elaine cristina conceiÇÃo de oliveira - mbm.urca.brmbm.urca.br/pdf/dissertacoes/elaine cristina...

OLIVEIRA, E. C. C. Identificação de Metabólitos Secundários de Cianobactérias... 0

UNIVERSIDADE REGIONAL DO CARIRI

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA BIOLÓGICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOPROSPECÇÃO MOLECULAR

MESTRADO ACADÊMICO EM BIOPROSPECÇÃO MOLECULAR

ELAINE CRISTINA CONCEIÇÃO DE OLIVEIRA

BIOPROSPECÇÃO E TOXICIDADE DE CIANOBACTÉRIAS NAS LAGOAS DE

ESTABILIZAÇÃO DE TRATAMENTO DE ESGOTO (ETE) DO MUNICÍPIO DE

JUAZEIRO DO NORTE, CEARÁ.

CRATO – CE

2011





JUAZEIRO DO NORTE, CEARÁ

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Bioprospecção Molecular da

Universidade Regional do Cariri como

requisito parcial para obtenção do título de mestre

em Bioprospecção Molecular (Área de

concentração: Bioprospecção de Produtos Naturais).

Orientadora:

Dra. Sírleis Rodrigues Lacerda

Universidade Regional do Cariri - URCA

Co-orientadora:

Dra. Luciana Retz de Carvalho

Instituto de Botânica – IBt/SP.

CRATO – CE

2011





JUAZEIRO DO NORTE, CEARÁ.

Dissertação defendida em: ____/____/2011 e aprovada em: ____/____/2011.

BANCA EXAMINADORA

______________________________________________

Profa. Dra. Sírleis Rodrigues Lacerda (Orientadora)Universidade Regional do Cariri – URCA/CE

______________________________________________

Profa. Dra. Luciana Retz de Carvalho (Co-orientadora)Instituto de Botânica – IBt/SP

______________________________________________

Profa. Dra. Maria Odete Parente Moreira (Membro Titular)Universidade Federal do Ceará – UFC/CE

______________________________________________

Prof. Dr. José Galberto Martins da Costa (Membro Titular)Universidade Regional do Cariri – URCA/CE

______________________________________________

Profa. Dra. Marta Regina Kerntopf (1º Suplente)Universidade Regional do Cariri – URCA/CE

______________________________________________

Profa. Dra. Maria Arlene Pessoa da Silva (2º Suplente)Universidade Regional do Cariri – URCA/CE

CRATO – CE2011


DEDICO

Aos meus pais, Francisca Maria da

Conceição e José Claudio de Oliveira (in

memorian). Aos meus irmãos, Cleide e

Eugênio, e ao meu esposo Jaceilton Alves de

Melo, com muito carinho.


AGRADECIMENTOS

“A fim de que saibam, e pela observaçãocompreendam, que a mão do Senhor fez

essas coisas”Isaías 41:20

A DEUS, por seu AMOR, pela presença constante em minha vida, abençoando, conduzindo e

dando forças em todos os momentos, principalmente os mais difíceis;

Aos meus pais, José Claudio de Oliveira (in memorian) que, mesmo ausente, sempre

contribuiu para as minhas realizações, pois me deixou o que há de mais importante, seu amor,

seu exemplo e valores de vida, que sempre os tenho comigo, força, determinação e

humildade. E minha mãe, Francisca Maria da Conceição, mulher de “aço e de flores”, valente

frente os desafios da vida e muito generosa. Soube ser mãe e pai ao mesmo tempo,

interferindo com sabedoria e firmeza, quando necessário, mas também nos fazendo sentir

filhos muito amados. Ambos são expressão marcante de coragem e amor;

A meu esposo Jaceilton Alves de Melo, pelo amor que nos une, pelas conquistas que

sonhamos juntos, pelas dificuldades que se tornam de um só, por seu exemplo e constantes

palavras de conforto e estímulo, que sempre foram fundamentais na persistência pela vitória.

Obrigada pela paciência sempre devotada, por me entender e por contribuir para essa

realização, que também é sua;

Aos meus irmãos Eugênio Oliveira e Cleide Oliveira, pelo amor que partilhamos, pelos

esforços conduzidos por minha felicidade, pela torcida em cada desafio e por mais esse

momento que divido com eles. Ao meu sobrinho e afilhado Ícaro Oliveira e sobrinha Ianne

Oliveira, que são verdadeiros presentes de DEUS em nossas vidas;

À grande professora Dra. Sírleis Rodrigues Lacerda, pela orientação, pelos ensinamentos e

por haver me mostrado desde muito cedo a riqueza de informações eminentes no mundo das

algas. Obrigada querida Sírleis, pela oportunidade de compor a equipe do Laboratório de

Botânica, que muito contribuiu para a minha formação acadêmica, tanto na graduação através

da Iniciação Científica, quanto no Mestrado. Assim, agradeço pela confiança em mim sempre

depositada, pelo carinho, pelos desafios... e ...alegrias partilhadas, pelo exemplo profissional e

humano que emanam constantemente em seus gestos de honestidade, humildade e

generosidade. Uma verdadeira mãe-científica e sobretudo grande amiga, pela qual carrego

grande apreço e admiração;

À Dra. Luciana Retz de Carvalho, pela co-orientação, pelo apoio e total disponibilidade do

Laboratório de Química do Núcleo de Pesquisa em Ficologia – Instituto de Botânica de São

Paulo (IBt), tanto em infra-estrutura como em material utilizado. Uma feliz parceria que foi

decisiva para a realização deste trabalho e que contou com a constante dedicação da Dra.


Luciana, que não mediu esforços para possibilitar a concretização de todas as etapas que

envolveram o estudo de metabólitos secundários (da etapa mais simples às mais longas e

difíceis). Obrigada Dra. Luciana por todo o carinho, pelo cuidado de mãe enquanto estive em

seu convívio, pelos valiosos ensinamentos que perdurarão para sempre, pelo exemplo de

grande profissional e generosidade, e enfim, pela grande amizade;

Ao grande amigo Ubirajara Fernandes, pelo qual tenho um carinho de irmão, por havermos

caminhado juntos, trilhado os mesmos desafios e sempre partilhado o conhecimento, que

assim, se fez ainda maior. Nossa amizade é algo que carrego com muito orgulho!;

Às irmãs-amigas do Laboratório de Botânica, Claudiana Santos, Felismária Silva e Thalita

Campos pelo apoio sempre desprendido, pelo companheirismo, fiel disponibilidade e

principalmente pelos laços de amizade que perdurarão sempre. Trio perfeito, da mais calma a

mais agoniadinha. Adoro vocês!;

Á grande amiga Lenier Inácio, pelo carinho, pelas conversas e motivações, pela presença

sempre constante, enfim, por sua singela amizade que é tão importante pra mim. Aos

compadres Lenice Silva e Emanoel Saraiva, pelo apoio, atenção e a Vinícius Saraiva, meu

afilhado, o qual nos dá muita alegria;

À todos os amigos da graduação pelos desafios vencidos juntos e em especial, às grandes

amigas, Aldeni Lima e Gerlânia Leite, pelo carinho e presença constante;

Aos ex-membros do Laboratório de Botânica, Ionara Freitas, Eveline Aquino e Valdemi

Ferreira, pelos momentos partilhados durante a iniciação científica; bem como aos membros

atuais, Joemília Macêdo, Irismã Góes, Karla Nascimento e Anne Rangel, pelo carinho e

apoio;

À Profa. Dra. Marta Almeida e às alunas do grupo de pesquisa em Ecologia Vegetal,

Alexsandra Lourenço, Renata Souza e Samara Oliveira, pelo apoio;

Aos coordenadores do Laboratório de Pesquisa de Produtos Naturais (LPPN), Prof. Dr. José

Galberto Martins da Costa e Msc. Fabíola Fernandes Galvão, pela valiosa contribuição na

disponibilidade das instalações e material necessário à fase inicial desse trabalho, meus

sinceros agradecimentos, os quais também se estendem à toda equipe LPPN;

Ao Laboratório de Farmacologia e Química Molecular (LFQM), na pessoa da Dra. Marta

Regina Kerntopf, por permitir o congelamento de amostras;

À Companhia de Água e Esgoto do Ceará – CAGECE, na pessoa do Gerente Regional, o

Senhor Expedito Galba Batista, pelo apoio e concessão de dados físicos e químicos das

Lagoas de Estabilização de Tratamento de Esgoto – ETE/Juazeiro do Norte – CE. Meus

agradecimentos também aos funcionários Cyntia Araujo e Antonio Macedo pelas valiosas

contribuições;


À Fundação Cearense de Meteorologia e Recursos Hídricos – FUNCEME, pela

disponibilidade de dados pluviométricos;

À Dra. Célia Leite Sant’Anna, pesquisadora do Núcleo de Pesquisa em Ficologia – Instituto

de Botânica de São Paulo (IBt), pelo apoio, atenção e contribuição na identificação de

espécies de Cianobactérias;

À Dra. Andréa Tucci, pesquisadora do Núcleo de Pesquisa em Ficologia – Instituto de

Botânica de São Paulo (IBt), pelo apoio, atenção, disponibilidade de material bibliográfico,

ensinamentos de contagens por microscopia invertida, e enfim, pela amizade;

Ao Laboratório de Imunopatologia e ao Biotério Central do Instituto Butantan (SP) por

haverem possibilitado a realização dos ensaios em camundongos, bem como à Seção de

Fisiologia e Bioquímica de Plantas (IBt/SP), pelos demais ensaios;

À grande amiga Angélica Garcia, bolsista do Laboratório de Imunopatologia do Instituto

Butantan, pelo apoio, amizade e incansável contribuição na realização, principalmente, dos

ensaios em camundongos, que consistiu em uma etapa de bastante relevância para esse

trabalho. Para ela, meus sinceros agradecimentos, pois sua efetiva ajuda foi determinante;

Aos alunos do Núcleo de Pesquisa em Ficologia – Instituto de Botânica de São Paulo (IBt):

Geanne Conserva, Luciana Cunha, Luiz Felipe, Fernando Pipole, Raquel Lopes, Camila

Malone, Kleber Renan e Watson Arantes, pelo apoio, carinho e grande amizade, durante a

realização desse trabalho;

À toda a galera do alojamento do Instituto de Botânica de São Paulo (IBt), pela calorosa

recepção, apoio, carinho, momentos de descontração que me deram forças e enfim, pelos

laços de amizade que serão mantidos;

Ao Programa de Pós-Graduação em Bioprospecção Molecular, em especial à coordenação

representada por Dra. Sírleis Rodrigues Lacerda e Dra. Imeuda Peixoto Furtado, bem como às

secretárias, Andecieli Rolim, pelo carinho com que sempre nos trata e pela fiel torcida, e

Lenira Pereira, pelo apoio e manifestos de amizade;

Aos funcionários da URCA: Sylvanna Villar, Luiz Silva, Fernando Luciano, Marcos Aurélio,

Carlos Bezerra, Lêda Alcantara, Ivaneide Rocha e Francisca Adaci (in memorian) pelo

harmonioso convívio e amizade;

Ao setor de transporte da URCA, nas pessoas dos Srs. Geraldo Araújo e Frederico Silveira,

pela disponibilidade durante a realização desse trabalho;

À Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico – FUNCAP,

pela concessão da bolsa;

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES;

À Universidade Regional do Cariri – URCA.


Embora o Brasil ostente a maior descarga de

água doce do mundo nos seus rios, quando

estes secarem ou só transportarem esgotos

não tratados das nossas cidades, já não será

possível produzir alimentos, plantar árvores

e o dinheiro do bolso de pouco valerá.

Aldo da Cunha Rebouças


RESUMO

Para avaliar os riscos específicos de toxinas de Cianobactérias é necessário compreender assuas propriedades químicas, regulamentação da sua produção, mecanismos de ação, que sãodiversos, e seu destino nos ambientes, sendo de valiosa importância o monitoramento emáguas destinadas ao consumo humano. Dessa forma, faz-se necessário o controle das açõesantrópicas nas bacias hidrográficas, as quais podem gerar meios propícios à formação deflorações de Cianobactérias, e o gerenciamento continuado de modo a preservar os corposd´água existentes, não apenas em quantidade, mas também em qualidade. Determinar aocorrência de Cianobactérias e identificar a presença de metabólitos secundários bioativos(tóxicos ou apresentando ações antioxidante, anticolinesterásica e hemolítica) a partir deamostras coletadas nas Lagoas de Estabilização da Estação de Tratamento de Esgoto (ETE) deJuazeiro do Norte - CE, foi o objetivo desse trabalho. As amostras de Cianobactérias foramcoletadas mensalmente, de Fevereiro a Junho/2010, na superfície das lagoas aeróbiasdesignadas Facultativa A, Facultativa B e de Maturação, tendo sido efetuadas amostragenspara a análise taxonômica e para o estudo químico. A identificação das espécies foi feita pormicroscopia óptica. Para a pesquisa dos metabólitos, a biomassa de Cianobactérias foiconcentrada em filtros, congelada, liofilizada e submetida à extração com ácido acético 0,1 M.Os testes para detecção da neurotoxina β-N-metilamino-L-alanina (BMAA), bem como dasatividades, antioxidante e anticolinesterásica, foram feitos a partir de placas cromatográficas(gel de sílica 60, Merck), desenvolvidas com os extratos algáceos. Já a pesquisa dahepatotoxina microcistina foi conduzida tanto por ensaios em camundongos, com avaliaçãodos sintomas e tempo de sobrevida, quanto por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência(CLAE). Os resultados demonstraram a ocorrência de espécies consideradas potencialmentetóxicas como: Planktothrix isothrix (Skuja) Komárek et Komárková, Microcystis aeruginosa(Kützing) Kützing, Microcystis protocystis Crow e Radiocystis fernandoi Komárek &Komárková-Legnerová, sendo que Planktothrix isothrix, destacou-se pela ocorrência comdensidades características da floração. Foi detectada atividade antioxidante em todas asamostras e atividade anticolinesterásica em 4 (quatro) das 10 (dez) amostras analisadas. Já osensaios em camundongos apresentaram sintomas de alterações, lesões teciduais,principalmente no fígado, e toxicidade aguda letal por exposição a 3 (três) das 10 (dez)amostras administradas. Porém, não foi detectada a presença de microcistina nas amostras.Assim, é possível que os sinais de alterações verificados nos ensaios em camundongosestejam relacionados à ação de uma nova toxina. Para a neurotoxina β-N-metilamino-L-alanina (BMAA), foi verificado resultado positivo em todas as amostras analisadas. Assim,pelos efeitos devastadores que essa toxina pode causar em áreas do cérebro, os cuidados como monitoramento do Rio do Salgado, corpo receptor das lagoas de estabilização que contém asCianobactérias produtoras dessa neurotoxina, devem ser constantes e efetivos, de modo aproteger a saúde humana.

Palavras-Chave: Eutrofização, Cianobactérias, Metabólitos Secundários.


ABSTRACT

To assess the specific risks of toxins from Cyanobacteria is necessary to understand itschemical properties, regulation of its production, mechanisms of action that are diverse, andtheir fate in the environments, being of valuable importance the monitoring in water intendedfor human consumption. Thus, it is necessary the control of anthropic actions in thehydrographic basins, which could generate ways propitious to the formation of blooms ofCyanobacteria, and ongoing management in order to preserve the existing water bodies, notonly in quantity but also quality. Determine the occurrence of Cyanobacteria and identify thepresence of bioactive secondary metabolites (toxic or presenting antioxidant action,acetylcholinesterase and hemolytic) from samples collected in Stabilization Ponds of theStation Wastewater Treatment (SWT) of Juazeiro do Norte – CE, was the objective of thiswork. Samples of Cyanobacteria were collected monthly from February to June/2010, on thesurface of aerobic ponds known as: Facultative A, B and of Maturation, having beensamplings made for taxonomic analysis and for the chemical study. The species identificationwas made by optical microscopy. For the research of the metabolites, the biomass ofCyanobacteria was concentrated on filters, frozen, lyophilized and subjected to extractionwith acetic acid 0.1 M. Tests for detection of the neurotoxin β-N-methylamino-L-alanine(BMAA), as well as of the activities, antioxidant and anticholinesterase, were made fromchromatographic plates (silica gel 60, Merck), developed with the algal extracts. Already thesurvey of the hepatotoxin Microcystin was conducted by both tests, in mice, with evaluationof symptoms and survival time, and by High Performance Liquid Chromatography (HPLC).The results demonstrated the occurrence of potentially toxic species such as: Planktothrixisothrix (Skuja) Komárek et Komárková, Microcystis aeruginosa (Kützing) Kützing,Microcystis protocystis Crow and Radiocystis fernandoi Komárek & Komárková-Legnerová,being that Planktothrix isothrix, stood out by occurrence with densities characteristics of thebloom. Antioxidant activity was detected in all samples and anticholinesterase activity in 4(four) of 10 (ten) analyzed samples. Already the assays in mice showed symptoms of changes,tissue lesions, mainly in the liver, and acute lethal toxicity by exposure to 3 (three) of 10 (ten)administered samples. But it was not detected the presence of Microcystin in the samples. It istherefore possible that the signs of alterations observed in the assays in mice are related to theaction of a new toxin. For the neurotoxin β-N-methylamino-L-alanine, was found positiveresult in all analyzed samples. Thus, by the devastating effects that this toxin can cause inbrain areas, the cares with monitoring of the Salgado River, body receiving of theStabilization Ponds containing Cyanobacteria producing of this Neurotoxin, must be constantand effective, so to protect human health.

Keywords: Eutrophication, Cyanobacteria, Secondary Metabolites.


LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Esquema do funcionamento do sistema de Lagoas de Estabilização do

município de Juazeiro do Norte - Ceará. .............................................................. 23

Figura 2 – Estrutura química dos principais tipos de cianotoxinas ........................................ 30

Figura 3 – Fluxograma da estrutura de funcionamento do Sistema de Esgotamento

Sanitário (SES) de Juazeiro do Norte - Ceará. ..................................................... 35

Figura 4 – (A) Localização geográfica do município de Juazeiro do Norte, inserido na

Região do Cariri Central, Estado do Ceará, Brasil; (B) Foto aérea das Lagoas

de Estabilização da Estação de Tratamento de Esgoto (ETE) e (C) Esquema da

estrutura das Lagoas de Estabilização da ETE. .................................................... 36

Figura 5 – Lagoas de Estabilização da Estação de Tratamento de Esgoto (ETE) de

Juazeiro do Norte - Ceará. .................................................................................... 37

Figura 6 – Esquema das principais etapas do estudo químico. Obtenção da biomassa,

extração, testes, pré-purificação e fracionamento para pesquisa de

cianotoxinas. ......................................................................................................... 47

Figura 7 – (A) Aspecto geral das Lagoas de Estabilização – ETE/JN/CE; (B) Lagoa

Facultativa A; (C) Lagoa Facultativa B e (D) Lagoa de Maturação. ................. 48

Figura 8 – Planktothrix isothrix: (A) Dezenas de tricomas envolto a uma colônia de

Microcystis protocystis; (B) Tricomas envolto a uma colônia M.

aeruginosa; (C) Tricomas em massa (aspecto escuro) e (D) Detalhe da

morfologia dos tricomas. ...................................................................................... 49

Figura 9 – Média mensal histórica de precipitação no município de Juazeiro do Norte/CE

para um período de 30 anos (1980 a 2009) e registros da precipitação mensal

durante o período de coletas. ................................................................................ 51


Figura 10 – Frequência de ocorrência das espécies identificadas em relação ao período de

amostragem na Estação de Tratamento de Esgoto de Juazeiro do Norte/CE ........ 52

Figura 11 – Abundância relativa de Planktothrix isothrix em relação às demais espécies de

Cianobactérias identificadas durante o período de amostragem nas Lagoas:

Facultativa A, Facultativa B e de Maturação, ETE/Juazeiro do Norte-CE ........... 52

Figura 12 – Número de espécies identificadas durante o período de amostragem para

as Lagoas: Facultativa A, Facultativa B e de Maturação, ETE/Juazeiro do

Norte-CE................................................................................................................ 53

Figura 13 – Relação entre o índice de Shannon e Equitabilidade durante o período de

amostragem para a Lagoa Facultativa A, ETE/Juazeiro do Norte-CE .................. 55


amostragem para a Lagoa Facultativa B, ETE/Juazeiro do Norte-CE. ................. 55


amostragem para a Lagoa de Maturação, ETE/Juazeiro do Norte-CE.................. 56

Figura 16 – Achados post-mortem. A e B: animal com manchas brancas no fígado

(em detalhe) resultante da administração do extrato LFA (17 de maio, 2010).

[Arquivo pessoal].................................................................................................. 60

Figura 17 – Achados post-mortem. Animal apresentando fígado com os lobos, superior

e intermediário, aderidos (ver detalhe) resultante da administração do extrato

LFA (17 de maio, 2010). [Arquivo pessoal].......................................................... 61

Figura 18 – Achados post-mortem. Animal com acúmulo de material esverdeado no

pâncreas (ver detalhe) resultante da administração do extrato LFB (29 de abril,

2010). [Arquivo pessoal]. ...................................................................................... 61


Figura 19 – Achados post-mortem. A e B: Animal com manchas brancas no fígado (ver

detalhes) resultante da administração do extrato LM (29 de abril, 2010).

[Arquivo pessoal].................................................................................................. 62

Figura 20 – Achados post-mortem. A: Animal com diafragma aderido ao fígado (ver

detalhe) resultante da administração do extrato LM (29 de abril, 2010); B:

Controle. [Arquivo pessoal].................................................................................. 62

Figura 21 – Achados post-mortem. A: Animal com os lobos do fígado totalmente aderidos

e B: Animal com os lobos do fígado parcialmente aderidos (ver detalhes)

resultante da administração do extrato referente ao Rio (01 de junho, 2010).

[Arquivo pessoal].................................................................................................. 63

Figura 22 – (a): Cromatograma em placa de gel de sílica 60, Merck, dos extratos das

biomassas coletadas respectivamente nas Lagoas LFA1, LFA2, LFA3, LFB1,

LFB2, LFB3, LM1, LM2 e LM3. Fase móvel: clorofórmio: metanol: água

(64:36:8, v/v/v). Derivatizante: solução metanólica (2 mg.mL-1) do radical 2,2-

difenil-1-picrilhidrazila (DPPH). As manchas amareladas indicam as

substâncias com atividade antioxidante; (b) e (c): Cromatograma observado

sob luz ultravioleta, de comprimentos de onda 254 nm e 366 nm,

respectivamente. ................................................................................................... 66

Figura 23 – Diagrama das fontes de espécies reativas do oxigênio (EROS) e as respostas

celulares.. .............................................................................................................. 68

Figura 24 – (a): Cromatograma em placa de gel de sílica 60, Merck, dos extratos das

biomassas coletadas nas Lagoas LFA1, LFA2, LFA3, LFB1, LFB2, LFB3,

LM1, LM2 e LM3. Fase móvel: clorofórmio: metanol: água (64:36:8, v/v/v).

Revelador específico para inibidores de acetilcolinesterase. As manchas

coincidentes com os halos de cor branca indicam inibição da

acetilcolinesterase; (b) e (c): Cromatograma observado sob luz ultravioleta, de

comprimentos de onda 254 nm e 366 nm, respectivamente. ................................ 70


Figura 25 – Cromatograma em gel de sílica 60, Merck, dos extratos em ácido acético 0,1

M liofilizados das amostras da Lagoa Facultativa A: FA1, FA2 e FA3. Fase

móvel: clorofórmio: metanol: água (64:36:8, v/v/v). Agente derivatizante:

ninidrina. As setas apontam as manchas com Rf correspondente ao Rf do

padrão de BMAA............................................................................................. 71


M liofilizados das amostras da Lagoa Facultativa B: FB1, FB2 e FB3. Fase

móvel: butanol: ácido acético: água (5:2:3 v/v/v). Agente derivatizante:


padrão de BMAA.................................................................................................. 72


M liofilizados das amostras da Lagoa de Maturação: M1, M2 e M3. Fase

móvel: butanol: ácido acético: água (5:2:3 v/v/v). Agente derivatizante:


padrão de BMAA.................................................................................................. 72

Figura 28 – Cromatograma com o desenvolvimento do padrão de Microcistina-LR (pico 8,

tempo de retenção: 36,63 min.). Condições da análise: Coluna CN analítica;

Fase móvel: A - ácido trifluoracético (TFA) 0,1% e B: acetonitrila (ACN) /

TFA 0,1%; Fluxo: 1 mL.min-1; Detecção: UV 238nm......................................... 75

Figura 29 – Espectro de UV do pico 8 correspondente ao padrão de Microcistina-LR........... 75


LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Características gerais das principais toxinas de Cianobactérias ........................... 29

Tabela 2 – Características físicas das Lagoas de Tratamento Biológico do município

de Juazeiro do Norte – CE. ................................................................................... 38

Tabela 3 – Sinais de intoxicação e alterações macroscópicas apresentadas pelos

camundongos após administração por via intraperitoneal dos extratos em ácido

acético das amostras de floração das lagoas facultativa A, facultativa B e de

Maturação. ............................................................................................................ 58

Tabela 4 – Registros de peso corpóreo dos animais testados, antes e após o período de

exposição aos extratos algáceos............................................................................ 64

Tabela 5 – Registro da atividade antioxidante detectada por amostra e os seus respectivos

índices de retenção (Rf). ....................................................................................... 67

Tabela 6 – Perfil cromatográfico dos extratos das amostras provenientes das lagoasde estabilização: Lagoa Facultativa A, Lagoa Facultativa B e Lagoa deMaturação (ver em detalhe, o pico comum a todas as amostras e seurespectivo espectro UV) ....................................................................................... 76


LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

1O2 Oxigênio Singlete;

2-MIB 2-methylisoborneol;

AchE Acetilcolinesterase;

ACN Acetonitrila;

ALS Esclerose Lateral Amiotrófica;

ANA Agência Nacional de Águas;

BMAA β-N-metilamino-L-alanina;

CAGECE Companhia de Água e Esgoto do Ceará;

CE Ceará;

CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência;

CN Cromatografia de Fase Normal;

CONAMA Conselho Nacional do Meio Ambiente;

DNA Ácido Desoxirribonucleico;

DPPH 2,2-difenil-1-picrilhidrazila;

EROS Espécies Reativas do Oxigênio;

EEEs Estações Elevatórias de Esgotos;

ETE Estação de Tratamento de Esgoto;

H2O2 Peróxido de Hidrogênio;

HPLC High Performance Liquid Chromatography;

i.p. Intraperitonial;

IBt/SP Instituto de Botânica/São Paulo;

JN Juazeiro do Norte;

LFA Lagoa Facultativa A;

LFB Lagoa Facultativa B;

LM Lagoa de Maturação;

LPPN Laboratório de Pesquisa de Produtos Naturais;

MC-LA Microcistina-LA;

MC-LR Microcistina-LR;

MC-RR Microcistina-RR;

C-YR Microcistina-YR;

MS Ministério da Saúde;


O2- Superóxido;

ODS-C18 Coluna Octadecilsilanizada;

OH- Radical Hidroxila;

PDA Photodiode Array Detectors;

PDC Complexo de Demência Parkinsonismo;

pH Potencial de Hidrogênio;

PVDF Polyvinylidene Fluoride;

Rf Fator de Retenção;

SE Suspensão de Eritrócitos;

SES Sistema de Esgotamento Sanitário;

TFA Ácido Trifluoracético;

Tr Tempo de Retenção;

UN-BSA Unidade de Negócio da Bacia do Salgado;

URCA Universidade Regional do Cariri;

UV Ultra Violeta.


LISTA DE SÍMBOLOS

(S) Sul;

(W) Oeste;

≈ Aproximadamente;

µg/g Micrograma por grama

µL Microlitro;

µm Micrometro,

C6H12O6 Glicose;

CaCl2 Cloreto de Cálcio;

CO2 Dióxido de Carbono;

H2O Água;

KCl Cloreto de Potássio;

Kg Quilograma;

KH2PO4 Hidrogenofosfato de Potássio;

L/s Litro por Segundo;

m Metro;

M Molar;

m2 Metro Quadrado;

m3 Metro Cúbico;

MeOH Metanol;

mg Miligrama;

MgSO4 Sulfato de Magnésio;

mL Mililitro

min Minuto;

mm Milímetro;

mM Milimolar;

N Nitrogênio;

N2 Gás Nitrogênio;

NaCl Cloreto de Sódio;

NaHCO3 Bicarbonato de Sódio;

nm Nanômetro;

ºC Graus Celsius;


P Fósforo;

RPM Rotações Por Minuto;

v Volume;

W Watts;

λ Gama.


SUMÁRIO

RESUMO........................................................................................................................... viii

ABSTRACT ........................................................................................................................ ix

LISTA DE FIGURAS.......................................................................................................... x

LISTA DE TABELAS ...................................................................................................... xiv

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ...................................................................... xv

LISTA DE SÍMBOLOS .................................................................................................. xvii

1 INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 21

1.1 LAGOAS DE ESTABILIZAÇÃO ................................................................................ 22

1.2 AS CIANOBACTÉRIAS .............................................................................................. 23

1.3 FATORES PROMOTORES DAS CIANOBACTÉRIAS E CONSEQUÊNCIAS....... 25

1.4 TOXINAS DE CIANOBACTÉRIAS ........................................................................... 26

1.4.1 β-N-metilamino-L-alanina (BMAA) - A mais recente toxina de Cianobactérias 31

1.5 TESTES DE TOXICIDADE EM CAMUNDONGOS ................................................. 33

2 OBJETIVOS ................................................................................................................... 34

2.1 GERAL.......................................................................................................................... 34

2.2 ESPECÍFICOS .............................................................................................................. 34

3 MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................... 35

3.1 ÁREA DE ESTUDO ..................................................................................................... 35

3.2 ESTUDOS TAXONÔMICOS....................................................................................... 37

3.2.1 Coleta e tratamento das amostras ........................................................................... 37

3.2.2 Análise qualitativa da comunidade ......................................................................... 38

3.2.3 Frequência de ocorrência dos táxons...................................................................... 39

3.2.4 Abundância relativa dos táxons .............................................................................. 39


3.2.5 Diversidade e Equitabilidade................................................................................... 40

3.3 ESTUDOS QUÍMICOS E ENSAIOS ........................................................................... 41

3.3.1 Coleta da Biomassa................................................................................................... 41

3.3.2 Obtenção dos Extratos ............................................................................................. 42

3.3.3 Ensaio de toxicidades dos camundongos (intraperitonial – i.p.) .......................... 43

3.3.4 Prospecção de substâncias bioativas ....................................................................... 43

3.3.4.1 Atividade antioxidante ............................................................................................. 43

3.3.4.2 Atividade anticolinesterásica .................................................................................. 44

3.3.4.3 Atividade hemolítica ................................................................................................ 44

3.3.5 Prospecção de Cianotoxinas .................................................................................... 45

3.3.5.1 Teste para detecção de -N-metilamino-L-alanina (BMAA) .................................. 45

3.3.5.2 Análise de microcistinas .......................................................................................... 46

3.4 NORMALIZAÇÃO DO TEXTO.................................................................................. 46

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................... 48

4.1 DESCRIÇÃO DA ESPÉCIE ......................................................................................... 49

4.2 ENSAIO DE TOXICIDADE EM CAMUNDONGOS (i.p) ......................................... 56

4.3 PROSPECÇÃO DE SUBSTÂNCIAS BIOATIVAS .................................................... 65

4.3.1 Atividade antioxidante ............................................................................................. 65

4.3.2 Atividade anticolinesterásica ................................................................................... 69

4.3.3 Atividade hemolítica................................................................................................. 71

4.3.4 Teste para detecção de -N-metilamino-L-alanina (BMAA) ............................... 71

4.3.5 Análise para a detecção de microcistinas (CLAE) ................................................ 74

5 CONCLUSÃO................................................................................................................. 80

REFERÊNCIAS ................................................................................................................ 82


1 INTRODUÇÃO

A disponibilidade de água tem se tornado uma crescente preocupação do século XXI,

em função do indiscriminado tipo de uso e aumento contínuo de interferências antrópicas,

fatores que juntos, comprometem a proporção desse recurso em quantidade/qualidade.

Segundo Di Bernardo (1995), a proteção dos mananciais é invariavelmente o melhor método

para assegurar a qualidade da água destinada ao consumo humano.

Atualmente, as populações dos grandes centros urbanos, industriais e de áreas de

desenvolvimento agrícola, com uso intensivo de insumos químicos, já se deparam com

problemas de escassez qualitativa de água para consumo humano. Deve-se ressaltar, ainda

que, se a escassez quantitativa de água constitui fator limitante ao desenvolvimento, a

escassez qualitativa causa problemas muito mais sérios à saúde pública, à economia e ao

ambiente em geral (REBOUÇAS, 2006).

Entre as ações humanas que podem alterar o balanço hídrico, destacam-se em escala

local e regional o desmatamento, a mudança do uso do solo, os projetos de irrigação e a

construção de barragens. Na escala planetária, destaca-se a mudança climática global

decorrente da alteração das características químicas da atmosfera com gases que promovem o

“efeito estufa”. Assim, é importante ressaltar que qualquer atividade humana que altere os

fatores básicos que determinam o balanço hídrico acaba por influir na disponibilidade dos

recursos hídricos de uma bacia hidrográfica (SALATI, LEMOS e SALATI, 2006).

Dessa forma, faz-se necessário o controle das ações antrópicas nas bacias

hidrográficas e o gerenciamento continuado de modo a preservar os corpos d´água existentes,

e assim, manter sua disponibilidade em quantidade e qualidade satisfatória.

A necessidade de monitoramento da água é ainda mais urgente na região semi-árida,

na qual segundo Vieira e Gondim Filho (2006), a idéia de seca, por sua vez, vai desde a falta

de precipitação, deficiência de umidade no solo agrícola, quebra de produção agropecuária,

até impactos sociais e econômicos negativos. Isso é devido, principalmente, à variabilidade

dos deflúvios, que juntamente com as altas taxas de evaporação do Nordeste, concorrem

decisivamente para que os rendimentos hidrológicos dos açudes sejam bastante baixos se

comparados aos de regiões temperadas.


1.1 LAGOAS DE ESTABILIZAÇÃO

A água, devido às suas propriedades de solvente e à sua capacidade de transportar

partículas, incorpora a si diversas impurezas, as quais definem a sua qualidade. Essa

qualidade é função do uso e da ocupação do solo na bacia hidrográfica, que se deve aos

fatores de condições naturais, mas sobretudo de interferência do homem, quer de uma forma

concentrada, como na geração de despejos domésticos ou industriais, quer de forma dispersa,

como na aplicação de defensivos agrícolas no solo. Tais ações contribuem para a introdução

de compostos na água, afetando a sua qualidade (VON SPERLING, 1996a).

O processo de lagoas de estabilização constitui uma tecnologia de tratamento de

esgoto atraente para pequenas e médias comunidades, principalmente devido ao baixo custo e

simplicidade operacional, boa eficiência de remoção de poluentes orgânicos e patógenos.

Entretanto, estes sistemas constituem-se em corpos d’água artificialmente eutrofizados, com o

seu efluente apresentando elevada concentração de nutrientes N e P (eutrofização),

promovendo condições suscetíveis a intensa proliferação de Cianobactérias e conseqüente

produção de toxinas (CRUZ et al., 2005).

Basicamente, os sistemas de Lagoas de Estabilização consistem no processo de

retenção dos esgotos por um período de tempo longo o suficiente para que os processos

naturais de estabilização da matéria orgânica se desenvolvam. O esgoto afluente entra em uma

extremidade da lagoa e sai na extremidade oposta. Ao longo desse percurso, que demora

vários dias, uma série de mecanismos contribuem para a purificação dos esgotos. Tais

mecanismos ocorrem nas três zonas das lagoas denominadas: zona anaeróbia, zona aeróbia e

zona facultativa (VON SPERLING, 1996b).

No Brasil o sistema de Lagoas de Estabilização mais empregado é denominado

sistema australiano, que consiste em lançar o esgoto bruto diretamente em uma lagoa,

geralmente em condições anaeróbias. Nesse caso, a lagoa clarifica o esgoto através da

sedimentação de sólidos e da posterior degradação biológica realizada no fundo da lagoa. Já

na zona aeróbia a matéria orgânica em suspensão e solúvel, é oxidada por bactérias ali

presentes que necessitam de oxigênio, o qual é fornecido pelas algas, através da fotossíntese.

Dessa maneira, conclui-se que locais com grandes intensidades luminosas e pouca

nebulosidade são propícios à implantação desse sistema (KELLNER e PIRES, 1998).

O sistema de Lagoas de Estabilização para o tratamento de esgoto implantado no

município de Juazeiro do Norte, CE, é constituído por lagoas em série de processos

anaeróbios e aeróbios (Figura 1). As condições de temperatura e fotoperíodo dessa região, as


quais não apresentam grandes flutuações, são fundamentais para o adequado funcionamento

do sistema, que assim, propicia uma maior eficiência na remoção das formas poluentes.

Esse sistema, pioneiro na Região do Cariri, representa uma importante contribuição

de ordem sanitária e ambiental, com funções como a eliminação e/ou redução de patogênicos

e proteção ao corpo d’água receptor. Porém, o controle do despejo de microalgas, bem como

das toxinas produzidas por estas, não é assegurado, já que estudos anteriores apontam

espécies potencialmente tóxicas como dominantes neste local (ALENCAR, OLIVEIRA e

LACERDA, 1999; FREITAS et al., 2006; AQUINO, FREITAS e LACERDA, 2007).

Figura 1 – Esquema do funcionamento do sistema de Lagoas de Estabilização do municípiode Juazeiro do Norte - Ceará. Fonte: CAGECE, 2010.

1.2 AS CIANOBACTÉRIAS

As Cianobactérias são organismos clorofilados, bastante heterogêneos, que através

de variadas características estruturais e fisiológicas peculiares, podem suportar um grande

número de condições adversas nos mais diversos tipos de ambientes, aquáticos ou terrestres.

As estratégias adaptativas, dentre outras formas de manutenção de seu crescimento, lhes


conferem vantagens competitivas com sucesso ecológico no desenvolvimento e distribuição

geográfica de sua diversidade.

O nome popular desses organismos, “algas azuis”, vem da coloração verde-azulada

das células quando vistas ao microscópio. Isto acontece por que suas células contêm

diferentes pigmentos fotossintéticos, tais como clorofila a – que dá coloração esverdeada –,

ficocianina que é azul e algumas espécies possuem também um pigmento vermelho, a

ficoeritrina (SOUZA, 2006).

A célula procariota das Cianobactérias pode ser distinguida das células das algas

eucariotas, ao microscópio óptico, pela ausência de plastos. Os pigmentos fotossintéticos e os

demais componentes celulares, tais como grânulos de cianoficina, substância de reserva,

aerótopos (vesículas gasosas), carboxissomos e ribossomos, estão dispersos no protoplasma

(AZEVEDO e SANT’ANNA, 2006).

A capacidade de crescimento nos mais diferentes meios é uma característica

marcante das Cianobactérias. Várias espécies vivem em solos e rochas onde desempenham

importante papel nos processos funcionais do ecossistema e na ciclagem de nutrientes.

Entretanto, ambientes de água doce são os mais importantes para o crescimento de

Cianobactérias em pH neutro, temperatura entre 15 e 30ºC e alta concentração de nutrientes,

principalmente nitrogênio e fósforo (AZEVEDO e VASCONCELOS, 2008).

Os organismos fitoplanctônicos, dos quais fazem parte as Cianobactérias, são

produtores primários e constituem a base de toda a cadeia alimentar. Além disso, pelo

processo fotossintético representam a principal fonte de oxigênio para o meio aquático, sem a

qual é impossível a sobrevivência de qualquer forma de vida animal (SANT’ANNA, GENTIL

e SILVA, 2006).

Florações superficiais que formam “natas” e que podem mudar a coloração da água

são compostas por cianobactérias que possuem aerótopos (vesículas gasosas) em suas células,

possibilitando a flutuação e permanência na superfície. Embora presentes em grandes

quantidades, algumas espécies de cianobactérias também com aerótopos não formam “natas”

e nem tornam a água esverdeada em virtude de não possuírem bainhas mucilaginosas que

agregam e mantêm os organismos juntos. Portanto, água que apresenta aspecto claro, não

necessariamente significa ausência de altas densidades de Cianobactérias (SOUZA, 2006).

De acordo com Ferrão-Filho, Molica e Azevedo (2009), a tragédia de Caruaru que

causou dezenas de mortes em 1996 pela ação de uma cianotoxina hepatotóxica, foi o grande

impulsionador para o aumento no número de pesquisas realizadas com Cianobactérias no país.

Os focos principais destas pesquisas buscam a compreensão de aspectos sobre a ecofisiologia


e ecotoxicologia, bem como o desenvolvimento de novas tecnologias para identificação de

espécies tóxicas. Além disso, as florações de Cianobactérias tóxicas foram reconhecidas como

um problema de saúde pública e foram estabelecidos limites máximos permitidos para estas

toxinas em água de abastecimento (Portaria MS 518/04, Ministério da Saúde 2004) e de usos

múltiplos (Resolução CONAMA 357/05, CONAMA 2005).

Pesquisas também voltadas à elucidação de metabólitos secundários bioativos com

ações anticolinesterásica, antioxidante, antifúngica, antibacteriana, hemolítica, dentre outros

com importância farmacológica, têm se tornado crescente em função da diversidade de

subtâncias bioativas que tem sido relacionadas à produção por Cianobactérias. Segundo

Sivonen e Jones (1999), as Cianobactérias são consideradas uma rica fonte de compostos

biomedicamente interessantes, a partir das quais é conhecida a produção de compostos

antitumorais, antivirais, antibióticos e antifúngicos. E por tal importância, screenings de

Cianobactérias para obtenção de novos bioativos têm estado em andamento.

1.3 FATORES PROMOTORES DAS FLORAÇÕES DE CIANOBACTÉRIAS E

CONSEQÜÊNCIAS

Os principais problemas de deterioração dos recursos hídricos estão relacionados

com o crescimento e a diversificação das atividades agrícolas, o aumento da urbanização e a

intensificação de atividades diversas nas bacias hidrográficas. Com isso, os inúmeros efeitos

diretos e indiretos produzidos no ciclo hidrológico incidem sobre a quantidade e a qualidade

das águas, que vem se tornando uma constante, frente ao crescimento mundial da população

humana (TUNDISI, 2005).

Assim, a partir do massivo crescimento populacional e o conseqüente grau de

urbanização, é produzida com mais intensidade a eutrofização artificial, enriquecimento de

nutrientes nos corpos d’água, principalmente por nitrogênio e fósforo, que de acordo com

Azevedo e Vasconcelos (2008), produz mudanças na qualidade da água, incluindo: a redução

de oxigênio dissolvido, perdas das qualidades cênicas, aumento do custo de tratamento, morte

extensiva de peixes e aumento da incidência de florações de Cianobactérias.

A entrada de nutrientes nos corpos d’água, como por exemplo nitrogênio e fósforo,

se deve dentre as variadas formas de aporte, às descargas de esgotos domésticos e industriais.

Segundo Tundisi (2005), entre os elementos que são requeridos para o crescimento de algas

fitoplanctônicas, o fósforo e o nitrogênio, constituem-se elementos críticos e limitantes, sendo

o fósforo, necessário para manter o crescimento em populações de algas, o que torna sua


demanda muito maior. Assim, com o suprimento suficiente de fósforo para acelerar o

crescimento e a capacidade de fixar N2 (o que lhes fornece vantagem competitiva sobre outras

algas), as Cianobactérias crescem rapidamente, formando extensas populações que se

desenvolvem próximas à superfície.

O grande teor de partículas em suspensão na água contribui para reduzir a quantidade

de luz que atravessa a coluna d’água, diminuindo sua transparência e aumentando sua

turbidez. Essa diminuição da luz na coluna d’água propicia o desenvolvimento de

Cianobactérias, que conseguem manter sua atividade fotossintética e formar grande biomassa,

mesmo em baixa intensidade luminosa (SANT’ANNA, GENTIL e SILVA, 2006).

Altos valores de pH mudam o equilíbrio das concentrações das formas de carbono na

água em direção à formação de CO2 e diminuição de O2, o que favorece o desenvolvimento de

Cianobactérias e prejudica os demais grupos fitoplanctônicos (JENSEN et al., 1994).

As florações ou blooms de Cianobactérias se caracterizam pelo intenso crescimento

desses microorganismos na superfície da água, formando densa camada de células com vários

centímetros de profundidade, com conseqüências para a saúde pública (AZEVEDO e

VASCONCELOS, 2008).

No entanto, nem todas as florações de Cianobactérias são tóxicas e algumas podem

ser tóxicas apenas durante um período do ano, do mês ou da semana. A razão mais

comumente aceita é a dominância de cepas tóxicas e não tóxicas, as quais, quando são da

mesma espécie, não podem ser separadas fenotipicamente (MOLICA e AZEVEDO, 2009).

Porém grande atenção deve ser dada ao monitoramento das espécies tóxicas em função dos

danos que podem causar, principalmente, à saúde humana.

Além dos riscos à saúde, essas algas, quando em grandes quantidades, podem causar

obstrução de filtros nas estações de tratamento de água e também tornar a qualidade da água

indesejável para consumo, pois os metabólitos que produzem podem conferir gosto e odor

desagradáveis à água (ZAGATTO et al., 1997). O gosto e odor desagradáveis são devidos a

metabólitos como a geosmina e o 2-methylisoborneol (2-MIB) (SOUZA, 2006).

1.4 TOXINAS DE CIANOBACTÉRIAS

Segundo Sivonen e Jones (1999), as cianotoxinas são um grupo diverso de toxinas

naturais tanto do ponto de vista químico quanto toxicológico. Apesar de sua origem aquática,

a maioria dos cianotoxinas que foram identificadas até agora parecem ser mais perigosas aos

mamíferos terrestres do que à biota aquática. As Cianobactérias produzem uma variedade de


metabólitos incomuns, cuja função natural é desconhecida, embora alguns, talvez apenas

coincidentemente, provoquem efeitos a outras biotas. De acordo com Calijuri, Alves e Santos

(2006), alguns pesquisadores acreditam que as cianotoxinas desempenhem funções de defesa

em relação às espécies zooplanctônicas, seus predadores primários.

As toxinas de Cianobactérias são caracterizadas como endotoxinas por serem,

geralmente, liberadas apenas quando acontece o rompimento da célula (CARMICHAEL,

1997).

Segundo sua estrutura química, as toxinas de Cianobactérias são classificadas como

alcalóides, peptídeos cíclicos e lipopolissacarídeos (CALIJURI, ALVES e SANTOS, 2006).

Algumas cianotoxinas são caracterizadas por sua ação rápida, sendo as que causam a

morte de mamíferos por parada respiratória após poucos minutos de exposição, identificadas

como alcalóides ou organofosforados neurotóxicos. Outras atuam de forma mais lenta e são

identificadas como peptídeos ou alcalóides hepatotóxicos (CHORUS e BARTRAM, 1999).

Desta forma, pela ação farmacológica, as duas principais classes de cianotoxinas até

agora caracterizadas são: neurotoxinas e hepatotoxinas (MOLICA e AZEVEDO, 2009), como

podem ser vistas suas características na Tabela 1, e estruturas químicas na Figura 2. Assim, é

evidente que a toxicidade das Cianobactérias é bastante complexa. Conforme Carmichael

(1997), uma espécie de cianobactéria pode produzir mais de um tipo de toxina e dentro de

uma mesma espécie podem existir cepas produtoras e cepas não produtoras de toxinas. Estas

moléculas estão divididas em três classes principais: dermatotoxinas, neurotoxinas e

hepatotoxinas, sendo estas duas últimas as mais freqüentemente encontradas em corpos

d’água e que geram maiores preocupações.

A detecção de Cianobactérias tóxicas e de suas cianotoxinas é fundamental para o

gerenciamento seguro da água. Tradicionalmente, a identificação microscópica dessas algas

tem sido usada só ou em combinação com análise direta para toxinas. A discriminação

morfológica entre Cianobactérias tóxicas e não-tóxicas pode ser difícil, porque alguns gêneros

contêm ambos os representantes, tóxicos e não-tóxicos. Algumas espécies são conhecidas

como tóxicas, algumas podem ser geneticamente capazes de produzir toxinas (toxigênicas),

mas podem não produzir sob todas as condições, e algumas não produzem nenhuma toxina.

Métodos de detecção DNA-baseados ficaram populares por causa de sua especificidade

potencial (elucidar genes envolvidos na biossíntese de toxina), sensibilidade e velocidade

(OUELLETTE e WILHELM, 2003).

Para avaliar os riscos específicos de toxinas de Cianobactérias é necessário

compreender as suas propriedades químicas, regulamentação da sua produção, mecanismos de


ação, que são diversos, e seu destino nos ambientes, sendo de valiosa importância o

monitoramento em águas destinadas ao consumo humano.

O número de relatos de ocorrências de florações de Cianobactérias em todo o mundo

vem aumentando consideravelmente e na maioria desses episódios, as toxinas dominantes são

as microcistinas (CARVALHO et al., 2008). As microcistinas, hepatotoxinas mais

comumente encontradas em blooms de água doce, são peptídeos cíclicos formados por sete

aminoácidos, sendo caracterizadas de acordo com o arranjo desses aminoácidos na molécula,

podendo levar à morte em algumas horas por hemorragia no fígado. Cerca de 60 variações

estruturais de microcistinas já foram identificadas, sendo que as mais conhecidas são MC-RR;

MC-YR; MC-LR e MC-LA (SIVONEN e JONES, 1999).

Com relação às toxinas, embora só tenham sido detectadas e identificadas em alguns

gêneros, todas as Cianobactérias, a princípio, são consideradas potencialmente tóxicas

(SOUZA, 2006).

Segundo Sant’Anna e Azevedo (2000), considerando o processo de eutrofização

acelerado de muitos corpos d’água, as freqüentes ocorrências de blooms de Cianobactérias e o

pouco conhecimento de espécies tóxicas brasileiras, urge a necessidade de uma melhor

compreensão das Cianobactérias potencialmente tóxicas e de sua distribuição no Brasil. Esses

autores, com base na avaliação de dados na literatura brasileira e amostras examinadas,

afirmam que a maioria das espécies potencialmente tóxicas de Cianobactérias ocorrem em

ambas as áreas, tropical e subtropical do Brasil.

Os principais gêneros na produção de toxinas são Microcystis Kützing

(Lemmermann), Anabaena Bory (Bornet e Flahault), Oscillatoria Vaucher (Gomont),

Planktothrix Anagnostidis e Komárek, Aphanizomenon Morren (Bornet e Flahault),

Cylindrospermopsis Seenayya e Subba Raju, bem como Raphidiopsis Fritsch e Rich.

Microcystis é o gênero mais comum e amplamente distribuído (CARMICHAEL, 1996).

Para o Brasil, entre os gêneros potencialmente nocivos, destacam-se Microcystis,

Anabaena, Cylindrospermopsis, Oscillatoria, Planktothrix e Aphanocapsa (CALIJURI,

ALVES e SANTOS, 2006).

Para as Cianobactérias, é importante a identificação dos organismos dominantes,

pelo menos até o nível genérico, para saber se já são conhecidos seus efeitos tóxicos e

direcionar a escolha da técnica analítica para a determinação da toxina, já que diferentes

gêneros e espécies produzem diferentes toxinas (AGUJARO, 2006).

A determinação de uma proliferação de Cianobactérias tóxicas simplesmente pela

aparência é inviável, e a maior dificuldade no estudo de cianotoxinas encontra-se nos métodos


disponíveis para detecção e avaliação de toxidade. A identificação desses organismos, com

base em características morfológicas, apesar de amplamente utilizada e recomendada, tem se

mostrado insuficiente devido à extensa plasticidade fenotípica de algumas espécies. Por isso,

outras técnicas também podem ser empregadas e são recomendadas como padrão: bioensaios

com camundongos, detecção de toxinas através de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

(CLAE) ou análises imunoenzimáticas específicas (BITTENCOURT-OLIVEIRA et al.,

2001).

Tabela 1 – Características gerais das principais toxinas de Cianobactérias (Modificado deSIVONEN e JONES, 1999).

Tipo de ToxinaPrincipal Órgão

Alvo em Mamíferos

PrincipaisGêneros de

Cianobactérias

Hepatotoxinas

Microcistina Fígado

Microcystis, Anabaena,Planktothrix (Oscillatoria),

Nostoc, Hapalosiphon,Anabaenopsis

Nodularina Fígado Nodularia

Neurotoxinas

Anatoxina-a Nervo SinápticoAnabaena,

Planktothrix (Oscillatoria),Aphanizomenon

Anatoxina-a (S) Nervo Sináptico Anabaena

Saxitoxinas Nervo Axônico

Anabaena,Aphanizomenon, Lyngbya,

Cylindrospermopsis,Planktothrix1

Citotoxina

Cilindrospermopsina Fígado

Cylindrospermopsis,Aphanizomenon,

Umezakia

Dermatotoxina

Lipopolissacarídeo(LPS)

Afeta tecidos expostos(irritante potencial)

Todos

1. De acordo com Codd et al., 2005.


Figura 2 – Estrutura química dos principais tipos de cianotoxinas (Adaptado de SIVONEN eJONES, 1999).


1.4.1 β-N-metilamino-L-alanina (BMAA) – A mais recente toxina de Cianobactérias

Recentes pesquisas, como as realizadas por Cox et al. (2003; 2005), tem descoberto

uma nova toxina produzida por Cianobactérias, β-N-metilamino-L-alanina (BMAA), a qual é

classificada como neurotoxina em função do seu modo de ação sobre áreas do Sistema

Nervoso Central. De acordo com os mesmos autores, é sabido que essa toxina uma vez no

organismo, se acumula no cerébro e é responsável por doenças neurodegenerativas, como

Esclerose Lateral Amiotrófica/Parkinsonismo.

β-N-metilamino-L-alanina (BMAA), foi originalmente descoberto nas sementes de

uma cicadácea, Cycas circinalis, por Vega e Bell (1967). BMAA é um aminoácido não

protéico e estruturalmente aparece como uma alanina metilada. A princípio, a fonte de BMAA

em cicadáceas era desconhecida. No entanto, dada as suas profundas propriedades

neurotóxicas, a ocorrência de BMAA nessas plantas pode funcionar como um impedimento

químico à herbivoria (COX, BANACK e MURCH, 2003). Esse aminoácido neurotóxico,

ocorre na forma livre ou ligado à proteina (MURCH, COX e BANACK, 2004b).

Cicadáceas são plantas de sementes não florescentes de linhagem antiga. Essas

gimnospermas apresentam ocorrência comum para a região tropical e subtropical e são

tipicamente usadas na alimentação humana (VEGA e BELL, 1967).

As sementes de plantas cicadáceas, como Cycas micronesica Hill, que eram bastante

usadas pelo povo indígena Chamorro como uma fonte de farinha para elaboração de

alimentos, como tortas, inclui a presença da neurotoxina β-N-metilamino-L-alanina (BMAA),

que tem implicações em doenças neurodegenerativas ocorridas nessa população, na Ilha de

Guam no Oceano Oste do Pacifíco (BANACK e COX, 2003).

Assim, antes de 2003, a ocorrência de BMAA somente havia sido registrada em

cicadáceas, limitando a potencial exposição humana aos ambientes terrestres tropicais e

subtropicais, onde estas plantas crescem e então, somente aos povos indígenas que

consumiam produtos de cicadáceas ou animais que se alimentavam delas (COX et al., 2005).

No entanto, Cox, Banack e Murch (2003), através de culturas axênicas de Cianobactérias

Nostoc isoladas a partir de raízes coralóides de Cycas micronesica, verificaram que tais

Cianobactérias vivem como endossimbiontes nas raízes coralóides, invadindo uma região

especializada da raiz, de onde foram encontradas com produção de 0.3 µg/g de BMAA. Esses

autores verificaram que, através de níveis tróficos em ordem crescente na Ilha de Guam,

ocorre a biomagnificação dessa neurotoxina, a qual foi analisada acontecer de Cianobactérias


para Cycas (37 µg/g) e destas para raposas voadoras (3.556 µg/g), espécies de morcegos, que

por sua vez, eram consumidas pelo povo indígena, denominado Chamorro, na Ilha de Guam.

A relação de BMAA como principal causa de desordens neurodegenerativas

ocorridas em Guam, foi originalmente feita por Spencer et al. (1986), que a partir de estudos

em macacos com a doença esclerose lateral amiotrófica/complexo de demência

parkinsonismo (ALS/PDC), verificaram BMAA como indutor de danos no neurôneo motor.

Mais tarde Cox, Banack e Murch (2003), também em Guam, encontraram BMAA livre nos

tecidos cerebrais do córtex frontal de pacientes da população Chamorro que morreram vítimas

de ALS/PDC. Já Murch et al. (2004a), da mesma forma, constatou a presença de BMAA,

livre e na fração protéica, de pacientes com a mesma doença neurodegenerativa na referida

população.

A doença de desordem neurológica progressiva e incidente nos povos indígenas

Chamorro, tem características clínicas e patológicas semelhantes a esclerose lateral

amiotrófica (ALS), doença de Parkinson e doença de Alzheimer (COX, BANACK e

MURCH, 2003; MURCH et al., 2004a).

Uma das evidências que também relacionou BMAA como agente patológico da

doença neurodegenerativa (ALS/PDC) ocorrida em Guam foi verificada por Banack e Cox,

(2003), que em estudos realizados com espécimes de morcegos, denominados como raposas

voadoras, constataram uma abundância de BMAA na pele desses animais. Assim, uma vez

que estes integravam o hábito alimentar do povo Chamorro de Guam, os autores sugeriram

que o consumo abundante estaria relacionado à ingestão involuntária de altas doses de

BMAA.

Cox, Banack e Murch (2003) e Murch et al. (2004a), também constataram a presença

de BMAA em tecidos cerebrais de indivíduos canadenses que sofriam com a doença de

Alzheimer na mesma faixa de concentração que foi verificada em pacientes da população

Chamorro de Guam. Segundo esses autores, como BMAA era conhecido anteriormente

somente a partir de cicadáceas, e estas não ocorrem naturalmente no Canadá, as

Cianobactérias devem ser investigadas como a possível fonte de qualquer BMAA encontrado

em canadenses que sofrem de doença neurológica progressiva. Dado que, as Cianobactérias

apresentam distribuição em ambientes terrestres e aquáticos, isso abre a possibilidade da

neurotoxina BMAA ser biomagnificada por diferentes maneiras em vários ecossistemas.

Segundo Cox et al. (2005), BMAA é produzido por Cianobactérias planctônicas,

incluindo representantes de todas as cinco seções desse grupo. Os autores evidenciaram esse

resultado em 95% do total de gêneros testados (20 de 21 representantes selecionados


randomicamente), o que consideram ser BMAA, de significância ecológica e evolutiva. Esses

novos dados mostram que BMAA é produzido por cianobactérias de regiões geográficas e

ambientes diversos em todo o mundo. De acordo com Jonasson et al. (2010), dessa forma,

BMAA pode se propagar globalmente em ecossistemas terrestres e aquáticos.

1.5 TESTES DE TOXICIDADE EM CAMUNDONGOS

Segundo Calijuri, Alves e Santos (2006), os métodos de detecção de cianotoxinas em

águas doce e marinha, tiveram origem com bioensaios em camundongos, utilizados desde o

inicio do século XX. Já no início da década de 1980, métodos de detecção mais sofisticados

foram desenvolvidos, como ensaios enzimáticos e métodos analíticos como a cromatografia

líquida de alta eficiência (CLAE) e a espectrometria de massas.

Ainda que ocorram algumas limitações, o bioensaio em camundongo continua a ser

o principal meio de avaliação da função e potência das cianotoxinas (DOW e SWOBODA,

2000). Isso é corroborado por Azevedo e Vasconcelos (2008), que consideram como ensaios

mais comuns e mais antigos aqueles com camundongos, que têm a vantagem de num único

ensaio poder diferenciar os sintomas do tipo de toxina existente – neurotoxinas e

hepatotoxinas –, sendo rápidos, fáceis de executar e a resposta pode ser obtida no próprio dia

de recepção das amostras.

Os sinais clínicos de intoxicação apresentados pelos animais submetidos às análises

toxicológicas, aliados à identificação das Cianobactérias presentes na amostra em estudo,

podem fornecer indicações a respeito da classe química a qual pertence a ficotoxina,

apontando a análise química adequada à sua caracterização e quantificação (CARVALHO,

2006).


2 OBJETIVOS

2.1 GERAL

o Determinar a ocorrência de Cianobactérias e identificar a presença de metabólitos

secundários bioativos a partir de amostragens coletadas nas Lagoas de Estabilização

da Estação de Tratamento de Esgoto (ETE) do Município de Juazeiro do Norte, Ceará.

2.2 ESPECÍFICOS

o Conhecer a biodiversidade das Cianobactérias e correlacioná-las aos parâmetros

ambientais, avaliando a influência destes na composição quali-quantitativa das

espécies;

o Avaliar a variação das espécies de Cianobactérias durante o período de estudo;

o Detectar substâncias bioativas com ações: anticolinesterásica, antioxidante e

hemolítica;

o Determinar a toxicidade das Cianobactérias, através de ensaios em camundongos;

o Caracterizar a classe química das cianotoxinas detectadas;

o Identificar as toxinas biossintetizadas pelas Cianobactérias ocorrentes;

o Avaliar os riscos de exposição às espécies causadoras da floração.


3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 ÁREA DE ESTUDO

A Estação de Tratamento de Esgoto (ETE Malvas) de Juazeiro do Norte – CE tem

por finalidade o tratamento das águas servidas e contaminadas (esgotos), provenientes das

áreas urbanas delimitadas pelos bairros: Salesiano, Centro, São Miguel, Pio XII, Romeirão,

Pirajá, Franciscano, Santa Tereza, Limoeiro, Vila Fátima, João Cabral, Conj. Almino Loiola e

Malvas, dos quais essas águas residuárias são captadas pelas EEEs mais próximas (Estação

Elevatória de Esgoto) e a partir destas, conduzidas à ETE, onde são tratadas e só então,

lançadas no corpo aquático, neste caso o rio Salgado, seu receptor (Figura 3). A ETE Malvas

é operada pela Companhia de Água e Esgoto do Ceará (CAGECE), Unidade de Negócio da

Bacia do Salgado UN-BSA e está inserida na Região do Cariri Central, ao Sul do Ceará,

latitude (S) 7° 11' 33'' e longitude (W) 39° 18' 38'', sendo constituída por cinco lagoas de

estabilização, das quais duas são de processos anaeróbios e três de processos aeróbios (Figura

4).

Figura 3 – Fluxograma da estrutura de funcionamento do Sistema de Esgotamento Sanitário(SES) de Juazeiro do Norte - Ceará. Fonte: CAGECE, 2010.


Figura 4 – (A) Localização geográfica do município de Juazeiro do Norte, inserido na Regiãodo Cariri Central, Estado do Ceará, Brasil; (B) Foto aérea das Lagoas deEstabilização da Estação de Tratamento de Esgoto (ETE) e (C) Esquema daestrutura das Lagoas de Estabilização da ETE. Fontes: (A) Secretaria das Cidadesdo Estado do Ceará, 2009; (B) Arquivo pessoal e (C) CAGECE, 2010.


Dados como, pH e temperatura, foram cedidos pela Companhia de Água e Esgoto do

Ceará (CAGECE) de Juazeiro do Norte - Ceará, para a complementação desse estudo. Quanto

aos dados pluviométricos, estes foram disponibilizados pela Fundação Cearense de

Meteorologia e Recursos Hídricos – FUNCEME.

3.2 ESTUDOS TAXONÔMICOS

3.2.1 Coleta e tratamento das amostras

As amostras para o estudo do fitoplâncton, especificamente Cianobactérias, foram

coletadas mensalmente na superfície das lagoas de estabilização de processos aeróbios da

ETE/Juazeiro do Norte designadas como: Lagoa Facultativa A, Lagoa Facultativa B e Lagoa

de Maturação (Figura 5), no período de Fevereiro a Junho/2010, totalizando 5 amostragens

para cada lagoa. Tendo sido utilizados frascos apropriados (≈250 mL) para obtenção de três

subamostras, sendo uma para análise do material in vivo e outras para preservação com lugol

acético e fixação com formol neutro a 4%. Em seguida, as amostras foram transportadas para

o acervo do Laboratório de Botânica da Universidade Regional do Cariri, URCA, onde foram

devidamente armazenadas.

Figura 5 – Lagoas de Estabilização da Estação de Tratamento de Esgoto (ETE) de Juazeiro doNorte - Ceará. Fonte: CAGECE, 2006.


Esse Sistema de Lagoas de Estabilização associadas em série consiste no tratamento

biológico de águas residuárias e segundo dados da CAGECE (2010), apresenta um número de

19.602 ligações ativas, com extensão total de rede no valor de 149.219,36 m e vazão estimada

em 71,03 (L/s). O tipo de sistema é Convencional/Condominial e o índice de cobertura de

esgoto é estimado em 39,52%. Demais características estão apresentadas na Tabela 2.

Tabela 2 – Características físicas das Lagoas de Tratamento Biológico do município deJuazeiro do Norte – CE.

Lagoa Comp. x Larg. (m) Área (m2) Profundidade (m) Volume (m3)

Anaeróbia A 86,04 x 102 8.776,08 4,5 39.492,36

Anaeróbia B 86,04 x 102 8.776,08 4,5 39.492,36

Facultativa A 558,1 x 105,5 58.879,55 1,5 88.319,32

Facultativa B 558,1 x 105,5 58.879,55 1,5 88.319,32

Maturação 558,1 x 113,7 63.455,97 1,0 63.455,97

Fonte: CAGECE, 2010.

3.2.2 Análise qualitativa da comunidade

As amostras in vivo, mantidas em baixa luminosidade e baixa temperatura, bem

como as fixadas com formol neutro a 4% foram analisadas em microscópio óptico BIOVAL

L2000A acoplado a uma câmara fotográfica, sendo a análise taxonômica realizada com base

no exame morfológico e morfométrico. Quando necessário, foi utilizado nanquim para

evidenciar a bainha mucilaginosa. Deste modo, as Cianobactérias foram identificadas e

quando possível fotomicrografadas.

Para cada amostra, foram examinadas tantas lâminas quantas necessárias para que a

avaliação abrangesse uma população de 20 a 30 indivíduos, de cada táxon. A identificação foi

feita em nível genérico e infragenérico, e os exames para confirmação das espécies, realizados

no Laboratório de Microscopia do Núcleo de Pesquisa em Ficologia do Instituto de Botânica

de São Paulo.

A avaliação da composição florística consistiu na análise de sua diversidade, sendo

que, para identificação dos táxons, foram consultadas bibliografias especializadas, tais como:

Desikachary (1959), Prescott (1962), Mizuno (1968), Compère (1976), Parra, Gonzales e


Delarrosa (1983), Streble e Krauter (1987), Parra e Bicudo (1993), Bicudo e Menezes (2005),

Sant’Anna, Gentil e Silva (2006), dentre outras.

O sistema de classificação adotado para identificação de Cyanobacteria foi

Anagnostidis e Komárek (1988), Komárek e Anagnostidis (1989, 1999, 2005).

3.2.3 Frequência de ocorrência dos táxons

De acordo com Mateucci e Colma (1982), a frequência de ocorrência foi expressa em

termos de porcentagem, através da fórmula:

Onde,

a = número de amostras em que o táxon ocorreu;

A = número total de amostras.

Em função do valor de F, os táxons foram classificados nas seguintes categorias:

3.2.4 Abundância relativa dos táxons

Para os cálculos da abundância relativa foram quantificados os 100 primeiros

organismos na lâmina, sendo os demais considerados presentes ou ausentes.

Segundo Lobo e Leighton (1986), a abundância relativa foi expressa em

porcentagem e calculada com base na seguinte fórmula:

Ar= N.100/n

F= a.100/A

Muito Freqüente > 70%

Freqüente ≤ 70 > 40%

Pouco freqüente ≤ 40 > 10%

Esporádica ≤ 10%


Onde,

N = número de indivíduos encontrados para cada espécie;

n = número total de indivíduos de cada amostra.

A partir dos resultados obtidos, os táxons foram enquadrados nas seguintes categorias:

3.2.5 Diversidade e Equitabilidade

A riqueza de espécies (S) foi considerada como o número total de espécies presentes

em cada amostra.

Para os cálculos da diversidade específica (H’), utilizou-se o índice de Shannon

(1948), de acordo com a equação abaixo:

s

H’= - Σ pi x ln pii=1

Onde,

pi = Ni/N, e consiste na probabilidade de que um indivíduo pertença à espécie i contido nas

amostragens;

Ni = número de indivíduos amostrados da espécie i;

N = número total de indivíduos amostrados;

ln = logaritmo neperiano.

A diversidade foi expressa em bits.ind-1 e com base nas observações de Magurran

(2004), foi adotada a seguinte classificação: < 1,0 = diversidade muito baixa; < 2,0 ≥ 1,0 =

diversidade baixa; < 3,0 ≥ 2,0 = diversidade média; ≥ 3,0 = diversidade alta.

Dominante > 50%

Abundante > 30 ≤ 50%

Pouco Abundante ≤ 30 > 10%

Rara ≤ 10%


A equitabilidade (J) é expressa entre 0 e 1, sendo obtida pela proporção entre o

índice de Shannon (H’) e o valor máximo que este assumiria (H’max), caso os indivíduos

fossem distribuídos uniformemente entre as espécies:

H’J =

H’max

Onde,

H’ = índice de Shannon;

H’max = ln (S):

ln = logaritmo neperiano,

S = número total de espécies amostradas.

A diversidade e a equitabilidade foram calculadas com a utilização do software

Ecological Measures (KOTILA, 1986).

3.3 ESTUDOS QUÍMICOS E ENSAIOS

Para a investigação da presença de metabólitos secundários bioativos (tóxicos ou

apresentando ações antioxidante, anticolinesterásica e hemolítica) foram coletadas 10 (dez)

amostras de biomassa de Cianobactérias das Lagoas de Estabilização de Tratamento de

Esgoto – ETE/Juazeiro do Norte-CE. A periodicidade da amostragem foi mensal, abrangeu os

meses de abril a junho/2010 e resultou no total de 10 (dez) amostras: 3 (três) amostras de cada

lagoa de processo aeróbio: Lagoa Facultativa A, Facultativa B e de Maturação, e 1 (uma)

amostra para a saída da Estação de Tratamento, no ponto de lançamento no Rio Salgado (esta

coletada no mês de junho/2010).

3.3.1 Coleta da Biomassa

As florações de Cianobactérias foram coletadas com rede de plâncton (45µm), para

concentração da biomassa, até volume de aproximadamente 3L para cada amostra. As

amostras assim obtidas foram devidamente acondicionadas e mantidas sob baixa temperatura

em recipiente com gelo, para o transporte ao Laboratório de Botânica da Universidade


Regional do Cariri – URCA, onde foram armazenadas. Essas amostras foram filtradas a

vácuo, no mesmo dia em que foi realizada a coleta, no Laboratório de Pesquisa de Produtos

Naturais (LPPN) – URCA. Esse processo consistiu de pré-filtração em papel filtro 150 mm,

gramatura 80g, seguida de filtração em membrana de microfibra de vidro, AP20, 47 mm, de

todo o filtrado obtido na pré-filtração.

Os filtros contendo as células de Cianobactérias foram embalados, identificados e

congelados a -20 ºC, até o momento em que foram submetidos à extração.

3.3.2 Obtenção dos Extratos

Esta etapa do trabalho foi realizada no Laboratório de Química do Núcleo de

Pesquisa em Ficologia do Instituto de Botânica de São Paulo, sob a supervisão da Dra.

Luciana Retz de Carvalho.

Os filtros congelados contendo as células concentradas foram liofilizados,

submetidos à extração (5x) com ácido acétido 0,1 M, por exposição a ultra-som (5x, 30 min.,

50 W), seguida de centrifugação (3000 rpm, por 50 minutos), sendo os sobrenadantes de cada

extração filtrados e combinados, para liofilização. Após a liofilização, foi determinado o peso

do extrato total e dele foram separadas as quantidades de 100 mg e de 60 mg para estudos

químicos e para teste toxicológico em camundongos, respectivamente.

O extrato seco condicionado foi fracionado em coluna de gel de sílica

octadecilsilanizada (ODS-C18 - Bond Elut), previamente ativada com 75 mL de MeOH 100%

e de ácido acético 0,1 M , respectivamente, sendo eluído com 75 mL de cada um dos

componentes do seguinte gradiente:

(1) ácido acético 0,1 M;

(2) ácido acético 0,1 M / metanol 80:20 (v/v);

(3) ácido acético 0,1 M / metanol 50:50 (v/v);

(4) ácido acético 0,1 M / metanol 10:90 (v/v) e

(5) metanol 100%.

A fração (1), eluída em ácido acético 0,1 M, foi liofilizada e as demais (2), (3), (4) e

(5) foram concentradas a vácuo, para eliminação do solvente orgânico e liofilizadas.

A fração (1) foi utilizada para pesquisa cromatográfica de β-N-metilamino-L-alanina

(BMAA) por Cromatografia Planar (PIETRZYK, 1989) e a fração (3) foi submetida à análise


por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) para detecção de microcistinas

(CARVALHO et al., 2008).

3.3.3 Ensaio de toxicidade em camundongos (intraperitonial – i.p.)

O teste de toxicidade preconizado pela Organização Mundial da Saúde (HARADA et

al., 1999) consiste na administração da amostra (n = 3), por via intraperitonial, em

camundongos machos “Swiss-Webster”, pesando de 19 a 21 g. Para cada animal-teste, foram

administrados 20 mg de extrato de células liofilizado e reconstituído com até 1 mL de água

destilada. Os animais foram observados por 7 (sete) dias, sendo os sintomas de intoxicação e

o tempo de sobrevida anotados. Após o 7º dia de observação os animais foram eutanaziados e

submetidos a exames “post-mortem”.

As doses utilizadas para esses testes foram escolhidas com base no fator “f”,

empregado nos estudos toxicológicos de Dinoflagelados e de Cianobactérias (HARADA et

al., 1999) e determinado pela relação:

f = mg de células liofilizadas x Kg de peso corpóreo-1

Onde o numerador corresponde à quantidade de biomassa utilizada no ensaio e o

denominador, ao peso corpóreo do camundongo, animal escolhido para o teste.

3.3.4 Prospecção de substâncias bioativas

3.3.4.1 Atividade Antioxidante

A determinação da atividade antioxidante foi realizada na Seção de Fisiologia e

Bioquímica de Plantas (IBt/SP). As amostras submetidas a este teste estão descriminadas no

ítem 3.3 ESTUDOS QUÍMICOS E ENSAIOS.

Esse ensaio ocorreu em placa cromatográfica (20x20cm, sílica gel 60, Merck), na

qual os extratos na concentração de 25 µg/µl de CHCl3/MeOH/H2O (64:36:8, v/v/v) foram

aplicados e eluídos com a mesma mistura de solventes, clorofórmio: metanol: água (64:36:8,

v/v/v). Após o desenvolvimento da cromatografia, a placa foi secada e nebulizada com uma

solução metanólica (2 mg.mL-1) do radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazila (DPPH), um radical

estável, que permite detectar substâncias com atividade antioxidante.


O cromatograma obtido foi observado sob luz ultravioleta de comprimentos de onda

254 nm e 366 nm, e fotografado em câmera fotográfica Epson.

3.3.4.2 Atividade Anticolinesterásica

A determinação da Atividade Anticolinesterásica também foi realizada na Seção de

Fisiologia e Bioquímica de Plantas (IBt/SP). As amostras submetidas a este teste estão

descriminadas no ítem 3.3 ESTUDOS QUÍMICOS E ENSAIOS.

Esse ensaio ocorreu em placa cromatográfica (20x20cm, sílica gel 60, Merck), na

qual os extratos na concentração de 25 µg/µl de CHCl3/MeOH/H2O (64:36:8, v/v/v) foram

aplicados e eluídos com a mesma mistura de solventes, clorofórmio: metanol: água (64:36:8,

v/v/v). Após o desenvolvimento da cromatografia, a placa foi secada e borrifada com a

solução da enzima acetilcolinesterase (6,66 U) acrescida de albumina bovina fração V (0,1%)

e o solvente evaporado novamente. A placa cromatográfica foi incubada em uma câmara

úmida fechada, a 37°C, por 20 minutos e em seguida, borrifada com uma mistura das

soluções: etanólica de acetato de 1-naftila (5 mL; 0,25%) e aquosa do sal Fast Blue B (20 mL;

0,25%) (MARSTON et al., 2002).

Neste procedimento de derivatização, o acetato de 1-naftila e a solução de sal Fast

Blue B colorem a placa cromatográfica com cor roxa em 2 minutos; as substâncias com ação

antienzimática aparecem como halos brancos, sobre este fundo púrpura (MARSTON et al.,

2002).

O cromatograma obtido foi observado sob luz Ultravioleta de comprimentos de onda

254 nm e 366 nm, e fotografado em câmera fotográfica Epson.

3.3.4.3 Atividade Hemolítica

Esse teste de ação hemolítica foi realizado no Instituto Butantan/SP, segundo o

método descrito por Rangel et al. (1997) e que consiste no seguinte processo: uma alíquota de

sangue obtido de camundongo (Biotério Central do Instituto Butantan) foi colocada em um

béquer contendo volume aproximadamente 30 vezes maior de solução fisiológica Krebs-

Henseleit (NaCl 113mM; KH2PO4 1,2mM; KCl 4mM; MgSO4.7H2O 1,2mM; CaCl2 2,5mM;

NaHCO3 25mM; C6H12O6 11,1mM). O béquer foi mantido sob agitação constante, por 15

minutos sendo seu conteúdo, a seguir, centrifugado 3 vezes, por 3 minutos, a 3000 rpm, para


lavar os eritrócitos de componentes plasmáticos; com o centrifugado, foi preparada uma

suspensão de eritrócitos (SE) a 0,5 % (V/V), em solução fisiológica de Krebs-Henseleit.

Extratos das amostras LFA1, LFA2, LFA3 – LFB3 – LM1 (descriminadas no ítem

3.3) diluídos em solução fisiológica de Krebs-Henseleit foram colocados em tubos eppendorf

e sobre eles foram adicionados 500 µL de SE a 0,5 %. Como controle negativo foi utilizada

solução fisiológica e como controle positivo, o detergente Triton X-100 a 1% (hemólise total).

Após duas horas de incubação à temperatura ambiente, sob agitação constante, as amostras

foram centrifugadas a 3000 rpm, por 5 min. Os sobrenadantes obtidos foram transferidos para

placa de ELISA e a leitura da atividade hemolítica efetuada em comprimento de onda de 540

nm.

3.3.5 Prospecção de Cianotoxinas

3.3.5.1 Teste para detecção de -N-metilamino-L-alanina (BMAA)

Essa análise foi realizada segundo o método descrito por Vega e Bell (1967), na

fração (1) (em ácido acético 0,1 M), obtida no processo de fracionamento em coluna de sílica

octadecilsilanizada, descrito no ítem 3.3.2. Parte do material liofilizado foi pesado, suspenso

em água deionizada (100 µg/µl), aplicado em placas cromatográficas (20x20cm, sílica gel 60,

Merck) e comparados com o padrão β-N-metilamino-L-alanina. Foram utilizadas como fases

móveis, clorofórmio: metanol: água (64:36:8, v/v/v) e butanol: ácido acético: água (5:2:3,

v/v/v). Para cada fase móvel referida foi desenvolvida uma placa, a qual foi submetida ao

processo cromatográfico por 3 vezes.

Após o desenvolvimento, as cromatoplacas foram secadas em corrente de ar,

nebulizadas com o agente derivatizante ninidrina e em seguida aquecidas a 110°C. Manchas

de β-N-metilamino-L-alanina, após derivatização, adquirem a cor roxa (MERCK, 1971).

As cromatoplacas obtidas por esse processo foram devidamente fotografadas.


3.3.5.2 Análise de microcistinas

A fração (3) das amostras, descrita no ítem 3.3.2., foi analisada quanto à presença de

microcistinas por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), segundo método de Harada

et al. (1999). Para tanto, a quantidade de 2,5 mg da fração (3), ressuspenso em água

deionizada e filtrado em membranas PVDF (13mm x 0,2µm) foi aplicado em duplicata ao

cromatógrafo, sob as seguintes condições:

• Cromatógrafo líquido Dionex, equipado com bomba automática P680 HPLC;

• Coluna CN analítica;

• Detector UV-PDA; Comprimentos de onda fixos: λ 220 e 238nm;

• Injetor automático;

• Software Chromeleon® Chromatography Management System, versão 6.6, para a

geração e análise dos cromatogramas;

• Fases móveis - Solvente A: ácido trifluoracético (TFA) 0,1%;

Solvente B: acetonitrila (ACN) / TFA 0,1%;

• Gradiente: 5 a 95% de B em 60 min;

• Fluxo: 1 mL.min-1.

Cada uma das substâncias (expressas por picos, nos cromatogramas) teve seu espectro

UV comparado aos espectros UV da Microcistina-LR (padrão).

Um resumo das diferentes etapas desenvolvidas na pesquisa de metabólitos

secundários de Cianobactérias, pode ser visto na Figura 6.

3.4 NORMALIZAÇÃO DO TEXTO

Para normalização do texto, disposição de figuras e tabelas, bem como referências

bibliográficas, foram utilizadas as recomendações da Associação Brasileira de Normas

Técnicas (ABNT), referente ao ano de 2009.


Figura 6 – Esquema das principais etapas do estudo químico. Obtenção da biomassa,extração, testes, pré-purificação e fracionamento para pesquisa de cianotoxinas.


4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

As florações de Cianobactérias estudadas na ETE/Juazeiro do Norte, consistiram em

florações mistas e compostas principalmente pelas espécies: Microcystis aeruginosa

(Kützing) Kützing 1846, Microcystis protocystis Crow 1923, Sphaerocavum brasiliensis

Azevedo et Sant’Anna 2003 e Radiocystis fernandoi Komárek & Komárková-Legnerová

1993. Deve ser destacada a ocorrência de Planktothrix isothrix (Skuja) Komárek et

Komárková 2004, por ter sido esta, a espécie responsável pela caracterização da floração

(Figura 7), ou seja, pelo aspecto macroscópico e denso que se formou ao longo da superfície,

pois esteve presente em alta concentração, predominando em todo período amostrado nas 3

(três) lagoas estudadas.

Figura 7 – (A) Aspecto geral das Lagoas de Estabilização – ETE/JN/CE; (B) LagoaFacultativa A; (C) Lagoa Facultativa B e (D) Lagoa de Maturação. [Arquivopessoal].


Planktothrix isothrix consiste na espécie de maior importância para as Lagoas de

Estabilização, tanto pela distribuição espacial, como pela frequência de ocorrência e blooms

de organismos, que se trata da multiplicação em massa, fato que é contínuo no referido

ambiente. Sua classificação e descrição segundo Komárek e Anagnostidis (2005) é a seguinte:

Cyanobacteria

Classe Cyanophyceae

Ordem Oscillatoriales

Família Phormidiaceae

Subfamília Phormidioideae

Gênero Planktothrix

4.1 DESCRIÇÃO DA ESPÉCIE

Tricomas verde-azulados, verde acinzentados, escuros em massas, de livre flutuação,

solitários, frequentemente formando florações na água, retos ou algumas vezes curvos,

geralmente muito longos (até 3,5 mm), (5) 5,5-9,7 (10) µm de diâmetro, lentamente móveis

com oscilação peculiar, sem rotação, não constritos, com grânulos proeminentes, cilíndricos e

não atenuados nas extremidades (Figura 8).

Figura 8 – Planktothrix isothrix: (A) Dezenas de tricomas envolto a uma colônia deMicrocystis protocystis; (B) Tricomas envolto a uma colônia M. aeruginosa; (C)Tricomas em massa (aspecto escuro) e (D) Detalhe da morfologia dos tricomas.(A e C: Aumento de 100 X; B e D: Aumento de 400 X). [Arquivo pessoal].


As condições ambientais na ETE/JN são bastante favoráveis ao crescimento de

Cianobactérias. Nesse ambiente, a duração e a intensidade do fotoperíodo, bem como a

temperatura, que é em geral elevada, não apresentam grandes flutuações durante o ano. Esses

fatores complementados pelo pH que é alcalino (8-9) e uma grande carga de nutrientes,

principalmente nitrogênio e fósforo, que se encontram constantemente disponíveis, aceleram

o desenvolvimento desse grupo, com ocorrência de uma pequena diversidade, no entanto,

expressa em grandes concentrações.

A temperatura registrada na ETE/JN durante o presente estudo, ou seja, de fevereiro

a junho/2010, apresentou uma faixa de variação com valores entre 27ºC (mínima) e 33ºC

(máxima), sendo a média de 30,4ºC. Segundo Fernandes et. al. (2009), as elevadas

temperaturas, além de promoverem diretamente as florações de Cianobactérias, também

podem apresentar efeito indireto, promovendo estratificação térmica e tornando a coluna

d’água mais estável, estimulando a formação de floração.

Classicamente, a resposta da comunidade planctônica durante o processo de

eutrofização é uma diminuição de sua diversidade de espécies. Nestes ambientes, nota-se que

o fitoplâncton apresenta uma dominância crescente de espécies de Cianobactérias (FERRÃO-

FILHO, 2009). Fato verificado no presente estudo, no qual Cianobactérias ocorrem como

principal grupo, tanto em diversidade, quanto em concentração celular.

De acordo com a Agência Nacional de Águas – ANA (2009), a região Semi-Árida é

caracterizada por reservas insuficientes de água em seus mananciais, apresenta temperaturas

elevadas durante todo o ano, baixas amplitudes térmicas e forte insolação. Já os totais

pluviométricos, irregulares e inferiores a 900 mm, são normalmente superados por elevados

índices de evapotranspiração, resultando em taxas negativas no balanço hídrico. Dessa forma,

a necessidade de monitoramento para manutenção da disponibilidade hídrica dos mananciais,

que por sua vez já é preocupante, torna-se ainda mais urgente, frente aos riscos de possíveis

florescimentos de Cianobactérias, que na ausência de um controle efetivo desses mananciais,

podem vir a ocorrer.

Segundo dados disponibilizados pela Fundação Cearense de Meteorologia e

Recursos Hídricos – FUNCEME (2010), a média histórica de precipitação referente aos

últimos 30 anos (1980-2009), caracteriza o município de Juazeiro do Norte/CE onde está

localizada a Estação de Tratamento de Esgoto - ETE, com um período chuvoso que inicia no

mês de fevereiro e se estende até o mês de maio. Sendo que, as chuvas torrenciais foram

concentradas nos meses de fevereiro e março, que registraram médias de precipitação acima

de 200 mm. Em relação ao período de coletas, a maior precipitação foi registrada para o mês


de abril, com 168,5 mm, tendo sido esse valor muito próximo ao da média histórica para o

mesmo mês. Vale ressaltar que o mês de junho, não considerado dentro do período chuvoso,

registrou um valor de precipitação bem maior que o verificado na média histórica (Figura 9).

Figura 9 – Média mensal histórica de precipitação no município de Juazeiro do Norte/CE paraum período de 30 anos (1980 a 2009) e registros da precipitação mensal durante operíodo de coletas. Fonte: FUNCEME, 2010.

A composição de Cianobactérias nas Lagoas de Estabilização que compõem a

ETE/JN mostrou-se constituída por 14 espécies. Sendo Synechococcus sp. de ocorrência

exclusiva à Lagoa Facultativa A; Anabaena sp. à Lagoa Facultativa B, e as espécies

Aphanocapsa delicatissima, Chroococcus sp. e Cianofícea cocóide exclusivas à Lagoa de

Maturação. Já a ocorrência de 4 (quatro) espécies, Aphanocapsa sp., Aphanocapsa incerta,

Chlorococcum sp. e Oscillatoria sp. foram registradas como sendo comuns às duas Lagoas,

Facultativa B e de Maturação.

No entanto, 5 (cinco) espécies: Microcystis aeruginosa, Microcystis protocystis,

Sphaerocavum brasiliensis e Radiocystis fernandoi apresentaram ocorrência comum a todas

as Lagoas e foram consideradas muito freqüentes em relação ao período de amostragens, com

frequência de ocorrência igual a 100%, com exceção apenas para a última espécie que teve

80% de ocorrência. A frequência de todas as espécies identificadas pode ser verificada na

Figura 10.


Figura 10 – Frequência de ocorrência das espécies identificadas em relação ao período deamostragem na Estação de Tratamento de Esgoto de Juazeiro do Norte/CE.

A espécie Planktothrix isothrix em função da expressiva quantidade de tricomas é

responsável pelo aspecto esverdeado que é formado na superfície das lagoas de estabilização

da ETE, sendo esta a principal espécie da floração. A abundância relativa de Planktothrix

isothrix em relação às demais espécies de Cianobactérias identificadas para o referido

ambiente, mostra sua dominância em todas as lagoas analisadas e em todo o período de

amostragens (Figura 11).

Figura 11 – Abundância relativa de Planktothrix isothrix em relação às demais espécies deCianobactérias identificadas durante o período de amostragem nas Lagoas:Facultativa A, Facultativa B e de Maturação, ETE/Juazeiro do Norte-CE.


Nas regiões tropicais e subtropicais, os principais gêneros envolvidos na produção de

toxinas são Microcystis, Radiocystis, Planktothrix, Anabaena, Aphanizomenon e

Cylindrospermopsis (SANT’ANNA, GENTIL e SILVA, 2006).

Algumas espécies de Planktothrix têm uma capacidade notável para a regulação

sensitiva da flutuabilidade, sendo verificado para estas, um mecanismo poderoso de adaptação

cromática durante a estratificação do gradiente de luz no fundo. Essas algas também toleram

arrastamento holomítico e podem até mesmo crescer sob estas circunstâncias. Estas são

características estratégicas em resposta a pequenas alterações no campo de luz ou na

disponibilidade de outros recursos essenciais (REYNOLDS et al., 2002). Tais informações

podem justificar o sucesso no desenvolvimento de Planktothrix sobre outras espécies de

Cianobactérias.

Sant’Anna et al., (2008), verificaram através de uma revisão de espécies tóxicas de

Cianobactérias no Brasil que, Planktothrix isothrix apresenta ocorrência tóxica restrita à

região subtropical do Brasil. Essa informação é de grande relevância para o presente estudo, o

qual registra essa espécie como tóxica em região de clima tropical semi-árido, e outro fator

importante, envolvida na formação de blooms.

A riqueza específica não apresentou grande variabilidade em relação às diferentes

Lagoas de Estabilização e ao período amostrado. Tendo sido verificada uma variação mais

evidente no número de espécies, apenas entre as Lagoas Facultativa A e Facultativa B, nos

meses de fevereiro e março (Figura 12).

Figura 12 – Número de espécies identificadas durante o período de amostragem para asLagoas: Facultativa A, Facultativa B e de Maturação, ETE/Juazeiro do Norte-CE.


Os índices de diversidade específica aplicados aos resultados obtidos, de um modo

geral, classificaram o grupo das Cianobactérias das três Lagoas de Estabilização analisadas

(Facultativa A, Facultativa B e de Maturação) como de diversidade baixa, onde a maioria dos

índices H’ foram < 2,0 ≥ 1,0. Já para a equitabilidade, esta registrou valores variáveis entre

0,437 e 0,779.

Em relação à Lagoa Facultativa A (Figura 13), os meses de maio e junho, registraram

valores de diversidade < 1, com 0,997 e 0,896, respectivamente. Desse modo com diversidade

considerada muito baixa. Já para a Lagoa Facultativa B (Figura 14) e de Maturação (Figura

15), os menores índices de diversidade e equitabilidade foram registrados no mês de março,

com H’ 0,910 / J 0,437 e H’ 0,990 / J 0,509, respectivamente. Portanto, sendo esses valores

também de diversidade muito baixa. Essa condição foi verificada quando também se

constatou uma maior dominância de Planktothrix isothrix.

Tal dominância para essa espécie também foi registrada anteriormente no mesmo

ambiente por Aquino, Lacerda e Freitas (2010), que em estudos nos anos de 2005 a 2008,

registraram sua ocorrência como principal característica da floração em todo período

analisado.

Fatores como urbanização, agricultura e desenvolvimento industrial têm sido as

principais causas para o aumento das concentrações de nitrogênio (N) e fósforo (P) nos corpos

d’águas. Sendo importante ressaltar que a quantidade, a proporção e a composição química

das fontes destes nutrientes podem influenciar a composição, a magnitude e a duração e das

florações (PAERL, 2008). De acordo com Carmichael (1992), a eutrofização crescente de

nossas fontes de água doce e a consequente diminuição da qualidade da água têm gerado

florações de Cianobactérias que estão se tornando cada mais comum em qualquer área.

Em ambientes hipereutróficos é comum a ocorrência de uma diversidade baixa ou

muito baixa de Cianobactérias, como foi verificada nas Lagoas de Estabilização da

ETE/Juazeiro do Norte, CE. Segundo Paerl (2008), a entrada de nutrientes pode interagir

sinérgica ou antagonicamente com outros fatores como, sedimentação, descarga de água e

estabilidade da coluna d’água, determinando a floração.


Figura 13 – Relação entre o índice de Shannon e Equitabilidade durante o período deamostragem para a Lagoa Facultativa A, ETE/Juazeiro do Norte-CE.

Figura 14 – Relação entre o índice de Shannon e Equitabilidade durante o período deamostragem para a Lagoa Facultativa B, ETE/Juazeiro do Norte-CE.


Figura 15 – Relação entre o índice de Shannon e Equitabilidade durante o período deamostragem para a Lagoa de Maturação, ETE/Juazeiro do Norte-CE.

4.2 ENSAIO DE TOXICIDADE EM CAMUNDONGOS (intraperitonial – i.p.)

Os extratos de Cianobactérias provenientes de 10 amostras coletadas nas lagoas de

estabilização: Lagoa Facultativa A – LFA (3), Lagoa Facultativa B – LFB (3), Lagoa de

Maturação – LM (3) e Rio Salgado (1), foram administrados por via intraperitoneal em grupos

de animais machos “Swiss-Webster”, sendo os efeitos avaliados.

Os bioensaios em camundongos foram de grande importância para obtenção de

informações preliminares sobre a toxicidade das amostras, pois a partir dos efeitos observados

nos animais testados e com base no conhecimento dos mecanismos de ação das toxinas

conhecidas, foi possível direcionar o estudo químico. De acordo com Carmichael (1992), o

bioensaio em camundongo foi o primeiro teste típico de toxicidade na seleção de material de

blooms de água e culturas de laboratório ou extratos de células. Suas vantagens são a facilidade

de uso, assumindo que camundongos de análise laboratorial são prontamente disponíveis. O

método é barato e pode detectar, dentro de poucas horas, as características qualitativas e

quantitativas da toxina presente. A partir dos sinais de envenenamento, é possível distinguir

hepatotoxinas de neurotoxinas e até mesmo os diferentes tipos de neurotoxinas.

A pesquisa de cianotoxinas foi conduzida à investigação tanto da possível presença

de uma neurotoxina, ou de uma hepatotoxina, assumindo que a espécie predominante nas


amostras, Planktothrix isothrix, é produtora tanto de saxitoxinas, quanto de microcistinas,

ambas pertencentes às classes de toxinas citadas, respectivamente.

Mediante a resposta dos grupos testados foi suprimida a necessidade de investigação

química para uma determinada classe de toxina, nesse caso as neurotoxinas, em função dos

sintomas que causam e, sobretudo, pelo tempo de sobrevida que consiste em poucos minutos

(KUIPER-GOODMAN et al. 1999). Nesse caso, passou-se a investigar a possibilidade de

uma outra classe de toxinas, desta vez as hepatotoxinas, mais especificamente a do tipo

microcistina. No entanto, alguns dos sinais de toxicidade que foram sendo expressos pelos

grupos de animais injetados, e principalmente a ausência de lesão hemorrágica no fígado

(CARMICHAEL, 1992; SALOMON et al., 1996; WHITTON e POTTS, 2000), atenuaram a

probabilidade de sua ocorrência nas amostras.

Porém, durante o desenvolvimento dos ensaios de toxicidade, vários sintomas de

alterações observados chamaram a atenção e o fato da morte de alguns animais, fizeram

realizar a pesquisa química da hepatotoxina denominada microcistina, por Cromatografia

Líquida de Alta Eficiência (CLAE), para fins de confirmação de não estar associada aos

efeitos observados e assim, evitar possíveis resultados dúbeis.

A partir desses testes de toxicidade em camundongos foram observados sinais de

alterações crônicos e agudos. Das 10 (dez) amostras testadas, 3 destas, ou seja, 30%

apresentaram toxicidade aguda letal. As demais amostras administradas demonstraram a

presença de substâncias tóxicas, com ação temporária, pois vários sintomas de alterações

foram verificados por algumas horas após a injeção do extrato, demonstrando um efeito

tóxico, mas que foi sendo paulatinamente superado horas após a exposição ao material

administrado.

Decorridos 7 (sete) dias da observação dos grupos de animais testados, estes formam

submetidos à eutanásia para avaliação de possíveis alterações macroscópicas nos órgãos. Essa

etapa resultou em importantes achados post-mortem como: fígado com manchas brancas,

fígado com os lobos (parcialmente e/ou totalmente aderidos), acúmulo de material esverdeado

no pâncreas e diafragma aderido ao fígado. Para os indivíduos controle não foi apresentado

nenhum sinal de alteração e não houve nenhuma morte.

Os resultados evidenciados nos achados post-mortem revelam a importância da

avaliação dos efeitos crônicos que também causam sérias desordens estruturais no organismo,

como visto nesse estudo, com lesões que podem comprometer o funcionamento de órgãos

vitais, como o fígado. Os sinais de intoxicação e achados post-mortem estão listados na

Tabela 3. De acordo com Kuiper-Goodman et al. (1999), casos de toxicidade tem mostrado a


partir de exames post-mortem, evidências da ingestão de Cianobactérias, bem como lesão

tecidual característica no fígado.

A importância de estudos toxicológicos experimentais é relevante, no entanto, a

grande maioria dos dados sobre cianotoxinas ainda é obtida em estudos de intoxicação aguda,

enquanto que a intoxicação crônica e subletal é, certamente, mais freqüente, representando

sérios riscos à população e deveria, portanto, merecer uma maior atenção das pesquisas

científicas neste campo (SOARES, 2009).

Todos os efeitos tóxicos verificados nos bioensaios, as alterações imediatas

apresentadas por grande parte dos grupos de animais avaliados, os efeitos crônicos evidentes

nos importantes achados post-mortem e os efeitos agudos letais, mostraram o perigo de

exposição às cianobactérias da ETE/JN, que podem constituir danos irreparáveis à saúde

pública. Segundo Kuroda et al. (2007), o uso dos bioensaios, possibilitam a aquisição de

importantes informações sobre a toxicidade de uma amostra, permitindo um maior

entendimento do seu impacto no ambiente natural destinado ou não ao abastecimento de água,

além dos mecanismos de ação nos organismos.

Tabela 3 – Sinais de intoxicação e alterações macroscópicas apresentadas pelos camundongosapós administração por via intraperitoneal dos extratos em ácido acético dasamostras de floração das lagoas facultativa A, facultativa B e de Maturação.

Amostra/Data Sinais de intoxicaçãoTempo

decorridoaté a morte

Principais achadospost-mortem

Lagoa fac. A-

29/04/10

Respiração ofegante,contração abdominal,

dificuldade de locomoção(paralisia do trem

posterior), prostração epiloereção

Eutanásiaapós

7 dias deobservação

Ausência de alteraçõesmacroscópicassignificativas

Lagoa fac. A-

17/05/10

Respiração ofegante,ausência de coordenação

motora na locomoção,prostração, coceira

constante

Eutanásiaapós


Fígado com manchasbrancas (n=1), (Figura16)

Fígado com os lobossuperior e intermediárioaderidos (n=1), (Figura17)

continua...





Lagoa fac. A-

01/06/10

Respiração ofegante,ausência de coordenação

motora na locomoção,paralisia do trem posterior,

prostração,coceira constante

Eutanásiaapós



Lagoa fac. B-

29/04/10

Respiração ofegante,piloereção, prostração.

Paralisia do trem posterior(apenas n=1)

Eutanásiaapós


Acúmulo de materialesverdeado no pâncreas(n=1), (Figura 18)

Lagoa fac. B-

17/05/10Diarréia

Eutanásiaapós



Lagoa fac. B-

01/06/10

Respiração ofegante,espasmo, piloereção,

dificuldade de locomoção(paralisia do tremposterior), coceira

moderada e prostração.Sintoma de contração

abdominal (apenas n=1).

Morte apósadministração

do extrato(n=1)

Eutanásiaapós


(n=2)

Ausência de alteraçõesmacroscópicassignificativas.


Lagoa de

Maturação

29/04/10

Respiração ofegante,contração abdominal,

ausência de coordenaçãomotora na locomoção,

paralisia do trem posteriore prostração.

Eutanásiaapós


Fígado com manchasbrancas (n=1), (Figura 19)

Diafragma aderido aofígado (n=1), (Figura

20).

Lagoa de

Maturação

17/05/10

Respiração ofegante,espasmo, coceira

moderada, ausência decoordenação motora nalocomoção, paralisia do

trem posterior, prostração(grupo mais debilitado) e

piloereção.

Morte em até24h após

administraçãodo extrato

(n=3)


continua...





Lagoa de

Maturação

01/06/10Sem alterações

clínicas significativas

Morte em até18h após

administraçãodo extrato

(n=2)

Eutanásiaapós


(n=1)


Rio

01/06/10Diarréia

Eutanásiaapós


Lobos do fígadototalmente aderidos

(n=1);Lobos do fígado

parcialmente aderidos(n=1), (Figura 21).

Figura 16 – Achados post-mortem. A e B: animal com manchas brancas no fígado (emdetalhe) resultante da administração do extrato LFA (17 de maio, 2010).[Arquivo pessoal].

conclusão.


Figura 17 – Achados post-mortem. Animal apresentando fígado com os lobos, superior eintermediário, aderidos (ver detalhe) resultante da administração do extratoLFA (17 de maio, 2010). [Arquivo pessoal].

Figura 18 – Achados post-mortem. Animal com acúmulo de material esverdeado no pâncreas(ver detalhe) resultante da administração do extrato LFB (29 de abril, 2010).[Arquivo pessoal].


Figura 19 – Achados post-mortem. A e B: Animal com manchas brancas no fígado (verdetalhes) resultante da administração do extrato LM (29 de abril, 2010).[Arquivo pessoal].

Figura 20 – Achados post-mortem. A: Animal com diafragma aderido ao fígado (ver detalhe)resultante da administração do extrato LM (29 de abril, 2010); B: Controle.[Arquivo pessoal].


Figura 21 – Achados post-mortem. A: Animal com os lobos do fígado totalmente aderidos eB: Animal com os lobos do fígado parcialmente aderidos (ver detalhes)resultante da administração do extrato referente ao Rio (01 de junho, 2010).[Arquivo pessoal].

Nos testes de avaliação da toxicidade das amostras em camundongos, também foram

considerados os registros de peso corpóreo dos animais, antes e após o período de exposição

às soluções contendo os extratos algáceos (Tabela 4).

Assim, os animais que não apresentaram toxicidade aguda letal e que, portanto,

permaneceram em observação por 7 dias foram avaliados quanto ao ganho ou perda de peso.

Sendo que, o registro de pesos dos animais referentes ao intervalo compreendido pelo teste,

início e fim, permitiu a avaliação de ganho ou perda, quando comparados à média de ganho

de peso relativa aos animais controle, que não apresentaram alterações.

Dessa forma, observou-se que dentre o total de 24 animais injetados, que não

apresentaram toxicidade aguda letal, 75% (18) apresentou ganho de peso abaixo do valor da

média registrada para animais controle, que foi 6,69g de ganho de peso corpóreo após os 7

(sete) dias do ensaio. Já 8% (2) dos animais testados apresentaram perda de peso e apenas

17% (4) apresentaram valores de ganho de peso um pouco acima da média controle.

Dentre os 18 animais que apresentaram ganho de peso abaixo do valor da média, é

importante destacar que para 9 destes, foram registrados valores menores que 50% em relação

à média de ganho de peso controle. Já para 3 animais, um pertencente ao grupo LM1, um

pertencente ao grupo RIO e outro ao grupo LFA1, vale ressaltar que quase não apresentaram

ganho de peso, com valores de 11%, 8% e 5%, respectivamente, sobre a média controle. Os


outros 6 animais apresentaram valores variáveis acima de 50%, considerando a média

controle, porém todos ficaram situados abaixo da média.

Em relação ao registro de perda de peso, verificou-se esse resultado para 2 (dois)

animais do mesmo grupo (LM1), considerando o peso inicial e o peso final durante o ensaio.

É importante salientar que dentre os 3 animais testados desse grupo LM1, todos apresentaram

alterações quanto ao peso corpóreo, pois 2 destes perderam peso e 1 praticamente não obteve

ganho, registrou apenas 11% em relação à média controle. Esse dado chama atenção, uma vez

que os grupos LM2 e LM3, animais testados com amostras do mesmo ambiente, Lagoa de

Maturação, apresentaram toxicidade aguda letal, com n=3 e n=2, respectivamente. Assim,

verificou-se que o grupo LM1 apesar de não haver mostrado toxicidade aguda letal,

demonstrou importantes alterações evidenciadas no peso corpóreo (n=3).

Os 17% mencionados com relação aos animais que apresentaram valores de ganho

de peso um pouco acima da média, correspondem apenas a 4 (quatro) dentre a totalidade

testada. Constatando com isso que, os extratos algáceos das diferentes Lagoas de

Estabilização administrados causaram importantes alterações no trato alimentar dos animais,

pois, em todos os grupos testados houve registro, de pelo menos 1 (um) animal, com baixo ou

muito baixo ganho de peso, ou seja, com valores distantes da média de ganho de peso

controle.

Tabela 4 – Registros de peso corpóreo dos animais testados, antes e após o período deexposição aos extratos algáceos.

Pesos

Grupos

Peso doanimal (g)

(antes do teste)

Pesomédio

(g)

DesvioPadrão

Peso doanimal (g)

(7 dias após oteste)

Pesomédio

(g)

DesvioPadrão

LFA-1

(Abril)

26,53

23,2

22,72

24,15 2,075

29,59

27,54

23,07

26,73 3,334

LFA-2

(Maio)

17

15,4

16,22

16,21 0,800

23,3

18,24

24

21,85 3,143

LFA-3

(Junho)

17,4

16,4

16,57

16,79 0,535

25

23,9

2123,3 2,066

continua...


Pesos

Grupos

Peso doanimal (g)

(antes do teste)

Pesomédio

(g)

DesvioPadrão

Peso doanimal (g)

(7 dias após oteste)

Pesomédio

(g)

DesvioPadrão

LFB-1(Abril)

18,7925,1425,3

23,08 3,713

26,0229

27,0127,34 1,518

LFB-2

(Maio)

18,12

19,53

19,73

19,13 0,878

21,8

25,5

22,4

23,23 1,986

LFB-3

(Junho)25,52

2525,26 0,368

27,6

30,429 1,980

LM-1

(Abril)

21,65

19,43

22,55

21,21 1,60620

18,45

23,29

20,58 2,472

LM-3

(Junho)18,6 - - 23,6 - -

Rio

(Junho)

18,6

19

19,55

19,05 0,477

21,3

23

20,1

21,47 1,457

Controle Peso médio antes do teste (g):

18,22

Peso médio 7 dias após o teste (g):

24,91

4. 3 PROSPECÇÃO DE SUBSTÂNCIAS BIOATIVAS

4.3.1 Atividade Antioxidante

Todos os extratos representativos das Lagoas de Estabilização apresentaram

atividade antioxidante: a amostra LFA3 mostrou forte capacidade antioxidante e as amostras

LFA2, LFB2, LFB3, LM2 e RIO, atividade média. Esse resultado pode ser observado na

conclusão.


Figura 22 e os Rfs das manchas que apresentaram resultado positivo quanto a essa atividade

estão compilados na Tabela 5.

Substâncias que apresentam essa atividade aparecem como manchas amareladas

sobre um fundo violeta (HOSTETTMANN et al., 2003). A mudança de coloração da solução

de DPPH do violeta para o amarelo ocorre devido à transferência de elétrons ou átomos de

hidrogênios de substâncias antioxidantes para o radical livre, fazendo com que ele se torne

estável (SOUZA et al., 2007).

(a)

(b) (c)

Figura 22 – (a): Cromatograma em placa de gel de sílica 60, Merck, dos extratos dasbiomassas coletadas respectivamente nas Lagoas LFA1, LFA2, LFA3, LFB1,LFB2, LFB3, LM1, LM2 e LM3. Fase móvel: clorofórmio: metanol: água(64:36:8, v/v/v). Derivatizante: solução metanólica (2 mg.mL-1) do radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazila (DPPH). As manchas amareladas indicam assubstâncias com atividade antioxidante; (b) e (c): Cromatograma observadosob luz ultravioleta, de comprimentos de onda 254 nm e 366 nm,respectivamente.


Tabela 5 – Registro da atividade antioxidante detectada por amostra e os seus respectivosíndices de retenção (Rf).

Amostras Atividade Rf (cm)

LFA1 * 0,19

LFA2 ** 0,19

LFA3 *** 0,19

LFB1 * 0,19

LFB2 ** 0,19

LFB3 ** 0,18

LM1 * 0,20

LM2 ** 0,17

LM3 * 0,19

RIO ** 0,14

Legenda - * = Atividade fraca; ** = Atividade média; *** = Atividade forte.

De acordo com FINKEL e HOLBROOK (2000), espécies reativas do oxigênio

(EROS) abrangem uma variedade de espécies químicas, incluindo superóxido (O2-), oxigênio

singlete (1O2), radical hidroxila (OH-) e o peróxido de hidrogênio (H2O2). Estas várias

espécies de radicais livres podem ser geradas de forma exógena ou produzidas

intracelularmente a partir de várias fontes diferentes. A geração de EROS, em certos limites, é

essencial para manter a homeostase. No entanto, em certas situações de estresse metabólico, o

aumento nas concentrações intracelulares dos níveis de oxidantes tem dois efeitos

potencialmente importantes: danos para vários componentes das células, desencadeando a

ativação de rotas de sinalização específicas. Ambos os efeitos podem influenciar numerosos

processos celulares relacionados ao envelhecimento e desenvolvimento de doenças

relacionadas à idade (Figura 23).

Radicais livres associados ao estresse oxidativo estão envolvidos em vários

processos fisiopatológicos como, câncer, aterosclerose, artrite reumatóide, doenças auto-

imunes, etc (FERREIRA e MATSUBARA, 1997). Dessa forma, é de grande importância a


ação dos agentes antioxidantes que atuam para inibição e redução das lesões causadas pelos

radicais livres nas células (BIANCHI e ANTUNES, 1999).

Os antioxidantes naturais são bem indicados para atenuar os efeitos deletérios do

estresse oxidativo celular (NUNES et al., 2008). Assim, a utilização de fontes naturais pode

representar uma nova abordagem na inibição dos danos provocados pelo excesso de radicais

livres (BIANCHI e ANTUNES, 1999). Tais agentes naturais têm sido prioritariamente

recomendados para o alívio dos sinais e sintomas de doenças e, mesmo, para bloquear sua

evolução (FERREIRA e MATSUBARA, 1997).

Figura 23 – Diagrama das fontes de espécies reativas do oxigênio (EROS) e as respostascelulares (Modificado de FINKEL e HOLBROOK, 2000).


4.3.2 Atividade anticolinesterásica

Todos os extratos representativos das Lagoas de Estabilização: LFA1, LFA2, LFA3

– LFB1, LFB2, LFB3 – LM1, LM2, LM3, bem como o extrato referente ao Rio Salgado,

foram submetidos a ensaios para a determinação da presença de substâncias com ação

anticolinesterásica, sendo que quatro das dez amostras testadas apresentaram resultado

positivo. Com exceção da Lagoa Facultativa B, as demais lagoas avaliadas e o rio

apresentaram pelo menos uma amostra contendo substância com ação anticolinesterásica,

sendo que a Lagoa Facultativa A apresentou atividade em 2 (duas), dentre as 3 (três) amostras

analisadas (Figura 24).

De acordo com ZELÍK (2005), a exigência de novos inibidores da acetilcolinesterase

(AChE), conduz à uma seleção de fontes naturais, principalmente plantas superiores, ou à

modificação de estruturas químicas de inibidores conhecidos da AChE através de síntese

orgânica. Apenas poucos trabalhos foram centrados na triagem de microrganismos (Fungos e

Actinomicetos). E surpreendentemente, são escassas as publicações que tratam da triagem de

microorganismos autotróficos - Algas e Cianobactérias. Assim, esse autores na expectativa de

encontrar potenciais produtores de novos inibidores da AChE entre microrganismos

autotróficos, conduziram a pesquisa em cerca de 250 espécies de Algas e Cianobactérias.

Dentre os resultados para Cianobactérias, mostrou que algumas espécies de Nostoc

apresentaram atividade inibitória da AChE.

No Brasil, Dogo et al. (2010) em estudo com a Cianobactéria Geitlerinema

unigranulatum (Oscillatoriales), detectaram resultado positivo para a atividade

anticolinesterásica. Segundo esses autores, substâncias com ação anticolinesterásica elevam o

nível de acetilcolina no cérebro e são importantes no tratamento sintomático da doença de

Alzheimer (AD), uma doença neurodegenerativa caracterizada pela perda progressiva da

memória e funções cognitivas.


(a)

(b) (c)

Figura 24 – (a): Cromatograma em placa de gel de sílica 60, Merck, dos extratos dasbiomassas coletadas nas Lagoas LFA1, LFA2, LFA3, LFB1, LFB2, LFB3,LM1, LM2 e LM3. Fase móvel: clorofórmio: metanol: água (64:36:8, v/v/v).Revelador específico para inibidores de acetilcolinesterase. As manchascoincidentes com os halos de cor branca indicam inibição daacetilcolinesterase; (b) e (c): Cromatograma observado sob luz ultravioleta, decomprimentos de onda 254 nm e 366 nm, respectivamente.


4.3.3 Atividade hemolítica

Os extratos obtidos das biomassas coletadas nas Lagoas de Estabilização LFA1,

LFA2, LFA3 – LFB3 – LM1 foram submetidos à pesquisa da presença de substâncias com

atividade hemolítica, apresentando resultados negativos. A atividade hemolítica foi

inicialmente investigada em todas as amostras da Lagoa Facultativa A, e frente ao resultado

negativo apresentado, procedeu-se a pesquisa em apenas uma amostra das demais lagoas.

4.3.4 Teste para detecção de -N-metilamino-L-alanina (BMAA)

Todos os extratos das amostras das Lagoas de Estabilização: LFA1, LFA2, LFA3 –

LFB1, LFB2, LFB3 – LM1, LM2, LM3 (1 = mês de abril, 2 = maio e 3 = junho) foram

investigadas quanto à presença da neurotoxina β-N-metilamino-L-alanina (BMAA). A fração

1 (um) de cada uma das amostras, eluída em ácido acético 0,1 M, segundo especificado em

Material e Métodos (item 3.3.2) foi utilizada para essa análise; todas as amostras analisadas

apresentaram resultados positivos para a presença deste aminoácido (Figuras 25-27).

Figura 25 – Cromatograma em gel de sílica 60, Merck, dos extratos em ácido acético 0,1 Mliofilizados das amostras da Lagoa Facultativa A: FA1, FA2 e FA3. Fase móvel:clorofórmio: metanol: água (64:36:8, v/v/v). Agente derivatizante: ninidrina. Assetas apontam as manchas com Rf correspondente ao Rf do padrão de BMAA.


Figura 26 – Cromatograma em gel de sílica 60, Merck, dos extratos em ácido acético 0,1 Mliofilizados das amostras da Lagoa Facultativa B: FB1, FB2 e FB3. Fase móvel:butanol: ácido acético: água (5:2:3 v/v/v). Agente derivatizante: ninidrina. Assetas apontam as manchas com Rf correspondente ao Rf do padrão de BMAA.

Figura 27 – Cromatograma em gel de sílica 60, Merck, dos extratos em ácido acético 0,1 Mliofilizados das amostras da Lagoa de Maturação: M1, M2 e M3. Fase móvel:butanol: ácido acético: água (5:2:3 v/v/v). Agente derivatizante: ninidrina. Assetas apontam as manchas com Rf correspondente ao Rf do padrão de BMAA.


Cox et al. (2005), em estudos com representantes de Cianobactérias, verificaram que

a grande maioria destas produzem BMAA, incluindo representantes de todas as seções desse

grupo. No entanto, evidenciaram uma variação no teor de BMAA entre gêneros e espécies

analisadas. Tal variação sugere que a produção e o armazenamento de BMAA sejam uma

função dos estágios do ciclo de vida e/ou das condições do crescimento. Dentre essas

diferentes concentrações verificadas de BMAA entre as Cianobactérias testadas, Planktothrix

registrou uma das maiores faixas de concentração, com 318 µg/g de BMAA livre. Tal

informação é de grande importância para o presente trabalho, no qual se observou resultado

positivo para BMAA em todas as amostras contendo Planktothrix isothrix como espécie

dominante.

Outras pesquisas também recentes, revelaram a presença de BMAA em tecidos

cerebrais post-mortem de pacientes norte-americanos que morreram por doença de Alzheimeir

e esclerose lateral amiotrófica (ALS) esporádica. Essa constatação sugere uma possível

interação gene/ambiente, em que o BMAA desencadearia neurodegeneração em indivíduos

vulneráveis. Florações de Cianobactérias em corpos d’água marinhos e de água doce teriam

como consequência a entrada de BMAA nesses ambientes e na cadeia alimentar, constituindo

fontes potenciais da exposição humana ao BMAA (PABLO et al., 2009).

Outras pesquisas mais atuais demonstraram que Cianobactérias largamente

distribuídas em um ecossistema aquático temperado produzem BMAA e que este, é

bioacumulado em níveis tróficos superiores, como peixes e moluscos usados para o consumo

humano. Um fato importante a ser considerado foi a comprovação da acumulação de BMAA

em espécies de peixes fora da zona de radiação das Cianobactérias, sugerindo a transferência

do BMAA das Cianobactérias para os peixes que habitam as massas de água pelágicas e

bentônicas, através do Zooplâncton ou seja, sugerindo que o BMAA possa ser transferido,

pelo Zooplâncton, entre diferentes nichos de uma cadeia alimentar baseada em Cianobactérias

(JONASSON, 2010).

O BMAA foi descoberto na região tropical/subtropical de Guam, porém as notícias

da propapagação de BMAA em ambientes temperados sugerem que essa toxina possa estar

globalmente difundida o que representa potencial ameaça à saúde humana, se considerarmos

os riscos provenientes da ingestão de água contaminada e da bioacumulação em peixes e em

outros frutos do mar, integrantes dos alimentos humanos.

O rio Salgado é o receptor das águas das Lagoas de Estabilização de Tratamento de

Esgoto, que, comprovadamente, contém Cianobactérias produtoras de BMAA necessitando,

por isso, ser constantemente monitorado quanto á presença deste aminoácido, neurotoxina de


efeitos acumulativos e devastadores. Também devem ser observados os cuidados às diferentes

vias, pelas quais essa toxina pode chegar ao homem, que são a forma direta (consumo da água

contendo Cianobactérias que sintetizam essa toxina ou da própria cianotoxina) ou a forma

indireta (consumo de peixes que tenham bioacumulado essa toxina), dentre outras maneiras

que também devem ganhar a atenção.

4.3.5 Análise para detecção de microcistinas (CLAE)

Nas análises realizadas por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência nos extratos

das amostras provenientes das Lagoas LFA1, LFA2, LFA3 – LFB1, LFB2, LFB3 – LM1,

LM2, LM3 (1 = mês de abril, 2 = maio e 3 = junho), não foi detectada a presença da

hepatotoxina Microcistina-LR, por comparação com o padrão e com o espectro UV de

Microcistina-LR, que nas condições do experimento, mostrou Tr de 36,63 min. [pico 8 (oito)]

(Figuras 28 e 29). A fração 3 (três) de cada uma das amostras citadas, eluída em ácido acético

0,1 M / metanol 50:50 (v/v), segundo especificado em Material e Métodos (item 3.3.2), foi

utilizada para essa análise.

Entretanto, da observação do perfil cromatográfico dos extratos, foram notados picos

de ocorrência constante, ou seja, a ocorrência repetitiva de substâncias nos diferentes extratos,

as quais podem ser relacionadas a um determinado organismo (que as produz). Um exemplo

dessas substâncias é a representada pelo pico em destaque, mostrado nos cromatogramas

desenvolvidos com os extratos, de diferentes meses, das lagoas: Facultativa A, Facultativa B e

de Maturação, cujos espectros UV também são detalhados, como pode ser visto na Tabela 6.


Figura 28 – Cromatograma com o desenvolvimento do padrão de Microcistina-LR (pico 8,tempo de retenção: 36,63 min.). Condições da análise: Coluna CN analítica; Fasemóvel: A - ácido trifluoracético (TFA) 0,1% e B: acetonitrila (ACN) / TFA0,1%; Fluxo: 1 mL.min-1; Detecção: UV 238nm.

Figura 29 – Espectro de UV do pico 8 correspondente ao padrão de Microcistina-LR.

0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0-50

200

450

Sequencia curva analítica MC-LR #32 UV_VIS_2

mAU

min

1 -

Pea

k 3

- 4,

241

2 -

19,9

963

- 21

,419

4 -

24,9

79

5 -

29,2

88

6 -

33,3

697

- 34

,228

8 -

36,6

289

- 38

,721

10 -

39,

323

11 -

41,

061

12 -

44,

805

13 -

50,

179

14 -

52,

345

WVL:239 nm

... ..................

P A D R Ã O M C - L R


Tabela 6 – Perfil cromatográfico dos extratos das amostras provenientes das lagoas deestabilização: Lagoa Facultativa A, Lagoa Facultativa B e Lagoa de Maturação(ver em detalhe, o pico comum a todas as amostras e seu respectivo espectroUV).

AMOSTRASTr

Min.PERFIL CROMATOGRÁFICO

PERFIL 01

Lag. Fac. A(abril)

0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0-10

100

180


mAU

min

1 - 2

,764

2 - 3

,004

3 - P

eak

7 - 3

,967

4 - P

eak

4 - 4

,642

5 - p

eak

5 - 5

,240

6 - P

eak

6 - 6

,199

7 - 7

,153

8 - 8

,539

9 - 9

,957

10 -

11,1

2411

- 12

,544

12 -

14,6

4813

- 17

,118

14 -

19,0

7615

- 20

,734

16 -

26,0

39

17 -

36,3

3418

- 38

,530

19 -

40,7

72

20 -

50,3

1421

- 52

,416

WVL:239 nm

... ..................

ESPECTROUV

(PICO 17)36,33

Peak #17 100% at 36.33 min

-10,0

70,0

200 250 300 350 400 450 500 595

%

nm

202.3

224.3275.5

50% at 36.25 min: 998.09 -50% at 36.43 min: 989.56

PERFIL 02

Lag. Fac. A(Maio)

0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0-10

100

180


mAU

min

1 - P

eak

7 - 3

,969

2 - P

eak

4 - 4

,647

3 - p

eak

5 - 5

,249

4 - P

eak

6 - 6

,203

5 - 7

,172

6 - 8

,548

7 - 9

,976

8 - 1

1,14

99

- 12,

575

10 -

14,6

84

11 -

20,7

07

12 -

36,3

4713

- 38

,528

14 -

40,7

64

15 -

50,3

0416

- 52

,416

WVL:239 nm

... ..................

ESPECTROUV

(PICO 12)36,35

Peak #12 100% at 36.35 min

-10,0

70,0

200 250 300 350 400 450 500 595

%

nm

202.3

224.3275.4

50% at 36.26 min: 998.20 -50% at 36.44 min: 988.92

continua...


AMOSTRASTr


PERFIL 03

Lag. Fac. B(abril)

0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0-10

100

180


mAU

min

1 - P

eak

7 - 3

,968

2 - P

eak

3 - 4

,310

3 - P

eak

4 - 4

,673

4 - p

eak

5 - 5

,210

5 - P

eak

6 - 6

,197

6 - 7

,177

7 - 8

,588

8 - 1

0,07

39

- 11,

275

10 -

12,7

6111

- 14

,937

12 -

17,1

37

13 -

20,8

40

14 -

36,4

0015

- 38

,608

16 -

40,8

54

17 -

52,4

06

WVL:239 nm

... ..................

ESPECTROUV

(PICO 14)36,40

Peak #14 100% at 36.40 min

-10,0

70,0

200 250 300 350 400 450 500 595

%

nm

202.3

224.3275.5

50% at 36.32 min: 998.29 -50% at 36.49 min: 988.36

PERFIL 04

Lag. Fac. B(Maio)

0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0-20

100

250


mAU

min

1 - P

eak

7 - 3

,972

2 - P

eak

3 - 4

,306

3 - P

eak

4 - 4

,677

4 - p

eak

5 - 5

,232

5 - P

eak

6 - 6

,199

6 - 7

,185

7 - 8

,549

8 - 1

0,00

49

- 11,

193

10 -

12,6

24

11 -

17,1

29

12 -

20,7

40 13 -

36,3

6914

- 38

,580

15 -

40,8

07

16 -

50,3

3917

- 52

,397

WVL:239 nm

... ..................

ESPECTROUV

(PICO 13)36,37

Peak #13 100% at 36.37 min

-10,0

70,0

200 250 300 350 400 450 500 595

%

nm

202.3

224.3275.5

50% at 36.29 min: 998.44 -50% at 36.46 min: 988.67

continua...


AMOSTRASTr


PERFIL 05

Lag. Fac. B(Junho)

0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0-20

100

200


mAU

min

1 - 3

,930

2 - 4

,318

3 - 4

,641

4 - 5

,251

5 - 6

,217

6 - 7

,288

7 - 8

,565

8 - 1

0,13

89

- 11,

835

10 -

12,9

6711

- 15

,495

12 -

17,0

42

13 -

21,0

94 14 -

36,3

94

15 -

40,8

91

16 -

52,3

76

WVL:239 nm

...

ESPECTROUV

(PICO 14)36,39

Peak #14 100% at 36.39 min

-10,0

70,0

200 250 300 350 400 450 500 595

%

nm

202.3

224.8275.1

50% at 36.31 min: 999.48 -50% at 36.48 min: 996.51

PERFIL 06

Lag. Mat.(Abril)

0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0-10

100

180


mAU

min

1 - P

eak

7 - 3

,984

2 - P

eak

4 - 4

,722

3 - 8

,752

4 - 1

0,26

55

- 11,

696

6 - 1

3,13

07

- 15,

417

8 - 1

7,23

6

9 - 2

1,00

2

10 -

36,5

83

11 -

41,0

32

12 -

52,4

11

WVL:239 nm

... ..................

ESPECTROUV

(PICO 10)36,58

Peak #10 100% at 36.58 min

-10,0

70,0

200 250 300 350 400 450 500 595

%

nm

202.4

224.3275.5

50% at 36.50 min: 998.86 -50% at 36.68 min: 988.95

continua...


AMOSTRASTr


PERFIL 07

Lag. Mat.(Maio)

ESPECTROUV

(PICO 21)36,37

Peak #21 100% at 36.37 min

-10,0

70,0

200 250 300 350 400 450 500 595

%

nm

202.4

224.9275.3

50% at 36.28 min: 999.24 -50% at 36.46 min: 996.29

PERFIL 08

Lag. Mat.(Junho)

0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0-10

100

180


mAU

min

1 - P

eak

7 - 3

,965

2 - P

eak

3 - 4

,346

3 - P

eak

4 - 4

,682

4 - p

eak

5 - 5

,254

5 - P

eak

6 - 6

,246

6 - 7

,293

7 - 8

,703

8 - 1

0,22

29

- 11,

650

10 -

13,0

7611

- 15

,437

12 -

17,1

98

13 -

21,0

15 14 -

36,5

9115

- 38

,815

16 -

41,0

42

17 -

52,3

79

WVL:239 nm

... ..................

ESPECTROUV

(PICO 14)36,59

Peak #14 100% at 36.59 min

-10,0

70,0

200 250 300 350 400 450 500 595

%

nm

202.3

224.2275.6

50% at 36.50 min: 998.08 -50% at 36.68 min: 988.56

conclusão.


5 CONCLUSÃO

1. As lagoas de estabilização que compõem a Estação de Tratamento de Esgoto em

Juazeiro do Norte - CE, apresentam condições ambientais semelhantes às que são

requeridas ao crescimento excessivo de espécies potencialmente tóxicas;

2. As florações das Lagoas de Estabilização mostraram-se constituídas por 14 espécies,

tendo sido a ocorrência de Planktothrix isothrix predominante nas três lagoas

analisadas durante o período de amostragens, sendo verificada inclusive no Rio

Salgado, corpo receptor;

3. As espécies mais importantes em termos de frequência de ocorrência para as três

lagoas de estabilização analisadas foram: Microcystis aeruginosa, Microcystis

protocystis, Sphaerocavum brasiliensis e Radiocystis fernandoi, com destaque de

Planktothrix isothrix sobre as demais;

4. Microcystis protocystis, Sphaerocavum brasiliensis e Radiocystis fernandoi, consistem

em novos relatos de ocorrência para a Região do Cariri, bem como para o Estado do

Ceará;

5. No Brasil, não existem registros de Cianobactérias que apresentem atividade

antioxidante, sendo este o primeiro relato da presença de tal atividade;

6. A detecção da atividade anticolinesterásica em algumas das amostras testadas consiste

em resultado considerável, já que no Brasil, até a data do presente trabalho, somente 1

(um) trabalho consta na literatura disponível, sendo portanto, recentes os programas de

screening para as espécies de Cianobactérias com essa atividade;

7. A presença do aminoácido neurotóxico BMAA foi detectada em todas as Lagoas de

Estabilização: Facultativa A, Facultativa B e de Maturação, incluindo todo o período

de amostragem, representando risco quanto à exposição humana;

8. A partir dos testes de toxicidade em camundongos foram constatados mecanismos de

ação diferenciados, os quais se evidenciaram a partir da sintomologia, dos importantes

achados post-mortem que demonstraram efeitos crônicos e da toxicidade aguda que

apresentou tempo de morte divergente do registrado para as cianotoxinas já

conhecidas. Assim, esses dados direcionam à possível ocorrência de uma nova toxina,

para a qual mais estudos devem ser conduzidos;

9. A relação de Planktothrix isothrix à produção dos metabólitos secundários detectados

(tóxicos ou de interesse farmacológico) é suportada por sua massiva concentração de


organismos sobre as demais espécies de Cianobactérias coexistentes. Dessa forma,

estando Planktothrix isothrix envolvida na biossíntese das cianotoxinas detectadas, sua

ocorrência consiste em primeiro registro tóxico para a região tropical do Brasil;

10. A evidência biológica constatada na biomassa predominante e a evidência química

com o registro das mesmas substâncias metabólicas suportam a hipótese de tratar-se

de um mesmo organismo. Assim sendo, consiste na espécie de maior importância da

área estudada;

11. O rio Salgado por atravessar vários municípios pode ser fonte de dispersão de células

de Cianobactérias para as populações periurbanas e urbanas. Sendo importante

ressaltar que as flutuações quanto à velocidade das águas podem gerar fluxo

turbulento ou influenciar o tempo de retenção, mudando a dinâmica natural do sistema

e, portanto, podendo resultar em condições favoráveis para o estabelecimento de

populações tóxicas à jusante do lançamento do efluente da ETE no referido corpo

receptor;

12. É urgente a necessidade de um monitoramento planejado sobre o efluente final

resultante do processo de estabilização, em virtude da comprovada presença da

cianotoxina BMAA, a qual constitui uma grande ameaça à saúde humana.


REFERÊNCIAS

AGÊNCIA NACIONAL DE ÁGUAS. Atlas: abastecimento urbano de águas. Disponível em:<http://atlas.ana.gov.br/atlas/forms/AtlasNordeste.aspx>. Última atualização em 2009. Acessoem: 01 de junho de 2010.

AGUJARO, L. F. Métodos de análises. In: SANT’ANNA, C. L. et al. Manual ilustrado paraidentificação e contagem de cianobactérias planctônicas de águas continentaisbrasileiras. Rio de Janeiro: Interciência; São Paulo: Sociedade Brasileira de Ficologia –SBFic, 2006. p. 27 a 34.

ALENCAR, X. G. R.; OLIVEIRA, F. I. M.; LACERDA, S. R. Diversidade de algas emlagoas de estabilização no município de Juazeiro do Norte (CE). In: ENCONTRO DEINICIAÇÃO CIENTÍFICA DA UNIVERSIDADE REGIONAL DO CARIRI-URCA, 3.1999, Crato. Anais do III Encontro de Iniciação Científica da URCA, Crato: URCA, 1999.p. 35.

ANAGNOSTIDIS, K.; KOMÁREK, J. Modern approach to the classification system ofCyanophytes, 3: Oscillatoriales. Algological Studies, v. 80, n. 1 – 4, p. 327 – 472, 1988.

AQUINO, E. P.; FREITAS, A. I. G.; LACERDA, S. R. The phytoplanktonic community fromstabilization ponds in the Cariri area, Ceará. Journal of Biology, João Pessoa – PB, v. 02, p.153, 2007. Suplemento do IV Plankton Symposium e I Congresso Brasileiro de Plâncton,2007.

AQUINO, E. P.; LACERDA, S. R.; FREITAS, A. I. G. Cianobactérias das lagoas detratamento de esgoto no semi-árido nordestino (Ceará, Brasil). Insula, Santa Catarina: UFSC,v. 39, p. 34 - 46, 2010.

ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. Diretrizes para apresentaçãode dissertações e teses da USP: documento eletrônico e impresso - Parte I (ABNT). 2 ed.São Paulo: Universidade de São Paulo / Sistema Integrado de Bibliotecas - SIBi/USP, 2009.102 p.

AZEVEDO, M. T. P.; SANT’ANNA, C. L. Morfologia e reprodução. In: SANT’ANNA, C.L. et al. Manual ilustrado para identificação e contagem de cianobactérias planctônicasde águas continentais brasileiras. Rio de Janeiro: Interciência; São Paulo: SociedadeBrasileira de Ficologia – SBFic. 2006. p. 05 – 08.

AZEVEDO, S. M. F. O.; VASCONSELOS, V. M. Toxinas de cianobactérias: causas econseqüências para a saúde pública. In: ZAGATTO, P. A.; BERTOLETTI, E. Ecotoxicologiaaquática: princípios e aplicações. 2 ed. São Carlos: Rima, 2008. p. 433 – 452.

http://atlas.ana.gov.br/atlas/forms/AtlasNordeste.aspx


BANACK, S. A.; COX, P. A. Biomagnification of cycad neurotoxins in flying foxes:implications for ALS-PDC in Guam. Neurology, Kalaheo (Kauai), v. 61, p. 387 – 389, 2003.

BIANCHI, M. L. P.; ANTUNES, L. M. G. Radicais livres e os principais antioxidantes dadieta. Revista de Nutrição, Campinas (SP), v. 12, n. 2, p.123 – 130, 1999.

BICUDO, C. E. M.; MENEZES, M. Gêneros de algas de águas continentais do Brasil:chave para identificação e descrições. 2 ed. São Carlos: Rima, 2005. 502 p.

BITTENCOURT-OLIVEIRA, M. C.; OLIVEIRA, M. C.; YUNES, J. S. Cianobactériastóxicas: O uso de marcadores moleculares para avaliar a diversidade genética. BiotecnologiaCiência & Desenvolvimento. n. 23. Novembro e dezembro de 2001. Disponível em:<http://www.biotecnologia.com.br/revista/bio23/cianobac.pdf>. Acesso em: 01 de junho de2009.

CALIJURI, M. C.; ALVES, M. S. A.; SANTOS, A. C. A. Cianobactérias e cianotoxinas emáguas continentais. São Carlos: Rima, 2006. 118 p.

CARMICHAEL, W. W. Cyanobacteria secondary metabolites: the cyanotoxins. Journal ofApplied Bacteriology, Dayton (Ohio), v.72, p. 445 – 459, 1992.

CARMICHAEL, W. Toxic Microcystis and the environment. In: WATANABE, M. F. et al.Toxic Microcystis. Boca Raton: CRC Press, 1996. p. 1 – 11.

CARMICHAEL, W.W. The cyanotoxins. Advances in Botanical Research, Ohio (U.S.A.),v. 27. p. 211 – 212, 1997.

CARVALHO, L. R. Cianotoxinas. In: SANT’ANNA, C. L. et al. Manual ilustrado paraidentificação e contagem de cianobactérias planctônicas de águas continentaisbrasileiras. Rio de Janeiro: Interciência; São Paulo: Sociedade Brasileira de Ficologia –SBFic. 2006. p. 09 – 19.

CARVALHO, L. R. et al. A Toxic Cyanobacterial Bloom In An Urban Coastal Lake, RioGrande do Sul State, Southern Brazil. Brazilian Journal of Microbiology, Rio de Janeiro(RJ), v. 39, p. 761 – 769, 2008.

CHORUS, I.; BARTRAM, J. Toxic cyanobacteria in water. London/New York: WorldHealth Organization, 1999. 400 p.

CODD, G. A. et al. Harmful cyanobacteria. From mass mortalities to management measures.In: HUISMAN, J.; MATTHIJS, C. P.; VISSER, M. (eds.). Harmful cyanobacteria. AquaticEcology Series. Netherlands: Springer, 2005. p. 1 – 23.

COMPANHIA DE ÁGUA E ESGOTO DO ESTADO DO CEARÁ. Sistema de lagoa deestabilização. Juazeiro do Norte: CAGECE, 2010. 10 p.

http://www.biotecnologia.com.br/revista/bio23/cianobac.pdf


_____. Sistema de esgotamento sanitário. Juazeiro do Norte: CAGECE, 2006. 11 p.

COMPÈRE, P. Algues de la región du lac Tchad: v – chlorophycophytes (1ª partie). CahiersOrstom Hidrobiologie, v. 10, n. 02, p. 77 – 118, 1976.

COX, P. A.; BANACK, S. A.; MURCH, S. J. Biomagnification of cyanobacterial neurotoxinsand neurodegenerative disease among the Chamorro people of Guam. Proceedings of theNational Academy of Sciences, Tucson (Arizona), v. 100, n. 23, p. 13380 – 13383, 2003.

COX, P. A. et al. Diverse taxa of cyanobacteria produce β-N-methylamino-L-alanine, aneurotoxic amino acid. Proceedings of the National Academy of Sciences, Tucson(Arizona), v. 102, n. 14, p. 5074 – 5078, 2005.

CRUZ, L. S. et al. Variações temporais do fitoplâncton e de parâmetros físico-químicos emlagoas de estabilização facultativas tratando esgotos sanitários em regime de batelada. In: 23CONGRESSO BRASILEIRO DE ENGENHARIA SANITÁRIA E AMBIENTAL. 2005,Campo Grande – MS. Anais Eletrônicos do XXIII CBESA, Campo Grande: ABES, 2005.11 p.

DESIKACHARY, T. V. Cyanophyta. New Delhi: Indian Council of agricultural Research,1959. 686 p.

DI BERNARDO, L. Algas e suas influências na qualidade das águas e nas tecnologias detratamento. Rio de Janeiro: ABES, 1995. 140 p.

DOGO, C. R. et al. Evaluation of anticholinesterasic activity of strain SPC 920 –Geitlerinema unigranulatum (Oscillatoriales, Cyanobacteria). In: RIET-CORREA, F.;MEDEIROS, R. M. T.; FISTER, J. P. ; SCHILD, A. L. ; DANTAS, A. F. M. (Org.).Poisonings by plants, micotoxins and related substances in Brazilian livestock. Patos, PB:Sociedade Vicente Pallotti, 2010, v. 02, p. 1 – 6.

DOW, C. S; SWOBODA, U. K. Cianotoxins. In: WHITTON, B. A.; POTTS, M. The ecologyof cyanobacteria: their diversity in time and space. Dordrecht: Kluwer, 2000. p. 613 – 632.

FERNANDES, V. O. et al. Ecologia de cianobactérias: fatores promotores e conseqüênciasdas florações. Oecologia Brasiliensis, Rio de Janeiro: UFRJ, v. 13, n. 02, p. 247 – 258, 2009.

FERRÃO-FILHO, A. S. Bioacumulação de cianotoxinas e seus efeitos em organismosaquáticos. Oecologia Brasiliensis, Rio de Janeiro: UFRJ, v. 13, n. 02, p. 272 – 312, 2009.

FERRÃO-FILHO, A. S.; MOLICA, R.; AZEVEDO, S. M. F. O. Ecologia, ecofisiologia etoxicologia de cianobactérias. Oecologia Brasiliensis, Rio de Janeiro: UFRJ, v. 13, n. 02, p.225 – 228, 2009.


FREITAS, A. I. G. de; AQUINO, E. P.; OLIVEIRA, E. C. C. de; LACERDA, S. R.Levantamento da comunidade fitoplanctônica das lagoas de estabilização de tratamento deesgoto (ETE_Juazeiro do Norte_CE). In: REUNIÃO NORDESTINA DE BOTÂNICA, 29.2006, Mossoró – RN. Anais do XXIX Reunião Nordestina de Botânica. Mossoró:Universidade Estadual do Rio Grande do Norte – UERN, 2006.

FERREIRA, A. L. A.; MATSUBARA, L. S. Radicais livres: conceitos, doenças relacionadas,sistema de defesa e estresse oxidativo. Revista da Associação Médica Brasileira, Botucatu(SP), v. 43, n. 1, p. 61 – 68, 1997.

FINKEL, T.; HOLBROOK, N. J. Oxidants, oxidative stress and the biology of ageing.Nature, U.S.A, v. 408, n. 6809, p. 239 – 247, nov. 2000.

FUNDAÇÃO CEARENSE DE METEOROLOGIA E RECURSOS HÍDRICOS(FUNCEME). Dados de precipitação mensais de Juazeiro do Norte (1970-2010).Fortaleza, CE, 2010.

HARADA, K.; KONDO, F.; LAWTON, L. Laboratory analysis of cyanotoxins. In:CHORUS, I.; BARTRAM, J. Toxic cyanobacteria in water: a guide to their public healthconsequences, monitoring and management. New York: E & FN SPON, 1999. p. 369 – 405.

HONDA, R. Y. et al. Cianotoxinas em pesqueiros da região metropolitana de São Paulo. In:ESTEVES, K. E.; SANT’ANNA, C. L. Pesqueiros sob uma visão integrada de meioambiente, saúde pública e manejo. São Carlos: Rima, 2006. p. 105 – 120.

HOSTETTMANN, K.; QUEIROZ, E. F.; VIEIRA, P. C. Princípios ativos de plantassuperiores. v. 04. São Carlos: EdUFSCar, 2003. 152 p.

JENSEN, J. P. et al. Impact of nutrients and physical factorson the shift from Cyanobacterialand Chlorophyte dominance in shallow Danish lakes. Canadian Jounal of Fisheries andAquatic Sciences, v. 51, n. 08, p. 1692 – 1699, 1994.

JONASSON, S. et al. Transfer of a cyanobacterial neurotoxin within a temperate aquaticecosystem suggests pathwaysfor human exposure. Proceedings of the National Academy ofSciences, Honolulu (Hawaii), v. 107, n. 20, p. 9252 – 9257, 2010.

KELLNER, E.; PIRES, E. C. Lagoas de estabilização: projeto e operação. Rio de Janeiro:ABES, 1998. 244 p.

KOMÁREK, J.; ANAGNOSTIDIS, K. Cyanoprokaryota 2. Teil: Oscillatoriales. In: BÜDEL,B. et al. (eds). Sübwasserflora von Mitteleuropa. v. 19, n. 02. Heidberg: Elsevier/SpektrumAkademischer Verlag, 2005. 759 p.


KOMÁREK, J.; ANAGNOSTIDIS, K. Cyanoprokaryota 1. Teil: Chroococcales. In: ETTL,H. et al. (eds). Süsswasserflora von Mitteleuropa, v. 19, n. 01. Gustav Fischer, Jena, 1999.548 p.

KOMÁREK, J.; ANAGNOSTIDIS, K. Modern approach to the classification system ofcyanophytes 4. Teil: Nostocales. Algological Studies, Stuttgart (Germany), v. 82, n. 03. p.247 – 345, 1989.

KOTILA, P. M. Ecological Measures. Software package, St. Lawrence University. 1986.

KUIPER-GOODMAN, T.; FALCONER, I.; FITZGERALD, J. Human health aspects. In:CHORUS, I.; BARTRAM, J. Toxic cyanobacteria in water. London/New York: WorldHealth Organization, 1999. p. 125 – 160.

KURODA, E. K. et al. Avaliação da toxicidade aguda de uma cepa de Microcystis spp. pormeio de testes com camundongos. Engenharia Sanitária Ambiental, Rio de Janeiro, v. 12,n. 01, p. 24 – 31, 2007.

LOBO, E.; LEIGHTON, G. Estructuras comunitarias de las fitocenosis planctonicas de lossistemas de desembocaduras de rios y esteros de la zona central de Chile. Revista BiologiaMarina, Valparaíso, v. 22, n. 01, p. 1 - 29, 1986.

MAGURRAN, A. E. Measuring biological diversity. Malden: Blackwell Science, 2004.256p.

MARSTON, A.; KISSILING, J.; HOSSTETTMANN, K. A rapid TLC bioautographicmethod for the detection of acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase inhibitors in plants.Phytochemical Analysis, v. 13, p. 51 – 54, 2002.

MATEUCCI, S. D.; COLMA, A. La metodologia para el estudo de la vegetacion.Washington: Collecion de Monografias Cientificas, 1982. p. 1-168. Serie Biologia, 22 (1).

MERCK, E. Dyeing reagents for thin layer and paper chromatography. Darmstadt (Germany):E. Merck, 1971. Ítem 207, p.64.

MIZUNO, T. Illustrations of the freshwater plankton of Japan. Osaka: Hoikusha, 1968.351p.

MOLICA, R.; AZEVEDO, S. Ecofisiologia de cianobactérias produtoras de cianotoxinas.Oecologia Brasiliensis, Rio de Janeiro: UFRJ, v. 13, n. 02, p. 229 – 246, 2009.

MURCH, S. J.; COX, P. A.; BANACK, S. A. A mechanism for slow release of biomagnifiedcyanobacterial neurotoxins and neurodegenerative disease in Guam. Proceedings of theNational Academy of Sciences, Mexico City (Mexico), v. 101, n. 33, p. 12228 – 12231.2004b.


MURCH, S. J. et al. Occurrence of β-methylamino-L-alanine (BMAA) in ALS/PDC patientsfrom Guam. Acta Neurologica Scandinavica, Kalaheo (Hawaii), v. 102, p. 267 – 269.2004a.

NUNES, X. P.; MESQUITA, R. F.; SILVA, L. D. P.; COSTA, V. C. O.; SILVA, M. V. B.;XAVIER, A. L.; DINIZ, M. F. F. M.; AGRA, M. F. Constituintes químicos, avaliação dasatividades citotóxica e antioxidante de Mimosa paraibana Barneby (Mimosaceae). RevistaBrasileira de Farmacognosia, Curitiba (PR), v. 18, p. 718 – 723, dez, 2008.

OUELLETTE, A. J. A.; WILHELM, S. W. Toxic cyanobacteria: the evolving moleculartoolbox. Frontiers in Ecology and the Environment, Knoxville (Tennessee), v. 01, n. 07. p.359 – 366, 2003.

PABLO, J. et al. Cyanobacterial neurotoxin BMAA in ALS and Alzheimer’s disease. ActaNeurologica Scandinavica, v. 120, n. 04, p. 216 – 225, 2009.

PARRA, O. O.; BICUDO, C. E. M. Introducción a la biologia y sistematica de las algas deaguas continentales. Santiago, Chile: Concepción / Ediciones Universidad de Concepición.1993. 268 p.

PARRA, O. O.; GONZALEZ, M.; DELARROSA, V. Manual taxonomico del fitoplanctonde aguas continentales: com especial referencia al fitoplancton de Chile. V: Chlorophyceae.Parte I: Volvocales, Tetrasporales, Chlorococcales y Ulotricales. Santiago, Chile: Concepción/ Editorial Universidad de Concepción, 1983. 151 p.

PAERL, H. W. Nutrient and other environmental controls of harmful cyanobacterial bloomsalong the freshwater–marine continuum. In: HUDNELL, H. K. (ed.) CyanobacterialHarmful Algal Blooms: State of the Science and Research Needs. Springer, 2008. p. 217-237.

PIETRZYK, D. J. Organic polymeric stationary phases. In: BROWN, P. R.; HARTWICK, R.A. (eds). High performance liquid chromatography. v. 98. New York: Wiley-IntersciencePublication, 1989. p. 223-276.

PRESCOTT, G. W. Algae of the Western Great lakes area: with an illustrated key to thegenera of desmids and fresh water diatoms. Iowa: Wm. C. Brown Company Publishers. 1962.300 p.

RANGEL, M. et al. Hemolytic activity in extracts of the diatom Nitzschia. Toxicon,Washington DC (U.S.A.), v. 35, n. 02, p. 305 – 309, 1997.

REYNOLDS, C. et al. Towards a functional classification of the freshwater phytoplankton.Journal of Plankton Reserch, v. 24, p. 417 – 428, 2002.


REBOUÇAS, A. C. Água doce no mundo e no Brasil. In: REBOUÇAS, A. C.; BRAGA, B.;TUNDISI, J. G. Águas doces no Brasil: capital ecológico, uso e conservação. 3 ed. SãoPaulo: Escrituras, 2006. p. 1 – 35.

_______. Uso inteligente da água. São Paulo: Escrituras, 2008. 207 p.

REVIERS, B. Biologia e filogenia das algas. Porto Alegre: Ed Artmed, 2006. 280 p.

SALATI, E.; LEMOS, H. M.; SALATI, E. Água e o desenvolvimento sustentável. In:REBOUÇAS, A. C.; BRAGA, B.; TUNDISI, J. G. Águas doces no Brasil: capital ecológico,uso e conservação. 3 ed. São Paulo: Escrituras, 2006. p. 37 – 62.

SALOMON, P. S.; YUNES, J. S.; PARISE, M.; COUSIN, J. C. B. Toxicidade de um extratode Microcystis aeruginosa da Lagoa dos Patos sobre camundongos e suas alterações sobre otecido hepático. Revista Vittalle, Rio Grande, n. 8, p. 23 – 32, 1996.

SANT’ANNA, C. L.; AZEVEDO, M. T. P. Contribution to the knowledge of potentially toxicCyanobacteria from Brazil. Nova Hedwigia, Stuttgart (Germany), v. 71, n. 03 – 04, p. 359 –385, 2000.

SANT’ANNA, C. L. et al. Review of toxic species of Cyanobacteria in Brazil. Algologicalstudies, Stuttgart (Germany), v. 126, p. 251 – 265, 2008.

SANT’ANNA, C. L.; GENTIL, R. C.; SILVA, D. Comunidade fitoplanctônica de pesqueirosda região metropolitana de São Paulo. In: ESTEVES, K. E.; SANT’ANNA, C. L. Pesqueirossob uma visão integrada de meio ambiente, saúde pública e manejo. São Carlos: Rima,2006. p. 49 a 62.

SECRETARIA DAS CIDADES DO ESTADO DO CEARÁ. Localização da Região doCariri Central. Disponível em: <http://www.cidades.ce.gov.br/categoria4/mapa-localizacao-projeto-cariri-central-port.pdf> . Última atualização em 2009. Acesso em: 09 de dezembro de2010.

SIVONEN, K.; JONES, G. Cyanobacterial toxins. In: CHORUS, I.; BARTRAM, J. Toxiccyanobacteria in water: a guide to their public health consequences, monitoring andmanagement. London and New York: World Health Organization, 1999. p. 41 – 111.

SOARES, R. M. Toxicologia de cianotoxinas: microcistinas as estrelas do tema. OecologiaBrasiliensis, Rio de Janeiro: UFRJ, v. 13, n. 02, p. 259 – 271, 2009.

SOUZA, R. C. R. Introdução. In: SANT’ANNA, C. L. et al. Manual ilustrado paraidentificação e contagem de cianobactérias planctônicas de águas continentaisbrasileiras. Rio de Janeiro: Interciência; São Paulo: Sociedade Brasileira de Ficologia –SBFic. 2006. p. 01 – 04.

http://www.cidades.ce.gov.br/categoria4/mapa-localizacao-


SOUZA, T. M. et al. Bioprospecção de atividade antioxidante e antimicrobiana da casca deStryphnodendron adstrigens (Mart.) Coville (Leguminosae-Mimosoidae). Revista deCiências Farmacêuticas Básica e Aplicada, Araraquara (SP), v. 28, n. 2, p. 221 – 226, 2007.

SPENCER, P. S. et al. Motorneurone disease on Guam: possible role of a food neurotoxin.The Lancet, v. 01, p. 965, 1986.

STREBLE, H., KRAUTER, D. Atlas de los microorganismos de agua doce: la vida en unagota de agua. Barcelona: Ed Omega, 1987. 357 p.

TUNDISI, J. G. Água no século XXI: enfrentado a escassez. 2 ed. São Carlos: Rima, 2005.248 p.

VEGA, A.; BELL, E. A. α-Amino-β-methyl aminopropionic acid, a new amino acid fromseeds of Cycas circinalis. Phytochemistry, v. 06, p. 759 – 762, 1967.

VIEIRA, V. P. P. B.; GONDIM FILHO, C. G. Água doce no semi-árido. In: REBOUÇAS, A.C.; BRAGA, B.; TUNDISI, J. G. Águas doces no Brasil: capital ecológico, uso econservação. 3 ed. São Paulo: Escrituras, 2006. p. 481 – 505.

VON SPERLING, M. Introdução à qualidade das águas e ao tratamento de esgotos. 2 ed.v. 01. Belo Horizonte: Departamento de engenharia sanitária e ambiental, UniversidadeFederal de Minas Gerais, 1996a. 243 p.

_____, M. Lagoas de estabilização. v. 03. Belo Horizonte: Departamento de EngenhariaAmbiental, Universidade Federal de Minas Gerais, 1996b. 140 p.

WHITTON, B.; POTTS, M. The ecology of cyanobacteria: their diversity in time and space.Netherlands: Kluwer academy Publisher, 2000. 669p.

ZAGATTO, P. A. et al. Avaliação ecotoxicológica do reservatório do Guarapiranga, SP, comênfase à problemática das algas tóxicas e algicidas. In: CONGRESSO LATINO-AMERICANO DE FICOLOGIA, 4. São Paulo, 1997. Anais do IV Congresso Latino-Americano de Ficologia. São Paulo – SP, 1997. p. 63 – 81.

ZELÍK, P. Acetylcholinesterase inhibitor from Nostoc Sliz. Kol. Sborník, Brno (CzechRepublic), p. 187 – 190, 2005.

elaine cristina conceiÇÃo de oliveira - mbm.urca.brmbm.urca.br/pdf/dissertacoes/elaine cristina...

Documents