diversidade de fungos endofÍticos de cuscuta sp. e a...
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UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES
ROBERTA SOMMERS RIBEIRO STABOLAITZ
DIVERSIDADE DE FUNGOS ENDOFÍTICOS DE Cuscuta sp.
E A PRODUÇÃO DE ENZIMAS CELULOLÍTICAS
Mogi das Cruzes, SP
2010
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UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES
ROBERTA SOMMERS RIBEIRO STABOLAITZ
DIVERSIDADE DE FUNGOS ENDOFÍTICOS DE Cuscuta sp.
E A PRODUÇÃO DE ENZIMAS CELULOLÍTICAS
Orientador: Prof. Dr. João Lúcio de Azevedo
Co-orientador: Prof. Dr. Welington Luiz de Araújo
Mogi das Cruzes, SP
2010
Dissertação apresentada ao curso de Mestrado do Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da Universidade de Mogi das Cruzes, como requisito parcial para obtenção do título de mestre.
DEDICATÓRIA
Ao meu esposo, Jairo Alves Santos, e ao meu filho, Pedro Henrique
Stabolaitz Santos, por terem suportado com carinho e compreensão todos os
momentos de ausência.
Aos meus pais, Jandira e Alberto, porque sem o conforto de seu amor e
apoio, a caminhada teria sido muito mais árdua, ofereço.
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. João Lúcio de Azevedo, pela orientação valiosa, a qual contribuiu
para meu crescimento profissional e pessoal.
Ao Prof. Dr. Welington Luiz de Araújo pela amizade e constante apoio e sugestões imprescindíveis para o desenvolvimento desse trabalho.
À todos os professores de pós-graduação em Biotecnologia, pela ajuda durante as disciplinas, pela dedicação e pelos bons conselhos.
À Maria Carolina Quecine pelas sugestões e auxílio na parte estatística do trabalho.
Ao meu esposo Jairo, pelo seu amor, companheirismo e apoio.
À minha mãe Jandira, que nestes anos me apoiou nos maus momentos, se
preocupando com minha saúde e de minha família, e dando todo o suporte para que eu encontrasse forças para concluir esta etapa tão importante em minha vida.
Aos amigos do Núcleo Integrado de Biotecnologia pela convivência agradável,
pela união e pelos bons momentos que passamos estes anos.
Ao Governo do Estado de São Paulo pela ajuda financeira cedida através do Projeto Bolsa-Mestrado.
A UMC por auxiliar o meu crescimento profissional e educacional.
RESUMO
Fungos endofíticos foram isolados de caules de Cuscuta sp., com o objetivo de investigar a diversidade de endófitos e a produção de celulase. As coletas foram realizadas em três diferentes áreas quanto à vegetação local e em três épocas do ano. Considerando as características morfológicas das colônias e a observação em microscópio ótico, foi possível identificar nove gêneros: Aspergillus, Bipolaris, Chaetomium, Cladosporium, Colletotrichum, Fusarium, Penicillium, Paecilomyces e Ulocladium. Os gêneros isolados que apresentaram maior frequência foram: Cladosporium, Penicillium e Ulocladium, sendo Penicillium o gênero predominante. Quando testados quanto à atividade celulolítica pelo uso de carboximetilcelulose (CMC) o halo indicador da degradação da CMC e foi observada em apenas 12 isolados, ou seja, aproximadamente 15% dos fungos estudados. Destes, 8 pertencem ao gênero Penicillium. Nas condições expostas aqui neste trabalho, poucos dos fungos endofíticos associados à Cuscuta sp. apresentaram a capacidade de produzir celulase, sugerindo que sua comunidade fúngica endofítica não está envolvida na capacidade de penetração na planta hospedeira.
Palavras-chave: fungos endofíticos, Cuscuta sp., celulase
ABSTRACT Endophytic fungi were isolated from stems of Cuscuta sp. In order to investigate the diversity of endophytes and the production of cellulase. Samples were collected in three different areas on the local vegetation and in three seasons. Considering the characteristics of the colony and observation by optical microscopy, it was possible to identify nine genera, Aspergillus, Bipolaris, Chaetomium, Cladosporium, Colletotrichum, Fusarium, Penicillium, Paecilomyces and Ulocladium. The genera isolated which showed a higher frequency were Cladosporium, Penicillium and Ulocladium, Penicillium was the predominant genus. When tested for cellulolytic activity by the use of carboxymethylcellulose (CMC) indicator of the halo of CMC degradation was observed in only 12 isolates, or approximately 15% of the fungi studied. Of these, 8 belong to the genus Penicillium. In the circumstances described in this work, few of endophytic fungi associated with Cuscuta sp. had the ability to produce cellulase, suggesting that fungal endophytes your community is not involved in the ability to penetrate the host plant. Keywords: endophytic fungi, Cuscuta sp. Cellulase
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1: Cuscuta sp. parasitando Hibiscus sp........................................ 19
Figura 2: Cuscusta sp. parasitando Hibiscus sp.. Flecha mostrando haustórios. ................................................................................ 19
Figura 3: Exemplo de vegetação encontrada nos locais de coleta. Em a área de baixo grau de antropização. Em b área de vegetação secundária. Em c área fortemente antropizada. ...................... 30
Figura 4: Espécies hospedeiras de Cuscuta sp. e localização das amostras coletadas................................................................... 30
Figura 5: Frequência de colonização e erro padrão dos fungos endofíticos isolados de Cuscuta sp., comparando as épocas e os locais de coleta. ................................................................ 34
Figura 6: Frequência de colonização de fungos endofíticos e erro padrão nos três locais de coleta de Cuscuta sp. ..................... 36
Figura 7: Exemplos de colônias fúngicas isoladas de Cuscuta sp., agrupadas em 20 morfotipos.................................................... 38
Figura 8: Porcentagem de cada morfotipo dos fungos isolados de Cuscuta sp................................................................................ 38
Figura 9: Macro e micromorfologia de alguns dos fungos endofíticos isolados de Cuscuta sp. Estruturas reprodutivas observadas ao microscópio ótico em aumento de 400x e 1000x................. 39
Figura 10: População relativa de cada gênero de fungo endofítico isolado, e identificado, de Cuscuta sp....................................... 40
Figura 11: Porcentagem dos fungos endofíticos isolados, e identificado, comparando os locais de coleta de Cuscuta sp........................ 40
Figura 12: Porcentagem de fungos endofíticos isolados de Cuscuta sp. e suas respectivas respostas à produção de celulase............ 42
Figura 13: Atividade da celulase de fungos isolados de caules de cuscuta, cultivados em meio sintético com carboximetilcelulose por 7 dias a 28º C. As setas indicam formação de halo indicador da degradação de CMC. Em a, não houve degradação de CMC, b e c, halo indicando a degradação de CMC.................................................................
42
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
BDA Batata dextrose ágar
CF Frequência de colonização
CMC Carboximetilcelulose
EG Endoglicanase
EMBRAPA Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
HEC Hidroxietilcelulose
PR População relativa
SUMÁRIO
1 APRESENTAÇÃO ........................................................................................ 11
2 INTRODUÇÃO ............................................................................................. 13
2.1 Microrganismos endofíticos ........................................................................ 13
2.1.1 Fungos endofíticos ................................................................................... 14
2.2 Família Cuscutaceae .................................................................................. 16
2.2.1 Aspectos botânicos e ecológicos ............................................................. 16
2.2.2 Fungos endofíticos isolados de Cuscuta sp. ........................................... 20
2.3 Celulases .................................................................................................... 21
2.3.1 Endo-1,4- β-glicanase (EC 3.2.1.4) ......................................................... 23
2.3.2 Exo-β-1,4-glicanase (EC 3.2.1.91)........................................................... 24
2.3.3 β-D-glicosidase glicohidrolase (EC 3.2.1.21)............................................ 24
2.3.4 Fungos produtores de celulases .............................................................. 25
3 OBJETIVOS .................................................................................................. 28
3.1 Objetivo Geral ............................................................................................. 28
3.2 Objetivos Específicos ................................................................................. 28
4 MÉTODO....................................................................................................... 29
4.1 Material vegetal............................................................................................ 29
4.2 Desinfecção superficial ............................................................................... 31
4.3 Isolamento dos fungos endofíticos de Cuscuta sp. .................................... 31
4.4 Análise dos dados ...................................................................................... 32
4.5 Análise da diversidade de fungos associados à Cuscuta sp. ..................... 33
4.5.1 Identificação dos fungos endofíticos isolados ......................................... 33
4.6 Produção de endoglicanase ....................................................................... 33
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................... 34
5.2 Isolamento de fungos endofíticos ............................................................... 34
5.3 Identificação de fungos endofíticos ............................................................ 37
5.4 Produção de celulase (endoglicanase) ...................................................... 41
6 CONCLUSÕES E SUGESTÕES .................................................................. 43
REFERÊNCIAS ................................................................................................. 44
11
APRESENTAÇÃO
Fungos endofíticos estão associados a muitas espécies de vegetais. Ocupam
espaços intercelulares, o interior de tecidos vasculares ou mesmo intracelularmente.
São encontrados nos mais variados órgãos vegetais como folhas, ramos, caules,
raízes e estruturas florais. Competem por espaço e nutrientes com outros
microrganismos, até mesmo com os patógenos, podendo assim, reduzir o
aparecimento de doenças, além de obter nutrientes e proteção para a sua própria
sobrevivência. Fungos endofíticos possuem certas características de interesse
biotecnológico tais como a produção de enzimas, fármacos, hormônios de
crescimento entre outras.
A família Cuscutaceae possui gêneros que ocorrem em geral, em regiões
tropicais, sendo conhecida como fios-de-ouro, fios-de-ovos, cipó-dourado, cipó-
chumbinho, cuscuta, ou xirimbeira. São parasitas obrigatórias e invadem o xilema de
seus hospedeiros por meio de haustórios.
Em vista da relevante importância que têm os endófitos para as plantas, o
estudo das comunidades endofíticas de plantas ainda pouco investigadas, como a
Cuscuta sp., amplia as possibilidades de descoberta de novos microrganismos de
interesse biotecnológico. Uma vez que as cuscutas apresentam propriedades de
penetração em plantas, pela produção de celulases, possivelmente os
microrganismos endofíticos associados a estes sejam produtores de celulases
também.
O estudo da diversidade da comunidade endofítica de cuscuta, e a
investigação de fungos celulolíticos, foram os objetivos principais que originaram a
12 ideia deste trabalho. Fatores abióticos e bióticos podem exercer pressões seletivas
que favoreçam um ou outro endofítico em um dado ambiente. Assim, um hospedeiro
pode hospedar diferentes comunidades endofíticas de microrganismos, dependendo
da localização e condição às quais está sendo submetido.
Com base no exposto, o presente trabalho objetivou: (i) isolar e caracterizar a
comunidade de fungos endofíticos dos caules de Cuscuta sp., de três áreas de
vegetação característica: área de baixo grau de antropização, área de vegetação
secundária e área fortemente antropizada; (ii) Identificar morfologicamente os fungos
endofíticos; (iii) verificar e avaliar a produção de enzimas celulolíticas pelos
endófitos.
Dessa forma, é esperado que esse trabalho possa vir a contribuir para
investigações futuras acerca da relação de fungos endofíticos com a planta
hospedeira.
13
2 INTRODUÇÃO
2.1 Microrganismos endofíticos
Os microrganismos que em algum período de seu ciclo de vida habitam o
interior de vegetais, são denominados microrganismos endofíticos ou simplesmente
endófitos (AZEVEDO et al., 2002; ARNOLD, 2005). Estes se caracterizam por não
causarem danos à planta hospedeira e podem até mesmo proporcionar benefícios
ao vegetal. São representados principalmente por fungos e bactérias e podem ser
encontrados em órgãos e tecidos vegetais como folhas, ramos e raízes (AZEVEDO
et al. 2002, NETO et al., 2002). Os endófitos são potencialmente úteis na agricultura
e na indústria. Podem ser utilizados como vetores para introdução de genes de
interesse nas plantas, como agentes inibidores de pragas e patógenos e como
fontes de metabólitos primários e secundários (AZEVEDO et al., 200; NETO et al.,
2002; SILVA et al., 2006; SOUZA et al., 2004).
As comunidades endofíticas variam de acordo com o hospedeiro e as
condições ambientais (KOSKELA et al., 2001) e podem interagir no interior da planta
hospedeira. O desequilíbrio desta interação pode afetar o comportamento de todos
os microrganismos presentes, permitindo que microrganismos oportunistas
manifestem seu potencial patogênico no hospedeiro (AZEVEDO et al., 2000;
KOSKELA et al., 2001).
14 O primeiro registro a respeito de microrganismos endofíticos foi feito por Bary
em 1866, e foram descritos novamente, apenas em 1904, na Alemanha (ARAÚJO et
al., 2008; AZEVEDO, 1999). Trabalhos mais direcionados começaram a ser
realizados por volta de 1940. Até então se conhecia pouco sobre as verdadeiras
funções de microrganismos endofíticos, talvez, pelo fato destes não produzirem em
seus hospedeiros estruturas externas visíveis (AZEVEDO et al., 2000; NETO et al.,
2002).
Já no final dos anos 70 do século XX, foi possível confirmar após vários
estudos que os microrganismos endofíticos possuem algumas funções fundamentais
para a defesa de seus hospedeiros, tal como a relação mutualística onde o endófito
recebe nutrientes e proteção da planta hospedeira e produz compostos químicos,
tais como enzimas, alcalóides que protegem e auxiliam a planta (ALMEIDA et al.,
2005; NETO et al., 2002; SILVA et al., 2006).
2.1.1 Fungos endofíticos
Os fungos endofíticos estão associados a muitas espécies de vegetais. Todas
as plantas em ecossistemas naturais parecem ser simbióticas com fungos
endofíticos (RODRIGUEZ et al., 2009). A cada espécie de planta examinada até
agora, pelo menos uma espécie de fungo endofítico foi encontrada (ARNOLD,
2005). O número de espécies de microrganismos endofíticos varia
consideravelmente e geralmente depende das técnicas e recursos utilizados nas
pesquisas, o que permite ou não o desenvolvimento de certas espécies in vitro
15 (HYDE & SOYTONG, 2008). Dentro do vegetal, estes endófitos ocupam espaços
intercelulares, o interior de tecidos vasculares ou mesmo intracelularmente. São
encontrados nos mais variados órgãos vegetais como folhas, ramos, caules, raízes e
estruturas florais, tais como pólen, ovários, estames e anteras (NETO et al., 2002;
SILVA et al., 2006). Apesar dessa ampla ocorrência de endófitos, muitos destes
parecem ser especializados para determinados tecidos hospedeiros (ARNOLD,
2005).
Os microrganismos endofíticos podem penetrar na planta hospedeira por
meio dos estômatos ou por ferimento e/ou secretando enzimas hidrolíticas que
permitem a colonização (NETO et al., 2002; SILVA et al., 2006). No interior do
vegetal, os fungos endofíticos competem por espaço e nutrientes com outros
microrganismos, até mesmo com os patógenos, podendo assim, reduzir o
aparecimento de doenças (PIMENTEL et al., 2006). Podem trazer vários benefícios
para esta, além de obter nutrientes e proteção para a sua própria sobrevivência.
Algumas espécies de fungos endofíticos são capazes de sintetizar compostos
que inibem a herbivoria, enquanto que outras podem produzir fitormônios como a
auxina que induz o aumento do sistema radicular e consequentemente melhora o
crescimento da planta hospedeira (AZEVEDO et al., 2000; MACCHERONI Jr. et al.,
2004). A presença dos endófitos, em algumas vezes leva alterações bioquímicas e
histológicas do vegetal, podendo assim dificultar a penetração de patógenos, e
aumentando a resistência da planta (MACCHERONI Jr. et al., 2004).
Produtos de valor econômico, como fármacos tais como novos antibióticos e
produtos anticancerígenos, também têm sido descobertos a partir de fungos
endofíticos. Um exemplo é o taxol, um diterpenóide utilizado contra certos tipos de
16 câncer e que além de ser produzido por alguns vegetais, também é produzido por
fungos que habitam endofiticamente esta planta (AZEVEDO, 1999).
Os fungos endofíticos também são muito eficientes no controle de pragas na
agricultura. É uma alternativa que se tem mediante a necessidade de reduzir o
consumo de agroquímicos (AZEVEDO et al., 2002; ARAÚJO et al., 2008). Pimentel
et al., (2006) descreveram de plantas de erva-mate, fungos endofíticos com
potencial de biocontrole que segundo os autores deveriam ser testados quanto à
capacidade de induzir proteção contra pragas e doenças.
2.2 Família Cuscutaceae
2.2.1 Aspectos botânicos e ecológicos
A família Cuscutaceae é representada por plantas conhecidas como: fios-de-
ouro, fios-de-ovos, cipó-dourado, cipó-chumbinho, cuscuta, ou xirimbeira. São
parasitas obrigatórias com aproximadamente 150 espécies diferentes distribuídas
em todo o mundo, sendo mais comum nas Américas (LANINI et al., 2002). Em geral
são originárias da Europa, mas algumas espécies são nativas da América do Sul,
como a Cuscuta racemosa que é originária do Chile (PEREIRA, 1998).
Atualmente a espécie Cuscuta pertence à Família Cuscutaceae, mas alguns
autores a classificam na Família Convolvulaceae. Certos autores também divergem
17 em relação à classificação da Família Cuscutaceae, alguns relatam apenas um
gênero (Cuscuta) enquanto outros autores consideram dois: Cuscuta e Grammica
(JAYASINGHE et al., 2004; STEFANOVIC & OLMSTEAD, 2004; SWIFT, 2005;
FATHOMLLA & DUHOKI, 2008).
As cuscutas não possuem folhas, nem sistema radicular verdadeiro. Seus
caules (Fig. 1) são em forma de fios ou cordões alaranjados, algumas vezes
esbranquiçados, com várias ramificações, e o crescimento é indeterminado,
variando com a espécie e compatibilidade com o hospedeiro (COSTEA & TARDIF,
2006). Quando se fixa a um hospedeiro, enrola-se à volta do tronco do mesmo e
produz os haustórios (Fig. 2). A partir daí começa a extrair nutrientes e água do
hospedeiro, e sua ligação com solo cessa (PEREIRA, 1998; LANINI et al., 2002).
Embora a cuscuta seja capaz de realizar fotossíntese, obtém todas as suas energias
a partir da planta hospedeira (LANINI e KOGAN, 2005; NICE et al., 2005; SWIFT,
2005). A plântula pode sobreviver vários dias sem um hospedeiro, mas se um não é
encontrado dentro de 5 a 10 dias, ela irá morrer. Caules de cuscuta que foram
destacados da planta hospedeira já foram descritos por terem sobrevivido vários
dias (PRATHER & TYRL, 1993; LANINI et al., 2002; COSTEA & TARDIF, 2006).
São consideradas plantas anuais, reproduzindo-se, principalmente, por
sementes e/ou vegetativamente por pequenos pedaços de ramos que continuam
presos em partes da hospedeira. As sementes variam de tamanho, cor e forma.
(FATHOΜLLA et al., 2008). Cada planta é capaz de produzir milhares de sementes
e geralmente apenas cerca de 5% germina no ano seguinte à sua produção. O
restante pode permanecer latente, mas viáveis, no solo por mais de 20 anos,
dependendo da espécie e das condições ambientais (PRATHER & TYRL, 1993;
PEREIRA, 1998; LANINI et al., 2002; NICE et al., 2005). A temperatura favorável do
18 solo para a germinação está em um intervalo de 15 a 38°C, com um ótimo em torno
de 30°C (LANINI & KOGAN, 2005) e ocorre independent emente de qualquer
influência da planta hospedeira. O clima ideal para o desenvolvimento das cuscutas
é do temperado até o subtropical, com C. campestri exibindo a mais ampla gama
climática. A preferência para este clima está provavelmente relacionada com o ciclo
de dormência das sementes no solo (COSTEA & TARDIF, 2006).
Cuscuta sp. pode ser encontrada parasitando diversas culturas, plantas
ornamentais, plantas nativas e plantas daninhas. No Brasil, C. racemosa, é a
espécie mais comum encontrada parasitando as culturas de tomate, de cenoura,
plantas ornamentais como Euphorbia milli, Hibiscus sp., Crhysanthemum spp. e
outras. Algumas espécies apresentam uma estreita gama de hospedeiros, outras, no
entanto, são capazes de parasitar numerosas espécies de diferentes famílias.
Mesmo aquelas com uma ampla gama de hospedeiros podem mostrar uma
preferência, e podem apresentar uma parcial ou total incompatibilidade com outros
hospedeiros. Por exemplo, espécies como C. salina, são encontradas em sítios
restritos (pântanos e lagoas) e em apenas algumas espécies de vegetais
hospedeiros. No entanto, C. pentagona, pode ser encontrada em muitas culturas
incluindo alfafa, aspargos, beterraba, tomate e plantas daninhas (PEREIRA, 1998;
PRATHER & TYRL, 1993; LANINI et al., 2002; COSTEA & TARDIF, 2006).
O impacto da cuscuta varia de moderada até severas reduções no
crescimento do hospedeiro e, em alguns casos, pode resultar em completa perda de
vigor e de morte. A severidade de uma infestação depende da fase de crescimento
da planta hospedeira. A maior redução do crescimento ocorre quando cuscuta se
fixa; após esta fase os hospedeiros não são habitualmente mortos. Quando múltiplos
anexos são feitos para a mesma planta, a morte pode ocorrer (LANINI et al., 2002).
O mais bem sucedido controle de cuscuta envolve uma abordagem
combina vários métodos. Geralmente não podem ser eliminadas com um único
tratamento ou em um único ano. Quando é detectada, a ação imediata é necessária
para eliminar ou reduzir as infestações nestes locais (PEREIRA, 1998; LANINI
2002; FATHOMLLA & DUHOKI, 2008
Figura 1. Cuscuta
Figura 2. mostrando haustórios.
O mais bem sucedido controle de cuscuta envolve uma abordagem
combina vários métodos. Geralmente não podem ser eliminadas com um único
tratamento ou em um único ano. Quando é detectada, a ação imediata é necessária
para eliminar ou reduzir as infestações nestes locais (PEREIRA, 1998; LANINI
FATHOMLLA & DUHOKI, 2008).
Cuscuta sp. parasitando Hibiscus sp.
. Cuscusta sp. parasitando Hibiscus sp. Flecha mostrando haustórios.
19
O mais bem sucedido controle de cuscuta envolve uma abordagem sistemática que
combina vários métodos. Geralmente não podem ser eliminadas com um único
tratamento ou em um único ano. Quando é detectada, a ação imediata é necessária
para eliminar ou reduzir as infestações nestes locais (PEREIRA, 1998; LANINI et al.,
sp. Flecha
20
2.2.2 Fungos endofíticos isolados de Cuscuta sp.
Fungos endofíticos de Cuscuta sp. ainda é um assunto pouco descrito na
literatura. Shakir et al., (1999) isolaram quatro espécies de fungos (Colletotrichum
gloeosporioides, Fusarium pallidoroseum, Alternaria alternata, Curvularia lunata) que
foram obtidos de caules doentes de Cuscuta reflexa e C. campestri. Estes fungos
obtidos foram reinoculados em caules sadios, de cuscuta, com o objetivo de
identificar os responsáveis por causar necrose. Todos os quatro fungos produziram
lesões no vegetal. Foi observado que Colletotrichum gloeosporioides seguido de
Fusarium pallidoroseum e Alternaria alternarta foram os mais destrutivos quando
inoculadas separadamente. Ataque mais severos foram observados quando
Alternaria alternata, Curvularia lunata, Colletotrichum gloeosporioides e Fusarium
pallidoroseum foram inoculadas em combinações.
Fungos endofíticos de Cuscuta reflexa foram estudados também por
Suryanarayanan et al., (2000). Neste estudo o objetivo foi comparar os endófitos
encontrados em Cuscuta reflexa com os encontrados nas espécies vegetais
hospedeiras. Um total de quarenta fungos foi isolado do caule de Cuscuta reflexa,
onde a porcentagem de colonização de endófitos variou de 28% a 87%.
Cladosporium sp., Colletotrichum sp. e uma forma estéril (HI) pode ser isolado de
Cuscuta reflexa em cinco diferentes espécies hospedeiras.
21
2.3 Celulases
A celulose, dentre os materiais naturais, é o biopolímero mais abundante do
mundo. É um dos principais constituintes da parede celular dos vegetais, juntamente
com a xilana e outros polímeros. Quimicamente, celulose é um grande polímero de
resíduos de glicose. A cadeia molecular de celulose é consideravelmente longa,
variando com as diferentes espécies e diferentes tecidos (NORKRANS, 1963). É
composta de longas fibras cristalinas em que pontes de hidrogênio unem as
moléculas individuais. Além disso, as fibras são embebidas em uma matriz de
hemicelulose e lignina, as quais reduzem ainda mais a acessibilidade das enzimas
celulolíticas (BÉGUIN, 1990; LYND et al., 2002; ANGELO, 2004). Essas enzimas,
conhecidas como celulases hidrolisam a ligação glicosídica entre dois ou mais
carboidratos ou entre carboidratos e uma porção não carboidrato (CASTILLO et al.,
2002).
Um grande número de fungos e bactérias são capazes de produzir múltiplos
grupos de enzimas, as quais são coletivamente conhecidas como celulases. Tais
sistemas são compostos por uma variedade de enzimas com diferentes
especificidades e modos de ação, as quais agem em conjunto para hidrolisar
celulose. Podem ser classificadas em 3 tipos: endo-β-1,4 glicanase, exo-β-1,4
glicanase e β-D-glicosidade glicohidrolase (BÉGUIN, 1990; BALDRIAN &
VALASKOVÁ, 2008; CULEN & KARSTEN, 1992).
Assim como as demais enzimas extracelulares de hidrólise, as celulases são
induzidas quando há a necessidade de serem secretadas pelos microrganismos
para que ocorra a quebra de celulose, e sua produção depende do tipo de substrato
22 (RUEGGER & TORNISIELO, 2004). Celulases são induzidas na maioria dos fungos
quando celulose ou um indutor existe; já em bactérias, celulases são produzidas
constantemente (SUTO & TOMITA, 2001). Em Hypocrea jecorina e Penicillium
purpurogenum, os respectivos indutores são soforose e gentiobiose, os quais não
têm ligações β-1,4 assim como celobiose, as quais tem esta ligação, sendo um
indutor em outros fungos (SUTO & TOMITA, 2001).
As enzimas celulolíticas constituem o segundo grande grupo de
carboidratases exploradas comercialmente. Podem ser hidrolisadas quimicamente
em meio ácido, ou enzimaticamente, liberando produtos de baixo peso molecular
como hexoses e pentoses. Graças à eficiência e a especificidade de ação de
enzimas e ao seu apelo ambiental, a utilização de celulases em processos de
hidrólise ganha cada vez mais importância em vários setores da indústria química e
na agricultura (ANGELO, 2004).
Vários têm sido os trabalhos descritos na literatura visando o aumento da
produção de celulases, quer seja por otimização das condições de fermentação quer
seja pela obtenção de linhagens microbianas com alta produtividade. O interesse na
produção de celulases está ligado ao emprego destas enzimas na hidrólise de
resíduos celulósicos para diversas finalidades tais como a produção de proteína
microbiana para ração animal, produção de glicose, extração de componentes do
chá verde, proteína de soja e óleos essenciais; na indústria de polpa de celulose e
de papel, para melhorar as propriedades mecânicas das fibras ou ainda para facilitar
o processo de reciclagem; em processos de hidrólise de biomassa para produção de
reagentes químicos combustíveis e em silagem, entre outros (BHAT, 2000;
RUEGGER & TORNISIELO, 2004).
23
A importância dos microrganismos na produção enzimática é devido a sua
alta capacidade de produção, baixo custo e susceptibilidade à manipulação
genética. Na verdade, as enzimas de origem microbiana tem alto interesse
biotecnológico, como transformação de alimentos, fabricação de detergente, têxtil e
de produtos farmacêuticos, terapia médica e biologia molecular. Enzimas de
microrganismos endofíticos já foram estudadas, incluindo algumas com potencial de
aplicação na indústria, tais como amilases, quitinases, glicanases e proteases e
outros (ARAÚJO et al., 2008).
Nagar e colaboradores (1984) estudaram as enzimas degradadoras de
parede celular presentes em Cuscuta sp. e suas plantas hospedeiras. Como
conclusão deste trabalho houve atividade celulolítica apenas pela própria cuscuta e
não em suas plantas hospedeiras.
2.3.1 Endo-1,4- β-glicanase (EC 3.2.1.4)
São também conhecidas como endo-β-1,4 glicanases, endoglicanases e
carboximetilcelulases. São monoméricas, com massa molecular tipicamente entre 22
e 45 kDa. Hidrolizam randomicamente e internamente as pontes β-1,4 glicosídicas
em celulose, gerando oligossacarídeos de vários tamanhos e consequentemente
novas cadeias terminais. Como resultado, o polímero rapidamente decresce em
tamanho, e a concentração da redução de açúcar aumenta vagarosamente
(ONSORI et al., 2005; BALDRIAN & VALASKOVÁ, 2008).
24
Endoglicanases foram isoladas de muitos basidiomicetos e mostram catalise
ótima com pH entre 4.0 e 5.0. Temperatura ótima está entre 50 e 70o C.
Carboximetilcelulose e celulose amorfa são bons – embora não naturais –
substratos da maioria das endoglicanases e indicam que a atividade enzimática é
principalmente direcionada pelas regiões amorfas na molécula de celulose
(BALDRIAN & VALASKOVÁ, 2008).
2.3.2 Exo-β-1,4 glicanase (EC 3.2.1.91)
Conhecidas também como β-1,4 celobiohidrolase ou Avicelase, catalisam a
hidrólise de ligações β-1,4-D-glicosídicas na celulose, liberando celobiose das
extremidades não redutoras das cadeias. São capazes de atuar sobre a celulose
microcristalina, encurtando cadeias do polissacarídeo. (BHAT & BHAT, 1997, LYND
et al., 2002). Possuem ação limitada sobre substratos como carboximetilcelulose
(CMC) e hidroxietilcelulose (HEC) (SINGH & HAYASHI, 1995).
2.3.3 β-D-glicosidase glicohidrolase (EC 3.2.2.21)
Também conhecidas com celobiases, catalisa a hidrólise de resíduos β-D-
glicose terminais não redutores, liberando β-D-glicose. Perdem sua atividade com o
aumento da extensão da cadeia de celulose. Apresentam ampla especificidade por
25 β--D-glicosídeos, podendo hidrolisar também β-D-galactosídeos e β-D-xilosídeos
(SINGH & HAYASHI, 1995; LIND et al., 2002).
2.3.4 Fungos produtores de celulases
Na natureza existe uma grande variedade de microrganismos capazes de
degradar celulose por meio da produção de celulases (CASTILLO et al., 2002;
RUEGGER & TORNISIELO, 2004). Os fungos constituem um dos grupos de
microrganismos mais importantes na atividade de decomposição de matéria
orgânica em geral, e em particular dos substratos celulósicos (LYND et al., 2002).
Sistemas celulolíticos de fungos diferem de complexos sistemas celulolíticos de
bactérias (BALDRIAN & VALASKOVÁ, 2008).
Em geral, os fungos que decompõem substâncias celulósicas ocorrem no
solo, colonizando vegetais, suas raízes e resíduos, com importante função de
reciclagem de nutrientes. A atividade fúngica depende do conteúdo de matéria
orgânica no solo, a qual determina sobremaneira a ocorrência e a distribuição
desses organismos (RUEGGER & TORNISIELO, 2004). Basidiomicetos são os mais
potentes degradadores de celulose (BALDRIAN & VALASKOVÁ, 2008).
As celulases fúngicas tem sido as mais estudadas e exploradas
industrialmente e, apesar de grande parte dos trabalhos estarem voltados para a
obtenção de enzimas de Trichoderma reesei e Trichoderma viridae, muitas outras
espécies tem apresentado um bom potencial para produção de enzimas celulolíticas,
tais como Neurospora crassa e espécies dos gêneros Curvularia, Aspergillus e
26 Penicillium (RUEGGER & TAUK-TORNISIELO, 2004). No contexto atual, grande
ênfase tem sido dada à utilização de rejeitos de biomassa lignocelulósica
provenientes da agricultura e de processos industriais, por exemplo: da produção de
etanol e da produção de polpa de celulose, como substratos para obtenção de
celulases a partir de fermentação microbiana (CULLEN & KERSTEN, 1992;
ANGELO, 2004).
ONSORI et al., (2005) estudaram várias espécies de Aspergillus para verificar
qual produzia mais celulase. Aspergillus spp. são conhecidos por produzir uma
variedade de enzimas celulolíticas, incluindo carboximetilcelulase ou endo-β-1,4-
glicanase. Neste trabalho identificaram Aspergillus sp. (R4) como o maior produtor
de endo- β-1,4-glicanase entre as 13 diferentes espécies de Aspergillus.
Em Cylindrocladium clavatum a celulase produzida é um complexo
multienzimático que compreende duas endo e três exo β-1,4 glicanases e uma β -
glicosidase, sendo que C. clavatum é capaz de produzir tais enzimas in vitro, quanto
cultivado em diferentes substratos.
Três enzimas com pequenas diferenças foram isoladas de Gloeophyllum
trabeum, Phanerochaete chrysosporium, Sclerotium rolfsii e Serpula incrassata. O
mais estudado sistema de endoglicanase em Phanerochaete chrysosporium foi
originalmente descrito contendo 5 diferentes enzimas, mas algumas delas foram
depois identificadas como produtos de clivagem de outras endoglicanases
(BALDRIAN & VALASKOVÁ, 2008).
Sabe-se que o complexo celulásico de T. reessei possui pelo menos cinco
enzimas com atividade endoglicanásica (EG I, II, III, IV e V) tal multiplicidade tem
sido justificada por alguns autores como decorrente de modificações pós-
translacionais como a glicosilação. No entanto, existem fortes evidências de que
27 estas enzimas sejam biomoléculas não relacionadas e que, como tal, possuam
funções distintas durante o processo de sacarificação de celulose (GOYAL et al.,
1991).
A EG I é a endoglucanase produzida em maior quantidade pelo T. reesei,
chegando a cerca de 5% do total de proteínas liberadas no meio de cultura,
enquanto a EG II chega a 0,5% e as endoglucanases restantes apresentam-se como
componentes minoritários (CLAEYSSENS & AERTS, 1992).
28
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
O objetivo deste trabalho foi o de isolar, identificar e avaliar a diversidade de
fungos endofíticos associados à Cuscuta sp. e estudar a produção de
endoglicanases.
3.2 Objetivos Específicos
• Isolar fungos endofíticos de caules de Cuscuta sp. de três áreas de vegetação
característica: área de baixo grau de antropização, área de vegetação
secundária e área fortemente antropizada.
• Identificar os fungos endofíticos.
• Avaliar a produção de endoglicanases dos fungos endofíticos encontrados.
29
4 MÉTODO
4.1 Material vegetal
As amostras de Cuscuta sp. utilizadas neste trabalho foram coletadas em três
diferentes áreas quanto à vegetação local e, consequentemente, parasitando
diferentes espécies vegetais (Figura 3 e Tabela 1). As coletas dos caules maduros
sem marcas, arranhaduras ou ferimentos foram realizadas em junho de 2007,
agosto de 2007 e janeiro de 2008.
Os três locais de coletas, diferem quanto à composição vegetal. O local de
baixo grau de antropização, apresenta uma grande diversidade vegetal. A área de
vegetação secundária apresenta vegetação natural, sem interferência humana em
sua diversidade vegetal. No entanto, o local de forte antropização apresenta apenas
duas espécies vegetais (Duranta repens e Hibiscus sp.), sendo estas,
periodicamente podadas e manuseadas.
Locais de coleta
Área de baixo grau de
antropização
Área de vegetação
secundária
Área fortemente
antropizada
Figura 4. Espécies hospedeiras de
Figura 3. Exemplo de vegetação encontrada nos locais de coleta. Em Em b área de vegetação secundária. Em
a
Espécies vegetais hospedeiras S
Malvaviscus arboreus 23° 26.031’
Dracaena marginata 23° 26.030’
Euphorbia milii 23° 26.030’
Euphorbia milii 23° 28.085’
Syngonium podophyllum 23° 28.028’
Erythrina sp. 23° 28.029’ Ligustrum lucidum 23° 29.091’
Bouteloua curtipendula 23° 29.100’
Asclepias sp. 23° 29.077’
Duranta repens 23° 30.770’
Duranta repens 23° 30.769’
Hibiscus sp. 23° 30.769’
Hibiscus sp. 23° 30.647’
Hibiscus sp. 23° 30.746’
Hibiscus sp. 23° 30.758’ Espécies hospedeiras de Cuscuta sp. e localização das amostras coletadas.
Exemplo de vegetação encontrada nos locais de coleta. Em a área de baixo grau de antropização. área de vegetação secundária. Em c área fortemente antropizada.
b c
30
W
046° 19.437’
046° 19.431’
046° 19.434’
046° 19.758’
046° 19.758’
046° 19.761’ 046° 20.921’ 046° 20.907’
046° 20.900’
046° 11.400’
046° 11.401’
046° 11.430’
046° 11.654’
046° 11.410’
046° 11.406’ sp. e localização das amostras coletadas.
área de baixo grau de antropização.
31
4.2 Desinfecção superficial
A comunidade de fungos endofíticos associada às plantas foi isolada pela
técnica de desinfecção superficial dos tecidos vegetais. É a etapa mais importante
para o trabalho, pois tem por objetivo a completa eliminação de microrganismos
epifíticos, mantendo viável a comunidade endofítica da amostra vegetal. Para isso,
os caules de Cuscuta sp. foram coletados e posteriormente lavados em água
corrente abundante. Em seguida foram imersos em álcool 70% por 30 segundos,
seguida de imersão em hipoclorito de sódio (NaOCl) a 3%, por 1 minuto e 30
segundos e novamente imersos em álcool 70% por 30 segundos e duas lavagens
com água destilada esterilizada para finalizar.
4.3 Isolamento dos fungos endofíticos de Cuscuta sp.
Após desinfecção superficial, o caule de Cuscuta sp. foi cortado,
assepticamente, em fragmentos de aproximadamente 0,5 cm. Sete fragmentos
foram colocados em cada placa de Petri com meio de cultura BDA 20% (Potato
Dextrose Agar – MERCK) suplementado com o antibiótico tetraciclina (50 µg/ml-1)
para impedir o crescimento bacteriano. As placas foram incubadas a 28º C por até
15 dias. Foi utilizado um total de 35 fragmentos de cada amostra de Cuscuta sp. em
cada isolamento, totalizando ao final do trabalho, 1575 fragmentos. A última água de
32 lavagem, foi usada como controle sendo alíquotas da mesma semeadas nos
mesmos meios para isolamento de endofíticos com finalidade de verificação de
escape de microrganismos epifíticos não eliminados Se ocorreu crescimento de
colônias o tratamento correspondente não foi utilizado.
4.4 Análise dos dados
Para a análise dos dados de isolamento, foi calculada a frequência de
colonização em porcentagem (CF%) ao final de cada isolamento para avaliar o
número de fragmentos que apresentaram crescimento fúngico em relação ao
número total de fragmentos vegetais avaliados.
��% = �ú��� �� �� ������ ����� ��
�ú��� �� � �� �� ������ ×���
A população relativa (PR) foi calculada pela razão entre o número de
indivíduos da espécie e o número total de isolados.
33
4.5 Análise da diversidade de fungos associados à Cuscuta sp.
4.5.1 Identificação de fungos endofíticos
A identificação foi realizada por meio de observação de aspectos macro e
micro-morfológicos de estruturas vegetativas e reprodutivas dos isolados endofíticos,
para isto, pressionou-se um pedaço de fita adesiva contra a cultura do fungo,
coletando-a sobre uma lâmina contendo uma gota do corante azul algodão. Os
resultados foram comparados com literatura específica (BARNETT & HUNTER,
1972).
4.6 Produção de endoglicanase
Para a obtenção de resultados de produção de endoglicanase, os fungos
endofíticos foram crescidos em meio M9 contendo 1% de CMC
(Carboximetilcelulose) a 28º C de 7 a 14 dias. Após o crescimento foram
adicionados 10 mL de Vermelho Congo (1%) e posteriormente lavado com NaCl
(5M). A presença de um halo incolor em torno da colônia indicou a secreção de
endoglicanases. Foram realizadas três repetições para cada isolado fúngico.
34
0
3
6
9
12
15
Baixo grau de antropização
Vegetação secundária Fortemente antropizado
Fre
qu
ên
cia
de
co
lon
iza
ção
Mai-Jun/2007
Jul-Ago/2007
Jan-Fev/2008
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Isolamento de fungos endofíticos
Foram isolados 82 fungos endofítos dos caules de Cuscuta sp. A Fig. 4
compara os resultados obtidos quanto à frequência de colonização, nas três coletas
realizadas. O terceiro período foi o que resultou em um maior número de fragmentos
com fungos para todos os locais, embora o local de vegetação secundária tenha
como resultado, igual frequência de colonização no segundo e terceiro períodos.
Figura 5. Frequência de colonização e erro padrão dos fungos endofíticos isolados de Cuscuta sp., comparando as épocas e os locais de coleta.
35
Importantes aspectos ambientais podem influenciar a infecção da comunidade
endofítica que muitas vezes não são consideradas, como temperatura, umidade,
condições do solo, a espécie vegetal, precipitação anual entre outros fatores
(CARROLL 1988). Nas coletas realizadas entre maio e agosto de 2007, a presença
da própria cuscuta nas plantas hospedeiras era em menor quantidade que a mesma
durante a época de coleta realizada entre janeiro e fevereiro. Segundo Lanini e
Kogan (2005), temperaturas do solo favoráveis à germinação e emergência de
Cuscuta sp. estão entre 15 e 38º C, com ótimo em torno de 30ºC, as quais
correspondem às temperaturas que prevalecem na primavera e verão, época esta
que corresponde aos dados referidos ao 3º isolamento.É provável que a baixa
riqueza de fungos endofíticos nos primeiros isolamentos, esteja associada a algum
destes aspectos intrínsecos a área de estudo, principalmente no que se refere ao
clima ideal ao desenvolvimento da própria Cuscuta sp. Dados obtidos por Tóth et al.,
(2006) em culturas de beterraba na Eslováquia, mostraram que não houve o registro
de C. campestri apenas em regiões de clima frio, sendo que eles analisaram a
distribuição de cuscuta em 150 localidades no período de 2002 a 2004.
Considerando as características de vegetação dos locais de coleta, com os
valores obtidos, não foi possível observar se existe uma preferência destes endófitos
por um hospedeiro específico, bem como o local de coleta não influenciou neste
aspecto nos períodos em que foram realizados os isolamentos (Fig. 5).
36
0
5
10
15
20
25
Baixo grau de antropização Vegetação secundária Fortemente antropizado
Fre
qu
ên
cia
de
co
lon
iza
ção
Figura 6. Frequência de colonização de fungos endofíticos e erro padrão nos três locais de coleta de Cuscuta sp.
37
5.2 Identificação de fungos endofíticos
Os 82 fungos isolados de Cuscuta sp. foram inicialmente agrupados de
acordo com as suas características morfológicas em 20 morfotipos (Fig. 6). A Fig. 7
mostra a porcentagem de cada morfotipo isolado. Pode-se observar que, dentre
estes, o morfotipo 11 é o que mais se destaca, correspondendo a aproximadamente
28% dos fungos isolados.
A identificação microscópica apenas foi possível para os gêneros que
desenvolveram estruturas reprodutivas in vitro. A figura 8 mostra os nove gêneros
identicados: Penicillium, Bipolaris, Ulocladium, Colletotrichum, Fusarium,
Cladosporium, Chaetomium, Aspergillus e Paecilomyces. Foi possível diferenciar em
duas espécies, Penicillium sp. 1 e sp. 2, Fusarium sp. 1 e sp. 2 e Cladosporium sp. 1
e sp. 2. A população relativa de cada gênero identificado foi calculada e é
apresentada na Fig. 9. Na Figura 10, estão sendo apresentados os gêneros
identificados mostrando a ocorrência de cada uma destas e os referentes locais de
coleta.
Suryanarayanan et al., (2000) obtiveram um total de quarenta fungos
endofíticos em Cuscuta reflexa sendo que Cladosporium sp., Colletotrichum sp. e
uma forma estéril foram as espécies predominantes. Além destes foram obtidos
também Alternaria sp, Aspergillus sp., Chaetomium sp., Fusarium sp., Penicillium
sp., entre outros.
38
0
5
10
15
20
25
30
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Po
rcen
tage
m
Morfotipos
Figura 7. Exemplos de colônias fúngicas isoladas de Cuscuta sp., agrupadas em 20 morfotipos.
Figura 8. Porcentagem de cada morfotipo dos fungos isolados de Cuscuta sp.
39
Figura 9. Macro e micromorfologia de alguns dos fungos endofíticos isolados de Cuscuta sp.Estruturas reprodutivas observadas ao microscópio ótico em aumento de 400x e 1000x.
40
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Po
pu
laçã
o r
ela
tiv
a
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Área de baixo grau de antropização
Área de vegetação secundária Áreas fortemente antropizada
po
rce
nta
ge
m
Figura 11. Porcentagem dos fungos isolados, e identificados, comparando os locais de coleta de Cuscuta sp.
Figura 10. População relativa de cada gênero de fungo endofítico isolado, e identificado, de Cuscuta sp.
41
5.3 Produção de celulase (endoglicanase)
Os fungos endofíticos obtidos foram testados quanto à atividade celulolítica
pelo uso de carboximetilcelulose (CMC). Em todos os isolados fúngicos, foram
empregadas três repetições. A zona mais clara ao redor das colônias,
correspondente ao halo indicador da degradação da CMC e foi observada (Fig. 12)
em apenas 12 isolados, ou seja, aproximadamente 15% dos fungos estudados (Fig
11). Destes, 8 pertencem ao gênero Penicillium.
A visualização do halo depende de vários fatores, além da composição do
meio de cultura. Algumas substâncias químicas do meio de cultura podem interferir
no corante proporcionando resultados falso-positivos, ou ainda provocar sua
precipitação ou inibir a ligação deste aos polissacarídeos. Os fungos celulolíticos,
na natureza, não ocupam o mesmo nicho ecológico em cultura pura, onde não existe
competição; ao contrário, eles interagem com outros organismos celulolíticos e com
aqueles que degradam outros compostos. Essa associação é responsável pela
completa degradação dos substratos celulósicos nos ecossistemas onde estes
organismos são encontrados. (NEIROTTI & AZEVEDO, 1988; RUEGGER &
TORNISIELLO, 2004). Além disso, os fungos estudados foram isolados de três
áreas com coberturas vegetais distintas e em diferentes estações do ano. Todos
esses fatores influenciaram diretamente os resultados obtidos com os diferentes
isolados de uma mesma espécie.
Ruegger e Tornisiello, (2004) observaram que algumas colônias com pouco
crescimento apresentaram os maiores índices enzimáticos, dentre eles P. herquei,
P. miczynskii e P. verruculosum, P. glabrum e Trichoderma hamatum.,
Figura 12. Porcentagem de fungos endofíticos isolados de de celulase.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
positivo
Baixo grau de antropização
Po
rce
nta
ge
m
Figura 13. Atividade da celulase de fungos isolados de caules de cuscuta, cultivados em meio sintético com carboximetilcelulose por 7 dias a 28º C. As setas indicam formação de halo indicador da degradação de CMC. Em de CMC.
Porcentagem de fungos endofíticos isolados de Cuscuta sp. e suas respectivas respostas à produção
negativo positivo negativo positivo
Baixo grau de antropização Vegetação secundária Fortemente antropizado
Atividade da celulase de fungos isolados de caules de cuscuta, cultivados em meio sintético com carboximetilcelulose por 7 dias a 28º C. As setas indicam formação de halo indicador da degradação de CMC. Em a, não houve degradação de CMC, b e c, halo indicando a degradação
42
sp. e suas respectivas respostas à produção
positivo negativo
Fortemente antropizado
Atividade da celulase de fungos isolados de caules de cuscuta, cultivados em meio sintético com carboximetilcelulose por 7 dias a 28º C. As setas indicam formação de halo indicador
, halo indicando a degradação
43
6 CONCLUSÕES E SUGESTÕES
A comunidade fúngica endofítica de Cuscuta sp. apresenta uma grande
diversidade sendo composta pelos gêneros, identificados, Penicillium, Bipolaris,
Ulocladium, Colletotrichum, Fusarium, Cladosporium, Chaetomium, Aspergillus e
Paecilomyces sendo Penicillium o gênero predominante.
A época do ano influencia sobre a freqüência de colonização de fungos
endofíticos.
As diferenças de antropização nos locais de coleta não influenciou na
frequência de colonização dos fungos endofíticos, no entanto a diversidade
endofítica encontrada foi diferente para cada local.
Nas condições expostas aqui neste trabalho, poucos dos fungos endofíticos
associados à Cuscuta sp. apresentaram capacidade de produzir endocelulase,
sugerindo que sua comunidade fúngica endofítica não está envolvida na capacidade
de penetração na planta hospedeira.
44
REFERÊNCIAS
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