Download - Metodos Rapidos de Analise Microbiologica
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTASDepartamento de Ciências dos AlimentosBacharelado em Química de Alimentos
Disciplina de Seminários
Métodos rápidos de análise microbiológica
Júlia Coswig Goldbeck
Pelotas, 2008.
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Júlia Coswig Goldbeck
Métodos rápidos de análise microbiológica
Trabalho acadêmico apresentado ao
Curso de Bacharelado em Química
de Alimentos da Universidade
Federal de Pelotas, como requisito
parcial da disciplina de seminários.
Orientadora: Josiane Chim
Co-Orientadora: Carla Mendonça
Pelotas, 2008.
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Agradecimentos
À colaboração de todos integrantes da Microbial, em especial a Msc. Andréia
Saldanha de Lima e ao Prof. Dr. Wladimir Padilha da Silva, pela orientação,
confiança e oportunidade de crescimento pessoal e profissional.
À Profa. Dra. Miriam Galvão e Dra. Caroline Borges, pela orientação e
conhecimentos transmitidos.
Às orientadoras da referente disciplina, Profa. Dra. Carla Mendonça e Profa.
Josiane Chim.
Aos amigos, e ao apoio e compreensão do meu companheiro de todas as
horas, Wilson Colvara.
Ao órgão apoiador de minha graduação, CNPQ, pela concessão de bolsa
Iniciação Científica.
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“ A descoberta consiste em ver o que todo mundo viu e pensar no que
ninguém pensou. "( Jonathan Swift )
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GOLDBECK, Júlia C. Métodos rápidos de análise microbiológica. 2008. 32f.
Trabalho acadêmico. Bacharelado em Química de Alimentos. Universidade Federal
de Pelotas.
Resumo
A necessidade de rapidez dos resultados de análise, fez surgir os métodos rápidos
de análise microbiológica. Os métodos rápidos possuem várias vantagens, como
diminuição de custos para a empresa, facilidade de leitura e interpretação dos
resultados, bem como, simplificação de tarefas. Alguns desses métodos já são
aprovados pela AOAC, porém, resultados positivos devem ser apenas presuntivos,
enquanto que resultados negativos são considerados confirmatórios. Sob visão
geral, os métodos são projetados especificamente para identificar um grupo ou
espécie bacteriana. Quase todos os métodos rápidos são projetados para identificar
um único alvo, o que os torna muito eficientes em programas de qualidade. Os
testes são similares no formato e desempenho e possuem de 90 – 99% de exatidão
quando comparados a métodos convencionais, sendo que os resultados são obtidos
em alguns minutos, segundos ou em algumas horas. Os métodos rápidos são
divididos em métodos para avaliar a qualidade e métodos para avaliar a inocuidade.
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Lista de tabelas
Tabela 1 – Alguns sistemas baseados em ensaios imunoenzimáticos
encontrados no mercado.................................................................................. 23
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Lista de figuras
Figura 1 – Microscópio fluorogênico, usado para contagem de microrganismos e
conseqüente formação de colônias........................................................................... 18
Figura 2 – Placas PetrifilmTM prontas para uso.........................................................
Figura 3 – Reação antígeno anticorpo que ocorre no “Kit” ELISA.............................
Figura 4 – Eletroforese em gel de agarose................................................................
18
26
28
Figura 5 – Bax® System, sistema automatizado de PCR real time........................... 28
Figura 6 – Riboprinter® System da DuPont Qualicon, usado para identificar e
caracterizar bactérias de forma automatizada........................................................... 29
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Sumário
1 Introdução................................................................................................... 102 Métodos rápidos........................................................................................ 122.1 Métodos convencionais x métodos rápidos........................................ 133 Técnicas rápidas para a identificação de microrganismos................... 153.1 Métodos para avaliar a qualidade......................................................... 153.1.1 Métodos de contagem direta.............................................................. 153.1.1.1 Técnica de membrana filtrante........................................................ 153.1.1.2 Técnica de epifluorescência direta................................................. 163.1.1.3 Técnica fluorogênica........................................................................ 173.1.1.4 Sistemas prontos para uso.............................................................. 183.1.2 Métodos de contagem indireta........................................................... 193.1.2.1 Bioluminescência............................................................................. 203.1.2.2 Impedância/condutância.................................................................. 213.1.2.3 Placas SIMPLATETM......................................................................... 213.2 Métodos para avaliar a inocuidade....................................................... 223.2.1 Métodos bioquímicos.......................................................................... 223.2.2 Métodos imunológicos........................................................................ 223.2.2.1 Ensaios imunoenzimáticos.............................................................. 223.2.2.2 Imunocaptura.................................................................................... 233.2.2.3 Imunoimobilização............................................................................ 243.2.2.4 Coaglutinação................................................................................... 243.2.2.5 ELISA................................................................................................ 24
3.2.3 Métodos moleculares.......................................................................... 263.2.3.1 Sondas genéticas............................................................................ 263.2.3.2 Reação de Polimerase em cadeia (PCR)........................................ 26
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3.2.3.3 Bacteriófagos com DNA modificado............................................... 28
3.2.3.4 Ribotipagem...................................................................................... 284 Conclusões ................................................................................................ 30Referências.................................................................................................... 32
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1. Introdução
É impossível determinar exatamente quando, na história da humanidade, o
homem tomou conhecimento da existência de microrganismos e da sua importância
para os alimentos.
Após o período no qual o ser humano tinha a sua alimentação baseada
apenas nos abundantes recursos da natureza, o homem passou a plantar, criar
animais e produzir o seu próprio alimento. Com o surgimento de alimentos
preparados, começaram a ocorrer os problemas relacionados com doenças
transmitidas pelos alimentos e com a rápida deterioração dos mesmos,
principalmente pela conservação inadequada (FRANCO, 1999).
Entre os vários parâmetros que determinam a qualidade de um produto, os
mais importantes são, sem dúvida, aqueles que diferem as suas características
microbiológicas. A avaliação microbiológica do alimento fornece informações que
permitem avaliá-lo quanto às condições em relação à saúde da população.
Para que a análise microbiológica seja conduzida de forma que os resultados
obtidos permitam um julgamento correto do produto analisado, é necessário que os
critérios de avaliação sejam claramente estabelecidos. Esses critérios são definidos
de modo a permitir uma avaliação segura e válida.
Os critérios de avaliação são estabelecidos pela legislação de cada país, e
em nível internacional, por um programa conjunto FAO/WHO, da Organização das
Nações Unidas (Joint FAO/WHO Food Standards Program) e através da comissão
do Codex Alimentarius.
No Brasil, padrões microbiológicos para alimentos são definidos em nível
federal, pelo Ministério da Saúde sob RDC n° 12 de 02 de janeiro de 2001, devem
ser aprovados pela Association of Official Analytical Chemists (AOAC). Em nível
estadual, alguns estados de federação, como São Paulo, têm legislação própria.
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Logo, a análise de alimentos para se verificar quais e quantos microrganismos
estão presentes é fundamental, não somente para conhecer as condições de higiene
de determinado produto, como também é para observar se os padrões e
especificações microbiológicos, nacionais ou internacionais, estão sendo atendidos
adequadamente (FRANCO & LANDGRAF, 1996).
Atualmente, a análise microbiológica de um alimento pode ser realizada
através dos métodos “convencionais”, aqueles desenvolvidos há muitos anos e que
ainda vêm sendo empregados como métodos oficiais, ou métodos rápidos, ao quais
vêm se desenvolvendo de forma espantosa devido a sua praticidade.
Portanto, o objetivo do presente trabalho, foi conhecer as características, bem
como as vantagens e desvantagens, em relação aos métodos convencionais, de
alguns métodos rápidos empregados na análise microbiológica de alimentos.
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2. Métodos rápidos
Os métodos rápidos surgiram a partir da década de 70, como conseqüência da
necessidade de se abreviar o tempo necessário para a obtenção de resultados
analíticos e de se melhorar a produtividade laboratorial (HAJDENWURCEL, 1998).
São utilizados, geralmente, como técnicas de seleção e a fim de garantir a
segurança dos consumidores. Sob visão geral, a maioria desses métodos consiste
em um dispositivo descartável que contém 15 a 30 meios ou carcaças, projetados
especificamente para identificar um grupo ou uma espécie bacteriana. Os testes são
similares no formato e no desempenho e possuem exatidão de 90 – 99% quando
comparados a métodos convencionais (FUNG et al., 2000)
A maioria dos testes são projetados para identificar/quantificar as bactérias
entéricas, como também Campylobacter, Listeria, bactérias anaeróbias, gran
negativas e gran positivas. Os métodos rápidos mais encontrados no mercado são
os para contagem de coliformes totais e Escherichia coli, contagem de bolores e
leveduras, detecção de Salmonella spp. e Listeria, monocytogenes
(HAJDENWURCEL, 1998).
Quase todos os métodos rápidos são projetados para detectar um único alvo,
o que os torna eficientes em programas de controle de qualidade por selecionar
rapidamente um grande número de amostras contaminadas por um determinado
patógeno (YUSTE, 2007).
Os resultados com a utilização dos métodos rápidos podem se dar em alguns
minutos, segundos ou algumas horas e, as avaliações dos mesmos, mostram que o
bom desempenho desses métodos está relacionado com o tipo de alimento. Isto
pode ser atribuído, na maioria das vezes devido à composição química do alimento,
por isso, é aconselhável executar estudos comparativos para assegurar a eficiência
da análise (FRAQUEZA, 2002).
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Ainda são poucos os métodos validados oficialmente para alimentos, porém, vários
métodos alternativos de contagem têm sido proposto nos últimos anos, tem se
observado que a área de métodos rápidos desenvolve-se de forma espantosa.
Porém, muitos dos chamados “novos métodos em microbiologia de alimentos” nada
tem de “novos”, são na verdade resultados da transposição de métodos há muito
tempo utilizados em outras áreas da microbiologia.
2.1 Métodos convencionais X métodos rápidos
Os métodos convencionais recebem essa denominação porque foram
desenvolvidos há muitos anos e desde então vem sendo empregados como
métodos oficiais na maioria dos laboratórios de microbiologia de alimentos. Esses
métodos estão descritos em publicações consideradas de referência,
internacionalmente aceitos e recomendados pela American Public Health
Association (APHA), pelo International Commission on Microbiological Specification
for Foods (ICMSF) e pela Food and Drug Administration (FDA).
O método convencional de contagem de microrganismos consiste
basicamente no plaqueamento de alíquotas do produto homogeneizado e de suas
diluições em meios de cultura sólidos, adequadamente selecionados em função do
microrganismo a ser enumerado. O plaqueamento pode ser feito por semeadura na
superfície do meio de cultura previamente distribuído em placas de Petri estéreis
(semeadura em superfície), ou então o meio de cultura pode ser adicionado após a
transferência das alíquotas para as placas de Petri vazias (semeadura em
profundidade). As placas são então incubadas a uma combinação de tempo e
temperatura adequada para a determinação a ser feita, durante a qual os
microrganismos se multiplicam formando as colônias visíveis, que podem ser
enumeradas manualmente ou com o auxílio de contadores automáticos (FRANCO,
1999).
Apesar da aparente simplicidade dessa técnica, ela é bastante trabalhosa e
sujeita a erros, levando em consideração que: os microrganismos estão arranjados
em pares, tétrades, cadeias e cachos, conseqüentemente, o número de colônias que
aparece na placa não corresponde ao número de células individuais presentes, além
disso, quando muitas diluições precisam ser plaqueadas também pode haver erros,
bem como algumas partículas de alimentos podem ser confundidas com colônias,
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levando a um falso resultado positivo, sendo a leitura dos resultados bastante difícil,
pois pode variar de acordo com o analista, além de ser cansativa e imprecisa,
mesmo quando contadores automáticos são empregados (SILVEIRA et al.,1997).
Visando minimizar estes problemas, surgiram os métodos alternativos
(métodos rápidos), que apresentam a conveniência de produzirem resultados mais
rápidos, sensíveis e específicos, se comparados às técnicas convencionais. Tais
métodos também podem oferecer economia de espaço e materiais, aumentando a
produtividade laboratorial. Alternando a necessidade de rapidez dos resultados de
análises microbiológicas, em face do alto volume de alimentos à disposição do
consumidor em curto espaço de tempo (SILVA, 1996).
Como vantagens dos métodos rápidos, pode-se enumerar:
Redução do tempo de análise;
Menor tempo de retenção do produto na indústria;
Diminuição de custos;
Simplificação das tarefas envolvidos na análise;
Facilidade de leitura dos resultados;
Especificidade;
Maior sensibilidade de alguns métodos quando comparados com os
métodos convencionais.
Contudo, ao se escolher e implantar os métodos rápidos deve se levar em
conta parâmetros como precisão, custo, tempo de análise, aceitabilidade pelos
órgãos oficiais, simplicidade de operação, assistência técnica dos fabricantes e
disponibilidade de espaço no laboratório. Porém, segundo Feng (1995), os métodos
rápidos aprovados pelos órgãos oficiais podem ser utilizados somente para controle,
sendo que os resultados negativos são considerados como definitivos, mas
resultados positivos são considerados presuntivos e devem ser confirmados por
métodos padrões.
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3. Técnicas rápidas para a identificação de microrganismos
Os métodos rápidos podem ser divididos em dois grupos: métodos para
avaliar a qualidade e métodos para avaliar a inocuidade (SILVEIRA, 2006). Os
métodos que avaliam a qualidade do alimento estão mais relacionados aos
microrganismos deteriorantes, aqueles não patogênicos, já os métodos que avaliam
a inocuidade, quantificam/identificam microrganismos patogênicos.
3.1 Métodos para avaliar a qualidade
3.1.1 Métodos de contagem direta
3.1.1.1 Técnica de membrana filtrante
Utilizada há bastante tempo para enumeração de coliformes totais, fecais e
Escherichia coli em água, porém, seu uso em alimentos é mais recente. A mistura
alimento-diluente é filtrada através de membranas filtrantes de acetato de celulose
ou de nitrocelulose que tem porosidade suficiente (0,45µm) para retenção dos
microrganismos presentes nessa mistura. Em seguida as membranas são
transferidas para a superfície de placas contendo ágar ou cartões absorventes
saturados com meio de cultura. Após o tempo de incubação adequado para cada
microrganismo, faz-se a enumeração das colônias que surgiram na superfície das
membranas. A contagem pode ser facilitada pelo emprego de membranas
quadriculadas e pelo uso de contadores automáticos.
A técnica das membranas filtrantes apresenta as seguintes vantagens:
Remove os componentes do alimento que podem interferir no
crescimento microbiano (sólidos em suspensão ou agentes
antimicrobianos);
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Microrganismos presentes em pequeno número, por vezes não
detectáveis em outras técnicas, podem ser “concentrados” pela filtração
de volume maior da amostra;
Permite a contagem de 1 até 1,6x10-3 UFC por membrana, o que elimina
a necessidade de diluição;
As colônias são coradas para facilitar a visualização.
O uso de membranas Isogrid é aprovado pela AOAC para enumeração de
bactérias totais, coliformes totais, Escherichi coli e Salmonella, sendo também
aprovados diversos tratamentos enzimáticos que podem ser utilizados em função do
tipo de alimento, para melhorar a filtrabilidade.
Além da aprovação oficial, as membranas podem ser também utilizadas para a
pesquisa de Staphylococcus aureus, V. parahaemolyticus, Y. enterocolítica, C.
perfringens, P. aeruginosa, bactérias gran negativas e estreptococus fecais. Sua
aplicação em alimentos como leite, carne, condimentos, farinhas vegetais, frutos do
mar e outros têm apresentado ótimos resultados (MACHADO, 2007).
3.1.1.2 Técnica de epifluorescência direta
Técnica rápida de contagem de microrganismos que não depende de seu
cultivo e conseqüente formação de colônias. Os microrganismos viáveis e não
viáveis são enumerados por microscopia, sendo uma das técnicas que oferece
resultados mais rapidamente. A amostra devidamente homogeneizada tratada com
enzimas e tensoativos, se necessário, é filtrada através de uma membrana de
policarbonato, que retém os microrganismos. Essa membrana é então corada com
fluorocromo nucleofílico (alaranjado de acridina) e observada em um microscópio de
fluorescência. O corante permite a diferenciação das células viáveis, pois o DNA e
RNA corados apresentam fluorescência de coloração diferente, em função da fase
de crescimento microbiano. As células viáveis apresentam fluorescência laranja-
avermelhado, enquanto células mortas têm fluorescência verde. A epifluorescência
direta tem boa sensibilidade, resultante da concentração das células na superfície da
membrana filtrante. Tem sido bastante usada em leite.
Essa técnica, porém,apresenta algumas desvantagens:
Técnica muito cansativa;
Injúria de bactérias devido ao calor pode alterar a fluorescência;
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O custo elevado dos equipamentos torna seu uso limitado a grandes
laboratórios (MACHADO, 2007).
3.1.1.3 Técnica fluorogênica
Os testes baseados na adição de MUG (4-metil-umbeliferil-β-D-glicuronideo) a
um caldo de cultura para detecção de Escherichia coli., são exemplos desta técnica.
A enzima β-glicuronidase produzida pela grande maioria das cepas desse
microrganismo transforma o MUG em umbeliferona, fluorescente quando observado
sob luz ultravioleta de onda longa. A observação do número de tubos turvos, com
gás e fluorescentes após 24 ou 48h, permite o cálculo do número mais provável de
E. coli por grama (ou mL) do produto (MACHADO, 2007).
Este método oferece como vantagens:
- Rapidez e facilidade de usar;
- Identificação direta e enumeração de Escherichia coli ou enterococos em 36
horas (em comparação com 3 ou 4 dias usando métodos tradicionais);
- Dispensa a preparação de meio de cultura;
- Emprega microplacas estéreis e prontas para uso;
- Padronização do preparo, incubação e técnica de leitura para E. coli e
Enterococcus;
- Detecção da atividade de uma enzima específica de cada bactéria por
microplaca;
- Resultados confiáveis;
- Economia de tempo e material.
A Fig. 1 representa ilustrativamente um microscópio fluorogênico, usado
nesta técnica para enumerar as células viáveis não viáveis.
Figura 1 – Microscópio fluorogênico, usado para contagem de microrganismos.Fonte: Google imagens (Epifluorescência direta), 2008.
3.1.1.4 Sistemas prontos para uso
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Existem diferentes sistemas disponíveis comercialmente, com princípios
distintos, nos quais os meios de cultura já vêm prontos para uso, muitas vezes já na
própria placa de petri. Entre esses, destacam-se as Placas de Petrifilm-3M, Placas
de Simplate e diversos ágares adicionados de substratos cromogênicos ou
fluorogênicos.
As placas PetrifilmTM são produzidas e comercializadas pela 3M, são filmes de
papel quadriculado revestido com polietileno, recobertos de nutrientes desidratados
e géis hidrossolúveis a frio. Cada placa tem ainda um filme superior de polipropileno,
que na face voltada para o filme inferior é revestido por géis hidrossolúveis a frio e
um corante indicador (cloreto de trifeniltetrazolio – TTC), com exceção daquelas
usadas para contagem de fungos.
As placas devem ser armazenadas em temperaturas inferiores a 8°C, antes do
uso necessitam estar em temperaturas ambientes. A exposição das mesmas a
temperaturas superiores a 25°C e/ou umidade superior a 50% podem afetar seu
desempenho.
As placas Petrifilm são prontas para uso, isto é, basta erguer o filme superior e
inocular 1mL do produto a ser analisado, voltar o filme para a posição inicial e aplicar
um difusor plástico a fim de distribuir uniformemente o inoculo pela placa, através de
leve pressão manual. Os agentes gelificantes são solúveis em água e a frio. A água
de diluição contida na amostra, em contato com os componentes da placa provoca a
hidratação dos nutrientes e a geleificação da mistura.
Após a geleificação (1 min) as placas são incubadas na temperatura e tempo
adequados, fazendo-se em seguida a enumeração de colônias. As colônias
apresentam-se vermelhas devido ao indicador que quando reduzido pelo
microrganismo passa de incolor para vermelho.
A tecnologia Petrifilm pode ser usada para a enumeração de: bactérias
aeróbias totais, coliformes totais e fecais, E. coli, enterobactérias, leveduras e
bolores e ainda bactérias láticas.
Os resultados podem ser obtidos em 24 horas sendo, em alguns casos,
necessário incubar por 48 horas. Leveduras e bolores podem ser enumerados,
sendo a incubação pelo período de 3-5 dias a 25°C (SANT’ANA; CONCEIÇÃO;
AZEREDO, 2002).
Entre as vantagens desse sistema, tem-se:
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Ser um sistema pronto para uso;
Execução fácil e rápida, que dispensa a necessidade de preparo de meios de
cultura, do uso de placas de Petri e de equipamentos laboratoriais especiais;
Custo baixo;
Obtenção rápida dos resultados.
A Fig. 2 mostra as placas Petrifilm ilustrando que cada placa tem ainda um
filme superior de polipropileno e, como é observado o resultado final,
respectivamente,
Figura 2. Placas PetrifilmTM prontas para uso.Fonte: Google Imagens (Placas Petrifilm), 2008.
3.1.2 Métodos de contagem indireta
Além das técnicas diretas os analistas têm a seu dispor diversas técnicas
alternativas indiretas, baseadas na medição da atividade metabólica dos
microrganismos nos alimentos. Nestas técnicas os microrganismos presentes são
quantificados através da dosagem de determinados produtos metabólicos, que
produzem quando se multiplicam nos alimentos ou, ainda, através de medidas de
alterações físicas ocorridas durante este processo. Estas técnicas exigem a
construção de curvas-padrão, nas quais se faz a correlação entre os parâmetros
medidos e o número de células viáveis presentes. O princípio básico é quanto maior
o número de microrganismos presentes mais intenso é o fenômeno medido, desta
maneira quanto maior for o nível de contaminação de um produto, menor é o tempo
de retenção.
Através destas técnicas, teoricamente, é possível detectar a presença de até
uma célula viável na amostra em teste (FRANCO et al., 1992).
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3.1.2.1 Bioluminescência
Esta técnica está baseada no princípio de que a quantidade de Adenosina
Trifosfato (ATP) presente em um sistema está relacionada ao numero de células
metabolicamente ativas, inclusive microrganismos. Uma das formas mais simples de
se medir a quantidade de ATP é através do sistema luciferina-luciferase, inicialmente
obtido da cauda de vagalumes ou extraído de peixes e, mais recentemente, obtido
por manipulação genética de microrganismos. ATP reage com a enzima luciferase,
na presença de luciferina e íons Mg++, formando um complexo que, em contato com
o oxigênio, sofre uma descarboxilação, com emissão simultânea de luz.
A luz emitida pode ser medida em luminômetro, um fluorímetro ou em um
espectrofotômetro de cintilação líquida, podendo ser expressa através da seguinte
reação:
Mg+2
E + LH2 + ATP E - LH2 - AMP + PP
E - LH2 - AMP + O2 oxiluciferina + CO2 + AMP + luz
E = enzima luciferase, LH2 = luciferina , E - LH2 - AMP = complexo luciferase-
luciferina-AMP
Equação 1. Reações que ocorrem durante o ensaio de bioluminescência.
Uma das grandes aplicações dessa técnica é o monitoramento da eficiência
de procedimentos de limpeza e higienização em plantas processadoras de alimentos
(FRANCO; LANDGRAF, 1996).
Esta técnica é bastante conveniente no monitoramento de programas de
APPCC (análise de perigos e pontos críticos de controle).
Apresenta como vantagens:
- Fácil leitura, com valores máximos e mínimos;
- Resultados em minutos;
- Sistema portátil, fácil transporte;
- Fácil utilização, qualquer pessoa pode usar;
- Capacidade de armazenamento de dados (memória);
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- Não necessita adição de soluções;
- Medição exata da quantidade de ATP.
3.1.2.2 Impedância/Condutância
São baseadas na propriedade que os microrganismos têm de alterar a
transmissão da corrente elétrica através de um meio de cultura. Essas alterações
ocorrem como conseqüência da mudança da composição química desse meio
devido à atividade metabólica dos microrganismos presentes. Durante a
multiplicação microbiana, moléculas grandes (proteínas, lipídeos, carboidratos) são
transformadas em moléculas menores (aminoácidos, ácidos graxos, ácidos
orgânicos), quimicamente mais ativas; o acúmulo desses metabólitos finais resulta
em alterações mensuráveis na condutância e impedância elétrica do meio
(SILVEIRA, 2006).
São exemplos de equipamentos o Bactometer (bioMéurieux), RABIT (Don
Whitley Scientific) e o Malthus 2000 (Malthus Instrumments).
3.1.2.3 Placas SIMPLATETM
Técnica alternativa para a enumeração de bactérias totais, coliformes,
Escherichia coli, bolores e leveduras em alimentos. As placas são plásticas e
apresentam 84 ou 198 câmaras, às quais se adicionam alíquotas da amostra em
análise e o meio de cultura Simplate. As placas são incubadas a 35ºC por 24 horas.
A contagem de bolores e leveduras e bactérias mesófilas são realizadas
enumerando-se as câmaras que apresentam fluorescência sob luz UV. Coloração
púrpura indica presença de coliformes totais e fluorescência sob luz UV presença de
Escherichia coli. O número de microrganismos é determinado através de uma
tabela, expressando-se o NMP.g-1 ou mL-1 de alimento analisado (SILVA; GALLO,
2003).
3.2 Métodos para avaliar a inocuidade
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3.2.1 Métodos Bioquímicos
São baseados na avaliação da capacidade dos microrganismos de utilizarem
determinados substratos ou de produzirem determinados metabólitos. Existem no
mercado diversos “kits”, na maioria miniaturizados, onde os testes são executados
com pequenos volumes de meio de cultura, os quais se encontram na forma
desidratada ou liofilizada, e são reidratados pela adição de pequeno volume da
amostra a ser testada. Após a incubação faz-se a leitura dos resultados,
normalmente através de uma combinação de números obtida de acordo com o
resultado de cada um dos testes que faz parte do sistema. Cada combinação de
números corresponde a um microrganismo diferente (MACHADO, 2007).
3.2.2 Métodos Imunológicos
Esses métodos apresentam grande sensibilidade e elevada especificidade e,
em função disso, vêm sendo empregados cada vez mais em microbiologia de
alimentos. São baseados em reações específicas entre antígenos e anticorpos, os
quais podem ser poli ou monoclonais. Os principais métodos imunológicos são
descritos abaixo (SILVEIRA, 2006).
3.2.2.1 Ensaios imunoenzimáticos
Nesses ensaios um dos reagentes, antígeno ou anticorpo, fica adsorvido a
superfície de uma matriz sólida (esferas de poliestireno, placas de microtitulação,
partículas metálicas revestidas de policarbonato e outras). A reação é baseada na
ligação não covalente e reversível do antígeno com o anticorpo específico, no qual
um desses reagentes é marcado com uma enzima, normalmente cromogênica, ou
seja, que age em reações que resultam no desenvolvimento de cor. A cor formada
pode ser observada a olho nu ou em espectrofotômetro. Dois tipos de ensaios
imunoenzimáticos são mais comumente utilizados: competitivo e não competitivo. O
tipo não competitivo, também conhecido como tipo Sanduíche, é o mais utilizado nos
sistemas de triagem de microrganismos patogênicos em alimentos (SILVEIRA,
2006).
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Existe no mercado um grande número de sistemas comerciais baseados em
técnicas imunoenzimáticas, conforme a Tab. 1, a seguir.
Tabela 1 – Alguns sistemas baseados em ensaios imunoenzimáticos
encontrados no mercado
SISTEMA FABRICANTE
Salmonella-Tek, Listeria-Tek, EHEC-Teck Organon Teknika
Listeria-Via, Salmonella-Via, EHEC-Via, S. aureus-
Via
Tecra
Unique Salmonella, Unique Listeria Tecra
ECOLI Difcro
Listeria Rapid Test Oxoid
REVEAL Listeria, Salmonella e E. coli Neogen
Vip E. coli Biocontrol
VIDAS Siatema Salmonella, Listeria, E. coli e E.
aureus
bioMéuriex
Fonte: MACHADO, 2007.
3.2.2.2 Imunocaptura
Também chamada de imunoseparação magnética, nessa técnica os
anticorpos ficam ligados a partículas metálicas recobertas com policarbonato. Após
a ligação com o antígeno específico, as partículas metálicas são atraídas por um
imã, permitindo que o restante do material seja removido. Após a retirada do imã,
obtém-se um produto concentrado que pode, então, ser submetido aos testes de
escolha para pesquisa do microrganismo de interesse. Essa técnica, quando
aplicada diretamente em alimentos pode reduzir, ou mesmo substituir a etapa de
pré-enriquecimento, sempre necessária quando se pretende investigar a presença
de microrganismos patogênicos em alimentos por métodos convencionais (SILVA,
1996).
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3.2.2.3 Imunoimobilização
Nessa técnica, bactérias móveis cultivadas em meio semi-sólido têm sua
mobilidade bloqueada pela adição de anticorpos flagelares específicos. Há formação
de uma banda de precipitação visível na interface anticorpo-bactéria.
3.2.2.4 Coaglutinação
Essa técnica é baseada na aglutinação de partículas de látex sensibilizadas
com anticorpos antitoxinas. Também são conhecidas como reações de aglutinação
de látex ou aglutinação passiva reversa.
3.2.2.5 ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)
É um teste imunoenzimático que permite a detecção de anticorpos
específicos no soro. Este teste é usado no diagnóstico de várias doenças
infecciosas uma vez que vários agentes patológicos induzem a produção de
anticorpos (imunoglobulinas) por parte dos linfócitos B do sistema imunológico
humoral humano.
Este é o teste de primeira linha no diagnóstico da infecção pelo HIV vírus da
SIDA/AIDS, estes testes até a sua terceira geração só detectavam a presença de
anticorpos (IgG e IgM) três ou quatro semanas após o contato, no entanto, os testes
de quarta geração já detectam tanto anticorpos como um dos antígenos do HIV - a
proteína p24 - fato esse que diminuiu sensivelmente o período de janela
imunológica, podendo chegar a apenas duas semanas.
Um resultado positivo num teste de ELISA é sempre confirmado por outros
testes específicos como é o caso do Western blot, que detecta proteínas do vírus, e
do PCR, que detecta os ácidos nucleicos virais.
O teste ELISA também pode ser utilizado de diversas outras formas.
Utilizando-se de um método semelhante ao método de Imunoradioensaio, pode-se
transformar muitas outras substâncias em antígeno e obter um anticorpo do mesmo.
Assim, é possível utilizar o teste para se detectar outras substâncias de interesse
como, por exemplo, hormônios. Pelo fato do radioimunoensaio ser muito caro, o
teste ELISA pode ser uma alternativa muito mais simples e barata.
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O método utilizado para realizar o teste se baseia na interação anticorpo-
antígeno. Normalmente é usada uma placa de superfície inerte com poços onde
serão adsorvidas as proteínas de interesse. Depois é realizada uma lavagem com
uma proteína inespecífica para que esta ocupe os poços livres. A superfície é então
tratada com solução de anticorpo primário, sabendo-se que exista uma quantidade
maior de anticorpo do que a proteína, específico para a proteína de interesse e este
vai se ligar a ela. A superfície é lavada novamente para retirar os anticorpos
primários que não foram incorporados em nenhuma proteína. Em seguida o produto
é tratado com anticorpos secundários que possuem uma enzima acoplada que irá
produzir uma substância corada e que se constitui de um anticorpo para o anticorpo
primário. A superfície é lavada novamente para a retirada do anticorpo secundário
que não se ligou ao anticorpo primário. Adiciona-se o substrato de ligação para a
enzima produzir a substância corada e, assim, medindo-se a intensidade da cor da
superfície, pode-se quantificar e verificar a presença de alguma substância de
interesse (SIMERSKY,2000).
A Fig. 3 mostra ilustrativamente como ocorre a reação específica entre o
antígeno e o anticorpo.
Figura 3. Reação antígeno e anticorpo que ocorre no “Kit” ELISA.
Fonte: Google Imagens (ELISA), 2008.A figura acima, mostra como é possível estabelecer a concentração do analito
em questão, ou seja quanto maior a intensidade da cor emitida pela enzima
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cromogênica, menor é a concentração do analito, uma vez que, a enzima
cromogênica liga-se á enzima conjugada. A concentração é obtida através de uma
curva de calibração (Absorbancia x concentração), sendo porém inversamente
proporcional a quantidade do analito.
3.2.3 Métodos Moleculares
3.2.3.1 Sondas genéticas
Nessa técnica é necessário submeter os microrganismos a um tratamento em
que seu material genético é liberado e separado em duas fitas simples. Em seguida,
adicionam-se sondas, que são fragmentos de DNA ou RNA específicos para o
patógeno alvo, marcadas com enzimas, normalmente cromogênicas e, quando há
hibridização com a sonda, há desenvolvimento de cor e, portanto, a presença do
microrganismo investigado é detectada (MACHADO, 2007).
3.2.3.2 Reação de Polimerase em Cadeia (PCR)
É uma técnica muito utilizada em microbiologia para amplificação do material
genético de microrganismos.
A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é um método muito sensível de
análise e por isso é realizada com muito cuidado para evitar contaminações que
possam inviabilizar ou tornar errôneo o resultado. Em primeiro lugar, deve-se extrair
o material genético da célula ou outro material a ser estudado sem danificá-lo.
Normalmente o material extraído é o DNA (ADN), mas pode-se trabalhar com o RNA
(ARN) em uma RT-PCR que é um desdobramento da PCR e possui outras
aplicações (FUNG, 2002).
Depois de extraído o DNA, a este é adicionada uma mistura (também
conhecida como pré-mix) que contém os dNTPs (desoxirribonucleotídeos
trifosfatos), que são as bases nitrogenadas ligadas com três fosfato, os primers
também chamados de oligonucleotídeos (ou iniciadores) e a enzima DNA
polimerase em uma solução tampão. Toda esta mistura é colocada no termociclador,
o qual faz ciclos de temperatura pré-estabelecidos com tempos exatos específicos
para cada reação (fragmento a ser amplificado).
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Na primeira etapa do ciclo a temperatura é elevada de 94 a 96ºC, por pouco
tempo, para que haja a separação da dupla cadeia de DNA (Desnaturação). Na
segunda etapa, a temperatura é reduzida entre 50 a 60ºC, dependendo da
quantidade de C e G encontrada no primer, para que os primers se anelem
(pareiem) com a fita molde de DNA (anelamento). Na última etapa do ciclo a
temperatura é elevada a 72ºC para que a enzima possa funcionar sintetizando a
nova molécula (extensão), em seguida um novo ciclo é iniciado. Normalmente são
realizados de 25 a 40 ciclos para cada reação na qual a taxa de replicação é
exponencial 2ciclo. O resultado é analisado através de uma eletroforese em gel de
agarose ou de poliacrilamida (figura 4).
Figura 4. Eletroforese em gel de agarose. Fonte: Google Imagens (PCR), 2008.
Atualmente existem outras técnicas mais rápidas que a PCR, como por exemplo o Bax Sisten o qual é um sistema automatizado de PCR real-time,
baseado em DNA para análises microbiológicas de Salmonella, E.Coli 0157:H7, Listeria Monocytogenes, Listeria.sp, Enterobacter.sakazakii, Campylobacter jejuni/coli, Bolores e Leveduras. Roda de uma a noventa e seis análises por vez,
com resultados disponíveis em cerca de 3 horas e meia. Essa técnica avalia a
característica genética da bactéria, o que aumenta a capacidade e a estabilidade do
método de uma forma única, pois as variações do meio, flora acompanhante e
outras variáveis têm as suas influências reduzidas a praticamente zero (YUSTE;
FUNG, 2007).
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A Fig. 5 mostra, ilustrativamente, a técnica acima citada, onde a leitura é feita
diretamente na tela do aparelho, ou seja não há a necessidade de realizar uma
eletroforese, como na técnica de Reação de Polimerase em Cadeia (PCR).
Figura 5. Bax® System, sistema automatizado de PCR real timeFonte: Google Imagens (Sistema Bax Sistem), 2008.
3.2.3.3 Bacteriófagos com DNA modificado
Esses bacteriófagos carregam informação genética para a síntese de
proteínas especiais, responsáveis pela formação de cristais de gelo, quando a
amostra é resfriada adequadamente. Esse princípio é utilizado em um teste para
Salmonella e, quando esse microrganismo está presente na amostra, os
bacteriófagos se ligam a Salmonella e o material genético é introduzido na bactéria,
que passa a sintetizar proteínas especiais. A formação dos cristais de gelo provoca
alteração na coloração do meio, facilmente observada a olho nu (MACHADO, 2007).
3.2.3.4 Ribotipagem
É feita em um equipamento sofisticado, totalmente automatizado, no qual
bactérias podem ser identificadas rapidamente (menos de 8 horas) em nível de
espécie. Virtualmente qualquer bactéria pode ser identificada por esse método.
Como exemplo pode-se citar o Riboprinter® System da DuPont Qualicon é a
única tecnologia no mercado capaz de identificar e caracterizar bactérias de forma
automatizada, além de criar um banco de dados digital. O processo se baseia na
ribotipagem, ou seja, na análise e comparação de DNA-RNA oferecendo assim, um
alto poder discriminatório pela diferenciação em nível genético.
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A Fig. 6 ilustra o equipamento da Riboprinter® System da DuPont Qualicon.
Figura 6. Riboprinter® System da DuPont Qualicon, usado para identificar e caracterizar bactérias de forma automatizada.Fonte: Google imagens (Ribotipagem), 2008.
Com este equipamento é possível realizar a rastreabilidade completa do
microrganismo em questão, identificando a fonte e causa da contaminação de uma
maneira direta e indubitável, pois fornece um perfil genético de cada uma das
bactérias implicadas, permitindo que as bactérias com o ribogrupo coincidente sejam
identificadas e a causa do problema prevenida e/ou eliminada (FRANCO et al,
1996).
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4. Conclusões
A partir do estudo realizado, observou-se que o controle e segurança da
qualidade dos alimentos tem sido um dos grandes desafios colocados á indústria
alimentar. Logo, devido à necessidade de rapidez de resultados, hoje, já são
encontrados no mercado varias técnicas que possibilitam resultados muito rápidos,
essas técnicas são conhecidas por “métodos rápidos de análise microbiológica”, os
mais usados na área da pesquisa são PCR, o ELISA, placas petrifilm e placas
simplate.
Os métodos rápidos possuem muitas vantagens, como boa exatidão, além de
minimizar os custos de uma empresa, sendo de rápida e fácil leitura, porém,
possuem algumas desvantagens, como o elevados custo de algumas técnicas e
mesmo aqueles já aprovados pela AOAC, os resultados positivos ainda não são
considerados confirmatórios.
No entanto, torna-se imprescindível, não só aos microbiologistas, mas a todos
da área de alimentos, estarem interados com essas novas técnicas, pois estas vêm
crescendo, substituindo, em parte, os métodos convencionais aplicados na maioria
dos laboratórios de microbiologia de alimentos.
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Referências
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sobre padões microbiológicos para alimentos. Diário oficial da República do
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sampling of meat surfaces. Journal of Rapid Methods and Automation in Microbiology. v. 8, n. 3, p. 209-217, 2000.
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