Micotoxinas y uso de atrapantes
Alvaro Garcia DVM PhD
Hongos y micotoxinas
•Tres géneros: Aspergillus, Fusarium, y Penicillium
• Aspergillus: aflatoxina B1, B2, G1, and G2; ocratoxina A (Aspergillus ochraceus, carbonarius y niger; Penicillium verrucosum); patulina
• Fusarium: zearalenona, fumonisinas (B1), deoxynivalenol (DON), tricotecenos (T-2 y HT-2, diacetoxiscirpenol, nivalenol).
• Penicillium: P. verrucosum (Ocratoxina A); P. patulinum (patulina), toxina PR, acido micofenólico y roquefortina C
PROBLEMAS EN LAS AMERICAS
• Centro América FUM y DON más frecuentes (84% y 75%). Maíz, FUM en 98% de muestras; promedio de 2,426 ppb.
• América del Sur FUM (84%) promedio de 2,331 ppb. DON es problema en trigo, promedio de 3,122 ppb.
• Norteamérica. DON con 82% prevalencia seguido de FUM y ZEN (52% y 48%). En maíz prevalencia similar y promedios de 2,345 ppb FUM, 767 ppb DON y 390 ppb ZEN.
Fuente: BIOMIN
FUSARIUMASPERGILLUM
PENICILLIUM
Micotoxinas
• Esporas de hongos en aire, tierra y equipo
• Oportunistas; aprovechan estrés, daño, debilidad.
• Del crecimiento a la cosecha, transporte y almacenaje.
• Pre-cosecha (Aspergillus y Fusarium)
• Post-cosecha almacenamiento y transporte (Ocratoxina A)
Hongos y micotoxinas en alimentos
•Más alimentos en raciones: positivo y negativo
•Efectos:
1. Aditivos
2. Antagonistas
3. Sinergísticos
EFECTOS
•Específicos crónicos (hepatotóxico, genotóxico,
nefrotóxico, neurotóxico, reprotóxico, inmunotóxico, etc).
•No-específicos negativos sobre salud animal, susceptibilidad
a enfermedades y desempeño pobre.
• Inhibidores (ej. Ác. Propiónico, 5-10 kg/ton en maíz alta humedad) Eficaz al almacenaje no tiene sentido después.
• Inhibidores no tienen efecto contra micotoxinas.
•Evitar exposición al aire (almacenaje y suministro)
•Potenciar fermentación (ej. Inoculantes bacterianos)
Prevenir contaminación
• Separadores: aire, tamizado y densidad.
• Reduce toxinas (hasta 89%!).
• Cuanto más arriba en la tolva más toxinas (Muestreo!!!)
• Se pierde 8% del material o más
El uso de alimentos contaminados
PASOS
1. Reducir polvillo, mezclar grano limpio (FÁBRICAS DE RACIONES NO!)
2. Determinar hongos y micotoxinas presentes y concentración.
3. Reducir estrés animal:
*confort animal
*vitaminas A, E y Se.
*agentes atrapantes
Análisis de micotoxinas
Análisis rápidos y más lentos
• Ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA)
• Prueba de flujo lateral
• Cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC)
• HPLC acoplado a espectrometría de masa (LC-MS) o
espectrometría de masa en tándem (LC-MS/MS)
• Espectrometría de infrarrojo cercano (NIRS)
Opción a seleccionar?
• Métodos rápidos analizan pocos alimentos.
• Raciones es mejor usar análisis más completo.
• Test rápido resultados no concluyentes aún con síntomas.
• Analizar con HPLC o LC-MS/MS.
• Hay micotoxinas que aún no tienen análisis concluyentes.
ELISA(Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a Enzimas)
• Hasta 6 micotoxinas con una sóla extracción.
• Ideal para medir múltiples muestras en paralelo.
• Tiempo de incubación: 15’ hasta 42 muestras.
• Ventajas: rapidez, costo; bueno para estimación primaria.
• Desventajas: sólo detecta materias primas y principales micotoxinas.
Mínimo de 30 muestras por kit.
ELISA
Micotoxina en solución compite con cantidad conocida de toxinamarcada y añadida a la reacción (pasos 1 y 2). Después de lavarlos elementos acoplados, se añade solución que excita la toxina ycambia de color (paso 3).
Fuente: BIOMIN
Prueba de flujo lateral
• Análisis rápido in situ, varios alimentos; menos de 10’.
• Sólo materias primas. Analiza: AFLA, DON, ZEN y FUM.
• Kits convencionales usan solvente orgánico
• Kits que usan agua (costo; mantener y prod. químicos)
Fuente: BIOMIN
Prueba de flujo lateral
Almohadilla absorbente
membrana
Positivo Negativo
Almohadilla dorada
Tubo de muestra
Almohadilla filtro
Línea de test
Línea de control
HPLC“Cromatografía líquida de alto rendimiento”
• Solvente y muestra pasan a presión por columna de material adsorbente.Toxinas interactúan con adsorbente de la columna a diferentes velocidades,separándolas. Detector cuantifica micotoxinas y compara su señal con la deestándares preestablecidos.
• Varios detectores disponibles: espectrofotómetros, refractómetros,detectores de fluorescencia y espectrómetros de masa.
• Alta sensibilidad, pequeña cantidad de muestra, fiabilidad y precisión. Llevatiempo, es costosa, necesita técnicos calificados.
HPLC acoplado a espectrómetro de masa (LC-MS y MS-MS)
LC-MS Combina separación HPLC condetección de masa y característicasestructurales de la muestra. En HPLCy masa en tándem (MS-MS) iones decomponentes individuales se miden,luego se fragmentan y cada fragmentose vuelve a medir en un segundo paso. Fuente: BIOMIN
NIRS“Espectrometría de infrarrojo cercano”
• Mide interacción entre radiación infrarroja y enlaces químicos. La radiaciónreflejada por la muestra determina las vibraciones de enlaces químicos.
• Requiere curva de correlación compleja. Las muestras de calibración paracualquier método NIRS deben obtenerse mediante HPLC o HPLC/MS.
• Mide cambios en la matriz analizada y no las micotoxinas (muy baja masamolecular). Metabolitos fúngicos muy tóxicos a bajas concentraciones.
Niveles de acción
ZEA: No hay niveles de acción de la FDA
aCondiciones favorables para toxinas? Analizar. Evaluar síntomas. Limitar alimento sihay efectos moderados en rendimiento; retirarlo si son severos o hay síntomas.
bPotencialmente nocivo –Puede afectar rendimiento o producir síntomas.Interrumpir alimento temporalmente si hay síntomas. Observar los animales decerca en ausencia de síntomas y analizar más alimentos o RTM.
cMSRT - materia seca de ración total.
Zearalenona (ppb) Concentración a Bovinos b Suinos b
Alimento mayoritario base MS 560 5,600-10,000 1,100-5,600MSRT c 560 3,900 7,000
Alimentos más peligrosos
• Contribución de cada alimento al total de micotoxinas de la dieta no bien descrita en la literatura.
• Función de contaminación individual de cada alimento y su % de inclusión en la dieta.
• Alimentos más propensos a tener concentraciones mayores rara vez plantean problema por la cantidad incluida.
• Ingredientes múltiples diluyen toxinas haciendo la dieta más segura. • Efecto aditivo: ingredientes múltiples contaminados.
Uso de atrapantes en dietas y alimentos
Agentes atrapantes o anti-apelmazado
• Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA):
No considera seguros los agentes atrapantes (“binders”). Petición de aprobación para comercializarlos con ese fin. De base arcillosa como anti-apelmazantes (GRAS; 2% máximo).Adsorción uniforme? Que sucede con diferentes pHs?
• Comisión Europea (2009) amplió definición incluyendo:
“Materiales que suprimen o reducen la absorción de micotoxinas, promueven la excreción de micotoxinas o modifican su modo de acción y, por lo tanto, mitigan
los posibles efectos adversos de las micotoxinas sobre la salud animal".
Alternativas del nutricionista
• Objetivo principal: prevenir efecto de las toxinas.
• Intervenciones nutricionales para estimular inmunidad.
• Prácticas de manejo para reducir el estrés.
• Aditivos para neutralizar o bloquear las toxinas.
• Atrapantes para ligar la toxina y que no se absorba.
Propiedades “ideales” del atrapante
1. No afecta la salud ni a la producción animal
2. Produce adsorción estable con la toxina
3. Eficaz bajo diversos porciones del tubo digestivo
4. No afecta el medio ambiente al ser excretado
Modos de acción de los atrapantes
1. Ligar las toxinas para disminuir su absorción.2. Inactivarlas.3. Modificar enzimas del animal para que reduzcan la toxicidad
de las toxinas.
Clasificación de atrapantes
1. Inorgánicos 2. Orgánicos
Clasificación de atrapantesInorgánicos (compuestos de sílice)
• Aluminosilicatos• Filosilicatos
BentonitasMontmorillonitasHSCAS (Alimunosilicato hidratado de Na y Ca) Smectitas Kaolinitas Illitas
• Tectosilicatos Zeolitas
• Carbón activado• Polímeros sintéticos
Fibra dietética Polivinilpirrolidona Colestiramina
Orgánicos (compuestos de carbono)
• Saccharomyces cerevisiaeLevadura vivaParedes celulares de levadura/glucomananos
• LactobacilosLactococcusLactobacillusLeuconostocPediococcus
Atrapantes Orgánicos
• Fracción-d-glucano participa de la unión con las toxinas
• Su estructura modula la fuerza de los enlaces de H
• Dosis de levadura activa 1-2 kg/ton ó 20 g/día por vaca
• Contra más amplia gama de toxinas que inorgánicos
• Ventaja adicional: biodegradabilidad
• Reconocidos como atrapantes eficientes de toxinas agregados al 1% de la MS de la dieta.
• Eficacia contra toxinas de fusarium es casi nula (zearalenona, fumonisinas y trichotecenos).
• Adsorción 40 al 60 %. Fuerza del enlace depende de estructura química del atrapante (ej. carga eléctrica, porosidad) y de la toxina (ej. carga, solubilidad, forma).
Atrapantes Inorgánicos
Efecto de los Atrapantes
• Inorgánicos: redujeron AFM1 en leche sin afectar producción.
• 1er exp.: Aluminosilicato hidratado de Na y Ca (HSCAS) al 0,56% redujo AFM1 46%.
• 2º exp.: Aluminosilicato (HSCAS) al 1% MS redujo AFM1 51,9%
• 3er exp.: Aluminosilicato (HSCAS) al 2% y 4% MS redujeron AFM1 82,2% y 86,9%.
• Bentonita al 1,2% redujo AFM1 58% con un producto y 65% con otro.
• Orgánico (glucomanano de levadura) al 0.05% resultado inconsistente: un exp.
redujo AFM1 58,5% otro 4%!
Efecto de varios atrapantes comerciales sobe aflatoxinas
Nombre comercial Ingrediente activo % MS % Adsorción
Flow Guard 1 Bentonita de sodio 1.0 65
Astra-Ben-20 1 Bentonita de sodio 0.05 61
Mycosorb 1 Bentonita de sodio 1.0 50
RedCrown 1 Bentonita de calcio 0.25 31
MTB-100 1 Glucomanano esterificado 1.0 59
Solis 2 Aluminosilicato Na Ca 0.5 45
NovasilPlus 2 Aluminosilicato Na Ca 0.5 46
1 Diaz et al. 2004; 2 Kutz et al. 2009
Atrapantes inorgánicos efectivos en experimentos publicadosGrupo Producto Compañía Toxina
Aluminosilicatos
Bentonitas
Astra Ben 20® (B. de Na)Prince Agri products
AFB1 AFM1
Red Crown® (B. de Ca)
Flow Guard® (B. de Na) Laporte Biochem, INC
Microsorb® (B. de Na) American Colloid Co.
Volclay FD-181 (B. de Na) Volclay Intern. PTY Ltd. AFB1
Bentonita de Na - AFB1 FB1
Bentonita Sigma Chemical FB1
Atrapantes inorgánicos efectivos en experimentos publicadosGrupo Producto Compañía Toxina
Montmorillonitas
Mont. Organophil modificado Sud-Chemie AFB1; ZEAMont. de sodio y calcio Engelhart Chem. Corp. DON; ZEA
Montmorillonita Aldrich Chem. AFMont. modif. nanocompósito Feed Science Inst. China AF
MilbondTX. Mont. base arcilla Milwhite Inc. AFB1
ZeolitasCinoptilolita Engelhart Chem. Corp. AFAluminosilicato hidrat. Ca K Na Silver and Byte Ores Mining
Co.AF
HSCASNovaSil Engelhart Chem. Corp. AFB1;AFM1Myco-Ad®Zeolex®
Special nutrients Toxina T-2
Carbón activadoCarbón activado SIGMA
F.I.S.AFB1, AFM1; ZEA;
FB1, FB2; OTA; DON
Atrapantes orgánicos efectivos en experimentos publicados.Grupo Producto Compañía ToxinaParedes celulares de levadura
Paredes celulares de levadura AlltechLesaffre
AF; ZEA; OTA; Toxina T-2
MTB-100® (polímero de glucomananoextraído de pared celular de levadura)
Alltech
AFB1, AFM1; ZEA; OTA; Toxina T-2, DAS, moniliformina, FB1; ác.
fusáricoMycosorb® (basado en glucano de levadura, polímero de glucomanano
AFB1, AFM1; ZEA; DON; FB1; OTA; Toxina T-2, NIV
Glucomanano esterificado AFB1; OTA; Toxina T-2
EX16® (vinasa conteniendo 16% de pared celular de levadura)
Lesaffre
OTABETA® (beta glucano purificado de pared celular de levadura)
Lesaffre
LEC® (pared celular de levadura seca) Lesaffre
Atrapantes orgánicos efectivos en experimentos publicados.Grupo Producto Compañía Toxina
LevadurasTrichosporon mycotoxinivorans ZEA; OTA; DONPhaffia rhodozyma y xanthophyllomyces dendrorhous OTA
AFMycotox® (Oxicinol, tymol, levadura micronizada)
Mycofix Plus® (desactiva toxinas; contiene lalevadura Trichosporon mycotoxinivorans (poder deadsorción) y actividades de epoxidasa y lactonasa.
Biomin
FB1; ZEA; DON; NIV;
DAS; toxina T-2, OTA
Enzymas FUMzyme® Estearasa de fumonisina. Transforma fumonisinas en metabolitos no tóxicos.
FUM
Mensajes para llevar a casa
1. Analizar la ración completa y/o los ingredientes riesgosos
2. No almacenar mucho tiempo grano partido, no usar
barridos de molinos y eliminar contaminantes
3. Agregar atrapantes a la TMR o a alimentos riesgosos
4. Fortalecer Vitaminas A, E y Selenio
5. Evitar estrés y estar atento a sintomatología inespecífica
Preguntas?
Metabolismo en rumiantes
• ASPERGILLUS: AFB1 (rumen aflatoxicol AFM1 (hígado) leche
• FUSARIUM:
ZEA rumen α-zearalenol (estrogénico) y β-zearalenol (tóxico para endometrio)
TRIdiacetoxiscirpenol (DAS), toxinas T-2 y HT-2, nivalenol, and deoxinivalenol (DON) lesiones gastrointestinales, inmunidad
• PENICILLIUM: Ocra-A degradación ruminal daño hepático y renal (terneros)
Rumiantes
•AF B1 (42% degradada) AFM1 en leche (1-2% de AFB1
ingerida)
•En vacas de alta producción puede llegar al 6%.
•Concentración máxima de M1 en leche 0,05 g/kg (UE).
Alimentos mas peligrosos en Ganado lechero
• Contribución de AFB1 y DON a la dieta de vacas lecheras. • Toxinas de muestras de 6 años de análisis del Dairy One
(2000-2016). • Número de muestras: mínimo 20 para h. de soya máximo
1.480 para silo de maíz. • RTM de vaca lechera: silo de maíz (27,7%), maíz grano
(21,0%), DDGS grasa reducida (20%), heno alfalfa (19,3%), harina de soy (4,1%), heno hierba (3 %), otros aditivos (4,9%).
Maíz seco
• Muestras promediaron 17,4 ppb de AFB1 (toxina presente en concentración más alta). Valor máximo: 146 ppb.
• AFB1: Maíz al 21% contribuiría 3,7 ppb y 36,5 ppb con concentraciones de toxina medias y máx. respectivamente.
• DON: valor medio casi 1 ppm, máximo 3,6 ppm.
• Maíz al 21% DON sería 0,21 ppm y 0,8 ppm para concentraciones medias y altas, respectivamente.
Silo de maíz
• AFB1: 1 ppb promedio y máximo de 8,5 ppb.
• DON: valor medios de 1,6 ppm y máx. de 4,7 ppm.
• A la tasa de inclusión del ejemplo DON sería de 0,44 ppm y 1,3 ppm para valores medios y altos, respectiv.
• El silo de maíz contribuye menos AFB1 a la dieta que el grano, pero podría ser significativo para DON.
Granos de Destilería (DDGS)
• Muestras (n = 346) menor riesgo a AFB1 y DON que maíz o silo de maíz.
• AFB1: promedio de 0,5 ppb (menor al del maíz).Máx. 3,5 ppb, por debajo de 146 ppm del maíz, media y
máx. de AFB1 fue la mitad del silo de maíz.
• DON: promedio de 2,4 ppm con máximo de 4,8 ppm.
• Medidas de control de calidad en biorrefinerías.
Harina de soya
• H. de soja a baja inclusión (4,1 %), contribuye poco.
• AFB1: Promedio 6,2 ppb. Casi 6 veces más que silo de maíz y 12 veces más que DDGS. Máx. 24,6 ppb, 3 veces más que silo de maíz y mayor que DDGS.
• AFB1 0,37 ppb y 1 ppb para concen. medias y altas, respectiv.
• Terneros y monogástricos?
Pepa de algodón
• No incluida en esta dieta; proteína, energía y fibra eficaz
• AFB1: Muestras (62) promedio 26 ppb y máx. 188 ppb.; 29% más que el máx. del maíz.
• Al 6% (1.6 kg/d) de la MS, añadiría 1,6 ppb y 11 ppb para la concentración media y alta de AFB1 respectivamente.
• Puede inclinar la balanza cuando los valores generales están al límite de la toxicidad.
Maíz de alta humedad
• AFB1: Promedió la mitad (8,7 ppb) del maíz seco (17,4 ppb).
• AFB1: Valor máx. 42% menor que máx. del maíz (145,9 ppb vs. 102,8 ppb).
• DON tendencia opuesta; mayor en maíz alta humedad (2,63 ppm prom., 6,40 ppm máx.) vs. maíz seco (0,96 ppm promedio; 3,63 ppm máx.).
Gluten feed húmedo
• AFB1: segunda después del silo para el promedio y para los valores máx.
• DON: mayor de todos los alimentos húmedos, prom. 3,8 ppm y máx. 13,1 ppm.
• Buena fuente de proteína (alrededor del 24%) y altamente palatable.
• AFB1 y DON valores bajos comparado con otros alimentos húmedos.
Grano húmedo de cervecería
Ración total mezclada
• Pepa de algodón se incluyó al 6% de la MS en la evaluación final con fines ilustrativos.
• AFB1 El ingrediente más riesgoso a concentraciones medias y máx. Fue el maíz, luego pepa de algodón, y silo de maíz.
• El más seguro harina de soya (baja inclusión en la dieta).
• Con DDGS al 20% de la MS su contribución de toxinas fue insignificante incluso a su concentración máx.
Contribución de toxinas de los alimentos
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Maiz Silo maiz DDGS H. de soya Pepa algodon
AFB1 Promedio AFB1 Alta DON Promedio DON Alto