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ISSN 0104-6187
Dezembro/2000
Pseudomonas spp. Fluorescentes - BactériasPromotoras de Crescimento de Plantas e
Biocontroladoras de Fitopatógenos em Sistemas deProdução Agrícola
Empresa Brasileira de Pesquisa AgropecuáriaAgrobiologia
Ministério da Agricultura e do Abastecimento
Documentos
Número, 127
República Federativa do Brasil
PresidenteFernando Henrique Cardoso
Ministério da Agricultura e do Abastecimento
MinistroMarcus Vinicius Pratini de Moraes
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária - Embrapa
Diretor PresidenteAlberto Duque Portugal
DiretoresElza Ângela Battaggia Brito da Cunha
Dante Daniel Giacomelli ScolariJosé Roberto Rodrigues Peres
Embrapa Agrobiologia
Chefe GeralMaria Cristina Prata Neves
Chefe Adjunto de Pesquisa e DesenvolvimentoSebastião Manhães Souto
Chefe Adjunto AdministrativoVanderlei Pinto
DOCUMENTO Nº 127 ISSN 0104-6187Dezembro/2000
Pseudomonas spp. Fluorescentes - BactériasPromotoras de Crescimento de Plantas e
Biocontroladoras de Fitopatógenos em Sistemas deProdução Agrícola
Valéria C.P. ZagoHelvécio De-Polli
Norma G.
Seropédica - RJ2000
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Tiragem: 50 exemplares
Comitê de Publicações: Sebastião Manhães Souto (Presidente) José Ivo Baldani Norma Gouvêa Rumjanek José Antonio Ramos Pereira Robert Michael Boddey Dorimar dos Santos Felix (Bibliotecária)
Embrapa
ZAGO, V.C.P.; DE-POLLI, H.; RUMJANEK, N.G. Pseudonomas spp.Fluorescentes – Bactérias promotoras de crescimento de plantas ebiocontroladoras de fitopatógenos em sistemas de produção agrícola.Seropédica: Embrapa Agrobiologia, dez. 2000. 32p. (Embrapa-CNPAB.Documentos, 127).
ISSN 0104-6187
1. Pseudomonas spp. 2. Produção Agrícola. 3. Bacteria. 4. Crescimento. 5.Planta. I. De-Polli, H., colab. III.. Embrapa. Centro Nacional de Pesquisa deAgrobiologia (Seropédica, RJ). IV. Título. V. Série.
CDD 579.332
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .................................................................................... 2
2. TAXONOMIA DE PSEUDOMONAS ................................................ 4
3. COLONIZAÇÃO DA RIZOSFERA ................................................... 4
4. PROMOÇÃO DE CRESCIMENTO ................................................... 6
5. MECANISMOS DE AÇÃO ................................................................. 7
5.1 PRODUÇÃO DE ANTIBIÓTICOS .............................................................................. 75.2 SIDERÓFOROS .................................................................................................... 95.3 PRODUÇÃO DE ÁCIDO HICROCIÂNICO (HCN).................................................... 115.4 PRODUÇÃO DE REGULADORES DE CRESCIMENTO.............................................. 115.5 COMPETIÇÃO POR SUBSTRATO E EXCLUSÃO DE NICHO ..................................... 125.6 MINERALIZAÇÃO DE NUTRIENTES ...................................................................... 125.7 PARASITISMO .................................................................................................... 135.8 AUMENTO DA NODULAÇÃO DE RIZÓBIOS ............................................................ 135.9 INDUÇÃO DE RESISTÊNCIA ................................................................................. 13
6. CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA E GENOTÍPICA .................. 14
7. MELHORAMENTO GENÉTICO...................................................... 15
8. CONSIDERAÇÕES FINAIS ............................................................ 16
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................. 16
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Pseudomonas spp. Fluorescentes - BactériasPromotoras de Crescimento de Plantas e
Biocontroladoras de Fitopatógenos em Sistemas deProdução Agrícola
Valéria Cristina Palmeira Zago1
Helvécio De-Polli2
Norma Gouvea Rumjanek2
1. Introdução
Dentre os grupos de bactérias mais estudados e de grande potencial
para utilização na agricultura encontram-se as rizobactérias promotoras de
crescimento de plantas (RPCPs), representando um subgrupo diverso de
bactérias que colonizam as raízes. O estudo desses microrganismos vem
merecendo destaque nos últimos anos. Devido à grande demanda por
tecnologias ‘limpas’, ou seja, a viabilização da agricultura sustentável, pode-se
esperar que futuramente, uma percentagem maior destas bactérias seja usada
na produção de alimentos.
O termo Rizobactérias Promotoras de Crescimento em Plantas (RPCPs)
foi adotado por Schroth & Hancock (1982) para descrever bactérias benéficas
bem adaptadas à s raízes das plantas, e para diferenciá-las das bactérias do
solo que não as colonizam ou não o fazem tão agressivamente (Botelho, 1996).
Historicamente, as pesquisas com rizobactérias não simbióticas, como
na área de tratamento biológico de sementes, foram iniciadas há um século,
com o objetivo de aumentar o crescimento e o rendimento das plantas. Essas
investigações com sistemas não rizobiais começaram na Rússia e na Ucrânia,
em 1885, usando Azotobacter chroococcum, Bacillus megaterium e outras
espécies de Bacillus (Mishustin, 1963; citado por Luz, 1996).
Entretanto, os primeiros inoculantes usados na agricultura foram os
rizóbios (Rhizobium e Bradyrhizobium), que fixam o nitrogênio em simbiose
com leguminosas. Somente nos anos 50 é que microrganismos não rizobiais
foram utilizados na agricultura. Em 1958, mais de 35 milhões de hectares de
1 Bolsista de Doutorado da Embrapa Agrobiologia.2 Pesquisadores da Embrapa Agrobiologia, Caixa postal 74505, Cep: 23.851-970, Seropédica-RJ.
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terras cultivadas foram tratadas com inoculantes não rizobiais na Rússia,
aumentando o rendimento agrícola em 10 a 20%. Estes foram chamados de
fertilizantes bacterianos (Luz, 1996).
Nas décadas de 60 e 70, investigadores da Índia também usaram
inoculantes produzidos na Rússia e Ucrânia e isolados indianos de Beijerinckia
e de Pseudomonas (Balasundaram & Sem, 1971; citado por Luz, 1996).
Embora o reconhecimento de que certas bactérias poderiam estimular o
crescimento das plantas já estivesse estabelecido, somente com os trabalhos
de Burr et al. (1978), em batata, e de Kloepper & Schroth (1978) em rabanete,
iniciou-se um grande interesse por parte da indústria americana, quando estes
dois últimos cientistas estabeleceram o conceito de rizobactérias promotoras
de crescimento de plantas (RPCPs). Esses investigadores utilizaram estirpes
específicas de Pseudomonas fluorescens e de P. putida e obtiveram aumentos
significativos no rendimento da cultura da batata e do rabanete. Após esses
trabalhos, as RPCPs passaram a ser investigadas numa grande amplitude de
espécies de plantas. Estes trabalhos evidenciaram, conclusivamente, a
capacidade das RPCPs em promover o crescimento e a bioproteção de plantas
(Luz, 1996).
Os efeitos benéficos exercidos pelas RPCPs são realizados através do
estímulo ao crescimento da planta ou através da proteção microbiológica. Nos
últimos anos, têm-se tornado aparente que não há uma clara separação entre
promoção de crescimento e controle biológico induzido por inoculantes de
bactérias. Alguns trabalhos iniciais de Kloepper e colaboradores, mostravam
que a resposta da planta esteve relacionada ao controle dos microrganismos
deletérios nativos, ao invés da promoção direta de crescimento.
A promoção direta de crescimento ocorre quando uma rizobactéria
produz metabólitos que promovem diretamente o crescimento das plantas sem
a interação com a microflora nativa do solo. Em contraste, antibióticos,
sideróforos e ácido hidrociânico (HCN), que decrescem a atividade de
patógenos e/ou microrganismos deletérios, consequentemente, aumentam o
crescimento das plantas e são exemplos de promoção indireta pelo controle
biológico (Kloepper, 1993).
Uma padronização dos termos empregados na ampla literatura
envolvendo estas bactérias é sugerido, pois os diversos termos empregados
6
como “rizobactérias promotoras de crescimento de plantas”, “bactérias
benéficas as plantas”, “RPCPs diretas e indiretas”, dentre outros menos
comuns, tem gerado confusão entre os pesquisadores. Os autores sugerem os
termos “Bactérias promotoras de crescimento de plantas”-BPCPs (englobaria
também as bactérias habitantes da filosfera) e “BPCPs-biocontroladoras”
(bactérias com mecanismos de ação de promoção de crescimento e de
supressão de patógenos (Bashan & Holguin, 1998).
A maioria das estirpes de RPCPs documentadas até então, pertence aos
gêneros Pseudomonas (gram-negativas) e Bacillus (gram-positivas). Sendo
que, dentre o gênero das Pseudomonas, o maior número das espécies refere-
se ao grupo das fluorescentes.
Pseudomonas spp. fluorescentes também estão envolvidas na
conservação do ambiente. Seus metabolismos de carbono e energia são
responsáveis pela dissimilação de nitrato e degradação de compostos
xenobióticos. A diversidade metabólica das Pseudomonas spp. fluorescentes,
dá à estas bactérias uma grande habilidade para adaptação a vários
ambientes, tais como solo e rizosfera (Latour & Lemanceau, 1997).
2. Taxonomia de Pseudomonas
O gênero Pseudomonas compreende um taxon de organismos muito
versáteis metabolicamente, capazes de utilizar uma grande variedade de
compostos orgânicos simples ou complexos. Consequentemente, eles estão
distribuídos por solos e água, sendo importantes como patógenos de plantas,
animais e humanos, com algumas estirpes relacionadas à promoção de
crescimento de plantas e biocontrole de fitopatógenos.
O gênero Pseudomonas Migula 1894 foi originalmente estabelecido
baseado em características morfológicas e metabolismo celular. O
reconhecimento de que trata-se de um gênero bastante heterogêneo e as
subsequentes reorganizações taxonômicas, são resultados de estudos
moleculares por muitos anos. Reconhece-se, atualmente, como Pseudomonas
(stricto sensu), apenas as espécies que se agrupam com P.aeruginosa e P.
fluorescens no grupo I de homologia DNA-rRNA (Pallleroni et al., 1973) e
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subclasse γ das Proteobacteria (Woese, 1987), com pelo menos 30 espécies
validadas.
Com base nas caractéristicas fenotípicas, as espécies do gênero
Pseudomonas do grupo I DNA-rRNA, são divididas em dois grupos distintos,
segundo suas propriedades de produzir pigmentos fluorescentes (pioverdinas)
ou de acumular nas células inclusões de poli-α-hidroxibutirato (não-
fluorescentes) (Kimura & Ribeiro, 1994). No entanto, muitas dúvidas ainda
permanecem quanto à taxonomia deste gênero.
3. Colonização da rizosfera
A influência das raízes e as modificações bioquímicas e físicas
ocasionadas pela presença destas, promovem habitats especializados para os
microrganismos do solo. A rizosfera, como definido por Hiltner (1904) e citado
por Lynch (1990), é a região do solo sob influência das raízes. Alguns autores a
dividiram em: endorrizosfera (várias camadas dos tecidos da raiz); rizoplano
(superfície bidimensional da raiz) e ectorrizosfera (representando o solo
adjacente à raiz) Kloepper, 1996).
Uma extensiva colonização é essencial para alcançar um eficiente
controle biológico e estimular o crescimento das plantas. A colonização da
rizosfera deve-se a uma maior disponibilidade de nutrientes em relação ao solo
não-rizosférico. Esta disponibilidade é resultado da translocação de
fotosssintatos da parte aérea das plantas, via floema, para as raízes, onde
sustentam os processos biossintéticos, sendo uma parte liberada para o solo
rizosférico. A quantidade de fotossintatos rizodepositados é variável em função
da espécie vegetal e dos fatores ambientais, sendo os valores mais comuns
entre 10 e 100 mg de carbono/grama de raiz seca ou, aproximadamente, 20%
dos fotossintatos (Whipps, 1985).
O efeito da rizosfera sobre as bactérias não é específico, havendo a
presença de diferentes grupos morfológicos, fisiológicos e taxonômicos.
Entretanto, as bactérias gram-negativas compõem uma grande percentagem
da rizosfera, devido à suas altas taxas de crescimento, respondendo a adição
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de ácidos aminados e açúcares solúveis, produzindo ácido por adição de
glicose e sendo resistentes à antibióticos (Alexander, 1977).
Os microrganismos colonizam apenas 7 a 15% da superfície das raízes
e se localizam, principalmente, nas regiões de ramificações e partes mais
velhas da raiz. Ecologicamente são agrupados em: oportunistas (predominando
nas raízes mais novas, com crescimento rápido, alta capacidade competitiva e
população de pequeno tamanho) e estrategistas (com maior tamanho de
população, alta longevidade, baixa mortalidade e crescimento lento, são muito
especializados e predominam nas raízes mais velhas) (Siqueira & Franco,
1988).
A quimiotaxia contribui para o estabelecimento da colonização da
rizosfera de Pseudomonas (Scher et al., 1985, De Weger et al. 1987). Alguns
pesquisadores também mostraram a influência de aglutininas, quando uma
linhagem de P. putida aderiu-se à s raízes de feijão e pepino, através de seu
complexo de glicoproteínas. Essas evidências foram comprovadas com a
obtenção de mutantes negativos para aglutinação. Comparados à linhagem
nativa, os mutantes negativos aderiram-se à s raízes em menor extensão,
colonizando-as moderadamente e levando a uma menor proteção de plantas
de pepino contra Fusarium oxysporum (Tari & Anderson, 1988).
Algumas estirpes de Pseudomonas possuem polissacarídeos com
longas cadeias laterais de O-antigênico. Observaram-se que mutantes não
produtores destas cadeias laterais, não diferiram das linhagens selvagens com
relação ao ataque à partículas de sefadex ou raízes esterilizadas de batata.
Enquanto outros pesquisadores observaram resultados contrários à acertiva
acima (Broek & Vanderleyden, 1995). Estes achados conflitantes podem ser
atribuídos a possíveis diferenças nos isolados bacterianos, na espécie de
planta e nas condições físicas do solo, particularmente a umidade (De Weger
et al., 1987; Melo, 1998b).
A motilidade foi uma característica essencial para a colonização
competitiva nas raízes, quando um mutante não-móvel de Pseudomonas
putida, inoculado em raízes de espinafre, juntamente com a estirpe selvagem,
demonstrou que a sua população no rizoplano foi muito inferior a da estirpe
móvel (Sakai et al., 1996). No entanto, em outros trabalhos constatou-se que
mutantes imóveis foram capazes de colonizar as raízes de forma semelhante
9
as linhagens nativas, de onde se concluíu que a motilidade não foi essencial
neste processo (Howie et al., 1987; Scher et al., 1988). Vê-se, portanto,
necessidade de maior aprofundamento neste tema.
Para prover um efetivo biocontrole, a bactéria da rizosfera precisa estar
presente nas raízes no lugar certo (abaixo da coifa), no tempo certo (antes do
patógeno causar dano extensivo) e em quantidade suficiente. Como exemplo,
pode-se citar a habilidade de estirpes de Pseudomonas fluorescens em
supressionar a doença ‘take–all’ em trigo que foi diretamente proporcional à
sua densidade populacional (Raaijmakers et al, 1999, mencionado por Haas et
al., 2000).
4. Promoção de crescimento
Nos referimos aqui, ao crescimento e desenvolvimento das plantas de
forma geral, incluindo os efeitos benéficos na germinação de sementes,
emergência de plântulas, comprimento de ramos e tamanho e produção de
grãos e frutos. Assim, como exemplo dos efeitos de RPCPs na produtividade,
podemos citar aumentos de 33% na produção de ervilha e de até 150% em
plantas de rabanete com inoculação de Pseudomonas spp. (Parke et al., 1991;
Kloepper & Schorth, 1981).
Sementes de arroz, amendoim e quiabo foram inoculadas com espécies
de Pseudomonas spp. fluorescentes isoladas do rizoplano de arroz e pimentão,
respectivamente. A germinação das sementes aumentou com a inoculação da
espécies, sendo maior em amendoim. O comprimento dos ramos e raízes,
crescimento das plântulas e produção das culturas também aumentou com a
inoculação (Dileep et al.;1998).
Experimentos em condições controladas e em condições de campo
mostraram aumento da emergência de plântulas em até 100% ocasionadas por
P. fluorescens e P. putida. Essas bactérias, têm aumentado a emergência de
plântulas, principalmente em condições de baixa temperatura do solo (Kloepper
et al., 1986). Uma linhagem de P. aeruginosa e uma de P. fluorescens
induziram aumento na germinação de sementes que haviam sido submetidas
por 10 dias à condições de baixa temperatura. Plantas originadas de sementes
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bacterizadas com Pseudomonas, submetidas a um período de frio, tiveram um
conteúdo de matéria seca superior ao controle. A promoção da emergência de
plântulas foi atribuída a produção de antibióticos por estas bactérias (Hofte et
al., 1991).
Rizobactérias isoladas do rizoplano de milho de inverno, cv. Piranão de
inverno – ESALQ, ou seja, variedade com antocianina nas folhas, plantada sob
condições de baixa temperatura (16oC), foram selecionadas visando obter
bactérias que aumentassem a germinação de sementes, por ocasião do plantio
de inverno. Observou-se que cerca de 72% dos isolados bacterianos,
principalmente do gênero Pseudomonas spp., aumentaram a germinação de
sementes em 31% (Melo & Lucon, 1995).
Três isolados de P. aeruginosa, quando aplicados em bacterização do
substrato e da semente, mostraram aumento da emergência e peso seco das
plântulas, além de antagonismo à P. solanacearum. Porém, por serem
patogênicas à homens e animais não se recomenda o seu uso em controle
biológico de doenças (Peixoto et al., 1995).
Porém, nem sempre os efeitos benéficos da utilização destas estirpes
reflete-se em melhoria no crescimento e produção das culturas. Pseudomonas
spp. fluorescentes obtidas da rizosfera de algodão, milho, soja e tomate, foram
inoculadas em sementes de algodão, por bacterização. Alguns isolados
diminuíram significativamente a porcentagem de sementes portadoras de
Fusarium spp., sendo que agerminação e emergência das plântulas não
diferiram da testemunha (Pizzinatto & Freitas, 1996).
Os mecanismos de ação responsáveis pela produção de crescimento
em plantas, podem estar ligados inicialmente à inibição do patógeno, ou seja,
beneficiando o crescimento vegetal de forma indireta. Muitas vezes é difícil
reconhecer os mecanismos e relacioná-los à promoção direta de crescimento,
visto que mais de um mecanismo é produzido pela bactéria.
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5. Mecanismos de ação
Compostos como sideróforos, reguladores de crescimento e centenas de
diferentes metabólitos secundários, incluindo antibióticos e HCN são
produzidos por Pseudomonas spp. fluorescentes.
Mas em que condições as moléculas precursoras são canalizadas para
a biossíntese de metabólitos secundários ao invés de direcioná-las ao
metabolismo primário? O termo ‘idiofase’ refere-se a uma peculiar fase onde os
microrganismos produzem os metabólitos secundários e distingue-se da
‘trofofase’ (nutricional), quando os microrganismos devotam seus metabolismos
à síntese máxima de componentes celulares e ao crescimento. A ‘idiofase’ é
caracterizada pelo crescimento não–exponencial, tipicamente causada por
limitações nutricionais do ambiente e alta densidade de células (Haas et al.,
2000).
Quando tais limitações se fazem presentes, estes mecanismos de ação,
que estimulam o crescimento direto ou indireto, são produzidos.
5.1 Produção de antibióticos
A antibiose é a produção de compostos bactericidas, fungicidas ou
micostáticos e nematicidas. Substâncias produzidas pelas RPCPs já foram
isoladas e algumas identificadas. Os antibióticos são compostos orgânicos de
baixo peso molecular que, em baixas concentrações, são deletérios ao
crescimento ou à atividades metabólicas de outros organismos (Fravel, 1988).
Existe uma grande diversidade de antibióticos produzidos pelas
diferentes estirpes de Pseudomonas. Compostos como fenazinas,
pioluteorinas, pirrolnitrinas, tropolonas, piocianinas e 2,4 diacetilfloroglucinol
têm sido isolados de Pseudomonas spp. do solo. Estes, juntamente com os
sideróforos e HCN, parecem ser derivados do ácido corísmico, um
intermediário da rota do ácido chiquímico (Campbell et al., 1993). Alguns
compostos, como as tropolonas, tem amplo espectro de ação, o que pode não
ser desejável por eliminar outros organismos benéficos (Botelho, 1996).
12
Embora o mecanismo pelo qual o composto 2,4 diacetilfloroglucinol (Phl)
inibe o crescimento de fungos não esteja claro, várias hipóteses são cogitadas.
Certas espécies de plantas produzem floroglucinóis, que são depositados
externamente nas superfícies dos tecidos das plantas e podem estar
envolvidos na defesa da planta contra a invasão de patógenos. O 2,4
diacetilfloroglucinol é um membro da classe de compostos floroquinolina e
pode atuar na ruptura da membrana do fungo. Por outro lado, a produção de 2,
4 diacetilforoglucinol por bactérias pode ativar a indução de resistência
sistêmica. Esta hipótese é baseada na observação de que a presença de Phl
na rizosfera inibiu a podridão preta de raiz, causada por Thielaviopsis basicola,
sem redução drástica da população do fungo (Pierson, 1998).
A produção de Phl por P.aureofaciens Q2-87 é seu principal mecanismo
de inibição patogênica. Um mutante negativo na produção de Phl (Phl-) foi
criado por mutação Tn5 e, subsequentemente, mostrou ter perdido a habilidade
de inibir Gaeumannomyces gramicis var. tritici “in vitro”. A região do genoma de
Q2-87 que contém a inserção Tn5 foi subclonada e usada para identificar três
cosmídeos contendo DNA homólogo de uma biblioteca genômica de Q2-87.
Dois dos três cosmídeos foram hábeis para complementar vários mutantes Phl–
para a produção de Phl e a inibição ao fungo voltou a ser observada (Vicent et
al., 1991).
No entanto, a pirronitrina (Prn), sintetizada a partir do triptofano, inibi o
crescimento, mas não mata o organismo alvo, provavelmente, interferindo na
função normal da membrana (Pierson, 1998).
Mutagênicos químicos foram usados para criar mutantes de P.
fluorescens BL915 negativos para a produção de pirrolnitrina. Um dos mutante
(2-1), foi inábil à inibição de R. solani “in vitro”. Um fragmento 4,9 kb HindIII-
EcoRI do cosmídeo pANT9 de uma biblioteca genômica de BL915 restaurou a
produção de Prn e a supressão da doença para o mutante 2-1 (Gaffney et al.,
1994).
Outros compostos têm mostrado diferentes graus de especificidade e
podem ser efetivos contra alguns organismos fitopatogênicos, como por
exemplo, a pioluteorina de Pseudomonas spp. fluorescentes, que foi efetiva no
controle de “damping-off” de algodão, causado por Phytium, enquanto a
pirrolnitrina, de outra Pseudomonas, foi mais eficiente contra Rhizoctonia solani
13
(Howell & Stipanovic, 1980). Isolados de Pseudomonas spp. produzindo 2,4
diacetilfloroglucinol (Phl), foram superiores no controle de Fusarium em tomate
e Pythium, causando “dampping off” em pepino, do que aqueles produzindo
pioluteorina (Plt) em adição ao 2,4 diacetilfloroglucinol (Phl) (Sharifi-Tehrani, et
al.; 1998).
Fenazinas são moléculas heterocíclicas contendo nitrogênio, das quais
mais de 60 diferentes derivados têm sido identificados. A produção de fenazina
por P.aureofaciens 30-84 contribui para sua competitividade ecológica com
outros microrganismos nativos (Mazzola et al., 1992). Baseado na análise
funcional dos genes phz de algumas espécies, é sugerido que espécies
diferentes de Pseudomonas spp. fluorescentes tem sistemas genéticos
similares que conferem a habilidade para sintetizar fenazina-1- carboxilato
(PCA) (Mavrodi et al., 1998).
A inibição do crescimento de Phoma betae (Pleospora betae) e R.
solani, isoladas de sementes e raízes de beterraba, foi obtida através de
inoculação com Pseudomonas spp. fluorescentes, associadas à produção de
fenazina (Lovic et al.; 1993).
A frequência de Pseudomonas spp. fluorescentes produzindo
floroglucinol e fenazina foi determinada em raízes de trigo crescido em 3 solos
supressivos para a doença “take-all” (causada por Gaeumannomyces graminis
var. tritici) e em 4 solos condutivos. Estirpes produzindo fenazina não foram
detectadas em raízes de nenhum dos solos. Todavia, Pseudomonas spp.
fluorescentes foram isoladas de todos os três solos supressivos à densidades
variando de aproximadamente 5x105 to 2x106 unidades formadoras de
colônias/g de raiz. Nos solos condutivos, Pseudomonas spp. produzindo Phl
não foram detectados ou foram detectados em densidades pelo menos 40
vezes menor que aqueles nos solos supressivos. Isto sugere que as
Pseudomonas spp. fluorescentes produtoras de Phl têm um importante papel
na natureza supressiva desses solos para “take-all” de trigo. Análises de PCR e
hibridização por ‘southern blot’ demonstraram que genes específicos dentro
dos loci biossintéticos para Phl e fenazina são conservados entre várias
estirpes de Pseudomonas largamente distribuídas (Raaijmakers et al.; 1997).
Observou-se em estudo com isolados de Pseudomonas spp
fluorescentes da rizosfera de beterraba, o envolvimento de viscosinamida, um
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antibiótico lipopeptídico, além do 2,4 diacetilfloroglucinol e endoquitinase, na
ação antagonista de algumas estirpes à ‘damping-off’ (Phytium ultimum e
Rhizoctonia solani) (Nielsen et al., 1998).
Várias Pseudomonas spp. fluorescentes importantes no controle
biológico produzem sinais N-acil-homoserinas-lactonas (N-acil-HSL) que
regulam genes, que por sua vez, codificam produtos envolvidos na supressão
de patógenos. Esses sinais regulam a expressão da amplitude de várias
características bacterianas envolvida nas interações entre microrganismos e
hospedeiro-microrganismo. Todavia, para bactérias patogênicas, pouco é
conhecido a respeito da regulação do gene mediado por N-acil-HSL em
bactérias do controle biológico. O papel do N-acil-homoserina lactonas (N-acil-
HSL) é considerada na regulação do antibiótico fenazina, no controle biológico
por Pseudomonas spp. fluorescentes (Pierson et al., 1998).
5.2 Sideróforos
Os sideróforos são compostos de baixo peso molecular, queladores de
ferro, produzidos pela maioria das bactérias e fungos sob condições limitantes
desse elemento.
Embora o ferro seja abundante em solos aerados (1-6%), é
frequentemente indisponível para as plantas devido a sua solubilidade, que é
dependente do pH e controlada pela baixa solubilidade dos óxidos de ferro. A
disponibilidade do ferro para as raízes das plantas pode assim, depender de
quelantes orgânicos que manteriam um adequado suprimento de ferro por
difusão e fluxo de massa em concentrações tão baixas como 10-8 M (Powell et
al., 1980).
À medida em que o pH do solo decresce, a disponibilidade de ferro
aumenta e os sideróforos se tornam menos efetivos. O nível crítico de ferro,
necessário para provocar a supressão do crescimento de um patógeno fúngico
por parte de uma linhagem de P. putida, é menor que 10-6 mol m-3 (Simeoni et
al., 1987, citado por Melo, 1998b).
Um aspecto comum a todos os sideróforos é que formam complexos
octaédricos com o Fe+++ e são agrupados pelo tipo estrutural (hidroximatos e
fenolatos/catecolatos). De fato, quase todas as bactérias aeróbias e anaeróbias
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facultativas produzem sideróforos, diferindo, contudo, na eficiência de
produção. As espécies pertencentes ao grupo das Pseudomonas spp.
fluorescentes produzem sideróforos verde-amarelados, fluorescentes, solúveis
em água, como a pioverdina, cujo nome comum é pseudobactina, que
apresenta alta afinidade com Fe+++ e transporta esses elemento para o interior
das células. Dessa maneira, os microrganismos fixam Fe+++ , tornando-o
menos disponível a outros incapazes de produzir agentes similares de
transporte de ferro, ou cuja produção é comparativamente menor, ou ainda que
produzam sideróforos que têm menos afinidade por ferro que as RPCPs. Assim
a população destes microrganismos é reduzida e um ambiente mais favorável
para o crescimento das raízes é criado (Kloepper et al., 1980a; Luz, 1996).
Outros sideróforos, além da pioverdina, atuando na supressão de ‘damping-off’
em tomate, como o derivado de salicilato, pioquelina e ácido salicílico (Buysens
et al., 1996).
Um estudo sobre os mecanismos pelos quais a expressão gênica
controla o ferro, envolvido no metabolismo de pioverdina em Pseudomonas
aeruginosa mostrou que a transcrição desses genes foi reprimida pela
presença de ferro no meio de crescimento. Três promotores desses genes
foram clonados e a atividade desses promotores mostrou-se dependente da
quantidade de ferro no meio de cultura (Rombel et al.; 1995).
Foi observado também homologia do DNA entre os genes de síntese de
sideróforos no patógeno oportunista animal Pseudomonas aeuruginosa, e 3
espécies associadas à plantas, P. siringae, P. putida e Pseudomonas sp. B10,
sendo consistente com a hipótese de que os genes de síntese de diferentes
sideróforos tem o envolvimento de um mesmo conjunto ancestral de genes
(Rombel & Lamont; 1992).
Estudos para comprovar se a supressão de doenças era causada pela
produção de sideróforos e/ou antibióticos já foram bem documentados.
Kloepper et al. (1980b) demonstraram em experimentos controlados, que a
adição de ferro, na forma de etilenodiamina tetracetato de Fe+++ (Fe EDTA),
aboliu a ação antagonística “in vitro”. Observaram, também, que o sideróforo
pseudobactina, purificado de P. fluorescens. B-10, exibiu atividade
bacteriostática contra Erwinia carotovora, fato que não ocorreu com a
pseudobactina-férrica, sideróforo complexado com ferro. Observaram também,
16
que o sideróforo pseudobactina induziu um aumento significativo no
crescimento de plantas de batata, enquanto que o sideróforo complexado com
FeEDTA não foi capaz. Evidenciando assim, um mecanismo de ação através
da produção de sideróforos, demonstrando a sua capacidade de sequestrar o
Fe +++ da rizosfera (Kloepper et al., 1980a).
O complexo Fe-sideróforo pode ser específico para o organismo que o
produziu. Desta forma, pode ser restringido o crescimento de fungos e
bactérias, havendo controle das populações microbianas pelo organismo
produtor. Entretanto, sabe-se que algumas estirpes de Rhizobium meliloti são
capazes de utilizar sideróforos produzidos por outras. Os sideróforos
produzidos são idênticos ou suficientemente similares em estrutura para serem
transportados pelo sistema de transporte de membranas de cada estirpe e a
utilização de um sideróforo está correlacionada com a presença de proteínas
específicas da membrana externa (Reich & O’Connell (1993), citados por
Botelho, 1996).
Entretanto, muito pouco é conhecido sobre os efeitos causados na
obtenção de ferro pela planta. Um grande número de trabalhos mostra que os
vegetais superiores são capazes de obter ferro dos sideróforos de
microrganismos (Cline et al., 1984).
A planta também pode contribuir com sideróforos, dos quais se
beneficiaria os microrganismos da rizosfera. Um fitosideróforo foi estudado
como uma fonte de ferro para Pseudomonas spp. fluorescentes na rizosfera. O
55Fe suprido como Fe-fitosideróforo foi absorvido por isolados de
Pseudomonas putida, crescendo sob condições de deficiência de ferro. A
adsorção diminuiu quando as bactérias foram crescidas em presença de ferro.
Todavia, nenhuma diferença na absorção foi observada quando um mutante
deficiente em sideróforo foi testado (Marschner & Crowley, 1998).
5.3 Produção de ácido hicrociânico (HCN)
A produção de HCN pelas RPCPs parece ser um fenômeno bastante
comum. Este metabólito, derivado da glicina, além de apresentar propriedades
inibidoras de patógenos, também pode promover o crescimento das plantas
diretamente, aumentando o desenvolvimento dos pêlos radiculares (Luz, 1996).
17
As Pseudomonas spp. fluorescentes da rizosfera diferem em suas
habilidades de produzir HCN. De 30 isolados testados, apenas um isolado de
Pseudomonas putida foi produtor de HCN, promovendo a acumulação de
fenólicos e fitoalexinas em cotilédones de Phaseolus vulgaris (Zdor &
Anderson; 1991).
Aproximadamente 12% dos isolados de Pseudomonas spp.
fluorescentes, de rizosfera de Lotus cornicutatus avaliadas “in vitro” contra os
fungos fitopatógenos Pythium ultimum e Rhizoctonia solani,. inibiram um ou
ambos os fungos. Dos isolados selecionados “in vitro”, três estirpes de
Pseudomonas fluorescens produziram HCN e sideróforos, mas a adição de
ferro ao meio não afetou a atividade antagônica, além disso enzimas líticas tais
como quitinases e beta 1,3 glucanase também não foram detectadas,
sugerindo como principal mecanismo de ação a produção de HCN (Bagnasco
et al., 1998).
Por outro lado, alguns investigadores têm postulado que a produção de
HCN pode ser realizada também, por rizobactérias deletérias, que podem,
assim, restringir o crescimento das raízes de batata, sendo, portanto,
responsáveis pelo decréscimo de rendimento da cultura com rotações curtas.
De acordo com esta teoria, a produção de HCN pelas rizobactérias deletérias é
realizada através da competição por Fe+++, mediada por sideróforos, requerido
para a produção de HCN (Bakker et al., 1989; Schippers et al., 1991).
5.4 Produção de reguladores de crescimento
Reguladores de crescimento de plantas são substãncias orgânicas que
influenciam os processos fisiológicos de plantas em baixas concentrações. A
produção de reguladores de crescimento como metabólitos microbianos no
solo está diretamente ligada à disponibilidade de substratos, incluindo
exsudatos de plantas e resíduos de animais. Os microrganismos produtores
exercem um importante papel no controle de seu próprio ambiente, afetando o
metabolismo da planta. Os microrganismos, por sua vez, afetam a composição
química de exsudatos liberados e, consequentemente, seu suprimento
nutricional (Melo, 1998b).
18
A maioria dos trabalhos da literatura sobre a influência das RPCPs, no
crescimento das plantas, atribui esse fenômeno a um efeito indireto associado
ao controle biológico de patógenos secundários (Kloepper et al., 1980b,
Kloepper & Schroth, 1981). No entanto, em alguns trabalhos, observou-se que
a promoção de crescimento de plantas, por RPCPs, também tem sido
relacionada a produção de giberilinas (Holl et al., 1988), auxinas (Boronin et al.,
1993) e ácidos lático e succínico (Yoshikawa, 1993).
Observou-se também, estímulo de crescimento e produção de várias
culturas em casa de vegetação e em experimentos de campo em resposta à
inoculação de Pseudomonas fluorescens, que foram atribuídos aos efeitos da
produção de fitohormônios por parte do inoculante (Höflich, 1992). Também foi
observado produção de substâncias tipo AIA (ácido indol acético) “in vitro” e na
rizosfera das plantas de trigo em ‘vaso de Leonard’ (Freitas & Germide, 1992).
As Pseudomonas spp. fluorescentes produziram AIA em resposta aos
exsudatos de raiz de milho (Benizri et al., 1998; Pan et al., 1999).
5.5 Competição por substrato e exclusão de nicho
A exclusão competitiva de organismos deletérios por Pseudomonas na
rizosfera, é um dos modos de ação de supressão de doenças deste gênero.
Este mecanismo tem sido apontado como sendo o responsável pelo
biocontrole de Phytium e Fusarium (Rovira et al., 1990; Elad & Chet, 1987).
O fenômeno da exclusão de nicho é verificado com espécies de
Pseudomonas, já que estas, por suas altas variabilidades metabólicas
predominam sobre os microrganismos que colonizam nichos específicos nas
raízes, fenômeno observado em batata e em beterraba açucareira (Burr et al.,
1978; Kloepper et al., 1980b).
19
5.6 Mineralização de nutrientes
A elevação da disponibilidade de fósforo tem sido creditada a certas
RPCPs, aumentando o crescimento por estímulo da absorção desses
elemento.
Verificou-se, em estudo onde a hidroxiapatita foi usada para avaliar o
efeito da inoculação de sementes com Pseudomonas spp., que a quantidade
de hidroxiapatita dissolvida pela bactéria não diferiu significativamente do
controle não inoculado. Em outro trabalho, no entanto, observou-se a absorção
de fósforo pela inoculação das sementes com P.putida (Lifishitz et al., 1987).
Rodrigues & Fraga (1999) citam que estirpes do gênero Pseudomonas,
Bacillus e Rhizobium estão entre as bactérias com maior potencial de
solubilização de fósforo.
5.7 Parasitismo
A lise por enzimas hidrolíticas excretadas pelos microrganismos é um
aspecto do micoparasitismo. Quitinase e β-1,3 glucanase (laminarinase) são
enzimas importantes no controle de fungos, devido à s suas habilidades de
degradar os componentes das paredes celulares daqueles microrganismos.
Algumas RPCPs têm sido mostradas como produtoras de enzimas líticas,
como quitinases (Ordentlich et al., 1987).
Foi verificado em experimento em condições de casa de vegetação, que
Burkholderia cepacia (Pseudomonas cepacia), produzindo β-1,3 glucanase,
diminuiu a incidência de doenças causadas por Rhizoctonia solani, Sclerotium
rolfsii e Phytium ultimum em 85, 48 e 71%, respectivamente (Fridlender et al,
1993).
5.8 Aumento da nodulação de rizóbios
Algumas estirpes de RPCPs têm sido apresentadas como promotoras da
nodulação simbiótica por espécies de rizóbios fixadores de nitrogênio em
leguminosas em experimentos de campo (Burns et al., 1981; Turner &
Backman, 1991).
20
Os mecanismos propostos pelos quais as RPCPs podem aumentar a
nodulação de Rhizobium são: produção de proteínas de ligação na membrana
celular (Burns et al., 1981), produção de agentes antimicrobianos (Li &
Alexander, 1988), estímulo da colonização de raízes por fungos micorrízicos,
que resultam em mudanças nas morfologia das raízes (Meyer & Linderman,
1986).
A coinoculação de RPCPs e Bradyrhizobium apresentou um aumento na
nodulação e fixação de nitrogênio em soja à temperatura subótima da zona
radicular. O efeito das diferentes estirpes variou com a temperatura da zona
radicular. O aumento na nodulação da soja devido à RPCPs foi atribuído, em
grande parte, à melhor performance fisiológica das plantas (Zhang et al., 1997).
5.9 Indução de resistência
A indução de resistência pode ser definida como um processo de defesa
ativa da planta, em que esta utiliza múltiplos mecanismos induzidos
sistemicamente por agentes bióticos e abióticos, e que se apresenta eficiente
contra uma variedade de patógenos de plantas (Luz, 1996).
Embora a competição por Fe pareça ser o principal modo de ação de
Pseudomonas spp. fluorescentes contra Fusarium oxysporum, observou-se
que a competição não poderia levar em conta todos os dados experimentais de
controle da murcha de fusarium em cravo. Os autores consideraram a hipótese
de que a estirpe WCS417 de P. fluorescens poderia melhorar a resistência da
planta hospedeira (Van Peer et al.,1990). Com a separação física da estirpe de
Pseudomonas spp. fluorescentes na raiz, e o patógeno F. oxysporum sendo
inoculado no caule, não é possível atribuir os efeitos benéficos observados à
interação microbiana. Além disso, uma acumulação aumentada e acelerada de
fitoalexina no caule de cravo pré-inoculado com a bactéria foi observado (Van
Peer et al., 1991). A indução de resistência sistêmica (IRS) por Pseudomonas
putida e outras RPCPs. foi observada também promovendo crescimento em
plantas de pepino e reduzindo significativamente a severidade de
Pseudomonas syringae pv. lacrrymans e Colletotrichum orbiculare (Wei et al.,
1996).
21
A indução de resistência sistêmica também foi observada em pepino e
em tomate contra ‘Vírus do Mosaico do Pepino’ por Pseudomonas spp.
fluorescentes e outras RPCPs (Raupach et al., 1996).
Os mecanismos propostos para indução de resistência sistêmica das
plantas pelas RPCPs incluem vários processos bioquímicos, tais como:
aumento da produção das proteínas solúveis em ácido (Zdor & Anderson,
1992), acúmulo de fitoalexinas (Van Peer et al., 1991), lignificação (Hoffland &
Bik, 1993), ácido salicílico em baixa concentração de ferro (Leeman, 1995a),
estímulo da atividade da peroxidase (Wei et al.,1996) e cadeia lateral
antigênica-O de lipossacarídeos de membrana externa (Leeman et al, 1995c).
A indução por resistência parece ser dependente da estirpe, já que as P.
fluorescens WCS417 e WCS374 induziram resistência em rabanete, enquanto
P. putida WCS358 foi ineficiente em rabanete (Leeman et al., 1995b) e em
cravo (Diujff et al., 1993).
Trabalhos recentes mostram que a indução de resistência sistêmica
mediada por RPCPs apresenta-se bastante parecida com os trabalhos
clássicos. Neste caso, os sistema de resistência sistêmica (SRI) requeriria
indução via pré-inoculação com patógenos fracos, o que, em última análise,
dificultaria o desenvolvimento de formulações comerciais. Já o SRI mediado
por RPCPs poderá ser utilizado via produção de inoculantes para o controle
efetivo de doenças de plantas (Melo, 1998b).
A maioria das RPCPs, apresenta vários mecanismos de ação.
Mecanismos múltiplos foram observados em P. putida e em P. fluorescens.
Uma das estirpes testada de P. putida apresentou capacidade de solubilizar
fosfato, produziu sideróforo, estimulou a germinação de sementes e aumentou
o crescimento das plantas em condições estéreis, além de produzir um nível
baixo de AIA (Boronin et al., 1993). A estirpe BK8661 de Pseudomonas putida,
que produz sideróforos, antibióticos e HCN suprimiu o crescimento de Septoria
tritici e Puccinia recondita f. sp. tritici ‘in vitro’ e em folhas de trigo (Flaishaman
et al.; 1996).
Ainda outros mecanismos são citados na literatura, como: detoxificação
do solo em volta das raízes (Walton & Anderson, 1990), aderência das RPCPs
à s hifas dos patógenos por interação de lectinas que inibem o crescimento
22
adicional do fungo (Nelson et al., 1986) e a inativação de estimulantes de
propágulos de fungos presentes no exsudato das raízes (Van Dijk, 1995).
6. Caracterização fenotípica e genotípica
Diversos esforços têm sido feitos para conhecer a diversidade das
populações nativas de Pseudomonas spp. fluorescentes no ambiente rizo e
filosférico das culturas agrícolas. Esses estudos visam a um aprofundamento
sobre as interações entre microrganismos, entre microrganismos-plantas e
sobre a interferência dos fatores bióticos e abióticos, para então, viabilizar a
utilização do potencial natural das RPCPs.
A abundância e a composição de espécies de Pseudomonas spp.
fluorescentes saprofíticas foram estudadas na rizosfera de milho, girassol e
alfafa (Emnova et al.; 1995); arroz (Zeigler & Alvarez; 1990); filosfera de
beterraba (Rainey et al; 1994) e outras culturas (Tzeng et al.; 1994).
Na verdade, estes são os primeiros passos para a seleção de
microrganismos com potencial de utilização na agricultura ou em
biorremediação. Após testes bioquímicos, fisiológicos e de patogenicidade, os
isolados microbianos mais promissores como RPCPs e biocontroladores são
inoculados em plantas, via semente (bacterização), tratamento das raízes ou
injeção no caule ou raízes (Chen et al.; 1992) ou manipulados geneticamente,
objetivando aprofundamento sobre os mecanismos de ação ou introdução
destes microrganismos geneticamente modificados no ambiente.
7. Melhoramento genético
A maioria dos agente de controle biológico e biorremediação, que têm
sido descritos até então, são de ocorrência natural, ou seja, microrgansimos
indígenos. Estes continuaram por algum tempo a ser a fonte principal de
agentes de biocontrole potencialmente efetivos. Todavia, no futuro, a
23
manipulação genética e o melhoramento das estirpes selvagens, trarão muitos
avanços no controle biológico.
Uma vez que uma estirpe seja selecionada, é possível produzir estirpes
superiores por modificações genéticas. Tais modificações são mutações não-
específicas (com indução por irradiação, químicos ou inserção de plasmídeos),
recombinação sexual ou assexual do genoma das duas estirpes parentais, ou
transformação sítio- específico (Harman & Lumsden, 1990).
As recombinações sexuais ou assexuais permitem a recombinação dos
genomas de duas estirpes. Quando as estirpes são identificadas com
atividades complementares específicas (habilidade para controlar diferentes
patógenos ou melhorar a habilidade de competir eficazmente com a microflora
nativa), uma estratégia utíl pode ser combinar essas estirpes e gerar um
microrganismo com características desejavéis (Harman & Lumsden, 1990).
As mutações de inserção têm sido bastante usadas para inativar genes
específicos nas bactérias. Usando os mutantes negativos para a produção de
antibióticos fenazinas e pirrolnitrina, foi possível demonstrar a ação destes no
antagonismo à fitopatógenos (Thomashow & Weller, 1988; Gaffney et al.,
1994).
A recombinação de DNA já está sendo utilizada para a introdução de
genes que codificam endotoxinas (genes TOX-cry) de Bacillus thuringiensis,
em Pseudomonas fluorescens, para superar as limitações econômicas e
biológicas no controle de insetos que são pragas de solo, mostrando até então,
bons resultados (Botelho, 1996).
8. Considerações finais
Muito se tem avançado nestas últimas décadas, nos estudos sobre a
utilização de RPCPs e seus mecanismos de ação, graças à s técnicas de
biologia molecular. Sabemos, no entanto, que muito há ainda a se
compreender das interações microrganismo- hospedeiro -ambiente.
24
Devido à complexidade dos fatores bióticos e abióticos envolvidos e a
necessidade imperativa de conservar-se os recursos naturais, o emprego das
RPCPs deve ser criteriosamente orientado por estudos ecológicos.
Desta forma, um dos meios mais racionais de controle biológico seria o
manejo da microflora epífitica associada à s plantas. Isto se dá pela utilização
de práticas agrícolas conservacionistas, aumentando o teor de matéria
orgânica, melhorando a estrutura, aeração e teores de umidade dos solos, ou
seja, proporcionando ao agroecossistema, condições para exercer um controle
biológico natural.
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