrando assim
que estes pacientes eram portadores de infecccedilatildeo por viacuterus C ou seja natildeo
houve falso positivo anteriormente poreacutem todos eram assintomaacuteticos
dificultando a conclusatildeo de ser ou natildeo uma infecccedilatildeo persistente
60
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67
APEcircNDICES
68
APEcircNDICE A - TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Vocecirc estaacute sendo convidado para fazer parte de uma pesquisa que estaacute sendo desenvolvida pela Universidade Federal do Paraacute no Nuacutecleo de Medicina Tropical intitulada AUTOANTICORPOS CONTRA ANTIacuteGENOS CELULARES E SUA CORRELACcedilAtildeO COM O GENOacuteTIPO VIRAL EM PACIENTES COM INFECCcedilAtildeO PELO VIacuteRUS DA HEPATITE C (HCV)
O Objetivo da pesquisa eacute fazer uma correlaccedilatildeo do anticorpo antinuacutecleo (FAN) e o genoacutetipo viral em pacientes com hepatite C e o estaacutegio da doenccedila hepaacutetica a partir da histologia sempre que permitidos e correlacionar ao diagnoacutestico
Caso vocecirc participe da pesquisa seraacute necessaacuterio que forneccedila uma amostra de sangue (2ml)
O uacutenico inconveniente que vocecirc poderaacute experimentar eacute a dor provocada pela agulha na hora da coleta de sangue bem como pequenos hematomas que possam vir a ocorrer e que natildeo causam danos
Essa pesquisa natildeo oferece riscos as praacuteticas satildeo de uso rotineiro e seratildeo utilizados materiais esterilizados e descartaacuteveis como agulhas seringas etc
Estaacute garantido a vocecirc todas as informaccedilotildees que vocecirc queira antes durante e depois da pesquisa
A sua participaccedilatildeo neste estudo eacute voluntaacuteria Vocecirc tem a liberdade de recusar participar da pesquisa a qualquer momento
As informaccedilotildees relacionadas agrave pesquisa poderatildeo ser inspecionadas pelos pesquisadores que executam a pesquisa e pelas autoridades legais no entanto se qualquer informaccedilatildeo for divulgada em relatoacuterio publicaccedilatildeo ou qualquer outro meio isto seraacute feito de forma codificada para manter o caraacuteter confidencial
Todas as despesas necessaacuterias para a realizaccedilatildeo do estudo natildeo satildeo de sua responsabilidade assim como a sua participaccedilatildeo na pesquisa na seraacute remunerada (vocecirc natildeo receberaacute qualquer valor em dinheiro)
Quando os resultados forem divulgados natildeo apareceraacute seu nome e sim um coacutedigo
_____________________________________
Assinatura do Pesquisador Responsaacutevel NomeAna Maria Almeida Souza EndRodovia Maacuterio Covas 1426 ndash Cond Green Garden casa 41 Fone(91) 32352665 81197217 RegConselhoCRM 1508
69
APEcircNDICE B - CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Declaro que li as informaccedilotildees acima sobre a pesquisa que me sinto
perfeitamente esclarecido sobre o conteuacutedo da mesma assim como seus riscos e
benefiacutecios Declaro ainda que por minha livre vontade aceito participar da pesquisa
cooperando com a coleta de material para exame
Beleacutem _________
_________________________________________
Assinatura do sujeito da pesquisa ou do
responsaacutevel
70
ANEXOS
71
- Assinatura do Pesquisador Responsaacutevel
-
- Beleacutem _________
-
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Padrotildees de fluorescecircncia encontrados em maior frequumlecircncia e
patologias relacionadas 34
Quadro 2 - Anti-ena - auto-anticorpos contra antiacutegenos extraiacutedos do nuacutecleo e
relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 34
Quadro 3 ndash Padrotildees de FAN nuclear e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 35
Quadro 4 - Padrotildees de FAN citoplasmaacuteticos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 36
Quadro 5 - Padrotildees de FAN mistos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 37
Quadro 6 - Padrotildees de FAN nucleolares e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes 37
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos pacientes segundo as caracteriacutesticas demograacuteficas janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 48
Tabela 2 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes conforme os resultados laboratoriais de FAN citoplasmaacutetico e genotipagem janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 49
Tabela 3 ndash Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 49
Tabela 4 - Relaccedilatildeo da genotipagem de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 50
Tabela 5 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e faixa etaacuteria - janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 50
Tabela 6 - Estudo descritivo da idade dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e presenccedila do FAN citoplasmaacutetico janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 51
Tabela 7- Distribuiccedilatildeo dos genoacutetipos dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 51
Tabela 8 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 52
Tabela 9 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico segundo a presenccedila ou ausecircncia de infecccedilatildeo por HCV janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 52
Tabela 10 - Distribuiccedilatildeo do FAN de acordo com o genoacutetipo viral janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 53
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
AAN Anticorpos antinucleares
aCL Anticorpos anticardiolipina
AIDS Sindrome da Imunodeficiecircncia Adquirida
ALT Alanina aminotransferase
ANCA Anticorpos anti-citoplasma de neutroacutefilos
Anti-CCP Antipeptiacutedeo citrulinado ciacuteclico
Anti-β2GPI Anticorpos anti-β2 glicoproteiacutena I
Cdna DNA complementar
CEP Comitecirc em Eacutetica e Pesquisa
CHC Carcinoma hepatocelular
CIC Complexos imunes circulantes
DDTC Doenccedilas difusas do tecido conjuntivo
DMTC Doenccedila mista do tecido conjuntivo
E1 Proteiacutena do envoltoacuterio
ENH Eritema Nodoso Hansecircnico
ESP Esclerose sistecircmica progressive
FAN Fator Anti-nuacutecleo
FR Fator reumatoacuteide
HBV Viacuterus da hepatite B
HCV Viacuterus da Hepatite C
HEMOPA Fundaccedilatildeo Centro de Hemoterapia e Hematologia do Paraacute
HIV Viacuterus da imunodeficiecircncia humana
HIV-1 Viacuterus da imunodeficiecircncia humana1
IAH Iacutendice de atividade histoloacutegica
LE Lupus Eritematoso
LES Luacutepus eritematoso sistecircmico
MS Ministeacuterio da Sauacutede
mtDNA DNA mitrocondrial
NANBH Hepatite natildeo-A natildeo-B
NMT Nuacutecleo de Medicina Tropical
OMS Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede
PCR Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia
Rh Tipo sanguiacuteneo
RNA Aacutecido ribonucleacuteico
RT-PCR Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia-em tempo real
SAF Siacutendrome antifosfoliacutepide
SIDA Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida
SS Siacutendrome de Sjoumlgren
UFPA Universidade Federal do Paraacute
UV ultravioleta
VHA Viacuterus da Hepatite A
VHC Viacuterus da Hepatite C
VHCHCV Hepatite C
VV Hanseniacutease generalizada
SUMAacuteRIO 1 INTRODUCcedilAtildeO 15 11 HEPATITE C (VHCHCV) 15 111 Consideraccedilotildees Gerais 15 112 Agente Etioloacutegico 16 113 Epidemiologia 17 114 Modo de Transmissatildeo 18 115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica 19 116 Diagnoacutestico 23 12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC 25
13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC 26
14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE 27
15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES AGUDAS VIRAIS 31
16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN 32 2 JUSTIFICATIVA 39 21 ASPECTOS EacuteTICOS 39 3 OBJETIVOS 40
31 OBJETIVO GERAL 40
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 40 4 MATERIAL E MEacuteTODOS 41 41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO) 41 411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C 41 412 Grupo de natildeo infectados 41 42 MEacuteTODO 42 421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico 42 422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C 42 423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia
molecular 43
424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem) 45 425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas
HEp-2 46 43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 47 5 RESULTADOS 48 6 DISCUSSAtildeO 54 7 CONCLUSOtildeES 59 REFEREcircNCIAS 60 APEcircNDICES 67 ANEXOS 70
15
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 HEPATITE C (VHCHCV)
111 Consideraccedilotildees Gerais
As hepatites virais satildeo doenccedilas causadas por diferentes agentes
etioloacutegicos de distribuiccedilotildees universais que tecircm em comum o hepatotropismo
Possuem semelhanccedilas do ponto de vista cliacutenico-laboratorial mas apresentam
importantes diferenccedilas epidemioloacutegicas quanto agrave sua evoluccedilatildeo (FERREIRA
SILVEIRA 2004) Desde a descriccedilatildeo e definiccedilatildeo em 1989 (CHOO et al 1989 apud
RIBEIRO et al 2007) tornou-se evidente sua associaccedilatildeo com uma grande
variedade de manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas desordens reumaacuteticas e auto-imunes
(ALMEIDA 2010)
A infecccedilatildeo pelo VHCHCV acarreta inflamaccedilatildeo hepaacutetica e esteatose
podendo evoluir para fibrose hepaacutetica e cirrose em indiviacuteduos cronicamente
infectados estes com grande risco de desenvolvimento de carcinoma hepatocelular
(RIBEIRO et al 2007) Essas complicaccedilotildees tardias ocorrem em um periacuteodo em
geral superior a 20 anos apoacutes o iniacutecio da infecccedilatildeo A avaliaccedilatildeo filogeneacutetica das
sequumlecircncias do VHCHCV investigadas em vaacuterias regiotildees geograacuteficas sugere que
existam pelo menos seis genoacutetipos principais designados pelos nuacutemeros de 1 a 6 e
pelo menos 30 subtipos designados por letras minuacutesculas Nos Estados Unidos
prevalecem os genoacutetipos 1a (60) e 1b (20) Os tipos 5 e 6 satildeo mais encontrados
no sudeste e sul da Aacutefrica O tipo 4 eacute predominante na Aacutefrica Central e no Oriente
Meacutedio No Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b (63) e 3a (313) (BASSIT et
al 1999 apud RIBEIRO et al 2007) As informaccedilotildees sobre as causas que
determinam o curso evolutivo da doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos
progressos que haacute no campo do diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHCHCV Uma
questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo genoacutetipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de
lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o genoacutetipo 1 (1b) cursa com lesotildees
histoloacutegicas mais graves
As uacuteltimas deacutecadas foram de notaacuteveis conquistas no que se refere agrave
prevenccedilatildeo e ao controle das hepatites virais Entre as doenccedilas endecircmico-
epidecircmicas que representam problemas importantes de sauacutede puacuteblica no Brasil
16
salientam-se as Hepatites Virais cujo comportamento epidemioloacutegico no nosso paiacutes
e no mundo tem sofrido grandes mudanccedilas nos uacuteltimos anos
Antes da seleccedilatildeo rigorosa dos doadores de sangue em 1991 o
VHCHCV era a maior causa de hepatite poacutes-transfusional Atualmente permanece
como tal em casos esporaacutedicos (CONTE 2000) Os grupos considerados de risco
satildeo pessoas que receberam transfusatildeo de sangue antes de 1992 usuaacuterios de
drogas injetaacuteveis profissionais de sauacutede que lidam com sangue pacientes de
hemodiaacutelise e com menor risco pessoas tatuadas ou com piercings (CLEMENTE
ONO-NITA 2007)
A melhoria das condiccedilotildees de higiene e de saneamento das populaccedilotildees a
vacinaccedilatildeo contra a Hepatite B (HBV) e as novas teacutecnicas moleculares de diagnoacutestico
do viacuterus da Hepatite estatildeo entre esses avanccedilos importantes (BRASIL 2008)
112 Agente Etioloacutegico
O VHCHCV um viacuterus aacutecido ribonucleacuteico (RNA) da famiacutelia Flaviviridae
representa a principal causa da previamente denominada hepatite natildeo-A natildeo-B
(SANTOS 2009) Foi identificado e isolado a partir de um clone derivado de um
genoma NANBH semelhante aos togaviridae ou flaviviridae (SAADE 2008) e
visualizado a imunoeletromicroscopia como partiacutecula de 55 a 65 nm de diacircmetro
com projeccedilotildees espiculares e de morfologia muito semelhante aos flaviviridae Aleacutem
disso estas partiacuteculas reagiram especificamente com anticorpos mono e policlonais
do conteuacutedo proteacuteico do envelope do VHC (HIRANUMA et al 1994 apud CONTE
2000)
O agente etioloacutegico do HCV natildeo eacute uma partiacutecula homogecircnea e apresenta
uma taxa alta de mutaccedilatildeo levando-o a uma heterogeneicidade genocircmica cujo
resultado eacute um grande nuacutemero de genoacutetipos (1a 1b 2a 2b 3a 3b 4 5 6)
(AUGUSTO LOBATO 2003) Natildeo haacute evidecircncias de variantes natildeo patogecircnicas O
genoacutetipo 1b eacute o que apresenta maior virulecircncia e pior resposta ao tratamento
(LAUER WALKER 2001 apud SOUZA 2007) No Brasil dados obtidos a partir de
casos isolados e estudos de pequenas amostragens indicam que o genoacutetipo 1b
ocorre em cerca de 30 a 40 dos casos o 1a em cerca de 20 1a e 1b em 20
o 3a em cerca de 28 (FOCACCIA 2004)
17
113 Epidemiologia
De acordo com a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) a HCV eacute uma
questatildeo de sauacutede puacuteblica e tambeacutem a principal causa de transplante de fiacutegado no
Brasil (SOCIEDADE BRASILEIRA DE HEPATOLOGIA 2005) Eacute estimada uma
prevalecircncia em torno de 10 para a infecccedilatildeo pelo VHC na populaccedilatildeo mundial
(KILLEMBERG 2000) Nos Estados Unidos cerca de 27 milhotildees de pessoas estatildeo
infectadas pelo viacuterus (BRASIL 2006)
De acordo com Ferreira e Silveira (2004) no Brasil o nuacutemero de pacientes
infectados eacute incerto relacionado geralmente a alguns estados e municiacutepios e o
esclarecimento dos agentes causadores das hepatites cuja identificaccedilatildeo requer
teacutecnicas laboratoriais complexas de biologia molecular eacute realizado de maneira
insuficiente Por outro lado a progressiva integraccedilatildeo entre as instacircncias gestoras
dos programas de vigilacircncia e controle das doenccedilas com grupos de pesquisa e
desses com os serviccedilos (FERREIRA SILVEIRA 2004 p 473) e a disponibilidade
dos bancos de dados nacionais mais confiaacuteveis apontam para novos e melhores
caminhos (BRASIL 2005b)
A OMS alerta que o Paiacutes deve se preparar para uma ldquoexplosatildeordquo da
epidemia a partir de 2011 (BRASIL 2005b) Outra preocupaccedilatildeo eacute que as pessoas
que receberam sangue antes de 1992 tecircm mais chances de estarem infectadas na
eacutepoca o sangue destinado agraves transfusotildees natildeo era analisado para detecccedilatildeo da HCV
porque o viacuterus natildeo era conhecido e natildeo havia exames especiacuteficos (BRASIL 2005b)
A prevalecircncia da infecccedilatildeo nos doadores de sangue sadios varia de 001-002 no
Reino Unido e no norte da Europa 1-15 no sul da Europa 65 na Aacutefrica
equatorial e de ateacute 20 no Egito (CONTE 2000)
De acordo com a OMS a cada grupo de 50 pessoas no Brasil uma tem
hepatite e de dez portadores apenas um sabe (STRAUSS 2001) Satildeo dois milhotildees
de infectados no Paiacutes Denominada epidemia silenciosa calcula-se que 170 milhotildees
de indiviacuteduos no mundo estejam contaminados pelo viacuterus C a forma mais grave da
doenccedila Ainda de acordo com a OMS o nuacutemero de brasileiros viacutetimas da
enfermidade eacute bem maior do que o estimado pelo Ministeacuterio da Sauacutede (TRINDADE
2005)
18
Por ocasiatildeo da Conferecircncia Internacional de Consenso sobre HCV em Paris
(LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999) concluiu-se que a hepatite crocircnica por viacuterus
C eacute um problema grave de sauacutede puacuteblica sendo sua prevalecircncia mundial estimada
em 3 (de 01 a 5 segundo os vaacuterios paiacuteses) por tanto havendo no mundo
todo cerca de 150 milhotildees de portadores crocircnicos do VHCHCV 4 milhotildees nos EUA
e 5 milhotildees na Europa Ocidental Na Europa Oriental a prevalecircncia eacute maior ainda
114 Modo de Transmissatildeo
A HCV eacute transmitida pelo sangue Natildeo haacute comprovaccedilatildeo de contaacutegio por
meio de fluidos corporais como saliva suor laacutegrimas secircmen ou leite materno
Tambeacutem deixa de ocorrer por meio de abraccedilos beijos uso dos mesmos copos ou
roupas Especialistas afirmam que a contaminaccedilatildeo atraveacutes de relaccedilotildees sexuais eacute
possiacutevel mas rara Quando detectada de maneira precoce a enfermidade tem
tratamento inclusive gratuito aleacutem de cura (BRASIL 2006)
Dentre os fatores de risco para transmissatildeo outros aleacutem da transfusatildeo de
sangue o uso de drogas iliacutecitas o comportamento sexual de alto risco e variaacuteveis
socioeconocircmicas representadas pelo grau de escolaridade e renda familiar Natildeo foi
observada associaccedilatildeo entre o risco de infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas
designadas por gecircnero idade e raccedila (ALTER 2007) O risco de transmissatildeo sexual
do VHCHCV eacute miacutenimo A contaminaccedilatildeo intrafamilial natildeo-sexual eacute consideraacutevel
particularmente quando um dos enfermos tem hepatopatia grave e ou carga viral
elevada (risco 110) (CONTE 2000)
A praacutetica de tatuagem fornece dados conflitantes sabendo-se que os
liacutequidos usados para esterilizar os instrumentos usados satildeo ineficazes
Karmochkine et al (1998 apud CONTE 2000) observaram que
aproximadamente 80 dos pacientes contraem o viacuterus atraveacutes da toxicomania
intravenosa ou transfusotildees de sangue ou de derivados Os restantes meios de
transmissatildeo e de contaacutegio satildeo a hemodiaacutelise os transplantes de oacutergatildeos picadas
acidentais profissionais e transmissatildeo vertical matildee-crianccedila Em 20 a 40 dos
casos natildeo se consegue determinar o modo de contaminaccedilatildeo A transmissatildeo da
hepatite crocircnica por viacuterus C pode ser prevenida (KARMOCHKINE et al 1998 apud
CONTE 2000)
19
As duas fontes de contaminaccedilatildeo satildeo a toxicomania endovenosa e a
administraccedilatildeo de produtos de origem sanguumliacutenea Esta uacuteltima praticamente
eliminada desde 1991 com a introduccedilatildeo dos testes ELISA 2 na seleccedilatildeo
aprimorada de doadores de sangue (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998
apud CONTE 2000)
A transmissatildeo sexual eacute rara com menos de 3 em parceiros estaacuteveis e
ocorre principalmente em pessoas com muacuteltiplos parceiros e com praacutetica sexual de
risco (sem uso de preservativo) ndash para os indiviacuteduos com parceiros muacuteltiplos o uso
de preservativos eacute indicado (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998 apud
CONTE 2000)
A gravidez natildeo estaacute contra-indicada nas mulheres infectadas pelo
VHCHCV A transmissatildeo vertical matildee-crianccedila eacute rara (menor de 6) O tipo de parto
(natural ou cesaacuterea) natildeo tem influecircncia O aleitamento eacute permitido A transmissatildeo
nosocomial eacute prevenida eficazmente de modo convencional (KARMOCHKINE et
al 1998 apud CONTE 2000)
115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica
A infecccedilatildeo aguda pode passar clinicamente despercebida ou evoluir para
hepatite fulminante Aproximadamente 850 das pessoas infectadas agudamente
vatildeo desenvolver uma viremia persistente tornando-se dessa forma indiviacuteduos
infectados crocircnicos Depressatildeo irritabilidade dores no corpo mal-estar febre
naacuteuseas e falta de apetite satildeo alguns dos sintomas mais frequumlentes embora a
maioria dos casos natildeo apresente nenhum sintoma (ALTER 2007)
A cirrose eacute pouco observada em pessoas que apresentam niacuteveis
persistentemente baixos das transaminases mas a elevaccedilatildeo destas natildeo eacute
representativa do grau de fibrose hepaacutetica Dessa forma a bioacutepsia hepaacutetica
representa o melhor indicador do estaacutegio de evoluccedilatildeo da doenccedila uma vez que
gradua os componentes inflamatoacuterios e o estaacutegio de fibrose (AGMON-LEVIN et al
2009 BLOCK SCHIANO 1999)
Alter et al (1992) dizem que em 82 de 130 pacientes seguidos durante
muitos anos apoacutes surto agudo de hepatite natildeo-A natildeo-B apresentam anti-VHCHCV
ou VHCHCV RNA sendo que 62 deles desenvolveram hepatite crocircnica e
concluem que os pacientes que adquiriram HCV tiveram alto grau de hepatite
20
crocircnica sendo que o VHCHCV pode ser a maior causa de doenccedila crocircnica de fiacutegado
nos EUA e que na maioria dos pacientes a infecccedilatildeo pelo VHCHCV parece persistir
por muitos anos mesmo na ausecircncia de doenccedila hepaacutetica ativa
Almeida et al (1999) determinaram a prevalecircncia da infecccedilatildeo em
doadores de sangue assim como avaliaram o grau de comprometimento hepaacutetico
numa populaccedilatildeo de 37335 doadores durante o biecircnio 93-94 em Porto Alegre - RS
utilizando o teste anti-VHC ELISA 2 Selecionaram 60 deles para a biopsia hepaacutetica
com agulha de Menghini encontrando prevalecircncia de 174 com comprometimento
hepatico e 39 deles apresentavam cirrose hepaacutetica Sendo a hepatopatia crocircnica de
graus variaacuteveis observadas em 80 deles na sua grande maioria com lesotildees leves
e miacutenimas Foi observada forte associaccedilatildeo entre elevaccedilatildeo de alanina
aminotransferase (ALT) e a presenccedila de hepatopatia crocircnica embora a intensidade
desta elevaccedilatildeo natildeo se correlacione com a gravidade da lesatildeo histoloacutegica
Jaacute na experiecircncia de Mutimer et al (1995) cerca de 80 dos doadores
soro-positivos analisados exaustivamente inclusive com biopsia de fiacutegado
mostraram evidecircncias de alteraccedilotildees histoloacutegicas e ou viroloacutegicas de infecccedilatildeo
persistente sem no entanto atingir graus mais avanccedilados de hepatopatia crocircnica
quase todos permanecendo na categoria moderada
Nos paiacuteses industrializados a HCV eacute responsaacutevel por 20 dos casos de
hepatite aguda 70 dos casos de hepatite crocircnica 40 dos casos de cirrose
descompensada 60 dos carcinomas hepatocelulares e 30 dos transplantes
hepaacuteticos (LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999)
Cerca de 40 do total de pacientes curam-se ou tecircm doenccedila crocircnica de
natureza benigna Os restantes 60 cursam com atividade aumentada de
aminotransferase denotando evoluccedilatildeo crocircnica da doenccedila Dentre estes a maioria
tem lesotildees necro inflamatoacuterias discretas e fibrose miacutenima ou ausente O prognoacutestico
em longo prazo eacute mal conhecido no entanto provavelmente a maioria deles natildeo viraacute
a falecer da doenccedila hepaacutetica em curso Cerca de 20 deles depois de 10-20 anos
de evoluccedilatildeo desenvolveratildeo cirrose hepaacutetica passiacutevel de transplante Assim a
hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila que ocasiona a morte de um pequeno nuacutemero
de pacientes sem no entanto afetar a duraccedilatildeo da vida meacutedia da maioria deles
(CONTE 2000 FERREIRA SILVEIRA 2004)
Apoacutes infecccedilatildeo aguda somente 10 dos pacientes desenvolve doenccedila
cliacutenica com icteriacutecia A infecccedilatildeo sub-cliacutenica eacute a regra e assim passa despercebida
21
Cerca de 25 deles tecircm infecccedilatildeo crocircnica sintomaacutetica com aminotransferases
normais e lesotildees inflamatoacuterias histoloacutegicas miacutenimas (RESENDE et al 2010)
A remissatildeo espontacircnea acontece em cerca de 15 dos casos Na grande
minoria dos casos a progressatildeo da doenccedila aguda pode levar agrave insuficiecircncia
hepaacutetica aguda
Observaccedilotildees feitas pelo irlandecircs Kenny-Walsh (1999) comprovam a
natureza e a evoluccedilatildeo cliacutenica da afecccedilatildeo em causa O autor acompanhou durante 17
anos 376 mulheres que receberam injeccedilotildees de imunoglobulinas anti-D
contaminadas com VHC provenientes de doador uacutenico num programa de
isoimunizaccedilatildeo Rh Destas 81 apresentaram sintomatologia mais frequumlentemente
fadiga (66) ALT ligeiramente elevada (de 40 a 99 UL) em 47 e igual ou maior de
100 UL em 8 A biopsia hepaacutetica mostrou inflamaccedilatildeo em 98 delas na maioria
das vezes leves (41) e moderadas (52) fibrose presente em 51 no entanto
somente em sete pacientes (2) houve sinais de cirrose provaacutevel ou definitiva Em
uma delas havia acentuado alcoolismo
A hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila de evoluccedilatildeo variaacutevel De maneira
geral sua evoluccedilatildeo eacute lenta insidiosa e progressiva
Os pacientes que natildeo apresentam evidecircncias bioquiacutemicas de lesatildeo
hepaacutetica podem constituir em subgrupo de casos mais benignos no curso natural
da doenccedila Muitos co-fatores tecircm papel importante no desenvolvimento da cirrose
nesses pacientes como por exemplo a idade no momento da infecccedilatildeo (os
contaminados de idade mais avanccedilada tecircm evoluccedilatildeo mais raacutepida da doenccedila
enquanto que os mais jovens a tecircm mais lenta) o alcoolismo (eacute de consenso geral
que o abuso de aacutelcool favorece o aparecimento da cirrose) e a co-infecccedilatildeo com o
Viacuterus da Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida (SIDA) e da HVB
A incidecircncia anual de carcinoma hepatocelular (CHC) eacute de 1 a 4 nos
pacientes cirroacuteticos o que justifica plenamente o controle ecograacutefico do fiacutegado e a
dosagem seacuterica de alfa-fetoproteiacutena nesses pacientes a cada 1-2 anos Por outro
lado nos pacientes com hepatite crocircnica por viacuterus C sem cirrose o CHC eacute muito
raro (LOPES 2010)
Nos casos de cura a atividade das transaminases cessa e os viacuterus natildeo
satildeo detectados (VHC RNA) no soro Nos casos de cronificaccedilatildeo acontece o
contraacuterio ou seja as alteraccedilotildees bioquiacutemicas existem com flutuaccedilotildees e os viacuterus satildeo
detectaacuteveis na grande maioria dos casos Fazem exceccedilatildeo agravequeles pacientes com
22
viremia baixa que por isso mesmo fogem aos limites dos meacutetodos de detecccedilatildeo viral
ou devido agraves flutuaccedilotildees proacuteprias desses niacuteveis virecircmicos (HAYDON et al 1998)
Nos pacientes anti-VHC positivos com enzimas circulantes normais a
falta de VHC RNA no soro tem sido interpretada como sinal de cura completa No
entanto Haydon et al (1998) alteraram essa interpretaccedilatildeo Estes autores
demonstraram a presenccedila de VHC RNA no fiacutegado desses pacientes que eram
negativos no soro independente das alteraccedilotildees bioquiacutemicas positivas ou negativas
do soro ou seja mesmo naqueles casos anteriormente considerados como curados
Assim os niacuteveis de viacuterus intra-hepaacuteticos natildeo satildeo determinados pelos fatores
hospedeiro (idade modo e duraccedilatildeo da infecccedilatildeo) ou virais (VHC genoacutetipos) pois
mesmo as repetidamente Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia-em tempo real (RT-
PCR) negativos para VHC RNA no soro podem ter viacuterus da HCV albergados no
fiacutegado Entretanto existem limitaccedilotildees metodoloacutegicas que devem ser consideradas
nessa interpretaccedilatildeo como por exemplo as limitaccedilotildees do RIBA 3 e do RT-PCR
Mais importante eacute o seguimento dos pacientes ao longo do tempo Assim
Seef et al (1992) em 568 pacientes de hepatite poacutes-transfusional e dois grupos
controles pareados que receberam transfusotildees sem desenvolver hepatite apoacutes 18
anos de seguimento encontraram 33 de mortalidade no grupo 1 e 15 no grupo
controle sendo que a maioria das mortes ocorreu nos pacientes com alcoolismo
associado Evidenciando que a maioria dos que desenvolve doenccedila crocircnica o faz
muito lentamente
Existem ainda no curso natural da doenccedila flutuaccedilotildees intensas e muito
frequumlentes que dependem dos viacuterus e dos hospedeiros a saber niacuteveis da viremia
genoacutetipos 1b graus de diversidade geneacutetica dos viacuterus vias de transmissatildeo (os
inoculados via transfusatildeo apresentam lesotildees hepatocelulares mais ativas)
(GORDON et al 1993 GORDON BAYATI SILVERMAN 1998) deficiecircncias
imunes alcoolismo e co-infecccedilatildeo com HBV e delta ou o Viacuterus da imunodeficiecircncia
humana (HIV) (LOPES 2010) Nestes uacuteltimos casos a co-infecccedilatildeo com muacuteltiplos
viacuterus das hepatites estaacute associada com mais graves lesotildees histoloacutegicas do fiacutegado do
que nos casos de VHC isoladas
Importa saber se os resultados obtidos com os controles feitos se mantecircm
por longos periacuteodos Ou seja como exemplos a atividade da ALT persistentemente
normal a variabilidade do RT-PCR a detecccedilatildeo de VHC RNA pela teacutecnica Reaccedilatildeo
de polimerase em cadeia (PCR) que pode ser negativa devido agrave inadequada
23
armazenagem das amostras agrave contaminaccedilatildeo do soro com substacircncias que
interferem na leitura entre outras causas de erro
As informaccedilotildees sobre as causas que determinam o curso evolutivo da
doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos progressos havidos no campo do
diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHC Uma questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo
genotipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o
genotipo 1 (1b) cursa com lesotildees histoloacutegicas mais graves independentemente da
carga viral Ainda mais os VHC RNA negativos no soro mesmo apoacutes anos de
cura podem recair pois neles persistem os viacuterus no fiacutegado em regime de
replicaccedilatildeo muito baixa indetectaacutevel pelos meacutetodos atuais Ao contraacuterio os negativos
no soro e no fiacutegado tecircm demonstrado respostas boas e sustentadas inclusive no
sentido de se fazer prognoacutestico de cura real e verdadeira infelizmente na grande
minoria dos casos
116 Diagnoacutestico
Quanto mais cedo o diagnoacutestico maiores as chances de detectar a
doenccedila Por isso eacute importante que as pessoas faccedilam o exame especiacutefico porque soacute
esse exame eacute que detecta a HCV E as mulheres tecircm que ter uma atenccedilatildeo em
especial Tempos atraacutes o Correio Braziliense (2003) publicou uma grande mateacuteria
sobre a quantidade de mulheres que vecircm sendo infectadas com a HCV Cuja causa
estava na esterelizaccedilatildeo mal feita dos equipamentos das manicures Uma soluccedilatildeo
praacutetica eacute as mulheres terem seu proacuteprio material pra fazer as unhas e natildeo deixar
mais ningueacutem utilizar (nem matildee nem irmatilde etc) Bem e quem tiver passado por
transfusatildeo dentistas manicures operaccedilotildees etc deve fazer o exame
(KARMOCHKINE et al 1998 apud CONTE 2000 KEER et al 1997)
A HCV natildeo eacute como a Siacutendrome da Imunodeficiecircncia Adquirida (AIDS)
que possui drogas com grande tecnologia e o doente pode viver por muitos e muitos
anos Com a HCV o paciente soacute tem chance de ficar bem se a doenccedila for
diagnosticada e tratada antes dela se manifestar Atualmente o tratamento usa uma
associaccedilatildeo de duas drogas ndash o Interferon e a Ribavirina ldquoAs chances de cura em
meacutedia satildeo de 50rdquo
Barbaro et al (1999) verificaram que os pacientes VHC genoacutetipos 1b
frequumlentemente apresentavam alteraccedilotildees ultraestruturais das mitococircndrias com
24
depleccedilatildeo do mtDNA podendo comprometer o processo de fosforilizaccedilatildeo oxidativa
Sendo assim a produccedilatildeo aumentada de radicais livres nos pacientes VHC genoacutetipos
1b poderia atuar de modo negativo na evoluccedilatildeo da doenccedila hepaacutetica aumentando o
efeito citopaacuteticos do VHC Nesses pacientes haveria portanto aumento de
hiperoxidaccedilatildeo com consequumlente resistecircncia agrave accedilatildeo dos interferons e pior evoluccedilatildeo
da doenccedila hepaacutetica A ser confirmado este fato novas estrateacutegias terapecircuticas
poderatildeo vir a ser desenvolvidas no combate a essa doenccedila
Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila
poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses
autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis
vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo
hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja
quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a
concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave
hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em
parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)
Dos fatos acima expostos decorrem implicaccedilotildees tais como as respostas
CD8-CTL aos antiacutegenos VHC restritas aos complexos de histocompatibilidade
principais (MHC I) com inibiccedilatildeo ou mesmo insuficiente produccedilatildeo de complexo
peptiacutedeo VHC-MHC inibiccedilatildeo direta das ceacutelulas CTLK e a falta de resposta as
citoquininas entre outras dos vaacuterios mecanismos de escape existentes Dentro
desse contexto o niacutevel de morte celular natildeo seria alcanccedilado e a lesatildeo hepatocelular
consequumlente seria portanto miacutenima
Outra implicaccedilatildeo resultante consiste na induccedilatildeo de resposta imune
celular T Helper mediadas a partir de peptide vacinas contra o VHC Estas novas
vacinas tecircm a capacidade de gerar linfoacutecitos T citotoacutexico os CTLs contra o VHC em
camundongo imunizados com peptiacutedeos CTL e ceacutelulas HT epiacutetomes do core VHC
Esses estudos recente em animais de laboratoacuterio vecircm progredindo rapidamente
esperando-se em breve novos recursos no tratamento dessa doenccedila (AGNELLO et
al 1998)
25
12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC
O VHC constitui-se em uma famiacutelia heterogecircnea de viacuterus com no miacutenimo
seis genoacutetipos e inuacutemeros subtipos (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT
SANTOS SILVA 1999) Embora o meacutetodo de maior acuraacutecia para a determinaccedilatildeo
do genoacutetipo do VHC seja a identificaccedilatildeo completa da sequumlecircncia dos 9500
nucleotiacutedeos e a construccedilatildeo de uma aacutervore filogeneacutetica esse meacutetodo soacute pode ser
utilizado em laboratoacuterios de pesquisa (BARBOSA SILVA MARTINS 2005) e natildeo
em laboratoacuterios cliacutenicos Assim foram desenvolvidos meacutetodos para genotipagem
utilizando apenas as regiotildees mais conservadas do genoma como a proteiacutena do
envoltoacuterio (E1) a proteiacutena core e a proteiacutena natildeo estrutural NS5B A sequumlecircncia dos
nucleotiacutedeos dentro dessas regiotildees relativamente conservadas eacute genoacutetipo-
especiacutefico e os isolados podem ser genotipados independentemente da regiatildeo que
for utilizada para anaacutelise (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS
SILVA 1999) Para uso em laboratoacuterios cliacutenicos foram desenvolvidas basicamente
duas metodologias que se valem de teacutecnicas de biologia molecular (genotipagem)
ou citoloacutegicas (serotipagem)
Os meacutetodos que adotam teacutecnica de biologia molecular para genotipagem
utilizando porccedilotildees do genoma incluem a PCR aninhada (nested PCR) (BASSIT
SANTOS SILVA 1999) a teacutecnica de restriction fragment length polymorphism
(RFLP) (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS SILVA 1999) a
hibridizaccedilatildeo reversa (BASSIT SANTOS SILVA 1999) (INNO-LiPA Innogenetics
Beacutelgica Gen Eti DEIA HCV Sorin Biomedica Itaacutelia) e o sequumlenciamento direto da
regiatildeo natildeo-codificante 5 (TruGene Visible Genetics Canadaacute) Suas principais
vantagens satildeo a informaccedilatildeo direta sobre sequumlecircncia dos nucleotiacutedeos do genoma
viral a alta sensibilidade por se basearem na PCR e a possibilidade de identificar o
subtipo viral (BARBOSA SILVA MARTINS 2005)
Os meacutetodos para determinaccedilatildeo do genoacutetipo que utilizam serotipagem
baseiam-se na detecccedilatildeo de anticorpos genoacutetipos-especiacuteficos contra epiacutetopos do
VHC (por exemplo proteiacutenas da regiatildeo do core) (BLOCK SCHIANO 1999) Os
testes comercializados utilizam diferentes teacutecnicas ELISA competitivos ou
immunoblot (Murex-HC1-6 Murex Diagnostics Ltd Reino Unido RIBA HCV
Serotyping Assay Chiron Diagnostics Estados Unidos) As principais vantagens da
teacutecnica de serotipagem satildeo o baixo custo e maior facilidade de realizaccedilatildeo em
26
comparaccedilatildeo com os testes de biologia molecular (BLOCK SCHIANO 1999 De
LARANAGA et al 2000)
A determinaccedilatildeo do genoacutetipo anteriormente utilizada em pesquisas mas
sem maior utilidade na praacutetica meacutedica atualmente eacute recomendada para uso cliacutenico
Como jaacute mencionado os pacientes infectados pelo genoacutetipo 1 do VHC devem ser
tratados por 12 meses enquanto os demais por 6 meses (BASSIT SANTOS SILVA
1999)
A determinaccedilatildeo do genoacutetipo do VHC pode ser feita por PCR ou
serotipagem A primeira teacutecnica eacute mais sensiacutevel e possibilita a identificaccedilatildeo de
subtipos do VHC Contudo a segunda eacute de mais faacutecil realizaccedilatildeo e mais barata
razatildeo pela que eacute importante que a teacutecnica seja aprimorada
Oliveira et al (1999) investigaram os padrotildees de distribuiccedilatildeo dos
genoacutetipos do VHC estudando 250 pacientes anti-VHC positivos atraveacutes da
detecccedilatildeo VHC RNA pelo RT-PCR e encontraram prevalecircncia de 72 para o VHC 1
253 para o tipo 3 2 para o 2 e 07 para o 4 semelhantes aos das vaacuterias
regiotildees mundiais
13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC
As manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo pelo VHC satildeo as mais
variadas possiacuteveis A diversidade de resposta do hospedeiro ao agente infeccioso
variando desde quadros assintomaacuteticos ateacute aqueles com evoluccedilatildeo grave fatal ou
incapacitante tem estimulado a busca por justificativas de tais discrepacircncias
cliacutenicas sobretudo na imunomodulaccedilatildeo Dentre as infecccedilotildees mais bem estudadas
destacam-se aquelas pelos Viacuterus da hepatite C Viacuterus da imunodeficiecircncia humana1
(HIV-1) pelo Herpes viacuterus humano 4 (viacuterus do Epstein Baar) e pelo Mycobacterium
leprae (ABBAS LICHTMAN 2005)
A agressatildeo hepaacutetica por auto-imunidade eacute um fenocircmeno reconhecido em
vaacuterias doenccedilas do fiacutegado inclusive nas de etiologia viral Aleacutem do agente agressor e
de sua interaccedilatildeo com o sistema imunoloacutegico do hospedeiro fatores ambientais ou
hormonais estatildeo aparentemente envolvidos no surgimento de auto-imunidade
hepaacutetica como se supotildee acontecer na hepatite auto-imune em indiviacuteduos
geneticamente suscetiacuteveis (CODES et al 2002)
27
A lesatildeo hepatocelular relacionada agrave infecccedilatildeo pelos viacuterus hepatotroacutepicos e
pelos herpes viacuterus (citomegaloviacuterus e Epstein-Barr) eacute secundaacuteria a uma resposta
auto-imune do hospedeiro Estes viacuterus natildeo parecem ser diretamente citopaacuteticos
mas desencadeiam lesatildeo hepaacutetica atraveacutes da resposta imune do hospedeiro contra
ceacutelulas hepaacuteticas infectadas (MALOY POWRIE 2001)
Existem estudos que focalizam alteraccedilotildees imunoloacutegicas em hepatites
virais entretanto a maioria deles mostra resultados pontuais sem seguimento na
fase aguda da doenccedila (BLOCK SCHIANO 1999 McFARLONE et al 1990) Aleacutem
disso ainda natildeo se estabeleceu uma associaccedilatildeo entre as reaccedilotildees auto-imunes
transitoacuterias induzidas por viroses hepatotroacutepicas e agravamento do dano tecidual na
hepatite viral
A infecccedilatildeo crocircnica estaacute fortemente associada agrave crioglobulinemia mista
essencial glomerulonefrite membrano-proliferativa e porfiria cutacircnea tardia De
forma menos impressiva encontra-se tambeacutem associada agrave uacutelcera corneana de
Mooren liacutequen plano e fibrose pulmonar (KILLENBERG 2000 WENER et al 1996)
A ocorrecircncia de anticorpos antitireoidianos e hipotireoidismo tem sido relatada em
associaccedilatildeo com a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC em mulheres (KILLENBERG 2000
CACOUB et al 1999)
A associaccedilatildeo entre a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC a presenccedila do fator
reumatoacuteide e do anticorpo antinuclear (FAN) o fenocircmeno de Raynaud e doenccedilas
difusas do tecido conjuntivo (DDTC) como artrite reumatoacuteide luacutepus eritematoso
sistecircmico siacutendrome de Sjoumlgren e vasculites sistecircmicas eacute relatada em alguns
trabalhos (CACOUB et al 1999 LOVY STARKEBAUM UBEROI 1996 STAUB
1998 WENER et al 1996)
14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE
A associaccedilatildeo entre doenccedilas infecciosas e autoimunidade apresentando-
se com manifestaccedilotildees cliacutenicas ou detectadas apenas pelo desenvolvimento de auto-
anticorpos tem sido amplamente documentado Infecccedilotildees virais bacterianas e
parasitaacuterias podem estar envolvidas no desenvolvimento recidivas e ateacute mesmo na
prevenccedilatildeo de doenccedilas auto-imunes (KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)
Ribeiro e Proietti (2004) avaliaram a frequumlecircncia de FR anticorpos
antipeptiacutedeo citrulinado ciacuteclico (anti-CCP) AAN anticorpos anti-citoplasma de
28
neutroacutefilos (ANCA) anticorpos anticardiolipina (aCL) e anticorpos anti-β2
glicoproteiacutena I (anti-β2GPI) em pacientes com hanseniacutease Existe estudo
demonstrando pacientes que apresentavam manifestaccedilotildees articulares comparados
aos que natildeo apresentavam envolvimento articular e um grupo controle de indiviacuteduos
saudaacuteveis com idade e gecircnero semelhantes aos dos pacientes estudados e que
residiam na mesma aacuterea geograacutefica A maioria dos pacientes nos dois grupos (com
e sem envolvimento articular) apresentava hanseniacutease generalizada Entretanto
observaram uma baixa frequumlecircncia que natildeo foi significativamente diferente de FR
anti-CCP AAN e ANCA em pacientes com hanseniacutease (nos dois grupos) e normal
dos controles Mas a prevalecircncia de anticorpos aCL e anti-β2GPI estava
significativamente elevada nos pacientes com hanseniacutease quando comparados com
o grupo controle apesar de natildeo haver associaccedilatildeo significativa com o envolvimento
articular O isoacutetopo predominante dos dois autoanticorpos foi a IgM (487) dos
pacientes com hanseniacutease apresentava pelo menos um anticorpo antifosfoliacutepide
Aleacutem disso os autores observaram uma associaccedilatildeo entre a positividade para aCL e
as manifestaccedilotildees cliacutenicas jaacute que os pacientes com anticorpos aCL apresentavam
doenccedila Hanseniacutease generalizada (VV) com mais frequumlecircncia (p= 0002) Natildeo houve
associaccedilatildeo entre a presenccedila de anticorpos aCL ou anti-β2GPI e episoacutedios
reacionais poreacutem entre os pacientes com esses episoacutedios aqueles com anticorpos
aCL apresentavam eritema nodoso hansecircnico (ENH) em 100 dos casos enquanto
entre os pacientes negativos para aCL 57 apresentavam ENH Apesar de uma
alta taxa de concordacircncia para a presenccedila de anticorpos aCL e anti-β2GPI ter sido
observada manifestaccedilotildees tromboemboacutelicas natildeo foram observadas (RIBEIRO
PROIETTI 2004 2005)
Horimoto e Costa (2009) avaliaram pacientes com Leishmania
(leishmaniose visceral e leishmaniose cutacircnea) para a presenccedila de anticorpos anti-
Leishmania assim como FR AAN anti-DNA anti-Sm anti-RNP anti-Ro anti-La
aCL e complemento (C3 e C4) Como esperado os pacientes com leishmaniose
visceral apresentava anticorpos anti-Leishmania Tiacutetulos significativamente elevados
de AANs na maioria dos pacientes o anti-DNA foi detectado em poucos pacientes
com doenccedila visceral assim como tiacutetulos elevados de anticorpos aCL (isotipo IgG)
quando comparados com os pacientes com leishmaniose cutacircnea Niacuteveis reduzidos
de complemento tambeacutem satildeo evidentes na doenccedila visceral assim como niacuteveis
significativamente reduzidos de C3 Outros estudos comparam e discutem os
29
resultados em relaccedilatildeo agrave crescente evidecircncia na literatura da presenccedila de
autoanticorpos em ambas as doenccedilas Em geral a prevalecircncia variaacutevel de auto-
anticorpos relatada assim como relatos preacutevios na literatura podem estar
relacionados a diferenccedilas metodoloacutegicas como o tipo de ensaio utilizado a
definiccedilatildeo dos pontos de corte inativaccedilatildeo dos soros pelo calor seleccedilatildeo de pacientes
e variaccedilotildees eacutetnicas e geograacuteficas nos grupos de pacientes Mas um dos resultados
consistentes foi a frequumlecircncia significativamente mais elevada de anticorpos
antifosfoliacutepide aCL e anti-β2GPI em pacientes com hanseniacutease enquanto
anticorpos AAN e aCL foram detectados com mais frequumlecircncia nos pacientes com
leishmaniose visceral A incidecircncia aumentada de anticorpos AAN e aCL nos
pacientes com leishmaniose visceral eacute compatiacutevel com outros estudos (OSSADRON
et al 2006 SAKKAS et al 2008 VOULGARI et al 2004) e demonstra
semelhanccedilas das manifestaccedilotildees cliacutenicas e laboratoriais entre a leishmaniose
visceral e o luacutepus eritematoso sistecircmico (LES) Aleacutem disso a reatividade cruzada
entre AAN e anticorpos anti-Leishmania jaacute foi tambeacutem relatada (GRANEL et al
2000)
Diversos grupos documentaram niacuteveis elevados de anticorpos
antifosfoliacutepide (aCL anti-β2GPI e anti-protrombina) em diversas doenccedilas
infecciosas como a siacutefilis doenccedilas virais (incluindo a hepatite C Parvoviacuterus B19 e
HIV) malaacuteria e hanseniacutease sem as manifestaccedilotildees cliacutenicas da siacutendrome
antifosfoliacutepide (SAF) (ZANDMAN-GODDARD BLANK SHOENFELD 2002) Os
tiacutetulos elevados geralmente satildeo transitoacuterios diminuindo e desaparecendo apoacutes a
resoluccedilatildeo da infecccedilatildeo (LOIZOU et al 2003 ZANDMAN-GODDARD BLANK
SHOENFELD 2002) Mas em uma minoria dos pacientes a associaccedilatildeo entre
doenccedilas infecciosas e anticorpos antifosfoliacutepide pode levar a complicaccedilotildees severas
frequumlentemente fatais ou seja SAF catastroacutefica (ZANDMAN-GODDARD BLANK
SHOENFELD 2002)
Os resultados de Ribeiro e Proietti (2005) mostrando um aumento da
incidecircncia de anticorpos anti-β2-GPI em pacientes com hanseniacutease associados aos
dados de outros grupos (De LARANAGA et al 2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK
et al 1994 LOIZOU et al 2003) que tambeacutem documentaram niacuteveis elevados de
anticorpos anti-2βGPI lanccedilam duacutevidas sobre a noccedilatildeo de que os anticorpos aCL
associados a infecccedilotildees satildeo independentes dos anticorpos anti-β2GPI e natildeo
dependentes desses anticorpos como nas doenccedilas auto-imunes Em conjunto
30
esses resultados apoacuteiam a noccedilatildeo de que na presenccedila de infecccedilotildees anticorpos aCL
satildeo heterogecircneos em relaccedilatildeo agrave sua dependecircncia da 2GPI (De LARANAGA et al
2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK et al 1994 LOIZOU et al 2003) e as infecccedilotildees
podem desencadear a induccedilatildeo de anticorpos antifosfoliacutepide patogecircnicos em
indiviacuteduos predispostos (LOIZOU et al 2003)
A produccedilatildeo de autoanticorpos na hanseniacutease e leishmaniose pode ser
explicada por diversos mecanismos Na forma mais generalizada dessas doenccedilas
(hanseniacutease VV e leishmaniose visceral) os pacientes apresentam
hipergamaglobulinemia difusa semelhante agrave vista em outras infecccedilotildees como
Schistosoma mansoni T cruzi e Plasmodium A induccedilatildeo de autoanticorpos pode ser
atribuiacuteda agrave ativaccedilatildeo policlonal e proliferaccedilatildeo das ceacutelulas B algumas com auto-
reatividade pertencentes agrave biblioteca de anticorpos naturais em indiviacuteduos normais
(ARGOV et al 1989) Na leishmaniose antiacutegenos soluacuteveis derivados da L major e
L donovani satildeo mitogecircnicos e desencadeiam a produccedilatildeo de imunoglobulinas com
auto-reatividade (ARGOV et al 1989) Crioglobulinemia mista induzida pelo HCV eacute
outro exemplo de ativaccedilatildeo policlonal persistente levando a uma mistura de
autoanticorpos policlonais e monoclonais os quais causam doenccedilas auto-imunes
(AGMON-LEVIN et al 2009)
Mimetismo molecular ou homologias estruturais entre infecccedilotildees e
componentes do hospedeiro podem ser agrave base da produccedilatildeo de autoanticorpos
como no caso da febre reumaacutetica onde o componente M da membrana do
estreptococo apresenta homologia com peptiacutedeos cardiacuteacos cerebrais e sinoviais A
associaccedilatildeo da siacutendrome de Guillain-Barreacute com a infecccedilatildeo pelo Campylobacter
jejeuni representa outro exemplo de mimetismo molecular como base de uma
manifestaccedilatildeo auto-imune A reatividade cruzada entre agentes infecciosos e auto-
antiacutegenos jaacute foi demonstrada para o M leprae (McADAM MUDD SHOENFELD
1984) e M tuberculosis (SHOENFELD et al 1986) e a inibiccedilatildeo de anticorpos anti-
Sm anti-RNP e anti-SSB por promastigotas intactas de Leishmania apoacuteia a
homologia entre antiacutegenos nucleares e a Leishmania (ARGOV et al 1989)
A disseminaccedilatildeo de epiacutetopos a emergecircncia de novos anticorpos ou a
resposta de ceacutelulas T a um novo epiacutetopo (subdominante ou criacuteptico) no mesmo
antiacutegeno ou em outro antiacutegeno foi demonstrada em modelos experimentais e na
doenccedila humana alguns autores demonstraram a disseminaccedilatildeo molecular do
antiacutegeno Sm para reatividade anti-RNP (STAUB 1998) no LES enquanto na febre
31
reumaacutetica o estado de autoimunidade crocircnica que afeta as vaacutelvulas cardiacuteacas pode
resultar em uma resposta imunoloacutegica contra o colaacutegeno e laminina (KIVITY et al
2009 PORDEUS et al 2008) As infecccedilotildees tambeacutem podem desempenhar um papel
importante na induccedilatildeo da autoimunidade atraveacutes da liberaccedilatildeo de antiacutegenos
sequumlestrados apoacutes lesatildeo tecidual ou aumentando a exibiccedilatildeo de epiacutetopos criacutepticos
no meio inflamatoacuterio apresentando assim novos antiacutegenos ao sistema imunoloacutegico
(KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)
15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES
AGUDAS VIRAIS
O conceito de auto-imunidade induzida por viacuterus natildeo eacute exclusivo para
doenccedilas hepaacuteticas O viacuterus Coxsackie do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um
terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite infecciosa e estaacute implicado nas miocardites
auto-imunes reagindo contra a miosina cardiacuteaca (GIST BELL 1974) Niwa et al
(1984) encontraram elevaccedilatildeo transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator
reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas
virais comuns como varicela sarampo influenza caxumba herpes zoster e
exantema suacutebito
A patogecircnia da infecccedilatildeo viral inclui pelo menos trecircs tipos de interaccedilotildees
com o hospedeiro vertebrado 1) o efeito do agente sobre as ceacutelulas 2) a maneira
de disseminaccedilatildeo do agente no organismo infectado 3) a resposta imunoloacutegica e a
sua influencia no processo infeccioso Destacam-se dois tipos principais da
interaccedilatildeo a destruiccedilatildeo celular e a resposta imunoloacutegica (FIGUEIREDO 1999
CATALAN-SOARES PROIETTI CARNEIRO-PROIETTI 2006) O viacuterus Coxsackie
do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite
infecciosa e estaacute implicado nas miocardites auto-imunes reagindo contra a miosina
cardiacuteaca (GERSHON KONDO 1971) Niwa et al (1984) encontraram elevaccedilatildeo
transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo
anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas virais comuns como varicela sarampo
influenza caxumba herpes zoster e exantema suacutebito
32
16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN
De acordo com o II Consenso Brasileiro de FAN em HEp 2
(DELLAVANCE et al 2003) os AAN satildeo encontrados comumente em uma
variedade de doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Satildeo uacuteteis na investigaccedilatildeo dessas
doenccedilas auxiliando no diagnoacutestico de patologias como LES esclerose sistecircmica
progressiva (ESP) doenccedila mista do tecido conjuntivo (DMTC) siacutendrome de Sjoumlgren
(SS) polimiosite e dermatomiosite
Eles podem estar presentes em um pequeno percentual da populaccedilatildeo
aparentemente sadia essa frequumlecircncia eacute maior em mulheres e aumenta com a idade
Segundo a literatura a positividade entre 20 a 60 anos varia entre percentuais mais
altos (133) para tiacutetulos baixos e mais baixos (33) para tiacutetulos mais elevados
(DELLAVANCE et al 2003)
A pesquisa dos anticorpos antinucleares pode ser realizada por diferentes
teacutecnicas a imunofluorescecircncia indireta eacute a mais utilizada por sua sensibilidade
reprodutibilidade e facilidade de execuccedilatildeo A sensibilidade aumenta
significativamente quando se utiliza como substrato lacircminas com ceacutelulas Hep 2
(ceacutelulas de carcinoma de laringe humana) por causa da maior expressatildeo de
antiacutegenos na superfiacutecie dessas ceacutelulas comparados aos expressos nas ceacutelulas de
fiacutegado ou de rins de camundongos que se utilizavam anteriormente
Em geral eacute possiacutevel detectar melhor a presenccedila de AAN por associaccedilatildeo
de trecircs anti-soros isotipos especiacuteficos (anti-IgG anti-IgA e anti-IgM) A pesquisa
realizada por essa teacutecnica serve de triagem inicial para a presenccedila de AAN Eacute
normalmente denominada pesquisa de FAN ou AAN
A realizaccedilatildeo de outras metodologias tais como as imunoenzimaacuteticas
permite uma avaliaccedilatildeo isolada dos diferentes auto-anticorpos sugeridos pelos
padrotildees de fluorescecircncia encontrados no FAN A identificaccedilatildeo desses AAN permite
um diagnoacutestico mais preciso e eles podem ser utilizados em muitos casos como
marcador para uma das diferentes doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Muitas dessas
patologias apresentam um perfil distinto de auto-anticorpos que auxilia o diagnoacutestico
A presenccedila de FAN positivo em pessoas aparentemente sadias pode ser
devida a algumas situaccedilotildees
minus Doenccedila auto-imune precoce ainda natildeo expressa clinicamente
33
minus distuacuterbio imunoloacutegico transitoacuterio causado por doenccedila natildeo-imune
tais como infecccedilotildees principalmente virais
minus uso de medicamentos e neoplasias
minus manifestaccedilatildeo incompleta de uma siacutendrome ou seja o paciente
sintetiza o anticorpo poreacutem esse quadro natildeo evolui para doenccedila
minus fenocircmeno auto-imune fisioloacutegico
O resultado do FAN eacute expresso em tiacutetulo e padratildeo uma vez que ambos
os paracircmetros tecircm importacircncia para a avaliaccedilatildeo do significado cliacutenico do exame O
tiacutetulo do FAN corresponde agrave maior diluiccedilatildeo capaz de demonstrar fluorescecircncia
inequiacutevoca e didaticamente pode ser dividido em
minus Baixo menor 180
minus Moderado 1160
minus Moderadamente elevado 1320
minus Alto maior 1640
Nas pesquisas realizadas por imunofluorescecircncia indireta os resultados
satildeo expressos em tiacutetulos segundo as diluiccedilotildees empregadas Eacute possiacutevel trabalhar
utilizando-se como limite tiacutetulos de 140 que permitem maior sensibilidade ou de
180 que permitem maior especificidade ou seja um menor nuacutemero de falso-
positivos
Na praacutetica cliacutenica satildeo considerados significativos tiacutetulos superiores a
1160 Os resultados com tiacutetulos positivos satildeo acompanhados pela descriccedilatildeo do
padratildeo de fluorescecircncia encontrado que serve como orientaccedilatildeo da presenccedila de um
antiacutegeno especiacutefico e em alguns casos como padratildeo diagnoacutestico Em determinadas
situaccedilotildees em especial no LES em atividade pode ocorrer agrave observaccedilatildeo de mais de
um padratildeo de fluorescecircncia
O padratildeo do FAN a seu turno aponta uma probabilidade maior ou menor
de doenccedila auto-imune e ateacute mesmo sugere o antiacutegeno nuclear envolvido e por
consequumlecircncia a afecccedilatildeo com ele mais relacionada Os padrotildees homogecircneo
centromeacuterico e pontilhado grosso satildeo os mais indicativos de processos de
autoimunidade uma vez que se associam a diversas condiccedilotildees reumaacuteticas
especialmente ao LES e agrave esclerose sistecircmica e tambeacutem a enfermidades hepaacuteticas
tais como a cirrose biliar primaacuteria e a hepatite auto-imune (KILLENBERG 2000)
34
Jaacute o pontilhado fino o pontilhado grosso reticulado e a membrana nuclear
tecircm maior significado quando encontrados em tiacutetulos altos uma vez que podem
estar presentes em tiacutetulos baixos em indiviacuteduos hiacutegidos Por sua vez o pontilhado
fino denso mesmo quando elevado em pessoas assintomaacuteticas soacute guarda relaccedilatildeo
com alguma doenccedila em cerca de 20 dos casos (DELLAVANCE et al 2003)
O padratildeo pontilhado pode tambeacutem ser referido como padratildeo salpicado
Outros padrotildees de fluorescecircncia podem ser encontrados em menor frequumlecircncia Os
pontilhados citoplasmaacutetico grossos ou reticulares associados agrave presenccedila de
anticorpos antimitococircndrias em pacientes com cirrose biliar primaacuteria o
citoplasmaacutetico homogecircneo relacionado a proteiacutenas ribossocircmicas em pacientes com
LES e o padratildeo pontilhado fino citoplasmaacutetico que pode estar associado agrave
presenccedila de anticorpos anti-JO-1 anti-PCNA e proteiacutenas da membrana celular em
pacientes com LES outras patologias do tecido conjuntivo e hepatopatias auto-
imunes (DELLAVANCE et al 2003)
Quadro 1 - Padrotildees de fluorescecircncia encontrados em maior frequumlecircncia e patologias relacionadas
Padrotildees de Fluorececircncia Antiacutegenos Patologias Relacionadas
Perifeacuterico DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES
Homogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA
LES AR lupus induzido por drogas
Perifeacutericohomogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES
Pontilhado grosso SM RNP LES DMTC
Pontilhado fino nuclear SS-A (RO) SS-B (La) SS LES
Nucleolar Proteiacutenas Nucleolares ESP Centromeacuterico Proteiacutenas de centrocircmeros Siacutendrome de CREST
Fonte Dellavance et al 2003 Quadro 2 - Anti-ena - auto-anticorpos contra antiacutegenos extraiacutedos do nuacutecleo e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleares Patologias Relacionadas SM LES RNP DMTC LES ESP AR e Polimiosite
SS-A (Ro) SS LES lupus neonatal e forma cutacircnea subaguda
SS-B (La) SS LES luacutepus neonatal e forma cutacircnea subaguda
Scl 70 ESP Jo -1 Polimiosite e dermatomiosite Fonte Dellavance et al 2003
35
Quadro 3 ndash Padrotildees de FAN nuclear e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes
Padrotildees Nucleares Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos
Nuclear Pontilhado Centromeacuterico Anticorpo anti-centrocircmero Esclerose Sistecircmica forma CREST Cirrose Biliar Primaacuteria
Nuclear homogecircneo Anticorpo anti-DNA nativo Lupus Eritematoso Sistecircmico (LES) Anticorpo anti-Histoma LES induzido por drogas LES idiopaacutetico Anticorpo anti-cromatina (DNAHistona Nucleossomo) Artrite Reumatoacuteide (AR) Artrite Idiopaacutetica Juvenil importante associaccedilatildeo com uveiacutete na forma oligoarticular Siacutendrome de Felty Cirrose Billar Primaacuteria
Nuclear tipo membrana nuclear contiacutenua Anticorpo anti-Iamin e contra envelope nuclear - Iamins Hepatites auto-imunes Raramente associado a doenccedilas reumaacuteticas (algumas formas de LES e esclerodermia linear)
Nuclear pontilhado pleomoacuterficoPCNA Anticorpo contra nuacutecleo de ceacutelulas em proliferaccedilatildeo LES
Nuclear pontilhado fino denso Anticorpo anti-proteina p 75 kDa pode ser encontrado em indiviacuteduos saudaacuteveis processos inflamatoacuterios inespeciacuteficos doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Cistite Intersticial Dermatite Atoacutepica Psoriacutease e Asma
Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos
Anticorpo anti-p80 coilina natildeo apresenta associaccedilatildeo cliacutenica definida
Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos
Anticorpo anti-Sp100 (anti-p95) Cirrose Biliar Primaacuteria pode ocorrer em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas
Nuclear pontilhado grosso Anticorpo anti-Sm LES Anticorpo anti-RNP criteacuterio obrigatoacuterio no diagnostico da doenccedila mista do Tecido conjuntivo (DMTC) tambeacutem ocorre no LES Esclerose Sistecircmica (ES) e AR
Nuclear pontilhado fino Anticorpo anti SSARo Siacutendrome de Sjogren Primaacuteria (SS) LES Lupus neonatal e Lupus Cutacircneo Subagudo Anticorpo anti-SSBLa Lupus neonatal LES SS Anticorpo anti-Mi-2 Dermatomiosite embora raramente ocorra na polimiosite do adulto
Fonte Dellavance et al 2003
36
Quadro 4 - Padrotildees de FAN citoplasmaacuteticos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes
Padrotildees Citoplasmaacuteticos e Relacionados ao Aparelho Mitoacutetico Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos
Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina Hepatite auto-imune Cirrose Anticorpo anti-miosine Hepatite C Hepatocarcionoma Miastenia Gravis Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida
Citoplasmaacutetico Fibrilar Segmentar Anti actinina anti--vinculina e anti-tropomiose Miastenia Gravis Doenccedila de Crohn e Colite ulcerativa Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia cliacutenica definida
Citoplasmaacutetico Pontilhado Polar Anticorpo Anti-golginas (cisternas do aparelho de Golgi) raro no LES SS e outras doenccedilas auto-imunes sistecircmicas Relato na Ataxia Cerebelar Idiopaacutetica Degeneraccedilatildeo Cerebelar Paraneoplaacutesica infecccedilotildees virais pelo Epstein Barr (EBV) e pelo viacuterus da imunodeficiecircncia Humana (HIV) Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida
Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Anticorpo anti-Histidill t RNA sintetase (Jo-1) anticorpo marcador de Polimiosite no adulto Descrito raramente na Dermatomiosite
Citoplasmaacutetico Pontilhado com Pontos Isolados
Anticorpo anti-EEA1 e anti-fosfatidilserina natildeo haacute associaccedilotildees clinicas bem definida Anticorpo anti-GWBSS tambeacutem encontrado em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas
Citoplasmaacutetico Pontilhado Reticulado Anticorpo anti-mitococircndria Cirrose Biliar Primaacuteria Esclerose Sistecircmica Eacute relativamente comum o encontro deste padratildeo na ausecircncia de anticorpos anti-mitococircndria
Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Denso Anti PL7PL12 Raramente associado a Polimiosite Anticorpo P-ribossomal Este padratildeo ocorre no LES se a associaccedilatildeo eacute com anti-proteina P ribossomal
Citoplasmaacutetico Fibrilar Filamentar Anticorpo anti-vimentina e anti-queratina Anti-queratina eacute o anticorpo mais importante em doenccedila hepaacutetica alcooacutelica Descritos em vaacuterias doenccedilas inflamatoacuterias e infecciosas Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida
Aparelho mitoacutetico Tipo Centriacuteolo Anticorpo anti-enolase em baixos tiacutetulos natildeo tem associaccedilatildeo cliacutenica definida Em altos tiacutetulos eacute sugestivo de Esclerose Sistecircmica
Aparelho mitoacutetico Tipo ponte Intercelular
Anticorpo anti Tubulina Pode ser encontrado no LES e na DMTC outros anticorpos ainda natildeo bem definidos podem gerar o mesmo padratildeo
Aparelho mitoacutetico Tipo NuMa2 Anticorpo anti-HsEg5 diversas condiccedilotildees auto-imunes com baixa especificidade
Fonte Dellavance et al 2003
37
Quadro 5 - Padrotildees de FAN mistos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Mistos Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos
Misto do tipo nucleolar homogecircneo e nuclear pontilhado grosso com placa metafaacutesica decorada em anel (cromossomos negativos)
Anticorpo anti-Ku Superposiccedilatildeo Polimiose e Esclerose Sistecircmica Podem ocorrer no LES e Esclerodermia
Misto do tipo nuclear e nucleolar pontilhado com placa metafaacutesica positiva
Anticorpo anti-topoisomerase (Scl-70) ES forma difusa Mais raramente pode ocorrer na Siacutendrome CREST e superposiccedilatildeo PolimiositeEsclerodermia
Misto do tipo Citoplasmaacutetico pontilhado fino denso e homogecircneo e nucleolar homogecircneo
Anticorpo anti rRNP LES frequumlentemente relacionado agrave Psicose Luacutepica
Misto do tipo nuclear pontilhado fino com fluorescecircncia do aparelho mitoacutetico
Anticorpo anti-NuMA1SS pode ocorrer tambeacutem em outras condiccedilotildees auto-imunes ou inflamatoacuterias crocircnicas
Fonte Dellavance et al 2003
Quadro 6 - Padrotildees de FAN nucleolares e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleolares Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos
Nucleolar Aglomerado
Anticorpo anti-Fibrilarina (U3-nRNP) Esclerose Sistecircmica (ES) especialmente com comprometimento visceral grave entre eles a hipertensatildeo pulmonar
Nucleolar Pontilhado
Anticorpo anti-NOR-90 ES tambeacutem descrito em outras doenccedilas do tecido conjuntivo poreacutem sem relevacircncia clinica definida Anticorpos anti-RNA polimerase I ES de forma difusa com tendecircncia para comprometimento visceral mais frequumlente e grave
Nucleolar Homogecircneo
Anticorpo anti-PMScl Siacutendrome de Superposiccedilatildeo de Polimiosite com Esclerose Sistecircmica Raramente encontrado em casos de Polimiosite ou Esclerose Sistecircmica sem superposiccedilatildeo cliacutenica Outros auto-anticorpos mais raros podem apresentar esse padratildeo
Fonte Dellavance et al 2003
De acordo com o 3deg Consenso (DELLAVANCE et al 2009) foram
comunicados dois novos padrotildees de fluorescecircncia por participantes Vaacuterios outros
membros testemunharam jaacute haver observado esses padrotildees O primeiro trata-se de
um padratildeo nuclear pontilhado fino aproximando-se da textura homogecircnea e com
placa metafaacutesica corada da mesma forma Sua associaccedilatildeo cliacutenica e identidade
imunoloacutegica natildeo estatildeo definidas Sua importacircncia deriva do fato de que pode ser
facilmente confundido com o padratildeo pontilhado fino denso e com o padratildeo
homogecircneo O segundo trata-se de um padratildeo citoplasmaacutetico em forma de
pequenos bastotildees (rods) e ciacuterculos (rings) que aparentemente estaacute associado agrave
38
infecccedilatildeo pelo HCV Haacute estudos em curso por alguns grupos de pesquisa com a
finalidade de estabelecer sua identidade imunoloacutegica
Como ainda natildeo estatildeo definitivamente caracterizados esses dois novos
padrotildees foram considerados preliminares e o 3deg Consenso recomendou que os
mesmos fossem completamente caracterizados e apresentados na proacutexima versatildeo
do Consenso (DELLAVANCE et al 2009)
39
2 JUSTIFICATIVA
As inflamaccedilotildees do fiacutegado provocadas pelos viacuterus hepatotroacutepicos atingem
milhotildees de pessoas e representam significativos problemas de sauacutede puacuteblica em
todo o mundo No Brasil a Regiatildeo Norte responde por um significativo percentual
dos portadores de hepatite C Dentre as manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo
pelo viacuterus C as doenccedilas autoimunes tecircm significativo impacto na evoluccedilatildeo cliacutenica
desses pacientes A presenccedila de anticorpo antinuacutecleo eacute um marcador importante de
autoimunidade e apesar de existirem trabalhos relatando a pesquisa desse fator em
portadores de viacuterus C tais estudos ainda natildeo foram realizados na nossa regiatildeo
sobretudo correlacionando-se com o genoacutetipo do viacuterus responsaacutevel pela infecccedilatildeo
considerando que o genoacutetipo eacute um marcador de resposta ao tratamento ou
considerando que pacientes portadores do genoacutetipo 1 natildeo respondem
satisfatoriamente ao tratamento instituiacutedo pelo protocolo atual
21 ASPECTOS EacuteTICOS
A pesquisa a ser realizada apresenta relevacircncia social e natildeo perde o
sentido de sua destinaccedilatildeo soacutecio-humanitaacuteria (justiccedila e equidade)
Este trabalho adequa-se aos princiacutepios cientiacuteficos que o justificam e
apresenta possibilidade concreta de responder a incertezas tais como FAN e o
genoacutetipo viral em pacientes com infecccedilatildeo pelo viacuterus da hepatite C ldquoestatildeo
relacionadosrdquo
Segue rigorosamente os procedimentos descritos na Resoluccedilatildeo 19696-
CNSMS (BRASIL 1996) assegurando a confidenciabilidade e proteccedilatildeo da
identidade do sujeito da pesquisa no momento da afericcedilatildeo dos dados e sua
posterior utilizaccedilatildeo
Por tratar-se de um estudo que faraacute somente revisatildeo de soroteca os
participantes natildeo seratildeo submetidos a riscos de origem orgacircnica eou quiacutemica
40
3 OBJETIVOS
31 OBJETIVO GERAL
Estabelecer associaccedilatildeo entre a presenccedila de teste de FAN e o genoacutetipo
viral em pacientes portadores de infecccedilatildeo pelo HCV
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
I Identificar o padratildeo de fluorescecircncia do FAN em pacientes com diagnoacutestico
laboratorial de infecccedilatildeo pelo HCV
II Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados
pelo HCV de acordo com o gecircnero e a idade
III Identificar a prevalecircncia de FAN em pacientes infectados pelo HCV e natildeo
infectados
IV Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados
pelo HCV de acordo com as alteraccedilotildees bioquiacutemicas
41
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO)
Foi realizado um estudo transversal analiacutetico no Serviccedilo do Nuacutecleo de
Medicina Tropical da Universidade Federal do Paraacute (NMTUFPA) utilizando-se
pacientes oriundos da Fundaccedilatildeo Centro de Hemoterapia e Hematologia do Paraacute
(HEMOPA) e Plano de Assistecircncia ao Servidor (PASIASEP) com coleta de material
bioloacutegico para reconfirmaccedilatildeo do diagnoacutestico de hepatite C no periacuteodo de janeiro de
2009 a maio de 2010
411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C
A populaccedilatildeo de estudo consistiu de 51 pacientes admitidos no NMTUFPA
para reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica tratamento cliacutenico e acompanhamento ambulatorial
de ambos os gecircneros e independente da idade sem exclusatildeo dos pacientes com a
presenccedila de patologias associadas agrave condiccedilatildeo maior (motivadora da pesquisa)
oriundos da Fundaccedilatildeo HEMOPA e PAS
A amostra do grupo foi selecionada a partir da relaccedilatildeo dos prontuaacuterios
catalogados no laboratoacuterio de patologia do NMTUFPA
Os dados foram coletados atraveacutes dos resultados dos exames realizados
no soro de cada paciente O protocolo de coleta teve enfoque na identificaccedilatildeo
individual do paciente bem como a avaliaccedilatildeo cliacutenica dos resultados
412 Grupo de natildeo infectados
Foi utilizado um grupo controle de 100 amostras de soro de indiviacuteduos
doadores de sangue com sorologias negativas para HIV 1 e 2 HTLV 1 e 2 Siacutefilis
Doenccedilas de Chagas Hepatite B e para Hepatite C procedentes da fundaccedilatildeo
HEMOPA
42
42 MEacuteTODO
421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico
Foram colhidos em frasco sem anticoagulante 10ml de sangue perifeacuterico
dos 51 pacientes participantes da pesquisa A amostra sanguiacutenea de cada paciente
foi centrifugada o soro foi separado e colocado em frasco esteacuteril devidamente
identificado armazenado e resfriado de 2 a 8ordmC
Foi realizada no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais a
pesquisa soroloacutegica de anticorpos IgG anti-HCV por teste imunoenzimaacutetico (ELISA)
e os pacientes que apresentaram positividade tiveram seus resultados confirmados
atraveacutes de teacutecnicas moleculares (RT-PCR) e com identificaccedilatildeo do genoacutetipo viral
(genotipagem)
Foi realizado no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa a pesquisa
de FAN dos 51 pacientes selecionados utilizando as amostras existentes na
soroteca
422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C
Foram empregados testes soroloacutegicos de ELISA (Ensaio
Imunoenzimaacutetico) de 3ordf geraccedilatildeo utilizando-se de kits comerciais (kit ETI-AB-HCVK-
4 DiaSorin Itaacutelia) para detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos anti-HCV no soro dos
pacientes
As tiras (poccedilos) necessaacuterias para as reaccedilotildees foram retiradas da geladeira
com antecedecircncia de uma hora e deixadas agrave temperatura ambiente e os reagentes
homogeneizados rapidamente no voacutertex
O primeiro poccedilo da placa ficou o branco da reaccedilatildeo na sequecircncia da
microplaca de ELISA foi dispensado 200 microL do controle negativo em triplicata (trecircs
poccedilos) 200 microL do calibrador em duplicata (dois poccedilos) e 200 microL do controle positivo
em amostra uacutenica (um poccedilo)
Adicionou-se 200 microL do Diluente de Amostra em todos os poccedilos que
continham as amostras dos pacientes a serem dosadas na placa de ELISA
tomando cuidado para natildeo contaminar os poccedilos adjacentes
43
Dispensou-se 50 microL do Diluente do Reagente em todos os poccedilos de
controles calibradores e amostras cobrimos com adesivo para evitar evaporaccedilatildeo e
contaminaccedilatildeo das amostras e incubamos a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC
Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com
300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem diluiacuteda
Pipetou-se 100 microL de Conjugado Enzimaacutetico exceto no poccedilo do branco e
incubou-se a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se
cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com 300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem
diluiacuteda
Pipetou-se 100 microL de CromoacutegenoSubstrato em todos os poccedilos
Incubamos a microplaca protegendo-a de luz intensa e direta agrave temperatura
ambiente (18-24ordmC) por 15 min
Pipetou-se 100 microL de Aacutecido Sulfuacuterico em todos os poccedilos para ldquopararrdquo a
reaccedilatildeo enzimaacutetica e mediu-se a absorbacircncia da soluccedilatildeo obtida em leitor de ELISA
com filtro de 450 nM
O teste foi validado de acordo com os valores do controle de qualidade
preconizados pelo fabricante e que devem tanger os valores para o branco da
reaccedilatildeo le 0100 controle negativo le 0050 controle positivo ge 1000 e calibrador ge
1100 Para as amostras testadas os valores reagentes e natildeo reagentes para
pesquisa de anticorpos anti-HCV satildeo interpretados da seguinte maneira natildeo
reagentes com valores le 09 reagentes com valores ge 11 e indeterminados entre
os valores 09 ndash 11
423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia molecular
Nas amostras positivas pela sorologia (ELISA) realizou-se extraccedilatildeo do
RNA viral presente no soro do paciente utilizando kit comercial (QIAmp Viral RNA
kit Quiagen Alemanha) seguindo a teacutecnica adaptada no Laboratoacuterio de Patologia
Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais
Pipetou-se 560 microL de tampatildeo AVL (lise) contendo RNA em tubo de
centriacutefuga de 15 ml identificado adicionou-se 140 microL da amostra e homogenizou-se
em voacutertex por 15s incubando a temperatura ambiente (15-25degC) por 10 min Apoacutes
incubaccedilatildeo centrifugou-se rapidamente o tubo para remover partiacuteculas dispersas
44
Adicionou-se 560 microL de etanol (96-100) na amostra e homogenizou-se
no voacutertex por 15s centrifugando-se rapidamente para remover partiacuteculas dispersas
Depois cuidadosamente transferiu-se 630 microL para as colunas devidamente
identificadas centrifugou-se a 14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo
ficando soacute com a coluna para encaixar em outro tubo
Colocou-se o resto das amostras nas colunas devidas centrifugou-se a
14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo ficando soacute com a coluna para
encaixar em outro tubo Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW1) e
centrifugou-se por 1 min mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo
Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW2) e centrifugou-se por 4 min
mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo
Identificados os tubos para RNA colocou-se as colunas Adicionou-se 60
microL de tampatildeo para eluir (AVE) em cada amostra e centrifugou-se por 1 min
descartando a coluna e ficando com o tubo Colocou-se em banho-maria por 10 min
a 65degC centrifugado rapidamente e colocado no gelo As amostras extraiacutedas foram
congeladas e armazenadas em freezer a -20ordmC
O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado de acordo com a teacutecnica de
RT-PCR qualitativa com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das
Doenccedilas Tropicais da seguinte maneira para o Mix de uma amostra Tampatildeo 12
microL primer ou iniciador k10 1microL primer ou iniciador k11 1microL aacutegua ultrapura livre de
DNAse e RNAse 5 microL Enzima Taq polymerase One-Step (Invitrogen) 1 microL O
primer k10 constitui-se da sequecircncia GGC GAC ACT CCA CCA TRR e o primer k11
da sequecircncia GGT GCA CGG TCT ACG AGA CC
O volume do mix por amostra eacute de 20 microL e o volume da amostra (produto
da extraccedilatildeo) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As amostras
foram colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo eacute realizada a 42ordmC por 45 minutos
temperatura inicial de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 2 minutos seguida de 35 ciclos com
temperatura de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 54ordmC por 30
segundos de extensatildeo a 72ordmC por 45 segundos e temperatura de extensatildeo final de
72ordmC por 7 minutos e um hold de 4ordmC
Para visualizaccedilatildeo do produto dessa 1ordf PCR (RT-PCR) eacute feito um gel de
agarose a 1 (1g de agarose para 100mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de
etidium) que migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os
resultados foram visualizados atraveacutes de luz ultravioleta (UV) Os pacientes
45
positivos que apresentarem ldquobandardquo devem continuar os procedimentos e os
negativos que natildeo apresentarem ldquobandasrdquo deveratildeo ser liberados como
indetectaacuteveis por este meacutetodo
A 2ordf PCR (RFLP) foi responsaacutevel por fazer a amplificaccedilatildeo do cDNA
produto da 1ordf PCR Para esta etapa tambeacutem com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio
de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais foram necessaacuterios para o Mix de uma
amostra Tampatildeo 10X 25 microL DNTP 4 microL MgCl2 15 microL primer ou iniciador k15 1
microL primer ou iniciador k16 1 microL aacutegua ultrapura livre de DNAse e RNAse 125 microL
Enzima Taq platinum (Invitrogen) 05 microL O primer k15 constitui-se da sequecircncia
ACC ATR RAT CAC TCC CCT GT e o primer k16 da sequecircncia CAA GCA CCC TAT
CAG GCA GT
O volume do mix por amostra foi de 23 microL e o volume da amostra
(produto da 1ordf PCR) de 2 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As
amostras satildeo colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo se realiza a temperatura inicial
de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 4 minutos seguida de 35 ciclos com temperatura de
desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 55ordmC por 45 segundos de
extensatildeo a 72ordmC por 1 minuto e temperatura de extensatildeo final de 72ordmC por 7
minutos e um hold de 4ordmC
O produto da 2ordf PCR eacute observado atraveacutes de um gel de agarose a 1 (1g
de agarose para 100 mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que
migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os resultados
foram visualizados atraveacutes de luz UV (ultravioleta) Os pacientes positivos que
apresentaram ldquobandardquo (fragmento amplificado) se continuou os procedimentos e os
negativos que natildeo apresentaram ldquobandasrdquo foram repetidos para o procedimento da
2ordf PCR
424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem)
Os pacientes positivos para a 2ordf PCR foram submetidos agrave genotipagem
do viacuterus atraveacutes do meacutetodo de RFLP utilizando um par de enzimas de restriccedilatildeo
AVA II e RSA I Essa teacutecnica tambeacutem foi adaptada no Laboratoacuterio de Patologia
Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais
46
Na determinaccedilatildeo do genoacutetipo cada amostra eacute utilizada duas vezes
sendo uma reaccedilatildeo para AVA II e uma para RSA I portanto cada amostra teve dois
tubos correspondentes
Para a preparaccedilatildeo do mix de uma amostra para a enzima de restriccedilatildeo
AVA II (Promega) foram utilizados Buffer C X 30 2 microL aacutegua ultrapura livre de
DNAse e RNAse 125 microL AVA II 05 microL Para o mix de uma amostra de RSA I
(Invitrogen) satildeo necessaacuterios React 1 10X 2 microL aacutegua ultrapura libre de DNAse e
RNAse 11 microL RSA I 2 microL
O volume do mix por amostra foi de 15 microL e o volume da amostra
(produto da 2ordf PCR) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 20 microL para
cada frasco correspondente a sua enzima de restriccedilatildeo As amostras formatildeo ldquoparesrdquo
de tubos AVA II e RSA I e satildeo colocadas em banho-maria a 37ordmC overnight para
digerir (cortar) os fragmentos
Para visualizaccedilatildeo do produto da digestatildeo (RFLP) e verificaccedilatildeo dos
genoacutetipos foi preparado um gel de agarose a 2 (2g de agarose para 100 mL de
tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que migrou em cuba de eletroforese
com 100V 500A por 60 minutos Os resultados foram visualizados atraveacutes de luz UV
(ultravioleta) Os pacientes positivos apresentam ldquobandasrdquo (fragmentos) de
tamanhos diferentes O nuacutemero de bandas e sua disposiccedilatildeo no gel formaram
padrotildees de combinaccedilotildees correspondentes a cada genoacutetipo viral
425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas HEp-2
A pesquisa de auto-anticorpo contra antiacutegenos celulares foi realizada no
Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa pela teacutecnica de imunofluorescecircncia
indireta que os identifica atraveacutes da ligaccedilatildeo destes auto-anticorpos aos antiacutegenos do
substrato sendo esta ligaccedilatildeo revelada pela adiccedilatildeo de um soro com atividade Anti-
IgG conjugado agrave fluoresceiacutena
As amostras foram testadas utilizando-se um conjunto diagnoacutestico
comercial Antinuclear Antibody HEp-2 da Hemagen Diagnostics
Na primeira fase da reaccedilatildeo os soros diluiacutedos 140 colocados em contato
com o substrato durante 20 minutos seguido de lavagem com soluccedilatildeo salina
tamponada por 10 minutos Na segunda fase aplicacou-se a substacircncia
47
fluorescente sendo o conjugado diluiacutedo 130 deixando-se por 10 minutos seguida
de nova lavagem de 10 minutos e montagem da lacircmina com glicerina tamponada
Em cada lacircmina foram utilizados controle positivo e controle negativo
A leitura das lacircminas foi realizada em microscoacutepio de imunofluorescecircncia
marca Nikon modelo Eclipse E-200
Os criteacuterios morfoloacutegicos observados durante a leitura foram
a) aspecto da matriz nuclear
b) aspecto do nucleacuteolo
c) observaccedilatildeo de todos os estaacutegios de divisatildeo nuclear
d) aspecto do fuso mitoacutetico
e) aspecto do citoplasma
43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados coletados foram estruturados em um banco de dados no qual
tambeacutem foram confeccionadas tabelas e graacuteficos para representaccedilatildeo dos dados
Posteriormente foram analisados no programa Bioestat 50 para a geraccedilatildeo de
resultados estatiacutesticos que comprovassem a associaccedilatildeo de variaacuteveis pertinentes ao
estudo considerando o intervalo de confianccedila (IC) 95 e niacutevel α 5 (p-valor le 005)
isto eacute um achado seraacute considerado estatisticamente significante se valor de ldquoprdquo for
menor ou igual a 005 e seraacute considerado sem significacircncia estatiacutestica se esse valor
de ldquoprdquo for maior que 005
Nas variaacuteveis quantitativas foram realizadas as medidas de tendecircncia
central sendo calculado a meacutedia e a mediana com seus respectivos desvios
padrotildees O teste t foi usado para comparar as idades entre as amostras
O teste do Qui-quadrado e o teste G foram aplicados nas comparaccedilotildees de
n amostras independentes cujas proporccedilotildees observadas nas diversas modalidades
estiveram dispostas em tabelas de contigecircncia l x c onde se determinou as
proporccedilotildees observadas nas diferentes categorias e se estas tinham alguma
associaccedilatildeo
48
5 RESULTADOS
O Padratildeo de FAN em 100 dos 51 pacientes infectados pelo HCV e em
2 dos natildeo infectados pelo HCV ocorreu Citoplasmaacutetico
Com relaccedilatildeo agrave distribuiccedilatildeo dos pacientes por gecircnero observou-se uma
predominacircncia do gecircnero masculino (667) A faixa etaacuteria predominante foi a de 30
a 50 anos de idade (628) seguida da faixa etaacuteria compreendida entre 51 e 60
anos (196) No que diz respeito agrave naturalidade houve uma predominacircncia de
paraenses em 922 da amostra A maioria dos pacientes incluiacutedos no estudo foi
proveniente da Fundaccedilatildeo HEMOPA (98) por se tratarem de candidatos a doaccedilatildeo
de sangue (Tabela 1)
Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV segundo as caracteriacutesticas demograacuteficas janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Caracteriacutesticas demograacuteficas n Teste estatiacutestico Gecircnero
Masculino 34 667 Qui-quadrado Feminino 17 333 p = 00251
Total 51 1000
Idade (anos) lt 30 6 118 Qui-quadrado
30 a 40 16 314 p = 00094 41 a 50 16 314 51 a 60 10 196
gt 60 3 59 Total 51 1000
Naturalidade
Paraense 47 922 Qui-quadrado Macapaense 1 20 p lt 00001 Maranhense 1 20
Pernambucano 1 20 Gauacutecho 1 20
Total 51 1000
Procedecircncia Qui-quadrado HEMOPA 50 980 p lt 00001
IASEP 1 20 Total 51 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
49
Identificou-se no estudo a predominacircncia do genoacutetipo viral do tipo 1
(882) estando o genoacutetipo 3 presente em 118 dos casos Em 255 dos
pacientes foi observado uma positividade para FAN sendo que todos apresentaram
o padratildeo citoplasmaacutetico (Tabela 2)
Tabela 2 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV conforme os resultados laboratoriais de FAN citoplasmaacutetico e genotipagem janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Exames laboratoriais n Teste estatiacutestico
Genoacutetipo viral - HCV
Tipo 1 45 882 Qui-quadrado
Tipo3 6 118 p lt 00001
Total 51 1000
FAN Qui-quadrado
Positivo (citoplasmaacutetico) 13 255 p = 00008
Negativo 38 745 Total 51 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
Observou-se uma baixa positividade para o FAN tanto no gecircnero
masculino (294) quanto no gecircnero feminino (176) Natildeo houve diferenccedila
estatiacutestica significante entre os gecircneros e a anaacutelise do FAN (p = 05652) Isto eacute
independendo do gecircnero do paciente nada se poderaacute inferir se o mesmo teraacute maior
ou menor chance de possuir um FAN positivo ou negativo (Tabela 3)
Tabela 3 ndash Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
FAN (citoplasmaacutetico)
Gecircnero Teste estatiacutestico
(Teste G) Masculino Feminino
N N
Positivo 10 294 3 176
Negativo 24 706 14 824 p = 05652
Total 34 1000 17 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
Dentre os pacientes infectados o genoacutetipo viral tipo 1 e o tipo 3
predominaram no gecircnero masculino embora natildeo havendo diferenccedila significativa
entre os grupos (p=06376)(Tabela 4)
50
Tabela 4 - Relaccedilatildeo da genotipagem de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Gecircnero
Grupos estudados Teste estatiacutestico
(Teste G) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3
n n Masculino 29 644 5 833 p=06376 Feminino 16 356 1 167
Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa
Na faixa etaacuteria de 30 a 50 anos foi observada uma maior proporccedilatildeo (667)
do genoacutetipo viral do tipo 3 enquanto que para o genoacutetipo tipo 1 foi de 628 natildeo
tendo essa diferenccedila significacircncia estatiacutestica (Tabela 5)
Tabela 5 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e faixa etaacuteria - janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)
Idade (anos) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n
lt 30 04 118 0 00
30 a 40 15 314 3 500 p = 06401
41 a 50 15 314 1 167
51 a 60 08 196 2 333
gt 60 03 59 0 00 Total 45 1000 6 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
A anaacutelise descritiva das idades dos pacientes demonstrou que a meacutedia e
a mediana foi de 43 anos para aqueles com genoacutetipo viral tipo 1 no entanto para o
genoacutetipo viral tipo 3 a meacutedia foi de 44 e a mediana de 42 anos Observou-se que a
idade miacutenima dos pacientes com genoacutetipo viral-HCV do tipo 1 e 3 foi
respectivamente de 20 e 32 anos e a maacutexima foi de 68 e 57 anos perfazendo uma
amplitude total de 48 e 25 anos respectivamente Natildeo houve significacircncia estatiacutestica
entre as idades encontradas nos genoacutetipos 1 e 3 (Tabela 6 )
De acordo com o FAN citoplasmaacutetico a idade miacutenima dos pacientes com
FAN positivo e negativo foi respectivamente de 30 e 20 anos e a maacutexima foi de 53 e
68 anos perfazendo uma amplitude total de 23 e 48 anos respectivamente As
idades meacutedia e mediana foram respectivamente 435 e 46 anos nos pacientes com
o FAN positivo e meacutedia de 43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN
51
negativo Natildeo houve diferenccedila estatisticamente significativa entre as idades
encontradas nos pacientes com FAN positivo e negativo (Tabela 6)
Tabela 6 - Estudo descritivo da idade dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e presenccedila do FAN citoplasmaacutetico janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Grupos Estudados Genoacutetipo viral - HCV Auto anticorpo
Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 FAN (+) FAN (-) IDADE
Tamanho da amostra 45 6 13 38
Idade miacutenima 20 32 30 20
Idade maacutexima 68 57 53 68
Amplitude Total 48 25 23 48
Meacutedia Aritmeacutetica 43 44 435 43
Mediana 43 42 46 42
Desvio Padratildeo 107 93 78 113
Teste t p = 08363 p = 08809 Fonte Protocolo da pesquisa
Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos em que foram analisados AST
ALT ASTALT γ-GT e fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo
semelhantes dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e 3 natildeo
atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos
(Tabela 7)
Tabela 7- Distribuiccedilatildeo dos genoacutetipos dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Paracircmetros bioquiacutemicos
Genoacutetipo viral - HCV Teste estatiacutestico
(Teste t) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3
micro plusmn DP micro plusmn DP
AST 353 plusmn 219 328 plusmn 137 p = 07907
ALT 372 plusmn 321 288 plusmn 136 p = 05355
ASTALT 12 plusmn 07 14 plusmn 11 p = 06110
γ-GT 403 plusmn 38 302 plusmn 138 p = 02194
Fosfatase alcalina 1126 plusmn 443 1087 plusmn 376 p = 08349
Fonte Protocolo da pesquisa
Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos de AST ALT ASTALT γ-GT e
fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os
52
pacientes com FAN positivo e negativo natildeo sendo observada significacircncia
estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos de FAN (Tabela 8)
Tabela 8 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Paracircmetros bioquiacutemicos Auto anticorpos
Teste estatiacutestico (Teste t) Positivo Negativo
micro plusmn DP micro plusmn DP
AST 419 plusmn 238 326 plusmn 197 p = 01704
ALT 408 plusmn 29 346 plusmn 312 p = 05347
ASTALT 13 plusmn 08 12 plusmn 07 p = 05732
γ-GT 34 plusmn 21 409 plusmn 40 p = 04369
Fosfatase alcalina 1073 plusmn 345 1138 plusmn 462 p = 06431 Fonte Protocolo da pesquisa
Na comparaccedilatildeo entre resultados positivos e negativos do FAN
citoplasmaacutetico observou-se uma maior prevalecircncia da negatividade tanto em
pacientes natildeo infectados (98) como em pacientes infectados (745) pelo HCV
sendo essa diferenccedila estatisticamente significativa (plt00001) o que representa
uma natildeo associaccedilatildeo entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV
(Tabela 9)
Tabela 9 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico segundo a presenccedila ou ausecircncia de infecccedilatildeo por HCV janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
FAN (citoplasmaacutetico)
Pacientes Teste estatiacutestico (Teste G)
Infectados Natildeo infectados
N n
Positivo 13 255 2 2
Negativo 38 745 98 98 p lt 00001
Total 51 1000 100 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
Comparando-se os resultados do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos
viras observa-se que o resultado negativo eacute superior ao positivo em ambos os
genoacutetipos virais sendo 711 para o genoacutetipo viral 1 e 100 para o genoacutetipo viral 3
No entanto esta diferenccedila observada natildeo eacute estatisticamente significativa (p=02573)
(Tabela 10)
53
Tabela 10 - Distribuiccedilatildeo do FAN de acordo com o genoacutetipo viral janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
FAN (citoplasmaacutetico)
Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)
Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n
Positivo 13 289 0 00 p=02573 Negativo 32 711 6 1000
Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa
54
6 DISCUSSAtildeO
Desde o primeiro marcador soroloacutegico para diagnoacutestico do Lupus
Eritematoso Sistecircmico (LES) a ceacutelula LE descrita por Hargraves (1948) vaacuterios
substratos antigecircnicos foram utilizados para o estudo dos auto-anticorpos os quais
terminaram amplamente substituiacutedos pelas ceacutelulas HEp-2 Estas apresentam
significativas vantagens sobre os demais pela sua sensibilidade variedade de
antiacutegenos presentes e pelas facilidades morfoloacutegicas para o seu estudo
O uso da imunofluorescecircncia indireta para a visualizaccedilatildeo dos anticorpos
antinucleares nas ceacutelulas HEp-2 permite o reconhecimento de mais de 30 diferentes
padrotildees de fluorescecircncia como nucleares nucleolares da membrana nuclear do
aparelho mitoacutetico e citoplasmaacutetico todos satildeo proporcionados por diferentes auto-
anticorpos
A partir do 1deg Consenso Brasileiro para Padronizaccedilatildeo dos Laudos de FAN
(HEp-2) os criteacuterios para o preparo interpretaccedilatildeo da fluorescecircncia e nomenclatura
dos resultados passaram a ser normatizados Alguns padrotildees de fluorescecircncia satildeo
relativamente inespeciacuteficos outros satildeo ocasionados por uma gama restrita de auto-
anticorpos e outros ainda por um uacutenico auto-anticorpo (DELLAVANCE et al
2002) Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a tornaacute-las
imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo (DE
LARANAGA et al 2000)
Apesar do padratildeo de fluorescecircncia na maioria das vezes natildeo se pode
identificar o anticorpo presente ele pode sugerir ao cliacutenico qual o proacuteximo passo a
ser dado na investigaccedilatildeo da sua especificidade Os resultados encontrados devem
estar em associaccedilatildeo com a cliacutenica os padrotildees de fluorescecircncia e os tiacutetulos
alcanccedilados com a diluiccedilatildeo preacutevia (DELLAVANCE et al 2003)
No presente estudo a analise de 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo Viacuterus da
Hepatite C esteve presente o anticorpo-antinuclear (ANA FAN) em 13 (255) dos
pacientes e todos eram padratildeo citoplasmaacutetico corroborando com outros estudos
encontrados na literatura como
Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de
pacientes infectados pelo viacuterus HIV com Hanseniacutease e co-infectados com
Hanseniacutease HIV Ela obteve respectivamente as seguintes taxas de prevalecircncias
32 333 e 478 Em todos os grupos neste estudo houve predomiacutenio do
55
padratildeo citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear soacute foi observado entre os pacientes com
hanseniacutease (91) e co-infectados (237)
Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de
pacientes infectados pelo viacuterus da Dengue e viacuterus linfotroacutepico de ceacutelulas T humanas
HTLV-12 e controle Normais e obteve respectivamente as seguintes taxas de
prevalecircncias 40 40 e 2 Em todos os grupos houve predomiacutenio do padratildeo
citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear foi observado entre os pacientes com dengue
(67) e HTLV 12 (133)
Segundo Andrade et al (2002) Dellavance et al (2005) Dellavance e
Andrade et al (2007) o predomiacutenio do padratildeo de FAN do tipo citoplasmaacutetico indica
que determinados padrotildees de fluorescecircncia satildeo mais especiacuteficos de doenccedila auto-
imune enquanto outros ocorrem em indiviacuteduos com enfermidades natildeo auto-imunes
por ser o citoplasma celular rico em proteiacutenas para as quais auto-anticorpos naturais
apresentam afinidade moderada eacute comum observar positividade para FAN em
indiviacuteduos sadios cujo significado ainda natildeo eacute entendido completamente
O padratildeo Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina que pode ser
encontrado em Hepatite auto-imune Cirrose Hepatite C Hepatocarcionoma entre
outros Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica
definida Um resultado positivo pode estar ou natildeo associado a uma patologia assim
como poderaacute ou natildeo vir a apresentar uma doenccedila auto-imune com o passar do
tempo (DELLAVANCE et al 2003) Neste estudo natildeo foi feito avaliaccedilatildeo prospectiva
dos resultados embora todos sejam FAN citoplasmaacuteticos
Os achados de FAN positivo em populaccedilotildees sadias ou sem doenccedilas auto-
imunes tambeacutem jaacute observado por Leser et al (2004) que em 394 pacientes com
FAN-HEp-2 positivo natildeo encontraram nenhum paciente com doenccedila auto-imune
Outro exemplo estaacute no padratildeo citoplasmaacutetico de pontos isolados
estudado por Laurino et al (2006) presente em indiviacuteduos sem evidecircncia de auto-
imunidade mas tambeacutem em indiviacuteduos com acometimento de doenccedilas auto-imunes
sistecircmicas e natildeo-especiacuteficas
Os dados apresentados corroboram com este estudo em que foi
observado a presenccedila do auto-anticorpo em 2 (2 ) dos 100 indiviacuteduos sadios do
grupo controle todos com padratildeo citoplasmaacutetico
56
Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a
tornaacute-las imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo
(DE LARANAGA et al 2000)
Nas Infecccedilotildees agudas espera-se que a resposta auto-imune diminua a
medida que os viacuterus satildeo eliminados Entretanto alguns trabalhos sugerem que em
indiviacuteduos geneticamente susceptiacuteveis as reaccedilotildees auto-imunes possam persistir
apesar do clareamento viral uma vez que o gatilho imunoloacutegico foi ativado e natildeo
houve desativaccedilatildeo (DE LARANAGA et al 2000 SAKKAS et al 2008)
Ramos-Casals et al (2009) no estudo Doenccedilas Sistecircmica Auto-Imunes
em Pacientes com Infecccedilatildeo pelo (72) dos pacientes eram do gecircnero feminino e
(28) do masculino(ANA FAN) em 61 dos pacientes o que se diferem deste
trabalho eacute que dos 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo (667) eram do gecircnero
masculino e (333) eram do gecircnero feminino com meacutedia de idade de 430 (plusmn107)
anos com presenccedila de anticorpo-antinuclear em 13 (255) com meacutedia e mediana
respectivamente de 435 e 46 anos nos pacientes com o FAN positivo e meacutedia de
43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN negativo
Alter (1995) em sua pesquisa natildeo observou associaccedilatildeo entre o risco de
infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas designadas por gecircnero idade e raccedila Na
referida pesquisa foram estudados 51 pacientes com idade meacutedia de 430 (+- 107)
anos 34 (667) eram do gecircnero masculino e 17 (333) do gecircnero feminino todos
em fase preacute-tratamento assintomaacuteticos natildeo permitindo avaliar os risco da
infecccedilatildeoSegundo Pordeus et al (2008) a ocorrecircncia destes auto-anticorpos
indicaria um prognoacutestico desfavoraacutevel Perperas Mcfarlane e Mcsorley (1986)
sugeriram que os auto-anticorpos poderiam estar envolvidos na progressatildeo ou no
desenvolvimento de hepatites crocircnicas possivelmente por um distuacuterbio no controle
da auto-reatividade Outros estudos questionam a participaccedilatildeo dos auto-anticorpos
no processo de transiccedilatildeo para cronicidade das hepatites agudas virais poreacutem os
resultados natildeo satildeo convincentes (SHOENFELD ROSE 2004)
Lopez Seia e Roy (1998) demonstraram a presenccedila de anticorpo anti-
actina em baixos tiacutetulos em crianccedilas com hepatite aguda por curto periacuteodo de
tempo poreacutem nenhuma associaccedilatildeo com gravidade da agressatildeo hepaacutetica foi
descrita
Neste estudo a presenccedila dos auto-anticorpos em (255) dos pacientes
com infecccedilatildeo pelo HCV natildeo puderam ser relacionada com a gravidade da doenccedila
57
pois este estudo foi realizado em pacientes receacutem diagnosticados entatildeo seria
necessaacuterio um acompanhamento destes por um periacuteodo maior de tempo com a
finalidade de concluir esta afirmativa Apesar da presenccedila transitoacuteria de auto-
anticorpos jaacute ter sido descrita em doenccedilas virais comuns a associaccedilatildeo entre a
presenccedila de auto-anticorpos e a gravidade das doenccedilas necessita de comprovaccedilatildeo
Passaleva Massai e Leoncini (1983) avaliaram 302 pacientes com
hepatites agudas virais e encontraram complexos imunes circulantes (CIC) em
516 dos pacientes com frequumlecircncia significativamente maior em hepatite aguda
Nenhuma associaccedilatildeo entre a presenccedila de imuno-complexos e o niacutevel de
aminotransferases ou bilirrubina foi encontrada Segundo Andrade et al (2002)
Dellavance et al (2005) Andrade et al (2007) nos pacientes do estudo foi feita a
relaccedilatildeo entre a presenccedila dos auto-anticorpos e niacuteveis de aminotransferases e as
elevaccedilotildees natildeo tiveram significacircncia poreacutem houve associaccedilatildeo do genotipo viral 1
Nos paracircmetros bioquiacutemicos analisados em relaccedilatildeo aos genoacutetipos houve uma
distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e
3 natildeo atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os
grupos Segundo Wilson (1997) trecircs estudos mostraram correlaccedilatildeo entre niacuteveis
altos de alanina aminotransferase e atividade histoloacutegica da doenccedila hepaacutetica
Poreacutem nos pacientes considerados individualmente o valor preditivo dessa
associaccedilatildeo foi baixo enquanto muitos deles com enzimas normais apresentavam
graves alteraccedilotildees histoloacutegicas No presente estudo natildeo foi observada associaccedilatildeo entre os niacuteveis de
aminotransferases e a cronificaccedilatildeo da hepatite viral pois nem todos os pacientes do
estudo apresentavam resultado de bioacutepsia hepaacutetica
Alter et al (1999) afirmam que no Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b
(63) e 3a (313) em estudo realizado em Goiacircnia onde foi observada uma
maior prevalecircncia do genoacutetipo 1 seguida do genoacutetipo 3 em doadores de sangue e
hemofiacutelicos (DELLAVANCE ANDRADE et al 2007) Estando esses dados em
acordo com esta pesquisa que com genotipagem do viacuterus da hepatite C que
identificou o genoacutetipo 1 em 45 (882) seguidos pelo genoacutetipo 3 que foi
identificado em 6 (118) dos pacientes com infecccedilatildeo pelo HCV Em um estudo realizado na Franccedila com 13 pacientes luacutepicas infectadas
pelo viacuterus C 8 apresentavam o RNA viral sendo o genoacutetipo 1 presente em cinco
58
(625) casos seguido do genoacutetipo 3 (375) (PERLEMUTER et al 2000) dados
que se assemelham aos do presente estudo embora o estudo natildeo tenha incluiacutedo
pacientes com outras infecccedilotildees associadas ao HCV Eacute importante ressaltar que
estudos sobre genotipagem do HCV em indiviacuteduos com doenccedilas reumaacuteticas satildeo
raros
No presente estudo houve uma frequumlecircncia baixa de positividade para o
FAN nos pacientes com genoacutetipo 1 e genoacutetipo 3 Natildeo havendo significacircncia
estatiacutestica entre os pacientes com genoacutetipo 1 e 3
Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter
implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave menor
resposta agrave terapia antiviral (BRUNO et al1997) o que natildeo foi avaliado neste estudo
pois apesar de (882) dos pacientes serem genoacutetipo 1 todos estavam em fase de
reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica seja preacute- tratamento Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila
poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses
autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis
vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo
hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja
quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a
concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave
hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em
parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)
59
7 CONCLUSOtildeES
minus O padratildeo dos auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares encontrados nos
dois grupos estudados foi o citoplasmaacutetico
minus A prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares no grupo com
infecccedilatildeo pelo VHC foi significativamente maior do que no grupo controle
minus Nos resultados de FAN citoplasmaacutetico haacute uma maior prevalecircncia da
negatividade em pacientes infectados pelo HCV e natildeo infectados sendo
essa diferenccedila estatisticamente significativa conferindo a natildeo associaccedilatildeo
entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV
minus Os resultados negativos do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos viras eacute
superior aos positivos em ambos os genoacutetipos virais entretanto esta diferenccedila
natildeo eacute estatisticamente significativa
minus Houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos
celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado
minus Natildeo houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos
celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado com
relaccedilatildeo ao gecircnero onde predominou o gecircnero masculino nos dois grupos
minus Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter
implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave
menor resposta agrave terapia antiviral o que natildeo foi avaliado neste estudo pois
os pacientes estavam em fase preacute tratamento sugerindo que estes pacientes
sejam avaliados futuramente
minus A formaccedilatildeo dos auto-anticorpos parece ser mais uma consequumlecircncia do que
uma causa da agressatildeo hepaacutetica
minus A negatividade do FAN ndash Hep 2 foi maior que a positividade mas todos os
FAN positivos pertenciam ao genoacutetipo viral tipo 1 nos pacientes infectados
pelo HCV
minus Nesta pesquisa os resultados de PCR o RNA-HCV de reconfirmaccedilatildeo foi
positivo para o anti-HCV em todos os soros analisados mostrando assim
que estes pacientes eram portadores de infecccedilatildeo por viacuterus C ou seja natildeo
houve falso positivo anteriormente poreacutem todos eram assintomaacuteticos
dificultando a conclusatildeo de ser ou natildeo uma infecccedilatildeo persistente
60
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APEcircNDICE A - TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Vocecirc estaacute sendo convidado para fazer parte de uma pesquisa que estaacute sendo desenvolvida pela Universidade Federal do Paraacute no Nuacutecleo de Medicina Tropical intitulada AUTOANTICORPOS CONTRA ANTIacuteGENOS CELULARES E SUA CORRELACcedilAtildeO COM O GENOacuteTIPO VIRAL EM PACIENTES COM INFECCcedilAtildeO PELO VIacuteRUS DA HEPATITE C (HCV)
O Objetivo da pesquisa eacute fazer uma correlaccedilatildeo do anticorpo antinuacutecleo (FAN) e o genoacutetipo viral em pacientes com hepatite C e o estaacutegio da doenccedila hepaacutetica a partir da histologia sempre que permitidos e correlacionar ao diagnoacutestico
Caso vocecirc participe da pesquisa seraacute necessaacuterio que forneccedila uma amostra de sangue (2ml)
O uacutenico inconveniente que vocecirc poderaacute experimentar eacute a dor provocada pela agulha na hora da coleta de sangue bem como pequenos hematomas que possam vir a ocorrer e que natildeo causam danos
Essa pesquisa natildeo oferece riscos as praacuteticas satildeo de uso rotineiro e seratildeo utilizados materiais esterilizados e descartaacuteveis como agulhas seringas etc
Estaacute garantido a vocecirc todas as informaccedilotildees que vocecirc queira antes durante e depois da pesquisa
A sua participaccedilatildeo neste estudo eacute voluntaacuteria Vocecirc tem a liberdade de recusar participar da pesquisa a qualquer momento
As informaccedilotildees relacionadas agrave pesquisa poderatildeo ser inspecionadas pelos pesquisadores que executam a pesquisa e pelas autoridades legais no entanto se qualquer informaccedilatildeo for divulgada em relatoacuterio publicaccedilatildeo ou qualquer outro meio isto seraacute feito de forma codificada para manter o caraacuteter confidencial
Todas as despesas necessaacuterias para a realizaccedilatildeo do estudo natildeo satildeo de sua responsabilidade assim como a sua participaccedilatildeo na pesquisa na seraacute remunerada (vocecirc natildeo receberaacute qualquer valor em dinheiro)
Quando os resultados forem divulgados natildeo apareceraacute seu nome e sim um coacutedigo
_____________________________________
Assinatura do Pesquisador Responsaacutevel NomeAna Maria Almeida Souza EndRodovia Maacuterio Covas 1426 ndash Cond Green Garden casa 41 Fone(91) 32352665 81197217 RegConselhoCRM 1508
69
APEcircNDICE B - CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Declaro que li as informaccedilotildees acima sobre a pesquisa que me sinto
perfeitamente esclarecido sobre o conteuacutedo da mesma assim como seus riscos e
benefiacutecios Declaro ainda que por minha livre vontade aceito participar da pesquisa
cooperando com a coleta de material para exame
Beleacutem _________
_________________________________________
Assinatura do sujeito da pesquisa ou do
responsaacutevel
70
ANEXOS
71
- Assinatura do Pesquisador Responsaacutevel
-
- Beleacutem _________
-
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos pacientes segundo as caracteriacutesticas demograacuteficas janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 48
Tabela 2 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes conforme os resultados laboratoriais de FAN citoplasmaacutetico e genotipagem janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 49
Tabela 3 ndash Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 49
Tabela 4 - Relaccedilatildeo da genotipagem de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 50
Tabela 5 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e faixa etaacuteria - janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 50
Tabela 6 - Estudo descritivo da idade dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e presenccedila do FAN citoplasmaacutetico janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 51
Tabela 7- Distribuiccedilatildeo dos genoacutetipos dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 51
Tabela 8 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 52
Tabela 9 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico segundo a presenccedila ou ausecircncia de infecccedilatildeo por HCV janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 52
Tabela 10 - Distribuiccedilatildeo do FAN de acordo com o genoacutetipo viral janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute 53
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
AAN Anticorpos antinucleares
aCL Anticorpos anticardiolipina
AIDS Sindrome da Imunodeficiecircncia Adquirida
ALT Alanina aminotransferase
ANCA Anticorpos anti-citoplasma de neutroacutefilos
Anti-CCP Antipeptiacutedeo citrulinado ciacuteclico
Anti-β2GPI Anticorpos anti-β2 glicoproteiacutena I
Cdna DNA complementar
CEP Comitecirc em Eacutetica e Pesquisa
CHC Carcinoma hepatocelular
CIC Complexos imunes circulantes
DDTC Doenccedilas difusas do tecido conjuntivo
DMTC Doenccedila mista do tecido conjuntivo
E1 Proteiacutena do envoltoacuterio
ENH Eritema Nodoso Hansecircnico
ESP Esclerose sistecircmica progressive
FAN Fator Anti-nuacutecleo
FR Fator reumatoacuteide
HBV Viacuterus da hepatite B
HCV Viacuterus da Hepatite C
HEMOPA Fundaccedilatildeo Centro de Hemoterapia e Hematologia do Paraacute
HIV Viacuterus da imunodeficiecircncia humana
HIV-1 Viacuterus da imunodeficiecircncia humana1
IAH Iacutendice de atividade histoloacutegica
LE Lupus Eritematoso
LES Luacutepus eritematoso sistecircmico
MS Ministeacuterio da Sauacutede
mtDNA DNA mitrocondrial
NANBH Hepatite natildeo-A natildeo-B
NMT Nuacutecleo de Medicina Tropical
OMS Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede
PCR Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia
Rh Tipo sanguiacuteneo
RNA Aacutecido ribonucleacuteico
RT-PCR Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia-em tempo real
SAF Siacutendrome antifosfoliacutepide
SIDA Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida
SS Siacutendrome de Sjoumlgren
UFPA Universidade Federal do Paraacute
UV ultravioleta
VHA Viacuterus da Hepatite A
VHC Viacuterus da Hepatite C
VHCHCV Hepatite C
VV Hanseniacutease generalizada
SUMAacuteRIO 1 INTRODUCcedilAtildeO 15 11 HEPATITE C (VHCHCV) 15 111 Consideraccedilotildees Gerais 15 112 Agente Etioloacutegico 16 113 Epidemiologia 17 114 Modo de Transmissatildeo 18 115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica 19 116 Diagnoacutestico 23 12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC 25
13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC 26
14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE 27
15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES AGUDAS VIRAIS 31
16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN 32 2 JUSTIFICATIVA 39 21 ASPECTOS EacuteTICOS 39 3 OBJETIVOS 40
31 OBJETIVO GERAL 40
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 40 4 MATERIAL E MEacuteTODOS 41 41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO) 41 411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C 41 412 Grupo de natildeo infectados 41 42 MEacuteTODO 42 421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico 42 422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C 42 423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia
molecular 43
424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem) 45 425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas
HEp-2 46 43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 47 5 RESULTADOS 48 6 DISCUSSAtildeO 54 7 CONCLUSOtildeES 59 REFEREcircNCIAS 60 APEcircNDICES 67 ANEXOS 70
15
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 HEPATITE C (VHCHCV)
111 Consideraccedilotildees Gerais
As hepatites virais satildeo doenccedilas causadas por diferentes agentes
etioloacutegicos de distribuiccedilotildees universais que tecircm em comum o hepatotropismo
Possuem semelhanccedilas do ponto de vista cliacutenico-laboratorial mas apresentam
importantes diferenccedilas epidemioloacutegicas quanto agrave sua evoluccedilatildeo (FERREIRA
SILVEIRA 2004) Desde a descriccedilatildeo e definiccedilatildeo em 1989 (CHOO et al 1989 apud
RIBEIRO et al 2007) tornou-se evidente sua associaccedilatildeo com uma grande
variedade de manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas desordens reumaacuteticas e auto-imunes
(ALMEIDA 2010)
A infecccedilatildeo pelo VHCHCV acarreta inflamaccedilatildeo hepaacutetica e esteatose
podendo evoluir para fibrose hepaacutetica e cirrose em indiviacuteduos cronicamente
infectados estes com grande risco de desenvolvimento de carcinoma hepatocelular
(RIBEIRO et al 2007) Essas complicaccedilotildees tardias ocorrem em um periacuteodo em
geral superior a 20 anos apoacutes o iniacutecio da infecccedilatildeo A avaliaccedilatildeo filogeneacutetica das
sequumlecircncias do VHCHCV investigadas em vaacuterias regiotildees geograacuteficas sugere que
existam pelo menos seis genoacutetipos principais designados pelos nuacutemeros de 1 a 6 e
pelo menos 30 subtipos designados por letras minuacutesculas Nos Estados Unidos
prevalecem os genoacutetipos 1a (60) e 1b (20) Os tipos 5 e 6 satildeo mais encontrados
no sudeste e sul da Aacutefrica O tipo 4 eacute predominante na Aacutefrica Central e no Oriente
Meacutedio No Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b (63) e 3a (313) (BASSIT et
al 1999 apud RIBEIRO et al 2007) As informaccedilotildees sobre as causas que
determinam o curso evolutivo da doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos
progressos que haacute no campo do diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHCHCV Uma
questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo genoacutetipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de
lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o genoacutetipo 1 (1b) cursa com lesotildees
histoloacutegicas mais graves
As uacuteltimas deacutecadas foram de notaacuteveis conquistas no que se refere agrave
prevenccedilatildeo e ao controle das hepatites virais Entre as doenccedilas endecircmico-
epidecircmicas que representam problemas importantes de sauacutede puacuteblica no Brasil
16
salientam-se as Hepatites Virais cujo comportamento epidemioloacutegico no nosso paiacutes
e no mundo tem sofrido grandes mudanccedilas nos uacuteltimos anos
Antes da seleccedilatildeo rigorosa dos doadores de sangue em 1991 o
VHCHCV era a maior causa de hepatite poacutes-transfusional Atualmente permanece
como tal em casos esporaacutedicos (CONTE 2000) Os grupos considerados de risco
satildeo pessoas que receberam transfusatildeo de sangue antes de 1992 usuaacuterios de
drogas injetaacuteveis profissionais de sauacutede que lidam com sangue pacientes de
hemodiaacutelise e com menor risco pessoas tatuadas ou com piercings (CLEMENTE
ONO-NITA 2007)
A melhoria das condiccedilotildees de higiene e de saneamento das populaccedilotildees a
vacinaccedilatildeo contra a Hepatite B (HBV) e as novas teacutecnicas moleculares de diagnoacutestico
do viacuterus da Hepatite estatildeo entre esses avanccedilos importantes (BRASIL 2008)
112 Agente Etioloacutegico
O VHCHCV um viacuterus aacutecido ribonucleacuteico (RNA) da famiacutelia Flaviviridae
representa a principal causa da previamente denominada hepatite natildeo-A natildeo-B
(SANTOS 2009) Foi identificado e isolado a partir de um clone derivado de um
genoma NANBH semelhante aos togaviridae ou flaviviridae (SAADE 2008) e
visualizado a imunoeletromicroscopia como partiacutecula de 55 a 65 nm de diacircmetro
com projeccedilotildees espiculares e de morfologia muito semelhante aos flaviviridae Aleacutem
disso estas partiacuteculas reagiram especificamente com anticorpos mono e policlonais
do conteuacutedo proteacuteico do envelope do VHC (HIRANUMA et al 1994 apud CONTE
2000)
O agente etioloacutegico do HCV natildeo eacute uma partiacutecula homogecircnea e apresenta
uma taxa alta de mutaccedilatildeo levando-o a uma heterogeneicidade genocircmica cujo
resultado eacute um grande nuacutemero de genoacutetipos (1a 1b 2a 2b 3a 3b 4 5 6)
(AUGUSTO LOBATO 2003) Natildeo haacute evidecircncias de variantes natildeo patogecircnicas O
genoacutetipo 1b eacute o que apresenta maior virulecircncia e pior resposta ao tratamento
(LAUER WALKER 2001 apud SOUZA 2007) No Brasil dados obtidos a partir de
casos isolados e estudos de pequenas amostragens indicam que o genoacutetipo 1b
ocorre em cerca de 30 a 40 dos casos o 1a em cerca de 20 1a e 1b em 20
o 3a em cerca de 28 (FOCACCIA 2004)
17
113 Epidemiologia
De acordo com a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) a HCV eacute uma
questatildeo de sauacutede puacuteblica e tambeacutem a principal causa de transplante de fiacutegado no
Brasil (SOCIEDADE BRASILEIRA DE HEPATOLOGIA 2005) Eacute estimada uma
prevalecircncia em torno de 10 para a infecccedilatildeo pelo VHC na populaccedilatildeo mundial
(KILLEMBERG 2000) Nos Estados Unidos cerca de 27 milhotildees de pessoas estatildeo
infectadas pelo viacuterus (BRASIL 2006)
De acordo com Ferreira e Silveira (2004) no Brasil o nuacutemero de pacientes
infectados eacute incerto relacionado geralmente a alguns estados e municiacutepios e o
esclarecimento dos agentes causadores das hepatites cuja identificaccedilatildeo requer
teacutecnicas laboratoriais complexas de biologia molecular eacute realizado de maneira
insuficiente Por outro lado a progressiva integraccedilatildeo entre as instacircncias gestoras
dos programas de vigilacircncia e controle das doenccedilas com grupos de pesquisa e
desses com os serviccedilos (FERREIRA SILVEIRA 2004 p 473) e a disponibilidade
dos bancos de dados nacionais mais confiaacuteveis apontam para novos e melhores
caminhos (BRASIL 2005b)
A OMS alerta que o Paiacutes deve se preparar para uma ldquoexplosatildeordquo da
epidemia a partir de 2011 (BRASIL 2005b) Outra preocupaccedilatildeo eacute que as pessoas
que receberam sangue antes de 1992 tecircm mais chances de estarem infectadas na
eacutepoca o sangue destinado agraves transfusotildees natildeo era analisado para detecccedilatildeo da HCV
porque o viacuterus natildeo era conhecido e natildeo havia exames especiacuteficos (BRASIL 2005b)
A prevalecircncia da infecccedilatildeo nos doadores de sangue sadios varia de 001-002 no
Reino Unido e no norte da Europa 1-15 no sul da Europa 65 na Aacutefrica
equatorial e de ateacute 20 no Egito (CONTE 2000)
De acordo com a OMS a cada grupo de 50 pessoas no Brasil uma tem
hepatite e de dez portadores apenas um sabe (STRAUSS 2001) Satildeo dois milhotildees
de infectados no Paiacutes Denominada epidemia silenciosa calcula-se que 170 milhotildees
de indiviacuteduos no mundo estejam contaminados pelo viacuterus C a forma mais grave da
doenccedila Ainda de acordo com a OMS o nuacutemero de brasileiros viacutetimas da
enfermidade eacute bem maior do que o estimado pelo Ministeacuterio da Sauacutede (TRINDADE
2005)
18
Por ocasiatildeo da Conferecircncia Internacional de Consenso sobre HCV em Paris
(LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999) concluiu-se que a hepatite crocircnica por viacuterus
C eacute um problema grave de sauacutede puacuteblica sendo sua prevalecircncia mundial estimada
em 3 (de 01 a 5 segundo os vaacuterios paiacuteses) por tanto havendo no mundo
todo cerca de 150 milhotildees de portadores crocircnicos do VHCHCV 4 milhotildees nos EUA
e 5 milhotildees na Europa Ocidental Na Europa Oriental a prevalecircncia eacute maior ainda
114 Modo de Transmissatildeo
A HCV eacute transmitida pelo sangue Natildeo haacute comprovaccedilatildeo de contaacutegio por
meio de fluidos corporais como saliva suor laacutegrimas secircmen ou leite materno
Tambeacutem deixa de ocorrer por meio de abraccedilos beijos uso dos mesmos copos ou
roupas Especialistas afirmam que a contaminaccedilatildeo atraveacutes de relaccedilotildees sexuais eacute
possiacutevel mas rara Quando detectada de maneira precoce a enfermidade tem
tratamento inclusive gratuito aleacutem de cura (BRASIL 2006)
Dentre os fatores de risco para transmissatildeo outros aleacutem da transfusatildeo de
sangue o uso de drogas iliacutecitas o comportamento sexual de alto risco e variaacuteveis
socioeconocircmicas representadas pelo grau de escolaridade e renda familiar Natildeo foi
observada associaccedilatildeo entre o risco de infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas
designadas por gecircnero idade e raccedila (ALTER 2007) O risco de transmissatildeo sexual
do VHCHCV eacute miacutenimo A contaminaccedilatildeo intrafamilial natildeo-sexual eacute consideraacutevel
particularmente quando um dos enfermos tem hepatopatia grave e ou carga viral
elevada (risco 110) (CONTE 2000)
A praacutetica de tatuagem fornece dados conflitantes sabendo-se que os
liacutequidos usados para esterilizar os instrumentos usados satildeo ineficazes
Karmochkine et al (1998 apud CONTE 2000) observaram que
aproximadamente 80 dos pacientes contraem o viacuterus atraveacutes da toxicomania
intravenosa ou transfusotildees de sangue ou de derivados Os restantes meios de
transmissatildeo e de contaacutegio satildeo a hemodiaacutelise os transplantes de oacutergatildeos picadas
acidentais profissionais e transmissatildeo vertical matildee-crianccedila Em 20 a 40 dos
casos natildeo se consegue determinar o modo de contaminaccedilatildeo A transmissatildeo da
hepatite crocircnica por viacuterus C pode ser prevenida (KARMOCHKINE et al 1998 apud
CONTE 2000)
19
As duas fontes de contaminaccedilatildeo satildeo a toxicomania endovenosa e a
administraccedilatildeo de produtos de origem sanguumliacutenea Esta uacuteltima praticamente
eliminada desde 1991 com a introduccedilatildeo dos testes ELISA 2 na seleccedilatildeo
aprimorada de doadores de sangue (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998
apud CONTE 2000)
A transmissatildeo sexual eacute rara com menos de 3 em parceiros estaacuteveis e
ocorre principalmente em pessoas com muacuteltiplos parceiros e com praacutetica sexual de
risco (sem uso de preservativo) ndash para os indiviacuteduos com parceiros muacuteltiplos o uso
de preservativos eacute indicado (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998 apud
CONTE 2000)
A gravidez natildeo estaacute contra-indicada nas mulheres infectadas pelo
VHCHCV A transmissatildeo vertical matildee-crianccedila eacute rara (menor de 6) O tipo de parto
(natural ou cesaacuterea) natildeo tem influecircncia O aleitamento eacute permitido A transmissatildeo
nosocomial eacute prevenida eficazmente de modo convencional (KARMOCHKINE et
al 1998 apud CONTE 2000)
115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica
A infecccedilatildeo aguda pode passar clinicamente despercebida ou evoluir para
hepatite fulminante Aproximadamente 850 das pessoas infectadas agudamente
vatildeo desenvolver uma viremia persistente tornando-se dessa forma indiviacuteduos
infectados crocircnicos Depressatildeo irritabilidade dores no corpo mal-estar febre
naacuteuseas e falta de apetite satildeo alguns dos sintomas mais frequumlentes embora a
maioria dos casos natildeo apresente nenhum sintoma (ALTER 2007)
A cirrose eacute pouco observada em pessoas que apresentam niacuteveis
persistentemente baixos das transaminases mas a elevaccedilatildeo destas natildeo eacute
representativa do grau de fibrose hepaacutetica Dessa forma a bioacutepsia hepaacutetica
representa o melhor indicador do estaacutegio de evoluccedilatildeo da doenccedila uma vez que
gradua os componentes inflamatoacuterios e o estaacutegio de fibrose (AGMON-LEVIN et al
2009 BLOCK SCHIANO 1999)
Alter et al (1992) dizem que em 82 de 130 pacientes seguidos durante
muitos anos apoacutes surto agudo de hepatite natildeo-A natildeo-B apresentam anti-VHCHCV
ou VHCHCV RNA sendo que 62 deles desenvolveram hepatite crocircnica e
concluem que os pacientes que adquiriram HCV tiveram alto grau de hepatite
20
crocircnica sendo que o VHCHCV pode ser a maior causa de doenccedila crocircnica de fiacutegado
nos EUA e que na maioria dos pacientes a infecccedilatildeo pelo VHCHCV parece persistir
por muitos anos mesmo na ausecircncia de doenccedila hepaacutetica ativa
Almeida et al (1999) determinaram a prevalecircncia da infecccedilatildeo em
doadores de sangue assim como avaliaram o grau de comprometimento hepaacutetico
numa populaccedilatildeo de 37335 doadores durante o biecircnio 93-94 em Porto Alegre - RS
utilizando o teste anti-VHC ELISA 2 Selecionaram 60 deles para a biopsia hepaacutetica
com agulha de Menghini encontrando prevalecircncia de 174 com comprometimento
hepatico e 39 deles apresentavam cirrose hepaacutetica Sendo a hepatopatia crocircnica de
graus variaacuteveis observadas em 80 deles na sua grande maioria com lesotildees leves
e miacutenimas Foi observada forte associaccedilatildeo entre elevaccedilatildeo de alanina
aminotransferase (ALT) e a presenccedila de hepatopatia crocircnica embora a intensidade
desta elevaccedilatildeo natildeo se correlacione com a gravidade da lesatildeo histoloacutegica
Jaacute na experiecircncia de Mutimer et al (1995) cerca de 80 dos doadores
soro-positivos analisados exaustivamente inclusive com biopsia de fiacutegado
mostraram evidecircncias de alteraccedilotildees histoloacutegicas e ou viroloacutegicas de infecccedilatildeo
persistente sem no entanto atingir graus mais avanccedilados de hepatopatia crocircnica
quase todos permanecendo na categoria moderada
Nos paiacuteses industrializados a HCV eacute responsaacutevel por 20 dos casos de
hepatite aguda 70 dos casos de hepatite crocircnica 40 dos casos de cirrose
descompensada 60 dos carcinomas hepatocelulares e 30 dos transplantes
hepaacuteticos (LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999)
Cerca de 40 do total de pacientes curam-se ou tecircm doenccedila crocircnica de
natureza benigna Os restantes 60 cursam com atividade aumentada de
aminotransferase denotando evoluccedilatildeo crocircnica da doenccedila Dentre estes a maioria
tem lesotildees necro inflamatoacuterias discretas e fibrose miacutenima ou ausente O prognoacutestico
em longo prazo eacute mal conhecido no entanto provavelmente a maioria deles natildeo viraacute
a falecer da doenccedila hepaacutetica em curso Cerca de 20 deles depois de 10-20 anos
de evoluccedilatildeo desenvolveratildeo cirrose hepaacutetica passiacutevel de transplante Assim a
hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila que ocasiona a morte de um pequeno nuacutemero
de pacientes sem no entanto afetar a duraccedilatildeo da vida meacutedia da maioria deles
(CONTE 2000 FERREIRA SILVEIRA 2004)
Apoacutes infecccedilatildeo aguda somente 10 dos pacientes desenvolve doenccedila
cliacutenica com icteriacutecia A infecccedilatildeo sub-cliacutenica eacute a regra e assim passa despercebida
21
Cerca de 25 deles tecircm infecccedilatildeo crocircnica sintomaacutetica com aminotransferases
normais e lesotildees inflamatoacuterias histoloacutegicas miacutenimas (RESENDE et al 2010)
A remissatildeo espontacircnea acontece em cerca de 15 dos casos Na grande
minoria dos casos a progressatildeo da doenccedila aguda pode levar agrave insuficiecircncia
hepaacutetica aguda
Observaccedilotildees feitas pelo irlandecircs Kenny-Walsh (1999) comprovam a
natureza e a evoluccedilatildeo cliacutenica da afecccedilatildeo em causa O autor acompanhou durante 17
anos 376 mulheres que receberam injeccedilotildees de imunoglobulinas anti-D
contaminadas com VHC provenientes de doador uacutenico num programa de
isoimunizaccedilatildeo Rh Destas 81 apresentaram sintomatologia mais frequumlentemente
fadiga (66) ALT ligeiramente elevada (de 40 a 99 UL) em 47 e igual ou maior de
100 UL em 8 A biopsia hepaacutetica mostrou inflamaccedilatildeo em 98 delas na maioria
das vezes leves (41) e moderadas (52) fibrose presente em 51 no entanto
somente em sete pacientes (2) houve sinais de cirrose provaacutevel ou definitiva Em
uma delas havia acentuado alcoolismo
A hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila de evoluccedilatildeo variaacutevel De maneira
geral sua evoluccedilatildeo eacute lenta insidiosa e progressiva
Os pacientes que natildeo apresentam evidecircncias bioquiacutemicas de lesatildeo
hepaacutetica podem constituir em subgrupo de casos mais benignos no curso natural
da doenccedila Muitos co-fatores tecircm papel importante no desenvolvimento da cirrose
nesses pacientes como por exemplo a idade no momento da infecccedilatildeo (os
contaminados de idade mais avanccedilada tecircm evoluccedilatildeo mais raacutepida da doenccedila
enquanto que os mais jovens a tecircm mais lenta) o alcoolismo (eacute de consenso geral
que o abuso de aacutelcool favorece o aparecimento da cirrose) e a co-infecccedilatildeo com o
Viacuterus da Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida (SIDA) e da HVB
A incidecircncia anual de carcinoma hepatocelular (CHC) eacute de 1 a 4 nos
pacientes cirroacuteticos o que justifica plenamente o controle ecograacutefico do fiacutegado e a
dosagem seacuterica de alfa-fetoproteiacutena nesses pacientes a cada 1-2 anos Por outro
lado nos pacientes com hepatite crocircnica por viacuterus C sem cirrose o CHC eacute muito
raro (LOPES 2010)
Nos casos de cura a atividade das transaminases cessa e os viacuterus natildeo
satildeo detectados (VHC RNA) no soro Nos casos de cronificaccedilatildeo acontece o
contraacuterio ou seja as alteraccedilotildees bioquiacutemicas existem com flutuaccedilotildees e os viacuterus satildeo
detectaacuteveis na grande maioria dos casos Fazem exceccedilatildeo agravequeles pacientes com
22
viremia baixa que por isso mesmo fogem aos limites dos meacutetodos de detecccedilatildeo viral
ou devido agraves flutuaccedilotildees proacuteprias desses niacuteveis virecircmicos (HAYDON et al 1998)
Nos pacientes anti-VHC positivos com enzimas circulantes normais a
falta de VHC RNA no soro tem sido interpretada como sinal de cura completa No
entanto Haydon et al (1998) alteraram essa interpretaccedilatildeo Estes autores
demonstraram a presenccedila de VHC RNA no fiacutegado desses pacientes que eram
negativos no soro independente das alteraccedilotildees bioquiacutemicas positivas ou negativas
do soro ou seja mesmo naqueles casos anteriormente considerados como curados
Assim os niacuteveis de viacuterus intra-hepaacuteticos natildeo satildeo determinados pelos fatores
hospedeiro (idade modo e duraccedilatildeo da infecccedilatildeo) ou virais (VHC genoacutetipos) pois
mesmo as repetidamente Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia-em tempo real (RT-
PCR) negativos para VHC RNA no soro podem ter viacuterus da HCV albergados no
fiacutegado Entretanto existem limitaccedilotildees metodoloacutegicas que devem ser consideradas
nessa interpretaccedilatildeo como por exemplo as limitaccedilotildees do RIBA 3 e do RT-PCR
Mais importante eacute o seguimento dos pacientes ao longo do tempo Assim
Seef et al (1992) em 568 pacientes de hepatite poacutes-transfusional e dois grupos
controles pareados que receberam transfusotildees sem desenvolver hepatite apoacutes 18
anos de seguimento encontraram 33 de mortalidade no grupo 1 e 15 no grupo
controle sendo que a maioria das mortes ocorreu nos pacientes com alcoolismo
associado Evidenciando que a maioria dos que desenvolve doenccedila crocircnica o faz
muito lentamente
Existem ainda no curso natural da doenccedila flutuaccedilotildees intensas e muito
frequumlentes que dependem dos viacuterus e dos hospedeiros a saber niacuteveis da viremia
genoacutetipos 1b graus de diversidade geneacutetica dos viacuterus vias de transmissatildeo (os
inoculados via transfusatildeo apresentam lesotildees hepatocelulares mais ativas)
(GORDON et al 1993 GORDON BAYATI SILVERMAN 1998) deficiecircncias
imunes alcoolismo e co-infecccedilatildeo com HBV e delta ou o Viacuterus da imunodeficiecircncia
humana (HIV) (LOPES 2010) Nestes uacuteltimos casos a co-infecccedilatildeo com muacuteltiplos
viacuterus das hepatites estaacute associada com mais graves lesotildees histoloacutegicas do fiacutegado do
que nos casos de VHC isoladas
Importa saber se os resultados obtidos com os controles feitos se mantecircm
por longos periacuteodos Ou seja como exemplos a atividade da ALT persistentemente
normal a variabilidade do RT-PCR a detecccedilatildeo de VHC RNA pela teacutecnica Reaccedilatildeo
de polimerase em cadeia (PCR) que pode ser negativa devido agrave inadequada
23
armazenagem das amostras agrave contaminaccedilatildeo do soro com substacircncias que
interferem na leitura entre outras causas de erro
As informaccedilotildees sobre as causas que determinam o curso evolutivo da
doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos progressos havidos no campo do
diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHC Uma questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo
genotipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o
genotipo 1 (1b) cursa com lesotildees histoloacutegicas mais graves independentemente da
carga viral Ainda mais os VHC RNA negativos no soro mesmo apoacutes anos de
cura podem recair pois neles persistem os viacuterus no fiacutegado em regime de
replicaccedilatildeo muito baixa indetectaacutevel pelos meacutetodos atuais Ao contraacuterio os negativos
no soro e no fiacutegado tecircm demonstrado respostas boas e sustentadas inclusive no
sentido de se fazer prognoacutestico de cura real e verdadeira infelizmente na grande
minoria dos casos
116 Diagnoacutestico
Quanto mais cedo o diagnoacutestico maiores as chances de detectar a
doenccedila Por isso eacute importante que as pessoas faccedilam o exame especiacutefico porque soacute
esse exame eacute que detecta a HCV E as mulheres tecircm que ter uma atenccedilatildeo em
especial Tempos atraacutes o Correio Braziliense (2003) publicou uma grande mateacuteria
sobre a quantidade de mulheres que vecircm sendo infectadas com a HCV Cuja causa
estava na esterelizaccedilatildeo mal feita dos equipamentos das manicures Uma soluccedilatildeo
praacutetica eacute as mulheres terem seu proacuteprio material pra fazer as unhas e natildeo deixar
mais ningueacutem utilizar (nem matildee nem irmatilde etc) Bem e quem tiver passado por
transfusatildeo dentistas manicures operaccedilotildees etc deve fazer o exame
(KARMOCHKINE et al 1998 apud CONTE 2000 KEER et al 1997)
A HCV natildeo eacute como a Siacutendrome da Imunodeficiecircncia Adquirida (AIDS)
que possui drogas com grande tecnologia e o doente pode viver por muitos e muitos
anos Com a HCV o paciente soacute tem chance de ficar bem se a doenccedila for
diagnosticada e tratada antes dela se manifestar Atualmente o tratamento usa uma
associaccedilatildeo de duas drogas ndash o Interferon e a Ribavirina ldquoAs chances de cura em
meacutedia satildeo de 50rdquo
Barbaro et al (1999) verificaram que os pacientes VHC genoacutetipos 1b
frequumlentemente apresentavam alteraccedilotildees ultraestruturais das mitococircndrias com
24
depleccedilatildeo do mtDNA podendo comprometer o processo de fosforilizaccedilatildeo oxidativa
Sendo assim a produccedilatildeo aumentada de radicais livres nos pacientes VHC genoacutetipos
1b poderia atuar de modo negativo na evoluccedilatildeo da doenccedila hepaacutetica aumentando o
efeito citopaacuteticos do VHC Nesses pacientes haveria portanto aumento de
hiperoxidaccedilatildeo com consequumlente resistecircncia agrave accedilatildeo dos interferons e pior evoluccedilatildeo
da doenccedila hepaacutetica A ser confirmado este fato novas estrateacutegias terapecircuticas
poderatildeo vir a ser desenvolvidas no combate a essa doenccedila
Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila
poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses
autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis
vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo
hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja
quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a
concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave
hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em
parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)
Dos fatos acima expostos decorrem implicaccedilotildees tais como as respostas
CD8-CTL aos antiacutegenos VHC restritas aos complexos de histocompatibilidade
principais (MHC I) com inibiccedilatildeo ou mesmo insuficiente produccedilatildeo de complexo
peptiacutedeo VHC-MHC inibiccedilatildeo direta das ceacutelulas CTLK e a falta de resposta as
citoquininas entre outras dos vaacuterios mecanismos de escape existentes Dentro
desse contexto o niacutevel de morte celular natildeo seria alcanccedilado e a lesatildeo hepatocelular
consequumlente seria portanto miacutenima
Outra implicaccedilatildeo resultante consiste na induccedilatildeo de resposta imune
celular T Helper mediadas a partir de peptide vacinas contra o VHC Estas novas
vacinas tecircm a capacidade de gerar linfoacutecitos T citotoacutexico os CTLs contra o VHC em
camundongo imunizados com peptiacutedeos CTL e ceacutelulas HT epiacutetomes do core VHC
Esses estudos recente em animais de laboratoacuterio vecircm progredindo rapidamente
esperando-se em breve novos recursos no tratamento dessa doenccedila (AGNELLO et
al 1998)
25
12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC
O VHC constitui-se em uma famiacutelia heterogecircnea de viacuterus com no miacutenimo
seis genoacutetipos e inuacutemeros subtipos (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT
SANTOS SILVA 1999) Embora o meacutetodo de maior acuraacutecia para a determinaccedilatildeo
do genoacutetipo do VHC seja a identificaccedilatildeo completa da sequumlecircncia dos 9500
nucleotiacutedeos e a construccedilatildeo de uma aacutervore filogeneacutetica esse meacutetodo soacute pode ser
utilizado em laboratoacuterios de pesquisa (BARBOSA SILVA MARTINS 2005) e natildeo
em laboratoacuterios cliacutenicos Assim foram desenvolvidos meacutetodos para genotipagem
utilizando apenas as regiotildees mais conservadas do genoma como a proteiacutena do
envoltoacuterio (E1) a proteiacutena core e a proteiacutena natildeo estrutural NS5B A sequumlecircncia dos
nucleotiacutedeos dentro dessas regiotildees relativamente conservadas eacute genoacutetipo-
especiacutefico e os isolados podem ser genotipados independentemente da regiatildeo que
for utilizada para anaacutelise (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS
SILVA 1999) Para uso em laboratoacuterios cliacutenicos foram desenvolvidas basicamente
duas metodologias que se valem de teacutecnicas de biologia molecular (genotipagem)
ou citoloacutegicas (serotipagem)
Os meacutetodos que adotam teacutecnica de biologia molecular para genotipagem
utilizando porccedilotildees do genoma incluem a PCR aninhada (nested PCR) (BASSIT
SANTOS SILVA 1999) a teacutecnica de restriction fragment length polymorphism
(RFLP) (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS SILVA 1999) a
hibridizaccedilatildeo reversa (BASSIT SANTOS SILVA 1999) (INNO-LiPA Innogenetics
Beacutelgica Gen Eti DEIA HCV Sorin Biomedica Itaacutelia) e o sequumlenciamento direto da
regiatildeo natildeo-codificante 5 (TruGene Visible Genetics Canadaacute) Suas principais
vantagens satildeo a informaccedilatildeo direta sobre sequumlecircncia dos nucleotiacutedeos do genoma
viral a alta sensibilidade por se basearem na PCR e a possibilidade de identificar o
subtipo viral (BARBOSA SILVA MARTINS 2005)
Os meacutetodos para determinaccedilatildeo do genoacutetipo que utilizam serotipagem
baseiam-se na detecccedilatildeo de anticorpos genoacutetipos-especiacuteficos contra epiacutetopos do
VHC (por exemplo proteiacutenas da regiatildeo do core) (BLOCK SCHIANO 1999) Os
testes comercializados utilizam diferentes teacutecnicas ELISA competitivos ou
immunoblot (Murex-HC1-6 Murex Diagnostics Ltd Reino Unido RIBA HCV
Serotyping Assay Chiron Diagnostics Estados Unidos) As principais vantagens da
teacutecnica de serotipagem satildeo o baixo custo e maior facilidade de realizaccedilatildeo em
26
comparaccedilatildeo com os testes de biologia molecular (BLOCK SCHIANO 1999 De
LARANAGA et al 2000)
A determinaccedilatildeo do genoacutetipo anteriormente utilizada em pesquisas mas
sem maior utilidade na praacutetica meacutedica atualmente eacute recomendada para uso cliacutenico
Como jaacute mencionado os pacientes infectados pelo genoacutetipo 1 do VHC devem ser
tratados por 12 meses enquanto os demais por 6 meses (BASSIT SANTOS SILVA
1999)
A determinaccedilatildeo do genoacutetipo do VHC pode ser feita por PCR ou
serotipagem A primeira teacutecnica eacute mais sensiacutevel e possibilita a identificaccedilatildeo de
subtipos do VHC Contudo a segunda eacute de mais faacutecil realizaccedilatildeo e mais barata
razatildeo pela que eacute importante que a teacutecnica seja aprimorada
Oliveira et al (1999) investigaram os padrotildees de distribuiccedilatildeo dos
genoacutetipos do VHC estudando 250 pacientes anti-VHC positivos atraveacutes da
detecccedilatildeo VHC RNA pelo RT-PCR e encontraram prevalecircncia de 72 para o VHC 1
253 para o tipo 3 2 para o 2 e 07 para o 4 semelhantes aos das vaacuterias
regiotildees mundiais
13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC
As manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo pelo VHC satildeo as mais
variadas possiacuteveis A diversidade de resposta do hospedeiro ao agente infeccioso
variando desde quadros assintomaacuteticos ateacute aqueles com evoluccedilatildeo grave fatal ou
incapacitante tem estimulado a busca por justificativas de tais discrepacircncias
cliacutenicas sobretudo na imunomodulaccedilatildeo Dentre as infecccedilotildees mais bem estudadas
destacam-se aquelas pelos Viacuterus da hepatite C Viacuterus da imunodeficiecircncia humana1
(HIV-1) pelo Herpes viacuterus humano 4 (viacuterus do Epstein Baar) e pelo Mycobacterium
leprae (ABBAS LICHTMAN 2005)
A agressatildeo hepaacutetica por auto-imunidade eacute um fenocircmeno reconhecido em
vaacuterias doenccedilas do fiacutegado inclusive nas de etiologia viral Aleacutem do agente agressor e
de sua interaccedilatildeo com o sistema imunoloacutegico do hospedeiro fatores ambientais ou
hormonais estatildeo aparentemente envolvidos no surgimento de auto-imunidade
hepaacutetica como se supotildee acontecer na hepatite auto-imune em indiviacuteduos
geneticamente suscetiacuteveis (CODES et al 2002)
27
A lesatildeo hepatocelular relacionada agrave infecccedilatildeo pelos viacuterus hepatotroacutepicos e
pelos herpes viacuterus (citomegaloviacuterus e Epstein-Barr) eacute secundaacuteria a uma resposta
auto-imune do hospedeiro Estes viacuterus natildeo parecem ser diretamente citopaacuteticos
mas desencadeiam lesatildeo hepaacutetica atraveacutes da resposta imune do hospedeiro contra
ceacutelulas hepaacuteticas infectadas (MALOY POWRIE 2001)
Existem estudos que focalizam alteraccedilotildees imunoloacutegicas em hepatites
virais entretanto a maioria deles mostra resultados pontuais sem seguimento na
fase aguda da doenccedila (BLOCK SCHIANO 1999 McFARLONE et al 1990) Aleacutem
disso ainda natildeo se estabeleceu uma associaccedilatildeo entre as reaccedilotildees auto-imunes
transitoacuterias induzidas por viroses hepatotroacutepicas e agravamento do dano tecidual na
hepatite viral
A infecccedilatildeo crocircnica estaacute fortemente associada agrave crioglobulinemia mista
essencial glomerulonefrite membrano-proliferativa e porfiria cutacircnea tardia De
forma menos impressiva encontra-se tambeacutem associada agrave uacutelcera corneana de
Mooren liacutequen plano e fibrose pulmonar (KILLENBERG 2000 WENER et al 1996)
A ocorrecircncia de anticorpos antitireoidianos e hipotireoidismo tem sido relatada em
associaccedilatildeo com a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC em mulheres (KILLENBERG 2000
CACOUB et al 1999)
A associaccedilatildeo entre a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC a presenccedila do fator
reumatoacuteide e do anticorpo antinuclear (FAN) o fenocircmeno de Raynaud e doenccedilas
difusas do tecido conjuntivo (DDTC) como artrite reumatoacuteide luacutepus eritematoso
sistecircmico siacutendrome de Sjoumlgren e vasculites sistecircmicas eacute relatada em alguns
trabalhos (CACOUB et al 1999 LOVY STARKEBAUM UBEROI 1996 STAUB
1998 WENER et al 1996)
14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE
A associaccedilatildeo entre doenccedilas infecciosas e autoimunidade apresentando-
se com manifestaccedilotildees cliacutenicas ou detectadas apenas pelo desenvolvimento de auto-
anticorpos tem sido amplamente documentado Infecccedilotildees virais bacterianas e
parasitaacuterias podem estar envolvidas no desenvolvimento recidivas e ateacute mesmo na
prevenccedilatildeo de doenccedilas auto-imunes (KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)
Ribeiro e Proietti (2004) avaliaram a frequumlecircncia de FR anticorpos
antipeptiacutedeo citrulinado ciacuteclico (anti-CCP) AAN anticorpos anti-citoplasma de
28
neutroacutefilos (ANCA) anticorpos anticardiolipina (aCL) e anticorpos anti-β2
glicoproteiacutena I (anti-β2GPI) em pacientes com hanseniacutease Existe estudo
demonstrando pacientes que apresentavam manifestaccedilotildees articulares comparados
aos que natildeo apresentavam envolvimento articular e um grupo controle de indiviacuteduos
saudaacuteveis com idade e gecircnero semelhantes aos dos pacientes estudados e que
residiam na mesma aacuterea geograacutefica A maioria dos pacientes nos dois grupos (com
e sem envolvimento articular) apresentava hanseniacutease generalizada Entretanto
observaram uma baixa frequumlecircncia que natildeo foi significativamente diferente de FR
anti-CCP AAN e ANCA em pacientes com hanseniacutease (nos dois grupos) e normal
dos controles Mas a prevalecircncia de anticorpos aCL e anti-β2GPI estava
significativamente elevada nos pacientes com hanseniacutease quando comparados com
o grupo controle apesar de natildeo haver associaccedilatildeo significativa com o envolvimento
articular O isoacutetopo predominante dos dois autoanticorpos foi a IgM (487) dos
pacientes com hanseniacutease apresentava pelo menos um anticorpo antifosfoliacutepide
Aleacutem disso os autores observaram uma associaccedilatildeo entre a positividade para aCL e
as manifestaccedilotildees cliacutenicas jaacute que os pacientes com anticorpos aCL apresentavam
doenccedila Hanseniacutease generalizada (VV) com mais frequumlecircncia (p= 0002) Natildeo houve
associaccedilatildeo entre a presenccedila de anticorpos aCL ou anti-β2GPI e episoacutedios
reacionais poreacutem entre os pacientes com esses episoacutedios aqueles com anticorpos
aCL apresentavam eritema nodoso hansecircnico (ENH) em 100 dos casos enquanto
entre os pacientes negativos para aCL 57 apresentavam ENH Apesar de uma
alta taxa de concordacircncia para a presenccedila de anticorpos aCL e anti-β2GPI ter sido
observada manifestaccedilotildees tromboemboacutelicas natildeo foram observadas (RIBEIRO
PROIETTI 2004 2005)
Horimoto e Costa (2009) avaliaram pacientes com Leishmania
(leishmaniose visceral e leishmaniose cutacircnea) para a presenccedila de anticorpos anti-
Leishmania assim como FR AAN anti-DNA anti-Sm anti-RNP anti-Ro anti-La
aCL e complemento (C3 e C4) Como esperado os pacientes com leishmaniose
visceral apresentava anticorpos anti-Leishmania Tiacutetulos significativamente elevados
de AANs na maioria dos pacientes o anti-DNA foi detectado em poucos pacientes
com doenccedila visceral assim como tiacutetulos elevados de anticorpos aCL (isotipo IgG)
quando comparados com os pacientes com leishmaniose cutacircnea Niacuteveis reduzidos
de complemento tambeacutem satildeo evidentes na doenccedila visceral assim como niacuteveis
significativamente reduzidos de C3 Outros estudos comparam e discutem os
29
resultados em relaccedilatildeo agrave crescente evidecircncia na literatura da presenccedila de
autoanticorpos em ambas as doenccedilas Em geral a prevalecircncia variaacutevel de auto-
anticorpos relatada assim como relatos preacutevios na literatura podem estar
relacionados a diferenccedilas metodoloacutegicas como o tipo de ensaio utilizado a
definiccedilatildeo dos pontos de corte inativaccedilatildeo dos soros pelo calor seleccedilatildeo de pacientes
e variaccedilotildees eacutetnicas e geograacuteficas nos grupos de pacientes Mas um dos resultados
consistentes foi a frequumlecircncia significativamente mais elevada de anticorpos
antifosfoliacutepide aCL e anti-β2GPI em pacientes com hanseniacutease enquanto
anticorpos AAN e aCL foram detectados com mais frequumlecircncia nos pacientes com
leishmaniose visceral A incidecircncia aumentada de anticorpos AAN e aCL nos
pacientes com leishmaniose visceral eacute compatiacutevel com outros estudos (OSSADRON
et al 2006 SAKKAS et al 2008 VOULGARI et al 2004) e demonstra
semelhanccedilas das manifestaccedilotildees cliacutenicas e laboratoriais entre a leishmaniose
visceral e o luacutepus eritematoso sistecircmico (LES) Aleacutem disso a reatividade cruzada
entre AAN e anticorpos anti-Leishmania jaacute foi tambeacutem relatada (GRANEL et al
2000)
Diversos grupos documentaram niacuteveis elevados de anticorpos
antifosfoliacutepide (aCL anti-β2GPI e anti-protrombina) em diversas doenccedilas
infecciosas como a siacutefilis doenccedilas virais (incluindo a hepatite C Parvoviacuterus B19 e
HIV) malaacuteria e hanseniacutease sem as manifestaccedilotildees cliacutenicas da siacutendrome
antifosfoliacutepide (SAF) (ZANDMAN-GODDARD BLANK SHOENFELD 2002) Os
tiacutetulos elevados geralmente satildeo transitoacuterios diminuindo e desaparecendo apoacutes a
resoluccedilatildeo da infecccedilatildeo (LOIZOU et al 2003 ZANDMAN-GODDARD BLANK
SHOENFELD 2002) Mas em uma minoria dos pacientes a associaccedilatildeo entre
doenccedilas infecciosas e anticorpos antifosfoliacutepide pode levar a complicaccedilotildees severas
frequumlentemente fatais ou seja SAF catastroacutefica (ZANDMAN-GODDARD BLANK
SHOENFELD 2002)
Os resultados de Ribeiro e Proietti (2005) mostrando um aumento da
incidecircncia de anticorpos anti-β2-GPI em pacientes com hanseniacutease associados aos
dados de outros grupos (De LARANAGA et al 2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK
et al 1994 LOIZOU et al 2003) que tambeacutem documentaram niacuteveis elevados de
anticorpos anti-2βGPI lanccedilam duacutevidas sobre a noccedilatildeo de que os anticorpos aCL
associados a infecccedilotildees satildeo independentes dos anticorpos anti-β2GPI e natildeo
dependentes desses anticorpos como nas doenccedilas auto-imunes Em conjunto
30
esses resultados apoacuteiam a noccedilatildeo de que na presenccedila de infecccedilotildees anticorpos aCL
satildeo heterogecircneos em relaccedilatildeo agrave sua dependecircncia da 2GPI (De LARANAGA et al
2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK et al 1994 LOIZOU et al 2003) e as infecccedilotildees
podem desencadear a induccedilatildeo de anticorpos antifosfoliacutepide patogecircnicos em
indiviacuteduos predispostos (LOIZOU et al 2003)
A produccedilatildeo de autoanticorpos na hanseniacutease e leishmaniose pode ser
explicada por diversos mecanismos Na forma mais generalizada dessas doenccedilas
(hanseniacutease VV e leishmaniose visceral) os pacientes apresentam
hipergamaglobulinemia difusa semelhante agrave vista em outras infecccedilotildees como
Schistosoma mansoni T cruzi e Plasmodium A induccedilatildeo de autoanticorpos pode ser
atribuiacuteda agrave ativaccedilatildeo policlonal e proliferaccedilatildeo das ceacutelulas B algumas com auto-
reatividade pertencentes agrave biblioteca de anticorpos naturais em indiviacuteduos normais
(ARGOV et al 1989) Na leishmaniose antiacutegenos soluacuteveis derivados da L major e
L donovani satildeo mitogecircnicos e desencadeiam a produccedilatildeo de imunoglobulinas com
auto-reatividade (ARGOV et al 1989) Crioglobulinemia mista induzida pelo HCV eacute
outro exemplo de ativaccedilatildeo policlonal persistente levando a uma mistura de
autoanticorpos policlonais e monoclonais os quais causam doenccedilas auto-imunes
(AGMON-LEVIN et al 2009)
Mimetismo molecular ou homologias estruturais entre infecccedilotildees e
componentes do hospedeiro podem ser agrave base da produccedilatildeo de autoanticorpos
como no caso da febre reumaacutetica onde o componente M da membrana do
estreptococo apresenta homologia com peptiacutedeos cardiacuteacos cerebrais e sinoviais A
associaccedilatildeo da siacutendrome de Guillain-Barreacute com a infecccedilatildeo pelo Campylobacter
jejeuni representa outro exemplo de mimetismo molecular como base de uma
manifestaccedilatildeo auto-imune A reatividade cruzada entre agentes infecciosos e auto-
antiacutegenos jaacute foi demonstrada para o M leprae (McADAM MUDD SHOENFELD
1984) e M tuberculosis (SHOENFELD et al 1986) e a inibiccedilatildeo de anticorpos anti-
Sm anti-RNP e anti-SSB por promastigotas intactas de Leishmania apoacuteia a
homologia entre antiacutegenos nucleares e a Leishmania (ARGOV et al 1989)
A disseminaccedilatildeo de epiacutetopos a emergecircncia de novos anticorpos ou a
resposta de ceacutelulas T a um novo epiacutetopo (subdominante ou criacuteptico) no mesmo
antiacutegeno ou em outro antiacutegeno foi demonstrada em modelos experimentais e na
doenccedila humana alguns autores demonstraram a disseminaccedilatildeo molecular do
antiacutegeno Sm para reatividade anti-RNP (STAUB 1998) no LES enquanto na febre
31
reumaacutetica o estado de autoimunidade crocircnica que afeta as vaacutelvulas cardiacuteacas pode
resultar em uma resposta imunoloacutegica contra o colaacutegeno e laminina (KIVITY et al
2009 PORDEUS et al 2008) As infecccedilotildees tambeacutem podem desempenhar um papel
importante na induccedilatildeo da autoimunidade atraveacutes da liberaccedilatildeo de antiacutegenos
sequumlestrados apoacutes lesatildeo tecidual ou aumentando a exibiccedilatildeo de epiacutetopos criacutepticos
no meio inflamatoacuterio apresentando assim novos antiacutegenos ao sistema imunoloacutegico
(KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)
15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES
AGUDAS VIRAIS
O conceito de auto-imunidade induzida por viacuterus natildeo eacute exclusivo para
doenccedilas hepaacuteticas O viacuterus Coxsackie do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um
terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite infecciosa e estaacute implicado nas miocardites
auto-imunes reagindo contra a miosina cardiacuteaca (GIST BELL 1974) Niwa et al
(1984) encontraram elevaccedilatildeo transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator
reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas
virais comuns como varicela sarampo influenza caxumba herpes zoster e
exantema suacutebito
A patogecircnia da infecccedilatildeo viral inclui pelo menos trecircs tipos de interaccedilotildees
com o hospedeiro vertebrado 1) o efeito do agente sobre as ceacutelulas 2) a maneira
de disseminaccedilatildeo do agente no organismo infectado 3) a resposta imunoloacutegica e a
sua influencia no processo infeccioso Destacam-se dois tipos principais da
interaccedilatildeo a destruiccedilatildeo celular e a resposta imunoloacutegica (FIGUEIREDO 1999
CATALAN-SOARES PROIETTI CARNEIRO-PROIETTI 2006) O viacuterus Coxsackie
do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite
infecciosa e estaacute implicado nas miocardites auto-imunes reagindo contra a miosina
cardiacuteaca (GERSHON KONDO 1971) Niwa et al (1984) encontraram elevaccedilatildeo
transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo
anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas virais comuns como varicela sarampo
influenza caxumba herpes zoster e exantema suacutebito
32
16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN
De acordo com o II Consenso Brasileiro de FAN em HEp 2
(DELLAVANCE et al 2003) os AAN satildeo encontrados comumente em uma
variedade de doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Satildeo uacuteteis na investigaccedilatildeo dessas
doenccedilas auxiliando no diagnoacutestico de patologias como LES esclerose sistecircmica
progressiva (ESP) doenccedila mista do tecido conjuntivo (DMTC) siacutendrome de Sjoumlgren
(SS) polimiosite e dermatomiosite
Eles podem estar presentes em um pequeno percentual da populaccedilatildeo
aparentemente sadia essa frequumlecircncia eacute maior em mulheres e aumenta com a idade
Segundo a literatura a positividade entre 20 a 60 anos varia entre percentuais mais
altos (133) para tiacutetulos baixos e mais baixos (33) para tiacutetulos mais elevados
(DELLAVANCE et al 2003)
A pesquisa dos anticorpos antinucleares pode ser realizada por diferentes
teacutecnicas a imunofluorescecircncia indireta eacute a mais utilizada por sua sensibilidade
reprodutibilidade e facilidade de execuccedilatildeo A sensibilidade aumenta
significativamente quando se utiliza como substrato lacircminas com ceacutelulas Hep 2
(ceacutelulas de carcinoma de laringe humana) por causa da maior expressatildeo de
antiacutegenos na superfiacutecie dessas ceacutelulas comparados aos expressos nas ceacutelulas de
fiacutegado ou de rins de camundongos que se utilizavam anteriormente
Em geral eacute possiacutevel detectar melhor a presenccedila de AAN por associaccedilatildeo
de trecircs anti-soros isotipos especiacuteficos (anti-IgG anti-IgA e anti-IgM) A pesquisa
realizada por essa teacutecnica serve de triagem inicial para a presenccedila de AAN Eacute
normalmente denominada pesquisa de FAN ou AAN
A realizaccedilatildeo de outras metodologias tais como as imunoenzimaacuteticas
permite uma avaliaccedilatildeo isolada dos diferentes auto-anticorpos sugeridos pelos
padrotildees de fluorescecircncia encontrados no FAN A identificaccedilatildeo desses AAN permite
um diagnoacutestico mais preciso e eles podem ser utilizados em muitos casos como
marcador para uma das diferentes doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Muitas dessas
patologias apresentam um perfil distinto de auto-anticorpos que auxilia o diagnoacutestico
A presenccedila de FAN positivo em pessoas aparentemente sadias pode ser
devida a algumas situaccedilotildees
minus Doenccedila auto-imune precoce ainda natildeo expressa clinicamente
33
minus distuacuterbio imunoloacutegico transitoacuterio causado por doenccedila natildeo-imune
tais como infecccedilotildees principalmente virais
minus uso de medicamentos e neoplasias
minus manifestaccedilatildeo incompleta de uma siacutendrome ou seja o paciente
sintetiza o anticorpo poreacutem esse quadro natildeo evolui para doenccedila
minus fenocircmeno auto-imune fisioloacutegico
O resultado do FAN eacute expresso em tiacutetulo e padratildeo uma vez que ambos
os paracircmetros tecircm importacircncia para a avaliaccedilatildeo do significado cliacutenico do exame O
tiacutetulo do FAN corresponde agrave maior diluiccedilatildeo capaz de demonstrar fluorescecircncia
inequiacutevoca e didaticamente pode ser dividido em
minus Baixo menor 180
minus Moderado 1160
minus Moderadamente elevado 1320
minus Alto maior 1640
Nas pesquisas realizadas por imunofluorescecircncia indireta os resultados
satildeo expressos em tiacutetulos segundo as diluiccedilotildees empregadas Eacute possiacutevel trabalhar
utilizando-se como limite tiacutetulos de 140 que permitem maior sensibilidade ou de
180 que permitem maior especificidade ou seja um menor nuacutemero de falso-
positivos
Na praacutetica cliacutenica satildeo considerados significativos tiacutetulos superiores a
1160 Os resultados com tiacutetulos positivos satildeo acompanhados pela descriccedilatildeo do
padratildeo de fluorescecircncia encontrado que serve como orientaccedilatildeo da presenccedila de um
antiacutegeno especiacutefico e em alguns casos como padratildeo diagnoacutestico Em determinadas
situaccedilotildees em especial no LES em atividade pode ocorrer agrave observaccedilatildeo de mais de
um padratildeo de fluorescecircncia
O padratildeo do FAN a seu turno aponta uma probabilidade maior ou menor
de doenccedila auto-imune e ateacute mesmo sugere o antiacutegeno nuclear envolvido e por
consequumlecircncia a afecccedilatildeo com ele mais relacionada Os padrotildees homogecircneo
centromeacuterico e pontilhado grosso satildeo os mais indicativos de processos de
autoimunidade uma vez que se associam a diversas condiccedilotildees reumaacuteticas
especialmente ao LES e agrave esclerose sistecircmica e tambeacutem a enfermidades hepaacuteticas
tais como a cirrose biliar primaacuteria e a hepatite auto-imune (KILLENBERG 2000)
34
Jaacute o pontilhado fino o pontilhado grosso reticulado e a membrana nuclear
tecircm maior significado quando encontrados em tiacutetulos altos uma vez que podem
estar presentes em tiacutetulos baixos em indiviacuteduos hiacutegidos Por sua vez o pontilhado
fino denso mesmo quando elevado em pessoas assintomaacuteticas soacute guarda relaccedilatildeo
com alguma doenccedila em cerca de 20 dos casos (DELLAVANCE et al 2003)
O padratildeo pontilhado pode tambeacutem ser referido como padratildeo salpicado
Outros padrotildees de fluorescecircncia podem ser encontrados em menor frequumlecircncia Os
pontilhados citoplasmaacutetico grossos ou reticulares associados agrave presenccedila de
anticorpos antimitococircndrias em pacientes com cirrose biliar primaacuteria o
citoplasmaacutetico homogecircneo relacionado a proteiacutenas ribossocircmicas em pacientes com
LES e o padratildeo pontilhado fino citoplasmaacutetico que pode estar associado agrave
presenccedila de anticorpos anti-JO-1 anti-PCNA e proteiacutenas da membrana celular em
pacientes com LES outras patologias do tecido conjuntivo e hepatopatias auto-
imunes (DELLAVANCE et al 2003)
Quadro 1 - Padrotildees de fluorescecircncia encontrados em maior frequumlecircncia e patologias relacionadas
Padrotildees de Fluorececircncia Antiacutegenos Patologias Relacionadas
Perifeacuterico DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES
Homogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA
LES AR lupus induzido por drogas
Perifeacutericohomogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES
Pontilhado grosso SM RNP LES DMTC
Pontilhado fino nuclear SS-A (RO) SS-B (La) SS LES
Nucleolar Proteiacutenas Nucleolares ESP Centromeacuterico Proteiacutenas de centrocircmeros Siacutendrome de CREST
Fonte Dellavance et al 2003 Quadro 2 - Anti-ena - auto-anticorpos contra antiacutegenos extraiacutedos do nuacutecleo e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleares Patologias Relacionadas SM LES RNP DMTC LES ESP AR e Polimiosite
SS-A (Ro) SS LES lupus neonatal e forma cutacircnea subaguda
SS-B (La) SS LES luacutepus neonatal e forma cutacircnea subaguda
Scl 70 ESP Jo -1 Polimiosite e dermatomiosite Fonte Dellavance et al 2003
35
Quadro 3 ndash Padrotildees de FAN nuclear e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes
Padrotildees Nucleares Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos
Nuclear Pontilhado Centromeacuterico Anticorpo anti-centrocircmero Esclerose Sistecircmica forma CREST Cirrose Biliar Primaacuteria
Nuclear homogecircneo Anticorpo anti-DNA nativo Lupus Eritematoso Sistecircmico (LES) Anticorpo anti-Histoma LES induzido por drogas LES idiopaacutetico Anticorpo anti-cromatina (DNAHistona Nucleossomo) Artrite Reumatoacuteide (AR) Artrite Idiopaacutetica Juvenil importante associaccedilatildeo com uveiacutete na forma oligoarticular Siacutendrome de Felty Cirrose Billar Primaacuteria
Nuclear tipo membrana nuclear contiacutenua Anticorpo anti-Iamin e contra envelope nuclear - Iamins Hepatites auto-imunes Raramente associado a doenccedilas reumaacuteticas (algumas formas de LES e esclerodermia linear)
Nuclear pontilhado pleomoacuterficoPCNA Anticorpo contra nuacutecleo de ceacutelulas em proliferaccedilatildeo LES
Nuclear pontilhado fino denso Anticorpo anti-proteina p 75 kDa pode ser encontrado em indiviacuteduos saudaacuteveis processos inflamatoacuterios inespeciacuteficos doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Cistite Intersticial Dermatite Atoacutepica Psoriacutease e Asma
Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos
Anticorpo anti-p80 coilina natildeo apresenta associaccedilatildeo cliacutenica definida
Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos
Anticorpo anti-Sp100 (anti-p95) Cirrose Biliar Primaacuteria pode ocorrer em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas
Nuclear pontilhado grosso Anticorpo anti-Sm LES Anticorpo anti-RNP criteacuterio obrigatoacuterio no diagnostico da doenccedila mista do Tecido conjuntivo (DMTC) tambeacutem ocorre no LES Esclerose Sistecircmica (ES) e AR
Nuclear pontilhado fino Anticorpo anti SSARo Siacutendrome de Sjogren Primaacuteria (SS) LES Lupus neonatal e Lupus Cutacircneo Subagudo Anticorpo anti-SSBLa Lupus neonatal LES SS Anticorpo anti-Mi-2 Dermatomiosite embora raramente ocorra na polimiosite do adulto
Fonte Dellavance et al 2003
36
Quadro 4 - Padrotildees de FAN citoplasmaacuteticos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes
Padrotildees Citoplasmaacuteticos e Relacionados ao Aparelho Mitoacutetico Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos
Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina Hepatite auto-imune Cirrose Anticorpo anti-miosine Hepatite C Hepatocarcionoma Miastenia Gravis Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida
Citoplasmaacutetico Fibrilar Segmentar Anti actinina anti--vinculina e anti-tropomiose Miastenia Gravis Doenccedila de Crohn e Colite ulcerativa Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia cliacutenica definida
Citoplasmaacutetico Pontilhado Polar Anticorpo Anti-golginas (cisternas do aparelho de Golgi) raro no LES SS e outras doenccedilas auto-imunes sistecircmicas Relato na Ataxia Cerebelar Idiopaacutetica Degeneraccedilatildeo Cerebelar Paraneoplaacutesica infecccedilotildees virais pelo Epstein Barr (EBV) e pelo viacuterus da imunodeficiecircncia Humana (HIV) Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida
Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Anticorpo anti-Histidill t RNA sintetase (Jo-1) anticorpo marcador de Polimiosite no adulto Descrito raramente na Dermatomiosite
Citoplasmaacutetico Pontilhado com Pontos Isolados
Anticorpo anti-EEA1 e anti-fosfatidilserina natildeo haacute associaccedilotildees clinicas bem definida Anticorpo anti-GWBSS tambeacutem encontrado em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas
Citoplasmaacutetico Pontilhado Reticulado Anticorpo anti-mitococircndria Cirrose Biliar Primaacuteria Esclerose Sistecircmica Eacute relativamente comum o encontro deste padratildeo na ausecircncia de anticorpos anti-mitococircndria
Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Denso Anti PL7PL12 Raramente associado a Polimiosite Anticorpo P-ribossomal Este padratildeo ocorre no LES se a associaccedilatildeo eacute com anti-proteina P ribossomal
Citoplasmaacutetico Fibrilar Filamentar Anticorpo anti-vimentina e anti-queratina Anti-queratina eacute o anticorpo mais importante em doenccedila hepaacutetica alcooacutelica Descritos em vaacuterias doenccedilas inflamatoacuterias e infecciosas Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida
Aparelho mitoacutetico Tipo Centriacuteolo Anticorpo anti-enolase em baixos tiacutetulos natildeo tem associaccedilatildeo cliacutenica definida Em altos tiacutetulos eacute sugestivo de Esclerose Sistecircmica
Aparelho mitoacutetico Tipo ponte Intercelular
Anticorpo anti Tubulina Pode ser encontrado no LES e na DMTC outros anticorpos ainda natildeo bem definidos podem gerar o mesmo padratildeo
Aparelho mitoacutetico Tipo NuMa2 Anticorpo anti-HsEg5 diversas condiccedilotildees auto-imunes com baixa especificidade
Fonte Dellavance et al 2003
37
Quadro 5 - Padrotildees de FAN mistos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Mistos Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos
Misto do tipo nucleolar homogecircneo e nuclear pontilhado grosso com placa metafaacutesica decorada em anel (cromossomos negativos)
Anticorpo anti-Ku Superposiccedilatildeo Polimiose e Esclerose Sistecircmica Podem ocorrer no LES e Esclerodermia
Misto do tipo nuclear e nucleolar pontilhado com placa metafaacutesica positiva
Anticorpo anti-topoisomerase (Scl-70) ES forma difusa Mais raramente pode ocorrer na Siacutendrome CREST e superposiccedilatildeo PolimiositeEsclerodermia
Misto do tipo Citoplasmaacutetico pontilhado fino denso e homogecircneo e nucleolar homogecircneo
Anticorpo anti rRNP LES frequumlentemente relacionado agrave Psicose Luacutepica
Misto do tipo nuclear pontilhado fino com fluorescecircncia do aparelho mitoacutetico
Anticorpo anti-NuMA1SS pode ocorrer tambeacutem em outras condiccedilotildees auto-imunes ou inflamatoacuterias crocircnicas
Fonte Dellavance et al 2003
Quadro 6 - Padrotildees de FAN nucleolares e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleolares Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos
Nucleolar Aglomerado
Anticorpo anti-Fibrilarina (U3-nRNP) Esclerose Sistecircmica (ES) especialmente com comprometimento visceral grave entre eles a hipertensatildeo pulmonar
Nucleolar Pontilhado
Anticorpo anti-NOR-90 ES tambeacutem descrito em outras doenccedilas do tecido conjuntivo poreacutem sem relevacircncia clinica definida Anticorpos anti-RNA polimerase I ES de forma difusa com tendecircncia para comprometimento visceral mais frequumlente e grave
Nucleolar Homogecircneo
Anticorpo anti-PMScl Siacutendrome de Superposiccedilatildeo de Polimiosite com Esclerose Sistecircmica Raramente encontrado em casos de Polimiosite ou Esclerose Sistecircmica sem superposiccedilatildeo cliacutenica Outros auto-anticorpos mais raros podem apresentar esse padratildeo
Fonte Dellavance et al 2003
De acordo com o 3deg Consenso (DELLAVANCE et al 2009) foram
comunicados dois novos padrotildees de fluorescecircncia por participantes Vaacuterios outros
membros testemunharam jaacute haver observado esses padrotildees O primeiro trata-se de
um padratildeo nuclear pontilhado fino aproximando-se da textura homogecircnea e com
placa metafaacutesica corada da mesma forma Sua associaccedilatildeo cliacutenica e identidade
imunoloacutegica natildeo estatildeo definidas Sua importacircncia deriva do fato de que pode ser
facilmente confundido com o padratildeo pontilhado fino denso e com o padratildeo
homogecircneo O segundo trata-se de um padratildeo citoplasmaacutetico em forma de
pequenos bastotildees (rods) e ciacuterculos (rings) que aparentemente estaacute associado agrave
38
infecccedilatildeo pelo HCV Haacute estudos em curso por alguns grupos de pesquisa com a
finalidade de estabelecer sua identidade imunoloacutegica
Como ainda natildeo estatildeo definitivamente caracterizados esses dois novos
padrotildees foram considerados preliminares e o 3deg Consenso recomendou que os
mesmos fossem completamente caracterizados e apresentados na proacutexima versatildeo
do Consenso (DELLAVANCE et al 2009)
39
2 JUSTIFICATIVA
As inflamaccedilotildees do fiacutegado provocadas pelos viacuterus hepatotroacutepicos atingem
milhotildees de pessoas e representam significativos problemas de sauacutede puacuteblica em
todo o mundo No Brasil a Regiatildeo Norte responde por um significativo percentual
dos portadores de hepatite C Dentre as manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo
pelo viacuterus C as doenccedilas autoimunes tecircm significativo impacto na evoluccedilatildeo cliacutenica
desses pacientes A presenccedila de anticorpo antinuacutecleo eacute um marcador importante de
autoimunidade e apesar de existirem trabalhos relatando a pesquisa desse fator em
portadores de viacuterus C tais estudos ainda natildeo foram realizados na nossa regiatildeo
sobretudo correlacionando-se com o genoacutetipo do viacuterus responsaacutevel pela infecccedilatildeo
considerando que o genoacutetipo eacute um marcador de resposta ao tratamento ou
considerando que pacientes portadores do genoacutetipo 1 natildeo respondem
satisfatoriamente ao tratamento instituiacutedo pelo protocolo atual
21 ASPECTOS EacuteTICOS
A pesquisa a ser realizada apresenta relevacircncia social e natildeo perde o
sentido de sua destinaccedilatildeo soacutecio-humanitaacuteria (justiccedila e equidade)
Este trabalho adequa-se aos princiacutepios cientiacuteficos que o justificam e
apresenta possibilidade concreta de responder a incertezas tais como FAN e o
genoacutetipo viral em pacientes com infecccedilatildeo pelo viacuterus da hepatite C ldquoestatildeo
relacionadosrdquo
Segue rigorosamente os procedimentos descritos na Resoluccedilatildeo 19696-
CNSMS (BRASIL 1996) assegurando a confidenciabilidade e proteccedilatildeo da
identidade do sujeito da pesquisa no momento da afericcedilatildeo dos dados e sua
posterior utilizaccedilatildeo
Por tratar-se de um estudo que faraacute somente revisatildeo de soroteca os
participantes natildeo seratildeo submetidos a riscos de origem orgacircnica eou quiacutemica
40
3 OBJETIVOS
31 OBJETIVO GERAL
Estabelecer associaccedilatildeo entre a presenccedila de teste de FAN e o genoacutetipo
viral em pacientes portadores de infecccedilatildeo pelo HCV
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
I Identificar o padratildeo de fluorescecircncia do FAN em pacientes com diagnoacutestico
laboratorial de infecccedilatildeo pelo HCV
II Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados
pelo HCV de acordo com o gecircnero e a idade
III Identificar a prevalecircncia de FAN em pacientes infectados pelo HCV e natildeo
infectados
IV Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados
pelo HCV de acordo com as alteraccedilotildees bioquiacutemicas
41
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO)
Foi realizado um estudo transversal analiacutetico no Serviccedilo do Nuacutecleo de
Medicina Tropical da Universidade Federal do Paraacute (NMTUFPA) utilizando-se
pacientes oriundos da Fundaccedilatildeo Centro de Hemoterapia e Hematologia do Paraacute
(HEMOPA) e Plano de Assistecircncia ao Servidor (PASIASEP) com coleta de material
bioloacutegico para reconfirmaccedilatildeo do diagnoacutestico de hepatite C no periacuteodo de janeiro de
2009 a maio de 2010
411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C
A populaccedilatildeo de estudo consistiu de 51 pacientes admitidos no NMTUFPA
para reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica tratamento cliacutenico e acompanhamento ambulatorial
de ambos os gecircneros e independente da idade sem exclusatildeo dos pacientes com a
presenccedila de patologias associadas agrave condiccedilatildeo maior (motivadora da pesquisa)
oriundos da Fundaccedilatildeo HEMOPA e PAS
A amostra do grupo foi selecionada a partir da relaccedilatildeo dos prontuaacuterios
catalogados no laboratoacuterio de patologia do NMTUFPA
Os dados foram coletados atraveacutes dos resultados dos exames realizados
no soro de cada paciente O protocolo de coleta teve enfoque na identificaccedilatildeo
individual do paciente bem como a avaliaccedilatildeo cliacutenica dos resultados
412 Grupo de natildeo infectados
Foi utilizado um grupo controle de 100 amostras de soro de indiviacuteduos
doadores de sangue com sorologias negativas para HIV 1 e 2 HTLV 1 e 2 Siacutefilis
Doenccedilas de Chagas Hepatite B e para Hepatite C procedentes da fundaccedilatildeo
HEMOPA
42
42 MEacuteTODO
421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico
Foram colhidos em frasco sem anticoagulante 10ml de sangue perifeacuterico
dos 51 pacientes participantes da pesquisa A amostra sanguiacutenea de cada paciente
foi centrifugada o soro foi separado e colocado em frasco esteacuteril devidamente
identificado armazenado e resfriado de 2 a 8ordmC
Foi realizada no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais a
pesquisa soroloacutegica de anticorpos IgG anti-HCV por teste imunoenzimaacutetico (ELISA)
e os pacientes que apresentaram positividade tiveram seus resultados confirmados
atraveacutes de teacutecnicas moleculares (RT-PCR) e com identificaccedilatildeo do genoacutetipo viral
(genotipagem)
Foi realizado no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa a pesquisa
de FAN dos 51 pacientes selecionados utilizando as amostras existentes na
soroteca
422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C
Foram empregados testes soroloacutegicos de ELISA (Ensaio
Imunoenzimaacutetico) de 3ordf geraccedilatildeo utilizando-se de kits comerciais (kit ETI-AB-HCVK-
4 DiaSorin Itaacutelia) para detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos anti-HCV no soro dos
pacientes
As tiras (poccedilos) necessaacuterias para as reaccedilotildees foram retiradas da geladeira
com antecedecircncia de uma hora e deixadas agrave temperatura ambiente e os reagentes
homogeneizados rapidamente no voacutertex
O primeiro poccedilo da placa ficou o branco da reaccedilatildeo na sequecircncia da
microplaca de ELISA foi dispensado 200 microL do controle negativo em triplicata (trecircs
poccedilos) 200 microL do calibrador em duplicata (dois poccedilos) e 200 microL do controle positivo
em amostra uacutenica (um poccedilo)
Adicionou-se 200 microL do Diluente de Amostra em todos os poccedilos que
continham as amostras dos pacientes a serem dosadas na placa de ELISA
tomando cuidado para natildeo contaminar os poccedilos adjacentes
43
Dispensou-se 50 microL do Diluente do Reagente em todos os poccedilos de
controles calibradores e amostras cobrimos com adesivo para evitar evaporaccedilatildeo e
contaminaccedilatildeo das amostras e incubamos a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC
Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com
300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem diluiacuteda
Pipetou-se 100 microL de Conjugado Enzimaacutetico exceto no poccedilo do branco e
incubou-se a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se
cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com 300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem
diluiacuteda
Pipetou-se 100 microL de CromoacutegenoSubstrato em todos os poccedilos
Incubamos a microplaca protegendo-a de luz intensa e direta agrave temperatura
ambiente (18-24ordmC) por 15 min
Pipetou-se 100 microL de Aacutecido Sulfuacuterico em todos os poccedilos para ldquopararrdquo a
reaccedilatildeo enzimaacutetica e mediu-se a absorbacircncia da soluccedilatildeo obtida em leitor de ELISA
com filtro de 450 nM
O teste foi validado de acordo com os valores do controle de qualidade
preconizados pelo fabricante e que devem tanger os valores para o branco da
reaccedilatildeo le 0100 controle negativo le 0050 controle positivo ge 1000 e calibrador ge
1100 Para as amostras testadas os valores reagentes e natildeo reagentes para
pesquisa de anticorpos anti-HCV satildeo interpretados da seguinte maneira natildeo
reagentes com valores le 09 reagentes com valores ge 11 e indeterminados entre
os valores 09 ndash 11
423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia molecular
Nas amostras positivas pela sorologia (ELISA) realizou-se extraccedilatildeo do
RNA viral presente no soro do paciente utilizando kit comercial (QIAmp Viral RNA
kit Quiagen Alemanha) seguindo a teacutecnica adaptada no Laboratoacuterio de Patologia
Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais
Pipetou-se 560 microL de tampatildeo AVL (lise) contendo RNA em tubo de
centriacutefuga de 15 ml identificado adicionou-se 140 microL da amostra e homogenizou-se
em voacutertex por 15s incubando a temperatura ambiente (15-25degC) por 10 min Apoacutes
incubaccedilatildeo centrifugou-se rapidamente o tubo para remover partiacuteculas dispersas
44
Adicionou-se 560 microL de etanol (96-100) na amostra e homogenizou-se
no voacutertex por 15s centrifugando-se rapidamente para remover partiacuteculas dispersas
Depois cuidadosamente transferiu-se 630 microL para as colunas devidamente
identificadas centrifugou-se a 14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo
ficando soacute com a coluna para encaixar em outro tubo
Colocou-se o resto das amostras nas colunas devidas centrifugou-se a
14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo ficando soacute com a coluna para
encaixar em outro tubo Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW1) e
centrifugou-se por 1 min mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo
Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW2) e centrifugou-se por 4 min
mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo
Identificados os tubos para RNA colocou-se as colunas Adicionou-se 60
microL de tampatildeo para eluir (AVE) em cada amostra e centrifugou-se por 1 min
descartando a coluna e ficando com o tubo Colocou-se em banho-maria por 10 min
a 65degC centrifugado rapidamente e colocado no gelo As amostras extraiacutedas foram
congeladas e armazenadas em freezer a -20ordmC
O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado de acordo com a teacutecnica de
RT-PCR qualitativa com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das
Doenccedilas Tropicais da seguinte maneira para o Mix de uma amostra Tampatildeo 12
microL primer ou iniciador k10 1microL primer ou iniciador k11 1microL aacutegua ultrapura livre de
DNAse e RNAse 5 microL Enzima Taq polymerase One-Step (Invitrogen) 1 microL O
primer k10 constitui-se da sequecircncia GGC GAC ACT CCA CCA TRR e o primer k11
da sequecircncia GGT GCA CGG TCT ACG AGA CC
O volume do mix por amostra eacute de 20 microL e o volume da amostra (produto
da extraccedilatildeo) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As amostras
foram colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo eacute realizada a 42ordmC por 45 minutos
temperatura inicial de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 2 minutos seguida de 35 ciclos com
temperatura de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 54ordmC por 30
segundos de extensatildeo a 72ordmC por 45 segundos e temperatura de extensatildeo final de
72ordmC por 7 minutos e um hold de 4ordmC
Para visualizaccedilatildeo do produto dessa 1ordf PCR (RT-PCR) eacute feito um gel de
agarose a 1 (1g de agarose para 100mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de
etidium) que migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os
resultados foram visualizados atraveacutes de luz ultravioleta (UV) Os pacientes
45
positivos que apresentarem ldquobandardquo devem continuar os procedimentos e os
negativos que natildeo apresentarem ldquobandasrdquo deveratildeo ser liberados como
indetectaacuteveis por este meacutetodo
A 2ordf PCR (RFLP) foi responsaacutevel por fazer a amplificaccedilatildeo do cDNA
produto da 1ordf PCR Para esta etapa tambeacutem com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio
de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais foram necessaacuterios para o Mix de uma
amostra Tampatildeo 10X 25 microL DNTP 4 microL MgCl2 15 microL primer ou iniciador k15 1
microL primer ou iniciador k16 1 microL aacutegua ultrapura livre de DNAse e RNAse 125 microL
Enzima Taq platinum (Invitrogen) 05 microL O primer k15 constitui-se da sequecircncia
ACC ATR RAT CAC TCC CCT GT e o primer k16 da sequecircncia CAA GCA CCC TAT
CAG GCA GT
O volume do mix por amostra foi de 23 microL e o volume da amostra
(produto da 1ordf PCR) de 2 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As
amostras satildeo colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo se realiza a temperatura inicial
de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 4 minutos seguida de 35 ciclos com temperatura de
desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 55ordmC por 45 segundos de
extensatildeo a 72ordmC por 1 minuto e temperatura de extensatildeo final de 72ordmC por 7
minutos e um hold de 4ordmC
O produto da 2ordf PCR eacute observado atraveacutes de um gel de agarose a 1 (1g
de agarose para 100 mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que
migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os resultados
foram visualizados atraveacutes de luz UV (ultravioleta) Os pacientes positivos que
apresentaram ldquobandardquo (fragmento amplificado) se continuou os procedimentos e os
negativos que natildeo apresentaram ldquobandasrdquo foram repetidos para o procedimento da
2ordf PCR
424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem)
Os pacientes positivos para a 2ordf PCR foram submetidos agrave genotipagem
do viacuterus atraveacutes do meacutetodo de RFLP utilizando um par de enzimas de restriccedilatildeo
AVA II e RSA I Essa teacutecnica tambeacutem foi adaptada no Laboratoacuterio de Patologia
Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais
46
Na determinaccedilatildeo do genoacutetipo cada amostra eacute utilizada duas vezes
sendo uma reaccedilatildeo para AVA II e uma para RSA I portanto cada amostra teve dois
tubos correspondentes
Para a preparaccedilatildeo do mix de uma amostra para a enzima de restriccedilatildeo
AVA II (Promega) foram utilizados Buffer C X 30 2 microL aacutegua ultrapura livre de
DNAse e RNAse 125 microL AVA II 05 microL Para o mix de uma amostra de RSA I
(Invitrogen) satildeo necessaacuterios React 1 10X 2 microL aacutegua ultrapura libre de DNAse e
RNAse 11 microL RSA I 2 microL
O volume do mix por amostra foi de 15 microL e o volume da amostra
(produto da 2ordf PCR) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 20 microL para
cada frasco correspondente a sua enzima de restriccedilatildeo As amostras formatildeo ldquoparesrdquo
de tubos AVA II e RSA I e satildeo colocadas em banho-maria a 37ordmC overnight para
digerir (cortar) os fragmentos
Para visualizaccedilatildeo do produto da digestatildeo (RFLP) e verificaccedilatildeo dos
genoacutetipos foi preparado um gel de agarose a 2 (2g de agarose para 100 mL de
tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que migrou em cuba de eletroforese
com 100V 500A por 60 minutos Os resultados foram visualizados atraveacutes de luz UV
(ultravioleta) Os pacientes positivos apresentam ldquobandasrdquo (fragmentos) de
tamanhos diferentes O nuacutemero de bandas e sua disposiccedilatildeo no gel formaram
padrotildees de combinaccedilotildees correspondentes a cada genoacutetipo viral
425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas HEp-2
A pesquisa de auto-anticorpo contra antiacutegenos celulares foi realizada no
Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa pela teacutecnica de imunofluorescecircncia
indireta que os identifica atraveacutes da ligaccedilatildeo destes auto-anticorpos aos antiacutegenos do
substrato sendo esta ligaccedilatildeo revelada pela adiccedilatildeo de um soro com atividade Anti-
IgG conjugado agrave fluoresceiacutena
As amostras foram testadas utilizando-se um conjunto diagnoacutestico
comercial Antinuclear Antibody HEp-2 da Hemagen Diagnostics
Na primeira fase da reaccedilatildeo os soros diluiacutedos 140 colocados em contato
com o substrato durante 20 minutos seguido de lavagem com soluccedilatildeo salina
tamponada por 10 minutos Na segunda fase aplicacou-se a substacircncia
47
fluorescente sendo o conjugado diluiacutedo 130 deixando-se por 10 minutos seguida
de nova lavagem de 10 minutos e montagem da lacircmina com glicerina tamponada
Em cada lacircmina foram utilizados controle positivo e controle negativo
A leitura das lacircminas foi realizada em microscoacutepio de imunofluorescecircncia
marca Nikon modelo Eclipse E-200
Os criteacuterios morfoloacutegicos observados durante a leitura foram
a) aspecto da matriz nuclear
b) aspecto do nucleacuteolo
c) observaccedilatildeo de todos os estaacutegios de divisatildeo nuclear
d) aspecto do fuso mitoacutetico
e) aspecto do citoplasma
43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados coletados foram estruturados em um banco de dados no qual
tambeacutem foram confeccionadas tabelas e graacuteficos para representaccedilatildeo dos dados
Posteriormente foram analisados no programa Bioestat 50 para a geraccedilatildeo de
resultados estatiacutesticos que comprovassem a associaccedilatildeo de variaacuteveis pertinentes ao
estudo considerando o intervalo de confianccedila (IC) 95 e niacutevel α 5 (p-valor le 005)
isto eacute um achado seraacute considerado estatisticamente significante se valor de ldquoprdquo for
menor ou igual a 005 e seraacute considerado sem significacircncia estatiacutestica se esse valor
de ldquoprdquo for maior que 005
Nas variaacuteveis quantitativas foram realizadas as medidas de tendecircncia
central sendo calculado a meacutedia e a mediana com seus respectivos desvios
padrotildees O teste t foi usado para comparar as idades entre as amostras
O teste do Qui-quadrado e o teste G foram aplicados nas comparaccedilotildees de
n amostras independentes cujas proporccedilotildees observadas nas diversas modalidades
estiveram dispostas em tabelas de contigecircncia l x c onde se determinou as
proporccedilotildees observadas nas diferentes categorias e se estas tinham alguma
associaccedilatildeo
48
5 RESULTADOS
O Padratildeo de FAN em 100 dos 51 pacientes infectados pelo HCV e em
2 dos natildeo infectados pelo HCV ocorreu Citoplasmaacutetico
Com relaccedilatildeo agrave distribuiccedilatildeo dos pacientes por gecircnero observou-se uma
predominacircncia do gecircnero masculino (667) A faixa etaacuteria predominante foi a de 30
a 50 anos de idade (628) seguida da faixa etaacuteria compreendida entre 51 e 60
anos (196) No que diz respeito agrave naturalidade houve uma predominacircncia de
paraenses em 922 da amostra A maioria dos pacientes incluiacutedos no estudo foi
proveniente da Fundaccedilatildeo HEMOPA (98) por se tratarem de candidatos a doaccedilatildeo
de sangue (Tabela 1)
Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV segundo as caracteriacutesticas demograacuteficas janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Caracteriacutesticas demograacuteficas n Teste estatiacutestico Gecircnero
Masculino 34 667 Qui-quadrado Feminino 17 333 p = 00251
Total 51 1000
Idade (anos) lt 30 6 118 Qui-quadrado
30 a 40 16 314 p = 00094 41 a 50 16 314 51 a 60 10 196
gt 60 3 59 Total 51 1000
Naturalidade
Paraense 47 922 Qui-quadrado Macapaense 1 20 p lt 00001 Maranhense 1 20
Pernambucano 1 20 Gauacutecho 1 20
Total 51 1000
Procedecircncia Qui-quadrado HEMOPA 50 980 p lt 00001
IASEP 1 20 Total 51 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
49
Identificou-se no estudo a predominacircncia do genoacutetipo viral do tipo 1
(882) estando o genoacutetipo 3 presente em 118 dos casos Em 255 dos
pacientes foi observado uma positividade para FAN sendo que todos apresentaram
o padratildeo citoplasmaacutetico (Tabela 2)
Tabela 2 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV conforme os resultados laboratoriais de FAN citoplasmaacutetico e genotipagem janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Exames laboratoriais n Teste estatiacutestico
Genoacutetipo viral - HCV
Tipo 1 45 882 Qui-quadrado
Tipo3 6 118 p lt 00001
Total 51 1000
FAN Qui-quadrado
Positivo (citoplasmaacutetico) 13 255 p = 00008
Negativo 38 745 Total 51 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
Observou-se uma baixa positividade para o FAN tanto no gecircnero
masculino (294) quanto no gecircnero feminino (176) Natildeo houve diferenccedila
estatiacutestica significante entre os gecircneros e a anaacutelise do FAN (p = 05652) Isto eacute
independendo do gecircnero do paciente nada se poderaacute inferir se o mesmo teraacute maior
ou menor chance de possuir um FAN positivo ou negativo (Tabela 3)
Tabela 3 ndash Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
FAN (citoplasmaacutetico)
Gecircnero Teste estatiacutestico
(Teste G) Masculino Feminino
N N
Positivo 10 294 3 176
Negativo 24 706 14 824 p = 05652
Total 34 1000 17 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
Dentre os pacientes infectados o genoacutetipo viral tipo 1 e o tipo 3
predominaram no gecircnero masculino embora natildeo havendo diferenccedila significativa
entre os grupos (p=06376)(Tabela 4)
50
Tabela 4 - Relaccedilatildeo da genotipagem de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Gecircnero
Grupos estudados Teste estatiacutestico
(Teste G) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3
n n Masculino 29 644 5 833 p=06376 Feminino 16 356 1 167
Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa
Na faixa etaacuteria de 30 a 50 anos foi observada uma maior proporccedilatildeo (667)
do genoacutetipo viral do tipo 3 enquanto que para o genoacutetipo tipo 1 foi de 628 natildeo
tendo essa diferenccedila significacircncia estatiacutestica (Tabela 5)
Tabela 5 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e faixa etaacuteria - janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)
Idade (anos) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n
lt 30 04 118 0 00
30 a 40 15 314 3 500 p = 06401
41 a 50 15 314 1 167
51 a 60 08 196 2 333
gt 60 03 59 0 00 Total 45 1000 6 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
A anaacutelise descritiva das idades dos pacientes demonstrou que a meacutedia e
a mediana foi de 43 anos para aqueles com genoacutetipo viral tipo 1 no entanto para o
genoacutetipo viral tipo 3 a meacutedia foi de 44 e a mediana de 42 anos Observou-se que a
idade miacutenima dos pacientes com genoacutetipo viral-HCV do tipo 1 e 3 foi
respectivamente de 20 e 32 anos e a maacutexima foi de 68 e 57 anos perfazendo uma
amplitude total de 48 e 25 anos respectivamente Natildeo houve significacircncia estatiacutestica
entre as idades encontradas nos genoacutetipos 1 e 3 (Tabela 6 )
De acordo com o FAN citoplasmaacutetico a idade miacutenima dos pacientes com
FAN positivo e negativo foi respectivamente de 30 e 20 anos e a maacutexima foi de 53 e
68 anos perfazendo uma amplitude total de 23 e 48 anos respectivamente As
idades meacutedia e mediana foram respectivamente 435 e 46 anos nos pacientes com
o FAN positivo e meacutedia de 43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN
51
negativo Natildeo houve diferenccedila estatisticamente significativa entre as idades
encontradas nos pacientes com FAN positivo e negativo (Tabela 6)
Tabela 6 - Estudo descritivo da idade dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e presenccedila do FAN citoplasmaacutetico janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Grupos Estudados Genoacutetipo viral - HCV Auto anticorpo
Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 FAN (+) FAN (-) IDADE
Tamanho da amostra 45 6 13 38
Idade miacutenima 20 32 30 20
Idade maacutexima 68 57 53 68
Amplitude Total 48 25 23 48
Meacutedia Aritmeacutetica 43 44 435 43
Mediana 43 42 46 42
Desvio Padratildeo 107 93 78 113
Teste t p = 08363 p = 08809 Fonte Protocolo da pesquisa
Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos em que foram analisados AST
ALT ASTALT γ-GT e fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo
semelhantes dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e 3 natildeo
atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos
(Tabela 7)
Tabela 7- Distribuiccedilatildeo dos genoacutetipos dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Paracircmetros bioquiacutemicos
Genoacutetipo viral - HCV Teste estatiacutestico
(Teste t) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3
micro plusmn DP micro plusmn DP
AST 353 plusmn 219 328 plusmn 137 p = 07907
ALT 372 plusmn 321 288 plusmn 136 p = 05355
ASTALT 12 plusmn 07 14 plusmn 11 p = 06110
γ-GT 403 plusmn 38 302 plusmn 138 p = 02194
Fosfatase alcalina 1126 plusmn 443 1087 plusmn 376 p = 08349
Fonte Protocolo da pesquisa
Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos de AST ALT ASTALT γ-GT e
fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os
52
pacientes com FAN positivo e negativo natildeo sendo observada significacircncia
estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos de FAN (Tabela 8)
Tabela 8 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Paracircmetros bioquiacutemicos Auto anticorpos
Teste estatiacutestico (Teste t) Positivo Negativo
micro plusmn DP micro plusmn DP
AST 419 plusmn 238 326 plusmn 197 p = 01704
ALT 408 plusmn 29 346 plusmn 312 p = 05347
ASTALT 13 plusmn 08 12 plusmn 07 p = 05732
γ-GT 34 plusmn 21 409 plusmn 40 p = 04369
Fosfatase alcalina 1073 plusmn 345 1138 plusmn 462 p = 06431 Fonte Protocolo da pesquisa
Na comparaccedilatildeo entre resultados positivos e negativos do FAN
citoplasmaacutetico observou-se uma maior prevalecircncia da negatividade tanto em
pacientes natildeo infectados (98) como em pacientes infectados (745) pelo HCV
sendo essa diferenccedila estatisticamente significativa (plt00001) o que representa
uma natildeo associaccedilatildeo entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV
(Tabela 9)
Tabela 9 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico segundo a presenccedila ou ausecircncia de infecccedilatildeo por HCV janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
FAN (citoplasmaacutetico)
Pacientes Teste estatiacutestico (Teste G)
Infectados Natildeo infectados
N n
Positivo 13 255 2 2
Negativo 38 745 98 98 p lt 00001
Total 51 1000 100 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
Comparando-se os resultados do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos
viras observa-se que o resultado negativo eacute superior ao positivo em ambos os
genoacutetipos virais sendo 711 para o genoacutetipo viral 1 e 100 para o genoacutetipo viral 3
No entanto esta diferenccedila observada natildeo eacute estatisticamente significativa (p=02573)
(Tabela 10)
53
Tabela 10 - Distribuiccedilatildeo do FAN de acordo com o genoacutetipo viral janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
FAN (citoplasmaacutetico)
Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)
Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n
Positivo 13 289 0 00 p=02573 Negativo 32 711 6 1000
Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa
54
6 DISCUSSAtildeO
Desde o primeiro marcador soroloacutegico para diagnoacutestico do Lupus
Eritematoso Sistecircmico (LES) a ceacutelula LE descrita por Hargraves (1948) vaacuterios
substratos antigecircnicos foram utilizados para o estudo dos auto-anticorpos os quais
terminaram amplamente substituiacutedos pelas ceacutelulas HEp-2 Estas apresentam
significativas vantagens sobre os demais pela sua sensibilidade variedade de
antiacutegenos presentes e pelas facilidades morfoloacutegicas para o seu estudo
O uso da imunofluorescecircncia indireta para a visualizaccedilatildeo dos anticorpos
antinucleares nas ceacutelulas HEp-2 permite o reconhecimento de mais de 30 diferentes
padrotildees de fluorescecircncia como nucleares nucleolares da membrana nuclear do
aparelho mitoacutetico e citoplasmaacutetico todos satildeo proporcionados por diferentes auto-
anticorpos
A partir do 1deg Consenso Brasileiro para Padronizaccedilatildeo dos Laudos de FAN
(HEp-2) os criteacuterios para o preparo interpretaccedilatildeo da fluorescecircncia e nomenclatura
dos resultados passaram a ser normatizados Alguns padrotildees de fluorescecircncia satildeo
relativamente inespeciacuteficos outros satildeo ocasionados por uma gama restrita de auto-
anticorpos e outros ainda por um uacutenico auto-anticorpo (DELLAVANCE et al
2002) Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a tornaacute-las
imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo (DE
LARANAGA et al 2000)
Apesar do padratildeo de fluorescecircncia na maioria das vezes natildeo se pode
identificar o anticorpo presente ele pode sugerir ao cliacutenico qual o proacuteximo passo a
ser dado na investigaccedilatildeo da sua especificidade Os resultados encontrados devem
estar em associaccedilatildeo com a cliacutenica os padrotildees de fluorescecircncia e os tiacutetulos
alcanccedilados com a diluiccedilatildeo preacutevia (DELLAVANCE et al 2003)
No presente estudo a analise de 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo Viacuterus da
Hepatite C esteve presente o anticorpo-antinuclear (ANA FAN) em 13 (255) dos
pacientes e todos eram padratildeo citoplasmaacutetico corroborando com outros estudos
encontrados na literatura como
Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de
pacientes infectados pelo viacuterus HIV com Hanseniacutease e co-infectados com
Hanseniacutease HIV Ela obteve respectivamente as seguintes taxas de prevalecircncias
32 333 e 478 Em todos os grupos neste estudo houve predomiacutenio do
55
padratildeo citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear soacute foi observado entre os pacientes com
hanseniacutease (91) e co-infectados (237)
Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de
pacientes infectados pelo viacuterus da Dengue e viacuterus linfotroacutepico de ceacutelulas T humanas
HTLV-12 e controle Normais e obteve respectivamente as seguintes taxas de
prevalecircncias 40 40 e 2 Em todos os grupos houve predomiacutenio do padratildeo
citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear foi observado entre os pacientes com dengue
(67) e HTLV 12 (133)
Segundo Andrade et al (2002) Dellavance et al (2005) Dellavance e
Andrade et al (2007) o predomiacutenio do padratildeo de FAN do tipo citoplasmaacutetico indica
que determinados padrotildees de fluorescecircncia satildeo mais especiacuteficos de doenccedila auto-
imune enquanto outros ocorrem em indiviacuteduos com enfermidades natildeo auto-imunes
por ser o citoplasma celular rico em proteiacutenas para as quais auto-anticorpos naturais
apresentam afinidade moderada eacute comum observar positividade para FAN em
indiviacuteduos sadios cujo significado ainda natildeo eacute entendido completamente
O padratildeo Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina que pode ser
encontrado em Hepatite auto-imune Cirrose Hepatite C Hepatocarcionoma entre
outros Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica
definida Um resultado positivo pode estar ou natildeo associado a uma patologia assim
como poderaacute ou natildeo vir a apresentar uma doenccedila auto-imune com o passar do
tempo (DELLAVANCE et al 2003) Neste estudo natildeo foi feito avaliaccedilatildeo prospectiva
dos resultados embora todos sejam FAN citoplasmaacuteticos
Os achados de FAN positivo em populaccedilotildees sadias ou sem doenccedilas auto-
imunes tambeacutem jaacute observado por Leser et al (2004) que em 394 pacientes com
FAN-HEp-2 positivo natildeo encontraram nenhum paciente com doenccedila auto-imune
Outro exemplo estaacute no padratildeo citoplasmaacutetico de pontos isolados
estudado por Laurino et al (2006) presente em indiviacuteduos sem evidecircncia de auto-
imunidade mas tambeacutem em indiviacuteduos com acometimento de doenccedilas auto-imunes
sistecircmicas e natildeo-especiacuteficas
Os dados apresentados corroboram com este estudo em que foi
observado a presenccedila do auto-anticorpo em 2 (2 ) dos 100 indiviacuteduos sadios do
grupo controle todos com padratildeo citoplasmaacutetico
56
Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a
tornaacute-las imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo
(DE LARANAGA et al 2000)
Nas Infecccedilotildees agudas espera-se que a resposta auto-imune diminua a
medida que os viacuterus satildeo eliminados Entretanto alguns trabalhos sugerem que em
indiviacuteduos geneticamente susceptiacuteveis as reaccedilotildees auto-imunes possam persistir
apesar do clareamento viral uma vez que o gatilho imunoloacutegico foi ativado e natildeo
houve desativaccedilatildeo (DE LARANAGA et al 2000 SAKKAS et al 2008)
Ramos-Casals et al (2009) no estudo Doenccedilas Sistecircmica Auto-Imunes
em Pacientes com Infecccedilatildeo pelo (72) dos pacientes eram do gecircnero feminino e
(28) do masculino(ANA FAN) em 61 dos pacientes o que se diferem deste
trabalho eacute que dos 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo (667) eram do gecircnero
masculino e (333) eram do gecircnero feminino com meacutedia de idade de 430 (plusmn107)
anos com presenccedila de anticorpo-antinuclear em 13 (255) com meacutedia e mediana
respectivamente de 435 e 46 anos nos pacientes com o FAN positivo e meacutedia de
43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN negativo
Alter (1995) em sua pesquisa natildeo observou associaccedilatildeo entre o risco de
infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas designadas por gecircnero idade e raccedila Na
referida pesquisa foram estudados 51 pacientes com idade meacutedia de 430 (+- 107)
anos 34 (667) eram do gecircnero masculino e 17 (333) do gecircnero feminino todos
em fase preacute-tratamento assintomaacuteticos natildeo permitindo avaliar os risco da
infecccedilatildeoSegundo Pordeus et al (2008) a ocorrecircncia destes auto-anticorpos
indicaria um prognoacutestico desfavoraacutevel Perperas Mcfarlane e Mcsorley (1986)
sugeriram que os auto-anticorpos poderiam estar envolvidos na progressatildeo ou no
desenvolvimento de hepatites crocircnicas possivelmente por um distuacuterbio no controle
da auto-reatividade Outros estudos questionam a participaccedilatildeo dos auto-anticorpos
no processo de transiccedilatildeo para cronicidade das hepatites agudas virais poreacutem os
resultados natildeo satildeo convincentes (SHOENFELD ROSE 2004)
Lopez Seia e Roy (1998) demonstraram a presenccedila de anticorpo anti-
actina em baixos tiacutetulos em crianccedilas com hepatite aguda por curto periacuteodo de
tempo poreacutem nenhuma associaccedilatildeo com gravidade da agressatildeo hepaacutetica foi
descrita
Neste estudo a presenccedila dos auto-anticorpos em (255) dos pacientes
com infecccedilatildeo pelo HCV natildeo puderam ser relacionada com a gravidade da doenccedila
57
pois este estudo foi realizado em pacientes receacutem diagnosticados entatildeo seria
necessaacuterio um acompanhamento destes por um periacuteodo maior de tempo com a
finalidade de concluir esta afirmativa Apesar da presenccedila transitoacuteria de auto-
anticorpos jaacute ter sido descrita em doenccedilas virais comuns a associaccedilatildeo entre a
presenccedila de auto-anticorpos e a gravidade das doenccedilas necessita de comprovaccedilatildeo
Passaleva Massai e Leoncini (1983) avaliaram 302 pacientes com
hepatites agudas virais e encontraram complexos imunes circulantes (CIC) em
516 dos pacientes com frequumlecircncia significativamente maior em hepatite aguda
Nenhuma associaccedilatildeo entre a presenccedila de imuno-complexos e o niacutevel de
aminotransferases ou bilirrubina foi encontrada Segundo Andrade et al (2002)
Dellavance et al (2005) Andrade et al (2007) nos pacientes do estudo foi feita a
relaccedilatildeo entre a presenccedila dos auto-anticorpos e niacuteveis de aminotransferases e as
elevaccedilotildees natildeo tiveram significacircncia poreacutem houve associaccedilatildeo do genotipo viral 1
Nos paracircmetros bioquiacutemicos analisados em relaccedilatildeo aos genoacutetipos houve uma
distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e
3 natildeo atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os
grupos Segundo Wilson (1997) trecircs estudos mostraram correlaccedilatildeo entre niacuteveis
altos de alanina aminotransferase e atividade histoloacutegica da doenccedila hepaacutetica
Poreacutem nos pacientes considerados individualmente o valor preditivo dessa
associaccedilatildeo foi baixo enquanto muitos deles com enzimas normais apresentavam
graves alteraccedilotildees histoloacutegicas No presente estudo natildeo foi observada associaccedilatildeo entre os niacuteveis de
aminotransferases e a cronificaccedilatildeo da hepatite viral pois nem todos os pacientes do
estudo apresentavam resultado de bioacutepsia hepaacutetica
Alter et al (1999) afirmam que no Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b
(63) e 3a (313) em estudo realizado em Goiacircnia onde foi observada uma
maior prevalecircncia do genoacutetipo 1 seguida do genoacutetipo 3 em doadores de sangue e
hemofiacutelicos (DELLAVANCE ANDRADE et al 2007) Estando esses dados em
acordo com esta pesquisa que com genotipagem do viacuterus da hepatite C que
identificou o genoacutetipo 1 em 45 (882) seguidos pelo genoacutetipo 3 que foi
identificado em 6 (118) dos pacientes com infecccedilatildeo pelo HCV Em um estudo realizado na Franccedila com 13 pacientes luacutepicas infectadas
pelo viacuterus C 8 apresentavam o RNA viral sendo o genoacutetipo 1 presente em cinco
58
(625) casos seguido do genoacutetipo 3 (375) (PERLEMUTER et al 2000) dados
que se assemelham aos do presente estudo embora o estudo natildeo tenha incluiacutedo
pacientes com outras infecccedilotildees associadas ao HCV Eacute importante ressaltar que
estudos sobre genotipagem do HCV em indiviacuteduos com doenccedilas reumaacuteticas satildeo
raros
No presente estudo houve uma frequumlecircncia baixa de positividade para o
FAN nos pacientes com genoacutetipo 1 e genoacutetipo 3 Natildeo havendo significacircncia
estatiacutestica entre os pacientes com genoacutetipo 1 e 3
Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter
implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave menor
resposta agrave terapia antiviral (BRUNO et al1997) o que natildeo foi avaliado neste estudo
pois apesar de (882) dos pacientes serem genoacutetipo 1 todos estavam em fase de
reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica seja preacute- tratamento Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila
poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses
autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis
vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo
hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja
quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a
concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave
hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em
parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)
59
7 CONCLUSOtildeES
minus O padratildeo dos auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares encontrados nos
dois grupos estudados foi o citoplasmaacutetico
minus A prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares no grupo com
infecccedilatildeo pelo VHC foi significativamente maior do que no grupo controle
minus Nos resultados de FAN citoplasmaacutetico haacute uma maior prevalecircncia da
negatividade em pacientes infectados pelo HCV e natildeo infectados sendo
essa diferenccedila estatisticamente significativa conferindo a natildeo associaccedilatildeo
entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV
minus Os resultados negativos do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos viras eacute
superior aos positivos em ambos os genoacutetipos virais entretanto esta diferenccedila
natildeo eacute estatisticamente significativa
minus Houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos
celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado
minus Natildeo houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos
celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado com
relaccedilatildeo ao gecircnero onde predominou o gecircnero masculino nos dois grupos
minus Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter
implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave
menor resposta agrave terapia antiviral o que natildeo foi avaliado neste estudo pois
os pacientes estavam em fase preacute tratamento sugerindo que estes pacientes
sejam avaliados futuramente
minus A formaccedilatildeo dos auto-anticorpos parece ser mais uma consequumlecircncia do que
uma causa da agressatildeo hepaacutetica
minus A negatividade do FAN ndash Hep 2 foi maior que a positividade mas todos os
FAN positivos pertenciam ao genoacutetipo viral tipo 1 nos pacientes infectados
pelo HCV
minus Nesta pesquisa os resultados de PCR o RNA-HCV de reconfirmaccedilatildeo foi
positivo para o anti-HCV em todos os soros analisados mostrando assim
que estes pacientes eram portadores de infecccedilatildeo por viacuterus C ou seja natildeo
houve falso positivo anteriormente poreacutem todos eram assintomaacuteticos
dificultando a conclusatildeo de ser ou natildeo uma infecccedilatildeo persistente
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APEcircNDICES
68
APEcircNDICE A - TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Vocecirc estaacute sendo convidado para fazer parte de uma pesquisa que estaacute sendo desenvolvida pela Universidade Federal do Paraacute no Nuacutecleo de Medicina Tropical intitulada AUTOANTICORPOS CONTRA ANTIacuteGENOS CELULARES E SUA CORRELACcedilAtildeO COM O GENOacuteTIPO VIRAL EM PACIENTES COM INFECCcedilAtildeO PELO VIacuteRUS DA HEPATITE C (HCV)
O Objetivo da pesquisa eacute fazer uma correlaccedilatildeo do anticorpo antinuacutecleo (FAN) e o genoacutetipo viral em pacientes com hepatite C e o estaacutegio da doenccedila hepaacutetica a partir da histologia sempre que permitidos e correlacionar ao diagnoacutestico
Caso vocecirc participe da pesquisa seraacute necessaacuterio que forneccedila uma amostra de sangue (2ml)
O uacutenico inconveniente que vocecirc poderaacute experimentar eacute a dor provocada pela agulha na hora da coleta de sangue bem como pequenos hematomas que possam vir a ocorrer e que natildeo causam danos
Essa pesquisa natildeo oferece riscos as praacuteticas satildeo de uso rotineiro e seratildeo utilizados materiais esterilizados e descartaacuteveis como agulhas seringas etc
Estaacute garantido a vocecirc todas as informaccedilotildees que vocecirc queira antes durante e depois da pesquisa
A sua participaccedilatildeo neste estudo eacute voluntaacuteria Vocecirc tem a liberdade de recusar participar da pesquisa a qualquer momento
As informaccedilotildees relacionadas agrave pesquisa poderatildeo ser inspecionadas pelos pesquisadores que executam a pesquisa e pelas autoridades legais no entanto se qualquer informaccedilatildeo for divulgada em relatoacuterio publicaccedilatildeo ou qualquer outro meio isto seraacute feito de forma codificada para manter o caraacuteter confidencial
Todas as despesas necessaacuterias para a realizaccedilatildeo do estudo natildeo satildeo de sua responsabilidade assim como a sua participaccedilatildeo na pesquisa na seraacute remunerada (vocecirc natildeo receberaacute qualquer valor em dinheiro)
Quando os resultados forem divulgados natildeo apareceraacute seu nome e sim um coacutedigo
_____________________________________
Assinatura do Pesquisador Responsaacutevel NomeAna Maria Almeida Souza EndRodovia Maacuterio Covas 1426 ndash Cond Green Garden casa 41 Fone(91) 32352665 81197217 RegConselhoCRM 1508
69
APEcircNDICE B - CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Declaro que li as informaccedilotildees acima sobre a pesquisa que me sinto
perfeitamente esclarecido sobre o conteuacutedo da mesma assim como seus riscos e
benefiacutecios Declaro ainda que por minha livre vontade aceito participar da pesquisa
cooperando com a coleta de material para exame
Beleacutem _________
_________________________________________
Assinatura do sujeito da pesquisa ou do
responsaacutevel
70
ANEXOS
71
- Assinatura do Pesquisador Responsaacutevel
-
- Beleacutem _________
-
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
AAN Anticorpos antinucleares
aCL Anticorpos anticardiolipina
AIDS Sindrome da Imunodeficiecircncia Adquirida
ALT Alanina aminotransferase
ANCA Anticorpos anti-citoplasma de neutroacutefilos
Anti-CCP Antipeptiacutedeo citrulinado ciacuteclico
Anti-β2GPI Anticorpos anti-β2 glicoproteiacutena I
Cdna DNA complementar
CEP Comitecirc em Eacutetica e Pesquisa
CHC Carcinoma hepatocelular
CIC Complexos imunes circulantes
DDTC Doenccedilas difusas do tecido conjuntivo
DMTC Doenccedila mista do tecido conjuntivo
E1 Proteiacutena do envoltoacuterio
ENH Eritema Nodoso Hansecircnico
ESP Esclerose sistecircmica progressive
FAN Fator Anti-nuacutecleo
FR Fator reumatoacuteide
HBV Viacuterus da hepatite B
HCV Viacuterus da Hepatite C
HEMOPA Fundaccedilatildeo Centro de Hemoterapia e Hematologia do Paraacute
HIV Viacuterus da imunodeficiecircncia humana
HIV-1 Viacuterus da imunodeficiecircncia humana1
IAH Iacutendice de atividade histoloacutegica
LE Lupus Eritematoso
LES Luacutepus eritematoso sistecircmico
MS Ministeacuterio da Sauacutede
mtDNA DNA mitrocondrial
NANBH Hepatite natildeo-A natildeo-B
NMT Nuacutecleo de Medicina Tropical
OMS Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede
PCR Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia
Rh Tipo sanguiacuteneo
RNA Aacutecido ribonucleacuteico
RT-PCR Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia-em tempo real
SAF Siacutendrome antifosfoliacutepide
SIDA Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida
SS Siacutendrome de Sjoumlgren
UFPA Universidade Federal do Paraacute
UV ultravioleta
VHA Viacuterus da Hepatite A
VHC Viacuterus da Hepatite C
VHCHCV Hepatite C
VV Hanseniacutease generalizada
SUMAacuteRIO 1 INTRODUCcedilAtildeO 15 11 HEPATITE C (VHCHCV) 15 111 Consideraccedilotildees Gerais 15 112 Agente Etioloacutegico 16 113 Epidemiologia 17 114 Modo de Transmissatildeo 18 115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica 19 116 Diagnoacutestico 23 12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC 25
13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC 26
14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE 27
15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES AGUDAS VIRAIS 31
16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN 32 2 JUSTIFICATIVA 39 21 ASPECTOS EacuteTICOS 39 3 OBJETIVOS 40
31 OBJETIVO GERAL 40
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 40 4 MATERIAL E MEacuteTODOS 41 41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO) 41 411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C 41 412 Grupo de natildeo infectados 41 42 MEacuteTODO 42 421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico 42 422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C 42 423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia
molecular 43
424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem) 45 425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas
HEp-2 46 43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 47 5 RESULTADOS 48 6 DISCUSSAtildeO 54 7 CONCLUSOtildeES 59 REFEREcircNCIAS 60 APEcircNDICES 67 ANEXOS 70
15
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 HEPATITE C (VHCHCV)
111 Consideraccedilotildees Gerais
As hepatites virais satildeo doenccedilas causadas por diferentes agentes
etioloacutegicos de distribuiccedilotildees universais que tecircm em comum o hepatotropismo
Possuem semelhanccedilas do ponto de vista cliacutenico-laboratorial mas apresentam
importantes diferenccedilas epidemioloacutegicas quanto agrave sua evoluccedilatildeo (FERREIRA
SILVEIRA 2004) Desde a descriccedilatildeo e definiccedilatildeo em 1989 (CHOO et al 1989 apud
RIBEIRO et al 2007) tornou-se evidente sua associaccedilatildeo com uma grande
variedade de manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas desordens reumaacuteticas e auto-imunes
(ALMEIDA 2010)
A infecccedilatildeo pelo VHCHCV acarreta inflamaccedilatildeo hepaacutetica e esteatose
podendo evoluir para fibrose hepaacutetica e cirrose em indiviacuteduos cronicamente
infectados estes com grande risco de desenvolvimento de carcinoma hepatocelular
(RIBEIRO et al 2007) Essas complicaccedilotildees tardias ocorrem em um periacuteodo em
geral superior a 20 anos apoacutes o iniacutecio da infecccedilatildeo A avaliaccedilatildeo filogeneacutetica das
sequumlecircncias do VHCHCV investigadas em vaacuterias regiotildees geograacuteficas sugere que
existam pelo menos seis genoacutetipos principais designados pelos nuacutemeros de 1 a 6 e
pelo menos 30 subtipos designados por letras minuacutesculas Nos Estados Unidos
prevalecem os genoacutetipos 1a (60) e 1b (20) Os tipos 5 e 6 satildeo mais encontrados
no sudeste e sul da Aacutefrica O tipo 4 eacute predominante na Aacutefrica Central e no Oriente
Meacutedio No Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b (63) e 3a (313) (BASSIT et
al 1999 apud RIBEIRO et al 2007) As informaccedilotildees sobre as causas que
determinam o curso evolutivo da doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos
progressos que haacute no campo do diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHCHCV Uma
questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo genoacutetipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de
lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o genoacutetipo 1 (1b) cursa com lesotildees
histoloacutegicas mais graves
As uacuteltimas deacutecadas foram de notaacuteveis conquistas no que se refere agrave
prevenccedilatildeo e ao controle das hepatites virais Entre as doenccedilas endecircmico-
epidecircmicas que representam problemas importantes de sauacutede puacuteblica no Brasil
16
salientam-se as Hepatites Virais cujo comportamento epidemioloacutegico no nosso paiacutes
e no mundo tem sofrido grandes mudanccedilas nos uacuteltimos anos
Antes da seleccedilatildeo rigorosa dos doadores de sangue em 1991 o
VHCHCV era a maior causa de hepatite poacutes-transfusional Atualmente permanece
como tal em casos esporaacutedicos (CONTE 2000) Os grupos considerados de risco
satildeo pessoas que receberam transfusatildeo de sangue antes de 1992 usuaacuterios de
drogas injetaacuteveis profissionais de sauacutede que lidam com sangue pacientes de
hemodiaacutelise e com menor risco pessoas tatuadas ou com piercings (CLEMENTE
ONO-NITA 2007)
A melhoria das condiccedilotildees de higiene e de saneamento das populaccedilotildees a
vacinaccedilatildeo contra a Hepatite B (HBV) e as novas teacutecnicas moleculares de diagnoacutestico
do viacuterus da Hepatite estatildeo entre esses avanccedilos importantes (BRASIL 2008)
112 Agente Etioloacutegico
O VHCHCV um viacuterus aacutecido ribonucleacuteico (RNA) da famiacutelia Flaviviridae
representa a principal causa da previamente denominada hepatite natildeo-A natildeo-B
(SANTOS 2009) Foi identificado e isolado a partir de um clone derivado de um
genoma NANBH semelhante aos togaviridae ou flaviviridae (SAADE 2008) e
visualizado a imunoeletromicroscopia como partiacutecula de 55 a 65 nm de diacircmetro
com projeccedilotildees espiculares e de morfologia muito semelhante aos flaviviridae Aleacutem
disso estas partiacuteculas reagiram especificamente com anticorpos mono e policlonais
do conteuacutedo proteacuteico do envelope do VHC (HIRANUMA et al 1994 apud CONTE
2000)
O agente etioloacutegico do HCV natildeo eacute uma partiacutecula homogecircnea e apresenta
uma taxa alta de mutaccedilatildeo levando-o a uma heterogeneicidade genocircmica cujo
resultado eacute um grande nuacutemero de genoacutetipos (1a 1b 2a 2b 3a 3b 4 5 6)
(AUGUSTO LOBATO 2003) Natildeo haacute evidecircncias de variantes natildeo patogecircnicas O
genoacutetipo 1b eacute o que apresenta maior virulecircncia e pior resposta ao tratamento
(LAUER WALKER 2001 apud SOUZA 2007) No Brasil dados obtidos a partir de
casos isolados e estudos de pequenas amostragens indicam que o genoacutetipo 1b
ocorre em cerca de 30 a 40 dos casos o 1a em cerca de 20 1a e 1b em 20
o 3a em cerca de 28 (FOCACCIA 2004)
17
113 Epidemiologia
De acordo com a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) a HCV eacute uma
questatildeo de sauacutede puacuteblica e tambeacutem a principal causa de transplante de fiacutegado no
Brasil (SOCIEDADE BRASILEIRA DE HEPATOLOGIA 2005) Eacute estimada uma
prevalecircncia em torno de 10 para a infecccedilatildeo pelo VHC na populaccedilatildeo mundial
(KILLEMBERG 2000) Nos Estados Unidos cerca de 27 milhotildees de pessoas estatildeo
infectadas pelo viacuterus (BRASIL 2006)
De acordo com Ferreira e Silveira (2004) no Brasil o nuacutemero de pacientes
infectados eacute incerto relacionado geralmente a alguns estados e municiacutepios e o
esclarecimento dos agentes causadores das hepatites cuja identificaccedilatildeo requer
teacutecnicas laboratoriais complexas de biologia molecular eacute realizado de maneira
insuficiente Por outro lado a progressiva integraccedilatildeo entre as instacircncias gestoras
dos programas de vigilacircncia e controle das doenccedilas com grupos de pesquisa e
desses com os serviccedilos (FERREIRA SILVEIRA 2004 p 473) e a disponibilidade
dos bancos de dados nacionais mais confiaacuteveis apontam para novos e melhores
caminhos (BRASIL 2005b)
A OMS alerta que o Paiacutes deve se preparar para uma ldquoexplosatildeordquo da
epidemia a partir de 2011 (BRASIL 2005b) Outra preocupaccedilatildeo eacute que as pessoas
que receberam sangue antes de 1992 tecircm mais chances de estarem infectadas na
eacutepoca o sangue destinado agraves transfusotildees natildeo era analisado para detecccedilatildeo da HCV
porque o viacuterus natildeo era conhecido e natildeo havia exames especiacuteficos (BRASIL 2005b)
A prevalecircncia da infecccedilatildeo nos doadores de sangue sadios varia de 001-002 no
Reino Unido e no norte da Europa 1-15 no sul da Europa 65 na Aacutefrica
equatorial e de ateacute 20 no Egito (CONTE 2000)
De acordo com a OMS a cada grupo de 50 pessoas no Brasil uma tem
hepatite e de dez portadores apenas um sabe (STRAUSS 2001) Satildeo dois milhotildees
de infectados no Paiacutes Denominada epidemia silenciosa calcula-se que 170 milhotildees
de indiviacuteduos no mundo estejam contaminados pelo viacuterus C a forma mais grave da
doenccedila Ainda de acordo com a OMS o nuacutemero de brasileiros viacutetimas da
enfermidade eacute bem maior do que o estimado pelo Ministeacuterio da Sauacutede (TRINDADE
2005)
18
Por ocasiatildeo da Conferecircncia Internacional de Consenso sobre HCV em Paris
(LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999) concluiu-se que a hepatite crocircnica por viacuterus
C eacute um problema grave de sauacutede puacuteblica sendo sua prevalecircncia mundial estimada
em 3 (de 01 a 5 segundo os vaacuterios paiacuteses) por tanto havendo no mundo
todo cerca de 150 milhotildees de portadores crocircnicos do VHCHCV 4 milhotildees nos EUA
e 5 milhotildees na Europa Ocidental Na Europa Oriental a prevalecircncia eacute maior ainda
114 Modo de Transmissatildeo
A HCV eacute transmitida pelo sangue Natildeo haacute comprovaccedilatildeo de contaacutegio por
meio de fluidos corporais como saliva suor laacutegrimas secircmen ou leite materno
Tambeacutem deixa de ocorrer por meio de abraccedilos beijos uso dos mesmos copos ou
roupas Especialistas afirmam que a contaminaccedilatildeo atraveacutes de relaccedilotildees sexuais eacute
possiacutevel mas rara Quando detectada de maneira precoce a enfermidade tem
tratamento inclusive gratuito aleacutem de cura (BRASIL 2006)
Dentre os fatores de risco para transmissatildeo outros aleacutem da transfusatildeo de
sangue o uso de drogas iliacutecitas o comportamento sexual de alto risco e variaacuteveis
socioeconocircmicas representadas pelo grau de escolaridade e renda familiar Natildeo foi
observada associaccedilatildeo entre o risco de infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas
designadas por gecircnero idade e raccedila (ALTER 2007) O risco de transmissatildeo sexual
do VHCHCV eacute miacutenimo A contaminaccedilatildeo intrafamilial natildeo-sexual eacute consideraacutevel
particularmente quando um dos enfermos tem hepatopatia grave e ou carga viral
elevada (risco 110) (CONTE 2000)
A praacutetica de tatuagem fornece dados conflitantes sabendo-se que os
liacutequidos usados para esterilizar os instrumentos usados satildeo ineficazes
Karmochkine et al (1998 apud CONTE 2000) observaram que
aproximadamente 80 dos pacientes contraem o viacuterus atraveacutes da toxicomania
intravenosa ou transfusotildees de sangue ou de derivados Os restantes meios de
transmissatildeo e de contaacutegio satildeo a hemodiaacutelise os transplantes de oacutergatildeos picadas
acidentais profissionais e transmissatildeo vertical matildee-crianccedila Em 20 a 40 dos
casos natildeo se consegue determinar o modo de contaminaccedilatildeo A transmissatildeo da
hepatite crocircnica por viacuterus C pode ser prevenida (KARMOCHKINE et al 1998 apud
CONTE 2000)
19
As duas fontes de contaminaccedilatildeo satildeo a toxicomania endovenosa e a
administraccedilatildeo de produtos de origem sanguumliacutenea Esta uacuteltima praticamente
eliminada desde 1991 com a introduccedilatildeo dos testes ELISA 2 na seleccedilatildeo
aprimorada de doadores de sangue (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998
apud CONTE 2000)
A transmissatildeo sexual eacute rara com menos de 3 em parceiros estaacuteveis e
ocorre principalmente em pessoas com muacuteltiplos parceiros e com praacutetica sexual de
risco (sem uso de preservativo) ndash para os indiviacuteduos com parceiros muacuteltiplos o uso
de preservativos eacute indicado (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998 apud
CONTE 2000)
A gravidez natildeo estaacute contra-indicada nas mulheres infectadas pelo
VHCHCV A transmissatildeo vertical matildee-crianccedila eacute rara (menor de 6) O tipo de parto
(natural ou cesaacuterea) natildeo tem influecircncia O aleitamento eacute permitido A transmissatildeo
nosocomial eacute prevenida eficazmente de modo convencional (KARMOCHKINE et
al 1998 apud CONTE 2000)
115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica
A infecccedilatildeo aguda pode passar clinicamente despercebida ou evoluir para
hepatite fulminante Aproximadamente 850 das pessoas infectadas agudamente
vatildeo desenvolver uma viremia persistente tornando-se dessa forma indiviacuteduos
infectados crocircnicos Depressatildeo irritabilidade dores no corpo mal-estar febre
naacuteuseas e falta de apetite satildeo alguns dos sintomas mais frequumlentes embora a
maioria dos casos natildeo apresente nenhum sintoma (ALTER 2007)
A cirrose eacute pouco observada em pessoas que apresentam niacuteveis
persistentemente baixos das transaminases mas a elevaccedilatildeo destas natildeo eacute
representativa do grau de fibrose hepaacutetica Dessa forma a bioacutepsia hepaacutetica
representa o melhor indicador do estaacutegio de evoluccedilatildeo da doenccedila uma vez que
gradua os componentes inflamatoacuterios e o estaacutegio de fibrose (AGMON-LEVIN et al
2009 BLOCK SCHIANO 1999)
Alter et al (1992) dizem que em 82 de 130 pacientes seguidos durante
muitos anos apoacutes surto agudo de hepatite natildeo-A natildeo-B apresentam anti-VHCHCV
ou VHCHCV RNA sendo que 62 deles desenvolveram hepatite crocircnica e
concluem que os pacientes que adquiriram HCV tiveram alto grau de hepatite
20
crocircnica sendo que o VHCHCV pode ser a maior causa de doenccedila crocircnica de fiacutegado
nos EUA e que na maioria dos pacientes a infecccedilatildeo pelo VHCHCV parece persistir
por muitos anos mesmo na ausecircncia de doenccedila hepaacutetica ativa
Almeida et al (1999) determinaram a prevalecircncia da infecccedilatildeo em
doadores de sangue assim como avaliaram o grau de comprometimento hepaacutetico
numa populaccedilatildeo de 37335 doadores durante o biecircnio 93-94 em Porto Alegre - RS
utilizando o teste anti-VHC ELISA 2 Selecionaram 60 deles para a biopsia hepaacutetica
com agulha de Menghini encontrando prevalecircncia de 174 com comprometimento
hepatico e 39 deles apresentavam cirrose hepaacutetica Sendo a hepatopatia crocircnica de
graus variaacuteveis observadas em 80 deles na sua grande maioria com lesotildees leves
e miacutenimas Foi observada forte associaccedilatildeo entre elevaccedilatildeo de alanina
aminotransferase (ALT) e a presenccedila de hepatopatia crocircnica embora a intensidade
desta elevaccedilatildeo natildeo se correlacione com a gravidade da lesatildeo histoloacutegica
Jaacute na experiecircncia de Mutimer et al (1995) cerca de 80 dos doadores
soro-positivos analisados exaustivamente inclusive com biopsia de fiacutegado
mostraram evidecircncias de alteraccedilotildees histoloacutegicas e ou viroloacutegicas de infecccedilatildeo
persistente sem no entanto atingir graus mais avanccedilados de hepatopatia crocircnica
quase todos permanecendo na categoria moderada
Nos paiacuteses industrializados a HCV eacute responsaacutevel por 20 dos casos de
hepatite aguda 70 dos casos de hepatite crocircnica 40 dos casos de cirrose
descompensada 60 dos carcinomas hepatocelulares e 30 dos transplantes
hepaacuteticos (LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999)
Cerca de 40 do total de pacientes curam-se ou tecircm doenccedila crocircnica de
natureza benigna Os restantes 60 cursam com atividade aumentada de
aminotransferase denotando evoluccedilatildeo crocircnica da doenccedila Dentre estes a maioria
tem lesotildees necro inflamatoacuterias discretas e fibrose miacutenima ou ausente O prognoacutestico
em longo prazo eacute mal conhecido no entanto provavelmente a maioria deles natildeo viraacute
a falecer da doenccedila hepaacutetica em curso Cerca de 20 deles depois de 10-20 anos
de evoluccedilatildeo desenvolveratildeo cirrose hepaacutetica passiacutevel de transplante Assim a
hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila que ocasiona a morte de um pequeno nuacutemero
de pacientes sem no entanto afetar a duraccedilatildeo da vida meacutedia da maioria deles
(CONTE 2000 FERREIRA SILVEIRA 2004)
Apoacutes infecccedilatildeo aguda somente 10 dos pacientes desenvolve doenccedila
cliacutenica com icteriacutecia A infecccedilatildeo sub-cliacutenica eacute a regra e assim passa despercebida
21
Cerca de 25 deles tecircm infecccedilatildeo crocircnica sintomaacutetica com aminotransferases
normais e lesotildees inflamatoacuterias histoloacutegicas miacutenimas (RESENDE et al 2010)
A remissatildeo espontacircnea acontece em cerca de 15 dos casos Na grande
minoria dos casos a progressatildeo da doenccedila aguda pode levar agrave insuficiecircncia
hepaacutetica aguda
Observaccedilotildees feitas pelo irlandecircs Kenny-Walsh (1999) comprovam a
natureza e a evoluccedilatildeo cliacutenica da afecccedilatildeo em causa O autor acompanhou durante 17
anos 376 mulheres que receberam injeccedilotildees de imunoglobulinas anti-D
contaminadas com VHC provenientes de doador uacutenico num programa de
isoimunizaccedilatildeo Rh Destas 81 apresentaram sintomatologia mais frequumlentemente
fadiga (66) ALT ligeiramente elevada (de 40 a 99 UL) em 47 e igual ou maior de
100 UL em 8 A biopsia hepaacutetica mostrou inflamaccedilatildeo em 98 delas na maioria
das vezes leves (41) e moderadas (52) fibrose presente em 51 no entanto
somente em sete pacientes (2) houve sinais de cirrose provaacutevel ou definitiva Em
uma delas havia acentuado alcoolismo
A hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila de evoluccedilatildeo variaacutevel De maneira
geral sua evoluccedilatildeo eacute lenta insidiosa e progressiva
Os pacientes que natildeo apresentam evidecircncias bioquiacutemicas de lesatildeo
hepaacutetica podem constituir em subgrupo de casos mais benignos no curso natural
da doenccedila Muitos co-fatores tecircm papel importante no desenvolvimento da cirrose
nesses pacientes como por exemplo a idade no momento da infecccedilatildeo (os
contaminados de idade mais avanccedilada tecircm evoluccedilatildeo mais raacutepida da doenccedila
enquanto que os mais jovens a tecircm mais lenta) o alcoolismo (eacute de consenso geral
que o abuso de aacutelcool favorece o aparecimento da cirrose) e a co-infecccedilatildeo com o
Viacuterus da Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida (SIDA) e da HVB
A incidecircncia anual de carcinoma hepatocelular (CHC) eacute de 1 a 4 nos
pacientes cirroacuteticos o que justifica plenamente o controle ecograacutefico do fiacutegado e a
dosagem seacuterica de alfa-fetoproteiacutena nesses pacientes a cada 1-2 anos Por outro
lado nos pacientes com hepatite crocircnica por viacuterus C sem cirrose o CHC eacute muito
raro (LOPES 2010)
Nos casos de cura a atividade das transaminases cessa e os viacuterus natildeo
satildeo detectados (VHC RNA) no soro Nos casos de cronificaccedilatildeo acontece o
contraacuterio ou seja as alteraccedilotildees bioquiacutemicas existem com flutuaccedilotildees e os viacuterus satildeo
detectaacuteveis na grande maioria dos casos Fazem exceccedilatildeo agravequeles pacientes com
22
viremia baixa que por isso mesmo fogem aos limites dos meacutetodos de detecccedilatildeo viral
ou devido agraves flutuaccedilotildees proacuteprias desses niacuteveis virecircmicos (HAYDON et al 1998)
Nos pacientes anti-VHC positivos com enzimas circulantes normais a
falta de VHC RNA no soro tem sido interpretada como sinal de cura completa No
entanto Haydon et al (1998) alteraram essa interpretaccedilatildeo Estes autores
demonstraram a presenccedila de VHC RNA no fiacutegado desses pacientes que eram
negativos no soro independente das alteraccedilotildees bioquiacutemicas positivas ou negativas
do soro ou seja mesmo naqueles casos anteriormente considerados como curados
Assim os niacuteveis de viacuterus intra-hepaacuteticos natildeo satildeo determinados pelos fatores
hospedeiro (idade modo e duraccedilatildeo da infecccedilatildeo) ou virais (VHC genoacutetipos) pois
mesmo as repetidamente Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia-em tempo real (RT-
PCR) negativos para VHC RNA no soro podem ter viacuterus da HCV albergados no
fiacutegado Entretanto existem limitaccedilotildees metodoloacutegicas que devem ser consideradas
nessa interpretaccedilatildeo como por exemplo as limitaccedilotildees do RIBA 3 e do RT-PCR
Mais importante eacute o seguimento dos pacientes ao longo do tempo Assim
Seef et al (1992) em 568 pacientes de hepatite poacutes-transfusional e dois grupos
controles pareados que receberam transfusotildees sem desenvolver hepatite apoacutes 18
anos de seguimento encontraram 33 de mortalidade no grupo 1 e 15 no grupo
controle sendo que a maioria das mortes ocorreu nos pacientes com alcoolismo
associado Evidenciando que a maioria dos que desenvolve doenccedila crocircnica o faz
muito lentamente
Existem ainda no curso natural da doenccedila flutuaccedilotildees intensas e muito
frequumlentes que dependem dos viacuterus e dos hospedeiros a saber niacuteveis da viremia
genoacutetipos 1b graus de diversidade geneacutetica dos viacuterus vias de transmissatildeo (os
inoculados via transfusatildeo apresentam lesotildees hepatocelulares mais ativas)
(GORDON et al 1993 GORDON BAYATI SILVERMAN 1998) deficiecircncias
imunes alcoolismo e co-infecccedilatildeo com HBV e delta ou o Viacuterus da imunodeficiecircncia
humana (HIV) (LOPES 2010) Nestes uacuteltimos casos a co-infecccedilatildeo com muacuteltiplos
viacuterus das hepatites estaacute associada com mais graves lesotildees histoloacutegicas do fiacutegado do
que nos casos de VHC isoladas
Importa saber se os resultados obtidos com os controles feitos se mantecircm
por longos periacuteodos Ou seja como exemplos a atividade da ALT persistentemente
normal a variabilidade do RT-PCR a detecccedilatildeo de VHC RNA pela teacutecnica Reaccedilatildeo
de polimerase em cadeia (PCR) que pode ser negativa devido agrave inadequada
23
armazenagem das amostras agrave contaminaccedilatildeo do soro com substacircncias que
interferem na leitura entre outras causas de erro
As informaccedilotildees sobre as causas que determinam o curso evolutivo da
doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos progressos havidos no campo do
diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHC Uma questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo
genotipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o
genotipo 1 (1b) cursa com lesotildees histoloacutegicas mais graves independentemente da
carga viral Ainda mais os VHC RNA negativos no soro mesmo apoacutes anos de
cura podem recair pois neles persistem os viacuterus no fiacutegado em regime de
replicaccedilatildeo muito baixa indetectaacutevel pelos meacutetodos atuais Ao contraacuterio os negativos
no soro e no fiacutegado tecircm demonstrado respostas boas e sustentadas inclusive no
sentido de se fazer prognoacutestico de cura real e verdadeira infelizmente na grande
minoria dos casos
116 Diagnoacutestico
Quanto mais cedo o diagnoacutestico maiores as chances de detectar a
doenccedila Por isso eacute importante que as pessoas faccedilam o exame especiacutefico porque soacute
esse exame eacute que detecta a HCV E as mulheres tecircm que ter uma atenccedilatildeo em
especial Tempos atraacutes o Correio Braziliense (2003) publicou uma grande mateacuteria
sobre a quantidade de mulheres que vecircm sendo infectadas com a HCV Cuja causa
estava na esterelizaccedilatildeo mal feita dos equipamentos das manicures Uma soluccedilatildeo
praacutetica eacute as mulheres terem seu proacuteprio material pra fazer as unhas e natildeo deixar
mais ningueacutem utilizar (nem matildee nem irmatilde etc) Bem e quem tiver passado por
transfusatildeo dentistas manicures operaccedilotildees etc deve fazer o exame
(KARMOCHKINE et al 1998 apud CONTE 2000 KEER et al 1997)
A HCV natildeo eacute como a Siacutendrome da Imunodeficiecircncia Adquirida (AIDS)
que possui drogas com grande tecnologia e o doente pode viver por muitos e muitos
anos Com a HCV o paciente soacute tem chance de ficar bem se a doenccedila for
diagnosticada e tratada antes dela se manifestar Atualmente o tratamento usa uma
associaccedilatildeo de duas drogas ndash o Interferon e a Ribavirina ldquoAs chances de cura em
meacutedia satildeo de 50rdquo
Barbaro et al (1999) verificaram que os pacientes VHC genoacutetipos 1b
frequumlentemente apresentavam alteraccedilotildees ultraestruturais das mitococircndrias com
24
depleccedilatildeo do mtDNA podendo comprometer o processo de fosforilizaccedilatildeo oxidativa
Sendo assim a produccedilatildeo aumentada de radicais livres nos pacientes VHC genoacutetipos
1b poderia atuar de modo negativo na evoluccedilatildeo da doenccedila hepaacutetica aumentando o
efeito citopaacuteticos do VHC Nesses pacientes haveria portanto aumento de
hiperoxidaccedilatildeo com consequumlente resistecircncia agrave accedilatildeo dos interferons e pior evoluccedilatildeo
da doenccedila hepaacutetica A ser confirmado este fato novas estrateacutegias terapecircuticas
poderatildeo vir a ser desenvolvidas no combate a essa doenccedila
Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila
poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses
autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis
vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo
hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja
quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a
concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave
hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em
parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)
Dos fatos acima expostos decorrem implicaccedilotildees tais como as respostas
CD8-CTL aos antiacutegenos VHC restritas aos complexos de histocompatibilidade
principais (MHC I) com inibiccedilatildeo ou mesmo insuficiente produccedilatildeo de complexo
peptiacutedeo VHC-MHC inibiccedilatildeo direta das ceacutelulas CTLK e a falta de resposta as
citoquininas entre outras dos vaacuterios mecanismos de escape existentes Dentro
desse contexto o niacutevel de morte celular natildeo seria alcanccedilado e a lesatildeo hepatocelular
consequumlente seria portanto miacutenima
Outra implicaccedilatildeo resultante consiste na induccedilatildeo de resposta imune
celular T Helper mediadas a partir de peptide vacinas contra o VHC Estas novas
vacinas tecircm a capacidade de gerar linfoacutecitos T citotoacutexico os CTLs contra o VHC em
camundongo imunizados com peptiacutedeos CTL e ceacutelulas HT epiacutetomes do core VHC
Esses estudos recente em animais de laboratoacuterio vecircm progredindo rapidamente
esperando-se em breve novos recursos no tratamento dessa doenccedila (AGNELLO et
al 1998)
25
12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC
O VHC constitui-se em uma famiacutelia heterogecircnea de viacuterus com no miacutenimo
seis genoacutetipos e inuacutemeros subtipos (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT
SANTOS SILVA 1999) Embora o meacutetodo de maior acuraacutecia para a determinaccedilatildeo
do genoacutetipo do VHC seja a identificaccedilatildeo completa da sequumlecircncia dos 9500
nucleotiacutedeos e a construccedilatildeo de uma aacutervore filogeneacutetica esse meacutetodo soacute pode ser
utilizado em laboratoacuterios de pesquisa (BARBOSA SILVA MARTINS 2005) e natildeo
em laboratoacuterios cliacutenicos Assim foram desenvolvidos meacutetodos para genotipagem
utilizando apenas as regiotildees mais conservadas do genoma como a proteiacutena do
envoltoacuterio (E1) a proteiacutena core e a proteiacutena natildeo estrutural NS5B A sequumlecircncia dos
nucleotiacutedeos dentro dessas regiotildees relativamente conservadas eacute genoacutetipo-
especiacutefico e os isolados podem ser genotipados independentemente da regiatildeo que
for utilizada para anaacutelise (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS
SILVA 1999) Para uso em laboratoacuterios cliacutenicos foram desenvolvidas basicamente
duas metodologias que se valem de teacutecnicas de biologia molecular (genotipagem)
ou citoloacutegicas (serotipagem)
Os meacutetodos que adotam teacutecnica de biologia molecular para genotipagem
utilizando porccedilotildees do genoma incluem a PCR aninhada (nested PCR) (BASSIT
SANTOS SILVA 1999) a teacutecnica de restriction fragment length polymorphism
(RFLP) (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS SILVA 1999) a
hibridizaccedilatildeo reversa (BASSIT SANTOS SILVA 1999) (INNO-LiPA Innogenetics
Beacutelgica Gen Eti DEIA HCV Sorin Biomedica Itaacutelia) e o sequumlenciamento direto da
regiatildeo natildeo-codificante 5 (TruGene Visible Genetics Canadaacute) Suas principais
vantagens satildeo a informaccedilatildeo direta sobre sequumlecircncia dos nucleotiacutedeos do genoma
viral a alta sensibilidade por se basearem na PCR e a possibilidade de identificar o
subtipo viral (BARBOSA SILVA MARTINS 2005)
Os meacutetodos para determinaccedilatildeo do genoacutetipo que utilizam serotipagem
baseiam-se na detecccedilatildeo de anticorpos genoacutetipos-especiacuteficos contra epiacutetopos do
VHC (por exemplo proteiacutenas da regiatildeo do core) (BLOCK SCHIANO 1999) Os
testes comercializados utilizam diferentes teacutecnicas ELISA competitivos ou
immunoblot (Murex-HC1-6 Murex Diagnostics Ltd Reino Unido RIBA HCV
Serotyping Assay Chiron Diagnostics Estados Unidos) As principais vantagens da
teacutecnica de serotipagem satildeo o baixo custo e maior facilidade de realizaccedilatildeo em
26
comparaccedilatildeo com os testes de biologia molecular (BLOCK SCHIANO 1999 De
LARANAGA et al 2000)
A determinaccedilatildeo do genoacutetipo anteriormente utilizada em pesquisas mas
sem maior utilidade na praacutetica meacutedica atualmente eacute recomendada para uso cliacutenico
Como jaacute mencionado os pacientes infectados pelo genoacutetipo 1 do VHC devem ser
tratados por 12 meses enquanto os demais por 6 meses (BASSIT SANTOS SILVA
1999)
A determinaccedilatildeo do genoacutetipo do VHC pode ser feita por PCR ou
serotipagem A primeira teacutecnica eacute mais sensiacutevel e possibilita a identificaccedilatildeo de
subtipos do VHC Contudo a segunda eacute de mais faacutecil realizaccedilatildeo e mais barata
razatildeo pela que eacute importante que a teacutecnica seja aprimorada
Oliveira et al (1999) investigaram os padrotildees de distribuiccedilatildeo dos
genoacutetipos do VHC estudando 250 pacientes anti-VHC positivos atraveacutes da
detecccedilatildeo VHC RNA pelo RT-PCR e encontraram prevalecircncia de 72 para o VHC 1
253 para o tipo 3 2 para o 2 e 07 para o 4 semelhantes aos das vaacuterias
regiotildees mundiais
13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC
As manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo pelo VHC satildeo as mais
variadas possiacuteveis A diversidade de resposta do hospedeiro ao agente infeccioso
variando desde quadros assintomaacuteticos ateacute aqueles com evoluccedilatildeo grave fatal ou
incapacitante tem estimulado a busca por justificativas de tais discrepacircncias
cliacutenicas sobretudo na imunomodulaccedilatildeo Dentre as infecccedilotildees mais bem estudadas
destacam-se aquelas pelos Viacuterus da hepatite C Viacuterus da imunodeficiecircncia humana1
(HIV-1) pelo Herpes viacuterus humano 4 (viacuterus do Epstein Baar) e pelo Mycobacterium
leprae (ABBAS LICHTMAN 2005)
A agressatildeo hepaacutetica por auto-imunidade eacute um fenocircmeno reconhecido em
vaacuterias doenccedilas do fiacutegado inclusive nas de etiologia viral Aleacutem do agente agressor e
de sua interaccedilatildeo com o sistema imunoloacutegico do hospedeiro fatores ambientais ou
hormonais estatildeo aparentemente envolvidos no surgimento de auto-imunidade
hepaacutetica como se supotildee acontecer na hepatite auto-imune em indiviacuteduos
geneticamente suscetiacuteveis (CODES et al 2002)
27
A lesatildeo hepatocelular relacionada agrave infecccedilatildeo pelos viacuterus hepatotroacutepicos e
pelos herpes viacuterus (citomegaloviacuterus e Epstein-Barr) eacute secundaacuteria a uma resposta
auto-imune do hospedeiro Estes viacuterus natildeo parecem ser diretamente citopaacuteticos
mas desencadeiam lesatildeo hepaacutetica atraveacutes da resposta imune do hospedeiro contra
ceacutelulas hepaacuteticas infectadas (MALOY POWRIE 2001)
Existem estudos que focalizam alteraccedilotildees imunoloacutegicas em hepatites
virais entretanto a maioria deles mostra resultados pontuais sem seguimento na
fase aguda da doenccedila (BLOCK SCHIANO 1999 McFARLONE et al 1990) Aleacutem
disso ainda natildeo se estabeleceu uma associaccedilatildeo entre as reaccedilotildees auto-imunes
transitoacuterias induzidas por viroses hepatotroacutepicas e agravamento do dano tecidual na
hepatite viral
A infecccedilatildeo crocircnica estaacute fortemente associada agrave crioglobulinemia mista
essencial glomerulonefrite membrano-proliferativa e porfiria cutacircnea tardia De
forma menos impressiva encontra-se tambeacutem associada agrave uacutelcera corneana de
Mooren liacutequen plano e fibrose pulmonar (KILLENBERG 2000 WENER et al 1996)
A ocorrecircncia de anticorpos antitireoidianos e hipotireoidismo tem sido relatada em
associaccedilatildeo com a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC em mulheres (KILLENBERG 2000
CACOUB et al 1999)
A associaccedilatildeo entre a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC a presenccedila do fator
reumatoacuteide e do anticorpo antinuclear (FAN) o fenocircmeno de Raynaud e doenccedilas
difusas do tecido conjuntivo (DDTC) como artrite reumatoacuteide luacutepus eritematoso
sistecircmico siacutendrome de Sjoumlgren e vasculites sistecircmicas eacute relatada em alguns
trabalhos (CACOUB et al 1999 LOVY STARKEBAUM UBEROI 1996 STAUB
1998 WENER et al 1996)
14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE
A associaccedilatildeo entre doenccedilas infecciosas e autoimunidade apresentando-
se com manifestaccedilotildees cliacutenicas ou detectadas apenas pelo desenvolvimento de auto-
anticorpos tem sido amplamente documentado Infecccedilotildees virais bacterianas e
parasitaacuterias podem estar envolvidas no desenvolvimento recidivas e ateacute mesmo na
prevenccedilatildeo de doenccedilas auto-imunes (KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)
Ribeiro e Proietti (2004) avaliaram a frequumlecircncia de FR anticorpos
antipeptiacutedeo citrulinado ciacuteclico (anti-CCP) AAN anticorpos anti-citoplasma de
28
neutroacutefilos (ANCA) anticorpos anticardiolipina (aCL) e anticorpos anti-β2
glicoproteiacutena I (anti-β2GPI) em pacientes com hanseniacutease Existe estudo
demonstrando pacientes que apresentavam manifestaccedilotildees articulares comparados
aos que natildeo apresentavam envolvimento articular e um grupo controle de indiviacuteduos
saudaacuteveis com idade e gecircnero semelhantes aos dos pacientes estudados e que
residiam na mesma aacuterea geograacutefica A maioria dos pacientes nos dois grupos (com
e sem envolvimento articular) apresentava hanseniacutease generalizada Entretanto
observaram uma baixa frequumlecircncia que natildeo foi significativamente diferente de FR
anti-CCP AAN e ANCA em pacientes com hanseniacutease (nos dois grupos) e normal
dos controles Mas a prevalecircncia de anticorpos aCL e anti-β2GPI estava
significativamente elevada nos pacientes com hanseniacutease quando comparados com
o grupo controle apesar de natildeo haver associaccedilatildeo significativa com o envolvimento
articular O isoacutetopo predominante dos dois autoanticorpos foi a IgM (487) dos
pacientes com hanseniacutease apresentava pelo menos um anticorpo antifosfoliacutepide
Aleacutem disso os autores observaram uma associaccedilatildeo entre a positividade para aCL e
as manifestaccedilotildees cliacutenicas jaacute que os pacientes com anticorpos aCL apresentavam
doenccedila Hanseniacutease generalizada (VV) com mais frequumlecircncia (p= 0002) Natildeo houve
associaccedilatildeo entre a presenccedila de anticorpos aCL ou anti-β2GPI e episoacutedios
reacionais poreacutem entre os pacientes com esses episoacutedios aqueles com anticorpos
aCL apresentavam eritema nodoso hansecircnico (ENH) em 100 dos casos enquanto
entre os pacientes negativos para aCL 57 apresentavam ENH Apesar de uma
alta taxa de concordacircncia para a presenccedila de anticorpos aCL e anti-β2GPI ter sido
observada manifestaccedilotildees tromboemboacutelicas natildeo foram observadas (RIBEIRO
PROIETTI 2004 2005)
Horimoto e Costa (2009) avaliaram pacientes com Leishmania
(leishmaniose visceral e leishmaniose cutacircnea) para a presenccedila de anticorpos anti-
Leishmania assim como FR AAN anti-DNA anti-Sm anti-RNP anti-Ro anti-La
aCL e complemento (C3 e C4) Como esperado os pacientes com leishmaniose
visceral apresentava anticorpos anti-Leishmania Tiacutetulos significativamente elevados
de AANs na maioria dos pacientes o anti-DNA foi detectado em poucos pacientes
com doenccedila visceral assim como tiacutetulos elevados de anticorpos aCL (isotipo IgG)
quando comparados com os pacientes com leishmaniose cutacircnea Niacuteveis reduzidos
de complemento tambeacutem satildeo evidentes na doenccedila visceral assim como niacuteveis
significativamente reduzidos de C3 Outros estudos comparam e discutem os
29
resultados em relaccedilatildeo agrave crescente evidecircncia na literatura da presenccedila de
autoanticorpos em ambas as doenccedilas Em geral a prevalecircncia variaacutevel de auto-
anticorpos relatada assim como relatos preacutevios na literatura podem estar
relacionados a diferenccedilas metodoloacutegicas como o tipo de ensaio utilizado a
definiccedilatildeo dos pontos de corte inativaccedilatildeo dos soros pelo calor seleccedilatildeo de pacientes
e variaccedilotildees eacutetnicas e geograacuteficas nos grupos de pacientes Mas um dos resultados
consistentes foi a frequumlecircncia significativamente mais elevada de anticorpos
antifosfoliacutepide aCL e anti-β2GPI em pacientes com hanseniacutease enquanto
anticorpos AAN e aCL foram detectados com mais frequumlecircncia nos pacientes com
leishmaniose visceral A incidecircncia aumentada de anticorpos AAN e aCL nos
pacientes com leishmaniose visceral eacute compatiacutevel com outros estudos (OSSADRON
et al 2006 SAKKAS et al 2008 VOULGARI et al 2004) e demonstra
semelhanccedilas das manifestaccedilotildees cliacutenicas e laboratoriais entre a leishmaniose
visceral e o luacutepus eritematoso sistecircmico (LES) Aleacutem disso a reatividade cruzada
entre AAN e anticorpos anti-Leishmania jaacute foi tambeacutem relatada (GRANEL et al
2000)
Diversos grupos documentaram niacuteveis elevados de anticorpos
antifosfoliacutepide (aCL anti-β2GPI e anti-protrombina) em diversas doenccedilas
infecciosas como a siacutefilis doenccedilas virais (incluindo a hepatite C Parvoviacuterus B19 e
HIV) malaacuteria e hanseniacutease sem as manifestaccedilotildees cliacutenicas da siacutendrome
antifosfoliacutepide (SAF) (ZANDMAN-GODDARD BLANK SHOENFELD 2002) Os
tiacutetulos elevados geralmente satildeo transitoacuterios diminuindo e desaparecendo apoacutes a
resoluccedilatildeo da infecccedilatildeo (LOIZOU et al 2003 ZANDMAN-GODDARD BLANK
SHOENFELD 2002) Mas em uma minoria dos pacientes a associaccedilatildeo entre
doenccedilas infecciosas e anticorpos antifosfoliacutepide pode levar a complicaccedilotildees severas
frequumlentemente fatais ou seja SAF catastroacutefica (ZANDMAN-GODDARD BLANK
SHOENFELD 2002)
Os resultados de Ribeiro e Proietti (2005) mostrando um aumento da
incidecircncia de anticorpos anti-β2-GPI em pacientes com hanseniacutease associados aos
dados de outros grupos (De LARANAGA et al 2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK
et al 1994 LOIZOU et al 2003) que tambeacutem documentaram niacuteveis elevados de
anticorpos anti-2βGPI lanccedilam duacutevidas sobre a noccedilatildeo de que os anticorpos aCL
associados a infecccedilotildees satildeo independentes dos anticorpos anti-β2GPI e natildeo
dependentes desses anticorpos como nas doenccedilas auto-imunes Em conjunto
30
esses resultados apoacuteiam a noccedilatildeo de que na presenccedila de infecccedilotildees anticorpos aCL
satildeo heterogecircneos em relaccedilatildeo agrave sua dependecircncia da 2GPI (De LARANAGA et al
2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK et al 1994 LOIZOU et al 2003) e as infecccedilotildees
podem desencadear a induccedilatildeo de anticorpos antifosfoliacutepide patogecircnicos em
indiviacuteduos predispostos (LOIZOU et al 2003)
A produccedilatildeo de autoanticorpos na hanseniacutease e leishmaniose pode ser
explicada por diversos mecanismos Na forma mais generalizada dessas doenccedilas
(hanseniacutease VV e leishmaniose visceral) os pacientes apresentam
hipergamaglobulinemia difusa semelhante agrave vista em outras infecccedilotildees como
Schistosoma mansoni T cruzi e Plasmodium A induccedilatildeo de autoanticorpos pode ser
atribuiacuteda agrave ativaccedilatildeo policlonal e proliferaccedilatildeo das ceacutelulas B algumas com auto-
reatividade pertencentes agrave biblioteca de anticorpos naturais em indiviacuteduos normais
(ARGOV et al 1989) Na leishmaniose antiacutegenos soluacuteveis derivados da L major e
L donovani satildeo mitogecircnicos e desencadeiam a produccedilatildeo de imunoglobulinas com
auto-reatividade (ARGOV et al 1989) Crioglobulinemia mista induzida pelo HCV eacute
outro exemplo de ativaccedilatildeo policlonal persistente levando a uma mistura de
autoanticorpos policlonais e monoclonais os quais causam doenccedilas auto-imunes
(AGMON-LEVIN et al 2009)
Mimetismo molecular ou homologias estruturais entre infecccedilotildees e
componentes do hospedeiro podem ser agrave base da produccedilatildeo de autoanticorpos
como no caso da febre reumaacutetica onde o componente M da membrana do
estreptococo apresenta homologia com peptiacutedeos cardiacuteacos cerebrais e sinoviais A
associaccedilatildeo da siacutendrome de Guillain-Barreacute com a infecccedilatildeo pelo Campylobacter
jejeuni representa outro exemplo de mimetismo molecular como base de uma
manifestaccedilatildeo auto-imune A reatividade cruzada entre agentes infecciosos e auto-
antiacutegenos jaacute foi demonstrada para o M leprae (McADAM MUDD SHOENFELD
1984) e M tuberculosis (SHOENFELD et al 1986) e a inibiccedilatildeo de anticorpos anti-
Sm anti-RNP e anti-SSB por promastigotas intactas de Leishmania apoacuteia a
homologia entre antiacutegenos nucleares e a Leishmania (ARGOV et al 1989)
A disseminaccedilatildeo de epiacutetopos a emergecircncia de novos anticorpos ou a
resposta de ceacutelulas T a um novo epiacutetopo (subdominante ou criacuteptico) no mesmo
antiacutegeno ou em outro antiacutegeno foi demonstrada em modelos experimentais e na
doenccedila humana alguns autores demonstraram a disseminaccedilatildeo molecular do
antiacutegeno Sm para reatividade anti-RNP (STAUB 1998) no LES enquanto na febre
31
reumaacutetica o estado de autoimunidade crocircnica que afeta as vaacutelvulas cardiacuteacas pode
resultar em uma resposta imunoloacutegica contra o colaacutegeno e laminina (KIVITY et al
2009 PORDEUS et al 2008) As infecccedilotildees tambeacutem podem desempenhar um papel
importante na induccedilatildeo da autoimunidade atraveacutes da liberaccedilatildeo de antiacutegenos
sequumlestrados apoacutes lesatildeo tecidual ou aumentando a exibiccedilatildeo de epiacutetopos criacutepticos
no meio inflamatoacuterio apresentando assim novos antiacutegenos ao sistema imunoloacutegico
(KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)
15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES
AGUDAS VIRAIS
O conceito de auto-imunidade induzida por viacuterus natildeo eacute exclusivo para
doenccedilas hepaacuteticas O viacuterus Coxsackie do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um
terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite infecciosa e estaacute implicado nas miocardites
auto-imunes reagindo contra a miosina cardiacuteaca (GIST BELL 1974) Niwa et al
(1984) encontraram elevaccedilatildeo transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator
reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas
virais comuns como varicela sarampo influenza caxumba herpes zoster e
exantema suacutebito
A patogecircnia da infecccedilatildeo viral inclui pelo menos trecircs tipos de interaccedilotildees
com o hospedeiro vertebrado 1) o efeito do agente sobre as ceacutelulas 2) a maneira
de disseminaccedilatildeo do agente no organismo infectado 3) a resposta imunoloacutegica e a
sua influencia no processo infeccioso Destacam-se dois tipos principais da
interaccedilatildeo a destruiccedilatildeo celular e a resposta imunoloacutegica (FIGUEIREDO 1999
CATALAN-SOARES PROIETTI CARNEIRO-PROIETTI 2006) O viacuterus Coxsackie
do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite
infecciosa e estaacute implicado nas miocardites auto-imunes reagindo contra a miosina
cardiacuteaca (GERSHON KONDO 1971) Niwa et al (1984) encontraram elevaccedilatildeo
transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo
anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas virais comuns como varicela sarampo
influenza caxumba herpes zoster e exantema suacutebito
32
16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN
De acordo com o II Consenso Brasileiro de FAN em HEp 2
(DELLAVANCE et al 2003) os AAN satildeo encontrados comumente em uma
variedade de doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Satildeo uacuteteis na investigaccedilatildeo dessas
doenccedilas auxiliando no diagnoacutestico de patologias como LES esclerose sistecircmica
progressiva (ESP) doenccedila mista do tecido conjuntivo (DMTC) siacutendrome de Sjoumlgren
(SS) polimiosite e dermatomiosite
Eles podem estar presentes em um pequeno percentual da populaccedilatildeo
aparentemente sadia essa frequumlecircncia eacute maior em mulheres e aumenta com a idade
Segundo a literatura a positividade entre 20 a 60 anos varia entre percentuais mais
altos (133) para tiacutetulos baixos e mais baixos (33) para tiacutetulos mais elevados
(DELLAVANCE et al 2003)
A pesquisa dos anticorpos antinucleares pode ser realizada por diferentes
teacutecnicas a imunofluorescecircncia indireta eacute a mais utilizada por sua sensibilidade
reprodutibilidade e facilidade de execuccedilatildeo A sensibilidade aumenta
significativamente quando se utiliza como substrato lacircminas com ceacutelulas Hep 2
(ceacutelulas de carcinoma de laringe humana) por causa da maior expressatildeo de
antiacutegenos na superfiacutecie dessas ceacutelulas comparados aos expressos nas ceacutelulas de
fiacutegado ou de rins de camundongos que se utilizavam anteriormente
Em geral eacute possiacutevel detectar melhor a presenccedila de AAN por associaccedilatildeo
de trecircs anti-soros isotipos especiacuteficos (anti-IgG anti-IgA e anti-IgM) A pesquisa
realizada por essa teacutecnica serve de triagem inicial para a presenccedila de AAN Eacute
normalmente denominada pesquisa de FAN ou AAN
A realizaccedilatildeo de outras metodologias tais como as imunoenzimaacuteticas
permite uma avaliaccedilatildeo isolada dos diferentes auto-anticorpos sugeridos pelos
padrotildees de fluorescecircncia encontrados no FAN A identificaccedilatildeo desses AAN permite
um diagnoacutestico mais preciso e eles podem ser utilizados em muitos casos como
marcador para uma das diferentes doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Muitas dessas
patologias apresentam um perfil distinto de auto-anticorpos que auxilia o diagnoacutestico
A presenccedila de FAN positivo em pessoas aparentemente sadias pode ser
devida a algumas situaccedilotildees
minus Doenccedila auto-imune precoce ainda natildeo expressa clinicamente
33
minus distuacuterbio imunoloacutegico transitoacuterio causado por doenccedila natildeo-imune
tais como infecccedilotildees principalmente virais
minus uso de medicamentos e neoplasias
minus manifestaccedilatildeo incompleta de uma siacutendrome ou seja o paciente
sintetiza o anticorpo poreacutem esse quadro natildeo evolui para doenccedila
minus fenocircmeno auto-imune fisioloacutegico
O resultado do FAN eacute expresso em tiacutetulo e padratildeo uma vez que ambos
os paracircmetros tecircm importacircncia para a avaliaccedilatildeo do significado cliacutenico do exame O
tiacutetulo do FAN corresponde agrave maior diluiccedilatildeo capaz de demonstrar fluorescecircncia
inequiacutevoca e didaticamente pode ser dividido em
minus Baixo menor 180
minus Moderado 1160
minus Moderadamente elevado 1320
minus Alto maior 1640
Nas pesquisas realizadas por imunofluorescecircncia indireta os resultados
satildeo expressos em tiacutetulos segundo as diluiccedilotildees empregadas Eacute possiacutevel trabalhar
utilizando-se como limite tiacutetulos de 140 que permitem maior sensibilidade ou de
180 que permitem maior especificidade ou seja um menor nuacutemero de falso-
positivos
Na praacutetica cliacutenica satildeo considerados significativos tiacutetulos superiores a
1160 Os resultados com tiacutetulos positivos satildeo acompanhados pela descriccedilatildeo do
padratildeo de fluorescecircncia encontrado que serve como orientaccedilatildeo da presenccedila de um
antiacutegeno especiacutefico e em alguns casos como padratildeo diagnoacutestico Em determinadas
situaccedilotildees em especial no LES em atividade pode ocorrer agrave observaccedilatildeo de mais de
um padratildeo de fluorescecircncia
O padratildeo do FAN a seu turno aponta uma probabilidade maior ou menor
de doenccedila auto-imune e ateacute mesmo sugere o antiacutegeno nuclear envolvido e por
consequumlecircncia a afecccedilatildeo com ele mais relacionada Os padrotildees homogecircneo
centromeacuterico e pontilhado grosso satildeo os mais indicativos de processos de
autoimunidade uma vez que se associam a diversas condiccedilotildees reumaacuteticas
especialmente ao LES e agrave esclerose sistecircmica e tambeacutem a enfermidades hepaacuteticas
tais como a cirrose biliar primaacuteria e a hepatite auto-imune (KILLENBERG 2000)
34
Jaacute o pontilhado fino o pontilhado grosso reticulado e a membrana nuclear
tecircm maior significado quando encontrados em tiacutetulos altos uma vez que podem
estar presentes em tiacutetulos baixos em indiviacuteduos hiacutegidos Por sua vez o pontilhado
fino denso mesmo quando elevado em pessoas assintomaacuteticas soacute guarda relaccedilatildeo
com alguma doenccedila em cerca de 20 dos casos (DELLAVANCE et al 2003)
O padratildeo pontilhado pode tambeacutem ser referido como padratildeo salpicado
Outros padrotildees de fluorescecircncia podem ser encontrados em menor frequumlecircncia Os
pontilhados citoplasmaacutetico grossos ou reticulares associados agrave presenccedila de
anticorpos antimitococircndrias em pacientes com cirrose biliar primaacuteria o
citoplasmaacutetico homogecircneo relacionado a proteiacutenas ribossocircmicas em pacientes com
LES e o padratildeo pontilhado fino citoplasmaacutetico que pode estar associado agrave
presenccedila de anticorpos anti-JO-1 anti-PCNA e proteiacutenas da membrana celular em
pacientes com LES outras patologias do tecido conjuntivo e hepatopatias auto-
imunes (DELLAVANCE et al 2003)
Quadro 1 - Padrotildees de fluorescecircncia encontrados em maior frequumlecircncia e patologias relacionadas
Padrotildees de Fluorececircncia Antiacutegenos Patologias Relacionadas
Perifeacuterico DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES
Homogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA
LES AR lupus induzido por drogas
Perifeacutericohomogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES
Pontilhado grosso SM RNP LES DMTC
Pontilhado fino nuclear SS-A (RO) SS-B (La) SS LES
Nucleolar Proteiacutenas Nucleolares ESP Centromeacuterico Proteiacutenas de centrocircmeros Siacutendrome de CREST
Fonte Dellavance et al 2003 Quadro 2 - Anti-ena - auto-anticorpos contra antiacutegenos extraiacutedos do nuacutecleo e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleares Patologias Relacionadas SM LES RNP DMTC LES ESP AR e Polimiosite
SS-A (Ro) SS LES lupus neonatal e forma cutacircnea subaguda
SS-B (La) SS LES luacutepus neonatal e forma cutacircnea subaguda
Scl 70 ESP Jo -1 Polimiosite e dermatomiosite Fonte Dellavance et al 2003
35
Quadro 3 ndash Padrotildees de FAN nuclear e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes
Padrotildees Nucleares Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos
Nuclear Pontilhado Centromeacuterico Anticorpo anti-centrocircmero Esclerose Sistecircmica forma CREST Cirrose Biliar Primaacuteria
Nuclear homogecircneo Anticorpo anti-DNA nativo Lupus Eritematoso Sistecircmico (LES) Anticorpo anti-Histoma LES induzido por drogas LES idiopaacutetico Anticorpo anti-cromatina (DNAHistona Nucleossomo) Artrite Reumatoacuteide (AR) Artrite Idiopaacutetica Juvenil importante associaccedilatildeo com uveiacutete na forma oligoarticular Siacutendrome de Felty Cirrose Billar Primaacuteria
Nuclear tipo membrana nuclear contiacutenua Anticorpo anti-Iamin e contra envelope nuclear - Iamins Hepatites auto-imunes Raramente associado a doenccedilas reumaacuteticas (algumas formas de LES e esclerodermia linear)
Nuclear pontilhado pleomoacuterficoPCNA Anticorpo contra nuacutecleo de ceacutelulas em proliferaccedilatildeo LES
Nuclear pontilhado fino denso Anticorpo anti-proteina p 75 kDa pode ser encontrado em indiviacuteduos saudaacuteveis processos inflamatoacuterios inespeciacuteficos doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Cistite Intersticial Dermatite Atoacutepica Psoriacutease e Asma
Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos
Anticorpo anti-p80 coilina natildeo apresenta associaccedilatildeo cliacutenica definida
Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos
Anticorpo anti-Sp100 (anti-p95) Cirrose Biliar Primaacuteria pode ocorrer em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas
Nuclear pontilhado grosso Anticorpo anti-Sm LES Anticorpo anti-RNP criteacuterio obrigatoacuterio no diagnostico da doenccedila mista do Tecido conjuntivo (DMTC) tambeacutem ocorre no LES Esclerose Sistecircmica (ES) e AR
Nuclear pontilhado fino Anticorpo anti SSARo Siacutendrome de Sjogren Primaacuteria (SS) LES Lupus neonatal e Lupus Cutacircneo Subagudo Anticorpo anti-SSBLa Lupus neonatal LES SS Anticorpo anti-Mi-2 Dermatomiosite embora raramente ocorra na polimiosite do adulto
Fonte Dellavance et al 2003
36
Quadro 4 - Padrotildees de FAN citoplasmaacuteticos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes
Padrotildees Citoplasmaacuteticos e Relacionados ao Aparelho Mitoacutetico Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos
Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina Hepatite auto-imune Cirrose Anticorpo anti-miosine Hepatite C Hepatocarcionoma Miastenia Gravis Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida
Citoplasmaacutetico Fibrilar Segmentar Anti actinina anti--vinculina e anti-tropomiose Miastenia Gravis Doenccedila de Crohn e Colite ulcerativa Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia cliacutenica definida
Citoplasmaacutetico Pontilhado Polar Anticorpo Anti-golginas (cisternas do aparelho de Golgi) raro no LES SS e outras doenccedilas auto-imunes sistecircmicas Relato na Ataxia Cerebelar Idiopaacutetica Degeneraccedilatildeo Cerebelar Paraneoplaacutesica infecccedilotildees virais pelo Epstein Barr (EBV) e pelo viacuterus da imunodeficiecircncia Humana (HIV) Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida
Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Anticorpo anti-Histidill t RNA sintetase (Jo-1) anticorpo marcador de Polimiosite no adulto Descrito raramente na Dermatomiosite
Citoplasmaacutetico Pontilhado com Pontos Isolados
Anticorpo anti-EEA1 e anti-fosfatidilserina natildeo haacute associaccedilotildees clinicas bem definida Anticorpo anti-GWBSS tambeacutem encontrado em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas
Citoplasmaacutetico Pontilhado Reticulado Anticorpo anti-mitococircndria Cirrose Biliar Primaacuteria Esclerose Sistecircmica Eacute relativamente comum o encontro deste padratildeo na ausecircncia de anticorpos anti-mitococircndria
Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Denso Anti PL7PL12 Raramente associado a Polimiosite Anticorpo P-ribossomal Este padratildeo ocorre no LES se a associaccedilatildeo eacute com anti-proteina P ribossomal
Citoplasmaacutetico Fibrilar Filamentar Anticorpo anti-vimentina e anti-queratina Anti-queratina eacute o anticorpo mais importante em doenccedila hepaacutetica alcooacutelica Descritos em vaacuterias doenccedilas inflamatoacuterias e infecciosas Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida
Aparelho mitoacutetico Tipo Centriacuteolo Anticorpo anti-enolase em baixos tiacutetulos natildeo tem associaccedilatildeo cliacutenica definida Em altos tiacutetulos eacute sugestivo de Esclerose Sistecircmica
Aparelho mitoacutetico Tipo ponte Intercelular
Anticorpo anti Tubulina Pode ser encontrado no LES e na DMTC outros anticorpos ainda natildeo bem definidos podem gerar o mesmo padratildeo
Aparelho mitoacutetico Tipo NuMa2 Anticorpo anti-HsEg5 diversas condiccedilotildees auto-imunes com baixa especificidade
Fonte Dellavance et al 2003
37
Quadro 5 - Padrotildees de FAN mistos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Mistos Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos
Misto do tipo nucleolar homogecircneo e nuclear pontilhado grosso com placa metafaacutesica decorada em anel (cromossomos negativos)
Anticorpo anti-Ku Superposiccedilatildeo Polimiose e Esclerose Sistecircmica Podem ocorrer no LES e Esclerodermia
Misto do tipo nuclear e nucleolar pontilhado com placa metafaacutesica positiva
Anticorpo anti-topoisomerase (Scl-70) ES forma difusa Mais raramente pode ocorrer na Siacutendrome CREST e superposiccedilatildeo PolimiositeEsclerodermia
Misto do tipo Citoplasmaacutetico pontilhado fino denso e homogecircneo e nucleolar homogecircneo
Anticorpo anti rRNP LES frequumlentemente relacionado agrave Psicose Luacutepica
Misto do tipo nuclear pontilhado fino com fluorescecircncia do aparelho mitoacutetico
Anticorpo anti-NuMA1SS pode ocorrer tambeacutem em outras condiccedilotildees auto-imunes ou inflamatoacuterias crocircnicas
Fonte Dellavance et al 2003
Quadro 6 - Padrotildees de FAN nucleolares e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleolares Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos
Nucleolar Aglomerado
Anticorpo anti-Fibrilarina (U3-nRNP) Esclerose Sistecircmica (ES) especialmente com comprometimento visceral grave entre eles a hipertensatildeo pulmonar
Nucleolar Pontilhado
Anticorpo anti-NOR-90 ES tambeacutem descrito em outras doenccedilas do tecido conjuntivo poreacutem sem relevacircncia clinica definida Anticorpos anti-RNA polimerase I ES de forma difusa com tendecircncia para comprometimento visceral mais frequumlente e grave
Nucleolar Homogecircneo
Anticorpo anti-PMScl Siacutendrome de Superposiccedilatildeo de Polimiosite com Esclerose Sistecircmica Raramente encontrado em casos de Polimiosite ou Esclerose Sistecircmica sem superposiccedilatildeo cliacutenica Outros auto-anticorpos mais raros podem apresentar esse padratildeo
Fonte Dellavance et al 2003
De acordo com o 3deg Consenso (DELLAVANCE et al 2009) foram
comunicados dois novos padrotildees de fluorescecircncia por participantes Vaacuterios outros
membros testemunharam jaacute haver observado esses padrotildees O primeiro trata-se de
um padratildeo nuclear pontilhado fino aproximando-se da textura homogecircnea e com
placa metafaacutesica corada da mesma forma Sua associaccedilatildeo cliacutenica e identidade
imunoloacutegica natildeo estatildeo definidas Sua importacircncia deriva do fato de que pode ser
facilmente confundido com o padratildeo pontilhado fino denso e com o padratildeo
homogecircneo O segundo trata-se de um padratildeo citoplasmaacutetico em forma de
pequenos bastotildees (rods) e ciacuterculos (rings) que aparentemente estaacute associado agrave
38
infecccedilatildeo pelo HCV Haacute estudos em curso por alguns grupos de pesquisa com a
finalidade de estabelecer sua identidade imunoloacutegica
Como ainda natildeo estatildeo definitivamente caracterizados esses dois novos
padrotildees foram considerados preliminares e o 3deg Consenso recomendou que os
mesmos fossem completamente caracterizados e apresentados na proacutexima versatildeo
do Consenso (DELLAVANCE et al 2009)
39
2 JUSTIFICATIVA
As inflamaccedilotildees do fiacutegado provocadas pelos viacuterus hepatotroacutepicos atingem
milhotildees de pessoas e representam significativos problemas de sauacutede puacuteblica em
todo o mundo No Brasil a Regiatildeo Norte responde por um significativo percentual
dos portadores de hepatite C Dentre as manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo
pelo viacuterus C as doenccedilas autoimunes tecircm significativo impacto na evoluccedilatildeo cliacutenica
desses pacientes A presenccedila de anticorpo antinuacutecleo eacute um marcador importante de
autoimunidade e apesar de existirem trabalhos relatando a pesquisa desse fator em
portadores de viacuterus C tais estudos ainda natildeo foram realizados na nossa regiatildeo
sobretudo correlacionando-se com o genoacutetipo do viacuterus responsaacutevel pela infecccedilatildeo
considerando que o genoacutetipo eacute um marcador de resposta ao tratamento ou
considerando que pacientes portadores do genoacutetipo 1 natildeo respondem
satisfatoriamente ao tratamento instituiacutedo pelo protocolo atual
21 ASPECTOS EacuteTICOS
A pesquisa a ser realizada apresenta relevacircncia social e natildeo perde o
sentido de sua destinaccedilatildeo soacutecio-humanitaacuteria (justiccedila e equidade)
Este trabalho adequa-se aos princiacutepios cientiacuteficos que o justificam e
apresenta possibilidade concreta de responder a incertezas tais como FAN e o
genoacutetipo viral em pacientes com infecccedilatildeo pelo viacuterus da hepatite C ldquoestatildeo
relacionadosrdquo
Segue rigorosamente os procedimentos descritos na Resoluccedilatildeo 19696-
CNSMS (BRASIL 1996) assegurando a confidenciabilidade e proteccedilatildeo da
identidade do sujeito da pesquisa no momento da afericcedilatildeo dos dados e sua
posterior utilizaccedilatildeo
Por tratar-se de um estudo que faraacute somente revisatildeo de soroteca os
participantes natildeo seratildeo submetidos a riscos de origem orgacircnica eou quiacutemica
40
3 OBJETIVOS
31 OBJETIVO GERAL
Estabelecer associaccedilatildeo entre a presenccedila de teste de FAN e o genoacutetipo
viral em pacientes portadores de infecccedilatildeo pelo HCV
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
I Identificar o padratildeo de fluorescecircncia do FAN em pacientes com diagnoacutestico
laboratorial de infecccedilatildeo pelo HCV
II Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados
pelo HCV de acordo com o gecircnero e a idade
III Identificar a prevalecircncia de FAN em pacientes infectados pelo HCV e natildeo
infectados
IV Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados
pelo HCV de acordo com as alteraccedilotildees bioquiacutemicas
41
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO)
Foi realizado um estudo transversal analiacutetico no Serviccedilo do Nuacutecleo de
Medicina Tropical da Universidade Federal do Paraacute (NMTUFPA) utilizando-se
pacientes oriundos da Fundaccedilatildeo Centro de Hemoterapia e Hematologia do Paraacute
(HEMOPA) e Plano de Assistecircncia ao Servidor (PASIASEP) com coleta de material
bioloacutegico para reconfirmaccedilatildeo do diagnoacutestico de hepatite C no periacuteodo de janeiro de
2009 a maio de 2010
411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C
A populaccedilatildeo de estudo consistiu de 51 pacientes admitidos no NMTUFPA
para reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica tratamento cliacutenico e acompanhamento ambulatorial
de ambos os gecircneros e independente da idade sem exclusatildeo dos pacientes com a
presenccedila de patologias associadas agrave condiccedilatildeo maior (motivadora da pesquisa)
oriundos da Fundaccedilatildeo HEMOPA e PAS
A amostra do grupo foi selecionada a partir da relaccedilatildeo dos prontuaacuterios
catalogados no laboratoacuterio de patologia do NMTUFPA
Os dados foram coletados atraveacutes dos resultados dos exames realizados
no soro de cada paciente O protocolo de coleta teve enfoque na identificaccedilatildeo
individual do paciente bem como a avaliaccedilatildeo cliacutenica dos resultados
412 Grupo de natildeo infectados
Foi utilizado um grupo controle de 100 amostras de soro de indiviacuteduos
doadores de sangue com sorologias negativas para HIV 1 e 2 HTLV 1 e 2 Siacutefilis
Doenccedilas de Chagas Hepatite B e para Hepatite C procedentes da fundaccedilatildeo
HEMOPA
42
42 MEacuteTODO
421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico
Foram colhidos em frasco sem anticoagulante 10ml de sangue perifeacuterico
dos 51 pacientes participantes da pesquisa A amostra sanguiacutenea de cada paciente
foi centrifugada o soro foi separado e colocado em frasco esteacuteril devidamente
identificado armazenado e resfriado de 2 a 8ordmC
Foi realizada no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais a
pesquisa soroloacutegica de anticorpos IgG anti-HCV por teste imunoenzimaacutetico (ELISA)
e os pacientes que apresentaram positividade tiveram seus resultados confirmados
atraveacutes de teacutecnicas moleculares (RT-PCR) e com identificaccedilatildeo do genoacutetipo viral
(genotipagem)
Foi realizado no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa a pesquisa
de FAN dos 51 pacientes selecionados utilizando as amostras existentes na
soroteca
422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C
Foram empregados testes soroloacutegicos de ELISA (Ensaio
Imunoenzimaacutetico) de 3ordf geraccedilatildeo utilizando-se de kits comerciais (kit ETI-AB-HCVK-
4 DiaSorin Itaacutelia) para detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos anti-HCV no soro dos
pacientes
As tiras (poccedilos) necessaacuterias para as reaccedilotildees foram retiradas da geladeira
com antecedecircncia de uma hora e deixadas agrave temperatura ambiente e os reagentes
homogeneizados rapidamente no voacutertex
O primeiro poccedilo da placa ficou o branco da reaccedilatildeo na sequecircncia da
microplaca de ELISA foi dispensado 200 microL do controle negativo em triplicata (trecircs
poccedilos) 200 microL do calibrador em duplicata (dois poccedilos) e 200 microL do controle positivo
em amostra uacutenica (um poccedilo)
Adicionou-se 200 microL do Diluente de Amostra em todos os poccedilos que
continham as amostras dos pacientes a serem dosadas na placa de ELISA
tomando cuidado para natildeo contaminar os poccedilos adjacentes
43
Dispensou-se 50 microL do Diluente do Reagente em todos os poccedilos de
controles calibradores e amostras cobrimos com adesivo para evitar evaporaccedilatildeo e
contaminaccedilatildeo das amostras e incubamos a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC
Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com
300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem diluiacuteda
Pipetou-se 100 microL de Conjugado Enzimaacutetico exceto no poccedilo do branco e
incubou-se a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se
cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com 300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem
diluiacuteda
Pipetou-se 100 microL de CromoacutegenoSubstrato em todos os poccedilos
Incubamos a microplaca protegendo-a de luz intensa e direta agrave temperatura
ambiente (18-24ordmC) por 15 min
Pipetou-se 100 microL de Aacutecido Sulfuacuterico em todos os poccedilos para ldquopararrdquo a
reaccedilatildeo enzimaacutetica e mediu-se a absorbacircncia da soluccedilatildeo obtida em leitor de ELISA
com filtro de 450 nM
O teste foi validado de acordo com os valores do controle de qualidade
preconizados pelo fabricante e que devem tanger os valores para o branco da
reaccedilatildeo le 0100 controle negativo le 0050 controle positivo ge 1000 e calibrador ge
1100 Para as amostras testadas os valores reagentes e natildeo reagentes para
pesquisa de anticorpos anti-HCV satildeo interpretados da seguinte maneira natildeo
reagentes com valores le 09 reagentes com valores ge 11 e indeterminados entre
os valores 09 ndash 11
423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia molecular
Nas amostras positivas pela sorologia (ELISA) realizou-se extraccedilatildeo do
RNA viral presente no soro do paciente utilizando kit comercial (QIAmp Viral RNA
kit Quiagen Alemanha) seguindo a teacutecnica adaptada no Laboratoacuterio de Patologia
Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais
Pipetou-se 560 microL de tampatildeo AVL (lise) contendo RNA em tubo de
centriacutefuga de 15 ml identificado adicionou-se 140 microL da amostra e homogenizou-se
em voacutertex por 15s incubando a temperatura ambiente (15-25degC) por 10 min Apoacutes
incubaccedilatildeo centrifugou-se rapidamente o tubo para remover partiacuteculas dispersas
44
Adicionou-se 560 microL de etanol (96-100) na amostra e homogenizou-se
no voacutertex por 15s centrifugando-se rapidamente para remover partiacuteculas dispersas
Depois cuidadosamente transferiu-se 630 microL para as colunas devidamente
identificadas centrifugou-se a 14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo
ficando soacute com a coluna para encaixar em outro tubo
Colocou-se o resto das amostras nas colunas devidas centrifugou-se a
14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo ficando soacute com a coluna para
encaixar em outro tubo Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW1) e
centrifugou-se por 1 min mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo
Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW2) e centrifugou-se por 4 min
mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo
Identificados os tubos para RNA colocou-se as colunas Adicionou-se 60
microL de tampatildeo para eluir (AVE) em cada amostra e centrifugou-se por 1 min
descartando a coluna e ficando com o tubo Colocou-se em banho-maria por 10 min
a 65degC centrifugado rapidamente e colocado no gelo As amostras extraiacutedas foram
congeladas e armazenadas em freezer a -20ordmC
O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado de acordo com a teacutecnica de
RT-PCR qualitativa com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das
Doenccedilas Tropicais da seguinte maneira para o Mix de uma amostra Tampatildeo 12
microL primer ou iniciador k10 1microL primer ou iniciador k11 1microL aacutegua ultrapura livre de
DNAse e RNAse 5 microL Enzima Taq polymerase One-Step (Invitrogen) 1 microL O
primer k10 constitui-se da sequecircncia GGC GAC ACT CCA CCA TRR e o primer k11
da sequecircncia GGT GCA CGG TCT ACG AGA CC
O volume do mix por amostra eacute de 20 microL e o volume da amostra (produto
da extraccedilatildeo) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As amostras
foram colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo eacute realizada a 42ordmC por 45 minutos
temperatura inicial de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 2 minutos seguida de 35 ciclos com
temperatura de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 54ordmC por 30
segundos de extensatildeo a 72ordmC por 45 segundos e temperatura de extensatildeo final de
72ordmC por 7 minutos e um hold de 4ordmC
Para visualizaccedilatildeo do produto dessa 1ordf PCR (RT-PCR) eacute feito um gel de
agarose a 1 (1g de agarose para 100mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de
etidium) que migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os
resultados foram visualizados atraveacutes de luz ultravioleta (UV) Os pacientes
45
positivos que apresentarem ldquobandardquo devem continuar os procedimentos e os
negativos que natildeo apresentarem ldquobandasrdquo deveratildeo ser liberados como
indetectaacuteveis por este meacutetodo
A 2ordf PCR (RFLP) foi responsaacutevel por fazer a amplificaccedilatildeo do cDNA
produto da 1ordf PCR Para esta etapa tambeacutem com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio
de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais foram necessaacuterios para o Mix de uma
amostra Tampatildeo 10X 25 microL DNTP 4 microL MgCl2 15 microL primer ou iniciador k15 1
microL primer ou iniciador k16 1 microL aacutegua ultrapura livre de DNAse e RNAse 125 microL
Enzima Taq platinum (Invitrogen) 05 microL O primer k15 constitui-se da sequecircncia
ACC ATR RAT CAC TCC CCT GT e o primer k16 da sequecircncia CAA GCA CCC TAT
CAG GCA GT
O volume do mix por amostra foi de 23 microL e o volume da amostra
(produto da 1ordf PCR) de 2 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As
amostras satildeo colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo se realiza a temperatura inicial
de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 4 minutos seguida de 35 ciclos com temperatura de
desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 55ordmC por 45 segundos de
extensatildeo a 72ordmC por 1 minuto e temperatura de extensatildeo final de 72ordmC por 7
minutos e um hold de 4ordmC
O produto da 2ordf PCR eacute observado atraveacutes de um gel de agarose a 1 (1g
de agarose para 100 mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que
migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os resultados
foram visualizados atraveacutes de luz UV (ultravioleta) Os pacientes positivos que
apresentaram ldquobandardquo (fragmento amplificado) se continuou os procedimentos e os
negativos que natildeo apresentaram ldquobandasrdquo foram repetidos para o procedimento da
2ordf PCR
424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem)
Os pacientes positivos para a 2ordf PCR foram submetidos agrave genotipagem
do viacuterus atraveacutes do meacutetodo de RFLP utilizando um par de enzimas de restriccedilatildeo
AVA II e RSA I Essa teacutecnica tambeacutem foi adaptada no Laboratoacuterio de Patologia
Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais
46
Na determinaccedilatildeo do genoacutetipo cada amostra eacute utilizada duas vezes
sendo uma reaccedilatildeo para AVA II e uma para RSA I portanto cada amostra teve dois
tubos correspondentes
Para a preparaccedilatildeo do mix de uma amostra para a enzima de restriccedilatildeo
AVA II (Promega) foram utilizados Buffer C X 30 2 microL aacutegua ultrapura livre de
DNAse e RNAse 125 microL AVA II 05 microL Para o mix de uma amostra de RSA I
(Invitrogen) satildeo necessaacuterios React 1 10X 2 microL aacutegua ultrapura libre de DNAse e
RNAse 11 microL RSA I 2 microL
O volume do mix por amostra foi de 15 microL e o volume da amostra
(produto da 2ordf PCR) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 20 microL para
cada frasco correspondente a sua enzima de restriccedilatildeo As amostras formatildeo ldquoparesrdquo
de tubos AVA II e RSA I e satildeo colocadas em banho-maria a 37ordmC overnight para
digerir (cortar) os fragmentos
Para visualizaccedilatildeo do produto da digestatildeo (RFLP) e verificaccedilatildeo dos
genoacutetipos foi preparado um gel de agarose a 2 (2g de agarose para 100 mL de
tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que migrou em cuba de eletroforese
com 100V 500A por 60 minutos Os resultados foram visualizados atraveacutes de luz UV
(ultravioleta) Os pacientes positivos apresentam ldquobandasrdquo (fragmentos) de
tamanhos diferentes O nuacutemero de bandas e sua disposiccedilatildeo no gel formaram
padrotildees de combinaccedilotildees correspondentes a cada genoacutetipo viral
425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas HEp-2
A pesquisa de auto-anticorpo contra antiacutegenos celulares foi realizada no
Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa pela teacutecnica de imunofluorescecircncia
indireta que os identifica atraveacutes da ligaccedilatildeo destes auto-anticorpos aos antiacutegenos do
substrato sendo esta ligaccedilatildeo revelada pela adiccedilatildeo de um soro com atividade Anti-
IgG conjugado agrave fluoresceiacutena
As amostras foram testadas utilizando-se um conjunto diagnoacutestico
comercial Antinuclear Antibody HEp-2 da Hemagen Diagnostics
Na primeira fase da reaccedilatildeo os soros diluiacutedos 140 colocados em contato
com o substrato durante 20 minutos seguido de lavagem com soluccedilatildeo salina
tamponada por 10 minutos Na segunda fase aplicacou-se a substacircncia
47
fluorescente sendo o conjugado diluiacutedo 130 deixando-se por 10 minutos seguida
de nova lavagem de 10 minutos e montagem da lacircmina com glicerina tamponada
Em cada lacircmina foram utilizados controle positivo e controle negativo
A leitura das lacircminas foi realizada em microscoacutepio de imunofluorescecircncia
marca Nikon modelo Eclipse E-200
Os criteacuterios morfoloacutegicos observados durante a leitura foram
a) aspecto da matriz nuclear
b) aspecto do nucleacuteolo
c) observaccedilatildeo de todos os estaacutegios de divisatildeo nuclear
d) aspecto do fuso mitoacutetico
e) aspecto do citoplasma
43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados coletados foram estruturados em um banco de dados no qual
tambeacutem foram confeccionadas tabelas e graacuteficos para representaccedilatildeo dos dados
Posteriormente foram analisados no programa Bioestat 50 para a geraccedilatildeo de
resultados estatiacutesticos que comprovassem a associaccedilatildeo de variaacuteveis pertinentes ao
estudo considerando o intervalo de confianccedila (IC) 95 e niacutevel α 5 (p-valor le 005)
isto eacute um achado seraacute considerado estatisticamente significante se valor de ldquoprdquo for
menor ou igual a 005 e seraacute considerado sem significacircncia estatiacutestica se esse valor
de ldquoprdquo for maior que 005
Nas variaacuteveis quantitativas foram realizadas as medidas de tendecircncia
central sendo calculado a meacutedia e a mediana com seus respectivos desvios
padrotildees O teste t foi usado para comparar as idades entre as amostras
O teste do Qui-quadrado e o teste G foram aplicados nas comparaccedilotildees de
n amostras independentes cujas proporccedilotildees observadas nas diversas modalidades
estiveram dispostas em tabelas de contigecircncia l x c onde se determinou as
proporccedilotildees observadas nas diferentes categorias e se estas tinham alguma
associaccedilatildeo
48
5 RESULTADOS
O Padratildeo de FAN em 100 dos 51 pacientes infectados pelo HCV e em
2 dos natildeo infectados pelo HCV ocorreu Citoplasmaacutetico
Com relaccedilatildeo agrave distribuiccedilatildeo dos pacientes por gecircnero observou-se uma
predominacircncia do gecircnero masculino (667) A faixa etaacuteria predominante foi a de 30
a 50 anos de idade (628) seguida da faixa etaacuteria compreendida entre 51 e 60
anos (196) No que diz respeito agrave naturalidade houve uma predominacircncia de
paraenses em 922 da amostra A maioria dos pacientes incluiacutedos no estudo foi
proveniente da Fundaccedilatildeo HEMOPA (98) por se tratarem de candidatos a doaccedilatildeo
de sangue (Tabela 1)
Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV segundo as caracteriacutesticas demograacuteficas janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Caracteriacutesticas demograacuteficas n Teste estatiacutestico Gecircnero
Masculino 34 667 Qui-quadrado Feminino 17 333 p = 00251
Total 51 1000
Idade (anos) lt 30 6 118 Qui-quadrado
30 a 40 16 314 p = 00094 41 a 50 16 314 51 a 60 10 196
gt 60 3 59 Total 51 1000
Naturalidade
Paraense 47 922 Qui-quadrado Macapaense 1 20 p lt 00001 Maranhense 1 20
Pernambucano 1 20 Gauacutecho 1 20
Total 51 1000
Procedecircncia Qui-quadrado HEMOPA 50 980 p lt 00001
IASEP 1 20 Total 51 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
49
Identificou-se no estudo a predominacircncia do genoacutetipo viral do tipo 1
(882) estando o genoacutetipo 3 presente em 118 dos casos Em 255 dos
pacientes foi observado uma positividade para FAN sendo que todos apresentaram
o padratildeo citoplasmaacutetico (Tabela 2)
Tabela 2 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV conforme os resultados laboratoriais de FAN citoplasmaacutetico e genotipagem janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Exames laboratoriais n Teste estatiacutestico
Genoacutetipo viral - HCV
Tipo 1 45 882 Qui-quadrado
Tipo3 6 118 p lt 00001
Total 51 1000
FAN Qui-quadrado
Positivo (citoplasmaacutetico) 13 255 p = 00008
Negativo 38 745 Total 51 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
Observou-se uma baixa positividade para o FAN tanto no gecircnero
masculino (294) quanto no gecircnero feminino (176) Natildeo houve diferenccedila
estatiacutestica significante entre os gecircneros e a anaacutelise do FAN (p = 05652) Isto eacute
independendo do gecircnero do paciente nada se poderaacute inferir se o mesmo teraacute maior
ou menor chance de possuir um FAN positivo ou negativo (Tabela 3)
Tabela 3 ndash Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
FAN (citoplasmaacutetico)
Gecircnero Teste estatiacutestico
(Teste G) Masculino Feminino
N N
Positivo 10 294 3 176
Negativo 24 706 14 824 p = 05652
Total 34 1000 17 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
Dentre os pacientes infectados o genoacutetipo viral tipo 1 e o tipo 3
predominaram no gecircnero masculino embora natildeo havendo diferenccedila significativa
entre os grupos (p=06376)(Tabela 4)
50
Tabela 4 - Relaccedilatildeo da genotipagem de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Gecircnero
Grupos estudados Teste estatiacutestico
(Teste G) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3
n n Masculino 29 644 5 833 p=06376 Feminino 16 356 1 167
Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa
Na faixa etaacuteria de 30 a 50 anos foi observada uma maior proporccedilatildeo (667)
do genoacutetipo viral do tipo 3 enquanto que para o genoacutetipo tipo 1 foi de 628 natildeo
tendo essa diferenccedila significacircncia estatiacutestica (Tabela 5)
Tabela 5 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e faixa etaacuteria - janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)
Idade (anos) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n
lt 30 04 118 0 00
30 a 40 15 314 3 500 p = 06401
41 a 50 15 314 1 167
51 a 60 08 196 2 333
gt 60 03 59 0 00 Total 45 1000 6 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
A anaacutelise descritiva das idades dos pacientes demonstrou que a meacutedia e
a mediana foi de 43 anos para aqueles com genoacutetipo viral tipo 1 no entanto para o
genoacutetipo viral tipo 3 a meacutedia foi de 44 e a mediana de 42 anos Observou-se que a
idade miacutenima dos pacientes com genoacutetipo viral-HCV do tipo 1 e 3 foi
respectivamente de 20 e 32 anos e a maacutexima foi de 68 e 57 anos perfazendo uma
amplitude total de 48 e 25 anos respectivamente Natildeo houve significacircncia estatiacutestica
entre as idades encontradas nos genoacutetipos 1 e 3 (Tabela 6 )
De acordo com o FAN citoplasmaacutetico a idade miacutenima dos pacientes com
FAN positivo e negativo foi respectivamente de 30 e 20 anos e a maacutexima foi de 53 e
68 anos perfazendo uma amplitude total de 23 e 48 anos respectivamente As
idades meacutedia e mediana foram respectivamente 435 e 46 anos nos pacientes com
o FAN positivo e meacutedia de 43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN
51
negativo Natildeo houve diferenccedila estatisticamente significativa entre as idades
encontradas nos pacientes com FAN positivo e negativo (Tabela 6)
Tabela 6 - Estudo descritivo da idade dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e presenccedila do FAN citoplasmaacutetico janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Grupos Estudados Genoacutetipo viral - HCV Auto anticorpo
Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 FAN (+) FAN (-) IDADE
Tamanho da amostra 45 6 13 38
Idade miacutenima 20 32 30 20
Idade maacutexima 68 57 53 68
Amplitude Total 48 25 23 48
Meacutedia Aritmeacutetica 43 44 435 43
Mediana 43 42 46 42
Desvio Padratildeo 107 93 78 113
Teste t p = 08363 p = 08809 Fonte Protocolo da pesquisa
Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos em que foram analisados AST
ALT ASTALT γ-GT e fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo
semelhantes dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e 3 natildeo
atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos
(Tabela 7)
Tabela 7- Distribuiccedilatildeo dos genoacutetipos dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Paracircmetros bioquiacutemicos
Genoacutetipo viral - HCV Teste estatiacutestico
(Teste t) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3
micro plusmn DP micro plusmn DP
AST 353 plusmn 219 328 plusmn 137 p = 07907
ALT 372 plusmn 321 288 plusmn 136 p = 05355
ASTALT 12 plusmn 07 14 plusmn 11 p = 06110
γ-GT 403 plusmn 38 302 plusmn 138 p = 02194
Fosfatase alcalina 1126 plusmn 443 1087 plusmn 376 p = 08349
Fonte Protocolo da pesquisa
Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos de AST ALT ASTALT γ-GT e
fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os
52
pacientes com FAN positivo e negativo natildeo sendo observada significacircncia
estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos de FAN (Tabela 8)
Tabela 8 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Paracircmetros bioquiacutemicos Auto anticorpos
Teste estatiacutestico (Teste t) Positivo Negativo
micro plusmn DP micro plusmn DP
AST 419 plusmn 238 326 plusmn 197 p = 01704
ALT 408 plusmn 29 346 plusmn 312 p = 05347
ASTALT 13 plusmn 08 12 plusmn 07 p = 05732
γ-GT 34 plusmn 21 409 plusmn 40 p = 04369
Fosfatase alcalina 1073 plusmn 345 1138 plusmn 462 p = 06431 Fonte Protocolo da pesquisa
Na comparaccedilatildeo entre resultados positivos e negativos do FAN
citoplasmaacutetico observou-se uma maior prevalecircncia da negatividade tanto em
pacientes natildeo infectados (98) como em pacientes infectados (745) pelo HCV
sendo essa diferenccedila estatisticamente significativa (plt00001) o que representa
uma natildeo associaccedilatildeo entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV
(Tabela 9)
Tabela 9 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico segundo a presenccedila ou ausecircncia de infecccedilatildeo por HCV janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
FAN (citoplasmaacutetico)
Pacientes Teste estatiacutestico (Teste G)
Infectados Natildeo infectados
N n
Positivo 13 255 2 2
Negativo 38 745 98 98 p lt 00001
Total 51 1000 100 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
Comparando-se os resultados do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos
viras observa-se que o resultado negativo eacute superior ao positivo em ambos os
genoacutetipos virais sendo 711 para o genoacutetipo viral 1 e 100 para o genoacutetipo viral 3
No entanto esta diferenccedila observada natildeo eacute estatisticamente significativa (p=02573)
(Tabela 10)
53
Tabela 10 - Distribuiccedilatildeo do FAN de acordo com o genoacutetipo viral janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
FAN (citoplasmaacutetico)
Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)
Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n
Positivo 13 289 0 00 p=02573 Negativo 32 711 6 1000
Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa
54
6 DISCUSSAtildeO
Desde o primeiro marcador soroloacutegico para diagnoacutestico do Lupus
Eritematoso Sistecircmico (LES) a ceacutelula LE descrita por Hargraves (1948) vaacuterios
substratos antigecircnicos foram utilizados para o estudo dos auto-anticorpos os quais
terminaram amplamente substituiacutedos pelas ceacutelulas HEp-2 Estas apresentam
significativas vantagens sobre os demais pela sua sensibilidade variedade de
antiacutegenos presentes e pelas facilidades morfoloacutegicas para o seu estudo
O uso da imunofluorescecircncia indireta para a visualizaccedilatildeo dos anticorpos
antinucleares nas ceacutelulas HEp-2 permite o reconhecimento de mais de 30 diferentes
padrotildees de fluorescecircncia como nucleares nucleolares da membrana nuclear do
aparelho mitoacutetico e citoplasmaacutetico todos satildeo proporcionados por diferentes auto-
anticorpos
A partir do 1deg Consenso Brasileiro para Padronizaccedilatildeo dos Laudos de FAN
(HEp-2) os criteacuterios para o preparo interpretaccedilatildeo da fluorescecircncia e nomenclatura
dos resultados passaram a ser normatizados Alguns padrotildees de fluorescecircncia satildeo
relativamente inespeciacuteficos outros satildeo ocasionados por uma gama restrita de auto-
anticorpos e outros ainda por um uacutenico auto-anticorpo (DELLAVANCE et al
2002) Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a tornaacute-las
imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo (DE
LARANAGA et al 2000)
Apesar do padratildeo de fluorescecircncia na maioria das vezes natildeo se pode
identificar o anticorpo presente ele pode sugerir ao cliacutenico qual o proacuteximo passo a
ser dado na investigaccedilatildeo da sua especificidade Os resultados encontrados devem
estar em associaccedilatildeo com a cliacutenica os padrotildees de fluorescecircncia e os tiacutetulos
alcanccedilados com a diluiccedilatildeo preacutevia (DELLAVANCE et al 2003)
No presente estudo a analise de 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo Viacuterus da
Hepatite C esteve presente o anticorpo-antinuclear (ANA FAN) em 13 (255) dos
pacientes e todos eram padratildeo citoplasmaacutetico corroborando com outros estudos
encontrados na literatura como
Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de
pacientes infectados pelo viacuterus HIV com Hanseniacutease e co-infectados com
Hanseniacutease HIV Ela obteve respectivamente as seguintes taxas de prevalecircncias
32 333 e 478 Em todos os grupos neste estudo houve predomiacutenio do
55
padratildeo citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear soacute foi observado entre os pacientes com
hanseniacutease (91) e co-infectados (237)
Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de
pacientes infectados pelo viacuterus da Dengue e viacuterus linfotroacutepico de ceacutelulas T humanas
HTLV-12 e controle Normais e obteve respectivamente as seguintes taxas de
prevalecircncias 40 40 e 2 Em todos os grupos houve predomiacutenio do padratildeo
citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear foi observado entre os pacientes com dengue
(67) e HTLV 12 (133)
Segundo Andrade et al (2002) Dellavance et al (2005) Dellavance e
Andrade et al (2007) o predomiacutenio do padratildeo de FAN do tipo citoplasmaacutetico indica
que determinados padrotildees de fluorescecircncia satildeo mais especiacuteficos de doenccedila auto-
imune enquanto outros ocorrem em indiviacuteduos com enfermidades natildeo auto-imunes
por ser o citoplasma celular rico em proteiacutenas para as quais auto-anticorpos naturais
apresentam afinidade moderada eacute comum observar positividade para FAN em
indiviacuteduos sadios cujo significado ainda natildeo eacute entendido completamente
O padratildeo Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina que pode ser
encontrado em Hepatite auto-imune Cirrose Hepatite C Hepatocarcionoma entre
outros Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica
definida Um resultado positivo pode estar ou natildeo associado a uma patologia assim
como poderaacute ou natildeo vir a apresentar uma doenccedila auto-imune com o passar do
tempo (DELLAVANCE et al 2003) Neste estudo natildeo foi feito avaliaccedilatildeo prospectiva
dos resultados embora todos sejam FAN citoplasmaacuteticos
Os achados de FAN positivo em populaccedilotildees sadias ou sem doenccedilas auto-
imunes tambeacutem jaacute observado por Leser et al (2004) que em 394 pacientes com
FAN-HEp-2 positivo natildeo encontraram nenhum paciente com doenccedila auto-imune
Outro exemplo estaacute no padratildeo citoplasmaacutetico de pontos isolados
estudado por Laurino et al (2006) presente em indiviacuteduos sem evidecircncia de auto-
imunidade mas tambeacutem em indiviacuteduos com acometimento de doenccedilas auto-imunes
sistecircmicas e natildeo-especiacuteficas
Os dados apresentados corroboram com este estudo em que foi
observado a presenccedila do auto-anticorpo em 2 (2 ) dos 100 indiviacuteduos sadios do
grupo controle todos com padratildeo citoplasmaacutetico
56
Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a
tornaacute-las imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo
(DE LARANAGA et al 2000)
Nas Infecccedilotildees agudas espera-se que a resposta auto-imune diminua a
medida que os viacuterus satildeo eliminados Entretanto alguns trabalhos sugerem que em
indiviacuteduos geneticamente susceptiacuteveis as reaccedilotildees auto-imunes possam persistir
apesar do clareamento viral uma vez que o gatilho imunoloacutegico foi ativado e natildeo
houve desativaccedilatildeo (DE LARANAGA et al 2000 SAKKAS et al 2008)
Ramos-Casals et al (2009) no estudo Doenccedilas Sistecircmica Auto-Imunes
em Pacientes com Infecccedilatildeo pelo (72) dos pacientes eram do gecircnero feminino e
(28) do masculino(ANA FAN) em 61 dos pacientes o que se diferem deste
trabalho eacute que dos 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo (667) eram do gecircnero
masculino e (333) eram do gecircnero feminino com meacutedia de idade de 430 (plusmn107)
anos com presenccedila de anticorpo-antinuclear em 13 (255) com meacutedia e mediana
respectivamente de 435 e 46 anos nos pacientes com o FAN positivo e meacutedia de
43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN negativo
Alter (1995) em sua pesquisa natildeo observou associaccedilatildeo entre o risco de
infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas designadas por gecircnero idade e raccedila Na
referida pesquisa foram estudados 51 pacientes com idade meacutedia de 430 (+- 107)
anos 34 (667) eram do gecircnero masculino e 17 (333) do gecircnero feminino todos
em fase preacute-tratamento assintomaacuteticos natildeo permitindo avaliar os risco da
infecccedilatildeoSegundo Pordeus et al (2008) a ocorrecircncia destes auto-anticorpos
indicaria um prognoacutestico desfavoraacutevel Perperas Mcfarlane e Mcsorley (1986)
sugeriram que os auto-anticorpos poderiam estar envolvidos na progressatildeo ou no
desenvolvimento de hepatites crocircnicas possivelmente por um distuacuterbio no controle
da auto-reatividade Outros estudos questionam a participaccedilatildeo dos auto-anticorpos
no processo de transiccedilatildeo para cronicidade das hepatites agudas virais poreacutem os
resultados natildeo satildeo convincentes (SHOENFELD ROSE 2004)
Lopez Seia e Roy (1998) demonstraram a presenccedila de anticorpo anti-
actina em baixos tiacutetulos em crianccedilas com hepatite aguda por curto periacuteodo de
tempo poreacutem nenhuma associaccedilatildeo com gravidade da agressatildeo hepaacutetica foi
descrita
Neste estudo a presenccedila dos auto-anticorpos em (255) dos pacientes
com infecccedilatildeo pelo HCV natildeo puderam ser relacionada com a gravidade da doenccedila
57
pois este estudo foi realizado em pacientes receacutem diagnosticados entatildeo seria
necessaacuterio um acompanhamento destes por um periacuteodo maior de tempo com a
finalidade de concluir esta afirmativa Apesar da presenccedila transitoacuteria de auto-
anticorpos jaacute ter sido descrita em doenccedilas virais comuns a associaccedilatildeo entre a
presenccedila de auto-anticorpos e a gravidade das doenccedilas necessita de comprovaccedilatildeo
Passaleva Massai e Leoncini (1983) avaliaram 302 pacientes com
hepatites agudas virais e encontraram complexos imunes circulantes (CIC) em
516 dos pacientes com frequumlecircncia significativamente maior em hepatite aguda
Nenhuma associaccedilatildeo entre a presenccedila de imuno-complexos e o niacutevel de
aminotransferases ou bilirrubina foi encontrada Segundo Andrade et al (2002)
Dellavance et al (2005) Andrade et al (2007) nos pacientes do estudo foi feita a
relaccedilatildeo entre a presenccedila dos auto-anticorpos e niacuteveis de aminotransferases e as
elevaccedilotildees natildeo tiveram significacircncia poreacutem houve associaccedilatildeo do genotipo viral 1
Nos paracircmetros bioquiacutemicos analisados em relaccedilatildeo aos genoacutetipos houve uma
distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e
3 natildeo atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os
grupos Segundo Wilson (1997) trecircs estudos mostraram correlaccedilatildeo entre niacuteveis
altos de alanina aminotransferase e atividade histoloacutegica da doenccedila hepaacutetica
Poreacutem nos pacientes considerados individualmente o valor preditivo dessa
associaccedilatildeo foi baixo enquanto muitos deles com enzimas normais apresentavam
graves alteraccedilotildees histoloacutegicas No presente estudo natildeo foi observada associaccedilatildeo entre os niacuteveis de
aminotransferases e a cronificaccedilatildeo da hepatite viral pois nem todos os pacientes do
estudo apresentavam resultado de bioacutepsia hepaacutetica
Alter et al (1999) afirmam que no Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b
(63) e 3a (313) em estudo realizado em Goiacircnia onde foi observada uma
maior prevalecircncia do genoacutetipo 1 seguida do genoacutetipo 3 em doadores de sangue e
hemofiacutelicos (DELLAVANCE ANDRADE et al 2007) Estando esses dados em
acordo com esta pesquisa que com genotipagem do viacuterus da hepatite C que
identificou o genoacutetipo 1 em 45 (882) seguidos pelo genoacutetipo 3 que foi
identificado em 6 (118) dos pacientes com infecccedilatildeo pelo HCV Em um estudo realizado na Franccedila com 13 pacientes luacutepicas infectadas
pelo viacuterus C 8 apresentavam o RNA viral sendo o genoacutetipo 1 presente em cinco
58
(625) casos seguido do genoacutetipo 3 (375) (PERLEMUTER et al 2000) dados
que se assemelham aos do presente estudo embora o estudo natildeo tenha incluiacutedo
pacientes com outras infecccedilotildees associadas ao HCV Eacute importante ressaltar que
estudos sobre genotipagem do HCV em indiviacuteduos com doenccedilas reumaacuteticas satildeo
raros
No presente estudo houve uma frequumlecircncia baixa de positividade para o
FAN nos pacientes com genoacutetipo 1 e genoacutetipo 3 Natildeo havendo significacircncia
estatiacutestica entre os pacientes com genoacutetipo 1 e 3
Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter
implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave menor
resposta agrave terapia antiviral (BRUNO et al1997) o que natildeo foi avaliado neste estudo
pois apesar de (882) dos pacientes serem genoacutetipo 1 todos estavam em fase de
reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica seja preacute- tratamento Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila
poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses
autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis
vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo
hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja
quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a
concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave
hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em
parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)
59
7 CONCLUSOtildeES
minus O padratildeo dos auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares encontrados nos
dois grupos estudados foi o citoplasmaacutetico
minus A prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares no grupo com
infecccedilatildeo pelo VHC foi significativamente maior do que no grupo controle
minus Nos resultados de FAN citoplasmaacutetico haacute uma maior prevalecircncia da
negatividade em pacientes infectados pelo HCV e natildeo infectados sendo
essa diferenccedila estatisticamente significativa conferindo a natildeo associaccedilatildeo
entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV
minus Os resultados negativos do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos viras eacute
superior aos positivos em ambos os genoacutetipos virais entretanto esta diferenccedila
natildeo eacute estatisticamente significativa
minus Houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos
celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado
minus Natildeo houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos
celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado com
relaccedilatildeo ao gecircnero onde predominou o gecircnero masculino nos dois grupos
minus Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter
implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave
menor resposta agrave terapia antiviral o que natildeo foi avaliado neste estudo pois
os pacientes estavam em fase preacute tratamento sugerindo que estes pacientes
sejam avaliados futuramente
minus A formaccedilatildeo dos auto-anticorpos parece ser mais uma consequumlecircncia do que
uma causa da agressatildeo hepaacutetica
minus A negatividade do FAN ndash Hep 2 foi maior que a positividade mas todos os
FAN positivos pertenciam ao genoacutetipo viral tipo 1 nos pacientes infectados
pelo HCV
minus Nesta pesquisa os resultados de PCR o RNA-HCV de reconfirmaccedilatildeo foi
positivo para o anti-HCV em todos os soros analisados mostrando assim
que estes pacientes eram portadores de infecccedilatildeo por viacuterus C ou seja natildeo
houve falso positivo anteriormente poreacutem todos eram assintomaacuteticos
dificultando a conclusatildeo de ser ou natildeo uma infecccedilatildeo persistente
60
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APEcircNDICES
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APEcircNDICE A - TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Vocecirc estaacute sendo convidado para fazer parte de uma pesquisa que estaacute sendo desenvolvida pela Universidade Federal do Paraacute no Nuacutecleo de Medicina Tropical intitulada AUTOANTICORPOS CONTRA ANTIacuteGENOS CELULARES E SUA CORRELACcedilAtildeO COM O GENOacuteTIPO VIRAL EM PACIENTES COM INFECCcedilAtildeO PELO VIacuteRUS DA HEPATITE C (HCV)
O Objetivo da pesquisa eacute fazer uma correlaccedilatildeo do anticorpo antinuacutecleo (FAN) e o genoacutetipo viral em pacientes com hepatite C e o estaacutegio da doenccedila hepaacutetica a partir da histologia sempre que permitidos e correlacionar ao diagnoacutestico
Caso vocecirc participe da pesquisa seraacute necessaacuterio que forneccedila uma amostra de sangue (2ml)
O uacutenico inconveniente que vocecirc poderaacute experimentar eacute a dor provocada pela agulha na hora da coleta de sangue bem como pequenos hematomas que possam vir a ocorrer e que natildeo causam danos
Essa pesquisa natildeo oferece riscos as praacuteticas satildeo de uso rotineiro e seratildeo utilizados materiais esterilizados e descartaacuteveis como agulhas seringas etc
Estaacute garantido a vocecirc todas as informaccedilotildees que vocecirc queira antes durante e depois da pesquisa
A sua participaccedilatildeo neste estudo eacute voluntaacuteria Vocecirc tem a liberdade de recusar participar da pesquisa a qualquer momento
As informaccedilotildees relacionadas agrave pesquisa poderatildeo ser inspecionadas pelos pesquisadores que executam a pesquisa e pelas autoridades legais no entanto se qualquer informaccedilatildeo for divulgada em relatoacuterio publicaccedilatildeo ou qualquer outro meio isto seraacute feito de forma codificada para manter o caraacuteter confidencial
Todas as despesas necessaacuterias para a realizaccedilatildeo do estudo natildeo satildeo de sua responsabilidade assim como a sua participaccedilatildeo na pesquisa na seraacute remunerada (vocecirc natildeo receberaacute qualquer valor em dinheiro)
Quando os resultados forem divulgados natildeo apareceraacute seu nome e sim um coacutedigo
_____________________________________
Assinatura do Pesquisador Responsaacutevel NomeAna Maria Almeida Souza EndRodovia Maacuterio Covas 1426 ndash Cond Green Garden casa 41 Fone(91) 32352665 81197217 RegConselhoCRM 1508
69
APEcircNDICE B - CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Declaro que li as informaccedilotildees acima sobre a pesquisa que me sinto
perfeitamente esclarecido sobre o conteuacutedo da mesma assim como seus riscos e
benefiacutecios Declaro ainda que por minha livre vontade aceito participar da pesquisa
cooperando com a coleta de material para exame
Beleacutem _________
_________________________________________
Assinatura do sujeito da pesquisa ou do
responsaacutevel
70
ANEXOS
71
- Assinatura do Pesquisador Responsaacutevel
-
- Beleacutem _________
-
SAF Siacutendrome antifosfoliacutepide
SIDA Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida
SS Siacutendrome de Sjoumlgren
UFPA Universidade Federal do Paraacute
UV ultravioleta
VHA Viacuterus da Hepatite A
VHC Viacuterus da Hepatite C
VHCHCV Hepatite C
VV Hanseniacutease generalizada
SUMAacuteRIO 1 INTRODUCcedilAtildeO 15 11 HEPATITE C (VHCHCV) 15 111 Consideraccedilotildees Gerais 15 112 Agente Etioloacutegico 16 113 Epidemiologia 17 114 Modo de Transmissatildeo 18 115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica 19 116 Diagnoacutestico 23 12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC 25
13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC 26
14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE 27
15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES AGUDAS VIRAIS 31
16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN 32 2 JUSTIFICATIVA 39 21 ASPECTOS EacuteTICOS 39 3 OBJETIVOS 40
31 OBJETIVO GERAL 40
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 40 4 MATERIAL E MEacuteTODOS 41 41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO) 41 411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C 41 412 Grupo de natildeo infectados 41 42 MEacuteTODO 42 421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico 42 422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C 42 423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia
molecular 43
424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem) 45 425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas
HEp-2 46 43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 47 5 RESULTADOS 48 6 DISCUSSAtildeO 54 7 CONCLUSOtildeES 59 REFEREcircNCIAS 60 APEcircNDICES 67 ANEXOS 70
15
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 HEPATITE C (VHCHCV)
111 Consideraccedilotildees Gerais
As hepatites virais satildeo doenccedilas causadas por diferentes agentes
etioloacutegicos de distribuiccedilotildees universais que tecircm em comum o hepatotropismo
Possuem semelhanccedilas do ponto de vista cliacutenico-laboratorial mas apresentam
importantes diferenccedilas epidemioloacutegicas quanto agrave sua evoluccedilatildeo (FERREIRA
SILVEIRA 2004) Desde a descriccedilatildeo e definiccedilatildeo em 1989 (CHOO et al 1989 apud
RIBEIRO et al 2007) tornou-se evidente sua associaccedilatildeo com uma grande
variedade de manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas desordens reumaacuteticas e auto-imunes
(ALMEIDA 2010)
A infecccedilatildeo pelo VHCHCV acarreta inflamaccedilatildeo hepaacutetica e esteatose
podendo evoluir para fibrose hepaacutetica e cirrose em indiviacuteduos cronicamente
infectados estes com grande risco de desenvolvimento de carcinoma hepatocelular
(RIBEIRO et al 2007) Essas complicaccedilotildees tardias ocorrem em um periacuteodo em
geral superior a 20 anos apoacutes o iniacutecio da infecccedilatildeo A avaliaccedilatildeo filogeneacutetica das
sequumlecircncias do VHCHCV investigadas em vaacuterias regiotildees geograacuteficas sugere que
existam pelo menos seis genoacutetipos principais designados pelos nuacutemeros de 1 a 6 e
pelo menos 30 subtipos designados por letras minuacutesculas Nos Estados Unidos
prevalecem os genoacutetipos 1a (60) e 1b (20) Os tipos 5 e 6 satildeo mais encontrados
no sudeste e sul da Aacutefrica O tipo 4 eacute predominante na Aacutefrica Central e no Oriente
Meacutedio No Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b (63) e 3a (313) (BASSIT et
al 1999 apud RIBEIRO et al 2007) As informaccedilotildees sobre as causas que
determinam o curso evolutivo da doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos
progressos que haacute no campo do diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHCHCV Uma
questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo genoacutetipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de
lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o genoacutetipo 1 (1b) cursa com lesotildees
histoloacutegicas mais graves
As uacuteltimas deacutecadas foram de notaacuteveis conquistas no que se refere agrave
prevenccedilatildeo e ao controle das hepatites virais Entre as doenccedilas endecircmico-
epidecircmicas que representam problemas importantes de sauacutede puacuteblica no Brasil
16
salientam-se as Hepatites Virais cujo comportamento epidemioloacutegico no nosso paiacutes
e no mundo tem sofrido grandes mudanccedilas nos uacuteltimos anos
Antes da seleccedilatildeo rigorosa dos doadores de sangue em 1991 o
VHCHCV era a maior causa de hepatite poacutes-transfusional Atualmente permanece
como tal em casos esporaacutedicos (CONTE 2000) Os grupos considerados de risco
satildeo pessoas que receberam transfusatildeo de sangue antes de 1992 usuaacuterios de
drogas injetaacuteveis profissionais de sauacutede que lidam com sangue pacientes de
hemodiaacutelise e com menor risco pessoas tatuadas ou com piercings (CLEMENTE
ONO-NITA 2007)
A melhoria das condiccedilotildees de higiene e de saneamento das populaccedilotildees a
vacinaccedilatildeo contra a Hepatite B (HBV) e as novas teacutecnicas moleculares de diagnoacutestico
do viacuterus da Hepatite estatildeo entre esses avanccedilos importantes (BRASIL 2008)
112 Agente Etioloacutegico
O VHCHCV um viacuterus aacutecido ribonucleacuteico (RNA) da famiacutelia Flaviviridae
representa a principal causa da previamente denominada hepatite natildeo-A natildeo-B
(SANTOS 2009) Foi identificado e isolado a partir de um clone derivado de um
genoma NANBH semelhante aos togaviridae ou flaviviridae (SAADE 2008) e
visualizado a imunoeletromicroscopia como partiacutecula de 55 a 65 nm de diacircmetro
com projeccedilotildees espiculares e de morfologia muito semelhante aos flaviviridae Aleacutem
disso estas partiacuteculas reagiram especificamente com anticorpos mono e policlonais
do conteuacutedo proteacuteico do envelope do VHC (HIRANUMA et al 1994 apud CONTE
2000)
O agente etioloacutegico do HCV natildeo eacute uma partiacutecula homogecircnea e apresenta
uma taxa alta de mutaccedilatildeo levando-o a uma heterogeneicidade genocircmica cujo
resultado eacute um grande nuacutemero de genoacutetipos (1a 1b 2a 2b 3a 3b 4 5 6)
(AUGUSTO LOBATO 2003) Natildeo haacute evidecircncias de variantes natildeo patogecircnicas O
genoacutetipo 1b eacute o que apresenta maior virulecircncia e pior resposta ao tratamento
(LAUER WALKER 2001 apud SOUZA 2007) No Brasil dados obtidos a partir de
casos isolados e estudos de pequenas amostragens indicam que o genoacutetipo 1b
ocorre em cerca de 30 a 40 dos casos o 1a em cerca de 20 1a e 1b em 20
o 3a em cerca de 28 (FOCACCIA 2004)
17
113 Epidemiologia
De acordo com a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) a HCV eacute uma
questatildeo de sauacutede puacuteblica e tambeacutem a principal causa de transplante de fiacutegado no
Brasil (SOCIEDADE BRASILEIRA DE HEPATOLOGIA 2005) Eacute estimada uma
prevalecircncia em torno de 10 para a infecccedilatildeo pelo VHC na populaccedilatildeo mundial
(KILLEMBERG 2000) Nos Estados Unidos cerca de 27 milhotildees de pessoas estatildeo
infectadas pelo viacuterus (BRASIL 2006)
De acordo com Ferreira e Silveira (2004) no Brasil o nuacutemero de pacientes
infectados eacute incerto relacionado geralmente a alguns estados e municiacutepios e o
esclarecimento dos agentes causadores das hepatites cuja identificaccedilatildeo requer
teacutecnicas laboratoriais complexas de biologia molecular eacute realizado de maneira
insuficiente Por outro lado a progressiva integraccedilatildeo entre as instacircncias gestoras
dos programas de vigilacircncia e controle das doenccedilas com grupos de pesquisa e
desses com os serviccedilos (FERREIRA SILVEIRA 2004 p 473) e a disponibilidade
dos bancos de dados nacionais mais confiaacuteveis apontam para novos e melhores
caminhos (BRASIL 2005b)
A OMS alerta que o Paiacutes deve se preparar para uma ldquoexplosatildeordquo da
epidemia a partir de 2011 (BRASIL 2005b) Outra preocupaccedilatildeo eacute que as pessoas
que receberam sangue antes de 1992 tecircm mais chances de estarem infectadas na
eacutepoca o sangue destinado agraves transfusotildees natildeo era analisado para detecccedilatildeo da HCV
porque o viacuterus natildeo era conhecido e natildeo havia exames especiacuteficos (BRASIL 2005b)
A prevalecircncia da infecccedilatildeo nos doadores de sangue sadios varia de 001-002 no
Reino Unido e no norte da Europa 1-15 no sul da Europa 65 na Aacutefrica
equatorial e de ateacute 20 no Egito (CONTE 2000)
De acordo com a OMS a cada grupo de 50 pessoas no Brasil uma tem
hepatite e de dez portadores apenas um sabe (STRAUSS 2001) Satildeo dois milhotildees
de infectados no Paiacutes Denominada epidemia silenciosa calcula-se que 170 milhotildees
de indiviacuteduos no mundo estejam contaminados pelo viacuterus C a forma mais grave da
doenccedila Ainda de acordo com a OMS o nuacutemero de brasileiros viacutetimas da
enfermidade eacute bem maior do que o estimado pelo Ministeacuterio da Sauacutede (TRINDADE
2005)
18
Por ocasiatildeo da Conferecircncia Internacional de Consenso sobre HCV em Paris
(LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999) concluiu-se que a hepatite crocircnica por viacuterus
C eacute um problema grave de sauacutede puacuteblica sendo sua prevalecircncia mundial estimada
em 3 (de 01 a 5 segundo os vaacuterios paiacuteses) por tanto havendo no mundo
todo cerca de 150 milhotildees de portadores crocircnicos do VHCHCV 4 milhotildees nos EUA
e 5 milhotildees na Europa Ocidental Na Europa Oriental a prevalecircncia eacute maior ainda
114 Modo de Transmissatildeo
A HCV eacute transmitida pelo sangue Natildeo haacute comprovaccedilatildeo de contaacutegio por
meio de fluidos corporais como saliva suor laacutegrimas secircmen ou leite materno
Tambeacutem deixa de ocorrer por meio de abraccedilos beijos uso dos mesmos copos ou
roupas Especialistas afirmam que a contaminaccedilatildeo atraveacutes de relaccedilotildees sexuais eacute
possiacutevel mas rara Quando detectada de maneira precoce a enfermidade tem
tratamento inclusive gratuito aleacutem de cura (BRASIL 2006)
Dentre os fatores de risco para transmissatildeo outros aleacutem da transfusatildeo de
sangue o uso de drogas iliacutecitas o comportamento sexual de alto risco e variaacuteveis
socioeconocircmicas representadas pelo grau de escolaridade e renda familiar Natildeo foi
observada associaccedilatildeo entre o risco de infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas
designadas por gecircnero idade e raccedila (ALTER 2007) O risco de transmissatildeo sexual
do VHCHCV eacute miacutenimo A contaminaccedilatildeo intrafamilial natildeo-sexual eacute consideraacutevel
particularmente quando um dos enfermos tem hepatopatia grave e ou carga viral
elevada (risco 110) (CONTE 2000)
A praacutetica de tatuagem fornece dados conflitantes sabendo-se que os
liacutequidos usados para esterilizar os instrumentos usados satildeo ineficazes
Karmochkine et al (1998 apud CONTE 2000) observaram que
aproximadamente 80 dos pacientes contraem o viacuterus atraveacutes da toxicomania
intravenosa ou transfusotildees de sangue ou de derivados Os restantes meios de
transmissatildeo e de contaacutegio satildeo a hemodiaacutelise os transplantes de oacutergatildeos picadas
acidentais profissionais e transmissatildeo vertical matildee-crianccedila Em 20 a 40 dos
casos natildeo se consegue determinar o modo de contaminaccedilatildeo A transmissatildeo da
hepatite crocircnica por viacuterus C pode ser prevenida (KARMOCHKINE et al 1998 apud
CONTE 2000)
19
As duas fontes de contaminaccedilatildeo satildeo a toxicomania endovenosa e a
administraccedilatildeo de produtos de origem sanguumliacutenea Esta uacuteltima praticamente
eliminada desde 1991 com a introduccedilatildeo dos testes ELISA 2 na seleccedilatildeo
aprimorada de doadores de sangue (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998
apud CONTE 2000)
A transmissatildeo sexual eacute rara com menos de 3 em parceiros estaacuteveis e
ocorre principalmente em pessoas com muacuteltiplos parceiros e com praacutetica sexual de
risco (sem uso de preservativo) ndash para os indiviacuteduos com parceiros muacuteltiplos o uso
de preservativos eacute indicado (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998 apud
CONTE 2000)
A gravidez natildeo estaacute contra-indicada nas mulheres infectadas pelo
VHCHCV A transmissatildeo vertical matildee-crianccedila eacute rara (menor de 6) O tipo de parto
(natural ou cesaacuterea) natildeo tem influecircncia O aleitamento eacute permitido A transmissatildeo
nosocomial eacute prevenida eficazmente de modo convencional (KARMOCHKINE et
al 1998 apud CONTE 2000)
115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica
A infecccedilatildeo aguda pode passar clinicamente despercebida ou evoluir para
hepatite fulminante Aproximadamente 850 das pessoas infectadas agudamente
vatildeo desenvolver uma viremia persistente tornando-se dessa forma indiviacuteduos
infectados crocircnicos Depressatildeo irritabilidade dores no corpo mal-estar febre
naacuteuseas e falta de apetite satildeo alguns dos sintomas mais frequumlentes embora a
maioria dos casos natildeo apresente nenhum sintoma (ALTER 2007)
A cirrose eacute pouco observada em pessoas que apresentam niacuteveis
persistentemente baixos das transaminases mas a elevaccedilatildeo destas natildeo eacute
representativa do grau de fibrose hepaacutetica Dessa forma a bioacutepsia hepaacutetica
representa o melhor indicador do estaacutegio de evoluccedilatildeo da doenccedila uma vez que
gradua os componentes inflamatoacuterios e o estaacutegio de fibrose (AGMON-LEVIN et al
2009 BLOCK SCHIANO 1999)
Alter et al (1992) dizem que em 82 de 130 pacientes seguidos durante
muitos anos apoacutes surto agudo de hepatite natildeo-A natildeo-B apresentam anti-VHCHCV
ou VHCHCV RNA sendo que 62 deles desenvolveram hepatite crocircnica e
concluem que os pacientes que adquiriram HCV tiveram alto grau de hepatite
20
crocircnica sendo que o VHCHCV pode ser a maior causa de doenccedila crocircnica de fiacutegado
nos EUA e que na maioria dos pacientes a infecccedilatildeo pelo VHCHCV parece persistir
por muitos anos mesmo na ausecircncia de doenccedila hepaacutetica ativa
Almeida et al (1999) determinaram a prevalecircncia da infecccedilatildeo em
doadores de sangue assim como avaliaram o grau de comprometimento hepaacutetico
numa populaccedilatildeo de 37335 doadores durante o biecircnio 93-94 em Porto Alegre - RS
utilizando o teste anti-VHC ELISA 2 Selecionaram 60 deles para a biopsia hepaacutetica
com agulha de Menghini encontrando prevalecircncia de 174 com comprometimento
hepatico e 39 deles apresentavam cirrose hepaacutetica Sendo a hepatopatia crocircnica de
graus variaacuteveis observadas em 80 deles na sua grande maioria com lesotildees leves
e miacutenimas Foi observada forte associaccedilatildeo entre elevaccedilatildeo de alanina
aminotransferase (ALT) e a presenccedila de hepatopatia crocircnica embora a intensidade
desta elevaccedilatildeo natildeo se correlacione com a gravidade da lesatildeo histoloacutegica
Jaacute na experiecircncia de Mutimer et al (1995) cerca de 80 dos doadores
soro-positivos analisados exaustivamente inclusive com biopsia de fiacutegado
mostraram evidecircncias de alteraccedilotildees histoloacutegicas e ou viroloacutegicas de infecccedilatildeo
persistente sem no entanto atingir graus mais avanccedilados de hepatopatia crocircnica
quase todos permanecendo na categoria moderada
Nos paiacuteses industrializados a HCV eacute responsaacutevel por 20 dos casos de
hepatite aguda 70 dos casos de hepatite crocircnica 40 dos casos de cirrose
descompensada 60 dos carcinomas hepatocelulares e 30 dos transplantes
hepaacuteticos (LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999)
Cerca de 40 do total de pacientes curam-se ou tecircm doenccedila crocircnica de
natureza benigna Os restantes 60 cursam com atividade aumentada de
aminotransferase denotando evoluccedilatildeo crocircnica da doenccedila Dentre estes a maioria
tem lesotildees necro inflamatoacuterias discretas e fibrose miacutenima ou ausente O prognoacutestico
em longo prazo eacute mal conhecido no entanto provavelmente a maioria deles natildeo viraacute
a falecer da doenccedila hepaacutetica em curso Cerca de 20 deles depois de 10-20 anos
de evoluccedilatildeo desenvolveratildeo cirrose hepaacutetica passiacutevel de transplante Assim a
hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila que ocasiona a morte de um pequeno nuacutemero
de pacientes sem no entanto afetar a duraccedilatildeo da vida meacutedia da maioria deles
(CONTE 2000 FERREIRA SILVEIRA 2004)
Apoacutes infecccedilatildeo aguda somente 10 dos pacientes desenvolve doenccedila
cliacutenica com icteriacutecia A infecccedilatildeo sub-cliacutenica eacute a regra e assim passa despercebida
21
Cerca de 25 deles tecircm infecccedilatildeo crocircnica sintomaacutetica com aminotransferases
normais e lesotildees inflamatoacuterias histoloacutegicas miacutenimas (RESENDE et al 2010)
A remissatildeo espontacircnea acontece em cerca de 15 dos casos Na grande
minoria dos casos a progressatildeo da doenccedila aguda pode levar agrave insuficiecircncia
hepaacutetica aguda
Observaccedilotildees feitas pelo irlandecircs Kenny-Walsh (1999) comprovam a
natureza e a evoluccedilatildeo cliacutenica da afecccedilatildeo em causa O autor acompanhou durante 17
anos 376 mulheres que receberam injeccedilotildees de imunoglobulinas anti-D
contaminadas com VHC provenientes de doador uacutenico num programa de
isoimunizaccedilatildeo Rh Destas 81 apresentaram sintomatologia mais frequumlentemente
fadiga (66) ALT ligeiramente elevada (de 40 a 99 UL) em 47 e igual ou maior de
100 UL em 8 A biopsia hepaacutetica mostrou inflamaccedilatildeo em 98 delas na maioria
das vezes leves (41) e moderadas (52) fibrose presente em 51 no entanto
somente em sete pacientes (2) houve sinais de cirrose provaacutevel ou definitiva Em
uma delas havia acentuado alcoolismo
A hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila de evoluccedilatildeo variaacutevel De maneira
geral sua evoluccedilatildeo eacute lenta insidiosa e progressiva
Os pacientes que natildeo apresentam evidecircncias bioquiacutemicas de lesatildeo
hepaacutetica podem constituir em subgrupo de casos mais benignos no curso natural
da doenccedila Muitos co-fatores tecircm papel importante no desenvolvimento da cirrose
nesses pacientes como por exemplo a idade no momento da infecccedilatildeo (os
contaminados de idade mais avanccedilada tecircm evoluccedilatildeo mais raacutepida da doenccedila
enquanto que os mais jovens a tecircm mais lenta) o alcoolismo (eacute de consenso geral
que o abuso de aacutelcool favorece o aparecimento da cirrose) e a co-infecccedilatildeo com o
Viacuterus da Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida (SIDA) e da HVB
A incidecircncia anual de carcinoma hepatocelular (CHC) eacute de 1 a 4 nos
pacientes cirroacuteticos o que justifica plenamente o controle ecograacutefico do fiacutegado e a
dosagem seacuterica de alfa-fetoproteiacutena nesses pacientes a cada 1-2 anos Por outro
lado nos pacientes com hepatite crocircnica por viacuterus C sem cirrose o CHC eacute muito
raro (LOPES 2010)
Nos casos de cura a atividade das transaminases cessa e os viacuterus natildeo
satildeo detectados (VHC RNA) no soro Nos casos de cronificaccedilatildeo acontece o
contraacuterio ou seja as alteraccedilotildees bioquiacutemicas existem com flutuaccedilotildees e os viacuterus satildeo
detectaacuteveis na grande maioria dos casos Fazem exceccedilatildeo agravequeles pacientes com
22
viremia baixa que por isso mesmo fogem aos limites dos meacutetodos de detecccedilatildeo viral
ou devido agraves flutuaccedilotildees proacuteprias desses niacuteveis virecircmicos (HAYDON et al 1998)
Nos pacientes anti-VHC positivos com enzimas circulantes normais a
falta de VHC RNA no soro tem sido interpretada como sinal de cura completa No
entanto Haydon et al (1998) alteraram essa interpretaccedilatildeo Estes autores
demonstraram a presenccedila de VHC RNA no fiacutegado desses pacientes que eram
negativos no soro independente das alteraccedilotildees bioquiacutemicas positivas ou negativas
do soro ou seja mesmo naqueles casos anteriormente considerados como curados
Assim os niacuteveis de viacuterus intra-hepaacuteticos natildeo satildeo determinados pelos fatores
hospedeiro (idade modo e duraccedilatildeo da infecccedilatildeo) ou virais (VHC genoacutetipos) pois
mesmo as repetidamente Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia-em tempo real (RT-
PCR) negativos para VHC RNA no soro podem ter viacuterus da HCV albergados no
fiacutegado Entretanto existem limitaccedilotildees metodoloacutegicas que devem ser consideradas
nessa interpretaccedilatildeo como por exemplo as limitaccedilotildees do RIBA 3 e do RT-PCR
Mais importante eacute o seguimento dos pacientes ao longo do tempo Assim
Seef et al (1992) em 568 pacientes de hepatite poacutes-transfusional e dois grupos
controles pareados que receberam transfusotildees sem desenvolver hepatite apoacutes 18
anos de seguimento encontraram 33 de mortalidade no grupo 1 e 15 no grupo
controle sendo que a maioria das mortes ocorreu nos pacientes com alcoolismo
associado Evidenciando que a maioria dos que desenvolve doenccedila crocircnica o faz
muito lentamente
Existem ainda no curso natural da doenccedila flutuaccedilotildees intensas e muito
frequumlentes que dependem dos viacuterus e dos hospedeiros a saber niacuteveis da viremia
genoacutetipos 1b graus de diversidade geneacutetica dos viacuterus vias de transmissatildeo (os
inoculados via transfusatildeo apresentam lesotildees hepatocelulares mais ativas)
(GORDON et al 1993 GORDON BAYATI SILVERMAN 1998) deficiecircncias
imunes alcoolismo e co-infecccedilatildeo com HBV e delta ou o Viacuterus da imunodeficiecircncia
humana (HIV) (LOPES 2010) Nestes uacuteltimos casos a co-infecccedilatildeo com muacuteltiplos
viacuterus das hepatites estaacute associada com mais graves lesotildees histoloacutegicas do fiacutegado do
que nos casos de VHC isoladas
Importa saber se os resultados obtidos com os controles feitos se mantecircm
por longos periacuteodos Ou seja como exemplos a atividade da ALT persistentemente
normal a variabilidade do RT-PCR a detecccedilatildeo de VHC RNA pela teacutecnica Reaccedilatildeo
de polimerase em cadeia (PCR) que pode ser negativa devido agrave inadequada
23
armazenagem das amostras agrave contaminaccedilatildeo do soro com substacircncias que
interferem na leitura entre outras causas de erro
As informaccedilotildees sobre as causas que determinam o curso evolutivo da
doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos progressos havidos no campo do
diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHC Uma questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo
genotipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o
genotipo 1 (1b) cursa com lesotildees histoloacutegicas mais graves independentemente da
carga viral Ainda mais os VHC RNA negativos no soro mesmo apoacutes anos de
cura podem recair pois neles persistem os viacuterus no fiacutegado em regime de
replicaccedilatildeo muito baixa indetectaacutevel pelos meacutetodos atuais Ao contraacuterio os negativos
no soro e no fiacutegado tecircm demonstrado respostas boas e sustentadas inclusive no
sentido de se fazer prognoacutestico de cura real e verdadeira infelizmente na grande
minoria dos casos
116 Diagnoacutestico
Quanto mais cedo o diagnoacutestico maiores as chances de detectar a
doenccedila Por isso eacute importante que as pessoas faccedilam o exame especiacutefico porque soacute
esse exame eacute que detecta a HCV E as mulheres tecircm que ter uma atenccedilatildeo em
especial Tempos atraacutes o Correio Braziliense (2003) publicou uma grande mateacuteria
sobre a quantidade de mulheres que vecircm sendo infectadas com a HCV Cuja causa
estava na esterelizaccedilatildeo mal feita dos equipamentos das manicures Uma soluccedilatildeo
praacutetica eacute as mulheres terem seu proacuteprio material pra fazer as unhas e natildeo deixar
mais ningueacutem utilizar (nem matildee nem irmatilde etc) Bem e quem tiver passado por
transfusatildeo dentistas manicures operaccedilotildees etc deve fazer o exame
(KARMOCHKINE et al 1998 apud CONTE 2000 KEER et al 1997)
A HCV natildeo eacute como a Siacutendrome da Imunodeficiecircncia Adquirida (AIDS)
que possui drogas com grande tecnologia e o doente pode viver por muitos e muitos
anos Com a HCV o paciente soacute tem chance de ficar bem se a doenccedila for
diagnosticada e tratada antes dela se manifestar Atualmente o tratamento usa uma
associaccedilatildeo de duas drogas ndash o Interferon e a Ribavirina ldquoAs chances de cura em
meacutedia satildeo de 50rdquo
Barbaro et al (1999) verificaram que os pacientes VHC genoacutetipos 1b
frequumlentemente apresentavam alteraccedilotildees ultraestruturais das mitococircndrias com
24
depleccedilatildeo do mtDNA podendo comprometer o processo de fosforilizaccedilatildeo oxidativa
Sendo assim a produccedilatildeo aumentada de radicais livres nos pacientes VHC genoacutetipos
1b poderia atuar de modo negativo na evoluccedilatildeo da doenccedila hepaacutetica aumentando o
efeito citopaacuteticos do VHC Nesses pacientes haveria portanto aumento de
hiperoxidaccedilatildeo com consequumlente resistecircncia agrave accedilatildeo dos interferons e pior evoluccedilatildeo
da doenccedila hepaacutetica A ser confirmado este fato novas estrateacutegias terapecircuticas
poderatildeo vir a ser desenvolvidas no combate a essa doenccedila
Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila
poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses
autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis
vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo
hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja
quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a
concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave
hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em
parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)
Dos fatos acima expostos decorrem implicaccedilotildees tais como as respostas
CD8-CTL aos antiacutegenos VHC restritas aos complexos de histocompatibilidade
principais (MHC I) com inibiccedilatildeo ou mesmo insuficiente produccedilatildeo de complexo
peptiacutedeo VHC-MHC inibiccedilatildeo direta das ceacutelulas CTLK e a falta de resposta as
citoquininas entre outras dos vaacuterios mecanismos de escape existentes Dentro
desse contexto o niacutevel de morte celular natildeo seria alcanccedilado e a lesatildeo hepatocelular
consequumlente seria portanto miacutenima
Outra implicaccedilatildeo resultante consiste na induccedilatildeo de resposta imune
celular T Helper mediadas a partir de peptide vacinas contra o VHC Estas novas
vacinas tecircm a capacidade de gerar linfoacutecitos T citotoacutexico os CTLs contra o VHC em
camundongo imunizados com peptiacutedeos CTL e ceacutelulas HT epiacutetomes do core VHC
Esses estudos recente em animais de laboratoacuterio vecircm progredindo rapidamente
esperando-se em breve novos recursos no tratamento dessa doenccedila (AGNELLO et
al 1998)
25
12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC
O VHC constitui-se em uma famiacutelia heterogecircnea de viacuterus com no miacutenimo
seis genoacutetipos e inuacutemeros subtipos (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT
SANTOS SILVA 1999) Embora o meacutetodo de maior acuraacutecia para a determinaccedilatildeo
do genoacutetipo do VHC seja a identificaccedilatildeo completa da sequumlecircncia dos 9500
nucleotiacutedeos e a construccedilatildeo de uma aacutervore filogeneacutetica esse meacutetodo soacute pode ser
utilizado em laboratoacuterios de pesquisa (BARBOSA SILVA MARTINS 2005) e natildeo
em laboratoacuterios cliacutenicos Assim foram desenvolvidos meacutetodos para genotipagem
utilizando apenas as regiotildees mais conservadas do genoma como a proteiacutena do
envoltoacuterio (E1) a proteiacutena core e a proteiacutena natildeo estrutural NS5B A sequumlecircncia dos
nucleotiacutedeos dentro dessas regiotildees relativamente conservadas eacute genoacutetipo-
especiacutefico e os isolados podem ser genotipados independentemente da regiatildeo que
for utilizada para anaacutelise (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS
SILVA 1999) Para uso em laboratoacuterios cliacutenicos foram desenvolvidas basicamente
duas metodologias que se valem de teacutecnicas de biologia molecular (genotipagem)
ou citoloacutegicas (serotipagem)
Os meacutetodos que adotam teacutecnica de biologia molecular para genotipagem
utilizando porccedilotildees do genoma incluem a PCR aninhada (nested PCR) (BASSIT
SANTOS SILVA 1999) a teacutecnica de restriction fragment length polymorphism
(RFLP) (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS SILVA 1999) a
hibridizaccedilatildeo reversa (BASSIT SANTOS SILVA 1999) (INNO-LiPA Innogenetics
Beacutelgica Gen Eti DEIA HCV Sorin Biomedica Itaacutelia) e o sequumlenciamento direto da
regiatildeo natildeo-codificante 5 (TruGene Visible Genetics Canadaacute) Suas principais
vantagens satildeo a informaccedilatildeo direta sobre sequumlecircncia dos nucleotiacutedeos do genoma
viral a alta sensibilidade por se basearem na PCR e a possibilidade de identificar o
subtipo viral (BARBOSA SILVA MARTINS 2005)
Os meacutetodos para determinaccedilatildeo do genoacutetipo que utilizam serotipagem
baseiam-se na detecccedilatildeo de anticorpos genoacutetipos-especiacuteficos contra epiacutetopos do
VHC (por exemplo proteiacutenas da regiatildeo do core) (BLOCK SCHIANO 1999) Os
testes comercializados utilizam diferentes teacutecnicas ELISA competitivos ou
immunoblot (Murex-HC1-6 Murex Diagnostics Ltd Reino Unido RIBA HCV
Serotyping Assay Chiron Diagnostics Estados Unidos) As principais vantagens da
teacutecnica de serotipagem satildeo o baixo custo e maior facilidade de realizaccedilatildeo em
26
comparaccedilatildeo com os testes de biologia molecular (BLOCK SCHIANO 1999 De
LARANAGA et al 2000)
A determinaccedilatildeo do genoacutetipo anteriormente utilizada em pesquisas mas
sem maior utilidade na praacutetica meacutedica atualmente eacute recomendada para uso cliacutenico
Como jaacute mencionado os pacientes infectados pelo genoacutetipo 1 do VHC devem ser
tratados por 12 meses enquanto os demais por 6 meses (BASSIT SANTOS SILVA
1999)
A determinaccedilatildeo do genoacutetipo do VHC pode ser feita por PCR ou
serotipagem A primeira teacutecnica eacute mais sensiacutevel e possibilita a identificaccedilatildeo de
subtipos do VHC Contudo a segunda eacute de mais faacutecil realizaccedilatildeo e mais barata
razatildeo pela que eacute importante que a teacutecnica seja aprimorada
Oliveira et al (1999) investigaram os padrotildees de distribuiccedilatildeo dos
genoacutetipos do VHC estudando 250 pacientes anti-VHC positivos atraveacutes da
detecccedilatildeo VHC RNA pelo RT-PCR e encontraram prevalecircncia de 72 para o VHC 1
253 para o tipo 3 2 para o 2 e 07 para o 4 semelhantes aos das vaacuterias
regiotildees mundiais
13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC
As manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo pelo VHC satildeo as mais
variadas possiacuteveis A diversidade de resposta do hospedeiro ao agente infeccioso
variando desde quadros assintomaacuteticos ateacute aqueles com evoluccedilatildeo grave fatal ou
incapacitante tem estimulado a busca por justificativas de tais discrepacircncias
cliacutenicas sobretudo na imunomodulaccedilatildeo Dentre as infecccedilotildees mais bem estudadas
destacam-se aquelas pelos Viacuterus da hepatite C Viacuterus da imunodeficiecircncia humana1
(HIV-1) pelo Herpes viacuterus humano 4 (viacuterus do Epstein Baar) e pelo Mycobacterium
leprae (ABBAS LICHTMAN 2005)
A agressatildeo hepaacutetica por auto-imunidade eacute um fenocircmeno reconhecido em
vaacuterias doenccedilas do fiacutegado inclusive nas de etiologia viral Aleacutem do agente agressor e
de sua interaccedilatildeo com o sistema imunoloacutegico do hospedeiro fatores ambientais ou
hormonais estatildeo aparentemente envolvidos no surgimento de auto-imunidade
hepaacutetica como se supotildee acontecer na hepatite auto-imune em indiviacuteduos
geneticamente suscetiacuteveis (CODES et al 2002)
27
A lesatildeo hepatocelular relacionada agrave infecccedilatildeo pelos viacuterus hepatotroacutepicos e
pelos herpes viacuterus (citomegaloviacuterus e Epstein-Barr) eacute secundaacuteria a uma resposta
auto-imune do hospedeiro Estes viacuterus natildeo parecem ser diretamente citopaacuteticos
mas desencadeiam lesatildeo hepaacutetica atraveacutes da resposta imune do hospedeiro contra
ceacutelulas hepaacuteticas infectadas (MALOY POWRIE 2001)
Existem estudos que focalizam alteraccedilotildees imunoloacutegicas em hepatites
virais entretanto a maioria deles mostra resultados pontuais sem seguimento na
fase aguda da doenccedila (BLOCK SCHIANO 1999 McFARLONE et al 1990) Aleacutem
disso ainda natildeo se estabeleceu uma associaccedilatildeo entre as reaccedilotildees auto-imunes
transitoacuterias induzidas por viroses hepatotroacutepicas e agravamento do dano tecidual na
hepatite viral
A infecccedilatildeo crocircnica estaacute fortemente associada agrave crioglobulinemia mista
essencial glomerulonefrite membrano-proliferativa e porfiria cutacircnea tardia De
forma menos impressiva encontra-se tambeacutem associada agrave uacutelcera corneana de
Mooren liacutequen plano e fibrose pulmonar (KILLENBERG 2000 WENER et al 1996)
A ocorrecircncia de anticorpos antitireoidianos e hipotireoidismo tem sido relatada em
associaccedilatildeo com a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC em mulheres (KILLENBERG 2000
CACOUB et al 1999)
A associaccedilatildeo entre a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC a presenccedila do fator
reumatoacuteide e do anticorpo antinuclear (FAN) o fenocircmeno de Raynaud e doenccedilas
difusas do tecido conjuntivo (DDTC) como artrite reumatoacuteide luacutepus eritematoso
sistecircmico siacutendrome de Sjoumlgren e vasculites sistecircmicas eacute relatada em alguns
trabalhos (CACOUB et al 1999 LOVY STARKEBAUM UBEROI 1996 STAUB
1998 WENER et al 1996)
14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE
A associaccedilatildeo entre doenccedilas infecciosas e autoimunidade apresentando-
se com manifestaccedilotildees cliacutenicas ou detectadas apenas pelo desenvolvimento de auto-
anticorpos tem sido amplamente documentado Infecccedilotildees virais bacterianas e
parasitaacuterias podem estar envolvidas no desenvolvimento recidivas e ateacute mesmo na
prevenccedilatildeo de doenccedilas auto-imunes (KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)
Ribeiro e Proietti (2004) avaliaram a frequumlecircncia de FR anticorpos
antipeptiacutedeo citrulinado ciacuteclico (anti-CCP) AAN anticorpos anti-citoplasma de
28
neutroacutefilos (ANCA) anticorpos anticardiolipina (aCL) e anticorpos anti-β2
glicoproteiacutena I (anti-β2GPI) em pacientes com hanseniacutease Existe estudo
demonstrando pacientes que apresentavam manifestaccedilotildees articulares comparados
aos que natildeo apresentavam envolvimento articular e um grupo controle de indiviacuteduos
saudaacuteveis com idade e gecircnero semelhantes aos dos pacientes estudados e que
residiam na mesma aacuterea geograacutefica A maioria dos pacientes nos dois grupos (com
e sem envolvimento articular) apresentava hanseniacutease generalizada Entretanto
observaram uma baixa frequumlecircncia que natildeo foi significativamente diferente de FR
anti-CCP AAN e ANCA em pacientes com hanseniacutease (nos dois grupos) e normal
dos controles Mas a prevalecircncia de anticorpos aCL e anti-β2GPI estava
significativamente elevada nos pacientes com hanseniacutease quando comparados com
o grupo controle apesar de natildeo haver associaccedilatildeo significativa com o envolvimento
articular O isoacutetopo predominante dos dois autoanticorpos foi a IgM (487) dos
pacientes com hanseniacutease apresentava pelo menos um anticorpo antifosfoliacutepide
Aleacutem disso os autores observaram uma associaccedilatildeo entre a positividade para aCL e
as manifestaccedilotildees cliacutenicas jaacute que os pacientes com anticorpos aCL apresentavam
doenccedila Hanseniacutease generalizada (VV) com mais frequumlecircncia (p= 0002) Natildeo houve
associaccedilatildeo entre a presenccedila de anticorpos aCL ou anti-β2GPI e episoacutedios
reacionais poreacutem entre os pacientes com esses episoacutedios aqueles com anticorpos
aCL apresentavam eritema nodoso hansecircnico (ENH) em 100 dos casos enquanto
entre os pacientes negativos para aCL 57 apresentavam ENH Apesar de uma
alta taxa de concordacircncia para a presenccedila de anticorpos aCL e anti-β2GPI ter sido
observada manifestaccedilotildees tromboemboacutelicas natildeo foram observadas (RIBEIRO
PROIETTI 2004 2005)
Horimoto e Costa (2009) avaliaram pacientes com Leishmania
(leishmaniose visceral e leishmaniose cutacircnea) para a presenccedila de anticorpos anti-
Leishmania assim como FR AAN anti-DNA anti-Sm anti-RNP anti-Ro anti-La
aCL e complemento (C3 e C4) Como esperado os pacientes com leishmaniose
visceral apresentava anticorpos anti-Leishmania Tiacutetulos significativamente elevados
de AANs na maioria dos pacientes o anti-DNA foi detectado em poucos pacientes
com doenccedila visceral assim como tiacutetulos elevados de anticorpos aCL (isotipo IgG)
quando comparados com os pacientes com leishmaniose cutacircnea Niacuteveis reduzidos
de complemento tambeacutem satildeo evidentes na doenccedila visceral assim como niacuteveis
significativamente reduzidos de C3 Outros estudos comparam e discutem os
29
resultados em relaccedilatildeo agrave crescente evidecircncia na literatura da presenccedila de
autoanticorpos em ambas as doenccedilas Em geral a prevalecircncia variaacutevel de auto-
anticorpos relatada assim como relatos preacutevios na literatura podem estar
relacionados a diferenccedilas metodoloacutegicas como o tipo de ensaio utilizado a
definiccedilatildeo dos pontos de corte inativaccedilatildeo dos soros pelo calor seleccedilatildeo de pacientes
e variaccedilotildees eacutetnicas e geograacuteficas nos grupos de pacientes Mas um dos resultados
consistentes foi a frequumlecircncia significativamente mais elevada de anticorpos
antifosfoliacutepide aCL e anti-β2GPI em pacientes com hanseniacutease enquanto
anticorpos AAN e aCL foram detectados com mais frequumlecircncia nos pacientes com
leishmaniose visceral A incidecircncia aumentada de anticorpos AAN e aCL nos
pacientes com leishmaniose visceral eacute compatiacutevel com outros estudos (OSSADRON
et al 2006 SAKKAS et al 2008 VOULGARI et al 2004) e demonstra
semelhanccedilas das manifestaccedilotildees cliacutenicas e laboratoriais entre a leishmaniose
visceral e o luacutepus eritematoso sistecircmico (LES) Aleacutem disso a reatividade cruzada
entre AAN e anticorpos anti-Leishmania jaacute foi tambeacutem relatada (GRANEL et al
2000)
Diversos grupos documentaram niacuteveis elevados de anticorpos
antifosfoliacutepide (aCL anti-β2GPI e anti-protrombina) em diversas doenccedilas
infecciosas como a siacutefilis doenccedilas virais (incluindo a hepatite C Parvoviacuterus B19 e
HIV) malaacuteria e hanseniacutease sem as manifestaccedilotildees cliacutenicas da siacutendrome
antifosfoliacutepide (SAF) (ZANDMAN-GODDARD BLANK SHOENFELD 2002) Os
tiacutetulos elevados geralmente satildeo transitoacuterios diminuindo e desaparecendo apoacutes a
resoluccedilatildeo da infecccedilatildeo (LOIZOU et al 2003 ZANDMAN-GODDARD BLANK
SHOENFELD 2002) Mas em uma minoria dos pacientes a associaccedilatildeo entre
doenccedilas infecciosas e anticorpos antifosfoliacutepide pode levar a complicaccedilotildees severas
frequumlentemente fatais ou seja SAF catastroacutefica (ZANDMAN-GODDARD BLANK
SHOENFELD 2002)
Os resultados de Ribeiro e Proietti (2005) mostrando um aumento da
incidecircncia de anticorpos anti-β2-GPI em pacientes com hanseniacutease associados aos
dados de outros grupos (De LARANAGA et al 2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK
et al 1994 LOIZOU et al 2003) que tambeacutem documentaram niacuteveis elevados de
anticorpos anti-2βGPI lanccedilam duacutevidas sobre a noccedilatildeo de que os anticorpos aCL
associados a infecccedilotildees satildeo independentes dos anticorpos anti-β2GPI e natildeo
dependentes desses anticorpos como nas doenccedilas auto-imunes Em conjunto
30
esses resultados apoacuteiam a noccedilatildeo de que na presenccedila de infecccedilotildees anticorpos aCL
satildeo heterogecircneos em relaccedilatildeo agrave sua dependecircncia da 2GPI (De LARANAGA et al
2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK et al 1994 LOIZOU et al 2003) e as infecccedilotildees
podem desencadear a induccedilatildeo de anticorpos antifosfoliacutepide patogecircnicos em
indiviacuteduos predispostos (LOIZOU et al 2003)
A produccedilatildeo de autoanticorpos na hanseniacutease e leishmaniose pode ser
explicada por diversos mecanismos Na forma mais generalizada dessas doenccedilas
(hanseniacutease VV e leishmaniose visceral) os pacientes apresentam
hipergamaglobulinemia difusa semelhante agrave vista em outras infecccedilotildees como
Schistosoma mansoni T cruzi e Plasmodium A induccedilatildeo de autoanticorpos pode ser
atribuiacuteda agrave ativaccedilatildeo policlonal e proliferaccedilatildeo das ceacutelulas B algumas com auto-
reatividade pertencentes agrave biblioteca de anticorpos naturais em indiviacuteduos normais
(ARGOV et al 1989) Na leishmaniose antiacutegenos soluacuteveis derivados da L major e
L donovani satildeo mitogecircnicos e desencadeiam a produccedilatildeo de imunoglobulinas com
auto-reatividade (ARGOV et al 1989) Crioglobulinemia mista induzida pelo HCV eacute
outro exemplo de ativaccedilatildeo policlonal persistente levando a uma mistura de
autoanticorpos policlonais e monoclonais os quais causam doenccedilas auto-imunes
(AGMON-LEVIN et al 2009)
Mimetismo molecular ou homologias estruturais entre infecccedilotildees e
componentes do hospedeiro podem ser agrave base da produccedilatildeo de autoanticorpos
como no caso da febre reumaacutetica onde o componente M da membrana do
estreptococo apresenta homologia com peptiacutedeos cardiacuteacos cerebrais e sinoviais A
associaccedilatildeo da siacutendrome de Guillain-Barreacute com a infecccedilatildeo pelo Campylobacter
jejeuni representa outro exemplo de mimetismo molecular como base de uma
manifestaccedilatildeo auto-imune A reatividade cruzada entre agentes infecciosos e auto-
antiacutegenos jaacute foi demonstrada para o M leprae (McADAM MUDD SHOENFELD
1984) e M tuberculosis (SHOENFELD et al 1986) e a inibiccedilatildeo de anticorpos anti-
Sm anti-RNP e anti-SSB por promastigotas intactas de Leishmania apoacuteia a
homologia entre antiacutegenos nucleares e a Leishmania (ARGOV et al 1989)
A disseminaccedilatildeo de epiacutetopos a emergecircncia de novos anticorpos ou a
resposta de ceacutelulas T a um novo epiacutetopo (subdominante ou criacuteptico) no mesmo
antiacutegeno ou em outro antiacutegeno foi demonstrada em modelos experimentais e na
doenccedila humana alguns autores demonstraram a disseminaccedilatildeo molecular do
antiacutegeno Sm para reatividade anti-RNP (STAUB 1998) no LES enquanto na febre
31
reumaacutetica o estado de autoimunidade crocircnica que afeta as vaacutelvulas cardiacuteacas pode
resultar em uma resposta imunoloacutegica contra o colaacutegeno e laminina (KIVITY et al
2009 PORDEUS et al 2008) As infecccedilotildees tambeacutem podem desempenhar um papel
importante na induccedilatildeo da autoimunidade atraveacutes da liberaccedilatildeo de antiacutegenos
sequumlestrados apoacutes lesatildeo tecidual ou aumentando a exibiccedilatildeo de epiacutetopos criacutepticos
no meio inflamatoacuterio apresentando assim novos antiacutegenos ao sistema imunoloacutegico
(KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)
15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES
AGUDAS VIRAIS
O conceito de auto-imunidade induzida por viacuterus natildeo eacute exclusivo para
doenccedilas hepaacuteticas O viacuterus Coxsackie do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um
terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite infecciosa e estaacute implicado nas miocardites
auto-imunes reagindo contra a miosina cardiacuteaca (GIST BELL 1974) Niwa et al
(1984) encontraram elevaccedilatildeo transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator
reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas
virais comuns como varicela sarampo influenza caxumba herpes zoster e
exantema suacutebito
A patogecircnia da infecccedilatildeo viral inclui pelo menos trecircs tipos de interaccedilotildees
com o hospedeiro vertebrado 1) o efeito do agente sobre as ceacutelulas 2) a maneira
de disseminaccedilatildeo do agente no organismo infectado 3) a resposta imunoloacutegica e a
sua influencia no processo infeccioso Destacam-se dois tipos principais da
interaccedilatildeo a destruiccedilatildeo celular e a resposta imunoloacutegica (FIGUEIREDO 1999
CATALAN-SOARES PROIETTI CARNEIRO-PROIETTI 2006) O viacuterus Coxsackie
do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite
infecciosa e estaacute implicado nas miocardites auto-imunes reagindo contra a miosina
cardiacuteaca (GERSHON KONDO 1971) Niwa et al (1984) encontraram elevaccedilatildeo
transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo
anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas virais comuns como varicela sarampo
influenza caxumba herpes zoster e exantema suacutebito
32
16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN
De acordo com o II Consenso Brasileiro de FAN em HEp 2
(DELLAVANCE et al 2003) os AAN satildeo encontrados comumente em uma
variedade de doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Satildeo uacuteteis na investigaccedilatildeo dessas
doenccedilas auxiliando no diagnoacutestico de patologias como LES esclerose sistecircmica
progressiva (ESP) doenccedila mista do tecido conjuntivo (DMTC) siacutendrome de Sjoumlgren
(SS) polimiosite e dermatomiosite
Eles podem estar presentes em um pequeno percentual da populaccedilatildeo
aparentemente sadia essa frequumlecircncia eacute maior em mulheres e aumenta com a idade
Segundo a literatura a positividade entre 20 a 60 anos varia entre percentuais mais
altos (133) para tiacutetulos baixos e mais baixos (33) para tiacutetulos mais elevados
(DELLAVANCE et al 2003)
A pesquisa dos anticorpos antinucleares pode ser realizada por diferentes
teacutecnicas a imunofluorescecircncia indireta eacute a mais utilizada por sua sensibilidade
reprodutibilidade e facilidade de execuccedilatildeo A sensibilidade aumenta
significativamente quando se utiliza como substrato lacircminas com ceacutelulas Hep 2
(ceacutelulas de carcinoma de laringe humana) por causa da maior expressatildeo de
antiacutegenos na superfiacutecie dessas ceacutelulas comparados aos expressos nas ceacutelulas de
fiacutegado ou de rins de camundongos que se utilizavam anteriormente
Em geral eacute possiacutevel detectar melhor a presenccedila de AAN por associaccedilatildeo
de trecircs anti-soros isotipos especiacuteficos (anti-IgG anti-IgA e anti-IgM) A pesquisa
realizada por essa teacutecnica serve de triagem inicial para a presenccedila de AAN Eacute
normalmente denominada pesquisa de FAN ou AAN
A realizaccedilatildeo de outras metodologias tais como as imunoenzimaacuteticas
permite uma avaliaccedilatildeo isolada dos diferentes auto-anticorpos sugeridos pelos
padrotildees de fluorescecircncia encontrados no FAN A identificaccedilatildeo desses AAN permite
um diagnoacutestico mais preciso e eles podem ser utilizados em muitos casos como
marcador para uma das diferentes doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Muitas dessas
patologias apresentam um perfil distinto de auto-anticorpos que auxilia o diagnoacutestico
A presenccedila de FAN positivo em pessoas aparentemente sadias pode ser
devida a algumas situaccedilotildees
minus Doenccedila auto-imune precoce ainda natildeo expressa clinicamente
33
minus distuacuterbio imunoloacutegico transitoacuterio causado por doenccedila natildeo-imune
tais como infecccedilotildees principalmente virais
minus uso de medicamentos e neoplasias
minus manifestaccedilatildeo incompleta de uma siacutendrome ou seja o paciente
sintetiza o anticorpo poreacutem esse quadro natildeo evolui para doenccedila
minus fenocircmeno auto-imune fisioloacutegico
O resultado do FAN eacute expresso em tiacutetulo e padratildeo uma vez que ambos
os paracircmetros tecircm importacircncia para a avaliaccedilatildeo do significado cliacutenico do exame O
tiacutetulo do FAN corresponde agrave maior diluiccedilatildeo capaz de demonstrar fluorescecircncia
inequiacutevoca e didaticamente pode ser dividido em
minus Baixo menor 180
minus Moderado 1160
minus Moderadamente elevado 1320
minus Alto maior 1640
Nas pesquisas realizadas por imunofluorescecircncia indireta os resultados
satildeo expressos em tiacutetulos segundo as diluiccedilotildees empregadas Eacute possiacutevel trabalhar
utilizando-se como limite tiacutetulos de 140 que permitem maior sensibilidade ou de
180 que permitem maior especificidade ou seja um menor nuacutemero de falso-
positivos
Na praacutetica cliacutenica satildeo considerados significativos tiacutetulos superiores a
1160 Os resultados com tiacutetulos positivos satildeo acompanhados pela descriccedilatildeo do
padratildeo de fluorescecircncia encontrado que serve como orientaccedilatildeo da presenccedila de um
antiacutegeno especiacutefico e em alguns casos como padratildeo diagnoacutestico Em determinadas
situaccedilotildees em especial no LES em atividade pode ocorrer agrave observaccedilatildeo de mais de
um padratildeo de fluorescecircncia
O padratildeo do FAN a seu turno aponta uma probabilidade maior ou menor
de doenccedila auto-imune e ateacute mesmo sugere o antiacutegeno nuclear envolvido e por
consequumlecircncia a afecccedilatildeo com ele mais relacionada Os padrotildees homogecircneo
centromeacuterico e pontilhado grosso satildeo os mais indicativos de processos de
autoimunidade uma vez que se associam a diversas condiccedilotildees reumaacuteticas
especialmente ao LES e agrave esclerose sistecircmica e tambeacutem a enfermidades hepaacuteticas
tais como a cirrose biliar primaacuteria e a hepatite auto-imune (KILLENBERG 2000)
34
Jaacute o pontilhado fino o pontilhado grosso reticulado e a membrana nuclear
tecircm maior significado quando encontrados em tiacutetulos altos uma vez que podem
estar presentes em tiacutetulos baixos em indiviacuteduos hiacutegidos Por sua vez o pontilhado
fino denso mesmo quando elevado em pessoas assintomaacuteticas soacute guarda relaccedilatildeo
com alguma doenccedila em cerca de 20 dos casos (DELLAVANCE et al 2003)
O padratildeo pontilhado pode tambeacutem ser referido como padratildeo salpicado
Outros padrotildees de fluorescecircncia podem ser encontrados em menor frequumlecircncia Os
pontilhados citoplasmaacutetico grossos ou reticulares associados agrave presenccedila de
anticorpos antimitococircndrias em pacientes com cirrose biliar primaacuteria o
citoplasmaacutetico homogecircneo relacionado a proteiacutenas ribossocircmicas em pacientes com
LES e o padratildeo pontilhado fino citoplasmaacutetico que pode estar associado agrave
presenccedila de anticorpos anti-JO-1 anti-PCNA e proteiacutenas da membrana celular em
pacientes com LES outras patologias do tecido conjuntivo e hepatopatias auto-
imunes (DELLAVANCE et al 2003)
Quadro 1 - Padrotildees de fluorescecircncia encontrados em maior frequumlecircncia e patologias relacionadas
Padrotildees de Fluorececircncia Antiacutegenos Patologias Relacionadas
Perifeacuterico DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES
Homogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA
LES AR lupus induzido por drogas
Perifeacutericohomogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES
Pontilhado grosso SM RNP LES DMTC
Pontilhado fino nuclear SS-A (RO) SS-B (La) SS LES
Nucleolar Proteiacutenas Nucleolares ESP Centromeacuterico Proteiacutenas de centrocircmeros Siacutendrome de CREST
Fonte Dellavance et al 2003 Quadro 2 - Anti-ena - auto-anticorpos contra antiacutegenos extraiacutedos do nuacutecleo e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleares Patologias Relacionadas SM LES RNP DMTC LES ESP AR e Polimiosite
SS-A (Ro) SS LES lupus neonatal e forma cutacircnea subaguda
SS-B (La) SS LES luacutepus neonatal e forma cutacircnea subaguda
Scl 70 ESP Jo -1 Polimiosite e dermatomiosite Fonte Dellavance et al 2003
35
Quadro 3 ndash Padrotildees de FAN nuclear e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes
Padrotildees Nucleares Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos
Nuclear Pontilhado Centromeacuterico Anticorpo anti-centrocircmero Esclerose Sistecircmica forma CREST Cirrose Biliar Primaacuteria
Nuclear homogecircneo Anticorpo anti-DNA nativo Lupus Eritematoso Sistecircmico (LES) Anticorpo anti-Histoma LES induzido por drogas LES idiopaacutetico Anticorpo anti-cromatina (DNAHistona Nucleossomo) Artrite Reumatoacuteide (AR) Artrite Idiopaacutetica Juvenil importante associaccedilatildeo com uveiacutete na forma oligoarticular Siacutendrome de Felty Cirrose Billar Primaacuteria
Nuclear tipo membrana nuclear contiacutenua Anticorpo anti-Iamin e contra envelope nuclear - Iamins Hepatites auto-imunes Raramente associado a doenccedilas reumaacuteticas (algumas formas de LES e esclerodermia linear)
Nuclear pontilhado pleomoacuterficoPCNA Anticorpo contra nuacutecleo de ceacutelulas em proliferaccedilatildeo LES
Nuclear pontilhado fino denso Anticorpo anti-proteina p 75 kDa pode ser encontrado em indiviacuteduos saudaacuteveis processos inflamatoacuterios inespeciacuteficos doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Cistite Intersticial Dermatite Atoacutepica Psoriacutease e Asma
Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos
Anticorpo anti-p80 coilina natildeo apresenta associaccedilatildeo cliacutenica definida
Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos
Anticorpo anti-Sp100 (anti-p95) Cirrose Biliar Primaacuteria pode ocorrer em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas
Nuclear pontilhado grosso Anticorpo anti-Sm LES Anticorpo anti-RNP criteacuterio obrigatoacuterio no diagnostico da doenccedila mista do Tecido conjuntivo (DMTC) tambeacutem ocorre no LES Esclerose Sistecircmica (ES) e AR
Nuclear pontilhado fino Anticorpo anti SSARo Siacutendrome de Sjogren Primaacuteria (SS) LES Lupus neonatal e Lupus Cutacircneo Subagudo Anticorpo anti-SSBLa Lupus neonatal LES SS Anticorpo anti-Mi-2 Dermatomiosite embora raramente ocorra na polimiosite do adulto
Fonte Dellavance et al 2003
36
Quadro 4 - Padrotildees de FAN citoplasmaacuteticos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes
Padrotildees Citoplasmaacuteticos e Relacionados ao Aparelho Mitoacutetico Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos
Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina Hepatite auto-imune Cirrose Anticorpo anti-miosine Hepatite C Hepatocarcionoma Miastenia Gravis Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida
Citoplasmaacutetico Fibrilar Segmentar Anti actinina anti--vinculina e anti-tropomiose Miastenia Gravis Doenccedila de Crohn e Colite ulcerativa Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia cliacutenica definida
Citoplasmaacutetico Pontilhado Polar Anticorpo Anti-golginas (cisternas do aparelho de Golgi) raro no LES SS e outras doenccedilas auto-imunes sistecircmicas Relato na Ataxia Cerebelar Idiopaacutetica Degeneraccedilatildeo Cerebelar Paraneoplaacutesica infecccedilotildees virais pelo Epstein Barr (EBV) e pelo viacuterus da imunodeficiecircncia Humana (HIV) Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida
Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Anticorpo anti-Histidill t RNA sintetase (Jo-1) anticorpo marcador de Polimiosite no adulto Descrito raramente na Dermatomiosite
Citoplasmaacutetico Pontilhado com Pontos Isolados
Anticorpo anti-EEA1 e anti-fosfatidilserina natildeo haacute associaccedilotildees clinicas bem definida Anticorpo anti-GWBSS tambeacutem encontrado em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas
Citoplasmaacutetico Pontilhado Reticulado Anticorpo anti-mitococircndria Cirrose Biliar Primaacuteria Esclerose Sistecircmica Eacute relativamente comum o encontro deste padratildeo na ausecircncia de anticorpos anti-mitococircndria
Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Denso Anti PL7PL12 Raramente associado a Polimiosite Anticorpo P-ribossomal Este padratildeo ocorre no LES se a associaccedilatildeo eacute com anti-proteina P ribossomal
Citoplasmaacutetico Fibrilar Filamentar Anticorpo anti-vimentina e anti-queratina Anti-queratina eacute o anticorpo mais importante em doenccedila hepaacutetica alcooacutelica Descritos em vaacuterias doenccedilas inflamatoacuterias e infecciosas Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida
Aparelho mitoacutetico Tipo Centriacuteolo Anticorpo anti-enolase em baixos tiacutetulos natildeo tem associaccedilatildeo cliacutenica definida Em altos tiacutetulos eacute sugestivo de Esclerose Sistecircmica
Aparelho mitoacutetico Tipo ponte Intercelular
Anticorpo anti Tubulina Pode ser encontrado no LES e na DMTC outros anticorpos ainda natildeo bem definidos podem gerar o mesmo padratildeo
Aparelho mitoacutetico Tipo NuMa2 Anticorpo anti-HsEg5 diversas condiccedilotildees auto-imunes com baixa especificidade
Fonte Dellavance et al 2003
37
Quadro 5 - Padrotildees de FAN mistos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Mistos Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos
Misto do tipo nucleolar homogecircneo e nuclear pontilhado grosso com placa metafaacutesica decorada em anel (cromossomos negativos)
Anticorpo anti-Ku Superposiccedilatildeo Polimiose e Esclerose Sistecircmica Podem ocorrer no LES e Esclerodermia
Misto do tipo nuclear e nucleolar pontilhado com placa metafaacutesica positiva
Anticorpo anti-topoisomerase (Scl-70) ES forma difusa Mais raramente pode ocorrer na Siacutendrome CREST e superposiccedilatildeo PolimiositeEsclerodermia
Misto do tipo Citoplasmaacutetico pontilhado fino denso e homogecircneo e nucleolar homogecircneo
Anticorpo anti rRNP LES frequumlentemente relacionado agrave Psicose Luacutepica
Misto do tipo nuclear pontilhado fino com fluorescecircncia do aparelho mitoacutetico
Anticorpo anti-NuMA1SS pode ocorrer tambeacutem em outras condiccedilotildees auto-imunes ou inflamatoacuterias crocircnicas
Fonte Dellavance et al 2003
Quadro 6 - Padrotildees de FAN nucleolares e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleolares Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos
Nucleolar Aglomerado
Anticorpo anti-Fibrilarina (U3-nRNP) Esclerose Sistecircmica (ES) especialmente com comprometimento visceral grave entre eles a hipertensatildeo pulmonar
Nucleolar Pontilhado
Anticorpo anti-NOR-90 ES tambeacutem descrito em outras doenccedilas do tecido conjuntivo poreacutem sem relevacircncia clinica definida Anticorpos anti-RNA polimerase I ES de forma difusa com tendecircncia para comprometimento visceral mais frequumlente e grave
Nucleolar Homogecircneo
Anticorpo anti-PMScl Siacutendrome de Superposiccedilatildeo de Polimiosite com Esclerose Sistecircmica Raramente encontrado em casos de Polimiosite ou Esclerose Sistecircmica sem superposiccedilatildeo cliacutenica Outros auto-anticorpos mais raros podem apresentar esse padratildeo
Fonte Dellavance et al 2003
De acordo com o 3deg Consenso (DELLAVANCE et al 2009) foram
comunicados dois novos padrotildees de fluorescecircncia por participantes Vaacuterios outros
membros testemunharam jaacute haver observado esses padrotildees O primeiro trata-se de
um padratildeo nuclear pontilhado fino aproximando-se da textura homogecircnea e com
placa metafaacutesica corada da mesma forma Sua associaccedilatildeo cliacutenica e identidade
imunoloacutegica natildeo estatildeo definidas Sua importacircncia deriva do fato de que pode ser
facilmente confundido com o padratildeo pontilhado fino denso e com o padratildeo
homogecircneo O segundo trata-se de um padratildeo citoplasmaacutetico em forma de
pequenos bastotildees (rods) e ciacuterculos (rings) que aparentemente estaacute associado agrave
38
infecccedilatildeo pelo HCV Haacute estudos em curso por alguns grupos de pesquisa com a
finalidade de estabelecer sua identidade imunoloacutegica
Como ainda natildeo estatildeo definitivamente caracterizados esses dois novos
padrotildees foram considerados preliminares e o 3deg Consenso recomendou que os
mesmos fossem completamente caracterizados e apresentados na proacutexima versatildeo
do Consenso (DELLAVANCE et al 2009)
39
2 JUSTIFICATIVA
As inflamaccedilotildees do fiacutegado provocadas pelos viacuterus hepatotroacutepicos atingem
milhotildees de pessoas e representam significativos problemas de sauacutede puacuteblica em
todo o mundo No Brasil a Regiatildeo Norte responde por um significativo percentual
dos portadores de hepatite C Dentre as manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo
pelo viacuterus C as doenccedilas autoimunes tecircm significativo impacto na evoluccedilatildeo cliacutenica
desses pacientes A presenccedila de anticorpo antinuacutecleo eacute um marcador importante de
autoimunidade e apesar de existirem trabalhos relatando a pesquisa desse fator em
portadores de viacuterus C tais estudos ainda natildeo foram realizados na nossa regiatildeo
sobretudo correlacionando-se com o genoacutetipo do viacuterus responsaacutevel pela infecccedilatildeo
considerando que o genoacutetipo eacute um marcador de resposta ao tratamento ou
considerando que pacientes portadores do genoacutetipo 1 natildeo respondem
satisfatoriamente ao tratamento instituiacutedo pelo protocolo atual
21 ASPECTOS EacuteTICOS
A pesquisa a ser realizada apresenta relevacircncia social e natildeo perde o
sentido de sua destinaccedilatildeo soacutecio-humanitaacuteria (justiccedila e equidade)
Este trabalho adequa-se aos princiacutepios cientiacuteficos que o justificam e
apresenta possibilidade concreta de responder a incertezas tais como FAN e o
genoacutetipo viral em pacientes com infecccedilatildeo pelo viacuterus da hepatite C ldquoestatildeo
relacionadosrdquo
Segue rigorosamente os procedimentos descritos na Resoluccedilatildeo 19696-
CNSMS (BRASIL 1996) assegurando a confidenciabilidade e proteccedilatildeo da
identidade do sujeito da pesquisa no momento da afericcedilatildeo dos dados e sua
posterior utilizaccedilatildeo
Por tratar-se de um estudo que faraacute somente revisatildeo de soroteca os
participantes natildeo seratildeo submetidos a riscos de origem orgacircnica eou quiacutemica
40
3 OBJETIVOS
31 OBJETIVO GERAL
Estabelecer associaccedilatildeo entre a presenccedila de teste de FAN e o genoacutetipo
viral em pacientes portadores de infecccedilatildeo pelo HCV
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
I Identificar o padratildeo de fluorescecircncia do FAN em pacientes com diagnoacutestico
laboratorial de infecccedilatildeo pelo HCV
II Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados
pelo HCV de acordo com o gecircnero e a idade
III Identificar a prevalecircncia de FAN em pacientes infectados pelo HCV e natildeo
infectados
IV Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados
pelo HCV de acordo com as alteraccedilotildees bioquiacutemicas
41
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO)
Foi realizado um estudo transversal analiacutetico no Serviccedilo do Nuacutecleo de
Medicina Tropical da Universidade Federal do Paraacute (NMTUFPA) utilizando-se
pacientes oriundos da Fundaccedilatildeo Centro de Hemoterapia e Hematologia do Paraacute
(HEMOPA) e Plano de Assistecircncia ao Servidor (PASIASEP) com coleta de material
bioloacutegico para reconfirmaccedilatildeo do diagnoacutestico de hepatite C no periacuteodo de janeiro de
2009 a maio de 2010
411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C
A populaccedilatildeo de estudo consistiu de 51 pacientes admitidos no NMTUFPA
para reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica tratamento cliacutenico e acompanhamento ambulatorial
de ambos os gecircneros e independente da idade sem exclusatildeo dos pacientes com a
presenccedila de patologias associadas agrave condiccedilatildeo maior (motivadora da pesquisa)
oriundos da Fundaccedilatildeo HEMOPA e PAS
A amostra do grupo foi selecionada a partir da relaccedilatildeo dos prontuaacuterios
catalogados no laboratoacuterio de patologia do NMTUFPA
Os dados foram coletados atraveacutes dos resultados dos exames realizados
no soro de cada paciente O protocolo de coleta teve enfoque na identificaccedilatildeo
individual do paciente bem como a avaliaccedilatildeo cliacutenica dos resultados
412 Grupo de natildeo infectados
Foi utilizado um grupo controle de 100 amostras de soro de indiviacuteduos
doadores de sangue com sorologias negativas para HIV 1 e 2 HTLV 1 e 2 Siacutefilis
Doenccedilas de Chagas Hepatite B e para Hepatite C procedentes da fundaccedilatildeo
HEMOPA
42
42 MEacuteTODO
421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico
Foram colhidos em frasco sem anticoagulante 10ml de sangue perifeacuterico
dos 51 pacientes participantes da pesquisa A amostra sanguiacutenea de cada paciente
foi centrifugada o soro foi separado e colocado em frasco esteacuteril devidamente
identificado armazenado e resfriado de 2 a 8ordmC
Foi realizada no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais a
pesquisa soroloacutegica de anticorpos IgG anti-HCV por teste imunoenzimaacutetico (ELISA)
e os pacientes que apresentaram positividade tiveram seus resultados confirmados
atraveacutes de teacutecnicas moleculares (RT-PCR) e com identificaccedilatildeo do genoacutetipo viral
(genotipagem)
Foi realizado no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa a pesquisa
de FAN dos 51 pacientes selecionados utilizando as amostras existentes na
soroteca
422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C
Foram empregados testes soroloacutegicos de ELISA (Ensaio
Imunoenzimaacutetico) de 3ordf geraccedilatildeo utilizando-se de kits comerciais (kit ETI-AB-HCVK-
4 DiaSorin Itaacutelia) para detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos anti-HCV no soro dos
pacientes
As tiras (poccedilos) necessaacuterias para as reaccedilotildees foram retiradas da geladeira
com antecedecircncia de uma hora e deixadas agrave temperatura ambiente e os reagentes
homogeneizados rapidamente no voacutertex
O primeiro poccedilo da placa ficou o branco da reaccedilatildeo na sequecircncia da
microplaca de ELISA foi dispensado 200 microL do controle negativo em triplicata (trecircs
poccedilos) 200 microL do calibrador em duplicata (dois poccedilos) e 200 microL do controle positivo
em amostra uacutenica (um poccedilo)
Adicionou-se 200 microL do Diluente de Amostra em todos os poccedilos que
continham as amostras dos pacientes a serem dosadas na placa de ELISA
tomando cuidado para natildeo contaminar os poccedilos adjacentes
43
Dispensou-se 50 microL do Diluente do Reagente em todos os poccedilos de
controles calibradores e amostras cobrimos com adesivo para evitar evaporaccedilatildeo e
contaminaccedilatildeo das amostras e incubamos a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC
Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com
300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem diluiacuteda
Pipetou-se 100 microL de Conjugado Enzimaacutetico exceto no poccedilo do branco e
incubou-se a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se
cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com 300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem
diluiacuteda
Pipetou-se 100 microL de CromoacutegenoSubstrato em todos os poccedilos
Incubamos a microplaca protegendo-a de luz intensa e direta agrave temperatura
ambiente (18-24ordmC) por 15 min
Pipetou-se 100 microL de Aacutecido Sulfuacuterico em todos os poccedilos para ldquopararrdquo a
reaccedilatildeo enzimaacutetica e mediu-se a absorbacircncia da soluccedilatildeo obtida em leitor de ELISA
com filtro de 450 nM
O teste foi validado de acordo com os valores do controle de qualidade
preconizados pelo fabricante e que devem tanger os valores para o branco da
reaccedilatildeo le 0100 controle negativo le 0050 controle positivo ge 1000 e calibrador ge
1100 Para as amostras testadas os valores reagentes e natildeo reagentes para
pesquisa de anticorpos anti-HCV satildeo interpretados da seguinte maneira natildeo
reagentes com valores le 09 reagentes com valores ge 11 e indeterminados entre
os valores 09 ndash 11
423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia molecular
Nas amostras positivas pela sorologia (ELISA) realizou-se extraccedilatildeo do
RNA viral presente no soro do paciente utilizando kit comercial (QIAmp Viral RNA
kit Quiagen Alemanha) seguindo a teacutecnica adaptada no Laboratoacuterio de Patologia
Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais
Pipetou-se 560 microL de tampatildeo AVL (lise) contendo RNA em tubo de
centriacutefuga de 15 ml identificado adicionou-se 140 microL da amostra e homogenizou-se
em voacutertex por 15s incubando a temperatura ambiente (15-25degC) por 10 min Apoacutes
incubaccedilatildeo centrifugou-se rapidamente o tubo para remover partiacuteculas dispersas
44
Adicionou-se 560 microL de etanol (96-100) na amostra e homogenizou-se
no voacutertex por 15s centrifugando-se rapidamente para remover partiacuteculas dispersas
Depois cuidadosamente transferiu-se 630 microL para as colunas devidamente
identificadas centrifugou-se a 14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo
ficando soacute com a coluna para encaixar em outro tubo
Colocou-se o resto das amostras nas colunas devidas centrifugou-se a
14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo ficando soacute com a coluna para
encaixar em outro tubo Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW1) e
centrifugou-se por 1 min mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo
Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW2) e centrifugou-se por 4 min
mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo
Identificados os tubos para RNA colocou-se as colunas Adicionou-se 60
microL de tampatildeo para eluir (AVE) em cada amostra e centrifugou-se por 1 min
descartando a coluna e ficando com o tubo Colocou-se em banho-maria por 10 min
a 65degC centrifugado rapidamente e colocado no gelo As amostras extraiacutedas foram
congeladas e armazenadas em freezer a -20ordmC
O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado de acordo com a teacutecnica de
RT-PCR qualitativa com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das
Doenccedilas Tropicais da seguinte maneira para o Mix de uma amostra Tampatildeo 12
microL primer ou iniciador k10 1microL primer ou iniciador k11 1microL aacutegua ultrapura livre de
DNAse e RNAse 5 microL Enzima Taq polymerase One-Step (Invitrogen) 1 microL O
primer k10 constitui-se da sequecircncia GGC GAC ACT CCA CCA TRR e o primer k11
da sequecircncia GGT GCA CGG TCT ACG AGA CC
O volume do mix por amostra eacute de 20 microL e o volume da amostra (produto
da extraccedilatildeo) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As amostras
foram colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo eacute realizada a 42ordmC por 45 minutos
temperatura inicial de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 2 minutos seguida de 35 ciclos com
temperatura de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 54ordmC por 30
segundos de extensatildeo a 72ordmC por 45 segundos e temperatura de extensatildeo final de
72ordmC por 7 minutos e um hold de 4ordmC
Para visualizaccedilatildeo do produto dessa 1ordf PCR (RT-PCR) eacute feito um gel de
agarose a 1 (1g de agarose para 100mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de
etidium) que migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os
resultados foram visualizados atraveacutes de luz ultravioleta (UV) Os pacientes
45
positivos que apresentarem ldquobandardquo devem continuar os procedimentos e os
negativos que natildeo apresentarem ldquobandasrdquo deveratildeo ser liberados como
indetectaacuteveis por este meacutetodo
A 2ordf PCR (RFLP) foi responsaacutevel por fazer a amplificaccedilatildeo do cDNA
produto da 1ordf PCR Para esta etapa tambeacutem com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio
de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais foram necessaacuterios para o Mix de uma
amostra Tampatildeo 10X 25 microL DNTP 4 microL MgCl2 15 microL primer ou iniciador k15 1
microL primer ou iniciador k16 1 microL aacutegua ultrapura livre de DNAse e RNAse 125 microL
Enzima Taq platinum (Invitrogen) 05 microL O primer k15 constitui-se da sequecircncia
ACC ATR RAT CAC TCC CCT GT e o primer k16 da sequecircncia CAA GCA CCC TAT
CAG GCA GT
O volume do mix por amostra foi de 23 microL e o volume da amostra
(produto da 1ordf PCR) de 2 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As
amostras satildeo colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo se realiza a temperatura inicial
de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 4 minutos seguida de 35 ciclos com temperatura de
desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 55ordmC por 45 segundos de
extensatildeo a 72ordmC por 1 minuto e temperatura de extensatildeo final de 72ordmC por 7
minutos e um hold de 4ordmC
O produto da 2ordf PCR eacute observado atraveacutes de um gel de agarose a 1 (1g
de agarose para 100 mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que
migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os resultados
foram visualizados atraveacutes de luz UV (ultravioleta) Os pacientes positivos que
apresentaram ldquobandardquo (fragmento amplificado) se continuou os procedimentos e os
negativos que natildeo apresentaram ldquobandasrdquo foram repetidos para o procedimento da
2ordf PCR
424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem)
Os pacientes positivos para a 2ordf PCR foram submetidos agrave genotipagem
do viacuterus atraveacutes do meacutetodo de RFLP utilizando um par de enzimas de restriccedilatildeo
AVA II e RSA I Essa teacutecnica tambeacutem foi adaptada no Laboratoacuterio de Patologia
Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais
46
Na determinaccedilatildeo do genoacutetipo cada amostra eacute utilizada duas vezes
sendo uma reaccedilatildeo para AVA II e uma para RSA I portanto cada amostra teve dois
tubos correspondentes
Para a preparaccedilatildeo do mix de uma amostra para a enzima de restriccedilatildeo
AVA II (Promega) foram utilizados Buffer C X 30 2 microL aacutegua ultrapura livre de
DNAse e RNAse 125 microL AVA II 05 microL Para o mix de uma amostra de RSA I
(Invitrogen) satildeo necessaacuterios React 1 10X 2 microL aacutegua ultrapura libre de DNAse e
RNAse 11 microL RSA I 2 microL
O volume do mix por amostra foi de 15 microL e o volume da amostra
(produto da 2ordf PCR) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 20 microL para
cada frasco correspondente a sua enzima de restriccedilatildeo As amostras formatildeo ldquoparesrdquo
de tubos AVA II e RSA I e satildeo colocadas em banho-maria a 37ordmC overnight para
digerir (cortar) os fragmentos
Para visualizaccedilatildeo do produto da digestatildeo (RFLP) e verificaccedilatildeo dos
genoacutetipos foi preparado um gel de agarose a 2 (2g de agarose para 100 mL de
tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que migrou em cuba de eletroforese
com 100V 500A por 60 minutos Os resultados foram visualizados atraveacutes de luz UV
(ultravioleta) Os pacientes positivos apresentam ldquobandasrdquo (fragmentos) de
tamanhos diferentes O nuacutemero de bandas e sua disposiccedilatildeo no gel formaram
padrotildees de combinaccedilotildees correspondentes a cada genoacutetipo viral
425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas HEp-2
A pesquisa de auto-anticorpo contra antiacutegenos celulares foi realizada no
Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa pela teacutecnica de imunofluorescecircncia
indireta que os identifica atraveacutes da ligaccedilatildeo destes auto-anticorpos aos antiacutegenos do
substrato sendo esta ligaccedilatildeo revelada pela adiccedilatildeo de um soro com atividade Anti-
IgG conjugado agrave fluoresceiacutena
As amostras foram testadas utilizando-se um conjunto diagnoacutestico
comercial Antinuclear Antibody HEp-2 da Hemagen Diagnostics
Na primeira fase da reaccedilatildeo os soros diluiacutedos 140 colocados em contato
com o substrato durante 20 minutos seguido de lavagem com soluccedilatildeo salina
tamponada por 10 minutos Na segunda fase aplicacou-se a substacircncia
47
fluorescente sendo o conjugado diluiacutedo 130 deixando-se por 10 minutos seguida
de nova lavagem de 10 minutos e montagem da lacircmina com glicerina tamponada
Em cada lacircmina foram utilizados controle positivo e controle negativo
A leitura das lacircminas foi realizada em microscoacutepio de imunofluorescecircncia
marca Nikon modelo Eclipse E-200
Os criteacuterios morfoloacutegicos observados durante a leitura foram
a) aspecto da matriz nuclear
b) aspecto do nucleacuteolo
c) observaccedilatildeo de todos os estaacutegios de divisatildeo nuclear
d) aspecto do fuso mitoacutetico
e) aspecto do citoplasma
43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados coletados foram estruturados em um banco de dados no qual
tambeacutem foram confeccionadas tabelas e graacuteficos para representaccedilatildeo dos dados
Posteriormente foram analisados no programa Bioestat 50 para a geraccedilatildeo de
resultados estatiacutesticos que comprovassem a associaccedilatildeo de variaacuteveis pertinentes ao
estudo considerando o intervalo de confianccedila (IC) 95 e niacutevel α 5 (p-valor le 005)
isto eacute um achado seraacute considerado estatisticamente significante se valor de ldquoprdquo for
menor ou igual a 005 e seraacute considerado sem significacircncia estatiacutestica se esse valor
de ldquoprdquo for maior que 005
Nas variaacuteveis quantitativas foram realizadas as medidas de tendecircncia
central sendo calculado a meacutedia e a mediana com seus respectivos desvios
padrotildees O teste t foi usado para comparar as idades entre as amostras
O teste do Qui-quadrado e o teste G foram aplicados nas comparaccedilotildees de
n amostras independentes cujas proporccedilotildees observadas nas diversas modalidades
estiveram dispostas em tabelas de contigecircncia l x c onde se determinou as
proporccedilotildees observadas nas diferentes categorias e se estas tinham alguma
associaccedilatildeo
48
5 RESULTADOS
O Padratildeo de FAN em 100 dos 51 pacientes infectados pelo HCV e em
2 dos natildeo infectados pelo HCV ocorreu Citoplasmaacutetico
Com relaccedilatildeo agrave distribuiccedilatildeo dos pacientes por gecircnero observou-se uma
predominacircncia do gecircnero masculino (667) A faixa etaacuteria predominante foi a de 30
a 50 anos de idade (628) seguida da faixa etaacuteria compreendida entre 51 e 60
anos (196) No que diz respeito agrave naturalidade houve uma predominacircncia de
paraenses em 922 da amostra A maioria dos pacientes incluiacutedos no estudo foi
proveniente da Fundaccedilatildeo HEMOPA (98) por se tratarem de candidatos a doaccedilatildeo
de sangue (Tabela 1)
Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV segundo as caracteriacutesticas demograacuteficas janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Caracteriacutesticas demograacuteficas n Teste estatiacutestico Gecircnero
Masculino 34 667 Qui-quadrado Feminino 17 333 p = 00251
Total 51 1000
Idade (anos) lt 30 6 118 Qui-quadrado
30 a 40 16 314 p = 00094 41 a 50 16 314 51 a 60 10 196
gt 60 3 59 Total 51 1000
Naturalidade
Paraense 47 922 Qui-quadrado Macapaense 1 20 p lt 00001 Maranhense 1 20
Pernambucano 1 20 Gauacutecho 1 20
Total 51 1000
Procedecircncia Qui-quadrado HEMOPA 50 980 p lt 00001
IASEP 1 20 Total 51 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
49
Identificou-se no estudo a predominacircncia do genoacutetipo viral do tipo 1
(882) estando o genoacutetipo 3 presente em 118 dos casos Em 255 dos
pacientes foi observado uma positividade para FAN sendo que todos apresentaram
o padratildeo citoplasmaacutetico (Tabela 2)
Tabela 2 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV conforme os resultados laboratoriais de FAN citoplasmaacutetico e genotipagem janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Exames laboratoriais n Teste estatiacutestico
Genoacutetipo viral - HCV
Tipo 1 45 882 Qui-quadrado
Tipo3 6 118 p lt 00001
Total 51 1000
FAN Qui-quadrado
Positivo (citoplasmaacutetico) 13 255 p = 00008
Negativo 38 745 Total 51 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
Observou-se uma baixa positividade para o FAN tanto no gecircnero
masculino (294) quanto no gecircnero feminino (176) Natildeo houve diferenccedila
estatiacutestica significante entre os gecircneros e a anaacutelise do FAN (p = 05652) Isto eacute
independendo do gecircnero do paciente nada se poderaacute inferir se o mesmo teraacute maior
ou menor chance de possuir um FAN positivo ou negativo (Tabela 3)
Tabela 3 ndash Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
FAN (citoplasmaacutetico)
Gecircnero Teste estatiacutestico
(Teste G) Masculino Feminino
N N
Positivo 10 294 3 176
Negativo 24 706 14 824 p = 05652
Total 34 1000 17 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
Dentre os pacientes infectados o genoacutetipo viral tipo 1 e o tipo 3
predominaram no gecircnero masculino embora natildeo havendo diferenccedila significativa
entre os grupos (p=06376)(Tabela 4)
50
Tabela 4 - Relaccedilatildeo da genotipagem de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Gecircnero
Grupos estudados Teste estatiacutestico
(Teste G) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3
n n Masculino 29 644 5 833 p=06376 Feminino 16 356 1 167
Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa
Na faixa etaacuteria de 30 a 50 anos foi observada uma maior proporccedilatildeo (667)
do genoacutetipo viral do tipo 3 enquanto que para o genoacutetipo tipo 1 foi de 628 natildeo
tendo essa diferenccedila significacircncia estatiacutestica (Tabela 5)
Tabela 5 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e faixa etaacuteria - janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)
Idade (anos) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n
lt 30 04 118 0 00
30 a 40 15 314 3 500 p = 06401
41 a 50 15 314 1 167
51 a 60 08 196 2 333
gt 60 03 59 0 00 Total 45 1000 6 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
A anaacutelise descritiva das idades dos pacientes demonstrou que a meacutedia e
a mediana foi de 43 anos para aqueles com genoacutetipo viral tipo 1 no entanto para o
genoacutetipo viral tipo 3 a meacutedia foi de 44 e a mediana de 42 anos Observou-se que a
idade miacutenima dos pacientes com genoacutetipo viral-HCV do tipo 1 e 3 foi
respectivamente de 20 e 32 anos e a maacutexima foi de 68 e 57 anos perfazendo uma
amplitude total de 48 e 25 anos respectivamente Natildeo houve significacircncia estatiacutestica
entre as idades encontradas nos genoacutetipos 1 e 3 (Tabela 6 )
De acordo com o FAN citoplasmaacutetico a idade miacutenima dos pacientes com
FAN positivo e negativo foi respectivamente de 30 e 20 anos e a maacutexima foi de 53 e
68 anos perfazendo uma amplitude total de 23 e 48 anos respectivamente As
idades meacutedia e mediana foram respectivamente 435 e 46 anos nos pacientes com
o FAN positivo e meacutedia de 43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN
51
negativo Natildeo houve diferenccedila estatisticamente significativa entre as idades
encontradas nos pacientes com FAN positivo e negativo (Tabela 6)
Tabela 6 - Estudo descritivo da idade dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e presenccedila do FAN citoplasmaacutetico janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Grupos Estudados Genoacutetipo viral - HCV Auto anticorpo
Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 FAN (+) FAN (-) IDADE
Tamanho da amostra 45 6 13 38
Idade miacutenima 20 32 30 20
Idade maacutexima 68 57 53 68
Amplitude Total 48 25 23 48
Meacutedia Aritmeacutetica 43 44 435 43
Mediana 43 42 46 42
Desvio Padratildeo 107 93 78 113
Teste t p = 08363 p = 08809 Fonte Protocolo da pesquisa
Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos em que foram analisados AST
ALT ASTALT γ-GT e fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo
semelhantes dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e 3 natildeo
atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos
(Tabela 7)
Tabela 7- Distribuiccedilatildeo dos genoacutetipos dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Paracircmetros bioquiacutemicos
Genoacutetipo viral - HCV Teste estatiacutestico
(Teste t) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3
micro plusmn DP micro plusmn DP
AST 353 plusmn 219 328 plusmn 137 p = 07907
ALT 372 plusmn 321 288 plusmn 136 p = 05355
ASTALT 12 plusmn 07 14 plusmn 11 p = 06110
γ-GT 403 plusmn 38 302 plusmn 138 p = 02194
Fosfatase alcalina 1126 plusmn 443 1087 plusmn 376 p = 08349
Fonte Protocolo da pesquisa
Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos de AST ALT ASTALT γ-GT e
fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os
52
pacientes com FAN positivo e negativo natildeo sendo observada significacircncia
estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos de FAN (Tabela 8)
Tabela 8 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Paracircmetros bioquiacutemicos Auto anticorpos
Teste estatiacutestico (Teste t) Positivo Negativo
micro plusmn DP micro plusmn DP
AST 419 plusmn 238 326 plusmn 197 p = 01704
ALT 408 plusmn 29 346 plusmn 312 p = 05347
ASTALT 13 plusmn 08 12 plusmn 07 p = 05732
γ-GT 34 plusmn 21 409 plusmn 40 p = 04369
Fosfatase alcalina 1073 plusmn 345 1138 plusmn 462 p = 06431 Fonte Protocolo da pesquisa
Na comparaccedilatildeo entre resultados positivos e negativos do FAN
citoplasmaacutetico observou-se uma maior prevalecircncia da negatividade tanto em
pacientes natildeo infectados (98) como em pacientes infectados (745) pelo HCV
sendo essa diferenccedila estatisticamente significativa (plt00001) o que representa
uma natildeo associaccedilatildeo entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV
(Tabela 9)
Tabela 9 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico segundo a presenccedila ou ausecircncia de infecccedilatildeo por HCV janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
FAN (citoplasmaacutetico)
Pacientes Teste estatiacutestico (Teste G)
Infectados Natildeo infectados
N n
Positivo 13 255 2 2
Negativo 38 745 98 98 p lt 00001
Total 51 1000 100 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
Comparando-se os resultados do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos
viras observa-se que o resultado negativo eacute superior ao positivo em ambos os
genoacutetipos virais sendo 711 para o genoacutetipo viral 1 e 100 para o genoacutetipo viral 3
No entanto esta diferenccedila observada natildeo eacute estatisticamente significativa (p=02573)
(Tabela 10)
53
Tabela 10 - Distribuiccedilatildeo do FAN de acordo com o genoacutetipo viral janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
FAN (citoplasmaacutetico)
Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)
Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n
Positivo 13 289 0 00 p=02573 Negativo 32 711 6 1000
Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa
54
6 DISCUSSAtildeO
Desde o primeiro marcador soroloacutegico para diagnoacutestico do Lupus
Eritematoso Sistecircmico (LES) a ceacutelula LE descrita por Hargraves (1948) vaacuterios
substratos antigecircnicos foram utilizados para o estudo dos auto-anticorpos os quais
terminaram amplamente substituiacutedos pelas ceacutelulas HEp-2 Estas apresentam
significativas vantagens sobre os demais pela sua sensibilidade variedade de
antiacutegenos presentes e pelas facilidades morfoloacutegicas para o seu estudo
O uso da imunofluorescecircncia indireta para a visualizaccedilatildeo dos anticorpos
antinucleares nas ceacutelulas HEp-2 permite o reconhecimento de mais de 30 diferentes
padrotildees de fluorescecircncia como nucleares nucleolares da membrana nuclear do
aparelho mitoacutetico e citoplasmaacutetico todos satildeo proporcionados por diferentes auto-
anticorpos
A partir do 1deg Consenso Brasileiro para Padronizaccedilatildeo dos Laudos de FAN
(HEp-2) os criteacuterios para o preparo interpretaccedilatildeo da fluorescecircncia e nomenclatura
dos resultados passaram a ser normatizados Alguns padrotildees de fluorescecircncia satildeo
relativamente inespeciacuteficos outros satildeo ocasionados por uma gama restrita de auto-
anticorpos e outros ainda por um uacutenico auto-anticorpo (DELLAVANCE et al
2002) Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a tornaacute-las
imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo (DE
LARANAGA et al 2000)
Apesar do padratildeo de fluorescecircncia na maioria das vezes natildeo se pode
identificar o anticorpo presente ele pode sugerir ao cliacutenico qual o proacuteximo passo a
ser dado na investigaccedilatildeo da sua especificidade Os resultados encontrados devem
estar em associaccedilatildeo com a cliacutenica os padrotildees de fluorescecircncia e os tiacutetulos
alcanccedilados com a diluiccedilatildeo preacutevia (DELLAVANCE et al 2003)
No presente estudo a analise de 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo Viacuterus da
Hepatite C esteve presente o anticorpo-antinuclear (ANA FAN) em 13 (255) dos
pacientes e todos eram padratildeo citoplasmaacutetico corroborando com outros estudos
encontrados na literatura como
Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de
pacientes infectados pelo viacuterus HIV com Hanseniacutease e co-infectados com
Hanseniacutease HIV Ela obteve respectivamente as seguintes taxas de prevalecircncias
32 333 e 478 Em todos os grupos neste estudo houve predomiacutenio do
55
padratildeo citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear soacute foi observado entre os pacientes com
hanseniacutease (91) e co-infectados (237)
Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de
pacientes infectados pelo viacuterus da Dengue e viacuterus linfotroacutepico de ceacutelulas T humanas
HTLV-12 e controle Normais e obteve respectivamente as seguintes taxas de
prevalecircncias 40 40 e 2 Em todos os grupos houve predomiacutenio do padratildeo
citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear foi observado entre os pacientes com dengue
(67) e HTLV 12 (133)
Segundo Andrade et al (2002) Dellavance et al (2005) Dellavance e
Andrade et al (2007) o predomiacutenio do padratildeo de FAN do tipo citoplasmaacutetico indica
que determinados padrotildees de fluorescecircncia satildeo mais especiacuteficos de doenccedila auto-
imune enquanto outros ocorrem em indiviacuteduos com enfermidades natildeo auto-imunes
por ser o citoplasma celular rico em proteiacutenas para as quais auto-anticorpos naturais
apresentam afinidade moderada eacute comum observar positividade para FAN em
indiviacuteduos sadios cujo significado ainda natildeo eacute entendido completamente
O padratildeo Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina que pode ser
encontrado em Hepatite auto-imune Cirrose Hepatite C Hepatocarcionoma entre
outros Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica
definida Um resultado positivo pode estar ou natildeo associado a uma patologia assim
como poderaacute ou natildeo vir a apresentar uma doenccedila auto-imune com o passar do
tempo (DELLAVANCE et al 2003) Neste estudo natildeo foi feito avaliaccedilatildeo prospectiva
dos resultados embora todos sejam FAN citoplasmaacuteticos
Os achados de FAN positivo em populaccedilotildees sadias ou sem doenccedilas auto-
imunes tambeacutem jaacute observado por Leser et al (2004) que em 394 pacientes com
FAN-HEp-2 positivo natildeo encontraram nenhum paciente com doenccedila auto-imune
Outro exemplo estaacute no padratildeo citoplasmaacutetico de pontos isolados
estudado por Laurino et al (2006) presente em indiviacuteduos sem evidecircncia de auto-
imunidade mas tambeacutem em indiviacuteduos com acometimento de doenccedilas auto-imunes
sistecircmicas e natildeo-especiacuteficas
Os dados apresentados corroboram com este estudo em que foi
observado a presenccedila do auto-anticorpo em 2 (2 ) dos 100 indiviacuteduos sadios do
grupo controle todos com padratildeo citoplasmaacutetico
56
Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a
tornaacute-las imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo
(DE LARANAGA et al 2000)
Nas Infecccedilotildees agudas espera-se que a resposta auto-imune diminua a
medida que os viacuterus satildeo eliminados Entretanto alguns trabalhos sugerem que em
indiviacuteduos geneticamente susceptiacuteveis as reaccedilotildees auto-imunes possam persistir
apesar do clareamento viral uma vez que o gatilho imunoloacutegico foi ativado e natildeo
houve desativaccedilatildeo (DE LARANAGA et al 2000 SAKKAS et al 2008)
Ramos-Casals et al (2009) no estudo Doenccedilas Sistecircmica Auto-Imunes
em Pacientes com Infecccedilatildeo pelo (72) dos pacientes eram do gecircnero feminino e
(28) do masculino(ANA FAN) em 61 dos pacientes o que se diferem deste
trabalho eacute que dos 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo (667) eram do gecircnero
masculino e (333) eram do gecircnero feminino com meacutedia de idade de 430 (plusmn107)
anos com presenccedila de anticorpo-antinuclear em 13 (255) com meacutedia e mediana
respectivamente de 435 e 46 anos nos pacientes com o FAN positivo e meacutedia de
43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN negativo
Alter (1995) em sua pesquisa natildeo observou associaccedilatildeo entre o risco de
infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas designadas por gecircnero idade e raccedila Na
referida pesquisa foram estudados 51 pacientes com idade meacutedia de 430 (+- 107)
anos 34 (667) eram do gecircnero masculino e 17 (333) do gecircnero feminino todos
em fase preacute-tratamento assintomaacuteticos natildeo permitindo avaliar os risco da
infecccedilatildeoSegundo Pordeus et al (2008) a ocorrecircncia destes auto-anticorpos
indicaria um prognoacutestico desfavoraacutevel Perperas Mcfarlane e Mcsorley (1986)
sugeriram que os auto-anticorpos poderiam estar envolvidos na progressatildeo ou no
desenvolvimento de hepatites crocircnicas possivelmente por um distuacuterbio no controle
da auto-reatividade Outros estudos questionam a participaccedilatildeo dos auto-anticorpos
no processo de transiccedilatildeo para cronicidade das hepatites agudas virais poreacutem os
resultados natildeo satildeo convincentes (SHOENFELD ROSE 2004)
Lopez Seia e Roy (1998) demonstraram a presenccedila de anticorpo anti-
actina em baixos tiacutetulos em crianccedilas com hepatite aguda por curto periacuteodo de
tempo poreacutem nenhuma associaccedilatildeo com gravidade da agressatildeo hepaacutetica foi
descrita
Neste estudo a presenccedila dos auto-anticorpos em (255) dos pacientes
com infecccedilatildeo pelo HCV natildeo puderam ser relacionada com a gravidade da doenccedila
57
pois este estudo foi realizado em pacientes receacutem diagnosticados entatildeo seria
necessaacuterio um acompanhamento destes por um periacuteodo maior de tempo com a
finalidade de concluir esta afirmativa Apesar da presenccedila transitoacuteria de auto-
anticorpos jaacute ter sido descrita em doenccedilas virais comuns a associaccedilatildeo entre a
presenccedila de auto-anticorpos e a gravidade das doenccedilas necessita de comprovaccedilatildeo
Passaleva Massai e Leoncini (1983) avaliaram 302 pacientes com
hepatites agudas virais e encontraram complexos imunes circulantes (CIC) em
516 dos pacientes com frequumlecircncia significativamente maior em hepatite aguda
Nenhuma associaccedilatildeo entre a presenccedila de imuno-complexos e o niacutevel de
aminotransferases ou bilirrubina foi encontrada Segundo Andrade et al (2002)
Dellavance et al (2005) Andrade et al (2007) nos pacientes do estudo foi feita a
relaccedilatildeo entre a presenccedila dos auto-anticorpos e niacuteveis de aminotransferases e as
elevaccedilotildees natildeo tiveram significacircncia poreacutem houve associaccedilatildeo do genotipo viral 1
Nos paracircmetros bioquiacutemicos analisados em relaccedilatildeo aos genoacutetipos houve uma
distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e
3 natildeo atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os
grupos Segundo Wilson (1997) trecircs estudos mostraram correlaccedilatildeo entre niacuteveis
altos de alanina aminotransferase e atividade histoloacutegica da doenccedila hepaacutetica
Poreacutem nos pacientes considerados individualmente o valor preditivo dessa
associaccedilatildeo foi baixo enquanto muitos deles com enzimas normais apresentavam
graves alteraccedilotildees histoloacutegicas No presente estudo natildeo foi observada associaccedilatildeo entre os niacuteveis de
aminotransferases e a cronificaccedilatildeo da hepatite viral pois nem todos os pacientes do
estudo apresentavam resultado de bioacutepsia hepaacutetica
Alter et al (1999) afirmam que no Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b
(63) e 3a (313) em estudo realizado em Goiacircnia onde foi observada uma
maior prevalecircncia do genoacutetipo 1 seguida do genoacutetipo 3 em doadores de sangue e
hemofiacutelicos (DELLAVANCE ANDRADE et al 2007) Estando esses dados em
acordo com esta pesquisa que com genotipagem do viacuterus da hepatite C que
identificou o genoacutetipo 1 em 45 (882) seguidos pelo genoacutetipo 3 que foi
identificado em 6 (118) dos pacientes com infecccedilatildeo pelo HCV Em um estudo realizado na Franccedila com 13 pacientes luacutepicas infectadas
pelo viacuterus C 8 apresentavam o RNA viral sendo o genoacutetipo 1 presente em cinco
58
(625) casos seguido do genoacutetipo 3 (375) (PERLEMUTER et al 2000) dados
que se assemelham aos do presente estudo embora o estudo natildeo tenha incluiacutedo
pacientes com outras infecccedilotildees associadas ao HCV Eacute importante ressaltar que
estudos sobre genotipagem do HCV em indiviacuteduos com doenccedilas reumaacuteticas satildeo
raros
No presente estudo houve uma frequumlecircncia baixa de positividade para o
FAN nos pacientes com genoacutetipo 1 e genoacutetipo 3 Natildeo havendo significacircncia
estatiacutestica entre os pacientes com genoacutetipo 1 e 3
Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter
implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave menor
resposta agrave terapia antiviral (BRUNO et al1997) o que natildeo foi avaliado neste estudo
pois apesar de (882) dos pacientes serem genoacutetipo 1 todos estavam em fase de
reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica seja preacute- tratamento Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila
poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses
autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis
vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo
hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja
quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a
concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave
hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em
parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)
59
7 CONCLUSOtildeES
minus O padratildeo dos auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares encontrados nos
dois grupos estudados foi o citoplasmaacutetico
minus A prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares no grupo com
infecccedilatildeo pelo VHC foi significativamente maior do que no grupo controle
minus Nos resultados de FAN citoplasmaacutetico haacute uma maior prevalecircncia da
negatividade em pacientes infectados pelo HCV e natildeo infectados sendo
essa diferenccedila estatisticamente significativa conferindo a natildeo associaccedilatildeo
entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV
minus Os resultados negativos do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos viras eacute
superior aos positivos em ambos os genoacutetipos virais entretanto esta diferenccedila
natildeo eacute estatisticamente significativa
minus Houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos
celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado
minus Natildeo houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos
celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado com
relaccedilatildeo ao gecircnero onde predominou o gecircnero masculino nos dois grupos
minus Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter
implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave
menor resposta agrave terapia antiviral o que natildeo foi avaliado neste estudo pois
os pacientes estavam em fase preacute tratamento sugerindo que estes pacientes
sejam avaliados futuramente
minus A formaccedilatildeo dos auto-anticorpos parece ser mais uma consequumlecircncia do que
uma causa da agressatildeo hepaacutetica
minus A negatividade do FAN ndash Hep 2 foi maior que a positividade mas todos os
FAN positivos pertenciam ao genoacutetipo viral tipo 1 nos pacientes infectados
pelo HCV
minus Nesta pesquisa os resultados de PCR o RNA-HCV de reconfirmaccedilatildeo foi
positivo para o anti-HCV em todos os soros analisados mostrando assim
que estes pacientes eram portadores de infecccedilatildeo por viacuterus C ou seja natildeo
houve falso positivo anteriormente poreacutem todos eram assintomaacuteticos
dificultando a conclusatildeo de ser ou natildeo uma infecccedilatildeo persistente
60
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APEcircNDICES
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APEcircNDICE A - TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Vocecirc estaacute sendo convidado para fazer parte de uma pesquisa que estaacute sendo desenvolvida pela Universidade Federal do Paraacute no Nuacutecleo de Medicina Tropical intitulada AUTOANTICORPOS CONTRA ANTIacuteGENOS CELULARES E SUA CORRELACcedilAtildeO COM O GENOacuteTIPO VIRAL EM PACIENTES COM INFECCcedilAtildeO PELO VIacuteRUS DA HEPATITE C (HCV)
O Objetivo da pesquisa eacute fazer uma correlaccedilatildeo do anticorpo antinuacutecleo (FAN) e o genoacutetipo viral em pacientes com hepatite C e o estaacutegio da doenccedila hepaacutetica a partir da histologia sempre que permitidos e correlacionar ao diagnoacutestico
Caso vocecirc participe da pesquisa seraacute necessaacuterio que forneccedila uma amostra de sangue (2ml)
O uacutenico inconveniente que vocecirc poderaacute experimentar eacute a dor provocada pela agulha na hora da coleta de sangue bem como pequenos hematomas que possam vir a ocorrer e que natildeo causam danos
Essa pesquisa natildeo oferece riscos as praacuteticas satildeo de uso rotineiro e seratildeo utilizados materiais esterilizados e descartaacuteveis como agulhas seringas etc
Estaacute garantido a vocecirc todas as informaccedilotildees que vocecirc queira antes durante e depois da pesquisa
A sua participaccedilatildeo neste estudo eacute voluntaacuteria Vocecirc tem a liberdade de recusar participar da pesquisa a qualquer momento
As informaccedilotildees relacionadas agrave pesquisa poderatildeo ser inspecionadas pelos pesquisadores que executam a pesquisa e pelas autoridades legais no entanto se qualquer informaccedilatildeo for divulgada em relatoacuterio publicaccedilatildeo ou qualquer outro meio isto seraacute feito de forma codificada para manter o caraacuteter confidencial
Todas as despesas necessaacuterias para a realizaccedilatildeo do estudo natildeo satildeo de sua responsabilidade assim como a sua participaccedilatildeo na pesquisa na seraacute remunerada (vocecirc natildeo receberaacute qualquer valor em dinheiro)
Quando os resultados forem divulgados natildeo apareceraacute seu nome e sim um coacutedigo
_____________________________________
Assinatura do Pesquisador Responsaacutevel NomeAna Maria Almeida Souza EndRodovia Maacuterio Covas 1426 ndash Cond Green Garden casa 41 Fone(91) 32352665 81197217 RegConselhoCRM 1508
69
APEcircNDICE B - CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Declaro que li as informaccedilotildees acima sobre a pesquisa que me sinto
perfeitamente esclarecido sobre o conteuacutedo da mesma assim como seus riscos e
benefiacutecios Declaro ainda que por minha livre vontade aceito participar da pesquisa
cooperando com a coleta de material para exame
Beleacutem _________
_________________________________________
Assinatura do sujeito da pesquisa ou do
responsaacutevel
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ANEXOS
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- Assinatura do Pesquisador Responsaacutevel
-
- Beleacutem _________
-
SUMAacuteRIO 1 INTRODUCcedilAtildeO 15 11 HEPATITE C (VHCHCV) 15 111 Consideraccedilotildees Gerais 15 112 Agente Etioloacutegico 16 113 Epidemiologia 17 114 Modo de Transmissatildeo 18 115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica 19 116 Diagnoacutestico 23 12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC 25
13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC 26
14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE 27
15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES AGUDAS VIRAIS 31
16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN 32 2 JUSTIFICATIVA 39 21 ASPECTOS EacuteTICOS 39 3 OBJETIVOS 40
31 OBJETIVO GERAL 40
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS 40 4 MATERIAL E MEacuteTODOS 41 41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO) 41 411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C 41 412 Grupo de natildeo infectados 41 42 MEacuteTODO 42 421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico 42 422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C 42 423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia
molecular 43
424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem) 45 425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas
HEp-2 46 43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 47 5 RESULTADOS 48 6 DISCUSSAtildeO 54 7 CONCLUSOtildeES 59 REFEREcircNCIAS 60 APEcircNDICES 67 ANEXOS 70
15
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 HEPATITE C (VHCHCV)
111 Consideraccedilotildees Gerais
As hepatites virais satildeo doenccedilas causadas por diferentes agentes
etioloacutegicos de distribuiccedilotildees universais que tecircm em comum o hepatotropismo
Possuem semelhanccedilas do ponto de vista cliacutenico-laboratorial mas apresentam
importantes diferenccedilas epidemioloacutegicas quanto agrave sua evoluccedilatildeo (FERREIRA
SILVEIRA 2004) Desde a descriccedilatildeo e definiccedilatildeo em 1989 (CHOO et al 1989 apud
RIBEIRO et al 2007) tornou-se evidente sua associaccedilatildeo com uma grande
variedade de manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas desordens reumaacuteticas e auto-imunes
(ALMEIDA 2010)
A infecccedilatildeo pelo VHCHCV acarreta inflamaccedilatildeo hepaacutetica e esteatose
podendo evoluir para fibrose hepaacutetica e cirrose em indiviacuteduos cronicamente
infectados estes com grande risco de desenvolvimento de carcinoma hepatocelular
(RIBEIRO et al 2007) Essas complicaccedilotildees tardias ocorrem em um periacuteodo em
geral superior a 20 anos apoacutes o iniacutecio da infecccedilatildeo A avaliaccedilatildeo filogeneacutetica das
sequumlecircncias do VHCHCV investigadas em vaacuterias regiotildees geograacuteficas sugere que
existam pelo menos seis genoacutetipos principais designados pelos nuacutemeros de 1 a 6 e
pelo menos 30 subtipos designados por letras minuacutesculas Nos Estados Unidos
prevalecem os genoacutetipos 1a (60) e 1b (20) Os tipos 5 e 6 satildeo mais encontrados
no sudeste e sul da Aacutefrica O tipo 4 eacute predominante na Aacutefrica Central e no Oriente
Meacutedio No Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b (63) e 3a (313) (BASSIT et
al 1999 apud RIBEIRO et al 2007) As informaccedilotildees sobre as causas que
determinam o curso evolutivo da doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos
progressos que haacute no campo do diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHCHCV Uma
questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo genoacutetipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de
lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o genoacutetipo 1 (1b) cursa com lesotildees
histoloacutegicas mais graves
As uacuteltimas deacutecadas foram de notaacuteveis conquistas no que se refere agrave
prevenccedilatildeo e ao controle das hepatites virais Entre as doenccedilas endecircmico-
epidecircmicas que representam problemas importantes de sauacutede puacuteblica no Brasil
16
salientam-se as Hepatites Virais cujo comportamento epidemioloacutegico no nosso paiacutes
e no mundo tem sofrido grandes mudanccedilas nos uacuteltimos anos
Antes da seleccedilatildeo rigorosa dos doadores de sangue em 1991 o
VHCHCV era a maior causa de hepatite poacutes-transfusional Atualmente permanece
como tal em casos esporaacutedicos (CONTE 2000) Os grupos considerados de risco
satildeo pessoas que receberam transfusatildeo de sangue antes de 1992 usuaacuterios de
drogas injetaacuteveis profissionais de sauacutede que lidam com sangue pacientes de
hemodiaacutelise e com menor risco pessoas tatuadas ou com piercings (CLEMENTE
ONO-NITA 2007)
A melhoria das condiccedilotildees de higiene e de saneamento das populaccedilotildees a
vacinaccedilatildeo contra a Hepatite B (HBV) e as novas teacutecnicas moleculares de diagnoacutestico
do viacuterus da Hepatite estatildeo entre esses avanccedilos importantes (BRASIL 2008)
112 Agente Etioloacutegico
O VHCHCV um viacuterus aacutecido ribonucleacuteico (RNA) da famiacutelia Flaviviridae
representa a principal causa da previamente denominada hepatite natildeo-A natildeo-B
(SANTOS 2009) Foi identificado e isolado a partir de um clone derivado de um
genoma NANBH semelhante aos togaviridae ou flaviviridae (SAADE 2008) e
visualizado a imunoeletromicroscopia como partiacutecula de 55 a 65 nm de diacircmetro
com projeccedilotildees espiculares e de morfologia muito semelhante aos flaviviridae Aleacutem
disso estas partiacuteculas reagiram especificamente com anticorpos mono e policlonais
do conteuacutedo proteacuteico do envelope do VHC (HIRANUMA et al 1994 apud CONTE
2000)
O agente etioloacutegico do HCV natildeo eacute uma partiacutecula homogecircnea e apresenta
uma taxa alta de mutaccedilatildeo levando-o a uma heterogeneicidade genocircmica cujo
resultado eacute um grande nuacutemero de genoacutetipos (1a 1b 2a 2b 3a 3b 4 5 6)
(AUGUSTO LOBATO 2003) Natildeo haacute evidecircncias de variantes natildeo patogecircnicas O
genoacutetipo 1b eacute o que apresenta maior virulecircncia e pior resposta ao tratamento
(LAUER WALKER 2001 apud SOUZA 2007) No Brasil dados obtidos a partir de
casos isolados e estudos de pequenas amostragens indicam que o genoacutetipo 1b
ocorre em cerca de 30 a 40 dos casos o 1a em cerca de 20 1a e 1b em 20
o 3a em cerca de 28 (FOCACCIA 2004)
17
113 Epidemiologia
De acordo com a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) a HCV eacute uma
questatildeo de sauacutede puacuteblica e tambeacutem a principal causa de transplante de fiacutegado no
Brasil (SOCIEDADE BRASILEIRA DE HEPATOLOGIA 2005) Eacute estimada uma
prevalecircncia em torno de 10 para a infecccedilatildeo pelo VHC na populaccedilatildeo mundial
(KILLEMBERG 2000) Nos Estados Unidos cerca de 27 milhotildees de pessoas estatildeo
infectadas pelo viacuterus (BRASIL 2006)
De acordo com Ferreira e Silveira (2004) no Brasil o nuacutemero de pacientes
infectados eacute incerto relacionado geralmente a alguns estados e municiacutepios e o
esclarecimento dos agentes causadores das hepatites cuja identificaccedilatildeo requer
teacutecnicas laboratoriais complexas de biologia molecular eacute realizado de maneira
insuficiente Por outro lado a progressiva integraccedilatildeo entre as instacircncias gestoras
dos programas de vigilacircncia e controle das doenccedilas com grupos de pesquisa e
desses com os serviccedilos (FERREIRA SILVEIRA 2004 p 473) e a disponibilidade
dos bancos de dados nacionais mais confiaacuteveis apontam para novos e melhores
caminhos (BRASIL 2005b)
A OMS alerta que o Paiacutes deve se preparar para uma ldquoexplosatildeordquo da
epidemia a partir de 2011 (BRASIL 2005b) Outra preocupaccedilatildeo eacute que as pessoas
que receberam sangue antes de 1992 tecircm mais chances de estarem infectadas na
eacutepoca o sangue destinado agraves transfusotildees natildeo era analisado para detecccedilatildeo da HCV
porque o viacuterus natildeo era conhecido e natildeo havia exames especiacuteficos (BRASIL 2005b)
A prevalecircncia da infecccedilatildeo nos doadores de sangue sadios varia de 001-002 no
Reino Unido e no norte da Europa 1-15 no sul da Europa 65 na Aacutefrica
equatorial e de ateacute 20 no Egito (CONTE 2000)
De acordo com a OMS a cada grupo de 50 pessoas no Brasil uma tem
hepatite e de dez portadores apenas um sabe (STRAUSS 2001) Satildeo dois milhotildees
de infectados no Paiacutes Denominada epidemia silenciosa calcula-se que 170 milhotildees
de indiviacuteduos no mundo estejam contaminados pelo viacuterus C a forma mais grave da
doenccedila Ainda de acordo com a OMS o nuacutemero de brasileiros viacutetimas da
enfermidade eacute bem maior do que o estimado pelo Ministeacuterio da Sauacutede (TRINDADE
2005)
18
Por ocasiatildeo da Conferecircncia Internacional de Consenso sobre HCV em Paris
(LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999) concluiu-se que a hepatite crocircnica por viacuterus
C eacute um problema grave de sauacutede puacuteblica sendo sua prevalecircncia mundial estimada
em 3 (de 01 a 5 segundo os vaacuterios paiacuteses) por tanto havendo no mundo
todo cerca de 150 milhotildees de portadores crocircnicos do VHCHCV 4 milhotildees nos EUA
e 5 milhotildees na Europa Ocidental Na Europa Oriental a prevalecircncia eacute maior ainda
114 Modo de Transmissatildeo
A HCV eacute transmitida pelo sangue Natildeo haacute comprovaccedilatildeo de contaacutegio por
meio de fluidos corporais como saliva suor laacutegrimas secircmen ou leite materno
Tambeacutem deixa de ocorrer por meio de abraccedilos beijos uso dos mesmos copos ou
roupas Especialistas afirmam que a contaminaccedilatildeo atraveacutes de relaccedilotildees sexuais eacute
possiacutevel mas rara Quando detectada de maneira precoce a enfermidade tem
tratamento inclusive gratuito aleacutem de cura (BRASIL 2006)
Dentre os fatores de risco para transmissatildeo outros aleacutem da transfusatildeo de
sangue o uso de drogas iliacutecitas o comportamento sexual de alto risco e variaacuteveis
socioeconocircmicas representadas pelo grau de escolaridade e renda familiar Natildeo foi
observada associaccedilatildeo entre o risco de infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas
designadas por gecircnero idade e raccedila (ALTER 2007) O risco de transmissatildeo sexual
do VHCHCV eacute miacutenimo A contaminaccedilatildeo intrafamilial natildeo-sexual eacute consideraacutevel
particularmente quando um dos enfermos tem hepatopatia grave e ou carga viral
elevada (risco 110) (CONTE 2000)
A praacutetica de tatuagem fornece dados conflitantes sabendo-se que os
liacutequidos usados para esterilizar os instrumentos usados satildeo ineficazes
Karmochkine et al (1998 apud CONTE 2000) observaram que
aproximadamente 80 dos pacientes contraem o viacuterus atraveacutes da toxicomania
intravenosa ou transfusotildees de sangue ou de derivados Os restantes meios de
transmissatildeo e de contaacutegio satildeo a hemodiaacutelise os transplantes de oacutergatildeos picadas
acidentais profissionais e transmissatildeo vertical matildee-crianccedila Em 20 a 40 dos
casos natildeo se consegue determinar o modo de contaminaccedilatildeo A transmissatildeo da
hepatite crocircnica por viacuterus C pode ser prevenida (KARMOCHKINE et al 1998 apud
CONTE 2000)
19
As duas fontes de contaminaccedilatildeo satildeo a toxicomania endovenosa e a
administraccedilatildeo de produtos de origem sanguumliacutenea Esta uacuteltima praticamente
eliminada desde 1991 com a introduccedilatildeo dos testes ELISA 2 na seleccedilatildeo
aprimorada de doadores de sangue (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998
apud CONTE 2000)
A transmissatildeo sexual eacute rara com menos de 3 em parceiros estaacuteveis e
ocorre principalmente em pessoas com muacuteltiplos parceiros e com praacutetica sexual de
risco (sem uso de preservativo) ndash para os indiviacuteduos com parceiros muacuteltiplos o uso
de preservativos eacute indicado (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998 apud
CONTE 2000)
A gravidez natildeo estaacute contra-indicada nas mulheres infectadas pelo
VHCHCV A transmissatildeo vertical matildee-crianccedila eacute rara (menor de 6) O tipo de parto
(natural ou cesaacuterea) natildeo tem influecircncia O aleitamento eacute permitido A transmissatildeo
nosocomial eacute prevenida eficazmente de modo convencional (KARMOCHKINE et
al 1998 apud CONTE 2000)
115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica
A infecccedilatildeo aguda pode passar clinicamente despercebida ou evoluir para
hepatite fulminante Aproximadamente 850 das pessoas infectadas agudamente
vatildeo desenvolver uma viremia persistente tornando-se dessa forma indiviacuteduos
infectados crocircnicos Depressatildeo irritabilidade dores no corpo mal-estar febre
naacuteuseas e falta de apetite satildeo alguns dos sintomas mais frequumlentes embora a
maioria dos casos natildeo apresente nenhum sintoma (ALTER 2007)
A cirrose eacute pouco observada em pessoas que apresentam niacuteveis
persistentemente baixos das transaminases mas a elevaccedilatildeo destas natildeo eacute
representativa do grau de fibrose hepaacutetica Dessa forma a bioacutepsia hepaacutetica
representa o melhor indicador do estaacutegio de evoluccedilatildeo da doenccedila uma vez que
gradua os componentes inflamatoacuterios e o estaacutegio de fibrose (AGMON-LEVIN et al
2009 BLOCK SCHIANO 1999)
Alter et al (1992) dizem que em 82 de 130 pacientes seguidos durante
muitos anos apoacutes surto agudo de hepatite natildeo-A natildeo-B apresentam anti-VHCHCV
ou VHCHCV RNA sendo que 62 deles desenvolveram hepatite crocircnica e
concluem que os pacientes que adquiriram HCV tiveram alto grau de hepatite
20
crocircnica sendo que o VHCHCV pode ser a maior causa de doenccedila crocircnica de fiacutegado
nos EUA e que na maioria dos pacientes a infecccedilatildeo pelo VHCHCV parece persistir
por muitos anos mesmo na ausecircncia de doenccedila hepaacutetica ativa
Almeida et al (1999) determinaram a prevalecircncia da infecccedilatildeo em
doadores de sangue assim como avaliaram o grau de comprometimento hepaacutetico
numa populaccedilatildeo de 37335 doadores durante o biecircnio 93-94 em Porto Alegre - RS
utilizando o teste anti-VHC ELISA 2 Selecionaram 60 deles para a biopsia hepaacutetica
com agulha de Menghini encontrando prevalecircncia de 174 com comprometimento
hepatico e 39 deles apresentavam cirrose hepaacutetica Sendo a hepatopatia crocircnica de
graus variaacuteveis observadas em 80 deles na sua grande maioria com lesotildees leves
e miacutenimas Foi observada forte associaccedilatildeo entre elevaccedilatildeo de alanina
aminotransferase (ALT) e a presenccedila de hepatopatia crocircnica embora a intensidade
desta elevaccedilatildeo natildeo se correlacione com a gravidade da lesatildeo histoloacutegica
Jaacute na experiecircncia de Mutimer et al (1995) cerca de 80 dos doadores
soro-positivos analisados exaustivamente inclusive com biopsia de fiacutegado
mostraram evidecircncias de alteraccedilotildees histoloacutegicas e ou viroloacutegicas de infecccedilatildeo
persistente sem no entanto atingir graus mais avanccedilados de hepatopatia crocircnica
quase todos permanecendo na categoria moderada
Nos paiacuteses industrializados a HCV eacute responsaacutevel por 20 dos casos de
hepatite aguda 70 dos casos de hepatite crocircnica 40 dos casos de cirrose
descompensada 60 dos carcinomas hepatocelulares e 30 dos transplantes
hepaacuteticos (LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999)
Cerca de 40 do total de pacientes curam-se ou tecircm doenccedila crocircnica de
natureza benigna Os restantes 60 cursam com atividade aumentada de
aminotransferase denotando evoluccedilatildeo crocircnica da doenccedila Dentre estes a maioria
tem lesotildees necro inflamatoacuterias discretas e fibrose miacutenima ou ausente O prognoacutestico
em longo prazo eacute mal conhecido no entanto provavelmente a maioria deles natildeo viraacute
a falecer da doenccedila hepaacutetica em curso Cerca de 20 deles depois de 10-20 anos
de evoluccedilatildeo desenvolveratildeo cirrose hepaacutetica passiacutevel de transplante Assim a
hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila que ocasiona a morte de um pequeno nuacutemero
de pacientes sem no entanto afetar a duraccedilatildeo da vida meacutedia da maioria deles
(CONTE 2000 FERREIRA SILVEIRA 2004)
Apoacutes infecccedilatildeo aguda somente 10 dos pacientes desenvolve doenccedila
cliacutenica com icteriacutecia A infecccedilatildeo sub-cliacutenica eacute a regra e assim passa despercebida
21
Cerca de 25 deles tecircm infecccedilatildeo crocircnica sintomaacutetica com aminotransferases
normais e lesotildees inflamatoacuterias histoloacutegicas miacutenimas (RESENDE et al 2010)
A remissatildeo espontacircnea acontece em cerca de 15 dos casos Na grande
minoria dos casos a progressatildeo da doenccedila aguda pode levar agrave insuficiecircncia
hepaacutetica aguda
Observaccedilotildees feitas pelo irlandecircs Kenny-Walsh (1999) comprovam a
natureza e a evoluccedilatildeo cliacutenica da afecccedilatildeo em causa O autor acompanhou durante 17
anos 376 mulheres que receberam injeccedilotildees de imunoglobulinas anti-D
contaminadas com VHC provenientes de doador uacutenico num programa de
isoimunizaccedilatildeo Rh Destas 81 apresentaram sintomatologia mais frequumlentemente
fadiga (66) ALT ligeiramente elevada (de 40 a 99 UL) em 47 e igual ou maior de
100 UL em 8 A biopsia hepaacutetica mostrou inflamaccedilatildeo em 98 delas na maioria
das vezes leves (41) e moderadas (52) fibrose presente em 51 no entanto
somente em sete pacientes (2) houve sinais de cirrose provaacutevel ou definitiva Em
uma delas havia acentuado alcoolismo
A hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila de evoluccedilatildeo variaacutevel De maneira
geral sua evoluccedilatildeo eacute lenta insidiosa e progressiva
Os pacientes que natildeo apresentam evidecircncias bioquiacutemicas de lesatildeo
hepaacutetica podem constituir em subgrupo de casos mais benignos no curso natural
da doenccedila Muitos co-fatores tecircm papel importante no desenvolvimento da cirrose
nesses pacientes como por exemplo a idade no momento da infecccedilatildeo (os
contaminados de idade mais avanccedilada tecircm evoluccedilatildeo mais raacutepida da doenccedila
enquanto que os mais jovens a tecircm mais lenta) o alcoolismo (eacute de consenso geral
que o abuso de aacutelcool favorece o aparecimento da cirrose) e a co-infecccedilatildeo com o
Viacuterus da Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida (SIDA) e da HVB
A incidecircncia anual de carcinoma hepatocelular (CHC) eacute de 1 a 4 nos
pacientes cirroacuteticos o que justifica plenamente o controle ecograacutefico do fiacutegado e a
dosagem seacuterica de alfa-fetoproteiacutena nesses pacientes a cada 1-2 anos Por outro
lado nos pacientes com hepatite crocircnica por viacuterus C sem cirrose o CHC eacute muito
raro (LOPES 2010)
Nos casos de cura a atividade das transaminases cessa e os viacuterus natildeo
satildeo detectados (VHC RNA) no soro Nos casos de cronificaccedilatildeo acontece o
contraacuterio ou seja as alteraccedilotildees bioquiacutemicas existem com flutuaccedilotildees e os viacuterus satildeo
detectaacuteveis na grande maioria dos casos Fazem exceccedilatildeo agravequeles pacientes com
22
viremia baixa que por isso mesmo fogem aos limites dos meacutetodos de detecccedilatildeo viral
ou devido agraves flutuaccedilotildees proacuteprias desses niacuteveis virecircmicos (HAYDON et al 1998)
Nos pacientes anti-VHC positivos com enzimas circulantes normais a
falta de VHC RNA no soro tem sido interpretada como sinal de cura completa No
entanto Haydon et al (1998) alteraram essa interpretaccedilatildeo Estes autores
demonstraram a presenccedila de VHC RNA no fiacutegado desses pacientes que eram
negativos no soro independente das alteraccedilotildees bioquiacutemicas positivas ou negativas
do soro ou seja mesmo naqueles casos anteriormente considerados como curados
Assim os niacuteveis de viacuterus intra-hepaacuteticos natildeo satildeo determinados pelos fatores
hospedeiro (idade modo e duraccedilatildeo da infecccedilatildeo) ou virais (VHC genoacutetipos) pois
mesmo as repetidamente Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia-em tempo real (RT-
PCR) negativos para VHC RNA no soro podem ter viacuterus da HCV albergados no
fiacutegado Entretanto existem limitaccedilotildees metodoloacutegicas que devem ser consideradas
nessa interpretaccedilatildeo como por exemplo as limitaccedilotildees do RIBA 3 e do RT-PCR
Mais importante eacute o seguimento dos pacientes ao longo do tempo Assim
Seef et al (1992) em 568 pacientes de hepatite poacutes-transfusional e dois grupos
controles pareados que receberam transfusotildees sem desenvolver hepatite apoacutes 18
anos de seguimento encontraram 33 de mortalidade no grupo 1 e 15 no grupo
controle sendo que a maioria das mortes ocorreu nos pacientes com alcoolismo
associado Evidenciando que a maioria dos que desenvolve doenccedila crocircnica o faz
muito lentamente
Existem ainda no curso natural da doenccedila flutuaccedilotildees intensas e muito
frequumlentes que dependem dos viacuterus e dos hospedeiros a saber niacuteveis da viremia
genoacutetipos 1b graus de diversidade geneacutetica dos viacuterus vias de transmissatildeo (os
inoculados via transfusatildeo apresentam lesotildees hepatocelulares mais ativas)
(GORDON et al 1993 GORDON BAYATI SILVERMAN 1998) deficiecircncias
imunes alcoolismo e co-infecccedilatildeo com HBV e delta ou o Viacuterus da imunodeficiecircncia
humana (HIV) (LOPES 2010) Nestes uacuteltimos casos a co-infecccedilatildeo com muacuteltiplos
viacuterus das hepatites estaacute associada com mais graves lesotildees histoloacutegicas do fiacutegado do
que nos casos de VHC isoladas
Importa saber se os resultados obtidos com os controles feitos se mantecircm
por longos periacuteodos Ou seja como exemplos a atividade da ALT persistentemente
normal a variabilidade do RT-PCR a detecccedilatildeo de VHC RNA pela teacutecnica Reaccedilatildeo
de polimerase em cadeia (PCR) que pode ser negativa devido agrave inadequada
23
armazenagem das amostras agrave contaminaccedilatildeo do soro com substacircncias que
interferem na leitura entre outras causas de erro
As informaccedilotildees sobre as causas que determinam o curso evolutivo da
doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos progressos havidos no campo do
diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHC Uma questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo
genotipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o
genotipo 1 (1b) cursa com lesotildees histoloacutegicas mais graves independentemente da
carga viral Ainda mais os VHC RNA negativos no soro mesmo apoacutes anos de
cura podem recair pois neles persistem os viacuterus no fiacutegado em regime de
replicaccedilatildeo muito baixa indetectaacutevel pelos meacutetodos atuais Ao contraacuterio os negativos
no soro e no fiacutegado tecircm demonstrado respostas boas e sustentadas inclusive no
sentido de se fazer prognoacutestico de cura real e verdadeira infelizmente na grande
minoria dos casos
116 Diagnoacutestico
Quanto mais cedo o diagnoacutestico maiores as chances de detectar a
doenccedila Por isso eacute importante que as pessoas faccedilam o exame especiacutefico porque soacute
esse exame eacute que detecta a HCV E as mulheres tecircm que ter uma atenccedilatildeo em
especial Tempos atraacutes o Correio Braziliense (2003) publicou uma grande mateacuteria
sobre a quantidade de mulheres que vecircm sendo infectadas com a HCV Cuja causa
estava na esterelizaccedilatildeo mal feita dos equipamentos das manicures Uma soluccedilatildeo
praacutetica eacute as mulheres terem seu proacuteprio material pra fazer as unhas e natildeo deixar
mais ningueacutem utilizar (nem matildee nem irmatilde etc) Bem e quem tiver passado por
transfusatildeo dentistas manicures operaccedilotildees etc deve fazer o exame
(KARMOCHKINE et al 1998 apud CONTE 2000 KEER et al 1997)
A HCV natildeo eacute como a Siacutendrome da Imunodeficiecircncia Adquirida (AIDS)
que possui drogas com grande tecnologia e o doente pode viver por muitos e muitos
anos Com a HCV o paciente soacute tem chance de ficar bem se a doenccedila for
diagnosticada e tratada antes dela se manifestar Atualmente o tratamento usa uma
associaccedilatildeo de duas drogas ndash o Interferon e a Ribavirina ldquoAs chances de cura em
meacutedia satildeo de 50rdquo
Barbaro et al (1999) verificaram que os pacientes VHC genoacutetipos 1b
frequumlentemente apresentavam alteraccedilotildees ultraestruturais das mitococircndrias com
24
depleccedilatildeo do mtDNA podendo comprometer o processo de fosforilizaccedilatildeo oxidativa
Sendo assim a produccedilatildeo aumentada de radicais livres nos pacientes VHC genoacutetipos
1b poderia atuar de modo negativo na evoluccedilatildeo da doenccedila hepaacutetica aumentando o
efeito citopaacuteticos do VHC Nesses pacientes haveria portanto aumento de
hiperoxidaccedilatildeo com consequumlente resistecircncia agrave accedilatildeo dos interferons e pior evoluccedilatildeo
da doenccedila hepaacutetica A ser confirmado este fato novas estrateacutegias terapecircuticas
poderatildeo vir a ser desenvolvidas no combate a essa doenccedila
Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila
poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses
autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis
vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo
hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja
quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a
concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave
hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em
parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)
Dos fatos acima expostos decorrem implicaccedilotildees tais como as respostas
CD8-CTL aos antiacutegenos VHC restritas aos complexos de histocompatibilidade
principais (MHC I) com inibiccedilatildeo ou mesmo insuficiente produccedilatildeo de complexo
peptiacutedeo VHC-MHC inibiccedilatildeo direta das ceacutelulas CTLK e a falta de resposta as
citoquininas entre outras dos vaacuterios mecanismos de escape existentes Dentro
desse contexto o niacutevel de morte celular natildeo seria alcanccedilado e a lesatildeo hepatocelular
consequumlente seria portanto miacutenima
Outra implicaccedilatildeo resultante consiste na induccedilatildeo de resposta imune
celular T Helper mediadas a partir de peptide vacinas contra o VHC Estas novas
vacinas tecircm a capacidade de gerar linfoacutecitos T citotoacutexico os CTLs contra o VHC em
camundongo imunizados com peptiacutedeos CTL e ceacutelulas HT epiacutetomes do core VHC
Esses estudos recente em animais de laboratoacuterio vecircm progredindo rapidamente
esperando-se em breve novos recursos no tratamento dessa doenccedila (AGNELLO et
al 1998)
25
12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC
O VHC constitui-se em uma famiacutelia heterogecircnea de viacuterus com no miacutenimo
seis genoacutetipos e inuacutemeros subtipos (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT
SANTOS SILVA 1999) Embora o meacutetodo de maior acuraacutecia para a determinaccedilatildeo
do genoacutetipo do VHC seja a identificaccedilatildeo completa da sequumlecircncia dos 9500
nucleotiacutedeos e a construccedilatildeo de uma aacutervore filogeneacutetica esse meacutetodo soacute pode ser
utilizado em laboratoacuterios de pesquisa (BARBOSA SILVA MARTINS 2005) e natildeo
em laboratoacuterios cliacutenicos Assim foram desenvolvidos meacutetodos para genotipagem
utilizando apenas as regiotildees mais conservadas do genoma como a proteiacutena do
envoltoacuterio (E1) a proteiacutena core e a proteiacutena natildeo estrutural NS5B A sequumlecircncia dos
nucleotiacutedeos dentro dessas regiotildees relativamente conservadas eacute genoacutetipo-
especiacutefico e os isolados podem ser genotipados independentemente da regiatildeo que
for utilizada para anaacutelise (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS
SILVA 1999) Para uso em laboratoacuterios cliacutenicos foram desenvolvidas basicamente
duas metodologias que se valem de teacutecnicas de biologia molecular (genotipagem)
ou citoloacutegicas (serotipagem)
Os meacutetodos que adotam teacutecnica de biologia molecular para genotipagem
utilizando porccedilotildees do genoma incluem a PCR aninhada (nested PCR) (BASSIT
SANTOS SILVA 1999) a teacutecnica de restriction fragment length polymorphism
(RFLP) (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS SILVA 1999) a
hibridizaccedilatildeo reversa (BASSIT SANTOS SILVA 1999) (INNO-LiPA Innogenetics
Beacutelgica Gen Eti DEIA HCV Sorin Biomedica Itaacutelia) e o sequumlenciamento direto da
regiatildeo natildeo-codificante 5 (TruGene Visible Genetics Canadaacute) Suas principais
vantagens satildeo a informaccedilatildeo direta sobre sequumlecircncia dos nucleotiacutedeos do genoma
viral a alta sensibilidade por se basearem na PCR e a possibilidade de identificar o
subtipo viral (BARBOSA SILVA MARTINS 2005)
Os meacutetodos para determinaccedilatildeo do genoacutetipo que utilizam serotipagem
baseiam-se na detecccedilatildeo de anticorpos genoacutetipos-especiacuteficos contra epiacutetopos do
VHC (por exemplo proteiacutenas da regiatildeo do core) (BLOCK SCHIANO 1999) Os
testes comercializados utilizam diferentes teacutecnicas ELISA competitivos ou
immunoblot (Murex-HC1-6 Murex Diagnostics Ltd Reino Unido RIBA HCV
Serotyping Assay Chiron Diagnostics Estados Unidos) As principais vantagens da
teacutecnica de serotipagem satildeo o baixo custo e maior facilidade de realizaccedilatildeo em
26
comparaccedilatildeo com os testes de biologia molecular (BLOCK SCHIANO 1999 De
LARANAGA et al 2000)
A determinaccedilatildeo do genoacutetipo anteriormente utilizada em pesquisas mas
sem maior utilidade na praacutetica meacutedica atualmente eacute recomendada para uso cliacutenico
Como jaacute mencionado os pacientes infectados pelo genoacutetipo 1 do VHC devem ser
tratados por 12 meses enquanto os demais por 6 meses (BASSIT SANTOS SILVA
1999)
A determinaccedilatildeo do genoacutetipo do VHC pode ser feita por PCR ou
serotipagem A primeira teacutecnica eacute mais sensiacutevel e possibilita a identificaccedilatildeo de
subtipos do VHC Contudo a segunda eacute de mais faacutecil realizaccedilatildeo e mais barata
razatildeo pela que eacute importante que a teacutecnica seja aprimorada
Oliveira et al (1999) investigaram os padrotildees de distribuiccedilatildeo dos
genoacutetipos do VHC estudando 250 pacientes anti-VHC positivos atraveacutes da
detecccedilatildeo VHC RNA pelo RT-PCR e encontraram prevalecircncia de 72 para o VHC 1
253 para o tipo 3 2 para o 2 e 07 para o 4 semelhantes aos das vaacuterias
regiotildees mundiais
13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC
As manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo pelo VHC satildeo as mais
variadas possiacuteveis A diversidade de resposta do hospedeiro ao agente infeccioso
variando desde quadros assintomaacuteticos ateacute aqueles com evoluccedilatildeo grave fatal ou
incapacitante tem estimulado a busca por justificativas de tais discrepacircncias
cliacutenicas sobretudo na imunomodulaccedilatildeo Dentre as infecccedilotildees mais bem estudadas
destacam-se aquelas pelos Viacuterus da hepatite C Viacuterus da imunodeficiecircncia humana1
(HIV-1) pelo Herpes viacuterus humano 4 (viacuterus do Epstein Baar) e pelo Mycobacterium
leprae (ABBAS LICHTMAN 2005)
A agressatildeo hepaacutetica por auto-imunidade eacute um fenocircmeno reconhecido em
vaacuterias doenccedilas do fiacutegado inclusive nas de etiologia viral Aleacutem do agente agressor e
de sua interaccedilatildeo com o sistema imunoloacutegico do hospedeiro fatores ambientais ou
hormonais estatildeo aparentemente envolvidos no surgimento de auto-imunidade
hepaacutetica como se supotildee acontecer na hepatite auto-imune em indiviacuteduos
geneticamente suscetiacuteveis (CODES et al 2002)
27
A lesatildeo hepatocelular relacionada agrave infecccedilatildeo pelos viacuterus hepatotroacutepicos e
pelos herpes viacuterus (citomegaloviacuterus e Epstein-Barr) eacute secundaacuteria a uma resposta
auto-imune do hospedeiro Estes viacuterus natildeo parecem ser diretamente citopaacuteticos
mas desencadeiam lesatildeo hepaacutetica atraveacutes da resposta imune do hospedeiro contra
ceacutelulas hepaacuteticas infectadas (MALOY POWRIE 2001)
Existem estudos que focalizam alteraccedilotildees imunoloacutegicas em hepatites
virais entretanto a maioria deles mostra resultados pontuais sem seguimento na
fase aguda da doenccedila (BLOCK SCHIANO 1999 McFARLONE et al 1990) Aleacutem
disso ainda natildeo se estabeleceu uma associaccedilatildeo entre as reaccedilotildees auto-imunes
transitoacuterias induzidas por viroses hepatotroacutepicas e agravamento do dano tecidual na
hepatite viral
A infecccedilatildeo crocircnica estaacute fortemente associada agrave crioglobulinemia mista
essencial glomerulonefrite membrano-proliferativa e porfiria cutacircnea tardia De
forma menos impressiva encontra-se tambeacutem associada agrave uacutelcera corneana de
Mooren liacutequen plano e fibrose pulmonar (KILLENBERG 2000 WENER et al 1996)
A ocorrecircncia de anticorpos antitireoidianos e hipotireoidismo tem sido relatada em
associaccedilatildeo com a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC em mulheres (KILLENBERG 2000
CACOUB et al 1999)
A associaccedilatildeo entre a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC a presenccedila do fator
reumatoacuteide e do anticorpo antinuclear (FAN) o fenocircmeno de Raynaud e doenccedilas
difusas do tecido conjuntivo (DDTC) como artrite reumatoacuteide luacutepus eritematoso
sistecircmico siacutendrome de Sjoumlgren e vasculites sistecircmicas eacute relatada em alguns
trabalhos (CACOUB et al 1999 LOVY STARKEBAUM UBEROI 1996 STAUB
1998 WENER et al 1996)
14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE
A associaccedilatildeo entre doenccedilas infecciosas e autoimunidade apresentando-
se com manifestaccedilotildees cliacutenicas ou detectadas apenas pelo desenvolvimento de auto-
anticorpos tem sido amplamente documentado Infecccedilotildees virais bacterianas e
parasitaacuterias podem estar envolvidas no desenvolvimento recidivas e ateacute mesmo na
prevenccedilatildeo de doenccedilas auto-imunes (KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)
Ribeiro e Proietti (2004) avaliaram a frequumlecircncia de FR anticorpos
antipeptiacutedeo citrulinado ciacuteclico (anti-CCP) AAN anticorpos anti-citoplasma de
28
neutroacutefilos (ANCA) anticorpos anticardiolipina (aCL) e anticorpos anti-β2
glicoproteiacutena I (anti-β2GPI) em pacientes com hanseniacutease Existe estudo
demonstrando pacientes que apresentavam manifestaccedilotildees articulares comparados
aos que natildeo apresentavam envolvimento articular e um grupo controle de indiviacuteduos
saudaacuteveis com idade e gecircnero semelhantes aos dos pacientes estudados e que
residiam na mesma aacuterea geograacutefica A maioria dos pacientes nos dois grupos (com
e sem envolvimento articular) apresentava hanseniacutease generalizada Entretanto
observaram uma baixa frequumlecircncia que natildeo foi significativamente diferente de FR
anti-CCP AAN e ANCA em pacientes com hanseniacutease (nos dois grupos) e normal
dos controles Mas a prevalecircncia de anticorpos aCL e anti-β2GPI estava
significativamente elevada nos pacientes com hanseniacutease quando comparados com
o grupo controle apesar de natildeo haver associaccedilatildeo significativa com o envolvimento
articular O isoacutetopo predominante dos dois autoanticorpos foi a IgM (487) dos
pacientes com hanseniacutease apresentava pelo menos um anticorpo antifosfoliacutepide
Aleacutem disso os autores observaram uma associaccedilatildeo entre a positividade para aCL e
as manifestaccedilotildees cliacutenicas jaacute que os pacientes com anticorpos aCL apresentavam
doenccedila Hanseniacutease generalizada (VV) com mais frequumlecircncia (p= 0002) Natildeo houve
associaccedilatildeo entre a presenccedila de anticorpos aCL ou anti-β2GPI e episoacutedios
reacionais poreacutem entre os pacientes com esses episoacutedios aqueles com anticorpos
aCL apresentavam eritema nodoso hansecircnico (ENH) em 100 dos casos enquanto
entre os pacientes negativos para aCL 57 apresentavam ENH Apesar de uma
alta taxa de concordacircncia para a presenccedila de anticorpos aCL e anti-β2GPI ter sido
observada manifestaccedilotildees tromboemboacutelicas natildeo foram observadas (RIBEIRO
PROIETTI 2004 2005)
Horimoto e Costa (2009) avaliaram pacientes com Leishmania
(leishmaniose visceral e leishmaniose cutacircnea) para a presenccedila de anticorpos anti-
Leishmania assim como FR AAN anti-DNA anti-Sm anti-RNP anti-Ro anti-La
aCL e complemento (C3 e C4) Como esperado os pacientes com leishmaniose
visceral apresentava anticorpos anti-Leishmania Tiacutetulos significativamente elevados
de AANs na maioria dos pacientes o anti-DNA foi detectado em poucos pacientes
com doenccedila visceral assim como tiacutetulos elevados de anticorpos aCL (isotipo IgG)
quando comparados com os pacientes com leishmaniose cutacircnea Niacuteveis reduzidos
de complemento tambeacutem satildeo evidentes na doenccedila visceral assim como niacuteveis
significativamente reduzidos de C3 Outros estudos comparam e discutem os
29
resultados em relaccedilatildeo agrave crescente evidecircncia na literatura da presenccedila de
autoanticorpos em ambas as doenccedilas Em geral a prevalecircncia variaacutevel de auto-
anticorpos relatada assim como relatos preacutevios na literatura podem estar
relacionados a diferenccedilas metodoloacutegicas como o tipo de ensaio utilizado a
definiccedilatildeo dos pontos de corte inativaccedilatildeo dos soros pelo calor seleccedilatildeo de pacientes
e variaccedilotildees eacutetnicas e geograacuteficas nos grupos de pacientes Mas um dos resultados
consistentes foi a frequumlecircncia significativamente mais elevada de anticorpos
antifosfoliacutepide aCL e anti-β2GPI em pacientes com hanseniacutease enquanto
anticorpos AAN e aCL foram detectados com mais frequumlecircncia nos pacientes com
leishmaniose visceral A incidecircncia aumentada de anticorpos AAN e aCL nos
pacientes com leishmaniose visceral eacute compatiacutevel com outros estudos (OSSADRON
et al 2006 SAKKAS et al 2008 VOULGARI et al 2004) e demonstra
semelhanccedilas das manifestaccedilotildees cliacutenicas e laboratoriais entre a leishmaniose
visceral e o luacutepus eritematoso sistecircmico (LES) Aleacutem disso a reatividade cruzada
entre AAN e anticorpos anti-Leishmania jaacute foi tambeacutem relatada (GRANEL et al
2000)
Diversos grupos documentaram niacuteveis elevados de anticorpos
antifosfoliacutepide (aCL anti-β2GPI e anti-protrombina) em diversas doenccedilas
infecciosas como a siacutefilis doenccedilas virais (incluindo a hepatite C Parvoviacuterus B19 e
HIV) malaacuteria e hanseniacutease sem as manifestaccedilotildees cliacutenicas da siacutendrome
antifosfoliacutepide (SAF) (ZANDMAN-GODDARD BLANK SHOENFELD 2002) Os
tiacutetulos elevados geralmente satildeo transitoacuterios diminuindo e desaparecendo apoacutes a
resoluccedilatildeo da infecccedilatildeo (LOIZOU et al 2003 ZANDMAN-GODDARD BLANK
SHOENFELD 2002) Mas em uma minoria dos pacientes a associaccedilatildeo entre
doenccedilas infecciosas e anticorpos antifosfoliacutepide pode levar a complicaccedilotildees severas
frequumlentemente fatais ou seja SAF catastroacutefica (ZANDMAN-GODDARD BLANK
SHOENFELD 2002)
Os resultados de Ribeiro e Proietti (2005) mostrando um aumento da
incidecircncia de anticorpos anti-β2-GPI em pacientes com hanseniacutease associados aos
dados de outros grupos (De LARANAGA et al 2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK
et al 1994 LOIZOU et al 2003) que tambeacutem documentaram niacuteveis elevados de
anticorpos anti-2βGPI lanccedilam duacutevidas sobre a noccedilatildeo de que os anticorpos aCL
associados a infecccedilotildees satildeo independentes dos anticorpos anti-β2GPI e natildeo
dependentes desses anticorpos como nas doenccedilas auto-imunes Em conjunto
30
esses resultados apoacuteiam a noccedilatildeo de que na presenccedila de infecccedilotildees anticorpos aCL
satildeo heterogecircneos em relaccedilatildeo agrave sua dependecircncia da 2GPI (De LARANAGA et al
2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK et al 1994 LOIZOU et al 2003) e as infecccedilotildees
podem desencadear a induccedilatildeo de anticorpos antifosfoliacutepide patogecircnicos em
indiviacuteduos predispostos (LOIZOU et al 2003)
A produccedilatildeo de autoanticorpos na hanseniacutease e leishmaniose pode ser
explicada por diversos mecanismos Na forma mais generalizada dessas doenccedilas
(hanseniacutease VV e leishmaniose visceral) os pacientes apresentam
hipergamaglobulinemia difusa semelhante agrave vista em outras infecccedilotildees como
Schistosoma mansoni T cruzi e Plasmodium A induccedilatildeo de autoanticorpos pode ser
atribuiacuteda agrave ativaccedilatildeo policlonal e proliferaccedilatildeo das ceacutelulas B algumas com auto-
reatividade pertencentes agrave biblioteca de anticorpos naturais em indiviacuteduos normais
(ARGOV et al 1989) Na leishmaniose antiacutegenos soluacuteveis derivados da L major e
L donovani satildeo mitogecircnicos e desencadeiam a produccedilatildeo de imunoglobulinas com
auto-reatividade (ARGOV et al 1989) Crioglobulinemia mista induzida pelo HCV eacute
outro exemplo de ativaccedilatildeo policlonal persistente levando a uma mistura de
autoanticorpos policlonais e monoclonais os quais causam doenccedilas auto-imunes
(AGMON-LEVIN et al 2009)
Mimetismo molecular ou homologias estruturais entre infecccedilotildees e
componentes do hospedeiro podem ser agrave base da produccedilatildeo de autoanticorpos
como no caso da febre reumaacutetica onde o componente M da membrana do
estreptococo apresenta homologia com peptiacutedeos cardiacuteacos cerebrais e sinoviais A
associaccedilatildeo da siacutendrome de Guillain-Barreacute com a infecccedilatildeo pelo Campylobacter
jejeuni representa outro exemplo de mimetismo molecular como base de uma
manifestaccedilatildeo auto-imune A reatividade cruzada entre agentes infecciosos e auto-
antiacutegenos jaacute foi demonstrada para o M leprae (McADAM MUDD SHOENFELD
1984) e M tuberculosis (SHOENFELD et al 1986) e a inibiccedilatildeo de anticorpos anti-
Sm anti-RNP e anti-SSB por promastigotas intactas de Leishmania apoacuteia a
homologia entre antiacutegenos nucleares e a Leishmania (ARGOV et al 1989)
A disseminaccedilatildeo de epiacutetopos a emergecircncia de novos anticorpos ou a
resposta de ceacutelulas T a um novo epiacutetopo (subdominante ou criacuteptico) no mesmo
antiacutegeno ou em outro antiacutegeno foi demonstrada em modelos experimentais e na
doenccedila humana alguns autores demonstraram a disseminaccedilatildeo molecular do
antiacutegeno Sm para reatividade anti-RNP (STAUB 1998) no LES enquanto na febre
31
reumaacutetica o estado de autoimunidade crocircnica que afeta as vaacutelvulas cardiacuteacas pode
resultar em uma resposta imunoloacutegica contra o colaacutegeno e laminina (KIVITY et al
2009 PORDEUS et al 2008) As infecccedilotildees tambeacutem podem desempenhar um papel
importante na induccedilatildeo da autoimunidade atraveacutes da liberaccedilatildeo de antiacutegenos
sequumlestrados apoacutes lesatildeo tecidual ou aumentando a exibiccedilatildeo de epiacutetopos criacutepticos
no meio inflamatoacuterio apresentando assim novos antiacutegenos ao sistema imunoloacutegico
(KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)
15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES
AGUDAS VIRAIS
O conceito de auto-imunidade induzida por viacuterus natildeo eacute exclusivo para
doenccedilas hepaacuteticas O viacuterus Coxsackie do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um
terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite infecciosa e estaacute implicado nas miocardites
auto-imunes reagindo contra a miosina cardiacuteaca (GIST BELL 1974) Niwa et al
(1984) encontraram elevaccedilatildeo transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator
reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas
virais comuns como varicela sarampo influenza caxumba herpes zoster e
exantema suacutebito
A patogecircnia da infecccedilatildeo viral inclui pelo menos trecircs tipos de interaccedilotildees
com o hospedeiro vertebrado 1) o efeito do agente sobre as ceacutelulas 2) a maneira
de disseminaccedilatildeo do agente no organismo infectado 3) a resposta imunoloacutegica e a
sua influencia no processo infeccioso Destacam-se dois tipos principais da
interaccedilatildeo a destruiccedilatildeo celular e a resposta imunoloacutegica (FIGUEIREDO 1999
CATALAN-SOARES PROIETTI CARNEIRO-PROIETTI 2006) O viacuterus Coxsackie
do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite
infecciosa e estaacute implicado nas miocardites auto-imunes reagindo contra a miosina
cardiacuteaca (GERSHON KONDO 1971) Niwa et al (1984) encontraram elevaccedilatildeo
transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo
anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas virais comuns como varicela sarampo
influenza caxumba herpes zoster e exantema suacutebito
32
16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN
De acordo com o II Consenso Brasileiro de FAN em HEp 2
(DELLAVANCE et al 2003) os AAN satildeo encontrados comumente em uma
variedade de doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Satildeo uacuteteis na investigaccedilatildeo dessas
doenccedilas auxiliando no diagnoacutestico de patologias como LES esclerose sistecircmica
progressiva (ESP) doenccedila mista do tecido conjuntivo (DMTC) siacutendrome de Sjoumlgren
(SS) polimiosite e dermatomiosite
Eles podem estar presentes em um pequeno percentual da populaccedilatildeo
aparentemente sadia essa frequumlecircncia eacute maior em mulheres e aumenta com a idade
Segundo a literatura a positividade entre 20 a 60 anos varia entre percentuais mais
altos (133) para tiacutetulos baixos e mais baixos (33) para tiacutetulos mais elevados
(DELLAVANCE et al 2003)
A pesquisa dos anticorpos antinucleares pode ser realizada por diferentes
teacutecnicas a imunofluorescecircncia indireta eacute a mais utilizada por sua sensibilidade
reprodutibilidade e facilidade de execuccedilatildeo A sensibilidade aumenta
significativamente quando se utiliza como substrato lacircminas com ceacutelulas Hep 2
(ceacutelulas de carcinoma de laringe humana) por causa da maior expressatildeo de
antiacutegenos na superfiacutecie dessas ceacutelulas comparados aos expressos nas ceacutelulas de
fiacutegado ou de rins de camundongos que se utilizavam anteriormente
Em geral eacute possiacutevel detectar melhor a presenccedila de AAN por associaccedilatildeo
de trecircs anti-soros isotipos especiacuteficos (anti-IgG anti-IgA e anti-IgM) A pesquisa
realizada por essa teacutecnica serve de triagem inicial para a presenccedila de AAN Eacute
normalmente denominada pesquisa de FAN ou AAN
A realizaccedilatildeo de outras metodologias tais como as imunoenzimaacuteticas
permite uma avaliaccedilatildeo isolada dos diferentes auto-anticorpos sugeridos pelos
padrotildees de fluorescecircncia encontrados no FAN A identificaccedilatildeo desses AAN permite
um diagnoacutestico mais preciso e eles podem ser utilizados em muitos casos como
marcador para uma das diferentes doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Muitas dessas
patologias apresentam um perfil distinto de auto-anticorpos que auxilia o diagnoacutestico
A presenccedila de FAN positivo em pessoas aparentemente sadias pode ser
devida a algumas situaccedilotildees
minus Doenccedila auto-imune precoce ainda natildeo expressa clinicamente
33
minus distuacuterbio imunoloacutegico transitoacuterio causado por doenccedila natildeo-imune
tais como infecccedilotildees principalmente virais
minus uso de medicamentos e neoplasias
minus manifestaccedilatildeo incompleta de uma siacutendrome ou seja o paciente
sintetiza o anticorpo poreacutem esse quadro natildeo evolui para doenccedila
minus fenocircmeno auto-imune fisioloacutegico
O resultado do FAN eacute expresso em tiacutetulo e padratildeo uma vez que ambos
os paracircmetros tecircm importacircncia para a avaliaccedilatildeo do significado cliacutenico do exame O
tiacutetulo do FAN corresponde agrave maior diluiccedilatildeo capaz de demonstrar fluorescecircncia
inequiacutevoca e didaticamente pode ser dividido em
minus Baixo menor 180
minus Moderado 1160
minus Moderadamente elevado 1320
minus Alto maior 1640
Nas pesquisas realizadas por imunofluorescecircncia indireta os resultados
satildeo expressos em tiacutetulos segundo as diluiccedilotildees empregadas Eacute possiacutevel trabalhar
utilizando-se como limite tiacutetulos de 140 que permitem maior sensibilidade ou de
180 que permitem maior especificidade ou seja um menor nuacutemero de falso-
positivos
Na praacutetica cliacutenica satildeo considerados significativos tiacutetulos superiores a
1160 Os resultados com tiacutetulos positivos satildeo acompanhados pela descriccedilatildeo do
padratildeo de fluorescecircncia encontrado que serve como orientaccedilatildeo da presenccedila de um
antiacutegeno especiacutefico e em alguns casos como padratildeo diagnoacutestico Em determinadas
situaccedilotildees em especial no LES em atividade pode ocorrer agrave observaccedilatildeo de mais de
um padratildeo de fluorescecircncia
O padratildeo do FAN a seu turno aponta uma probabilidade maior ou menor
de doenccedila auto-imune e ateacute mesmo sugere o antiacutegeno nuclear envolvido e por
consequumlecircncia a afecccedilatildeo com ele mais relacionada Os padrotildees homogecircneo
centromeacuterico e pontilhado grosso satildeo os mais indicativos de processos de
autoimunidade uma vez que se associam a diversas condiccedilotildees reumaacuteticas
especialmente ao LES e agrave esclerose sistecircmica e tambeacutem a enfermidades hepaacuteticas
tais como a cirrose biliar primaacuteria e a hepatite auto-imune (KILLENBERG 2000)
34
Jaacute o pontilhado fino o pontilhado grosso reticulado e a membrana nuclear
tecircm maior significado quando encontrados em tiacutetulos altos uma vez que podem
estar presentes em tiacutetulos baixos em indiviacuteduos hiacutegidos Por sua vez o pontilhado
fino denso mesmo quando elevado em pessoas assintomaacuteticas soacute guarda relaccedilatildeo
com alguma doenccedila em cerca de 20 dos casos (DELLAVANCE et al 2003)
O padratildeo pontilhado pode tambeacutem ser referido como padratildeo salpicado
Outros padrotildees de fluorescecircncia podem ser encontrados em menor frequumlecircncia Os
pontilhados citoplasmaacutetico grossos ou reticulares associados agrave presenccedila de
anticorpos antimitococircndrias em pacientes com cirrose biliar primaacuteria o
citoplasmaacutetico homogecircneo relacionado a proteiacutenas ribossocircmicas em pacientes com
LES e o padratildeo pontilhado fino citoplasmaacutetico que pode estar associado agrave
presenccedila de anticorpos anti-JO-1 anti-PCNA e proteiacutenas da membrana celular em
pacientes com LES outras patologias do tecido conjuntivo e hepatopatias auto-
imunes (DELLAVANCE et al 2003)
Quadro 1 - Padrotildees de fluorescecircncia encontrados em maior frequumlecircncia e patologias relacionadas
Padrotildees de Fluorececircncia Antiacutegenos Patologias Relacionadas
Perifeacuterico DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES
Homogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA
LES AR lupus induzido por drogas
Perifeacutericohomogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES
Pontilhado grosso SM RNP LES DMTC
Pontilhado fino nuclear SS-A (RO) SS-B (La) SS LES
Nucleolar Proteiacutenas Nucleolares ESP Centromeacuterico Proteiacutenas de centrocircmeros Siacutendrome de CREST
Fonte Dellavance et al 2003 Quadro 2 - Anti-ena - auto-anticorpos contra antiacutegenos extraiacutedos do nuacutecleo e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleares Patologias Relacionadas SM LES RNP DMTC LES ESP AR e Polimiosite
SS-A (Ro) SS LES lupus neonatal e forma cutacircnea subaguda
SS-B (La) SS LES luacutepus neonatal e forma cutacircnea subaguda
Scl 70 ESP Jo -1 Polimiosite e dermatomiosite Fonte Dellavance et al 2003
35
Quadro 3 ndash Padrotildees de FAN nuclear e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes
Padrotildees Nucleares Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos
Nuclear Pontilhado Centromeacuterico Anticorpo anti-centrocircmero Esclerose Sistecircmica forma CREST Cirrose Biliar Primaacuteria
Nuclear homogecircneo Anticorpo anti-DNA nativo Lupus Eritematoso Sistecircmico (LES) Anticorpo anti-Histoma LES induzido por drogas LES idiopaacutetico Anticorpo anti-cromatina (DNAHistona Nucleossomo) Artrite Reumatoacuteide (AR) Artrite Idiopaacutetica Juvenil importante associaccedilatildeo com uveiacutete na forma oligoarticular Siacutendrome de Felty Cirrose Billar Primaacuteria
Nuclear tipo membrana nuclear contiacutenua Anticorpo anti-Iamin e contra envelope nuclear - Iamins Hepatites auto-imunes Raramente associado a doenccedilas reumaacuteticas (algumas formas de LES e esclerodermia linear)
Nuclear pontilhado pleomoacuterficoPCNA Anticorpo contra nuacutecleo de ceacutelulas em proliferaccedilatildeo LES
Nuclear pontilhado fino denso Anticorpo anti-proteina p 75 kDa pode ser encontrado em indiviacuteduos saudaacuteveis processos inflamatoacuterios inespeciacuteficos doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Cistite Intersticial Dermatite Atoacutepica Psoriacutease e Asma
Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos
Anticorpo anti-p80 coilina natildeo apresenta associaccedilatildeo cliacutenica definida
Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos
Anticorpo anti-Sp100 (anti-p95) Cirrose Biliar Primaacuteria pode ocorrer em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas
Nuclear pontilhado grosso Anticorpo anti-Sm LES Anticorpo anti-RNP criteacuterio obrigatoacuterio no diagnostico da doenccedila mista do Tecido conjuntivo (DMTC) tambeacutem ocorre no LES Esclerose Sistecircmica (ES) e AR
Nuclear pontilhado fino Anticorpo anti SSARo Siacutendrome de Sjogren Primaacuteria (SS) LES Lupus neonatal e Lupus Cutacircneo Subagudo Anticorpo anti-SSBLa Lupus neonatal LES SS Anticorpo anti-Mi-2 Dermatomiosite embora raramente ocorra na polimiosite do adulto
Fonte Dellavance et al 2003
36
Quadro 4 - Padrotildees de FAN citoplasmaacuteticos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes
Padrotildees Citoplasmaacuteticos e Relacionados ao Aparelho Mitoacutetico Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos
Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina Hepatite auto-imune Cirrose Anticorpo anti-miosine Hepatite C Hepatocarcionoma Miastenia Gravis Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida
Citoplasmaacutetico Fibrilar Segmentar Anti actinina anti--vinculina e anti-tropomiose Miastenia Gravis Doenccedila de Crohn e Colite ulcerativa Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia cliacutenica definida
Citoplasmaacutetico Pontilhado Polar Anticorpo Anti-golginas (cisternas do aparelho de Golgi) raro no LES SS e outras doenccedilas auto-imunes sistecircmicas Relato na Ataxia Cerebelar Idiopaacutetica Degeneraccedilatildeo Cerebelar Paraneoplaacutesica infecccedilotildees virais pelo Epstein Barr (EBV) e pelo viacuterus da imunodeficiecircncia Humana (HIV) Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida
Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Anticorpo anti-Histidill t RNA sintetase (Jo-1) anticorpo marcador de Polimiosite no adulto Descrito raramente na Dermatomiosite
Citoplasmaacutetico Pontilhado com Pontos Isolados
Anticorpo anti-EEA1 e anti-fosfatidilserina natildeo haacute associaccedilotildees clinicas bem definida Anticorpo anti-GWBSS tambeacutem encontrado em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas
Citoplasmaacutetico Pontilhado Reticulado Anticorpo anti-mitococircndria Cirrose Biliar Primaacuteria Esclerose Sistecircmica Eacute relativamente comum o encontro deste padratildeo na ausecircncia de anticorpos anti-mitococircndria
Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Denso Anti PL7PL12 Raramente associado a Polimiosite Anticorpo P-ribossomal Este padratildeo ocorre no LES se a associaccedilatildeo eacute com anti-proteina P ribossomal
Citoplasmaacutetico Fibrilar Filamentar Anticorpo anti-vimentina e anti-queratina Anti-queratina eacute o anticorpo mais importante em doenccedila hepaacutetica alcooacutelica Descritos em vaacuterias doenccedilas inflamatoacuterias e infecciosas Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida
Aparelho mitoacutetico Tipo Centriacuteolo Anticorpo anti-enolase em baixos tiacutetulos natildeo tem associaccedilatildeo cliacutenica definida Em altos tiacutetulos eacute sugestivo de Esclerose Sistecircmica
Aparelho mitoacutetico Tipo ponte Intercelular
Anticorpo anti Tubulina Pode ser encontrado no LES e na DMTC outros anticorpos ainda natildeo bem definidos podem gerar o mesmo padratildeo
Aparelho mitoacutetico Tipo NuMa2 Anticorpo anti-HsEg5 diversas condiccedilotildees auto-imunes com baixa especificidade
Fonte Dellavance et al 2003
37
Quadro 5 - Padrotildees de FAN mistos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Mistos Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos
Misto do tipo nucleolar homogecircneo e nuclear pontilhado grosso com placa metafaacutesica decorada em anel (cromossomos negativos)
Anticorpo anti-Ku Superposiccedilatildeo Polimiose e Esclerose Sistecircmica Podem ocorrer no LES e Esclerodermia
Misto do tipo nuclear e nucleolar pontilhado com placa metafaacutesica positiva
Anticorpo anti-topoisomerase (Scl-70) ES forma difusa Mais raramente pode ocorrer na Siacutendrome CREST e superposiccedilatildeo PolimiositeEsclerodermia
Misto do tipo Citoplasmaacutetico pontilhado fino denso e homogecircneo e nucleolar homogecircneo
Anticorpo anti rRNP LES frequumlentemente relacionado agrave Psicose Luacutepica
Misto do tipo nuclear pontilhado fino com fluorescecircncia do aparelho mitoacutetico
Anticorpo anti-NuMA1SS pode ocorrer tambeacutem em outras condiccedilotildees auto-imunes ou inflamatoacuterias crocircnicas
Fonte Dellavance et al 2003
Quadro 6 - Padrotildees de FAN nucleolares e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleolares Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos
Nucleolar Aglomerado
Anticorpo anti-Fibrilarina (U3-nRNP) Esclerose Sistecircmica (ES) especialmente com comprometimento visceral grave entre eles a hipertensatildeo pulmonar
Nucleolar Pontilhado
Anticorpo anti-NOR-90 ES tambeacutem descrito em outras doenccedilas do tecido conjuntivo poreacutem sem relevacircncia clinica definida Anticorpos anti-RNA polimerase I ES de forma difusa com tendecircncia para comprometimento visceral mais frequumlente e grave
Nucleolar Homogecircneo
Anticorpo anti-PMScl Siacutendrome de Superposiccedilatildeo de Polimiosite com Esclerose Sistecircmica Raramente encontrado em casos de Polimiosite ou Esclerose Sistecircmica sem superposiccedilatildeo cliacutenica Outros auto-anticorpos mais raros podem apresentar esse padratildeo
Fonte Dellavance et al 2003
De acordo com o 3deg Consenso (DELLAVANCE et al 2009) foram
comunicados dois novos padrotildees de fluorescecircncia por participantes Vaacuterios outros
membros testemunharam jaacute haver observado esses padrotildees O primeiro trata-se de
um padratildeo nuclear pontilhado fino aproximando-se da textura homogecircnea e com
placa metafaacutesica corada da mesma forma Sua associaccedilatildeo cliacutenica e identidade
imunoloacutegica natildeo estatildeo definidas Sua importacircncia deriva do fato de que pode ser
facilmente confundido com o padratildeo pontilhado fino denso e com o padratildeo
homogecircneo O segundo trata-se de um padratildeo citoplasmaacutetico em forma de
pequenos bastotildees (rods) e ciacuterculos (rings) que aparentemente estaacute associado agrave
38
infecccedilatildeo pelo HCV Haacute estudos em curso por alguns grupos de pesquisa com a
finalidade de estabelecer sua identidade imunoloacutegica
Como ainda natildeo estatildeo definitivamente caracterizados esses dois novos
padrotildees foram considerados preliminares e o 3deg Consenso recomendou que os
mesmos fossem completamente caracterizados e apresentados na proacutexima versatildeo
do Consenso (DELLAVANCE et al 2009)
39
2 JUSTIFICATIVA
As inflamaccedilotildees do fiacutegado provocadas pelos viacuterus hepatotroacutepicos atingem
milhotildees de pessoas e representam significativos problemas de sauacutede puacuteblica em
todo o mundo No Brasil a Regiatildeo Norte responde por um significativo percentual
dos portadores de hepatite C Dentre as manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo
pelo viacuterus C as doenccedilas autoimunes tecircm significativo impacto na evoluccedilatildeo cliacutenica
desses pacientes A presenccedila de anticorpo antinuacutecleo eacute um marcador importante de
autoimunidade e apesar de existirem trabalhos relatando a pesquisa desse fator em
portadores de viacuterus C tais estudos ainda natildeo foram realizados na nossa regiatildeo
sobretudo correlacionando-se com o genoacutetipo do viacuterus responsaacutevel pela infecccedilatildeo
considerando que o genoacutetipo eacute um marcador de resposta ao tratamento ou
considerando que pacientes portadores do genoacutetipo 1 natildeo respondem
satisfatoriamente ao tratamento instituiacutedo pelo protocolo atual
21 ASPECTOS EacuteTICOS
A pesquisa a ser realizada apresenta relevacircncia social e natildeo perde o
sentido de sua destinaccedilatildeo soacutecio-humanitaacuteria (justiccedila e equidade)
Este trabalho adequa-se aos princiacutepios cientiacuteficos que o justificam e
apresenta possibilidade concreta de responder a incertezas tais como FAN e o
genoacutetipo viral em pacientes com infecccedilatildeo pelo viacuterus da hepatite C ldquoestatildeo
relacionadosrdquo
Segue rigorosamente os procedimentos descritos na Resoluccedilatildeo 19696-
CNSMS (BRASIL 1996) assegurando a confidenciabilidade e proteccedilatildeo da
identidade do sujeito da pesquisa no momento da afericcedilatildeo dos dados e sua
posterior utilizaccedilatildeo
Por tratar-se de um estudo que faraacute somente revisatildeo de soroteca os
participantes natildeo seratildeo submetidos a riscos de origem orgacircnica eou quiacutemica
40
3 OBJETIVOS
31 OBJETIVO GERAL
Estabelecer associaccedilatildeo entre a presenccedila de teste de FAN e o genoacutetipo
viral em pacientes portadores de infecccedilatildeo pelo HCV
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
I Identificar o padratildeo de fluorescecircncia do FAN em pacientes com diagnoacutestico
laboratorial de infecccedilatildeo pelo HCV
II Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados
pelo HCV de acordo com o gecircnero e a idade
III Identificar a prevalecircncia de FAN em pacientes infectados pelo HCV e natildeo
infectados
IV Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados
pelo HCV de acordo com as alteraccedilotildees bioquiacutemicas
41
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO)
Foi realizado um estudo transversal analiacutetico no Serviccedilo do Nuacutecleo de
Medicina Tropical da Universidade Federal do Paraacute (NMTUFPA) utilizando-se
pacientes oriundos da Fundaccedilatildeo Centro de Hemoterapia e Hematologia do Paraacute
(HEMOPA) e Plano de Assistecircncia ao Servidor (PASIASEP) com coleta de material
bioloacutegico para reconfirmaccedilatildeo do diagnoacutestico de hepatite C no periacuteodo de janeiro de
2009 a maio de 2010
411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C
A populaccedilatildeo de estudo consistiu de 51 pacientes admitidos no NMTUFPA
para reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica tratamento cliacutenico e acompanhamento ambulatorial
de ambos os gecircneros e independente da idade sem exclusatildeo dos pacientes com a
presenccedila de patologias associadas agrave condiccedilatildeo maior (motivadora da pesquisa)
oriundos da Fundaccedilatildeo HEMOPA e PAS
A amostra do grupo foi selecionada a partir da relaccedilatildeo dos prontuaacuterios
catalogados no laboratoacuterio de patologia do NMTUFPA
Os dados foram coletados atraveacutes dos resultados dos exames realizados
no soro de cada paciente O protocolo de coleta teve enfoque na identificaccedilatildeo
individual do paciente bem como a avaliaccedilatildeo cliacutenica dos resultados
412 Grupo de natildeo infectados
Foi utilizado um grupo controle de 100 amostras de soro de indiviacuteduos
doadores de sangue com sorologias negativas para HIV 1 e 2 HTLV 1 e 2 Siacutefilis
Doenccedilas de Chagas Hepatite B e para Hepatite C procedentes da fundaccedilatildeo
HEMOPA
42
42 MEacuteTODO
421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico
Foram colhidos em frasco sem anticoagulante 10ml de sangue perifeacuterico
dos 51 pacientes participantes da pesquisa A amostra sanguiacutenea de cada paciente
foi centrifugada o soro foi separado e colocado em frasco esteacuteril devidamente
identificado armazenado e resfriado de 2 a 8ordmC
Foi realizada no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais a
pesquisa soroloacutegica de anticorpos IgG anti-HCV por teste imunoenzimaacutetico (ELISA)
e os pacientes que apresentaram positividade tiveram seus resultados confirmados
atraveacutes de teacutecnicas moleculares (RT-PCR) e com identificaccedilatildeo do genoacutetipo viral
(genotipagem)
Foi realizado no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa a pesquisa
de FAN dos 51 pacientes selecionados utilizando as amostras existentes na
soroteca
422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C
Foram empregados testes soroloacutegicos de ELISA (Ensaio
Imunoenzimaacutetico) de 3ordf geraccedilatildeo utilizando-se de kits comerciais (kit ETI-AB-HCVK-
4 DiaSorin Itaacutelia) para detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos anti-HCV no soro dos
pacientes
As tiras (poccedilos) necessaacuterias para as reaccedilotildees foram retiradas da geladeira
com antecedecircncia de uma hora e deixadas agrave temperatura ambiente e os reagentes
homogeneizados rapidamente no voacutertex
O primeiro poccedilo da placa ficou o branco da reaccedilatildeo na sequecircncia da
microplaca de ELISA foi dispensado 200 microL do controle negativo em triplicata (trecircs
poccedilos) 200 microL do calibrador em duplicata (dois poccedilos) e 200 microL do controle positivo
em amostra uacutenica (um poccedilo)
Adicionou-se 200 microL do Diluente de Amostra em todos os poccedilos que
continham as amostras dos pacientes a serem dosadas na placa de ELISA
tomando cuidado para natildeo contaminar os poccedilos adjacentes
43
Dispensou-se 50 microL do Diluente do Reagente em todos os poccedilos de
controles calibradores e amostras cobrimos com adesivo para evitar evaporaccedilatildeo e
contaminaccedilatildeo das amostras e incubamos a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC
Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com
300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem diluiacuteda
Pipetou-se 100 microL de Conjugado Enzimaacutetico exceto no poccedilo do branco e
incubou-se a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se
cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com 300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem
diluiacuteda
Pipetou-se 100 microL de CromoacutegenoSubstrato em todos os poccedilos
Incubamos a microplaca protegendo-a de luz intensa e direta agrave temperatura
ambiente (18-24ordmC) por 15 min
Pipetou-se 100 microL de Aacutecido Sulfuacuterico em todos os poccedilos para ldquopararrdquo a
reaccedilatildeo enzimaacutetica e mediu-se a absorbacircncia da soluccedilatildeo obtida em leitor de ELISA
com filtro de 450 nM
O teste foi validado de acordo com os valores do controle de qualidade
preconizados pelo fabricante e que devem tanger os valores para o branco da
reaccedilatildeo le 0100 controle negativo le 0050 controle positivo ge 1000 e calibrador ge
1100 Para as amostras testadas os valores reagentes e natildeo reagentes para
pesquisa de anticorpos anti-HCV satildeo interpretados da seguinte maneira natildeo
reagentes com valores le 09 reagentes com valores ge 11 e indeterminados entre
os valores 09 ndash 11
423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia molecular
Nas amostras positivas pela sorologia (ELISA) realizou-se extraccedilatildeo do
RNA viral presente no soro do paciente utilizando kit comercial (QIAmp Viral RNA
kit Quiagen Alemanha) seguindo a teacutecnica adaptada no Laboratoacuterio de Patologia
Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais
Pipetou-se 560 microL de tampatildeo AVL (lise) contendo RNA em tubo de
centriacutefuga de 15 ml identificado adicionou-se 140 microL da amostra e homogenizou-se
em voacutertex por 15s incubando a temperatura ambiente (15-25degC) por 10 min Apoacutes
incubaccedilatildeo centrifugou-se rapidamente o tubo para remover partiacuteculas dispersas
44
Adicionou-se 560 microL de etanol (96-100) na amostra e homogenizou-se
no voacutertex por 15s centrifugando-se rapidamente para remover partiacuteculas dispersas
Depois cuidadosamente transferiu-se 630 microL para as colunas devidamente
identificadas centrifugou-se a 14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo
ficando soacute com a coluna para encaixar em outro tubo
Colocou-se o resto das amostras nas colunas devidas centrifugou-se a
14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo ficando soacute com a coluna para
encaixar em outro tubo Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW1) e
centrifugou-se por 1 min mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo
Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW2) e centrifugou-se por 4 min
mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo
Identificados os tubos para RNA colocou-se as colunas Adicionou-se 60
microL de tampatildeo para eluir (AVE) em cada amostra e centrifugou-se por 1 min
descartando a coluna e ficando com o tubo Colocou-se em banho-maria por 10 min
a 65degC centrifugado rapidamente e colocado no gelo As amostras extraiacutedas foram
congeladas e armazenadas em freezer a -20ordmC
O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado de acordo com a teacutecnica de
RT-PCR qualitativa com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das
Doenccedilas Tropicais da seguinte maneira para o Mix de uma amostra Tampatildeo 12
microL primer ou iniciador k10 1microL primer ou iniciador k11 1microL aacutegua ultrapura livre de
DNAse e RNAse 5 microL Enzima Taq polymerase One-Step (Invitrogen) 1 microL O
primer k10 constitui-se da sequecircncia GGC GAC ACT CCA CCA TRR e o primer k11
da sequecircncia GGT GCA CGG TCT ACG AGA CC
O volume do mix por amostra eacute de 20 microL e o volume da amostra (produto
da extraccedilatildeo) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As amostras
foram colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo eacute realizada a 42ordmC por 45 minutos
temperatura inicial de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 2 minutos seguida de 35 ciclos com
temperatura de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 54ordmC por 30
segundos de extensatildeo a 72ordmC por 45 segundos e temperatura de extensatildeo final de
72ordmC por 7 minutos e um hold de 4ordmC
Para visualizaccedilatildeo do produto dessa 1ordf PCR (RT-PCR) eacute feito um gel de
agarose a 1 (1g de agarose para 100mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de
etidium) que migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os
resultados foram visualizados atraveacutes de luz ultravioleta (UV) Os pacientes
45
positivos que apresentarem ldquobandardquo devem continuar os procedimentos e os
negativos que natildeo apresentarem ldquobandasrdquo deveratildeo ser liberados como
indetectaacuteveis por este meacutetodo
A 2ordf PCR (RFLP) foi responsaacutevel por fazer a amplificaccedilatildeo do cDNA
produto da 1ordf PCR Para esta etapa tambeacutem com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio
de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais foram necessaacuterios para o Mix de uma
amostra Tampatildeo 10X 25 microL DNTP 4 microL MgCl2 15 microL primer ou iniciador k15 1
microL primer ou iniciador k16 1 microL aacutegua ultrapura livre de DNAse e RNAse 125 microL
Enzima Taq platinum (Invitrogen) 05 microL O primer k15 constitui-se da sequecircncia
ACC ATR RAT CAC TCC CCT GT e o primer k16 da sequecircncia CAA GCA CCC TAT
CAG GCA GT
O volume do mix por amostra foi de 23 microL e o volume da amostra
(produto da 1ordf PCR) de 2 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As
amostras satildeo colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo se realiza a temperatura inicial
de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 4 minutos seguida de 35 ciclos com temperatura de
desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 55ordmC por 45 segundos de
extensatildeo a 72ordmC por 1 minuto e temperatura de extensatildeo final de 72ordmC por 7
minutos e um hold de 4ordmC
O produto da 2ordf PCR eacute observado atraveacutes de um gel de agarose a 1 (1g
de agarose para 100 mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que
migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os resultados
foram visualizados atraveacutes de luz UV (ultravioleta) Os pacientes positivos que
apresentaram ldquobandardquo (fragmento amplificado) se continuou os procedimentos e os
negativos que natildeo apresentaram ldquobandasrdquo foram repetidos para o procedimento da
2ordf PCR
424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem)
Os pacientes positivos para a 2ordf PCR foram submetidos agrave genotipagem
do viacuterus atraveacutes do meacutetodo de RFLP utilizando um par de enzimas de restriccedilatildeo
AVA II e RSA I Essa teacutecnica tambeacutem foi adaptada no Laboratoacuterio de Patologia
Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais
46
Na determinaccedilatildeo do genoacutetipo cada amostra eacute utilizada duas vezes
sendo uma reaccedilatildeo para AVA II e uma para RSA I portanto cada amostra teve dois
tubos correspondentes
Para a preparaccedilatildeo do mix de uma amostra para a enzima de restriccedilatildeo
AVA II (Promega) foram utilizados Buffer C X 30 2 microL aacutegua ultrapura livre de
DNAse e RNAse 125 microL AVA II 05 microL Para o mix de uma amostra de RSA I
(Invitrogen) satildeo necessaacuterios React 1 10X 2 microL aacutegua ultrapura libre de DNAse e
RNAse 11 microL RSA I 2 microL
O volume do mix por amostra foi de 15 microL e o volume da amostra
(produto da 2ordf PCR) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 20 microL para
cada frasco correspondente a sua enzima de restriccedilatildeo As amostras formatildeo ldquoparesrdquo
de tubos AVA II e RSA I e satildeo colocadas em banho-maria a 37ordmC overnight para
digerir (cortar) os fragmentos
Para visualizaccedilatildeo do produto da digestatildeo (RFLP) e verificaccedilatildeo dos
genoacutetipos foi preparado um gel de agarose a 2 (2g de agarose para 100 mL de
tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que migrou em cuba de eletroforese
com 100V 500A por 60 minutos Os resultados foram visualizados atraveacutes de luz UV
(ultravioleta) Os pacientes positivos apresentam ldquobandasrdquo (fragmentos) de
tamanhos diferentes O nuacutemero de bandas e sua disposiccedilatildeo no gel formaram
padrotildees de combinaccedilotildees correspondentes a cada genoacutetipo viral
425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas HEp-2
A pesquisa de auto-anticorpo contra antiacutegenos celulares foi realizada no
Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa pela teacutecnica de imunofluorescecircncia
indireta que os identifica atraveacutes da ligaccedilatildeo destes auto-anticorpos aos antiacutegenos do
substrato sendo esta ligaccedilatildeo revelada pela adiccedilatildeo de um soro com atividade Anti-
IgG conjugado agrave fluoresceiacutena
As amostras foram testadas utilizando-se um conjunto diagnoacutestico
comercial Antinuclear Antibody HEp-2 da Hemagen Diagnostics
Na primeira fase da reaccedilatildeo os soros diluiacutedos 140 colocados em contato
com o substrato durante 20 minutos seguido de lavagem com soluccedilatildeo salina
tamponada por 10 minutos Na segunda fase aplicacou-se a substacircncia
47
fluorescente sendo o conjugado diluiacutedo 130 deixando-se por 10 minutos seguida
de nova lavagem de 10 minutos e montagem da lacircmina com glicerina tamponada
Em cada lacircmina foram utilizados controle positivo e controle negativo
A leitura das lacircminas foi realizada em microscoacutepio de imunofluorescecircncia
marca Nikon modelo Eclipse E-200
Os criteacuterios morfoloacutegicos observados durante a leitura foram
a) aspecto da matriz nuclear
b) aspecto do nucleacuteolo
c) observaccedilatildeo de todos os estaacutegios de divisatildeo nuclear
d) aspecto do fuso mitoacutetico
e) aspecto do citoplasma
43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados coletados foram estruturados em um banco de dados no qual
tambeacutem foram confeccionadas tabelas e graacuteficos para representaccedilatildeo dos dados
Posteriormente foram analisados no programa Bioestat 50 para a geraccedilatildeo de
resultados estatiacutesticos que comprovassem a associaccedilatildeo de variaacuteveis pertinentes ao
estudo considerando o intervalo de confianccedila (IC) 95 e niacutevel α 5 (p-valor le 005)
isto eacute um achado seraacute considerado estatisticamente significante se valor de ldquoprdquo for
menor ou igual a 005 e seraacute considerado sem significacircncia estatiacutestica se esse valor
de ldquoprdquo for maior que 005
Nas variaacuteveis quantitativas foram realizadas as medidas de tendecircncia
central sendo calculado a meacutedia e a mediana com seus respectivos desvios
padrotildees O teste t foi usado para comparar as idades entre as amostras
O teste do Qui-quadrado e o teste G foram aplicados nas comparaccedilotildees de
n amostras independentes cujas proporccedilotildees observadas nas diversas modalidades
estiveram dispostas em tabelas de contigecircncia l x c onde se determinou as
proporccedilotildees observadas nas diferentes categorias e se estas tinham alguma
associaccedilatildeo
48
5 RESULTADOS
O Padratildeo de FAN em 100 dos 51 pacientes infectados pelo HCV e em
2 dos natildeo infectados pelo HCV ocorreu Citoplasmaacutetico
Com relaccedilatildeo agrave distribuiccedilatildeo dos pacientes por gecircnero observou-se uma
predominacircncia do gecircnero masculino (667) A faixa etaacuteria predominante foi a de 30
a 50 anos de idade (628) seguida da faixa etaacuteria compreendida entre 51 e 60
anos (196) No que diz respeito agrave naturalidade houve uma predominacircncia de
paraenses em 922 da amostra A maioria dos pacientes incluiacutedos no estudo foi
proveniente da Fundaccedilatildeo HEMOPA (98) por se tratarem de candidatos a doaccedilatildeo
de sangue (Tabela 1)
Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV segundo as caracteriacutesticas demograacuteficas janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Caracteriacutesticas demograacuteficas n Teste estatiacutestico Gecircnero
Masculino 34 667 Qui-quadrado Feminino 17 333 p = 00251
Total 51 1000
Idade (anos) lt 30 6 118 Qui-quadrado
30 a 40 16 314 p = 00094 41 a 50 16 314 51 a 60 10 196
gt 60 3 59 Total 51 1000
Naturalidade
Paraense 47 922 Qui-quadrado Macapaense 1 20 p lt 00001 Maranhense 1 20
Pernambucano 1 20 Gauacutecho 1 20
Total 51 1000
Procedecircncia Qui-quadrado HEMOPA 50 980 p lt 00001
IASEP 1 20 Total 51 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
49
Identificou-se no estudo a predominacircncia do genoacutetipo viral do tipo 1
(882) estando o genoacutetipo 3 presente em 118 dos casos Em 255 dos
pacientes foi observado uma positividade para FAN sendo que todos apresentaram
o padratildeo citoplasmaacutetico (Tabela 2)
Tabela 2 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV conforme os resultados laboratoriais de FAN citoplasmaacutetico e genotipagem janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Exames laboratoriais n Teste estatiacutestico
Genoacutetipo viral - HCV
Tipo 1 45 882 Qui-quadrado
Tipo3 6 118 p lt 00001
Total 51 1000
FAN Qui-quadrado
Positivo (citoplasmaacutetico) 13 255 p = 00008
Negativo 38 745 Total 51 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
Observou-se uma baixa positividade para o FAN tanto no gecircnero
masculino (294) quanto no gecircnero feminino (176) Natildeo houve diferenccedila
estatiacutestica significante entre os gecircneros e a anaacutelise do FAN (p = 05652) Isto eacute
independendo do gecircnero do paciente nada se poderaacute inferir se o mesmo teraacute maior
ou menor chance de possuir um FAN positivo ou negativo (Tabela 3)
Tabela 3 ndash Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
FAN (citoplasmaacutetico)
Gecircnero Teste estatiacutestico
(Teste G) Masculino Feminino
N N
Positivo 10 294 3 176
Negativo 24 706 14 824 p = 05652
Total 34 1000 17 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
Dentre os pacientes infectados o genoacutetipo viral tipo 1 e o tipo 3
predominaram no gecircnero masculino embora natildeo havendo diferenccedila significativa
entre os grupos (p=06376)(Tabela 4)
50
Tabela 4 - Relaccedilatildeo da genotipagem de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Gecircnero
Grupos estudados Teste estatiacutestico
(Teste G) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3
n n Masculino 29 644 5 833 p=06376 Feminino 16 356 1 167
Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa
Na faixa etaacuteria de 30 a 50 anos foi observada uma maior proporccedilatildeo (667)
do genoacutetipo viral do tipo 3 enquanto que para o genoacutetipo tipo 1 foi de 628 natildeo
tendo essa diferenccedila significacircncia estatiacutestica (Tabela 5)
Tabela 5 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e faixa etaacuteria - janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)
Idade (anos) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n
lt 30 04 118 0 00
30 a 40 15 314 3 500 p = 06401
41 a 50 15 314 1 167
51 a 60 08 196 2 333
gt 60 03 59 0 00 Total 45 1000 6 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
A anaacutelise descritiva das idades dos pacientes demonstrou que a meacutedia e
a mediana foi de 43 anos para aqueles com genoacutetipo viral tipo 1 no entanto para o
genoacutetipo viral tipo 3 a meacutedia foi de 44 e a mediana de 42 anos Observou-se que a
idade miacutenima dos pacientes com genoacutetipo viral-HCV do tipo 1 e 3 foi
respectivamente de 20 e 32 anos e a maacutexima foi de 68 e 57 anos perfazendo uma
amplitude total de 48 e 25 anos respectivamente Natildeo houve significacircncia estatiacutestica
entre as idades encontradas nos genoacutetipos 1 e 3 (Tabela 6 )
De acordo com o FAN citoplasmaacutetico a idade miacutenima dos pacientes com
FAN positivo e negativo foi respectivamente de 30 e 20 anos e a maacutexima foi de 53 e
68 anos perfazendo uma amplitude total de 23 e 48 anos respectivamente As
idades meacutedia e mediana foram respectivamente 435 e 46 anos nos pacientes com
o FAN positivo e meacutedia de 43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN
51
negativo Natildeo houve diferenccedila estatisticamente significativa entre as idades
encontradas nos pacientes com FAN positivo e negativo (Tabela 6)
Tabela 6 - Estudo descritivo da idade dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e presenccedila do FAN citoplasmaacutetico janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Grupos Estudados Genoacutetipo viral - HCV Auto anticorpo
Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 FAN (+) FAN (-) IDADE
Tamanho da amostra 45 6 13 38
Idade miacutenima 20 32 30 20
Idade maacutexima 68 57 53 68
Amplitude Total 48 25 23 48
Meacutedia Aritmeacutetica 43 44 435 43
Mediana 43 42 46 42
Desvio Padratildeo 107 93 78 113
Teste t p = 08363 p = 08809 Fonte Protocolo da pesquisa
Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos em que foram analisados AST
ALT ASTALT γ-GT e fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo
semelhantes dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e 3 natildeo
atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos
(Tabela 7)
Tabela 7- Distribuiccedilatildeo dos genoacutetipos dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Paracircmetros bioquiacutemicos
Genoacutetipo viral - HCV Teste estatiacutestico
(Teste t) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3
micro plusmn DP micro plusmn DP
AST 353 plusmn 219 328 plusmn 137 p = 07907
ALT 372 plusmn 321 288 plusmn 136 p = 05355
ASTALT 12 plusmn 07 14 plusmn 11 p = 06110
γ-GT 403 plusmn 38 302 plusmn 138 p = 02194
Fosfatase alcalina 1126 plusmn 443 1087 plusmn 376 p = 08349
Fonte Protocolo da pesquisa
Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos de AST ALT ASTALT γ-GT e
fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os
52
pacientes com FAN positivo e negativo natildeo sendo observada significacircncia
estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos de FAN (Tabela 8)
Tabela 8 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Paracircmetros bioquiacutemicos Auto anticorpos
Teste estatiacutestico (Teste t) Positivo Negativo
micro plusmn DP micro plusmn DP
AST 419 plusmn 238 326 plusmn 197 p = 01704
ALT 408 plusmn 29 346 plusmn 312 p = 05347
ASTALT 13 plusmn 08 12 plusmn 07 p = 05732
γ-GT 34 plusmn 21 409 plusmn 40 p = 04369
Fosfatase alcalina 1073 plusmn 345 1138 plusmn 462 p = 06431 Fonte Protocolo da pesquisa
Na comparaccedilatildeo entre resultados positivos e negativos do FAN
citoplasmaacutetico observou-se uma maior prevalecircncia da negatividade tanto em
pacientes natildeo infectados (98) como em pacientes infectados (745) pelo HCV
sendo essa diferenccedila estatisticamente significativa (plt00001) o que representa
uma natildeo associaccedilatildeo entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV
(Tabela 9)
Tabela 9 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico segundo a presenccedila ou ausecircncia de infecccedilatildeo por HCV janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
FAN (citoplasmaacutetico)
Pacientes Teste estatiacutestico (Teste G)
Infectados Natildeo infectados
N n
Positivo 13 255 2 2
Negativo 38 745 98 98 p lt 00001
Total 51 1000 100 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
Comparando-se os resultados do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos
viras observa-se que o resultado negativo eacute superior ao positivo em ambos os
genoacutetipos virais sendo 711 para o genoacutetipo viral 1 e 100 para o genoacutetipo viral 3
No entanto esta diferenccedila observada natildeo eacute estatisticamente significativa (p=02573)
(Tabela 10)
53
Tabela 10 - Distribuiccedilatildeo do FAN de acordo com o genoacutetipo viral janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
FAN (citoplasmaacutetico)
Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)
Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n
Positivo 13 289 0 00 p=02573 Negativo 32 711 6 1000
Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa
54
6 DISCUSSAtildeO
Desde o primeiro marcador soroloacutegico para diagnoacutestico do Lupus
Eritematoso Sistecircmico (LES) a ceacutelula LE descrita por Hargraves (1948) vaacuterios
substratos antigecircnicos foram utilizados para o estudo dos auto-anticorpos os quais
terminaram amplamente substituiacutedos pelas ceacutelulas HEp-2 Estas apresentam
significativas vantagens sobre os demais pela sua sensibilidade variedade de
antiacutegenos presentes e pelas facilidades morfoloacutegicas para o seu estudo
O uso da imunofluorescecircncia indireta para a visualizaccedilatildeo dos anticorpos
antinucleares nas ceacutelulas HEp-2 permite o reconhecimento de mais de 30 diferentes
padrotildees de fluorescecircncia como nucleares nucleolares da membrana nuclear do
aparelho mitoacutetico e citoplasmaacutetico todos satildeo proporcionados por diferentes auto-
anticorpos
A partir do 1deg Consenso Brasileiro para Padronizaccedilatildeo dos Laudos de FAN
(HEp-2) os criteacuterios para o preparo interpretaccedilatildeo da fluorescecircncia e nomenclatura
dos resultados passaram a ser normatizados Alguns padrotildees de fluorescecircncia satildeo
relativamente inespeciacuteficos outros satildeo ocasionados por uma gama restrita de auto-
anticorpos e outros ainda por um uacutenico auto-anticorpo (DELLAVANCE et al
2002) Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a tornaacute-las
imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo (DE
LARANAGA et al 2000)
Apesar do padratildeo de fluorescecircncia na maioria das vezes natildeo se pode
identificar o anticorpo presente ele pode sugerir ao cliacutenico qual o proacuteximo passo a
ser dado na investigaccedilatildeo da sua especificidade Os resultados encontrados devem
estar em associaccedilatildeo com a cliacutenica os padrotildees de fluorescecircncia e os tiacutetulos
alcanccedilados com a diluiccedilatildeo preacutevia (DELLAVANCE et al 2003)
No presente estudo a analise de 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo Viacuterus da
Hepatite C esteve presente o anticorpo-antinuclear (ANA FAN) em 13 (255) dos
pacientes e todos eram padratildeo citoplasmaacutetico corroborando com outros estudos
encontrados na literatura como
Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de
pacientes infectados pelo viacuterus HIV com Hanseniacutease e co-infectados com
Hanseniacutease HIV Ela obteve respectivamente as seguintes taxas de prevalecircncias
32 333 e 478 Em todos os grupos neste estudo houve predomiacutenio do
55
padratildeo citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear soacute foi observado entre os pacientes com
hanseniacutease (91) e co-infectados (237)
Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de
pacientes infectados pelo viacuterus da Dengue e viacuterus linfotroacutepico de ceacutelulas T humanas
HTLV-12 e controle Normais e obteve respectivamente as seguintes taxas de
prevalecircncias 40 40 e 2 Em todos os grupos houve predomiacutenio do padratildeo
citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear foi observado entre os pacientes com dengue
(67) e HTLV 12 (133)
Segundo Andrade et al (2002) Dellavance et al (2005) Dellavance e
Andrade et al (2007) o predomiacutenio do padratildeo de FAN do tipo citoplasmaacutetico indica
que determinados padrotildees de fluorescecircncia satildeo mais especiacuteficos de doenccedila auto-
imune enquanto outros ocorrem em indiviacuteduos com enfermidades natildeo auto-imunes
por ser o citoplasma celular rico em proteiacutenas para as quais auto-anticorpos naturais
apresentam afinidade moderada eacute comum observar positividade para FAN em
indiviacuteduos sadios cujo significado ainda natildeo eacute entendido completamente
O padratildeo Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina que pode ser
encontrado em Hepatite auto-imune Cirrose Hepatite C Hepatocarcionoma entre
outros Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica
definida Um resultado positivo pode estar ou natildeo associado a uma patologia assim
como poderaacute ou natildeo vir a apresentar uma doenccedila auto-imune com o passar do
tempo (DELLAVANCE et al 2003) Neste estudo natildeo foi feito avaliaccedilatildeo prospectiva
dos resultados embora todos sejam FAN citoplasmaacuteticos
Os achados de FAN positivo em populaccedilotildees sadias ou sem doenccedilas auto-
imunes tambeacutem jaacute observado por Leser et al (2004) que em 394 pacientes com
FAN-HEp-2 positivo natildeo encontraram nenhum paciente com doenccedila auto-imune
Outro exemplo estaacute no padratildeo citoplasmaacutetico de pontos isolados
estudado por Laurino et al (2006) presente em indiviacuteduos sem evidecircncia de auto-
imunidade mas tambeacutem em indiviacuteduos com acometimento de doenccedilas auto-imunes
sistecircmicas e natildeo-especiacuteficas
Os dados apresentados corroboram com este estudo em que foi
observado a presenccedila do auto-anticorpo em 2 (2 ) dos 100 indiviacuteduos sadios do
grupo controle todos com padratildeo citoplasmaacutetico
56
Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a
tornaacute-las imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo
(DE LARANAGA et al 2000)
Nas Infecccedilotildees agudas espera-se que a resposta auto-imune diminua a
medida que os viacuterus satildeo eliminados Entretanto alguns trabalhos sugerem que em
indiviacuteduos geneticamente susceptiacuteveis as reaccedilotildees auto-imunes possam persistir
apesar do clareamento viral uma vez que o gatilho imunoloacutegico foi ativado e natildeo
houve desativaccedilatildeo (DE LARANAGA et al 2000 SAKKAS et al 2008)
Ramos-Casals et al (2009) no estudo Doenccedilas Sistecircmica Auto-Imunes
em Pacientes com Infecccedilatildeo pelo (72) dos pacientes eram do gecircnero feminino e
(28) do masculino(ANA FAN) em 61 dos pacientes o que se diferem deste
trabalho eacute que dos 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo (667) eram do gecircnero
masculino e (333) eram do gecircnero feminino com meacutedia de idade de 430 (plusmn107)
anos com presenccedila de anticorpo-antinuclear em 13 (255) com meacutedia e mediana
respectivamente de 435 e 46 anos nos pacientes com o FAN positivo e meacutedia de
43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN negativo
Alter (1995) em sua pesquisa natildeo observou associaccedilatildeo entre o risco de
infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas designadas por gecircnero idade e raccedila Na
referida pesquisa foram estudados 51 pacientes com idade meacutedia de 430 (+- 107)
anos 34 (667) eram do gecircnero masculino e 17 (333) do gecircnero feminino todos
em fase preacute-tratamento assintomaacuteticos natildeo permitindo avaliar os risco da
infecccedilatildeoSegundo Pordeus et al (2008) a ocorrecircncia destes auto-anticorpos
indicaria um prognoacutestico desfavoraacutevel Perperas Mcfarlane e Mcsorley (1986)
sugeriram que os auto-anticorpos poderiam estar envolvidos na progressatildeo ou no
desenvolvimento de hepatites crocircnicas possivelmente por um distuacuterbio no controle
da auto-reatividade Outros estudos questionam a participaccedilatildeo dos auto-anticorpos
no processo de transiccedilatildeo para cronicidade das hepatites agudas virais poreacutem os
resultados natildeo satildeo convincentes (SHOENFELD ROSE 2004)
Lopez Seia e Roy (1998) demonstraram a presenccedila de anticorpo anti-
actina em baixos tiacutetulos em crianccedilas com hepatite aguda por curto periacuteodo de
tempo poreacutem nenhuma associaccedilatildeo com gravidade da agressatildeo hepaacutetica foi
descrita
Neste estudo a presenccedila dos auto-anticorpos em (255) dos pacientes
com infecccedilatildeo pelo HCV natildeo puderam ser relacionada com a gravidade da doenccedila
57
pois este estudo foi realizado em pacientes receacutem diagnosticados entatildeo seria
necessaacuterio um acompanhamento destes por um periacuteodo maior de tempo com a
finalidade de concluir esta afirmativa Apesar da presenccedila transitoacuteria de auto-
anticorpos jaacute ter sido descrita em doenccedilas virais comuns a associaccedilatildeo entre a
presenccedila de auto-anticorpos e a gravidade das doenccedilas necessita de comprovaccedilatildeo
Passaleva Massai e Leoncini (1983) avaliaram 302 pacientes com
hepatites agudas virais e encontraram complexos imunes circulantes (CIC) em
516 dos pacientes com frequumlecircncia significativamente maior em hepatite aguda
Nenhuma associaccedilatildeo entre a presenccedila de imuno-complexos e o niacutevel de
aminotransferases ou bilirrubina foi encontrada Segundo Andrade et al (2002)
Dellavance et al (2005) Andrade et al (2007) nos pacientes do estudo foi feita a
relaccedilatildeo entre a presenccedila dos auto-anticorpos e niacuteveis de aminotransferases e as
elevaccedilotildees natildeo tiveram significacircncia poreacutem houve associaccedilatildeo do genotipo viral 1
Nos paracircmetros bioquiacutemicos analisados em relaccedilatildeo aos genoacutetipos houve uma
distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e
3 natildeo atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os
grupos Segundo Wilson (1997) trecircs estudos mostraram correlaccedilatildeo entre niacuteveis
altos de alanina aminotransferase e atividade histoloacutegica da doenccedila hepaacutetica
Poreacutem nos pacientes considerados individualmente o valor preditivo dessa
associaccedilatildeo foi baixo enquanto muitos deles com enzimas normais apresentavam
graves alteraccedilotildees histoloacutegicas No presente estudo natildeo foi observada associaccedilatildeo entre os niacuteveis de
aminotransferases e a cronificaccedilatildeo da hepatite viral pois nem todos os pacientes do
estudo apresentavam resultado de bioacutepsia hepaacutetica
Alter et al (1999) afirmam que no Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b
(63) e 3a (313) em estudo realizado em Goiacircnia onde foi observada uma
maior prevalecircncia do genoacutetipo 1 seguida do genoacutetipo 3 em doadores de sangue e
hemofiacutelicos (DELLAVANCE ANDRADE et al 2007) Estando esses dados em
acordo com esta pesquisa que com genotipagem do viacuterus da hepatite C que
identificou o genoacutetipo 1 em 45 (882) seguidos pelo genoacutetipo 3 que foi
identificado em 6 (118) dos pacientes com infecccedilatildeo pelo HCV Em um estudo realizado na Franccedila com 13 pacientes luacutepicas infectadas
pelo viacuterus C 8 apresentavam o RNA viral sendo o genoacutetipo 1 presente em cinco
58
(625) casos seguido do genoacutetipo 3 (375) (PERLEMUTER et al 2000) dados
que se assemelham aos do presente estudo embora o estudo natildeo tenha incluiacutedo
pacientes com outras infecccedilotildees associadas ao HCV Eacute importante ressaltar que
estudos sobre genotipagem do HCV em indiviacuteduos com doenccedilas reumaacuteticas satildeo
raros
No presente estudo houve uma frequumlecircncia baixa de positividade para o
FAN nos pacientes com genoacutetipo 1 e genoacutetipo 3 Natildeo havendo significacircncia
estatiacutestica entre os pacientes com genoacutetipo 1 e 3
Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter
implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave menor
resposta agrave terapia antiviral (BRUNO et al1997) o que natildeo foi avaliado neste estudo
pois apesar de (882) dos pacientes serem genoacutetipo 1 todos estavam em fase de
reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica seja preacute- tratamento Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila
poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses
autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis
vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo
hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja
quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a
concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave
hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em
parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)
59
7 CONCLUSOtildeES
minus O padratildeo dos auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares encontrados nos
dois grupos estudados foi o citoplasmaacutetico
minus A prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares no grupo com
infecccedilatildeo pelo VHC foi significativamente maior do que no grupo controle
minus Nos resultados de FAN citoplasmaacutetico haacute uma maior prevalecircncia da
negatividade em pacientes infectados pelo HCV e natildeo infectados sendo
essa diferenccedila estatisticamente significativa conferindo a natildeo associaccedilatildeo
entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV
minus Os resultados negativos do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos viras eacute
superior aos positivos em ambos os genoacutetipos virais entretanto esta diferenccedila
natildeo eacute estatisticamente significativa
minus Houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos
celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado
minus Natildeo houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos
celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado com
relaccedilatildeo ao gecircnero onde predominou o gecircnero masculino nos dois grupos
minus Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter
implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave
menor resposta agrave terapia antiviral o que natildeo foi avaliado neste estudo pois
os pacientes estavam em fase preacute tratamento sugerindo que estes pacientes
sejam avaliados futuramente
minus A formaccedilatildeo dos auto-anticorpos parece ser mais uma consequumlecircncia do que
uma causa da agressatildeo hepaacutetica
minus A negatividade do FAN ndash Hep 2 foi maior que a positividade mas todos os
FAN positivos pertenciam ao genoacutetipo viral tipo 1 nos pacientes infectados
pelo HCV
minus Nesta pesquisa os resultados de PCR o RNA-HCV de reconfirmaccedilatildeo foi
positivo para o anti-HCV em todos os soros analisados mostrando assim
que estes pacientes eram portadores de infecccedilatildeo por viacuterus C ou seja natildeo
houve falso positivo anteriormente poreacutem todos eram assintomaacuteticos
dificultando a conclusatildeo de ser ou natildeo uma infecccedilatildeo persistente
60
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APEcircNDICES
68
APEcircNDICE A - TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Vocecirc estaacute sendo convidado para fazer parte de uma pesquisa que estaacute sendo desenvolvida pela Universidade Federal do Paraacute no Nuacutecleo de Medicina Tropical intitulada AUTOANTICORPOS CONTRA ANTIacuteGENOS CELULARES E SUA CORRELACcedilAtildeO COM O GENOacuteTIPO VIRAL EM PACIENTES COM INFECCcedilAtildeO PELO VIacuteRUS DA HEPATITE C (HCV)
O Objetivo da pesquisa eacute fazer uma correlaccedilatildeo do anticorpo antinuacutecleo (FAN) e o genoacutetipo viral em pacientes com hepatite C e o estaacutegio da doenccedila hepaacutetica a partir da histologia sempre que permitidos e correlacionar ao diagnoacutestico
Caso vocecirc participe da pesquisa seraacute necessaacuterio que forneccedila uma amostra de sangue (2ml)
O uacutenico inconveniente que vocecirc poderaacute experimentar eacute a dor provocada pela agulha na hora da coleta de sangue bem como pequenos hematomas que possam vir a ocorrer e que natildeo causam danos
Essa pesquisa natildeo oferece riscos as praacuteticas satildeo de uso rotineiro e seratildeo utilizados materiais esterilizados e descartaacuteveis como agulhas seringas etc
Estaacute garantido a vocecirc todas as informaccedilotildees que vocecirc queira antes durante e depois da pesquisa
A sua participaccedilatildeo neste estudo eacute voluntaacuteria Vocecirc tem a liberdade de recusar participar da pesquisa a qualquer momento
As informaccedilotildees relacionadas agrave pesquisa poderatildeo ser inspecionadas pelos pesquisadores que executam a pesquisa e pelas autoridades legais no entanto se qualquer informaccedilatildeo for divulgada em relatoacuterio publicaccedilatildeo ou qualquer outro meio isto seraacute feito de forma codificada para manter o caraacuteter confidencial
Todas as despesas necessaacuterias para a realizaccedilatildeo do estudo natildeo satildeo de sua responsabilidade assim como a sua participaccedilatildeo na pesquisa na seraacute remunerada (vocecirc natildeo receberaacute qualquer valor em dinheiro)
Quando os resultados forem divulgados natildeo apareceraacute seu nome e sim um coacutedigo
_____________________________________
Assinatura do Pesquisador Responsaacutevel NomeAna Maria Almeida Souza EndRodovia Maacuterio Covas 1426 ndash Cond Green Garden casa 41 Fone(91) 32352665 81197217 RegConselhoCRM 1508
69
APEcircNDICE B - CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Declaro que li as informaccedilotildees acima sobre a pesquisa que me sinto
perfeitamente esclarecido sobre o conteuacutedo da mesma assim como seus riscos e
benefiacutecios Declaro ainda que por minha livre vontade aceito participar da pesquisa
cooperando com a coleta de material para exame
Beleacutem _________
_________________________________________
Assinatura do sujeito da pesquisa ou do
responsaacutevel
70
ANEXOS
71
- Assinatura do Pesquisador Responsaacutevel
-
- Beleacutem _________
-
424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem) 45 425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas
HEp-2 46 43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA 47 5 RESULTADOS 48 6 DISCUSSAtildeO 54 7 CONCLUSOtildeES 59 REFEREcircNCIAS 60 APEcircNDICES 67 ANEXOS 70
15
1 INTRODUCcedilAtildeO
11 HEPATITE C (VHCHCV)
111 Consideraccedilotildees Gerais
As hepatites virais satildeo doenccedilas causadas por diferentes agentes
etioloacutegicos de distribuiccedilotildees universais que tecircm em comum o hepatotropismo
Possuem semelhanccedilas do ponto de vista cliacutenico-laboratorial mas apresentam
importantes diferenccedilas epidemioloacutegicas quanto agrave sua evoluccedilatildeo (FERREIRA
SILVEIRA 2004) Desde a descriccedilatildeo e definiccedilatildeo em 1989 (CHOO et al 1989 apud
RIBEIRO et al 2007) tornou-se evidente sua associaccedilatildeo com uma grande
variedade de manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas desordens reumaacuteticas e auto-imunes
(ALMEIDA 2010)
A infecccedilatildeo pelo VHCHCV acarreta inflamaccedilatildeo hepaacutetica e esteatose
podendo evoluir para fibrose hepaacutetica e cirrose em indiviacuteduos cronicamente
infectados estes com grande risco de desenvolvimento de carcinoma hepatocelular
(RIBEIRO et al 2007) Essas complicaccedilotildees tardias ocorrem em um periacuteodo em
geral superior a 20 anos apoacutes o iniacutecio da infecccedilatildeo A avaliaccedilatildeo filogeneacutetica das
sequumlecircncias do VHCHCV investigadas em vaacuterias regiotildees geograacuteficas sugere que
existam pelo menos seis genoacutetipos principais designados pelos nuacutemeros de 1 a 6 e
pelo menos 30 subtipos designados por letras minuacutesculas Nos Estados Unidos
prevalecem os genoacutetipos 1a (60) e 1b (20) Os tipos 5 e 6 satildeo mais encontrados
no sudeste e sul da Aacutefrica O tipo 4 eacute predominante na Aacutefrica Central e no Oriente
Meacutedio No Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b (63) e 3a (313) (BASSIT et
al 1999 apud RIBEIRO et al 2007) As informaccedilotildees sobre as causas que
determinam o curso evolutivo da doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos
progressos que haacute no campo do diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHCHCV Uma
questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo genoacutetipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de
lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o genoacutetipo 1 (1b) cursa com lesotildees
histoloacutegicas mais graves
As uacuteltimas deacutecadas foram de notaacuteveis conquistas no que se refere agrave
prevenccedilatildeo e ao controle das hepatites virais Entre as doenccedilas endecircmico-
epidecircmicas que representam problemas importantes de sauacutede puacuteblica no Brasil
16
salientam-se as Hepatites Virais cujo comportamento epidemioloacutegico no nosso paiacutes
e no mundo tem sofrido grandes mudanccedilas nos uacuteltimos anos
Antes da seleccedilatildeo rigorosa dos doadores de sangue em 1991 o
VHCHCV era a maior causa de hepatite poacutes-transfusional Atualmente permanece
como tal em casos esporaacutedicos (CONTE 2000) Os grupos considerados de risco
satildeo pessoas que receberam transfusatildeo de sangue antes de 1992 usuaacuterios de
drogas injetaacuteveis profissionais de sauacutede que lidam com sangue pacientes de
hemodiaacutelise e com menor risco pessoas tatuadas ou com piercings (CLEMENTE
ONO-NITA 2007)
A melhoria das condiccedilotildees de higiene e de saneamento das populaccedilotildees a
vacinaccedilatildeo contra a Hepatite B (HBV) e as novas teacutecnicas moleculares de diagnoacutestico
do viacuterus da Hepatite estatildeo entre esses avanccedilos importantes (BRASIL 2008)
112 Agente Etioloacutegico
O VHCHCV um viacuterus aacutecido ribonucleacuteico (RNA) da famiacutelia Flaviviridae
representa a principal causa da previamente denominada hepatite natildeo-A natildeo-B
(SANTOS 2009) Foi identificado e isolado a partir de um clone derivado de um
genoma NANBH semelhante aos togaviridae ou flaviviridae (SAADE 2008) e
visualizado a imunoeletromicroscopia como partiacutecula de 55 a 65 nm de diacircmetro
com projeccedilotildees espiculares e de morfologia muito semelhante aos flaviviridae Aleacutem
disso estas partiacuteculas reagiram especificamente com anticorpos mono e policlonais
do conteuacutedo proteacuteico do envelope do VHC (HIRANUMA et al 1994 apud CONTE
2000)
O agente etioloacutegico do HCV natildeo eacute uma partiacutecula homogecircnea e apresenta
uma taxa alta de mutaccedilatildeo levando-o a uma heterogeneicidade genocircmica cujo
resultado eacute um grande nuacutemero de genoacutetipos (1a 1b 2a 2b 3a 3b 4 5 6)
(AUGUSTO LOBATO 2003) Natildeo haacute evidecircncias de variantes natildeo patogecircnicas O
genoacutetipo 1b eacute o que apresenta maior virulecircncia e pior resposta ao tratamento
(LAUER WALKER 2001 apud SOUZA 2007) No Brasil dados obtidos a partir de
casos isolados e estudos de pequenas amostragens indicam que o genoacutetipo 1b
ocorre em cerca de 30 a 40 dos casos o 1a em cerca de 20 1a e 1b em 20
o 3a em cerca de 28 (FOCACCIA 2004)
17
113 Epidemiologia
De acordo com a Organizaccedilatildeo Mundial de Sauacutede (OMS) a HCV eacute uma
questatildeo de sauacutede puacuteblica e tambeacutem a principal causa de transplante de fiacutegado no
Brasil (SOCIEDADE BRASILEIRA DE HEPATOLOGIA 2005) Eacute estimada uma
prevalecircncia em torno de 10 para a infecccedilatildeo pelo VHC na populaccedilatildeo mundial
(KILLEMBERG 2000) Nos Estados Unidos cerca de 27 milhotildees de pessoas estatildeo
infectadas pelo viacuterus (BRASIL 2006)
De acordo com Ferreira e Silveira (2004) no Brasil o nuacutemero de pacientes
infectados eacute incerto relacionado geralmente a alguns estados e municiacutepios e o
esclarecimento dos agentes causadores das hepatites cuja identificaccedilatildeo requer
teacutecnicas laboratoriais complexas de biologia molecular eacute realizado de maneira
insuficiente Por outro lado a progressiva integraccedilatildeo entre as instacircncias gestoras
dos programas de vigilacircncia e controle das doenccedilas com grupos de pesquisa e
desses com os serviccedilos (FERREIRA SILVEIRA 2004 p 473) e a disponibilidade
dos bancos de dados nacionais mais confiaacuteveis apontam para novos e melhores
caminhos (BRASIL 2005b)
A OMS alerta que o Paiacutes deve se preparar para uma ldquoexplosatildeordquo da
epidemia a partir de 2011 (BRASIL 2005b) Outra preocupaccedilatildeo eacute que as pessoas
que receberam sangue antes de 1992 tecircm mais chances de estarem infectadas na
eacutepoca o sangue destinado agraves transfusotildees natildeo era analisado para detecccedilatildeo da HCV
porque o viacuterus natildeo era conhecido e natildeo havia exames especiacuteficos (BRASIL 2005b)
A prevalecircncia da infecccedilatildeo nos doadores de sangue sadios varia de 001-002 no
Reino Unido e no norte da Europa 1-15 no sul da Europa 65 na Aacutefrica
equatorial e de ateacute 20 no Egito (CONTE 2000)
De acordo com a OMS a cada grupo de 50 pessoas no Brasil uma tem
hepatite e de dez portadores apenas um sabe (STRAUSS 2001) Satildeo dois milhotildees
de infectados no Paiacutes Denominada epidemia silenciosa calcula-se que 170 milhotildees
de indiviacuteduos no mundo estejam contaminados pelo viacuterus C a forma mais grave da
doenccedila Ainda de acordo com a OMS o nuacutemero de brasileiros viacutetimas da
enfermidade eacute bem maior do que o estimado pelo Ministeacuterio da Sauacutede (TRINDADE
2005)
18
Por ocasiatildeo da Conferecircncia Internacional de Consenso sobre HCV em Paris
(LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999) concluiu-se que a hepatite crocircnica por viacuterus
C eacute um problema grave de sauacutede puacuteblica sendo sua prevalecircncia mundial estimada
em 3 (de 01 a 5 segundo os vaacuterios paiacuteses) por tanto havendo no mundo
todo cerca de 150 milhotildees de portadores crocircnicos do VHCHCV 4 milhotildees nos EUA
e 5 milhotildees na Europa Ocidental Na Europa Oriental a prevalecircncia eacute maior ainda
114 Modo de Transmissatildeo
A HCV eacute transmitida pelo sangue Natildeo haacute comprovaccedilatildeo de contaacutegio por
meio de fluidos corporais como saliva suor laacutegrimas secircmen ou leite materno
Tambeacutem deixa de ocorrer por meio de abraccedilos beijos uso dos mesmos copos ou
roupas Especialistas afirmam que a contaminaccedilatildeo atraveacutes de relaccedilotildees sexuais eacute
possiacutevel mas rara Quando detectada de maneira precoce a enfermidade tem
tratamento inclusive gratuito aleacutem de cura (BRASIL 2006)
Dentre os fatores de risco para transmissatildeo outros aleacutem da transfusatildeo de
sangue o uso de drogas iliacutecitas o comportamento sexual de alto risco e variaacuteveis
socioeconocircmicas representadas pelo grau de escolaridade e renda familiar Natildeo foi
observada associaccedilatildeo entre o risco de infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas
designadas por gecircnero idade e raccedila (ALTER 2007) O risco de transmissatildeo sexual
do VHCHCV eacute miacutenimo A contaminaccedilatildeo intrafamilial natildeo-sexual eacute consideraacutevel
particularmente quando um dos enfermos tem hepatopatia grave e ou carga viral
elevada (risco 110) (CONTE 2000)
A praacutetica de tatuagem fornece dados conflitantes sabendo-se que os
liacutequidos usados para esterilizar os instrumentos usados satildeo ineficazes
Karmochkine et al (1998 apud CONTE 2000) observaram que
aproximadamente 80 dos pacientes contraem o viacuterus atraveacutes da toxicomania
intravenosa ou transfusotildees de sangue ou de derivados Os restantes meios de
transmissatildeo e de contaacutegio satildeo a hemodiaacutelise os transplantes de oacutergatildeos picadas
acidentais profissionais e transmissatildeo vertical matildee-crianccedila Em 20 a 40 dos
casos natildeo se consegue determinar o modo de contaminaccedilatildeo A transmissatildeo da
hepatite crocircnica por viacuterus C pode ser prevenida (KARMOCHKINE et al 1998 apud
CONTE 2000)
19
As duas fontes de contaminaccedilatildeo satildeo a toxicomania endovenosa e a
administraccedilatildeo de produtos de origem sanguumliacutenea Esta uacuteltima praticamente
eliminada desde 1991 com a introduccedilatildeo dos testes ELISA 2 na seleccedilatildeo
aprimorada de doadores de sangue (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998
apud CONTE 2000)
A transmissatildeo sexual eacute rara com menos de 3 em parceiros estaacuteveis e
ocorre principalmente em pessoas com muacuteltiplos parceiros e com praacutetica sexual de
risco (sem uso de preservativo) ndash para os indiviacuteduos com parceiros muacuteltiplos o uso
de preservativos eacute indicado (BRASIL 2005a KARMOCHKINE et al 1998 apud
CONTE 2000)
A gravidez natildeo estaacute contra-indicada nas mulheres infectadas pelo
VHCHCV A transmissatildeo vertical matildee-crianccedila eacute rara (menor de 6) O tipo de parto
(natural ou cesaacuterea) natildeo tem influecircncia O aleitamento eacute permitido A transmissatildeo
nosocomial eacute prevenida eficazmente de modo convencional (KARMOCHKINE et
al 1998 apud CONTE 2000)
115 Evoluccedilatildeo Cliacutenica
A infecccedilatildeo aguda pode passar clinicamente despercebida ou evoluir para
hepatite fulminante Aproximadamente 850 das pessoas infectadas agudamente
vatildeo desenvolver uma viremia persistente tornando-se dessa forma indiviacuteduos
infectados crocircnicos Depressatildeo irritabilidade dores no corpo mal-estar febre
naacuteuseas e falta de apetite satildeo alguns dos sintomas mais frequumlentes embora a
maioria dos casos natildeo apresente nenhum sintoma (ALTER 2007)
A cirrose eacute pouco observada em pessoas que apresentam niacuteveis
persistentemente baixos das transaminases mas a elevaccedilatildeo destas natildeo eacute
representativa do grau de fibrose hepaacutetica Dessa forma a bioacutepsia hepaacutetica
representa o melhor indicador do estaacutegio de evoluccedilatildeo da doenccedila uma vez que
gradua os componentes inflamatoacuterios e o estaacutegio de fibrose (AGMON-LEVIN et al
2009 BLOCK SCHIANO 1999)
Alter et al (1992) dizem que em 82 de 130 pacientes seguidos durante
muitos anos apoacutes surto agudo de hepatite natildeo-A natildeo-B apresentam anti-VHCHCV
ou VHCHCV RNA sendo que 62 deles desenvolveram hepatite crocircnica e
concluem que os pacientes que adquiriram HCV tiveram alto grau de hepatite
20
crocircnica sendo que o VHCHCV pode ser a maior causa de doenccedila crocircnica de fiacutegado
nos EUA e que na maioria dos pacientes a infecccedilatildeo pelo VHCHCV parece persistir
por muitos anos mesmo na ausecircncia de doenccedila hepaacutetica ativa
Almeida et al (1999) determinaram a prevalecircncia da infecccedilatildeo em
doadores de sangue assim como avaliaram o grau de comprometimento hepaacutetico
numa populaccedilatildeo de 37335 doadores durante o biecircnio 93-94 em Porto Alegre - RS
utilizando o teste anti-VHC ELISA 2 Selecionaram 60 deles para a biopsia hepaacutetica
com agulha de Menghini encontrando prevalecircncia de 174 com comprometimento
hepatico e 39 deles apresentavam cirrose hepaacutetica Sendo a hepatopatia crocircnica de
graus variaacuteveis observadas em 80 deles na sua grande maioria com lesotildees leves
e miacutenimas Foi observada forte associaccedilatildeo entre elevaccedilatildeo de alanina
aminotransferase (ALT) e a presenccedila de hepatopatia crocircnica embora a intensidade
desta elevaccedilatildeo natildeo se correlacione com a gravidade da lesatildeo histoloacutegica
Jaacute na experiecircncia de Mutimer et al (1995) cerca de 80 dos doadores
soro-positivos analisados exaustivamente inclusive com biopsia de fiacutegado
mostraram evidecircncias de alteraccedilotildees histoloacutegicas e ou viroloacutegicas de infecccedilatildeo
persistente sem no entanto atingir graus mais avanccedilados de hepatopatia crocircnica
quase todos permanecendo na categoria moderada
Nos paiacuteses industrializados a HCV eacute responsaacutevel por 20 dos casos de
hepatite aguda 70 dos casos de hepatite crocircnica 40 dos casos de cirrose
descompensada 60 dos carcinomas hepatocelulares e 30 dos transplantes
hepaacuteticos (LrsquoEUROPEAN ASSOCIATION 1999)
Cerca de 40 do total de pacientes curam-se ou tecircm doenccedila crocircnica de
natureza benigna Os restantes 60 cursam com atividade aumentada de
aminotransferase denotando evoluccedilatildeo crocircnica da doenccedila Dentre estes a maioria
tem lesotildees necro inflamatoacuterias discretas e fibrose miacutenima ou ausente O prognoacutestico
em longo prazo eacute mal conhecido no entanto provavelmente a maioria deles natildeo viraacute
a falecer da doenccedila hepaacutetica em curso Cerca de 20 deles depois de 10-20 anos
de evoluccedilatildeo desenvolveratildeo cirrose hepaacutetica passiacutevel de transplante Assim a
hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila que ocasiona a morte de um pequeno nuacutemero
de pacientes sem no entanto afetar a duraccedilatildeo da vida meacutedia da maioria deles
(CONTE 2000 FERREIRA SILVEIRA 2004)
Apoacutes infecccedilatildeo aguda somente 10 dos pacientes desenvolve doenccedila
cliacutenica com icteriacutecia A infecccedilatildeo sub-cliacutenica eacute a regra e assim passa despercebida
21
Cerca de 25 deles tecircm infecccedilatildeo crocircnica sintomaacutetica com aminotransferases
normais e lesotildees inflamatoacuterias histoloacutegicas miacutenimas (RESENDE et al 2010)
A remissatildeo espontacircnea acontece em cerca de 15 dos casos Na grande
minoria dos casos a progressatildeo da doenccedila aguda pode levar agrave insuficiecircncia
hepaacutetica aguda
Observaccedilotildees feitas pelo irlandecircs Kenny-Walsh (1999) comprovam a
natureza e a evoluccedilatildeo cliacutenica da afecccedilatildeo em causa O autor acompanhou durante 17
anos 376 mulheres que receberam injeccedilotildees de imunoglobulinas anti-D
contaminadas com VHC provenientes de doador uacutenico num programa de
isoimunizaccedilatildeo Rh Destas 81 apresentaram sintomatologia mais frequumlentemente
fadiga (66) ALT ligeiramente elevada (de 40 a 99 UL) em 47 e igual ou maior de
100 UL em 8 A biopsia hepaacutetica mostrou inflamaccedilatildeo em 98 delas na maioria
das vezes leves (41) e moderadas (52) fibrose presente em 51 no entanto
somente em sete pacientes (2) houve sinais de cirrose provaacutevel ou definitiva Em
uma delas havia acentuado alcoolismo
A hepatite crocircnica por viacuterus C eacute doenccedila de evoluccedilatildeo variaacutevel De maneira
geral sua evoluccedilatildeo eacute lenta insidiosa e progressiva
Os pacientes que natildeo apresentam evidecircncias bioquiacutemicas de lesatildeo
hepaacutetica podem constituir em subgrupo de casos mais benignos no curso natural
da doenccedila Muitos co-fatores tecircm papel importante no desenvolvimento da cirrose
nesses pacientes como por exemplo a idade no momento da infecccedilatildeo (os
contaminados de idade mais avanccedilada tecircm evoluccedilatildeo mais raacutepida da doenccedila
enquanto que os mais jovens a tecircm mais lenta) o alcoolismo (eacute de consenso geral
que o abuso de aacutelcool favorece o aparecimento da cirrose) e a co-infecccedilatildeo com o
Viacuterus da Siacutendrome de Imunodeficiecircncia Adquirida (SIDA) e da HVB
A incidecircncia anual de carcinoma hepatocelular (CHC) eacute de 1 a 4 nos
pacientes cirroacuteticos o que justifica plenamente o controle ecograacutefico do fiacutegado e a
dosagem seacuterica de alfa-fetoproteiacutena nesses pacientes a cada 1-2 anos Por outro
lado nos pacientes com hepatite crocircnica por viacuterus C sem cirrose o CHC eacute muito
raro (LOPES 2010)
Nos casos de cura a atividade das transaminases cessa e os viacuterus natildeo
satildeo detectados (VHC RNA) no soro Nos casos de cronificaccedilatildeo acontece o
contraacuterio ou seja as alteraccedilotildees bioquiacutemicas existem com flutuaccedilotildees e os viacuterus satildeo
detectaacuteveis na grande maioria dos casos Fazem exceccedilatildeo agravequeles pacientes com
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viremia baixa que por isso mesmo fogem aos limites dos meacutetodos de detecccedilatildeo viral
ou devido agraves flutuaccedilotildees proacuteprias desses niacuteveis virecircmicos (HAYDON et al 1998)
Nos pacientes anti-VHC positivos com enzimas circulantes normais a
falta de VHC RNA no soro tem sido interpretada como sinal de cura completa No
entanto Haydon et al (1998) alteraram essa interpretaccedilatildeo Estes autores
demonstraram a presenccedila de VHC RNA no fiacutegado desses pacientes que eram
negativos no soro independente das alteraccedilotildees bioquiacutemicas positivas ou negativas
do soro ou seja mesmo naqueles casos anteriormente considerados como curados
Assim os niacuteveis de viacuterus intra-hepaacuteticos natildeo satildeo determinados pelos fatores
hospedeiro (idade modo e duraccedilatildeo da infecccedilatildeo) ou virais (VHC genoacutetipos) pois
mesmo as repetidamente Reaccedilatildeo de polimerase em cadeia-em tempo real (RT-
PCR) negativos para VHC RNA no soro podem ter viacuterus da HCV albergados no
fiacutegado Entretanto existem limitaccedilotildees metodoloacutegicas que devem ser consideradas
nessa interpretaccedilatildeo como por exemplo as limitaccedilotildees do RIBA 3 e do RT-PCR
Mais importante eacute o seguimento dos pacientes ao longo do tempo Assim
Seef et al (1992) em 568 pacientes de hepatite poacutes-transfusional e dois grupos
controles pareados que receberam transfusotildees sem desenvolver hepatite apoacutes 18
anos de seguimento encontraram 33 de mortalidade no grupo 1 e 15 no grupo
controle sendo que a maioria das mortes ocorreu nos pacientes com alcoolismo
associado Evidenciando que a maioria dos que desenvolve doenccedila crocircnica o faz
muito lentamente
Existem ainda no curso natural da doenccedila flutuaccedilotildees intensas e muito
frequumlentes que dependem dos viacuterus e dos hospedeiros a saber niacuteveis da viremia
genoacutetipos 1b graus de diversidade geneacutetica dos viacuterus vias de transmissatildeo (os
inoculados via transfusatildeo apresentam lesotildees hepatocelulares mais ativas)
(GORDON et al 1993 GORDON BAYATI SILVERMAN 1998) deficiecircncias
imunes alcoolismo e co-infecccedilatildeo com HBV e delta ou o Viacuterus da imunodeficiecircncia
humana (HIV) (LOPES 2010) Nestes uacuteltimos casos a co-infecccedilatildeo com muacuteltiplos
viacuterus das hepatites estaacute associada com mais graves lesotildees histoloacutegicas do fiacutegado do
que nos casos de VHC isoladas
Importa saber se os resultados obtidos com os controles feitos se mantecircm
por longos periacuteodos Ou seja como exemplos a atividade da ALT persistentemente
normal a variabilidade do RT-PCR a detecccedilatildeo de VHC RNA pela teacutecnica Reaccedilatildeo
de polimerase em cadeia (PCR) que pode ser negativa devido agrave inadequada
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armazenagem das amostras agrave contaminaccedilatildeo do soro com substacircncias que
interferem na leitura entre outras causas de erro
As informaccedilotildees sobre as causas que determinam o curso evolutivo da
doenccedila satildeo pouco conhecidas apesar dos progressos havidos no campo do
diagnoacutestico da infecccedilatildeo pelo VHC Uma questatildeo intrigante diz respeito agrave relaccedilatildeo
genotipo versus replicaccedilatildeo viral e graus de lesatildeo histoloacutegica Assim por exemplo o
genotipo 1 (1b) cursa com lesotildees histoloacutegicas mais graves independentemente da
carga viral Ainda mais os VHC RNA negativos no soro mesmo apoacutes anos de
cura podem recair pois neles persistem os viacuterus no fiacutegado em regime de
replicaccedilatildeo muito baixa indetectaacutevel pelos meacutetodos atuais Ao contraacuterio os negativos
no soro e no fiacutegado tecircm demonstrado respostas boas e sustentadas inclusive no
sentido de se fazer prognoacutestico de cura real e verdadeira infelizmente na grande
minoria dos casos
116 Diagnoacutestico
Quanto mais cedo o diagnoacutestico maiores as chances de detectar a
doenccedila Por isso eacute importante que as pessoas faccedilam o exame especiacutefico porque soacute
esse exame eacute que detecta a HCV E as mulheres tecircm que ter uma atenccedilatildeo em
especial Tempos atraacutes o Correio Braziliense (2003) publicou uma grande mateacuteria
sobre a quantidade de mulheres que vecircm sendo infectadas com a HCV Cuja causa
estava na esterelizaccedilatildeo mal feita dos equipamentos das manicures Uma soluccedilatildeo
praacutetica eacute as mulheres terem seu proacuteprio material pra fazer as unhas e natildeo deixar
mais ningueacutem utilizar (nem matildee nem irmatilde etc) Bem e quem tiver passado por
transfusatildeo dentistas manicures operaccedilotildees etc deve fazer o exame
(KARMOCHKINE et al 1998 apud CONTE 2000 KEER et al 1997)
A HCV natildeo eacute como a Siacutendrome da Imunodeficiecircncia Adquirida (AIDS)
que possui drogas com grande tecnologia e o doente pode viver por muitos e muitos
anos Com a HCV o paciente soacute tem chance de ficar bem se a doenccedila for
diagnosticada e tratada antes dela se manifestar Atualmente o tratamento usa uma
associaccedilatildeo de duas drogas ndash o Interferon e a Ribavirina ldquoAs chances de cura em
meacutedia satildeo de 50rdquo
Barbaro et al (1999) verificaram que os pacientes VHC genoacutetipos 1b
frequumlentemente apresentavam alteraccedilotildees ultraestruturais das mitococircndrias com
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depleccedilatildeo do mtDNA podendo comprometer o processo de fosforilizaccedilatildeo oxidativa
Sendo assim a produccedilatildeo aumentada de radicais livres nos pacientes VHC genoacutetipos
1b poderia atuar de modo negativo na evoluccedilatildeo da doenccedila hepaacutetica aumentando o
efeito citopaacuteticos do VHC Nesses pacientes haveria portanto aumento de
hiperoxidaccedilatildeo com consequumlente resistecircncia agrave accedilatildeo dos interferons e pior evoluccedilatildeo
da doenccedila hepaacutetica A ser confirmado este fato novas estrateacutegias terapecircuticas
poderatildeo vir a ser desenvolvidas no combate a essa doenccedila
Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila
poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses
autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis
vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo
hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja
quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a
concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave
hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em
parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)
Dos fatos acima expostos decorrem implicaccedilotildees tais como as respostas
CD8-CTL aos antiacutegenos VHC restritas aos complexos de histocompatibilidade
principais (MHC I) com inibiccedilatildeo ou mesmo insuficiente produccedilatildeo de complexo
peptiacutedeo VHC-MHC inibiccedilatildeo direta das ceacutelulas CTLK e a falta de resposta as
citoquininas entre outras dos vaacuterios mecanismos de escape existentes Dentro
desse contexto o niacutevel de morte celular natildeo seria alcanccedilado e a lesatildeo hepatocelular
consequumlente seria portanto miacutenima
Outra implicaccedilatildeo resultante consiste na induccedilatildeo de resposta imune
celular T Helper mediadas a partir de peptide vacinas contra o VHC Estas novas
vacinas tecircm a capacidade de gerar linfoacutecitos T citotoacutexico os CTLs contra o VHC em
camundongo imunizados com peptiacutedeos CTL e ceacutelulas HT epiacutetomes do core VHC
Esses estudos recente em animais de laboratoacuterio vecircm progredindo rapidamente
esperando-se em breve novos recursos no tratamento dessa doenccedila (AGNELLO et
al 1998)
25
12 DETERMINACcedilAtildeO DO GENOacuteTIPO DO VHC
O VHC constitui-se em uma famiacutelia heterogecircnea de viacuterus com no miacutenimo
seis genoacutetipos e inuacutemeros subtipos (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT
SANTOS SILVA 1999) Embora o meacutetodo de maior acuraacutecia para a determinaccedilatildeo
do genoacutetipo do VHC seja a identificaccedilatildeo completa da sequumlecircncia dos 9500
nucleotiacutedeos e a construccedilatildeo de uma aacutervore filogeneacutetica esse meacutetodo soacute pode ser
utilizado em laboratoacuterios de pesquisa (BARBOSA SILVA MARTINS 2005) e natildeo
em laboratoacuterios cliacutenicos Assim foram desenvolvidos meacutetodos para genotipagem
utilizando apenas as regiotildees mais conservadas do genoma como a proteiacutena do
envoltoacuterio (E1) a proteiacutena core e a proteiacutena natildeo estrutural NS5B A sequumlecircncia dos
nucleotiacutedeos dentro dessas regiotildees relativamente conservadas eacute genoacutetipo-
especiacutefico e os isolados podem ser genotipados independentemente da regiatildeo que
for utilizada para anaacutelise (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS
SILVA 1999) Para uso em laboratoacuterios cliacutenicos foram desenvolvidas basicamente
duas metodologias que se valem de teacutecnicas de biologia molecular (genotipagem)
ou citoloacutegicas (serotipagem)
Os meacutetodos que adotam teacutecnica de biologia molecular para genotipagem
utilizando porccedilotildees do genoma incluem a PCR aninhada (nested PCR) (BASSIT
SANTOS SILVA 1999) a teacutecnica de restriction fragment length polymorphism
(RFLP) (BARBOSA SILVA MARTINS 2005 BASSIT SANTOS SILVA 1999) a
hibridizaccedilatildeo reversa (BASSIT SANTOS SILVA 1999) (INNO-LiPA Innogenetics
Beacutelgica Gen Eti DEIA HCV Sorin Biomedica Itaacutelia) e o sequumlenciamento direto da
regiatildeo natildeo-codificante 5 (TruGene Visible Genetics Canadaacute) Suas principais
vantagens satildeo a informaccedilatildeo direta sobre sequumlecircncia dos nucleotiacutedeos do genoma
viral a alta sensibilidade por se basearem na PCR e a possibilidade de identificar o
subtipo viral (BARBOSA SILVA MARTINS 2005)
Os meacutetodos para determinaccedilatildeo do genoacutetipo que utilizam serotipagem
baseiam-se na detecccedilatildeo de anticorpos genoacutetipos-especiacuteficos contra epiacutetopos do
VHC (por exemplo proteiacutenas da regiatildeo do core) (BLOCK SCHIANO 1999) Os
testes comercializados utilizam diferentes teacutecnicas ELISA competitivos ou
immunoblot (Murex-HC1-6 Murex Diagnostics Ltd Reino Unido RIBA HCV
Serotyping Assay Chiron Diagnostics Estados Unidos) As principais vantagens da
teacutecnica de serotipagem satildeo o baixo custo e maior facilidade de realizaccedilatildeo em
26
comparaccedilatildeo com os testes de biologia molecular (BLOCK SCHIANO 1999 De
LARANAGA et al 2000)
A determinaccedilatildeo do genoacutetipo anteriormente utilizada em pesquisas mas
sem maior utilidade na praacutetica meacutedica atualmente eacute recomendada para uso cliacutenico
Como jaacute mencionado os pacientes infectados pelo genoacutetipo 1 do VHC devem ser
tratados por 12 meses enquanto os demais por 6 meses (BASSIT SANTOS SILVA
1999)
A determinaccedilatildeo do genoacutetipo do VHC pode ser feita por PCR ou
serotipagem A primeira teacutecnica eacute mais sensiacutevel e possibilita a identificaccedilatildeo de
subtipos do VHC Contudo a segunda eacute de mais faacutecil realizaccedilatildeo e mais barata
razatildeo pela que eacute importante que a teacutecnica seja aprimorada
Oliveira et al (1999) investigaram os padrotildees de distribuiccedilatildeo dos
genoacutetipos do VHC estudando 250 pacientes anti-VHC positivos atraveacutes da
detecccedilatildeo VHC RNA pelo RT-PCR e encontraram prevalecircncia de 72 para o VHC 1
253 para o tipo 3 2 para o 2 e 07 para o 4 semelhantes aos das vaacuterias
regiotildees mundiais
13 MANIFESTACcedilOtildeES EXTRA-HEPAacuteTICAS DA INFECCcedilAtildeO PELO VHC
As manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo pelo VHC satildeo as mais
variadas possiacuteveis A diversidade de resposta do hospedeiro ao agente infeccioso
variando desde quadros assintomaacuteticos ateacute aqueles com evoluccedilatildeo grave fatal ou
incapacitante tem estimulado a busca por justificativas de tais discrepacircncias
cliacutenicas sobretudo na imunomodulaccedilatildeo Dentre as infecccedilotildees mais bem estudadas
destacam-se aquelas pelos Viacuterus da hepatite C Viacuterus da imunodeficiecircncia humana1
(HIV-1) pelo Herpes viacuterus humano 4 (viacuterus do Epstein Baar) e pelo Mycobacterium
leprae (ABBAS LICHTMAN 2005)
A agressatildeo hepaacutetica por auto-imunidade eacute um fenocircmeno reconhecido em
vaacuterias doenccedilas do fiacutegado inclusive nas de etiologia viral Aleacutem do agente agressor e
de sua interaccedilatildeo com o sistema imunoloacutegico do hospedeiro fatores ambientais ou
hormonais estatildeo aparentemente envolvidos no surgimento de auto-imunidade
hepaacutetica como se supotildee acontecer na hepatite auto-imune em indiviacuteduos
geneticamente suscetiacuteveis (CODES et al 2002)
27
A lesatildeo hepatocelular relacionada agrave infecccedilatildeo pelos viacuterus hepatotroacutepicos e
pelos herpes viacuterus (citomegaloviacuterus e Epstein-Barr) eacute secundaacuteria a uma resposta
auto-imune do hospedeiro Estes viacuterus natildeo parecem ser diretamente citopaacuteticos
mas desencadeiam lesatildeo hepaacutetica atraveacutes da resposta imune do hospedeiro contra
ceacutelulas hepaacuteticas infectadas (MALOY POWRIE 2001)
Existem estudos que focalizam alteraccedilotildees imunoloacutegicas em hepatites
virais entretanto a maioria deles mostra resultados pontuais sem seguimento na
fase aguda da doenccedila (BLOCK SCHIANO 1999 McFARLONE et al 1990) Aleacutem
disso ainda natildeo se estabeleceu uma associaccedilatildeo entre as reaccedilotildees auto-imunes
transitoacuterias induzidas por viroses hepatotroacutepicas e agravamento do dano tecidual na
hepatite viral
A infecccedilatildeo crocircnica estaacute fortemente associada agrave crioglobulinemia mista
essencial glomerulonefrite membrano-proliferativa e porfiria cutacircnea tardia De
forma menos impressiva encontra-se tambeacutem associada agrave uacutelcera corneana de
Mooren liacutequen plano e fibrose pulmonar (KILLENBERG 2000 WENER et al 1996)
A ocorrecircncia de anticorpos antitireoidianos e hipotireoidismo tem sido relatada em
associaccedilatildeo com a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC em mulheres (KILLENBERG 2000
CACOUB et al 1999)
A associaccedilatildeo entre a infecccedilatildeo crocircnica pelo VHC a presenccedila do fator
reumatoacuteide e do anticorpo antinuclear (FAN) o fenocircmeno de Raynaud e doenccedilas
difusas do tecido conjuntivo (DDTC) como artrite reumatoacuteide luacutepus eritematoso
sistecircmico siacutendrome de Sjoumlgren e vasculites sistecircmicas eacute relatada em alguns
trabalhos (CACOUB et al 1999 LOVY STARKEBAUM UBEROI 1996 STAUB
1998 WENER et al 1996)
14 A ASSOCIACcedilAtildeO ENTRE DOENCcedilAS INFECCIOSAS E AUTOIMUNIDADE
A associaccedilatildeo entre doenccedilas infecciosas e autoimunidade apresentando-
se com manifestaccedilotildees cliacutenicas ou detectadas apenas pelo desenvolvimento de auto-
anticorpos tem sido amplamente documentado Infecccedilotildees virais bacterianas e
parasitaacuterias podem estar envolvidas no desenvolvimento recidivas e ateacute mesmo na
prevenccedilatildeo de doenccedilas auto-imunes (KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)
Ribeiro e Proietti (2004) avaliaram a frequumlecircncia de FR anticorpos
antipeptiacutedeo citrulinado ciacuteclico (anti-CCP) AAN anticorpos anti-citoplasma de
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neutroacutefilos (ANCA) anticorpos anticardiolipina (aCL) e anticorpos anti-β2
glicoproteiacutena I (anti-β2GPI) em pacientes com hanseniacutease Existe estudo
demonstrando pacientes que apresentavam manifestaccedilotildees articulares comparados
aos que natildeo apresentavam envolvimento articular e um grupo controle de indiviacuteduos
saudaacuteveis com idade e gecircnero semelhantes aos dos pacientes estudados e que
residiam na mesma aacuterea geograacutefica A maioria dos pacientes nos dois grupos (com
e sem envolvimento articular) apresentava hanseniacutease generalizada Entretanto
observaram uma baixa frequumlecircncia que natildeo foi significativamente diferente de FR
anti-CCP AAN e ANCA em pacientes com hanseniacutease (nos dois grupos) e normal
dos controles Mas a prevalecircncia de anticorpos aCL e anti-β2GPI estava
significativamente elevada nos pacientes com hanseniacutease quando comparados com
o grupo controle apesar de natildeo haver associaccedilatildeo significativa com o envolvimento
articular O isoacutetopo predominante dos dois autoanticorpos foi a IgM (487) dos
pacientes com hanseniacutease apresentava pelo menos um anticorpo antifosfoliacutepide
Aleacutem disso os autores observaram uma associaccedilatildeo entre a positividade para aCL e
as manifestaccedilotildees cliacutenicas jaacute que os pacientes com anticorpos aCL apresentavam
doenccedila Hanseniacutease generalizada (VV) com mais frequumlecircncia (p= 0002) Natildeo houve
associaccedilatildeo entre a presenccedila de anticorpos aCL ou anti-β2GPI e episoacutedios
reacionais poreacutem entre os pacientes com esses episoacutedios aqueles com anticorpos
aCL apresentavam eritema nodoso hansecircnico (ENH) em 100 dos casos enquanto
entre os pacientes negativos para aCL 57 apresentavam ENH Apesar de uma
alta taxa de concordacircncia para a presenccedila de anticorpos aCL e anti-β2GPI ter sido
observada manifestaccedilotildees tromboemboacutelicas natildeo foram observadas (RIBEIRO
PROIETTI 2004 2005)
Horimoto e Costa (2009) avaliaram pacientes com Leishmania
(leishmaniose visceral e leishmaniose cutacircnea) para a presenccedila de anticorpos anti-
Leishmania assim como FR AAN anti-DNA anti-Sm anti-RNP anti-Ro anti-La
aCL e complemento (C3 e C4) Como esperado os pacientes com leishmaniose
visceral apresentava anticorpos anti-Leishmania Tiacutetulos significativamente elevados
de AANs na maioria dos pacientes o anti-DNA foi detectado em poucos pacientes
com doenccedila visceral assim como tiacutetulos elevados de anticorpos aCL (isotipo IgG)
quando comparados com os pacientes com leishmaniose cutacircnea Niacuteveis reduzidos
de complemento tambeacutem satildeo evidentes na doenccedila visceral assim como niacuteveis
significativamente reduzidos de C3 Outros estudos comparam e discutem os
29
resultados em relaccedilatildeo agrave crescente evidecircncia na literatura da presenccedila de
autoanticorpos em ambas as doenccedilas Em geral a prevalecircncia variaacutevel de auto-
anticorpos relatada assim como relatos preacutevios na literatura podem estar
relacionados a diferenccedilas metodoloacutegicas como o tipo de ensaio utilizado a
definiccedilatildeo dos pontos de corte inativaccedilatildeo dos soros pelo calor seleccedilatildeo de pacientes
e variaccedilotildees eacutetnicas e geograacuteficas nos grupos de pacientes Mas um dos resultados
consistentes foi a frequumlecircncia significativamente mais elevada de anticorpos
antifosfoliacutepide aCL e anti-β2GPI em pacientes com hanseniacutease enquanto
anticorpos AAN e aCL foram detectados com mais frequumlecircncia nos pacientes com
leishmaniose visceral A incidecircncia aumentada de anticorpos AAN e aCL nos
pacientes com leishmaniose visceral eacute compatiacutevel com outros estudos (OSSADRON
et al 2006 SAKKAS et al 2008 VOULGARI et al 2004) e demonstra
semelhanccedilas das manifestaccedilotildees cliacutenicas e laboratoriais entre a leishmaniose
visceral e o luacutepus eritematoso sistecircmico (LES) Aleacutem disso a reatividade cruzada
entre AAN e anticorpos anti-Leishmania jaacute foi tambeacutem relatada (GRANEL et al
2000)
Diversos grupos documentaram niacuteveis elevados de anticorpos
antifosfoliacutepide (aCL anti-β2GPI e anti-protrombina) em diversas doenccedilas
infecciosas como a siacutefilis doenccedilas virais (incluindo a hepatite C Parvoviacuterus B19 e
HIV) malaacuteria e hanseniacutease sem as manifestaccedilotildees cliacutenicas da siacutendrome
antifosfoliacutepide (SAF) (ZANDMAN-GODDARD BLANK SHOENFELD 2002) Os
tiacutetulos elevados geralmente satildeo transitoacuterios diminuindo e desaparecendo apoacutes a
resoluccedilatildeo da infecccedilatildeo (LOIZOU et al 2003 ZANDMAN-GODDARD BLANK
SHOENFELD 2002) Mas em uma minoria dos pacientes a associaccedilatildeo entre
doenccedilas infecciosas e anticorpos antifosfoliacutepide pode levar a complicaccedilotildees severas
frequumlentemente fatais ou seja SAF catastroacutefica (ZANDMAN-GODDARD BLANK
SHOENFELD 2002)
Os resultados de Ribeiro e Proietti (2005) mostrando um aumento da
incidecircncia de anticorpos anti-β2-GPI em pacientes com hanseniacutease associados aos
dados de outros grupos (De LARANAGA et al 2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK
et al 1994 LOIZOU et al 2003) que tambeacutem documentaram niacuteveis elevados de
anticorpos anti-2βGPI lanccedilam duacutevidas sobre a noccedilatildeo de que os anticorpos aCL
associados a infecccedilotildees satildeo independentes dos anticorpos anti-β2GPI e natildeo
dependentes desses anticorpos como nas doenccedilas auto-imunes Em conjunto
30
esses resultados apoacuteiam a noccedilatildeo de que na presenccedila de infecccedilotildees anticorpos aCL
satildeo heterogecircneos em relaccedilatildeo agrave sua dependecircncia da 2GPI (De LARANAGA et al
2000 FIALLO et al 1998 HOJNIK et al 1994 LOIZOU et al 2003) e as infecccedilotildees
podem desencadear a induccedilatildeo de anticorpos antifosfoliacutepide patogecircnicos em
indiviacuteduos predispostos (LOIZOU et al 2003)
A produccedilatildeo de autoanticorpos na hanseniacutease e leishmaniose pode ser
explicada por diversos mecanismos Na forma mais generalizada dessas doenccedilas
(hanseniacutease VV e leishmaniose visceral) os pacientes apresentam
hipergamaglobulinemia difusa semelhante agrave vista em outras infecccedilotildees como
Schistosoma mansoni T cruzi e Plasmodium A induccedilatildeo de autoanticorpos pode ser
atribuiacuteda agrave ativaccedilatildeo policlonal e proliferaccedilatildeo das ceacutelulas B algumas com auto-
reatividade pertencentes agrave biblioteca de anticorpos naturais em indiviacuteduos normais
(ARGOV et al 1989) Na leishmaniose antiacutegenos soluacuteveis derivados da L major e
L donovani satildeo mitogecircnicos e desencadeiam a produccedilatildeo de imunoglobulinas com
auto-reatividade (ARGOV et al 1989) Crioglobulinemia mista induzida pelo HCV eacute
outro exemplo de ativaccedilatildeo policlonal persistente levando a uma mistura de
autoanticorpos policlonais e monoclonais os quais causam doenccedilas auto-imunes
(AGMON-LEVIN et al 2009)
Mimetismo molecular ou homologias estruturais entre infecccedilotildees e
componentes do hospedeiro podem ser agrave base da produccedilatildeo de autoanticorpos
como no caso da febre reumaacutetica onde o componente M da membrana do
estreptococo apresenta homologia com peptiacutedeos cardiacuteacos cerebrais e sinoviais A
associaccedilatildeo da siacutendrome de Guillain-Barreacute com a infecccedilatildeo pelo Campylobacter
jejeuni representa outro exemplo de mimetismo molecular como base de uma
manifestaccedilatildeo auto-imune A reatividade cruzada entre agentes infecciosos e auto-
antiacutegenos jaacute foi demonstrada para o M leprae (McADAM MUDD SHOENFELD
1984) e M tuberculosis (SHOENFELD et al 1986) e a inibiccedilatildeo de anticorpos anti-
Sm anti-RNP e anti-SSB por promastigotas intactas de Leishmania apoacuteia a
homologia entre antiacutegenos nucleares e a Leishmania (ARGOV et al 1989)
A disseminaccedilatildeo de epiacutetopos a emergecircncia de novos anticorpos ou a
resposta de ceacutelulas T a um novo epiacutetopo (subdominante ou criacuteptico) no mesmo
antiacutegeno ou em outro antiacutegeno foi demonstrada em modelos experimentais e na
doenccedila humana alguns autores demonstraram a disseminaccedilatildeo molecular do
antiacutegeno Sm para reatividade anti-RNP (STAUB 1998) no LES enquanto na febre
31
reumaacutetica o estado de autoimunidade crocircnica que afeta as vaacutelvulas cardiacuteacas pode
resultar em uma resposta imunoloacutegica contra o colaacutegeno e laminina (KIVITY et al
2009 PORDEUS et al 2008) As infecccedilotildees tambeacutem podem desempenhar um papel
importante na induccedilatildeo da autoimunidade atraveacutes da liberaccedilatildeo de antiacutegenos
sequumlestrados apoacutes lesatildeo tecidual ou aumentando a exibiccedilatildeo de epiacutetopos criacutepticos
no meio inflamatoacuterio apresentando assim novos antiacutegenos ao sistema imunoloacutegico
(KIVITY et al 2009 PORDEUS et al 2008)
15 FREQUumlEcircNCIA E IMPLICACcedilOtildeES DOS AUTO-ANTICORPOS EM HEPATITES
AGUDAS VIRAIS
O conceito de auto-imunidade induzida por viacuterus natildeo eacute exclusivo para
doenccedilas hepaacuteticas O viacuterus Coxsackie do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um
terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite infecciosa e estaacute implicado nas miocardites
auto-imunes reagindo contra a miosina cardiacuteaca (GIST BELL 1974) Niwa et al
(1984) encontraram elevaccedilatildeo transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator
reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas
virais comuns como varicela sarampo influenza caxumba herpes zoster e
exantema suacutebito
A patogecircnia da infecccedilatildeo viral inclui pelo menos trecircs tipos de interaccedilotildees
com o hospedeiro vertebrado 1) o efeito do agente sobre as ceacutelulas 2) a maneira
de disseminaccedilatildeo do agente no organismo infectado 3) a resposta imunoloacutegica e a
sua influencia no processo infeccioso Destacam-se dois tipos principais da
interaccedilatildeo a destruiccedilatildeo celular e a resposta imunoloacutegica (FIGUEIREDO 1999
CATALAN-SOARES PROIETTI CARNEIRO-PROIETTI 2006) O viacuterus Coxsackie
do grupo B eacute responsaacutevel por mais de um terccedilo dos casos cliacutenicos de miocardite
infecciosa e estaacute implicado nas miocardites auto-imunes reagindo contra a miosina
cardiacuteaca (GERSHON KONDO 1971) Niwa et al (1984) encontraram elevaccedilatildeo
transitoacuteria de auto-anticorpos incluindo fator reumatoacuteide fator antinuacutecleo anticorpo
anti-DNA (tiacutetulos acima de 140) em doenccedilas virais comuns como varicela sarampo
influenza caxumba herpes zoster e exantema suacutebito
32
16 ANTICORPOS ANTINUCLEARES - FATOR ANTINUCLEAR ndash FAN
De acordo com o II Consenso Brasileiro de FAN em HEp 2
(DELLAVANCE et al 2003) os AAN satildeo encontrados comumente em uma
variedade de doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Satildeo uacuteteis na investigaccedilatildeo dessas
doenccedilas auxiliando no diagnoacutestico de patologias como LES esclerose sistecircmica
progressiva (ESP) doenccedila mista do tecido conjuntivo (DMTC) siacutendrome de Sjoumlgren
(SS) polimiosite e dermatomiosite
Eles podem estar presentes em um pequeno percentual da populaccedilatildeo
aparentemente sadia essa frequumlecircncia eacute maior em mulheres e aumenta com a idade
Segundo a literatura a positividade entre 20 a 60 anos varia entre percentuais mais
altos (133) para tiacutetulos baixos e mais baixos (33) para tiacutetulos mais elevados
(DELLAVANCE et al 2003)
A pesquisa dos anticorpos antinucleares pode ser realizada por diferentes
teacutecnicas a imunofluorescecircncia indireta eacute a mais utilizada por sua sensibilidade
reprodutibilidade e facilidade de execuccedilatildeo A sensibilidade aumenta
significativamente quando se utiliza como substrato lacircminas com ceacutelulas Hep 2
(ceacutelulas de carcinoma de laringe humana) por causa da maior expressatildeo de
antiacutegenos na superfiacutecie dessas ceacutelulas comparados aos expressos nas ceacutelulas de
fiacutegado ou de rins de camundongos que se utilizavam anteriormente
Em geral eacute possiacutevel detectar melhor a presenccedila de AAN por associaccedilatildeo
de trecircs anti-soros isotipos especiacuteficos (anti-IgG anti-IgA e anti-IgM) A pesquisa
realizada por essa teacutecnica serve de triagem inicial para a presenccedila de AAN Eacute
normalmente denominada pesquisa de FAN ou AAN
A realizaccedilatildeo de outras metodologias tais como as imunoenzimaacuteticas
permite uma avaliaccedilatildeo isolada dos diferentes auto-anticorpos sugeridos pelos
padrotildees de fluorescecircncia encontrados no FAN A identificaccedilatildeo desses AAN permite
um diagnoacutestico mais preciso e eles podem ser utilizados em muitos casos como
marcador para uma das diferentes doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Muitas dessas
patologias apresentam um perfil distinto de auto-anticorpos que auxilia o diagnoacutestico
A presenccedila de FAN positivo em pessoas aparentemente sadias pode ser
devida a algumas situaccedilotildees
minus Doenccedila auto-imune precoce ainda natildeo expressa clinicamente
33
minus distuacuterbio imunoloacutegico transitoacuterio causado por doenccedila natildeo-imune
tais como infecccedilotildees principalmente virais
minus uso de medicamentos e neoplasias
minus manifestaccedilatildeo incompleta de uma siacutendrome ou seja o paciente
sintetiza o anticorpo poreacutem esse quadro natildeo evolui para doenccedila
minus fenocircmeno auto-imune fisioloacutegico
O resultado do FAN eacute expresso em tiacutetulo e padratildeo uma vez que ambos
os paracircmetros tecircm importacircncia para a avaliaccedilatildeo do significado cliacutenico do exame O
tiacutetulo do FAN corresponde agrave maior diluiccedilatildeo capaz de demonstrar fluorescecircncia
inequiacutevoca e didaticamente pode ser dividido em
minus Baixo menor 180
minus Moderado 1160
minus Moderadamente elevado 1320
minus Alto maior 1640
Nas pesquisas realizadas por imunofluorescecircncia indireta os resultados
satildeo expressos em tiacutetulos segundo as diluiccedilotildees empregadas Eacute possiacutevel trabalhar
utilizando-se como limite tiacutetulos de 140 que permitem maior sensibilidade ou de
180 que permitem maior especificidade ou seja um menor nuacutemero de falso-
positivos
Na praacutetica cliacutenica satildeo considerados significativos tiacutetulos superiores a
1160 Os resultados com tiacutetulos positivos satildeo acompanhados pela descriccedilatildeo do
padratildeo de fluorescecircncia encontrado que serve como orientaccedilatildeo da presenccedila de um
antiacutegeno especiacutefico e em alguns casos como padratildeo diagnoacutestico Em determinadas
situaccedilotildees em especial no LES em atividade pode ocorrer agrave observaccedilatildeo de mais de
um padratildeo de fluorescecircncia
O padratildeo do FAN a seu turno aponta uma probabilidade maior ou menor
de doenccedila auto-imune e ateacute mesmo sugere o antiacutegeno nuclear envolvido e por
consequumlecircncia a afecccedilatildeo com ele mais relacionada Os padrotildees homogecircneo
centromeacuterico e pontilhado grosso satildeo os mais indicativos de processos de
autoimunidade uma vez que se associam a diversas condiccedilotildees reumaacuteticas
especialmente ao LES e agrave esclerose sistecircmica e tambeacutem a enfermidades hepaacuteticas
tais como a cirrose biliar primaacuteria e a hepatite auto-imune (KILLENBERG 2000)
34
Jaacute o pontilhado fino o pontilhado grosso reticulado e a membrana nuclear
tecircm maior significado quando encontrados em tiacutetulos altos uma vez que podem
estar presentes em tiacutetulos baixos em indiviacuteduos hiacutegidos Por sua vez o pontilhado
fino denso mesmo quando elevado em pessoas assintomaacuteticas soacute guarda relaccedilatildeo
com alguma doenccedila em cerca de 20 dos casos (DELLAVANCE et al 2003)
O padratildeo pontilhado pode tambeacutem ser referido como padratildeo salpicado
Outros padrotildees de fluorescecircncia podem ser encontrados em menor frequumlecircncia Os
pontilhados citoplasmaacutetico grossos ou reticulares associados agrave presenccedila de
anticorpos antimitococircndrias em pacientes com cirrose biliar primaacuteria o
citoplasmaacutetico homogecircneo relacionado a proteiacutenas ribossocircmicas em pacientes com
LES e o padratildeo pontilhado fino citoplasmaacutetico que pode estar associado agrave
presenccedila de anticorpos anti-JO-1 anti-PCNA e proteiacutenas da membrana celular em
pacientes com LES outras patologias do tecido conjuntivo e hepatopatias auto-
imunes (DELLAVANCE et al 2003)
Quadro 1 - Padrotildees de fluorescecircncia encontrados em maior frequumlecircncia e patologias relacionadas
Padrotildees de Fluorececircncia Antiacutegenos Patologias Relacionadas
Perifeacuterico DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES
Homogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA
LES AR lupus induzido por drogas
Perifeacutericohomogecircneo DNA de dupla heacutelice ou de heacutelice uacutenica histona e RNA LES
Pontilhado grosso SM RNP LES DMTC
Pontilhado fino nuclear SS-A (RO) SS-B (La) SS LES
Nucleolar Proteiacutenas Nucleolares ESP Centromeacuterico Proteiacutenas de centrocircmeros Siacutendrome de CREST
Fonte Dellavance et al 2003 Quadro 2 - Anti-ena - auto-anticorpos contra antiacutegenos extraiacutedos do nuacutecleo e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleares Patologias Relacionadas SM LES RNP DMTC LES ESP AR e Polimiosite
SS-A (Ro) SS LES lupus neonatal e forma cutacircnea subaguda
SS-B (La) SS LES luacutepus neonatal e forma cutacircnea subaguda
Scl 70 ESP Jo -1 Polimiosite e dermatomiosite Fonte Dellavance et al 2003
35
Quadro 3 ndash Padrotildees de FAN nuclear e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes
Padrotildees Nucleares Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos
Nuclear Pontilhado Centromeacuterico Anticorpo anti-centrocircmero Esclerose Sistecircmica forma CREST Cirrose Biliar Primaacuteria
Nuclear homogecircneo Anticorpo anti-DNA nativo Lupus Eritematoso Sistecircmico (LES) Anticorpo anti-Histoma LES induzido por drogas LES idiopaacutetico Anticorpo anti-cromatina (DNAHistona Nucleossomo) Artrite Reumatoacuteide (AR) Artrite Idiopaacutetica Juvenil importante associaccedilatildeo com uveiacutete na forma oligoarticular Siacutendrome de Felty Cirrose Billar Primaacuteria
Nuclear tipo membrana nuclear contiacutenua Anticorpo anti-Iamin e contra envelope nuclear - Iamins Hepatites auto-imunes Raramente associado a doenccedilas reumaacuteticas (algumas formas de LES e esclerodermia linear)
Nuclear pontilhado pleomoacuterficoPCNA Anticorpo contra nuacutecleo de ceacutelulas em proliferaccedilatildeo LES
Nuclear pontilhado fino denso Anticorpo anti-proteina p 75 kDa pode ser encontrado em indiviacuteduos saudaacuteveis processos inflamatoacuterios inespeciacuteficos doenccedilas reumaacuteticas auto-imunes Cistite Intersticial Dermatite Atoacutepica Psoriacutease e Asma
Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos
Anticorpo anti-p80 coilina natildeo apresenta associaccedilatildeo cliacutenica definida
Nuclear pontilhado tipo pontos isolados com menos de dez pontos
Anticorpo anti-Sp100 (anti-p95) Cirrose Biliar Primaacuteria pode ocorrer em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas
Nuclear pontilhado grosso Anticorpo anti-Sm LES Anticorpo anti-RNP criteacuterio obrigatoacuterio no diagnostico da doenccedila mista do Tecido conjuntivo (DMTC) tambeacutem ocorre no LES Esclerose Sistecircmica (ES) e AR
Nuclear pontilhado fino Anticorpo anti SSARo Siacutendrome de Sjogren Primaacuteria (SS) LES Lupus neonatal e Lupus Cutacircneo Subagudo Anticorpo anti-SSBLa Lupus neonatal LES SS Anticorpo anti-Mi-2 Dermatomiosite embora raramente ocorra na polimiosite do adulto
Fonte Dellavance et al 2003
36
Quadro 4 - Padrotildees de FAN citoplasmaacuteticos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes
Padrotildees Citoplasmaacuteticos e Relacionados ao Aparelho Mitoacutetico Relevacircncia Clinica por Auto-Anticorpos
Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina Hepatite auto-imune Cirrose Anticorpo anti-miosine Hepatite C Hepatocarcionoma Miastenia Gravis Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida
Citoplasmaacutetico Fibrilar Segmentar Anti actinina anti--vinculina e anti-tropomiose Miastenia Gravis Doenccedila de Crohn e Colite ulcerativa Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia cliacutenica definida
Citoplasmaacutetico Pontilhado Polar Anticorpo Anti-golginas (cisternas do aparelho de Golgi) raro no LES SS e outras doenccedilas auto-imunes sistecircmicas Relato na Ataxia Cerebelar Idiopaacutetica Degeneraccedilatildeo Cerebelar Paraneoplaacutesica infecccedilotildees virais pelo Epstein Barr (EBV) e pelo viacuterus da imunodeficiecircncia Humana (HIV) Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida
Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Anticorpo anti-Histidill t RNA sintetase (Jo-1) anticorpo marcador de Polimiosite no adulto Descrito raramente na Dermatomiosite
Citoplasmaacutetico Pontilhado com Pontos Isolados
Anticorpo anti-EEA1 e anti-fosfatidilserina natildeo haacute associaccedilotildees clinicas bem definida Anticorpo anti-GWBSS tambeacutem encontrado em diversas outras condiccedilotildees cliacutenicas
Citoplasmaacutetico Pontilhado Reticulado Anticorpo anti-mitococircndria Cirrose Biliar Primaacuteria Esclerose Sistecircmica Eacute relativamente comum o encontro deste padratildeo na ausecircncia de anticorpos anti-mitococircndria
Citoplasmaacutetico Pontilhado Fino Denso Anti PL7PL12 Raramente associado a Polimiosite Anticorpo P-ribossomal Este padratildeo ocorre no LES se a associaccedilatildeo eacute com anti-proteina P ribossomal
Citoplasmaacutetico Fibrilar Filamentar Anticorpo anti-vimentina e anti-queratina Anti-queratina eacute o anticorpo mais importante em doenccedila hepaacutetica alcooacutelica Descritos em vaacuterias doenccedilas inflamatoacuterias e infecciosas Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica definida
Aparelho mitoacutetico Tipo Centriacuteolo Anticorpo anti-enolase em baixos tiacutetulos natildeo tem associaccedilatildeo cliacutenica definida Em altos tiacutetulos eacute sugestivo de Esclerose Sistecircmica
Aparelho mitoacutetico Tipo ponte Intercelular
Anticorpo anti Tubulina Pode ser encontrado no LES e na DMTC outros anticorpos ainda natildeo bem definidos podem gerar o mesmo padratildeo
Aparelho mitoacutetico Tipo NuMa2 Anticorpo anti-HsEg5 diversas condiccedilotildees auto-imunes com baixa especificidade
Fonte Dellavance et al 2003
37
Quadro 5 - Padrotildees de FAN mistos e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Mistos Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos
Misto do tipo nucleolar homogecircneo e nuclear pontilhado grosso com placa metafaacutesica decorada em anel (cromossomos negativos)
Anticorpo anti-Ku Superposiccedilatildeo Polimiose e Esclerose Sistecircmica Podem ocorrer no LES e Esclerodermia
Misto do tipo nuclear e nucleolar pontilhado com placa metafaacutesica positiva
Anticorpo anti-topoisomerase (Scl-70) ES forma difusa Mais raramente pode ocorrer na Siacutendrome CREST e superposiccedilatildeo PolimiositeEsclerodermia
Misto do tipo Citoplasmaacutetico pontilhado fino denso e homogecircneo e nucleolar homogecircneo
Anticorpo anti rRNP LES frequumlentemente relacionado agrave Psicose Luacutepica
Misto do tipo nuclear pontilhado fino com fluorescecircncia do aparelho mitoacutetico
Anticorpo anti-NuMA1SS pode ocorrer tambeacutem em outras condiccedilotildees auto-imunes ou inflamatoacuterias crocircnicas
Fonte Dellavance et al 2003
Quadro 6 - Padrotildees de FAN nucleolares e relevacircncias cliacutenicas mais frequumlentes Padrotildees Nucleolares Relevacircncia Clinica por Auto-anticorpos
Nucleolar Aglomerado
Anticorpo anti-Fibrilarina (U3-nRNP) Esclerose Sistecircmica (ES) especialmente com comprometimento visceral grave entre eles a hipertensatildeo pulmonar
Nucleolar Pontilhado
Anticorpo anti-NOR-90 ES tambeacutem descrito em outras doenccedilas do tecido conjuntivo poreacutem sem relevacircncia clinica definida Anticorpos anti-RNA polimerase I ES de forma difusa com tendecircncia para comprometimento visceral mais frequumlente e grave
Nucleolar Homogecircneo
Anticorpo anti-PMScl Siacutendrome de Superposiccedilatildeo de Polimiosite com Esclerose Sistecircmica Raramente encontrado em casos de Polimiosite ou Esclerose Sistecircmica sem superposiccedilatildeo cliacutenica Outros auto-anticorpos mais raros podem apresentar esse padratildeo
Fonte Dellavance et al 2003
De acordo com o 3deg Consenso (DELLAVANCE et al 2009) foram
comunicados dois novos padrotildees de fluorescecircncia por participantes Vaacuterios outros
membros testemunharam jaacute haver observado esses padrotildees O primeiro trata-se de
um padratildeo nuclear pontilhado fino aproximando-se da textura homogecircnea e com
placa metafaacutesica corada da mesma forma Sua associaccedilatildeo cliacutenica e identidade
imunoloacutegica natildeo estatildeo definidas Sua importacircncia deriva do fato de que pode ser
facilmente confundido com o padratildeo pontilhado fino denso e com o padratildeo
homogecircneo O segundo trata-se de um padratildeo citoplasmaacutetico em forma de
pequenos bastotildees (rods) e ciacuterculos (rings) que aparentemente estaacute associado agrave
38
infecccedilatildeo pelo HCV Haacute estudos em curso por alguns grupos de pesquisa com a
finalidade de estabelecer sua identidade imunoloacutegica
Como ainda natildeo estatildeo definitivamente caracterizados esses dois novos
padrotildees foram considerados preliminares e o 3deg Consenso recomendou que os
mesmos fossem completamente caracterizados e apresentados na proacutexima versatildeo
do Consenso (DELLAVANCE et al 2009)
39
2 JUSTIFICATIVA
As inflamaccedilotildees do fiacutegado provocadas pelos viacuterus hepatotroacutepicos atingem
milhotildees de pessoas e representam significativos problemas de sauacutede puacuteblica em
todo o mundo No Brasil a Regiatildeo Norte responde por um significativo percentual
dos portadores de hepatite C Dentre as manifestaccedilotildees extra-hepaacuteticas da infecccedilatildeo
pelo viacuterus C as doenccedilas autoimunes tecircm significativo impacto na evoluccedilatildeo cliacutenica
desses pacientes A presenccedila de anticorpo antinuacutecleo eacute um marcador importante de
autoimunidade e apesar de existirem trabalhos relatando a pesquisa desse fator em
portadores de viacuterus C tais estudos ainda natildeo foram realizados na nossa regiatildeo
sobretudo correlacionando-se com o genoacutetipo do viacuterus responsaacutevel pela infecccedilatildeo
considerando que o genoacutetipo eacute um marcador de resposta ao tratamento ou
considerando que pacientes portadores do genoacutetipo 1 natildeo respondem
satisfatoriamente ao tratamento instituiacutedo pelo protocolo atual
21 ASPECTOS EacuteTICOS
A pesquisa a ser realizada apresenta relevacircncia social e natildeo perde o
sentido de sua destinaccedilatildeo soacutecio-humanitaacuteria (justiccedila e equidade)
Este trabalho adequa-se aos princiacutepios cientiacuteficos que o justificam e
apresenta possibilidade concreta de responder a incertezas tais como FAN e o
genoacutetipo viral em pacientes com infecccedilatildeo pelo viacuterus da hepatite C ldquoestatildeo
relacionadosrdquo
Segue rigorosamente os procedimentos descritos na Resoluccedilatildeo 19696-
CNSMS (BRASIL 1996) assegurando a confidenciabilidade e proteccedilatildeo da
identidade do sujeito da pesquisa no momento da afericcedilatildeo dos dados e sua
posterior utilizaccedilatildeo
Por tratar-se de um estudo que faraacute somente revisatildeo de soroteca os
participantes natildeo seratildeo submetidos a riscos de origem orgacircnica eou quiacutemica
40
3 OBJETIVOS
31 OBJETIVO GERAL
Estabelecer associaccedilatildeo entre a presenccedila de teste de FAN e o genoacutetipo
viral em pacientes portadores de infecccedilatildeo pelo HCV
32 OBJETIVOS ESPECIacuteFICOS
I Identificar o padratildeo de fluorescecircncia do FAN em pacientes com diagnoacutestico
laboratorial de infecccedilatildeo pelo HCV
II Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados
pelo HCV de acordo com o gecircnero e a idade
III Identificar a prevalecircncia de FAN em pacientes infectados pelo HCV e natildeo
infectados
IV Distribuir a prevalecircncia de FAN e o Genoacutetipo viral em pacientes infectados
pelo HCV de acordo com as alteraccedilotildees bioquiacutemicas
41
4 MATERIAL E MEacuteTODOS
41 GRUPOS POPULACIONAIS ESTUDADOS (POPULACcedilAtildeO DO ESTUDO)
Foi realizado um estudo transversal analiacutetico no Serviccedilo do Nuacutecleo de
Medicina Tropical da Universidade Federal do Paraacute (NMTUFPA) utilizando-se
pacientes oriundos da Fundaccedilatildeo Centro de Hemoterapia e Hematologia do Paraacute
(HEMOPA) e Plano de Assistecircncia ao Servidor (PASIASEP) com coleta de material
bioloacutegico para reconfirmaccedilatildeo do diagnoacutestico de hepatite C no periacuteodo de janeiro de
2009 a maio de 2010
411 Pacientes com diagnoacutestico laboratorial de Hepatite C
A populaccedilatildeo de estudo consistiu de 51 pacientes admitidos no NMTUFPA
para reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica tratamento cliacutenico e acompanhamento ambulatorial
de ambos os gecircneros e independente da idade sem exclusatildeo dos pacientes com a
presenccedila de patologias associadas agrave condiccedilatildeo maior (motivadora da pesquisa)
oriundos da Fundaccedilatildeo HEMOPA e PAS
A amostra do grupo foi selecionada a partir da relaccedilatildeo dos prontuaacuterios
catalogados no laboratoacuterio de patologia do NMTUFPA
Os dados foram coletados atraveacutes dos resultados dos exames realizados
no soro de cada paciente O protocolo de coleta teve enfoque na identificaccedilatildeo
individual do paciente bem como a avaliaccedilatildeo cliacutenica dos resultados
412 Grupo de natildeo infectados
Foi utilizado um grupo controle de 100 amostras de soro de indiviacuteduos
doadores de sangue com sorologias negativas para HIV 1 e 2 HTLV 1 e 2 Siacutefilis
Doenccedilas de Chagas Hepatite B e para Hepatite C procedentes da fundaccedilatildeo
HEMOPA
42
42 MEacuteTODO
421 Obtenccedilatildeo do material bioloacutegico
Foram colhidos em frasco sem anticoagulante 10ml de sangue perifeacuterico
dos 51 pacientes participantes da pesquisa A amostra sanguiacutenea de cada paciente
foi centrifugada o soro foi separado e colocado em frasco esteacuteril devidamente
identificado armazenado e resfriado de 2 a 8ordmC
Foi realizada no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais a
pesquisa soroloacutegica de anticorpos IgG anti-HCV por teste imunoenzimaacutetico (ELISA)
e os pacientes que apresentaram positividade tiveram seus resultados confirmados
atraveacutes de teacutecnicas moleculares (RT-PCR) e com identificaccedilatildeo do genoacutetipo viral
(genotipagem)
Foi realizado no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa a pesquisa
de FAN dos 51 pacientes selecionados utilizando as amostras existentes na
soroteca
422 Diagnoacutestico soroloacutegico da hepatite C
Foram empregados testes soroloacutegicos de ELISA (Ensaio
Imunoenzimaacutetico) de 3ordf geraccedilatildeo utilizando-se de kits comerciais (kit ETI-AB-HCVK-
4 DiaSorin Itaacutelia) para detecccedilatildeo de anticorpos especiacuteficos anti-HCV no soro dos
pacientes
As tiras (poccedilos) necessaacuterias para as reaccedilotildees foram retiradas da geladeira
com antecedecircncia de uma hora e deixadas agrave temperatura ambiente e os reagentes
homogeneizados rapidamente no voacutertex
O primeiro poccedilo da placa ficou o branco da reaccedilatildeo na sequecircncia da
microplaca de ELISA foi dispensado 200 microL do controle negativo em triplicata (trecircs
poccedilos) 200 microL do calibrador em duplicata (dois poccedilos) e 200 microL do controle positivo
em amostra uacutenica (um poccedilo)
Adicionou-se 200 microL do Diluente de Amostra em todos os poccedilos que
continham as amostras dos pacientes a serem dosadas na placa de ELISA
tomando cuidado para natildeo contaminar os poccedilos adjacentes
43
Dispensou-se 50 microL do Diluente do Reagente em todos os poccedilos de
controles calibradores e amostras cobrimos com adesivo para evitar evaporaccedilatildeo e
contaminaccedilatildeo das amostras e incubamos a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC
Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com
300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem diluiacuteda
Pipetou-se 100 microL de Conjugado Enzimaacutetico exceto no poccedilo do branco e
incubou-se a microplaca de ELISA por 45 min a 37ordmC Apoacutes incubaccedilatildeo lavou-se
cada poccedilo da microplaca de 4 a 5 vezes com 300 microL da Soluccedilatildeo de Lavagem
diluiacuteda
Pipetou-se 100 microL de CromoacutegenoSubstrato em todos os poccedilos
Incubamos a microplaca protegendo-a de luz intensa e direta agrave temperatura
ambiente (18-24ordmC) por 15 min
Pipetou-se 100 microL de Aacutecido Sulfuacuterico em todos os poccedilos para ldquopararrdquo a
reaccedilatildeo enzimaacutetica e mediu-se a absorbacircncia da soluccedilatildeo obtida em leitor de ELISA
com filtro de 450 nM
O teste foi validado de acordo com os valores do controle de qualidade
preconizados pelo fabricante e que devem tanger os valores para o branco da
reaccedilatildeo le 0100 controle negativo le 0050 controle positivo ge 1000 e calibrador ge
1100 Para as amostras testadas os valores reagentes e natildeo reagentes para
pesquisa de anticorpos anti-HCV satildeo interpretados da seguinte maneira natildeo
reagentes com valores le 09 reagentes com valores ge 11 e indeterminados entre
os valores 09 ndash 11
423 Detecccedilatildeo dos aacutecidos nucleacuteicos do viacuterus da hepatite C por biologia molecular
Nas amostras positivas pela sorologia (ELISA) realizou-se extraccedilatildeo do
RNA viral presente no soro do paciente utilizando kit comercial (QIAmp Viral RNA
kit Quiagen Alemanha) seguindo a teacutecnica adaptada no Laboratoacuterio de Patologia
Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais
Pipetou-se 560 microL de tampatildeo AVL (lise) contendo RNA em tubo de
centriacutefuga de 15 ml identificado adicionou-se 140 microL da amostra e homogenizou-se
em voacutertex por 15s incubando a temperatura ambiente (15-25degC) por 10 min Apoacutes
incubaccedilatildeo centrifugou-se rapidamente o tubo para remover partiacuteculas dispersas
44
Adicionou-se 560 microL de etanol (96-100) na amostra e homogenizou-se
no voacutertex por 15s centrifugando-se rapidamente para remover partiacuteculas dispersas
Depois cuidadosamente transferiu-se 630 microL para as colunas devidamente
identificadas centrifugou-se a 14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo
ficando soacute com a coluna para encaixar em outro tubo
Colocou-se o resto das amostras nas colunas devidas centrifugou-se a
14000 rpm por 1 min e descartou-se a parte de baixo ficando soacute com a coluna para
encaixar em outro tubo Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW1) e
centrifugou-se por 1 min mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo
Lavou-se com 500 microL de tampatildeo da lavagem (AW2) e centrifugou-se por 4 min
mantendo-se a coluna e descartando-se a parte de baixo
Identificados os tubos para RNA colocou-se as colunas Adicionou-se 60
microL de tampatildeo para eluir (AVE) em cada amostra e centrifugou-se por 1 min
descartando a coluna e ficando com o tubo Colocou-se em banho-maria por 10 min
a 65degC centrifugado rapidamente e colocado no gelo As amostras extraiacutedas foram
congeladas e armazenadas em freezer a -20ordmC
O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado de acordo com a teacutecnica de
RT-PCR qualitativa com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica das
Doenccedilas Tropicais da seguinte maneira para o Mix de uma amostra Tampatildeo 12
microL primer ou iniciador k10 1microL primer ou iniciador k11 1microL aacutegua ultrapura livre de
DNAse e RNAse 5 microL Enzima Taq polymerase One-Step (Invitrogen) 1 microL O
primer k10 constitui-se da sequecircncia GGC GAC ACT CCA CCA TRR e o primer k11
da sequecircncia GGT GCA CGG TCT ACG AGA CC
O volume do mix por amostra eacute de 20 microL e o volume da amostra (produto
da extraccedilatildeo) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As amostras
foram colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo eacute realizada a 42ordmC por 45 minutos
temperatura inicial de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 2 minutos seguida de 35 ciclos com
temperatura de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 54ordmC por 30
segundos de extensatildeo a 72ordmC por 45 segundos e temperatura de extensatildeo final de
72ordmC por 7 minutos e um hold de 4ordmC
Para visualizaccedilatildeo do produto dessa 1ordf PCR (RT-PCR) eacute feito um gel de
agarose a 1 (1g de agarose para 100mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de
etidium) que migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os
resultados foram visualizados atraveacutes de luz ultravioleta (UV) Os pacientes
45
positivos que apresentarem ldquobandardquo devem continuar os procedimentos e os
negativos que natildeo apresentarem ldquobandasrdquo deveratildeo ser liberados como
indetectaacuteveis por este meacutetodo
A 2ordf PCR (RFLP) foi responsaacutevel por fazer a amplificaccedilatildeo do cDNA
produto da 1ordf PCR Para esta etapa tambeacutem com adaptaccedilotildees feitas no Laboratoacuterio
de Patologia Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais foram necessaacuterios para o Mix de uma
amostra Tampatildeo 10X 25 microL DNTP 4 microL MgCl2 15 microL primer ou iniciador k15 1
microL primer ou iniciador k16 1 microL aacutegua ultrapura livre de DNAse e RNAse 125 microL
Enzima Taq platinum (Invitrogen) 05 microL O primer k15 constitui-se da sequecircncia
ACC ATR RAT CAC TCC CCT GT e o primer k16 da sequecircncia CAA GCA CCC TAT
CAG GCA GT
O volume do mix por amostra foi de 23 microL e o volume da amostra
(produto da 1ordf PCR) de 2 microL perfazendo um volume total por tubo de 25 microL As
amostras satildeo colocadas em termociclador e a reaccedilatildeo se realiza a temperatura inicial
de desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 4 minutos seguida de 35 ciclos com temperatura de
desnaturaccedilatildeo a 94ordmC por 30 segundos de anelamento a 55ordmC por 45 segundos de
extensatildeo a 72ordmC por 1 minuto e temperatura de extensatildeo final de 72ordmC por 7
minutos e um hold de 4ordmC
O produto da 2ordf PCR eacute observado atraveacutes de um gel de agarose a 1 (1g
de agarose para 100 mL de tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que
migrou na cuba de eletroforese com 100V 500A por 60 minutos Os resultados
foram visualizados atraveacutes de luz UV (ultravioleta) Os pacientes positivos que
apresentaram ldquobandardquo (fragmento amplificado) se continuou os procedimentos e os
negativos que natildeo apresentaram ldquobandasrdquo foram repetidos para o procedimento da
2ordf PCR
424 Determinaccedilatildeo do genoacutetipo do viacuterus (genotipagem)
Os pacientes positivos para a 2ordf PCR foram submetidos agrave genotipagem
do viacuterus atraveacutes do meacutetodo de RFLP utilizando um par de enzimas de restriccedilatildeo
AVA II e RSA I Essa teacutecnica tambeacutem foi adaptada no Laboratoacuterio de Patologia
Cliacutenica das Doenccedilas Tropicais
46
Na determinaccedilatildeo do genoacutetipo cada amostra eacute utilizada duas vezes
sendo uma reaccedilatildeo para AVA II e uma para RSA I portanto cada amostra teve dois
tubos correspondentes
Para a preparaccedilatildeo do mix de uma amostra para a enzima de restriccedilatildeo
AVA II (Promega) foram utilizados Buffer C X 30 2 microL aacutegua ultrapura livre de
DNAse e RNAse 125 microL AVA II 05 microL Para o mix de uma amostra de RSA I
(Invitrogen) satildeo necessaacuterios React 1 10X 2 microL aacutegua ultrapura libre de DNAse e
RNAse 11 microL RSA I 2 microL
O volume do mix por amostra foi de 15 microL e o volume da amostra
(produto da 2ordf PCR) de 5 microL perfazendo um volume total por tubo de 20 microL para
cada frasco correspondente a sua enzima de restriccedilatildeo As amostras formatildeo ldquoparesrdquo
de tubos AVA II e RSA I e satildeo colocadas em banho-maria a 37ordmC overnight para
digerir (cortar) os fragmentos
Para visualizaccedilatildeo do produto da digestatildeo (RFLP) e verificaccedilatildeo dos
genoacutetipos foi preparado um gel de agarose a 2 (2g de agarose para 100 mL de
tampatildeo TEB 1X e 3 microL de brometo de etidium) que migrou em cuba de eletroforese
com 100V 500A por 60 minutos Os resultados foram visualizados atraveacutes de luz UV
(ultravioleta) Os pacientes positivos apresentam ldquobandasrdquo (fragmentos) de
tamanhos diferentes O nuacutemero de bandas e sua disposiccedilatildeo no gel formaram
padrotildees de combinaccedilotildees correspondentes a cada genoacutetipo viral
425 Teacutecnica da pesquisa de auto-anticorpos antinucleares (FAN) em ceacutelulas HEp-2
A pesquisa de auto-anticorpo contra antiacutegenos celulares foi realizada no
Laboratoacuterio de Patologia Cliacutenica Amaral Costa pela teacutecnica de imunofluorescecircncia
indireta que os identifica atraveacutes da ligaccedilatildeo destes auto-anticorpos aos antiacutegenos do
substrato sendo esta ligaccedilatildeo revelada pela adiccedilatildeo de um soro com atividade Anti-
IgG conjugado agrave fluoresceiacutena
As amostras foram testadas utilizando-se um conjunto diagnoacutestico
comercial Antinuclear Antibody HEp-2 da Hemagen Diagnostics
Na primeira fase da reaccedilatildeo os soros diluiacutedos 140 colocados em contato
com o substrato durante 20 minutos seguido de lavagem com soluccedilatildeo salina
tamponada por 10 minutos Na segunda fase aplicacou-se a substacircncia
47
fluorescente sendo o conjugado diluiacutedo 130 deixando-se por 10 minutos seguida
de nova lavagem de 10 minutos e montagem da lacircmina com glicerina tamponada
Em cada lacircmina foram utilizados controle positivo e controle negativo
A leitura das lacircminas foi realizada em microscoacutepio de imunofluorescecircncia
marca Nikon modelo Eclipse E-200
Os criteacuterios morfoloacutegicos observados durante a leitura foram
a) aspecto da matriz nuclear
b) aspecto do nucleacuteolo
c) observaccedilatildeo de todos os estaacutegios de divisatildeo nuclear
d) aspecto do fuso mitoacutetico
e) aspecto do citoplasma
43 ANAacuteLISE ESTATIacuteSTICA
Os dados coletados foram estruturados em um banco de dados no qual
tambeacutem foram confeccionadas tabelas e graacuteficos para representaccedilatildeo dos dados
Posteriormente foram analisados no programa Bioestat 50 para a geraccedilatildeo de
resultados estatiacutesticos que comprovassem a associaccedilatildeo de variaacuteveis pertinentes ao
estudo considerando o intervalo de confianccedila (IC) 95 e niacutevel α 5 (p-valor le 005)
isto eacute um achado seraacute considerado estatisticamente significante se valor de ldquoprdquo for
menor ou igual a 005 e seraacute considerado sem significacircncia estatiacutestica se esse valor
de ldquoprdquo for maior que 005
Nas variaacuteveis quantitativas foram realizadas as medidas de tendecircncia
central sendo calculado a meacutedia e a mediana com seus respectivos desvios
padrotildees O teste t foi usado para comparar as idades entre as amostras
O teste do Qui-quadrado e o teste G foram aplicados nas comparaccedilotildees de
n amostras independentes cujas proporccedilotildees observadas nas diversas modalidades
estiveram dispostas em tabelas de contigecircncia l x c onde se determinou as
proporccedilotildees observadas nas diferentes categorias e se estas tinham alguma
associaccedilatildeo
48
5 RESULTADOS
O Padratildeo de FAN em 100 dos 51 pacientes infectados pelo HCV e em
2 dos natildeo infectados pelo HCV ocorreu Citoplasmaacutetico
Com relaccedilatildeo agrave distribuiccedilatildeo dos pacientes por gecircnero observou-se uma
predominacircncia do gecircnero masculino (667) A faixa etaacuteria predominante foi a de 30
a 50 anos de idade (628) seguida da faixa etaacuteria compreendida entre 51 e 60
anos (196) No que diz respeito agrave naturalidade houve uma predominacircncia de
paraenses em 922 da amostra A maioria dos pacientes incluiacutedos no estudo foi
proveniente da Fundaccedilatildeo HEMOPA (98) por se tratarem de candidatos a doaccedilatildeo
de sangue (Tabela 1)
Tabela 1- Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV segundo as caracteriacutesticas demograacuteficas janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Caracteriacutesticas demograacuteficas n Teste estatiacutestico Gecircnero
Masculino 34 667 Qui-quadrado Feminino 17 333 p = 00251
Total 51 1000
Idade (anos) lt 30 6 118 Qui-quadrado
30 a 40 16 314 p = 00094 41 a 50 16 314 51 a 60 10 196
gt 60 3 59 Total 51 1000
Naturalidade
Paraense 47 922 Qui-quadrado Macapaense 1 20 p lt 00001 Maranhense 1 20
Pernambucano 1 20 Gauacutecho 1 20
Total 51 1000
Procedecircncia Qui-quadrado HEMOPA 50 980 p lt 00001
IASEP 1 20 Total 51 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
49
Identificou-se no estudo a predominacircncia do genoacutetipo viral do tipo 1
(882) estando o genoacutetipo 3 presente em 118 dos casos Em 255 dos
pacientes foi observado uma positividade para FAN sendo que todos apresentaram
o padratildeo citoplasmaacutetico (Tabela 2)
Tabela 2 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes portadores de HCV conforme os resultados laboratoriais de FAN citoplasmaacutetico e genotipagem janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Exames laboratoriais n Teste estatiacutestico
Genoacutetipo viral - HCV
Tipo 1 45 882 Qui-quadrado
Tipo3 6 118 p lt 00001
Total 51 1000
FAN Qui-quadrado
Positivo (citoplasmaacutetico) 13 255 p = 00008
Negativo 38 745 Total 51 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
Observou-se uma baixa positividade para o FAN tanto no gecircnero
masculino (294) quanto no gecircnero feminino (176) Natildeo houve diferenccedila
estatiacutestica significante entre os gecircneros e a anaacutelise do FAN (p = 05652) Isto eacute
independendo do gecircnero do paciente nada se poderaacute inferir se o mesmo teraacute maior
ou menor chance de possuir um FAN positivo ou negativo (Tabela 3)
Tabela 3 ndash Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
FAN (citoplasmaacutetico)
Gecircnero Teste estatiacutestico
(Teste G) Masculino Feminino
N N
Positivo 10 294 3 176
Negativo 24 706 14 824 p = 05652
Total 34 1000 17 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
Dentre os pacientes infectados o genoacutetipo viral tipo 1 e o tipo 3
predominaram no gecircnero masculino embora natildeo havendo diferenccedila significativa
entre os grupos (p=06376)(Tabela 4)
50
Tabela 4 - Relaccedilatildeo da genotipagem de acordo com o gecircnero dos pacientes janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Gecircnero
Grupos estudados Teste estatiacutestico
(Teste G) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3
n n Masculino 29 644 5 833 p=06376 Feminino 16 356 1 167
Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa
Na faixa etaacuteria de 30 a 50 anos foi observada uma maior proporccedilatildeo (667)
do genoacutetipo viral do tipo 3 enquanto que para o genoacutetipo tipo 1 foi de 628 natildeo
tendo essa diferenccedila significacircncia estatiacutestica (Tabela 5)
Tabela 5 - Distribuiccedilatildeo dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e faixa etaacuteria - janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)
Idade (anos) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n
lt 30 04 118 0 00
30 a 40 15 314 3 500 p = 06401
41 a 50 15 314 1 167
51 a 60 08 196 2 333
gt 60 03 59 0 00 Total 45 1000 6 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
A anaacutelise descritiva das idades dos pacientes demonstrou que a meacutedia e
a mediana foi de 43 anos para aqueles com genoacutetipo viral tipo 1 no entanto para o
genoacutetipo viral tipo 3 a meacutedia foi de 44 e a mediana de 42 anos Observou-se que a
idade miacutenima dos pacientes com genoacutetipo viral-HCV do tipo 1 e 3 foi
respectivamente de 20 e 32 anos e a maacutexima foi de 68 e 57 anos perfazendo uma
amplitude total de 48 e 25 anos respectivamente Natildeo houve significacircncia estatiacutestica
entre as idades encontradas nos genoacutetipos 1 e 3 (Tabela 6 )
De acordo com o FAN citoplasmaacutetico a idade miacutenima dos pacientes com
FAN positivo e negativo foi respectivamente de 30 e 20 anos e a maacutexima foi de 53 e
68 anos perfazendo uma amplitude total de 23 e 48 anos respectivamente As
idades meacutedia e mediana foram respectivamente 435 e 46 anos nos pacientes com
o FAN positivo e meacutedia de 43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN
51
negativo Natildeo houve diferenccedila estatisticamente significativa entre as idades
encontradas nos pacientes com FAN positivo e negativo (Tabela 6)
Tabela 6 - Estudo descritivo da idade dos pacientes de acordo com o genoacutetipo viral e presenccedila do FAN citoplasmaacutetico janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Grupos Estudados Genoacutetipo viral - HCV Auto anticorpo
Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 FAN (+) FAN (-) IDADE
Tamanho da amostra 45 6 13 38
Idade miacutenima 20 32 30 20
Idade maacutexima 68 57 53 68
Amplitude Total 48 25 23 48
Meacutedia Aritmeacutetica 43 44 435 43
Mediana 43 42 46 42
Desvio Padratildeo 107 93 78 113
Teste t p = 08363 p = 08809 Fonte Protocolo da pesquisa
Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos em que foram analisados AST
ALT ASTALT γ-GT e fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo
semelhantes dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e 3 natildeo
atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos
(Tabela 7)
Tabela 7- Distribuiccedilatildeo dos genoacutetipos dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Paracircmetros bioquiacutemicos
Genoacutetipo viral - HCV Teste estatiacutestico
(Teste t) Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3
micro plusmn DP micro plusmn DP
AST 353 plusmn 219 328 plusmn 137 p = 07907
ALT 372 plusmn 321 288 plusmn 136 p = 05355
ASTALT 12 plusmn 07 14 plusmn 11 p = 06110
γ-GT 403 plusmn 38 302 plusmn 138 p = 02194
Fosfatase alcalina 1126 plusmn 443 1087 plusmn 376 p = 08349
Fonte Protocolo da pesquisa
Com relaccedilatildeo aos paracircmetros bioquiacutemicos de AST ALT ASTALT γ-GT e
fosfatase alcalina identificou-se uma distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os
52
pacientes com FAN positivo e negativo natildeo sendo observada significacircncia
estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os grupos de FAN (Tabela 8)
Tabela 8 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico dos pacientes de acordo com os paracircmetros bioquiacutemicos janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
Paracircmetros bioquiacutemicos Auto anticorpos
Teste estatiacutestico (Teste t) Positivo Negativo
micro plusmn DP micro plusmn DP
AST 419 plusmn 238 326 plusmn 197 p = 01704
ALT 408 plusmn 29 346 plusmn 312 p = 05347
ASTALT 13 plusmn 08 12 plusmn 07 p = 05732
γ-GT 34 plusmn 21 409 plusmn 40 p = 04369
Fosfatase alcalina 1073 plusmn 345 1138 plusmn 462 p = 06431 Fonte Protocolo da pesquisa
Na comparaccedilatildeo entre resultados positivos e negativos do FAN
citoplasmaacutetico observou-se uma maior prevalecircncia da negatividade tanto em
pacientes natildeo infectados (98) como em pacientes infectados (745) pelo HCV
sendo essa diferenccedila estatisticamente significativa (plt00001) o que representa
uma natildeo associaccedilatildeo entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV
(Tabela 9)
Tabela 9 - Distribuiccedilatildeo do FAN citoplasmaacutetico segundo a presenccedila ou ausecircncia de infecccedilatildeo por HCV janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
FAN (citoplasmaacutetico)
Pacientes Teste estatiacutestico (Teste G)
Infectados Natildeo infectados
N n
Positivo 13 255 2 2
Negativo 38 745 98 98 p lt 00001
Total 51 1000 100 1000
Fonte Protocolo da pesquisa
Comparando-se os resultados do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos
viras observa-se que o resultado negativo eacute superior ao positivo em ambos os
genoacutetipos virais sendo 711 para o genoacutetipo viral 1 e 100 para o genoacutetipo viral 3
No entanto esta diferenccedila observada natildeo eacute estatisticamente significativa (p=02573)
(Tabela 10)
53
Tabela 10 - Distribuiccedilatildeo do FAN de acordo com o genoacutetipo viral janeiro 2009 a maio 2010 Beleacutem ndash Paraacute
FAN (citoplasmaacutetico)
Grupos estudados Teste estatiacutestico (Teste G)
Genoacutetipo 1 Genoacutetipo 3 n n
Positivo 13 289 0 00 p=02573 Negativo 32 711 6 1000
Total 45 1000 6 1000 Fonte Protocolo da pesquisa
54
6 DISCUSSAtildeO
Desde o primeiro marcador soroloacutegico para diagnoacutestico do Lupus
Eritematoso Sistecircmico (LES) a ceacutelula LE descrita por Hargraves (1948) vaacuterios
substratos antigecircnicos foram utilizados para o estudo dos auto-anticorpos os quais
terminaram amplamente substituiacutedos pelas ceacutelulas HEp-2 Estas apresentam
significativas vantagens sobre os demais pela sua sensibilidade variedade de
antiacutegenos presentes e pelas facilidades morfoloacutegicas para o seu estudo
O uso da imunofluorescecircncia indireta para a visualizaccedilatildeo dos anticorpos
antinucleares nas ceacutelulas HEp-2 permite o reconhecimento de mais de 30 diferentes
padrotildees de fluorescecircncia como nucleares nucleolares da membrana nuclear do
aparelho mitoacutetico e citoplasmaacutetico todos satildeo proporcionados por diferentes auto-
anticorpos
A partir do 1deg Consenso Brasileiro para Padronizaccedilatildeo dos Laudos de FAN
(HEp-2) os criteacuterios para o preparo interpretaccedilatildeo da fluorescecircncia e nomenclatura
dos resultados passaram a ser normatizados Alguns padrotildees de fluorescecircncia satildeo
relativamente inespeciacuteficos outros satildeo ocasionados por uma gama restrita de auto-
anticorpos e outros ainda por um uacutenico auto-anticorpo (DELLAVANCE et al
2002) Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a tornaacute-las
imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo (DE
LARANAGA et al 2000)
Apesar do padratildeo de fluorescecircncia na maioria das vezes natildeo se pode
identificar o anticorpo presente ele pode sugerir ao cliacutenico qual o proacuteximo passo a
ser dado na investigaccedilatildeo da sua especificidade Os resultados encontrados devem
estar em associaccedilatildeo com a cliacutenica os padrotildees de fluorescecircncia e os tiacutetulos
alcanccedilados com a diluiccedilatildeo preacutevia (DELLAVANCE et al 2003)
No presente estudo a analise de 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo Viacuterus da
Hepatite C esteve presente o anticorpo-antinuclear (ANA FAN) em 13 (255) dos
pacientes e todos eram padratildeo citoplasmaacutetico corroborando com outros estudos
encontrados na literatura como
Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de
pacientes infectados pelo viacuterus HIV com Hanseniacutease e co-infectados com
Hanseniacutease HIV Ela obteve respectivamente as seguintes taxas de prevalecircncias
32 333 e 478 Em todos os grupos neste estudo houve predomiacutenio do
55
padratildeo citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear soacute foi observado entre os pacientes com
hanseniacutease (91) e co-infectados (237)
Bichara (2009) analisou a prevalecircncia de ANA-Hep-2 em 3 grupos de
pacientes infectados pelo viacuterus da Dengue e viacuterus linfotroacutepico de ceacutelulas T humanas
HTLV-12 e controle Normais e obteve respectivamente as seguintes taxas de
prevalecircncias 40 40 e 2 Em todos os grupos houve predomiacutenio do padratildeo
citoplasmaacutetico e o padratildeo nuclear foi observado entre os pacientes com dengue
(67) e HTLV 12 (133)
Segundo Andrade et al (2002) Dellavance et al (2005) Dellavance e
Andrade et al (2007) o predomiacutenio do padratildeo de FAN do tipo citoplasmaacutetico indica
que determinados padrotildees de fluorescecircncia satildeo mais especiacuteficos de doenccedila auto-
imune enquanto outros ocorrem em indiviacuteduos com enfermidades natildeo auto-imunes
por ser o citoplasma celular rico em proteiacutenas para as quais auto-anticorpos naturais
apresentam afinidade moderada eacute comum observar positividade para FAN em
indiviacuteduos sadios cujo significado ainda natildeo eacute entendido completamente
O padratildeo Citoplasmaacutetico Fibrilar Linear Anticorpo anti-actina que pode ser
encontrado em Hepatite auto-imune Cirrose Hepatite C Hepatocarcionoma entre
outros Quando em tiacutetulos baixos ou moderados podem natildeo ter relevacircncia clinica
definida Um resultado positivo pode estar ou natildeo associado a uma patologia assim
como poderaacute ou natildeo vir a apresentar uma doenccedila auto-imune com o passar do
tempo (DELLAVANCE et al 2003) Neste estudo natildeo foi feito avaliaccedilatildeo prospectiva
dos resultados embora todos sejam FAN citoplasmaacuteticos
Os achados de FAN positivo em populaccedilotildees sadias ou sem doenccedilas auto-
imunes tambeacutem jaacute observado por Leser et al (2004) que em 394 pacientes com
FAN-HEp-2 positivo natildeo encontraram nenhum paciente com doenccedila auto-imune
Outro exemplo estaacute no padratildeo citoplasmaacutetico de pontos isolados
estudado por Laurino et al (2006) presente em indiviacuteduos sem evidecircncia de auto-
imunidade mas tambeacutem em indiviacuteduos com acometimento de doenccedilas auto-imunes
sistecircmicas e natildeo-especiacuteficas
Os dados apresentados corroboram com este estudo em que foi
observado a presenccedila do auto-anticorpo em 2 (2 ) dos 100 indiviacuteduos sadios do
grupo controle todos com padratildeo citoplasmaacutetico
56
Os viacuterus podem ainda modificar proteiacutenas do hospedeiro de forma a
tornaacute-las imunogecircnicas ativando o sistema imunoloacutegico e causando auto-reaccedilatildeo
(DE LARANAGA et al 2000)
Nas Infecccedilotildees agudas espera-se que a resposta auto-imune diminua a
medida que os viacuterus satildeo eliminados Entretanto alguns trabalhos sugerem que em
indiviacuteduos geneticamente susceptiacuteveis as reaccedilotildees auto-imunes possam persistir
apesar do clareamento viral uma vez que o gatilho imunoloacutegico foi ativado e natildeo
houve desativaccedilatildeo (DE LARANAGA et al 2000 SAKKAS et al 2008)
Ramos-Casals et al (2009) no estudo Doenccedilas Sistecircmica Auto-Imunes
em Pacientes com Infecccedilatildeo pelo (72) dos pacientes eram do gecircnero feminino e
(28) do masculino(ANA FAN) em 61 dos pacientes o que se diferem deste
trabalho eacute que dos 51 pacientes com Infecccedilatildeo pelo (667) eram do gecircnero
masculino e (333) eram do gecircnero feminino com meacutedia de idade de 430 (plusmn107)
anos com presenccedila de anticorpo-antinuclear em 13 (255) com meacutedia e mediana
respectivamente de 435 e 46 anos nos pacientes com o FAN positivo e meacutedia de
43 anos e mediana de 42 anos nos pacientes com o FAN negativo
Alter (1995) em sua pesquisa natildeo observou associaccedilatildeo entre o risco de
infecccedilatildeo e as variaacuteveis demograacuteficas designadas por gecircnero idade e raccedila Na
referida pesquisa foram estudados 51 pacientes com idade meacutedia de 430 (+- 107)
anos 34 (667) eram do gecircnero masculino e 17 (333) do gecircnero feminino todos
em fase preacute-tratamento assintomaacuteticos natildeo permitindo avaliar os risco da
infecccedilatildeoSegundo Pordeus et al (2008) a ocorrecircncia destes auto-anticorpos
indicaria um prognoacutestico desfavoraacutevel Perperas Mcfarlane e Mcsorley (1986)
sugeriram que os auto-anticorpos poderiam estar envolvidos na progressatildeo ou no
desenvolvimento de hepatites crocircnicas possivelmente por um distuacuterbio no controle
da auto-reatividade Outros estudos questionam a participaccedilatildeo dos auto-anticorpos
no processo de transiccedilatildeo para cronicidade das hepatites agudas virais poreacutem os
resultados natildeo satildeo convincentes (SHOENFELD ROSE 2004)
Lopez Seia e Roy (1998) demonstraram a presenccedila de anticorpo anti-
actina em baixos tiacutetulos em crianccedilas com hepatite aguda por curto periacuteodo de
tempo poreacutem nenhuma associaccedilatildeo com gravidade da agressatildeo hepaacutetica foi
descrita
Neste estudo a presenccedila dos auto-anticorpos em (255) dos pacientes
com infecccedilatildeo pelo HCV natildeo puderam ser relacionada com a gravidade da doenccedila
57
pois este estudo foi realizado em pacientes receacutem diagnosticados entatildeo seria
necessaacuterio um acompanhamento destes por um periacuteodo maior de tempo com a
finalidade de concluir esta afirmativa Apesar da presenccedila transitoacuteria de auto-
anticorpos jaacute ter sido descrita em doenccedilas virais comuns a associaccedilatildeo entre a
presenccedila de auto-anticorpos e a gravidade das doenccedilas necessita de comprovaccedilatildeo
Passaleva Massai e Leoncini (1983) avaliaram 302 pacientes com
hepatites agudas virais e encontraram complexos imunes circulantes (CIC) em
516 dos pacientes com frequumlecircncia significativamente maior em hepatite aguda
Nenhuma associaccedilatildeo entre a presenccedila de imuno-complexos e o niacutevel de
aminotransferases ou bilirrubina foi encontrada Segundo Andrade et al (2002)
Dellavance et al (2005) Andrade et al (2007) nos pacientes do estudo foi feita a
relaccedilatildeo entre a presenccedila dos auto-anticorpos e niacuteveis de aminotransferases e as
elevaccedilotildees natildeo tiveram significacircncia poreacutem houve associaccedilatildeo do genotipo viral 1
Nos paracircmetros bioquiacutemicos analisados em relaccedilatildeo aos genoacutetipos houve uma
distribuiccedilatildeo semelhante dos achados entre os pacientes com genoacutetipo viral tipo 1 e
3 natildeo atestando significacircncia estatiacutestica quando realizada as comparaccedilotildees entre os
grupos Segundo Wilson (1997) trecircs estudos mostraram correlaccedilatildeo entre niacuteveis
altos de alanina aminotransferase e atividade histoloacutegica da doenccedila hepaacutetica
Poreacutem nos pacientes considerados individualmente o valor preditivo dessa
associaccedilatildeo foi baixo enquanto muitos deles com enzimas normais apresentavam
graves alteraccedilotildees histoloacutegicas No presente estudo natildeo foi observada associaccedilatildeo entre os niacuteveis de
aminotransferases e a cronificaccedilatildeo da hepatite viral pois nem todos os pacientes do
estudo apresentavam resultado de bioacutepsia hepaacutetica
Alter et al (1999) afirmam que no Brasil predominam os genoacutetipos 1a e 1b
(63) e 3a (313) em estudo realizado em Goiacircnia onde foi observada uma
maior prevalecircncia do genoacutetipo 1 seguida do genoacutetipo 3 em doadores de sangue e
hemofiacutelicos (DELLAVANCE ANDRADE et al 2007) Estando esses dados em
acordo com esta pesquisa que com genotipagem do viacuterus da hepatite C que
identificou o genoacutetipo 1 em 45 (882) seguidos pelo genoacutetipo 3 que foi
identificado em 6 (118) dos pacientes com infecccedilatildeo pelo HCV Em um estudo realizado na Franccedila com 13 pacientes luacutepicas infectadas
pelo viacuterus C 8 apresentavam o RNA viral sendo o genoacutetipo 1 presente em cinco
58
(625) casos seguido do genoacutetipo 3 (375) (PERLEMUTER et al 2000) dados
que se assemelham aos do presente estudo embora o estudo natildeo tenha incluiacutedo
pacientes com outras infecccedilotildees associadas ao HCV Eacute importante ressaltar que
estudos sobre genotipagem do HCV em indiviacuteduos com doenccedilas reumaacuteticas satildeo
raros
No presente estudo houve uma frequumlecircncia baixa de positividade para o
FAN nos pacientes com genoacutetipo 1 e genoacutetipo 3 Natildeo havendo significacircncia
estatiacutestica entre os pacientes com genoacutetipo 1 e 3
Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter
implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave menor
resposta agrave terapia antiviral (BRUNO et al1997) o que natildeo foi avaliado neste estudo
pois apesar de (882) dos pacientes serem genoacutetipo 1 todos estavam em fase de
reconfirmaccedilatildeo diagnoacutestica seja preacute- tratamento Agnello et al (1998) acreditam que a infecccedilatildeo persistente nessa doenccedila
poderia ser devida agrave baixa percentagem de replicaccedilatildeo viral nos hepatoacutecitos Esses
autores usaram nova teacutecnica de hibridizaccedilatildeo in situ para detectar VHC RNA seis
vezes mais especiacutefica do que a do RT-PCR Concluem que a extensatildeo da infecccedilatildeo
hepatociacutetica varia inversamente ao iacutendice de atividade histoloacutegica (IAH) ou seja
quando esta for miacutenima aquela seraacute maacutexima No entanto nesses casos a
concentraccedilatildeo de VHC nos hepatoacutecitos seraacute muito baixa Esses achados levam agrave
hipoacutetese de que a infecccedilatildeo persistente no fiacutegado pode ser causada ao menos em
parte por essa mesma baixa replicaccedilatildeo viral (AGMON-LEVIN et al 2009)
59
7 CONCLUSOtildeES
minus O padratildeo dos auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares encontrados nos
dois grupos estudados foi o citoplasmaacutetico
minus A prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos celulares no grupo com
infecccedilatildeo pelo VHC foi significativamente maior do que no grupo controle
minus Nos resultados de FAN citoplasmaacutetico haacute uma maior prevalecircncia da
negatividade em pacientes infectados pelo HCV e natildeo infectados sendo
essa diferenccedila estatisticamente significativa conferindo a natildeo associaccedilatildeo
entre positividade de FAN citoplasmaacutetico e infecccedilatildeo pelo HCV
minus Os resultados negativos do FAN citoplasmaacutetico entre os genoacutetipos viras eacute
superior aos positivos em ambos os genoacutetipos virais entretanto esta diferenccedila
natildeo eacute estatisticamente significativa
minus Houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos
celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado
minus Natildeo houve diferenccedila entre a prevalecircncia de auto-anticorpos contra antiacutegenos
celulares entre o grupo infectado com VHC e o grupo dos natildeo infectado com
relaccedilatildeo ao gecircnero onde predominou o gecircnero masculino nos dois grupos
minus Eacute possiacutevel que o predomiacutenio do genoacutetipo 1 nesta populaccedilatildeo possa ter
implicaccedilotildees cliacutenico-terapecircuticas visto que este genoacutetipo tem sido associado agrave
menor resposta agrave terapia antiviral o que natildeo foi avaliado neste estudo pois
os pacientes estavam em fase preacute tratamento sugerindo que estes pacientes
sejam avaliados futuramente
minus A formaccedilatildeo dos auto-anticorpos parece ser mais uma consequumlecircncia do que
uma causa da agressatildeo hepaacutetica
minus A negatividade do FAN ndash Hep 2 foi maior que a positividade mas todos os
FAN positivos pertenciam ao genoacutetipo viral tipo 1 nos pacientes infectados
pelo HCV
minus Nesta pesquisa os resultados de PCR o RNA-HCV de reconfirmaccedilatildeo foi
positivo para o anti-HCV em todos os soros analisados mostrando assim
que estes pacientes eram portadores de infecccedilatildeo por viacuterus C ou seja natildeo
houve falso positivo anteriormente poreacutem todos eram assintomaacuteticos
dificultando a conclusatildeo de ser ou natildeo uma infecccedilatildeo persistente
60
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APEcircNDICES
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APEcircNDICE A - TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Vocecirc estaacute sendo convidado para fazer parte de uma pesquisa que estaacute sendo desenvolvida pela Universidade Federal do Paraacute no Nuacutecleo de Medicina Tropical intitulada AUTOANTICORPOS CONTRA ANTIacuteGENOS CELULARES E SUA CORRELACcedilAtildeO COM O GENOacuteTIPO VIRAL EM PACIENTES COM INFECCcedilAtildeO PELO VIacuteRUS DA HEPATITE C (HCV)
O Objetivo da pesquisa eacute fazer uma correlaccedilatildeo do anticorpo antinuacutecleo (FAN) e o genoacutetipo viral em pacientes com hepatite C e o estaacutegio da doenccedila hepaacutetica a partir da histologia sempre que permitidos e correlacionar ao diagnoacutestico
Caso vocecirc participe da pesquisa seraacute necessaacuterio que forneccedila uma amostra de sangue (2ml)
O uacutenico inconveniente que vocecirc poderaacute experimentar eacute a dor provocada pela agulha na hora da coleta de sangue bem como pequenos hematomas que possam vir a ocorrer e que natildeo causam danos
Essa pesquisa natildeo oferece riscos as praacuteticas satildeo de uso rotineiro e seratildeo utilizados materiais esterilizados e descartaacuteveis como agulhas seringas etc
Estaacute garantido a vocecirc todas as informaccedilotildees que vocecirc queira antes durante e depois da pesquisa
A sua participaccedilatildeo neste estudo eacute voluntaacuteria Vocecirc tem a liberdade de recusar participar da pesquisa a qualquer momento
As informaccedilotildees relacionadas agrave pesquisa poderatildeo ser inspecionadas pelos pesquisadores que executam a pesquisa e pelas autoridades legais no entanto se qualquer informaccedilatildeo for divulgada em relatoacuterio publicaccedilatildeo ou qualquer outro meio isto seraacute feito de forma codificada para manter o caraacuteter confidencial
Todas as despesas necessaacuterias para a realizaccedilatildeo do estudo natildeo satildeo de sua responsabilidade assim como a sua participaccedilatildeo na pesquisa na seraacute remunerada (vocecirc natildeo receberaacute qualquer valor em dinheiro)
Quando os resultados forem divulgados natildeo apareceraacute seu nome e sim um coacutedigo
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Assinatura do Pesquisador Responsaacutevel NomeAna Maria Almeida Souza EndRodovia Maacuterio Covas 1426 ndash Cond Green Garden casa 41 Fone(91) 32352665 81197217 RegConselhoCRM 1508
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APEcircNDICE B - CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Declaro que li as informaccedilotildees acima sobre a pesquisa que me sinto
perfeitamente esclarecido sobre o conteuacutedo da mesma assim como seus riscos e
benefiacutecios Declaro ainda que por minha livre vontade aceito participar da pesquisa
cooperando com a coleta de material para exame
Beleacutem _________
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Assinatura do sujeito da pesquisa ou do
responsaacutevel
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ANEXOS
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- Assinatura do Pesquisador Responsaacutevel
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- Beleacutem _________
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