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Controle de Qualidade Físico-Químico
Continuação : Métodos Instrumentais de Identificação
- Espectrometria de Massa
- Métodos Cromatográficos
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A amostra é fragmentada e ionizada em um padrão característico da espécie química.
ESPECTROMETRIA DE MASSA : Princípio
1) Moléculas da amostra são bombardeadas por elétrons
ABCDE + e- ABCDE.+ + 2 e-
2) O íon formado se fragmenta:
ABCDE.+ AB. + CDE+
ABCDE.+ AB+ + CDE.
ABCDE.+ A+ + BCDE.
3) Os fragmentos iônicos formados são separados magneticamente de acordo com suas massas moleculares e contados:
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Massa molecular de cada fragmento = formação dos picos = descoberta / identificação da amostra
A massa e a carga dos íons podem ser medidas por sua posição no espectro.
AB
UN
DÂ
NC
IA
MASSA / CARGA
O gráfico do número de íons formados em função da razão Massa / Carga dos íons é o ESPECTRO DE MASSAS do analito
ESPECTROMETRIA DE MASSA : Princípio
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Ilustração das quatro etapas básicas na análise por Espectrometria de Massas.
ESPECTROMETRIA DE MASSA
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No espectrômetro de massas as moléculas são bombardeadas com um feixe de elétrons de alta energia. As moléculas ionizam-se e dissociam em muitos fragmentos. Cada espécie de íons possui determinado valor da razão da massa pelo número de carga, ou o valor m/z.
http://em.iqm.unicamp.br/
Finalidade: Os espectros de massas são utilizados em geral para identificar um composto.
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- Método bastante caro: aquisição e manutenção do equipamento.
- Extremamente útil na caracterização de uma molécula. - Devido ao seu alto custo, a espectrometria de massa não é utilizada rotineiramente no Controle de Qualidade.
ESPECTROMETRIA DE MASSA
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CROMATOGRAFIA
Método físico-químico de separação de componentes de uma mistura, realizada através da distribuição desses componentes entre duas fases (sistema heterogêneo bifásico) estão em contato íntimo:
1) Fase Estacionária (FE)
2) Fase Móvel (FM)
APLICAÇÃO:
- Identificação de compostos (análise qualitativa)- Quantificação de compostos
- Separação (isolamento/purificação)
Cromatografia analítica
Cromatografia de purificação
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Separação de misturas por interação diferencial dos seus componentes entre uma FASE ESTACIONÁRIA (fixa, colocada em uma coluna ou numa superfície sólida) e uma FASE MÓVEL.
- As fases móvel e estacionária são IMISCÍVEIS.
CROMATOGRAFIA: Principio Básico
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CROMATOGRAFIA: Principio Básico
FE : Líquida ou sólida
FM: Líquida ou gasosa
Separação dos componentes da
amostra
Componentes da amostra separados
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Princípios do Mecanismo de separação em Cromatografia
Para desenvolvimento de uma análise cromatográfica:
1) A amostra é introduzida como uma única alíquota numa das extremidades do sistema cromatográfico.
2) Um solvente (eluente – Fase Móvel) é adicionado para fluir através do sistema. As moléculas se alternam entre FM e FE. 3) Os componentes da amostra são distribuídos entre as duas fases, onde uma fase permanece estacionária (FE) enquanto a outra elui / caminha (FM) entre os interstícios ou superfície da Fase estacionária (FE). O movimento da Fase Móvel resulta numa migração diferenciada dos componentes da amostra.
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4) Os componentes da mistura são “arrastados” em velocidades diferentes, dependendo da afinidade relativa pelas duas fases. Substâncias que se movimentam vagarosamente são aquelas que ficam mais fortemente presas a FE, enquanto que as que se movem rapidamente gastam uma menor fração de tempo na FE, devido a uma menor solubilidade ou afinidade por esta fase.
5) Componentes são totalmente ou parcialmente separados, de acordo com a eficiência do sistema cromatográfico.
A separação ocorre em função das diferenças de afinidade que as diferentes substâncias tem por uma fase móvel ou pela fase estacionária. Essas afinidades diferenciadas podem ser
exploradas para fins analíticos e de identificação
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CROMATOGRAFIA: Classificação
FM = Líquido
FM = Gás
CromatografiaLíquida
CromatografiaGasosa
Em CG a FEpode ser:
Sólida
Líquida
CromatografiaGás-Sólido (CGS)
CromatografiaGás-Líquido (CGL)
Fase Móvel
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Considera-se em geral, pela forma física:
- Forma física do sistema: a) FE em coluna: Cromatografia líquida de Clássica (CLC)*
Cromatografia Líquida de alta eficiência (HPLC)*, Cromatografia gasosa (CG).
b) FE sobre superfície planar: Cromatografia em papel (CP) e Cromatografia em camada delgada (CCD)*
- Estado Físico da Fase Móvel empregada:a) Gás: Cromatografia gasosa (CG ou GC), CSCb) Líquido : HPLC e CLC
- Estado Físico da Fase Estacionária:Sólido, Líquido ou quimicamente ligada.
CROMATOGRAFIA: Classificação
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a) FE Líquida: simplesmente espalhado sobre suporte sólido ou imobilizado por meio de ligações.
b) FE quimicamente ligada: suportes modificados são considerados separadamente,, por diferirem dos demais por outros mecanismos de separação.
CROMATOGRAFIA: Classificação
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- Classificação pelo modo de separaçãoa) Separação por adsorçãob) Separação por partiçãoc) Troca iônicad) Mistura desses mecanismos
Os dois sistemas mais simples e utilizados de cromatografia são a Cromatografia Planar (CP ou CCD) e a Cromatografia Líquida Clássica. Estas duas técnicas são normalmente empregadas de forma manual e ou semi automatizadas (não constituem verdadeiramente técnicas instrumentais)
- CP e CLC são as versões mais simples e baratas de cromatografia.
CROMATOGRAFIA
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CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD)
1) Aplicação da amostra (aprox 1,0 cm da base inferior da placa)2) Ds1: Distância percorrida pela subst.13) Ds2: Distância percorrida pela subst. 24) Dm: Distância percorrida pela FM Rf: Fator de retenção. Seus valores ideais são 0,4 – 0,6
Placa Cuba
- Geralmente são placas de vidro (Existem placas / lâminas prontas de alumínio ou plástico) - FE: Sólida (Sílica gel - mais utilizada, alumina, terra diatomácea ou celulose). - FM: Líquida (dentro da cuba)
Rf : Ds Dm
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CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD)
Rf : É constante para uma dada substância, e corresponde a uma propriedade física daquele composto. O valor de Rf pode, então, ser usado para identificar um composto desconhecido, mas como muitas substâncias podem ter o mesmo valor de Rf, assim com podem ter o mesmo ponto de fusão, métodos adicionais devem ser utilizados para identificação inequívoca do composto.
-Utiliza-se, ao mesmo tempo, padrão da substância para comparação de resultado
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- Como a maioria dos compostos orgânicos é incolor, após a separação das substâncias, é necessário um processo de revelação para analisar o resultado.
- As manchas podem ser reveladas por meio de luz UV, vapores de iodo, soluções de cloreto férrico e tiocianoferrato de potássio, fluorescências, etc.
- É um método simples, rápido, visual e econômico.
CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD)
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CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD)
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Cromatografia Líquida Clássica (CLC)
- O CLC foi o primeiro modo de cromatografia que surgiu.
- Colunas de vidro, sob pressão atmosférica, com fluxo de fase móvel devido à força da gravidade.
- FE: Sílica ou alumina são as mais utilizadas.
- A FM que passa pela coluna pode ser captada na saída por um becker ou erlenmeyer.
- Já as frações de interesse são coletadas em frascos ou tubos de ensaio
Introdução da amostra
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Cromatografia Líquida Clássica (CLC)
![Page 24: Controle de Qualidade Físico-Químico Continuação : Métodos Instrumentais de Identificação - Espectrometria de Massa - Métodos Cromatográficos](https://reader035.vdocuments.com.br/reader035/viewer/2022062219/552fc168497959413d8eb46c/html5/thumbnails/24.jpg)
- Para análise das amostras obtidas, pode-se utilizar análises químicas auxiliares, CCD ou análise espectrofotométrica.
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CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE)
HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATGRAPHY ( HPLC)
- Técnica analítica mais utilizada no Controle de Qualidade pelas Indústrias Farmacêuticas
- É utilizado como ensaios de doseamento, identificação de compostos e ensaios de impurezas orgânicas
- Otimização da coluna clássica: emprego da pressão torna a separação mais eficiente.
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CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE) Modelo Esquemático
Reservatório de FM
Sistema de Bombeamento
Cromatogramas
Válvula p/ amostra
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CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE)
a) reservatório da fase móvel; b) bomba de alta pressão; c) válvula de injeção; d) coluna; e) detector , f) registrador.
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Fase Móvel: - Alto grau de pureza – livre de gases dissolvidos e O2.- O solvente (FM) que se encontra no reservatório é bombeado com auxilio da bomba até a coluna cromatográfica.
Bomba: - Vazão contínua, sem pulsos, não interferindo na eluição da FM.-Método mais eficiente que o a cromatografia líquida clássica (CLC), pois o emprego da pressão torna a separação mais eficiente.
Colunas: - Geralmente de aço inoxidável, diâmetro interno de 0,45 cm para separações analíticas e 2,2 para preparativas.- Comprimento da coluna é variável (10 - 25 cm para colunas analíticas e de 25 - 30 cm para colunas preparativas)
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE)
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- O “recheio” da coluna cromatográfica é a FE, a qual pode ser sólida ou líquida. A FE sólida é a mais utilizada.
Detectores:- O detector mais utilizado para separações por CLAE é o detector de ultravioleta (Absorção da luz na faixa UV – visível), sendo também empregados detectores de fluorescência, eletroquímico e de massa.
Registro de dados: - Pode ser feito através de um integrador, registrador ou computador
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE) HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATGRAPHY ( HPLC)
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CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE)
Bombeamento ISOCRÁTICO ou por GRADIENTE
- Composição da Fase Móvel Constante: HPLC ISOCRÁTICA
-Alteração da Fase Móvel durante a Análise: HPLC com programação de Gradiente.
- A eluição com gradiente é muitas vezes usada quando os componentes da amostra possuem polaridade muito diferentes.
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Mecanismos das separações em CLAE
As separações em CLAE podem ser: - Adsorção, - Partição - Ambos
- O suporte mais comumente utilizado é a sílica.
O uso de fases estacionárias líquidas adsorvidas a um suporte não tem grande aplicação devido à perda de fase estacionária. O uso de suportes modificados, os quais foram desenvolvidos como conseqüência do problema acima, possibilita a produção de uma imensa variedade de colunas com diferentes propriedades e tipos de seletividade. As fases assim obtidas são chamadas de quimicamente ligadas.
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Separações analíticas são predominantemente realizadas em fase reversa.
As fases quimicamente ligadas, dependendo da modificação feita ao suporte, podem atuar no modo normal, reverso ou ambos.
Cromatografia na fase normal: a fase estacionária é mais polar que a fase móvel.
Cromatografia em fase reversa: a fase móvel é mais polar.
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HPLC Equipamentos empregados para efetuar a cromatografia a líquido (HPLC) são chamados de cromatógrafos a líquido.
Colunas cromatográficas
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A resposta do detector é traduzida em um gráfico, denominado CROMATOGRAMA.
CROMATOGRAMA
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Cromatograma: demonstração gráfica da separação obtida por alguma técnica cromatográfica, que permite utilizar os dados para análise quantitativa e/ou qualitativa.
Cromatograma CLAE - UV
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Cromatograma
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Cromatogramas
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Cromatogramas
Tempo de retenção: Tempo necessário para eluir as substâncias, desde o instante da injeção até o máximo do pico.
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Cromatografia de Líquida Clássica e HPLC
Cromatografia LíquidaCromatografia Líquida
Clássica
Cromatografia Líquida Alta Eficiência
Cromatografia Líquida Clássica
Cromatografia Líquida Alta Eficiência
A FM é arrastada pela coluna por ação da gravidade
A FM é submetida a uma bomba de alta pressão para a sua eluição pela coluna, devido a baixa permeabilidade pela coluna cromatográfica
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Cromatografia de Líquida Clássica e HPLC
Cromatografia Líquida Clássica
Cromatografia Líquida Alta Eficiência
O recheio da coluna é utilizado geralmente uma só vez porque parte da amostra usualmente se adsorve de forma irreversível
Na CLAE emprega-se um coluna fechada, reaproveitável.
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Cromatografia de Líquida Clássica e HPLC
Coluna Clássica CLAE
Barata Alto custo de operação e manutenção
Recheio descartado Coluna cara, mas realiza muitas análises
Precisa-se coletar frações Rapidez e automação (detecção contínua)
Detecção mais demorada (cada fração)
Maior resolução, sensibilidade e repetibilidade
Depende da experiência do analista para ter repetibilidade (técnica manual)
Necessita de experiência do analista