Aula de Bioquímica Avançada
Tema:
Sinalização Celular
Prof. Dr. Júlio César BorgesDepto. de Química e Física Molecular – DQFM
Instituto de Química de São Carlos – IQSC
Universidade de São Paulo – USP
E-mail: [email protected]
Princípios da Sinalização CelularORGANISMOS UNICELULARES
Células respondem a estímulos do meio: disponibilidade de oxigênio, nutrientes, etc
ORGANISMOS MULTICELULARES
Células enviam sinais umas às outras células mediante centenas de tipos de moléculas extracelulares.
Célula ???
Morrer
Viver
Dividir
Proliferar
Diversos sinais
simultâneos
Especialização celular
Interação celular
Movimento celular
Proliferação celular
���� A partir da integração dos
sinais, as células devem decidir o
que fazer
���� As células-alvo possuem proteínas receptoras.���� As proteínas-receptoras reconhecem o 1º Mensageiro e respondem de forma específica.
���� Alta especificidade e sensibilidade
Célula sinalizadora
Princípios da Sinalização Celular
TRANSDUÇÃO DE SINAL
CÉLULAS SINALIZADORAS
MOLÉCULA SINAL: 1º
MENSAGEIRO
PROTEÍNAS RECEPTORAS
(CÉLULAS ALVO)
EMITE SINAL
ALTERAÇÃO DO COMPORTAMENTO
CELULAR
Princípios da sinalização celular
Transdução de sinalManeira pela qual a célula recebe um determinado tipo de sinalização e o transmite para diversas vias, que poderão ser
novamente transformadas,até chegar a função
efetora – Dividir, proliferar, morrer ....
1º mensageiro
- Proteínas
- Peptídeos
- Aminoácidos
- Nucleotídeos
- Ácidos graxos
- Esteroides
- Gases
Transdução de sinal
Uma dada célula responde a um conjunto limitado de sinais- Depende de seu próprio conjunto de moléculas efetoras
���� Diferentes moléculas-sinais extracelulares alteram o comportamento da célula-alvo.
���� Células diferentes respondem de modo diferente ao mesmo tipo de sinal.
A informação transmitida pelo sinal
depende de como a célula-alvo recebe e interpreta o sinal.
Integração da sinalização Intracelular
TRANSDUÇÃO INICIAL
TRANSMISSÃO
AMPLIFICAÇÃO
INTEGRAÇÃO
DISTRIBUIÇÃO
RESPOSTA CELULAR
Receptores celulares específicos
���� responsáveis em disparar processos celulares conforme a disponibilidade de
moléculas executoras
- RESPOSTA DIFERENCIADA
DEPENDENTE DO TIPO CELULAR
Sinalização Celular
Moléculas-sinal extracelulares: 1º Mensageiro ���� Receptores específicos
Leveduras – unicelulares – sinalização feita por poucos tipos de moléculas
Células de animais superiores – Centenas de diferentes tipos de moléculas
Maioria das moléculas é secretada por exocitose. Outras são liberadas por difusão através da membrana plasmática e outras ficam expostas ao meio extracelular, mas permanecem
ligadas a superfície da célula sinalizadora (proteínas de membrana)
Emissão do sinalIndependente da natureza do sinal, a célula-alvo responde por meio de uma proteína
específica: RECEPTOR.
� Local onde a molécula sinalizadora se liga de forma específica iniciando uma resposta nas células- alvo.
� Alta especificidade
� Proteínas modulares
� Múltiplas isoformas tecido-específicas
� Pontos de convergência/divergência de sinais
Sinalização CelularMoléculas-sinal extracelulares���� 1º Mensageiro ���� Características químicas
Influencia as características estruturais do RECEPTOR
Grandes e hidrofílicas Pequenas e hidrofóbicas
���� Ligante tem que penetrar na célula-alvo para ativação
���� Ativa receptores citoplasmáticos e/ou nucleares
���� Maior parte dos receptores���� Proteínas transmembrana que ao se
ligarem a molécula sinalizadora são ativados e geram uma cascata de sinais intracelulares
alterando o comportamento da célula.
Tipos de Sinalização Extracelular� Endócrinos: liberados no plasma ���� ação a “longa distância”
� Neuronais ���� ação mediada por neurotransmissor
�Autócrinos: liberados no
espaço extracelular ����
ação na mesma célula que os libera
�Parácrinos: liberados no
espaço extracelular ���� ação local em outras
células
Hormônios: 1º mensageiro
Conjunto de moléculas responsáveis pela manutenção e coordenação das funções em um organismo complexo.
Mensageiros químicos secretados no plasma ou interstício celular para regular a atividade de outras células ou tecidos do organismo.
Função Tecido/célula/sistema alvo
Pressão arterial sistema vascular
Volume sanguíneo sistema vascular e rins
Balanço eletrolítico sistema vascular e rins
Embriogênese embriões
Diferenciação sexual órgãos sexuais e organismo
Desenvolvimento e reprodução órgãos sexuais e organismo
Fome cérebro
Comportamento alimentar cérebro e sistema digestivo
Digestão cérebro e sistema digestivo
Distribuição de combustíveis fígado
Sinalização de longa distânciaLiberação do 1º mensageiro: Tipos de sinalização a longa distância
Sinalização neuronal Sinalização Endócrina
���� Distribuição muito rápida – 100 m/seg
���� Concentração alta do neurotransmissor
���� Efeito localizado
���� Maior precisão e rapidez
� Distribuição lenta� depende da difusão
no fluxo sanguíneo� Concentração baixa
de hormônios� Efeito disperso
Vias de Sinalização Intracelular
Hormônios
Sistema neuroendócrino
Tipos de Sinalização Extracelular� A transmissão dos sinais em relação a distância
Distâncias
Secreção de sinais
(Ex: Hormônios)Sinalização endócrina
Mediadores locais
(Ex: Inflamação)Sinalização parácrina
Secreção de neurotransmissores
(Ex: Acetilcolina)
Sinalização neuronal
Contato direto, sem liberação de sinais
(Ex: desenvolvimento embrionário)
Sinalização dependente de
contato
Curtas
Longas
Transdução de sinais
A resposta celular a um sinal pode ser rápida ou lenta
A Especificidade da ação depende da interação do 1º mensageiro com
receptores celulares
1) Liberação de 2º mensageiro no citoplasma ���� modificações
covalente reversíveis de proteínas alvo
- Ativação/inativação de enzimas efetoras
2) Abertura de canais
- Efeito direto
3) Modulação da expressão gênica
- Pode ser ação decorrente da integração conjunta com 2º
mensageiro ou receptores nucleares
Sistemas de amplificação de sinal
As vantagens do uso de 2º mensageiros
���� Efeito “Cascata de sinalização”
1) Amplificação de sinal
- Um pequeno sinal pode produzir amplas respostas
celulares
2) Difusão do sinal por todos os compartimentos
celulares
- Modulação de toda célula para a nova situação
celular
3) Comunicação cruzada
- Integração com outros sinais
Transdução de sinais: características gerais
Alta conservação dos mecanismos de transdução de sinais biológicos
���� Tipos de sinais biológicos ���� milhares
���� Maquinaria de transdução conta com alguns tipos básicos de componentes proteínas
Resumindo
Modulação da Célula-alvo
Célula sinalizadora
Sinal (1º mensageiro)Ex: hormônio
Proteína receptora
Distância
1. Parácrina2. Dependente de
contato3. Endócrina4. Neuronal
1. Intracelular
1. Canais iônicos
2. Receptores enzimáticos
3. GPCR ���� Proteínas G
4. Guanilil-ciclase
2º mensageiroscAMPIP3DAGCa2+
cGMP
Tiroquinases
- Óxido nítrico- Hormônios esteroides- Hormônios tireoidianos
2. Superfície
Transdução do sinal
Hormônios1os Mensageiros
Tipos de hormônios
Hormônios
Tipos de hormônios
HormôniosTipos de hormônios: continuação
HormôniosHormônios peptídicos
Ação dependente de receptores de membranas e segundos mensageiros
Ex: Insulina e glucagon: metabolismo de carboidratos
Angiotensina II e bradicinina: pressão e volume sanguíneo
HormôniosHormônios catecolamínicos
Ação dependente de receptores de membranas e segundos mensageiros
Produzidos na medula adrenal
Papel importante na neurotransmissão e metabolismo energético
Noradrenalina/norepinefrina
Adrenalina/epinefrina
HormôniosOs efeitos da Epinefrina e Glucagon no metabolismo do Glicogênio
- Cascatas de sinalização
- Amplificação de sinal
HormôniosHormônios eicosanoides
Ação dependente de receptores de membranas e segundos mensageiros
- mediadores celulares locais ���� inflamação, febre, dor e agregação plaquetária
HormôniosHormônios esteróides
Ação dependente de receptores nucleares ���� modulação da expressão gênica
cortisol TestosteronaAldosterona Estradiol
HormôniosHormônios vitamina D
Ação dependente de receptores nucleares ���� modulação da expressão gênica
Hormônios
Hormônios Retinoides
Ação dependente de receptores nucleares ���� modulação da expressão gênica
HormôniosHormônios Retinoides
Ação dependente de receptores nucleares ���� modulação da expressão gênica
HormôniosHormônios Tireoides
Ação dependente de receptores nucleares ���� modulação da expressão gênica
Produzido na tireoide
Estimulam o metabolismo energético
HormôniosÓxido nítrico
Radical livre estável
Síntese dependente da NO-sintase
Ação local por intermédio da guanilato-ciclase
���� segundo mensageiro GMPc
Hormônios
Hormônios
Hormônios
Transdução de sinaisOs 6 mecanismos básicos
A redundância mecanística permite fazer generalizações
1) Receptores acoplados a Proteínas GGPCR: G protein-coupled recpetors~1/2 dos fármacos atuam sobre GPCR
Sistema de transdução de sinal formado por 3 componentes:
1) Receptor de membrana plasmática com 7 segmentos transmembrana
- Receptor hepta-helicoidais
2) Proteína G que alterna entre forma ativa (GTP) e inativa (GDP)
3) Proteína G-GTP ativa uma enzima que libera 2º mensageiros
Protótipo de funcionamento GPCR ����Receptor β-adrenérgico
Receptor adrenalina
4 tipos básicos:
α1, α2, β1, β2
Adrenalina = epinefrina� Dispara sinais de alarme
- Mobiliza energia metabólica- Aumenta capacidade
cardiovascular“lutar ou fugir”
Agonista: simula ligante natural
Antagonista: bloqueia efeito do ligante natural = Fármaco
1) Receptores acoplados a Proteínas GGPCR: G protein-coupled receptors~1/2 dos fármacos atuam sobre GPCR
���� ~1000 genes em humanos ���� ~150 órfãos (sem ligantes descritos)
~350 para hormônios e outras moléculas endógenas
~ 500 para receptores olfativos e gustativos ���� moléculas exógenas
���� Alta conservação estrutural e funcional
- Aminas de baixa massa molecular ���� adrenalina- Peptídeos opióides
- Proteínas - Peptídeos
- Eicosanoides- Receptores de luz
1) Receptores acoplados a Proteínas G
Proteína G ���� Ancorada a membrana via palmitoil
���� Gs- estimulatória ���� Forma inativa ����
Heterotrímero αβγGsαβγ(GDP) ���� Ativação do
receptor - dissociação da Gsα(GDP)
- Dissociação do GDP- Ligação do GTP
���� Ativação da Adenilil-ciclase
Receptor β-adrenérgico���� Protótipo do grupo
���� Presente no músculo esquelético, fígado e
adipócitos- Degradação de glicogênio e
triacilgliceróis
Adenilil-ciclase ���� proteína de membrana ���� forma
cAMP na face citoplasmática
1) Receptores acoplados a Proteínas G1) cAMP ativa a PKA induzindo a dissociação da
cadeia catalítica ativa da cadeia regulatória inibitória
2) Fosforilação indiscriminada de proteínas diversas como Glicogênio Fosforilase Kinase
(degradação de glicogênio) e Glicogênio Sintasekinase (inibição da síntese de glicogênio)
���� Susceptível a cascata de amplificação de sinal
1) Receptores acoplados a Proteínas G���� Todo sistema de transdução de sinal tem um mecanismo de término de resposta
Mecanismos de desligamento da ativação dos receptores β-adrenérgicos
1) Depende da dissociação do Gsα–GTP da adenilil ciclase
2) Atividade GTPase intrínseca da Gsα sobre o próprio GTP
- Existem proteínas ativadores da atividade GTPase (GAP) intrínseca da Gsα
Comutador binário autolimitanteEstímulo da Gsα(GTP) sobre a
Adenilil-ciclase é autolimitada pela sua atividade GTPase
intrínseca
A Gsα(GDP) se reassocia ao Gsβγ e ao receptor de membrana
3) Hidrólise do cAMP ���� fosfodiesterase de nucleotídeo cíclico
4) Fosfoproteínas-fosfatases atuam sobre as proteínas fosforiladas pela PKA
1) Receptores acoplados a Proteínas GDessensibilizarão de receptores β-adrenérgicos
Processo que sequestra os receptores em vesículas no citoplasma.
���� Depende da fosforilação da face citoplasmática do receptor pela β-ARK (β-
adrenergic receptor kinase)
- Família GRK (G-protein coupled kinases)
���� Bloqueio da interação com a Proteína G
���� Recrutamento da β-arrestina e Clatrina
���� Sequestro em vesículas citoplasmáticas
cAMP é um 2º mensageiro multifuncionalVários sistemas de transdução usam o cAMP
���� cAMP ativa a CREB (cAMP response element binding protein) ���� ativa transcrição gênica
Reúnem Balsas lipídicas- Receptor-proteína Gsαβγ
- Adenilil ciclase- PKA
- cAMP fosfodiesterase- Fosfoproteína fosfatase
- Outras
���� Proteína G-inibitória ���� inibição da adenilil ciclase
- Estruturalmente similar a Gsαβγ
- GIαβγ(GDP) interage com receptores específicos
���� [cAMP] reflete a integração de ambos os sistemas
� Resposta ao cAMP pode ser breve e localizada
- Efeito dos complexos envolvendo proteínas de
ancoragem da PKA (AKAP5)
1) Receptores acoplados a Proteínas GGPCR podem estar acoplados a Fosfolipase C (PLC)
Respondem a ativação de hormônios diversos
Ação conjunta de 2º mensageiros ���� Diacilglicerol (DAG) ���� Ativa isoenzima da PKC
���� Inositol-1,4,5-trifosfato (IP3) ���� libera Ca2+
Ca2+ ���� Ativa isoenzima PKC
1) Receptores acoplados a Proteínas GAcoplados resposta via Fosfolipase C (PLC)
Efeito do Ca2+ ���� dependente da Calmodulina (CaM) ���� sensor ubíquo de Ca2+
� Ativa a CaM-kinaseEfeito do Ca2+ ���� interconexão com cAMP
- Estimula a adenilil ciclase- Estimula a cAMP-fosfodiesterase
Efeitos locais/temporais
2) Receptores Tirosina-kinases (RTK)���� Domínio extracelular de interação com o ligante
���� Domínio citoplasmático com atividade kinase
- Conectados por um único segmento transmembrana
- Atividade Tyr-kinase intrínseca ���� fosforilação cruzada
� Receptor da Insulina: INSR ���� Protótipo da classe
- Dímero
- Regulação de metabolismo e expressão gênica
- Interação com a Insulina ���� fosforilação cruzada
- Saída da sequência auto-inibitória do sítio ativo
- Sítio ativo livre para interagir com proteínas citoplasmáticas
O INSR ativo fosforila e ativa o IRS-1 (Insulinreceptor substrate-1)
O IRS-1 (Pi-Tyr) funciona como ponto de nucleação para complexo de proteínas
2) Receptores Tirosina-kinases (RTK)���� Possuem atividade kinase intrínseca: Receptor da Insulina: INSR
Montagem do complexo envolve proteínas contendo o domínio SH2 ���� liga Pi-Tyr
���� Gbr2- Reconhece Pi-Tyr da IRS-1
- Proteína conectora- Contém domínio SH3
- Liga proteínas ricas em Pro
���� Sos- É fator de troca de nucleotídeos (GEF)
- Induz troca de GDP/GTP na Ras
���� Ras- Protótipo das pequenas proteína G
- Ligada a GTP ���� ativa a proteína kinase Raf1 ���� uma MAPK (mitogen-activated protein kinase)
- Raf1 fosforila e ativa a MEK (uma MAPK kinase - MAPKK)- MEK fosforila e ativa a ERK (uma MAPKK kinase -
MAPKKK)���� Cascatas das MAPK
2) Receptores Tirosina-kinases (RTK)���� Possuem atividade kinase intrínseca: Receptor da Insulina: INSR
Ativação de enzimas contendo o domínio SH2
���� Fosfoinositídeo-3-kinase – PI3K
- Reconhece Pi-Tyr da IRS-1
- Atua sobre fosfatidilinositol-4,5-fosfato (PIP2)
- Formação do fosfatidilinositol-3,4,5-fosfato (PIP3)
- O PIP3 ativa a PDK1 ���� fosforila a Akt (PKB)
���� Insulina inibe a enzima que inibe a Glicogênio Sintase
- Síntese de glicogênio
���� PKB
- Disponibiliza o Glut4
- Fosforila Ser e Thr de proteínas alvo ���� inativa GSK3
���� Glicogênio sintase kinase 3
- GSK3 não fosforilada ���� Fosforilaa Glicogênio Sintase
- Redução da síntese de glicogênio
2) Receptores Tirosina-kinases (RTK)���� Possuem atividade kinase intrínseca: Outros exemplos
���� Envolvem dimerização dependente do 1º mensageiro
- Usam proteínas que interagem com Pi-Tyr via domínios SH2
- Permite ampla integração de sinal
� Envolvem dimerização dependente do 1º mensageiro
- Citocina Eritropoitina
- Modulação da expressão gênica direta e indireta via cascata das MAPK
Integração de viasInsulina versus Adrenalina
���� Metabolismo é entrelaçado e estratificado
Integração do sinal da insulina
���� Insulina induz sequestro de receptores β-adrenérgicosdevido a fosforilação do C-
terminal do receptor via IRS-1 e PKB
���� Fosforilação receptores α2-adrenérgicos permite nucleação do complexo via SH2 e ativação
da cascata das MAPK ����modulação da expressão gênica
3) Receptores Guanilil-ciclasesAção via cGMP e Proteínas Kinases G (PKG)
� cGMP transmite diferentes mensagens para diferentes tecidos
- Rins e intestino ���� retenção de água
- Relaxamento do músculo cardíaco
Fator natriurético atrial (ANF)
- Secretado pelos átrios cardíacos
- Excreção renal de sódio
- Excreção de água
- Vasodilatação
Efeito do cGMP é revertido pela cGMP-fosfodiesterase (cGMP-PDE)
- O Sildenafil (Viagra) inibe a isoforma peniana ���� vasodilatação ���� ereção prolongada
Guanilil ciclase citosólica ���� ativada por óxido nítrico (NO)
- cGMP reduz tônus cardíaco
- Via da ação da nitroglicerina
- Tratamento da angina pectoris
Proteínas adaptadoras ���� Tema recorrenteFosforilação criam sítios de ancoragem em proteínas multivalentes
Proteínas multi-domínios que participam de circuitos proteicos
� Interação específica de Pi-Tyr
- Interação específica mediada pela sequencia adjacente da Pi-Tyr
���� Exemplos:
- domínio SH2
- PTB (Phosphotyrosin-Binding protein)
� Auto-inibição via fosforilação interna
Proteínas adaptadoras ���� Tema recorrenteProteínas multi-domínios que participam de circuitos proteicos
� Módulos de interação recorrentes
- Múltiplos domínios de interação comuns em diferentes proteínas
���� Em humanos
- 87 proteínas contendo o domínio SH2
- 24 proteínas contém o domínio PTB
���� Muitas contém o domínio SH3
- liga PIP3 na face interna da membrana formado em resposta a PIK3 e IRS-1
- Proteínas multivalentes
Proteínas adaptadoras ���� Tema recorrente Circuitos proteicos, proteínas de ancoragem e balsas lipídicas
EX: A cascata das Raf (MAPK), MEK (MAPKK) e Erk (MAPKKK) depende da proteína de ancoragem KSR
� Possibilita resposta combinatória
� Regulação da intensidade de resposta via fosforilação no
sítio de ancoragem
Ex: Raf
� Proteínas Tyr-fosfatasestambém contém domínios de
interação comuns aos envolvidos nos circuitos de
ativação
- Ex: domínio SH2
4) Receptores acoplados a canais iônicos���� Convertem sinais QUÍMICOS em sinais ELÉTRICOS
- Funcionam de maneira simples e direta- Responsáveis pela transmissão rápida de sinais (sinapses do sistema nervoso)- Contração muscular, secreção hormonal, processos sensoriais, memória, etc.
Potencial de membranaPolarização da membrana decorrente a
diferente concentração de íons
���� Gradiente de concentração de íons e potencial elétrico são mantidos a custas de
ATP
- Na+K+-ATPase
� Gradiente/potencial elétrico rompido pela abertura de Canais iônicos passivos
específicos induzida por ligantes ou variação de potencial elétrico transmembrana
� Fluxo de íons continua até consumir a força propulsora provida pelo gradiente de íons e
potencial de membrana.
- É especifico para cada íon
- É influenciado pelo tempo de abertura e fechamento de um dado canal iônico
4) Receptores acoplados a canais iônicosCanal de membrana controlados por voltagem
� Sinalização no sistema nervoso central
- Potencial de ação em extremidades do neurônio
- Liberação de neurotransmissores na fenda sináptica
- Potencial elétrico passado adiante
���� Ação conjunta de 3 canais iônicos controlados por voltagem
1) Onda de despolarização abre canais de Na+ ���� entrada de Na+
2) Despolarização atrasada de canais de K+ ���� saída de K+
- Participa da repolarização
3) Despolarização final abre canais de Ca+ ���� entrada de Ca+
- Ca+ age como 2º mensageiro
4) Exocitose de vesículas de acetilcolina ���� neurotransmissor na fenda sináptica
- Ativação de receptores na membrana pós-sináptica
- Abertura de canais iônicos
4) Receptores acoplados a canais iônicosFuncionamento do canal iônico de Na+ sensível a voltagem
���� 1840 resíduos
���� 4 domínios contendo 6 α-hélices transmembrana
formando um canal central em funil específico para Na+
- Filtro de seletividade loop entre hélice 5 e 6
���� α-hélice 4 é carregada +++ e funciona como sensor de
abertura
���� Inativação depende de mecanismo de “bola de
corrente” que bloqueia o canal
- Comprimento da “corrente” determina o
tempo de abertura do canal
4) Receptores acoplados a canais iônicosFuncionamento do canal iônico de Na+, K+ e Ca+ ativado por acetilcolina
���� Receptor nicotínico de acetilcolina- Sensível a nicotina
- Sinapses e junções neuromuscular
���� Receptor formado por 5 subunidades ����α2βγδ
- Cada subunidade tem 4 segmentos α-hélices transmembrana (M1-M4)
- A hélice M2 é anfipáticas com Leu voltadas para o centro do poro
� A isoformas α contém o sítio de interação para acetilcolina
� Acetilcolina induz uma rotação no segmento M2 de cada
subunidade levando as Leu para o lado, abrindo o poro.
Outros neurotransmissores com receptores similares:Serotonina, glutamato e glicina
A despolarização da membrana neuronal depende da integração dos diversos sinais que o neurônio recebe
Transdução sensorial na visão, olfato e paladarEnvolvem integração de GPCR e canais de membranas
� 2º mensageiros intracelulares regulam canais iônicos acoplados a receptores específicos� Disparam despolarização/polarização da membrana de neurônios acoplados
� Guardam semelhanças estruturais e funcionais com GPCR hormonais- Ativação dependente da percepção de luz ou composto exógeno
- Modulação da concentração de um 2º mensageiro- Supressão do sinal devido a ação autolimitante da Proteína Gα
5) Integrinas: Receptores BidirecionaisDímeros αβ ���� Genoma indica 8 genes e 18 genes β
���� 24 integrinas identificadas���� Interações macromoleculares seletivas
- Desenvolvimento embrionário, coagulação, angiogênese, sistema imune, diferenciação celular, crescimento e metástase tumoral
Sinalização “de fora para dentro” e “de dentro para fora”���� liga citoesqueleto a matriz extracelular ���� integra intra- e extracelular
- Influencia diretamente a adesividade celular
Ligantes extracelulares
- Colágeno- Fibrinogênio- Fibronectina
- Outras
Ligantes intracelulares- Proteínas do citoesqueleto
- Talina- α-actinina- Vinculina- Paxilina- outras
6) Receptores nucleares
���� Ação hormônios esteroides, tireoidianos e retinóide
- Livre trânsito pela membrana plasmática ���� pequenos e hidrofóbicos
- Ativação da transcrição de genes específicos
���� Presença de sequências HRE: elementos de resposta hormonal específicos