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Determinação da Determinação da actividade enzimática da actividade enzimática da
Fosfatase AlcalinaFosfatase Alcalina
Elaborado por:Elaborado por:
• Ana Carina Nogueira;• Ana Cláudia Costa;• Carla Saraiva;• Melissa Alves.
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Fosfatase AlcalinaFosfatase Alcalina
• Enzima que remove grupos fosfato de diferentes moléculas (desfosforilação), principalmente os das extremidades 5’ do DNA, impedindo a sua ligação com outras moléculas de DNA;
• É mais activa em soluções alcalinas;
• É produzida por diversos órgãos e tecidos. Nesta experiência, será utilizada a da mucosa do intestino delgado do rato;
• A fosfatase alcalina é também utilizada em outras técnicas, como a marcação radioactiva e ensaios de imunodetecção.
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DetecçãoDetecção da fosfatase alcalinada fosfatase alcalina
• A presença desta enzima é detectada pela reacção com o substrato incolor p-nitrofenilfosfato (pNPP);
• Os produtos desta reacção são um grupo fosfato e p-nitrofenol, cuja coloração é amarela, sendo assim detectado por absorvância a 405nm.
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AbsorvânciaAbsorvância
• Quantidade matemática do processo de absorção da luz;
• É detectada usando um espectrofotómetro.
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Lei de Beer-LambertLei de Beer-Lambert
A lei de Beer-Lambert, também conhecida como lei de
Beer ou lei de Beer-Lambert-Bouguer é uma relação empírica
que, na Óptica, relaciona a absorção de luz com as propriedades
do material atravessado por esta.
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Isto se pode expressar de distintas maneiras:
Onde:
• A é a absorção.• Є é a constante de absortividade molar
(18500cm/M) .• l é a largura da cuvete.• c é a concentração.
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Cinética enzimáticaCinética enzimática
S1 + E ES1 ES2 E + S2
• Iremos calcular velocidade máxima e constante de Michaelis-Menten (Km)
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• A vantagem do uso de gráficos lineares é a quantificação precisa de Km e Vmáx através da extrapolação em linhas rectas em vez de assímptotas.
Cinética enzimática (cont.)Cinética enzimática (cont.)
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Preparação de um extracto enzimático da Preparação de um extracto enzimático da mucosa intestinal de ratomucosa intestinal de rato
• Raspar a superfície interna do intestino do rato, para obter o extrato enzimático
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Determinação da actividade da fosfatase Determinação da actividade da fosfatase alcalina a pH 8,5alcalina a pH 8,5
• Medir a absorvância antes e depois de adicionar a fosfatase alcalina, de modo a verificar a sua acção;
• Representar graficamente os resultados obtidos.
• Preparar uma solução com Tris-HCl, pNPP e NaCl;
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Efeito da concentração de substrato na Efeito da concentração de substrato na actividade enzimáticaactividade enzimática
• Preparar 12 tubos com diferentes concentrações de reagentes;
• Ler absorvância;
• Fazer os gráficos normal e inverso da cinética da reacção em estudo e concluir sobre a mesma.