Interação entre Theobroma cacao e Crinipellis perniciosa
Dr. Abelmon GesteiraDCB/UESC
Interaction cacao-Crinipellis
Crinipellis (Cp) Basidiomiceto Fase patogênica e saprofitica
Sintomas Desenvolvimento anormal dos
caules e flores Formação de vassouras Infecção dos frutos
Conseqüências Econômicas Sociais Ambientais
Interação cacau-Cp: os sintomas
Bibliotecas de cDNA das interações compatível e incompatível Objetivo: Monitorar comparativamente a
expressão diferencial de genes resultantes interação cacau-Cp
Acessos utilizados
- TSH1188 (resistente) RT
- Catongo (susceptível) SP
Plantas cultivadas em casa de vegetação (Ceplac)
Inoculação e cultura controladas (mistura de esporos, spray, umidade,…)
75.000 basidiósporos/mL
Sintomas e pontos de coleta
Catongo
Plantio
24h, 48h, 72h 5 DAI
Inoculação (30d)
0
Extração de RNA: um novo método
Extração de RNA de cacau
rRNA 5S
rRNA 18SrRNA 28S
RNA extraído dos diferentes pontos de coletas de TSH e Catongo
Pool de RNA
24h, 48h, 72h Cada 5 DAI
70 diasPlantio Inoculação (30d)
0
Confecção das bibliotecas
Smart Creator Kit (Clontech)
Características das bibliotecas
The cocoa-Cp interaction libraries show a high library specificity (79.7 and 71.2%).
a Vector sequences and sequences of low quality were eliminated.bThe singletons present in each library independent of other libraries. The percentage was calculated as number of singletons/number
of sequences analyzed from the library.cTC = tentative contig. The contigs present in each library independent of other libraries.dThe unigene set for each library is the sum of singleton plus contigs for the library.eThe mean size of the unigene sequences.fThe redundancy of each library calculated as 1-(unigene library/number of sequence analyzed).g The unigenes(singletons+contigs) specific to the library. The percentage was calculated as (library-specific unigenes/unigene total).hThe percentage contribution of unigenesspecific to each library as a percentage of total unigenes.
2. Statistical analysis of the cocoa-Cplibraries
a Vector sequences and sequences of low quality were eliminated.bThe singletons present in each library independent of other libraries. The percentage was calculated as number of singletons/number
of sequences analyzed from the library.cTC = tentative contig. The contigs present in each library independent of other libraries.dThe unigene set for each library is the sum of singleton plus contigs for the library.eThe mean size of the unigene sequences.fThe redundancy of each library calculated as 1-(unigene library/number of sequence analyzed).g The unigenes(singletons+contigs) specific to the library. The percentage was calculated as (library- specific unigenes/unigene total).hThe percentage contribution of unigenesspecific to each library as a percentage of total unigenes.
2. Statistical analysis of the cocoa-Cplibraries
-
29.3
46.8
Contribution (%)h
52
58
46
Redundancy(%)f
1207 (42)
1719 (54)
Unigene
(%)d
2585 1065 (37)
Singletons (%)b
6884 3790
3355
Sequences generateda
2230347.53416024 Total
859 (71.2)3541422852 (87) SP1371 (79.7) 1153172 (88) RT
Library specific unigene (%)g
Mean size of the
sequencese
cSequences analyzed
Library
-
Contribution (%)h
Redundancy(%)f
2926
Unigene
(%)d
1520 (48)
Singletons (%)b
3271
3613
Sequences generateda
Total
SP
341199RT
Library specific unigene (%)g
Mean size of the
sequenceseTC
Sequences analyzed
Library
Distribuição dos ESTs por contigRT and SP libraries are represented by and ,
respectively.
ESTs as mais abundantesLibrary TC
N° de ESTs
in TC (%) Putative function of the gene family Species Expected Size (bp)
74 41 Unknown function homologue to Orf107a Arabido psis thaliana 2.10 - 27 521
9 37 Metallothionein - like protein Betula platyphylla 6.10 - 26 651
19 32 Seed protein homolog to trypsin inhibitor Theobroma cacao 2.10 - 93 929
112 28 Pathogenesis - related protein 4b Oryza sativa 1.10 - 34 1058
184 13 Proline -rich protein Gossypium hirsutum 5.10 - 10 184
76 12 Ribosomal RNA 18S Poncirus trifoliata 0.0 893
60 10 Unknown function Oryza sativa 6.10- 22 386
10 9 Metallothionein - like protein Petuniaxhybrida 2.10 - 16 489
20 9 No hit - - 829
RT
42 9 Dehydrin Vaccinium corymbosum 2.10-6 618
13 144 Metallothionein - like protein Betula platyphylla 6.10 - 26 669
42 49 Unknown function homologue to Orf107a Arabidopsis thaliana 1.10 - 27 266
20 29 Metallothionein - like protein Petuniaxhybrida 3.10 - 16 535
141 26 Ankyrin repeat family protein Arabidopsis thaliana 1.10-9 625
103 13 Metallothionein - like protein Gossypium hirsutum 1.10 - 24 495
57 10 Ankyrin repeat family protein Arabidopsis thaliana 7.10-7 505
1 8 Unknown function Oryza sativa 7.10-4 494
132 8 Putativ e copper chaperone Arabidopsis thaliana 2.10 - 28 631
38 6 Nuclear factor 1 Mus musculus 1.10 - 10 447
52 6 Unknown function Homo sapiens 1.10-8 497
SP
124 6 Unknown function Mus musculus 1.10-4 499
Comparação com outras bibliotecas de cacau
Venn diagram showing the distribution of the sequences present in cacao libraries.a. From Verica et al., 2004. b. From Jones et al., 2002.
Outros genes de interesse
Resistência/defesa: quitinases, HPRP, proteina rica em leucina, PRs, Bax inhibidor, U-box, cistatina, glucanase
PCD/necrose: superoxide dismutase, oxalato oxidase, proteínas relacionadas a senescência, proteases, proteasoma 26S
Parede celular: expansin, celulose sintase, peroxidases Detoxificação: transportador ABC, proteína de reparo Hormônios: proteína regulada por auxina, proteína reprimida por
auxina, Fatores de transcrição: myb fator, WRKY, bzip Transdução: receptor kinase, calmodulina, MAP kinase Outros: Formato deshidrogenase, acido cafeico, glicerol
aciltransferase, diacilglicerol kinase, transportador de sacarose
RT
SP Poucas diferenças quantitativas com
relação a classificação dos genes
Estudos funcionais de genes de interessem
Glicanase Proteases Factor de transcription WRKY Bax Inhibidor (regulador de morte celular) PR 10
Estudo funcional da PR10
Clonagem em vetor de expressão (pET28a) Expressão em bacteria pLysBl21 Purificação da proteina em coluna His-Tag
Estudo funcional da PR10
Teste de atividade anti-fungica (Cp) Em pseudo-colonias (Freitas et al. 2005)
Com 10 ug de PR10
Controle PR10 10 ug
Screening da biblioteca BACColaboração com o Cirad
Estudos de promotores; Sondas: 27 cDNA interação cacao-Cp; Identificação de 21 clones BACs; sub-clonagem e sequenciamento de
promotores.
Estudos de expressão / ArraysColaboração com o Cirad
PCR de todos ESTs de cada biblioteca de cDNA
Confeção dos macroarrays (Nylon) Hibridização com sondas Catongo e TSH Projeto en andameto
Tese Defendidas
Dahyana Santos Britto. Estudos funcionais de genes que codificam proteínas PR ( Pathogenesis Related Proteins) expressas em theobroma cacoa em resposta ao ataque de crinipellis perniciosa. 2005. Dissertação (Mestrado em Genética e Biologia Molecular) - Universidade Estadual de Santa Cruz,. Orientador: Abelmon da Silva Gesteira.
Stênio Carvalho Santos. Caracterização de hidrofobinas do fungo Crinipellis perniciosa (Stahel) Singer, Causador da Doença vassoura-de-bruxa do cacaueiro . 2005. 53 f. Dissertação (Mestrado em Genética e Biologia Molecular) - Universidade Estadual de Santa Cruz. Orientador: Julio Cezar de Mattos Cascardo
Joci Neuby Alves Macêdo. Caracterização funcional do indutor de necrose de Crinipellis perniciosa EM Theobroma Cacao L.. 2004. 54 f. Dissertação (Mestrado em Mestrado Em Genética e Biologia Molecular) - Universidade Estadual de Santa Cruz Orientador: Julio Cezar de Mattos Cascardo
Tese em Andamento
Braz Tavares da Hora Junior. Determinação de genes envolvidos na resistência do cacau ao Crinipellis perniciosa via arrays. Início: 2006. Dissertação (Mestrado em Genética e Biologia Molecular) - UESC, Orientador - Fabienne Micheli
Heliana Argolo Santos Carvalho. Estudo funcional de genes envolvidos na interação cacau-Crinipellis. Início: 2005. Dissertação (Mestrado em Genética e Biologia Molecular) - Universidade Estadual de Santa Cruz. Orientador – Fabienne Micheli
Livia Santos Lima. Mapeamento de genes de resistência obtidos pela genômica da interação cacau-crinipellis, aplicados à programas de melhoramento. Início: 2005. Dissertação (Mestrado em Genética e Biologia Molecular) - UESC. Orientador Fabienne Micheli
Maiza Alves Lopes. Estudo funcional de fatores de transcrição WRKY da interação cacau-Crinipellis perniciosa. Início: 2006. Tese (Doutorado em Genetica e Biologia Molecular) - Universidade Estadual de Santa Cruz. Orientador Fabienne Micheli
Sarah Alves de Melo. Análise bioquímica e funcional do gene relacionada à patogênese (PR10) isolado de uma biblioteca de cDNA da interação entre Theobroma cacao e Crinipellis perniciosa . Início: 2006. Dissertação (Mestrado em Genética e Biologia Molecular) - Universidade Estadual de Santa Cruz Orientador - Abelmon Gesteira
Agradecimentos
Fapesb UESC CIRAD Dr. Júlio Cascardo Dr. Nicolas Carles e Dra. Fabienne Micheli
pela a análise de bioinformática Dra. Karina Gramacho Aos Bolsistas Aline Clara, Lorena Blosi e
Antônio Carlos Rodrigues