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Aminoácidos, peptídeos e proteínas
Características químicas dos aminoácidos
Os aminoácidos
• Os aminoácidos presentes nas proteínas são isômeros L– A biologia é canhota
• Glicina nãotem isomeriaóptica
Carbono alfa
Grupo R apolar e alifáticos
• Aminoácidos apolares e hidrofóbicos• Ligações de Van der Waals• Ala, Val, Leu, Iso– Interações hidrofóbicas
• Gly; menor aminoácido• Met– Possui átomo de enxofre
• Pro– Iminoácido, menor flexibilidade estrutural
Grupo R aromáticos
• Aminoácidos hidrofóbicos• Tirosina pode formar pontes de hidrogênio
com a água• Modificações pós-
traducionais– Fosforilação do OH
da tirosina• Fenilalanina– Mais apolar
Grupos R polares, não carregados
• Solubilidade intermediária em água• Serina e treonina– Grupos hidroxil
• Asparagina e glutamina– Grupo amida
• Cisteína– Grupo sulfidril– Ligações dissulfeto
Grupos R carregados• Aminoácidos básicos– Carga positiva– Lisina, segundo grupo amino– Arginina, grupo guanidina– Histidina, grupo aromático
imidazol
• Aminoácidos ácidos– Carga negativa– Possuem segundo grupo
ácido carboxílico
Aminoácidos incomuns
• Modificações pós-traducionais– 4-hidroxiprolina– 5-hidroxilisina– 6-N-metil-lisina– Gama-carboxiglutamato– Fosforilação de resíduos
• Selenocisteína– Selênio ao invés de enxofre na Cys– É adicionado durante a tradução por
mecanismo específico e regulado
pH e pKa
• Constantes de dissociação dependem do pH do meio e são diferentes para diferentes moléculas
• Ionização
• < pH; > [H]+
estado não-ionizado
Aminoácidos são ionizáveis
• Substâncias anfóteras: possuem natureza dual
• Podem funcionar assim como ácidos ou bases– Doam ou recebem
prótons
Titulação de um aminoácido
• Conclusão: a função das proteínas depende do pH ao qual estão submetidas
Curvas de titulação predizem a carga elétrica dos aminoácidos
• Alguns aminoácidos podem ter átomos ionizáveis também em sua cadeia lateral
Peptídeos e proteínas
Ligações peptídicas e o ângulo omega
Trans: ω = 180º
• Ligações peptídicas tem geometria rígida e planar
Ângulos torsionais, phi e psi
• Responsáveis pela curvatura na estrutura da proteína
• Entre o C-αe o N (do NH2)e o C (do COOH)
Omega, phi e psi
Polipeptídeo
>Insulina [Homo sapiens] MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN
Peptídeos são ionizáveis
• Ou seja, possuem curva de titulação característica
• Funcionam em faixas de pH ótimas
Número de resíduos por proteína
Uso de aminoácidos
• Varia bastante entre as proteínas
• Não permite predizer com precisão o comportamento molecular da molécula
Proteínas com outros grupos químicos
• Adicionados pós-traducionalmente
Trabalhando com proteínas
Proteínas podem ser separadas e purificadas
• Sabendo que a célula possui milhares de proteínas, como purificar uma única delas?– Basta selecionar por propriedade
• Tamanho, carga e propriedades de ligação
• Obter o extrato bruto– “correr” em cromatografia de coluna
• Fase estável (matriz)• Fase móvel (solução com tampão)
– Coluna maior permite maior resolução na separação
Cromatografia por troca iônica
• Polímero carregado negativamente– Proteínas positivas ligam ao
polímero e demoram mais a ser eluídas da coluna
• Afinidade da proteína é definido também pelo pH
Cromatografia por exclusão de tamanho
• Grânulos porosos na matriz seguram as moléculas menores
• Moléculas grandes não entram nos poros e são eluídas primeiro
Cromatografia de afinidade• Adiciona-se à matriz da
coluna algum tipo de molécula ligante da molécula de interesse
• Molécula ligadora de ATP; adiciona-se ATP à matriz
• Elui-se com solução de ATP
Eletroforese -- Histórico• 1952, Markham and Smith
– Ao estudarem hidrólise de RNA percebem que moléculas de diferentes estruturas têm sua mobilidade diferenciada quando aplicadas num papel e submetidas a um campo elétrico
• 1955, Smithies– Géis de amido funcionam bem para separar
proteínas do soro humano
• 1967, Loening – Géis de acrilamida com maior resolução e permitem
separar ainda moléculas grandes de DNA
• 1980, Schwartz and Cantor – Eletroforese em campo pulsado separa fragmentos
enormes• É hoje impossível imaginar um laboratório de
biomol sem eletroforese acontecendo a todo instante...
Eletroforese• Movimento de partículas dispersas
num fluído sob influência de um campo elétrico uniforme
• DNA, carga negativa– Tem tendência a se dirigir ao polo
positivo quando sujeito a um campo elétrico
• Serve para separar moléculas por tamanho/carga elétrica – Proteína deve ser desnaturada com
detergente (SDS)
• Técnica utilizada à exaustão em trabalhos de biologia molecular
Eletroforese, etapas
1.Preparação do gel
2.Aplicação das amostras
3.Eletroforese
4.Coloração
5. Análise dos resultados
Preparação do gel
Horizontal X Vertical
Agarose X Poliacrilamida
Aplicação das amostras
Definição do mapa das amostras por canaleta
Corrida do gel• Aplicação do campo elétrico
• Fonte elétrica gera fluxo de íons através da solução tampão
• Terminais positivo e negativo
• Tempo adequado, senão o DNA sai do gel
Coloração das moléculas
• Prata– Gel SDS-PAGE
• PoliAcrilamide Gel Electrophoresis
– Melhor resolução
• Coomassie blue, etc• Brometo de etídio– Agente intercalante do DNA
• Cancerígeno!
– Composto fluorescente à luz UV– Gel de agarose
Eletroforese de um resultado de cromatografia
O marcador de peso molecular• Comprado de uma empresa
– Possui proteínas de peso molecular bem conhecido
• Permite saber o peso molecular da(s) proteína(s) presente(s) numa amostra
Geis bidimensionais
• Corre-se o gel normalmente em uma dimensão... E depois corre-se em outra dimensão
• Cada ponto representa aproximadamente uma proteína original presente na amostra– Maiores géis dão maiores
resolução
Proteínas não separadas podem ser quantificadas
• Deve-se saber qual o substrato que a enzima usa
• Deve-se poder medir o produto da ação enzimática
• Uma unidade de enzima digere 1μmol de substrato por minuto a 25ºC
Estrutura primária das proteínas
Níveis estruturais das proteínas
Estruturas secundárias• Descreve o arranjo espacial dos
átomos na cadeia principal
• Ocorre quando os ângulos diedros (phi e psi) permanecem quase iguais durante todo um segmento da proteína
• Tipos– Hélices α– Conformações β– Voltas β– Indefinida (loops, coils, turns)
Alfa-hélices• O arranjo mais simples que as proteínas podem assumir é um
arranjo helicoidal
• Esqueleto polipeptídico fica enrolado em torno de um eixo imaginário– Cada volta contém 3,6 resíduos – Φ = -57º; ψ = -47º
• Grupos R se voltam para fora do eixo
• Em média, 25% dos aminoácidos de qualquer proteína estão em hélices α
All-alpha proteins
Estabilidade da alfa hélice• A hélice é comum porque
nesse modelo as posições das ligações de hidrogênio estão otimizadas– Entre um H ligado ao NH2 e um
O do COOH– Cada ligação peptídica participa
de ligação de hidrogênio, conferindo estabilidade
• Para isso, todos os aminoácidos precisam ter o mesmo tipo de isomeria óptica (L ou D)
Tendência dos Aminoácidos em formar hélices
• O grupo lateral interfere na capacidade do aminoácido em formar hélices– Volume e forma de Asp, Ser, Thr e Cys
desestabilizam se estiverem muito próximos
– Pro e Gly dificultam a formação de hélices
• Relações com o vizinho também são importantes
• Componentes amino a carbonil formam dipolo elétrico
Restrições para a formação de hélice-α
1. Tendência do resíduo em formar hélice
2. Interações entre os grupos R espaçados 3-4 aa
3. Volumes dos grupos R adjacentes
4. Ocorrência de Pro e Gly5. Interações entre resíduos
das extremidades com o dipolo
1951
Conformação β (beta)• Esqueleto estendido em
forma de zigue-zague
• Folhas β paralelas e anti-paralelas– Paralela: Φ = -119º; ψ = 113º– Anti-par: Φ = -139º; ψ = 135º
• Quanto as folhas são próximas, os grupos R devem ser pequenos– Teias e queratinas... Gly e Ala
Estruturas em folhas Beta
• Beta-propeller Beta-barril
Dicroismo circular (CD)
• Uma assimetria estrutural em uma molécula leva a diferenças de absorção de luz polarizada
• A medida dessa diferença permite-nos ter uma idéia da estrutura secundária de uma proteína.
Dicroismo circular
O CD pode ser empregado na obtenção de detalhes estruturais de diferentes tipos de compostos:▪Proteínas;▪Carboidratos;▪Ácidos nucléicos;▪Fármacos;É considerado o método de escolha para determinação rápida do conteúdo de estrutura 2ª de peptídeos e proteínas;O CD é um método altamente sensível, capaz de distinguir conformações de α-hélice, folhas-β e alças.
Estruturas terciárias e quaternárias de proteínas
Estrutura terciária (3D)• Arranjo tridimensional total de
todos os átomos de uma proteína• Alcance mais longo e dimensão
total, quando comparado com 2D• Segmentos distantes na estrutura
1D podem ser atraídos por interações fracas
• Algumas proteínas são formadas por mais de um complexo polipeptídico (quaternária)
• Proteínas fibrosas e globulares
Proteínas fibrosas
• Queratina, colágeno, fibroína– Proteínas estruturais: força e
elasticidade
• Insolúveis em água: aa’s hidrofóbicos (Ala, Val, Leu, Ile, Met e Phe)
• Alfa queratina: cabelo, pelo, unhas, garras, penas, chifres, cascos e parte externa da pele
• Pontes dissulfeto estabilizam e dão mais resistências às cadeias
Colágeno• Tecidos conectivos:
tendões, cartilagens– Garante resistência
• Hélice específica (phi = -51º; psi = 153º)
• Existem mais de 30 variantes do colágeno dependendo do tecido e da função
Fibroínas de seda
• Folhas beta• Rica em Ala e Gly
– Alto empacotamento
• Ligações de H entre as cadeias B
• Não é elástica, mas é flexível
• A fibroína, produzida por aranhas e insetos, é uma proteína fibrosa constituída por cadeias β estendidas, e rica em Alanina e Glicina (estudos da sequência indicam a presença da unida de (-Gly-Ser-Gly-Ala-Gly-Ala-)n)• As folhaβ ficam sobrepostas em camadas com um empacotamento de Alaninas numa face e Glicinas na outra• A as propriedades mecânicas da seda podem ser explicadas se considerarmos a sua estrutura:pequena extensibilidade: porque a cadeia β já é uma estruturaquase totalmente estendidaflexibilidade: porque as forças entre camadas sucessivas são de natureza não-covalente (relativamente fracas)
Proteínas globulares
• Diversidade estrutural reflete diversidade funcional– Dobramento gera estrutura compacta
• Teem partes em hélices-a e partes em folhas-B• Motivos estruturais
– Padrão identificável– Envolve elementos 2D
e conexões entre eles
Classificação estrutural das proteínas
Classificação estrutural das proteínas
SCOP – Famílias de proteínas
Estrutura quaternária
• Dímeros, homodímeros, heterodímeros
• Trímero, tetrâmero• Oligômero, multímero
Desnaturação de proteínas
• Condições diferentes das celulares levam as proteínas à desnaturação
• Perda da estrutura leva também à perda da função
• Calor, pHs extremos, temperatura (?), solventes orgânicos, detergentes
Renaturação de proteínas• A sequência terciária é
determinada pela sequência primária, certo?
• As proteínas desnaturadas, portanto, podem voltar aos estados nativos através de renaturação, quando o estímulo é retirado
Enovelamento protéico
• Lento e gradual• Diminuição da entropia
até alcançar um estadoestável
• Algumas proteínas se dobramde forma assistida pelasproteínas chaperonas
As estruturas primárias das proteínas são conhecidas
• Para todos os genomas sequenciados, conhece-se a estrutura primária de todas as proteínas para este organismo
• As pontes dissulfeto podem se formar entre diferentes cadeias protéicas– E principalmente dentro da
mesma
Sequenciamento de peptídeos• Degradação de Edman– Marca e remove apenas o
resíduo N-terminal
• Método ineficiente, permite sequenciamento de pequenas porções das moléculas
• Sequenciamento do RNAm é muito mais simples e preciso; permite sequenciar proteínas enormes – como a titina
Produção de peptídeos
• Purificação a partir de tecidos
• Engenharia genética
• Síntese química direta
Alinhamento de sequências• Os organismos possuem,
em grande medida, as mesmas proteínas (ortólogas)– Derivam do ancestral
comum entre os organismos
• O alinhamento permite que identifiquemos as porções mais importantes (conservadas) da proteína
Evolução molecular
• Quanto mais similares as sequências das proteínas dos organismos, mais próximos eles são evolutivamente
Árvore molecular da vida
Conclusões• Diferentes características químicas das cadeias laterais dos
aminoácidos definem características de peptídeos e proteínas• Os resíduos de aminoácidos são ligados às centenas
ou milhares para formar peptídeos e proteínas• As proteínas podem ser modificadas pós-traducionalmente• As proteínas podem ser separadas por carga, tamanho e
afinidade e assim estudadas isoladamente – cromatografia e eletroforese
• As proteínas podem ser sequenciadas e sua estrutura primária (seq. de aminoácidos é conhecida)
• As sequências das proteínas são excelentes marcadores da evolução da vida na terra