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EVALUACIÓN DE PSEUDOMONAS SP. SOLUBILIZADORA DE FÓSFORO, NATIVA

DE SUELOS DEL PIEDEMONTE LLANERO ARTIFICIALMENTE CONTAMINADOS

CON DIÉSEL

LINA MARÍA QUIROZ ARANGO

UNIVERSIDAD SANTO TOMÁS

FACULTAD DE INGENIERÍA AMBIENTAL

VILLAVICENCIO

2019

EVALUACIÓN DE PSEUDOMONAS SP. SOLUBILIZADORA DE FÓSFORO, NATIVA

DE SUELOS DEL PIEDEMONTE LLANERO ARTIFICIALMENTE CONTAMINADOS

CON DIÉSEL

LINA MARÍA QUIROZ ARANGO

Trabajo de grado presentado como requisito para optar al título de ingeniera ambiental

Directora

MARÍA ALEXANDRA MÉNDEZ LEAL

MSc. Microbióloga Industrial

UNIVERSIDAD SANTO TOMÁS

FACULTAD DE INGENIERÍA AMBIENTAL

VILLAVICENCIO

2019

Autoridades Académicas

P. JOSÉ GABRIEL MESA ANGULO, O.P.

Rector General

P. EDUARDO GONZÁLEZ GIL, O.P.

Vicerrector Académico General

P. JOSÉ ARTURO RESTREPO RESTREPO, O.P.

Rector Sede Villavicencio

P. RODRIGO GARCÍA JARA, O.P.

Vicerrector Académico Sede Villavicencio

JULIETH ANDREA SIERRA TOBÓN

Secretaria de División Sede Villavicencio

YESICA NATALIA MOSQUERA BELTRÁN

Decana Facultad de Ingeniería Ambiental

Nota De Aceptación

_______________________________

_______________________________

_______________________________

_______________________________

_____________________________

YESICA NATALIA MOSQUERA BELTRÁN

Decana de Facultad de Ingeniería Ambiental

_____________________________

MARÍA ALEXANDRA MÉNDEZ LEAL

Directora Trabajo de Grado

____________________________

JONATHAN STEVEN MURCÍA FANDIÑO

Jurado

____________________________

VERONICA DUQUE PARDO

Jurado

Villavicencio, junio de 2019

Dedicatoria

Dedico este proyecto de grado a Dios, mis padres e hija.

A Dios por darme la oportunidad de llevar a cabo este logro.

A mis padres gracias por su apoyo, esfuerzo y amor.

Agradecimientos

Gracias a la financiación del Fondo de investigación de la Universidad Santo Tomás de

Villavicencio (FODEIN), quien apoyó el macroproyecto “Comportamiento de las características

físicas, químicas y microbiológicas en suelos de vocación agrícola artificialmente contaminados

con Gasolina y Diésel en el piedemonte llanero del Municipio de Cumaral (Meta)” del cuál fui

partícipe aportando insumos para el primer y segundo objetivo.

Gracias a la Universidad Santo Tomás de Villavicencio por la formación de alta calidad que me

brindo, por sus buenos maestros, en especial mi directora de trabajo María Alexandra Méndez Leal

por su apoyo y orientación en la realización de la investigación, gracias también al personal de

laboratorio por su paciencia y orientación.

Tabla de contenido

Pág.

Resumen ................................................................................................................................... 12

Introducción .............................................................................................................................. 14

1. Planteamiento del problema ............................................................................................... 16

1.1 Descripción del Problema ................................................................................................ 16

1.2 Formulación de la pregunta problema.......................................................................... 17

2. Objetivos ........................................................................................................................... 18

2.1 Objetivo general .............................................................................................................. 18

2.2 Objetivos específicos ....................................................................................................... 18

3. Justificación ....................................................................................................................... 19

4. Alcance del proyecto .......................................................................................................... 21

5. Antecedentes ...................................................................................................................... 23

6. Marco de referencia ........................................................................................................... 25

6.1. Marco Teórico ................................................................................................................ 25

6.1.1. Generalidades del piedemonte llanero. ...................................................................... 25

6.1.2. Suelo. ....................................................................................................................... 25

6.1.3. Fósforo. .................................................................................................................... 26

6.1.4. Microorganismos solubilizadores de fósforo. ............................................................ 28

6.1.5. Uso de fertilizantes. .................................................................................................. 29

6.2. Marco Conceptual ........................................................................................................... 30

6.2.1. Suelo. ....................................................................................................................... 30

6.2.2. Hidrocarburos. .......................................................................................................... 30

6.2.3. Diésel. ...................................................................................................................... 30

6.2.4. Fertilizante. .............................................................................................................. 30

6.2.5. Bacterias solubilizadoras de fósforo. ......................................................................... 31

6.2.6. Pseudomonas sp. ...................................................................................................... 31

6.2.7. Textura. .................................................................................................................... 31

6.2.8. Densidad aparente. ................................................................................................... 31

6.2.9. Densidad real............................................................................................................ 32

6.2.10. Porosidad................................................................................................................ 32

6.3. Marco Legal ................................................................................................................... 32

7. Metodología ....................................................................................................................... 36

7.1. Área de estudio ............................................................................................................... 36

7.2. Toma de muestra del suelo .............................................................................................. 36

7.3. Contaminación ex situ con Diésel ................................................................................... 37

7.4. Características físicas del suelo ....................................................................................... 38

7.5. Características químicas del suelo ................................................................................... 38

7.6. Características microbiológicas del suelo ........................................................................ 38

7.6.1. Capacidad solubilizadora de fosfatos. ....................................................................... 39

7.6.2. Caracterización fenotípica de las cepas aisladas. ....................................................... 39

7.6.3. Caracterización bioquímica. ..................................................................................... 40

7.6.4. Conservación de la cepa. .......................................................................................... 40

7.7. Diseño experimental y Análisis estadístico ...................................................................... 40

7.7.1. Diseño experimental. ................................................................................................ 40

7.7.2. Análisis estadístico. .................................................................................................. 41

8. Resultados y Análisis de Resultados ................................................................................... 42

8.1. Características físicas del suelo ....................................................................................... 42

8.1.1. Textura. .................................................................................................................... 42

8.1.2. Densidad aparente. ................................................................................................... 43

8.1.3. Densidad real............................................................................................................ 43

8.1.4. Porosidad. ................................................................................................................ 43

8.2. Características químicas del suelo ................................................................................... 44

8.3. Capacidad solubilizadora de fosfato ................................................................................ 48

8.4. Caracterización fenotípica de las cepas aisladas .............................................................. 50

8.5. Caracterización bioquímica ............................................................................................. 51

8.6 Conservación de la cepa ................................................................................................... 53

Conclusiones ............................................................................................................................. 54

Discusión de Resultados y Recomendaciones ............................................................................ 55

Referencias Bibliográficas......................................................................................................... 58

Lista de tablas

Pág.

Tabla 1. Reglamentación Colombiana sobre hidrocarburos y contaminación del suelo………….32

Tabla 2. Concentraciones de diésel aplicadas a los diferentes tratamientos………………............40

Tabla 3. Resultados de textura por sedimentación……………………………………………….42

Tabla 4. Resultados de los parámetros químicos…………………………………………………44

Tabla 5. Análisis de varianza (ANOVA) para las características químicas……………………….46

Tabla 6. Capacidad solubilizadora de fosfatos de las cepas seleccionadas en medio de cultivo

Pikovskaya……………………………………………………………………………………….48

Tabla 7. Coeficiente de correlación de Pearson entre el volumen del diésel y el índice de

solubilización…………………………………………………………………………………….49

Tabla 8. Caracterización macroscópica y microscópica de las cepas seleccionadas en medio de

cultivo Agar King B………………………………………………………………………...........50

Tabla 9. Caracterización bioquímica de las cepas seleccionadas en medio de cultivo Agar King

B………………………………………………………………………………………………….52

Lista de figuras

Pág.

Figura 1. Mapa de ubicación del área de estudio………………………………………………….21

Figura 2. Toma de muestras del suelo…………………………………………………………….37

Figura 3. Reactores con muestra de suelo contaminada con diésel……………………………….37

Figura 4. Biplot para propiedades químicas de los diferentes tratamientos……………................47

Figura 5. Halo de solubilización de la C3P (lado izquierdo con 32 mm) y la C9P (lado derecho

con 10 mm)……………………………………………………………………….........................50

EVALUACIÓN DE PSEUDOMONAS SP. SOLUBILIZADORA DE FÓSFORO 12

Resumen

El piedemonte llanero es uno de los paisajes más productivos económicamente y el más adecuado

para manejo agrícola, para lo cual se emplea gran cantidad de fertilizantes químicos, aportando

elementos al suelo, necesarios para la fertilidad, siendo el fósforo uno de los nutrientes esenciales

para el desarrollo de las plantas. No obstante, el tipo de suelo hará que la disponibilidad de fósforo

en forma de fosfatos, para las plantas sea mayor o menor, siendo menor para los suelos ácidos,

como los del piedemonte. Adicionalmente, al sobre uso de fertilizantes, se han de tener en cuenta

ciertos contaminantes, como el diésel, vertido al suelo por fugas en la maquinaria requerida para

el laboreo del suelo, el cual ocasiona cambios que afectarán la absorción de macronutrientes por

parte de las plantas.

Siendo los microorganismos presentes en suelos, los únicos capaces de devolver el equilibrio

al mismo, el presente proyecto aporta en segunda fase, al primer y segundo objetivo del macro-

proyecto “Comportamiento de las características físicas, químicas y microbiológicas en suelos de

vocación agrícola artificialmente contaminados con Gasolina y Diésel en el piedemonte llanero

del municipio de Cumaral (Meta)”, debido a que determinó la capacidad de solubilizar fósforo

por parte de uno de los géneros bacterianos más conocidos con dicha propiedad, Pseudomonas sp.

nativa y la relación con las características químicas del suelo de donde se obtuvo, las cepas

previamente aisladas en la primer fase de estudio, se obtuvieron de los reactores contaminados con

0, 200, 500 y 800 ml de diésel.

En el presente estudio se identificó la capacidad solubilizadora de fosfatos por parte de nueve

cepas de Pseudomonas sp. en medio agar Pikovskaya adicionado con 0.1 g/L de Púrpura de

Bromocresol, identificándose que el 78% de las cepas posee alta capacidad solubilizadora de

fosfatos y que estas provenían del reactor con 500 ml de diésel, así mismo, se realizó tinción de

Gram, para el mantenimiento de pureza.

Palabras clave: Suelo, fósforo, Pseudomonas sp, diésel.


Abstract

The Piedmont foothills is one of the most economically productive landscapes and the most

suitable for agricultural management, for which a large amount of chemical fertilizers are used,

contributing elements to the soil, necessary for fertility, with phosphorus being one of the essential

nutrients for the development of plants. However, the type of soil will make the availability of

phosphorus in the form of phosphates, for plants is higher or lower, being lower for acid soils, such

as those of the piedmont. Additionally, the overuse of fertilizers, must take into account certain

pollutants, such as diesel, spilled to the ground by leaks in the machinery required for soil tillage,

which causes changes that will affect the absorption of macronutrients by the plants.

Being the microorganisms present in soils, the only ones able to restore the equilibrium to it,

the present project contributes in the second phase, to the first and second objective of the macro-

project "Behavior of the physical, chemical and microbiological characteristics in soils of

agricultural vocation artificially Contaminated with Gasoline and Diesel in the foothills of the

municipality of Cumaral (Meta) ", because it determined the ability to solubilize phosphorus by

one of the most well-known bacterial genera with this property, Pseudomonas sp nativa and the

relationship with the characteristics Soil chemical from which it was obtained, the strains

previously isolated in the first phase of the study, were obtained from the reactors contaminated

with 0, 200, 500 and 800 ml of diesel.

In the present study, phosphate solubilizing capacity was identified by nine strains of

Pseudomonas sp in Pikovskaya agar medium added with 0.1 g / L of Bromocresol purpura,

identifying that 78% of the strains have phosphate solubilizing capacity and that they came from

the reactor with 500 ml of diesel, likewise, Gram stain was made, for the maintenance of purity.

Keywords: soil, phosphorus, pseudomonas sp, diesel.


Introducción

El fósforo (P) es un nutriente esencial para el desarrollo de las plantas; desempeña un papel

fundamental en la síntesis de proteínas, clorofila, biosíntesis de lípidos, entre otros. Es el segundo

elemento limitante de las cosechas, después del nitrógeno, debido a su gran insolubilidad. (Navarro

& Navarro, 2003).

Los agricultores adicionan fertilizantes químicos a sus cultivos para suplir los requerimientos

de nitrógeno, fósforo y potasio de estos, aumentando así el costo de producción, contaminación al

medio ambiente y afectación a la salud, ya que las plantas consumen alrededor del 40% de cada

kilogramo de fertilizante aplicado y el 60% restante se pierde por diferentes vías que contaminan

el suelo y el agua (Nacional, 2014).

Algunas especies microbianas del suelo tienen la capacidad de convertir las formas insolubles

del fósforo en formas asimilables para las plantas, a través de procesos como la producción de

ácidos orgánicos, quelación e intercambio de reacciones (Begonia, Begonia, Miller, Gilliard, &

Young, 2004). Las bacterias que solubilizan activamente el fósforo representan un 10% de la

población microbiana del suelo, dentro de los géneros bacterianos encontrados esta Bacillus,

Flavobacterium, Burkholderia, Rizhobium y Pseudomonas (Coyne, 2000).

El suelo empleado para el macro-proyecto fue obtenido de la Institución Educativa Agrícola de

Guacavía, en Cumaral, este municipio del departamento del Meta, ubicado en la parte

noroccidental del departamento, en él se desarrolla principalmente turismo, ganadería, agricultura

y últimamente explotación de petróleo (Plan de Desarrollo Municipal, 2016), estas actividades

generan contaminación a los recursos naturales, y ejercen presión sobre el recurso, ocasionando

pérdida de fertilidad y por ende se pierde macronutrientes esenciales para el desarrollo y

crecimiento de las plantas como el fósforo (P) (Tejera, Heydrich, & Rojas, 2013).

Así, que en el presente documento se identificó la viabilidad y capacidad solubilizadora de

fosfatos de cepas nativas de Pseudomonas sp (Restrepo, y otros, 2015), microorganismos

metabólicamente muy versátiles, capaces de utilizar gran variedad de compuestos orgánicos e

inorgánicos, incluyendo tóxicos como hidrocarburos (Ruiz, 2007), además promueven el

crecimiento vegetal, inclusive en condiciones de contaminación por hidrocarburos, debido a la


acción degradadora y la reducción de los efectos tóxicos (Ruberto, Vázquez, & Mac Cormack,

2003).


1. Planteamiento del problema

1.1 Descripción del Problema

En la agricultura del piedemonte llanero es común el uso de maquinaria para sus diferentes

actividades agrícolas y por ende el uso de combustible como el diésel, las malas prácticas generan

accidentes de fuga o derrames de este contaminante en el suelo, además la actividad petrolera

también genera contaminación al suelo cuando se genera accidentes en las operaciones de

explotación, extracción y transporte del hidrocarburo, afectando la flora, fauna y salud de los seres

humanos (Velásquez, 2017).

La contaminación del suelo por parte del diésel causa efectos nocivos en la flora y fauna,

además de dañar los suelos agrícolas, afectando su fertilidad y crecimiento de los cultivos

(Cavazos, Pérez, & Gutiérrez, 2014). Los hidrocarburos son compuestos orgánicos susceptibles

para ser biodegradados, ya sea eliminados o trasformados en sustancias menos tóxicas (Velásquez,

2017), los microorganismos presentes en el suelo pueden degradar los hidrocarburos

transformándolos en compuestos menos tóxicos, siendo una buena opción de biorremediación

(Pérez, Silva, Peñuela, & Cardona, 2015).

La mayoría de los suelos en Colombia tienen deficiencia de fósforo y la disponibilidad es escasa

para las plantas, por lo que se requiere el uso de fertilizantes químicos en la agricultura para suplir

las necesidades nutricionales del suelo y así obtener altos niveles de productividad, aumentando

los costos de producción y la contaminación de los recursos naturales (Porras, 2016).

Los microorganismos presentes en el suelo juegan un papel importante en procesos que afectan

la transformación del fósforo en el suelo y su disponibilidad para las plantas, pueden solubilizar el

fósforo orgánico e inorgánico a través de la liberación de ácidos orgánicos y de enzimas

hidrolíticas que incrementan la disponibilidad de este macroelemento para las plantas (Porras,

2016).

El uso de microorganismos solubilizadores de fósforo es una gran alternativa para reducir la

contaminación y mejorar la productividad de los cultivos, además de producir sustancias

promotoras del crecimiento vegetal (Porras, 2016).


Entre los microorganismos más reportados por la gran capacidad de solubilizar fósforo se

encuentra el género Pseudomonas sp, consideradas también como importantes promotoras del

crecimiento vegetal. (Rodríguez & Fraga, 1999)

En Colombia el consumo promedio de fertilizantes es de 330 Kg de fertilizante por hectárea

según el estudio de la FAO en el año 2015 sobre la agricultura mundial. Los fertilizantes luego de

su aplicación se convierten en sustancias insolubles por parte de la planta, siendo necesaria la

aplicación de mayor cantidad, lo que conlleva a un aumento en las reservas en el suelo de estas

partes insolubles, afectando así la fertilidad y aumentando el costo de producción de los

agricultores, quienes gastan entre un 30 y 40% de su presupuesto en plaguicidas y fertilizantes de

síntesis química industrial para suplir los requerimientos de N, P y K de sus cultivos (Nacional,

2014), además que los precios de los fertilizantes en Colombia superan entre el 30 y 50% el precio

mundial (Marín A. , 2013), generando así en el 2018 un bajo uso de estos fertilizantes químicos

en el país por menor rentabilidad de los productos agrícolas (Dinero, 2018).

El uso intensivo de fertilizantes y la mecanización agrícola reducen las poblaciones microbianas

benéficas y el servicio ecosistémico que proveen. (Restrepo, y otros, 2015)

1.2 Formulación de la pregunta problema

Se generó la siguiente pregunta problema: ¿Cómo varía la capacidad solubilizadora de fósforo de

las Pseudomonas sp. del suelo disturbado y de vocación agrícola obtenido del Instituto Agrícola

Guacavía de Cumaral (Meta), contaminado artificialmente ex situ, en el laboratorio de Toxicología

y Biotecnología, con tres volúmenes diferentes de Diésel, durante un periodo de 5 meses teniendo

en cuenta las características físicas y químicas, especialmente fósforo?

Se estableció la siguiente hipótesis de investigación: Ante una eventual situación de derrame

de hidrocarburos y sus derivados, según las concentraciones del contaminante va a generarse un

efecto diferencial. Por lo que la afectación de los microorganismos presentes en el suelo dependería

de la concentración del derrame de hidrocarburo, por ende, a mayor concentración mayor es el

grado de afectación.


2. Objetivos

2.1 Objetivo general

Evaluar la viabilidad y capacidad de solubilizar fosfatos de Pseudomonas sp. en suelo contaminado

artificialmente ex situ, con diferentes volúmenes de Diésel y su relación con las características

físicas y químicas.

2.2 Objetivos específicos

• Determinar los parámetros físicos y químicos, de un suelo disturbado obtenido del Instituto

Agrícola Guacavía y contaminado artificialmente ex situ con tres volúmenes de Diésel.

• Identificar y determinar la viabilidad de Pseudomonas sp. solubilizadoras de fósforo, de un

suelo disturbado obtenido del Instituto Agrícola Guacavía y contaminado artificialmente ex situ

con tres volúmenes de Diésel.

• Determinar la correlación entre los cambios de las características físicas y químicas del

suelo contaminado con Diésel y la capacidad solubilizadora de fosfatos por parte de Pseudomonas

sp.


3. Justificación

Uno de los grandes problemas que aquejan a la humanidad es la destrucción acelerada de los

recursos naturales, entre ellos el suelo debido a la expansión agrícola acelerada e insostenible,

modificando sus propiedades físicas, químicas y biológicas. Entre las actividades diarias de la

agricultura se utiliza maquinaria para la preparación de la tierra y la recolección de la cosecha que

causan derrames de diésel en el suelo, ya sean accidental o incidentalmente. De lo cual, según la

consulta realizada no se encontró información disponible sobre las cantidades derramadas de diésel

en estas actividades agrícolas, al tratarse de prácticas manejadas de forma particular y/o privada.

Adicionalmente, existe el potencial de degradación de los suelos por parte del uso de

fertilizantes químicos y de derrames registrados en el transporte de crudo y derivados del petróleo,

según la base de datos generada del convenio CORMACARENA-ECOPETROL se tiene

reportados 72 incidentes de hidrocarburos de fuentes móviles en el departamento del Meta, en

municipios de Cumaral, Puerto Gaitán, San Martín, Villavicencio, entre otros. Registrados desde

el año 2012 hasta el 2017, en donde se han derramado más de 128.737 galones de crudo causando

grandes afectaciones al medio ambiente, la principal causa de estos incidentes se da en un 52,77%

por fallas humanas, mecánicas (31.94%), de orden público (1.38%), mal estado de la vía (5.55%),

colisión (1.38%) o afectaciones por terceros (2.77%) y en un 5.55% no se reporta la causa

(CORMACARENA-ECOPETROL, 2018).

En los llanos orientales, se ha estado llevando a cabo un gran esfuerzo por parte de entidades

públicas y privadas, como la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (Agrosavia),

con el objetivo de desarrollar investigaciones relacionadas a conocer los procesos, las condiciones

y la dinámica de los suelos del piedemonte llanero y calificar su estado, sin embargo es escasa la

información disponible sobre la contaminación por diésel en el suelo del piedemonte llanero, y

más aún las investigaciones del género Pseudomonas sp. como solubilizadoras de fósforo;

considerando que son limitados los reportes de las concentraciones de fósforo en la región, por

ende lo es también de las proporciones disponible de este, siendo de vital importancia su

conocimiento e investigación, ya que es uno de los macronutrientes del suelo, esencial para la

agricultura debido a su aporte nutricional y primordial para el desarrollo y crecimiento de las

plantas, teniendo como sus principales funciones fisiológicas, intervenir en procesos de


acumulación y liberación de energía en el proceso de metabolismo celular (Bobadilla & Rincón,

2008), forma parte de los ácidos nucleicos ADN y ARN, participa en la fotosíntesis y la síntesis

de almidón, el fósforo también forma parte de otros compuestos como el ácido fítico, el cual es

fundamental en el proceso de formación y desarrollo de las semillas y raíces, e igualmente una

deficiencia de este nutriente provoca entre diversas consecuencias, la reducción en la expansión

celular (enanismo) (Rodríguez & Flórez, 2004). Razón por la cual, es importante evaluar el

comportamiento de las Pseudomonas sp. pues representan una alternativa para el aumento en la

disponibilidad del fósforo asimilable para las plantas. Y lo es aún más el hecho de evaluar la

alteración en esta importante capacidad, bajo ambientes perturbados por la contaminación de

hidrocarburos y sus derivados.

Por tanto, en el presente estudio se identificó la viabilidad de solubilizar fosfatos del género

bacteriano Pseudomonas sp, a partir de un suelo del piedemonte llanero con vocación agrícola, en

el Instituto Agrícola de Guacavía en el municipio de Cumaral (Meta), disturbado y contaminado

artificialmente con diferentes volúmenes de diésel, para generar información básica del

comportamiento de los suelos del piedemonte llanero ante un eventual derrame de diésel en cuanto

a las características fisicoquímicas, y la capacidad del género Pseudomonas sp. para solubilizar

fósforo, ya que estas bacterias no han sido estudiadas en la región y como una alternativa para

biorremediación del suelo.


4. Alcance del proyecto

El presente proyecto pertenece al macro-proyecto de investigación denominado “Comportamiento

de las características físicas, químicas y microbiológicas en suelos de vocación agrícola

artificialmente contaminados con Gasolina y Diésel en el piedemonte llanero del Municipio de

Cumaral (Meta)”, ganador en modalidad de Proyectos independientes de grupos de investigación

en el marco de líneas activas y protocolizadas de investigación.

El proyecto tuvo como alcance, aportar información de las bacterias del género Pseudomonas

sp. como microorganismos solubilizadores de fósforo en un suelo no perturbado con

hidrocarburos, mediante la contaminación simulada y controlada ex situ con diésel a diferentes

volúmenes (0, 200, 500 y 800 ml) en un suelo disturbado con vocación agrícola del piedemonte

llanero extraído del Instituto Agrícola Guacavía del Municipio de Cumaral (Meta) ubicado en las

coordenadas 4°15’5.08’’ N y 73°10’59.72’’ O, siendo este el área de estudio (Figura 1).

Figura 1. Mapa de ubicación del área de estudio. Por: González & Mora, 2019.


El estudio se ejecutó en un periodo de tiempo de 14 meses, el cual transcurrió desde el mes de

marzo del 2018 a abril del 2019, distribuidos así: dos meses para realizar el montaje de las pruebas

experimentales en las que se generó la contaminación simulada experimentalmente, a partir de esta

fecha y durante cada mes se realizó el muestreo para identificar la capacidad de solubilizar fósforo

de las Pseudomonas sp. y a la vez se realizaron pruebas que permiten identificar la actividad

bacteriana en los diferentes volúmenes de diésel. En los últimos 2 meses se realizaron los procesos

de análisis de los resultados obtenidos con respecto al potencial de las Pseudomonas sp. como

solubilizadoras de fósforo y las conclusiones de la investigación.


5. Antecedentes

Se realiza la vigilancia tecnológica para identificar la tendencia en publicaciones de documentos

relacionados con el tema de solubilizadores de fósforo en suelos contaminados por hidrocarburos,

la cual está guiada por la siguiente clave de búsqueda: (TITLE-ABS- KEY (phosphorus) AND

TITLE-ABS- KEY (soil) AND TITLE-ABS- KEY (microorganisms) AND TITLE-ABS- KEY

(“oil spills”)). Determinando así, indicadores cienciométricos de la producción científica de dicho

campo. Lo anterior haciendo uso de la base de datos de Scopus. (Elsevier, 2019)

Bajo este parámetro de búsqueda fueron encontrados 21 documentos relacionados con el tema

en cuestión (Apéndice A).

De acuerdo con la base de datos, el número de artículos publicados por año es bajo, ya que

desde 1981 se comenzó a investigar el tema y solo han sido 21 documentos realizados hasta la

actualidad, además que durante varios años no se hizo investigación y en el año 2003 y 2015 se

reportaron 3 documentos, siendo este el reporte máximo por año y desde esa fecha hasta la

actualidad solo se ha registrado un documento en el año 2017.

La distribución de artículos publicados relacionados con el tema de estudio según el país

(Apéndice B), permite evidenciar que es Estados Unidos el que más investigación ha realizado en

cuanto al tema, según los resultados de la base de datos de Scopus; contando con 8 publicaciones.

El único país de América Latina que registra en el listado de publicaciones relacionadas con el

tema es México, por otra parte, Colombia no registra ninguna publicación relacionada a este campo

de investigación en torno al patrón de búsqueda en la mencionada base de datos. Pudiendo

relacionarse este comportamiento con la escasa o nula producción investigativa acerca de

solubilizadores de fósforo bajo condiciones de contaminación con diésel, en suelos del piedemonte

llanero.

Se han realizado pocos estudios de las Pseudomonas sp. como solubilizadoras de fósforo en

suelos contaminados por hidrocarburos, sin embargo, han logrado ser ampliamente aislados y

evaluados a partir de suelos de actividad agrícola, con el objetivo de evaluar el potencial promotor

de crecimiento vegetal, y la capacidad de solubilizar fósforo como alternativa sostenible al uso de

fertilizantes (biofertilizantes).


En china aislaron 5 cepas bacterianas de un suelo contaminado con petróleo a largo plazo en el

campo petrolífero de Daqing para biorremediar la contaminación de petróleo, donde se identificó

a Pseudomonas sp. y Pseudomonas aeruginosa mostrando una alta capacidad de degradación de

hidrocarburos del petróleo. Regulando la concentración de sal inicial, nitrógeno y fósforo. (Qu,

Tu, Jia, & Wang, 2013)

En Colombia se ha aislado de la rizosfera de cultivos como el chontaduro, Uchuva, café y arroz;

como microorganismos para solubilizar fosfato inorgánico. En donde diversos autores identifican

a las Pseudomonas sp, con la mayor actividad para la solubilización, además de otras bacterias

identificadas como Burkholderia sp (Patiño & Sanchez, 2012), Bacillus sp, (Cisneros, Sánchez, &

Menjivar, 2017) y Azotobacter (Florez, Leal, Ardila, & Cardenas, 2017). Adicionalmente, se ha

identificado la capacidad para promover la germinación de semillas, el tallo de las plantas y

longitud de la raíz (Caviedes, 2010).

El aislamiento e identificación de Pseudomonas sp, también se ha llevado a cabo en medios

contaminados con hidrocarburos tanto en el agua como en suelo. Donde se ha determinado que es

capaz de adaptarse a las condiciones que proporciona el medio alterado, tomando como fuente de

carbono y energía el contaminante, logrando degradarlo en cierta proporción.

De acuerdo con lo anterior, en Cuba aislaron el género Pseudomonas sp, con el objetivo de

estudiar la biodegradación de petróleo de 9 cepas aisladas de suelos contaminados por petróleo,

estableciendo como objeto de estudio a las cepas Gram negativas representadas por el género

Pseudomonas sp, siendo estas capaces de crecer sobre el crudo de petróleo como única fuente de

carbono y energía, identificando a Pseudomonas aeruginosa, quien presentó mayor crecimiento

logrando degradar hasta el 57% del petróleo. (Pérez, y otros, 2008)

Por otra parte, en Colombia, también se han realizado intentos con el objetivo de determinar la

capacidad degradadora, para uso potencial de biorremediación en ecosistemas. En la ciudad de

Cartagena se aislaron Pseudomonas aeruginosa, a partir de 4 hábitats de suelo y agua

contaminados por industria petroquímica, que permitió constatar su amplia adaptación (Cabrera,

Echeverri, & Manjarrez, 2010). Además, en otro estudio de la ciudad de Cartagena se determinó

de manera adicional microorganismos degradadores de petróleo crudo como fuente de energía

(Quintana, Cabrera, Tous, & Echeverry, 2012).


6. Marco de referencia

6.1. Marco Teórico

6.1.1. Generalidades del piedemonte llanero.

El piedemonte llanero está ubicado en la región de la Orinoquia colombiana, en la base de la

cordillera oriental con alturas de 200 a 700 msnm, el clima es tropical, húmedo y seco, con épocas

bien definidas de lluvia y sequía, con temperaturas uniformes a través del año, precipitación

promedio de 2800 mm y temperatura promedio de 26°C. Los registros de la dirección y velocidad

del viento son muy variables y la predominante es E-NE. La humedad relativa promedio es del

82% en invierno y 70-75% en verano. El piedemonte es uno de los paisajes más productivos

económicamente y el de mejor manejo agrícola y pecuario (Jamioy, 2011).

6.1.2. Suelo.

El suelo es un sistema complejo que alberga especies vegetales, animales y microorganismos. Los

microorganismos son de gran importancia porque se relacionan con procesos de edafogénesis,

ciclos biogeoquímicos de elementos como carbono, nitrógeno, azufre, fósforo, hierro y otros

elementos, fertilidad de las plantas, protección frente a patógenos, y degradación de compuestos

xenobióticos, entre otros (Nogales, 2005). El suelo está formado por una corteza terrestre que

constituye elementos físicos, químicos y biológicos, que desempeñan funciones naturales como la

descomposición de productos vegetales o la biodegradación de componentes que contaminan el

suelo por medio de procesos metabólicos que llevan a cabo los microorganismos (Viñas Canals,

2005). La estructura del suelo está dividida en tres tipos de capas (horizonte A, B y C), el horizonte

A es el más superficial, en el cual abunda materia orgánica, el contacto de este con las bacterias

facilita la degradación de hidrocarburos (Ortega & Saiz, 1998). La contaminación del petróleo se

encuentra principalmente en el horizonte A, donde se encuentra el mayor contenido de materia


orgánica y microorganismos (Paul & Clark, 1998). Los suelos expuestos a la contaminación

prolongada de hidrocarburos, constituye un microhábitat adecuado para bacterias degradadoras,

donde el contaminante ejerce una presión sobre la población microbiana y se selecciona las que

sean capaces de sobrevivir y adaptarse a estas condiciones (Gómez, y otros, 2008).

En los ambientes contaminados existen especies con capacidades metabólicas específicas, que

hacen que la microflora se adapte al contaminante (Marchal, Pene, Solano, & Vandecasteele,

2003). Las Pseudomonas sp. son microorganismos capaces de utilizar el hidrocarburo como fuente

de carbono y energía, siendo una opción muy viable de biorremediación (Bracho, Díaz, & Soto,

2004).

Los suelos contaminados con hidrocarburos presentan mayor cantidad de microorganismos,

pero menor diversidad. Entre estos, se encuentran los capaces de biodegradar hidrocarburos,

representado 1% de la población total, es decir aproximadamente de 104 a 106 células por gramo

de suelo (Rojas, Torres, Fernández, Balderas, & Moroyoqui, 2010). Las bacterias Gram negativas

son el grupo con mayor capacidad para degradar los hidrocarburos (Narvaez, Gomez, & Martinez,

2008)

6.1.3. Fósforo.

Los nutrientes son necesarios para la actividad microbiana y metabólica de la Pseudomona sp, por

lo que se deben encontrar disponibles para su asimilación y síntesis (Viñas Canals, 2005), estos se

dividen en macronutrientes (C, N, P, K) y micronutrientes (Fe, Cu, Zn, S, Co, Mn, Mg y Ca).

El fósforo (P) es un elemento esencial e irremplazable para el metabolismo celular,

contribuyendo en el desarrollo de las plantas, a través del sistema radicular, frutos y demás, las

plantas lo necesitan para crecer y desarrollar su potencial genético y forma la base de un gran

número de compuestos de los cuales los más importantes son los fosfatos. El fósforo está en

pequeñas cantidades en las plantas, 0.2% aproximadamente y en los animales hasta el 1% de su

masa (Porras, 2016).

En el suelo existen diferentes fuentes de fósforo que pueden ser categorizadas como fósforo

inorgánico y orgánico.

El fósforo inorgánico se encuentra formando parte de minerales de calcio, hierro y aluminio

originados por mecanismos de precipitación y pueden liberar fósforo muy lentamente por medio


de la meteorización y son menos solubles que los compuestos de fósforo orgánico (Bobadilla &

Rincón, 2008). El fósforo disponible para las plantas se encuentra en el suelo en forma de

ortofosfatos, que son formas inorgánicas solubles, encontrándose iones monobásicos y dibásicos

(Benerjee, Palit, Sengupta, & Standing, 2010).

El fósforo orgánico está presente en la materia orgánica, que se origina por la degradación

microbiana de restos de animales y vegetales. En diversos suelos puede representar cerca de 50%

del fósforo total insoluble (Oliviera, y otros, 2008).

Los fosfatos desempeñan un papel esencial en los procesos de transferencia de energía y en el

metabolismo (Elizondo, 2005). Procesos que se afectan por la disponibilidad de este en el suelo,

pues el fósforo inorgánico (disponible para las plantas) representa del 50% - 70% del P total,

aunque puede variar entre el 10 y 90%, dependiendo del tipo de suelo (Patiño & Sanclemente,

2014). Es decir, una concentración disponible muy baja para los requerimientos de los cultivos.

Una insuficiencia de fósforo en el suelo puede influir en el retraso de la madurez y el desarrollo

de la planta, disminuyendo el rendimiento de la cosecha, lo que conlleva a la necesidad de uso de

fertilizantes que, al ser aplicados, aproximadamente el 90% pasa a formas solubles no disponibles

(Beltrán, 2014), solo una parte muy baja, entre 0,1 y 0,3 ppm, se encuentra realmente en solución,

plenamente disponible para plantas y microorganismos (Montecinos, 2003). Las plantas extraen

el P del suelo por solubilización de los minerales, con intervención de los microorganismos, en

función de sus necesidades. (Moreno, Nevarrete, & Virgos, 1998).

Los microorganismos presentes en el suelo son capaces de transformar el fósforo a través de

procesos como, mineralización, inmovilización, óxido reducción y solubilización, relacionados

con el metabolismo molecular (Patiño & Sanclemente, 2014). El mecanismo más usado por las

poblaciones microbianas para solubilizar el fosfato es a través de la producción de ácidos

orgánicos, los cuales actúan sobre las formas insolubles (fosfato tricálcico, fosfato dicálcico,

hidroxiapatita y roca fosfórica) (Lara, Esquivel, & Negrete, 2011).

Los ácidos orgánicos permiten que haya solubilización debido a que estos implican un descenso

en el pH a valores aproximados a 2, necesarios para que se pueda llevar a cabo la solubilización

Lara et al (2011).


6.1.4. Microorganismos solubilizadores de fósforo.

La mayoría de los microorganismos son encontrados a uno o dos centímetros de las raíces de las

plantas, zona denominada como rizosfera, debido a la gran cantidad de nutrientes que se encuentra

en esta zona. (Niklitscheck, 2008). Los microorganismos son importantes para la agricultura ya

que estos promueven la circulación de nutrientes para las plantas y a su vez, disminuyen la

fertilización química ayudando así a la conservación del medio ambiente y a una agricultura

sostenible.

Las bacterias que solubilizan activamente el fósforo representan un 10% de la población

microbiana del suelo. Dentro de los géneros de hongos se encuentran Aspergillus, Fusarium y

Sclerotium, un segundo grupo lo constituyen los Actinomycetes, entre las bacterias esta Bacillus,

Flavobacterium, Burkholderia, rizhobium y Pseudomonas (Coyne, 2000).

Las bacterias son los microorganismos predominantes que solubilizan fosfato mineral en los

suelos si se comparan con los hongos y los actinomicetos (Beltrán, 2014).

Las Pseudomonas sp, constituyen bacterias Gram negativas, es el grupo más heterogéneo, se

trata de microorganismos metabólicamente muy versátiles, capaces de utilizar gran variedad de

compuestos orgánicos e inorgánicos, incluyendo tóxicos como hidrocarburos alifáticos y

aromáticos (Ruiz, 2007). Entre las especies están P. fluorescens, P. putida, P. aeruginosa. P.

oryzihabitans, P. stutzeri, P. syringae entre otras. (Slabbinck, De Baets, Dawyndt, & Vos, 2010)

Estas bacterias pertenecen al grupo de promotoras de crecimiento vegetal (PGPR), dentro de

estos microorganismos están los géneros Pseudomonas, Azospirillum, Bacillus, Enterobacter,

Rhizobium, Burkholderia y Erwinia, entre otros (Porras, 2016).

Los microorganismos solubilizadores de fósforo constituyen hasta un 40% de la población de

bacterias del suelo y una porción significativa de ellos son aislados de la rizosfera, dentro de los

aislamientos se encuentran hongos como Aspergillus niger y bacterias como Bacillus sp y

Pseudomonas sp (Porras, 2016), Stenotrophomonas, Burkholderia, Rhizobium sp, Vibrio

proteolyticus, Enterobacter aerogenes y Streptomyces, entre otras (Fernández, Zalba, Gómez, &

Sagardoy, 2005).

Las bacterias que solubilizan el fosfato utilizan diferentes mecanismos para convertir las formas

insolubles en solubles para las plantas. La primera es la secreción de ácidos producidos en el

metabolismo de los azúcares, metabolizando el azúcar y liberando ácidos orgánicos como el ácido


butírico, acético, láctico, entre otros, que actúan como quelantes de los cationes de calcio (Ca),

aluminio (Al) y magnesio (Mg) que acompañan a la liberación de fosfatos. Otro método es

mediante las enzimas producidas por determinados tipos de bacterias, conocidas como fosfatasas,

las cuales mediante la hidrólisis son capaces de solubilizar el fósforo orgánico procedente de la

materia orgánica. Entre los géneros bacterianos más significativos de solubilizadores de fosfatos

se encuentran las Pseudomonas sp. (Benjumeda, 2017).

6.1.5. Uso de fertilizantes.

En Colombia se subutilizan los fertilizantes, esto se debe a que muchos agricultores no están

aplicando la dosis recomendada de fertilizantes, principalmente porque no se realiza un estudio

del suelo previo y no se conocen las características y requerimientos nutricionales del mismo

(Alfonso, 2017).

En el municipio de Cumaral se siembra arroz, maíz, cítricos, maracuyá, papaya, piña, palma de

aceite, cacao, café, plátano, yuca, entre otros, además de la ganadería (Secretaria de Desarrollo

Agroeconomico, 2018). Entre los fertilizantes químicos que contiene fósforo se utilizan en los

diferentes cultivos Triple 18, 25 4 24, 17 6 18 (estas son las concentraciones de N, P y K que tiene

cada fertilizante) con un precio aproximado de 68.000 pesos el bulto de 50 kilos, roca fosfórica

18.000 el bulto y DAP 85.000 el bulto.

Es importante tener en cuenta que el suelo está vivo y que existen enormes cantidades de

microorganismos que lo habitan (hongos, bacterias, actinomicetos), que aportan soluciones a las

necesidades de las plantas (Nacional, 2014), como el uso de las bacterias Pseudomonas sp. para

solubilizar fosfatos, contribuyendo así a la mejora de las propiedades del suelo, garantizando un

producto más sano y por ende menos costoso.


6.2. Marco Conceptual

6.2.1. Suelo.

El suelo es una capa delgada que se ha formado a través de los siglos por medio de la desintegración

de las rocas superficiales por la acción del agua, aire y cambios de temperatura, está compuesto

por minerales, materia orgánica, aire, agua y organismos vegetales y animales (FAO, 1996).

6.2.2. Hidrocarburos.

Los hidrocarburos son sustancias naturales originadas a partir de algas acuáticas establecidas

durante millones de años, proceso iniciado con la fotosíntesis, la cual hace parte del ciclo del

carbono; y a través del tiempo geológico este aporte ha producido grandes cantidades de materia

fósil, estas sustancias están conformadas de compuestos con diferente solubilidad, volatilidad, y

como están formadas únicamente por átomos de carbono e hidrógeno son compuestos orgánicos

susceptibles a ser biodegradados, ya sea eliminados o transformados en sustancias menos tóxicas

tanto en suelos como en cuerpos de agua contaminadas (Yavari, Yeganeh, & Abolghasemi, 2015).

6.2.3. Diésel.

El diésel es un hidrocarburo en estado líquido compuesto por parafinas, se obtiene gracias al

proceso de destilación del petróleo crudo, tiene una densidad de 850 kg/m3, presenta un poder

calorífico de 8.800 kcal/kg, a diferencia de la gasolina, el diésel no se mezcla con etanol.

Aproximadamente el 86.1% de su composición es carbono, se compone en un 75% por

hidrocarburos saturados y el resto son aromáticos (Menna, 2018).

6.2.4. Fertilizante.

Fertilizante es cualquier material orgánico o inorgánico, natural o sintético, que se adiciona al suelo

con la finalidad de suplir determinados elementos esenciales para el crecimiento de las plantas,

pueden ser de dos tipos: orgánicos y minerales. Los orgánicos son de origen vegetal o animal y los


minerales son sustancias de origen mineral, producidas por la industria química o la explotación

de yacimientos naturales (fosfatos, potasa) (AEFA, 2017).

6.2.5. Bacterias solubilizadoras de fósforo.

Las bacterias solubilizadoras de fósforo son microorganismos promotores de crecimiento vegetal

(PGPR), habitan en la rizosfera de las plantas y la benefician potencializando su crecimiento y la

absorción de minerales y compuestos como fosfatos, además combaten la contaminación del suelo

sea de tipo orgánico o inorgánico (Benjumeda, 2017)

6.2.6. Pseudomonas sp.

Las Pseudomonas sp, son bacilos Gram negativos, aerobios estrictos, oxidasa positiva, tienen

cierta facilidad de adaptación que les permite adecuar el hábitat donde se encuentren para utilizar

diferentes fuentes como el carbono o el nitrógeno para su nutrición (Willey, Sherwood, &

Woolverton, 2013), además de tener alta capacidad para solubilizar fosfatos.

6.2.7. Textura.

La textura es la forma en la que se distribuyen por tamaños las partículas del suelo.

Específicamente a las proporciones relativas de las partículas o fracciones de arena, limo y arcilla,

en el suelo tamizado y con diámetro inferior a 2 mm, está relacionada con otras propiedades como

retención de agua, porosidad y retención de nutrientes, entre otras (González, 2014).

6.2.8. Densidad aparente.

La densidad aparente es la relación entre la masa y el volumen de las partículas de suelo y se

expresa en g/cm3 (González, 2014).


6.2.9. Densidad real.

La densidad real es la relación que existe entre la masa y el volumen de las partículas de suelo, el

volumen es el de las partículas de suelo menos el volumen que ocupa los poros y se expresa en

g/cm3 (González, 2014).

6.2.10. Porosidad.

La porosidad es la relación entre el volumen de los espacios vacíos y el volumen total de la masa

del suelo (González, 2014).

6.3. Marco Legal

Actualmente en Colombia no hay una normatividad que regule la contaminación del suelo por

hidrocarburos, y específicamente por diésel, por lo tanto, el marco legal se basa en acuerdos

internacionales, la constitución política, leyes, decretos y resoluciones que abordan temáticas sobre

la contaminación de los recursos naturales principalmente el suelo y sobre hidrocarburos (Tabla

1).

Tabla 1.

Reglamentación Colombiana sobre hidrocarburos y contaminación del suelo.

Tratados Internacionales

Declaración de Río de Janeiro sobre

Medio Ambiente y Desarrollo 1992.

Reconocimiento de la importancia de la

protección del suelo y sus usos potenciales en un

sentido de desarrollo sostenible.

Convenio de la Naciones Unidas

1994.

Fija como objetivo evitar y reducir la

degradación del suelo.


Tabla 1. (Continuación).

Constitución Nacional

Artículo 8

Es obligación del Estado y de las personas

proteger las riquezas culturales y naturales de la

Nación.

Artículo 79

Derecho colectivo a un Ambiente Sano y a

participar en las decisiones que puedan afectarlo.

Artículo 80

El Estado planificará el manejo y

aprovechamiento de los recursos naturales, para

garantizar su desarrollo sostenible, su

conservación o sustitución. Además, deberá

prevenir y controlar los factores de deterioro

ambiental.

Artículo 95

Son deberes de la persona y del ciudadano

proteger los recursos naturales y velar por la

conservación del ambiente.

Leyes

Ley 2 de 1959 Reserva forestal y protección de suelos y agua.

Ley 23 de 1973 Principios fundamentales sobre prevención y

control de la contaminación del aire, agua y suelo.

Ley 9 de 1979

Por la cual se establecen normas que regulan

la protección de la salud pública y el Medio

Ambiente.


Ley 99 de 1993

Crea el Ministerio del Medio Ambiente y la

estructura del Sistema Nacional Ambiental

(SINA).

Ley 430 de 1998

Por la cual se dictan normas prohibitivas en

materia ambiental referentes a los desechos

peligrosos y se dictan otras disposiciones.

Ley 685 de 2001 Código de minas.

Ley 1205 de 2008 Por medio de la cual se mejora la calidad de

vida a través de la calidad del diésel.

Decretos

Decreto 2811 de 1974 parte VII Del suelo agrícola y de los usos no agrícolas

de la tierra.

Decreto 321 de 1999

Por el cual se adopta el plan nacional de

contingencias contra derrame e hidrocarburos,

derivados y sustancias nocivas.

Decreto 1521 de 1998

Manejo, transporte y distribución de

combustibles líquidos derivados del petróleo para

estaciones de Servicio.

Decreto 1609 DE 2002

Por el cual se reglamenta el manejo y

transporte terrestre automotor de mercancías

peligrosas por carretera.

Decreto 2041 de 2014 Todo lo referente a las licencias y trámites

ambientales para el transporte de hidrocarburos.

https://www.minambiente.gov.co/images/Atencion_y_particpacion_al_ciudadano/consultas_publicas_2015/respuesta_Matriz_RTA_comentarios_modificaci%C3%B3n_Decreto_2041.xls



Nota: Normatividad colombiana sobre contaminación del suelo e hidrocarburo. Por: Quiroz,

2019.

Resoluciones

Resolución 004014 de 2005 Por la cual se restringe el transporte de

hidrocarburos por las vías del país.

Resolución 0170 de 2009 Se adoptan medidas para la conservación y

protección de los suelos en el territorio nacional.


7. Metodología

7.1. Área de estudio

El presente estudio, recibe 17 cepas nativas previamente aisladas de reactores contaminados con

0, 200, 500 y 800 ml de diésel, del macro-proyecto “Comportamiento de las características físicas,

químicas y microbiológicas en suelos de vocación agrícola artificialmente contaminados con

Gasolina y Diésel en el piedemonte llanero del municipio de Cumaral (Meta)”, la muestra de suelo

se obtuvo del predio de la Institución Educativa Agrícola de Guacavía del municipio de Cumaral-

Meta ubicado en las coordenadas 4°15’5.08’’ N y 73°10’59.72’’ O. Con un clima entre

superhúmedo medio (A2) y superhúmedo bajo (A1), con factores de humedad entre 101 y 300,

precipitaciones entre 2.800 y 5.270 mm, temperaturas entre 16.6 y 26.2 °C. La humedad relativa

media anual que se presenta en el área oscila entre 60 y 90%. Químicamente su suelo es de reacción

ácida, tiene bajo contenido de fósforo y bases (Ca, Mg, K); capacidad de intercambio catiónico y

saturación de bases igualmente bajas, niveles altos de aluminio intercambiable, valores medios y

bajos de carbono orgánico y fertilidad baja (IGAC; Gobernación del Meta, 2004)

7.2. Toma de muestra del suelo

El muestreo siguió lo establecido en la “Guía toma de muestras de suelo para análisis químico y

físicos” de CORPOICA, de acuerdo con la NTC 4113-2 del 2007 (Figura 2), trasladada al campus

Aguas Claras de la Universidad Santo Tomás, en donde se secó a temperatura ambiente y se tamizó

en malla de 2 mm de diámetro.


Figura 2. Toma de muestras del suelo. Por: Quiroz, 2019.

7.3. Contaminación ex situ con Diésel

Después de tamizadas, se ubicaron 7 kg de suelo en cada reactor (polietileno), para ser

contaminadas con diésel, de acuerdo con (Hernández, Ferrera, & Rodríguez, 2003), se determinó

emplear los volúmenes de diésel (0, 200, 500 y 800 ml) (Figura 3), el volumen cero, hace referencia

a la muestra testigo sin contaminar, todas por triplicado, para un total de 12 reactores previamente

rotulados.

Figura 3. Reactores con muestra de suelo contaminada con diésel. Por: Quiroz, 2019.


7.4. Características físicas del suelo

El procesamiento de las características físicas del suelo se llevó a cabo en el laboratorio de suelos

de la Universidad Santo Tomás, sede Villavicencio, empleando las siguientes metodologías:

textura por el método de sedimentación, densidad aparente por método de cilindro publicado en el

Manual de prácticas de campo y del laboratorio de suelos (SENA, 2013), densidad real por método

del picnómetro y porosidad.

7.5. Características químicas del suelo

Las características químicas fueron procesadas en el laboratorio de la corporación Colombiana de

Investigación Agropecuaria (AGROSAVIA) en el centro de investigación Tibaitata, empleando

las siguientes metodologías: pH (VC_R _004 versión 03), conductividad eléctrica (NTC

5596:2008), materia orgánica (Walkey & black), fósforo disponible Bray II (VC_R _007 versión

02), azufre y boro disponible (Fosfato monobásico de calcio), acidez y aluminio intercambiable

(KCL), calcio, magnesio, potasio y sodio intercambiable (ID_R_072 versión 5), capacidad

intercambio catiónico (suma de cationes), micronutrientes en suelo por Olsen modificado hierro,

manganeso, cobre y zinc (NTC 5526:2007).

Los análisis de Hidrocarburos Totales del Petróleo (TPH) fueron analizados por el

laboratorio acreditado de Tecnoambiental SAS, utilizando la metodología: Ultrasonido NMX-

AA-145 SCFI-2008 IR SM 5520C.F.

7.6. Características microbiológicas del suelo

Los aislamientos de las cepas de interés fueron realizados en el laboratorio de Microbiología del

campus Aguas Claras de la Universidad Santo Tomás, por la egresada de Ingeniería Ambiental,

Ing. Andrea Katherine Riveros Herrera, quien participaba como auxiliar de investigación del

macro-proyecto. Entregó un total de 17 cepas con crecimiento sobre agar King B con emisión de

fluorescencia ante luz U.V., en su mayoría bacilos Gram negativos y Gram positivos, denominadas

C1P (Cepa 1 fosfatos), C2P, …, C17P.


7.6.1. Capacidad solubilizadora de fosfatos.

Se determinó la capacidad de solubilización de fosfatos de las 17 cepas mediante siembra por

picadura en medio selectivo Agar Pikovskaya (PVK) que contiene fosfato tricálcico como única

fuente de P, adicionando 0,1 g/L de púrpura de bromocresol, el cual permite identificar la

formación de halos de solubilización que se evidencia por la acidificación del medio (viraje a

amarillo), se incubaron las cajas a 37°C durante 3 días, transcurridos los días de incubación, se

tomaron los datos del diámetro total de halo en mm y del diámetro de la colonia en mm durante

los días de crecimiento, mediante el software LAS EZ de LEICA EA4 HD, datos que se incluyeron

en la fórmula del índice de solubilización (I.S):

𝐼. 𝑆 =𝐷𝑖á𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎 + 𝐷𝑖á𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 𝑑𝑒𝑙 ℎ𝑎𝑙𝑜

𝐷𝑖á𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑐𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖𝑎

El diámetro del halo se calculó, restando el diámetro de la colonia al diámetro total del halo. De

acuerdo con (Sanclemente, Yacumal, & Patiño, 2017) las cepas que producen halos mayores a 10

mm son consideradas con alto potencial de capacidad solubilizadora, totalmente opuesto a halos

inferiores o iguales a 10 mm, consideradas de bajo potencial.

Teniendo en cuenta lo anterior se seleccionaron las cepas con diámetro de halo mayor a 10 mm,

para un total de 9 cepas seleccionadas.

7.6.2. Caracterización fenotípica de las cepas aisladas.

7.6.2.1. Caracterización macroscópica.

Se realiza una resiembra de las 9 cepas sobre Agar King B, para describir las características

macroscópicas de las cepas, tales como: color, forma y textura, se empleó el estereoscopio Leica

EZ4 (4X).

7.6.2.2. Caracterización microscópica.

Se realizó Tinción de Gram de las resiembras de las 9 cepas, para confirmar la morfología

microscópica por medio del microscopio Leica Dm750 (100X).


7.6.3. Caracterización bioquímica.

Se determinó la capacidad metabólica de las 9 cepas seleccionadas, mediante la realización de las

pruebas bioquímicas: Catalasa, Oxidasa, Agar Citrato Simmons, LIA (Agar de hierro lisina), TSI

(Agar tres azúcares hierro), MR-VP (Rojo de Metilo, Voges Proskauer), Agar Manitol Hipersalino

(Agar Chapman), Agar MacConkey, SIM (producción de H2S, formación de Indol y Movilidad)

y Tioglicolato.

7.6.4. Conservación de la cepa.

Se realizó en caldo BHI (Brain Heart Infusion), compuesto por 17,5 g/L de Infusión de cerebro y

corazón, 10 g/L de peptona, 2 g/L glucosa, 5 g/L de NaCl y 2.5 g/L de Fosfato disódico, se calentó

hasta completar su disolución, se adiciono 20% v/v de glicerol y se esterilizó en el autoclave

durante 20 minutos a 121°C.

7.7. Diseño experimental y Análisis estadístico

7.7.1. Diseño experimental.

Las características fisicoquímicas de la investigación se componen de 3 tratamientos, más uno de

control (testigo), todos por triplicado, para un tamaño de muestra total de 12 reactores (Tabla 2)

(Apéndice C).

Tabla 2.

Concentraciones de diésel aplicadas a los diferentes tratamientos.

Tratamiento Diésel adicionado

(ml)

Concentración de diésel

(mg kg-1 de suelo)

Testigo 0 0

1 200 2500

2 500 6100

3 800 9800

Nota: Concentraciones de diésel utilizadas. Por: González & Mora, 2019.


7.7.2. Análisis estadístico.

Mediante el análisis de varianza (ANOVA) se evaluaron las características químicas para

establecer diferencias significativas entre los tratamientos experimentales, además se realizó un

Análisis de Componentes Principales (ACP) para relacionar las diferentes variables químicas con

los 4 tratamientos y por último se realizó el Coeficiente de correlación de Pearson para las

características químicas y el índice de solubilización, para establecer la relación entre las variables.

Estos datos fueron procesados mediante la herramienta Microsoft Office Excel y XLSTAT.


8. Resultados y Análisis de Resultados

A continuación, se presentan los resultados obtenidos y análisis realizados para el logro de los

objetivos específicos propuestos.

8.1. Características físicas del suelo

8.1.1. Textura.

La técnica empleada para determinar la textura por sedimentación fue el método de Bouyoucos,

con el fin de determinar los porcentajes de los diferentes separados del suelo (arena, limo y arcilla)

(Tabla 3).

Tabla 3.

Resultados de textura por sedimentación.

Separado Unidad Resultado

Arcilla (< 0,002 mm) % 22,72

Limo (0,05 - 0,002 mm) % 2,73

Arena (2 – 0.05 mm) % 74,55

Textura Franco arcillo arenoso (FArA)

Nota: Porcentajes de la distribución de las partículas minerales en el suelo. Por: Quiroz, 2019.

Los valores dispuestos en la tabla 3 se ubicaron en el diagrama textural de la USDA,

herramienta para obtener las clases texturales en función de los porcentajes de arena, limo y arcilla,

lo cual indicó que la clase textural era franco arcillo arenoso (FArA), considerando que los

resultados se encontraban entre el rango de arena (≥45%), limo (<28%) y arcilla (20-35%)

(Matrero, 2014). Por otra parte, en los estudios realizados por Jamioy (2011), González (2014) y

Marín (2017) en el piedemonte llanero también reportaron la clase textural como franco arcillo

arenoso.


8.1.2. Densidad aparente.

La densidad aparente se estableció por el método del cilindro, como resultado se obtuvo 1,11

g/cm3, las densidades aparentes típicas del suelo franco arcillo arenoso fluctúan entre 1.0 y 1.7

g/cm3, siendo la densidad aparente ideal <1.40 (USDA, 1999), encontrándose entre estos

parámetros la densidad aparente de la muestra testigo del suelo evaluado, por otra parte este valor

es menor a los rangos normales (1.3 – 1.4 g/cm3 ) reportados por CORPOICA (2007) para este tipo

de suelo, y para los valores normales (1,2 a 1,4 g/cm3) de las propiedades físicas de los suelos más

frecuentes en Colombia mencionado por Murillo (s.f.) para suelos de textura FArA. Marín (2017)

reportó una densidad aparente (0.81-1.57 g/cm3), Villegas (2012) de 1.07 a 1,37g/cm3, Jamioy

(2011) de 1,12 y 1,70 g/cm3, González (2014) de 1,61 y 1,68 g/cm3 en suelos del piedemonte

llanero clasificados como FArA.

8.1.3. Densidad real.

La densidad real se determinó con el método del picnómetro, como resultado se obtuvo un valor

de 2,28 g/cm3, encontrándose entre el rango (2.11 a 2.68 g/cm3) que reporto Jamioy (2011) y

González (2014) de (2,56 a 2,68 g/cm3) en suelos del piedemonte llanero clasificados como FArA,

es inferior al rango dado Villegas (2012) de 2,38 a 2,69 g/cm3.

8.1.4. Porosidad.

La porosidad se determinó teniendo en cuenta la relación de la densidad aparente y la densidad

real, dando como resultado una porosidad de 51,57%, teóricamente se acepta como buena una

porosidad total promedia de alrededor del 50%, Kaurichev (1984) califica la porosidad total del

suelo como satisfactoria en un rango de 50-55%, además, se encuentra dentro del rango de valores

normales (47 a 54%) proporcionado por Murillo (s.f) para suelos de textura FArA. Igualmente, en

suelos del piedemonte llanero clasificados como FArA Villegas (2012) reportó la porosidad en un

rango de 44,08 a 55,04%, Marín (2017) encontró una porosidad total menor y mayor al 50%,

Jamioy (2011) encontró rangos de 27.84% a 51.97% y González (2014) reportó la porosidad menor

del 50%.


Según el estudio realizado por Jamioy (2011) la clasificación de la calidad física del suelo del

piedemonte de los llanos orientales de Colombia es alta en cuanto a densidad aparente (<1.4 - >1.2

g/cm3), media para arcilla (15-25%), baja en arena (>60 %) y limo (<20%).

8.2. Características químicas del suelo

Los resultados obtenidos de los parámetros químicos en los cuatro tratamientos indican que

algunos parámetros se vieron afectados negativamente por la presencia de diésel mientras que otros

no. El 61.11% de las variables disminuyeron sus valores con la contaminación del diésel en sus

diferentes concentraciones (Tabla 4), encontrándose el pH, CE, P, S, Ca, K, CIC, Na, Fe, Zn y Cu,

el restante, 38.88% incremento los valores con la presencia del contaminante, siendo el caso de la

MO, Al+H, Al, Mg, Mn, B y TPH.

Tabla 4.

Resultados de los parámetros químicos.

Determinación

Analítica Unidad Método Testigo T1 T2 T3

pH pH VC_R_004 Versión 03 5,37 5,3 5,2 5,28

CE dS/m NTC 5596:2008 0,65 0,36 0,26 0,25

MO % Walkey & Black 1,69 2,66 3,1 3,54

P mg/kg VC-R-007 Versión 02 34,35 13,93 7,19 12,93

S mg/kg Fosfato monobásico de

calcio

26,86 15,35 12,72 13,31

Al+H cmol(+)/kg KCl 0,05 0,16 0,21 0,21

Al cmol(+)/kg KCl 0 0,08 0,02 0

Ca cmol(+)/kg ID-R-072 Versión 5 4,28 3,48 3,38 3,05

Mg cmol(+)/kg ID-R-072 Versión 5 0,79 0,58 0,61 0,63

K cmol(+)/kg ID-R-072 Versión 5 0,46 0,35 0,33 0,35

Na cmol(+)/kg ID-R-072 Versión 5 0,15 <0,14 <0,14 <0,14

CIC cmol(+)/kg Suma de cationes 5,73 4,71 4,67 4,38

Fe mg/kg NTC 5526:2007 123,02 97,41 66,2 74,36



Mn mg/kg NTC 5526:2007 32,04 48,58 47,73 60,21

Zn mg/kg NTC 5526:2007 4,32 3,92 3 3,71

Cu mg/kg NTC 5526:2007 1,39 1,25 <1 <1

B mg/kg Fosfato monobásico de

calcio

0,33 0,25 0,38 0,45

TPH % Ultrasonido NMX-AA-

145 SCFI-2008 IR SM

5520C.F

0,004 3,7 5,26 6,6

Nota: Parámetros químicos evaluados, CE (Conductividad Eléctrica), MO (Materia Orgánica),

P (Fósforo disponible, Bray II), S (Azufre disponible), Al+H (Acidez intercambiable), Al

(Aluminio intercambiable), Ca (Calcio intercambiable), Mg (Magnesio Intercambiable), K

(Potasio intercambiable), Na (Sodio intercambiable), CIC (Capacidad de Intercambio Catiónico),

Fe (Hierro disponible, Olsen), Mn (Manganeso disponible, Olsen), Zn (Zinc disponible, Olsen),

Cu (Cobre disponible, Olsen), B (Boro disponible), TPH (Hidrocarburos Totales de petróleo). Por:

Quiroz, 2019.

En particular, el pH en todos los tratamientos estuvo en el rango de fuertemente ácido según

SSDS (2017), afectando la disponibilidad de fósforo debido a que frecuentemente hay una alta

fijación de este elemento volviéndolo insoluble, por la formación de fosfatos de aluminio y de

hierro (Jaramillo, 2002), la conductividad eléctrica, CE, entre 0 y 0.8 dS/m son aceptables para el

crecimiento de los cultivos en general (USDA, 1999), la capacidad de intercambio catiónico, CIC,

es baja (<10 cmol/kg) debido también al pH ácido (González, 2014).

El suelo no contaminado, usado como testigo presentó un pH ácido de 5,37 similar al pH de 5,3

reportado por Vanegas (2012) y se encuentra dentro del rango dado por Jamioy (2011) de 4,03 a

5,88 para suelos inceptisoles. El contenido de materia orgánica fue de 1,69%, el cual es inferior al

rango informado por Villegas (2012) de 2 a 3,1% en la muestra testigo y mayor en el tratamiento

3 y al de Rincón & Ligarreto (2010) entre 1,9 y 3%. Se obtuvo una capacidad de intercambio

catiónico de 5,73 cmol/kg y manganeso de 32,04 mg/kg valores similares al 5,02 cmol/kg y 33,7

mg/kg reportados por Vanegas (2012) respectivamente.


Según Gonzáles (2014) los valores de fósforo para la muestra testigo oscila entre bajo y medio

(15-40 mg/kg), el fósforo disponible de los tratamientos son bajos (<15 mg/kg), demostrando así

que la contaminación del diésel afecta negativamente el fósforo disponible en el suelo, es decir, la

disponibilidad de todos los nutrientes a las plantas está regulada por el pH del suelo, este afecta la

solubilidad de algunos elementos y por lo tanto afecta el desarrollo de la planta, confirmando por

la baja disponibilidad de fósforo obtenida (Jaramillo, 2002).

En un estudio realizado por (Jamioy, Menjivar, & Rubiano, 2015) realizaron una clasificación

de la calidad química del suelo inceptisol del piedemonte de los llanos orientales de Colombia, la

calidad química del suelo es alta en cuanto a pH (>5), Ca (>1.5 cmol/kg), Mg (>0.5 cmol/kg), Al+H

(<1.5 cmol/kg) y calidad alta para Fe en la muestra testigo (100-182 mg/kg) y media para los

diferentes tratamientos (50-100 mg/kg).

Para comprender, la relación e influencia existente entre la disponibilidad de P y la

contaminación artificial con diésel, se elaboró el coeficiente de correlación de Pearson (Apéndice

D), encontrando relaciones positivas con altos valores significativos entre P y CE (0.970), S y P

(0.987), K y P (0.995), Na y P (0.968), indicando que al incrementar una de estas variables, la otra

también aumenta, existe una relación negativa con alto valor significativo entre P y Al+H (-0.968)

indicando que al disminuir una variable la otra también disminuye. Por otra parte, se realizó el

Análisis de varianza (ANOVA) (Tabla 5), donde se puede observar que la significación (Valor

crítico para F) es mayor al nivel de significancia del 0,05, se puede analizar que las diferencias

entre las medias no son estadísticamente significativas y por lo tanto no hay relación entre las

diferentes variables.

Tabla 5.

Análisis de varianza (ANOVA) para las características químicas.

Origen de las

variaciones

Suma de

cuadrados

Grados de

libertad

Promedio de

los cuadrados F Probabilidad

Valor crítico

para F

Entre grupos 35424,60314 17 2083,800185 38,2519314 4,91844E-24 1,815540397

Dentro de los

grupos 2941,687017 54 54,4756855

Total 38366,29016 71

Nota: Análisis de varianza (ANOVA). Por: Quiroz, 2019.


Posteriormente, se elaboró el Análisis de Componentes Principales (ACP), seleccionando los

componentes F1 y F2 que explicaron el 94.23% de la variabilidad de los datos, el componente F1

con el 80,84% y el componente F2 con el 13,39%. En el Biplot (Figura 4) se observa las variables

activas (variables químicas) con relación a las observaciones activas (los 4 tratamientos).

Figura 4. Biplot para propiedades químicas de los diferentes tratamientos. Por: Quiroz, 2019.

En la figura 4 se puede observar que los tratamientos están ubicados en diferentes cuadrantes

(a excepción de T2 y T3), representando diferencias entre sí. La distribución de los vectores

permite distinguir cada tratamiento, igualmente indica que todas las propiedades son importantes,

mientras que los ángulos entre ellos representan la posible relación de las variables, dado que

ángulos agudos (menor de 90º) significan correlación positiva, ángulos rectos (90º) tienen

correlación nula y ángulos obtusos (mayor de 90º) la correlación es negativa. La ubicación positiva

de la variable Al incide en el T1, las variables negativas próximas a -1, como TPH, MO, Al+H y

Mn inciden en el tratamiento T2 y el B en el tratamiento T3, el testigo se relaciona de manera

directa con CE, CICE, S, P, K, Na, Mg, Cu, Fe, Zn, pH y Ca indicando una correlación positiva

entre ellas (González & Mora, 2019).

pH

CE

MOP

S

Al+H

Al

Ca

Mg

K

Na

CICE

Fe

Mn

Zn

Cu

B

TPH

Testigo

T1

T2

T3-1

-0,5

0

0,5

1

1,5

2

-2 -1,5 -1 -0,5 0 0,5 1

F2 (

13,3

9 %

)

F1 (80,84 %)

Biplot (ejes F1 y F2: 94,23 %)

Variables activas Observaciones activas


8.3. Capacidad solubilizadora de fosfato

A partir de las lecturas realizadas al día tres de incubación se obtuvo el índice de solubilización

presentado en la Tabla 6, se muestran los datos tomados.

Tabla 6.

Capacidad solubilizadora de fosfatos de las cepas seleccionadas en medio de cultivo

Pikovskaya.

Cepa Volumen

diésel (ml)

Diámetro de la

colonia (mm)

Diámetro total

del halo (mm)

Índice de

solubilización (I.S)

C1P* 500 8 23 2.875

C2P 500 6 10 1.666

C3P 500 6.5 32 4.923

C4P 500 7 30 4.285

C5P 200 5 25 5

C6P 800 3 27 9

C7P 500 3 21 7

C8P 500 2 22 11

C9P 500 7 10 1.428

Nota: Índice de solubilización de las cepas, *C1P= Cepa 1 Fosfatos. Por: Quiroz, 2019.

El total de cepas nativas recibidas, fue de 17, pero solamente nueve presentaron la capacidad

solubilizadora de fosfato con halos mayores a 10mm, las cepas C1P, C2P, C3P, C4P, C5P, C6P,

C7P y C8P, son bacilos Gram negativos identificados como Pseudomonas sp, a excepción de la

C9P, este es un bacilo Gram positivo, identificado como Bacillus sp, que también presento alto

potencial de solubilización, este último resultado coincide con los encontrados por Lara et al

(2011), quienes aislaron bacterias con capacidad solubilizadora de fosfatos en suelos de Montería

(Colombia), cultivados con guayaba agria Psidium araca, encontrando que la mayoría (93%)

correspondían a bacilos Gram negativos.

El género Bacillus es el más representativo del grupo de solubilizadores de fosfato, se encuentra

presente en el suelo, agua, vegetales y aire, son bacilos aerobios y anaerobios facultativos, Gram


positivos pertenecientes a la familia Bacillaceae y catalasa positiva (Layton, Maldonado, Monroy,

Corrales, & Sánchez, 2011), evidente en la Tabla 9. Entre las especies potencialmente

solubilizadoras se encuentran: Bacillus licheniformes, B. pumilus, B. subtilis y B. brevis. (Arévalo

& Moreno, 2014).

Teniendo en cuenta la tabla 6, C8P tuvo el I.S más alto con un valor de 11, seguido de C6P con

un valor de 9, C2P y C9P tuvieron el I.S más bajo con valores de 1.666 y 1.428 respectivamente,

además se puede observar que la capacidad solubilizadora de fosfatos no se puede medir solamente

con el diámetro de halo, ya que la cepa C3P tuvo el diámetro de halo más alto (32 mm) y no está

dentro de los índices más altos de solubilización.

De acuerdo con los estudios realizados por (Niklitscheck, 2008), (Becerra, Quintero, Martínez,

& Matiz, 2011), (Constanza, Arévalo, & Moreno, 2014) y (Lara, Esquivel, & Negrete, 2011)

obtuvieron índices de solubilización entre 2.4 y 4.2 destacándolos como altos y con buena

capacidad de solubilización de fosfatos, a partir de estos estudios se puede afirmar que la mayoría

de las cepas seleccionadas (77.77 %) tienen buena capacidad solubilizadora de fosfatos a

excepción de C2P y C9P.

Teniendo en consideración el volumen del diésel, el 78% de las cepas seleccionadas por su alta

capacidad de solubilizar fosfato pertenecen a la contaminación de 500 ml, 11% a 200 ml y 11% a

800 ml, demostrando así que las cepas seleccionadas tienen mayor capacidad de solubilizar fosfato

en una contaminación de 6100 mg de diésel por kg de suelo (500 ml), además se realizó la

correlación de Pearson (Tabla 7), dando una correlación positiva (0.31) con tendencia a 0 entre el

volumen del diésel y el índice de solubilización, interpretando que la correlación entre estas dos

variables es débil y que por tanto, una variable no afecta significativamente a la otra, es decir, la

capacidad de solubilizar fosfato por parte de las Pseudomonas sp. no dependen de la concentración

del diésel.

Tabla 7.

Coeficiente de correlación de Pearson entre el volumen del diésel y el índice de solubilización.

Diésel I.S

Diésel 1

I.S 0,31 1

Nota: Coeficiente de correlación de Pearson. Por: Quiroz, 2019.


En la figura 5 se puede observar el halo de solubilización de C3P y C9P, mostrando así el halo

con mayor y menor diámetro de las cepas seleccionadas.

Figura 5. Halo de solubilización de la C3P (lado izquierdo con 32 mm) y C9P (lado derecho

con 10 mm). Por: Quiroz, 2019.

En el apéndice E se encuentra el registro fotográfico de C1P, … C9P, sobre medio de cultivo

King B sin exposición a luz ultravioleta, a través de la luz ultravioleta, tinción de Gram y el halo

de solubilización.

8.4. Caracterización fenotípica de las cepas aisladas

A las 9 cepas seleccionadas se les realizó una caracterización macroscópica (descripción de la

colonia) y microscópica (tinción de Gram) como se observa en la Tabla 8.

Tabla 8.

Caracterización macroscópica y microscópica de las cepas seleccionadas en medio de cultivo

Agar King B.

Cepa Código cepa Características

macroscópicas

Características

microscópicas

C1P -10-1A 500 D T3 Colonia cremosa, forma

circular, color verde

fluorescente.

Bacilos Gram -



C2P 10-1B 500 D T1 Colonia cremosa, forma


fluorescente.

Bacilos Gram -

C3P 10-1B 500 D T2 Colonia cremosa, forma


fluorescente.

Bacilos Gram -

C4P 10-1A 500 DM2 Colonia cremosa, forma


fluorescente.

Bacilos Gram -

C5P 10-2C 200 DM2

T1 T4

Colonia cremosa, forma


fluorescente.

Bacilos Gram -

C6P

10-3 CABA 800 D

T2 T1


circular, color beige.

Bacilos Gram -

C7P 10-4B 500 D T4 T1 Colonia cremosa, forma


Bacilos Gram -

C8P 10-2A 500 D T1

T1



Bacilos Gram -

C9P 10-1B 500 DM2

T1


irregular, color beige.

Bacilos Gram +

Nota: Características físicas de las cepas estudiadas. Por: Quiroz, 2019.

8.5. Caracterización bioquímica

A las nueve cepas seleccionadas se les realizó la caracterización bioquímica, permitiendo obtener

su capacidad metabólica (Tabla 9).


Tabla 9.

Caracterización bioquímica de las cepas seleccionadas en medio de cultivo Agar King B.

Prueba Bioquímica

Cep

a

Oxid

asa

Cat

alas

a

Cit

rato

de

Sim

mons

TS

I

IA

Sulf

uro

Indol

Movil

idad

Tio

gli

cola

to

Pru

eba

Rojo

Met

ilo

Voges

-Pro

skau

er

Man

itol

Mac

Conkey

C1P + - + A KK - - - AE - - - -

C2P + - + A KK - - - ANAF - - - -

C3P + - + D KK - - - AE - - - -

C4P + - + A KK - - - AE - - - -

C5P + - + C KK - - - ANAF - - - -

C6P + - + B KK - - - ANAF - - - -

C7P + - + A KK - - - ANAF - - - -

C8P + - + A KK - - - ANAF - - - -

C9P + - - C KA - - - ANAF - - - +

Nota: Caracterización bioquímica de las cepas, + (positivo), - (negativo), A (sin fermentación

de azúcar), B (control: No viro a ningún color), C (fermenta glucosa, pero no fermenta lactosa, ni

sacarosa), D (fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa), KK (Descarboxilación de la lisina: Positivo),

KA (Descarboxilación de la lisina: Negativa, fermentación glucosa), AE (aerobio estricto), ANAF

(anaerobio facultativo). Por: Quiroz, 2019.

Todas las cepas presentaron oxidasa positiva, catalasa negativa, rojo de metilo, Voges-

Proskauer y Manitol negativo, MacConkey negativo para las 8 primeras cepas, medio de cultivo

selectivo para bacterias Gram negativas, la C9P, creció sobre agar MacConkey debido a que se

trata de un microorganismo bacilo Gram positivo que fermenta la glucosa y es anaerobio

facultativo, las C1P a la C8P presentaron descarboxilación de la lisina positivo, C1P, C3P y C4P

son microorganismos aerobios estrictos, es decir, las cepas restantes son anaerobios facultativos,

es decir, crecen en todo el medio de cultivo tioglicolato, todas las cepas presentan sulfuro, indol y


movilidad negativa, las cepas C1P, C2P, C4P, C7P y C8P no fermentan azucares, C5P y C9P

fermentan la glucosa y C3P fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa, por último la cepa C9P no usa

el citrato como fuente de carbono.

8.6 Conservación de la cepa

Se realizó la preservación de las cepas por congelación a largo plazo, en caldo Infusión Cerebro

Corazón –BHI-, adicionado con 20% glicerol estéril y almacenadas en viales estériles a -18°C.


Conclusiones

• Se aportó insumos para el macroproyecto “Comportamiento de las características físicas,

químicas y microbiológicas en suelos de vocación agrícola artificialmente contaminados con

Gasolina y Diésel en el piedemonte llanero del Municipio de Cumaral (Meta)”, aportando

información de las características físicas y químicas de un suelo del piedemonte llanero

contaminado artificialmente con diferentes volúmenes de diésel y la capacidad de solubilización

de fosfatos que tienen las cepas nativas aisladas a partir de los reactores.

• Las características físicas y químicas permitieron determinar el tipo de suelo de estudio,

como inceptisol, ya que presentó textura Franco arcillo arenosa (FArA), densidad aparente ideal

para el tipo de suelo, densidad real dentro de los parámetro normales para el suelo FArA, porosidad

satisfactoria, pH fuertemente ácido afectando la disponibilidad de fósforo volviéndolo insoluble,

la presencia del diésel en el suelo disminuyo los valores de pH, CE, P, S, Ca, K, CIC, Na, Fe, Zn

y Cu en los diferentes tratamientos y aumento los valores de MO, Al+H, Al, Mg, Mn, B y TPH.

• Se logró determinar que las bacterias del género Pseudomonas sp. tienen una gran

viabilidad y alta capacidad para solubilizar fosfatos, el 78% pertenecen al reactor artificialmente

contaminado con 500 ml de diésel, demostrando así que las cepas seleccionadas tienen mayor

capacidad de solubilizar fosfato en esa concentración, sin embargo, dicha capacidad no depende

de la concentración de diésel.

• Se puede concluir que la solubilidad de fosfatos no se puede medir solamente con el

diámetro de halo, ya que C3P tuvo el diámetro de halo más alto (32 mm) y no está dentro de los

índices más altos de solubilización. La C8P tuvo el I.S. más alto con un valor de 11 y C9P el más

bajo con un valor de 1.428.

• Las bacterias del género Pseudomonas sp. y Bacillus sp, están presentes en el suelo

inceptisoles del piedemonte llanero, demostrando a la vez la capacidad para solubilizar fosfato en

condiciones de contaminación de diésel a diferentes concentraciones, siendo una gran alternativa

para permitir la biodisponibilidad de este nutriente esencial a las plantas.


Discusión de Resultados y Recomendaciones

La caracterización física mostró que la clase textural era Franco arcillo arenoso (FArA),

considerando que los resultados se encontraban entre el rango de arena (≥45%), limo (<28%) y

arcilla (20-35%) (Matrero, 2014), además concuerda con los estudios realizados en el piedemonte

llanero, la densidad aparente es ideal para el tipo de suelo según la USDA, la densidad real se

encuentra dentro de los rangos reportados por Jamioy (2011) y González (2014) en el piedemonte

llanero y la porosidad es satisfactoria según Kaurichev (1984).

Las variables químicas se vieron afectadas por la contaminación del diésel a diferentes

concentraciones, el 61.11% (pH, CE, P, S, Ca, K, CIC, Na, Fe, Zn y Cu) de las variables

disminuyeron sus valores, el otro 38.88% (MO, Al+H, Al, Mg, Mn, B y TPH) aumentaron sus

valores. El pH en todos los tratamientos estuvo en fuertemente ácido según SSDS (2017) afectando

la disponibilidad de fósforo volviéndolo insoluble (Jaramillo, 2002), la CE es no salino aceptable

para el crecimiento de los cultivos (USDA, 1999) y el intercambio catiónico es bajo debido al pH

ácido (González, 2014).

Según González (2014) los valores de fósforo para los diferentes tratamientos son bajos,

demostrando así que la contaminación del diésel afecta negativamente el fósforo disponible en el

suelo, por otra parte el pH controla la disponibilidad de los nutrientes de la planta, afectando la

solubilidad y por lo tanto el desarrollo de la planta, la mayor solubilidad para el fósforo se

encuentra entre 5.6 y 6.6 (Jaramillo, 2002), valores superiores a los encontrados en los diferentes

tratamientos, por lo que la solubilidad de fósforo por parte de la planta se puede ver afectada.

De las nueve cepas recibidas, previamente identificadas como Pseudomonas sp, y Bacillus sp,

presentaron la capacidad de solubilizar fosfatos sobre medio Pikovskaya, el 89% se identificaron

como bacilos Gram negativos, pertenecientes al género bacteriano Pseudomonas sp. a excepción

de C9P que es un bacilo Gram positivo perteneciente al género bacteriano Bacillus sp,

comprobando la viabilidad de estos géneros bacterianos para solubilizar fosfato como se menciona

en los estudios realizados por Constanza et al (2014), Lara et al (2011), (Patiño & Sanclemente,

2014) y (Sánchez, García, Romero, & Bonilla, 2014), estos géneros bacterianos no solo tienen la


capacidad de solubilizar fósforo en ambientes naturales, sino también en suelos contaminados a

diferentes concentraciones de diésel como se demuestra en el presente estudio.

Teniendo en cuenta los estudios realizados por Niklitscheck (2008), Becerra et al (2011),

Constanza et al (2014) y Lara et al (2011) que obtuvieron índices de solubilización entre 2.4 y 4.2

destacándolos como altos y con buena capacidad de solubilización de fosfatos, se puede afirmar

que la mayoría de las cepas seleccionadas (77.77%) tienen buena capacidad solubilizadora de

fosfatos pertenecientes al género Pseudomonas sp, ya que el índice de solubilización se encuentra

en un rango de 2.875 a 11, por otra parte el 78 % de las cepas estudiadas pertenecen al reactor

artificialmente contaminado con 500 ml de diésel, demostrando así que las cepas seleccionadas

tienen mayor capacidad de solubilizar fosfato en esa concentración, sin embargo dicha capacidad

no depende de la concentración de diésel, como se puede observar en la correlación del índice de

solubilización y la concentración del diésel.

El coeficiente de correlación de Pearson para las características químicas mostró una relación

positiva con altos valores significativos entre el P y la CE, S, K y Na, indicando que al aumentar

una variable la otra también lo hace, además se da una relación negativa entre el P y Al+H, es decir,

cuando disminuye una la otra también. La correlación del índice de solubilización y la

concentración de diésel mostró una relación positiva (0.31) con tendencia a 0, mostrando una

correlación débil, ya que una variable no afecta significativamente a la otra, es decir, la capacidad

de solubilizar el fósforo no está relacionada directamente con la concentración de diésel, ya que

de las 7 cepas que tienen alta capacidad de solubilizar fosfato, 5 pertenecen a la concentración de

500 ml, una a 200 ml y una a 800 ml, demostrando que las bacterias del género Pseudomonas sp,

tienen una alta capacidad para solubilizar fosfatos en ambientes contaminados a diferentes

concentraciones de diésel.

En la investigación realizada se demuestra una vez más la capacidad que tienen las bacterias

del género Pseudomonas sp. para solubilizar fósforo en el suelo, específicamente en el suelo del

piedemonte llanero, siendo una buena opción para biorremediación de suelos contaminados por

hidrocarburos, ya que la solubilización no solo se da en suelos naturales, sino también es suelos

contaminados a diferentes concentraciones de diésel, como se demuestra en el presente estudio,

ayudando a degradar el contaminante como se muestra en los estudios realizados por (Loya, 2013),

(Muñoz, 2016), Narvaez et al (2008) y (Arrieta, 2011).


Teniendo en cuenta la pregunta problema y el estudio realizado, la capacidad para solubilizar

fósforo por parte de las Pseudomonas sp. no varía ni depende de la concentración del diésel como

se evidencia en la correlación de Pearson, por lo tanto, las bacterias del género Pseudomonas sp.

tienen una alta capacidad para solubilizar fósforo en el suelo del piedemonte llanero contaminado

a diferentes volúmenes de diésel.

En la investigación realizada se aprueba la hipótesis planteada, ya que, a mayor concentración

de diésel, mayor es el porcentaje de materia orgánica presente en el suelo, como se evidencia en

los estudios realizados por Pérez et al (2015) y Rojas et al (2010) quienes encontraron que una

proporción más alta de diésel aumentó la cantidad de bacterias, además que la variedad de

microrganismos se da en función de la cantidad de diésel, por otra parte la capacidad que tiene las

Pseudomonas sp. para solubilizar fósforo es alta en cualquiera de las concentraciones evaluadas,

aunque la mayoría (el 78 %) de las cepas estudiadas pertenecen a la concentración de 500 ml.

Se recomienda seguir investigando sobre el uso de estas bacterias nativas, a diferentes

concentraciones de diésel y otros combustibles derivados de petróleo, que permitan establecer el

comportamiento de estas.


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