PRINCIPAIS PARÂMETROS OPERACIONAIS
PARÂMETROS OPERACIONAIS
Agitação/
Aeração
Concentração
do inóculo
pH
Temperatura
Composição
do meio
NUTRIENTES
Classificação quanto a concentração mínima
Requerida para o crescimento ótimo
Macronutrientes
C, N, O, H, S, P,
Mg2+ e K+
Micronutrientes
Mo2+, Zn2+, Cu2+, Mn2+,
Fe2+, Ca2+, Na2+, vitaminas
e hormônios de
crescimento
Custos relevantes
C e N; O
NUTRIENTES Os oito elementos macronutrientes e funções fisiológicas
Elemento Funções fisiológicas e fração da massa seca de
Escherichia coli
Concentração
requerida (M)
Carbono Constituinte de material orgânico celular.
Freqüentemente fonte de energia – 50%
10-2
Nitrogênio Constituinte de proteínas, ácidos nucléicos e
coenzimas – 14%
10-3
Hidrogênio Material orgânico celular e água – 8% -
Oxigênio Material orgânico celular e água. Requerida para
respiração aeróbia – 20%
-
Enxofre Principal íon inorgânico na célula e cofator – 1% 10-4
Fósforo Constituinte de ácidos nucléicos, fosfolipídeos,
nucleotídeos e certas enzimas – 3%
10-4 – 10-3
Potássio Principal cátion inorgânico na célula e cofator para
algumas enzimas – 1%
10-4 – 10-3
Magnésio Cofator para diversas enzimas presente em
paredes celulares e membranas – 0,5%
10-4 – 10-3
MEIOS DE CULTURA
Composição dos Meios de Cultura
Meios sintéticos Meios Complexos
Composição química é
qualitativa
e quantitativamente
conhecida
Meios contendo um ou mais
produtos cuja composição
química não é
perfeitamente definida
PROCESSO FERMENTATIVO GENÉRICO
Preparo
do
Inóculo
Ar/Esterilização
Fermentação
Preparo do meio
de cultura/
Esterilização
Controle
Resíduos Sub-produtos Produtos
Processos de
Separação,
Purificação e
Tratamento
Fase de
Laboratório
Fase
Industrial
PREPARO DO INÓCULO
Inóculo: suspensão celular com concentração adequada para garantir a fermentação de um dado volume de mosto, em condições econômicas Volume do inóculo: 0,5 a 50% da capacidade útil do fermentador
Incubação
Incubação
Incubação
Cultura
pura
Volume de
meio = V1
Volume de
meio = V2> V1
Volume de
meio = V3> V2
Fase de
Laboratório
Fase
Industrial
Dornas
Volume de
meio = V4> V3
Volume de
meio = V5> V4
Representação Esquemática: Preparo do Inóculo
Curva Típica de Crescimento Celular em Batelada
A B C D E
m= m MAX m< m
MAX
m=0 m< m
MAX
m=0 m< m MAX
Tempo de Cultivo
Log
(nú
mer
o c
élu
las
viá
veis
/ m
l) F
A: fase de latência ou lag B: fase de aceleração C: fase log ou exponencial D: fase de desaceleração E: fase estacionária F: fase de declínio ou morte celular
m = (1/X) dX/dt
m - taxa específica de crescimento celular:
CRESCIMENTO CELULAR EM BATELADA: FASE LAG
Adaptação ao novo ambiente: reorganização dos constituintes
moleculares das células
Fatores que aumentam a duração da fase lag:
• inóculo com concentração celular reduzida;
• baixa concentração de nutrientes e de fatores de
crescimento no meio de cultura;
• inóculo com idade avançada.
Crescimento diáuxico: alterações metabólicas.
A fonte de carbono de mais fácil utilização (C1) reprime a
síntese de enzimas requeridas para o metabolismo da
fonte (C2).
tempo
log (no de
células)
utilização
da fonte C1
CRESCIMENTO CELULAR EM BATELADA: FASE LAG
CRESCIMENTO CELULAR EM BATELADA: FASE LOG
dX/dt = m X X: concentração celular
t: tempo de cultivo
m = mmax
td = (ln 2)/mmax
Período de crescimento balanceado:
• A composição média das células permanece aproximadamente constante;
• Formação de metabólitos primários;
• Crescimento celular independe da concentração de substratos.
Crescimento exponencial de primeira ordem:
Tempo de duplicação da biomassa (td):
A massa celular e o número de células aumentam
exponencialmente com o tempo
CRESCIMENTO CELULAR EM BATELADA: FASE DE DESACELERAÇÃO
Período de crescimento desbalanceado.
O stress induzido pela exaustão de um nutriente ou pelo
acúmulo de resíduos.
Reestruturação microbiana para aumentar a
sobrevivência em ambiente hostil.
CRESCIMENTO CELULAR EM BATELADA: FASE ESTACIONÁRIA
Não há crescimento celular líquido
Ocorre catabolismo de reservas celulares:
Produção de energia e novos blocos construtores
Fenômenos que podem ocorrer durante a fase estacionária:
• A massa celular mantém-se constante, com redução no número de
células viáveis.
• Lise celular, com redução no número de células viáveis. Produtos
da lise celular: nutrientes para as células viáveis remanescentes.
• Células metabolicamente ativas produzem metabólitos
secundários.
CRESCIMENTO CELULAR EM BATELADA: FASE DE DECLÍNIO OU MORTE CELULAR
A morte celular resulta da diminuição da concentração de nutrientes e do acúmulo de produtos tóxicos:
dN/dt = -k’ X
Forma integrada:
N = Ns e-k’t
onde: N: concentração de células viáveis
Ns: concentração de células viáveis no final da
fase estacionária
k’: constante da taxa de morte
DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO CELULAR
Métodos Diretos: Determinação da
população total e/ou do número de células viáveis
Método de plaqueamento;
Medida da massa seca
DETERMINAÇÃO DA
CONCENTRAÇÃO DE CÉLULAS
MÉTODOS
Diretos: determinação da população total e/ou do
número de células viáveis (sujeitos a interferentes)
Indiretos : baseados na medida de consumo de
substrato e/ou na formação de produtos
DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO CELULAR
MÉTODOS DIRETOS
1. Método da Câmera de Neubauer ou Hemocitômetro
A suspensão celular, colocada em uma câmara de volume
conhecido, é observada no microscópio óptico.
- aplicável a meios de cultura sem outras partículas suspensas;
- pode-se usar corantes para se distinguir entre células vivas e
mortas (células totais e células viáveis);
- adequado para células não agregadas.
profundidade: 0,1 mm
1 mm X 1 mm X 0,1 mm = 0,1 mL
DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO CELULAR
Exemplo da Análise da Viabilidade Celular com o Auxílio de Corantes:
Avaliação de Mudanças Morfológicas Associadas à Morte Celular
Empregando Laranja de Acridina (LA) e Brometo de Etídio (BE)
Fundamento:
LA: capaz de penetrar no interior da
célula, independentemente da
integridade da membrana,
intercalando-se nas fitas duplas de
DNA e emitindo fluorescência verde.
BE: não é capaz de permear através
da membrana, penetrando somente
em células não viáveis. É capaz de se
intercalar com as bases das fitas
duplas de DNA, resultando em
fluorescência laranja.
Em verde: células viáveis
Em laranja: células apoptóticas
Fonte:
www.cmj.org/paper_journal/04/07/04/7c2.jpg
MÉTODOS DIRETOS 2. Método de Plaqueamento Placas de Petri com meio de cultura gelificado são usadas para
a contagem de células viáveis (capazes de se reproduzir)
~ 25 gerações colônia visível a olho nu
Células metabolicamente ativas podem não formar colônias
se o meio e as condições de cultura não forem adequados
Método adequado para bactérias e leveduras
MÉTODOS DIRETOS
3. Medida da Massa Seca
Aplicável a meios de cultura sem outras partículas
suspensas.
Centrifugação
Filtração
Secagem
80oC, 24 h
Determinação
rápida:
volume empacotado
Massa
seca
celular
DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO CELULAR
Monitoramento de componentes intracelulares:
DNA, proteínas, RNA, ATP, NADH E outros
Quantificação de substratos:
Oxigênio, fontes de carbono, fontes de nitrogênio
Quantificação de produtos:
Etanol e ácido lático (processos anaeróbios);
CO2 (processos aeróbicos);
H+ (queda no pH resultante do uso de amônio)
Monitoramento da viscosidade:
Aumento: Crescimento de micélios
Formação de polissacarídeo extracelular
Redução: substrato = polímero biodegradável
Métodos Indiretos: Baseados na medida de consumo de
substrato e/ou na formação de produtos
Caracterização dos Microrganismos
Na natureza: m.o. existem em culturas mistas
Determinação das características de um m.o. Cultura pura
População Microbiana - muitas espécies diferentes
Quais os tipos de m.o. presentes?
Isolamento – Enumeração – identificação