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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
Laboratório de Neuroanatomia e Neuropsicobiologia
ENVOLVIMENTO DE RECEPTORES OPIÓIDES µ1 E DAS
REDES NEURAIS DO COLÍCULO INFERIOR
NA ANALGESIA PÓS-ICTAL
Tatiana Tocchini Felippotti
Dissertação apresentada ao Departamento de Neurologia,
Psiquiatria e Psicologia Médica da Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São
Paulo (USP), como requisito para a obtenção do grau de
Mestre em Ciências Médicas.
Área de Pós-graduação: Neurologia.
Ribeirão Preto – SP
2005
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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
Laboratório de Neuroanatomia e Neuropsicobiologia
ENVOLVIMENTO DE RECEPTORES OPIÓIDES µ1 E DAS
REDES NEURAIS DO COLÍCULO INFERIOR
NA ANALGESIA PÓS-ICTAL
Tatiana Tocchini Felippotti
Dissertação apresentada ao Departamento de Neurologia,
Psiquiatria e Psicologia Médica da Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São
Paulo (USP), como requisito para a obtenção do grau de
Mestre em Ciências Médicas.
Área de Pós-graduação: Neurologia.
Orientador: Prof. Dr. Norberto Cysne Coimbra
Ribeirão Preto – SP
2005
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Dedicatória
Dedico aos meus pais, Sidnéa e André e,
à minha irmã, Giovanna.
Que foram os meus primeiros mestres.
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“A mente de um indivíduo, uma vez desenvolvida por uma idéia nova, nunca recupera suas
dimensões originais.”
Oliver Wendell Holmes
“Golpe a golpe, passo a passo, Caminhante, não há caminho, o caminho é feito ao andar.
Andando, se faz o caminho e se você olhar para trás tudo que verá são as marcas de passos que
algum dia seus pés tornarão a percorrer. Caminhante, não há caminho, o caminho é feito ao
andar.”
Antônio Machado
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AGRADECIMENTOS
� A Deus, pelo dom da vida.
� Aos meus pais, Sidnéa e André, pela vida, pela luta dia-a-dia, por ensinar a superar os
limites e por acreditarem em mim.
� À minha irmã, Giovanna, pela nossa união, amizade e cumplicidade.
� Aos meus avós (in memorian), pela simplicidade e por fazerem de nós, pessoas saudáveis.
� Ao Prof. Dr. Norberto Cysne Coimbra, pela orientação e, pela preocupação e dedicação em
fazer de nós pesquisadores, o que me faz ter muito orgulho de ser sua aluna.
� À tia “Morena” (Shirlene), pelo carinho, que junto com minha mãe, são meus maiores
exemplos de mulheres fortes, dedicadas e determinadas.
� Ao tio “Samu” (Samuel), por ser presente em nossas vidas com sua generosidade.
� Aos meus primos, Fellipe e Fabíola, pelo carinho que me é muito importante.
� Às minhas “paixões”: Pity, Bobby e Pingo, por me receberem com alegria todos os dias.
� À tia Heloísa, pelas orações.
� Aos professores do Curso de Biologia do Centro Universitário Barão de Mauá, em especial,
aos Profs. Abbud e Fernando, pela colaboração na agilização do certificado de conclusão
de curso, o que possibilitou minha matrícula na pós-graduação.
� Aos amigos do LNN (Laboratório de Neuroanatomia e Neuropsicobiologia): Andressa,
Renato, Daoud, Rithiele, Célio, Ricardo, Tati Paschoalin, Valéria, Raquel, Priscila, Juliana,
Fabrício, Leonardo, Valdir, Walter e Gabriel, pela amizade, pelas brincadeiras e boas risadas
que tornaram o ambiente mais agradável, e pelo auxílio na realização desse trabalho,
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cada qual à sua maneira. Em especial, aos amigos: Renato, pela consideração ao iniciar
minha caminhada científica e, Andressa, que além de sua amizade e auxílio, foi o meu
porto seguro, por me encorajar em todos os sentidos.
� Aos amigos da “Força Metra”: Elynton, Rodolfo, Viviana, Vanessa Kataguiri, Guilherme,
Cleber e Luís Carlo, pela amizade e pelos momentos divertidos.
� À amiga Dani Ribeiro (Cuti), por sua amizade sincera e apoio nas dificuldades.
� Aos amigos do Departamento de Neurologia: Malu, Drica, Andressa, Fabrício, Karina,
Carol, Bruno, Maira, Poliana, Simone e Franco, pela iniciativa e empenho nas reuniões
científicas e, pela organização da comissão discente, que foram importantes para a
integração dos alunos de pós-graduação desse departamento.
� Aos professores da banca, Profa. Dra. Christie Ramos Andrade Leite Panissi e Prof. Dr.
Américo Ceiki Sakamoto, pela compreensão e contribuição nesse momento tão
importante.
� À Vani e Izilda, técnicas do Departamento de Morfologia dessa faculdade, pelo apoio e
disponibilidade em ajudar.
� Ao Rubinho, técnico do Departamento de Fisiologia dessa faculdade, pela dedicação e
disponibilidade em ajudar.
� À Eleni, técnica do Departamento de Farmacologia, pelo apoio.
� À Bete, secretária do curso de pós-graduação do Departamento de Neurologia, pelas
informações e ajuda.
� Aos responsáveis pelo Biotério, do Departamento de Farmacologia (Inês e Eliana) e do
Departamento de Biologia Celular e Molecular (Domingos), pelo cuidado com os animais
no período dos experimentos.
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� Ao Departamento de Neurologia, pela iniciativa de um curso de nivelamento, para integrar
as diversas especialidades das áreas biológicas e da saúde.
� Ao Departamento de Farmacologia, onde se encontra o LNN, por propiciar o
desenvolvimento do projeto.
� À FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo) pelo apoio
financeiro, que é totalmente necessário para a realização de pesquisa científica.
� Aos animais de laboratório.
� A todos aqueles que contribuíram com a minha formação profissional, permitindo que
eu leve conhecimento àqueles que anseiam por ele.
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SUMÁRIO
INTRODUÇÃO ..........................................................................10
1 – Dor................................................................................................................................................11
2 – Opióides e analgesia ...................................................................................................................18
3 – Colículo inferior ..........................................................................................................................21
4 – Crises convulsivas e analgesia pós-ictal ...................................................................................23
OBJETIVOS............................................................................... 27
1. Objetivos gerais .............................................................................................................................28
2. Objetivos específicos ....................................................................................................................28
MATERIAIS E MÉTODO ........................................................ 29
1) Animais...........................................................................................................................................30
2) Testes nociceptivos.......................................................................................................................30
3) Testes comportamentais ..............................................................................................................31
4) Equipamentos ...............................................................................................................................31
5) Procedimentos...............................................................................................................................32
6) Drogas ............................................................................................................................................34
7) Análise estatística ..........................................................................................................................34
8) Histologia .......................................................................................................................................34
RESULTADOS........................................................................... 36
RESUMO.................................................................................... 56
ABSTRACT ................................................................................ 59
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................... 62
ANEXOS .................................................................................... 84
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LISTA DE ABREVIATURAS AP: antero-posterior
CDME: corno dorsal da medula espinhal
CI: colículo inferior
CPCS: camadas profundas do colículo superior
CS: colículo superior
DV: dorso-ventral
EPM: Erro Padrão da Média
FDL: funículo dorso-lateral
GABA: ácido gama-aminobutírico
h: horas
IP: intraperitoneal
kg: kilograma
LC: locus coeruleus
LRC: latência de retirada de cauda
mg: miligrama
min: minutos
ML: médio-lateral
mm: milímetro
NCCI: núcleo central do colículo inferior
NCDCI: núcleo cortical dorsal do colículo inferior
NCECI: núcleo cortical externo do colículo inferior
NDR: núcleo dorsal da rafe
NMgR: núcleo magno da rafe
PTZ: pentilenotetrazol
SCP: substância cinzenta periaquedutal
SN: substância negra
seg: segundos
TM: teto mesencefálico
µg: micrograma
µl: microlitro
µm: micrômetro
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INTRODUÇÃO
__________________________________________________________________Introdução
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1 – Dor
1.1 – Transmissão da dor
A dor é definida pela Associação Internacional para o Estudo da Dor (IASP)
como uma “experiência sensorial e emocional desagradável associada a uma lesão tecidual
real ou potencial, ou descrita nestes termos” (MERSKEY, 1986; FLÓREZ, 1993). A dor,
portanto, é uma percepção subjetiva com dimensão psicológica. Por outro lado, a
nocicepção constitui a percepção pelos nociceptores de estímulos que codificam sinais para
fornecer informação o sistema nervoso central da existência de uma injúria tissular
associada a um estímulo nocivo. A dor tem sido considerada como consistindo de dois
componentes: perceptivo-discriminativo, que permite ao indivíduo reconhecer o estímulo
como doloroso e localizá-lo em regiões do corpo, e o aversivo-cognitivo-motivacional ou
reacional, que compreende uma variedade de comportamentos, os quais, por sua vez,
envolvem fatores inatos de cada espécie, aprendizagem e memória (BRANDÃO, 1995).
Segundo NOBACK e col. (1996), dor seria o termo mais adequado para o homem,
enquanto que nocicepção seria mais indicado para modelos experimentais. Não obstante,
surpreendentemente subsídios neuromorfológicos funcionais que embasam os aspectos
subjetivos da dor foram primeiramente descritos em animais de laboratório (HAMMOND,
1989), o que sugere-nos cautela durante qualquer tentativa em restringir os aspectos
emocionais da dor exclusivamente a seres humanos.
Os neurotransmissores envolvidos nas aferências nociceptivas primárias são
diversos, particularmente, a substância P (HÖKFELT e col., 1975; FURST, 1999),
somatostatina, colecistoquinina, glutamato (JESSEL & DODD, 1986), neurocinina-A e
neurocinina-B. Estes parecem ser transmissores das aferências primárias ou facilitadores da
expressão de estímulos nociceptivos (FURST, 1999).
__________________________________________________________________Introdução
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Os nociceptores distribuem-se por praticamente todos os tecidos do organismo, com
exceção do tecido nervoso. Estão presentes na superfície cutânea, na parede das vísceras ocas,
no parênquima das vísceras sólidas, na vasculatura, nos ossos e nas articulações, na córnea, nas
raízes dentárias (MILLAN, 1999). Os nociceptores são terminações livres de neurônios
pseudounipolares associados a fibras não mielinizadas (fibras C) ou mielinizadas (fibras Aδ).
As fibras C respondem a estímulos nocivos de origem térmica, mecânica ou química e por isso,
são chamados de polimodais. Já as fibras Aδ, respondem mais fortemente a estímulos nocivos
térmicos e pressórios e com menor intensidade a estímulos químicos (RANG e col., 1991).
Tanto as fibras Aδ como as fibras C são largamente distribuídas na pele e em tecidos
profundos (JESSEL & KELLY, 1991).
A atividade gerada pelo nociceptor é transferida, após processamento complexo e
ativo no corno dorsal da medula espinhal (CDME), diretamente ou via núcleos do tronco
encefálico, aos núcleos inespecíficos do tálamo ou ao núcleo talâmico ventral póstero-lateral, e
então para o córtex, onde a percepção da dor é gerada. Impulsos paralelos do CDME passam
para o corno ventral da medula espinhal e ativam neurônios motores reflexos, os quais geram o
reflexo flexor de retirada (WOOLF, 1994).
A informação nociceptiva é convertida em impulsos pelos nociceptores e transmitida
pelos nervos espinhais e cranianos aos núcleos na medula espinhal e tronco cerebral. No
interior da substância cinzenta do corno dorsal da medula espinhal, a projeção aferente do
neurônio primário faz sinapse com os neurônios secundários. A substância cinzenta da medula
espinhal foi dividida por Rexed em dez lâminas ou camadas (BESSON & CHAOUCH, 1987;
DUBNER & BENNETT, 1983; REXED, 1952; WILLIS & COGGESHALL, 1991): as
lâminas I a VI compõem o CDME. Os corpos celulares dos neurônios secundários estão
localizados na lâmina I (zona marginal), II (substância gelatinosa) e V (camada profunda). As
fibras finas do neurônio primário geralmente terminam nas camadas mais superficiais, e as
__________________________________________________________________Introdução
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fibras mais grossas na camada profunda. (WILLIS & WESTLUND, 1997; MILLAN, 1999). As
lâminas I e II de Rexed recebem fibras C e algumas fibras Aδ. Outras fibras Aδ penetram mais
profundamente no CDME (lâmina V) (MILLAN, 1999), já as fibras mielinizadas grossas Aα e
Aβ são responsáveis em transmitir as informações não-nociceptivas (FIELDS & BASBAUM,
1978; ALBE-FESSARD e col., 1985; BESSON & CHAOUCH, 1987; FITZGERALD &
WALL, 1980; BRANDÃO, 1995). Essas fibras sensoriais de alto limiar ativam um grande
número de interneurônios de segunda ordem e neurônios de projeção na medula espinal,
alguns deles ativados exclusivamente por estímulos nocivos (denominados de neurônios
nociceptivos específicos ou NS – nociceptive-specific) e outros são ativados por estímulos de alta
ou baixa intensidade (denominados de faixa dinâmica ampla ou WDR – wide-dynamic-range). As
células presentes nas lâminas I e V dão origem às principais vias de projeção do CDME para o
tálamo (MILLAN, 1999). A informação neural se projeta, então, do tálamo para as áreas
sensoriais do córtex cerebral, onde as várias submodalidades da sensibilidade nociceptiva,
como qualidade, intensidade, localização e o seu aspecto emocional ou afetivo são integrados
na experiência da percepção (NOBACK e col., 1996). Essas fibras constituem os tratos espino-
talâmicos, espino-mesencefálico, espino-reticular (WILLIS, 1985), espino-límbico, espino-
cervical e coluna dorsal pós-sináptica (WILLIS & WESTLUND, 1997).
Da medula espinhal, a informação nociceptiva ascende para o encéfalo por
algumas vias, das quais a mais importante é a via espinotalâmica, que se divide
filogeneticamente, em duas projeções: a via paleo-espinotalâmica (mais antiga) e a via neo-
espinotalâmica (mais recente, na escala filogenética). O trato espinotalâmico conduz a
informação nociceptiva e outras informações sensoriais da periferia para o tálamo. É
constituído primariamente de axônios de células das lâminas I e V, mas também os corpos
desses neurônios são encontrados nas lâminas II, IV, VI, VII, VIII e X (ZHANG e col., 2000).
Baseado na origem e no modelo de projeções das fibras Aδ e C, alguns autores descreveram
__________________________________________________________________Introdução
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três formas de aferências do trato espinotalâmico. Uma é a via neo-espinotalâmica
monossináptica, ou trato espinotalâmico ventral, que se projeta diretamente para núcleos do
complexo lateral do tálamo, envolvendo o componente sensório-discriminativo da dor. Outra
é a via paleo-espinotalâmica multissináptica, ou trato espinotalâmico dorsal, que projeta para
núcleos do complexo intralaminar e posterior medial do tálamo, envolvidos no aspecto
afetivo-motivacional da dor. E, finalmente, uma via espinotalâmica monossináptica
projetando-se diretamente para núcleos central e medial do tálamo, envolvidos no componente
afetivo da experiência dolorosa (TEIXEIRA, 1990; ZHANG e col., 1999).
Além do trato espinotalâmico, a informação nociceptiva pode ascender pelo trato
espinorreticular, cujas células de origem se localizam principalmente nas lâminas V, VII e VIII,
e também nas lâminas I e X (KEVETTER e col., 1982; WILLIS & WESTLUND, 1997).
Também existem projeções diretas da medula para sítios mesencefálicos. Em
primatas, a maioria das células de origem do trato espino-mesencefálico está localizada nas
lâminas I e IV a VI. As projeções espino-mesencefálicas terminam na substância cinzenta
periaquedutal (SCP), núcleo cuneiforme, camadas profundas do colículo superior (CPCS),
núcleos pré-tectal anterior e posterior, núcleo intercolicular e núcleo rubro, entre outros
(WIBERG & BLOMQVIST, 1984; para revisão, ver WILLIS & WESTLUND, 1997). É muito
importante destacar a existência do trato espino-límbico, pois projeções espinotalâmicas e
espino-amigdalinas diretas também já foram descritas (WILLIS & WESTLUND, 1997). As
células de origem desse trato estão localizadas nas lâminas I, VII e X (para revisão, ver WILLIS
& WESTLUND, 1997). Algumas projeções espinhais também alcançam o núcleo accumbens e
os núcleos septais (BURSTEIN & GIESLER, 1989). Essas conexões, diretas ou indiretas com
estruturas relacionadas ao controle das emoções, sugerem que tais projeções devem estar
ligadas aos aspectos motivacionais da dor.
Além disso, o trato espino-cervical origina-se principalmente das lâminas III e IV e
__________________________________________________________________Introdução
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em menor extensão, das lâminas I, II e V (MILLAN, 1999). As funções relatadas para este
trato são as características autonômicas, sensório-discriminativas e afetivo-motivacionais da
dor, como também, esse trato atua como integrador sensorial e modulador das aferências da
medula espinhal.
1.2 – Modulação da dor
Um importante componente da resposta do organismo a situações de emergência é a
redução da capacidade de perceber a dor (COIMBRA e col., 1992; MENESCAL-DE-
OLIVEIRA e col., 1993; COIMBRA & BRANDÃO, 1997). Assim, a antinocicepção pode ser
definida como redução na resposta do sistema sensorial a estímulos nocivos (FANSELOW &
BOLLES, 1979).
Existem mecanismos analgésicos endógenos, ou seja, um sistema de regiões neurais
conectadas às vias aferentes nociceptivas, e que modulam, ou bloqueiam completamente a
passagem das informações da dor em sua trajetória em direção ao córtex cerebral. O primeiro
desses mecanismos é muito simples e atua logo na entrada das vias nociceptivas na medula
espinhal. As sinapses destas com os neurônios de segunda ordem estão localizadas no CDME.
Esses neurônios, no entanto, recebem também sinapses inibitórias de interneurônios situados
nas redondezas, os quais, por sua vez, são ativados pelas fibras Aβ, que veiculam as
informações táteis quando chegam à medula espinhal ao mesmo tempo que os impulsos
dolorosos (cada um através de suas vias aferentes específicas), e podem inibir a transmissão
sináptica entre o neurônio primário nociceptivo e o neurônio de segunda ordem (MELZACK
& WALL, 1965). Mais recentemente, descobriu-se que as sinapses moduladoras da dor não
estão presentes apenas na medula espinhal, mas nos vários níveis das vias nociceptivas e que a
origem dos circuitos inibitórios não se restringe às fibras Aβ. De fato, sabe-se, hoje, que
__________________________________________________________________Introdução
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existem vias descendentes moduladoras da dor que se originam no córtex somestésico e no
hipotálamo, projetando-se para a SCP, e desta para diferentes núcleos bulbares, especialmente
os núcleos da rafe, como por exemplo, o núcleo dorsal da rafe (NDR), cuja estimulação
elétrica desperta forte analgesia, uma região mesencefálica especializada, situada ventralmente
na SCP (OLIVERAS e col., 1979). Eferências do NDR atingem estruturas pontinas e bulbares
mais caudais. Do núcleo magno da rafe (NMgR) ou do locus coeruleus (LC), dois importantes
exemplos dessas estruturas mais caudais, fibras serotoninérgicas ou noradrenérgicas,
respectivamente, descem, através do funículo dorso-lateral (FDL) da medula espinhal com
destino à substância gelatinosa do CDME. Essas vias ainda podem se projetar sobre
interneurônios encefalinérgicos que, por sua vez, hiperpolarizam os neurônios responsáveis
pela transmissão da mensagem nociceptiva (BASBAUM & FIELDS, 1978; MELZACK e col.,
1982), provocando o bloqueio da dor.
A dor normalmente promove um conjunto de reflexos de retirada, fuga, retraimento,
entre outros comportamentos recuperativos. Seria mais razoável, portanto, que essas reações
fossem suprimidas automaticamente em favor de respostas mais adaptativas. Se, dessa forma, a
resposta natural do organismo a situações de emergência inclui uma diminuída sensibilidade a
impulsos nociceptivos, parece plausível que o sistema de inibição de dor seja recrutado em tais
situações (COIMBRA, 1995; COIMBRA e col., 2005), e possivelmente também em situações
patológicas, como durante aquelas que evocam as crises epilépticas, onde a movimentação
vigorosa e rápida, pode não somente extenuar o paciente mas também ser seguida, durante e
após a síndrome de imobilidade pós-ictal, do recrutamento de mecanismos de inibição da dor,
por meio da ativação completa ou parcial do sistema endógeno de inibição da dor. A
serotonina e a noradrenalina são fortes candidatos a neurotransmissores envolvidos nessa rede
neural (OLIVEIRA, 2003; FERREIRA, 2004). Contudo, estudos dos mecanismos neurais e
hormonais têm apresentado provas do envolvimento de ß-endorfina e encefalinas, além de
__________________________________________________________________Introdução
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corticotrofinas e corticosterona em algumas formas de antinocicepção (BASBAUM &
FIELDS, 1989; MILLER, 1981; JONES e col., 1992, 1994), o que sugere o envolvimento de
outros neurotransmissores nesse processo.
Há estudos que sugerem a participação de neurônios encefalinérgicos da substância
gelatinosa no controle da transmissão nociceptiva, inibindo as aferências primárias Aδ e C,
através de projeções pré-sinápticas sobre seu primeiro contato neural com células nociceptivas
localizadas no núcleo espinhal do nervo trigêmeo e, muito provavelmente, no CDME
(JESSEL & IVERSEN, 1977). Esse mecanismo tomaria como base o bloqueio do influxo de
íons cálcio em terminais axônicos de células do gânglio da raiz dorsal, por onde trafegam
impulsos nociceptivos, realizado por neurotransmissores opióides, como as encefalinas e
endorfinas (MUDGE e col., 1979).
As reações comportamentais e autonômicas induzidas pela estimulação do teto
mesencefálico (TM) têm sido descritas como sendo similares àquelas observadas em
decorrência da estimulação nociceptiva aguda (SPIEGEL e col., 1954; KEENE &
FIGUEROA, 1986). É também conhecido que, em humanos, tais estimulações eliciam
sensações desagradáveis associadas ao sofrimento causado pela dor (NASHOLD e col., 1969).
Processos antinociceptivos podem ser gerados por estimulação não somente das diversas
regiões da SCP, mas também das CPCS (GEBHART & TOLEIKIS, 1978; COIMBRA e col.,
1992; COIMBRA & BRANDÃO, 1997; COIMBRA e col., 2005). Essas áreas também têm
sido implicadas com processos convulsivos (DE PAULIS e col., 1990), assim como o colículo
inferior (CI) (CARDOSO e col., 1994).
Como provável base neuroanatômica desse fenômeno antinociceptivo, podemos
salientar as conexões, basicamente serotoninérgicas, de núcleos da formação reticular, tais
como os núcleos da rafe, núcleo paragigantocelular e gigantocelular parte alfa, com o colículo
superior (CS) e SCP (BEITZ, 1986; COIMBRA e col., 2005). Esses núcleos bulbares, assim
__________________________________________________________________Introdução
18
como a SCP, fazem parte do sistema endógeno que modula a percepção de estímulos
nociceptivos (WILLIS & WESTLUND, 1997). A SCP foi uma das primeiras regiões a serem
implicadas na modulação da dor (REYNOLDS, 1969; MAYER e col., 1971). Muito embora
alguns sítios mais rostrais sejam mais usualmente estimulados, há evidências de que a analgesia
eliciada nesses sítios é transmitida através da SCP (RHODES, 1979). Processos
antinociceptivos podem ser gerados em todas as regiões da SCP, apesar de haver relatos na
literatura apontando a região ventro-lateral como sendo mais efetiva em produzir analgesia
(GEBHART & TOLEIKIS, 1978), ao lado de sítios localizados nas colunas dorso-medial e
dorso-lateral da SCP (COIMBRA e col., 1992; COIMBRA e col., 1997).
2 – Opióides e analgesia
Os opióides foram, com toda a probabilidade, estudados mais intensamente do que
qualquer outro grupo de drogas, na tentativa de se compreender seus poderosos efeitos em
termos moleculares, bioquímicos e fisiológicos, visando utilizar essa compreensão no
desenvolvimento de agentes opióides como analgésicos dotados de vantagens significativas
em relação à morfina. (DUGGAN & NORTH, 1984; PASTERNAK, 1993; YAKSH, 1997;
RANG, e col., 2001).
MARTIN (1983) propôs a existência de múltiplas classes de receptores para os
opióides, o que foi posteriormente comprovado com estudos de ligação de drogas a
receptores e com a clonagem de pelo menos cinco tipos de receptores para opióides,
nomeados com as letras gregas µ, κ, δ, σ e ε. Para os três primeiros tipos, já foram
demonstrados diferentes subtipos de receptores, nomeados µ1 e µ2, κ1, κ2 e κ3, e δ1 e δ2,
respectivamente. De modo geral, as drogas utilizadas clinicamente são ativas em mais de um
__________________________________________________________________Introdução
19
receptor, e a distribuição de receptores opióides no sistema nervoso central guarda estreita
relação com os efeitos farmacológicos dos analgésicos opióides. Diversos agonistas e
antagonistas opióides com elevada seletividade pelos diferentes tipos de receptores estão hoje
disponíveis como subsídios farmacológicos eficazes para o estudo das ações opióides. O uso
dessas drogas em modelos animais permitiu estabelecer qual tipo de receptor está envolvido
em cada um dos diferentes efeitos de opiáceos (TSENG, 2001; QUIRION, 1984).
A pesquisa dos neurotransmissores envolvidos na mediação de processos
antinociceptivos tem despertado o interesse de muitos neurocientistas, sendo de crucial
importância a investigação dos pontos do neuro-eixo em que a percepção da dor pode ser
eficientemente modulada. Nos últimos anos têm-se acumulado evidências sugestivas da ação
de opióides em determinados sítios do sistema nervoso periférico e central. Receptores
opióides foram identificados em terminais de pequeno diâmetro na medula espinhal e sobre o
soma de neurônios localizados no gânglio da raiz dorsal (STEIN e col., 1990). Sob uma vasta
gama de condições experimentais e clínicas, uma série de opióides e seus antagonistas
evidenciam efeitos analgésicos e algésicos periféricos (RUSSELL e col., 1987; STEIN e col.,
1991; STEIN, 1993; CZLONKOWSKI e col., 1993).
Um grande avanço na elucidação dos mecanismos endógenos de inibição de dor foi
obtido com a descoberta dos peptídeos opióides e seus efeitos. Assim a busca de opióides
naturais logo foi coroada com a descoberta das encefalinas, endorfinas, a dinorfina e, mais
recentemente, a nociceptina (HENDERSON & McKINGHT, 1997), que são encontrados na
SCP, núcleos da rafe e no CDME, exercendo função moduladora nas sinapses entre vias
nociceptivas (PERT e col, 1976).
O fato de que a microinjeção de opióides (MURFIN e col., 1976) ou a estimulação
elétrica da SCP geram analgesia (através de vias que compõem o FDL) e hiperpolarizam alguns
neurônios localizados no CDME (LIEBESKIND e col., 1973) vai ao encontro do ponto de
__________________________________________________________________Introdução
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vista de alguns autores de que analgesia opióide e analgesia induzida por estimulação elétrica da
SCP possuem um substrato neural comum (MAYER & LIEBESKIND, 1974; MAYER &
HAYES, 1975; MAYER & PRICE, 1976). O substrato anatômico dessas duas formas de
analgesia pode, entretanto, não ser completamente similar. Em alguns estudos encontrou-se
que há sítios na SCP que são mais propensos à analgesia induzida por estimulação elétrica do
que a uma analgesia eliciada por ativação de mecanismos estritamente opióides, pois esses
efeitos podem ser antagonizados pela depleção de monoaminas (TENEN, 1968).
Há evidências de que processos antinociceptivos ativados por aplicações centrais ou
periféricas de drogas opióides, como encefalina e endorfina, assim como a analgesia induzida
por estimulação de determinados sítios encefálicos podem vir a ter um substrato neural
comum, possivelmente ativado não somente após a eliciação de analgesia na SCP, na região
dorsal ou ventral (NICHOLS e col., 1989; COIMBRA e col., 1992), próximo ou na intimidade
do NDR (rico em serotonina e envolvido em processos de inibição de dor) (WANG &
NAKAI, 1994), mas também em se estimulando as estruturas periventriculares, que se
estendem rostralmente em direção ao encéfalo (RHODES, 1979). Sabe-se que dor de origem
visceral e somática pode ser prontamente inibida com a estimulação dessas áreas
(REYNOLDS e col., 1969, BAIK e col., 1995).
Há considerável evidência de que a analgesia induzida pela estimulação elétrica da SCP
ventral primeiramente ativa fibras contendo peptídeos opióides, as quais se projetam ao NMgR
e a outras estruturas da formação reticular (YAKSH, 1980; BASBAUM & FIELDS, 1984). As
fibras serotoninérgicas da rafe, por sua vez, projetam-se, através do funículo lateral, a
neurônios do CDME, produzindo um efeito analgésico que não é reversível pelo naloxone
(CANNON e col., 1982). Em recentes relatos na literatura, tem sido sugerido que, pelo menos,
parte dessa analgesia não-opióide poderia ser mediada por mecanismos serotoninérgicos, pois
é inibida por administrações sistêmicas de metisergida, um bloqueador inespecífico de
__________________________________________________________________Introdução
21
receptores para serotonina (NICHOLS e col., 1989).
Tem sido relatado que várias formas de estresse podem causar analgesia, por ativação
de mecanismos opióides e não-opióides, dependendo da natureza e da intensidade do estímulo
(BODNAR e col., 1980; TERMAN e col., 1984; PAVONE e col., 1986; DE LIMA & RAE,
1991), assim como, uma ação opióide protetora, sensível ao naloxone, durante o estresse
causado por convulsões audiogênicas (CHEN e col., 1976), espontâneas (MELDRUN e col.,
1979; BAJOREK e col., 1984), ou induzidas pelo pentilenotetrazol (ADLER e col., 1976) e por
eletrochoque (PUGLISI-ALLEGRA e col., 1984).
3 – Colículo inferior
O mesencéfalo, que é o mais curto segmento do tronco encefálico, estende-se da ponte
até o diencéfalo e o terceiro ventrículo, e tem sido alvo de inúmeras investigações, cuja
abordagem é centralizada em mecanismos neuroniais envolvidos tanto na elaboração de
processos antinociceptivos, dos comportamentos de defesa (BRANDÃO e col., 1993), quanto
no desencadear de crises audiogênicas (FAINGOLD e col., 1992; GARCIA-CAIRASCO e
col., 1993). Esta região pode ser dividida em duas sub-regiões: o tegmento e o teto
mesencefálico, onde se encontra a lâmina quadrigêmina que contém os colículos inferiores e os
colículos superiores.
O CI, estrutura bilateral e relé das fibras auditivas que ascendem em direção ao córtex
auditivo, está localizado no mesencéfalo dorsal onde ocupa uma posição fundamental na
recepção e processamento dos sinais auditivos. Inicialmente, foi verificada a existência de três
principais subdivisões do CI em mamíferos: o núcleo central, núcleo externo e o núcleo
pericentral (RAMON Y CAJAL, 1909). Na literatura, podemos encontrar outras subdivisões e
__________________________________________________________________Introdução
22
nomenclaturas para o CI, tais como as sugeridas por MORREST & OLIVER (1984) que
distinguiram duas regiões distintas no CI de gatos; uma região tectal, composta pelo núcleo
central (e seus subnúcleos medial, central, lateral e ventral), um córtex (com suas partes dorsal
e caudal), e um núcleo pericentral (composto pelos subnúcleos comissural, dorsomedial,
rostral, lateral e ventrolateral) e outra região tegmental (composta basicamente por áreas
pericoliculares e o núcleo do braço do CI). Posteriormente, HUFFMAN & HENSON (1990)
adotaram uma subdivisão em três principais núcleos: núcleo central, e os núcleos corticais
externo (NCECI) e dorsal (NCDCI), divisão utilizada neste trabalho.
Tem sido descrito que os colículos inferiores são estruturas relacionadas com a
elaboração dos comportamentos de defesas (BRANDÃO e col., 1988; COIMBRA e col., 2000;
OSAKI e col., 2003), assim como com a organização da analgesia eliciada pela estimulação
elétrica (COIMBRA e col.,1992).
COIMBRA & BRANDÃO (1997) e CASTILHO & BRANDÃO (2001)
caracterizaram as bases farmacológicas da antinocicepção que é iniciada pelo comportamento
de fuga em resposta à estimulação do teto mesencefálico. Segundo esses autores, nesse
processo antinociceptivo, há o envolvimento do sistema serotoninérgico e particularmente de
receptores do tipo 5-HT2, os quais medeiam respostas antinociceptivas exibidas durante
comportamentos de fuga desencadeados por estimulação elétrica e pelo bloqueio de receptores
GABAérgicos do tipo A em estruturas mesencefálicas. Efetivamente, há evidências prévias de
que comportamentos induzidos por estímulos aversivos, como aqueles evocados através do
estímulo elétrico do TM, são seguidos de antinocicepção (FARDIN e col., 1984; COIMBRA e
col., 1992; COIMBRA & BRANDÃO, 1997).
As CPCS, assim como diversas regiões da SCP, encontram-se envolvidas com a
elaboração de processos antinociceptivos, que são gerados através de estimulação elétrica e
química dessas áreas (GEBHART & TOLEIKIS, 1978; COIMBRA e col., 1992; COIMBRA
__________________________________________________________________Introdução
23
& BRANDÃO, 1997; COIMBRA e col., 2005). Segundo DE PAULIS e col. (1990), essas
áreas também têm sido implicadas em processos convulsivos, onde o CI possui uma relevante
inserção (CARDOSO e col., 1994). Comportamentos induzidos por estímulos aversivos ou
convulsivos estressantes, são seguidos de antinocicepção (FARDIN e col., 1984; COIMBRA e
col., 1992; COIMBRA & BRANDÃO, 1997), algumas vezes precedidas por crises convulsivas
tônico-clônicas (GARCIA-CAIRASCO, 2002; De FREITAS e col., 2004; FREITAS e col.,
2005).
Recentes achados (OSAKI e col., 2003; FREITAS e col., 2005) têm demonstrado
conexões entre os aspectos dorsais e ventrais da SCP com sítios do CI, cuja estimulação elicia
reações convulsivas (CARDOSO e col., 1994). Quando estimulados, os corpos quadrigêmeos
induzem crises convulsivas tônico-clônicas (CARDOSO e col., 1994; GARCIA-CAIRASCO e
col., 1996a). Com efeito, recentes estudos têm implicado essas regiões com reações
nociceptivas (COIMBRA e col., 1992; COIMBRA & BRANDÃO, 1997; FREITAS e col.,
2005).
4 – Crises convulsivas e analgesia pós-ictal
O aminoácido gama-aminobutírico (GABA) é o neurotransmissor mais amplamente
distribuído no sistema nervoso central dos vertebrados (BORMANN, 2000), e está presente
em 30-50% das terminações nervosas (ROBERTS & FRANKEL, 1950). No sistema nervoso,
o GABA atua em duas famílias de receptores: os do tipo A (GABAA) e os do tipo B (GABAB).
Esses dois receptores têm sido classificados de acordo com critérios farmacológicos e segundo
a natureza dos mecanismos efetores. O receptor GABAA está diretamente acoplado a um canal
de cloro, enquanto que o receptor GABAB está diretamente acoplado a canais de potássio e
__________________________________________________________________Introdução
24
cálcio por meio de uma proteína G (SHOEFIELD, 1987; BOWERY, 1989; BOWERY &
PRATT, 1992). As estruturas localizadas no TM possuem altas concentrações desse
neurotransmissor (OKADA, 1974; SANDNER e col., 1981), particularmente o CI
(SHIRAISHI e col., 2001).
Alguns estudos sugerem a presença de GABA nos interneurônios corticais e
hipocampais, assim como em algumas células da retina, no núcleo accumbens, no núcleo reticular
do tálamo e nos neurônios de Purkinje. Evidências indicam, ainda, que neurônios
GABAérgicos estejam presentes também, no complexo estriado-palidal, estriado-nigral e
projeções coliculares (OKADA e col., 1971; DE PAULIS e col., 1990; FLOREY, 1991).
Existem, também, interneurônios GABAérgicos nos núcleos da rafe, interagindo com
neurônios serotoninérgicos e encefalinérgicos do prosencéfalo, e também com neurônios
colinérgicos (NISIKAWA & SCATTON, 1983; GRIDITTI e col., 1993; WANG & NAKAI,
1993).
A diminuição da neurotransmissão do GABA tem sido envolvida na etiologia de várias
doenças neurológicas, tal como a epilepsia, pois que a atividade desse sistema transmissor está
com o nível anormalmente baixo nos epilépticos. Alguns investigadores têm avaliado a
concentração de GABA no líquido encéfalo-raquidiano de epilépticos, como uma forma de
aferir a atividade neuronial GABAérgica. Encontrou-se uma redução da concentração desse
neurotransmissor no líquor de indivíduos epilépticos (MANYAM e col., 1980), embora um
estado anterior não relatou essa diferença em pacientes epilépticos (ENNA e col., 1977).
Epilepsia é uma descarga elétrica cerebral desorganizada que se propaga para todas as
regiões do encéfalo e leva a uma alteração de toda a atividade cerebral. A convulsão é uma das
tantas formas de manifestação de epilepsia. Tem sido visto que crises epilépticas podem ser
induzidas experimentalmente por inibição do GABA ou por bloqueio de receptores de
membrana relacionados a esse neurotransmissor, por qualquer antagonista GABAérgico
__________________________________________________________________Introdução
25
competitivo ou não competitivo, assim como o pentilenotetrazol (PTZ). Portanto, não há
dúvida que a manipulação do sistema GABAérgico possa influenciar grandemente a
excitabilidade do cérebro e promover crises, tanto em animais como no homem. Uma outra
forma de indução de crises epilépticas consiste em aplicar um estímulo sonoro de alta
intensidade, o que desperta convulsões tônico-clônicas em animais sensíveis (TSUTSUI e col.,
1992; RIBAK E MORIN, 1995; RIBAK e col., 1997), um fenômeno que também pode estar
sob controle de vias ricas em GABA (GARCIA-CAIRASCO e SABBATINI, 1991).
O PTZ é um antagonista não competitivo, GABAérgico, que não interage diretamente
com o receptor do GABA, mas sim bloqueia o influxo de Cl- mediado pelo GABA. A injeção,
por via periférica, de PTZ, em ratos, provoca convulsões tônico-clônicas (SCHOFIELD,
1987; DE LIMA & RAE, 1991).
De acordo com alguns achados, mecanismos GABAérgicos da substância negra (SN)
estão envolvidos no controle de crises convulsivas generalizadas (DINGLEDINE e col., 1978;
GARCIA-CAIRASCO e col., 1996a), o que comprovam outros estudos neurais e hormonais
segundo os quais injeções bilaterais de agonistas GABA dentro do sistema nervoso central
(prosencéfalo e cerebelo), possuem a propriedade de deprimir crises convulsivas
(DINGLEDINE e col., 1978). Na literatura, descreve-se um duplo elo estriadonigral-
nigrotectal que consiste em duas sucessivas vias inibitórias GABAérgicas. Está bem
estabelecido que os neurônios GABAérgicos do estriado que enviam conexões à SN
(CROSSMAN e col., 1973; RINVIC e col., 1976; BROWNSTEIN e col., 1977; OERTEL e
col., 1981), exercem influência inibitória sobre a parte reticulada dessa estrutura (FELTZ, 1971;
PRESCHT & YOSHIDA, 1971; CROSSMAN e col., 1973; DRAY e col., 1976). A parte
reticulada da SN envia projeções também GABAérgicas aos corpos quadrigêmeos (COIMBRA
e col., 1989; COIMBRA & BRANDÃO, 1993). Essas regiões induzem crises convulsivas
quando estimuladas (CARDOSO e col., 1994; GARCIA-CAIRASCO e col., 1996a). Esses
__________________________________________________________________Introdução
26
dados sustentam a hipótese de que a saída nigral deve funcionar como um mecanismo de
barreira para as crises generalizadas (DINGLEDINE e col., 1978). Repetidas estimulações
acústicas em ratos susceptíveis geneticamente à epilepsia evocam alterações neuroquímicas e
límbicas, as quais são abolidas por microinjeção de agonistas GABA (GARCIA-CAIRASCO e
col., 1996b).
Assim também, mecanismos serotoninérgicos e opióides têm sido implicados na
elaboração da analgesia pós-ictal (COIMBRA e col., 2001a, b), onde os corpos quadrigêmeos
podem apresentarem-se como importantes substratos neurais (CARDOSO e col., 1994;
GARCIA-CAIRASCO e col., 1996a; FREITAS e col., 2005). Com efeito, o CS e o núcleo
intercolicular, são importantes componentes da rede mesencefálica das crises convulsivas
(MERRILL e col., 2003), como também a SCP (DE PAULIS e col., 1990) e o CI (CARDOSO
e col., 1994). É possível que esses sítios possam funcionar também como sede da ação
convulsiva do PTZ, assim como da analgesia pós-ictal.
Assim, o estudo de mecanismos GABAérgicos, opióides, serotoninérgicos e até mesmo
colinérgicos pode oferecer dados elucidativos acerca da neuroquímica da analgesia pós-ictal.
Com efeito, opióides endógenos, serotonina, acetilcolina parecem estar criticamente implicados
em processos antinociceptivos induzidos por estimulação de estruturas de onde também se
podem obter crises convulsivas (CARDOSO e col., 1992; OLIVEIRA & PRADO, 1994;
COIMBRA E BRANDÃO, 1997). Entretanto, encontra-se, na literatura, grande escassez de
trabalhos que tratem da analgesia induzida por convulsão. Desta maneira, a analgesia que
segue as crises convulsivas induzidas experimentalmente ou por processos naturais ainda
necessita ser melhor elucidada, assim como o substrato neural desse processo de inibição de
dor.
27
OBJETIVOS
___________________________________________________________________Objetivos
28
1. Objetivos gerais
• Este trabalho foi realizado com o objetivo de investigar se as crises convulsivas
induzidas por drogas, como o pentilenotetrazol, são seguidas de antinocicepção,
reversível pelo antagonismo de receptores opióides por via periférica e central.
2. Objetivos específicos
• Caracterizada a analgesia pós-ictal, a neuroquímica subjacente a essa antinocicepção
foi investigada com o uso de um antagonista farmacológico específico, opióide,
como o naloxonazine, que promove ligações covalentes irreversíveis com
receptores µ1. A participação desse subtipo de receptores opióides na analgesia pós-
ictal foi avaliada em um modelo experimental de epilepsia induzida por droga, e o
bloqueador foi administrado por via periférica.
• Também foi investigada parte do substrato neural responsável pela organização da
analgesia pós-ictal, avaliando o envolvimento do núcleo central do colículo inferior
(NCCI) na analgesia que segue crises convulsivas induzidas pelo bloqueio ionóforo
de canais de cloro ligados ao ácido gama-aminobutírico. Com esse intuito,
microinjeções centrais de naloxonazine, em diferentes doses, foram realizadas no
CI.
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MATERIAIS E MÉTODO
____________________________________________________________Materiais e Método
30
1) Animais
Foram utilizados ratos albinos (Rattus norvegicus, Rodentia, Muridae), da linhagem Wistar,
pesando entre 200-250g. Esses animais foram colocados em caixas com quatro exemplares, os
quais tiveram acesso à comida e água, durante todo o experimento, e foram mantidos em
ambiente com ciclo claro escuro de 12/12h (luzes ligadas das 7h às 19h), e temperatura
constante de 25°C±1°C. Os experimentos foram realizados em harmonia com os princípios
elaborados pela Comissão de Ética em Experimentação Animal da FMRP-USP.
2) Testes nociceptivos
Todos os ratos tiveram seus limiares nociceptivos aferidos, utilizando-se para o isso o
teste de retirada de cauda. Cada animal foi colocado em uma cela de contenção com paredes de
acrílico, e teve sua cauda colocada sobre o sensor de uma fonte de calor (Tail-Flick Analgesia
Instrument; Ugo Basile), cuja elevação progressiva de calorimetria (proporção de 9ºC/s) era
automaticamente interrompida, tão logo o animal retirava a cauda do dispositivo. Um pequeno
ajuste da intensidade e corrente foi realizado, quando necessário, no início do experimento,
com o propósito de se obterem três latências consecutivas de retirada de cauda, entre 2,5 e 3,5
s. Caso o animal não removesse a cauda da fonte de calor dentro de 6 s, o dispositivo era
desligado para prevenir danos teciduais. Toda a latência de retirada de cauda (LRC) foi
normalizada em um índice de analgesia (IA) usando-se para isso a seguinte fórmula:
____________________________________________________________Materiais e Método
31
)controleLRC( - 6
)controleLRC(-)teste
(LRC=IA
A linha de base foi formada pela média de três LRC, tomadas em intervalos de 5 min.
O limiar nociceptivo foi igualmente aferido em seqüência às crises convulsivas, induzidas pelo
PTZ.
3) Testes comportamentais
Os testes comportamentais foram realizados no interior de uma arena circular (open-
field), cujas paredes, de acrílico transparente, medem 60 cm de diâmetro e 50 cm de altura, e
cujo assoalho é dividido em 12 secções iguais. Essa arena é situada em um compartimento
experimental e iluminada por lâmpada fluorescente. O efeito das drogas administradas (efeito
do PTZ, do bloqueador farmacológico e salina), foi estudado no interior desse aparato, e os
comportamentos convulsivos registrados através de uma câmera filmadora (Panasonic).
4) Equipamentos
As cirurgias estereotáxicas foram realizadas por meio de um estereotáxico ultra-preciso,
desenvolvido para pequenos animais (David Kopf, 902, EEUU).
Os testes antinociceptivos foram realizados através de um analgesímetro para realização
do teste de retirada da cauda (Ugo Basile, 21025, Itália).
A análise histológica foi feita através de um micrótomo de congelação (HM 505 E,
Zeiss, Alemanha), e os resultados foram avaliados através de um microscópio de luz (Axioplan,
Zeiss).
____________________________________________________________Materiais e Método
32
5) Procedimentos
5.1) Estudo do efeito do bloqueio de receptores opióides, por via periférica, sobre a analgesia pós-ictal.
Inicialmente, foi feita uma linha de base do teste de retirada de cauda com todos os
animais de cada grupo (N=8). Os animais dos grupos controles receberam injeção
intraperitoneal (IP) de salina, após 10 min (N=14) ou 24h (N=8), foi administrado por via
periférica, PTZ em todos os animais. Após haver recebido a droga, os animais foram
colocados na arena, onde permaneceram até o término da crise convulsiva e tiveram seus
limiares nociceptivos aferidos através do teste de retirada de cauda, tão logo a ativação
comportamental chegasse ao seu fim; portanto, imediatamente após as crises, 10, 20, 30, 40,
60, 70, 80, 90, 100, 120, 140 e 160 min após as convulsões.
Grupos independentes de animais receberam aplicações periféricas de naloxonazine,
nas doses de 10 mg/kg (N=8, para 10 min e 24h), 20 mg/kg (N=8 para 10 min e 24h) e 30
mg/kg (N= 10 para 10 min e 24h), seguindo-se, após 10 min ou 24h, a aplicação periférica de
pentilenotetrazol. O limiar nociceptivo foi aferido imediatamente após o término da crise
convulsiva, e nos tempos estipulados anteriormente.
5.2) Estudo do efeito do bloqueio central de receptores opióides µ1 sobre a analgesia pós-ictal
Inicialmente, após o período de recuperação pós-operatória da cirurgia estereotáxica (3
a 5 dias), foi feita uma linha de base para o teste de retirada de cauda com todos os animais de
cada grupo. Os animais do grupo sham (N=5) foram operados e, sem receberem injeção de
droga, por via central, foram tratados apenas com PTZ, administrado por via IP. Após haver
____________________________________________________________Materiais e Método
33
recebido a droga, os animais foram colocados na arena, onde permaneceram até o término da
crise convulsiva, determinando-se então sua LRC, tão logo a ativação comportamental
chegasse ao seu fim; portanto, imediatamente após as crises, 10, 20, 30, 40, 60, 70, 80, 90, 100,
120, 140 e 160 min após as convulsões. Grupos independentes de animais receberam
aplicações centrais (no NCCI ou, nos NCDCI ou NCECI) de naloxonazine, nas doses de
1µg/0,2µl (N=8), 2µg/0,2µl (N=8) e 3µg/0,2µl (N=7), ou salina (NaCl a 0,9%; 0,2µl; N=9),
seguindo-se, após 24h (em grupos independentes de animais), a aplicação por via IP de PTZ
(64 mg/kg). O limiar nociceptivo foi aferido imediatamente após o término da crise
convulsiva, e nos tempos estipulados anteriormente. As crises convulsivas tônico-clônicas
foram registradas através de uma câmera filmadora, e os resultados foram analisados através da
observação dos comportamentos quanto à duração do processo convulsivo em segundos (seg).
5.2.1) Intervenções cirúrgicas
Os animais foram anestesiados, com cetamina (10%, Agener) e xilasina (2%, Dopaser),
colocados no aparelho estereotáxico e a calvária, exposta. Foram feitas duas trepanações no
crânio, para a introdução de um parafuso de ancoragem de uma prótese de fixação (feita de
resina autopolimerizável) e de uma cânula-guia, a qual foi direcionada para o NCCI, segundo as
seguintes coordenadas: AP: - 8,8mm; ML: 1,6mm; DV: 4,5mm. Tomando-se a linha interaural
como referência e estando bregma e lambda em um mesmo plano experimental. A cânula-guia
foi confeccionada com agulha de injeção intradérmica (25X6mm), de aço inoxidável, com
l5mm de comprimento. Um fio de aço foi introduzido na luz da cânula, para protegê-la de
impurezas.
Para a microinjeção das drogas, uma microagulha (Mizzi), conectada a uma microseringa
(Hamilton, l0µl) foi introduzida na cânula, e ultrapassou a sua extremidade final em l mm. Um
____________________________________________________________Materiais e Método
34
cateter de polietileno foi acoplado a microagulha para monitorização das microinjeções, que
eram feitas através de uma bomba de infusão de drogas (Stoelting). Após oito dias de
sobrevivência, os animais foram anestesiados, sacrificados, e tiveram seus encéfalos removidos
para a realização das análises morfológicas, em nível de microscopia de luz.
6) Drogas
Foram utilizados o pentilenotetrazol (PTZ, Sigma) e o naloxonazine (RBI) dissolvidos
em solução salina (NaCl a 0,9 %); esta foi igualmente utilizada como controle do veículo das
drogas injetadas.
Os bloqueadores farmacológicos foram administrados perifericamente em dose única,
no caso do PTZ (64 mg/kg) e em três doses, no caso do naloxonazine (10 mg/kg, 20 mg/kg e
30 mg/kg). O antagonista de receptores opióides também foi utilizado centralmente (no CI),
nas seguintes doses: 1µg/0,2µl, 2µg/0,2µl e 3µg/0,2µl.
7) Análise estatística
Os dados foram avaliados pelo teste de análise de variância de medidas repetidas
(MANOVA), seguido, quando apropriado, pelo teste post-hoc de Duncan.
8) Histologia
Após a finalização dos experimentos, os animais (Rattus norvegicus) foram anestesiados
com pentobarbital sódico (45 mg/kg) até atingir uma depressão respiratória letal, seguida de
____________________________________________________________Materiais e Método
35
uma incisão no tórax, com exposição do mediastino. O próximo passo foi clampear a aorta
descendente torácica libertando o coração do envoltório pericárdico, para o puncionamento do
ventrículo esquerdo, por meio de um equipo sanguíneo conectado a uma seringa de 60ml, e foi
feita uma incisão no átrio direito, quando então os encéfalos foram perfundidos com solução
salina a 0,9%, seguida por solução de paraformaldeído a 4%. Em seguida, os encéfalos foram
removidos, seccionados em cortes coronais, para separação do tecido mesencefálico do
restante do tecido nervoso. O bloco assim obtido foi levado ao criostato, onde secções
seriadas de 40µm foram realizadas e adequadamente montadas em lâminas gelatinizadas;
posteriormente desidratadas, diafanizadas e coradas com hematoxilina/eosina (HE). Em
seguida, foram analisadas ao microscópio de luz (Axioplan), e os sítios de microinjeção de
drogas puderam ser assinalados em diagramas do Atlas de Paxinos & Watson (1997).
36
RESULTADOS
________________________________________________________________Resultados
37
Neste trabalho foi investigado o efeito do pré-tratamento com um bloqueador de
receptores opióides µ1, o naloxonazine, na analgesia pós-ictal induzida por ataques epilépticos,
evocados por um bloqueio sistêmico de canais Cl– ligados a sinapses GABAérgicas no sistema
nervoso central. O PTZ induziu crises tônico-clônicas, seguidas de analgesia em todos os
animais do presente estudo e, as convulsões não foram precedidas por corridas selvagens.
A administração periférica de naloxonazine em todas as doses (10 mg/kg, 20mg/kg e
30 mg/kg) apresentou efeitos significativos em relação ao grupo controle (salina, NaCl 0,9%),
causando diminuição da LRC observada no teste de retirada de cauda (tail-flick), após 24h da
administração de naloxonazine mas não após 10 min.
O pré-tratamento com naloxonazine 10 minutos antes da administração IP de
PTZ não alterou a LRC. A análise de variância de uma via (“One Way ANOVA”) não mostrou
efeito estatisticamente significante do tratamento [F (3,47) = 1,72; p> 0,05], nem interação
tratamento x tempo [F (36,104) = 1,42; p> 0,05]. Dados mostrados na figura 1.
Contudo, o pré-tratamento com naloxonazine 24h antes da administração IP de PTZ
causou diminuição das LRC. Houve efeito estatisticamente significante do tratamento
farmacológico com naloxonazine [F (3,30) = 6,19; p< 0,01], do tempo [F (12,19) = 90,88; p<
0,0001] e interação tratamento x tempo [F (36,53) = 3,94; p< 0,0001]. A análise post-hoc
mostrou que o bloqueio de receptores µ1-opióides causou redução da analgesia aferida de 0 a
160 min do período pós-ictal [F (3,30) variando de 4,29 a 12,79; p< 0,05]. Esse efeito foi
evidenciado mais precisamente de 30 a 80 min (naloxonazine a 10 mg/kg, naloxonazine a 20
mg/kg e naloxonazine a 30 mg/kg x salina) do período pós-ictal. O teste post-hoc mostrou,
ainda, que 20 min após as convulsões já houve diferenças entre as maiores doses de
naloxonazine (20 mg/kg e 30 mg/kg), em relação ao controle [Duncan; p< 0,05; em todos os
casos], como mostrado na figura 2.
________________________________________________________________Resultados
38
A administração central de naloxonazine em todas as doses estudadas (1µg/0,2µl;
2µg/0,2µl; 3µg/0,2µl) apresentou efeitos significativos em relação ao grupo controle (salina,
NaCl 0,9%) e ao grupo sham, causando diminuição da LRC observada no teste de tail-flick,
após 24h da administração de naloxonazine.
Houve efeito estatisticamente significante do tratamento farmacológico com
naloxonazine [F (4,32) = 25,10; p< 0,0001], do tempo [F (12,21) = 73,97; p< 0,0001] e
interação tratamento x tempo [F (48,78) = 2,63; p< 0,0001]. A análise post-hoc mostrou que o
bloqueio de receptores µ1-opióides no CI causou redução da analgesia aferida de 0 a 160 min
do período pós-ictal [F (4,32) variando de 3,83 a 35,51; p< 0,05]. Esse efeito foi evidenciado
mais precisamente de 20 a 140 min (naloxonazine a 1µg/0,2µl, naloxonazine a 2µg/0,2µl e
naloxonazine a 3µg/0,2µl x salina e sham) do período pós-ictal. O teste post-hoc mostrou ainda
que, 60, 70, 90 e 120 min após as convulsões houve diferenças entre os grupos salina e sham
(Figura 3).
Contudo, o pré-tratamento prolongado (24h) com naloxonazine em todas as doses
estudadas (1µg/0,2µl; 2µg/0,2µl; 3µg/0,2µl) apresentou efeitos significativos em relação ao
grupo controle (salina, NaCl 0,9%), causando diminuição do tempo de processo convulsivo
avaliado após a administração IP de PTZ, observado nos registros dos comportamentos
convulsivos.
Houve efeito estatisticamente significante do tratamento farmacológico com
naloxonazine [F (4,32) = 3,79; p< 0,05]. A análise post-hoc mostrou que o bloqueio de
receptores µ1-opióides no CI causou redução do tempo de processo convulsivo aferido após a
administração IP de PTZ aferido no intervalo entre o primeiro comportamento (mioclonia de
mandíbula) e o fim do processo convulsivo (comportamento exploratório do animal na arena
circular – open field). Dados mostrados na Figura 4.
________________________________________________________________Resultados
39
Os presentes resultados apontam para a participação de receptores opióides µ1 na
analgesia pós-ictal envolvendo as redes neurais do CI, assim como na modulação das crises
convulsivas tônico-clônicas, induzidas pelo bloqueio do sistema GABAérgico.
Todos os sítios estudados foram localizados no NCECI, no NCDCI e no NCCI (como
mostrado na figura 5). Um resumo da localização dos sítios de microinjeção do antagonista
farmacológico e de seu veículo, assim como do grupo “cirurgia fictícia” (sham) é mostrada na
figura 6.
________________________________________________________________Resultados
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tempo (min)
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An
alg
esia
(IA
)
Salina fisiológica + PTZ (64 mg/kg) Naloxonazine (10 mg/kg) + PTZ (64 mg/kg)
Naloxonazine (20 mg/kg) + PTZ (64 mg/kg) Naloxonazine (30 mg/kg) + PTZ (64 mg/kg)
FIGURA 1 – Ausência de efeito do pré-tratamento por via intraperitoneal com salina
fisiológica + pentilenotetrazol (PTZ 64 mg/kg) (□-□) (N=14); naloxonazine (10 mg/kg) +
PTZ (64 mg/kg) (■-■) (N=8); naloxonazine (20 mg/kg) + PTZ (64 mg/kg) (▲-▲) (N=8) e
naloxonazine (30 mg/kg) + PTZ (64 mg/kg) (∆-∆) (N=10) na analgesia pós-ictal. Os dados
foram apresentados como média ± EPM, p>0,05. O bloqueio de canais de cloro ligados ao
GABA, com PTZ, foi realizado 10 min após o antagonismo de receptores opióides µ1, com
naloxonazine, ou 10 min após administração de seu veículo.
________________________________________________________________Resultados
41
-0,4
-0,2
0
0,2
0,4
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0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160
tempo (min)
Ind
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de
An
alg
esia
(IA
)
Salina fisiológica + PTZ (64 mg/kg) Naloxonazine (10mg/kg) + PTZ (64 mg/kg)
Naloxonazine (20mg/kg) + PTZ (64 mg/kg) Naloxonazine (30mg/kg) + PTZ (64 mg/kg)
**
* * *
**
*
** *
*
***
**
FIGURA 2 – Efeito do pré-tratamento por via intraperitoneal com salina fisiológica +
pentilenotetrazol (PTZ; 64 mg/kg) (□-□) (N=8); naloxonazine (10 mg/kg) + PTZ (64 mg/kg)
(■-■) (N=8); naloxonazine (20 mg/kg) + PTZ (64 mg/kg) (▲-▲) (N=8) e naloxonazine (30
mg/kg) + PTZ (64 mg/kg) (∆-∆) (N=10) na analgesia pós-ictal. Os dados foram apresentados
como média ± EPM., * (p< 0,05) quando comparado com o controle (□-□), segundo o teste
post hoc de Duncan. O bloqueio de canais de cloro ligados ao GABA, com PTZ, foi realizado
24 h após o antagonismo de receptores opióides µ1, com naloxonazine, ou 24 h após
administração de seu veículo.
________________________________________________________________Resultados
42
-0,2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160
tempo (min)
Índ
ice
de
An
alg
esia
(IA
)
Sham + PTZ (64 mg/kg) Salina Fisiológica + PTZ (64 mg/kg)
Naloxonazine (1µg/0,2µl) + PTZ (64 mg/kg) Naloxonazine (2µg/0,2µl) + PTZ (64 mg/kg)
Naloxonazine (3µg/0,2µl) + PTZ (64 mg/kg)
*
*#
§
*#
§
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§
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* #
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# **
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**
*
FIGURA 3 - Efeito do pré-tratamento prolongado, sobre o colículo inferior, com salina
fisiológica + pentilenotetrazol (PTZ; 64 mg/kg) (□-□) (N=9); naloxonazine (1µg/0,2µl) +
PTZ (64 mg/kg) (■-■) (N=8); naloxonazine (2µg/0,2µl) + PTZ (64 mg/kg; i.p.) (●-●) (N=8);
naloxonazine (3µg/0,2µl) + PTZ (64 mg/kg; i.p.) (▲-▲) (N=7) e sham (∆-∆) (N=5) na
analgesia pós-ictal. Os dados foram apresentados como média ± EPM.; * (p< 0,05) quando
comparado com o grupo salina + PTZ (64 mg/kg) (□-□), # (p<0,05) quando comparado ao
grupo sham (∆-∆), § (p<0,05) quando comparado com o grupo naloxonazine (1µg/0,2µl) +
PTZ (64 mg/kg) (■-■), segundo o teste post hoc de Duncan. O bloqueio de canais de cloro
ligados ao GABA, com PTZ, foi realizado, por via intraperitoneal, 24h após o antagonismo
opióide ou após administração de seu veículo, ou ainda 24 h após a introdução da microagulha
no teto mesencefálico.
________________________________________________________________Resultados
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vuls
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(seg
)
SH SL NLX 1 NLX 2 NALX 3
*
*
*
FIGURA 4 – Efeito do pré-tratamento prolongado, sobre o colículo inferior, com salina
fisiológica + pentilenotetrazol (PTZ; 64 mg/kg) (SL) (N=9); naloxonazine (1µg/0,2µl) + PTZ
(64 mg/kg) (NLX 1) (N=8); naloxonazine (2µg/0,2µl) + PTZ (64 mg/kg; i.p.) (NLX 2)
(N=8); naloxonazine (3µg/0,2µl) + PTZ (64 mg/kg; i.p.) (NLX 3) (N=7) e sham (SH) (N=5)
no tempo de processo convulsivo. Os dados foram apresentados como média ± EPM; * (p<
0,05) quando comparado com o grupo salina + PTZ (64 mg/kg) (SL), segundo o teste post hoc
de Duncan. O bloqueio de canais de cloro ligados ao GABA, com PTZ, foi realizado, por via
intraperitoneal, 24h após o antagonismo opióide ou após administração de seu veículo, ou
ainda 24 h após a introdução da microagulha no teto mesencefálico. Compreende-se pelo
tempo de processo convulsivo o intervalo entre a primeira crise (mioclonia de mandíbula) e a
completa exacerbação das crises (comportamente exploratório do animal pela arena).
________________________________________________________________Resultados
44
A
C
B
FIGURA 5 – Fotomicrografias de cortes transversais do mesencéfalo de rato Wistar, onde se vêem (setas)
sítios representativos das microinjeções realizadas no núcleo cortical dorsal do colículo inferior em A, no
núcleo central do colículo inferior em B e no núcleo cortical externo do colículo inferior em C. Barra: 519
µm em A, 983 µm em B e 504 µm em C.
________________________________________________________________Resultados
45
FIGURA 6 – Representação esquemática dos sítios de microinjeção de salina (□), naloxonazine 1µg/0,2µl
(■), naloxonazine 2µg/0,2µl (●), naloxonazine 3µg/0,2µl (▲) e sham (∆) realizadas no colículo inferior,
segundo o Atlas de Paxinos & Watson, 1997.
Bregma - 9,30 mm
Bregma - 8,30 mm
Bregma - 9,16 mm
Bregma - 9,68 mm
Bregma - 9,80 mm
46
DISCUSSÃO
___________________________________________________________________Discussão
47
Os presentes achados sugerem o envolvimento do sistema opioidérgico, mais
especificamente de receptores µ1, nos processos antinociceptivos induzidos por reações
convulsivas. Essa antinocicepção foi estudada através do teste de retirada de cauda (tail-flick),
que utiliza reflexos medulares, em detrimento de outros clássicos testes de analgesia, como o
teste da placa quente (hot-plate) ou de formalina, que requerem a participação de mecanismos
supra-espinais (DICKENSON e col., 1979; LE BARS e col., 2001).
Primeiramente descritos em estudos de binding (WOLOZIN & PASTERNACK, 1981;
NISHIMURA e col., 1984; ZANG & PASTERNACK, 1981a,b) os receptores µ1 têm sido
implicados em numerosas ações opióides, tais como analgesia supra-espinal, modulação do
comportamento alimentar, liberação de prolactina, e nos muitos mecanismos de dependência
física a drogas opiáceas (PASTERNACK e col., 1980 a,b; ZANG & PASTERNACK, 1981
a,b; SPIEGEL e col., 1982; LING & PASTERNACK, 1983; LING e col., 1984, 1985;
SIMONE e col., 1985). A capacidade dos antagonistas inespecíficos , como o naloxone, ou
seletivos , como o naloxonazine (PASTERNACK & HAHN, 1980; PASTERNACK e col.,
1980 a,b; HAHN e col., 1982), de antagonizar os receptores µ1, facilitou grandemente estudos
sobre a ação dos opióides. Embora ambos os compostos possuam propriedades
farmacológicas similares, o naloxonazine é o mais potente in vivo e in vitro (LING e col.,
1986).
Em nossos resultados pudemos observar que o naloxonazine foi capaz de antagonizar
a analgesia induzida pelas crises convulsivas tônico-clônicas. Essa antagonização teve efeito
estatisticamente significante após 24h da administração de naloxonazine em todas as doses
estudadas. O antagonismo opióide após 10 minutos, não foi estatisticamente significante,
muito embora tenha havido tendência a diminuição da analgesia induzida pelas crises
___________________________________________________________________Discussão
48
convulsivas. Esse fato pode ter sido devido a ação inespecífica do tratamento agudo com
naloxonazine sobre receptores opióides (LING e col., 1986), os quais podem desempenhar
efeitos antagônicos nas redes neurais em que se situam.
Os resultados obtidos no presente trabalho indicam que os receptores opióides µ1 estão
envolvidos na analgesia pós-ictal, embora seja prudente considerarmos também a possibilidade
do envolvimento de outros mecanismos opióides na elaboração da analgesia induzida pelas
crises convulsivas tônico-clônicas.
LING e col. (1986), caracterizaram a ação do naloxonazine em camundongos e
ratos. O naloxonazine antagonizou a analgesia induzida por morfina por 24h sem alterar a
letalidade causada por intoxicação aguda por opiáceos. Essa ação prolongada não poderia ser
facilmente explicada por uma lenta taxa de eliminação, já que a meia-vida de eliminação
terminal foi estimada em menos de 3h. Em acréscimo, a seletividade da ação do naloxonazine
é dose-dependente, pois quanto maior a dose, maior é a sua seletividade (LING e col., 1986).
Curiosamente, o naloxonazine liga-se reversivelmente a outros subtipos de receptores opióides
a uma potência similar à do naloxone. Entretanto, sob circunstâncias específicas, o
naloxonazine bloqueia os receptores µ1 de uma maneira mais prolongada, pois esse bloqueador
farmacológico tem ação irreversível ao se ligar cronicamente a esse subtipo de receptor
(HAHN e col., 1982; JOHNSON & PASTERNAK, 1984). Esse fato permite-nos considerar
seguramente o envolvimento de receptores µ1 em redes neurais de estruturas envolvidas na
elaboração do processo de analgesia pós-ictal, após os resultados obtidos com o tratamento
mais prolongado com naloxonazine, como antagonista opióide.
Além de mecanismos opióides, sistemas monoaminérgicos e colinérgicos têm sido
implicados na elaboração da analgesia pós-ictal (COIMBRA e col., 2001a, b; OLIVEIRA,
2003; FERREIRA, 2004; DE FREITAS e col., 2004). Recentes relatos na literatura sugerem a
participação de prolactina, vasopressina e opióides endógenos na analgesia pós-ictal induzida
___________________________________________________________________Discussão
49
por eletrochoque (PORTUGAL-SANTANA e col., 2004). Como sugerido por COIMBRA e
col. (2001a), opióides endógenos, como encefalina e endorfina, podem não participar de
estágios iniciais da analgesia pós-ictal, sendo tais neurotransmissores recrutados num estágio
tardio, considerando os primeiros 30 minutos de período pós-ictal, pois o pré-tratamento
periférico com antagonista opióide inespecífico, naloxone, em sua menor dose, não produziu
efeito sobre a antinocicepção evocada por crises convulsivas tônico-clônicas. Portanto,
receptores opióides kappa, delta e µ, podem estar envolvidos em mecanismos mais tardios do
período pós-ictal, ao passo que, as monoaminas e a acetilcolina estariam envolvidas no início
da antinocicepção que segue as crises convulsivas (COIMBRA e col., 2001b ; DE FREITAS e
col., 2004). Corroborando esses achados, nossos dados demonstram o bloqueio de receptores
opióides µ1, dose-dependente, por meio de administrações centrais de naloxonazine,
microinjetado em núcleos específicos do CI de ratos, sobre a analgesia pós-ictal.
Dentre as vantagens oferecidas pela microinjeção central de drogas, está a de tornar
possível a aplicação de substâncias diretamente no tecido nervoso, evitando as limitações
decorrentes da administração periférica, como, por exemplo, os efeitos de fármacos em
diversos sítios, os processos de metabolização e a seleção pela barreira hemato-encefálica. Esse
método apresenta ainda aspectos positivos quando comparado aos outros procedimentos
adotados quando se trata do tecido nervoso, como por exemplo, lesões teciduais e estimulação
elétrica, porque restringe os sítios encefálicos relacionados à atividade em estudo e evita a
ativação de fibras de passagem. Além disso, é possível recrutar número suficiente de neurônios
capazes de alterar uma resposta comportamental, entre elas a redução da resposta aos
estímulos nociceptivos (YAKSH & RUDY, 1978).
O mesencéfalo tem sido alvo de considerável atenção nos estudos de comportamento
de fuga e crises audiogênicas, tanto na região do teto (BRANDÃO e col., 1993; FAINGOLD e
col, 1992; GARCIA-CAIRASCO e col., 1993), quanto do tegmento mesencefálicos
___________________________________________________________________Discussão
50
(FAINGOLD & RANDALL, 1995; LIU e col., 1999; ISHIMOTO e col., 2000), assim como,
tem sido postulado seu envolvimento em processos antinociceptivos (GEBHART &
TOLEIKIS, 1978; COIMBRA e col., 1992; COIMBRA & BRANDÃO, 1997; CASTILHO e
col., 1999). Os dados obtidos no presente trabalho sugerem que os receptores opióides µ1
encontram-se envolvidos nesse processo antinociceptivo, podendo elaborar a antinocicepção
que se estabelece após a síndrome de imobilidade pós-ictal por meio de todo o contínuum do
TM, onde a presença de neurotransmissores representados por polipeptídeos opióides
endógenos já foram amplamente demonstrados (EICHENBERGER e col., 2002; OSAKI e
col., 2003), embora seja prudente considerarmos a possibilidade do envolvimento de outros
mecanismos opióides na elaboração da analgesia induzida pelas crises convulsivas tônico-
clônicas.
Os presentes resultados ainda indicam o envolvimento dos núcleos do CI na
elaboração da analgesia pós-ictal, pois a microinjeção de naloxonazine sobre as redes neurais
do CI antagonizou a antinocicepção eliciada pelas crises convulsivas tônico-clônicas,
evidenciando seu efeito específico após 24h, como descrito por LING e col. (1986).
Achados na literatura demonstram processos antinociceptivos em modelos
experimentais de epilepsia, nos quais receptores opióides µ1 e receptores colinérgicos
muscarínicos e nicotínicos podem estar envolvidos (COIMBRA e col., 1996, 2001 a ; DE
FREITAS e col., 2004). Na verdade, algumas estruturas e redes neurais mesencefálicas, assim
como o CI, SCP, NDR, núcleo paragigantocelular, parte alfa e LC possuem mecanismos
opióides, monoaminérgicos e colinérgicos envolvidos no controle da dor (AZAMI e col., 2001;
BASBAUM & FIELDS, 1989; LI e col., 1993; MAMEDE-ROSA e col., 1998), defesa
(COIMBRA e col., 2000; EICHENBERGER e col., 2002; MONASSI e col., 1997; OSAKI e
col., 2003), e epilepsia (CARDOSO e col., 1994; GARCIA-CAIRASCO e col., 1993;
PETERSON e col., 2000). Em vista disso, os presentes resultados também apontam para o
___________________________________________________________________Discussão
51
envolvimento dos receptores µ1-opióides e de tais núcleos do CI na elaboração do processo
convulsivo induzido pelo PTZ, pois o tempo total de processo convulsivo foi reduzido pela
microinjeção de naloxonazine quando administrado no CI.
Alguns cientistas descrevem que o CI, uma estrutura que participa da elaboração de
processos antinociceptivos, possui neurônios positivos para β-endorfina e leu-encefalina
(EICHENBERGER e col., 2002; OSAKI e col., 2003). Entretanto, o CI recebe aferências
GABAérgicas da parte reticulada da SN (COIMBRA e col., 1989; COIMBRA & BRANDÃO,
1993). Tem sido descrito que essa estrutura mesencefálica está intimamente relacionada com a
indução de crises convulsivas (MCCOWN e col., 1987, 1984; CARDOSO e col., 1994;
GARCIA-CAIRASCO e col., 1996a ), sugerindo que, as eferências nigrais funcionem como
uma barreira na indução das crises generalizadas (DINGLEDINE e col., 1978). Portanto,
podemos sugerir que, o bloqueio de receptores opióides µ1 sobre as redes neurais do CI estaria
modulando tais mecanismos GABAérgicos oriundos da SN. Esses dados corroboram estudos
que postulam a hipótese de que o sistema opióide que elabora a antinocicepção evocada por
situações de estresse, tenha função pró-convulsivante, cujo pré-tratamento com naloxone
atrasou a ativação das crises convulsivas induzidas pelo PTZ (DE LIMA & RAE, 1991). Outro
estudo demonstrou ainda, que agonistas opióides, podem inibir a liberação de GABA via
ativação de receptores µ-opióides no CI (TONGJAROENBUNGAM e col., 2004).
É sabido que uma mesma dose de encefalina pode causar analgesia, sem convulsões,
quando injetada na SCP, como também pode causar convulsões, sem analgesia, quando
administrada no núcleo dorso-medial do tálamo (FRENK e col., 1978). Tanto a SCP, como a
região dorso-medial do tálamo, contêm sítios de ligantes para opióides endógenos, como as
encefalinas e β-endorfinas (FRENK e col., 1978). Estudos realizados anteriormente revelam
que receptores opióides mediando analgesia e convulsão não somente são localizados em
diferentes áreas do encéfalo, mas também diferem uns dos outros farmacologicamente
___________________________________________________________________Discussão
52
(FRENK e col., 1978).
Muitos estudiosos têm investigado as bases neurais e neuroquímicas que embasam a
analgesia pós-ictal, evidenciando que lesões neuroquímicas do LC e também do NMgR
diminuíram a magnitude da analgesia pós-ictal, sugerindo o envolvimento desses núcleos nesse
processo antinociceptivo (FREITAS e col., 2005). Outras evidências têm mostrado a ligação
entre o TM e o NMgR, um importante núcleo do sistema de inibição de dor (COIMBRA e
col., 2005; FREITAS e col., 2005). Através de estudos de neurotraçamento, tem sido mostrado
interconexões entre CS, SCP partes dorsal e ventral e CI. Substratos defensivos do CI, também
envolvidos com corrida selvagem e epilepsia, enviam projeções para o NMgR e LC, que são
núcleos ricos em monoaminas e, que por sua vez, enviam projeções para outros núcleos
monoaminérgicos do mesencéfalo envolvidos com o controle da transmissão nociceptiva no
CDME (FREITAS e col., 2005), nas sinapses entre o primeiro e segundo neurônio da via
nociceptiva espino-talâmica (AZAMI e col., 2001; BASBAUM & FIELDS, 1989; LI e col.,
1993; MAMEDE-ROSA e col., 1998).
O estudo de mecanismos opióides pode oferecer dados elucidativos sobre a
neuroquímica da analgesia pós-ictal. Na realidade, opióides endógenos parecem estar
implicados criticamente na antinocicepção (FRENK e col., 1978; NICHOLS e col., 1989;
ROYCHOWDHURY & FIELDS, 1996) e em processos defensivos (CARDOSO e col., 1992;
COIMBRA e col., 2000) induzidos por excitação de estruturas onde também é possível induzir
ataques convulsivos (CARDOSO e col., 1992; GARCIA-CAIRASCO & SABATINI, 1991;
RIBAK e col., 1997; TERRA & GARCIA-CAIRASCO, 1994). Estudos imunoistoquímicos
(TONGJAROENBUNGAM e col., 2004) demonstraram que agonistas opióides no CI de
ratos podem inibir a liberação de GABA induzida por canais de cloro, via ativação de
receptores opióides do subtipo µ..
___________________________________________________________________Discussão
53
As bases neurais da analgesia (BASBAUM & FIELDS, 1984, 1989) e os substratos
neurais envolvidos na eliciação e propagação da atividade epileptogênica no sistema nervoso
central (RIBAK e col., 1997; TSUTSUI e col., 1992) são o foco de muitas investigações na área
de neurociências e neurologia experimental (MARGERISON & CORSELLIS, 1966; SAGAR
& OXBURY, 1987). Estudos pioneiros demonstraram a correlação entre epilepsia do lobo
temporal em adultos e a ocorrência de crise e status epilepticus (MARGERISON &
CORSELLIS, 1966; SAGAR & OXBURY, 1987). Limiares nociceptivos parecem ser
espontaneamente altos em pacientes com epilepsia do lobo temporal (GUIEU e col., 1992).
A completa elucidação da neuroquímica do processo antinociceptivo evocado pelas
crises convulsivas pode representar importante passo para o entendimento das bases neurais
do controle da dor e dos mecanismos da epilepsia. O substrato neural discutido no presente
trabalho reforça o envolvimento do sistema endógeno de inibição da dor no controle da
sensibilidade álgica e que os receptores opióides µ1 participam ativamente como parte
importante da citoarquitetura que regula a analgesia pós-ictal.
Portanto, o estudo dos mecanismos subjacentes à elaboração da analgesia pós-ictal
pode oferecer nova compreensão dos mecanismos endógenos de inibição de dor e pode
estabelecer as bases neurais e psicofarmacológicas envolvidas nessa rede neural endógena
inibitória da dor, esclarecendo quais mediadores neurais são recrutados neste fenômeno
analgésico. Assim, esta investigação poderá ser capaz de gerar dados elucidativos para o
desenvolvimento de drogas efetivas para o tratamento da dor crônica e melhor controle dos
mecanismos que geram a epilepsia, além de oferecer novos subsídios para a compreensão e
tratamento de alguns relatos de pró-nocicepção ictal ou mesmo oscilações do limiar
nociceptivo no período pós-ictal.
54
CONCLUSÕES
__________________________________________________________________Conclusões
55
• As crises convulsivas evocadas pelo pentilenotetrazol foram capazes de gerar
analgesia em todos os animais estudados no presente trabalho.
• A injeção intraperitoneal de naloxonazine, em todas as doses estudadas, foi capaz
de antagonizar a analgesia que segue as crises convulsivas tônico-clônicas, após 24h, mas não
após 10 min de bloqueio opióide.
• A microinjeção de naloxonazine em núcleos do CI, em todas as doses estudadas,
foi capaz de antagonizar a analgesia pós-ictal, após 24h de bloqueio opióide.
• O sistema opioidérgico encontra-se crucialmente envolvido na elaboração da
analgesia pós-ictal.
• Receptores opióides do subtipo µ1, localizados nas redes neurais do CI (núcleos
cortical dorsal, central e externo do colículo inferior) encontram-se implicados na elaboração
da analgesia pós-ictal, assim como, na modulação das crises convulsivas tônico-clônicas.
56
RESUMO
____________________________________________________________________Resumo
57
A antinocicepção é descrita como redução na capacidade de perceber a dor, sendo
importante componente para o organismo, quando este está envolvido em situações de
emergência. Muitos neurotransmissores e seus receptores estão envolvidos nas diversas formas
de analgesia, como por exemplo, monoaminas, acetilcolina e opióides endógenos. A analgesia
pós-ictal é uma das tantas formas de antinocicepção em que a participação de cada um desses
neurotransmissores é descrita.
Algumas evidências mostram o envolvimento de estruturas mesencefálicas em
processos antinociceptivos (GEBHART & TOLEIKIS, 1978; COIMBRA e col., 1992;
COIMBRA & BRANDÃO, 1997; CASTILHO e col., 1999) O colículo inferior é a estrutura
mesencefálica responsável pela origem e expressão de crises audiogênicas (MCCOWN e col,
1987). Estruturas como a substância cinzenta periaquedutal, camadas profundas do colículo
superior e núcleo central do colículo inferior, têm sido implicadas em processos convulsivos
(DE PAULIS e col., 1990; CARDOSO e col., 1994, MCCOWN e col., 1984). Alguns
cientistas descrevem que a estimulação dessas estruturas, em cujo substrato neural há
neurônios positivos para β-endorfina e leu-encefalina (EICHENBERGER e col., 2002;
OSAKI e col., 2003) pode gerar processos antinociceptivos (CASTILHO e col., 1999;
GEBHART & TOLEIKIS, 1978), seja de natureza opióide (NICHOLS e col., 1989), seja de
natureza monoaminérgica (COIMBRA e col., 1992; COIMBRA & BRANDÃO, 1997).
Nesse trabalho, foi realizado o estudo periférico para investigar o envolvimento, mais
especificamente, dos receptores opióides µ1 na analgesia que segue as crises convulsivas
evocadas pela administração de um antagonista de canais de Cl- ligados ao GABA, como é o
caso do pentilenotetrazol, por via intraperitoneal, após o pré-tratamento com o bloqueador
opióide específico, o naloxonazine, administrado em diferentes doses. Assim como, a
____________________________________________________________________Resumo
58
participação do colículo inferior nesse processo de inibição de dor, evidenciado pelo teste de
retirada de cauda.
O pré-tratamento com naloxonazine, administrado por via intraperitoneal por tempo
prolongado (24h), mas não agudamente (10 min), antagonizou a antinocicepção evocada por
convulsões tônico-clônicas. Como também, as microinjeções de naloxonazine realizadas nos
núcleos central, cortical externo e cortical dorsal do colículo inferior antagonizaram a analgesia
induzida por crises convulsivas tônico-clônicas, efeito que segue uma curva dose-resposta, bem
como, a redução do tempo de processo convulsivo. Em vista disso, podemos sugerir o
envolvimento de receptores µ1-opióides e das redes neurais do colículo inferior na elaboração
da analgesia pós-ictal, e na modulação de crises convulsivas tônico-clônicas.
Palavras-chave: naloxonazine, opióides, receptores µ1, analgesia pós-ictal.
59
ABSTRACT
___________________________________________________________________Abstract
60
The post-ictal analgesia is one of many kinds of antinociception, in which the
involvement of many neural systems has been demonstrated. Some evidences have been
showed the involvement of mesencephalic structures in antinociceptive processes. The inferior
colliculus is the brainstem structure responsible for the origin and elaboration of convulsive
responses (MCCOWN e col, 1987) in the presence of audiogenic stimulus or during the
treatment of supralimiar administration of GABAergic antagonists. Mesencephalic structures
such as the periaqueductal gray matter, the deep layers of the superior colliculus and the central
nucleus of the inferior colliculus, have been implicated in convulsive processes (DE PAULIS e
col., 1990; CARDOSO e col., 1994, MCCOWN e col., 1984). The stimulation of these areas, in
whose neural substrates there are β-endorphin- and leu-enkephalin-positive neurons
(EICHENBERGER e col., 2002; OSAKI e col., 2003) can generate antinociceptive processes
(CASTILHO e col., 1999; GEBHART & TOLEIKIS, 1978), of either opioid (NICHOLS e
col., 1989) or monoaminergic (COIMBRA e col., 1992; COIMBRA & BRANDÃO, 1997)
nature.
The aim of the present work is to investigate the involvement of the µ1-opioid
receptor-mediated system in the post-ictal analgesia. The antinociceptive responses were
recorded by the tail-flick test, after the pre-treatment with the specific opioid antagonist
naloxonazine, administered either by peripheral (intraperitoneally) or central (into the inferior
colliculus neural networks) way, in different doses.
The peripheral long-lasting (24h) but not acute (10 min) pre-treatment with naloxonazine
antagonized the analgesia evoked by tonic-clonic convulsions. Such as, the microinjections of
naloxonazine in the central, dorsal cortical and external cortical nuclei of inferior colliculus
antagonized the analgesia induced by tonic-clonic convulsive reactions, whose effect followed
a dose-response curve. Also, the microinjections of naloxonazine reduced the time of
___________________________________________________________________Abstract
61
convulsive reactions. These findings suggest the involvement of µ1-opiate receptors and the
neural networks of the inferior colliculus in this antinociceptive phenomenon, and in addition,
the involvement of these receptors in the modulation of tonic-clonic convulsive reactions.
Thus, we can suggest that the endogenous opioid peptides-mediated systems of the neural
networks of the inferior colliculus are implicated in the elaboration of the post-ictal
antinociception and in the modulation of tonic-clonic convulsions. In these processes, µ1-
opioid receptors of the central nucleus, as well as of the cortical dorsal and cortical external
nuclei of the inferior colliculus are crucially involved.
Key-words: naloxonazine, opioid, µ1-receptors, post-ictal analgesia.
62
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84
ANEXOS
___________________________________________________________________________________________________________Anexos
85
Animal Média
LRC 0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160
1 2,80 6,00 6,00 5,80 4,30 3,60 3,50 5,10 4,30 4,30 3,60 3,90 2,80 2,60
2 2,66 6,00 6,00 6,00 5,90 4,00 4,60 4,70 3,90 3,90 4,50 4,00 3,50 3,70
3 3,03 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 5,80 5,80 4,20 4,10 4,10 3,90 3,30
4 2,96 6,00 3,80 6,00 5,90 5,30 6,00 6,00 4,60 4,00 4,30 3,30 2,50 3,20
5 2,83 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 4,20 4,00 6,00 6,00 5,80 6,00 3,50 2,70
6 2,70 6,00 6,00 6,00 6,00 5,50 5,30 4,80 3,90 6,00 5,20 5,20 5,90 4,20
7 3,06 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 5,30 6,00 4,80 3,90 4,30 3,70 2,60 2,50
8 2,76 6,00 6,00 6,00 6,00 4,70 5,00 3,80 3,90 3,60 3,10 3,20 3,00 2,80
9 2,83 6,00 6,00 6,00 6,00 5,40 3,90 4,60 4,90 6,00 4,10 4,20 3,70 3,20
10 2,66 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 5,00 3,20 3,20
11 2,93 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 5,90 6,00 4,10 5,20 2,60 2,60
12 3,10 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 5,80 5,20 4,90 3,70 3,20
13 2,80 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 5,90 3,60 3,30
14 2,96 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 5,70 5,80 4,90 4,30 4,20 2,60
IA 0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160
Média 1 0,9486 0,9957 0,9579 0,8343 0,7721 0,7964 0,7236 0,7129 0,5686 0,5164 0,1907 0,0636
EPM 0 0,0514 0,0043 0,0376 0,0667 0,0747 0,0678 0,0726 0,0875 0,0757 0,0767 0,0763 0,0463
Tabela 1: Resultados individuais correspondentes ao grupo controle (injeção de salina fisiológica), durante o tempo de exposição ao teste de tail-
flick, após pré-tratamento de 10 min por via intraperitoneal.
___________________________________________________________________________________________________________Anexos
86
Animal Média LRC
0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160
15 3,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 4,30 2,70 3,90 4,40 6,00 3,50 2,30 3,50
16 2,80 6,00 3,30 3,10 4,40 3,50 3,40 2,50 4,30 4,00 4,90 4,00 3,70 2,30
17 2,67 4,40 6,00 5,80 5,80 5,00 3,50 2,80 2,40 3,00 3,60 2,30 2,90 2,60
18 2,90 6,00 6,00 6,00 4,80 4,60 2,00 2,80 2,80 3,80 3,90 2,40 2,90 2,40
19 2,63 6,00 3,90 5,10 2,90 2,50 2,20 1,80 3,40 2,30 2,90 2,20 2,40 2,60
20 2,73 6,00 6,00 4,30 3,30 2,40 2,60 2,50 3,40 2,90 2,60 2,60 3,00 2,60
21 2,87 5,50 6,00 6,00 3,30 2,70 2,50 2,30 2,40 3,30 2,40 2,60 2,70 1,90
22 3,07 6,00 4,20 3,20 2,50 2,00 2,30 2,70 2,20 2,50 2,60 1,90 2,80 2,00
IA 0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160
Média 1 0,924 0,8933 0,862 0,77 0,7787 0,5353 0,664 0,452 0,2173 0,3773 0,078 0,1073
EPM 0 0,0417 0,0703 0,0713 0,0882 0,0791 0,0707 0,1092 0,0857 0,0781 0,1105 0,0641 0,0445
Tabela 2: Resultados individuais correspondentes ao grupo tratado com naloxonazine na dose de 10mg/kg, durante o tempo de exposição ao
teste de tail-flick, após pré-tratamento de 10 min por via intraperitoneal.
___________________________________________________________________________________________________________Anexos
87
Animal Média LRC
0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160
23 3,03 6,00 4,80 3,40 3,40 3,10 3,50 2,60 3,60 3,30 3,00 3,00 3,30 3,40
24 2,83 6,00 6,00 4,20 4,20 3,10 3,00 2,40 3,40 2,50 2,20 3,10 2,00 1,90
25 2,73 5,70 5,60 3,20 2,90 3,80 2,40 2,20 2,20 2,60 2,00 2,20 2,60 2,20
26 2,93 6,00 6,00 6,00 4,50 4,70 4,30 3,30 3,00 2,30 2,50 2,20 2,20 2,90
27 2,93 6,00 3,80 3,20 2,80 2,90 2,80 2,90 2,30 2,90 2,40 2,50 3,40 2,40
28 2,90 6,00 6,00 5,60 6,00 6,00 3,50 6,00 4,70 4,80 3,80 3,50 3,10 3,00
29 2,76 6,00 2,60 2,70 3,20 2,30 3,50 3,10 2,40 3,00 2,80 2,80 2,60 2,00
30 3,13 6,00 4,90 5,60 3,20 2,80 3,00 2,60 2,60 2,90 2,00 3,30 2,90 2,80
IA 0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160
Média 0,9577 0,8323 0,8862 0,7092 0,7062 0,7746 0,63 0,5769 0,7023 0,4508 0,4792 0,4 0,3977
EPM 0,0399 0,0729 0,065 0,1101 0,1062 0,0944 0,1074 0,1019 0,0922 0,1009 0,1274 0,0819 0,1102
Tabela 3: Resultados individuais correspondentes ao grupo tratado com naloxonazine na dose de 20mg/kg, durante o tempo de exposição ao
teste de tail-flick, após pré-tratamento de 10 min por via intraperitoneal.
___________________________________________________________________________________________________________Anexos
88
Animal Média LRC
0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160
31 3,16 6,00 6,00 3,50 3,20 2,30 2,70 3,20 3,50 2,70 2,60 2,70 2,90 2,60
32 2,70 6,00 6,00 3,00 2,10 2,40 2,40 2,50 2,40 2,50 2,30 2,80 2,00 2,40
33 2,63 6,00 4,80 3,90 4,20 4,60 3,70 3,30 2,90 3,40 3,10 3,90 2,30 3,10
34 2,70 5,70 6,00 5,60 4,50 6,00 3,10 3,10 2,80 4,40 3,40 4,30 4,20 3,80
35 2,87 6,00 6,00 3,80 4,30 4,10 2,90 2,50 2,50 3,30 3,40 3,20 2,60 2,50
36 2,73 6,00 5,80 5,30 3,40 3,00 3,00 2,90 2,80 2,70 2,30 2,10 2,60 2,30
37 3,00 4,50 5,00 5,20 4,50 3,50 2,80 2,60 2,70 2,80 3,10 2,50 2,10 2,50
38 2,80 5,90 4,80 4,60 6,00 3,80 3,30 3,60 3,20 2,40 3,50 3,00 3,30 3,80
39 2,87 5,70 5,50 3,80 3,50 3,20 3,00 2,80 2,60 2,20 2,90 2,80 2,40 3,50
40 2,80 6,00 5,80 4,50 2,80 4,50 3,20 3,60 3,00 3,20 3,00 3,60 4,00 3,70
IA 0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160
Média 0,8678 0,7533 0,6978 0,6433 0,7167 0,6833 0,6211 0,42 0,5678 0,3511 0,4889 0,1956 0,1878
EPM 0,0883 0,1229 0,139 0,119 0,1298 0,1381 0,1247 0,1319 0,1125 0,1356 0,1365 0,0867 0,0847
Tabela 4: Resultados individuais correspondentes ao grupo tratado com naloxonazine na dose de 30mg/kg, durante o tempo de exposição ao
teste de tail-flick, após pré-tratamento de 10 min por via intraperitoneal.
___________________________________________________________________________________________________________Anexos
89
Animal Média LRC
0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160
41 2,73 6,00 6,00 5,70 4,60 5,50 3,30 4,40 5,20 3,30 3,50 3,30 3,00 2,50
42 3,30 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 4,00 6,00 5,10 4,00 4,00 3,20 3,40 3,10
43 2,96 4,00 6,00 5,60 6,00 6,00 6,00 5,10 6,00 6,00 3,30 2,60 3,30 2,90
44 2,80 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 4,50 4,90 3,10 3,40 2,50 3,30 2,50 3,20
45 3,13 6,00 5,90 6,00 4,80 3,90 5,20 3,20 5,60 2,60 2,70 3,50 2,90 3,00
46 2,93 6,00 6,00 6,00 6,00 3,90 4,20 4,40 3,70 2,90 2,10 2,70 2,70 2,60
47 2,83 6,00 5,40 6,00 5,00 6,00 3,60 3,90 5,80 3,40 3,10 4,30 3,20 3,30
48 2,93 5,40 6,00 6,00 5,10 3,80 4,40 4,60 4,80 3,20 3,30 3,40 3,20 2,90
IA 0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160
Média 0,8295 0,9725 0,9725 0,8175 0,715 0,4763 0,5313 0,6475 0,2125 0,0387 0,105 0,0205
-0,0063
EPM 0,0827 0,0235 0,0184 0,0709 0,1258 0,098 0,1005 0,1148 0,1228 0,067 0,0652 0,0319 0,0338
Tabela 5: Resultados individuais correspondentes ao grupo controle (salina fisiológica), durante o tempo de exposição ao teste de tail-flick, após
pré-tratamento de 24h por via intraperitoneal.
___________________________________________________________________________________________________________Anexos
90
Animal Média LRC
0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160
49 3,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 4,30 2,70 3,90 4,40 6,00 3,50 2,30 3,50
50 2,80 6,00 3,30 3,10 4,40 3,50 3,40 2,50 4,30 4,00 4,90 4,00 3,70 2,30
51 2,66 4,40 6,00 5,80 5,80 5,00 3,50 2,80 2,40 3,00 3,60 2,30 2,90 2,60
52 2,90 6,00 6,00 6,00 4,80 4,60 2,00 2,80 2,80 3,80 3,90 2,40 2,90 2,40
53 2,63 6,00 3,90 5,10 2,90 2,50 2,20 1,80 3,40 2,30 2,90 2,20 2,40 2,60
54 2,73 6,00 6,00 4,30 3,30 2,40 2,60 2,50 3,40 2,90 2,60 2,60 3,00 2,60
55 2,86 5,50 6,00 6,00 3,30 2,70 2,50 2,30 2,40 3,30 2,40 2,60 2,70 1,90
56 3,06 6,00 4,20 3,20 2,50 2,00 2,30 2,70 2,20 2,50 2,60 1,90 2,80 2,00
IA 0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160
Média 0,92 0,7413 0,6613 0,4063 0,24 0,005 -0,1 0,0813 0,1425 0,2488
-0,0405
-0,0012
-0,1113
EPM 0,0605 0,1286 0,1439 0,151 0,165 0,0912 0,0313 0,0911 0,0807 0,145 0,0815 0,0531 0,0611
Tabela 6: Resultados individuais correspondentes ao grupo tratado com naloxonazine na dose de 10mg/kg, durante o tempo de exposição ao
teste de tail-flick, após pré-tratamento de 24h por via intraperitoneal.
___________________________________________________________________________________________________________Anexos
91
Animal Média LRC
0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160
57 3,03 6,00 4,80 3,40 3,40 3,10 3,50 2,60 3,60 3,30 3,00 3,00 3,30 3,40
58 2,83 6,00 6,00 4,20 4,20 3,10 3,00 2,40 3,40 2,50 2,20 3,10 2,00 1,90
59 2,73 5,70 5,60 3,20 2,90 3,80 2,40 2,20 2,20 2,60 2,00 2,20 2,60 2,20
60 2,93 6,00 6,00 6,00 4,50 4,70 4,30 3,30 3,00 2,30 2,50 2,20 2,20 2,90
61 2,93 6,00 3,80 3,20 2,80 2,90 2,80 2,90 2,30 2,90 2,40 2,50 3,40 2,40
62 2,90 6,00 6,00 5,60 6,00 6,00 3,50 6,00 4,70 4,80 3,80 3,50 3,10 3,00
63 2,76 6,00 2,60 2,70 3,20 2,30 3,50 3,10 2,40 3,00 2,80 2,80 2,60 2,00
64 3,13 6,00 4,90 5,60 3,20 2,80 3,00 2,60 2,60 2,90 2,00 3,30 2,90 2,80
IA 0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160
Média 0,9888 0,6663 0,4363 0,2788 0,22 0,1112 0,0737 0,0388 0,0412
-0,1038
-0,205
-0,0463
-0,1025
EPM 0,0112 0,1368 0,1465 0,1241 0,1401 0,0647 0,1388 0,0952 0,088 0,0716 0,051 0,0522 0,0491
Tabela 7: Resultados individuais correspondentes ao grupo tratado com naloxonazine na dose de 20mg/kg, durante o tempo de exposição ao
teste de tail-flick, após pré-tratamento de 24h por via intraperitoneal.
___________________________________________________________________________________________________________Anexos
92
Animal Média LRC
0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160
65 3,16 6,00 6,00 3,50 3,20 2,30 2,70 3,20 3,50 2,70 2,60 2,70 2,90 2,60
66 2,70 6,00 6,00 3,00 2,10 2,40 2,40 2,50 2,40 2,50 2,30 2,80 2,00 2,40
67 2,63 6,00 4,80 3,90 4,20 4,60 3,70 3,30 2,90 3,40 3,10 3,90 2,30 3,10
68 2,70 5,70 6,00 5,60 4,50 6,00 3,10 3,10 2,80 4,40 3,40 4,30 4,20 3,80
69 2,86 6,00 6,00 3,80 4,30 4,10 2,90 2,50 2,50 3,30 3,40 3,20 2,60 2,50
70 2,73 6,00 5,80 5,30 3,40 3,00 3,00 2,90 2,80 2,70 2,30 2,10 2,60 2,30
71 3,00 4,50 5,00 5,20 4,50 3,50 2,80 2,60 2,70 2,80 3,10 2,50 2,10 2,50
72 2,80 5,90 4,80 4,60 6,00 3,80 3,30 3,60 3,20 2,40 3,50 3,00 3,30 3,80
73 2,86 5,70 5,50 3,80 3,50 3,20 3,00 2,80 2,60 2,20 2,90 2,80 2,40 3,50
74 2,80 6,00 5,80 4,50 2,80 4,50 3,20 3,60 3,00 3,20 3,00 3,60 4,00 3,70
IA 0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160
Média 0,928 0,866 0,468 0,321 0,278 0,054 0,056 0,006 0,038 0,039 0,077 0,002 0,056
EPM 0,0491 0,0504 0,0871 0,1089 0,1173 0,0443 0,0452 0,0296 0,07 0,0473 0,0735 0,0785 0,0681
Tabela 8: Resultados individuais correspondentes ao grupo tratado com naloxonazine na dose de 30mg/kg, durante o tempo de exposição ao
teste de tail-flick, após pré-tratamento de 24h por via intraperitoneal.
___________________________________________________________________________________________________________Anexos
93
Animal Média LRC
0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160
75 2,53 6,00 6,00 6,00 6,00 5,50 5,40 4,70 5,90 5,40 6,00 3,80 4,00 2,60
76 2,83 6,00 5,30 5,40 4,30 4,00 2,50 3,10 2,70 6,00 2,50 4,70 3,20 3,40
77 3,20 6,00 4,00 4,50 3,50 2,70 5,40 3,60 4,70 3,70 3,00 4,40 4,20 3,40
78 2,93 6,00 5,60 4,10 5,90 3,90 5,80 5,30 4,10 3,20 3,80 3,30 3,00 3,70
79 2,66 6,00 6,00 4,50 4,20 5,40 4,40 4,30 3,40 4,20 2,80 2,80 3,20 3,00
80 3,06 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 4,00 3,60 5,30 4,10 4,20 3,80 3,20 2,60
81 3,00 6,00 6,00 6,00 4,50 5,10 4,60 3,80 3,40 6,00 3,70 3,80 3,60 3,80
IA 0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160
Média 1 0,832 0,678 0,708 0,564 0,678 0,442 0,574 0,382 0,328 0,242 0,202 0,056
EPM 0 0,1378 0,1342 0,1814 0,2187 0,1123 0,1235 0,1333 0,1292 0,187 0,0733 0,0808 0,0662
Tabela 9: Resultados individuais do teste de retirada de cauda, correspondentes ao grupo sham (“cirurgia fictícia”), no CI, após administração
intraperitoneal de PTZ.
___________________________________________________________________________________________________________Anexos
94
Animal Média LRC
0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160
82 3,23 6,00 6,00 6,00 6,00 4,40 6,00 6,00 3,70 6,00 6,00 6,00 3,90 2,80
83 3,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 5,20 4,50 6,00 3,90 5,90 2,80
84 2,86 6,00 6,00 4,00 4,10 6,00 6,00 5,00 4,80 4,90 3,90 5,50 4,00 2,90
85 2,70 6,00 3,40 6,00 6,00 4,60 6,00 4,80 3,60 3,40 3,90 4,10 3,20 3,90
86 3,26 6,00 4,30 6,00 6,00 6,00 5,40 6,00 6,00 4,10 4,90 3,60 5,90 6,00
87 2,93 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 5,00 6,00 4,50 3,90
88 2,86 6,00 6,00 6,00 4,00 6,00 5,80 6,00 6,00 6,00 4,90 4,20 3,80 2,90
89 2,86 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00 4,60 2,60 2,10 2,70
90 3,26 6,00 6,00 5,80 5,90 5,30 4,90 4,60 6,00 5,50 3,80 5,80 4,10 2,70
IA 0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160
Média 1 0,8433 0,9211 0,8567 0,86 0,9244 0,8678 0,7544 0,7211 0,5956 0,5511 0,3956 0,1356
EPM 0 0,1046 0,0706 0,0912 0,0749 0,0472 0,0682 0,1116 0,1057 0,0928 0,1348 0,1274 0,1258
Tabela 10: Resultados individuais do teste de retirada de cauda, correspondentes ao grupo controle (microinjeção de salina fisiológica), no CI,
após administração intraperitoneal de PTZ.
___________________________________________________________________________________________________________Anexos
95
Animal Média LRC
0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160
91 3,00 6,00 5,90 3,70 3,20 3,30 3,60 3,40 2,80 3,00 4,50 3,10 3,20 2,70
92 2,80 6,00 6,00 3,90 3,10 5,50 3,70 4,30 3,10 2,70 3,90 2,80 3,50 2,60
93 3,00 6,00 4,90 4,80 4,50 3,70 3,70 2,60 2,80 2,50 3,20 3,10 2,70 3,00
94 2,76 6,00 5,80 5,10 4,10 3,20 2,90 2,50 3,10 2,60 2,70 2,80 3,10 2,80
95 2,70 6,00 5,00 5,00 3,00 3,60 2,60 3,40 2,90 2,80 2,80 2,70 2,60 2,90
96 2,66 6,00 6,00 6,00 4,10 2,90 3,10 2,50 3,20 2,60 2,70 3,30 2,90 2,90
97 2,76 6,00 6,00 4,80 5,00 3,30 3,40 3,30 2,90 3,40 3,10 3,40 2,70 3,00
98 2,83 6,00 5,70 6,00 6,00 4,90 4,80 3,70 3,20 3,40 2,80 3,30 3,30 2,80
99 3,00 6,00 6,00 6,00 6,00 3,70 5,80 3,70 4,00 3,40 2,60 3,50 2,80 3,40
IA 0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160
Média 1 0,8938 0,6525 0,41 0,3088 0,2088 0,155 0,0987 0,0525 0,1375 0,1113 0,0925 0,0488
EPM 0 0,516 0,0971 0,1161 0,0995 0,069 0,0995 0,0617 0,0852 0,0971 0,0723 0,0744 0,0635
Tabela 11: Resultados individuais do teste de retirada de cauda, correspondentes ao grupo microinjeção de naloxonazine 1µg/0,2µl, no CI, após
administração intraperitoneal de PTZ.
___________________________________________________________________________________________________________Anexos
96
Animal Média LRC
0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160
103 3,00 6,00 5,30 3,50 3,20 3,10 2,90 2,60 2,70 2,90 2,50 2,50 2,80 2,90
100 2,90 4,70 3,60 3,40 2,80 3,00 3,50 2,80 3,50 2,50 3,20 2,60 2,90 2,50
101 2,56 6,00 6,00 3,80 2,70 2,80 3,30 2,80 2,80 3,20 2,70 3,40 3,10 3,20
102 2,90 6,00 6,00 4,60 3,50 3,70 2,70 2,60 3,50 2,50 3,10 2,50 2,60 3,20
103 2,83 6,00 5,90 4,20 3,40 3,40 3,10 3,20 2,90 3,20 3,30 3,00 2,80 2,70
104 3,06 6,00 4,50 2,80 1,90 2,10 2,20 2,50 3,70 3,00 3,00 3,10 1,80 2,80
105 3,16 6,00 3,60 3,60 2,50 3,20 2,90 2,80 3,50 3,20 3,20 2,90 3,10 3,00
106 2,63 6,00 6,00 3,10 2,40 2,60 2,60 2,30 1,80 2,40 2,10 2,50 1,80 2,30
107 2,63 6,00 2,90 2,60 3,20 3,00 3,30 2,90 2,60 3,30 3,50 2,70 3,50 2,60
IA 0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160
Média 0,9475 0,5863 0,215 0 0,045 0,0288
-0,0388 0,0875 0,0263 0,0538
-0,0213
-0,0263
-0,0087
EPM 0,0525 0,1405 0,077 0,0744 0,0615 0,0631 0,0411 0,0399 0,0463 0,0446 0,0465 0,0717 0,037
Tabela 12: Resultados individuais do teste de retirada de cauda, correspondentes ao grupo microinjeção de naloxonazine 2µg/0,2µl, no CI, após
administração intraperitoneal de PTZ.
___________________________________________________________________________________________________________Anexos
97
Animal Média LRC
0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160
108 2,63 6,00 3,60 2,60 2,50 3,10 3,00 2,50 3,60 2,60 2,50 2,90 2,60 2,50
109 2,76 6,00 4,90 5,40 4,80 3,80 2,80 3,80 4,00 2,50 2,70 3,00 3,50 3,40
110 2,80 6,00 3,60 3,90 2,70 3,60 3,40 3,00 2,90 3,50 2,90 2,50 2,90 2,90
111 2,90 6,00 6,00 4,70 5,70 3,20 3,20 3,10 4,20 3,20 2,80 3,20 3,10 3,40
112 2,76 6,00 6,00 6,00 4,00 4,00 2,80 3,50 2,90 2,50 3,00 2,80 3,00 3,30
113 3,00 5,30 3,00 2,60 1,50 2,20 2,00 2,30 1,60 2,60 2,50 2,10 2,70 2,90
114 2,80 3,20 3,20 2,90 3,50 3,00 1,30 2,60 2,70 1,10 1,40 2,10 1,60 1,70
IA 0 10 20 30 40 60 70 80 90 100 120 140 160
Média 0,8429 0,4757 0,3743 0,2229 0,14
-0,0543 0,0486 0,0943
-0,0729
-0,0857 -0,05
-0,0143 0,0214
EPM 0,1231 0,1555 0,1651 0,1762 0,0814 0,0936 0,0697 0,1162 0,0889 0,0654 0,0598 0,0716 0,0708
Tabela 13: Resultados individuais do teste de retirada de cauda, correspondentes ao grupo microinjeção de naloxonazine 3µg/0,2µl, no CI, após
administração intraperitoneal de PTZ.
___________________________________________________________________________________________________________Anexos
98
Grupo Tempo de processo convulsivo (seg)
Média ± EPM.
Sham (SH) 723 ± 126,96
Salina fisiológica (SL) 1388,11 ± 431,92
Naloxonazine 1µg/0,2µl (NLX 1) 405,05 ± 32,22
Naloxonazine 2µg/0,2µl (NLX 2) 393,25 ± 55,09
Naloxonazine 3µg/0,2µl (NLX 3) 291,86 ± 27,39
Tabela 14: Resultados individuais do tempo de processo convulsivo, correspondentes aos grupos sham (SH), salina fisiológica (SL), microinjeção
de naloxonazine 1µg/0,2µl (NLX 1), naloxonazine 2µg/0,2µl (NLX 2) e naloxonazine 3µg/0,2µl (NLX 3), no CI, após administração
intraperitoneal de PTZ.
___________________________________________________________________________________________________________Anexos
99
Artigo Científico Publicado
DE FREITAS e col., Pharmacology, Biochemistry and Behavior, 79: 367-376, 2004.
Co-autora
(FELIPPOTTI, T.T.)