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Cultura de células de DRG’s e transdução
viral
Faculdade de Medicina da Universidade do PortoInstituto de Embriologia e Histologia – Disciplina de Biologia Molecular e
Celular
Porto - 2004
Realizado por:
Francisco A. F. Ferro de Beça
Francisco M. Pinto da Costa
Luís F. Silva Machado
Rita M. Marinho Pires
Orientado por:
Dra. Joana Gomes
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Objectivos
1. Estabelecer uma cultura de células;
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O que é?É um tipo de cultura de tecidos que implica a desagregação (mecânica ou enzimática) do tecido original e em que as células são cultivadas numa camada aderente, num substrato sólido ou em suspensão em meio de cultura.
Tipos de cultura de tecidos (adaptado de Freshney, 2000).
Cultura de células
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Limitações
•Necessidade de operadores experientes (com conhecimentos da técnica asséptica, etc);
•Custo do esforço e material (baixa quantidade de células produzidas para o material e esforço gasto);
•Perda de características fenotípicas;
•Necessidade do uso de marcadores devido à perda de características fenotípicas;
•Instabilidade das células (sobretudo em linhas celulares imortais).
Cultura de células
Vantagens
•Controlo das condições ambientais (pH, temperatura, concentração de O2 e CO2, etc);
•Obtenção de células com boa homogeneidade e bem caracterizadas;
•Economia de animais, reagentes, tempo, etc.
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Algum do material utilizado:
Cultura de células
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•Gânglios que se localizam nas raízes dorsais dos nervos raquidianos.
•Possuem sobretudo os corpos celulares de neurónios aferentes primários sensitivos.
–Neurónios pseudounipolares com 2 axonónios: sendo um dirigido à periferia para fazer a enervação sensitiva dos tecidos; e o outro para a medula espinal.
Dorsal Root Ganglions (DRG’s)
Estrutura da medula espinal (adaptado de Martin, 1989).
Neurónio de um DRG (adaptado de Kandel et al., 1985).
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Actividade experimental
1ª experiência (parte 1) - Protocolo
1. Sacrificou-se um ratinho (C57 BL / 6J) e dissecaram-se os DRG’s;
2. Procedeu-se à digestão enzimática dos DRG’s com colagenase durante 3 horas;
3. Cobriram-se os poços de cultura com PORN (Poly-DL-ornitina hidrobromido) e esterilizaram-se os mesmos com luz UV;
4. Após a digestão enzimática, lavaram-se as células com meio de cultura;
5. Transferiram-se as células para para um falcon com BSA (sterile bovine serum albumin type IV) a 15% e centrifugaram-se (durante 10 min a 1000 rpm);
6. Semearam-se as células nos poços de cultura;
7. Incubaram-se durante 2 dias a 37ºC e a 5% de CO2.
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1ª experiência (parte 1) - Resultados
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Objectivos
1. Estabelecer uma cultura de células;
2. Infectar as células com HSV-1;
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Neurónio de um DRG (adaptado de Kandel et al., 1985).
HSV-1 (Herpes simplex vírus tipo 1)
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•Genoma extenso (150 Kb) e zona de inserção também (35 Kb);
•Não integra o seu genoma no da célula hospedeira;
•Infecta preferencialmente células quiescentes.
HSV-1 (Herpes simplex vírus tipo 1)
Infecção pelo HSV-1 (Adaptado de Fink et al., 1996).
Estrutura da partícula viral (Adaptado de Burton et al.,2002).
Que vantagens oferece o HSV-1 como vector sobre outros vírus?
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Utilizou-se uma versão do herpes vírus alterado geneticamente para:
• Não ser replicativo;
• Não ser patogénico;
• Incluir no seu DNA uma cassete contendo a unidade transcripcional do gene codificador da GFP (Green Fluorescence Protein) .
Esquema do genoma recombinado (adaptado de Wilson et al., 1999). Transcrição em cascata do genoma do HSV
wildtype 1.
HSV-1 (Herpes simplex vírus tipo 1)
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6. Incubaram-se as células com um meio de cultura com HSV-1(diluição 1/5000 – 8x102 Pfu) e durante 2h para infecção das mesmas pelo vírus;
7. Após infecção substituiu-se o meio de cultura com o vírus por novo meio e incubaram-se de novo as células;
8. Passadas 24 horas procedeu-se à fixação das células com etanol e posterior observação destas no microscópio confocal para pesquisa do sinal verde da GFP.
1ª experiência (parte 2) - Protocolo
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1. Sacrificou-se um rato (Wistar) e dissecaram-se os DRG’s.
2. ...
6. Adicionou-se NGF (Nerve Growth Factor) ao meio (50 ng/mL).
7. Semearam-se as células nos poços de cultura.
8. Incubaram-se durante 5 dias a 37ºC e a 5% de CO2.
9. Incubaram-se as células com um meio de cultura com HSV-1 (com 2 diluições diferentes, uma 1/5000 – 8x102 Pfu e outra 1/2500 – 1,6x103 Pfu) durante 24h para infecção das mesmas pelo vírus.
10. Substituiu-se o meio de cultura com o vírus por novo meio de cultura e incubaram-se de novo as células durante 2 dias.
11. Procedeu-se à fixação das células em PFA (Paraformaldeído) (a 4%) e posterior observação destas ao microscópio confocal para pesquisa do sinal verde da GFP.
2ª experiência (parte 1) - Protocolo
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2ª experiência (parte 1) - Resultados
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2ª experiência (parte 1) - Resultados
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Objectivos
1. Estabelecer uma cultura de células.
2. Infectar as células com HSV-1.
3. Verificar se as células infectadas eram de facto neurónios.
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13. Seguidamente, realizou-se uma imunocitoquímica começando por se lavar duas vezes os poços com PBS (Phosphate Bufer Salive) ( 8 min cada lavagem);
14. Lavaram-se os poços com PBS-T (PBS+Triton)(durante 5min);
15. Adicionou-se uma solução de PBS+glicínia+NGS (Normal Goat Serum)(15mg glicínia em 2mL de PBS e 10% de NGS) e aguardou-se 1 hora;
16. Retirou-se a solução anterior e adicionou-se o anticorpo primário anti-Neu N, utilizando-se duas soluções (anti-Neu N em PBS + 2% NGS) com concentrações diferentes ( 1/2500 e 1/5000);
17. Incubou-se à temperatura ambiente overnight;
18. Lavaram-se os poços duas vezes com PBS e uma com PBS-T como anteriormente;
19. Adicionou-se o anticorpo secundário goat anti-mouse (goat anti-mouse em PBS com uma diluição 1/1000) e aguardou-se 1 hora;
20. Lavaram-se os poços com PBS 2 vezes (5 min cada lavagem);
21. Observou-se ao microscópio confocal para pesquisa do sinal.
2ª experiência (parte 2) - Protocolo
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O protocolo usado foi o basicamente o mesmo da 2ª experiência com as seguintes alterações:
1. Voltamos a utilizar ratinhos em vez de ratos;
2. Apenas incubamos as células 3 dias antes de as infectarmos com o HSV-1;
3. Na imunocitoquímica não realizamos as lavagens com PBS-T.
3ª experiência - Protocolo
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3ª experiência - Resultados
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3ª experiência – Resultados
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Conclusões•Foi possível estabelecer uma cultura de DRG’s viáveis ultrapassando a complexidade da técnica da cultura celular;
•Ocorreu uma transdução viral eficiente e consequente expressão da GFP nas células em cultura;
•Verificou-se que o vírus infectou neurónios bem como outras células.
•Efectuar uma contagem dos sinais para se conhecer a percentagem de células infectadas pelo HSV-1 face à percentagem de neurónios.
•Realizar novas imunocitoquimicas com outros marcadores (p.e. GFAP para certas células gliais) de forma a conhecer os outros tipos de células infectados pelo HSV-1, bem como a percentagem de infecção.
•Elaborar um novo protocolo que permita investigar se a entrada do vírus nos neurónios se processa pelos prolongamentos celulares ou se efectivamente entra pelo corpo celular.
Estratégias a seguir em trabalhos futuros
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Bibliografia
Burton E. A., Fink D. J., Glorioso J. C.. “Gene delivery using herpes simplex virus vectors”. (2002) DNA and Cell Biology, 21(12):915-36.
Fink D. J., DeLuca N. A., Goins W. F., Glorioso J. C.. “Gene transfert to neurons using herpes simplex virus-based vectors”. (1996). Anual Review of Neuroscience, 19:265-87.
Freshney R.I.. “Culture of Animal Cells, a manual of basic technique”. 4th ed., (2000), Wiley-Liss. chapter 1, p. 7, fig. 1.2.
Kelly J.P.. “Anatomical Basis of Sensory Perception and Motor Coordination” in: Kandel, E.R. and Schwartz J.H. (edit). “Principles of Neuronal Science”. 2nd ed.,(1985), Elsevier. Vol 20, p. 223, fig.20-1.
Martin J.H. “Neuroanatomy, Text and Atlas”. 1st ed., (1989), Elsevier. p.8, fig. 1.4.
Mullen, R. J. Buck, C.R. Smith, A. M.. “NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates”. (1992), Developement, p.201-211.
Wilson S. P., Yeomans D. C., Bender M.A., Lu Y, Goins W.F., Glorioso J.C.. “Antihyperalgesic effects of infection with a preproenkephaline-encoding herpes simplex”. (1999) Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 96:3211-3216.
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Agradecimentos
À Dra. Isabel Martins por nos ter disponibilizado as amostras de HSV-1, informação sobre o mesmo e ainda pela ajuda na operação do microscópio confocal bem como na realização desta apresentação.
À Profa. Fani Neto e à Dra. Sandra Rebelo pela disponibilização do material biológico (ratinhos e ratos).