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ANÁLISE FARMACOPÊICA ENSAIOS DE POTÊNCIA – MÉTODOS INSTRUMENTAIS

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Page 1: ANÁLISE FARMACOPÊICA ENSAIOS DE POTÊNCIA – MÉTODOS INSTRUMENTAIS

ANÁLISE FARMACOPÊICA

ENSAIOS DE POTÊNCIA – MÉTODOS INSTRUMENTAIS

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Métodos Quantitativos InstrumentaisMétodos Quantitativos Instrumentais

- São mais sensíveis;- Requerem quantidades menores de amostras;- São mais seletivos que os métodos clássicos (análise volumétrica).

Métodos EspectrométricosMétodos Espectrométricos

- São caracterizados pela interação entre a matéria e a energia eletromagnética.

Energia Radiante: dividida em várias regiões e relaciona-se com os mecanismos de transições atômicas ou moleculares pertinentes a cada região.

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Região do espectro Λ (comprimento de onda)

ModificaçõesInteração energia / matéria

Raios gama 0,0001 – 0,01 nm Reações nucleares

Raios x 0,01 – 2 nm Transições de elétrons de camada K e L

Ultravioleta afastado 2 – 200 nm Transições de elétrons de camada intermediária

Ultravioleta 200 – 400 nm Transições de elétrons valência (externos)Visível 400 – 750 nm

Infravermelho próximo

0,75 – 2,5 µm Vibrações moleculares

Infravermelho 2,5 – 25 µm Rotações moleculares e vibrações fracas

Microondas 1 mm – 30 cm Rotações moleculares

MÉTODOS ESPECTROMÉTRICOS

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ESPECTROSCOPIA DE ABSORÇÃO NO UV-VISÍVELESPECTROSCOPIA DE ABSORÇÃO NO UV-VISÍVEL

-Conceito: técnica analítica quali-quantitativa que tem como fundamento a interação da radiação eletromagnética com diferentes espécies químicas: moléculas, íons, átomos isolados.

- Absorção: processo específico relacionado com a estrutura da espécie absorvente.

- Análise farmacopeica: Ultravioleta: (λ 190 – 380 nm) Visível: (λ 380 – 780 nm)

Page 6: ANÁLISE FARMACOPÊICA ENSAIOS DE POTÊNCIA – MÉTODOS INSTRUMENTAIS

ESPECTROSCOPIA DE ABSORÇÃO NO UV-VISESPECTROSCOPIA DE ABSORÇÃO NO UV-VIS

Objetivo: avaliação da qualidade de medicamentos, alimentos, cosméticos, insumos, análises clínicas e toxicológicas: IDENTIFICAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO.: IDENTIFICAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO.

Características: facilidade de manuseio e operação, boa sensibilidade, boa exatidão, ampla aplicabilidade, porém pouca seletividade.

Page 7: ANÁLISE FARMACOPÊICA ENSAIOS DE POTÊNCIA – MÉTODOS INSTRUMENTAIS

LEI DE LAMBERT-BEERLEI DE LAMBERT-BEER

Correlaciona a intensidade de energia absorvida com a concentração da solução.

Io It

b

c= concentração da espécie química absorvente (solução em análise)b= espessura atravessada pelo feixe luminosoIo = intensidade de luz incidente

It = intensidade de luz transmitidaε = cte característica para cada solução.

Io > It

“A quantidade de luz que é absorvida por uma solução depende da concentração da substância absorvente e da espessura da solução através da qual a luz passa”.

Log I0 = ε . c . It

It

A = ε . c . It

Page 8: ANÁLISE FARMACOPÊICA ENSAIOS DE POTÊNCIA – MÉTODOS INSTRUMENTAIS

Desvios da Lei de Lambert-BeerDesvios da Lei de Lambert-Beer

Presença de mais de uma substância absorvente;

Mudança de natureza do solvente ou soluções muito concentradas;

Incidência de luz com mais de um comprimento de onda em virtude de uma larga faixa de luz.

Ps. Espectrofotômetros de boa qualidade apresentam menor desvio porque fornecem faixas de luz estreitas e um mínimo de luz dispersa.

Page 9: ANÁLISE FARMACOPÊICA ENSAIOS DE POTÊNCIA – MÉTODOS INSTRUMENTAIS

Definições:Definições:

- Deslocamento batocrômico: deslocamento da absorção para comprimento de onda maior devido efeitos de substituição do solvente (deslocamento para o vermelho).

-Deslocamento hipsocrômico: deslocamento da absorção para comprimento de onda menor devido efeitos de substituição do solvente (deslocamento para o azul).

- Efeito hipercrômico: é o aumento da intensidade de absorção.

- Efeito hipocrômico: é uma diminuição da intensidade de absorção.

Page 10: ANÁLISE FARMACOPÊICA ENSAIOS DE POTÊNCIA – MÉTODOS INSTRUMENTAIS

Espectroscopia no UV-VisEspectroscopia no UV-Vis

-Para quantificar substâncias que não absorvem a luz a nenhum comprimento de onda da região do UV ou compostos coloridos, as leituras devem ser efetuadas na região do visível (Vis) - λ 380 – 780 nm.

- Ou realizar reação da substância com reagente específico, de modo a desenvolver cor cuja intensidade é diretamente proporcional à concentração.

Cor Comprimento de onda (nm)

Violeta 390 – 455

Azul 455 – 492

Verde 492 – 577

Amarelo 577 – 597

Laranja 597 – 622

vermelho 622 - 780

Região do visível

Page 11: ANÁLISE FARMACOPÊICA ENSAIOS DE POTÊNCIA – MÉTODOS INSTRUMENTAIS

ESPECTROFOTÔMETROSESPECTROFOTÔMETROS- Instrumento usado para medir absorbância da solução em um ou mais comprimentos de onda.

- Quando se mede a absorção para fins de quantificação, o comprimento de onda escolhido, é aquele em que se observa absorção máxima.

- A curva de absorção espectral é a representação gráfica da absorbância em relação ao comprimento de onda.

Page 12: ANÁLISE FARMACOPÊICA ENSAIOS DE POTÊNCIA – MÉTODOS INSTRUMENTAIS

Fonte luminosa:Fonte luminosa:

-Região do UV: lâmpada de descarga de hidrogênio ou de deutério (190 – 370 nm).-Região do Visível: lâmpada de filamento de tungstênio (350 – 750 nm)

Monocromador:Monocromador: seleciona comprimento de onda da fonte luminosa.

Detector: Detector: desenvolve corrente elétrica.

Amplificador: amplia o sinal.

Galvanômetro: mede a intensidade de luz.

Cubeta: local onde é transferida a amostra ou solução. Pode ser de vidro, quartzo ou sílica transparente, com faces perfeitamente paralelas, espessura de 1cm (padrão).

Page 13: ANÁLISE FARMACOPÊICA ENSAIOS DE POTÊNCIA – MÉTODOS INSTRUMENTAIS

Variações nos cálculos de doseamentoVariações nos cálculos de doseamento

- Absortividade (ε): razão entre absorbância (A) e o produto da concentração (c) em g/L e caminho óptico (b) em cm.

ε = A/bc ou A = ε . b .c

- Absortividade Molar (E) = razão entre absorbância (A) e o produto da concentração (c) em mol/L e caminho óptico (b) em cm.

E = A/bc ou E = ε . PM

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Aplicações da fotometria (Exemplo prático) Dosagem de Proteína

A principal finalidade de uma medida espectrofotométrica, nas regiões do

ultravioleta e visível, é avaliar quantidades.

Assim, é extremamente importante efetuar uma rigorosa calibração visando

obter resultados exatos.

Para obter-se uma curva de calibração alguns aspectos devem ser

considerados como:

1. A escolha de uma solução padrão ( Ex:proteina-Albumina)

2. O estabelecimento de um branco adequado

3. A seleção da área espectral.

Page 15: ANÁLISE FARMACOPÊICA ENSAIOS DE POTÊNCIA – MÉTODOS INSTRUMENTAIS

PrePreparo de uma curva padrão (ou calibração)paro de uma curva padrão (ou calibração)

O preparo da curva de calibração é de grande importância e deve

ser bem entendido. Todo analista deve ser capaz de preparar

suas próprias curvas de calibração e interpretar os resultados

obtidos.

Para se obter o valor da concentração de substâncias cuja

concentração se desconhece, é necessário estabelecer uma

relação entre a absorbância desta solução em diferentes

concentrações com as suas concentrações.

Isto se chama curva de calibração (curva padrão).

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Espectro de absorção do permanganato de potássioA amostra (1) tem 66 mg/L de concentração.

As demais (2),(3),(4) e (5) foram diluídas para (0,8), (0,6), (0,4) e (0,2) da concentração da primeira amostra, respectivamente.

- Preparar a série de padrões de concentração conhecida, cobrindo-se a faixa de leitura.

Curva de CalibraçãoCurva de Calibração

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1. Preparar uma série de padrões exatos, cobrindo a faixa de trabalho usada ou indicada. Usar o padrão recomendado para o método a ser calibrado.

2. Dosar todos os padrões de acordo com a técnica recomendada. Efetuar as leituras colorimétricas, usando o branco apropriado para acertar o zero-A, além do comprimento de onda recomendado pela literatura ou obtido pela curva de absorção espectral previamente realizada.

3. Obter os valores de Absorbância.

4. Plotar os resultados em papel milimetrado, relacionando Absorbância (ordenada) com as concentrações dos padrões (abcissa).

Examinar bem os pontos e decidir se eles serão cobertos por uma linha reta. Se os pontos aparentemente seguirem uma linha reta, traçar uma curva de modo que mais se aproxime de todos os pontos obtidos. A curva não deve ser traçada de ponto a ponto, mas interpolando através dos pontos.

5. Examinar a curva traçada, avaliando se ela tem sensibilidade correta

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Curva padrão de Albumina

Na prática, como será a performance de vocês?

TuboTubo Conc.Conc.

(mg/ml)(mg/ml)

Albumina Albumina 10 mg/ml 10 mg/ml

(ml)(ml)

Água Água

(ml)(ml)

Biureto Biureto (ml)(ml)

AA

11 2,02,0 4,04,0

22 4,04,0 4,04,0

33 6,06,0 4,04,0

44 8,08,0 4,04,0

55 10,010,0 4,04,0

BRBR ---------- ---------- 1,01,0 4,04,0 ----------

Page 20: ANÁLISE FARMACOPÊICA ENSAIOS DE POTÊNCIA – MÉTODOS INSTRUMENTAIS

Preenchendo a tabela para obter a curva...

TuboTubo Conc.Conc.

(mg/ml)(mg/ml)

Albumina Albumina 10 mg/ml 10 mg/ml

(ml)(ml)

Água Água

(ml)(ml)

Biureto Biureto (ml)(ml)

AA

11 2,02,0 4,04,0

22 4,04,0 4,04,0

33 6,06,0 4,04,0

44 8,08,0 4,04,0

55 10,010,0 4,04,0

BRBR ---------- ---------- 1,01,0 4,04,0 ----------

0,2

0,8

0,4

0,6

0,6

0,4

0,8

0,2

1,0

---

Deixar os tubos em repouso por 10 minutos.Ler as absorbâncias de todos os tubos contra o Branco no adequado.Traçar o gráfico e analisar.

Page 21: ANÁLISE FARMACOPÊICA ENSAIOS DE POTÊNCIA – MÉTODOS INSTRUMENTAIS

A curva padrão ideal deve ter ângulo aproximado de 45°

Uma boa curva padrão

Equação da reta: y = bx + a

Page 22: ANÁLISE FARMACOPÊICA ENSAIOS DE POTÊNCIA – MÉTODOS INSTRUMENTAIS

Dosagem de proteínas totais de uma amostraDosagem de proteínas totais de uma amostra

1,0 ml da amostra4,0 ml do reagente de biureto

Esperar 10 minutosLer contra o BrancoAmostra

Conc. ?

Determinar a concentração de proteínas totais na amostra recorrendo à curva padrão

Page 23: ANÁLISE FARMACOPÊICA ENSAIOS DE POTÊNCIA – MÉTODOS INSTRUMENTAIS

Exemplo pela extrapolação gráfica e pelo cálculo da Exemplo pela extrapolação gráfica e pelo cálculo da equação da reta:equação da reta:

Curva de calibração da albuminaEquação da reta:

y = bx + a

Y = 0,0579x + 0,001

0,438 = 0,0579x + 0,001

X = 7,56 mg/mL

Leitura da amostra

[ ] ?

7,56 mg/mL

Page 24: ANÁLISE FARMACOPÊICA ENSAIOS DE POTÊNCIA – MÉTODOS INSTRUMENTAIS

O uso de Fator de Calibração (FC)O uso de Fator de Calibração (FC)

É um artifício usado rotineiramente e seu cálculo é feito como:

concentração padrãoFC = absorbância padrão

Finalmente, para calcular a concentração da amostra:

[amostra] = Absorbância da amostra · FC