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REAÇÕES AG X AC Aplicações em Diagnóstico e
Pesquisa
Dra. Rosa Maria Tavares HaidoProfa. Associada – Disciplina de
Imunologia
Características das Reações Ag/Ac
• Especificidade
Acs são formados sob influência das caracaterísticas estruturais do Ag.
A sequência de Aa do sítio combinatório tem a configuração espacial mais adequada para complementar a configuração espacial do epítopo
Características das Reações Ag/Ac
A capacidade de um único sítio combinatório do Ac reagir com somente um epítopo.
• Especificidade
A capacidade de uma população de moléculas de Acs de reagir somente com um Ag
Ligações não covalentes - Pontes de Hidrogênio - Interações eletrostáticas - Forças de Van der Waal - Interações hidrofóbicas
Ab
Ag
Alta afinidade
Ab
Ag
Baixa afinidade
• Afinidade
Força de reação entre um único epítopo e um único sítio combinatório do Ac
• Afinidade > ou < afinidade depende da complementariedade entre Ag e Ac > complementariedade reconhece grande porção do epítopo < complementariedade reconhece pequena porção do epítopo e podem interagir com moléculas que tenham estruturas semelhantes com < afinidade
REAÇÃO CRUZADA
Reação Cruzada• A capacidade de um único sítio combinatório do Ac de
reagir com mais de um epítopo.• Ocorre entre Ags que compartilham os mesmos epítopos
ou possuem epítopos similares
Ac Anti-A
Ag A
Ac Anti-A
Ag B
Epítopo igual
Anti-A Ac
Ag C
Epítopo similar
Reações cruzadas
• Avidez A força de ligação total entre um Ag com muitos epítopos e
Acs multivalentes
Keq = 104
Afinidade106
Avidez1010
Avidez
IgG - Ligação bivalente - Afinidade alta (maturação de afinidade) - Avidez alta só para Ags solúveis (epítopos acessíveis)
IgM - Ligação pentavalente (sítios de ligação idênticos) - Afinidade de cada sítio para o Ag é baixa - Avidez total do Ac para Ag multivalente elevada
DIVERSIDADE
Acs específicos sintetizados em resposta a um único epítopo são diferentes entre si e tem propriedades diferentes, especialmente em relação a afinidade
• Interações em proporções múltiplas
• Reversíveis
Etapas das Reações Ag x Ac Combinação do Ag com o Ac Manifestações visíveis dessa combinação Expressão biológica da reação Ag x Ac
Fatores Que Influenciam Nos Resultados Das Reações Imunológicas
Antígenos
Anti-soros padronizados
Reações padronizadas (técnicas)
Avaliação: Sensibilidade, especificidade e valor preditivo
Fatores que influenciam a medição das Reações Ag/Ac
• Afinidade
• Avidez• Concentração Ag:Ab
• Estado físico do Ag
Fatores que influenciam a medição das Reações Ag/Ac
Concentração relativa de Ag e Ac
Excesso de Ac Equivalência Excesso de Agentre Ag e Ac
Formação de Rede
Reações Ag x AcReações Ag x Ac
Pesquisa
Ags ou Acs Ags
no Soro nos Tecidos
Sorologia Imunohistoquímica
Diagnóstico de infecções Detecção de Ags / Acs
Monitoramento do tratamento
DETECÇÃO DE ANTÍGENOS E ANTICORPOSDETECÇÃO DE ANTÍGENOS E ANTICORPOS
AG AC SISTEMAREVELADOR
Íntegro
Recombinante
Peptídeo
Monoclonais
PrecipitaçãoAglutinação
Enzima
Radioisótopo
Fixaçãodo C`
Extrato
Policlonais
FluorocromoPurificado
FONTES ANTIGÊNICAS
• Antígenos totais• Antígenos de superfície• Frações purificadas• Proteínas recombinantes• Peptídeos sintéticos
Conter epítopos específicos
Ser comum as diferentes cepas do patógeno
De fácil obtenção e através de metodologia reprodutível
Características Ideais de um Antígeno
TÍTULO maior diluição do Ag ou Ac onde ainda há manifestação visível da reação
Quantitativa = Titulação
é a dosagem semi-quantitativa do Ag /Ac usando Ac/Ag conhecido
Titulação do Ag
Determina a concentração mínima de Ag a ser usada numa reação sorológica
Titulação de Ac
Determina a quantidade de Ac presente em um soro = SORODIAGNÓSTICO
SOROLOGIASOROLOGIA Qualitativa
Diagnóstico e terapia de tumores
Imunodiagnóstico de doenças infecciosas
APLICAÇÕES DOS ANTICORPOS MONOCLONAISAPLICAÇÕES DOS ANTICORPOS MONOCLONAIS
Identificação de marcadores fenotípicos e análise funcional de moléculas de superfície celular
PESQUISA DA CLASSE DE AC
Detecção de IgM – Infecção primária
- Diagnóstico de infecção em recém-nascido Detecção de IgM e IgG – Infecção em curso
Deteção de IgG – Convalescência
- Vacinação
- Cicatriz sorológica
- Teste de avidez para IgG
SOROLOGIA PAREADAColeta e análise de duas amostras do
pacienteSegunda coleta 2-4 semanas após a
primeira coletaConversão sorológica
Aumento de 4 vezes no título de Acs do soro da fase convalescente(2ª coleta) em relação ao soro da fase aguda(1ª coleta)
A escolha do teste sorológico a ser utilizado no diagnóstico de infecções agudas deve levar em consideração a sensibilidade e
a duração do período necessário para o aparecimento de títulos de anticorpos detectáveis
SOROLOGIASOROLOGIA
Resultados positivos necessitam de testes confirmatórios
Resultados devem ser interpretados dentro de um contexto clínico e epidemiológico
Testes Sorológicos Baseados nas Reações Ag/Ac
Todos os testes baseados nas reações Ag/Ac dependem da formação de rede ou utilizam recursos (sistemas reveladores) para detectar pequenos complexos imunes
Todos os testes baseados nas reações Ag/Ac podem ser usados para detectar ou Ag ou Ac
Aglutinação/Hemaglutinação Direta
+ =
Direta
Ag particulado
Ac solúvel
Agregado
Execução da técnica: - tubo, lâmina ou microplacas- qualitativa ou quantitativa
Aglutinação/Hemaglutinação Direta Direta Qualitativa
Ac anti-Ag A
Hemácias A
Tipagem sanguínea
A B AB O
Aglutinação/Hemaglutinação Direta
Infecções Bacterianas
Pesquisa de Acs para infecções (salmonelose, leptospirose,toxoplasmose...)
Sorotipagem de bactérias
Direta Qualitativa
+ =
Ex: REAÇÃO DE WIDAL - Febre tifóide
50 L do soro
1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640
0,950 mL PBS
0,5 mL PBS
0,5 mL PBS
0,5 mL PBS
0,5 mL PBS
0,5 mL PBS
0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL
Acrescentar 0,5 mL de Ag em cada tubo
Armazenar a 4ºC por 72 horas
Realizar a leitura a cada 24 horas
Aglutinação/Hemaglutinação Direta Direta quantitativa
Aglutinação/Hemaglutinação Direta
Aglutinação Quantitativa
• Título
• Prozona• ControleAg + tampão salina fosfato(PBS)
1:256
1:512
Título
Aglutinação/Hemaglutinação Direta• Aglutinação Quantitativa
Botão = Teste negativo
Rede = Teste positivo
Aglutinação/Hemaglutinação Direta
Considerações Práticas– Fácilidade de execução– Baixo custo– Elevada sensibilidade– Leitura visual– Semi-quantitativo
1/2
1/4
1/8
1/16
1/32
1/64
1/12
81/
256
1/51
2
Ex: Tipagem de grupos sanguineos
Sorotipagem de bactérias
Reação de Widal (febre tifóide)
Aglutinação /Hemaglutinação Indireta
Definição – Antigeno solúvel adsorvido a superfície de uma particula (látex, hemácia)
AplicaçõesEx: TPHA – Hemácias de Carneiro sensibilizadas com Ag
deTreponema pallidum
Sorodiagnóstico de sífilis
Resultado negativo (microscópio óptico x 100)
Resultado positivo (microscópio óptico x 100)
(VDRL latex)
(VDRL- floculação)
Testes de Coombs (Antiglobulina)
•Teste Coombs Direto– Detecta anticorpos nos eritrócitos do cordão umbilical
+
Eritrócitos do Paciente Reagente de Coombs(Anti-imunoglobulina)
Teste de Coombs (Antiglobulina) Teste de Coombs Indireto
―Detecta anticorpos anti-eritrócitos no soro da mãe
Soro do paciente Eritrócito teste+
Etapa 1
+
Reagente de Coombs(Antiglobulina)
Etapa 2
Inibição da Aglutinação/Hemaglutinação
• Definição - Teste baseado na inibição da aglutinação devido a competição com um Ag solúvel
Controle Positivo (Sem amostra do paciente)
Detecção / medida de Ag solúveisTeste positivo = Ausência de Aglutinação
Inibição da Aglutinação/Hemaglutinação• Definição - teste baseado na inibição da aglutinação devido a presença de Ac no soro de paciente
Detecção / medida de AcTeste positivo = ausência de aglutinação
Controle positivo (Sem amostra do paciente)
YY YYYYYY
YY
Hemaglutinina viral
(Ac ?)
Ex: diagnótico de vírus hemaglutinantes (Influenza)
Inibição da Aglutinação/Hemaglutinação
• Aplicações- Medição de Ags solúveis
Considerações práticas Mesmas dos testes de aglutinação
- Diagnóstico de viroses por vírus hemaglutinantes ( Influenza)
- Teste de Gravidez
Botão = Teste positivo
Rede = Teste negativo
• Definição - Testes que têm como resultado final a precipitação
de um Ag solúvel
PrecipitaçãPrecipitaçãoo
AG solúvel + AC solúvel Complexo Insolúvel
(rede tridimensional)
A formação de complexo insolúvel depende de: relativa do Ag e Ac (excesso de um ou outro
forma complexos solúveis)
Nº de epítopos presentes na moléculas
Imunodifusão Radial Simples (Mancini)
• Interpretação― Diâmetro do anel é
proporcional a concentração
• Quantitativo―Níveis de Igs
• Método– Ac incorporado ao gel– Ag no poço
Precipitação em meio Gelificado
Imunodifusão Radial Dupla (Ouchterlony)
Interpretação― Número de linhas de precipitação = quantidade de epítopo
Método– Ag e Ac colocados em poços equidistantes no gel– Permite comparação simultânea de vários sistemas antigênicos
Ex: diagnóstico de micoses, titulação de soros
Imunodifusão Radial Dupla (Ouchterlony)
A- Identidade
B- Não identidade
C- Identidade parcial
Comparação entre frações antigênicas
Contra-imuno - Eletroforese•Método
• Ag e Ac migram um contra o outro por eletroforese• Usado somente quando Ag e Ac tem cargas opostas• O movimento eletroforético e a eletroendosmose concentram
rapidamente Ag e Ac
Ag Ac- +
-- +
Contra-imuno - Eletroforese
Qualitativo Semiquantitativo Mais sensível que a imunodifusão dupla Rápido Uso: detecção rápida de Ags bacterianos (pneumonia, meningite, septicemia)
Imunoeletroforese•Método
Ags são separados por eletroforese
• Interpretação– Arcos de precipitação representam o número de antigenos
Ag
Ab
– Ac é colocado em um recorte no agar
Ag-+ Ag
Ab
Imunoelectroforese•Qualitativo
Concentração relativa
• Aplicação:Caracterização de proteínas – anormalidades estruturais ou alterações nas concentrações
Métodos Automatizados• Nefelometria- Precipitação entre Ag x Ac em soluções dliluidas produzem aumento da reflexão da luz que é medida pela dispersão da luz incidente- Acs específicos purose m concentrações constantes- Concentrações crescentes da amostra em análise- Intensidade da luz dispersada = densidade ótica
-Vantagens:Totalmente automatizado, fácil realização, rápido e preciso-Desvantagem:Custo elevado dos equipamentos e dos soros imunesReações inespecíficas: soros lipêmicos e hemolisadosVárias diluições =Ags concentrados
- Aplicação:Determinação de proteinas de significado clínico em qualquer fluido corporalEx: Fator reumatóide, IgA, IgG, IgM, C3, C4,albumina, Ptn C-reativa, transferrina, fibronectina, etc....