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Últimas notícias do “El Dorado” das
células pluripotentes induzidas (iPS’s)
Biologia do Desenvolvimento – 28 de Junho de 2012
Licenciatura em Biologia Humana
2º Ano (4º Semestre)
Ano Letivo 2011/2012
Elaborado por:
Maria Ferreira nº 27496
Mariana Ascensão nº 27756
Júri:
Prof. Fernando Capela
Prof. Paulo de Oliveira
![Page 2: Biologia do Desenvolvimento – 28 de Junho de 2012 Licenciatura em Biologia Humana 2º Ano (4º Semestre) Ano Letivo 2011/2012 Elaborado por: Maria Ferreira](https://reader037.vdocuments.com.br/reader037/viewer/2022110117/552fc17d497959413d8f1594/html5/thumbnails/2.jpg)
“Stem Cells”
Células indiferenciadas
Diferenciar em
células
especializadas
Autorrenovar
2 Fontes
Embrião
Tecidos adultos
![Page 3: Biologia do Desenvolvimento – 28 de Junho de 2012 Licenciatura em Biologia Humana 2º Ano (4º Semestre) Ano Letivo 2011/2012 Elaborado por: Maria Ferreira](https://reader037.vdocuments.com.br/reader037/viewer/2022110117/552fc17d497959413d8f1594/html5/thumbnails/3.jpg)
De acordo com o tipo de células que
podem gerar dividem-se em:
Totipotentes
Pluripotentes
Multipotentes
Oligopotentes
Unipotentes
“Stem Cells”
Figura
1 –
“Ste
m c
ells
” plu
ripote
nte
s
![Page 4: Biologia do Desenvolvimento – 28 de Junho de 2012 Licenciatura em Biologia Humana 2º Ano (4º Semestre) Ano Letivo 2011/2012 Elaborado por: Maria Ferreira](https://reader037.vdocuments.com.br/reader037/viewer/2022110117/552fc17d497959413d8f1594/html5/thumbnails/4.jpg)
“Stem cells” pluripotentes derivadas
artificialmente de células não-
pluripotentes pela indução de uma
manifestação “forçada” de certos genes
Não são obtidas a partir do embrião,
mas sim de células diferenciadas
Células iPS
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Yamanaka (2006) – 1ª vez que se geraram
iPSCs a partir de fibroblastos de ratinhos
Foram isolados 4 genes essenciais para a
produção de “stem cells”
Yamanaka (2007) – descobriu que:
Nanog um dos principais determinantes da
pluripotência celular
c-Myc é oncogénico
História das células iPS
![Page 6: Biologia do Desenvolvimento – 28 de Junho de 2012 Licenciatura em Biologia Humana 2º Ano (4º Semestre) Ano Letivo 2011/2012 Elaborado por: Maria Ferreira](https://reader037.vdocuments.com.br/reader037/viewer/2022110117/552fc17d497959413d8f1594/html5/thumbnails/6.jpg)
Yamanaka (2007) – transformou fibroblastos
humanos em células iPS’s
Hochedlonger (2008) - utilizou um
adenovírus para transportar os 4TF para o
DNA de célula da pele e fígado de ratinhos
Yamanaka (2008) - concluiu que
se poderiam transferir os 4 genes
necessários com um plasmídeo
História das células iPS
Figura 2 - Yamanaka
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Freed (2009) – demonstrou outra
vantagem do adenovírus
Morrisey (2011) – usou microRNAs,
melhorando a eficiência da
reprogramação
História das células iPS
![Page 8: Biologia do Desenvolvimento – 28 de Junho de 2012 Licenciatura em Biologia Humana 2º Ano (4º Semestre) Ano Letivo 2011/2012 Elaborado por: Maria Ferreira](https://reader037.vdocuments.com.br/reader037/viewer/2022110117/552fc17d497959413d8f1594/html5/thumbnails/8.jpg)
Células para reprogramação:
Eficácia, período de tempo e extensão da
reprogramação varia conforme as células
iniciais
Tecidos da medula óssea são uma fonte de
“stem cells”
Produção de células iPS
Cirurgia invasiva e dolorosa
![Page 9: Biologia do Desenvolvimento – 28 de Junho de 2012 Licenciatura em Biologia Humana 2º Ano (4º Semestre) Ano Letivo 2011/2012 Elaborado por: Maria Ferreira](https://reader037.vdocuments.com.br/reader037/viewer/2022110117/552fc17d497959413d8f1594/html5/thumbnails/9.jpg)
Produção de células iPS
Figura3 – Indução de iPSC’s
![Page 10: Biologia do Desenvolvimento – 28 de Junho de 2012 Licenciatura em Biologia Humana 2º Ano (4º Semestre) Ano Letivo 2011/2012 Elaborado por: Maria Ferreira](https://reader037.vdocuments.com.br/reader037/viewer/2022110117/552fc17d497959413d8f1594/html5/thumbnails/10.jpg)
Produção de células iPS
Geração de iPSCCélulas Adultas
Células adultas podem ser reprogramados para um estado
pluripotente pela expressão “forçada” de alguns fatores
embrionários de transcrição
![Page 11: Biologia do Desenvolvimento – 28 de Junho de 2012 Licenciatura em Biologia Humana 2º Ano (4º Semestre) Ano Letivo 2011/2012 Elaborado por: Maria Ferreira](https://reader037.vdocuments.com.br/reader037/viewer/2022110117/552fc17d497959413d8f1594/html5/thumbnails/11.jpg)
Eficiência da produção extremamente
baixa
Se forem usados vírus poderá haver
alteração genética das células e a
expressão de oncogenes pode ser
acionada
iPSC’s são tipicamente derivadas por
transfecção de certas células
Produção de células iPS
Exemplo: Fibroblastos
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O estado de diferenciação da célula alvo
influencia a sua suscetibilidade para a
reprogramação e para o potencial de
diferenciação das iPSC’s daí derivadas
Stem cells de músculo de rato
reprogramam com maior eficiência que as
suas células filhas mais diferenciadas
(mioblastos e fibroblastos)
Influência do estado de diferenciação das células
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depende
Reguladores transcricionais cruciais
envolvidos no processo de indução, cuja
ausência torna impossível a indução
Oct-3/4
Sox2
Genes de indução
Genes utilizados para a indução
Geração de iPSC’s
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Fatores adicionais para ↑ eficiência da
indução:
Klf4
c-Myc
Nanog
LIN28
Genes de indução
oncogénico
Células Adultas
Transferência dos 4TF,
exceto c-Myc
Processo: + lento - eficaz Não se desenvolve cancro
Células iPS
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Oct-3/4
Papel crucial na manutenção da pluripotência
Ausência → conduz à diferenciação
Sox2
Semelhante ao Oct-3/4 → mantém pluripotência
Expresso em “stem cells” pluripotentes e
unipotentes
Klf4
fator capaz de gerar células iPS
Genes de indução
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c-Myc
Mostrou-se desnecessários para a geração de iPSC’s humanas
Oncogene → por isso o seu uso é preocupante
Nanog
Necessário para promover pluripotência
Poder de renovar “stem cells”
Ausência → rápida diferenciação
Desnecessário para a indução
LIN28
Fator de geração de iPSC’s
Desnecessário
Genes de indução
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Proteína supressora de tumores
Principal inibidora da geração de células iPS
Liga-se diretamente ao promotor do Nanog
para suprimir o seu nível de expressão
p53
Inicia-se a diferenciação de “stem cells” em células
adultas Deleção do gene p53 ↑ eficiência de
geração de iPSCs em 1000x
![Page 18: Biologia do Desenvolvimento – 28 de Junho de 2012 Licenciatura em Biologia Humana 2º Ano (4º Semestre) Ano Letivo 2011/2012 Elaborado por: Maria Ferreira](https://reader037.vdocuments.com.br/reader037/viewer/2022110117/552fc17d497959413d8f1594/html5/thumbnails/18.jpg)
Proteínas envolvida na geração de células
iPS humanas
Possui 2 promotores alternativos:
TAp73 funções semelhantes à p53
DNp73 inibe o p53 e o p73 ↑a expressão
Nanog
p73
pode ↑ eficiência da geração de iPSC’s humanas
células geradas com a sua expressão são +
resistentes à diferenciação (in vitro e in vivo)
![Page 19: Biologia do Desenvolvimento – 28 de Junho de 2012 Licenciatura em Biologia Humana 2º Ano (4º Semestre) Ano Letivo 2011/2012 Elaborado por: Maria Ferreira](https://reader037.vdocuments.com.br/reader037/viewer/2022110117/552fc17d497959413d8f1594/html5/thumbnails/19.jpg)
Os 2 promotores da p73 têm papéis
opostos
Lin et al descobriu que a adição do
gene humano de DNp73 ↑ a geração de
iPSC’s
DNp73
Condições basais:
• Oct-3/4
• Sox 2
• Klf4
• c-MycCondições
basais +
DNp73
Gráfico 1 – Colónias de iPSC humanas
![Page 20: Biologia do Desenvolvimento – 28 de Junho de 2012 Licenciatura em Biologia Humana 2º Ano (4º Semestre) Ano Letivo 2011/2012 Elaborado por: Maria Ferreira](https://reader037.vdocuments.com.br/reader037/viewer/2022110117/552fc17d497959413d8f1594/html5/thumbnails/20.jpg)
Contribui diretamente para a expressão
do Nanog e do Oct-3/4
DNp73
Manutenção da pluripotência
Gráfico 2 – Expressão de fatores de transcrição
![Page 21: Biologia do Desenvolvimento – 28 de Junho de 2012 Licenciatura em Biologia Humana 2º Ano (4º Semestre) Ano Letivo 2011/2012 Elaborado por: Maria Ferreira](https://reader037.vdocuments.com.br/reader037/viewer/2022110117/552fc17d497959413d8f1594/html5/thumbnails/21.jpg)
Até 2009, todos os métodos
desenvolvidos envolviam a utilização de
materiais genéticos
Proteínas recombinantes
Possibilidade de ocorrerem
modificações genéticas
Tumores
Hongyan et al
Utilizaram proteínas recombinantes capazes de
reprogramação celular piPSC’s
![Page 22: Biologia do Desenvolvimento – 28 de Junho de 2012 Licenciatura em Biologia Humana 2º Ano (4º Semestre) Ano Letivo 2011/2012 Elaborado por: Maria Ferreira](https://reader037.vdocuments.com.br/reader037/viewer/2022110117/552fc17d497959413d8f1594/html5/thumbnails/22.jpg)
Hongyan et al
Proteínas recombinantes
piPSC’s
Autorrenovam-se
Pluripotentes in vitro e in vivo
Evitam introdução de modificações
genéticas
![Page 23: Biologia do Desenvolvimento – 28 de Junho de 2012 Licenciatura em Biologia Humana 2º Ano (4º Semestre) Ano Letivo 2011/2012 Elaborado por: Maria Ferreira](https://reader037.vdocuments.com.br/reader037/viewer/2022110117/552fc17d497959413d8f1594/html5/thumbnails/23.jpg)
piPSC’s
Foram criadas em ratinhos
Indistinguíveis das “stem cells”
embrionárias
Exigem métodos de aperfeiçoamento
Representa um avanço em relação aos
outros métodos Vantagens
Proteínas recombinantes
![Page 24: Biologia do Desenvolvimento – 28 de Junho de 2012 Licenciatura em Biologia Humana 2º Ano (4º Semestre) Ano Letivo 2011/2012 Elaborado por: Maria Ferreira](https://reader037.vdocuments.com.br/reader037/viewer/2022110117/552fc17d497959413d8f1594/html5/thumbnails/24.jpg)
Vantagens:
Elimina o risco de modificar o genoma da célula-
alvo Oferece um método para gerar iPSC’s +
seguras
Confere uma abordagem + simples e + rápida
Poderia potencialmente permitir a aplicação de
uma metodologia de reprogramação mais ampla e
mais económica produção de proteína
recombinantes em larga escala
Proteínas recombinantes
![Page 25: Biologia do Desenvolvimento – 28 de Junho de 2012 Licenciatura em Biologia Humana 2º Ano (4º Semestre) Ano Letivo 2011/2012 Elaborado por: Maria Ferreira](https://reader037.vdocuments.com.br/reader037/viewer/2022110117/552fc17d497959413d8f1594/html5/thumbnails/25.jpg)
Obstáculos
Reduzido número de células
Falta de metodologias simples
Custos
Rendimento
Inserção genómica
Rejeição Imunológica
Teratomas
![Page 26: Biologia do Desenvolvimento – 28 de Junho de 2012 Licenciatura em Biologia Humana 2º Ano (4º Semestre) Ano Letivo 2011/2012 Elaborado por: Maria Ferreira](https://reader037.vdocuments.com.br/reader037/viewer/2022110117/552fc17d497959413d8f1594/html5/thumbnails/26.jpg)
Vetores Alternativos
Plasmídeos – evita vírus, necessita de
oncogenes e é menos eficiente
Adenovírus – não incorpora os seus
genes no hospedeiro alvo e necessita de
pouco tempo de apresentação
Proteínas recombinantes
![Page 27: Biologia do Desenvolvimento – 28 de Junho de 2012 Licenciatura em Biologia Humana 2º Ano (4º Semestre) Ano Letivo 2011/2012 Elaborado por: Maria Ferreira](https://reader037.vdocuments.com.br/reader037/viewer/2022110117/552fc17d497959413d8f1594/html5/thumbnails/27.jpg)
Semelhanças entre iPSC’s e ‘stem cells’
Propriedades celulares biológicas:
Morfologia – forma redonda, nucleótidos grandes e citoplasma escasso
Propriedades de crescimento – tempo de duplicação e atividade mitótica
Marcadores de stem cells - iPS humanas expressam os marcadores
específicos para hESC, incluindo SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, TRA-
2-49/6E e Nanog
Genes de ‘stem cells’ – Oct-3/4, Sox2, Nanog, GDF3, REX1, FGF4, ESG1,
DPPA2, DPPA4 e hTERT
Atividade da telomerase – hESCs expressam alta atividade de telomerases
para sustentar a autorrenovação e proliferação e assim como as iPS
![Page 28: Biologia do Desenvolvimento – 28 de Junho de 2012 Licenciatura em Biologia Humana 2º Ano (4º Semestre) Ano Letivo 2011/2012 Elaborado por: Maria Ferreira](https://reader037.vdocuments.com.br/reader037/viewer/2022110117/552fc17d497959413d8f1594/html5/thumbnails/28.jpg)
Plutipotência:
Diferenciação neural – iPS diferenciadas em
neurónios, expressando βIII-tubulina, tirosina
hidroxilase, AADC, DAT, Chat, LMX1B e MAP2
Diferenciação cardíaca – iPSC diferenciadas em
cardiomiócitos
Formação de teratomas
Quimeras de ratinhos
Complementação tetraploide
Semelhanças entre iPSC’s e ‘stem cells’
![Page 29: Biologia do Desenvolvimento – 28 de Junho de 2012 Licenciatura em Biologia Humana 2º Ano (4º Semestre) Ano Letivo 2011/2012 Elaborado por: Maria Ferreira](https://reader037.vdocuments.com.br/reader037/viewer/2022110117/552fc17d497959413d8f1594/html5/thumbnails/29.jpg)
Vantagens e desafios das iPSC’s
Grande plasticidade celular
Não geram riscos de rejeição imune
Possibilidade de modelos de doenças in vivo
Possibilidade de reparação de doenças por
mutações
A eficácia de indução de iPSC’s é muito baixa
dando origem a células insuficientemente
reprogramadas
![Page 30: Biologia do Desenvolvimento – 28 de Junho de 2012 Licenciatura em Biologia Humana 2º Ano (4º Semestre) Ano Letivo 2011/2012 Elaborado por: Maria Ferreira](https://reader037.vdocuments.com.br/reader037/viewer/2022110117/552fc17d497959413d8f1594/html5/thumbnails/30.jpg)
Medicina personalizada
A tecnologia das iPS tem potencial para avançar com a terapia médica personalizada, a medicina regenerativa e criar novos modelos de doenças humanas para pesquisa e testes terapêuticos
Uso de iPSC’s para a terapia de doenças incuráveis: produção de células adultas específicas para cada paciente e doença específica
![Page 31: Biologia do Desenvolvimento – 28 de Junho de 2012 Licenciatura em Biologia Humana 2º Ano (4º Semestre) Ano Letivo 2011/2012 Elaborado por: Maria Ferreira](https://reader037.vdocuments.com.br/reader037/viewer/2022110117/552fc17d497959413d8f1594/html5/thumbnails/31.jpg)
Medicina personalizada
O transplante de órgãos exige disponibilidade de tecidos e tratamento com imunossupressores
As iPSCs humanas poderiam ser induzidas nos tipos de células desejados e seriam geneticamente compatíveis com o paciente
Surgiram discussões sobre o fornecimento de terapias celulares em humanos, nomeadamente para pacientes com doenças debilitantes e distúrbios neurológicos – Questão ética
![Page 32: Biologia do Desenvolvimento – 28 de Junho de 2012 Licenciatura em Biologia Humana 2º Ano (4º Semestre) Ano Letivo 2011/2012 Elaborado por: Maria Ferreira](https://reader037.vdocuments.com.br/reader037/viewer/2022110117/552fc17d497959413d8f1594/html5/thumbnails/32.jpg)
Um futuro aberto
É necessário superar a barreira que está
entre a eficiência e a integração genómica.
Caracterização proteómica de iPSC’s.
Uso de iPSC’s para identificar fármacos
terapêuticos capazes de resgatar um
fenótipo.
Por exemplo, linhas de células iPS derivadas de pacientes afetados pela síndrome de displasia ectodérmica (CEE), onde o gene p63 está mutado, exibem um compromisso epitelial anormal que poderia ser parcialmente resgatado.
![Page 33: Biologia do Desenvolvimento – 28 de Junho de 2012 Licenciatura em Biologia Humana 2º Ano (4º Semestre) Ano Letivo 2011/2012 Elaborado por: Maria Ferreira](https://reader037.vdocuments.com.br/reader037/viewer/2022110117/552fc17d497959413d8f1594/html5/thumbnails/33.jpg)
Potenciais aplicações das iPSC’s
Modelação de doenças
Descoberta de fármacos
Terapia genética
Terapia de substituição/reprogramação
Terapia para o Parkinson
Terapia para reparação cardíaca
Terapia para reparação hepática
![Page 34: Biologia do Desenvolvimento – 28 de Junho de 2012 Licenciatura em Biologia Humana 2º Ano (4º Semestre) Ano Letivo 2011/2012 Elaborado por: Maria Ferreira](https://reader037.vdocuments.com.br/reader037/viewer/2022110117/552fc17d497959413d8f1594/html5/thumbnails/34.jpg)
Estas técnicas de geração de células iPS
são revolucionárias pois, anteriormente
só se podiam obter células pluripotentes
a partir do embrião e agora, é possível
obtê-las a partir de células adultas.
A eficiência das iPSC é muito baixa
células insuficientemente rerogramadas
Conclusões
![Page 35: Biologia do Desenvolvimento – 28 de Junho de 2012 Licenciatura em Biologia Humana 2º Ano (4º Semestre) Ano Letivo 2011/2012 Elaborado por: Maria Ferreira](https://reader037.vdocuments.com.br/reader037/viewer/2022110117/552fc17d497959413d8f1594/html5/thumbnails/35.jpg)
A utilização de vírus pode levar a
alterações genómicas
Reguladores transcricionais cruciais
envolvidos no processo de indução, cuja
ausência torna impossível a indução
Importante descoberta para a terapêutica.
Conclusões
![Page 36: Biologia do Desenvolvimento – 28 de Junho de 2012 Licenciatura em Biologia Humana 2º Ano (4º Semestre) Ano Letivo 2011/2012 Elaborado por: Maria Ferreira](https://reader037.vdocuments.com.br/reader037/viewer/2022110117/552fc17d497959413d8f1594/html5/thumbnails/36.jpg)
FIM
![Page 37: Biologia do Desenvolvimento – 28 de Junho de 2012 Licenciatura em Biologia Humana 2º Ano (4º Semestre) Ano Letivo 2011/2012 Elaborado por: Maria Ferreira](https://reader037.vdocuments.com.br/reader037/viewer/2022110117/552fc17d497959413d8f1594/html5/thumbnails/37.jpg)
Lin et al. DNp73 improves generation
efficiency of human induced pluripotent stem
cells. BMC Cell Biology. 2012; 13:9
TAN, Kah Yong et al. Efficient Generation of iPS
Cells from Skeletal Muscle Stem Cells. PLoS
ONE. Outubro 2011; vol. 6
ZHOU, Hongyan et al. Generation of Induced
Pluripotent Stem Cells Using Recombinant
Proteins. Cell Press. Maio 2009
Biografia
![Page 38: Biologia do Desenvolvimento – 28 de Junho de 2012 Licenciatura em Biologia Humana 2º Ano (4º Semestre) Ano Letivo 2011/2012 Elaborado por: Maria Ferreira](https://reader037.vdocuments.com.br/reader037/viewer/2022110117/552fc17d497959413d8f1594/html5/thumbnails/38.jpg)
Fonte das imagens
Figura 1 - “Stem cells” pluripotenes em http://dererummundi.blogspot.pt/2008/03/clulas-estaminais-e-expresso-gnica.html
Figura 2 – Yamanaka em http://www.gladstone.ucsf.edu/gladstone/site/publicaffairs/content/1/648
Figura 3 – Indução de iPSC’s em http://en.wikipedia.org/wiki/File:Induction_of_iPS_cells.svg
Gráfico 1- Colónias de iPSCs humanas em Lin et al. DNp73 improves generation efficiency of human induced pluripotent stem cells. BMC Cell Biology. 2012; 13:9
Gráfico 2 - Expressão de fatores de transcrição em Lin et al. DNp73 improves generation efficiency of human induced pluripotent stem cells. BMC Cell Biology. 2012; 13:9