distribuiÇÃo temporal, distribuiÇÃo espacial e ... · semelhantes àquelas estudadas por...
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DISTRIBUIÇÃO TEMPORAL, DISTRIBUIÇÃO ESPACIAL E POLIMORFISMO DA ISOENZIMA ALFA-ESTERASE (E.C. 3.1.1.1) EM TRÊS ESPÉCIES DE DROSOFILÍDEOS (INSECTA, DIPTERA)
COMUNS NO CERRADO
JULIANA ALVES THOMÉ
Orientadora: Profa. Dra. Rosana Tidon
Dissertação apresentada para
obtenção do Grau de Mestre em Ecologia
Programa de Pós Graduação em Ecologia Instituto de Ciências Biológicas
Universidade de Brasília
Brasília –DF 2005
“BRIDGEKEEPER: What is the air-speed velocity of an unladen swallow?
ARTHUR: What do you mean? An African or European swallow?
BRIDGEKEEPER: Huh? I-- I don't know that! Auuuuuuuugh! [ explodes and dies]
BEDEVERE: How do know so much about swallows?
ARTHUR: Well, you have to know these things when you're a king, you know.”
MONTY PHYTON in THE HOLY GRAIL
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Ao meu querido pai Ricardo Thomé DEDICO.
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AGRADECIMENTOS
Gostaria de manifestar minha gratidão a todos aqueles que estiveram
comigo durante esses dois anos, colaborando e incentivando para que mais
uma etapa desse grande sonho de fazer ciência se concretizasse. Quero
agradecer àqueles que tanto me ajudaram, direta ou indiretamente, tornando
esse caminho menos árduo e tão mais alegre. Em especial:
À Profa. Dra. Rosana Tidon, pela orientação competente, atenciosa e
dedicada e principalmente pela confiança a mim depositada.
À Profa. Dra. Maria de Nazaré Guimarães Grisólia, do Laboratório de
Genética, pela colaboração valiosa, me acolhendo e me dando bases firmes em
uma área que a mim era quase desconhecida.
Aos Professores Doutores César Koppe Grisólia e Silviene Fabiana de Oliveira, por me acolherem tão bem no Laboratório de Genética, me fazendo
sentir realmente parte da equipe.
Às colegas Renata, Luciana e Roberta do Laboratório de Evolução, que
me acompanharam em grande parte dessa jornada e ouviram pacientemente
minhas reclamações, e principalmente por todas as “horas do chá”
divertidíssimas.
Aos colegas Arthur, Daniela, Luzirlane e Neda do Laboratório de
Genética pelas proveitosas conversas, risadas e principalmente pelo apoio e
companheirismo ao final desse trabalho.
Ao Dr. Luzitano B. Ferreira da USP de Ribeirão preto pela grande ajuda
em momentos cruciais do trabalho de laboratório, principalmente ao procurar e
enviar prontamente um reagente importante para a continuidade da parte
genética laboratorial.
À Dulce Rocha pela ajuda na elaboração do resumo em inglês.
Ao Seu Antonio Brito, técnico do Laboratório de Evolução, pela
companhia em campo e pelo conhecimento repassado, sem ele as coletas não
teriam acontecido.
À Elisa e Ornil, técnicos do Laboratório de Genética, sempre simpáticos
e prontos a ajudar.
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Aos funcionários do Departamento de Ecologia Fabiana e Hugo (ex-funcionário), em primeiro lugar por terem sempre me atendido tão bem, pela
simpatia e pela paciência ao ouvirem de mim sempre a mesma frase: “Vim fazer
umas cópias!”.
Aos colegas de turma da Pós em Ecologia de 2003, pela convivência
maravilhosa, pelas trocas de idéias e pela companhia. Em especial aos amigos
Pablo, Ana Paula e Clarissa pela companhia maravilhosa no Congresso de
Ecologia e pela amizade verdadeira que surgiu depois disso.
À minha avó Maria Amélia Ferreira Thomé por ter sido compreensiva e
amorosa em todos os momentos, tanto os difíceis como os alegres desta
jornada, por entendido e apoiado minha escolha de vida.
Ao Aniello O. G. Gréco Junior, companheiro de todas as horas, ombro,
amigo e conselheiro, que me proporcionou os melhores debates sobre ciência
durante esses últimos dois anos e me fez ver durante esse período que as
coisas na vida são muito simples, nós é que as complicamos.
Agradeço também a agencia de fomento CNPq, pela concessão da bolsa
de estudos e ao Programa de Pós-Graduação em Ecologia da Universidade
de Brasília.
Termino agradecendo a oportunidade de estar aqui, fechando um ciclo,
finalmente.
Muito obrigada.
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ÍNDICE
1. Introdução
1
2. Objetivos 5
3. Material e Métodos
3.1 Áreas de Estudo 6 3.2 Espécies Estudadas 8 3.3 Métodos de Coleta 9
3.4 Análise da Alfa-Esterase
10
3.5 Análises Estatísticas 14
4. Resultados
4.1 Flutuação Temporal da Abundância das Espécies 15
4.2 Análises Genéticas 19
5. Discussão
27
I. Drosophila mercatorum 28 II. Drosophila simulans 30 III. Zaprionus indianus 31
IV. Drosophila sturtevanti
32
6. Considerações Finais 33 7. Referência Bibliográfica 35 8. Resumo 40
9. Abstract 41
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1. Introdução
A evolução de uma população só acontece quando esta apresenta
variabilidade genética. O exame da variabilidade e por conseqüência da
evolução em populações naturais é baseado na heterozigosidade desta
população, que é definida pela freqüência total de heterozigotos de um dado
lócus. Como estas freqüências são relações genotípicas simples, muito
semelhantes àquelas estudadas por Mendel, muitos dos estudos com
populações estão concentrados nesse tipo de característica observada em
diversos níveis de fenótipo, e abrangendo desde a morfologia externa até
seqüência de aminoácidos em enzimas e proteínas (Suzuki et al., 1992).
Sabe-se que a variabilidade genética está extremamente relacionada com
a história natural das espécies. Conhecer a maneira pela qual a seleção natural,
a ecologia e os ambientes heterogêneos agem e interagem é importante para se
obter uma explicação de como esta variabilidade se mantém em uma
população. O estudo dos processos evolutivos, no contexto da genética de
populações, é baseado no entendimento destas variações (Futuyma, 1992) e
pode explicar a existência e manutenção da variabilidade genética em
populações naturais. Diversos estudos estimam a variação genética mediante a
avaliação de polimorfismos tais como Beardmore (1963), Brncic e Napp (1980),
Hedrik (1986), Valente et al. (1993), Borash et al. (1998), Mateus e Sene (2003),
entre outros, integrando assim as áreas da ecologia e da genética de
populações.
Quando se considera que a variação em isoenzimas pode ser
influenciada pela seleção natural, atribui-se um significado adaptativo para a
mesma, portanto, o estudo evolutivo de isoenzimas não é um estudo de um
conjunto de genes ao acaso e sim de genes que atuam em partes específicas
do metabolismo do indivíduo estudado. O equilíbrio genético da variação de
uma enzima é dependente do balanço entre as taxas de mutação, que criam
variabilidade, e a pressão da seleção que mantém a atividade ótima para a
enzima na via catalítica. O funcionamento de uma via metabólica, portanto,
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dependeria de como a enzima ou isoenzima modifica a conformação dos
complexos polienzimáticos (com a mudança da carga elétrica destes, por
exemplo) e como estes passam a atuar e chegam ao produto final desta via
(Alfenas, 1998).
Deve-se entender que a seleção natural atuando sobre o fluxo de uma via
catalítica também está atuando sobre sua eficiência, ou seja, produtividade
versus custo energético de manutenção da enzima e ainda, sobre a
concentração dos metabólitos na célula a cada etapa dessa via (Eanes, 1999).
Admite-se, então, que os alelos de isoenzimas representam variações no
funcionamento (catálise) e estrutura tridimensional da enzima em questão,
causando resposta diferencial em termos fenotípicos (valor adaptativo).
A experimentação usando as técnicas eletroforéticas em proteínas,
surgidas na década de 1960 (Hubby e Lewontin, 1966; Lewontin e Hubby, 1966)
revolucionou a genética de populações. Essas técnicas demonstraram que
diferentes tipos isoenzimáticos, ou seja, formas múltiplas de uma mesma
enzima com afinidade individual para um mesmo substrato, podiam ter
diferentes valores adaptativos, os quais podiam inclusive ser correlacionados
com fatores ambientais (Powers et al., 1991). Tais estudos técnicos trouxeram
importantes informações, pois a análise de isoenzimas forneceria dados
genotípicos de grandes quantidades de loci de uma só vez. Como a eletroforese
de proteínas é uma técnica com marcadores co-dominantes (todos os alelos são
evidenciados), é possível calcular-se coeficientes de endogamia, proporção de
loci polimórficos, freqüências gênicas e genotípicas, heterozigosidade e testar o
equilíbrio de Hardy-Weinberg para as populações estudadas (Solferini e Selivon,
2001). A premissa básica adotada ao se utilizar dados isoenzimáticos é que
diferenças na mobilidade de isoenzimas em um campo elétrico (eletroforese)
são resultantes de diferenças ao nível de seqüências de DNA que codificam tais
enzimas, assim, se os padrões de bandas eletroforéticas de dois indivíduos
diferem, assume-se que estas diferenças possuem base genética e sejam
herdáveis.
Baseando-se nos resultados dos trabalhos de Lewontin e Hubby (1966),
tanto Gillespie e Langley (1974) quanto Futuyma (1992) discutiram a
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manutenção do polimorfismo de isoenzimas nas populações usando modelos
teóricos, que dependeriam, intrinsecamente, da intensidade da seleção natural e
de sua variância sob flutuações ambientais. A idéia era de que, em ambientes
variáveis e heterogêneos, o polimorfismo de uma população se manteria com
maior facilidade e isso se daria possivelmente pela variação dos valores
seletivos dos genótipos, que mudariam de acordo com a alteração ambiental
(Roughgarden, 1996). Existiria, portanto, uma forte conexão entre ambientes
heterogêneos e manutenção da variabilidade genética.
A presença de variação ambiental seja temporal ou espacial, se torna
particularmente interessante se os valores seletivos mudam de “direção” de
geração para geração, explorando o modelo de um ambiente em mudança
dentro de uma geração da população em vez de estar em um estado fixo, sendo
os genótipos caracterizados como um grupo de valores constantes de
adaptabilidade. Muitos locais possuem estações climáticas extremas ou severas
tais como uma baixa temperatura e umidade ou ainda queimadas constantes
havendo, presumivelmente, genes beneficiados durante estas condições não
usuais que não seriam favorecidos durante condições regulares (Roughgarden,
1996). Nesses locais, a variação ambiental poderia alterar as pressões seletivas
sobre os alelos dos indivíduos da população ao longo do tempo, provavelmente
mantendo o polimorfismo genético da população.
Mateus e Sene (2003), baseando-se na teoria dos ambientes
heterogêneos observaram variação intrapopulacional em Drosophila antonietae,
uma espécie cactofílica da América do Sul, e observaram influência ambiental
(precipitação) ao analisarem a variação enzimática dentro dessas populações.
Outro exemplo baseado em adaptações a ambientes extremos pode ser
observado em Gibert et al. (1998) onde analizou-se as curvas de norma de
reação de pigmentação de abdomens e tórax de indivíduos de duas populações
de Drosophila melanogaster em altas temperaturas. Os resultados obtidos
destas análises indicaram que devido às alterações na forma das curvas de
norma de reação, havendo uma provável reatividade entre pigmentação e
temperatura ambiental.
Dentro desse contexto, a utilização de isoenzimas do tipo hidrolases para
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a observação de variação genética ligada a mudanças ambientais em
invertebrados, entre eles drosófilas, é amplamente empregada. O termo
hidrolase engloba enzimas que catalisam a adição de elementos da água em
ligações que conectam as subunidades monoméricas em algumas
macromoléculas. A água e o dióxido de carbono (CO2) são produtos terminais
da oxidação dos combustíveis como a glicose, por exemplo, e essa “água
metabólica” formada a partir dos alimentos estocados é suficiente para permitir
que alguns animais característicos de habitats muito secos, sobrevivam sem
tomar água por longos períodos (Lehninger et al., 1995).
As esterases estão contidas no conjunto das hidrolases e têm a
propriedade de catalisar as ligações ésteres em variados substratos tendo
nesse sentido, semelhança às colinesterases (colesterol) e carboxilesterases
que são encontradas e amplamente estudadas nos humanos (Stryer, 1996). Nos
insetos estas isoenzimas estão relacionadas a diversos processos metabólicos,
tais como digestão de alimentos, degradação de inseticidas organofosforados,
além da degradação de ferormônios e controle do hormônio juvenil (ADH), pela
hidrolise de seu grupo metil-ester. As carboxil /colinesterases são uma família
de grande importância e englobam todas as esterases de Drosophila já
seqüenciadas até o momento. As alfa–esterases (objeto de nosso estudo), da
família carboxil/colinesterase, têm sido caracterizadas em várias espécies de
drosofilídeos (Healy et al., 1991; Lapenta et al., 1995) e suas atividades vem
sendo determinadas também para várias espécies de drosofilídeos, inclusive
relacionando-as com variação temporal (Brncic e Napp, 1980; Pereira et al.,
1981; Carrasco et al., 1984; Mateus e Sene, 2003), entretanto, sua distribuição
tecidual parece ser conhecida apenas para adultos (Lunday e Farmer, 1983).
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2. Objetivos
Nesse contexto, os objetivos deste trabalho são:
1. Investigar a distribuição temporal e espacial na abundância de quatro
espécies de drosofilídeos, no período de um ano.
2. Investigar a distribuição temporal e espacial na variabilidade genética
de alelos de três espécies de drosofilídeos, no período de um ano.
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3. Material e Métodos
3.1 Áreas de Estudo
Os cerrados são as savanas mais ricas do mundo, exibindo uma grande
diversidade de climas e solos que se reflete em uma impressionante diversidade
genética, formando ecossistemas únicos (Dias, 1985). A região do Distrito
Federal pertence à área nuclear da região do cerrado contínuo, porção central
de um complexo de vegetação que ocupa quase um quarto da superfície do
território brasileiro. Encontram-se, no Distrito Federal, todos os tipos de
vegetação comumente englobados sob o termo cerrado, que encerra uma gama
de aspectos naturais que vão desde o cerrado limpo, muito aberto, até o cerrado
com arvores de porte elevado e alta densidade (Dias, 1985).
O clima do Distrito Federal enquadra-se entre os tipos tropical de savana
e temperado chuvoso de inverno seco, caracterizando-se pela existência bem
nítida de duas estações: uma chuvosa e quente que se prolonga de outubro a
abril, e outra fria e seca que vai de abril a setembro. A temperatura média anual
varia de 18 a 20 0C, sendo que os meses de setembro e outubro são os mais
quentes, com temperaturas medias variando entre 20 e 22 ºC, podendo o
Cerrado do DF ser descrito como um bioma que tem variações sazonais
regulares em sua estrutura temporal, ou seja, possuindo padrões climáticos
bastante constantes.
I. Reserva Ecológica do IBGE (RECOR)
A Reserva Ecológica do IBGE (RECOR) está situada a 35 km ao sul do
centro de Brasília - Distrito Federal-DF, no km zero da BR 251, na estrada de
acesso à cidade de UNAÍ-MG, com coordenadas geográficas de 150 56’ 41 “S e
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470 53’ 07” W. A RECOR faz limites à nordeste e noroeste com o Jardim
Botânico de Brasília, a sudeste com a Fazenda Água Limpa e a sudeste com a
BR-251.
A RECOR é parte da área de Proteção Ambiental (APA) Gama-Cabeça
de Veado e além disso, a RECOR é uma das áreas núcleo da Reserva Biosfera
do Cerrado, criada em 1993 pela UNESCO.
A reserva contém grande parte das fitofisionomias do Cerrado,
representando bem o bioma em questão e foi considerada, por suas
características preservadas, o local de coleta de menor ação antrópica.
II. Cerrado da Universidade de Brasília (CO) Localizado na Universidade de Brasília, o cerrado da Casa do Estudante
Universitário (CEU), constitui-se numa pequena área protegida, porém,
constituída por vegetação de cerrado não preservada, além de espécies
introduzidas (especialmente gramíneas). Próximas ao local, existem edificações
residenciais e há acesso de pessoas, sendo a visitação pública permitida
Considerando-se as características de urbanização do local, comparada
com os outros dois locais, o CO foi classificado como um local de média
urbanização.
III. Áreas Octogonais (Condomínios)
Localizada no Distrito Federal-DF, na Região Administrativa XI-Cruzeiro,
o Setor de Habitações Coletivas - Áreas Octogonais (SHC, AO/Sul), é formado
por oito quadras em forma de octógono e localiza-se entre Cruzeiro Novo, Setor
Sudoeste e Setor de Indústrias. As Áreas Octogonais constituem-se de prédios
residenciais com áreas arborizadas ao redor de pequenos fragmentos de
cerrado antropizado e com vegetação composta basicamente de espécies
introduzidas. Considerou-se devido suas característicasde urbanização o local
de maior ação antrópica.
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3.2 Espécies estudadas
A família Drosophilidae deriva da subordem dos dípteros Cyclorrapha,
sendo primitivamente saprofíticas, vivendo em substratos fermentados. Das
mais de três mil espécies nos 61 gêneros da família, cerca de duas mil estão no
gênero Drosophila.
Drosophila é um gênero de fácil cultivo em laboratório e provou ser
altamente versátil no desenvolvimento da genética moderna de populações,
mostrando uma detalhada correlação entre desenvolvimento genético e
citológico (Parsons, 1973). São moscas pequenas, numerosas e com um ciclo
de vida curto, além de serem fáceis de coletar e manipular (Powell, 1997). Por
serem extremamente sensíveis a mudanças nas condições existentes de seus
habitats e ter uma história evolutiva de grande capacidade de se adaptar a
condições climáticas muito diversas, drosofilídeos são modelos bem adequados
ao estudo de ecologia evolutiva (Herrewege e David, 1997).
Drosophila mercatorum pertence ao grupo repleta, subgênero Drosophila,
e com base na morfologia dos cromossomos metafásicos e na distribuição
geográfica a espécie é dividida em duas subespécies: Drosophila mercatorum
mercatorum, que ocorre no Peru, Colômbia, América Central e do Norte, Havaí,
Austrália, África, Europa e Ásia, geralmente estando associada ao homem e
sendo endêmica da região Neotropical; e a Drosophila mercatorum pararepleta,
que ocorre ao leste dos Andes, em áreas de vegetação aberta, áreas secas e
matas.
Drosophila sturtevanti faz parte do grupo saltans, o qual apresenta
acentuada variação sazonal segundo Sene et al. (1981). É uma espécie
neotropical, amplamente distribuída na América Central e do Sul, ocorrendo em
diferentes domínios morfoclimáticos, e tendo grande afinidade pelos cerrados
(Sene et al., 1980). Drosophila mercatorum e Drosophila sturtevanti são as duas
espécies endêmicas mais abundantes no bioma cerrado.
Drosophila simulans pertence ao grupo melanogaster, subgênero
Sophophora e é umas das espécies introduzidas na região Neotropical que
melhor se adaptou, colonizando diferentes regiões fitogeográficas. É freqüente
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em regiões abertas onde em muitas coletas é a mais abundante, principalmente
nos meses mais secos do ano (Sene et al., 1980; Tidon-Sklorz e Sene, 1992;
Tidon, 2005).
Zaprionus indianus é um díptero pertencente ao subgênero Zaprionus e é
a espécie desse gênero mais comum na África. Segundo Vilela (1999) o
primeiro registro dessa espécie em território sul-americano foi no ano de 1990 e
desde então tem colonizado diversas regiões do País sendo considerada uma
espécie invasora muito bem adaptada às condições peculiares da região do
Cerrado (Tidon et al., 2003)
3.3 Métodos de Coleta
Em cada local foram colocadas ao acaso 30 armadilhas, as quais foram
construídas a partir de latas com aproximadamente 15 cm de altura, possuindo
vários furos de aproximadamente um centímetro de diâmetro para permitir a
entrada das drosófilas (Sene et al., 1980; Tidon et al., 2003). As armadilhas
foram fixadas em troncos de árvores, preferencialmente em locais sombreados
e na altura média de um metro e meio do chão para evitar o super aquecimento
do ambiente dentro da armadilha.
No interior de cada armadilha foi colocada uma mistura de banana,
laranja e fermento biológico, que funcionou como isca para atrair os insetos. As
drosófilas foram coletadas após dois a três dias, com o auxilio de redes
entomológicas, e transferidas para frascos devidamente etiquetados. O
procedimento foi repetido a cada três meses, a partir de julho de 2003 até abril
de 2004.
No laboratório, as moscas foram imobilizadas com auxilio de CO2 e os
indivíduos de Drosophila mercatorum, Drosophila simulans, Drosophila
sturtevanti e Zaprionus indianus que ocorrem na região foram separados dos
demais indivíduos coletados, através da observação da morfologia externa e/ou
analise da genitália masculina, um excelente caráter diagnóstico para a
identificação das espécies desse grupo (Vilela, 1983). As fêmeas de Drosophila
mercatorum são crípticas com as de Drosophila paranaensis, portanto, a
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identificação final dessa espécie só pôde ser obtida para as fêmeas que
ovopositaram e produziram prole masculina.
Os indivíduos parentais, após a triagem de morfologia externa,
pertencentes às espécies citadas, foram congelados e posteriormente
macerados, sendo utilizados nos zimogramas.
3.4 Análise da Alfa-Esterase
O conjunto de bandas coradas que uma enzima forma no gel é chamado
de zimograma. Quando se deseja examinar processos evolutivos que atuam em
uma população, podem-se utilizar como marcadores os loci e os respectivos
alelos identificados pela interpretação do zimograma.
Para a tipagem dos zimogramas as fêmeas coletadas das espécies
Drosophila mercatorum, Drosophila simulans e Zaprionus indianus foram
separadas dos demais e acondicionadas em vidros individuais (uma fêmea em
cada vidro) de onde se obteve uma prole F1 usada para observação dos
genótipos parentais. Foram amostrados aproximadamente 40 indivíduos de
cada espécie, para cada local e para cada período de coleta. Depois dos
zimogramas feitos, o total de indivíduos tipados foi de 1128.
Os zimogramas para Drosophila sturtevanti não foram determinados
devido à dificuldade do desenvolvimento de um protocolo de eletroforese e
coloração adequadas, dentro do período deste estudo.
Para confecção dos zimogramas foram utilizados géis de poliacrilamida a
10% para Drosophila mercatorum e Drosophila simulans e a 12% para
Zaprionus indianus como descritos no quadro 1.
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Quadro1. Sistema eletroforético utilizado.
Sistema
Poliacrilamida 10% (D.mercatorum e Drosophila simulans)
Poliacrilamida 12% (Zaprionus indianus)
Tampão de Amostra
0.242g Tris +2 ml Glicerol + 0.2 ml Azul de Bromofenol a
0.01% . Completar para 20 ml.
pH 6.3 (Drosophila mercatorum e Zaprionus indianus)
pH 8.8 (Drosophila simulans)
Tampão do Gel 18.71g Tris. Completar para 100 ml. pH 8.8.
Tampão do Eletrodo 1.15g Tris + 7.21g Glicina. Completar para 1 litro. pH 8.3.
Isoenzima analisada 1-naftil acetato (alfa-esterase)
Nas corridas eletroforéticas, foram utilizados homogeneizados individuais
dos indivíduos coletados da natureza em 40 µL de tampão de amostra (gelado)
para Drosophila mercatorum e Zaprionus indianus e 20 μL de tampão de
amostra (gelado) para Drosophila simulans, centrifugando-se por 5 minutos a
12.000 rpm. Dos 40µL / 20 μL centrifugados de cada indivíduo, 15 µL foram
aplicados nos poços dos géis de poliacrilamida.
Após a corrida eletroforética de 5 horas a 200 V para Drosophila
mercatorum, 6 horas a 200 V para Drosophila simulans e 12 horas a 45 V para
Zaprionus indianus os géis foram submetidos à coloração específica para
esterase, modificada de Lapenta (1998), como descrito abaixo.
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A. Coloração para os Géis de Poliacrilamida
Para cada gel foi utilizado o seguinte protocolo desenvolvido para este
trabalho partindo de Pereira (1979) e Lapenta (1998).
a. Tampões de Coloração
FOSFATO A - 26.4g/L de Fosfato de Sódio Monobásico 0,17M pH 6.2
FOSFATO B - 56,65g/L de Fosfato de Sódio Dibásico 0.15M pH 6.2
aa. Soluções Estoque Alfa-naftil acetato - 1g alfa-naftil diluído em 25 ml de acetona mais25 ml
de água destilada
b. Solução Corante para Drosophila mercatorum
Em uma cuba de vidro adiciona-se: 75 ml de Fosfato A mais 25 ml de
Fosfato B (preparados anteriormente, separando-se 30ml do total para uso
posterior) mais 3 ml de solução de alfa-esterase. Manter o gel por 30 minutos a
37o C no escuro.
Adicionar após os 30 minutos os 30 ml de Tampão Fosfato separados
anteriormente, adicionados de 10 ml de Álcool Isopropílico e 200 mg de Fast
Blue (RR) Salt (filtrar em algodão). O gel revela-se em aproximadamente duas
horas, sob agitação constante.
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c. Solução Corante para Drosophila simulans
Em uma cuba de vidro adiciona-se: 75 ml de Fosfato A mais 25 ml de
Fosfato B (preparados anteriormente, separando-se 30ml do total para uso
posterior) mais 4 ml de solução de alfa-esterase. Manter o gel por 30 minutos a
37o C no escuro.
Adicionar os 30 ml de Tampão Fosfato separados anteriormente,
adicionados de 30 ml de Álcool Isopropílico e 300 mg de Fast Blue (RR) Salt
(filtrar em algodão). O gel revela-se em aproximadamente seis horas, sob
agitação constante.
d. Solução Corante para Zaprionus indianus
Em uma cuba de vidro adiciona-se: 75 ml de Fosfato A mais 25 ml de
Fosfato B mais 4 ml de solução de alfa-esterase. Diluir em 30 ml de Álcool
Isopropílico 150 mg de Fast Blue (RR) Salt e misturar na solução anterior.
Manter o gel por 30 minutos a 37o C no escuro. O gel revela-se em
aproximadamente quatro horas, sob agitação constante.
Após a coloração os géis são tratados com uma solução fixadora de
ácido acético, álcool etílico comercial e água destilada na proporção de 2:1:8
durante 2 horas. Após esse procedimento o gel é fotografado e fixado em
glicerol 10%, sendo seco em papel celofane como descrito em Alfenas (1998).
e. Interpretação dos Géis
Os alelos de cada loco foram numerados de acordo com a mobilidade
relativa de suas aloenzimas em cada sistema enzimático específico. O alelo de
maior freqüência foi designado de 1,00 e aos demais se atribuiu valores
arbitrários de acordo com as migrações mais lentas e mais rápidas, baseadas
em Pereira (1979).
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3.5 Analises Estatísticas
I. Cálculo da Densidade Relativa
Obtivemos o cálculo da densidade relativa de cada espécie estudada
através da divisão da abundância da própria espécie em três áreas diferentes ao
longo de quatro coletas trimestrais sobre o número total de drosofilídeos
coletados nesse período.
II. Regressão
O calculo da regressão foi gerado usando-se o pacote estatístico
SYSTAT (Wilkinson, 1990). Calculou-se a regressão linear entre a abundância
de cada espécie e variáveis climáticas (umidade relativa do ar e temperatura
média) (IBGE, 2005).
III. Analises Genéticas
Para a verificação de variação eletroforética nas populações estudadas
foi utilizado o programa BIOSYS (Swofford e Selander, 1989), calculando-se
frequências alélicas, distribuição genotípica, equilibrio de Hardy-Weinberg e
heterozigozidade média das amostras a partir dos dados obtidos pelos
zimogramas.
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Nas figuras 3 e 4 temos os gráficos da variação da umidade relativa do ar
e precipitação respectivamente. Estes dados foram obtidos acessando a base
de dados da estação climatológica da reserva ecológica do IBGE, nos anos de
2003 e 2004 (IBGE,2005).
Através da análise da regressão linear encontrou-se resultados
significativos apenas para a relação entre umidade e abundância total da
espécie Drosophila sturtevanti, como descrito na tabela 2 e figura 2.
A tabela 1 e a figura 5 mostram as relações entre a abundância relativa
de cada espécie nas sucessivas coletas, e a amplitude dessas variações dentro
da população. A figura 1 mostra a flutuação na freqüência relativa de cada
espécie ao longo do tempo.
No total, foram coletados 11.403 indivíduos neste trabalho, dos quais
aproximadamente 10% foram analisados geneticamente. As quatro espécies de
drosofilídeos mais abundantes (Zaprionus indianus, Drosophila simulans,
Drosophila sturtevanti e Drosophila mercatorum) corresponderam
conjuntamente a 75.93% da amostra capturada. As outras espécies não foram
separadas morfológica ou geneticamente.
4.1 Flutuação Temporal da Abundância das espécies 4. Resultados
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† A medida da Estimativa de Afunilamento se dá pela divisão do maior valor de abundância pelo menor valor de abundância em cada local coletado
Tabela 1. Abundância relativa (%) dos drosofilídeos coletados, em três áreas diferentes do DF ao longo de quatro coletas trimestrais.
D. mercatorum D. simulans Z. indianus D. sturtevanti
COLETA CO CND REC CO CND REC CO CND REC CO CND REC
Julho 2003 28 08 30 26 45 03 24 12 94 05 0,2 11 Outubro 2003 06 04 25 58 64 10 26 15 31 01 0,2 14 Janeiro 2004 09 21 32 02 04 10 47 28 38 29 17 07 Abril 2004 07 03 01 07 06 31 33 47 28 45 03 21 TOTAL 11 08 21 17 29 14 39 27 51 24 04 14 Afunilamento† 4,52 4,12 26,2 11,6 20,8 9,8 16,4 5,1 4,7 70,3 68,5 4,9
Tabela 2. Resultados das regressões lineares (R2) para variáveis climáticas e espécies de drosofilídeos coletados, em três áreas diferentes do DF ao longo de quatro coletas trimestrais.
Temperatura Umidade Drosophila mercatorum 0,1671 0,027 Drosophila sturtevanti 0,1896 0,9655*
Drosophila simulans 0,6853 0,5572 Zaprionus indianus 0,6617 0,584 *p < 0,05
- 16 -
Figura1. Freqüência de quatro espécies de drosofilídeos ao longo de quatro coletas trimestrais em três áreas diferentes.
A- D. mercatorum, B-D. simulans, C- D. sturtevanti, D- Z. indianus.
A
00,10,20,30,40,50,6
7
jul/03 out/03 jan/04
Freq
uênc
ia
B
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
jul/03 out/03 jan/04 abr/04
Tempo
Freq
uênc
ias
0,
abr/04
Tempo
CO COND IBGE
C
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
jul/03 out/03 jan/04 mai/04Tempo
Freq
uênc
ia
D
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
out/03 n/04 mai/04
Tempo
Freq
uênc
ia
jul/03 ja
- 17 -
abr/04
jan/04
out/03
jul/03
0 55 60 65 70 75 80 85 90
Umidade relativa (%)
0
300
600
900
5
Abu
ndân
cia
D. s
turt
evan
ti
Figura 2. Linha de tendência (regressão) plotada a partir da relação entre a
abundância total da espécie Drosophila sturtevanti e a umidade relativa do ar
em quatro períodos de coleta consecutivos. Y=25,359-1358 R2=0,9655
p=0,017
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
A M J J A S O N D J F M A
Tempo (Meses)
Um
idad
e R
elat
iva
do A
r (%
)
Figura4. Variação tempor
de 2003 a a
al na umidade relativa do ar na RECOR, entre os meses de abril
bril de 2004. Meses de coleta.
18
19
20
21
22
23
24
25
A M J J A S O N D J F
Tempo (
Tem
pera
tura
Méd
ia
(°C)
Figura3. Variação temporal na temperatura média medida na RECOR, entre os meses
abril de 2003 a abril de 2004. Meses de coleta
M A
meses)
de
0%
20%
40%
60%
80%
100%
CO CND REC
Locais de col
Abu
ndân
cia
Rel
ativ
a (%
)
eta
Figura5. Abundância relativa total (%) de quatro espécies de drosofilídeos em três
áreas diferentes do DF. D.mercatorum D.simulans Z.indianus D.sturtevanti-18-
4.2 Analises Genéticas
Primeiramente foi observado durante a confecção dos zimogramas que
os indivíduos congelados das espécies Zaprionus indianus, D. simulans e D.
mercatorum com tempo de coleta superior a um ano apresentaram perda de
atividade enzimática ao serem submetidos à analise eletroforética , o que foi
resolvido fazendo-se alterações nos protocolos, resultando portanto, nos
protocolos de coloração utilizados neste estudo.
Cada umas das espécies analisadas (Zaprionus indianus, D. simulans e
D. mercatorum), pareceu mostrar três loci para alfa-esterase, dos quais dois
revelariam variabilidade. Entretanto, a amostra obtida para o segundo loco,
apesar de parecer mostrar variabilidade, foi de baixa freqüência em sua
expressão enzimática, e devido a isso não foi possível analisa-la neste estudo,
sendo observados apenas um loco para cada espécie.
As tabelas de 3 a 5 mostram para cada uma das espécies, o nível de
significância do teste de equilíbrio de Hardy-Weinberg (p), assim como a
freqüência de cada alelo observado, a heterozigosidade média e a média das
heterozigosidades com seu respectivo desvio padrão.
Observamos nas tabelas de 5 a 7 os padrões de migração eletroforética
de cada uma das espécies (D. mercatorum, D. simulans e Z. indianus), onde
observamos os alelos amostrados. A nomenclatura dos alelos foi baseada em
Pereira (1979).
Nas figuras 6 a 8 observa-se o padrão isoenzimático geral de migração
da alfa-esterase em D. mercatorum, D.simulans e Z.indianus e nas figuras de
6.1 a 8.1, observamos os padrões de alfa-esterase no loco EST-1.
Nas figuras de 9 a 11 observa-se a oscilação temporal nas freqüências
dos alelos encontrados para cada uma das espécies descritas, além da
heterozigosidade média nos diferentes locais e períodos de coletas
consecutivas.
- 19 -
Tabela 3. Local e período de coleta, número de indivíduos, período de coletas, nível de significância para H-W†, freqüência dos alelos observados e heterozigosidade para D. mercatorum.
D. mercatorum ALELOS
Local Período
N p
A B C D E
H
Jul. 2003 24 0,228 0,292 0,313 0,208 0,104 0,083 0,458
Out. 2003 30 0,952 0,567 0,050 0,183 0,067 0,133 0,567
Jan. 2004 30 0,996 0,583 0,150 0,050 0,200 0,017 0,633 REC
OR
Abr. 2004 10 0,999 0,150 0,250 0,350 0,050 0,200 0,800
Jul. 2003 43 0,111 0,419 0,233 0,070 0,058 0,221 0,628
Out. 2003 37 0,022* 0,122 0,203 0,365 0,216 0,095 0,595
Jan. 2004 37 0,421 0,514 0,095 0,230 0,054 0,108 0,459
CO
Abr. 2004 29 0,008** 0,345 0,259 0,259 0,138 0,000 0,483
Jul. 2003 34 0,380 0,471 0,103 0,191 0,103 0,132 0,588
Out. 2003 30 0,862 0,583 0,083 0,150 0,117 0,067 0,433
Jan. 2004 37 0,912 0,081 0,486 0,095 0,216 0,122 0,378
CO
ND
OM
ÍNIO
Abr. 2004 40 0,033* 0,375 0,438 0,013 0,112 0,063 0,425
Média da heterozigosidade X = 0,53725 ± 0,114532
* p<0,05 **p< 0,01 / †= Equilíbrio de Hardy-Weinberg / A- alelo 1.00, B- alelo 0.95, C- alelo 0.90, D- alelo 0.85, E- alelo 1.05
- 20 -
Tabela 4. Local e período de coleta, número de indivíduos, período de coletas, nível de significância para H-W†, freqüência dos alelos observados e heterozigosidade para D.simulans.
* p<0,05 **p< 0,01 / †= Equilíbrio de Hardy-Weinberg / A- alelo 1.00, B- alelo 0.95, C- alelo 0.90, D- alelo 0.85, E- alelo 1.05
D. simulans ALELOS H
Local Período
N p
A B C D
Jul. 2003 26 0,000** 0,600 0,133 0,067 0,200 0,200
Out. 2003 33 0,008** 0,773 0,152 0,061 0,015 0,152
Jan. 2004 23 0,000** 0,630 0,109 0,261 0,000 0,043 IBG
E
Abr. 2004 22 0,365** 0,727 0,159 0,114 0,000 0,273
Jul. 2003 29 0,003** 0,569 0,207 0,224 0,000 0,276
Out. 2003 39 0,868 0,705 0,013 0,128 0,154 0,359
Jan. 2004 45 0,000** 0,656 0,000 0,189 0,156 0,200
CO
Abr. 2004 21 0,224 0,500 0,143 0,214 0,143 0,429
Jul. 2003 36 0,921 0,736 0,014 0,069 0,181 0,444
Out. 2003 14 0,293 0,643 0,000 0,286 0,071 0,286
Jan. 2004 28 0,161 0,643 0,179 0,054 0,125 0,321
CO
ND
OM
ÍNIO
Abr. 2004 26 0,000** 0,519 0,346 0,058 0,077 0,115
Média da heterozigosidade X = 0,258166667± 0,116896559
* p<0,05 ** p< 0,01 / †= Equilíbrio de Hardy-Weinberg / A- alelo 1.00, B- alelo 1.05, C- alelo 0.90, D- alelo 0.75.
- 21 -
Tabela 5. Local de coleta, número de indivíduos, período de coletas, nível de significância para H-W†, freqüência dos alelos observados e heterozigosidade para Zaprionus indianus.
* p<0,05 **p< 0,01 / †= Equilíbrio de Hardy-Weinberg / A- alelo 1.00, B- alelo 0.95, C- alelo 0.90, D- alelo 0.85, E- alelo 1.05
Z. indianus ALELOS H
local período
N p
A B C D
Jul. 2003 36 0,000** 0,542 0,069 0,278 0,111 0,167
Out. 2003 28 0,003** 0,464 0,143 0,232 0,161 0,393
Jan. 2004 26 0,002** 0,596 0,077 0,096 0,231 0,308 IBG
E
Abr. 2004 35 0,000** 0,400 0,257 0,214 0,129 0,229
Jul. 2003 20 0,800 0,300 0,175 0,225 0,300 0,600
Out. 2003 17 0,032* 0,441 0,294 0,118 0,147 0,235
Jan. 2004 32 0,000** 0,578 0,156 0,109 0,156 0,250
CO
Abr. 2004 56 0,170 0,265 0,205 0,220 0,311 0,563
Jul. 2003 34 0,065 0,456 0,147 0,147 0,250 0,441
Out. 2003 30 0,002* 0,550 0,167 0,133 0,150 0,300
Jan. 2004 29 0,111 0,414 0,052 0,207 0,328 0,448
CO
ND
OM
ÍNIO
Abr. 2004 58 0,020* 0,379 0,310 0,267 0,043 0,448
Média da heterozigosidade X= 0,365166667 ± 0,132308247
p<0,05 **p< 0,01 / †= Equilíbrio de Hardy-Weinberg / A- alelo 1.00, B- alelo 0.94, C- alelo 0.80, D- alelo 0.75.
- 22 -
Figura 6. Migração eletroforética dos alelos de alfa-esterase para Drosophila
mercatorum. A - alelo 1.00, B - alelo 0.95, C - alelo 0.90, D - alelo 0.85, E - alelo 1.05 .
Figura 7. Migração eletroforética dos alelos de alfa-esterase para Drosophila simulans. A - alelo 1.00, B - alelo 1.05, C - alelo 0.90, D - alelo 0.75.
Figura 8. Migração eletroforética dos alelos de alfa-esterase para Zaprionus indianus. A - alelo 1.00, B - alelo 0.94, C - alelo 0.80, D - alelo 0.75.
- 23 -
- 24 -
Figura 6.1. Migração eletroforética dos alelos do loco 1 (EST-1) para Drosophila mercatorum. A - alelo 1.00, B - alelo 0.95, C - alelo 0.90, D - alelo 0.85, E - alelo 1.05 .
+
A
B
D
E
C
-
A B
C
D
-
+ Figura 7.1. Migração eletroforética dos alelos do loco 1 (EST-1) para Drosophila simulans. A - alelo 1.00, B - alelo 1.05, C - alelo 0.90, D - alelo 0.75.
A B
C
D
-
+Figura 8.1. Migração eletroforética dos alelos do loco 1 (EST-1) para Zaprionus indianus. A - alelo 1.00, B - alelo 0.94, C - alelo 0.80, D - alelo 0.75.
Figura 9. Oscilação temporal das freqüências alélicas e da heterozigosidade em Drosophila mercatorum. A- alelo 1.00, B- alelo 0.95, C- alelo 0.90, D- alelo 0.85, E-
alelo 1.05, F- heterozigosidade.
A
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
jul/03 out/ 3 jan/04 abr/04
Tempo
Freq
uênc
ia
0
D
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
jul/03 out/0 jan/04 abr/04Tempo
Freq
uênc
ia
3
E
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
jul/03 out/03 jan/04 abr/04Tempo
Freq
uenc
ia
C
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
jul/03 out/03 jan/04 abr/04
Tempo
Freq
uênc
ia
B
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
jul/03 out/03 jan/04 abr/04
TempoFr
equê
ncia
F
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
jul/03 out/03 jan/04 abr/04
Tempo
Het
eroz
ig. M
édia
IBGE CO CONDOMÍNIOS- 24 -
C
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
jul/03 out/03 jan/04 abr/04
Tempo
Freq
uênc
ia
Figura 10. Oscilação temporal das freqüências alélicas e da heterozigosidade em Drosophila simulans. A- alelo 1.00, B- alelo 1.05, C- alelo 0.90, D- alelo 0.75,
E- heterozigosidade.
D
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
jul/03 out/03 jan/04 abr/04
Tem po
Freq
uênc
ia
B
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
jul/03 out/03 jan/04 abr/04Tem po
Freq
uênc
ia
A
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
jul/03 ou 03 jan/04 abr/04
Tem po
Freq
uênc
ia
t/
E
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
jul/03 out/03 jan/04 abr/04
TempoH
eter
ozig
. méd
ia
- 25 -IBGE CO CONDOMÍNIOS
C
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
jul/03 out/03 jan/04 abr/04
Tempo
Freq
uênc
ia
- 26 -
E
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
jul/03 out/03 jan/04 abr/04
Tempo
Het
eroz
ig. m
édia
D
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
jul/03 out/03 jan/04 abr/04
Tempo
Freq
uênc
ia
v
A
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
jul/03 out/03 jan/04 abr/04
Tempo
Freq
uênc
ia
B
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
jul/03 out/03 jan/04 abr/04
Tempo
Freq
uênc
ia
Figura 11. Oscilação temporal das freqüências alélicas e da heterozigosidade em Zaprionus indianus. A - alelo 1.00, B - alelo 0.94, C - alelo 0.80, D - alelo 0.75,
E- heterozigosidade.
CONDOMÍNIOSCOIBGE
5. Discussão
Sabemos que a heterogeneidade temporal difere da heterogeneidade
espacial, pois, um indivíduo pode mover-se entre as partes do espaço, porém,
não entre as partes do tempo. Embora não possa escolher entre os ambientes
temporais, pode escolher seu comportamento diante as condições que encontra
em qualquer tempo em particular, e algumas vezes, essa sua “escolha”, pode
assumir uma forma evolutiva. A variação temporal requer uma resposta flexível
por parte do organismo que a sofre, cuja natureza depende do curso do tempo,
da previsibilidade e da amplitude de sua variação (Ricklefs, 1996; Futuyma,
1992).
Dentro das populações, os indivíduos podem variar de gênero, forma,
idade, genótipo, e os efeitos acumulados por variações provocadas pelo acaso
influem em como os indivíduos dessa população reagem, ocasionando
diferentes dinâmicas populacionais (Odum, 1988; Ricklefs, 1996; Huston, 1994).
Devido a essas dinâmicas mudarem com o tempo e o espaço a percepção que
se tem de uma população depende de quando e onde ela é observada.
Devido às condições ecológicas variarem espacialmente, a dinâmica de
populações individuais pode diferir de um lugar para o outro, pois, a distância
pode isolar as populações, mesmo estas sendo da mesma espécie, fazendo
com que estas se comportem, pelo menos parcialmente, independentemente
(Huston, 1994).
Sabemos que há uma variedade enorme nas diferenças existentes entre
um ambiente e outro, fazendo com que os indivíduos adotem escolhas
concernentes ao uso desse ambiente. A ação antrópica em um ambiente pode
levar a uma mudança na composição, na abundância e na sobrevivência das
espécies que ali estão. O distúrbio provocado pela ação antrópica seria um fator
que levaria o ambiente em questão a ser, de certa forma, mais suscetível a
espécies invasoras (Ricklefs, 1996; Huston, 1994).
- 27 -
Em nossas observações verificou-se um padrão de maior abundância de
indivíduos no local de coleta Condomínio, sendo este local, dentre os escolhidos
para este estudo, o de maior perturbação antrópica. A alta ação antrópica no
ambiente acarretaria às espécies introduzidas Drosophila simulans e Zaprionus
indianus maior valor adaptativo por serem cosmopolitas, como observado em
Ferreira e Tidon (2004). Isso se verifica nitidamente pela maior abundância
destas espécies neste ambiente (tabela 1).
Para o local de coleta RECOR, um ambiente de baixa ação antrópica
(reserva ecológica), verificou-se o menor nível de abundância geral, entretanto,
as espécies endêmicas (Drosophila mercatorum e Drosophila sturtevanti),
provavelmente mais adaptadas, se fizeram mais presentes e possivelmente
utilizaram melhor os recursos presentes do que o fizeram em locais mais
urbanizados. Analisando a distribuição geográfica da abundância nos três locais
de coleta (RECOR, CO e Condomínio), verificamos que em ambientes de baixa
ação antrópica a espécie D. mercatorum é nitidamente mais presente que em
ambientes mais urbanizados.
A abundância das quatro espécies em relação ao total de drosofilídeos
coletados foi de cerca de 84% no CO, 65% nos condomínios e 87% na RECOR,
indicando que estas espécies são as mais presentes dentro do conjunto de
espécies relacionadas a esses três locais estudados.
I. Drosophila mercatorum
De acordo com dados climáticos obtidos através da estação climatológica
da reserva do IBGE (IBGE, 2005) de janeiro a abril de 2004, o Distrito Federal
se encontrava em plena estação úmida sendo que entre julho e outubro de 2003
localizava-se em uma estação de seca prolongada. As coletas dentro desse
período climático mostraram que em relação à abundância, a população de
Drosophila mercatorum decresceu no período de baixa de umidade (outubro de
2003 e abril 2004) e aumentou com a volta das chuvas (janeiro de 2004). O forte
- 28 -
decréscimo registrado em abril de 2004 pode ser parcialmente explicado pela
queda relativa de umidade em relação a janeiro e fevereiro de 2004, porém, esta
queda acentuada na abundância da espécie no mês de abril não seguiu uma
relação linear com a pequena queda de umidade, tendo sido influenciada,
portanto, por fatores não analisados neste estudo. De acordo com Tidon (2005)
os resultados de queda de abundância nos períodos mais secos e alta de
abundância nos períodos úmidos seriam esperados, pois, em coletas anteriores,
fora observado o padrão de crescimento na população de drosofilídeos no
Distrito Federal com a estação úmida e decréscimo na estação seca.
Provavelmente esse decréscimo na abundância populacional na estação seca
seria regido por algum efeito gargalo que atingiria a população nesse período,
tal como; diminuição dos recursos alimentares ou a própria dissecação devido à
seca duradoura. De acordo com Kimura (1976) e Valente e Araújo (1991),
admite-se que outros fatores complexos tais como a fisiologia do drosofilídeo, a
competição dentro do próprio habitat ou a própria disponibilidade de alimento
podem interferir na visualização de padrões de distribuição da espécie, o que
pode ter acontecido no presente estudo no mês de abril de 2004.
Na Drosophila mercatorum observou-se a maior heterozigosidade média
entre as três espécies analisadas quanto à alfa-esterase, sendo bem próxima a
descrita por Pereira (1979) em seu trabalho também com D. mercatorum no
Distrito Federal. Nesta espécie também se observou o maior número de alelos
dentre as espécies estudadas, sendo um forte indicativo de uma maior
variabilidade genética entre estas espécies. O numero de alelos achados em
nossas analises também foi o mesmo das analises descritas em Pereira (1979).
Drosophila mercatorum também foi observada como a espécie que está
mais próxima do equilíbrio de Hardy-Weinberg, sendo que apenas nos
ambientes mais urbanizados (CO e Condomínios) pudemos notar pequeno
desequilíbrio, mesmo assim, apenas em períodos de relativa queda de umidade.
Isto sugere que sendo uma espécie endêmica, possuiria um maior equilíbrio
genético com o ambiente. É possível que o alto índice de heterozigosidade
média nos alelos de esterase seja uma forma da espécie se mostrar mais
- 29 -
adaptada ao ambiente em que está inserida, mostrando uma maior elasticidade
na população em ambientes de variação de umidade.
Houve alto índice no equilíbrio de Hardy-Weinberg observado nas
populações da RECOR, e uma hipótese para explicar esse equilíbrio seria a de
que esta espécie endêmica estaria parcialmente adaptada a seu ambiente
nativo. Já as populações fora do equilíbrio de Hardy-Weinberg sugerem que
esteja ocorrendo com a Drosophila mercatorum um possível processo seletivo
relacionado com as espécies invasoras nos ambientes urbanos durante a seca.
De acordo com Pereira (1979), esta seria uma hipótese plausível já que em seu
estudo houve indicações que a espécie possui respostas específicas para o
ambiente natural que ela ocupa.
Os alelos de esterase EST-1 1.00 e EST-1 0.95 mostraram-se os mais
freqüentes nas populações de Drosophila mercatorum (figura 4). Em abril
obtivemos os valores mínimos nas freqüências de aparecimento destes alelos,
mas isto pode ter ocorrido devido ao extremamente baixo número de indivíduos
coletados neste período, reduzindo a precisão da amostra. De acordo com
Pereira (1979) EST-1 foi o loco de maior freqüência em todas as populações de
alfa-esterase analisadas no Distrito Federal, obtendo alto polimorfismo.
II. Drosophila simulans
Drosophila simulans é uma espécie introduzida e pode ser encontrada em
todos os tipos de ambiente (Sene et al., 1980), e apresentou neste estudo a
mais acentuada flutuação populacional ao longo do período de coletas em todos
os locais coletados (RECOR, CO, Condomínio). Os picos populacionais mais
elevados verificados nos ambientes urbanos durante períodos de seca podem
indicar uma facilidade em se adaptar a ambientes de pouca umidade como
indicam os estudos de flutuação sazonal em Gladis e Valente (1985), porém,
devemos reforçar que não encontramos uma relação direta entre fatores
- 30 -
ambientais estudados e os dados populacionais, através dos cálculos de
regressão linear, como se pode ver na tabela 2.
A maioria das amostras analisadas desta espécie não se encontra em
equilíbrio de Hardy-Weinberg. As exceções ocorrem apenas nos locais de
coletas de maior ação antrópica, em especial no Condomínio. Isto é um forte
indício indicando que esta espécie pode estar entrando em relativo equilíbrio
nos ambientes urbanizados, o que não seria novidade por se tratar de uma
espécie cosmopolita.
Os valores das taxas de heterozigosidade média das populações na
RECOR são relativamente reduzidos se comparados com os valores desta taxa
do CO e Condomínio, que são aproximadamente iguais entre si. Isto é mais um
indício a favor de uma maior adaptabilidade a ambientes urbanos. Notamos
também que não há perda de variabilidade nos locos de esterase
(heterozigosidade média) na seca, indicando uma possível adaptação a baixa
umidade.
Há uma clara predominância do alelo EST-1 1.00. Em alguns outros alelos
do mesmo loco (EST-1 1.05, EST-1 0.75) há uma forte diminuição da freqüência ou
mesmo o seu desaparecimento, observando-se posteriormente seu retorno. Isto
pode nos indicar uma possível deriva genética destes alelos na população ou
um possível maior valor adaptativo.
III. Zaprionus indianus
Zaprionus indianus mostrou-se a espécie mais abundantemente coletada,
refletindo uma distribuição ambiental ampla. Sabe-se que esta é uma espécie
que foi recentemente introduzida na região de acordo com os dados de sua
abundância em Tidon (2005). Como demonstra seu crescimento exacerbado, a
espécie tem aparecido como uma forte competidora pelos nichos dos
drosofilídeos já presentes no cerrado do Distrito Federal, tendo uma clara
dominância como invasora de acordo com Ferreira e Tidon (2004), inclusive em
- 31 -
ambientes pouco perturbados antropicamente como na RECOR, demonstrando
sua alta flexibilidade a variados tipos de ambientes. Dentro das observações
feitas de outubro de 2003 a janeiro de 2004 houve um aumento em freqüência
da Zaprionus indianus, conjuntamente com uma redução brusca na abundância
da espécie Drosophila simulans, outra espécie também invasora, mostrando que
tem ocupado espaços não só de espécies endêmicas como D. mercatorum ou
D. sturtevanti.
Talvez por ser uma espécie recentemente introduzida no Distrito Federal,
a Zaprionus indianus raramente foi encontrada em equilíbrio de Hardy-
Weinberg. A heterozigosidade média encontrada foi levemente maior que a da
Drosophila simulans, possivelmente possuindo certo valor adaptativo para o
ambiente do Distrito Federal.
Zaprionus indianus está em total desequilíbrio de Hardy-Weinberg na
RECOR, o que nos levaria a crer que a espécie estaria passando por algum
processos evolutivo que a levariam a uma possível adaptação ao ambiente e
explicaria tal facilidade na colonização deste, como mostram os dados de
abundância em Tidon (2005).
IV. Drosophila sturtevanti
Drosophila sturtevanti, espécie endêmica ao Cerrado, foi a única a
apresentar um valor significativo na regressão linear entre abundância total da
espécie e umidade relativa do ar. (figura 2). Essa relação entre abundância e
umidade é uma relação direta, mostrando uma forte dependência desta espécie
com a presença de umidade no ambiente. É interessante observar que o
acréscimo na abundância durante a época mais úmida é muito mais acentuado
nas zonas urbanas que na RECOR.
- 32 -
6. Considerações finais
Embora tenha ocorrido uma variação temporal na abundância das
espécies estudadas, não foi observado um padrão claro que explique a
oscilação de todas as espécies e em todos os locais. Os resultados das
regressões feitas para se observar um possível padrão de variação da
abundância relacionado a variáveis climáticas foi pouco significativo de acordo
com a tabela 2, exceto para a umidade em relação à abundância de Drosophila
sturtevanti. Assim concluímos que, nas condições deste trabalho há uma grande
dificuldade em associar variações na abundância de espécies de drosofilídeos
coletadas com as variáveis climáticas.
Sabe-se que a heterozigosidade é aceita como sendo o mecanismo
primário pelo qual a seleção natural mantém a variação genética em populações
naturais (Lewontin, 1966). Partindo desse pressuposto, e analisando a
heterozigosidade média das populações de Drosophila mercatorum, Drosophila
simulans e Zaprionus indianus, observou-se que a espécie Drosophila
mercatorum possui o índice mais alto de heterozigose em sua população, algo
já esperado por esta ser endêmica no Cerrado. O também elevado índice de
heterozigosidade de Zaprionus indianus pode ser umas das causas do sucesso
desta espécie invasora no cerrado brasiliense.
Concluímos neste trabalho que há uma grande dificuldade em ligar
variações na abundância de espécies de drosofilídeos coletadas neste trabalho
com as variáveis climáticas.
Notamos uma clara relação entre o grau de endemia das espécies das
espécies e a heterozigosidade média observada.
Devido a maior heterozigosidade média da Drosophila mercatorum e por
esta ser uma espécie endêmica, esperávamos encontrar uma maior estabilidade
nos níveis de abundância correlacionados a ela, porém, devido aos discrepantes
- 33 -
resultados em abril de 2004 (chuvas) isto não se verificou. Portanto a alta
heterozigosidade média em abril de 2004 na RECOR poderia ter ocorrido devido
não há um aumento real de heterozigosidade média, mas sim ao pequeno
numero de indivíduos coletados, aumentando o erro experimental.
Os dados do mês de abril, também são altamente variáveis em quase
todas as espécies, ambientes e alelos analisados. Houve uma forte alteração
nos níveis populacionais de todos os drosofilídeos sem uma explicação clara
dentro dos fatores analisados neste estudo.
Para futuros estudo recomendamos uma análise temporal mais longa e
freqüente, verificando uma possível sazonalidade dos dados e não apenas uma
variação temporal nestes. Isto possibilitaria separarmos variações estocásticas
(como a que possivelmente ocorreu em abril de 2004) das variações sazonais.
Seria interessante fazermos mais medidas em futuros estudos para
Drosophila sturtevanti para verificarmos se a relação linear significativa que
encontramos para essa espécie se confirmaria real ao longo dos anos ou se foi
um efeito pontual do período de 2003/2004.
Recomendamos também o estudo de mais localidades com ações
antrópicas semelhantes para uma melhor comparação espacial da variação
genética assim como também o uso de uma variedade maior de marcadores
genéticos para uma verificação mais precisa da ocorrência ou não de processos
evolutivos.
- 34 -
7. Referências Bibliográficas
Alfenas AC (1998) Eletroforese de isoenzimas e proteínas afins: fundamentos e
aplicações em plantas e microorganismos. Editora da UFV, Viçosa, 574 pp.
Beardmore JA (1963) Mutual facilitation and the fitness of polymorphic populations.
Amer. Naturalist 97:69-74.
Borash DJ, Gibbs AG, Joshi A and Mueller LD (1998) A genetic polymorphism
maintained by natural selection in a temporally varying environment. Amer.
Naturalist 151:148-156.
Brncic D and Napp M (1980) Allozyme and inversion polymorphisms in Chilean
natural populations of Drosophila flavopilosa. Brazilian J. Genetics 3:21-29.
Carrasco CE, Pérez-Chiesa Y, Bruck D (1984) The esterases of Drosophila dunni.
Comp. Biochem Physiol. 79B:375-378.
Dias, B. F. S. (1985). Atlas do Distrito Federal, Vol II. Distrito Federal,
SEMATEC.
Eanes WF (1999) Analysis of selection on enzyme polymorphisms. Ann. Rev. Ecol.
Syst. 30:301-326.
Ferreira LB and Tidon R (2004) Colonizing potential os Drosophilidae (Insecta,
Díptera) in environments with different grades of urbanization. Biodiv. And
Conservation 00:1-13.
- 35 -
Futuyma DJ (1992) Biologia evolutiva. SBG, Ribeirão Preto, 646 pp.
Gilbert P, Moreteau B, Moreteau J-C, Parkash R and David JR (1998) Light body
pigmentation in Indian Drosophila melanogaster : a likely adaptation to a hot
and arid climate. J. Genetics 77:13-20.
Gillespie JH and Langley CH (1974) A general model for enzyme variation in natural
populations. Genetics 76:837-884.
Gladis F and Valente VLS (1985) Study on the fluctuation in Drosophila populations
of Bento Golçalves, RS, Brazil. Rev. Bras. Biol. 45:133-141.
Healy MJ, Dumancic MM, Oakeshott JG (1991) Biochemical and physiological
studies of soluble esterases from Drosophila melanogaster. Biochem. Genetics
29:7-8.
Hedrick PW (1986) Genetic polymorphism in heterogeneous environments: a
decade later. Ann. Rev. Ecol. Systematics 17:535-566.
Herrewege LV and David JR (1997) Starvation and desiccation tolerances in
Drosophila: comparison of species from different climatic origins. Ecoscience
4:151-157.
Hubby JL and Lewontin RC (1966) A molecular approach to the study of genic
heterozygosity in natural population. I. The number of alleles at different loci in
Drosophila pseudoobscura. Genetics 54:577-594.
Huston MA (1994) Biological diversity-The coexistence of species on changing
landscapes. Cambridge University Press, UK, 681pp.
IBGE (2005) http://www.recor.org.br/Estacao/estacao.html.
- 36 -
Kimura MT (1976) Drosophila survey of Hokkaido. Micro-distribution and sazonal
fluctuations of Drosophilids flies dwelling among the undergrowth plants.
Zoology 20 (2):192-2002.
Lapenta AS, Bicudo HEMC, Ceron CR, Cordeiro A (1995) Esterases patterns of
species in the Drosophila buzzatii cluster. Cytobios 84:13-29.
Lapenta AS (1998) Caracterização de espécies de Drosophila do "cluster" buzzatii
com base nos padrões de esterases. Tese de Doutorado, Universidade
Estadual Paulista, São José do Rio Preto.
Lehninger AL, Nelson DL and Cox MM (1995) Princípios de bioquímica. Editora
Sarvier, São Paulo, 839 pp.
Lewontin RC and Hubby JL (1966) A molecular approach to the study of genic
heterozygosity in natural population. II. Amount of variation and degree of
heterozygosity in natural population of Drosophila pseudoobscura. Genetics
54:595-609.
Lunday AJ, Farmer JL (1983) Tissue localization of esterase-5 in Drosophila
pseudoobscura. Biochem. Genetics 2:453-463.
Mateus RP and Sene FM (2003) Temporal and spatial allozyme variation in the
South American cactophilic Drosophila antonietae (Diptera: Drosophilidae).
Biochem. Genetics 41:219-233.
Morales AC (2001) Dinâmica em uma zona de contato entre espécies cactófilas de
Drosophila nos estados de Santa Catarina e Rio Grande do Sul. Dissertação
de Mestrado, USP, Ribeirão Preto.
Odum EP (1988) Ecologia. Guanabara-Koogan, RJ, 434 pp.
- 37 -
Parsons PA (1973) Behavioural and ecological genetics. A study in Drosophila.
Clarendon Press, Oxford, 223 pp.
Parsons PA (1982) Evolutionary Ecology of Australian Drosophila - a Species
Analysis. Evolutionary Biology 14: 297-350.
Pereira MAQR (1979) Estudo da variabilidade genética em populações naturais de
Drosophila mercatorum pararepleta. Dissertação de Mestrado, USP, São
Paulo.
Pereira SMF, Magalhães AS, Toledo FSA, Cohen CM (1981) A study of esterase
isozyme in D. mercatorum pararepleta (Drosophila, díptera). Rev. Brasil.
Genet. 3:309-316.
Powell, JR (1997) Progress and prospects in evolutionary Biology: The drosophila
model. Oxford University Press, N.Y,562pp.
Powers DA, Lauerman T, Crawford DL, Dimichele L. (1991) Genetic mechanisms for
adapting to a changing environment. Annu. Rev. Genet. 25:629-659.
Ricklefs RE (1996) A economia da natureza. Granabara-Koogan, RJ, 470 pp.
Roughgarden J (1996) Theory of population genetics and evolutionary ecology: an
introduction. Stanford University, USA, 328 pp.
Sene FM, Val FC, Vilela CR and Rodrigues-Pereira MAQ (1980) Preliminary data on
the geographical distribution of Drosophila spp. within morpho-climatic domains
of Brazil. Pap. Avul. Dep. Zool. Sec. Agric. 33:315-326.
Sene FM, Amabis JM, Carson HL and Cyrino THFS (1981) Chromosomal
polymorphism in Drosophila mercatorum pararepleta in South America. Revta
bras. Genet. 4:1-10.
- 38 -
Shorrocks B (1977) Ecological Classification of European Drosophila Species. Oecologia 26(4): 335-345.
Solferini VN and Selivon D (2001) Polimorfismos de isoenzimas. In: S. R. Matioli
(eds) Biologia Molecular e Evolução. 1. Editora Holus, São Paulo-SP, pp 137-142.
Stryer L (1996) Bioquímica. Editora Guanabara Koogan, Rio de Janeiro - RJ, 1000 pp.
Swofford D and Selander R (1989) BIOSYS-1. A Computer Program for the Analysis
of Allelic Variation in Population Genetics and Biochemical
Systematics. Release 1.7. Illinois Natural History Survey Press. 43p.
Suzuki DT, Griffiths AJF, Miller JH and Lewontin RC (1992) Introdução à genética.
Guanabara Koogan, Rio de Janeiro-RJ, 633 pp.
Tidon R (2005) Relationships between drosophilids (Diptera, Drosophilidae) and
environment in two contrasting tropical vegetations. Biol. J. Linn. Soc. In press.
Tidon R, Leite DF and Leão BFD (2003) Impact of the colonization of Zaprionus
(Diptera, Drosophilidae) in different ecosystems of the Neotropical region: 2
years after the invasion. Biological Conservation 112:299-305.
Tidon-Sklorz R and Sene FM (1992) Vertical and temporal distribution of Drosophila
(Diptera, Drosophilidae) species in a wooded area in the state of Sao Paulo,
Brazil. Revta. bras. Biol. 52:311-317.
Valente VLS, Araújo AM (1991) Ecological aspects of Drosophila species in two
contrasting environments in Southern Brazil (Diptera, Drosophilidae). Revta.
bras. Entom 35(2):237-253.
Valente VLS, Ruszczyk A and Santos RA (1993) Chromosomal polymorphism in
urban Drosophila willistoni. Brazilian J. Genetics 16:307-319.
- 39 -
Vilela CR (1983) A revision of the Drosophila repleta species group (Diptera,
Drosophilidae). Revta. bras. Entom. 27:1-114.
Vilela CR (1999) Is Zaprionus indianus Gupta, 1970 (Diptera, Drosophilidae)
currently colonizing the Neotropical region? Drosophila Imformation Service.
82: 37-39.
Wilkinson L (1990) Systat: The system for statistics. Systat Inc., Evnston.
- 40 -
Resumo
Esterases têm sido amplamente usadas no estudo da variação genética em ambientes
variáveis. Este estudo teve dois objetivos. O primeiro foi investigar a distribuição
temporal a abundância de Drosophila mercatorum e D. sturtevanti, ambas as espécies
endêmicas da Região Neotropical, e D. simulans e Zaprionus indianus, duas espécies
exóticas, comparando três diferentes locais expostos a diferentes graus de
urbanização. Um total de 11000 espécies foram coletadas sendo analisadas
geneticamente um montante de 1000 indivíduos. As quatro espécies estudadas tiveram
maior abundância nas áreas mais antropizadas e Z. indianus foi a espécie dominante
em todos os locais. Explorou-se também a distribuição temporal na freqüência dos
alelos de esterase nos mesmos locais em D. mercatorum, D. simulans e Z. indianus
nos períodos de julho de 2003 a abril de 2004, sendo feitas coletas a cada três meses.
Os padrões de esterase foram separados por eletroforese de poliacrilamida a 10 e 12%
e coradas com coloração enzimo-específica, revelando padrões individuais. A maior
heterozigosidade foi detectada em D. mercatorum. As freqüências alélicas de cada
espécie variaram temporal e espacialmente.
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Summary
Esterases have been widely employed to study genetic variation in relation to
environmental changes. This study has two objectives. First, we investigated the
temporal abundance distribution of Drosophila mercatorum and D. sturtevanti, both
endemic species of the Neotropical region, and D. simulans and Zaprionus indianus,
two exotic species comparing three different places exposed to different degrees of
urbanization. A total of 11000 specimens were collected. The four species studied were
more abundant in the most anthropized of the areas studied. Z. indianus was the
dominant species in all sites. We also explored the temporal distribution in frequency of
esterase alleles in D. mercatorum, D. simulans and Z. indianus collected in the same
sites between July of 2003 and April of 2004. Each place was sampled every three
months. A total of 1000 individuals were analyzed. The esterase patterns were
separated by 10 to 12% polyacrilamyde gel electrophoresis and stained with the specific
substratum to reveal the genetic pattern of each individual. The highest heterozygosity
was detected in D. mercatorum. For each species the allele frequencies varied in time
and space.
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