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Programa de Pós-Graduação em MicrobiologiaBiologia Molecular de Micro-organismos (MIC842)ICB/UFMG
PCR quantitativaTeoria e Aplicações
Lucas Secchim RibeiroLaboratório de Interação Microrganismo-Hospedeiro
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• PCR Histórico Teoria Aplicações
• Desenho de primers
• qPCR MetodologiasCálculos Aplicações PCR Digital
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Dogma central da Biologia Molecular• Francis Crick / 1956
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PCRPCR
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PCR - Polymerase Chain Reaction
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Funções da PCR• Distinguir uma sequência-alvo específica de uma grande quantidade de background;
• Amplificação de cópias de uma sequência específica a partir de pequenas quantidades do DNA modelo.
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Aplicações da PCR “convencional”• Diagnóstico
• Avaliação de mutações• Detecção de patógenos (bactérias, fungos, vírus, protozoários)
• Tipagem para transplantes - MHC
• Testes forenses• Paternidade• Investigações criminais
• Sequenciamento e clonagem• Epidemiologia molecular e bioinformática• Análise de OGM• ...
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PCR “convencional”
Reagentes básicosIniciadores
senso/antissenso(primers forward/reverse)
Cátions(Na+/K+ e Mg2+)
DNA polimerasecom DNA modelo
Deoxinucleotídeos(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
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Importância do tampão e íon potássio na PCR• pH 8,3 pH 7,2 a 72º C
• Tris/ Tris-Cl•Função enzimática da DNA polimerase
• K+
• Reduz a repulsão entre DNA/DNA e DNA/primer pela neutralização de cargas negativas
↑ [K+] para fragmentos pequenos ↓ [K+] para fragmentos grandes
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Importância dos dNTPs e íon magnésio na PCR• Deoxinucleotídeos trifosfato (dNTPs)
• Associados ao DNA na forma de dNMPs• Sequestradores de Mg2+
• Mg2+
• Cofator da DNA polimerase• Especificidade e eficiência da enzima•Estabiliza ligação de dNTP/dNMP e primers à fita de DNA (↑ Tm)• Rendimento x Concentração crítica e empírica
↑ [Mg2+] ↑eficiência ↓especificidade
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Função e relevância dos primers• Polinucleotídeos sintéticos de fita simples, de sequência complementar e flanqueadora à fita molde, com a extremidade 3´-OH livre
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Thermus aquaticus
DNA polimerase termorresistente• Antigamente: adição de enzima a cada novo ciclo
• Taq DNA Polimerase• Dependente de cátions bivalentes (Mg2+ > Mn2+ >>>Ca2+)
• Inibição por agentes quelantes (EDTA, citrato)
Parque Nacional de Yellowstone / EUA
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DNA molde• Qualidade • Cuidado com resíduos de processos de extração
• SDS (dodecil sulfato de sódio)• Fenol• Corantes• Heparina/EDTA/Citrato• Polissacarídeos vegetais/carragenina• Poliestireno/polipropileno expostos à radiação UV
• Quantidade• Excesso de DNA é prejudicial• Aumento de reação inespecífica
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![Page 18: PCR Quantitativa - Lucas Secchim Ribeiro (PGMicro UFMG 2015-1)](https://reader030.vdocuments.com.br/reader030/viewer/2022020208/55a656211a28ab56308b466b/html5/thumbnails/18.jpg)
Parâmetros de termociclagem• Temperatura de anelamento
↑ Tanelamento ↑estringência ↓produtos inespecíficos
↓ Tanelamento ↑rendimento ↑ produtos inespecíficos
• Tempo de extensão• DNA Polimerase: 35 – 100 nt por segundo a 72º C• Mínimo = 1 minuto • Excesso Atividade de exonuclase 5´-3´
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Aditivos• Separação de fitas com alto conteúdo G:C• Estruturas secundárias fortes
• Betaína (1 M)• DMSO (1-10%)• Formamida (1-10%)
• Agentes estabilizantes da DNA polimerase• Redução da adesão de reagentes ao tubo
• BSA (0,1 mg/mL)• Gelatina (0,1 – 1,0%)• Detergentes não-iônicos (<0,5%)
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Inibidores• Derivados das próprias amostras ou do método de extração/purificação do ácido nucléico;
• Fenol/álcoois• EDTA• Debris celular• Detergentes
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![Page 22: PCR Quantitativa - Lucas Secchim Ribeiro (PGMicro UFMG 2015-1)](https://reader030.vdocuments.com.br/reader030/viewer/2022020208/55a656211a28ab56308b466b/html5/thumbnails/22.jpg)
![Page 23: PCR Quantitativa - Lucas Secchim Ribeiro (PGMicro UFMG 2015-1)](https://reader030.vdocuments.com.br/reader030/viewer/2022020208/55a656211a28ab56308b466b/html5/thumbnails/23.jpg)
Fonte: Koch WH, 2004. Nature Reviews Drug Discovery 3, 749-761 (Sep 2004)
![Page 24: PCR Quantitativa - Lucas Secchim Ribeiro (PGMicro UFMG 2015-1)](https://reader030.vdocuments.com.br/reader030/viewer/2022020208/55a656211a28ab56308b466b/html5/thumbnails/24.jpg)
Visualização dos resultados• Separação por eletroforese• Corantes/marcação fluorescente
![Page 25: PCR Quantitativa - Lucas Secchim Ribeiro (PGMicro UFMG 2015-1)](https://reader030.vdocuments.com.br/reader030/viewer/2022020208/55a656211a28ab56308b466b/html5/thumbnails/25.jpg)
Visualização dos resultados• Sequenciamento capilar• Dideoxinucleotídeos
![Page 26: PCR Quantitativa - Lucas Secchim Ribeiro (PGMicro UFMG 2015-1)](https://reader030.vdocuments.com.br/reader030/viewer/2022020208/55a656211a28ab56308b466b/html5/thumbnails/26.jpg)
Antes da PCR...• Clonagem!
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Antes dos termocicladores...• Banho-maria!
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Desenho deDesenho deprimersprimers
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Características de bons primers• Tamanho adequado• 15 a 25 pares de bases• Tamanho x Temperatura de dissociação
• Temperatura adequada de dissociação (Tm)• Conteúdo G:C•Diferença entre primers < 5º C
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Características de bons primers• Tamanho do fragmento a ser gerado• Tempo de extensão da polimerase
•Especificidade Primers específicos x degenerados
![Page 31: PCR Quantitativa - Lucas Secchim Ribeiro (PGMicro UFMG 2015-1)](https://reader030.vdocuments.com.br/reader030/viewer/2022020208/55a656211a28ab56308b466b/html5/thumbnails/31.jpg)
Características de maus primers• Inter-complementariedade• Formação de dímeros (primer dimer)• Atenção à extremidade 3´
![Page 32: PCR Quantitativa - Lucas Secchim Ribeiro (PGMicro UFMG 2015-1)](https://reader030.vdocuments.com.br/reader030/viewer/2022020208/55a656211a28ab56308b466b/html5/thumbnails/32.jpg)
Características de maus primers• Auto-complementariedade• Formação de auto-dímeros e hairpins
![Page 33: PCR Quantitativa - Lucas Secchim Ribeiro (PGMicro UFMG 2015-1)](https://reader030.vdocuments.com.br/reader030/viewer/2022020208/55a656211a28ab56308b466b/html5/thumbnails/33.jpg)
![Page 34: PCR Quantitativa - Lucas Secchim Ribeiro (PGMicro UFMG 2015-1)](https://reader030.vdocuments.com.br/reader030/viewer/2022020208/55a656211a28ab56308b466b/html5/thumbnails/34.jpg)
Características de bons primers• Adequação para qPCR• Tamanho do amplicon •Junção exon-exon e contaminação com gDNA
![Page 35: PCR Quantitativa - Lucas Secchim Ribeiro (PGMicro UFMG 2015-1)](https://reader030.vdocuments.com.br/reader030/viewer/2022020208/55a656211a28ab56308b466b/html5/thumbnails/35.jpg)
Ferramentas online de suporte• Primer-BLAST
www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
• Primer3bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3
• IDT Oligo Analyzer 3.1www.idtdna.com/calc/analyzer
• UCSC PCR in silicogenome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr?command=start
• RT Primer DB (específico para qPCR)• medgen.ugent.be/rtprimerdb
![Page 36: PCR Quantitativa - Lucas Secchim Ribeiro (PGMicro UFMG 2015-1)](https://reader030.vdocuments.com.br/reader030/viewer/2022020208/55a656211a28ab56308b466b/html5/thumbnails/36.jpg)
Problemadetectado
Workflow para desenho de primers
Verificar• Temp. de anelamento• Temp. de dissociação• Tamanho do amplicon• Estruturas secundárias• Complementaridade• EspecificidadeNãoSim
PCR para confirmação de funcionamento
PCR para confirmação de funcionamento
GenBank/NCBI
Encontrar sequência da região desejada
Encontrar sequência da região desejada
PrimerBLASTPrimer3, etcDesenhar primersDesenhar primers
Registrar e arquivarresultados obtidos
Registrar e arquivarresultados obtidos
Reaçãoadequada
OK?OK?
CHECAR PRIMERS!CHECAR PRIMERS!
![Page 37: PCR Quantitativa - Lucas Secchim Ribeiro (PGMicro UFMG 2015-1)](https://reader030.vdocuments.com.br/reader030/viewer/2022020208/55a656211a28ab56308b466b/html5/thumbnails/37.jpg)
PCRPCRquantitativaquantitativa
![Page 38: PCR Quantitativa - Lucas Secchim Ribeiro (PGMicro UFMG 2015-1)](https://reader030.vdocuments.com.br/reader030/viewer/2022020208/55a656211a28ab56308b466b/html5/thumbnails/38.jpg)
PCR quantitativa
• Nomenclatura• qPCR• qRT-PCR• Real-time PCR
![Page 39: PCR Quantitativa - Lucas Secchim Ribeiro (PGMicro UFMG 2015-1)](https://reader030.vdocuments.com.br/reader030/viewer/2022020208/55a656211a28ab56308b466b/html5/thumbnails/39.jpg)
Ensaios químicos disponíveis
• SYBR Green I• Ensaio para 5´-nuclease (TaqMan)• Molecular Beacons• LightCycler• LUX
Detecção de fluorescência!
↑ sensibilidade
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SYBR Green I• Corante específico para DNA de fita dupla• Flourescência aumenta ao longo da reação• Não tem ação inibitória• Detecta produtos inespecíficos
SYBR Green I
Brometo de etídio
![Page 41: PCR Quantitativa - Lucas Secchim Ribeiro (PGMicro UFMG 2015-1)](https://reader030.vdocuments.com.br/reader030/viewer/2022020208/55a656211a28ab56308b466b/html5/thumbnails/41.jpg)
Ensaio para 5´-nuclase – Sondas TaqMan• Atividade 5´-nucleásica da Taq DNA Polimerase• Altamente específica, sem produtos espúrios• Duas marcações simultâneas são possíveis• Tecnologia baseada em FRET• Flourescence Resonance Energy Transfer
![Page 42: PCR Quantitativa - Lucas Secchim Ribeiro (PGMicro UFMG 2015-1)](https://reader030.vdocuments.com.br/reader030/viewer/2022020208/55a656211a28ab56308b466b/html5/thumbnails/42.jpg)
FRET - Transferência de energia por ressonância fluorescente• Fenômeno quântico entre duas moléculas muito próximas (10 – 100 Å), com bloqueio da emissão de luz• Quencher/bloqueador
![Page 43: PCR Quantitativa - Lucas Secchim Ribeiro (PGMicro UFMG 2015-1)](https://reader030.vdocuments.com.br/reader030/viewer/2022020208/55a656211a28ab56308b466b/html5/thumbnails/43.jpg)
Ensaio para 5´-nuclase – Sondas TaqMan
![Page 44: PCR Quantitativa - Lucas Secchim Ribeiro (PGMicro UFMG 2015-1)](https://reader030.vdocuments.com.br/reader030/viewer/2022020208/55a656211a28ab56308b466b/html5/thumbnails/44.jpg)
![Page 45: PCR Quantitativa - Lucas Secchim Ribeiro (PGMicro UFMG 2015-1)](https://reader030.vdocuments.com.br/reader030/viewer/2022020208/55a656211a28ab56308b466b/html5/thumbnails/45.jpg)
Ensaio para 5´-nuclase – Sondas TaqMan• Discriminação alélica
![Page 46: PCR Quantitativa - Lucas Secchim Ribeiro (PGMicro UFMG 2015-1)](https://reader030.vdocuments.com.br/reader030/viewer/2022020208/55a656211a28ab56308b466b/html5/thumbnails/46.jpg)
Conceitos importantes• Fases exponencial, logarítmica e plateau
• Threshold• Baseline• Cycle threshold (CT)
Ciclos
Flou
resc
ênci
a(p
rodu
tos
de P
CR
)
Plateau
Linear
Exponencial
Threshold
![Page 47: PCR Quantitativa - Lucas Secchim Ribeiro (PGMicro UFMG 2015-1)](https://reader030.vdocuments.com.br/reader030/viewer/2022020208/55a656211a28ab56308b466b/html5/thumbnails/47.jpg)
Ciclos
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Amostra A 3 6 12 24 48 96 192 384 768 1536 3072
Amostra B 15 30 60 120 240 480 960 1920 3840 7680 15360
~7,05 ~9,38
![Page 48: PCR Quantitativa - Lucas Secchim Ribeiro (PGMicro UFMG 2015-1)](https://reader030.vdocuments.com.br/reader030/viewer/2022020208/55a656211a28ab56308b466b/html5/thumbnails/48.jpg)
↑ CT ↓ Qtde. inicial↑ CT ↓ Qtde. inicial
Quantidadeinicial
CT
Amostra A 3 9,38
Amostra B 15 7,05
![Page 49: PCR Quantitativa - Lucas Secchim Ribeiro (PGMicro UFMG 2015-1)](https://reader030.vdocuments.com.br/reader030/viewer/2022020208/55a656211a28ab56308b466b/html5/thumbnails/49.jpg)
Conceitos importantes• Quantidade inicial de amostra• Relação CT x Quantidade inicial
![Page 50: PCR Quantitativa - Lucas Secchim Ribeiro (PGMicro UFMG 2015-1)](https://reader030.vdocuments.com.br/reader030/viewer/2022020208/55a656211a28ab56308b466b/html5/thumbnails/50.jpg)
Conceitos importantes• Eficiência
2n = cópias em n ciclos Eficiência teórica= 100%
![Page 51: PCR Quantitativa - Lucas Secchim Ribeiro (PGMicro UFMG 2015-1)](https://reader030.vdocuments.com.br/reader030/viewer/2022020208/55a656211a28ab56308b466b/html5/thumbnails/51.jpg)
Conceitos importantes• Eficiência
Qtde. inicial de
DNA1 10 100 1000 10000 100000 1000000 10000000 100000000
CT 40 35 30 25 20 15 10 5 1
![Page 52: PCR Quantitativa - Lucas Secchim Ribeiro (PGMicro UFMG 2015-1)](https://reader030.vdocuments.com.br/reader030/viewer/2022020208/55a656211a28ab56308b466b/html5/thumbnails/52.jpg)
Log 10da qtde. inicial
0 1 2 3 4 5 6 7 8
CT 40 35 30 25 20 15 10 5 1
Conceitos importantes• Eficiência
![Page 53: PCR Quantitativa - Lucas Secchim Ribeiro (PGMicro UFMG 2015-1)](https://reader030.vdocuments.com.br/reader030/viewer/2022020208/55a656211a28ab56308b466b/html5/thumbnails/53.jpg)
E = 10(-1/slope)
Conceitos importantes• Eficiência
Eficiência 100% = 2n a cada ciclo = log 2 x
Para um aumento de 10x = log 2 10 = 3,32
Slope(inclinação)
![Page 54: PCR Quantitativa - Lucas Secchim Ribeiro (PGMicro UFMG 2015-1)](https://reader030.vdocuments.com.br/reader030/viewer/2022020208/55a656211a28ab56308b466b/html5/thumbnails/54.jpg)
Conceitos importantes• Curva-padrão e blank sample
• Gene de referência/constitutivo/normalizador• Gene de interesse
Controle Infectado
GAPDH IFN-γ Relação GAPDH IFN-γ Relação
Amostra 1 20 20 1 5 40 8,0
Amostra 2 30 40 1,33 5 20 4,0
Amostra 3 60 80 1,33 10 50 5,0
Amostra 4 50 60 1,2 15 80 5,33
Amostra 5 40 50 1,25 10 60 6,0
Média + EPM 1,22 + 0,06 Média + EPM 5,66 + 0,67
![Page 55: PCR Quantitativa - Lucas Secchim Ribeiro (PGMicro UFMG 2015-1)](https://reader030.vdocuments.com.br/reader030/viewer/2022020208/55a656211a28ab56308b466b/html5/thumbnails/55.jpg)
Conceitos importantes• Curva de dissociação (Curva de melting)• Indica a temperatura em que 50% dos primers estão anelados;• Ligação específica do corante à fita dupla
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Conceitos importantes• Curva de dissociação (Curva de melting)• Diretamente relacionada ao conteúdo G:C• Pode apontar amplificação inespecífica e dímeros de primers
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Conceitos importantes• Curva de dissociação (Curva de melting)• Importante para distinção de amplicons/primers em protocolos multiplex
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Fatores que afetam a eficiência da qPCR• DNA degradado• Produtos inespecíficos• Tamanho do amplicon• Condições de termociclagem
• Prática laboratorial inadequada• Reagentes contaminados• Primers mal desenhados• Diluições mal feitas• Falta de calibração e manutenção
• Pipetagem errada!
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Funções da PCR quantitativa• Quantificação absoluta• Curvas-padrão• Quantidade conhecida de “cópias por volume”• Semelhante a um ELISA• Exemplos: carga viral, 16S bacteriano
• Avaliação relativa• Ausência de curva-padrão• Gene de referência para normalização• Apresentada em aumento/redução em relação a um controle experimental• Exemplo: expressão gênica
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CÁLCULOS E ANÁLISES
CÁLCULOS E ANÁLISES
Verificar dispersão entre replicatas biológicas e técnicas
Verificar dispersão entre replicatas biológicas e técnicas
Checar controles positivos(curva-padrão) e negativos (blank)
Checar controles positivos(curva-padrão) e negativos (blank)
Conferir curvas de dissociação (Tm)Conferir curvas de dissociação (Tm)
Verificar ajuste do thresholdVerificar ajuste do threshold
Análise de resultados
Avaliar as curvas de amplificaçãoAvaliar as curvas de amplificação
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Cálculos em qPCR – Quantificação absoluta• Regressão linear simples• Método Pfaffl Método Pfaffl Curva de cópias (plasmídeos) Curva de cópias (plasmídeos)
![Page 62: PCR Quantitativa - Lucas Secchim Ribeiro (PGMicro UFMG 2015-1)](https://reader030.vdocuments.com.br/reader030/viewer/2022020208/55a656211a28ab56308b466b/html5/thumbnails/62.jpg)
Cálculos em qPCR – Quantificação relativa• Relação matemática entre a expressão dos genes de referência e os de interesse• Método Livak Método Livak 2 2--ΔΔΔΔCTCT
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Cálculos em qPCR – Quantificação relativa• Avaliada a conformidade de todos os outros parâmetros, a única informação útil será o CT
• Exemplo:
Controle Infectado
GAPDH IFN-γ GAPDH IFN-γ
Amostra 1 15,1 32,5 14,9 29,4
Amostra 2 15,4 33,1 15,5 29,1
Amostra 3 16,0 32,8 15,1 28,8
Amostra 4 18,1 31,5 15,8 29,9
Amostra 5 15,7 32,0 15,5 28,9
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GAPDH IFN-γ Amostra 1 15,1 32,5 17,4 1,08 0,47Amostra 2 15,4 33,1 17,7 1,38 0,38Amostra 3 16 32,8 16,8 0,48 0,72Amostra 4 18,1 31,5 13,4 -2,92 7,57Amostra 5 15,7 32 16,3 -0,02 1,01
GAPDH IFN-γ Amostra 1 14,9 29,4 14,5 - -1,82 3,53Amostra 2 15,5 29,1 13,6 - -2,72 6,59Amostra 3 15,1 28,8 13,7 - -2,62 6,15Amostra 4 15,8 29,9 14,1 - -2,22 4,66Amostra 5 15,5 28,9 13,4 - -2,92 7,57
Controle
Infectado
ΔCT ΔΔCT 2-ΔΔCT
ΔCT
Média ΔCT
16,32
Média ΔCT ΔΔCT 2-ΔΔCT
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Extração e manuseio de ácidos nucléicos• RNA = extremamente lábil!• Armazenamento correto• Dosagem e normalização das amostras• A260/280 e A260/230 > 1,8
• Contaminação com DNA genômico
Confecção de cDNA• Normalizar a mesma quantidade (p.e. 2 µg) de RNA para todas as amostras;• Todo o procedimento deve ser realizado no gelo;• Ciclos de congelamento/descongelamento;
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Escolha do gene de referência• É necessário ter opções!• Ex.: 18S, GAPDH, RPL4, HPRT para camundongo
• Diferentes estímulos/tecidos/tratamentos podem ter a expressão do gene constitutivo alterada; •Preparar um pool com amostras-controle• 6 diluições em triplicata
• Diferença entre o CT mínimo e máximo < 1,0
•Algoritmos gratuitos na internet•NormFinder: macro para Excel
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Antes da qPCR...• Northern Blotting (RNA)• Southern Blotting (DNA)
![Page 69: PCR Quantitativa - Lucas Secchim Ribeiro (PGMicro UFMG 2015-1)](https://reader030.vdocuments.com.br/reader030/viewer/2022020208/55a656211a28ab56308b466b/html5/thumbnails/69.jpg)
PCRPCRdigitaldigital
![Page 70: PCR Quantitativa - Lucas Secchim Ribeiro (PGMicro UFMG 2015-1)](https://reader030.vdocuments.com.br/reader030/viewer/2022020208/55a656211a28ab56308b466b/html5/thumbnails/70.jpg)
PCR digital (dPCR)
Baseada na compartimentalização da amostra• Gotículas (droplets) em emulsão = microfluidos• Chips com nanopoços
Individualização das moléculas!Distribuição de Poisson
Aplicações• Quantificação absoluta sem curva-padrão• Expressão gênica• Detecção de alelos raros e/ou mutações• Discriminação de baixas diferenças para CNV
![Page 71: PCR Quantitativa - Lucas Secchim Ribeiro (PGMicro UFMG 2015-1)](https://reader030.vdocuments.com.br/reader030/viewer/2022020208/55a656211a28ab56308b466b/html5/thumbnails/71.jpg)
Sample DNA
Target
![Page 72: PCR Quantitativa - Lucas Secchim Ribeiro (PGMicro UFMG 2015-1)](https://reader030.vdocuments.com.br/reader030/viewer/2022020208/55a656211a28ab56308b466b/html5/thumbnails/72.jpg)
Fonte: Baker M, 2012. Nature Methods 9, 541 (Jun 2012)
![Page 73: PCR Quantitativa - Lucas Secchim Ribeiro (PGMicro UFMG 2015-1)](https://reader030.vdocuments.com.br/reader030/viewer/2022020208/55a656211a28ab56308b466b/html5/thumbnails/73.jpg)
http://www.gene-quantification.de/
![Page 74: PCR Quantitativa - Lucas Secchim Ribeiro (PGMicro UFMG 2015-1)](https://reader030.vdocuments.com.br/reader030/viewer/2022020208/55a656211a28ab56308b466b/html5/thumbnails/74.jpg)
![Page 75: PCR Quantitativa - Lucas Secchim Ribeiro (PGMicro UFMG 2015-1)](https://reader030.vdocuments.com.br/reader030/viewer/2022020208/55a656211a28ab56308b466b/html5/thumbnails/75.jpg)
![Page 76: PCR Quantitativa - Lucas Secchim Ribeiro (PGMicro UFMG 2015-1)](https://reader030.vdocuments.com.br/reader030/viewer/2022020208/55a656211a28ab56308b466b/html5/thumbnails/76.jpg)
![Page 77: PCR Quantitativa - Lucas Secchim Ribeiro (PGMicro UFMG 2015-1)](https://reader030.vdocuments.com.br/reader030/viewer/2022020208/55a656211a28ab56308b466b/html5/thumbnails/77.jpg)
O que é importante saber?
• Teoria e suas diferenças entre as técnicas
• Vantagens e desvantagens de cada uma
• Como aplicar a PCR ao seu projeto
• Aplicações gerais e específicas
• Boas práticas laboratoriais
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Lucas Secchim Ribeiro
Dpto. MicrobiologiaLaboratório de Interação Microrganismo-Hospedeiro
Sala C4 191 – Ramal 2735