dissertaÇÃo de mestrado dois vizinhos

UNIVERSIDADE TECNOLÓGICA FEDERAL DO PARANÁ

PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM ZOOTECNIA

IZABEL CAROLINA VARGAS PINTO GOGONE

DIAGNÓSTICO DE VÍRUS DE IMPACTO REPRODUTIVO EM

SUÍNOS: APLICABILIDADE DA ESPECTROSCOPIA RAMAN

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

DOIS VIZINHOS

2021

IZABEL CAROLINA VARGAS PINTO GOGONE

DIAGNÓSTICO DE VÍRUS DE IMPACTO REPRODUTIVO EM SUÍNOS:

APLICABILIDADE DA ESPECTROSCOPIA RAMAN

Applicability of Raman micro spectroscopy for viral reproductive failure.

Dissertação apresentada como requisito para obtenção do título de Mestre em Zootecnia, do Programa de Pós-Graduação em Zootecnia (PPGZO), da Universidade Tecnológica Federal do Paraná.

Orientadora: Prof.ª. Drª. Flavia Regina Oliveira de Barros

Coorientadora: Prof.ª. Drª. Raquel de Almeida Rocha Ponzoni

DOIS VIZINHOS

2021

4.0 Internacional

Esta licença permite remixe, adaptação e criação a partir do trabalho, mesmo para fins comerciais, desde que sejam atribuídos créditos ao(s) autor(es) e que licenciem as novas criações sob termos idênticos.

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À minha mãe, axs amigxs de São Paulo e do Paraná, às irmãs com que a vida me surpreendeu.

AGRADECIMENTOS

Agradeço a essa força tão invisível quanto vital, que alguns identificam como

Deus, outros como os Orixás, ou Alá, Buda, Destino, ou mesmo como essa vontade

genuína de fazer da nossa vida mais do que apenas a busca da felicidade individual.

Agradeço à minha mãe, quem lutou bravamente para me criar. Cada

sacrifício, eu sei, foi por amor (o maior de todos) e sou eternamente grata. Espero que

em breve possamos estar mais próximas. Certamente, D. Leninha estará aqui, de

alguma forma, para comemorar essa vitória conosco.

Agradeço às amigues: vocês são a base da minha vida! Amo cada ume!

Menines da Vet, Tchutchus, es guerreires que sobreviveram à Palotexas, amigues de

quase duas décadas do Rubens, amigues que parecem de décadas, mas que conheci

em Dois Vizinhos! Agradeço demais a cada ume!

Agradeço à vida por recentemente me abençoar com a realização de um

grande sonho de infância: ter irmãos! Aos 33 ganhei duas irmãs mais velhas (e sabe-

se lá quantos mais virão, né, Marília?! Chama o Bonde!).

Agradeço aos colegas de trabalho, tanto os da minha equipe como os de

outros setores, assim como à minha chefia, por sempre serem compreensivos e

pacientes. O apoio de vocês foi determinante para eu conseguir chegar até aqui.

Agradeço especialmente às minhas orientadoras, Flávia e Raquel, por quem

a profunda admiração que cultivo, assim como a forma gentil e profissional com que

conduziram todo o projeto, trouxeram leveza e seriedade a esta tarefa.

Agradeço com muito carinho e à equipe – orgulhosamente feminina – que

construiu esse projeto da ideia à publicação: Gláucia e Fabíola (UNIFESP), Danielle

e Rejane (EMBRAPA); ainda, registro minha gratidão à contribuição inestimável da

colega de profissão (muito mais gabaritada, sem dúvida) Marisete, assim como à toda

equipe da EMBRAPA – Concórdia e CEDISA.

E, claro, agradeço ao time de profissionais incríveis e cheios de energia do

LabBarros, foi inspirador trabalhar com vocês, e por favor me desculpem pelos

desenhos medonhos no Gartic!

"Cada tic-tac es un segundo de la vida que pasa, huye, y no se repite. Y hay en ella tanta

intensidad, tanto interés, que el problema es solo saberla vivir. Que cada uno lo resuelva como

pueda"

(Frida Kahlo)

RESUMO

GOGONE, Izabel C. V. P. Diagnóstico de vírus de impacto reprodutivo em suínos: Aplicabilidade da Espectroscopia Raman. 84 f. (Dissertação de Mestrado em Zootecnia - Universidade Tecnológica Federal do Paraná, Dois Vizinhos, 2021).

De grande relevância para a medicina veterinária preventiva, o parvovírus suíno (PPV) é uma das principais causas infecciosas de falha reprodutiva em granjas suínas, responsável por importantes perdas econômicas, principalmente em co-infecção com o circovírus suíno tipo 2 (PCV2). Até o momento, as ferramentas de detecção mais utilizadas são baseadas na Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR), bastante sensível e específica, porém complexa, com altos custos associados, além de exigir de horas a dias para oferecer os resultados. Além disso, a recente pandemia mostrou o quanto a saúde pública demanda estratégias diagnósticas inovadoras e simples, mais adequadas para aplicações em larga escala. O objetivo do presente estudo foi identificar biomarcadores moleculares de infecção de PPV ou PCV2 através da Microespectroscopia Raman (RMS), a fim de fortalecer a base de dados da literatura científica, contribuindo para sua aplicação no diagnóstico em virologia no mundo todo. Para tanto, células de testículo de suíno (ST) foram inoculadas com PPV ou PCV2 e cultivadas in vitro (37 ºC, 5% CO2) por quatro dias. As células fixadas foram então submetidas à investigação RMS usando um laser de 633 nm. Um total de 225 espectros foi obtido para cada grupo experimental: PPV+, PCV2+ e controle negativo (NC). O ajuste teórico dos espectros obtidos foi realizado para o cálculo da Razão de Intensidade de Pico (PIR), a partir da qual os biomarcadores foram identificados. Os biomarcadores que separaram com precisão os três grupos foram, dos mais impactantes aos menos: ácidos nucleicos, proteínas e Arginina, enquanto os biomarcadores de infecção, i. e., picos capazes de diferenciar o controle negativo (NC) contra outros grupos foram principalmente proteínas. Curiosamente, o PPV apresentou resultados de assinaturas específicas, sendo lipídios e ácidos nucleicos os mais impactantes, embora também proteínas. Esses resultados contribuíram para a construção de bases promissoras para a aplicação de RMS em ciências biomédicas, como uma abordagem diagnóstica alternativa.

Palavras-chave: PPV, PCV2, impressões digitais, biomarcadores, SMEDI, PWMS.

ABSTRACT

GOGONE, Izabel C. V. P. Applicability of Raman micro spectroscopy for viral reproductive failure. 2021. 84 p. Thesis (Master’s Degree in Animal Science - Universidade Tecnológica Federal do Paraná, Dois Vizinhos, 2021).

Of great relevance for preventive veterinary medicine, porcine parvovirus (PPV) is one of the major infectious causes of reproductive failure in swine, responsible for important economic losses, specially along with Porcine Circovirus type 2 (PCV2). To date, the most useful detection tool is PCR-based, which is quite sensitive and specific, but laborious, costly and time-demanding. Moreover, the recent pandemic has shown how much public health demands innovative and simple diagnostic strategies that are more suitable for large scale applications. Our goal was to identify molecular biomarkers of PPV or PCV2 infection by Raman Microspectroscopy (RMS), in order to strength the Raman database and to contribute to its application on viral diagnostic worldwide. For this intent, swine testis (ST) cells were inoculated with PPV or PCV2 and in vitro cultured (37 ºC, 5% CO2) for four days. Fixed cells were then subdjected to RMS investigation using a 633 nm laser. A total of 225 spectra was obtained for each experimental group (PPV+, PCV2+ and negative control). Theoretical fitting of obtained spectra was performed for Peak Intensity Ratios (PIR) calculation, from which biomarkers were derived. Biomarkers which accurately separated all three groups were, from the most to the least impactful: nucleic acids, proteins and Arginine, while infection biomarkers, i. e., peaks able to differentiate negative control (NC) against other groups were mostly proteins. Interestingly, PPV show specific biomarkers assignments, being lipids and nucleic acids the most impactful ones, although proteins too. These results built a promising bases for RMS, as an alternative diagnostic approach for biomedical applications.

Keywords: PPV, PCV2, fingerprints, biomarkers, SMEDI, PMWS.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 - C. V. Raman ............................................................................................. 17

Figura 2 - Espalhamentos elásticos (Rayleigh) e inelásticos (Raman) ilustrados. .... 19

Figura 3 - Capsídeo viral do PPV .............................................................................. 22

Figura 4 - Partícula pseudoviral de PCV2 ................................................................. 27

Figura 5 - Ilustração esquemática de um espectroscópio Raman associado ao microscópio confocal, semelhante ao modelo utilizado no presente experimento. ... 33

Figura 6 - Imagem obtida das amostras através do microscópio do equipamento (hotspot) para seleção dos pontos de aquisição de espectros. ................................. 34

Figura 7 – Média de 225 espectros por grupo amostral: PPV+ (azul), PCV2+ (vermelho) e NC (preto). O SE é representado pela área de menor opacidade ao redor das médias. ...................................................................................................... 37

Figura 8 - Modelo de análise multivariada PCA-LDA apresentando clara separação entre os três grupos experimentais: PPV+ (azul), PCV2+ (vermelho) e NC (preto). . 38

Figura 9 – Loadings relativos a cada uma das três PCs mais importantes, sendo: (A) PC1 (loading 1 – vermelho), (B) PC2 (loading 2- azul) e (C) PC3 (loading 3 – verde). .................................................................................................................................. 39

Figura 10 - PIR 1583 – Fenilalanina (Phe) ................................................................ 47

Figura 11 - PIR 1398 – Proteínas .............................................................................. 47

Figura 12 - PIR 894 – Ácidos Nucleicos e Proteínas ................................................. 48

Figura 13 - PIR 1669 – Lipídios, Proteínas e Ácidos Nucleicos. ............................... 48

Figura 14 - PIR 1101 – Ácidos Nucleicos .................................................................. 49


Figura 16 - PIR 985 – Proteínas e Arginina (Arg). ..................................................... 50

Figura 17 - PIR 937 – Proteínas ................................................................................ 52

Figura 18 - PIR 1554 – Amida III e Triptofano (Try) .................................................. 52

Figura 19 - PIR 1300 – Lipídios ................................................................................. 53




Figura 23 - PIR 757 – Proteínas. ............................................................................... 55


Figura 25 - PIR 1654 – Lipídios e Proteínas ............................................................. 56

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Matriz de confusão de LOOCV do modelo analítico PCA-LDA, para a discriminação de espectros Raman obtidos de células infectadas com PPV ou PCV2, além do NC. .............................................................................................................. 38

Tabela 2 - Assinaturas espectrais dos principais picos encontrados no presente estudo. Erro associado à medida da posição (instrumental) ± 1 cm-1 ....................... 40

LISTA DE ABREVIATURAS

aa Aminoácido

Arg Arginina

Cap Proteína de capsídeo

cm Centímetros

DAg Deformação angular

DAx Deformação axial

x g Força centrífuga relativa

He-Ne Hélio-Neônio

Kb Quilo pares de bases

min Minutos

mm Milímetros

mRNA RNA mensageiro

mW Miliwatts

nm Nanômetro

ºC Graus Celsius

Phe Fenilalanina

PLA2 Fosfolipase A2

RBm Modo de breathing do anel

Rep Replicase não estrutural

Se Sensibilidade

Sp Especificidade

Try Triptofano

Tyr Tirosina

v/v Proporção volume : volume

α Alfa

β Beta

μL Microlitro

LISTA DE SIGLAS

10FCV Validação cruzada 10-fold

DNA Ácido dessoxirribonucleico

EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético

FWHM Largura a meia altura

IgG Imunoglobulina G

IgM Imunoglobulina M

LDA Análise de Discriminantes Lineares

LOOCV Validação cruzada leave-one-out

NA Abertura da lente

NC Controle negativo

NS1 Proteína não estrutural 1

NS2 Proteína não estrutural 2

ORF Fase de leitura aberta

PBS Tampão fosfato salino

PC Componente principal

PCA Análise de Componentes Principais

PCR Reação em cadeia pela polimerase

PCV2 Circovírus suíno tipo 2

PPV Parvovírus suíno tipo 1 ou Ungulate protoparvovirus 1

RMS Microespectroscopia Raman

RNA Ácido ribonucleico

RPA Amplificação pela polimerase da recombinase

RPMI Meio de cultura Roswell Park Memorial Institute

SDMS Síndrome Definhante Multissistêmica de Suínos Desmamados

SDN Síndrome da Dermatite Nefropatia

SE Erro padrão

SFB Soro fetal bovino

ST Linhagem de cultivo celular proveniente de testículo suíno

VP1 Proteína viral 1



LISTA DE ACRÔNIMOS

SMEDI Natimortalidade, mumificação fetal, morte embrionária e infertilidade

ELISA Ensaio de imunoabsorção enzimática

LAMP Amplificação isotérmica mediada por Loop

PIR Razão de Intensidades dos picos

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO .....................................................................................................13

2 HIPÓTESES E OBJETIVOS ................................................................................15

2.1 HIPÓTESES .....................................................................................................15

2.2 OBJETIVOS ......................................................................................................15

3 DESENVOLVIMENTO ..........................................................................................16

3.1 REVISÃO DE LITERATURA .............................................................................16

3.1.1 Espectroscopia Raman ...................................................................................16

3.1.2 Parvovirose suína ...........................................................................................21

3.1.3 Circovirose suína ............................................................................................25

3.2 MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................30

3.2.1 Delineamento experimental ............................................................................30

3.2.2 Produção de Amostras ...................................................................................30

3.2.3 Espectroscopia Raman ...................................................................................32

3.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................36

3.3.1 Resultados da análise estatística (PCA-LDA) .................................................36

3.3.2 Biomarcadores gerais .....................................................................................46

3.3.3 Biomarcadores específicos: infecção viral ......................................................51

3.3.4 Biomarcadores específicos: PPV ....................................................................53

4 CONCLUSÕES ....................................................................................................57

REFERÊNCIAS .......................................................................................................58

APÊNDICE A - Teste de Permutação ...................................................................73

APÊNDICE B - PIRs de menor impacto ...............................................................75

13

1 INTRODUÇÃO

A segurança alimentar da população mundial, em consonância com práticas

sustentáveis de produção, é um dos grandes desafios para os próximos anos, em

especial considerando as previsões de crescimento demográfico global, capaz de

superar os 9 bilhões de pessoas até 2050, e 11 bilhões até o final do século (FAO,

2017). Nesse ritmo, seria necessário aumentar a produção mundial de alimentos em

torno de 70% até a metade do século XXI para garantir o acesso a todos os indivíduos

(FAO, 2009). Como resposta, a sociedade exerce pressões crescentes de demanda

para a produção de alimentos, em especial nos últimos 40 anos (MONTAGNESE et

al., 2019).

Na pecuária, a cadeia de suínos destaca-se como importante alternativa de

fonte de proteína animal, tendo em vista sua viabilidade econômica ímpar, graças às

altas taxas de conversão alimentar e prolificidade, além do ciclo de vida curto,

alavancadas principalmente pela criação intensiva (AFOLABI et al., 2019),

determinante para que o Brasil se insira entre os quatro maiores produtores e

exportadores mundiais de suínos, destacando-se o estado do Paraná como o 2º maior

produtor nacional (ABPA, 2020).

A criação intensiva propicia incremento na produção necessária às demandas

do mercado mundial, entretanto gera importantes desafios sanitários e relativos ao

bem-estar animal, uma vez que se baseia em alta densidade populacional (e, portanto,

de indivíduos suscetíveis) e, consequentemente, maior probabilidade de contatos

infecciosos, além de ambientes propícios à manutenção de patógenos

(MONTAGNESE et al., 2019).

Tanto a intensificação da produção como a globalização do comércio de

suínos expõem a importância do controle de doenças infecciosas, uma vez que

representam importante gargalo para o avanço da produtividade da suinocultura, além

de apresentarem recentes mudanças no perfil epidemiológico com crescente ênfase

para enfermidades virais e multifatoriais (BRUM et al., 2013; ZANELLA; MORÉS; DE

BARCELLOS, 2016). Dentre os vários agentes infecciosos que interferem direta e

indiretamente sobre o desempenho reprodutivo de suínos, destacam-se o parvovírus

suíno tipo 1 clássico (PPV) ou, mais recentemente denominado Ungulate

protoparvovirus 1, assim como o Circovírus suíno tipo 2 (PCV2), amplamente

14

dispersos pelas granjas do mundo todo (AFOLABI et al., 2019; COTMORE et al., 2019;

OPRIESSNIG et al., 2020).

A detecção rápida de agentes infecciosos é determinante para a

implementação de medidas de contenção e, portanto, para o controle do foco; a

importância da questão torna-se evidente com relação às doenças transfronteiriças e

ao comércio internacional (CHOMEL, 2003; YEH et al., 2020)

Atualmente, técnicas baseadas na reação em cadeia pela polimerase (PCR),

seja através da metodologia convencional e da quantitativa, são largamente utilizadas

para o diagnóstico de parvovirose e circovirose suínas. Embora sejam sensíveis e

específicas, apresentam algumas desvantagens como protocolos complexos de

extração e necessidade de profissionais altamente treinados para sua condução

(MÉSZÁROS et al., 2017; PISSUWAN et al., 2020). Em linhas gerais, apesar dos

grandes avanços em estratégias diagnósticas de patógenos, gargalos como estes,

além de exigências em infraestrutura, por exemplo, levam a comunidade científica a

explorar continuamente ferramentas inovadoras, especialmente para atender

demandas em saúde pública, como a recente pandemia por Sars-CoV-2 (DESAI et

al., 2020; YEH et al., 2020).

O presente trabalho pretende colaborar nesse esforço conjunto, oferecendo

subsídios para aplicação da espectroscopia Raman para o diagnóstico de mais dois

agentes virais.

15

2 HIPÓTESES E OBJETIVOS

2.1 HIPÓTESES

Os dados obtidos na espectroscopia Raman permitem a diferenciação entre

culturas de células de testículo suíno inoculadas com PPV ou PCV2 e células sem

inóculo, ou seja, o sistema consegue detectar a infecção viral inespecífica.

Os dados obtidos na espectroscopia Raman permitem a diferenciação entre

os três grupos amostrais: células inoculadas com PPV, células inoculadas com PCV2

e células livres de inóculo, refletindo os testes de PCR.

2.2 OBJETIVOS

Objetivo Geral

Obter dados iniciais que fundamentem a utilização de espectroscopia Raman

como ferramenta diagnóstica para detecção de PPV ou PCV2 em amostras biológicas.

Objetivos específicos

Avaliar se os dados obtidos através da espectroscopia Raman diferem

quantitativamente entre os grupos amostrais, quais sejam (1) células inoculadas com

PPV; (2) células inoculadas com PCV2; e (3) células sem inóculo, refletindo os

resultados obtidos no teste padrão ouro, PCR.

Calcular Sensibilidade e Especificidade do teste diagnóstico para PPV e para

PCV2.

Avaliar se é possível identificar picos característicos para células inoculadas

com PPV ou PCV2, a fim de verificar se cada vírus oferece um padrão de leitura

específico (biomarcadores).

16

3 DESENVOLVIMENTO

Espera-se, com o presente trabalho, demonstrar a relevância da inovação em

métodos diagnósticos alternativos para parvovirose e circovirose suínas - e

potencialmente para outras doenças infecciosas, a partir de técnicas idealmente mais

rápidas, acuradas e simples.

A tecnologia de espectroscopia Raman oferece oportunidades promissoras

para essa finalidade e vem se provando como uma ferramenta poderosa para

pesquisa e diagnóstico em virologia (MOOR et al., 2013). Maiores detalhes sobre a

técnica, além de minucioso levantamento bibliográfico acerca das enfermidades em

questão seguem abaixo.

3.1 REVISÃO DE LITERATURA

3.1.1 Espectroscopia Raman

O fenômeno vibracional que receberia o nome de seu descobridor, Sir

Chandrasekhra Venkata Raman (Figura 1), foi descrito primeiramente em 1928

(FERRARO; NAKAMOTO; BROWN, 2003). Apenas nas décadas de 60 e 70 houve

registro da aplicação da técnica para estudo de ácidos nucleicos e virologia

(NĚMEČEK; THOMAS, 2009; THOMAS, 1976), ainda que a iniciativa de testar o

fenômeno para pesquisas nas áreas biológicas tenha sido discutida algumas décadas

antes (BLOUT; MELLORS, 1949; JIN; ZHANG; MARTIN, 2017). Todavia, foi no século

XXI que a combinação entre a microscopia e o desenvolvimento de abordagens

correlatas permitiram a aplicação em larga escala para ciências biomédicas

(ANDRYUKOV et al., 2019).

17

(BOHNING; MISRA; CHOUDHURY, 1998)

Em termos teóricos, é preciso estabelecer inicialmente alguns conceitos, que

são básicos para a interpretação das informações espectrais obtidas através da

espectroscopia Raman. Na ondulatória, a distância entre dois padrões idênticos que

se repetem em uma onda é denominada comprimento de onda (wavelength) (λ),

enquanto a frequência (frequency) (ν) significa o número repetições por unidade de

tempo. Levando em conta que a espectroscopia Raman se baseia no espalhamento

inelástico da luz, uma onda eletromagnética, e que está em velocidade c

(3,0 x 108 m/s), a frequência pode ser escrita como:

𝜈 = 𝑐

𝜆 (1)

Um outro conceito essencial é o do número de onda (wavenumber) (ṽ), cuja

unidade de medida é 1/cm ou simplesmente cm-1, definido pela equação:

(2)

Figura 1 - C. V. Raman

Fonte: Bohning, Misra & Choudhury (1998)

18

Assim, fica clara a diferença conceitual entre frequência (ν) e número de onda

(ṽ).

ν =𝑐

𝜆= 𝑐

1

𝜆= 𝑐ṽ (3)

Além disso, é preciso pontuar, por fim, a relação de interação entre moléculas

e energia do campo eletromagnético associado à luz, a chamada Condição de

Frequência de Bohr, na qual ΔE é a variação de energia entre dois estados quânticos

possíveis, h é a constante de Planck (6,62 x 10-34 m2 kg/ s) e c a velocidade da luz

(3,0 x 108 m/s), dada por

△ 𝐸 = ℎ𝜈 = ℎ𝑐

𝜆= ℎ𝑐ṽ, (4)

e que, consequentemente, pode se expressa pela equação abaixo, na qual E2

representa um estado excitado da molécula e E1 seu estado fundamental:

Δ𝐸 = 𝐸2 − 𝐸1 = ℎ𝑐ṽ (5)

Ou seja, uma molécula absorverá energia ao passar do estado fundamental

para um estado quântico excitado (de E1 para E2) e emitirá na hipótese inversa. As

magnitudes dessa variação de energia, podem ser detectadas por meio de

espectroscopia, ou seja, essa transição de estados energéticos de moléculas pode

ser detectada pela espectroscopia Raman (FERRARO; NAKAMOTO; BROWN, 2003).

Do ponto de vista dos pesquisadores em ciências biomédicas, interessa

compreender que o sistema detecta a variação que uma luz incidente sobre uma

amostra sofre. Portanto, se uma onda eletromagnética conhecida incide sobre uma

amostra, parte é refletida, enquanto outra é transmitida da superfície ao conteúdo do

material. Essa porção refletida emergirá da amostra, sendo majoritariamente

composta pela mesma frequência incidente (espalhamento elástico ou Rayleigh),

porém uma pequena proporção da luz espalhada é constituída por frequências

distintas da original (espalhamento inelástico), como consequência da interação com

a vibração das moléculas que formam a amostra, levando-os a estados mais ou

menos excitados, ainda que por um curto período de tempo (Figura 2). Esse fenômeno

19

é o efeito Raman (Raman effect) ou espalhamento Raman (Raman scattering)

(FERRARO; NAKAMOTO; BROWN, 2003; RODRIGUES; GALZERANI, 2012).

(RENISHAW, 2018a)

Ainda, como detalhado na Figura 2, o espalhamento Raman pode apresentar

dois perfis distintos, com relação à diferença entre a frequências da radiação incidente

(original) e a que emerge da amostra: se houve redução, ou seja, se a frequência que

deixa a amostra (espalhada) é menor do que a incidente, significa que o processo

espalhamento em si absorveu energia (Stoke scattering); por outro lado, se a

frequência da radiação espalhada é maior do que a incidente, o processo de

espalhamento cedeu energia à radiação (Anti-Stokes scattering). Assim, na

espectroscopia Raman, mede-se essa variação na frequência e, consequentemente,

no número de onda (FERRARO; NAKAMOTO; BROWN, 2003; RODRIGUES;

GALZERANI, 2012).

Portanto, o princípio da técnica consiste na detecção de variações de

frequências vibracionais que são únicas e originadas da interação da radiação com as

moléculas constituintes da amostra, refletindo assim sua composição em termos de

grupos funcionais, ligações entre os átomos e geometria molecular. Moléculas

complexas geram picos tão únicos de captação dessas frequências que são

Figura 2 - Espalhamentos elásticos (Rayleigh) e inelásticos (Raman) ilustrados.

Fonte: Renishaw (2018)

(Stokes)

20

comparados às impressões digitais (MOOR et al., 2013). Assim, os resultados obtidos

da análise fornecem um perfil bioquímico das amostras (NĚMEČEK; THOMAS, 2009).

Trata-se de uma ferramenta não invasiva, comprovadamente capaz de

identificar microrganismos específicos sem a necessidade de métodos de marcação

(tais como fluorescência, radioatividade, reações químicas etc), adaptável para ser

utilizada em diversos estados físicos de amostras; em especial, a água não interfere

na obtenção de dados, uma imensa vantagem para obtenção de informações de

infecção em células vivas de cultivos celulares, por exemplo (NĚMEČEK; THOMAS,

2009).

Resultados promissores já foram obtidos com Adenovirus (FAN et al., 2010;

MOOR et al., 2013, 2014), vírus da Hepatite B e C (CHENG et al., 2020; CUI; ZHOU,

2020; DITTA et al., 2019; KASHIF et al., 2020; KHAN et al., 2019; NASEER et al.,

2019; TONG et al., 2019), Echovirus 1 (RUOKOLA et al., 2014), vírus Influenza (EOM

et al., 2019; XIAO et al., 2019), Norovirus, Parvovirus, Rotavirus (FAN et al., 2010;

LUO et al., 2017), virus da Dengue (AMIN et al., 2017; GAHLAUT et al., 2020; KHAN

et al., 2016), HIV (OTANGE et al., 2019) Herpesvirus e Coronavirus (FAN et al., 2010;

HULEIHEL et al., 2016), inclusive o SARS-CoV-2 (CARVALHO; NOGUEIRA, 2020;

DESAI et al., 2020; MADDALI et al., 2020). A aplicação da espectroscopia Raman em

virologia foi extensivamente revisada há poucos anos (SANTOS et al., 2017).

Ainda, variações da metodologia original para incrementar o sinal a ser

detectado com o equipamento, também vem sendo desenvolvidas, através do

emprego de nano partículas de metais como o ouro ou prata, tais como Tip-enhanced

Raman spectroscopy e Surface-enhanced Raman spectroscopy (KHAN et al., 2016,

2018; LEBEDEV et al., 2016; MOOR et al., 2014; SALMAN et al., 2014; XIAO et al.,

2019).

Até o momento não se tem informação sobre o uso de espectroscopia Raman

para estudo e diagnóstico de vírus de importância reprodutiva em suínos, tais como

PPV e PCV2. Como trata-se de uma metodologia que dispensa processamento

complexo prévio e permite leituras rápidas e precisas de amostras biológicas, sua

aplicação neste contexto pode representar um campo promissor de estudo para

contribuir com o arcabouço de estratégias diagnósticas de forma inovadora e

potencialmente mais acessíveis.

21

3.1.2 Parvovirose suína

Ungulate protoparvovirus 1 (PPV)

PPV é considerado a mais importante causa infecciosa de falha reprodutiva

em suínos de todo o mundo, além de determinante da síndrome SMEDI (do inglês

stillbirth, mummification, embryonic death e infertility para natimortalidade,

mumificação fetal, morte embrionária e infertilidade). Desde sua descoberta no final

dos anos 60, as manifestações clínicas decorrentes da infecção por PPV são um

problema para a cadeia produtiva suína no mundo todo, constituindo-se como um dos

principais e mais comuns agentes relacionados à infertilidade (MÉSZÁROS et al.,

2017; STRECK; CANAL; TRUYEN, 2015), endêmico na maioria dos países

produtores de suínos (AFOLABI et al., 2019). Em fetos mumificados, a frequência de

material genético de PPV encontrada foi de 68%, sendo 45% de co-infecção com

PCV2 (HERDT et al., 2019).

Trata-se de um vírus pequeno, não-envelopado, constituído por capsídeo que

protege o genoma viral, composto por uma única molécula de DNA fita simples com 4

a 6,3 Kb, codificante de cinco proteínas através de splicing alternativo (Figura 3)

(ZIMMERMAN et al., 2019). As proteínas não estruturais NS1 e NS2 atuam na

replicação, particularmente do DNA, enquanto a proteína estrutural VP2 (smaller) é

codificada a partir do splincing alternativo de uma sequência maior, VP1 (larger);

assim, podemos dizer que a sequência codificante de VP2 está inserida no gene VP1.

Uma terceira proteína estrutural, VP3, é obtida após a ação pós-traducional de

proteases em algumas moléculas (ZIMMERMAN et al., 2019). O virion é composto de

60 cópias de proteínas estruturais, sendo 90% de VP2, principal envolvida na resposta

de defesa pelo hospedeiro e, portanto, de suma importância para o desenvolvimento

de profilaxia através de imunobiológicos ou desenvolvimento de testes diagnósticos

(OH et al., 2017; ZIMMERMAN et al., 2019).

(SIMPSON et al., 2002)

22

Até poucos anos atrás, acreditava-se que o PPV era único dentre os

parvovírus a apresentar relativa estabilidade evolutiva, inclusive do ponto de vista de

imunogenicidade e eficácia vacinal (MÉSZÁROS et al., 2017). Estudos recentes

demonstraram que PPV é muito mais geneticamente diverso do que se imaginava,

pois apresenta taxas de mutação análogas às de vírus RNA, de forma semelhante

aos aparentados parvovírus de carnívoros. Particularmente, mutações em VP1/VP2

são preocupantes com relação à eficácia das vacinas disponíveis, desenvolvidas

sobre isolados de décadas atrás (FOERSTER et al., 2016; STRECK; CANAL;

TRUYEN, 2015).

Manifestações clínicas

Do ponto de vista das consequências clínicas, muitos experimentos

demonstraram que a infecção em fêmeas gestantes a qualquer momento antes da

Figura 3 - Capsídeo viral do PPV

Fonte: Simpson et al. (2002)

23

metade da gestação causará falhas reprodutivas - exceto quando os embriões estão

protegidos pela zona pelúcida no período pré-implantação (até 17 dias após

fecundação) - ao passo que infecções fetais após os 70 dias de gestação geram

soroconversão dos fetos, já então imunocompetentes, que nascem clinicamente

saudáveis (KERR et al., 2006; MÉSZÁROS et al., 2017).

Morte embrionária e reabsorção de tecidos moles são as lesões mais

comumente encontradas no início do desenvolvimento fetal; entretanto, depois que os

fetos se tornam imunocompetentes, não há lesões macroscópicas nem

consequências clínicas da infecção, assim como em animais adultos, que podem

atuar como fontes de infecção do vírus (ZIMMERMAN et al., 2019). De fato, suínos

infectados podem excretar PPV desde o 4º dia pós-infecção e mantê-la por pelo

menos 49 dias (MÉSZÁROS et al., 2017).

Métodos diagnósticos

Didaticamente, as técnicas diagnósticas em microbiologia incluem métodos

diretos e indiretos. Os diretos são aqueles nos quais se pesquisa a presença atual do

agente, tais como estruturas morfológicas típicas, antígenos ou material genético.

Esse tipo de técnica favorece a correlação direta entre os achados clínicos e o

possível agente causal, na medida que comprovam a presença do microrganismo no

momento da coleta da amostra. Uma desvantagem desses métodos é que se a

infecção foi debelada pelo hospedeiro, o teste pode oferecer resultado negativo,

mesmo se o quadro foi causado pelo microrganismo. Alguns exemplos desse tipo de

metodologia diagnóstica são a Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR),

Imunofluorescência Direta, Imunoperoxidase para detecção de antígenos, dentre

outros (WASHINGTON, 1996).

Técnicas diagnósticas indiretas, por sua vez, são aquelas que pesquisam os

anticorpos produzidos como resposta imune específica do hospedeiro contra a

infecção. Por essa razão, não necessariamente indicam que o processo infecioso

esteja ocorrendo no momento da coleta da amostra – embora a diferenciação entre o

tipo de Imunoglobulina presente, IgM ou IgG possa oferecer maiores informações

sobre o momento da infecção – tendo em vista que esses anticorpos podem durar

meses ou anos como, por exemplo, na proteção explorada através da vacinação. Um

dos exemplos clássicos de diagnóstico indireto é o Ensaio Imunoenzimático (ELISA)

24

que, embora preciso, é complexo e depende da resposta imune do hospedeiro

(WASHINGTON, 1996).

Os diversos métodos diagnósticos são considerados em termos de dois

parâmetros principais, quais sejam a Sensibilidade e a Especificidade de testes

diagnósticos. A primeira variável determina, em proporção, a capacidade do teste em

detectar o patógeno-alvo na amostra ou, quando esta de fato é positiva, a habilidade

do teste em identificar indivíduos doentes. A Especificidade, por outro lado, determina

também em termos proporcionais a capacidade do teste em identificar corretamente

o indivíduo que, de fato, não está acometido, ou seja, classificar corretamente um

indivíduo como não-doente (PARIKH et al., 2008).

Outrossim, cabe delimitar os conceitos de Sensibilidade e Especificidade

Analíticas, distintos daqueles previamente descritos; neste caso, trata-se da mínima

quantidade amostral capaz de oferecer resultados confiáveis (Sensibilidade Analítica),

ou seja, que o teste detecte a presença do agente e não de qualquer outro

(Especificidade Analítica) (RIBEIRO et al., 2016).

As amostras comumente utilizadas para diagnóstico podem ser de secreções

de origem nasal ou genital, mucosa intestinal, sangue, rins, pulmões, linfonodos e

produtos de abortamentos. Outros métodos moleculares incluem Amplificação

Isotérmica Mediada por Loop (LAMP), um método alternativo à PCR que não depende

de altas temperaturas para desnaturação das fitas complementares de DNA;

nanoPCR, por sua vez, permite o incremento da técnica tradicional com relação à

sensibilidade, especificidade e taxas de extensão através da aplicação de nano

materiais mimetizando a ação de biomoléculas; amplificação pela polimerase da

recombinase (RPA), método oriundo da técnica clássica, cujo objetivo é permitir o

diagnóstico no ponto de cuidado por dispensar o uso de equipamentos elaborados

através de uma abordagem enzimática. Esses métodos, embora bastante sensíveis,

ainda não são atualmente aplicáveis na rotina diagnóstica (ABUKHALID; PASTEY,

2017; MÉSZÁROS et al., 2017; MONTAGNESE et al., 2019; PAN et al., 2012).

Apesar de bem estabelecidos, esses métodos ainda exigem tempo e valores

nem sempre acessíveis ao produtor, deixando uma lacuna em termos de métodos

diagnósticos rápidos, sensíveis, específicos e acessíveis, que recentemente diversos

autores procuram preencher (MONTAGNESE et al., 2019; PFANKUCHE et al., 2018;

WANG et al., 2017, 2019; YANG et al., 2016; YU et al., 2015).

25

Testes capazes de detectar simultaneamente mais de um agente são

particularmente interessantes, tais como multiplex-PCR, considerando que as co-

infecções são uma realidade em granjas suínas (ZHENG et al., 2018);

particularmente, parece bem estabelecida na literatura a relação associativa positiva

entre a infecção por PPV e PCV2 na conformação de desordens reprodutivas

(OUYANG et al., 2019; SEGALÉS, 2012). Foi sugerido que PPV seja capaz de facilitar

a infecção por circovírus, em razão das consequências de sua própria replicação no

sistema de defesa do hospedeiro ou, ainda, por incrementar a replicação viral através

de ativação celular no hospedeiro (MÉSZÁROS et al., 2017).

Profilaxia

As vacinas inativadas utilizadas atualmente são baseadas na estirpe NADL-2

ou similares; são bastante eficazes contra infecções homólogas, isto é, pela mesma

estirpe utilizada na vacina, mas não oferece proteção cruzada (contra a estirpe 27,

por exemplo) (MÉSZÁROS et al., 2017). Ainda que as vacinas vivas ou de vetores

sejam propostas promissoras, as questões éticas e legais envolvidas - por exemplo,

para obter a licença de manuseio de organismos geneticamente modificados - ainda

impedem que se tornem mais amplamente utilizadas. Além disso, falhas vacinais e a

dispersão através de populações não submetidas a profilaxia (tais como suínos ferais

ou fauna silvestre) representam importante fonte de variabilidade fenotípica,

destacando a importância de detecção rápida do vírus (MÉSZÁROS et al., 2017).

3.1.3 Circovirose suína

Circovírus suíno tipo 2 (PCV2)

PCV2 é conhecido como um patógeno viral universal, dada a sua presença

ubíqua em granjas suínas por todo o mundo, cuja soroprevalência pode chegar a 80%

(AFOLABI et al., 2017). Cerca de 98% das granjas americanas são positivas para

PCV2, e taxas semelhantes são descritas por todo o mundo; uma possível explicação

para a frequência altíssima é a capacidade do agente de manter infecções

persistentes, além da alta capacidade de viabilidade ambiental (SHEN; HALBUR;

OPRIESSNIG, 2012; SSEMADAALI; ILHA; RAMAMOORTHY, 2015). A mortalidade

26

pode variar entre 3 a 10% e a taxa de descarte pode chegar a 40% (AFOLABI et al.,

2017). Há relato de frequência de 87% de PCV2 em fetos suínos mumificados, no Sul

do Brasil (HERDT et al., 2019).

Menor vírus relatado em animais, o PCV2 apresenta virion composto de

capsídeo não envelopado de morfologia icosaédrica, composta por 60 proteínas de

capsídeo. O DNA simples e circular apresenta 1767 a 1768 nucleotídeos (AFOLABI

et al., 2017; KLAUMANN et al., 2018; ZIMMERMAN et al., 2019) (Figura 4) . Postula-

se que a replicação viral seja dependente de proteínas expressadas na fase S do ciclo

celular, e por isso células com altas taxas de divisão celular seriam os principais alvos.

Após a penetração na célula hospedeira, o genoma consolida sua forma genômica

replicativa, apresentando conformação de dupla-hélice. São conhecidas 11 regiões

codificantes (ORF, do inglês open reading frame), sendo apenas 3 conhecidas por

expressar proteínas descritas: ORF1 (gene Rep), única na fita senso, é responsável

pela expressão de suas replicases não estruturais, Rep e Rep', importantes no

processo de replicação viral e a mais conservada entre os genótipos conhecidos;

ORF2 (gene Cap) expressa a única proteína do capsídeo viral (Cap); e ORF3, que por

sua vez codifica uma proteína estrutural de 105 aminoácidos capaz de induzir

apoptose celular in vitro, determinante para virulência do agente (ZIMMERMAN et al.,

2019). Por ser a linha de frente no reconhecimento imunológico do agente pelo

hospedeiro, a proteína Cap é o principal alvo para desenvolvimento de

imunobiológicos e ferramentas diagnósticas (SSEMADAALI; ILHA; RAMAMOORTHY,

2015).

(MO et al., 2019)

Desde que foi descrito na década de 90, observa-se que PCV2 está em

dinâmico processo evolutivo e atualmente pelo menos cinco genótipos já foram

descritos, dos quais PCV2a, 2b e 2d foram correlacionados com manifestações

clínicas em suínos. A co-infecção entre os genótipos não só é possível como pode ser

fonte da variabilidade genética em razão de fenômenos de recombinação entre eles,

assim como a co-infecção com outros agentes pode impor pressões de seleção e

consequentemente variabilidade (AFOLABI et al., 2017; FRANZO; SEGALÉS, 2018;

SSEMADAALI; ILHA; RAMAMOORTHY, 2015).

27

Manifestações clínicas

A maior parte das infecções cursa com manifestações subclínicas, ou seja,

que cursa sem sinais evidentes da infecção; porém, além das conhecidas

consequências reprodutivas, diversos quadros foram relacionados à infecção por

PCV2, sendo a Síndrome Definhante Multissistêmica de Suínos Desmamados

(SDMS) e a Síndrome da Dermatite e da Nefropatia (SDN) as mais bem estabelecidos

na literatura (AFOLABI et al., 2017; OUYANG et al., 2019; SEGALÉS, 2012).

SDMS é mais comum em animais de 2 a 4 meses de idade, como resultado

da combinação de altas taxas de excreção viral, viremia intensa e baixa resposta

humoral. A morbidade varia de 4 a 30% mas pode alcançar até 60% e a mortalidade

varia de 4% a 20%. O quadro clínico é caracterizado por palidez, angústia respiratória,

Figura 4 - Partícula pseudoviral de PCV2

Fonte: Mo et al. (2019)

28

diarreia e ocasionalmente icterícia, podendo levar a descarte de animais

(ZIMMERMAN et al., 2019).

SDN acomete animais na creche, em crescimento e animais adultos. A

prevalência em geral é baixa; contudo, a mortalidade aumenta com o desenvolvimento

e pode chegar a 100% em animais com mais de 3 meses. Situações agudas levam o

indivíduo a óbito em poucos dias ou, em caso de recuperação, esta começa a ser

observada em 7 dias após início dos sintomas. Leitões acometidos apresentam

anorexia, depressão e pouca ou nenhuma febre e andar rígido assim como máculas

e pápulas difusas (ZIMMERMAN et al., 2019).

O contato direto é o mecanismo mais efetivo para a transmissão do vírus; a

maioria dos leitões se infecta entre 4 a 11 semanas de vida e, embora uma baixa

percentagem de fêmeas e leitões apresentem-se virêmicos durante a lactação, essa

via de transmissão é possível, assim como a transmissão sexual, tendo em vista que

o sêmen pode conter o vírus. Há relatos de que o DNA viral foi obtido após 125 dias

da infecção experimental, demonstrando o potencial de manutenção da fonte de

infecção. A campo, a viremia pode chegar a 22 semanas (SSEMADAALI; ILHA;

RAMAMOORTHY, 2015; ZIMMERMAN et al., 2019).

A suscetibilidade dos embriões suínos ao PCV2 varia segundo o estágio de

desenvolvimento gestacional. A inoculação direta experimental em fetos com 57 dias

de gestação desencadeou mumificação - inclusive de indivíduos adjacentes que não

haviam sido inoculados -, enquanto a infecção aos 75 dias foi associada à

natimortalidade. Todavia, a infecção experimental aos 92 dias de gestação parece não

causar nenhum efeito clínico detectável (ZIMMERMAN et al., 2019).

Ressalte-se que a placenta suína é do tipo epiteliocorial difusa, isto é, o

epitélio coriônico e o endotélio são preservados, resultado em seis camadas de tecido

que separam completamente a circulação materna da fetal. Essas camadas são tão

justapostas que sequer permitem a passagem de moléculas como anticorpos. Os

vírus podem ser encontrados em cardiomiócitos, hepatócitos e células da linhagem

de macrófagos e monócitos. Particularmente o coração contém os mais altos títulos

virais e é possível identificar lesões semelhantes a miocardite (ZIMMERMAN et al.,

2019). Abortamentos na fase final da gestação e natimortalidade com evidente

hipertrofia do miocárdio fetal são indicativos para a suspeita de circovirose suína.

Lesões compatíveis com miocardite fibrótica ou necrótica devem ser amostradas para

29

confirmação da presença do agente ou de seu material genético (ZIMMERMAN et al.,

2019).

Métodos diagnósticos

Testes diagnósticos podem ser processados em amostras de tecidos

linfoides, assim como fígado, pulmões, rins ou intestino; porém, em razão do perfil

ubíquo do agente, métodos indiretos podem gerar erros de interpretação, uma vez

que é altamente provável que os animais sejam soropositivos. Nesse sentido, o

padrão ouro para diagnóstico de doença reprodutiva associada a circovirose é a

detecção de antígeno ou material genético do vírus em quantidades que variem de

moderada a alta, através de técnicas como PCR, exame histopatológico, Hibridização

in situ e Imunohistoquímica (AFOLABI et al., 2017). Embora essas técnicas venham

se tornando mais comuns e baratas ao longo do tempo, ainda estão inacessíveis ao

produtor.

Profilaxia

Todas as vacinas disponíveis - inativadas ou recombinantes - se baseiam nos

genótipos PCV2-2a e/ou PCV2-2b e seu emprego nos protocolos vacinais tem sido

considerado bem-sucedido. Entretanto, estudos vêm demonstrando mudanças na

epidemiologia molecular do agente, alterações dos genótipos predominantes e

mesmo a emergência de novos - decorrentes de mutações, recombinação ou diversos

mecanismos de pressão de seleção - o que pode comprometer a eficácia vacinal

(AFOLABI et al., 2017; OPRIESSNIG et al., 2013; SSEMADAALI; ILHA;

RAMAMOORTHY, 2015). Embora não evite a infecção ou impeça a disseminação, a

profilaxia através de vacinas propicia redução da carga contaminante excretada pela

infectado, reduzindo a contaminação ambiental (AFOLABI et al., 2017).

Readequações de manejo vacinal podem, inclusive, ser necessárias para prover

imunidade à fêmea prenhe, no intuito de que a imunização passiva através da lactação

seja efetiva (HERDT et al., 2019).

O uso de vacinas desenvolvidas sobre a estirpe 2a parece ter desencadeado

uma mudança no padrão epidemiológico dos isolados, associado a um drift genotípico

30

- PCV2a substituída por 2b -, relacionado com maior intensidade (KARUPPANNAN;

OPRIESSNIG, 2017).

3.2 MATERIAL E MÉTODOS

Esta seção inclui a descrição pormenorizada dos procedimentos que

permitiram a obtenção dos dados, de modo que possam ser integralmente

reproduzidas futuramente.

Inclui tanto o preparo controlado das amostras de células inoculadas com PPV

ou PCV2, como todo o processo de aquisição dos espectros, pré-processamento dos

dados brutos, validação estatística dos resultados obtidos através de análise

multivariada e cálculo das razões de intensidade entre os picos (PIR), com vistas à

obtenção de biomarcadores específicos.

3.2.1 Delineamento experimental

Para a amostragem, desenhou-se um experimento com duração de cinco dias

incluindo a semeadura de cultivos celulares e inoculação das estirpes, separadamente

(dia 0); manutenção das placas (dias 1 a 3); sincronização do ciclo celular (dia 4); e

fixação e coleta de amostras celulares (dia 5).

Para garantir quantidade de células suficientes para análise e backup caso

repetições fossem necessárias, utilizaram-se placas de 6 poços para o experimento,

em que cada poço representava uma unidade amostral (replicata), e o conjunto de

três poços representa o grupo amostral (triplicata).

3.2.2 Produção de Amostras

Estirpes virais

O inóculo de PPV (101/18 e BRMSA 2341) foi isolado em 2018 a partir de

fetos mumificados oriundos de uma granja produtora de suínos, localizada em Rio

Verde, Goiás, Brasil. Já o inóculo de PCV2 (303/12 e BRMSA 01351) foi isolado em

2012, a partir de amostras de animais que apresentaram quadro clínico compatível

com a Síndrome Definhante Multissistêmica de Suínos Desmamados, provenientes

31

de uma fazenda em Caibi, Santa Catarina, Brasil, o qual se demonstrou pertencer ao

genótipo 2b do PCV2Ambos isolados passaram por confirmação etiológica a partir de

sequenciamento genético (números de acesso MT812690 e KT719404,

respectivamente) (GAVA et al., 2018).

Replicação in vitro

Para replicação in vitro foram utilizadas células estabelecidas da linhagem de

testículo suíno (ST, do inglês Swine Testis), cultivadas em placas de seis poços

(confluência aproximada de 50%), contendo 3mL de meio de cultura para células

Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (Thermo Fischer®) suplementado com 10%

(v/v) de Soro Fetal Bovino (SFB).

Assim, para o preparo das amostras de células infectadas com PPV, foram

adicionados 500 µL de inóculo em cada poço com células estabelecidas, em triplicata,

ao primeiro dia do experimento, enquanto os três poços restantes da placa foram

utilizados como controle negativo (NC), ou seja, o cultivo celular sem inóculo.

Da mesma forma, foram adicionados 500 µL de inóculo de PCV2 a cada um

dos três poços de uma segunda placa, para preparo das amostras. Entretanto, tendo

em vista o requerimento particular para cultivo in vitro de PCV2 (TISCHER et al., 1987;

YANG et al., 2013), foram adicionados 500 µL de D-Glucosamina (Sigma®), no

primeiro e no quarto dias do experimento.

Após 1h de adsorção as placas foram incubadas em estufa (37 ºC, 5 % de

CO2, em umidade saturada), durante todo o experimento (cinco dias).

Para evitar potenciais vieses decorrentes de fases distintas do ciclo celular

nos espectros Raman coletados, ao final do quinto dia todas as amostras foram

submetidas à sincronização do ciclo celular, seguindo protocolo de depleção de SFB

(a 0,5 %) por 24h, o que, associado à confluência celular, permite eficiência no

processo de sincronização com mínimo dano ao material genético e evita morte

celular (BARROS et al., 2010).

Fixação e coleta das amostras

A coleta das amostras celulares foi realizada no quinto dia do experimento e,

para tanto, adicionaram-se 500 µL de solução composta de tripsina a 2 % (v/v) e ácido

32

etilenodiamino tetra-acético (EDTA) 0,25 % (v/v) em tampão fosfato salino (PBS), em

temperatura ambiente, até que o desprendimento celular fosse macroscopicamente

detectável, quando se adicionou 1,5 mL de RPMI suplementado com SFB na

proporção de 10 % (v/v), para bloqueio da tripsinização.

As células foram, então, submetidas à centrifugação a frio (4 ºC), a 1200 x g,

por 4 min, formando precipitados celulares que foram ressuspendidos em 1000 µL de

uma solução de fixação (paraformaldeído 4 % em PBS (v/v)), por 4 min. Procedeu-se,

então, à lavagem para remoção de resíduos da solução fixadora, através de nova

centrifugação a frio, a 1200 x g, por 4 min, com subsequente descarte do

sobrenadante e ressuspensão em 1000 µL de PBS, quando as amostras foram

mantidas sob refrigeração (4-8 ºC), até a coleta dos espectros. Todas as amostras

positivas para PPV e para PCV2, assim como as células não inoculadas (NC), foram

submetidas à confirmação de presença ou ausência dos vírus através de uma técnica

previamente reconhecida pela literatura, atuando como padrão-ouro diagnóstico.

Para detecção de PPV, procedeu-se à extração de DNA através da incubação

(50 ºC, por 1 h) das amostras em solução tampão Cloridrato de

tris(hidroximetil)aminometano (Tris-HCl) com dodecilsulfato de sódio (SDS) (1%) e

proteinase K (0,5 mg / mL), seguida de associação de fenol com solução de

clorofórmio:álcool isoamílico (24:1). A amplificação foi realizada através de

nestedPCR e a sequência-alvo foi do gene codificante da proteína não-estrutural NS1,

por ser altamente conservada entre os parvovírus (SOUCIE et al., 2000).

Já para a confirmação de presença ou ausência de PCV2 foi realizada através

de qPCR, utilizando-se probes específicas (TaqMan) marcadas com FAMTM (6-

carboxyfluoresceína) (porção terminal 5’) e TAMRATM (6-carboxytetrametilrodamina)

(terminação 3’), após a extração com kit comercial (Nucleospin®) (OLVERA et al.,

2004).

3.2.3 Espectroscopia Raman

Aquisição dos espectros

33

Como preparo para a coleta de espectros, as amostras foram centrifugadas a

1200 x g, por 4min, à temperatura de 4º C. 5 µL do precipitado resultante foram

submetidos à coleta de espectros por um microespectroscópio Raman (InViaTM

Renishaw®), utilizando-se a objetiva de 50 x (0,75 NA), esquematizado na Figura 5.

(HOLLRICHER, 2018)

Para a excitação das amostras, utilizou se 100 % da potência de radiação de

um laser de He-Ne com 633 nm de comprimento de onda (espectro visível), ou seja

15 mW na saída do laser e 5 mW ao alcançar a amostra (variação esperada,

decorrente de perdas ópticas no trajeto entre a saída do tubo do laser até que o feixe

alcance a amostra). Embora houvesse outra opção de laser para excitação das

amostras (830 nm), optou-se pelo laser vermelho, uma vez que é sabido que a

eficiência do espalhamento Raman é substancialmente inferior em Infravermelho

Próximo (KERR; BYRNE; HENNELLY, 2015) A amplitude da faixa de detecção vai de

600 cm-1 a 1800 cm-1, com centro estático de 1300 cm-1, portanto na região

denominada fingerprint, na qual há prevalência de picos para amostras biológicas

(HASHIMOTO et al., 2019).

Para representar cada grupo experimental (PPV+, PCV2+ e NC) foram

utilizadas 15 células amostrais, com espectros coletados em 5 pontos distintos de

aquisição em cada uma delas, de forma a representá-las sem viés de localização

celular, totalizando 75 espectros por replicata e, portanto, 225 espectros por grupo

amostral (PPV+, PCV2+ e NC) (Figura 6). Cada aquisição corresponde a 5 s de

Figura 5 - Ilustração esquemática de um espectroscópio Raman associado ao microscópio confocal, semelhante ao modelo utilizado no presente experimento.

Fonte: Hollricher (2018)

Amostra

Espectrômetro

34

exposição ao laser, por janela espectral, com um total de 5 acumulações por espectro,

utilizando-se uma rede de difração de 1800 linhas/mm. Os dados espectrais brutos

foram coletados através do pacote WiRETM (RENISHAW, 2018b).

Pré-processamento dos espectros

O pré-processamento dos dados brutos é uma ferramenta para melhorar a

razão entre sinal e ruído (SANTOS et al., 2017), para o que se utilizou o pacote Raman

Tool Set (CANDELORO, 2013), e consistiu em (1) correção quadrática de baseline

sobre o espectro médio, por grupo amostral; (2) normalização do espectro médio, por

grupo amostral, pela área total do gráfico; (3) atenuação de ruídos, smoothing, através

de função spline cúbica com intensidade de 0,5 (em uma escala em que 0 corresponde

a 100 % de atenuação e 1,0 significa nenhuma), no intuito de evitar perda de picos.

Finalmente, para minimizar os efeitos de variação de uma célula para outra, calculou-

se (4) a média espectral por célula (considerando que foram coletados 5 espectros

por unidade celular), através do programa IGOR Pro (WAVEMETRICS INC., 2019).

Figura 6 - Imagem obtida das amostras através do microscópio do equipamento (hotspot) para seleção dos pontos de aquisição de espectros.

Fonte: Autoria própria (2020)

35

Análise estatística

A análise estatística utilizada para o conjunto de dados foi a multivariada,

aplicando-se Análise de Componentes Principais (PCA) associada à Análise de

Discriminantes Lineares (LDA), que permitem o uso da técnica de “machine learning”

para testes e predição. Nesse sistema, a PCA é utilizada como uma redução das

dimensões dos dados de forma não supervisionada; na segunda fase, aplica-se a LDA

nos dados oriundos da primeira fase, no intuito de incrementar a acurácia da predição

(NASEER et al., 2019).

Para avaliar a capacidade de generalização do modelo analítico escolhido, e

portanto, sua acurácia e capacidade de predição, utilizou-se a validação cruzada pelo

método leave-one-out (LOOCV), confirmada posteriormente pelo método 10-fold

cross-validation (10FCV) no qual a permutação do dados foi repetida 1000 vezes para

o cálculo do erro, conforme metodologia descrita anteriormente (LLOYD et al., 2012).

O teste de permutação é um teste de hipóteses no qual não se pressupõe

uma distribuição particular dos dados, portanto os rótulos dos dados (PPV+, PCV2+ e

NC) são aleatoriamente embaralhados entre cada uma das observações, quando são

calculados os valores de acurácia. Essas análises foram conduzidas através da

linguagem livre R (versão 3.3.0) (R CORE TEAM, 2019), em conjunto com o pacote

Machine Learning Toolbox (KOUL; BECCHIO; CAVALLO, 2018).

Ajuste teórico das curvas experimentais

O conjunto de espectros, representados por uma média, por grupo (PPV+,

PCV2+ e NC) dos dados empíricos, previamente submetidos ao pré-processamento,

assim como o seu respectivo erro padrão da média (SE), foram então submetidos ao

ajuste teórico através de funções gaussianas, utilizando para tanto o pacote Multi peak

Fitting do programa IGOR Pro (WAVEMETRICS INC., 2019). Os ajustes teóricos

foram realizados por janela espectral, a partir de regiões selecionadas do espectro

total. A partir desse ajuste teórico, cada pico do espectro médio é descrito a partir de

três parâmetros, quais sejam: largura a meia altura (FWHM), amplitude e localização.

36

Análise das Razões de Intensidade dos Picos (PIR)

A intensidade dos picos é uma medida arbitrária e, portanto, a análise

comparativa entre picos, necessária para se averiguar o impacto na separação dos

grupos amostrais, é realizada de forma relativa, ou seja, na razão entre as

intensidades dos picos (PIR).

A PIR é calculada a partir dos valores de intensidade obtidos no ajuste teórico,

através da divisão do valor de intensidade de cada um dos picos por um deles, de

cada vez, enquanto o grau de incerteza se expressa pela propagação dos respectivos

valores de SE no cálculo da divisão. O conjunto de dados resultante desse processo

é então apresentado graficamente, permitindo conclusões acerca de biomarcadores

moleculares a serem interpretados no curso do presente trabalho.

3.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados do presente trabalho estão organizados em duas partes. A

primeira contém a validação estatística do modelo, conforme descrito previamente,

composta dos resultados da PCA-LDA. O objetivo dessa primeira seção é demonstrar

que o sistema composto pelos espectros Raman associado à análise multivariada é

capaz de identificar adequadamente os grupos amostrais.

A segunda seção é dedicada à compreensão dos biomarcadores moleculares

encontrados através da análise das PIR, quando os principais picos capazes de

diferenciar adequadamente os grupos amostrais são esmiuçados e interpretados, a

fim de oferecer ferramentas para melhor compreensão dos fenômenos biológicos

decorrentes da infecção por cada um desses agentes.

3.3.1 Resultados da análise estatística (PCA-LDA)

Um total de 225 espectros foram utilizados para calcular um espectro médio

por grupo experimental, gerando, portanto, um respectivo SE (Figura 7).

37

(GOGONE et al., 2021)

A PCA isoladamente não foi capaz de discriminar os grupos experimentais.

Entretanto, a combinação PCA-LDA aplicada ao conjunto dos dados atingiu este

objetivo.

No intuito de evitar sobre-ajuste (overfitting) do modelo teórico aos dados

experimentais, impactando em sua aplicabilidade, foram incluídas apenas seis PCs

(correspondente a 93,73% da variância) para a LDA; portanto, menos da metade do

número de espectros obtidos para cada grupo (CHAN et al., 2009).

O modelo PCA-LCA apresentou clara separação dos grupos experimentais,

conforme se depreende da Figura 8, demonstrando a capacidade do sistema RMS

aliado à PCA-LDA em discriminar células infectadas e não infectadas. Esse resultado

foi validado através de LOOCV e 10FCV, resultando em acurácia de 99,97% e 100%,

respectivamente.

Figura 7 – Média de 225 espectros por grupo amostral: PPV+ (azul), PCV2+ (vermelho) e NC (preto). O SE é representado pela área de menor opacidade ao redor das médias.

Fonte: Gogone et al. (2021)

38

O teste de permutação resultou em 0,34 de precisão do nível de aleatoriedade

e classificação de acurácia de 1, confirmando que os resultados não são ao acaso

(Apêndice A). Ainda, um p-valor de 0,001 para o nível de confiança para exclusão a

hipótese nula (hipótese de o resultado da separação dos grupos ser obtida ao acaso)

foi obtido para o teste de permutação. Em razão de similaridades, apenas a matriz de

confusão para o teste LOOCV é apresentada na Tabela 1, na qual constam

Especificidade de 100% para ambos os agentes virais testados, além de Sensibilidade

de 95,55 % para PCV2 e 97,77 % para PPV.

Tabela 1 - Matriz de confusão de LOOCV do modelo analítico PCA-LDA, para a discriminação de espectros Raman obtidos de células infectadas com PPV ou PCV2, além do NC.

Diagnóstico previsto

NC PVC2+ PPV+

Res

ult

ad

os

ex

pe

rim

en

tais

NC 45 0 0

PCV2+ 2 43 0

PPV+ 1 0 44


Figura 8 - Modelo de análise multivariada PCA-LDA apresentando clara separação entre os três grupos experimentais: PPV+ (azul), PCV2+ (vermelho) e NC (preto).


39

A três primeiras PCs explicam 80,17 % da variância total entre os grupos

amostrais, sendo 43,02 % decorrente de PC1, 21,67 % de PC2 e 15,48 % de PC3;

por serem as mais importantes, foram investigadas com maior detalhamento a partir

dos respectivos loadings, ou seja, a projeção gráfica quantitativa do impacto individual

de cada pico sobre a variância calculada entre as amostras (Figura 9), levando-se em

consideração as assinaturas espectrais associadas a cada pico, conforme Tabela 2.

Figura 9 – Loadings relativos a cada uma das três PCs mais importantes, sendo: (A) PC1 (loading 1 – vermelho), (B) PC2 (loading 2- azul) e (C) PC3 (loading 3 – verde).


40

Tabela 2 - Assinaturas espectrais dos principais picos encontrados no presente estudo. Erro associado à medida da posição (instrumental) ± 1 cm-1

(continua)

Picos

experimentais

(cm-1)

Dados

literatura

(cm-1)

Assinatura Espectral

745 746 DNA/RNA (RBm de Timina) (CHAN et al., 2006)

757 753-760

Triptofano (modo breathing simétrico) (CHENG et al., 2005;

DUKOR, 2006; GALLER et al., 2014; HANLON et al., 2000;

HUANG et al., 2003b; JARQUÍN-DÍAZ et al., 2019; KAMINAKA et

al., 2002; STONE et al., 2002, 2004; SU et al., 2012)

781 781-786

Citosina (RBm) (CHAN et al., 2006; RUIZ-CHICA et al., 2004;

STONE et al., 2002, 2004)

Uracila (RBm) (NOTINGHER et al., 2004; STONE et al., 2002,

2004)

828 826-831

DNA (DAx assimétrico de O-P-O) (LIU et al., 2008; STONE et al.,

2004)

Ácidos nucleicos (DAx de PO2-) (CHENG et al., 2005;

NOTINGHER et al., 2004; STONE et al., 2002, 2004)

Grupo fosfato (CHAN et al., 2006; LIU et al., 2008; STONE et al.,

2002, 2004)

851 850

DNA (MOOR et al., 2014)

Tirosina (ressonância de Fermi do anel fundamental and

harmônico) (SHETTY et al., 2006)

876 876 Hidroxiprolina (νC-C) (assinatura proteica) (HUANG et al., 2003b)

DAx de C-C (FRANK; MCCREERY; REDD, 1995)

894 892-896 Desoxirribose (Dang em plano), Fosfodiéster (GAHLAUT et al.,

2020; RUIZ-CHICA et al., 2004)

937 937-938

Carboidratos (C-O-C) (NOTINGHER et al., 2004)

Glicogênio (BINOY et al., 2004)

Proteinas (DAx C-C, α-hélice) (NOTINGHER et al., 2004)

Proteínas (vibrações da cadeia lateral de aa da Proline e

Hidroxiprolina) (CHENG et al., 2005)

959 960 Fosfato (DAx simétrica de PO4-3) (CHENG et al., 2005)

974 974 Ribose (CHAN et al., 2006)

41


(continua)

Picos

experimentais

(cm-1)

Dados

literatura

(cm-1)

Assinatura Espectral

1002 1000-1008

Fenilalanina (RBm simétrico) (BHATTACHARJEE et al., 2014;

BONNIER; BYRNE, 2012; CHAN et al., 2006; CHENG et al., 2005;

HUANG et al., 2003a; LAKSHMI et al., 2002; LI et al., 2011; LIU et

al., 2008; MALINI et al., 2006; NAUMANN, 1998; SHETTY et al.,

2006; SIGURDSSON et al., 2004; STONE et al., 2004)

1031 1030-1033

Fenilalanina (C-H em plano DAg) (CHAN et al., 2006; CHENG et

al., 2005; HUANG et al., 2003b; STONE et al., 2004)

Fosfolipídios (CH2CH3 DAg) (HUANG et al., 2003b)

1064 1064 Lipídios (DAx do esqueleto de C-C) (STONE et al., 2004)

1085

1093

1094

1078-1094

Fosfato (DAx simétrico) (CHAN et al., 2006; CHENG et al., 2005;

GAZI et al., 2003; HUANG et al., 2003b; MOOR et al., 2014)

Fosfodiéster (DUKOR, 2006; GAZI et al., 2003)

Fosfolipídios (DAx de C-C ou C-O) (HUANG et al., 2003b; MALINI

et al., 2006)

DNA (DAx simétrica de PO2−) (MALINI et al., 2006)

1098 1095-1099

Lipidíos (LASKA; WIDLARZ, 2005)

Proteínas (DAx de C-N) (CHENG et al., 2005)

Ácidos nucleicos (grupo fosfodioxi) (KRAFFT et al., 2005; LIU et

al., 2008)

1101 1095-1105

Lipídios e grupo Fosfodioxi (CHENG et al., 2005; KRAFFT et al.,

2005; LASKA; WIDLARZ, 2005; LIU et al., 2008); Proteínas e

ácidos graxos (LAKSHMI et al., 2002; SHAPIRO et al., 2011;

SHETTY et al., 2006); Fenilalanina (LAKSHMI et al., 2002)

1126 1124-1126

Carboidratos (dissacarídios, sacarose) (SHETTY et al., 2006)

Lipídios (esqueleto do grupo acil) (CHENG et al., 2005)

Proteína (DAx C-N) (CHAN et al., 2006)

1154 1152-1157

Carboidratos, Carotenóides e Proteínas, (CHAN et al., 2006;

DUKOR, 2006; MAHADEVAN-JANSEN; RICHARDS-KORTUM,

1997; NAUMANN, 1998; PUPPELS et al., 1993; RONEN; STIER;

DEGANI, 1990; SILVEIRA et al., 2002; STONE et al., 2002, 2004)

42


(continua)

1171 1168-1176

Lipídios (DUKOR, 2006)

Tirosina (DAg C-H em plano)

(CHAN et al., 2006; CHENG et al., 2005; HUANG et al., 2003b;

LAKSHMI et al., 2002; LIU et al., 2008; STONE et al., 2002, 2004)

1206 1206-1210

Tirosina (BONNIER; BYRNE, 2012; LAU et al., 2005; STONE et

al., 2004); Triptofano

(BHATTACHARJEE et al., 2014; CHENG et al., 2005; HUANG et

al., 2003b; LAU et al., 2005; LIU et al., 2008; STONE et al., 2002,

2004); Citosina e Guanina (CHAN et al., 2006; CHENG et al.,

2005; LIU et al., 2008; RUIZ-CHICA et al., 2004)

1251 1242-1260

Amida III (BONNIER; BYRNE, 2012; DUKOR, 2006; KAMEMOTO

et al., 2010; LAKSHMI et al., 2002; NAUMANN, 1998; SHETTY et

al., 2006; STONE et al., 2004)

1306 1298-1309

Ácidos graxos (DUKOR, 2006; HUANG et al., 2011; KRAFFT et

al., 2005; SHETTY et al., 2006; STONE et al., 2004)

Lipídios (BHATTACHARJEE et al., 2014; CHENG et al., 2005;

HUANG et al., 2003b; LAKSHMI et al., 2002; LIU et al., 2008;

NOTINGHER et al., 2004; RONEN; STIER; DEGANI, 1990;

SHETTY et al., 2006; STONE et al., 2004)

Grupo Metileno (DAg proteínas e fosfolípides) (HUANG et al.,

2003a)

Fosfolipídios (HUANG et al., 2003a)

1316 1313-1320 Bases nucleotídicas; Guanina; Proteínas; Amida III (CHAN et al.,

2006; LAKSHMI et al., 2002; RUIZ-CHICA et al., 2004)

1335 1335-1339

Proteínas (CHAN et al., 2006; CHENG et al., 2005; HUANG et al.,

2003b; STONE et al., 2004)

Ácidos nucleicos (DAg da cadeia de polinucleotídeos); Adenina e

Guanina (RBm) (HUANG et al., 2003b, 2003a; RUIZ-CHICA et al.,

2004; STONE et al., 2002)

1362 1362 Guanina (RUIZ-CHICA et al., 2004)

1398 1395-1938

DAx simétrico de C=O (Ó FAOLÁIN et al., 2005)

Deformação de CH2 (CHENG et al., 2005)

43


(continua)

1447 1447-1465

Amida I e DAg de CH (proteínas) (CHAN et al., 2006; DUKOR,

2006; LAKSHMI et al., 2002; LIU et al., 2008; MOOR et al., 2013;

Ó FAOLÁIN et al., 2005)

Lipídios (CHENG et al., 2005; DUKOR, 2006; LIU et al., 2008)

Fosfolipídios (LAU et al., 2005)

Ácidos nucleicos (RUIZ-CHICA et al., 2004)

1481 1480-1484 Amida II (DUKOR, 2006)

1555 1548-1560

Amida II (LAKSHMI et al., 2002; Ó FAOLÁIN et al., 2005)

Triptofano (CHENG et al., 2005; HUANG et al., 2003b; LAU et al.,

2005; SIGURDSSON et al., 2004; STONE et al., 2002, 2004)

1573 1573-1579

Adenina e Guanina (RBm) (CHAN et al., 2006; RUIZ-CHICA et al.,

2004; STONE et al., 2004)

Ácidos nucleicos (DOVBESHKO, 2000; MAHADEVAN-JANSEN;

RICHARDS-KORTUM, 1997; STONE et al., 2002, 2004)

1583 1582-1585

Fenilalanina (DAg e DAx C=C) (HUANG et al., 2003b)(HUANG et

al., 2011; LAU et al., 2003; Ó FAOLÁIN et al., 2005; SAHU et al.,

2013);

DAx de C-C (SHAPIRO et al., 2011)

1605

1614 1590-1623

Amida I (CHAN et al., 2006; DUKOR, 2006; LUO et al., 2017;

SIGURDSSON et al., 2004)

Lipídios (insaturados) (LUO et al., 2017)

Tirosina (DAx de C=C) (CHAN et al., 2006; CHENG et al., 2005;

LAKSHMI et al., 2002; LUO et al., 2017; STONE et al., 2002,

2004)

Triptofano (DAx de C=C) (CHAN et al., 2006; CHENG et al., 2005;

HUANG et al., 2003b; LAKSHMI et al., 2002; NOTINGHER et al.,

2004; STONE et al., 2002, 2004)

44


(conclusão)

1655

1640-1680 Proteínas (AGARWAL; TANDON; GUPTA, 2006; LAKSHMI et al.,

2002; MALINI et al., 2006; NĚMEČEK; THOMAS, 2009; STONE et

al., 2004)

1652-1659

Amida I (NĚMEČEK; THOMAS, 2009)

Colesterol (SILVEIRA et al., 2002)

Ácidos graxos (DUKOR, 2006; HANLON et al., 2000; SILVEIRA et

al., 2002)

Lipídios (DAx de C=C) (LAKSHMI et al., 2002; RONEN; STIER;

DEGANI, 1990; STONE et al., 2004)

Assim, levando-se em consideração os dados dos loadings e das assinaturas

espectrais, destacam-se bandas de assinaturas de vibração de DNA (745, 828, 851,

876, 1094, 1335 e 1573 cm-1) (BINOY et al., 2004; CHAN et al., 2006; CHENG et al.,

2005; HUANG et al., 2003b, 2003a; LIU et al., 2008; MAHADEVAN-JANSEN;

RICHARDS-KORTUM, 1997; MALINI et al., 2006; MOOR et al., 2014; NOTINGHER

et al., 2004; STONE et al., 2002, 2004), grupos fosfodiéster dos ácidos nucleicos (1085

cm-1) (DUKOR, 2006; GAZI et al., 2003), além de deformação axial (DAx) simétrica e

assimétrica de grupamentos fosfato (959 e 1085 cm-1) (CHAN et al., 2006; CHENG et

al., 2005; DUKOR, 2006; GAZI et al., 2003; HUANG et al., 2003b; MOOR et al., 2014),

impactantes em todos as três PCs, que podem ser relacionadas ao impacto da

vibração viral no ambiente celular.

Em termos gerais, uma consequência comum das infecções virais é uma a

supressão da síntese de ácidos nucleicos do hospedeiro, cuja maquinaria celular é

direcionada à replicação e expressão do genoma viral (MACLACHLAN; DUBOVI,

2011), ainda que diversos genes do hospedeiro suíno se apresentem altamente

expressados quando da infecção por PCV2 (FINSTERBUSCH; MANKERTZ, 2009).

Por sua vez, a capacidade replicativa de PPV é bem reportada na literatura

científica (FERNANDES; BOISVERT; TIJSSEN, 2011) e está intimamente vinculada

ao ciclo da célula hospedeira, em especial com relação à fase S do ciclo celular, uma


45

vez que o genoma do PPV não codifica sua própria polimerase, depende, portanto,

da enzima do hospedeiro, redirecionando suas atividades para a multiplicação do

parasita, o que é diretamente relacionado com os eventos patogênicos da história

natural da doença (MACLACHLAN; DUBOVI, 2017).

Na espectroscopia Raman não é possível diferenciar o genoma viral do

celular; ainda assim, considerando que a assinatura espectral 1093 cm-1 (vibração de

fosfato estrutural) exerce um papel importante como marcador de DNA na célula

(CHAN et al., 2006), bem como que possui impacto importante para a variância total,

é possível levantar a hipótese de que o genoma viral tenha impactado sobre as bandas

de DNA, permitindo a diferenciação entre os grupos amostrais.

Como consequência da replicação viral, proteínas são expressadas pela

maquinaria celular (MACLACHLAN; DUBOVI, 2011). Assim, um aumento da atividade

de transcrição do mRNA viral é uma explicação razoável para o pico 974 cm-1, que

corresponde à assinatura espectral de vibração da ribose presente no RNA (CHAN et

al., 2006), com importantes contribuições para todos os loadings.

Além disso, bandas a 1555 e 1655 cm-1 são claramente importantes para a

variância explicada pelos loadings de PCA. O pico 1555 cm-1 apresenta uma diferença

visual entre as intensidades referente a cada um dos grupos amostrais, sendo mais

intensa em amostras positivas para um dos inóculos (Figura 1). Ambas regiões (1555

cm-1 e 1655 cm-1) são associadas às estruturas proteicas secundárias, presentes em

proteínas virais – α-hélice e β-conformação –, assim como assinaturas espectrais de

Amida I (1655 cm-1) e a decomposição de Amida II (1555 cm-1) (LAKSHMI et al., 2002;

NĚMEČEK; THOMAS, 2009; Ó FAOLÁIN et al., 2005). Outros sinais associados a

proteínas são também observadas em 937 cm-1 (CHENG et al., 2005; NOTINGHER

et al., 2004) e 1447 cm-1 (CHAN et al., 2006; Ó FAOLÁIN et al., 2005), conforme se

depreende dos loadings das PC3 e PC2, respectivamente. O pico 1251 cm-1

relacionado com a decomposição da Amida III (NĚMEČEK; THOMAS, 2009), também

exerce importante papel para a separação dos grupos amostrais, conforme se conclui

na análise do loading da PC2.

Outra vibração associada com assinaturas proteicas que influenciou a

discriminação obtida na PCA-LDA inclui o modo breathing (RBm) de aminoácidos

aromáticos como a Fenilalanina (Phe) (1002, 1031 e 1605 cm-1) (CHAN et al., 2006;

CHENG et al., 2005; HUANG et al., 2003b; MALINI et al., 2006; STONE et al., 2004),

Tirosina (Tyr) (851, 1171, 1206, 1605 e 1614 cm-1) (BONNIER; BYRNE, 2012; CHENG

46

et al., 2005; LAKSHMI et al., 2002; SHETTY et al., 2006; STONE et al., 2004) e

Triptofano (Try) (757, 1206, 1555 e 1614 cm-1) (CHAN et al., 2006; CHENG et al.,

2005; HUANG et al., 2003b; LAU et al., 2005; SIGURDSSON et al., 2004; STONE et

al., 2002, 2004).

Ainda que dados obtidos na RMS não possam determinar a origem dos

aminoácidos detectados, e nem todos eles sejam constitutivos de proteínas virais, é

razoável inferir que, ao menos parcialmente, a variância observada é decorrente da

síntese de proteínas virais. Phe e Try aparecem principalmente nos loadings das PC1

e PC2, enquanto Tyr exerce impacto sobre todos os três loadings.

Por fim, a importância das assinaturas espectrais associadas a lipídios se

expressam majoritariamente nos loadings das PC1 e PC2, em especial com as

bandas 1064, 1098, 1126, 1171, 1306, 1447, 1605 e 1655 cm-1, relacionadas às

moléculas C=C e CH2 (modos de vibração de lipídios) (BHATTACHARJEE et al.,

2014; CHENG et al., 2005; DUKOR, 2006; HUANG et al., 2003b; LAKSHMI et al.,

2002; LASKA; WIDLARZ, 2005; LIU et al., 2008; NOTINGHER et al., 2004; RONEN;

STIER; DEGANI, 1990; STONE et al., 2004), sendo este último também associado a

vibrações de colesterol (SILVEIRA et al., 2002). Curiosamente, os fosfolipídios

(bandas a 1031, 1085, 1094, 1306 e 1447 cm-1) (HUANG et al., 2003b, 2003a; LAU et

al., 2005; MALINI et al., 2006) também contribuem com o loading 2.

De fato, a infecção por PPV, assim como para todos os membro da família

Parvoviridae, desencadeiam a cascata de ativação da Fosfolipase A2 de origem da

célula hospedeira, e é determinante para o sucesso da infecção (ZÁDORI et al., 2001).

Essa enzima promove a lise de membranas fosfolipídicas e endossomais, assim como

a liberação de seus ácidos graxos constitutivos (ZÁDORI et al., 2001), expressando o

papel dos lipídios na interação entre o vírus e a célula hospedeira (HEATON;

RANDALL, 2011), o que já foi observado em estudos pioneiros com cultivos celulares

infectados com adenovírus (MOOR et al., 2013).

3.3.2 Biomarcadores gerais

Um dos resultados mais impactantes obtidos através da análise das razões

de intensidade foi o conjunto de biomarcadores capazes de diferenciar corretamente

cada um dos três grupos amostrais, conforme se depreende das Figuras 10-16. A

47

Figura 7, por exemplo, PIR 1583 apresenta graficamente as razões de intensidade de

cada um dos 41 picos em relação à intensidade do pico 1583.

Figura 11 - PIR 1398 – Proteínas

Fonte: Autoria própria


Figura 10 - PIR 1583 – Fenilalanina (Phe)

A barra de erro corresponde à propagação do SE obtido

Número de onda (cm-1)

Razão d

e inte

nsid

ade d

os p

icos


48

Figura 12 - PIR 894 – Ácidos Nucleicos e Proteínas

Figura 13 - PIR 1669 – Lipídios, Proteínas e Ácidos Nucleicos.



49

Figura 14 - PIR 1101 – Ácidos Nucleicos




50

Figura 16 - PIR 985 – Proteínas e Arginina (Arg).

Proteínas foram as principais macromoléculas biológicas para separação dos

grupos amostrais, apresentando-se principalmente como assinaturas de aminoácidos,

tais quais Fenilalanina (1583 e 1101 cm-1), Triptofano (1554 cm-1) e Arginina (985 cm-

1), mas também como grupos funcionais como Amida I (1669 cm-1), Amida II (1554

cm-1) e III (1101 cm-1).

Em infecções por PCV2 a maquinaria celular é desviada para a replicação

viral, iniciando pela expressão das proteínas Rep e Rep’ (produtos da ORF1), ambas

necessárias para a replicação viral através de metodologia específica em razão do

genoma circular, além da expressão da principal proteína de capsídeo, Cap

(CHEUNG, 2006; FINSTERBUSCH; MANKERTZ, 2009).

PPV, por sua vez, demanda a tradução de proteínas estruturais VP1 e VP2,

assim como aquelas não estruturais, NS1 e NS2 (MACLACHLAN; DUBOVI, 2017).

Tendo em vista as diferentes estratégias de replicação utilizadas, que PCV2 apresenta

genoma circular, enquanto PPV apresenta genoma linear, em contraste com células

não infectadas, ajudam a explicar o porquê de proteínas sejam a assinatura espectral

mais importante para a discriminação dos três grupos amostrais.

PIRs obtidas contra Fenilalanina (Phe) (Figura 7) foram as mais relevantes

uma vez que quase todas as razões constitutivas do gráfico apresentaram evidente

separação entre os grupos amostrais. Um possível explicação para esse resultado é


51

a que Phe é mais demandada pela maquinaria celular na fase de crescimento ativo,

em contraste com a manutenção e sobrevivência (CHOO; COTTON; DANKS, 1976).

Considerando que tanto a replicação tanto de PPV como PCV2 é intimamente

dependente da fase S do ciclo da célula hospedeira (REN; CHEN; OUYANG, 2016;

STRECK; TRUYEN, 2020), é possível inferior que a Phe atue como um biomarcadores

associado à infecção viral.

Em linhas gerais, postula-se que o ambiente interno da célula infectada por

vírus sofra mudanças substanciais em sua composição bioquímica, mas em especial

com relação à Phe (MOOR et al., 2018). Entretanto, entre grupos infectados (PPV ou

PCV2) não está claro o papel desse aminoácido, embora ele tenha a capacidade de

diferenciá-los. Uma hipótese poderia residir nas diferentes estratégias de replicação

observadas entre os agentes, assim como cascatas de sinalização intracelular

decorrentes ou mesmo a sequência de aminoácidos dos produtos traduzidos.

Curiosamente, a Arginina (Arg) (985 cm-1) destacou-se entre os principais

biomarcadores. Uma possível explicação, complementar àquelas sustentadas acima,

se relaciona com a porção terminal da proteína Cap de PCV2, rica desse aminoácido

(mais da metade da composição dos resíduos é de Arg) (DHINDWAL; FENG;

KHAYAT, 2019), em contraste com as concentrações de Arg em NC e PPV.

Finalmente, as assinaturas espectrais associadas ao conteúdo de ácidos

nucleicos também contribuíram marcadamente para a discriminação das amostras,

tais como DNA (1101 cm-1), desoxirribose e grupamentos fosfodiéster (894 cm-1),

assinaturas das bases nitrogenadas Adenina (894 cm-1), Citosina, Guanina e Timina

(1669 cm-1) e grupos fosfodioxi (1101 cm-1). Ainda que a técnica não permita a

distinção entre o genoma do hospedeiro e do parasita, é razoável propor a hipótese

de que as diferenças observadas refletem, ao menos parcialmente, a replicação do

genoma viral (NĚMEČEK; THOMAS, 2009). Além disso, tanto a infecção por PCV2

como por PPV induzem diferentes cascatas de microRNA (LI et al., 2015; REN; CHEN;

OUYANG, 2016) que podem se refletir nesses resultados.

3.3.3 Biomarcadores específicos: infecção viral

Uma segunda habilidade do sistema é diferenciar, em termos genéricos,

células infectadas (PPV+ ou PCV2+) daquelas não infectadas (NC), constituindo,

portanto, marcadores inespecíficos de infecção.

52

Neste estudo, foram obtidos dois desses marcadores de infecção, quais sejam

a assinatura espectral proteicas 937 cm-1 (Figura 17) e a assinatura do pico 1554 cm-

1 (Triptofano / grupo Amida II) (Figura 18). Esses achados são consistentes com dados

prévios, considerando que o espectro de proteínas virais é usualmente um reflexo da

multiplicidade de ligações entre os átomos, além de anéis aromáticos de aminoácidos

presentes em aminoácidos como o próprio Try (NĚMEČEK; THOMAS, 2009).


Figura 18 - PIR 1554 – Amida III e Triptofano (Try)



53

3.3.4 Biomarcadores específicos: PPV

Ainda, identificaram-se biomarcadores da infecção por PPV, curiosamente

associados a assinaturas espectrais de lipídios (em termos genéricos) ácidos graxos,

fosfolipídios, além de ácidos nucleicos e proteínas (757, 1171, 1300, 1316, 1336, 1481

e 1654 cm-1) (Figuras 19 a 25).

Uma possível explicação da especificidade desses marcadores está no

domínio de Fosfolipase A2 (PLA2) presente na VP2, e não reportada para PCV2, a

qual é determinante para a liberação do virion dos endossomos e vesículas

lisossomais da célula hospedeira, permitindo o acesso ao conteúdo nuclear e,

portanto, à replicação (CANAAN et al., 2004; ZÁDORI et al., 2001)). PLA2

desencadeia digestão enzimática dessas estruturas, liberando as moléculas

constitutivas (lipídios, ácidos graxos e proteínas das membranas fosfolipídicas) no

ambiente intracellular (MÉSZÁROS et al., 2017). Não há registro de qualquer atividade

análoga nas infecções por PCV2.

Figura 19 - PIR 1300 – Lipídios


54





55


Figura 23 - PIR 757 – Proteínas.



56


Figura 25 - PIR 1654 – Lipídios e Proteínas



57

4 CONCLUSÕES

Ainda que a espectroscopia Raman tenha se mostrado promissora para

estudos e diagnóstico em virologia, sendo aplicada para diversos outros agentes

virais, ainda são se tinham resultados sobre a capacidade de identificar PPV e PCV2.

Para avaliar essa possibilidade, idealizamos e executamos o presente estudo,

obtendo resultados animadores.

O sistema que inclui a coleta de espectros e análise estatística multivariada

(PCA-LDA) mostrou-se não só eficaz como acurado para identificar corretamente a

presença e ausência dos agentes em ambientes complexos, como células.

Mais do que identificar a presença de vírus, inespecificamente, foi possível

obter biomarcadores associados a uma ou outra das estirpes virais utilizadas. Esses

dados podem contribuir com a base de dados da comunidade científica, oferecendo

robustez para aplicação da espectroscopia Raman em rotinas diagnósticas.

Entre as principais vantagens dessa tecnologia estão o baixo custo

operacional, a simplicidade do preparo das amostras e rapidez para obtenção dos

resultados. Ainda que o custo de aquisição inicial do equipamento seja alto, existem

avanços promissores para o desenho de novos equipamentos, mais baratos e mesmo

portáteis (CHIWO; GONZALEZ, 2019; FARBER et al., 2019; GAHLAUT et al., 2020;

GOODING et al., 2017; SORAK et al., 2012).

O presente trabalho, embora desenhado no âmbito da ciência básica,

conseguiu oferecer respostas efetivas sobre a aplicabilidade da espectroscopia

Raman para o diagnóstico de PPV e PCV2, importantes agentes associados às falhas

reprodutivas em suínos, somando-se aos inúmeros trabalhos de aplicação da técnica

para diagnóstico e pesquisa em virologia.

Estudos futuros, porém, são necessários para validar esses achados em

amostras ainda mais complexas como tecidos, por exemplo, a fim de verificar a

capacidade do sistema em detectar estes e outros marcadores virais, o que

fortaleceria a proposta de uso em larga escala dessa ferramenta inovadora.

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APÊNDICE A - Teste de Permutação

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Perfil de distribuição nula para os resultados do teste de permutação da 10FCV para o modelo PCA-LDA. A precisão do nível de aleatoriedade é representada pela linha vertical vermelha e a precisão da classificação real pela linha vertical azul.

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APÊNDICE B - PIRs de menor impacto

dissertaÇÃo de mestrado dois vizinhos

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