MARCADORES MOLECULARES BASEADOS EM DNA
Alberto José Prioli
Sônia Maria Alves Pinto Prioli
Nupélia - Universidade Estadual de Maringá
MARCADOR MOLECULAR (DNA)
Seqüência de bases com localização única no genoma e cujas variações podem ser rastreadas em famílias e populações.
Pode ou não ser parte de um gene.
Marcadores Moleculares
RAPDSPAR
Microssatélites
DNA mitocondrial
NÃO exige conhecimento prévio do genoma
Exige um conhecimentoparcial do genoma
NÃO exige conhecimento prévio do genoma
Marcadores Moleculares
RAPDSPARAFLP
MicrossatélitesRFLP
DNA mitocondrial
? Custo Haplóide; Alto No CópiasHerança MaternaNão RecombinaEvolução Rápida
Simples,Baixo CustoImenso Número de LocosMas... Dominantes
TrabalhosoAlto CustoCo-Dominantes !
DNA – Estrutura e Replicação
• A seqüência de bases codifica a informação genética.
• Com um molde e um primer a DNA polimerase sintetiza um novo polinucleotídeo.
• A necessidade de um primer per- mite a síntese in vitro (PCR) de fragmentos de interesse.
PCR – Reação da Polimerase em Cadeia
• Taq-polimerase• dNTP• Mg2+
• Tampão• Primers• DNA• Ciclos com mudanças de temperatura
A repetição d o ciclo amplifica o o número de cópias do segmento entre os sítios do par de primers.
O resultado é lido em gel.
PCR (PCR (Polymerase Chain ReactionPolymerase Chain Reaction))
• Mullis & Faloona, 1987; Saiki et al., 1985.• Eficiência na detecção de polimorfismo.• Síntese enzimática de milhões de cópias na presença da DNA pol.• Reação: anelamento e extensão com um par de primers sintetizados artificialmente.
CICLO
Desnaturação Anelamento Extensão
RAPDPolimorfismo de DNA Amplificado ao Acaso
Técnica desenvolvida por Williams et al. (1990).
Primer curto e arbitrário. Não se sabe, antecipadamente, em em quais posições do genoma ocorrerão pareamentos.
A amplificação é garantida por sítios de iniciação próximos e em fitas opostas.
Cada fragmento amplificado é uma característica binária do indivíduo ou da população.
Vantagens principais: baixo custo, grande número de locos e não há necessidade de qualquer conhecimento prévio do genoma do organismo.
Loco RAPD é um segmento amplificável,incluindo os dois sítios de iniciação.
Cada loco pode ser tratado como um
sistema de DOIS ALELOS
A configuração do segmento que resulta em amplificação é o ALELO DOMINANTE
A configuração que não amplifica é o ALELO RECESSIVO (nulo)
A INFORMAÇÃO OCULTA PELA DOMINÂNCIA É PERDIDA:
não há como saber se a população está emequilíbrio de HW, pois os heterozigotos nãopodem ser identificados.
Exemplos:
Distâncias genéticas
Índice de fixação FST (diferenciação genética)
Número de migrantes (Nm)
...
Para amostras pequenas, a metodologia deLynch e Milligan (1994) miniminiza o erro introduzido pela suposição de equilíbrio.
Parâmetros desenvolvidos para marcadores co-dominantes podem ser estimados com RAPD,admitindo-se equilíbrio de Hardy-Weinberg.
Nem sempre é necessária a suposição de equilíbrio.
Índices de similaridade (Jaccard ou outro)
Coordenadas principais
Componentes principais
Componentes de variância da AMOVA
Diversidade de Shannon
. . .
Estas análises não protegem contra a perda da informação oculta pela dominância.
O RAPD gera estimativas menosprecisas, mas é muito útil como ferramenta exploratória e em combinação com marcadores mais informativos.
Usar RAPD? Se para a espécie ainda não existem marcadores mais eficientes, decide-se diante da relevância e urgência.
Locos Microssatélites ou Simple Sequence Repeats (SSR)
Blocos de seqüências nucleotídicas de dois a seis pares de bases que se repetem em tandem de 20 a 100 vezes. O genoma humano contém cerca de 30.000 diferentes locos SSR.
Exemplo de um loco microssatélite:
Alelo (CAG)14 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 5’...AATGACATAGA......CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG......GTCAAGATC...3’ 3’...TTACTGTATCT......GTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTC......CAGTTCTAG...5’
Alelo (CAG)17 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 5’...AATGACATAGA......CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG......GTCAAGATC...3’ 3’...TTACTGTATCT......GTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTC......CAGTTCTAG...5’
Alelo (CAG)19 . 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 . 5’...AATGACATAGA....CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG.....GTCAAGATC...3’ 3’...TTACTGTATCT....GTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTC.....CAGTTCTAG...5’
Alelo (CAG)n
Esta seqüência de pares de bases não ocorre em nenhum outro local do genoma.
Esta seqüência de pares de bases não ocorre em nenhum outro local do genoma.
AMPLIFICAÇÃO, VIA PCR, DE BLOCOS DE
MICROSSATÉLITES 5’...AATGACATAGA......CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG......GTCAAGATC...3’ 3’...TTACTGTATCT......GTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTC......CAGTTCTAG...5’ 5’...AATGACATAGA......CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG......GTCAAGATC...3’ CAGTTCTAG5’ 5’AATGACATAGA 3’ ...TTACTGTATCT......GTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTC......CAGTTCTAG...5’ 5’ ...AATGACATAGA......CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG......GTCAAGATC...3’ 3’ ...TTACTGTATCT......GTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTC......CAGTTCTAG...5’
+ 5’ ...AATGACATAGA......CAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAG......GTCAAGATC...3’ 3’ ...TTACTGTATCT......GTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTC......CAGTTCTAG...5’
AMPLIFICAÇÃO DIRETA A PARTIR DE MICROSSATÉLITES OU
Inter-Simple Sequence Repeat (ISSR) ou Single Primers Amplifications Reactions (SPAR)
O primer com três ou quatro unidades repetitivas. Amplificados segmentos localizados entre dois blocos de microssatélites com a mesma unidade repetitiva do primer.
Exemplo de um loco ISSR:
Loco ISSR 5’...CAGCAGCAGCAGCAGCAGAAGTCATGGTCACGTGGCTGATATGACTGACATAGCCTCGAGTCTAGATCTATGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTG..3’ 3’...GTCGTCGTCGTCGTCGTCTTCTGTACCAGTGCACCGACTATACTGACTGTATCGGAGCTCAGATCTAGATACGACGACGACGACGACGACGACGACGAC..5’
Primer único a ser utilizado: 5’CAGCAGCAG3’
Amplificação via PCR: 5’...CAGCAGCAGCAGCAGCAGAAGTCATGGTCACGTGGCTGATATGACTGACATAGCCTCGAGTCTAGATCTATGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTG..3’ GACGACGAC5’ 5’CAGCAGCAG 3’...GTCGTCGTCGTCGTCGTCTTCTGTACCAGTGCACCGACTATACTGACTGTATCGGAGCTCAGATCTAGATACGACGACGACGACGACGACGACGACGAC..5’
Blocos de microssatélites em posição cis e com as seqüências repetitivas em fitas opostas.
Marcadores Moleculares
RAPDSPARAFLP
MicrossatélitesRFLP
DNA mitocondrial
? Custo Haplóide; Alto No CópiasHerança MaternaNão RecombinaEvolução Rápida
Simples,Baixo CustoImenso Número de LocosMas... Dominantes
TrabalhosoAlto CustoCo-Dominantes !
Marcadores Moleculares Mitocondriais
Metodologia
• Escolha da Seqüência (Qual é o Objetivo?)
• DNA Total
• Amplificação via PCR• Clonagem do Fragmento• Seqüenciamento • Seqüência: Edição e Alinhamento
mtDNA
• Geralmente evolui 5-10 vezes mais rápido do que genes nucleares de cópia simples.
• Alta velocidade de evolução - No Transição > Transversão
• CO I, II, III e Citocromo b = Evolução + lenta (conservados)
• ND, ATPases = Evolução menos lenta (~menos conservados)
• tRNAs = Evolução lenta; pequenos (59-75 bp) (primers)
• rRNAs = Evolução lenta (interessantes p/ espécies distantes)
• D-Loop ou Região Controle = Mais variável do mtDNA.
Molecular Markers and Genetic Variability of Hoplias aff. malabaricus
Populations from the Floodplain of Upper Paraná River
PRIOLI1,2*, Alberto J.; LUCIO1, Léia C.; MANIGLIA1, Thiago C.; PRIOLI1,2, Sônia M. A. P.; JÚLIO Jr1,2, Horácio F.; PAZZA1, Rubens; PRIOLI1,3, Laudenir M.
1Nupélia – Núcleo de Pesquisas em Limnologia, Ictiologia e Aqüicultura; 2Depto. Biol. Celular e Genética; 3Depto. Biologia – Universidade Estadual de Maringá, Av. Colombo, 5790, 87020-900 Maringá, PR, Brazil. *Autor para correspondência (Phone: 44-261-4750; Fax: 44-263-1424; e-mail: [email protected])
R i o I v a i
3 0 ’ 30 ’
30 ’ 30 ’
30 ’ 30 ’
3 0 ’
24 º 24 º
23 º
5 4 º
5 4 º
25 º 25 º
3 0 ’
3 0 ’
11B R A S ILM AT O G R O S S O
D O S U L
PA R A N Á
F O Z D O IG U A Ç U
I TA IP U D A M
G U A Í R A
S A N TA H E L E N A
21 .4 km
S C A L E
P o r to R ic o
Planície de inundaçãodo alto rio Paraná
Reservatório de Itaipu
Base Nupelia-UEMem Porto Rico - PR
Foz do Iguaçu
Sete Quedas
R i o I v a i
3 0 ’ 30 ’
30 ’ 30 ’
30 ’ 30 ’
3 0 ’
24 º 24 º
23 º
5 4 º
5 4 º
25 º 25 º
3 0 ’
3 0 ’
11B R A S ILM AT O G R O S S O
D O S U L
PA R A N Á
F O Z D O IG U A Ç U
I TA IP U D A M
G U A Í R A
S A N TA H E L E N A
21 .4 km
S C A L E
P o r to R ic o
Reservatório de Itaipu
Sete Quedas
Foz do Iguaçu
Planície de inundaçãodo alto rio Paraná
Base Nupelia-UEMem Porto Rico - PR
Atualmente ocorrem três citótipos de Hoplias aff. malabaricus na planície alagável do alto rio Paraná:
A (42) C (40) D (39/40) macho/fêmea
O citótipo C invadiu a planície depois do barramento de Itaipu.
Figure 1 – DNA fragments amplified by PCR with SPAR primer (GGAC)3T, identifying Hoplias aff. malabaricus cytotypes A, C, and D from the floodplain of Upper Paraná River. (L) Molecular weight markers (Ladder 100 bp); (b) negative control without DNA.
Dados sobre Citótipo C na planície Conclusão
HPL4
HPL17
HPL20
HPL18
HPL21
HPL19
HPL6
HPL5
HPL7
HPL35
HPL16
HPL8
HPL36100
66
99
76
99
100
0.01
Figure 2. Neighbor-joining tree for mitochondrial control region sequences of Hoplias malabaricus specimens from the Upper Paraná River Foodplain. Genetic distance was computed by using Tamura and Nei (1993) method. Number on
each node indicates bootstrap probability based on 1000 replications.