OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 0
UNIVERSIDADE REGIONAL DO CARIRI
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA BIOLÓGICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOPROSPECÇÃO MOLECULAR
MESTRADO ACADÊMICO EM BIOPROSPECÇÃO MOLECULAR
ELAINE CRISTINA CONCEIÇÃO DE OLIVEIRA
BIOPROSPECÇÃO E TOXICIDADE DE CIANOBACTÉRIAS NAS LAGOAS DE
ESTABILIZAÇÃO DE TRATAMENTO DE ESGOTO (ETE) DO MUNICÍPIO DE
JUAZEIRO DO NORTE, CEARÁ.
CRATO – CE
2011
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 1
ELAINE CRISTINA CONCEIÇÃO DE OLIVEIRA
BIOPROSPECÇÃO E TOXICIDADE DE CIANOBACTÉRIAS NAS LAGOAS DE
ESTABILIZAÇÃO DE TRATAMENTO DE ESGOTO (ETE) DO MUNICÍPIO DE
JUAZEIRO DO NORTE, CEARÁ
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Bioprospecção Molecular da
Universidade Regional do Cariri como
requisito parcial para obtenção do título de mestre
em Bioprospecção Molecular (Área de
concentração: Bioprospecção de Produtos Naturais).
Orientadora:
Dra. Sírleis Rodrigues Lacerda
Universidade Regional do Cariri - URCA
Co-orientadora:
Dra. Luciana Retz de Carvalho
Instituto de Botânica – IBt/SP.
CRATO – CE
2011
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 2
ELAINE CRISTINA CONCEIÇÃO DE OLIVEIRA
BIOPROSPECÇÃO E TOXICIDADE DE CIANOBACTÉRIAS NAS LAGOAS DE
ESTABILIZAÇÃO DE TRATAMENTO DE ESGOTO (ETE) DO MUNICÍPIO DE
JUAZEIRO DO NORTE, CEARÁ.
Dissertação defendida em: ____/____/2011 e aprovada em: ____/____/2011.
BANCA EXAMINADORA
______________________________________________
Profa. Dra. Sírleis Rodrigues Lacerda (Orientadora)Universidade Regional do Cariri – URCA/CE
______________________________________________
Profa. Dra. Luciana Retz de Carvalho (Co-orientadora)Instituto de Botânica – IBt/SP
______________________________________________
Profa. Dra. Maria Odete Parente Moreira (Membro Titular)Universidade Federal do Ceará – UFC/CE
______________________________________________
Prof. Dr. José Galberto Martins da Costa (Membro Titular)Universidade Regional do Cariri – URCA/CE
______________________________________________
Profa. Dra. Marta Regina Kerntopf (1º Suplente)Universidade Regional do Cariri – URCA/CE
______________________________________________
Profa. Dra. Maria Arlene Pessoa da Silva (2º Suplente)Universidade Regional do Cariri – URCA/CE
CRATO – CE2011
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 3
DEDICO
Aos meus pais, Francisca Maria da
Conceição e José Claudio de Oliveira (in
memorian). Aos meus irmãos, Cleide e
Eugênio, e ao meu esposo Jaceilton Alves de
Melo, com muito carinho.
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 4
AGRADECIMENTOS
“A fim de que saibam, e pela observaçãocompreendam, que a mão do Senhor fez
essas coisas”Isaías 41:20
A DEUS, por seu AMOR, pela presença constante em minha vida, abençoando, conduzindo e
dando forças em todos os momentos, principalmente os mais difíceis;
Aos meus pais, José Claudio de Oliveira (in memorian) que, mesmo ausente, sempre
contribuiu para as minhas realizações, pois me deixou o que há de mais importante, seu amor,
seu exemplo e valores de vida, que sempre os tenho comigo, força, determinação e
humildade. E minha mãe, Francisca Maria da Conceição, mulher de “aço e de flores”, valente
frente os desafios da vida e muito generosa. Soube ser mãe e pai ao mesmo tempo,
interferindo com sabedoria e firmeza, quando necessário, mas também nos fazendo sentir
filhos muito amados. Ambos são expressão marcante de coragem e amor;
A meu esposo Jaceilton Alves de Melo, pelo amor que nos une, pelas conquistas que
sonhamos juntos, pelas dificuldades que se tornam de um só, por seu exemplo e constantes
palavras de conforto e estímulo, que sempre foram fundamentais na persistência pela vitória.
Obrigada pela paciência sempre devotada, por me entender e por contribuir para essa
realização, que também é sua;
Aos meus irmãos Eugênio Oliveira e Cleide Oliveira, pelo amor que partilhamos, pelos
esforços conduzidos por minha felicidade, pela torcida em cada desafio e por mais esse
momento que divido com eles. Ao meu sobrinho e afilhado Ícaro Oliveira e sobrinha Ianne
Oliveira, que são verdadeiros presentes de DEUS em nossas vidas;
À grande professora Dra. Sírleis Rodrigues Lacerda, pela orientação, pelos ensinamentos e
por haver me mostrado desde muito cedo a riqueza de informações eminentes no mundo das
algas. Obrigada querida Sírleis, pela oportunidade de compor a equipe do Laboratório de
Botânica, que muito contribuiu para a minha formação acadêmica, tanto na graduação através
da Iniciação Científica, quanto no Mestrado. Assim, agradeço pela confiança em mim sempre
depositada, pelo carinho, pelos desafios... e ...alegrias partilhadas, pelo exemplo profissional e
humano que emanam constantemente em seus gestos de honestidade, humildade e
generosidade. Uma verdadeira mãe-científica e sobretudo grande amiga, pela qual carrego
grande apreço e admiração;
À Dra. Luciana Retz de Carvalho, pela co-orientação, pelo apoio e total disponibilidade do
Laboratório de Química do Núcleo de Pesquisa em Ficologia – Instituto de Botânica de São
Paulo (IBt), tanto em infra-estrutura como em material utilizado. Uma feliz parceria que foi
decisiva para a realização deste trabalho e que contou com a constante dedicação da Dra.
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 5
Luciana, que não mediu esforços para possibilitar a concretização de todas as etapas que
envolveram o estudo de metabólitos secundários (da etapa mais simples às mais longas e
difíceis). Obrigada Dra. Luciana por todo o carinho, pelo cuidado de mãe enquanto estive em
seu convívio, pelos valiosos ensinamentos que perdurarão para sempre, pelo exemplo de
grande profissional e generosidade, e enfim, pela grande amizade;
Ao grande amigo Ubirajara Fernandes, pelo qual tenho um carinho de irmão, por havermos
caminhado juntos, trilhado os mesmos desafios e sempre partilhado o conhecimento, que
assim, se fez ainda maior. Nossa amizade é algo que carrego com muito orgulho!;
Às irmãs-amigas do Laboratório de Botânica, Claudiana Santos, Felismária Silva e Thalita
Campos pelo apoio sempre desprendido, pelo companheirismo, fiel disponibilidade e
principalmente pelos laços de amizade que perdurarão sempre. Trio perfeito, da mais calma a
mais agoniadinha. Adoro vocês!;
Á grande amiga Lenier Inácio, pelo carinho, pelas conversas e motivações, pela presença
sempre constante, enfim, por sua singela amizade que é tão importante pra mim. Aos
compadres Lenice Silva e Emanoel Saraiva, pelo apoio, atenção e a Vinícius Saraiva, meu
afilhado, o qual nos dá muita alegria;
À todos os amigos da graduação pelos desafios vencidos juntos e em especial, às grandes
amigas, Aldeni Lima e Gerlânia Leite, pelo carinho e presença constante;
Aos ex-membros do Laboratório de Botânica, Ionara Freitas, Eveline Aquino e Valdemi
Ferreira, pelos momentos partilhados durante a iniciação científica; bem como aos membros
atuais, Joemília Macêdo, Irismã Góes, Karla Nascimento e Anne Rangel, pelo carinho e
apoio;
À Profa. Dra. Marta Almeida e às alunas do grupo de pesquisa em Ecologia Vegetal,
Alexsandra Lourenço, Renata Souza e Samara Oliveira, pelo apoio;
Aos coordenadores do Laboratório de Pesquisa de Produtos Naturais (LPPN), Prof. Dr. José
Galberto Martins da Costa e Msc. Fabíola Fernandes Galvão, pela valiosa contribuição na
disponibilidade das instalações e material necessário à fase inicial desse trabalho, meus
sinceros agradecimentos, os quais também se estendem à toda equipe LPPN;
Ao Laboratório de Farmacologia e Química Molecular (LFQM), na pessoa da Dra. Marta
Regina Kerntopf, por permitir o congelamento de amostras;
À Companhia de Água e Esgoto do Ceará – CAGECE, na pessoa do Gerente Regional, o
Senhor Expedito Galba Batista, pelo apoio e concessão de dados físicos e químicos das
Lagoas de Estabilização de Tratamento de Esgoto – ETE/Juazeiro do Norte – CE. Meus
agradecimentos também aos funcionários Cyntia Araujo e Antonio Macedo pelas valiosas
contribuições;
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 6
À Fundação Cearense de Meteorologia e Recursos Hídricos – FUNCEME, pela
disponibilidade de dados pluviométricos;
À Dra. Célia Leite Sant’Anna, pesquisadora do Núcleo de Pesquisa em Ficologia – Instituto
de Botânica de São Paulo (IBt), pelo apoio, atenção e contribuição na identificação de
espécies de Cianobactérias;
À Dra. Andréa Tucci, pesquisadora do Núcleo de Pesquisa em Ficologia – Instituto de
Botânica de São Paulo (IBt), pelo apoio, atenção, disponibilidade de material bibliográfico,
ensinamentos de contagens por microscopia invertida, e enfim, pela amizade;
Ao Laboratório de Imunopatologia e ao Biotério Central do Instituto Butantan (SP) por
haverem possibilitado a realização dos ensaios em camundongos, bem como à Seção de
Fisiologia e Bioquímica de Plantas (IBt/SP), pelos demais ensaios;
À grande amiga Angélica Garcia, bolsista do Laboratório de Imunopatologia do Instituto
Butantan, pelo apoio, amizade e incansável contribuição na realização, principalmente, dos
ensaios em camundongos, que consistiu em uma etapa de bastante relevância para esse
trabalho. Para ela, meus sinceros agradecimentos, pois sua efetiva ajuda foi determinante;
Aos alunos do Núcleo de Pesquisa em Ficologia – Instituto de Botânica de São Paulo (IBt):
Geanne Conserva, Luciana Cunha, Luiz Felipe, Fernando Pipole, Raquel Lopes, Camila
Malone, Kleber Renan e Watson Arantes, pelo apoio, carinho e grande amizade, durante a
realização desse trabalho;
À toda a galera do alojamento do Instituto de Botânica de São Paulo (IBt), pela calorosa
recepção, apoio, carinho, momentos de descontração que me deram forças e enfim, pelos
laços de amizade que serão mantidos;
Ao Programa de Pós-Graduação em Bioprospecção Molecular, em especial à coordenação
representada por Dra. Sírleis Rodrigues Lacerda e Dra. Imeuda Peixoto Furtado, bem como às
secretárias, Andecieli Rolim, pelo carinho com que sempre nos trata e pela fiel torcida, e
Lenira Pereira, pelo apoio e manifestos de amizade;
Aos funcionários da URCA: Sylvanna Villar, Luiz Silva, Fernando Luciano, Marcos Aurélio,
Carlos Bezerra, Lêda Alcantara, Ivaneide Rocha e Francisca Adaci (in memorian) pelo
harmonioso convívio e amizade;
Ao setor de transporte da URCA, nas pessoas dos Srs. Geraldo Araújo e Frederico Silveira,
pela disponibilidade durante a realização desse trabalho;
À Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico – FUNCAP,
pela concessão da bolsa;
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES;
À Universidade Regional do Cariri – URCA.
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 7
Embora o Brasil ostente a maior descarga de
água doce do mundo nos seus rios, quando
estes secarem ou só transportarem esgotos
não tratados das nossas cidades, já não será
possível produzir alimentos, plantar árvores
e o dinheiro do bolso de pouco valerá.
Aldo da Cunha Rebouças
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 8
RESUMO
Para avaliar os riscos específicos de toxinas de Cianobactérias é necessário compreender assuas propriedades químicas, regulamentação da sua produção, mecanismos de ação, que sãodiversos, e seu destino nos ambientes, sendo de valiosa importância o monitoramento emáguas destinadas ao consumo humano. Dessa forma, faz-se necessário o controle das açõesantrópicas nas bacias hidrográficas, as quais podem gerar meios propícios à formação deflorações de Cianobactérias, e o gerenciamento continuado de modo a preservar os corposd´água existentes, não apenas em quantidade, mas também em qualidade. Determinar aocorrência de Cianobactérias e identificar a presença de metabólitos secundários bioativos(tóxicos ou apresentando ações antioxidante, anticolinesterásica e hemolítica) a partir deamostras coletadas nas Lagoas de Estabilização da Estação de Tratamento de Esgoto (ETE) deJuazeiro do Norte - CE, foi o objetivo desse trabalho. As amostras de Cianobactérias foramcoletadas mensalmente, de Fevereiro a Junho/2010, na superfície das lagoas aeróbiasdesignadas Facultativa A, Facultativa B e de Maturação, tendo sido efetuadas amostragenspara a análise taxonômica e para o estudo químico. A identificação das espécies foi feita pormicroscopia óptica. Para a pesquisa dos metabólitos, a biomassa de Cianobactérias foiconcentrada em filtros, congelada, liofilizada e submetida à extração com ácido acético 0,1 M.Os testes para detecção da neurotoxina β-N-metilamino-L-alanina (BMAA), bem como dasatividades, antioxidante e anticolinesterásica, foram feitos a partir de placas cromatográficas(gel de sílica 60, Merck), desenvolvidas com os extratos algáceos. Já a pesquisa dahepatotoxina microcistina foi conduzida tanto por ensaios em camundongos, com avaliaçãodos sintomas e tempo de sobrevida, quanto por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência(CLAE). Os resultados demonstraram a ocorrência de espécies consideradas potencialmentetóxicas como: Planktothrix isothrix (Skuja) Komárek et Komárková, Microcystis aeruginosa(Kützing) Kützing, Microcystis protocystis Crow e Radiocystis fernandoi Komárek &Komárková-Legnerová, sendo que Planktothrix isothrix, destacou-se pela ocorrência comdensidades características da floração. Foi detectada atividade antioxidante em todas asamostras e atividade anticolinesterásica em 4 (quatro) das 10 (dez) amostras analisadas. Já osensaios em camundongos apresentaram sintomas de alterações, lesões teciduais,principalmente no fígado, e toxicidade aguda letal por exposição a 3 (três) das 10 (dez)amostras administradas. Porém, não foi detectada a presença de microcistina nas amostras.Assim, é possível que os sinais de alterações verificados nos ensaios em camundongosestejam relacionados à ação de uma nova toxina. Para a neurotoxina β-N-metilamino-L-alanina (BMAA), foi verificado resultado positivo em todas as amostras analisadas. Assim,pelos efeitos devastadores que essa toxina pode causar em áreas do cérebro, os cuidados como monitoramento do Rio do Salgado, corpo receptor das lagoas de estabilização que contém asCianobactérias produtoras dessa neurotoxina, devem ser constantes e efetivos, de modo aproteger a saúde humana.
Palavras-Chave: Eutrofização, Cianobactérias, Metabólitos Secundários.
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 9
ABSTRACT
To assess the specific risks of toxins from Cyanobacteria is necessary to understand itschemical properties, regulation of its production, mechanisms of action that are diverse, andtheir fate in the environments, being of valuable importance the monitoring in water intendedfor human consumption. Thus, it is necessary the control of anthropic actions in thehydrographic basins, which could generate ways propitious to the formation of blooms ofCyanobacteria, and ongoing management in order to preserve the existing water bodies, notonly in quantity but also quality. Determine the occurrence of Cyanobacteria and identify thepresence of bioactive secondary metabolites (toxic or presenting antioxidant action,acetylcholinesterase and hemolytic) from samples collected in Stabilization Ponds of theStation Wastewater Treatment (SWT) of Juazeiro do Norte – CE, was the objective of thiswork. Samples of Cyanobacteria were collected monthly from February to June/2010, on thesurface of aerobic ponds known as: Facultative A, B and of Maturation, having beensamplings made for taxonomic analysis and for the chemical study. The species identificationwas made by optical microscopy. For the research of the metabolites, the biomass ofCyanobacteria was concentrated on filters, frozen, lyophilized and subjected to extractionwith acetic acid 0.1 M. Tests for detection of the neurotoxin β-N-methylamino-L-alanine(BMAA), as well as of the activities, antioxidant and anticholinesterase, were made fromchromatographic plates (silica gel 60, Merck), developed with the algal extracts. Already thesurvey of the hepatotoxin Microcystin was conducted by both tests, in mice, with evaluationof symptoms and survival time, and by High Performance Liquid Chromatography (HPLC).The results demonstrated the occurrence of potentially toxic species such as: Planktothrixisothrix (Skuja) Komárek et Komárková, Microcystis aeruginosa (Kützing) Kützing,Microcystis protocystis Crow and Radiocystis fernandoi Komárek & Komárková-Legnerová,being that Planktothrix isothrix, stood out by occurrence with densities characteristics of thebloom. Antioxidant activity was detected in all samples and anticholinesterase activity in 4(four) of 10 (ten) analyzed samples. Already the assays in mice showed symptoms of changes,tissue lesions, mainly in the liver, and acute lethal toxicity by exposure to 3 (three) of 10 (ten)administered samples. But it was not detected the presence of Microcystin in the samples. It istherefore possible that the signs of alterations observed in the assays in mice are related to theaction of a new toxin. For the neurotoxin β-N-methylamino-L-alanine, was found positiveresult in all analyzed samples. Thus, by the devastating effects that this toxin can cause inbrain areas, the cares with monitoring of the Salgado River, body receiving of theStabilization Ponds containing Cyanobacteria producing of this Neurotoxin, must be constantand effective, so to protect human health.
Keywords: Eutrophication, Cyanobacteria, Secondary Metabolites.
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 10
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Esquema do funcionamento do sistema de Lagoas de Estabilização do
município de Juazeiro do Norte - Ceará. .............................................................. 23
Figura 2 – Estrutura química dos principais tipos de cianotoxinas ........................................ 30
Figura 3 – Fluxograma da estrutura de funcionamento do Sistema de Esgotamento
Sanitário (SES) de Juazeiro do Norte - Ceará. ..................................................... 35
Figura 4 – (A) Localização geográfica do município de Juazeiro do Norte, inserido na
Região do Cariri Central, Estado do Ceará, Brasil; (B) Foto aérea das Lagoas
de Estabilização da Estação de Tratamento de Esgoto (ETE) e (C) Esquema da
estrutura das Lagoas de Estabilização da ETE. .................................................... 36
Figura 5 – Lagoas de Estabilização da Estação de Tratamento de Esgoto (ETE) de
Juazeiro do Norte - Ceará. .................................................................................... 37
Figura 6 – Esquema das principais etapas do estudo químico. Obtenção da biomassa,
extração, testes, pré-purificação e fracionamento para pesquisa de
cianotoxinas. ......................................................................................................... 47
Figura 7 – (A) Aspecto geral das Lagoas de Estabilização – ETE/JN/CE; (B) Lagoa
Facultativa A; (C) Lagoa Facultativa B e (D) Lagoa de Maturação. ................. 48
Figura 8 – Planktothrix isothrix: (A) Dezenas de tricomas envolto a uma colônia de
Microcystis protocystis; (B) Tricomas envolto a uma colônia M.
aeruginosa; (C) Tricomas em massa (aspecto escuro) e (D) Detalhe da
morfologia dos tricomas. ...................................................................................... 49
Figura 9 – Média mensal histórica de precipitação no município de Juazeiro do Norte/CE
para um período de 30 anos (1980 a 2009) e registros da precipitação mensal
durante o período de coletas. ................................................................................ 51
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 11
Figura 10 – Frequência de ocorrência das espécies identificadas em relação ao período de
amostragem na Estação de Tratamento de Esgoto de Juazeiro do Norte/CE ........ 52
Figura 11 – Abundância relativa de Planktothrix isothrix em relação às demais espécies de
Cianobactérias identificadas durante o período de amostragem nas Lagoas:
Facultativa A, Facultativa B e de Maturação, ETE/Juazeiro do Norte-CE ........... 52
Figura 12 – Número de espécies identificadas durante o período de amostragem para
as Lagoas: Facultativa A, Facultativa B e de Maturação, ETE/Juazeiro do
Norte-CE................................................................................................................ 53
Figura 13 – Relação entre o índice de Shannon e Equitabilidade durante o período de
amostragem para a Lagoa Facultativa A, ETE/Juazeiro do Norte-CE .................. 55
Figura 14 – Relação entre o índice de Shannon e Equitabilidade durante o período de
amostragem para a Lagoa Facultativa B, ETE/Juazeiro do Norte-CE. ................. 55
Figura 15 – Relação entre o índice de Shannon e Equitabilidade durante o período de
amostragem para a Lagoa de Maturação, ETE/Juazeiro do Norte-CE.................. 56
Figura 16 – Achados post-mortem. A e B: animal com manchas brancas no fígado
(em detalhe) resultante da administração do extrato LFA (17 de maio, 2010).
[Arquivo pessoal].................................................................................................. 60
Figura 17 – Achados post-mortem. Animal apresentando fígado com os lobos, superior
e intermediário, aderidos (ver detalhe) resultante da administração do extrato
LFA (17 de maio, 2010). [Arquivo pessoal].......................................................... 61
Figura 18 – Achados post-mortem. Animal com acúmulo de material esverdeado no
pâncreas (ver detalhe) resultante da administração do extrato LFB (29 de abril,
2010). [Arquivo pessoal]. ...................................................................................... 61
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 12
Figura 19 – Achados post-mortem. A e B: Animal com manchas brancas no fígado (ver
detalhes) resultante da administração do extrato LM (29 de abril, 2010).
[Arquivo pessoal].................................................................................................. 62
Figura 20 – Achados post-mortem. A: Animal com diafragma aderido ao fígado (ver
detalhe) resultante da administração do extrato LM (29 de abril, 2010); B:
Controle. [Arquivo pessoal].................................................................................. 62
Figura 21 – Achados post-mortem. A: Animal com os lobos do fígado totalmente aderidos
e B: Animal com os lobos do fígado parcialmente aderidos (ver detalhes)
resultante da administração do extrato referente ao Rio (01 de junho, 2010).
[Arquivo pessoal].................................................................................................. 63
Figura 22 – (a): Cromatograma em placa de gel de sílica 60, Merck, dos extratos das
biomassas coletadas respectivamente nas Lagoas LFA1, LFA2, LFA3, LFB1,
LFB2, LFB3, LM1, LM2 e LM3. Fase móvel: clorofórmio: metanol: água
(64:36:8, v/v/v). Derivatizante: solução metanólica (2 mg.mL-1) do radical 2,2-
difenil-1-picrilhidrazila (DPPH). As manchas amareladas indicam as
substâncias com atividade antioxidante; (b) e (c): Cromatograma observado
sob luz ultravioleta, de comprimentos de onda 254 nm e 366 nm,
respectivamente. ................................................................................................... 66
Figura 23 – Diagrama das fontes de espécies reativas do oxigênio (EROS) e as respostas
celulares.. .............................................................................................................. 68
Figura 24 – (a): Cromatograma em placa de gel de sílica 60, Merck, dos extratos das
biomassas coletadas nas Lagoas LFA1, LFA2, LFA3, LFB1, LFB2, LFB3,
LM1, LM2 e LM3. Fase móvel: clorofórmio: metanol: água (64:36:8, v/v/v).
Revelador específico para inibidores de acetilcolinesterase. As manchas
coincidentes com os halos de cor branca indicam inibição da
acetilcolinesterase; (b) e (c): Cromatograma observado sob luz ultravioleta, de
comprimentos de onda 254 nm e 366 nm, respectivamente. ................................ 70
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 13
Figura 25 – Cromatograma em gel de sílica 60, Merck, dos extratos em ácido acético 0,1
M liofilizados das amostras da Lagoa Facultativa A: FA1, FA2 e FA3. Fase
móvel: clorofórmio: metanol: água (64:36:8, v/v/v). Agente derivatizante:
ninidrina. As setas apontam as manchas com Rf correspondente ao Rf do
padrão de BMAA............................................................................................. 71
Figura 26 – Cromatograma em gel de sílica 60, Merck, dos extratos em ácido acético 0,1
M liofilizados das amostras da Lagoa Facultativa B: FB1, FB2 e FB3. Fase
móvel: butanol: ácido acético: água (5:2:3 v/v/v). Agente derivatizante:
ninidrina. As setas apontam as manchas com Rf correspondente ao Rf do
padrão de BMAA.................................................................................................. 72
Figura 27 – Cromatograma em gel de sílica 60, Merck, dos extratos em ácido acético 0,1
M liofilizados das amostras da Lagoa de Maturação: M1, M2 e M3. Fase
móvel: butanol: ácido acético: água (5:2:3 v/v/v). Agente derivatizante:
ninidrina. As setas apontam as manchas com Rf correspondente ao Rf do
padrão de BMAA.................................................................................................. 72
Figura 28 – Cromatograma com o desenvolvimento do padrão de Microcistina-LR (pico 8,
tempo de retenção: 36,63 min.). Condições da análise: Coluna CN analítica;
Fase móvel: A - ácido trifluoracético (TFA) 0,1% e B: acetonitrila (ACN) /
TFA 0,1%; Fluxo: 1 mL.min-1; Detecção: UV 238nm......................................... 75
Figura 29 – Espectro de UV do pico 8 correspondente ao padrão de Microcistina-LR........... 75
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 14
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Características gerais das principais toxinas de Cianobactérias ........................... 29
Tabela 2 – Características físicas das Lagoas de Tratamento Biológico do município
de Juazeiro do Norte – CE. ................................................................................... 38
Tabela 3 – Sinais de intoxicação e alterações macroscópicas apresentadas pelos
camundongos após administração por via intraperitoneal dos extratos em ácido
acético das amostras de floração das lagoas facultativa A, facultativa B e de
Maturação. ............................................................................................................ 58
Tabela 4 – Registros de peso corpóreo dos animais testados, antes e após o período de
exposição aos extratos algáceos............................................................................ 64
Tabela 5 – Registro da atividade antioxidante detectada por amostra e os seus respectivos
índices de retenção (Rf). ....................................................................................... 67
Tabela 6 – Perfil cromatográfico dos extratos das amostras provenientes das lagoasde estabilização: Lagoa Facultativa A, Lagoa Facultativa B e Lagoa deMaturação (ver em detalhe, o pico comum a todas as amostras e seurespectivo espectro UV) ....................................................................................... 76
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 15
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
1O2 Oxigênio Singlete;
2-MIB 2-methylisoborneol;
AchE Acetilcolinesterase;
ACN Acetonitrila;
ALS Esclerose Lateral Amiotrófica;
ANA Agência Nacional de Águas;
BMAA β-N-metilamino-L-alanina;
CAGECE Companhia de Água e Esgoto do Ceará;
CE Ceará;
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência;
CN Cromatografia de Fase Normal;
CONAMA Conselho Nacional do Meio Ambiente;
DNA Ácido Desoxirribonucleico;
DPPH 2,2-difenil-1-picrilhidrazila;
EROS Espécies Reativas do Oxigênio;
EEEs Estações Elevatórias de Esgotos;
ETE Estação de Tratamento de Esgoto;
H2O2 Peróxido de Hidrogênio;
HPLC High Performance Liquid Chromatography;
i.p. Intraperitonial;
IBt/SP Instituto de Botânica/São Paulo;
JN Juazeiro do Norte;
LFA Lagoa Facultativa A;
LFB Lagoa Facultativa B;
LM Lagoa de Maturação;
LPPN Laboratório de Pesquisa de Produtos Naturais;
MC-LA Microcistina-LA;
MC-LR Microcistina-LR;
MC-RR Microcistina-RR;
C-YR Microcistina-YR;
MS Ministério da Saúde;
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 16
O2- Superóxido;
ODS-C18 Coluna Octadecilsilanizada;
OH- Radical Hidroxila;
PDA Photodiode Array Detectors;
PDC Complexo de Demência Parkinsonismo;
pH Potencial de Hidrogênio;
PVDF Polyvinylidene Fluoride;
Rf Fator de Retenção;
SE Suspensão de Eritrócitos;
SES Sistema de Esgotamento Sanitário;
TFA Ácido Trifluoracético;
Tr Tempo de Retenção;
UN-BSA Unidade de Negócio da Bacia do Salgado;
URCA Universidade Regional do Cariri;
UV Ultra Violeta.
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 17
LISTA DE SÍMBOLOS
(S) Sul;
(W) Oeste;
≈ Aproximadamente;
µg/g Micrograma por grama
µL Microlitro;
µm Micrometro,
C6H12O6 Glicose;
CaCl2 Cloreto de Cálcio;
CO2 Dióxido de Carbono;
H2O Água;
KCl Cloreto de Potássio;
Kg Quilograma;
KH2PO4 Hidrogenofosfato de Potássio;
L/s Litro por Segundo;
m Metro;
M Molar;
m2 Metro Quadrado;
m3 Metro Cúbico;
MeOH Metanol;
mg Miligrama;
MgSO4 Sulfato de Magnésio;
mL Mililitro
min Minuto;
mm Milímetro;
mM Milimolar;
N Nitrogênio;
N2 Gás Nitrogênio;
NaCl Cloreto de Sódio;
NaHCO3 Bicarbonato de Sódio;
nm Nanômetro;
ºC Graus Celsius;
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 18
P Fósforo;
RPM Rotações Por Minuto;
v Volume;
W Watts;
λ Gama.
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 19
SUMÁRIO
RESUMO........................................................................................................................... viii
ABSTRACT ........................................................................................................................ ix
LISTA DE FIGURAS.......................................................................................................... x
LISTA DE TABELAS ...................................................................................................... xiv
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ...................................................................... xv
LISTA DE SÍMBOLOS .................................................................................................. xvii
1 INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 21
1.1 LAGOAS DE ESTABILIZAÇÃO ................................................................................ 22
1.2 AS CIANOBACTÉRIAS .............................................................................................. 23
1.3 FATORES PROMOTORES DAS CIANOBACTÉRIAS E CONSEQUÊNCIAS....... 25
1.4 TOXINAS DE CIANOBACTÉRIAS ........................................................................... 26
1.4.1 β-N-metilamino-L-alanina (BMAA) - A mais recente toxina de Cianobactérias 31
1.5 TESTES DE TOXICIDADE EM CAMUNDONGOS ................................................. 33
2 OBJETIVOS ................................................................................................................... 34
2.1 GERAL.......................................................................................................................... 34
2.2 ESPECÍFICOS .............................................................................................................. 34
3 MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................... 35
3.1 ÁREA DE ESTUDO ..................................................................................................... 35
3.2 ESTUDOS TAXONÔMICOS....................................................................................... 37
3.2.1 Coleta e tratamento das amostras ........................................................................... 37
3.2.2 Análise qualitativa da comunidade ......................................................................... 38
3.2.3 Frequência de ocorrência dos táxons...................................................................... 39
3.2.4 Abundância relativa dos táxons .............................................................................. 39
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 20
3.2.5 Diversidade e Equitabilidade................................................................................... 40
3.3 ESTUDOS QUÍMICOS E ENSAIOS ........................................................................... 41
3.3.1 Coleta da Biomassa................................................................................................... 41
3.3.2 Obtenção dos Extratos ............................................................................................. 42
3.3.3 Ensaio de toxicidades dos camundongos (intraperitonial – i.p.) .......................... 43
3.3.4 Prospecção de substâncias bioativas ....................................................................... 43
3.3.4.1 Atividade antioxidante ............................................................................................. 43
3.3.4.2 Atividade anticolinesterásica .................................................................................. 44
3.3.4.3 Atividade hemolítica ................................................................................................ 44
3.3.5 Prospecção de Cianotoxinas .................................................................................... 45
3.3.5.1 Teste para detecção de -N-metilamino-L-alanina (BMAA) .................................. 45
3.3.5.2 Análise de microcistinas .......................................................................................... 46
3.4 NORMALIZAÇÃO DO TEXTO.................................................................................. 46
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................... 48
4.1 DESCRIÇÃO DA ESPÉCIE ......................................................................................... 49
4.2 ENSAIO DE TOXICIDADE EM CAMUNDONGOS (i.p) ......................................... 56
4.3 PROSPECÇÃO DE SUBSTÂNCIAS BIOATIVAS .................................................... 65
4.3.1 Atividade antioxidante ............................................................................................. 65
4.3.2 Atividade anticolinesterásica ................................................................................... 69
4.3.3 Atividade hemolítica................................................................................................. 71
4.3.4 Teste para detecção de -N-metilamino-L-alanina (BMAA) ............................... 71
4.3.5 Análise para a detecção de microcistinas (CLAE) ................................................ 74
5 CONCLUSÃO................................................................................................................. 80
REFERÊNCIAS ................................................................................................................ 82
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 21
1 INTRODUÇÃO
A disponibilidade de água tem se tornado uma crescente preocupação do século XXI,
em função do indiscriminado tipo de uso e aumento contínuo de interferências antrópicas,
fatores que juntos, comprometem a proporção desse recurso em quantidade/qualidade.
Segundo Di Bernardo (1995), a proteção dos mananciais é invariavelmente o melhor método
para assegurar a qualidade da água destinada ao consumo humano.
Atualmente, as populações dos grandes centros urbanos, industriais e de áreas de
desenvolvimento agrícola, com uso intensivo de insumos químicos, já se deparam com
problemas de escassez qualitativa de água para consumo humano. Deve-se ressaltar, ainda
que, se a escassez quantitativa de água constitui fator limitante ao desenvolvimento, a
escassez qualitativa causa problemas muito mais sérios à saúde pública, à economia e ao
ambiente em geral (REBOUÇAS, 2006).
Entre as ações humanas que podem alterar o balanço hídrico, destacam-se em escala
local e regional o desmatamento, a mudança do uso do solo, os projetos de irrigação e a
construção de barragens. Na escala planetária, destaca-se a mudança climática global
decorrente da alteração das características químicas da atmosfera com gases que promovem o
“efeito estufa”. Assim, é importante ressaltar que qualquer atividade humana que altere os
fatores básicos que determinam o balanço hídrico acaba por influir na disponibilidade dos
recursos hídricos de uma bacia hidrográfica (SALATI, LEMOS e SALATI, 2006).
Dessa forma, faz-se necessário o controle das ações antrópicas nas bacias
hidrográficas e o gerenciamento continuado de modo a preservar os corpos d´água existentes,
e assim, manter sua disponibilidade em quantidade e qualidade satisfatória.
A necessidade de monitoramento da água é ainda mais urgente na região semi-árida,
na qual segundo Vieira e Gondim Filho (2006), a idéia de seca, por sua vez, vai desde a falta
de precipitação, deficiência de umidade no solo agrícola, quebra de produção agropecuária,
até impactos sociais e econômicos negativos. Isso é devido, principalmente, à variabilidade
dos deflúvios, que juntamente com as altas taxas de evaporação do Nordeste, concorrem
decisivamente para que os rendimentos hidrológicos dos açudes sejam bastante baixos se
comparados aos de regiões temperadas.
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 22
1.1 LAGOAS DE ESTABILIZAÇÃO
A água, devido às suas propriedades de solvente e à sua capacidade de transportar
partículas, incorpora a si diversas impurezas, as quais definem a sua qualidade. Essa
qualidade é função do uso e da ocupação do solo na bacia hidrográfica, que se deve aos
fatores de condições naturais, mas sobretudo de interferência do homem, quer de uma forma
concentrada, como na geração de despejos domésticos ou industriais, quer de forma dispersa,
como na aplicação de defensivos agrícolas no solo. Tais ações contribuem para a introdução
de compostos na água, afetando a sua qualidade (VON SPERLING, 1996a).
O processo de lagoas de estabilização constitui uma tecnologia de tratamento de
esgoto atraente para pequenas e médias comunidades, principalmente devido ao baixo custo e
simplicidade operacional, boa eficiência de remoção de poluentes orgânicos e patógenos.
Entretanto, estes sistemas constituem-se em corpos d’água artificialmente eutrofizados, com o
seu efluente apresentando elevada concentração de nutrientes N e P (eutrofização),
promovendo condições suscetíveis a intensa proliferação de Cianobactérias e conseqüente
produção de toxinas (CRUZ et al., 2005).
Basicamente, os sistemas de Lagoas de Estabilização consistem no processo de
retenção dos esgotos por um período de tempo longo o suficiente para que os processos
naturais de estabilização da matéria orgânica se desenvolvam. O esgoto afluente entra em uma
extremidade da lagoa e sai na extremidade oposta. Ao longo desse percurso, que demora
vários dias, uma série de mecanismos contribuem para a purificação dos esgotos. Tais
mecanismos ocorrem nas três zonas das lagoas denominadas: zona anaeróbia, zona aeróbia e
zona facultativa (VON SPERLING, 1996b).
No Brasil o sistema de Lagoas de Estabilização mais empregado é denominado
sistema australiano, que consiste em lançar o esgoto bruto diretamente em uma lagoa,
geralmente em condições anaeróbias. Nesse caso, a lagoa clarifica o esgoto através da
sedimentação de sólidos e da posterior degradação biológica realizada no fundo da lagoa. Já
na zona aeróbia a matéria orgânica em suspensão e solúvel, é oxidada por bactérias ali
presentes que necessitam de oxigênio, o qual é fornecido pelas algas, através da fotossíntese.
Dessa maneira, conclui-se que locais com grandes intensidades luminosas e pouca
nebulosidade são propícios à implantação desse sistema (KELLNER e PIRES, 1998).
O sistema de Lagoas de Estabilização para o tratamento de esgoto implantado no
município de Juazeiro do Norte, CE, é constituído por lagoas em série de processos
anaeróbios e aeróbios (Figura 1). As condições de temperatura e fotoperíodo dessa região, as
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 23
quais não apresentam grandes flutuações, são fundamentais para o adequado funcionamento
do sistema, que assim, propicia uma maior eficiência na remoção das formas poluentes.
Esse sistema, pioneiro na Região do Cariri, representa uma importante contribuição
de ordem sanitária e ambiental, com funções como a eliminação e/ou redução de patogênicos
e proteção ao corpo d’água receptor. Porém, o controle do despejo de microalgas, bem como
das toxinas produzidas por estas, não é assegurado, já que estudos anteriores apontam
espécies potencialmente tóxicas como dominantes neste local (ALENCAR, OLIVEIRA e
LACERDA, 1999; FREITAS et al., 2006; AQUINO, FREITAS e LACERDA, 2007).
Figura 1 – Esquema do funcionamento do sistema de Lagoas de Estabilização do municípiode Juazeiro do Norte - Ceará. Fonte: CAGECE, 2010.
1.2 AS CIANOBACTÉRIAS
As Cianobactérias são organismos clorofilados, bastante heterogêneos, que através
de variadas características estruturais e fisiológicas peculiares, podem suportar um grande
número de condições adversas nos mais diversos tipos de ambientes, aquáticos ou terrestres.
As estratégias adaptativas, dentre outras formas de manutenção de seu crescimento, lhes
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 24
conferem vantagens competitivas com sucesso ecológico no desenvolvimento e distribuição
geográfica de sua diversidade.
O nome popular desses organismos, “algas azuis”, vem da coloração verde-azulada
das células quando vistas ao microscópio. Isto acontece por que suas células contêm
diferentes pigmentos fotossintéticos, tais como clorofila a – que dá coloração esverdeada –,
ficocianina que é azul e algumas espécies possuem também um pigmento vermelho, a
ficoeritrina (SOUZA, 2006).
A célula procariota das Cianobactérias pode ser distinguida das células das algas
eucariotas, ao microscópio óptico, pela ausência de plastos. Os pigmentos fotossintéticos e os
demais componentes celulares, tais como grânulos de cianoficina, substância de reserva,
aerótopos (vesículas gasosas), carboxissomos e ribossomos, estão dispersos no protoplasma
(AZEVEDO e SANT’ANNA, 2006).
A capacidade de crescimento nos mais diferentes meios é uma característica
marcante das Cianobactérias. Várias espécies vivem em solos e rochas onde desempenham
importante papel nos processos funcionais do ecossistema e na ciclagem de nutrientes.
Entretanto, ambientes de água doce são os mais importantes para o crescimento de
Cianobactérias em pH neutro, temperatura entre 15 e 30ºC e alta concentração de nutrientes,
principalmente nitrogênio e fósforo (AZEVEDO e VASCONCELOS, 2008).
Os organismos fitoplanctônicos, dos quais fazem parte as Cianobactérias, são
produtores primários e constituem a base de toda a cadeia alimentar. Além disso, pelo
processo fotossintético representam a principal fonte de oxigênio para o meio aquático, sem a
qual é impossível a sobrevivência de qualquer forma de vida animal (SANT’ANNA, GENTIL
e SILVA, 2006).
Florações superficiais que formam “natas” e que podem mudar a coloração da água
são compostas por cianobactérias que possuem aerótopos (vesículas gasosas) em suas células,
possibilitando a flutuação e permanência na superfície. Embora presentes em grandes
quantidades, algumas espécies de cianobactérias também com aerótopos não formam “natas”
e nem tornam a água esverdeada em virtude de não possuírem bainhas mucilaginosas que
agregam e mantêm os organismos juntos. Portanto, água que apresenta aspecto claro, não
necessariamente significa ausência de altas densidades de Cianobactérias (SOUZA, 2006).
De acordo com Ferrão-Filho, Molica e Azevedo (2009), a tragédia de Caruaru que
causou dezenas de mortes em 1996 pela ação de uma cianotoxina hepatotóxica, foi o grande
impulsionador para o aumento no número de pesquisas realizadas com Cianobactérias no país.
Os focos principais destas pesquisas buscam a compreensão de aspectos sobre a ecofisiologia
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 25
e ecotoxicologia, bem como o desenvolvimento de novas tecnologias para identificação de
espécies tóxicas. Além disso, as florações de Cianobactérias tóxicas foram reconhecidas como
um problema de saúde pública e foram estabelecidos limites máximos permitidos para estas
toxinas em água de abastecimento (Portaria MS 518/04, Ministério da Saúde 2004) e de usos
múltiplos (Resolução CONAMA 357/05, CONAMA 2005).
Pesquisas também voltadas à elucidação de metabólitos secundários bioativos com
ações anticolinesterásica, antioxidante, antifúngica, antibacteriana, hemolítica, dentre outros
com importância farmacológica, têm se tornado crescente em função da diversidade de
subtâncias bioativas que tem sido relacionadas à produção por Cianobactérias. Segundo
Sivonen e Jones (1999), as Cianobactérias são consideradas uma rica fonte de compostos
biomedicamente interessantes, a partir das quais é conhecida a produção de compostos
antitumorais, antivirais, antibióticos e antifúngicos. E por tal importância, screenings de
Cianobactérias para obtenção de novos bioativos têm estado em andamento.
1.3 FATORES PROMOTORES DAS FLORAÇÕES DE CIANOBACTÉRIAS E
CONSEQÜÊNCIAS
Os principais problemas de deterioração dos recursos hídricos estão relacionados
com o crescimento e a diversificação das atividades agrícolas, o aumento da urbanização e a
intensificação de atividades diversas nas bacias hidrográficas. Com isso, os inúmeros efeitos
diretos e indiretos produzidos no ciclo hidrológico incidem sobre a quantidade e a qualidade
das águas, que vem se tornando uma constante, frente ao crescimento mundial da população
humana (TUNDISI, 2005).
Assim, a partir do massivo crescimento populacional e o conseqüente grau de
urbanização, é produzida com mais intensidade a eutrofização artificial, enriquecimento de
nutrientes nos corpos d’água, principalmente por nitrogênio e fósforo, que de acordo com
Azevedo e Vasconcelos (2008), produz mudanças na qualidade da água, incluindo: a redução
de oxigênio dissolvido, perdas das qualidades cênicas, aumento do custo de tratamento, morte
extensiva de peixes e aumento da incidência de florações de Cianobactérias.
A entrada de nutrientes nos corpos d’água, como por exemplo nitrogênio e fósforo,
se deve dentre as variadas formas de aporte, às descargas de esgotos domésticos e industriais.
Segundo Tundisi (2005), entre os elementos que são requeridos para o crescimento de algas
fitoplanctônicas, o fósforo e o nitrogênio, constituem-se elementos críticos e limitantes, sendo
o fósforo, necessário para manter o crescimento em populações de algas, o que torna sua
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 26
demanda muito maior. Assim, com o suprimento suficiente de fósforo para acelerar o
crescimento e a capacidade de fixar N2 (o que lhes fornece vantagem competitiva sobre outras
algas), as Cianobactérias crescem rapidamente, formando extensas populações que se
desenvolvem próximas à superfície.
O grande teor de partículas em suspensão na água contribui para reduzir a quantidade
de luz que atravessa a coluna d’água, diminuindo sua transparência e aumentando sua
turbidez. Essa diminuição da luz na coluna d’água propicia o desenvolvimento de
Cianobactérias, que conseguem manter sua atividade fotossintética e formar grande biomassa,
mesmo em baixa intensidade luminosa (SANT’ANNA, GENTIL e SILVA, 2006).
Altos valores de pH mudam o equilíbrio das concentrações das formas de carbono na
água em direção à formação de CO2 e diminuição de O2, o que favorece o desenvolvimento de
Cianobactérias e prejudica os demais grupos fitoplanctônicos (JENSEN et al., 1994).
As florações ou blooms de Cianobactérias se caracterizam pelo intenso crescimento
desses microorganismos na superfície da água, formando densa camada de células com vários
centímetros de profundidade, com conseqüências para a saúde pública (AZEVEDO e
VASCONCELOS, 2008).
No entanto, nem todas as florações de Cianobactérias são tóxicas e algumas podem
ser tóxicas apenas durante um período do ano, do mês ou da semana. A razão mais
comumente aceita é a dominância de cepas tóxicas e não tóxicas, as quais, quando são da
mesma espécie, não podem ser separadas fenotipicamente (MOLICA e AZEVEDO, 2009).
Porém grande atenção deve ser dada ao monitoramento das espécies tóxicas em função dos
danos que podem causar, principalmente, à saúde humana.
Além dos riscos à saúde, essas algas, quando em grandes quantidades, podem causar
obstrução de filtros nas estações de tratamento de água e também tornar a qualidade da água
indesejável para consumo, pois os metabólitos que produzem podem conferir gosto e odor
desagradáveis à água (ZAGATTO et al., 1997). O gosto e odor desagradáveis são devidos a
metabólitos como a geosmina e o 2-methylisoborneol (2-MIB) (SOUZA, 2006).
1.4 TOXINAS DE CIANOBACTÉRIAS
Segundo Sivonen e Jones (1999), as cianotoxinas são um grupo diverso de toxinas
naturais tanto do ponto de vista químico quanto toxicológico. Apesar de sua origem aquática,
a maioria dos cianotoxinas que foram identificadas até agora parecem ser mais perigosas aos
mamíferos terrestres do que à biota aquática. As Cianobactérias produzem uma variedade de
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 27
metabólitos incomuns, cuja função natural é desconhecida, embora alguns, talvez apenas
coincidentemente, provoquem efeitos a outras biotas. De acordo com Calijuri, Alves e Santos
(2006), alguns pesquisadores acreditam que as cianotoxinas desempenhem funções de defesa
em relação às espécies zooplanctônicas, seus predadores primários.
As toxinas de Cianobactérias são caracterizadas como endotoxinas por serem,
geralmente, liberadas apenas quando acontece o rompimento da célula (CARMICHAEL,
1997).
Segundo sua estrutura química, as toxinas de Cianobactérias são classificadas como
alcalóides, peptídeos cíclicos e lipopolissacarídeos (CALIJURI, ALVES e SANTOS, 2006).
Algumas cianotoxinas são caracterizadas por sua ação rápida, sendo as que causam a
morte de mamíferos por parada respiratória após poucos minutos de exposição, identificadas
como alcalóides ou organofosforados neurotóxicos. Outras atuam de forma mais lenta e são
identificadas como peptídeos ou alcalóides hepatotóxicos (CHORUS e BARTRAM, 1999).
Desta forma, pela ação farmacológica, as duas principais classes de cianotoxinas até
agora caracterizadas são: neurotoxinas e hepatotoxinas (MOLICA e AZEVEDO, 2009), como
podem ser vistas suas características na Tabela 1, e estruturas químicas na Figura 2. Assim, é
evidente que a toxicidade das Cianobactérias é bastante complexa. Conforme Carmichael
(1997), uma espécie de cianobactéria pode produzir mais de um tipo de toxina e dentro de
uma mesma espécie podem existir cepas produtoras e cepas não produtoras de toxinas. Estas
moléculas estão divididas em três classes principais: dermatotoxinas, neurotoxinas e
hepatotoxinas, sendo estas duas últimas as mais freqüentemente encontradas em corpos
d’água e que geram maiores preocupações.
A detecção de Cianobactérias tóxicas e de suas cianotoxinas é fundamental para o
gerenciamento seguro da água. Tradicionalmente, a identificação microscópica dessas algas
tem sido usada só ou em combinação com análise direta para toxinas. A discriminação
morfológica entre Cianobactérias tóxicas e não-tóxicas pode ser difícil, porque alguns gêneros
contêm ambos os representantes, tóxicos e não-tóxicos. Algumas espécies são conhecidas
como tóxicas, algumas podem ser geneticamente capazes de produzir toxinas (toxigênicas),
mas podem não produzir sob todas as condições, e algumas não produzem nenhuma toxina.
Métodos de detecção DNA-baseados ficaram populares por causa de sua especificidade
potencial (elucidar genes envolvidos na biossíntese de toxina), sensibilidade e velocidade
(OUELLETTE e WILHELM, 2003).
Para avaliar os riscos específicos de toxinas de Cianobactérias é necessário
compreender as suas propriedades químicas, regulamentação da sua produção, mecanismos de
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 28
ação, que são diversos, e seu destino nos ambientes, sendo de valiosa importância o
monitoramento em águas destinadas ao consumo humano.
O número de relatos de ocorrências de florações de Cianobactérias em todo o mundo
vem aumentando consideravelmente e na maioria desses episódios, as toxinas dominantes são
as microcistinas (CARVALHO et al., 2008). As microcistinas, hepatotoxinas mais
comumente encontradas em blooms de água doce, são peptídeos cíclicos formados por sete
aminoácidos, sendo caracterizadas de acordo com o arranjo desses aminoácidos na molécula,
podendo levar à morte em algumas horas por hemorragia no fígado. Cerca de 60 variações
estruturais de microcistinas já foram identificadas, sendo que as mais conhecidas são MC-RR;
MC-YR; MC-LR e MC-LA (SIVONEN e JONES, 1999).
Com relação às toxinas, embora só tenham sido detectadas e identificadas em alguns
gêneros, todas as Cianobactérias, a princípio, são consideradas potencialmente tóxicas
(SOUZA, 2006).
Segundo Sant’Anna e Azevedo (2000), considerando o processo de eutrofização
acelerado de muitos corpos d’água, as freqüentes ocorrências de blooms de Cianobactérias e o
pouco conhecimento de espécies tóxicas brasileiras, urge a necessidade de uma melhor
compreensão das Cianobactérias potencialmente tóxicas e de sua distribuição no Brasil. Esses
autores, com base na avaliação de dados na literatura brasileira e amostras examinadas,
afirmam que a maioria das espécies potencialmente tóxicas de Cianobactérias ocorrem em
ambas as áreas, tropical e subtropical do Brasil.
Os principais gêneros na produção de toxinas são Microcystis Kützing
(Lemmermann), Anabaena Bory (Bornet e Flahault), Oscillatoria Vaucher (Gomont),
Planktothrix Anagnostidis e Komárek, Aphanizomenon Morren (Bornet e Flahault),
Cylindrospermopsis Seenayya e Subba Raju, bem como Raphidiopsis Fritsch e Rich.
Microcystis é o gênero mais comum e amplamente distribuído (CARMICHAEL, 1996).
Para o Brasil, entre os gêneros potencialmente nocivos, destacam-se Microcystis,
Anabaena, Cylindrospermopsis, Oscillatoria, Planktothrix e Aphanocapsa (CALIJURI,
ALVES e SANTOS, 2006).
Para as Cianobactérias, é importante a identificação dos organismos dominantes,
pelo menos até o nível genérico, para saber se já são conhecidos seus efeitos tóxicos e
direcionar a escolha da técnica analítica para a determinação da toxina, já que diferentes
gêneros e espécies produzem diferentes toxinas (AGUJARO, 2006).
A determinação de uma proliferação de Cianobactérias tóxicas simplesmente pela
aparência é inviável, e a maior dificuldade no estudo de cianotoxinas encontra-se nos métodos
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 29
disponíveis para detecção e avaliação de toxidade. A identificação desses organismos, com
base em características morfológicas, apesar de amplamente utilizada e recomendada, tem se
mostrado insuficiente devido à extensa plasticidade fenotípica de algumas espécies. Por isso,
outras técnicas também podem ser empregadas e são recomendadas como padrão: bioensaios
com camundongos, detecção de toxinas através de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
(CLAE) ou análises imunoenzimáticas específicas (BITTENCOURT-OLIVEIRA et al.,
2001).
Tabela 1 – Características gerais das principais toxinas de Cianobactérias (Modificado deSIVONEN e JONES, 1999).
Tipo de ToxinaPrincipal Órgão
Alvo em Mamíferos
PrincipaisGêneros de
Cianobactérias
Hepatotoxinas
Microcistina Fígado
Microcystis, Anabaena,Planktothrix (Oscillatoria),
Nostoc, Hapalosiphon,Anabaenopsis
Nodularina Fígado Nodularia
Neurotoxinas
Anatoxina-a Nervo SinápticoAnabaena,
Planktothrix (Oscillatoria),Aphanizomenon
Anatoxina-a (S) Nervo Sináptico Anabaena
Saxitoxinas Nervo Axônico
Anabaena,Aphanizomenon, Lyngbya,
Cylindrospermopsis,Planktothrix1
Citotoxina
Cilindrospermopsina Fígado
Cylindrospermopsis,Aphanizomenon,
Umezakia
Dermatotoxina
Lipopolissacarídeo(LPS)
Afeta tecidos expostos(irritante potencial)
Todos
1. De acordo com Codd et al., 2005.
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 30
Figura 2 – Estrutura química dos principais tipos de cianotoxinas (Adaptado de SIVONEN eJONES, 1999).
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 31
1.4.1 β-N-metilamino-L-alanina (BMAA) – A mais recente toxina de Cianobactérias
Recentes pesquisas, como as realizadas por Cox et al. (2003; 2005), tem descoberto
uma nova toxina produzida por Cianobactérias, β-N-metilamino-L-alanina (BMAA), a qual é
classificada como neurotoxina em função do seu modo de ação sobre áreas do Sistema
Nervoso Central. De acordo com os mesmos autores, é sabido que essa toxina uma vez no
organismo, se acumula no cerébro e é responsável por doenças neurodegenerativas, como
Esclerose Lateral Amiotrófica/Parkinsonismo.
β-N-metilamino-L-alanina (BMAA), foi originalmente descoberto nas sementes de
uma cicadácea, Cycas circinalis, por Vega e Bell (1967). BMAA é um aminoácido não
protéico e estruturalmente aparece como uma alanina metilada. A princípio, a fonte de BMAA
em cicadáceas era desconhecida. No entanto, dada as suas profundas propriedades
neurotóxicas, a ocorrência de BMAA nessas plantas pode funcionar como um impedimento
químico à herbivoria (COX, BANACK e MURCH, 2003). Esse aminoácido neurotóxico,
ocorre na forma livre ou ligado à proteina (MURCH, COX e BANACK, 2004b).
Cicadáceas são plantas de sementes não florescentes de linhagem antiga. Essas
gimnospermas apresentam ocorrência comum para a região tropical e subtropical e são
tipicamente usadas na alimentação humana (VEGA e BELL, 1967).
As sementes de plantas cicadáceas, como Cycas micronesica Hill, que eram bastante
usadas pelo povo indígena Chamorro como uma fonte de farinha para elaboração de
alimentos, como tortas, inclui a presença da neurotoxina β-N-metilamino-L-alanina (BMAA),
que tem implicações em doenças neurodegenerativas ocorridas nessa população, na Ilha de
Guam no Oceano Oste do Pacifíco (BANACK e COX, 2003).
Assim, antes de 2003, a ocorrência de BMAA somente havia sido registrada em
cicadáceas, limitando a potencial exposição humana aos ambientes terrestres tropicais e
subtropicais, onde estas plantas crescem e então, somente aos povos indígenas que
consumiam produtos de cicadáceas ou animais que se alimentavam delas (COX et al., 2005).
No entanto, Cox, Banack e Murch (2003), através de culturas axênicas de Cianobactérias
Nostoc isoladas a partir de raízes coralóides de Cycas micronesica, verificaram que tais
Cianobactérias vivem como endossimbiontes nas raízes coralóides, invadindo uma região
especializada da raiz, de onde foram encontradas com produção de 0.3 µg/g de BMAA. Esses
autores verificaram que, através de níveis tróficos em ordem crescente na Ilha de Guam,
ocorre a biomagnificação dessa neurotoxina, a qual foi analisada acontecer de Cianobactérias
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 32
para Cycas (37 µg/g) e destas para raposas voadoras (3.556 µg/g), espécies de morcegos, que
por sua vez, eram consumidas pelo povo indígena, denominado Chamorro, na Ilha de Guam.
A relação de BMAA como principal causa de desordens neurodegenerativas
ocorridas em Guam, foi originalmente feita por Spencer et al. (1986), que a partir de estudos
em macacos com a doença esclerose lateral amiotrófica/complexo de demência
parkinsonismo (ALS/PDC), verificaram BMAA como indutor de danos no neurôneo motor.
Mais tarde Cox, Banack e Murch (2003), também em Guam, encontraram BMAA livre nos
tecidos cerebrais do córtex frontal de pacientes da população Chamorro que morreram vítimas
de ALS/PDC. Já Murch et al. (2004a), da mesma forma, constatou a presença de BMAA,
livre e na fração protéica, de pacientes com a mesma doença neurodegenerativa na referida
população.
A doença de desordem neurológica progressiva e incidente nos povos indígenas
Chamorro, tem características clínicas e patológicas semelhantes a esclerose lateral
amiotrófica (ALS), doença de Parkinson e doença de Alzheimer (COX, BANACK e
MURCH, 2003; MURCH et al., 2004a).
Uma das evidências que também relacionou BMAA como agente patológico da
doença neurodegenerativa (ALS/PDC) ocorrida em Guam foi verificada por Banack e Cox,
(2003), que em estudos realizados com espécimes de morcegos, denominados como raposas
voadoras, constataram uma abundância de BMAA na pele desses animais. Assim, uma vez
que estes integravam o hábito alimentar do povo Chamorro de Guam, os autores sugeriram
que o consumo abundante estaria relacionado à ingestão involuntária de altas doses de
BMAA.
Cox, Banack e Murch (2003) e Murch et al. (2004a), também constataram a presença
de BMAA em tecidos cerebrais de indivíduos canadenses que sofriam com a doença de
Alzheimer na mesma faixa de concentração que foi verificada em pacientes da população
Chamorro de Guam. Segundo esses autores, como BMAA era conhecido anteriormente
somente a partir de cicadáceas, e estas não ocorrem naturalmente no Canadá, as
Cianobactérias devem ser investigadas como a possível fonte de qualquer BMAA encontrado
em canadenses que sofrem de doença neurológica progressiva. Dado que, as Cianobactérias
apresentam distribuição em ambientes terrestres e aquáticos, isso abre a possibilidade da
neurotoxina BMAA ser biomagnificada por diferentes maneiras em vários ecossistemas.
Segundo Cox et al. (2005), BMAA é produzido por Cianobactérias planctônicas,
incluindo representantes de todas as cinco seções desse grupo. Os autores evidenciaram esse
resultado em 95% do total de gêneros testados (20 de 21 representantes selecionados
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 33
randomicamente), o que consideram ser BMAA, de significância ecológica e evolutiva. Esses
novos dados mostram que BMAA é produzido por cianobactérias de regiões geográficas e
ambientes diversos em todo o mundo. De acordo com Jonasson et al. (2010), dessa forma,
BMAA pode se propagar globalmente em ecossistemas terrestres e aquáticos.
1.5 TESTES DE TOXICIDADE EM CAMUNDONGOS
Segundo Calijuri, Alves e Santos (2006), os métodos de detecção de cianotoxinas em
águas doce e marinha, tiveram origem com bioensaios em camundongos, utilizados desde o
inicio do século XX. Já no início da década de 1980, métodos de detecção mais sofisticados
foram desenvolvidos, como ensaios enzimáticos e métodos analíticos como a cromatografia
líquida de alta eficiência (CLAE) e a espectrometria de massas.
Ainda que ocorram algumas limitações, o bioensaio em camundongo continua a ser
o principal meio de avaliação da função e potência das cianotoxinas (DOW e SWOBODA,
2000). Isso é corroborado por Azevedo e Vasconcelos (2008), que consideram como ensaios
mais comuns e mais antigos aqueles com camundongos, que têm a vantagem de num único
ensaio poder diferenciar os sintomas do tipo de toxina existente – neurotoxinas e
hepatotoxinas –, sendo rápidos, fáceis de executar e a resposta pode ser obtida no próprio dia
de recepção das amostras.
Os sinais clínicos de intoxicação apresentados pelos animais submetidos às análises
toxicológicas, aliados à identificação das Cianobactérias presentes na amostra em estudo,
podem fornecer indicações a respeito da classe química a qual pertence a ficotoxina,
apontando a análise química adequada à sua caracterização e quantificação (CARVALHO,
2006).
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 34
2 OBJETIVOS
2.1 GERAL
o Determinar a ocorrência de Cianobactérias e identificar a presença de metabólitos
secundários bioativos a partir de amostragens coletadas nas Lagoas de Estabilização
da Estação de Tratamento de Esgoto (ETE) do Município de Juazeiro do Norte, Ceará.
2.2 ESPECÍFICOS
o Conhecer a biodiversidade das Cianobactérias e correlacioná-las aos parâmetros
ambientais, avaliando a influência destes na composição quali-quantitativa das
espécies;
o Avaliar a variação das espécies de Cianobactérias durante o período de estudo;
o Detectar substâncias bioativas com ações: anticolinesterásica, antioxidante e
hemolítica;
o Determinar a toxicidade das Cianobactérias, através de ensaios em camundongos;
o Caracterizar a classe química das cianotoxinas detectadas;
o Identificar as toxinas biossintetizadas pelas Cianobactérias ocorrentes;
o Avaliar os riscos de exposição às espécies causadoras da floração.
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 35
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 ÁREA DE ESTUDO
A Estação de Tratamento de Esgoto (ETE Malvas) de Juazeiro do Norte – CE tem
por finalidade o tratamento das águas servidas e contaminadas (esgotos), provenientes das
áreas urbanas delimitadas pelos bairros: Salesiano, Centro, São Miguel, Pio XII, Romeirão,
Pirajá, Franciscano, Santa Tereza, Limoeiro, Vila Fátima, João Cabral, Conj. Almino Loiola e
Malvas, dos quais essas águas residuárias são captadas pelas EEEs mais próximas (Estação
Elevatória de Esgoto) e a partir destas, conduzidas à ETE, onde são tratadas e só então,
lançadas no corpo aquático, neste caso o rio Salgado, seu receptor (Figura 3). A ETE Malvas
é operada pela Companhia de Água e Esgoto do Ceará (CAGECE), Unidade de Negócio da
Bacia do Salgado UN-BSA e está inserida na Região do Cariri Central, ao Sul do Ceará,
latitude (S) 7° 11' 33'' e longitude (W) 39° 18' 38'', sendo constituída por cinco lagoas de
estabilização, das quais duas são de processos anaeróbios e três de processos aeróbios (Figura
4).
Figura 3 – Fluxograma da estrutura de funcionamento do Sistema de Esgotamento Sanitário(SES) de Juazeiro do Norte - Ceará. Fonte: CAGECE, 2010.
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 36
Figura 4 – (A) Localização geográfica do município de Juazeiro do Norte, inserido na Regiãodo Cariri Central, Estado do Ceará, Brasil; (B) Foto aérea das Lagoas deEstabilização da Estação de Tratamento de Esgoto (ETE) e (C) Esquema daestrutura das Lagoas de Estabilização da ETE. Fontes: (A) Secretaria das Cidadesdo Estado do Ceará, 2009; (B) Arquivo pessoal e (C) CAGECE, 2010.
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 37
Dados como, pH e temperatura, foram cedidos pela Companhia de Água e Esgoto do
Ceará (CAGECE) de Juazeiro do Norte - Ceará, para a complementação desse estudo. Quanto
aos dados pluviométricos, estes foram disponibilizados pela Fundação Cearense de
Meteorologia e Recursos Hídricos – FUNCEME.
3.2 ESTUDOS TAXONÔMICOS
3.2.1 Coleta e tratamento das amostras
As amostras para o estudo do fitoplâncton, especificamente Cianobactérias, foram
coletadas mensalmente na superfície das lagoas de estabilização de processos aeróbios da
ETE/Juazeiro do Norte designadas como: Lagoa Facultativa A, Lagoa Facultativa B e Lagoa
de Maturação (Figura 5), no período de Fevereiro a Junho/2010, totalizando 5 amostragens
para cada lagoa. Tendo sido utilizados frascos apropriados (≈250 mL) para obtenção de três
subamostras, sendo uma para análise do material in vivo e outras para preservação com lugol
acético e fixação com formol neutro a 4%. Em seguida, as amostras foram transportadas para
o acervo do Laboratório de Botânica da Universidade Regional do Cariri, URCA, onde foram
devidamente armazenadas.
Figura 5 – Lagoas de Estabilização da Estação de Tratamento de Esgoto (ETE) de Juazeiro doNorte - Ceará. Fonte: CAGECE, 2006.
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 38
Esse Sistema de Lagoas de Estabilização associadas em série consiste no tratamento
biológico de águas residuárias e segundo dados da CAGECE (2010), apresenta um número de
19.602 ligações ativas, com extensão total de rede no valor de 149.219,36 m e vazão estimada
em 71,03 (L/s). O tipo de sistema é Convencional/Condominial e o índice de cobertura de
esgoto é estimado em 39,52%. Demais características estão apresentadas na Tabela 2.
Tabela 2 – Características físicas das Lagoas de Tratamento Biológico do município deJuazeiro do Norte – CE.
Lagoa Comp. x Larg. (m) Área (m2) Profundidade (m) Volume (m3)
Anaeróbia A 86,04 x 102 8.776,08 4,5 39.492,36
Anaeróbia B 86,04 x 102 8.776,08 4,5 39.492,36
Facultativa A 558,1 x 105,5 58.879,55 1,5 88.319,32
Facultativa B 558,1 x 105,5 58.879,55 1,5 88.319,32
Maturação 558,1 x 113,7 63.455,97 1,0 63.455,97
Fonte: CAGECE, 2010.
3.2.2 Análise qualitativa da comunidade
As amostras in vivo, mantidas em baixa luminosidade e baixa temperatura, bem
como as fixadas com formol neutro a 4% foram analisadas em microscópio óptico BIOVAL
L2000A acoplado a uma câmara fotográfica, sendo a análise taxonômica realizada com base
no exame morfológico e morfométrico. Quando necessário, foi utilizado nanquim para
evidenciar a bainha mucilaginosa. Deste modo, as Cianobactérias foram identificadas e
quando possível fotomicrografadas.
Para cada amostra, foram examinadas tantas lâminas quantas necessárias para que a
avaliação abrangesse uma população de 20 a 30 indivíduos, de cada táxon. A identificação foi
feita em nível genérico e infragenérico, e os exames para confirmação das espécies, realizados
no Laboratório de Microscopia do Núcleo de Pesquisa em Ficologia do Instituto de Botânica
de São Paulo.
A avaliação da composição florística consistiu na análise de sua diversidade, sendo
que, para identificação dos táxons, foram consultadas bibliografias especializadas, tais como:
Desikachary (1959), Prescott (1962), Mizuno (1968), Compère (1976), Parra, Gonzales e
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 39
Delarrosa (1983), Streble e Krauter (1987), Parra e Bicudo (1993), Bicudo e Menezes (2005),
Sant’Anna, Gentil e Silva (2006), dentre outras.
O sistema de classificação adotado para identificação de Cyanobacteria foi
Anagnostidis e Komárek (1988), Komárek e Anagnostidis (1989, 1999, 2005).
3.2.3 Frequência de ocorrência dos táxons
De acordo com Mateucci e Colma (1982), a frequência de ocorrência foi expressa em
termos de porcentagem, através da fórmula:
Onde,
a = número de amostras em que o táxon ocorreu;
A = número total de amostras.
Em função do valor de F, os táxons foram classificados nas seguintes categorias:
3.2.4 Abundância relativa dos táxons
Para os cálculos da abundância relativa foram quantificados os 100 primeiros
organismos na lâmina, sendo os demais considerados presentes ou ausentes.
Segundo Lobo e Leighton (1986), a abundância relativa foi expressa em
porcentagem e calculada com base na seguinte fórmula:
Ar= N.100/n
F= a.100/A
Muito Freqüente > 70%
Freqüente ≤ 70 > 40%
Pouco freqüente ≤ 40 > 10%
Esporádica ≤ 10%
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 40
Onde,
N = número de indivíduos encontrados para cada espécie;
n = número total de indivíduos de cada amostra.
A partir dos resultados obtidos, os táxons foram enquadrados nas seguintes categorias:
3.2.5 Diversidade e Equitabilidade
A riqueza de espécies (S) foi considerada como o número total de espécies presentes
em cada amostra.
Para os cálculos da diversidade específica (H’), utilizou-se o índice de Shannon
(1948), de acordo com a equação abaixo:
s
H’= - Σ pi x ln pii=1
Onde,
pi = Ni/N, e consiste na probabilidade de que um indivíduo pertença à espécie i contido nas
amostragens;
Ni = número de indivíduos amostrados da espécie i;
N = número total de indivíduos amostrados;
ln = logaritmo neperiano.
A diversidade foi expressa em bits.ind-1 e com base nas observações de Magurran
(2004), foi adotada a seguinte classificação: < 1,0 = diversidade muito baixa; < 2,0 ≥ 1,0 =
diversidade baixa; < 3,0 ≥ 2,0 = diversidade média; ≥ 3,0 = diversidade alta.
Dominante > 50%
Abundante > 30 ≤ 50%
Pouco Abundante ≤ 30 > 10%
Rara ≤ 10%
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 41
A equitabilidade (J) é expressa entre 0 e 1, sendo obtida pela proporção entre o
índice de Shannon (H’) e o valor máximo que este assumiria (H’max), caso os indivíduos
fossem distribuídos uniformemente entre as espécies:
H’J =
H’max
Onde,
H’ = índice de Shannon;
H’max = ln (S):
ln = logaritmo neperiano,
S = número total de espécies amostradas.
A diversidade e a equitabilidade foram calculadas com a utilização do software
Ecological Measures (KOTILA, 1986).
3.3 ESTUDOS QUÍMICOS E ENSAIOS
Para a investigação da presença de metabólitos secundários bioativos (tóxicos ou
apresentando ações antioxidante, anticolinesterásica e hemolítica) foram coletadas 10 (dez)
amostras de biomassa de Cianobactérias das Lagoas de Estabilização de Tratamento de
Esgoto – ETE/Juazeiro do Norte-CE. A periodicidade da amostragem foi mensal, abrangeu os
meses de abril a junho/2010 e resultou no total de 10 (dez) amostras: 3 (três) amostras de cada
lagoa de processo aeróbio: Lagoa Facultativa A, Facultativa B e de Maturação, e 1 (uma)
amostra para a saída da Estação de Tratamento, no ponto de lançamento no Rio Salgado (esta
coletada no mês de junho/2010).
3.3.1 Coleta da Biomassa
As florações de Cianobactérias foram coletadas com rede de plâncton (45µm), para
concentração da biomassa, até volume de aproximadamente 3L para cada amostra. As
amostras assim obtidas foram devidamente acondicionadas e mantidas sob baixa temperatura
em recipiente com gelo, para o transporte ao Laboratório de Botânica da Universidade
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 42
Regional do Cariri – URCA, onde foram armazenadas. Essas amostras foram filtradas a
vácuo, no mesmo dia em que foi realizada a coleta, no Laboratório de Pesquisa de Produtos
Naturais (LPPN) – URCA. Esse processo consistiu de pré-filtração em papel filtro 150 mm,
gramatura 80g, seguida de filtração em membrana de microfibra de vidro, AP20, 47 mm, de
todo o filtrado obtido na pré-filtração.
Os filtros contendo as células de Cianobactérias foram embalados, identificados e
congelados a -20 ºC, até o momento em que foram submetidos à extração.
3.3.2 Obtenção dos Extratos
Esta etapa do trabalho foi realizada no Laboratório de Química do Núcleo de
Pesquisa em Ficologia do Instituto de Botânica de São Paulo, sob a supervisão da Dra.
Luciana Retz de Carvalho.
Os filtros congelados contendo as células concentradas foram liofilizados,
submetidos à extração (5x) com ácido acétido 0,1 M, por exposição a ultra-som (5x, 30 min.,
50 W), seguida de centrifugação (3000 rpm, por 50 minutos), sendo os sobrenadantes de cada
extração filtrados e combinados, para liofilização. Após a liofilização, foi determinado o peso
do extrato total e dele foram separadas as quantidades de 100 mg e de 60 mg para estudos
químicos e para teste toxicológico em camundongos, respectivamente.
O extrato seco condicionado foi fracionado em coluna de gel de sílica
octadecilsilanizada (ODS-C18 - Bond Elut), previamente ativada com 75 mL de MeOH 100%
e de ácido acético 0,1 M , respectivamente, sendo eluído com 75 mL de cada um dos
componentes do seguinte gradiente:
(1) ácido acético 0,1 M;
(2) ácido acético 0,1 M / metanol 80:20 (v/v);
(3) ácido acético 0,1 M / metanol 50:50 (v/v);
(4) ácido acético 0,1 M / metanol 10:90 (v/v) e
(5) metanol 100%.
A fração (1), eluída em ácido acético 0,1 M, foi liofilizada e as demais (2), (3), (4) e
(5) foram concentradas a vácuo, para eliminação do solvente orgânico e liofilizadas.
A fração (1) foi utilizada para pesquisa cromatográfica de β-N-metilamino-L-alanina
(BMAA) por Cromatografia Planar (PIETRZYK, 1989) e a fração (3) foi submetida à análise
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 43
por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) para detecção de microcistinas
(CARVALHO et al., 2008).
3.3.3 Ensaio de toxicidade em camundongos (intraperitonial – i.p.)
O teste de toxicidade preconizado pela Organização Mundial da Saúde (HARADA et
al., 1999) consiste na administração da amostra (n = 3), por via intraperitonial, em
camundongos machos “Swiss-Webster”, pesando de 19 a 21 g. Para cada animal-teste, foram
administrados 20 mg de extrato de células liofilizado e reconstituído com até 1 mL de água
destilada. Os animais foram observados por 7 (sete) dias, sendo os sintomas de intoxicação e
o tempo de sobrevida anotados. Após o 7º dia de observação os animais foram eutanaziados e
submetidos a exames “post-mortem”.
As doses utilizadas para esses testes foram escolhidas com base no fator “f”,
empregado nos estudos toxicológicos de Dinoflagelados e de Cianobactérias (HARADA et
al., 1999) e determinado pela relação:
f = mg de células liofilizadas x Kg de peso corpóreo-1
Onde o numerador corresponde à quantidade de biomassa utilizada no ensaio e o
denominador, ao peso corpóreo do camundongo, animal escolhido para o teste.
3.3.4 Prospecção de substâncias bioativas
3.3.4.1 Atividade Antioxidante
A determinação da atividade antioxidante foi realizada na Seção de Fisiologia e
Bioquímica de Plantas (IBt/SP). As amostras submetidas a este teste estão descriminadas no
ítem 3.3 ESTUDOS QUÍMICOS E ENSAIOS.
Esse ensaio ocorreu em placa cromatográfica (20x20cm, sílica gel 60, Merck), na
qual os extratos na concentração de 25 µg/µl de CHCl3/MeOH/H2O (64:36:8, v/v/v) foram
aplicados e eluídos com a mesma mistura de solventes, clorofórmio: metanol: água (64:36:8,
v/v/v). Após o desenvolvimento da cromatografia, a placa foi secada e nebulizada com uma
solução metanólica (2 mg.mL-1) do radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazila (DPPH), um radical
estável, que permite detectar substâncias com atividade antioxidante.
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 44
O cromatograma obtido foi observado sob luz ultravioleta de comprimentos de onda
254 nm e 366 nm, e fotografado em câmera fotográfica Epson.
3.3.4.2 Atividade Anticolinesterásica
A determinação da Atividade Anticolinesterásica também foi realizada na Seção de
Fisiologia e Bioquímica de Plantas (IBt/SP). As amostras submetidas a este teste estão
descriminadas no ítem 3.3 ESTUDOS QUÍMICOS E ENSAIOS.
Esse ensaio ocorreu em placa cromatográfica (20x20cm, sílica gel 60, Merck), na
qual os extratos na concentração de 25 µg/µl de CHCl3/MeOH/H2O (64:36:8, v/v/v) foram
aplicados e eluídos com a mesma mistura de solventes, clorofórmio: metanol: água (64:36:8,
v/v/v). Após o desenvolvimento da cromatografia, a placa foi secada e borrifada com a
solução da enzima acetilcolinesterase (6,66 U) acrescida de albumina bovina fração V (0,1%)
e o solvente evaporado novamente. A placa cromatográfica foi incubada em uma câmara
úmida fechada, a 37°C, por 20 minutos e em seguida, borrifada com uma mistura das
soluções: etanólica de acetato de 1-naftila (5 mL; 0,25%) e aquosa do sal Fast Blue B (20 mL;
0,25%) (MARSTON et al., 2002).
Neste procedimento de derivatização, o acetato de 1-naftila e a solução de sal Fast
Blue B colorem a placa cromatográfica com cor roxa em 2 minutos; as substâncias com ação
antienzimática aparecem como halos brancos, sobre este fundo púrpura (MARSTON et al.,
2002).
O cromatograma obtido foi observado sob luz Ultravioleta de comprimentos de onda
254 nm e 366 nm, e fotografado em câmera fotográfica Epson.
3.3.4.3 Atividade Hemolítica
Esse teste de ação hemolítica foi realizado no Instituto Butantan/SP, segundo o
método descrito por Rangel et al. (1997) e que consiste no seguinte processo: uma alíquota de
sangue obtido de camundongo (Biotério Central do Instituto Butantan) foi colocada em um
béquer contendo volume aproximadamente 30 vezes maior de solução fisiológica Krebs-
Henseleit (NaCl 113mM; KH2PO4 1,2mM; KCl 4mM; MgSO4.7H2O 1,2mM; CaCl2 2,5mM;
NaHCO3 25mM; C6H12O6 11,1mM). O béquer foi mantido sob agitação constante, por 15
minutos sendo seu conteúdo, a seguir, centrifugado 3 vezes, por 3 minutos, a 3000 rpm, para
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 45
lavar os eritrócitos de componentes plasmáticos; com o centrifugado, foi preparada uma
suspensão de eritrócitos (SE) a 0,5 % (V/V), em solução fisiológica de Krebs-Henseleit.
Extratos das amostras LFA1, LFA2, LFA3 – LFB3 – LM1 (descriminadas no ítem
3.3) diluídos em solução fisiológica de Krebs-Henseleit foram colocados em tubos eppendorf
e sobre eles foram adicionados 500 µL de SE a 0,5 %. Como controle negativo foi utilizada
solução fisiológica e como controle positivo, o detergente Triton X-100 a 1% (hemólise total).
Após duas horas de incubação à temperatura ambiente, sob agitação constante, as amostras
foram centrifugadas a 3000 rpm, por 5 min. Os sobrenadantes obtidos foram transferidos para
placa de ELISA e a leitura da atividade hemolítica efetuada em comprimento de onda de 540
nm.
3.3.5 Prospecção de Cianotoxinas
3.3.5.1 Teste para detecção de -N-metilamino-L-alanina (BMAA)
Essa análise foi realizada segundo o método descrito por Vega e Bell (1967), na
fração (1) (em ácido acético 0,1 M), obtida no processo de fracionamento em coluna de sílica
octadecilsilanizada, descrito no ítem 3.3.2. Parte do material liofilizado foi pesado, suspenso
em água deionizada (100 µg/µl), aplicado em placas cromatográficas (20x20cm, sílica gel 60,
Merck) e comparados com o padrão β-N-metilamino-L-alanina. Foram utilizadas como fases
móveis, clorofórmio: metanol: água (64:36:8, v/v/v) e butanol: ácido acético: água (5:2:3,
v/v/v). Para cada fase móvel referida foi desenvolvida uma placa, a qual foi submetida ao
processo cromatográfico por 3 vezes.
Após o desenvolvimento, as cromatoplacas foram secadas em corrente de ar,
nebulizadas com o agente derivatizante ninidrina e em seguida aquecidas a 110°C. Manchas
de β-N-metilamino-L-alanina, após derivatização, adquirem a cor roxa (MERCK, 1971).
As cromatoplacas obtidas por esse processo foram devidamente fotografadas.
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 46
3.3.5.2 Análise de microcistinas
A fração (3) das amostras, descrita no ítem 3.3.2., foi analisada quanto à presença de
microcistinas por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), segundo método de Harada
et al. (1999). Para tanto, a quantidade de 2,5 mg da fração (3), ressuspenso em água
deionizada e filtrado em membranas PVDF (13mm x 0,2µm) foi aplicado em duplicata ao
cromatógrafo, sob as seguintes condições:
• Cromatógrafo líquido Dionex, equipado com bomba automática P680 HPLC;
• Coluna CN analítica;
• Detector UV-PDA; Comprimentos de onda fixos: λ 220 e 238nm;
• Injetor automático;
• Software Chromeleon® Chromatography Management System, versão 6.6, para a
geração e análise dos cromatogramas;
• Fases móveis - Solvente A: ácido trifluoracético (TFA) 0,1%;
Solvente B: acetonitrila (ACN) / TFA 0,1%;
• Gradiente: 5 a 95% de B em 60 min;
• Fluxo: 1 mL.min-1.
Cada uma das substâncias (expressas por picos, nos cromatogramas) teve seu espectro
UV comparado aos espectros UV da Microcistina-LR (padrão).
Um resumo das diferentes etapas desenvolvidas na pesquisa de metabólitos
secundários de Cianobactérias, pode ser visto na Figura 6.
3.4 NORMALIZAÇÃO DO TEXTO
Para normalização do texto, disposição de figuras e tabelas, bem como referências
bibliográficas, foram utilizadas as recomendações da Associação Brasileira de Normas
Técnicas (ABNT), referente ao ano de 2009.
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 47
Figura 6 – Esquema das principais etapas do estudo químico. Obtenção da biomassa,extração, testes, pré-purificação e fracionamento para pesquisa de cianotoxinas.
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 48
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
As florações de Cianobactérias estudadas na ETE/Juazeiro do Norte, consistiram em
florações mistas e compostas principalmente pelas espécies: Microcystis aeruginosa
(Kützing) Kützing 1846, Microcystis protocystis Crow 1923, Sphaerocavum brasiliensis
Azevedo et Sant’Anna 2003 e Radiocystis fernandoi Komárek & Komárková-Legnerová
1993. Deve ser destacada a ocorrência de Planktothrix isothrix (Skuja) Komárek et
Komárková 2004, por ter sido esta, a espécie responsável pela caracterização da floração
(Figura 7), ou seja, pelo aspecto macroscópico e denso que se formou ao longo da superfície,
pois esteve presente em alta concentração, predominando em todo período amostrado nas 3
(três) lagoas estudadas.
Figura 7 – (A) Aspecto geral das Lagoas de Estabilização – ETE/JN/CE; (B) LagoaFacultativa A; (C) Lagoa Facultativa B e (D) Lagoa de Maturação. [Arquivopessoal].
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 49
Planktothrix isothrix consiste na espécie de maior importância para as Lagoas de
Estabilização, tanto pela distribuição espacial, como pela frequência de ocorrência e blooms
de organismos, que se trata da multiplicação em massa, fato que é contínuo no referido
ambiente. Sua classificação e descrição segundo Komárek e Anagnostidis (2005) é a seguinte:
Cyanobacteria
Classe Cyanophyceae
Ordem Oscillatoriales
Família Phormidiaceae
Subfamília Phormidioideae
Gênero Planktothrix
4.1 DESCRIÇÃO DA ESPÉCIE
Tricomas verde-azulados, verde acinzentados, escuros em massas, de livre flutuação,
solitários, frequentemente formando florações na água, retos ou algumas vezes curvos,
geralmente muito longos (até 3,5 mm), (5) 5,5-9,7 (10) µm de diâmetro, lentamente móveis
com oscilação peculiar, sem rotação, não constritos, com grânulos proeminentes, cilíndricos e
não atenuados nas extremidades (Figura 8).
Figura 8 – Planktothrix isothrix: (A) Dezenas de tricomas envolto a uma colônia deMicrocystis protocystis; (B) Tricomas envolto a uma colônia M. aeruginosa; (C)Tricomas em massa (aspecto escuro) e (D) Detalhe da morfologia dos tricomas.(A e C: Aumento de 100 X; B e D: Aumento de 400 X). [Arquivo pessoal].
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 50
As condições ambientais na ETE/JN são bastante favoráveis ao crescimento de
Cianobactérias. Nesse ambiente, a duração e a intensidade do fotoperíodo, bem como a
temperatura, que é em geral elevada, não apresentam grandes flutuações durante o ano. Esses
fatores complementados pelo pH que é alcalino (8-9) e uma grande carga de nutrientes,
principalmente nitrogênio e fósforo, que se encontram constantemente disponíveis, aceleram
o desenvolvimento desse grupo, com ocorrência de uma pequena diversidade, no entanto,
expressa em grandes concentrações.
A temperatura registrada na ETE/JN durante o presente estudo, ou seja, de fevereiro
a junho/2010, apresentou uma faixa de variação com valores entre 27ºC (mínima) e 33ºC
(máxima), sendo a média de 30,4ºC. Segundo Fernandes et. al. (2009), as elevadas
temperaturas, além de promoverem diretamente as florações de Cianobactérias, também
podem apresentar efeito indireto, promovendo estratificação térmica e tornando a coluna
d’água mais estável, estimulando a formação de floração.
Classicamente, a resposta da comunidade planctônica durante o processo de
eutrofização é uma diminuição de sua diversidade de espécies. Nestes ambientes, nota-se que
o fitoplâncton apresenta uma dominância crescente de espécies de Cianobactérias (FERRÃO-
FILHO, 2009). Fato verificado no presente estudo, no qual Cianobactérias ocorrem como
principal grupo, tanto em diversidade, quanto em concentração celular.
De acordo com a Agência Nacional de Águas – ANA (2009), a região Semi-Árida é
caracterizada por reservas insuficientes de água em seus mananciais, apresenta temperaturas
elevadas durante todo o ano, baixas amplitudes térmicas e forte insolação. Já os totais
pluviométricos, irregulares e inferiores a 900 mm, são normalmente superados por elevados
índices de evapotranspiração, resultando em taxas negativas no balanço hídrico. Dessa forma,
a necessidade de monitoramento para manutenção da disponibilidade hídrica dos mananciais,
que por sua vez já é preocupante, torna-se ainda mais urgente, frente aos riscos de possíveis
florescimentos de Cianobactérias, que na ausência de um controle efetivo desses mananciais,
podem vir a ocorrer.
Segundo dados disponibilizados pela Fundação Cearense de Meteorologia e
Recursos Hídricos – FUNCEME (2010), a média histórica de precipitação referente aos
últimos 30 anos (1980-2009), caracteriza o município de Juazeiro do Norte/CE onde está
localizada a Estação de Tratamento de Esgoto - ETE, com um período chuvoso que inicia no
mês de fevereiro e se estende até o mês de maio. Sendo que, as chuvas torrenciais foram
concentradas nos meses de fevereiro e março, que registraram médias de precipitação acima
de 200 mm. Em relação ao período de coletas, a maior precipitação foi registrada para o mês
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 51
de abril, com 168,5 mm, tendo sido esse valor muito próximo ao da média histórica para o
mesmo mês. Vale ressaltar que o mês de junho, não considerado dentro do período chuvoso,
registrou um valor de precipitação bem maior que o verificado na média histórica (Figura 9).
Figura 9 – Média mensal histórica de precipitação no município de Juazeiro do Norte/CE paraum período de 30 anos (1980 a 2009) e registros da precipitação mensal durante operíodo de coletas. Fonte: FUNCEME, 2010.
A composição de Cianobactérias nas Lagoas de Estabilização que compõem a
ETE/JN mostrou-se constituída por 14 espécies. Sendo Synechococcus sp. de ocorrência
exclusiva à Lagoa Facultativa A; Anabaena sp. à Lagoa Facultativa B, e as espécies
Aphanocapsa delicatissima, Chroococcus sp. e Cianofícea cocóide exclusivas à Lagoa de
Maturação. Já a ocorrência de 4 (quatro) espécies, Aphanocapsa sp., Aphanocapsa incerta,
Chlorococcum sp. e Oscillatoria sp. foram registradas como sendo comuns às duas Lagoas,
Facultativa B e de Maturação.
No entanto, 5 (cinco) espécies: Microcystis aeruginosa, Microcystis protocystis,
Sphaerocavum brasiliensis e Radiocystis fernandoi apresentaram ocorrência comum a todas
as Lagoas e foram consideradas muito freqüentes em relação ao período de amostragens, com
frequência de ocorrência igual a 100%, com exceção apenas para a última espécie que teve
80% de ocorrência. A frequência de todas as espécies identificadas pode ser verificada na
Figura 10.
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 52
Figura 10 – Frequência de ocorrência das espécies identificadas em relação ao período deamostragem na Estação de Tratamento de Esgoto de Juazeiro do Norte/CE.
A espécie Planktothrix isothrix em função da expressiva quantidade de tricomas é
responsável pelo aspecto esverdeado que é formado na superfície das lagoas de estabilização
da ETE, sendo esta a principal espécie da floração. A abundância relativa de Planktothrix
isothrix em relação às demais espécies de Cianobactérias identificadas para o referido
ambiente, mostra sua dominância em todas as lagoas analisadas e em todo o período de
amostragens (Figura 11).
Figura 11 – Abundância relativa de Planktothrix isothrix em relação às demais espécies deCianobactérias identificadas durante o período de amostragem nas Lagoas:Facultativa A, Facultativa B e de Maturação, ETE/Juazeiro do Norte-CE.
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 53
Nas regiões tropicais e subtropicais, os principais gêneros envolvidos na produção de
toxinas são Microcystis, Radiocystis, Planktothrix, Anabaena, Aphanizomenon e
Cylindrospermopsis (SANT’ANNA, GENTIL e SILVA, 2006).
Algumas espécies de Planktothrix têm uma capacidade notável para a regulação
sensitiva da flutuabilidade, sendo verificado para estas, um mecanismo poderoso de adaptação
cromática durante a estratificação do gradiente de luz no fundo. Essas algas também toleram
arrastamento holomítico e podem até mesmo crescer sob estas circunstâncias. Estas são
características estratégicas em resposta a pequenas alterações no campo de luz ou na
disponibilidade de outros recursos essenciais (REYNOLDS et al., 2002). Tais informações
podem justificar o sucesso no desenvolvimento de Planktothrix sobre outras espécies de
Cianobactérias.
Sant’Anna et al., (2008), verificaram através de uma revisão de espécies tóxicas de
Cianobactérias no Brasil que, Planktothrix isothrix apresenta ocorrência tóxica restrita à
região subtropical do Brasil. Essa informação é de grande relevância para o presente estudo, o
qual registra essa espécie como tóxica em região de clima tropical semi-árido, e outro fator
importante, envolvida na formação de blooms.
A riqueza específica não apresentou grande variabilidade em relação às diferentes
Lagoas de Estabilização e ao período amostrado. Tendo sido verificada uma variação mais
evidente no número de espécies, apenas entre as Lagoas Facultativa A e Facultativa B, nos
meses de fevereiro e março (Figura 12).
Figura 12 – Número de espécies identificadas durante o período de amostragem para asLagoas: Facultativa A, Facultativa B e de Maturação, ETE/Juazeiro do Norte-CE.
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 54
Os índices de diversidade específica aplicados aos resultados obtidos, de um modo
geral, classificaram o grupo das Cianobactérias das três Lagoas de Estabilização analisadas
(Facultativa A, Facultativa B e de Maturação) como de diversidade baixa, onde a maioria dos
índices H’ foram < 2,0 ≥ 1,0. Já para a equitabilidade, esta registrou valores variáveis entre
0,437 e 0,779.
Em relação à Lagoa Facultativa A (Figura 13), os meses de maio e junho, registraram
valores de diversidade < 1, com 0,997 e 0,896, respectivamente. Desse modo com diversidade
considerada muito baixa. Já para a Lagoa Facultativa B (Figura 14) e de Maturação (Figura
15), os menores índices de diversidade e equitabilidade foram registrados no mês de março,
com H’ 0,910 / J 0,437 e H’ 0,990 / J 0,509, respectivamente. Portanto, sendo esses valores
também de diversidade muito baixa. Essa condição foi verificada quando também se
constatou uma maior dominância de Planktothrix isothrix.
Tal dominância para essa espécie também foi registrada anteriormente no mesmo
ambiente por Aquino, Lacerda e Freitas (2010), que em estudos nos anos de 2005 a 2008,
registraram sua ocorrência como principal característica da floração em todo período
analisado.
Fatores como urbanização, agricultura e desenvolvimento industrial têm sido as
principais causas para o aumento das concentrações de nitrogênio (N) e fósforo (P) nos corpos
d’águas. Sendo importante ressaltar que a quantidade, a proporção e a composição química
das fontes destes nutrientes podem influenciar a composição, a magnitude e a duração e das
florações (PAERL, 2008). De acordo com Carmichael (1992), a eutrofização crescente de
nossas fontes de água doce e a consequente diminuição da qualidade da água têm gerado
florações de Cianobactérias que estão se tornando cada mais comum em qualquer área.
Em ambientes hipereutróficos é comum a ocorrência de uma diversidade baixa ou
muito baixa de Cianobactérias, como foi verificada nas Lagoas de Estabilização da
ETE/Juazeiro do Norte, CE. Segundo Paerl (2008), a entrada de nutrientes pode interagir
sinérgica ou antagonicamente com outros fatores como, sedimentação, descarga de água e
estabilidade da coluna d’água, determinando a floração.
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 55
Figura 13 – Relação entre o índice de Shannon e Equitabilidade durante o período deamostragem para a Lagoa Facultativa A, ETE/Juazeiro do Norte-CE.
Figura 14 – Relação entre o índice de Shannon e Equitabilidade durante o período deamostragem para a Lagoa Facultativa B, ETE/Juazeiro do Norte-CE.
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 56
Figura 15 – Relação entre o índice de Shannon e Equitabilidade durante o período deamostragem para a Lagoa de Maturação, ETE/Juazeiro do Norte-CE.
4.2 ENSAIO DE TOXICIDADE EM CAMUNDONGOS (intraperitonial – i.p.)
Os extratos de Cianobactérias provenientes de 10 amostras coletadas nas lagoas de
estabilização: Lagoa Facultativa A – LFA (3), Lagoa Facultativa B – LFB (3), Lagoa de
Maturação – LM (3) e Rio Salgado (1), foram administrados por via intraperitoneal em grupos
de animais machos “Swiss-Webster”, sendo os efeitos avaliados.
Os bioensaios em camundongos foram de grande importância para obtenção de
informações preliminares sobre a toxicidade das amostras, pois a partir dos efeitos observados
nos animais testados e com base no conhecimento dos mecanismos de ação das toxinas
conhecidas, foi possível direcionar o estudo químico. De acordo com Carmichael (1992), o
bioensaio em camundongo foi o primeiro teste típico de toxicidade na seleção de material de
blooms de água e culturas de laboratório ou extratos de células. Suas vantagens são a facilidade
de uso, assumindo que camundongos de análise laboratorial são prontamente disponíveis. O
método é barato e pode detectar, dentro de poucas horas, as características qualitativas e
quantitativas da toxina presente. A partir dos sinais de envenenamento, é possível distinguir
hepatotoxinas de neurotoxinas e até mesmo os diferentes tipos de neurotoxinas.
A pesquisa de cianotoxinas foi conduzida à investigação tanto da possível presença
de uma neurotoxina, ou de uma hepatotoxina, assumindo que a espécie predominante nas
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 57
amostras, Planktothrix isothrix, é produtora tanto de saxitoxinas, quanto de microcistinas,
ambas pertencentes às classes de toxinas citadas, respectivamente.
Mediante a resposta dos grupos testados foi suprimida a necessidade de investigação
química para uma determinada classe de toxina, nesse caso as neurotoxinas, em função dos
sintomas que causam e, sobretudo, pelo tempo de sobrevida que consiste em poucos minutos
(KUIPER-GOODMAN et al. 1999). Nesse caso, passou-se a investigar a possibilidade de
uma outra classe de toxinas, desta vez as hepatotoxinas, mais especificamente a do tipo
microcistina. No entanto, alguns dos sinais de toxicidade que foram sendo expressos pelos
grupos de animais injetados, e principalmente a ausência de lesão hemorrágica no fígado
(CARMICHAEL, 1992; SALOMON et al., 1996; WHITTON e POTTS, 2000), atenuaram a
probabilidade de sua ocorrência nas amostras.
Porém, durante o desenvolvimento dos ensaios de toxicidade, vários sintomas de
alterações observados chamaram a atenção e o fato da morte de alguns animais, fizeram
realizar a pesquisa química da hepatotoxina denominada microcistina, por Cromatografia
Líquida de Alta Eficiência (CLAE), para fins de confirmação de não estar associada aos
efeitos observados e assim, evitar possíveis resultados dúbeis.
A partir desses testes de toxicidade em camundongos foram observados sinais de
alterações crônicos e agudos. Das 10 (dez) amostras testadas, 3 destas, ou seja, 30%
apresentaram toxicidade aguda letal. As demais amostras administradas demonstraram a
presença de substâncias tóxicas, com ação temporária, pois vários sintomas de alterações
foram verificados por algumas horas após a injeção do extrato, demonstrando um efeito
tóxico, mas que foi sendo paulatinamente superado horas após a exposição ao material
administrado.
Decorridos 7 (sete) dias da observação dos grupos de animais testados, estes formam
submetidos à eutanásia para avaliação de possíveis alterações macroscópicas nos órgãos. Essa
etapa resultou em importantes achados post-mortem como: fígado com manchas brancas,
fígado com os lobos (parcialmente e/ou totalmente aderidos), acúmulo de material esverdeado
no pâncreas e diafragma aderido ao fígado. Para os indivíduos controle não foi apresentado
nenhum sinal de alteração e não houve nenhuma morte.
Os resultados evidenciados nos achados post-mortem revelam a importância da
avaliação dos efeitos crônicos que também causam sérias desordens estruturais no organismo,
como visto nesse estudo, com lesões que podem comprometer o funcionamento de órgãos
vitais, como o fígado. Os sinais de intoxicação e achados post-mortem estão listados na
Tabela 3. De acordo com Kuiper-Goodman et al. (1999), casos de toxicidade tem mostrado a
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 58
partir de exames post-mortem, evidências da ingestão de Cianobactérias, bem como lesão
tecidual característica no fígado.
A importância de estudos toxicológicos experimentais é relevante, no entanto, a
grande maioria dos dados sobre cianotoxinas ainda é obtida em estudos de intoxicação aguda,
enquanto que a intoxicação crônica e subletal é, certamente, mais freqüente, representando
sérios riscos à população e deveria, portanto, merecer uma maior atenção das pesquisas
científicas neste campo (SOARES, 2009).
Todos os efeitos tóxicos verificados nos bioensaios, as alterações imediatas
apresentadas por grande parte dos grupos de animais avaliados, os efeitos crônicos evidentes
nos importantes achados post-mortem e os efeitos agudos letais, mostraram o perigo de
exposição às cianobactérias da ETE/JN, que podem constituir danos irreparáveis à saúde
pública. Segundo Kuroda et al. (2007), o uso dos bioensaios, possibilitam a aquisição de
importantes informações sobre a toxicidade de uma amostra, permitindo um maior
entendimento do seu impacto no ambiente natural destinado ou não ao abastecimento de água,
além dos mecanismos de ação nos organismos.
Tabela 3 – Sinais de intoxicação e alterações macroscópicas apresentadas pelos camundongosapós administração por via intraperitoneal dos extratos em ácido acético dasamostras de floração das lagoas facultativa A, facultativa B e de Maturação.
Amostra/Data Sinais de intoxicaçãoTempo
decorridoaté a morte
Principais achadospost-mortem
Lagoa fac. A-
29/04/10
Respiração ofegante,contração abdominal,
dificuldade de locomoção(paralisia do trem
posterior), prostração epiloereção
Eutanásiaapós
7 dias deobservação
Ausência de alteraçõesmacroscópicassignificativas
Lagoa fac. A-
17/05/10
Respiração ofegante,ausência de coordenação
motora na locomoção,prostração, coceira
constante
Eutanásiaapós
7 dias deobservação
Fígado com manchasbrancas (n=1), (Figura16)
Fígado com os lobossuperior e intermediárioaderidos (n=1), (Figura17)
continua...
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 59
Amostra/Data Sinais de intoxicaçãoTempo
decorridoaté a morte
Principais achadospost-mortem
Lagoa fac. A-
01/06/10
Respiração ofegante,ausência de coordenação
motora na locomoção,paralisia do trem posterior,
prostração,coceira constante
Eutanásiaapós
7 dias deobservação
Ausência de alteraçõesmacroscópicassignificativas
Lagoa fac. B-
29/04/10
Respiração ofegante,piloereção, prostração.
Paralisia do trem posterior(apenas n=1)
Eutanásiaapós
7 dias deobservação
Acúmulo de materialesverdeado no pâncreas(n=1), (Figura 18)
Lagoa fac. B-
17/05/10Diarréia
Eutanásiaapós
7 dias deobservação
Ausência de alteraçõesmacroscópicassignificativas
Lagoa fac. B-
01/06/10
Respiração ofegante,espasmo, piloereção,
dificuldade de locomoção(paralisia do tremposterior), coceira
moderada e prostração.Sintoma de contração
abdominal (apenas n=1).
Morte apósadministração
do extrato(n=1)
Eutanásiaapós
7 dias deobservação
(n=2)
Ausência de alteraçõesmacroscópicassignificativas.
Ausência de alteraçõesmacroscópicassignificativas.
Lagoa de
Maturação
29/04/10
Respiração ofegante,contração abdominal,
ausência de coordenaçãomotora na locomoção,
paralisia do trem posteriore prostração.
Eutanásiaapós
7 dias deobservação
Fígado com manchasbrancas (n=1), (Figura 19)
Diafragma aderido aofígado (n=1), (Figura
20).
Lagoa de
Maturação
17/05/10
Respiração ofegante,espasmo, coceira
moderada, ausência decoordenação motora nalocomoção, paralisia do
trem posterior, prostração(grupo mais debilitado) e
piloereção.
Morte em até24h após
administraçãodo extrato
(n=3)
Ausência de alteraçõesmacroscópicassignificativas.
continua...
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 60
Amostra/Data Sinais de intoxicaçãoTempo
decorridoaté a morte
Principais achadospost-mortem
Lagoa de
Maturação
01/06/10Sem alterações
clínicas significativas
Morte em até18h após
administraçãodo extrato
(n=2)
Eutanásiaapós
7 dias deobservação
(n=1)
Ausência de alteraçõesmacroscópicassignificativas.
Rio
01/06/10Diarréia
Eutanásiaapós
7 dias deobservação
Lobos do fígadototalmente aderidos
(n=1);Lobos do fígado
parcialmente aderidos(n=1), (Figura 21).
Figura 16 – Achados post-mortem. A e B: animal com manchas brancas no fígado (emdetalhe) resultante da administração do extrato LFA (17 de maio, 2010).[Arquivo pessoal].
conclusão.
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 61
Figura 17 – Achados post-mortem. Animal apresentando fígado com os lobos, superior eintermediário, aderidos (ver detalhe) resultante da administração do extratoLFA (17 de maio, 2010). [Arquivo pessoal].
Figura 18 – Achados post-mortem. Animal com acúmulo de material esverdeado no pâncreas(ver detalhe) resultante da administração do extrato LFB (29 de abril, 2010).[Arquivo pessoal].
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 62
Figura 19 – Achados post-mortem. A e B: Animal com manchas brancas no fígado (verdetalhes) resultante da administração do extrato LM (29 de abril, 2010).[Arquivo pessoal].
Figura 20 – Achados post-mortem. A: Animal com diafragma aderido ao fígado (ver detalhe)resultante da administração do extrato LM (29 de abril, 2010); B: Controle.[Arquivo pessoal].
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 63
Figura 21 – Achados post-mortem. A: Animal com os lobos do fígado totalmente aderidos eB: Animal com os lobos do fígado parcialmente aderidos (ver detalhes)resultante da administração do extrato referente ao Rio (01 de junho, 2010).[Arquivo pessoal].
Nos testes de avaliação da toxicidade das amostras em camundongos, também foram
considerados os registros de peso corpóreo dos animais, antes e após o período de exposição
às soluções contendo os extratos algáceos (Tabela 4).
Assim, os animais que não apresentaram toxicidade aguda letal e que, portanto,
permaneceram em observação por 7 dias foram avaliados quanto ao ganho ou perda de peso.
Sendo que, o registro de pesos dos animais referentes ao intervalo compreendido pelo teste,
início e fim, permitiu a avaliação de ganho ou perda, quando comparados à média de ganho
de peso relativa aos animais controle, que não apresentaram alterações.
Dessa forma, observou-se que dentre o total de 24 animais injetados, que não
apresentaram toxicidade aguda letal, 75% (18) apresentou ganho de peso abaixo do valor da
média registrada para animais controle, que foi 6,69g de ganho de peso corpóreo após os 7
(sete) dias do ensaio. Já 8% (2) dos animais testados apresentaram perda de peso e apenas
17% (4) apresentaram valores de ganho de peso um pouco acima da média controle.
Dentre os 18 animais que apresentaram ganho de peso abaixo do valor da média, é
importante destacar que para 9 destes, foram registrados valores menores que 50% em relação
à média de ganho de peso controle. Já para 3 animais, um pertencente ao grupo LM1, um
pertencente ao grupo RIO e outro ao grupo LFA1, vale ressaltar que quase não apresentaram
ganho de peso, com valores de 11%, 8% e 5%, respectivamente, sobre a média controle. Os
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 64
outros 6 animais apresentaram valores variáveis acima de 50%, considerando a média
controle, porém todos ficaram situados abaixo da média.
Em relação ao registro de perda de peso, verificou-se esse resultado para 2 (dois)
animais do mesmo grupo (LM1), considerando o peso inicial e o peso final durante o ensaio.
É importante salientar que dentre os 3 animais testados desse grupo LM1, todos apresentaram
alterações quanto ao peso corpóreo, pois 2 destes perderam peso e 1 praticamente não obteve
ganho, registrou apenas 11% em relação à média controle. Esse dado chama atenção, uma vez
que os grupos LM2 e LM3, animais testados com amostras do mesmo ambiente, Lagoa de
Maturação, apresentaram toxicidade aguda letal, com n=3 e n=2, respectivamente. Assim,
verificou-se que o grupo LM1 apesar de não haver mostrado toxicidade aguda letal,
demonstrou importantes alterações evidenciadas no peso corpóreo (n=3).
Os 17% mencionados com relação aos animais que apresentaram valores de ganho
de peso um pouco acima da média, correspondem apenas a 4 (quatro) dentre a totalidade
testada. Constatando com isso que, os extratos algáceos das diferentes Lagoas de
Estabilização administrados causaram importantes alterações no trato alimentar dos animais,
pois, em todos os grupos testados houve registro, de pelo menos 1 (um) animal, com baixo ou
muito baixo ganho de peso, ou seja, com valores distantes da média de ganho de peso
controle.
Tabela 4 – Registros de peso corpóreo dos animais testados, antes e após o período deexposição aos extratos algáceos.
Pesos
Grupos
Peso doanimal (g)
(antes do teste)
Pesomédio
(g)
DesvioPadrão
Peso doanimal (g)
(7 dias após oteste)
Pesomédio
(g)
DesvioPadrão
LFA-1
(Abril)
26,53
23,2
22,72
24,15 2,075
29,59
27,54
23,07
26,73 3,334
LFA-2
(Maio)
17
15,4
16,22
16,21 0,800
23,3
18,24
24
21,85 3,143
LFA-3
(Junho)
17,4
16,4
16,57
16,79 0,535
25
23,9
2123,3 2,066
continua...
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 65
Pesos
Grupos
Peso doanimal (g)
(antes do teste)
Pesomédio
(g)
DesvioPadrão
Peso doanimal (g)
(7 dias após oteste)
Pesomédio
(g)
DesvioPadrão
LFB-1(Abril)
18,7925,1425,3
23,08 3,713
26,0229
27,0127,34 1,518
LFB-2
(Maio)
18,12
19,53
19,73
19,13 0,878
21,8
25,5
22,4
23,23 1,986
LFB-3
(Junho)25,52
2525,26 0,368
27,6
30,429 1,980
LM-1
(Abril)
21,65
19,43
22,55
21,21 1,60620
18,45
23,29
20,58 2,472
LM-3
(Junho)18,6 - - 23,6 - -
Rio
(Junho)
18,6
19
19,55
19,05 0,477
21,3
23
20,1
21,47 1,457
Controle Peso médio antes do teste (g):
18,22
Peso médio 7 dias após o teste (g):
24,91
4. 3 PROSPECÇÃO DE SUBSTÂNCIAS BIOATIVAS
4.3.1 Atividade Antioxidante
Todos os extratos representativos das Lagoas de Estabilização apresentaram
atividade antioxidante: a amostra LFA3 mostrou forte capacidade antioxidante e as amostras
LFA2, LFB2, LFB3, LM2 e RIO, atividade média. Esse resultado pode ser observado na
conclusão.
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 66
Figura 22 e os Rfs das manchas que apresentaram resultado positivo quanto a essa atividade
estão compilados na Tabela 5.
Substâncias que apresentam essa atividade aparecem como manchas amareladas
sobre um fundo violeta (HOSTETTMANN et al., 2003). A mudança de coloração da solução
de DPPH do violeta para o amarelo ocorre devido à transferência de elétrons ou átomos de
hidrogênios de substâncias antioxidantes para o radical livre, fazendo com que ele se torne
estável (SOUZA et al., 2007).
(a)
(b) (c)
Figura 22 – (a): Cromatograma em placa de gel de sílica 60, Merck, dos extratos dasbiomassas coletadas respectivamente nas Lagoas LFA1, LFA2, LFA3, LFB1,LFB2, LFB3, LM1, LM2 e LM3. Fase móvel: clorofórmio: metanol: água(64:36:8, v/v/v). Derivatizante: solução metanólica (2 mg.mL-1) do radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazila (DPPH). As manchas amareladas indicam assubstâncias com atividade antioxidante; (b) e (c): Cromatograma observadosob luz ultravioleta, de comprimentos de onda 254 nm e 366 nm,respectivamente.
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 67
Tabela 5 – Registro da atividade antioxidante detectada por amostra e os seus respectivosíndices de retenção (Rf).
Amostras Atividade Rf (cm)
LFA1 * 0,19
LFA2 ** 0,19
LFA3 *** 0,19
LFB1 * 0,19
LFB2 ** 0,19
LFB3 ** 0,18
LM1 * 0,20
LM2 ** 0,17
LM3 * 0,19
RIO ** 0,14
Legenda - * = Atividade fraca; ** = Atividade média; *** = Atividade forte.
De acordo com FINKEL e HOLBROOK (2000), espécies reativas do oxigênio
(EROS) abrangem uma variedade de espécies químicas, incluindo superóxido (O2-), oxigênio
singlete (1O2), radical hidroxila (OH-) e o peróxido de hidrogênio (H2O2). Estas várias
espécies de radicais livres podem ser geradas de forma exógena ou produzidas
intracelularmente a partir de várias fontes diferentes. A geração de EROS, em certos limites, é
essencial para manter a homeostase. No entanto, em certas situações de estresse metabólico, o
aumento nas concentrações intracelulares dos níveis de oxidantes tem dois efeitos
potencialmente importantes: danos para vários componentes das células, desencadeando a
ativação de rotas de sinalização específicas. Ambos os efeitos podem influenciar numerosos
processos celulares relacionados ao envelhecimento e desenvolvimento de doenças
relacionadas à idade (Figura 23).
Radicais livres associados ao estresse oxidativo estão envolvidos em vários
processos fisiopatológicos como, câncer, aterosclerose, artrite reumatóide, doenças auto-
imunes, etc (FERREIRA e MATSUBARA, 1997). Dessa forma, é de grande importância a
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 68
ação dos agentes antioxidantes que atuam para inibição e redução das lesões causadas pelos
radicais livres nas células (BIANCHI e ANTUNES, 1999).
Os antioxidantes naturais são bem indicados para atenuar os efeitos deletérios do
estresse oxidativo celular (NUNES et al., 2008). Assim, a utilização de fontes naturais pode
representar uma nova abordagem na inibição dos danos provocados pelo excesso de radicais
livres (BIANCHI e ANTUNES, 1999). Tais agentes naturais têm sido prioritariamente
recomendados para o alívio dos sinais e sintomas de doenças e, mesmo, para bloquear sua
evolução (FERREIRA e MATSUBARA, 1997).
Figura 23 – Diagrama das fontes de espécies reativas do oxigênio (EROS) e as respostascelulares (Modificado de FINKEL e HOLBROOK, 2000).
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 69
4.3.2 Atividade anticolinesterásica
Todos os extratos representativos das Lagoas de Estabilização: LFA1, LFA2, LFA3
– LFB1, LFB2, LFB3 – LM1, LM2, LM3, bem como o extrato referente ao Rio Salgado,
foram submetidos a ensaios para a determinação da presença de substâncias com ação
anticolinesterásica, sendo que quatro das dez amostras testadas apresentaram resultado
positivo. Com exceção da Lagoa Facultativa B, as demais lagoas avaliadas e o rio
apresentaram pelo menos uma amostra contendo substância com ação anticolinesterásica,
sendo que a Lagoa Facultativa A apresentou atividade em 2 (duas), dentre as 3 (três) amostras
analisadas (Figura 24).
De acordo com ZELÍK (2005), a exigência de novos inibidores da acetilcolinesterase
(AChE), conduz à uma seleção de fontes naturais, principalmente plantas superiores, ou à
modificação de estruturas químicas de inibidores conhecidos da AChE através de síntese
orgânica. Apenas poucos trabalhos foram centrados na triagem de microrganismos (Fungos e
Actinomicetos). E surpreendentemente, são escassas as publicações que tratam da triagem de
microorganismos autotróficos - Algas e Cianobactérias. Assim, esse autores na expectativa de
encontrar potenciais produtores de novos inibidores da AChE entre microrganismos
autotróficos, conduziram a pesquisa em cerca de 250 espécies de Algas e Cianobactérias.
Dentre os resultados para Cianobactérias, mostrou que algumas espécies de Nostoc
apresentaram atividade inibitória da AChE.
No Brasil, Dogo et al. (2010) em estudo com a Cianobactéria Geitlerinema
unigranulatum (Oscillatoriales), detectaram resultado positivo para a atividade
anticolinesterásica. Segundo esses autores, substâncias com ação anticolinesterásica elevam o
nível de acetilcolina no cérebro e são importantes no tratamento sintomático da doença de
Alzheimer (AD), uma doença neurodegenerativa caracterizada pela perda progressiva da
memória e funções cognitivas.
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 70
(a)
(b) (c)
Figura 24 – (a): Cromatograma em placa de gel de sílica 60, Merck, dos extratos dasbiomassas coletadas nas Lagoas LFA1, LFA2, LFA3, LFB1, LFB2, LFB3,LM1, LM2 e LM3. Fase móvel: clorofórmio: metanol: água (64:36:8, v/v/v).Revelador específico para inibidores de acetilcolinesterase. As manchascoincidentes com os halos de cor branca indicam inibição daacetilcolinesterase; (b) e (c): Cromatograma observado sob luz ultravioleta, decomprimentos de onda 254 nm e 366 nm, respectivamente.
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 71
4.3.3 Atividade hemolítica
Os extratos obtidos das biomassas coletadas nas Lagoas de Estabilização LFA1,
LFA2, LFA3 – LFB3 – LM1 foram submetidos à pesquisa da presença de substâncias com
atividade hemolítica, apresentando resultados negativos. A atividade hemolítica foi
inicialmente investigada em todas as amostras da Lagoa Facultativa A, e frente ao resultado
negativo apresentado, procedeu-se a pesquisa em apenas uma amostra das demais lagoas.
4.3.4 Teste para detecção de -N-metilamino-L-alanina (BMAA)
Todos os extratos das amostras das Lagoas de Estabilização: LFA1, LFA2, LFA3 –
LFB1, LFB2, LFB3 – LM1, LM2, LM3 (1 = mês de abril, 2 = maio e 3 = junho) foram
investigadas quanto à presença da neurotoxina β-N-metilamino-L-alanina (BMAA). A fração
1 (um) de cada uma das amostras, eluída em ácido acético 0,1 M, segundo especificado em
Material e Métodos (item 3.3.2) foi utilizada para essa análise; todas as amostras analisadas
apresentaram resultados positivos para a presença deste aminoácido (Figuras 25-27).
Figura 25 – Cromatograma em gel de sílica 60, Merck, dos extratos em ácido acético 0,1 Mliofilizados das amostras da Lagoa Facultativa A: FA1, FA2 e FA3. Fase móvel:clorofórmio: metanol: água (64:36:8, v/v/v). Agente derivatizante: ninidrina. Assetas apontam as manchas com Rf correspondente ao Rf do padrão de BMAA.
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 72
Figura 26 – Cromatograma em gel de sílica 60, Merck, dos extratos em ácido acético 0,1 Mliofilizados das amostras da Lagoa Facultativa B: FB1, FB2 e FB3. Fase móvel:butanol: ácido acético: água (5:2:3 v/v/v). Agente derivatizante: ninidrina. Assetas apontam as manchas com Rf correspondente ao Rf do padrão de BMAA.
Figura 27 – Cromatograma em gel de sílica 60, Merck, dos extratos em ácido acético 0,1 Mliofilizados das amostras da Lagoa de Maturação: M1, M2 e M3. Fase móvel:butanol: ácido acético: água (5:2:3 v/v/v). Agente derivatizante: ninidrina. Assetas apontam as manchas com Rf correspondente ao Rf do padrão de BMAA.
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 73
Cox et al. (2005), em estudos com representantes de Cianobactérias, verificaram que
a grande maioria destas produzem BMAA, incluindo representantes de todas as seções desse
grupo. No entanto, evidenciaram uma variação no teor de BMAA entre gêneros e espécies
analisadas. Tal variação sugere que a produção e o armazenamento de BMAA sejam uma
função dos estágios do ciclo de vida e/ou das condições do crescimento. Dentre essas
diferentes concentrações verificadas de BMAA entre as Cianobactérias testadas, Planktothrix
registrou uma das maiores faixas de concentração, com 318 µg/g de BMAA livre. Tal
informação é de grande importância para o presente trabalho, no qual se observou resultado
positivo para BMAA em todas as amostras contendo Planktothrix isothrix como espécie
dominante.
Outras pesquisas também recentes, revelaram a presença de BMAA em tecidos
cerebrais post-mortem de pacientes norte-americanos que morreram por doença de Alzheimeir
e esclerose lateral amiotrófica (ALS) esporádica. Essa constatação sugere uma possível
interação gene/ambiente, em que o BMAA desencadearia neurodegeneração em indivíduos
vulneráveis. Florações de Cianobactérias em corpos d’água marinhos e de água doce teriam
como consequência a entrada de BMAA nesses ambientes e na cadeia alimentar, constituindo
fontes potenciais da exposição humana ao BMAA (PABLO et al., 2009).
Outras pesquisas mais atuais demonstraram que Cianobactérias largamente
distribuídas em um ecossistema aquático temperado produzem BMAA e que este, é
bioacumulado em níveis tróficos superiores, como peixes e moluscos usados para o consumo
humano. Um fato importante a ser considerado foi a comprovação da acumulação de BMAA
em espécies de peixes fora da zona de radiação das Cianobactérias, sugerindo a transferência
do BMAA das Cianobactérias para os peixes que habitam as massas de água pelágicas e
bentônicas, através do Zooplâncton ou seja, sugerindo que o BMAA possa ser transferido,
pelo Zooplâncton, entre diferentes nichos de uma cadeia alimentar baseada em Cianobactérias
(JONASSON, 2010).
O BMAA foi descoberto na região tropical/subtropical de Guam, porém as notícias
da propapagação de BMAA em ambientes temperados sugerem que essa toxina possa estar
globalmente difundida o que representa potencial ameaça à saúde humana, se considerarmos
os riscos provenientes da ingestão de água contaminada e da bioacumulação em peixes e em
outros frutos do mar, integrantes dos alimentos humanos.
O rio Salgado é o receptor das águas das Lagoas de Estabilização de Tratamento de
Esgoto, que, comprovadamente, contém Cianobactérias produtoras de BMAA necessitando,
por isso, ser constantemente monitorado quanto á presença deste aminoácido, neurotoxina de
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 74
efeitos acumulativos e devastadores. Também devem ser observados os cuidados às diferentes
vias, pelas quais essa toxina pode chegar ao homem, que são a forma direta (consumo da água
contendo Cianobactérias que sintetizam essa toxina ou da própria cianotoxina) ou a forma
indireta (consumo de peixes que tenham bioacumulado essa toxina), dentre outras maneiras
que também devem ganhar a atenção.
4.3.5 Análise para detecção de microcistinas (CLAE)
Nas análises realizadas por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência nos extratos
das amostras provenientes das Lagoas LFA1, LFA2, LFA3 – LFB1, LFB2, LFB3 – LM1,
LM2, LM3 (1 = mês de abril, 2 = maio e 3 = junho), não foi detectada a presença da
hepatotoxina Microcistina-LR, por comparação com o padrão e com o espectro UV de
Microcistina-LR, que nas condições do experimento, mostrou Tr de 36,63 min. [pico 8 (oito)]
(Figuras 28 e 29). A fração 3 (três) de cada uma das amostras citadas, eluída em ácido acético
0,1 M / metanol 50:50 (v/v), segundo especificado em Material e Métodos (item 3.3.2), foi
utilizada para essa análise.
Entretanto, da observação do perfil cromatográfico dos extratos, foram notados picos
de ocorrência constante, ou seja, a ocorrência repetitiva de substâncias nos diferentes extratos,
as quais podem ser relacionadas a um determinado organismo (que as produz). Um exemplo
dessas substâncias é a representada pelo pico em destaque, mostrado nos cromatogramas
desenvolvidos com os extratos, de diferentes meses, das lagoas: Facultativa A, Facultativa B e
de Maturação, cujos espectros UV também são detalhados, como pode ser visto na Tabela 6.
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 75
Figura 28 – Cromatograma com o desenvolvimento do padrão de Microcistina-LR (pico 8,tempo de retenção: 36,63 min.). Condições da análise: Coluna CN analítica; Fasemóvel: A - ácido trifluoracético (TFA) 0,1% e B: acetonitrila (ACN) / TFA0,1%; Fluxo: 1 mL.min-1; Detecção: UV 238nm.
Figura 29 – Espectro de UV do pico 8 correspondente ao padrão de Microcistina-LR.
0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0-50
200
450
Sequencia curva analítica MC-LR #32 UV_VIS_2
mAU
min
1 -
Pea
k 3
- 4,
241
2 -
19,9
963
- 21
,419
4 -
24,9
79
5 -
29,2
88
6 -
33,3
697
- 34
,228
8 -
36,6
289
- 38
,721
10 -
39,
323
11 -
41,
061
12 -
44,
805
13 -
50,
179
14 -
52,
345
WVL:239 nm
... ..................
P A D R Ã O M C - L R
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 76
Tabela 6 – Perfil cromatográfico dos extratos das amostras provenientes das lagoas deestabilização: Lagoa Facultativa A, Lagoa Facultativa B e Lagoa de Maturação(ver em detalhe, o pico comum a todas as amostras e seu respectivo espectroUV).
AMOSTRASTr
Min.PERFIL CROMATOGRÁFICO
PERFIL 01
Lag. Fac. A(abril)
0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0-10
100
180
Sequencia curva analítica MC-LR #45 UV_VIS_2
mAU
min
1 - 2
,764
2 - 3
,004
3 - P
eak
7 - 3
,967
4 - P
eak
4 - 4
,642
5 - p
eak
5 - 5
,240
6 - P
eak
6 - 6
,199
7 - 7
,153
8 - 8
,539
9 - 9
,957
10 -
11,1
2411
- 12
,544
12 -
14,6
4813
- 17
,118
14 -
19,0
7615
- 20
,734
16 -
26,0
39
17 -
36,3
3418
- 38
,530
19 -
40,7
72
20 -
50,3
1421
- 52
,416
WVL:239 nm
... ..................
ESPECTROUV
(PICO 17)36,33
Peak #17 100% at 36.33 min
-10,0
70,0
200 250 300 350 400 450 500 595
%
nm
202.3
224.3275.5
50% at 36.25 min: 998.09 -50% at 36.43 min: 989.56
PERFIL 02
Lag. Fac. A(Maio)
0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0-10
100
180
Sequencia curva analítica MC-LR #46 UV_VIS_2
mAU
min
1 - P
eak
7 - 3
,969
2 - P
eak
4 - 4
,647
3 - p
eak
5 - 5
,249
4 - P
eak
6 - 6
,203
5 - 7
,172
6 - 8
,548
7 - 9
,976
8 - 1
1,14
99
- 12,
575
10 -
14,6
84
11 -
20,7
07
12 -
36,3
4713
- 38
,528
14 -
40,7
64
15 -
50,3
0416
- 52
,416
WVL:239 nm
... ..................
ESPECTROUV
(PICO 12)36,35
Peak #12 100% at 36.35 min
-10,0
70,0
200 250 300 350 400 450 500 595
%
nm
202.3
224.3275.4
50% at 36.26 min: 998.20 -50% at 36.44 min: 988.92
continua...
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 77
AMOSTRASTr
Min.PERFIL CROMATOGRÁFICO
PERFIL 03
Lag. Fac. B(abril)
0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0-10
100
180
Sequencia curva analítica MC-LR #41 UV_VIS_2
mAU
min
1 - P
eak
7 - 3
,968
2 - P
eak
3 - 4
,310
3 - P
eak
4 - 4
,673
4 - p
eak
5 - 5
,210
5 - P
eak
6 - 6
,197
6 - 7
,177
7 - 8
,588
8 - 1
0,07
39
- 11,
275
10 -
12,7
6111
- 14
,937
12 -
17,1
37
13 -
20,8
40
14 -
36,4
0015
- 38
,608
16 -
40,8
54
17 -
52,4
06
WVL:239 nm
... ..................
ESPECTROUV
(PICO 14)36,40
Peak #14 100% at 36.40 min
-10,0
70,0
200 250 300 350 400 450 500 595
%
nm
202.3
224.3275.5
50% at 36.32 min: 998.29 -50% at 36.49 min: 988.36
PERFIL 04
Lag. Fac. B(Maio)
0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0-20
100
250
Sequencia curva analítica MC-LR #43 UV_VIS_2
mAU
min
1 - P
eak
7 - 3
,972
2 - P
eak
3 - 4
,306
3 - P
eak
4 - 4
,677
4 - p
eak
5 - 5
,232
5 - P
eak
6 - 6
,199
6 - 7
,185
7 - 8
,549
8 - 1
0,00
49
- 11,
193
10 -
12,6
24
11 -
17,1
29
12 -
20,7
40 13 -
36,3
6914
- 38
,580
15 -
40,8
07
16 -
50,3
3917
- 52
,397
WVL:239 nm
... ..................
ESPECTROUV
(PICO 13)36,37
Peak #13 100% at 36.37 min
-10,0
70,0
200 250 300 350 400 450 500 595
%
nm
202.3
224.3275.5
50% at 36.29 min: 998.44 -50% at 36.46 min: 988.67
continua...
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 78
AMOSTRASTr
Min.PERFIL CROMATOGRÁFICO
PERFIL 05
Lag. Fac. B(Junho)
0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0-20
100
200
Sequencia curva analítica MC-LR #28 UV_VIS_2
mAU
min
1 - 3
,930
2 - 4
,318
3 - 4
,641
4 - 5
,251
5 - 6
,217
6 - 7
,288
7 - 8
,565
8 - 1
0,13
89
- 11,
835
10 -
12,9
6711
- 15
,495
12 -
17,0
42
13 -
21,0
94 14 -
36,3
94
15 -
40,8
91
16 -
52,3
76
WVL:239 nm
...
ESPECTROUV
(PICO 14)36,39
Peak #14 100% at 36.39 min
-10,0
70,0
200 250 300 350 400 450 500 595
%
nm
202.3
224.8275.1
50% at 36.31 min: 999.48 -50% at 36.48 min: 996.51
PERFIL 06
Lag. Mat.(Abril)
0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0-10
100
180
Sequencia curva analítica MC-LR #35 UV_VIS_2
mAU
min
1 - P
eak
7 - 3
,984
2 - P
eak
4 - 4
,722
3 - 8
,752
4 - 1
0,26
55
- 11,
696
6 - 1
3,13
07
- 15,
417
8 - 1
7,23
6
9 - 2
1,00
2
10 -
36,5
83
11 -
41,0
32
12 -
52,4
11
WVL:239 nm
... ..................
ESPECTROUV
(PICO 10)36,58
Peak #10 100% at 36.58 min
-10,0
70,0
200 250 300 350 400 450 500 595
%
nm
202.4
224.3275.5
50% at 36.50 min: 998.86 -50% at 36.68 min: 988.95
continua...
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 79
AMOSTRASTr
Min.PERFIL CROMATOGRÁFICO
PERFIL 07
Lag. Mat.(Maio)
ESPECTROUV
(PICO 21)36,37
Peak #21 100% at 36.37 min
-10,0
70,0
200 250 300 350 400 450 500 595
%
nm
202.4
224.9275.3
50% at 36.28 min: 999.24 -50% at 36.46 min: 996.29
PERFIL 08
Lag. Mat.(Junho)
0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0-10
100
180
Sequencia curva analítica MC-LR #34 UV_VIS_2
mAU
min
1 - P
eak
7 - 3
,965
2 - P
eak
3 - 4
,346
3 - P
eak
4 - 4
,682
4 - p
eak
5 - 5
,254
5 - P
eak
6 - 6
,246
6 - 7
,293
7 - 8
,703
8 - 1
0,22
29
- 11,
650
10 -
13,0
7611
- 15
,437
12 -
17,1
98
13 -
21,0
15 14 -
36,5
9115
- 38
,815
16 -
41,0
42
17 -
52,3
79
WVL:239 nm
... ..................
ESPECTROUV
(PICO 14)36,59
Peak #14 100% at 36.59 min
-10,0
70,0
200 250 300 350 400 450 500 595
%
nm
202.3
224.2275.6
50% at 36.50 min: 998.08 -50% at 36.68 min: 988.56
conclusão.
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 80
5 CONCLUSÃO
1. As lagoas de estabilização que compõem a Estação de Tratamento de Esgoto em
Juazeiro do Norte - CE, apresentam condições ambientais semelhantes às que são
requeridas ao crescimento excessivo de espécies potencialmente tóxicas;
2. As florações das Lagoas de Estabilização mostraram-se constituídas por 14 espécies,
tendo sido a ocorrência de Planktothrix isothrix predominante nas três lagoas
analisadas durante o período de amostragens, sendo verificada inclusive no Rio
Salgado, corpo receptor;
3. As espécies mais importantes em termos de frequência de ocorrência para as três
lagoas de estabilização analisadas foram: Microcystis aeruginosa, Microcystis
protocystis, Sphaerocavum brasiliensis e Radiocystis fernandoi, com destaque de
Planktothrix isothrix sobre as demais;
4. Microcystis protocystis, Sphaerocavum brasiliensis e Radiocystis fernandoi, consistem
em novos relatos de ocorrência para a Região do Cariri, bem como para o Estado do
Ceará;
5. No Brasil, não existem registros de Cianobactérias que apresentem atividade
antioxidante, sendo este o primeiro relato da presença de tal atividade;
6. A detecção da atividade anticolinesterásica em algumas das amostras testadas consiste
em resultado considerável, já que no Brasil, até a data do presente trabalho, somente 1
(um) trabalho consta na literatura disponível, sendo portanto, recentes os programas de
screening para as espécies de Cianobactérias com essa atividade;
7. A presença do aminoácido neurotóxico BMAA foi detectada em todas as Lagoas de
Estabilização: Facultativa A, Facultativa B e de Maturação, incluindo todo o período
de amostragem, representando risco quanto à exposição humana;
8. A partir dos testes de toxicidade em camundongos foram constatados mecanismos de
ação diferenciados, os quais se evidenciaram a partir da sintomologia, dos importantes
achados post-mortem que demonstraram efeitos crônicos e da toxicidade aguda que
apresentou tempo de morte divergente do registrado para as cianotoxinas já
conhecidas. Assim, esses dados direcionam à possível ocorrência de uma nova toxina,
para a qual mais estudos devem ser conduzidos;
9. A relação de Planktothrix isothrix à produção dos metabólitos secundários detectados
(tóxicos ou de interesse farmacológico) é suportada por sua massiva concentração de
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 81
organismos sobre as demais espécies de Cianobactérias coexistentes. Dessa forma,
estando Planktothrix isothrix envolvida na biossíntese das cianotoxinas detectadas, sua
ocorrência consiste em primeiro registro tóxico para a região tropical do Brasil;
10. A evidência biológica constatada na biomassa predominante e a evidência química
com o registro das mesmas substâncias metabólicas suportam a hipótese de tratar-se
de um mesmo organismo. Assim sendo, consiste na espécie de maior importância da
área estudada;
11. O rio Salgado por atravessar vários municípios pode ser fonte de dispersão de células
de Cianobactérias para as populações periurbanas e urbanas. Sendo importante
ressaltar que as flutuações quanto à velocidade das águas podem gerar fluxo
turbulento ou influenciar o tempo de retenção, mudando a dinâmica natural do sistema
e, portanto, podendo resultar em condições favoráveis para o estabelecimento de
populações tóxicas à jusante do lançamento do efluente da ETE no referido corpo
receptor;
12. É urgente a necessidade de um monitoramento planejado sobre o efluente final
resultante do processo de estabilização, em virtude da comprovada presença da
cianotoxina BMAA, a qual constitui uma grande ameaça à saúde humana.
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 82
REFERÊNCIAS
AGÊNCIA NACIONAL DE ÁGUAS. Atlas: abastecimento urbano de águas. Disponível em:<http://atlas.ana.gov.br/atlas/forms/AtlasNordeste.aspx>. Última atualização em 2009. Acessoem: 01 de junho de 2010.
AGUJARO, L. F. Métodos de análises. In: SANT’ANNA, C. L. et al. Manual ilustrado paraidentificação e contagem de cianobactérias planctônicas de águas continentaisbrasileiras. Rio de Janeiro: Interciência; São Paulo: Sociedade Brasileira de Ficologia –SBFic, 2006. p. 27 a 34.
ALENCAR, X. G. R.; OLIVEIRA, F. I. M.; LACERDA, S. R. Diversidade de algas emlagoas de estabilização no município de Juazeiro do Norte (CE). In: ENCONTRO DEINICIAÇÃO CIENTÍFICA DA UNIVERSIDADE REGIONAL DO CARIRI-URCA, 3.1999, Crato. Anais do III Encontro de Iniciação Científica da URCA, Crato: URCA, 1999.p. 35.
ANAGNOSTIDIS, K.; KOMÁREK, J. Modern approach to the classification system ofCyanophytes, 3: Oscillatoriales. Algological Studies, v. 80, n. 1 – 4, p. 327 – 472, 1988.
AQUINO, E. P.; FREITAS, A. I. G.; LACERDA, S. R. The phytoplanktonic community fromstabilization ponds in the Cariri area, Ceará. Journal of Biology, João Pessoa – PB, v. 02, p.153, 2007. Suplemento do IV Plankton Symposium e I Congresso Brasileiro de Plâncton,2007.
AQUINO, E. P.; LACERDA, S. R.; FREITAS, A. I. G. Cianobactérias das lagoas detratamento de esgoto no semi-árido nordestino (Ceará, Brasil). Insula, Santa Catarina: UFSC,v. 39, p. 34 - 46, 2010.
ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. Diretrizes para apresentaçãode dissertações e teses da USP: documento eletrônico e impresso - Parte I (ABNT). 2 ed.São Paulo: Universidade de São Paulo / Sistema Integrado de Bibliotecas - SIBi/USP, 2009.102 p.
AZEVEDO, M. T. P.; SANT’ANNA, C. L. Morfologia e reprodução. In: SANT’ANNA, C.L. et al. Manual ilustrado para identificação e contagem de cianobactérias planctônicasde águas continentais brasileiras. Rio de Janeiro: Interciência; São Paulo: SociedadeBrasileira de Ficologia – SBFic. 2006. p. 05 – 08.
AZEVEDO, S. M. F. O.; VASCONSELOS, V. M. Toxinas de cianobactérias: causas econseqüências para a saúde pública. In: ZAGATTO, P. A.; BERTOLETTI, E. Ecotoxicologiaaquática: princípios e aplicações. 2 ed. São Carlos: Rima, 2008. p. 433 – 452.
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 83
BANACK, S. A.; COX, P. A. Biomagnification of cycad neurotoxins in flying foxes:implications for ALS-PDC in Guam. Neurology, Kalaheo (Kauai), v. 61, p. 387 – 389, 2003.
BIANCHI, M. L. P.; ANTUNES, L. M. G. Radicais livres e os principais antioxidantes dadieta. Revista de Nutrição, Campinas (SP), v. 12, n. 2, p.123 – 130, 1999.
BICUDO, C. E. M.; MENEZES, M. Gêneros de algas de águas continentais do Brasil:chave para identificação e descrições. 2 ed. São Carlos: Rima, 2005. 502 p.
BITTENCOURT-OLIVEIRA, M. C.; OLIVEIRA, M. C.; YUNES, J. S. Cianobactériastóxicas: O uso de marcadores moleculares para avaliar a diversidade genética. BiotecnologiaCiência & Desenvolvimento. n. 23. Novembro e dezembro de 2001. Disponível em:<http://www.biotecnologia.com.br/revista/bio23/cianobac.pdf>. Acesso em: 01 de junho de2009.
CALIJURI, M. C.; ALVES, M. S. A.; SANTOS, A. C. A. Cianobactérias e cianotoxinas emáguas continentais. São Carlos: Rima, 2006. 118 p.
CARMICHAEL, W. W. Cyanobacteria secondary metabolites: the cyanotoxins. Journal ofApplied Bacteriology, Dayton (Ohio), v.72, p. 445 – 459, 1992.
CARMICHAEL, W. Toxic Microcystis and the environment. In: WATANABE, M. F. et al.Toxic Microcystis. Boca Raton: CRC Press, 1996. p. 1 – 11.
CARMICHAEL, W.W. The cyanotoxins. Advances in Botanical Research, Ohio (U.S.A.),v. 27. p. 211 – 212, 1997.
CARVALHO, L. R. Cianotoxinas. In: SANT’ANNA, C. L. et al. Manual ilustrado paraidentificação e contagem de cianobactérias planctônicas de águas continentaisbrasileiras. Rio de Janeiro: Interciência; São Paulo: Sociedade Brasileira de Ficologia –SBFic. 2006. p. 09 – 19.
CARVALHO, L. R. et al. A Toxic Cyanobacterial Bloom In An Urban Coastal Lake, RioGrande do Sul State, Southern Brazil. Brazilian Journal of Microbiology, Rio de Janeiro(RJ), v. 39, p. 761 – 769, 2008.
CHORUS, I.; BARTRAM, J. Toxic cyanobacteria in water. London/New York: WorldHealth Organization, 1999. 400 p.
CODD, G. A. et al. Harmful cyanobacteria. From mass mortalities to management measures.In: HUISMAN, J.; MATTHIJS, C. P.; VISSER, M. (eds.). Harmful cyanobacteria. AquaticEcology Series. Netherlands: Springer, 2005. p. 1 – 23.
COMPANHIA DE ÁGUA E ESGOTO DO ESTADO DO CEARÁ. Sistema de lagoa deestabilização. Juazeiro do Norte: CAGECE, 2010. 10 p.
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 84
_____. Sistema de esgotamento sanitário. Juazeiro do Norte: CAGECE, 2006. 11 p.
COMPÈRE, P. Algues de la región du lac Tchad: v – chlorophycophytes (1ª partie). CahiersOrstom Hidrobiologie, v. 10, n. 02, p. 77 – 118, 1976.
COX, P. A.; BANACK, S. A.; MURCH, S. J. Biomagnification of cyanobacterial neurotoxinsand neurodegenerative disease among the Chamorro people of Guam. Proceedings of theNational Academy of Sciences, Tucson (Arizona), v. 100, n. 23, p. 13380 – 13383, 2003.
COX, P. A. et al. Diverse taxa of cyanobacteria produce β-N-methylamino-L-alanine, aneurotoxic amino acid. Proceedings of the National Academy of Sciences, Tucson(Arizona), v. 102, n. 14, p. 5074 – 5078, 2005.
CRUZ, L. S. et al. Variações temporais do fitoplâncton e de parâmetros físico-químicos emlagoas de estabilização facultativas tratando esgotos sanitários em regime de batelada. In: 23CONGRESSO BRASILEIRO DE ENGENHARIA SANITÁRIA E AMBIENTAL. 2005,Campo Grande – MS. Anais Eletrônicos do XXIII CBESA, Campo Grande: ABES, 2005.11 p.
DESIKACHARY, T. V. Cyanophyta. New Delhi: Indian Council of agricultural Research,1959. 686 p.
DI BERNARDO, L. Algas e suas influências na qualidade das águas e nas tecnologias detratamento. Rio de Janeiro: ABES, 1995. 140 p.
DOGO, C. R. et al. Evaluation of anticholinesterasic activity of strain SPC 920 –Geitlerinema unigranulatum (Oscillatoriales, Cyanobacteria). In: RIET-CORREA, F.;MEDEIROS, R. M. T.; FISTER, J. P. ; SCHILD, A. L. ; DANTAS, A. F. M. (Org.).Poisonings by plants, micotoxins and related substances in Brazilian livestock. Patos, PB:Sociedade Vicente Pallotti, 2010, v. 02, p. 1 – 6.
DOW, C. S; SWOBODA, U. K. Cianotoxins. In: WHITTON, B. A.; POTTS, M. The ecologyof cyanobacteria: their diversity in time and space. Dordrecht: Kluwer, 2000. p. 613 – 632.
FERNANDES, V. O. et al. Ecologia de cianobactérias: fatores promotores e conseqüênciasdas florações. Oecologia Brasiliensis, Rio de Janeiro: UFRJ, v. 13, n. 02, p. 247 – 258, 2009.
FERRÃO-FILHO, A. S. Bioacumulação de cianotoxinas e seus efeitos em organismosaquáticos. Oecologia Brasiliensis, Rio de Janeiro: UFRJ, v. 13, n. 02, p. 272 – 312, 2009.
FERRÃO-FILHO, A. S.; MOLICA, R.; AZEVEDO, S. M. F. O. Ecologia, ecofisiologia etoxicologia de cianobactérias. Oecologia Brasiliensis, Rio de Janeiro: UFRJ, v. 13, n. 02, p.225 – 228, 2009.
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 85
FREITAS, A. I. G. de; AQUINO, E. P.; OLIVEIRA, E. C. C. de; LACERDA, S. R.Levantamento da comunidade fitoplanctônica das lagoas de estabilização de tratamento deesgoto (ETE_Juazeiro do Norte_CE). In: REUNIÃO NORDESTINA DE BOTÂNICA, 29.2006, Mossoró – RN. Anais do XXIX Reunião Nordestina de Botânica. Mossoró:Universidade Estadual do Rio Grande do Norte – UERN, 2006.
FERREIRA, A. L. A.; MATSUBARA, L. S. Radicais livres: conceitos, doenças relacionadas,sistema de defesa e estresse oxidativo. Revista da Associação Médica Brasileira, Botucatu(SP), v. 43, n. 1, p. 61 – 68, 1997.
FINKEL, T.; HOLBROOK, N. J. Oxidants, oxidative stress and the biology of ageing.Nature, U.S.A, v. 408, n. 6809, p. 239 – 247, nov. 2000.
FUNDAÇÃO CEARENSE DE METEOROLOGIA E RECURSOS HÍDRICOS(FUNCEME). Dados de precipitação mensais de Juazeiro do Norte (1970-2010).Fortaleza, CE, 2010.
HARADA, K.; KONDO, F.; LAWTON, L. Laboratory analysis of cyanotoxins. In:CHORUS, I.; BARTRAM, J. Toxic cyanobacteria in water: a guide to their public healthconsequences, monitoring and management. New York: E & FN SPON, 1999. p. 369 – 405.
HONDA, R. Y. et al. Cianotoxinas em pesqueiros da região metropolitana de São Paulo. In:ESTEVES, K. E.; SANT’ANNA, C. L. Pesqueiros sob uma visão integrada de meioambiente, saúde pública e manejo. São Carlos: Rima, 2006. p. 105 – 120.
HOSTETTMANN, K.; QUEIROZ, E. F.; VIEIRA, P. C. Princípios ativos de plantassuperiores. v. 04. São Carlos: EdUFSCar, 2003. 152 p.
JENSEN, J. P. et al. Impact of nutrients and physical factorson the shift from Cyanobacterialand Chlorophyte dominance in shallow Danish lakes. Canadian Jounal of Fisheries andAquatic Sciences, v. 51, n. 08, p. 1692 – 1699, 1994.
JONASSON, S. et al. Transfer of a cyanobacterial neurotoxin within a temperate aquaticecosystem suggests pathwaysfor human exposure. Proceedings of the National Academy ofSciences, Honolulu (Hawaii), v. 107, n. 20, p. 9252 – 9257, 2010.
KELLNER, E.; PIRES, E. C. Lagoas de estabilização: projeto e operação. Rio de Janeiro:ABES, 1998. 244 p.
KOMÁREK, J.; ANAGNOSTIDIS, K. Cyanoprokaryota 2. Teil: Oscillatoriales. In: BÜDEL,B. et al. (eds). Sübwasserflora von Mitteleuropa. v. 19, n. 02. Heidberg: Elsevier/SpektrumAkademischer Verlag, 2005. 759 p.
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 86
KOMÁREK, J.; ANAGNOSTIDIS, K. Cyanoprokaryota 1. Teil: Chroococcales. In: ETTL,H. et al. (eds). Süsswasserflora von Mitteleuropa, v. 19, n. 01. Gustav Fischer, Jena, 1999.548 p.
KOMÁREK, J.; ANAGNOSTIDIS, K. Modern approach to the classification system ofcyanophytes 4. Teil: Nostocales. Algological Studies, Stuttgart (Germany), v. 82, n. 03. p.247 – 345, 1989.
KOTILA, P. M. Ecological Measures. Software package, St. Lawrence University. 1986.
KUIPER-GOODMAN, T.; FALCONER, I.; FITZGERALD, J. Human health aspects. In:CHORUS, I.; BARTRAM, J. Toxic cyanobacteria in water. London/New York: WorldHealth Organization, 1999. p. 125 – 160.
KURODA, E. K. et al. Avaliação da toxicidade aguda de uma cepa de Microcystis spp. pormeio de testes com camundongos. Engenharia Sanitária Ambiental, Rio de Janeiro, v. 12,n. 01, p. 24 – 31, 2007.
LOBO, E.; LEIGHTON, G. Estructuras comunitarias de las fitocenosis planctonicas de lossistemas de desembocaduras de rios y esteros de la zona central de Chile. Revista BiologiaMarina, Valparaíso, v. 22, n. 01, p. 1 - 29, 1986.
MAGURRAN, A. E. Measuring biological diversity. Malden: Blackwell Science, 2004.256p.
MARSTON, A.; KISSILING, J.; HOSSTETTMANN, K. A rapid TLC bioautographicmethod for the detection of acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase inhibitors in plants.Phytochemical Analysis, v. 13, p. 51 – 54, 2002.
MATEUCCI, S. D.; COLMA, A. La metodologia para el estudo de la vegetacion.Washington: Collecion de Monografias Cientificas, 1982. p. 1-168. Serie Biologia, 22 (1).
MERCK, E. Dyeing reagents for thin layer and paper chromatography. Darmstadt (Germany):E. Merck, 1971. Ítem 207, p.64.
MIZUNO, T. Illustrations of the freshwater plankton of Japan. Osaka: Hoikusha, 1968.351p.
MOLICA, R.; AZEVEDO, S. Ecofisiologia de cianobactérias produtoras de cianotoxinas.Oecologia Brasiliensis, Rio de Janeiro: UFRJ, v. 13, n. 02, p. 229 – 246, 2009.
MURCH, S. J.; COX, P. A.; BANACK, S. A. A mechanism for slow release of biomagnifiedcyanobacterial neurotoxins and neurodegenerative disease in Guam. Proceedings of theNational Academy of Sciences, Mexico City (Mexico), v. 101, n. 33, p. 12228 – 12231.2004b.
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 87
MURCH, S. J. et al. Occurrence of β-methylamino-L-alanine (BMAA) in ALS/PDC patientsfrom Guam. Acta Neurologica Scandinavica, Kalaheo (Hawaii), v. 102, p. 267 – 269.2004a.
NUNES, X. P.; MESQUITA, R. F.; SILVA, L. D. P.; COSTA, V. C. O.; SILVA, M. V. B.;XAVIER, A. L.; DINIZ, M. F. F. M.; AGRA, M. F. Constituintes químicos, avaliação dasatividades citotóxica e antioxidante de Mimosa paraibana Barneby (Mimosaceae). RevistaBrasileira de Farmacognosia, Curitiba (PR), v. 18, p. 718 – 723, dez, 2008.
OUELLETTE, A. J. A.; WILHELM, S. W. Toxic cyanobacteria: the evolving moleculartoolbox. Frontiers in Ecology and the Environment, Knoxville (Tennessee), v. 01, n. 07. p.359 – 366, 2003.
PABLO, J. et al. Cyanobacterial neurotoxin BMAA in ALS and Alzheimer’s disease. ActaNeurologica Scandinavica, v. 120, n. 04, p. 216 – 225, 2009.
PARRA, O. O.; BICUDO, C. E. M. Introducción a la biologia y sistematica de las algas deaguas continentales. Santiago, Chile: Concepción / Ediciones Universidad de Concepición.1993. 268 p.
PARRA, O. O.; GONZALEZ, M.; DELARROSA, V. Manual taxonomico del fitoplanctonde aguas continentales: com especial referencia al fitoplancton de Chile. V: Chlorophyceae.Parte I: Volvocales, Tetrasporales, Chlorococcales y Ulotricales. Santiago, Chile: Concepción/ Editorial Universidad de Concepción, 1983. 151 p.
PAERL, H. W. Nutrient and other environmental controls of harmful cyanobacterial bloomsalong the freshwater–marine continuum. In: HUDNELL, H. K. (ed.) CyanobacterialHarmful Algal Blooms: State of the Science and Research Needs. Springer, 2008. p. 217-237.
PIETRZYK, D. J. Organic polymeric stationary phases. In: BROWN, P. R.; HARTWICK, R.A. (eds). High performance liquid chromatography. v. 98. New York: Wiley-IntersciencePublication, 1989. p. 223-276.
PRESCOTT, G. W. Algae of the Western Great lakes area: with an illustrated key to thegenera of desmids and fresh water diatoms. Iowa: Wm. C. Brown Company Publishers. 1962.300 p.
RANGEL, M. et al. Hemolytic activity in extracts of the diatom Nitzschia. Toxicon,Washington DC (U.S.A.), v. 35, n. 02, p. 305 – 309, 1997.
REYNOLDS, C. et al. Towards a functional classification of the freshwater phytoplankton.Journal of Plankton Reserch, v. 24, p. 417 – 428, 2002.
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 88
REBOUÇAS, A. C. Água doce no mundo e no Brasil. In: REBOUÇAS, A. C.; BRAGA, B.;TUNDISI, J. G. Águas doces no Brasil: capital ecológico, uso e conservação. 3 ed. SãoPaulo: Escrituras, 2006. p. 1 – 35.
_______. Uso inteligente da água. São Paulo: Escrituras, 2008. 207 p.
REVIERS, B. Biologia e filogenia das algas. Porto Alegre: Ed Artmed, 2006. 280 p.
SALATI, E.; LEMOS, H. M.; SALATI, E. Água e o desenvolvimento sustentável. In:REBOUÇAS, A. C.; BRAGA, B.; TUNDISI, J. G. Águas doces no Brasil: capital ecológico,uso e conservação. 3 ed. São Paulo: Escrituras, 2006. p. 37 – 62.
SALOMON, P. S.; YUNES, J. S.; PARISE, M.; COUSIN, J. C. B. Toxicidade de um extratode Microcystis aeruginosa da Lagoa dos Patos sobre camundongos e suas alterações sobre otecido hepático. Revista Vittalle, Rio Grande, n. 8, p. 23 – 32, 1996.
SANT’ANNA, C. L.; AZEVEDO, M. T. P. Contribution to the knowledge of potentially toxicCyanobacteria from Brazil. Nova Hedwigia, Stuttgart (Germany), v. 71, n. 03 – 04, p. 359 –385, 2000.
SANT’ANNA, C. L. et al. Review of toxic species of Cyanobacteria in Brazil. Algologicalstudies, Stuttgart (Germany), v. 126, p. 251 – 265, 2008.
SANT’ANNA, C. L.; GENTIL, R. C.; SILVA, D. Comunidade fitoplanctônica de pesqueirosda região metropolitana de São Paulo. In: ESTEVES, K. E.; SANT’ANNA, C. L. Pesqueirossob uma visão integrada de meio ambiente, saúde pública e manejo. São Carlos: Rima,2006. p. 49 a 62.
SECRETARIA DAS CIDADES DO ESTADO DO CEARÁ. Localização da Região doCariri Central. Disponível em: <http://www.cidades.ce.gov.br/categoria4/mapa-localizacao-projeto-cariri-central-port.pdf> . Última atualização em 2009. Acesso em: 09 de dezembro de2010.
SIVONEN, K.; JONES, G. Cyanobacterial toxins. In: CHORUS, I.; BARTRAM, J. Toxiccyanobacteria in water: a guide to their public health consequences, monitoring andmanagement. London and New York: World Health Organization, 1999. p. 41 – 111.
SOARES, R. M. Toxicologia de cianotoxinas: microcistinas as estrelas do tema. OecologiaBrasiliensis, Rio de Janeiro: UFRJ, v. 13, n. 02, p. 259 – 271, 2009.
SOUZA, R. C. R. Introdução. In: SANT’ANNA, C. L. et al. Manual ilustrado paraidentificação e contagem de cianobactérias planctônicas de águas continentaisbrasileiras. Rio de Janeiro: Interciência; São Paulo: Sociedade Brasileira de Ficologia –SBFic. 2006. p. 01 – 04.
OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 89
SOUZA, T. M. et al. Bioprospecção de atividade antioxidante e antimicrobiana da casca deStryphnodendron adstrigens (Mart.) Coville (Leguminosae-Mimosoidae). Revista deCiências Farmacêuticas Básica e Aplicada, Araraquara (SP), v. 28, n. 2, p. 221 – 226, 2007.
SPENCER, P. S. et al. Motorneurone disease on Guam: possible role of a food neurotoxin.The Lancet, v. 01, p. 965, 1986.
STREBLE, H., KRAUTER, D. Atlas de los microorganismos de agua doce: la vida en unagota de agua. Barcelona: Ed Omega, 1987. 357 p.
TUNDISI, J. G. Água no século XXI: enfrentado a escassez. 2 ed. São Carlos: Rima, 2005.248 p.
VEGA, A.; BELL, E. A. α-Amino-β-methyl aminopropionic acid, a new amino acid fromseeds of Cycas circinalis. Phytochemistry, v. 06, p. 759 – 762, 1967.
VIEIRA, V. P. P. B.; GONDIM FILHO, C. G. Água doce no semi-árido. In: REBOUÇAS, A.C.; BRAGA, B.; TUNDISI, J. G. Águas doces no Brasil: capital ecológico, uso econservação. 3 ed. São Paulo: Escrituras, 2006. p. 481 – 505.
VON SPERLING, M. Introdução à qualidade das águas e ao tratamento de esgotos. 2 ed.v. 01. Belo Horizonte: Departamento de engenharia sanitária e ambiental, UniversidadeFederal de Minas Gerais, 1996a. 243 p.
_____, M. Lagoas de estabilização. v. 03. Belo Horizonte: Departamento de EngenhariaAmbiental, Universidade Federal de Minas Gerais, 1996b. 140 p.
WHITTON, B.; POTTS, M. The ecology of cyanobacteria: their diversity in time and space.Netherlands: Kluwer academy Publisher, 2000. 669p.
ZAGATTO, P. A. et al. Avaliação ecotoxicológica do reservatório do Guarapiranga, SP, comênfase à problemática das algas tóxicas e algicidas. In: CONGRESSO LATINO-AMERICANO DE FICOLOGIA, 4. São Paulo, 1997. Anais do IV Congresso Latino-Americano de Ficologia. São Paulo – SP, 1997. p. 63 – 81.
ZELÍK, P. Acetylcholinesterase inhibitor from Nostoc Sliz. Kol. Sborník, Brno (CzechRepublic), p. 187 – 190, 2005.