C o n t r o le d e Q u a l id a d e e m C it o m e t r ia d e F lu x o
A n a P a u la d e A z a m b u ja
C la s s i f ic a ç ã o d o s P a d r õ e s d e C la s s i f ic a ç ã o d o s P a d r õ e s d e F lu o r e s c ê n c ia F lu o r e s c ê n c ia
• O c i t ô m e t r o d e f lu x o d e v e d i f e r e n c ia r e n t r e o p ic o f r a c o e a a u to f lu o r e s c ê n c ia n o c a n a l d e f lu o r e s c ê n c ia
• O s c o n ju g a d o s d e f lu o r o c r o m o s :
• Devem ser fortes (bright) • Minima sobreposição (spectral overlap ou spilltover)• AcMo adequados
Chave : Separar Sinais Positivos & Negativos
PMT A
Quais fatores determinam a separação?
Intensidade do Fluorocromo
Relacionado ao Fluorocromo
Emissão de Fótons
Erro na dispersão
Autofluorescência Celular
PMT A
Relacionado ao Citômetro
Detector Dinâmico do Intervalo
Ruído Eletrônico
Poder do Laser
Filtros de qualidade pobre ou impróprios
Chave : Separar Sinais Positivos & Negativos
Quais fatores determinam a separação?
Chave: Citometros e Reagentes bem caracterizados
Relacionados ao Fluorocromo Relacionados ao CitômetroIntensidade de Fluorescência Detector Dinâmico de intervaloPE, APC mais brilhantes Qualidade fixada, Característica
Autofluorecência Celular Ruído EletrônicoHigher in UV/Violet Region
Emissão de Fótons Poder do LaserBaixa para Fluorocromos vermelhos, Melhor mais altoDetecção imperfeita para baixo sinal.
Erro na Dispersão Filtros Pobres/ImprópriosCaracterística do painel de anticorpos,sinais de outros canais resulta emdetecção imperfeita de baixos sinais.
Quais fatores determinam a separação?
Chave: Citometros e Reagentes bem caracterizados
Relacionados ao Fluorocromo Relacionados ao CitômetroIntensidade de Fluorescencia Detector Dinâmico de intervaloPE, APC mais brilhantes Qualidade fixada, Característica
Autofluorecência Celular Ruído EletrônicoHigher in UV/Violet Region
Emissão de Fótons Poder do LaserBaixa para Fluorocromos vermelhos, Melhor mais altoDetecção imperfeita para baixo sinal.
Erro na Dispersão Filtros Pobres/Impróprios
Característica do painél de anticorpos,sinais de outros canais resulta emdetecção imperfeita de baixos sinais.
Quais fatores determinam a separação?
De todas essas coisas voce pode…
Medir
Otimizar
e/ou Trabalhar-melhorias!
Conhecer o citometro, reagentes, e estudar!
Beads padronizadas sao usadas para determinadas funçoes.ALINHAMENTOCOMPENSAÇAOCALIBRAÇAO
DETERMINAÇAO DA PERFORMANCE DO INSTRUMENTOLinearidade, detecçao do threshold, variabilidades de análise
QUANTIFICAÇAO DA INTENSIDADE DE FLORESCENCIA
COMPARAÇAO INTRA-INSTRUMENTO E INTERINSTRUMENTOS
C la s s i f ic a ç ã o d o s P a d r õ e s d e C la s s i f ic a ç ã o d o s P a d r õ e s d e F lu o r e s c ê n c ia F lu o r e s c ê n c ia
C la s s i f ic a ç ã o d o s P a d r õ e s d e C la s s i f ic a ç ã o d o s P a d r õ e s d e F lu o r e s c ê n c ia F lu o r e s c ê n c ia
C a l ib r a ç ã o e c o m p e n s a ç ã o d o c i t ô m e t r o d e f lu x o
• O s v a lo r e s d o s d e te c t o r e s d e f lu o r e s c ê n c ia s ã o a ju s t a d o s d e m o d o a r e t i r a r a f lu o r e s c ê n c ia d e fu n d o , a q u a l p o d e r e s u l t a r d e u m a u n iã o n ã o e s p e c í f ic a d e a n t ic o r p o s n o c o n t r o le is o t í p ic o e d a a u to f lu o r e s c ê n c ia d a s c é lu la s .
• A s d e f in iç õ e s d e c o m p e n s a ç ã o s ã o a ju s t a d a s p a r a c o r r ig i r a s o b r e p o s iç ã o e s p e c t r a l e d e p e n d e m d a s v o l t a g e n s d o d e te c t o r e s t a b e le c id a s c o m o c o n t r o le is o t í p ic o .
• A p ó s d e f in i r a s v o l t a g e n s , a c o m p e n s a ç ã o é a ju s t a d a n a s c é lu la s f lu o r e s c e n t e s p o s i t iv a s .
A m o s t r a s e m a n t ic o r p o
• A ju s ta r o T H R E S H O L D p a r a r e m o v e r a m a io r ia d o s d e b r is s e m c o r t a r a p o p u la ç ã o d e in te r e s s e
• A ju s ta r a s v o l t a g e n s d e F L 1 , F L 2 , F L 3 e F L 4 n a ja n e la D E T E C T O R S /A M P S p a r a s i t u a r a p o p u la ç ã o n e g a t iv a n o q u a d r a n te e s q u e r d o in fe r io r ;
A m o s t r a s c o m a n t ic o r p o
• E m c o n d iç õ e s ó t im a s , a f lu o r e s c ê n c ia F L 1 d e v e s e r d e te c t a d a p o r u m d e te c t o r d e F L 1 ; a F L 2 p o r u m d e te c t o r d e F L 2 ; a F L 3 p o r u m d e te c t o r d e F L 3 e a F L 4 p o r u m d e te c t o r d e F L 4 .
• N o e n t a n t o , q u a n d o a lg u m a n t ic o r p o m o n o c lo n a l m a r c a d o fo r n e c e u m a f lu o r e s c ê n c ia m u it o a l t a , e s t a f lu o r e s c ê n c ia p o d e s e r d e te c t a d a p a r c ia lm e n t e (o u to t a lm e n te ) e m u m d e te c t o r q u e n ã o lh e c o r r e s p o n d a
• V a lo r e s f a ls o p o s i t iv o s o u in f r a c o m p e n s a d o s
• V a lo r e s f a ls o -n e g a t iv o s o u h ip e r c o m p e n s a d o s
C o m p e n s a ç ã o d a s C o m p e n s a ç ã o d a s F lu o r e s c ê n c ia sF lu o r e s c ê n c ia s
TUBO FITC PE PerCP PECy5 PerCP Cy5.5
APC
1 - - - - - -2 8 - - - - -3 - 8 - - - -4 - - 3 - - -5 - - - 8 - -6 - - - - 3 -7 - - - - - 8
C a l ib r a ç ã o c o m B E A D SC a l ib r a ç ã o c o m B E A D S
• D is p o n ib i l id a d e d e m ic r o e s fe r a s c o m u m n ú m e r o p r é -d e te rm in a d o d e m o lé c u la s e q u iv a le n t e s d e f lu o r o c r o m o s f lu o r o c r o m o s s o lú v e is (M E S F ) s o lú v e is (M E S F ) in v e s t ig a l in e a r id a d e e d e f in e o m í n im o d e M E S F d e t e c t á v e l p a r a c a d a f lu o r o c r o m o .
• P a r a v a l id a ç ã o d e s e n s ib i l id a d e e l in e a r id a d e v a l id a ç ã o d e s e n s ib i l id a d e e l in e a r id a d e (v e r i f i c a r a r e s p o s ta d o d e te c t o r) u t i l iz a -s e s é r ie d e b e a d s c o m n í v e is d e In t e n s id a d e d e F lu o r e s c ê n c ia p r é d e f in id o s .
• Q u a n d o - s e m p r e q u e u t i l iz a d o s n o v o s in s t r u m e n to s , e p a r a m a n u t e n ç ã o e r e p a r o .
• P a r a a ju s t a r o s g a n h o s d e a m p l i f ic a ç ã o o u a ju s t a r o s g a n h o s d e a m p l i f ic a ç ã o o u fo t o m u l t ip l ic a d o r e sf o t o m u l t ip l ic a d o r e s , u t i l iz a -s e e s p é c ie s n o rm a is o u b e a d s d e r e f e r ê n c ia p r e d e f in id o s
• Q u a n d o - e m c a s o s d e n o v o s in s t r u m e n to s , m a n u te n ç ã o e r e p a r o , in t r o d u ç ã o d e te s t e s o u m u d a n ç a s n o s p r o t o c o lo s .
B e a d s d e c o m p e n s a çB e a d s d e c o m p e n s a ç ã o - ã o - C A L IB R IT EC A L IB R IT E
C o m p e n s a ç ã o M u l t ic o lo r Um fato da vida na citometria de fluxo: sobreposiçao/compensaçao
“Compensação” subtração dessas sobreposições…Melhor determinação usando beads anti-IgK, coloração única
com cada anticorpo, e calcular por software.
(Policro flow é muito complexo para compensar manualmente por pares!)
Rápido e sem “sujeiras” para contruir um painel trabalhoso:
Usar fluorocromos com alta sobreposição para marcadores que não são co-expressos (CD4/CD8).
Evitar fluorocromos que fazer sobreposição… dotsplot ajuda.
Aplic a tion note: S elec ting R eag ents for M ultic olor Flow C ytometry. H o ld e n M a e c k e r a n d J o e T r o t t e r . B D B io s c ie n c e s , S a n J o s e . S e t/2 0 0 9
Compensação é o processo matemático pelo qual nós corrigimos os dados multiparamétricos do citômetro de fluxo para diminuir a sobreposição espectral.
Esta sobreposição, ou (overlap ou “spillover”) resulta do uso de corantes fluorocromos que sao mensuráveis em mais de um detector.
“The process of compensation is a simple application of linear algebra, with the goal to correct for spillovers of all dyes into all detectors, such that on output, the data are effectively normalized so that each parameter contains information from a single dye.”
Roendenter, Cytometry 45:194–205 (2001)
C o m p e n s a ç ã o M u l t ic o lo r
R eg ra bás ic a : C onheç a s eu ins trumento
• R u le 1 : C h o o s e th e b r ig h te s t s e t o f f lu o r o c h r o m e s fo r y o u r p a r t ic u la r in s t r u m e n t c o n f ig u r a t io n .
• A s e le ç ã o d o s r e a g e n t e s c o m e ç a c o m a c o n f ig u r a ç ã o d o c i t ô m e t r o d e f lu x o .
• O t ip o e o n ú m e r o d e la s e r s e d e te c t o r e s d i t a s e o s is t e m a ó p t ic o p o d e e x c i t a r u m f lu o r o c r o m o e d e te c t a r a p r o p r ia d a m e n te u m a c o m b in a ç ã o d e f lu o r o c r o m o s .
• O d e s ig n d o s is t e m a ó p t ic o e o s ‘in s t r u m e n t s e t t in g s ’, in c lu in d o a s v o l t a g e n s d o s P M T , ta m b é m tê m im p a c to n a e f ic iê n c ia d e u m c o r a n t e p a r t ic u la r .
• E s c o lh a d o s f i l t r o s ó p t ic o s
Aplic a tion note: S elec ting R eag ents for M ultic olor Flow C ytometry. H o ld e n M a e c k e r a n d J o e T r o t t e r . B D B io s c ie n c e s , S a n J o s e . S e t/2 0 0 9
Fluoroc hromes : G o for the brig ht...
• R u le 2 : C h o o s e f lu o r o c h r o m e s to m in im iz e th e p o t e n t ia l f o r s p e c t r a l o v e r la p .
• D a d a s a s m u it a s d i f e r e n ç a s n a c o n f ig u r a ç ã o d o s in s t r u m e n to s , é im p o s s í v e l e n c o n t r a r o "m e lh o r " f lu o r o c r o m o p a r a u s a r e m c o m b in a ç õ e s d e 6 , 8 , o u m a is c o r e s .
• N o e n ta n t o , p a r a u m c i t ô m e t r o d e f lu x o p a r t ic u la r é p o s s í v e l c la s s i f ic a r c o r a n te s d is p o n í v e is d e a c o r d o c o m s e u b r i lh o s o b r e e s s e in s t r u m e n to (q u a n d o c o n f ig u r a d o c o m u m d e te rm in a d o c o n ju n to d e la s e r s e f i l t r o s ).
• M a s c o m o e x a t a m e n te p o d e m o s d e f in i r e m e d ir o b r i lh o ?
M a e c k e r H T , F r e y T , N o m u r a L E , T r o t t e r J . S e le c t in g f lu o r o c h r o m e c o n ju g a t e s f o r m a x im u m s e n s i t iv i t y . Cytometry A. 2 0 0 4 ;6 2 :1 6 9 .
S ta in I n d e x (S I) = D /W
• O b je t iv o : N o rm a l iz a r o s in a l p a r a r e t i r a r o b a c k g r o u n d (a u to f lu o r e s c ê n c ia ), c o lo r a ç o e s n ã o e s p e c í f ic a s , “e le t r o n ic n o is e ”, e b a c k g r o u n d ó p t ic o d e o u t r o s f lu o r o c r o m o s (in t e r f e r ê n c ia o u s p i l lo v e r).
M a e c k e r H T , F r e y T , N o m u r a L E , T r o t t e r J . S e le c t in g f lu o r o c h r o m e c o n ju g a t e s f o r m a x im u m s e n s i t iv i t y . Cytometry A. 2 0 0 4 ;6 2 :1 6 9 .
• T e s t e s fe i t o s c o m u m m e s m o A c M o c o n ju g a d o c o m o s d iv e r s o s r e a g e n t e s n u m m e s m o in s t r u m e n to (B D ™ L S R I I)
• R e a g e n t e s s o z in h o s , n ã o p a r t e d e u m ‘c o q u e te l ’
• O b je t iv o e v i t a r ‘S p e c t r a l o v e r la p (o r s p i l lo v e r)’
R u le 3 : R e s e r v e t h e b r ig h t e s t f lu o r o c h r o m e s fo r d im a n t ib o d ie s , a n d v ic e v e r s a .
• Ordenar os Fluoroc romos pos s íveis pelo brilho rela tivo
P E > A P C >P E -C y 7 > P e rC P -C y 5 .5 P E > A P C >P E -C y 7 > P e rC P -C y 5 .5 >A le x a 7 0 0 > P E -T e x a s > P e rC P > >A le x a 7 0 0 > P E -T e x a s > P e rC P >
F IT C > P a c i f ic B lu e > A m C y a n > A P C -F IT C > P a c i f ic B lu e > A m C y a n > A P C -C y 7C y 7
Aplic a tion note: S elec ting R eag ents for M ultic olor Flow C ytometry. H o ld e n M a e c k e r a n d J o e T r o t t e r . B D B io s c ie n c e s , S a n J o s e . S e t/2 0 0 9
B R ILHO = E FIC IÊ N C IA
R o e d e s r , v e r
• R e g r a B á s ic a (R o e d e r e r ): T H E L O W E R T H E A N T IG E N D E N S IT Y , T H E B R IG H T E R T H E F L U O R O C H R O M E T O B E U S E D
Roederer
R u le 4 : A v o id s p i l lo v e r f r o m b r ig h t c e l l p o p u la t io n s in t o d e te c t o r s r e q u i r in g h ig h s e n s i t iv i t y f o r t h o s e p o p u la t io n s .
• P E -C y ™ 5 é m u i t o fo r t e (a l t o S ta in In d e x ), m a s te m c o n s id e r á v e l “s p i l lo v e r “(o u s e ja , a d ic io n a b a c k g r o u n d ) n o d e te c t o r A P C .
• S e e s s e s d o is f lu o r o c r o m o s s ã o u s a d o s ju n to s , a s e n s ib i l id a d e d e r e s o lu ç ã o n o A P C v a i s e r r e d u z id a , s e c o m p a r a d a p o r e x e m p lo , a u m a c o m b in a ç ã o d e P e rC P -C y 5 .5 e A P C .
• E s te é u m c a s o e m q u e p o d e s e r q u e te n h a m o s q u e s a c r i f ic a r u m a c e r t a q u a n t id a d e d e b r i lh o e n u m d e te c t o r p a r a e v i t a r ‘s p i l lo v e r ’ (e p e r d a d a s e n s ib i l id a d e d e r e s o lu ç ã o ) n o o u t r o .
Aplic a tion note: S elec ting R eag ents for M ultic olor Flow C ytometry. H o ld e n M a e c k e r a n d J o e T r o t t e r . B D B io s c ie n c e s , S a n J o s e . S e t/2 0 0 9
P E S IG N A L Q U E N C H E D B Y A P C …
COMPBEADS LOADEDWITH PE
COMPBEADS LOADEDWITH PE AND APC
PE
PE
… W IT H O U T F R E T
F R O M P E T O A P C
COMPBEADS LOADEDWITH PE
COMPBEADS LOADEDWITH PE AND APC
APC
APC
R u le 5 : T a k e s te p s to a v o id ta n d e m d y e d e g r a d a t io n , a n d c o n s id e r i t s im p a c t u p o n r e s u l t s .
• P o te n c ia l p a r a d e g r a d a ç ã o d o s c o r a n t e s ta n d e m
• A P C -C y 7 e P E -C y 7 p o r e x e m p lo , p o d e m d e g r a d a r n a p r e s e n ç a d e lu z , f ix a ç ã o , te m p e r a t u r a s e le v a d a s e e m i t i r s in a l n o d e te c t o r “p a i” (A P C o u P E ). E s te p r o c e s s o c o m e ç a e m u m a s u b p o p u la ç ã o c a u s a n d o fa ls o p o s i t iv o s e m A P C o u P E
• E v i t a r e x p o s iç ã o a lu z o u c a lo r , o u c o m
f lu o r o c r o m o s n ã o ta n d e m (A P C H 7).
Aplic a tion note: S elec ting R eag ents for M ultic olor Flow C ytometry. H o ld e n M a e c k e r a n d J o e T r o t t e r . B D B io s c ie n c e s , S a n J o s e . S e t/2 0 0 9
R e g r a s p a r a e s c o lh a d o s r e a g e n t e s
• R e g r a 1 : E s c o lh a o s f lu o r o c r o m o s c o n fo rm e s e u in s t r u m e n to .
• R e g r a 2 : E s c o lh a o s f lu o r o c r o m o s p a r a m in im iz a r o p o te n c ia l d e s o b r e p o s iç ã o (spectral overlap).
• R e g r a 3 : R e s e r v e o s f lu o r o c r o m o s m a is fo r t e s p a r a o s a n t ic o r p o s m a is f r a c o s , e v ic e v e r s a .
• R e g r a 4 : E v i t a r spillover d e p o p u la ç o e s c e lu la r e s d e u m d e te c to r e m o u t r o (P E c y 5 x A P C )
• R e g r a 5 : E v i t a r d e g r a d a ç ã o d o s a n t ic o r p o s ta n d e m , e c o n s id e r a r n o s r e s u l t a d o s .
R e fe r ê n c ia sR e fe r ê n c ia s
• R o e d e r e r , M . C y t o m e t r y 4 5 :1 9 4 -2 0 5 (2 0 0 1 )
• M a e c k e r H T , F r e y T , N o m u r a L E , T r o t t e r J . S e le c t in g f lu o r o c h r o m e c o n ju g a t e s f o r m a x im u m s e n s i t i v i t y . Cytometry A. 2 0 0 4 ;6 2 :1 6 9 .
• M a n u a l d o F A C S C a l ib u r (B D B io s c ie n c e s , S a n J o s e , C a l i f o r n ia , E U A ).
• B IO , C T . T r e in a m e n t o p a r a Q u a n t i f i c a ç ã o d e L in f ó c i t o s T C D 4 /C D 8 . B D B io s c ie n c e s .
• M a n e jo D e l C i t ó m e t r o d e F lu jo (C T F ) m o d e lo F A C S c a n d e B e c t o n D ic k in s o n . P r o t o c o lo s e n I n m u n o lo g í a C e lu la r , S a la m a n c a , E s p a n h a .
• G u ia d o E q u ip a m e n to e G u ia d e S o f tw a r e (C e l l Q u e s t P r o ) B D F A C S C a l ib u r .
• W o o d B . 9 -C o lo r a n d 1 0 -C o lo r F lo w C y t o m e t r y in th e C l in ic a l L a b o r a t o r y . A r c h P a t h o l L a b M e d 2 0 0 6 ;1 3 0 6 8 0 -6 9 0
• R o e d e r e r M . C o m p e n s a t io n . In : R o b in s o n J P , D a r z y n k ie w ic z Z , D e a n P N , D r e s s le r L G , R a b in o v i t c h P S , S t e w a r t C C , T a n k e H J , W h e e le s s L L , e d i t o r s . C u r r e n t P r o t o c o ls in C y to m e t r y . N e w Y o r k : J o h n W ile y & S o n s , I n c .; 1 9 9 9 .
• S h a p ir o H M , P e r lm u t t e r N G , S te in P G : A F lo w C y t o m e t e r D e s ig n e d fo r F lu o r e s c e n c e C a l ib r a t io n . C y t o m e t r y 3 3 :2 8 0 – 2 8 7 (1 9 9 8 ).
• H o f fm a n R A a n d C h a s e E S , R e s o lu t io n o f D im ly F lu o r e s c e n t P a r t ic le s : A P r a c t ic a l M e a s u r e o f F lu o r e s c e n c e S e n s i t iv i t y . C y to m e t r y 3 3 :2 6 7 – 2 7 9 (1 9 9 8 ).
• B a g w e l l C B a n d A d a m s E G . F lu o r e s c e n c e s p e c t r a l o v e r la p c o m p e n s a t io n f o r a n y n u m b e r o f f lo w c y t o m e t r y p a r a m e te r s . A n n N Y A c a d S c i 1 9 9 3 ;6 7 7 :1 6 7 – 1 8 4 .
• H e r z e n b e r g L A , T u n g J , M o o r e W A , H e r z e n b e r g L A , P a r k s D R . I n t e r p r e t in g