dissertaÇÃo de mestrado...tecnologia do dna recombinante..... 22 3.3. proteínas recombinantes...

Universidade Federal do Rio Grande do Norte

Centro de Tecnologia

Departamento de Engenharia Química

Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

ESTRATÉGIAS DE INDUÇÃO DO ANTÍGENO 503

RECOMBINANTE DE Leishmania i. chagasi EXPRESSO EM

Escherichia coli M15

LUAN TALES COSTA DE PAIVA VASCONCELOS

Orientador: Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos

Coorientador: Prof. Dr. Francisco Canindé de Sousa Júnior

Natal/RN

Fevereiro/2018

Luan Tales Costa de Paiva Vasconcelos

ESTRATÉGIAS DE INDUÇÃO DO ANTÍGENO 503

RECOMBINANTE DE Leishmania i. chagasi EXPRESSO EM

Escherichia coli M15

Dissertação de Mestrado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em Engenharia

Química da Universidade Federal do Rio

Grande do Norte – UFRN, em cumprimento

às exigências para obtenção do grau de mestre

em Engenharia Química, sob a orientação do

Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos e

coorientação do Prof. Dr. Francisco Canindé

de Sousa Júnior.

Natal/RN

Fevereiro/2018

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN

Sistema de Bibliotecas - SISBI

Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Central Zila Mamede

Vasconcelos, Luan Tales Costa de Paiva.

Estratégias de indução do antígeno 503 recombinante de Leishmania

i. chagasi expresso em Escherichia coli M15 / Luan Tales Costa de

Paiva Vasconcelos. - 2018.

91 f.: il.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do

Norte, Centro de Tecnologia, Programa de Pós-Graduação em

Engenharia Química. Natal, RN, 2018.

Orientador: Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos.

Coorientador: Prof. Dr. Francisco Canindé de Sousa Júnior.

1. Antígeno recombinante - Dissertação. 2. Escherichia coli

recombinante - Dissertação. 3. Antígeno 503- Dissertação. 4. Indução

- Dissertação. 5. Leishmaniose - Dissertação. I. Santos, Everaldo

Silvino dos. II. Júnior, Francisco Canindé de Sousa. III. Título.

RN/UF/BCZM CDU 578.74

VASCONCELOS, Luan Tales Costa de Paiva - Estratégias de indução do antígeno 503

recombinante de Leishmania i. chagasi expresso em Escherichia coli M15. Dissertação de

Mestrado, UFRN, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química – PPgEQ. Área de

concentração: Engenharia Química. Linha de pesquisa: Processos Químicos, Biotecnológicos

e Catálise, Natal/RN, 2018, Brasil.

Orientador: Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos

Coorientador: Prof. Dr. Francisco Canindé de Sousa Júnior

___________________________________________________________________________

RESUMO: Com cerca de 900.000 a 1,3 milhões de novos casos anualmente, a Leishmaniose

é um complexo de doenças que pode ser fatal se não dada a devida atenção. Apesar de sua

relevância na saúde pública, ainda não existe uma vacina capaz de prevenir a doença em

humanos, e seu tratamento é caro e agressivo à saúde. O presente estudo tem como objetivo

otimizar os parâmetros de indução do antígeno 503 de Leishmania i. chagasi expresso em

Escherichia coli recombinante. Dessa forma, para a indução foi utilizada a lactose nas

concentrações de 0,1; 1,0 e 10 g/L, e o isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG) nas

concentrações de 20,0; 100,0; 500,0 e 1000,0 M como moléculas indutoras em diferentes

densidades celulares (densidade óptica a 600 nm de 0,5 e 1,0) de modo a analisar a influência

do instante de indução no rendimento da proteína de interesse. Os resultados mostraram que a

concentração de IPTG de 100,0 M foi a que mais favoreceu a produção do antígeno (0,087

g/L), sendo esta concentração de IPTG 10 vezes menor do que utilizada em trabalhos anteriores

para esse tipo de sistema, e para a lactose foi a de 1,0 g/L (0,016 g/L). Dessa forma, a indução

com 100,0 M de IPTG permitiu obter o antígeno 503 com uma concentração 5,6 vezes maior

que a máxima obtida quando a lactose foi usada como indutor.

Palavras-chave: Antígeno 503, Escherichia coli recombinante, Leishmaniose, indução.

___________________________________________________________________________

ABSTRACT

With nearly 900,000 to 1.3 million new cases annually, Leishmaniosis is a complex of diseases

that can be fatal if not given proper attention. Despite its relevance in the public health system,

there is no vaccine capable of preventing disease in humans so far, and its treatment is expensive

and aggressive to human health. Vaccination remains the most practical and realistic way of

fight against the disease, thus, the production of recombinant antigens as a pathway towards a

vaccine acquisition is necessary. In addition, the optimization of the strategy of the recombinant

antigen’s production is of interest so it can make the process viable. Therefore, the present study

aims to optimize the induction parameters of the 503 Leishmania i. chagasi antigen expressed

in recombinant Escherichia coli. Hence, the induction at different cell densities (optical density

at 600 nm of 0.5 and 1.0) was evaluated in order to analyse the influence of the induction time

on the yield of the protein of interest. In this segment, lactose and isopropyl-β-D-

thiogalactopyranoside (IPTG) were used as inducer molecules, using various concentrations:

0.1 g/L, 1.0 g/L and 10 g/L for lactose and 20 μM, 100 μM, 500 μM and 1000 μM for IPTG.

The results presented that the concentration of IPTG that obtained the higher antigen levels was

that of 100 μM (0.087 g/L), a 10-fold lower concentration than was being previously used in

this type of system, and for lactose it was 1 g/L (0.016 g/L). Thus, the induction with 100 μM

allowed to obtain the antigen with a concentration 5.6 times higher than the lactose induction

maximum concentration.

Keywords: 503 antigen, recombinant Escherichia coli, Leishmaniosis, induction.

SUMÁRIO

1. Introdução ............................................................................................................................. 14

2. Objetivos ............................................................................................................................... 17

2.1. Objetivo geral ................................................................................................................ 17

2.2. Objetivos específicos ..................................................................................................... 17

3. Revisão bibliográfica ............................................................................................................ 19

3.1. Leishmaniose visceral americana .................................................................................. 19

3.1.1. Antígeno 503 .......................................................................................................... 21

3.2. Tecnologia do DNA recombinante ................................................................................ 22

3.3. Proteínas recombinantes expressas em Escherichia coli ............................................... 23

3.4. Operon lac ..................................................................................................................... 25

3.5. Estratégias de indução e produção de ácido acético ...................................................... 26

3.5.1. IPTG e lactose ........................................................................................................ 28

4. Material e métodos ............................................................................................................... 30

4.1. Microrganismo .............................................................................................................. 30

4.2. Meio de cultivo .............................................................................................................. 30

4.2.1. Antibióticos ................................................................................................................ 30

4.3. Inóculo ........................................................................................................................... 31

4.4. Ensaios em shaker ..................................................................................................... 31

4.4.1 Avaliação da influência dos indutores na expressão do antígeno 503 ........................ 32

4.4.2. Indução em shaker .................................................................................................. 32

4.5. Estratégia experimental ................................................................................................. 33

4.5.1. Determinação da biomassa ..................................................................................... 33

4.5.2. Determinação do ácido acético ............................................................................... 34

4.5.3. Avaliação do rompimento celular........................................................................... 34

4.5.4. Recuperação do antígeno 503 ................................................................................. 34

4.5.4.1. Eletroforese de proteínas sob condições desnaturantes (SDS-PAGE) ................ 35

4.6. Determinação dos parâmetros cinéticos ........................................................................ 36

4.6.1. Cálculo das velocidades específicas de transformação .......................................... 36

4.6.2. Cálculo da produtividade em células e de produto em células ............................... 37

4.7. Análise estatística .......................................................................................................... 37

5. Resultados e Discussão ......................................................................................................... 40

5.1. Influência da concentração de IPTG e do instante de indução ...................................... 40

5.1.2. Produtividade de proteínas em células (Pp/x) e velocidade de crescimento específico

(x) ................................................................................................................................... 45

5.1.3. Antígeno ................................................................................................................. 50

5.2. Avaliação dos ensaios utilizando lactose ...................................................................... 54

5.2.1. Biomassa, proteína total e densidade celular .......................................................... 54

5.2.2. Produtividade de proteína em células (Pp/x) e velocidade de crescimento específica

(x) ................................................................................................................................... 60

5.2.3. Antígeno ................................................................................................................. 63

5.3. IPTG versus lactose ....................................................................................................... 64

6. Conclusões ............................................................................................................................ 68

7. Referências bibliográficas .................................................................................................... 70

APÊNDICE 1 ........................................................................................................................... 79

APÊNDICE 2 ........................................................................................................................... 81

APÊNDICE 3 ........................................................................................................................... 82

APÊNDICE 4 ........................................................................................................................... 83

APÊNDICE 5 ........................................................................................................................... 88

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Mapa da distribuição de casos reportados da Leishmaniose Visceral no mundo em

2013. Adaptado (WHO, 2015). ................................................................................................ 20

Figura 2: Esquema do fator de alongamento 1- de L. infantum mostrando sua sequência de

aminoácidos. Fonte: GenBank número CAC35543.1 .............................................................. 21

Figura 3: Ilustração do funcionamento do operon lac (VAZ, 2011) ........................................ 25

Figura 4: Estratégia experimental do estudo. Fonte: Autor. ..................................................... 33

Figura 5: Perfil de biomassa em preto (■), concentração de proteínas totais em azul (○) e ácido

acético em laranja (▲) em função do tempo de cultivo para o ensaio I utilizando IPTG como

indutor de concentração 20 M e DO600 de 0,5. A seta representa o instante de indução........ 41


acético em laranja (▲) em função do tempo de cultivo para o ensaio III utilizando IPTG como

indutor de concentração 100 M e DO600 de 0,5. A seta representa o instante de indução...... 41


acético em laranja (▲) em função do tempo de cultivo para o ensaio V utilizando IPTG como



acético em laranja (▲) em função do tempo de cultivo para o ensaio VII utilizando IPTG como

indutor de concentração 1000 M e DO600 de 0,5. A seta representa o instante de indução.... 42

Figura 9: Perfil de produtividade de proteínas totais em células em preto (●) e velocidade de

crescimento específico em vermelho (○) em função do tempo de cultivo para o ensaio I

utilizando IPTG com concentração 20 M e DO600 de 0,5. A seta representa o instante de

indução. .................................................................................................................................... 46


crescimento específico em vermelho (○) em função do tempo de cultivo para o ensaio III


indução. .................................................................................................................................... 47


crescimento específico em vermelho (○) em função do tempo de cultivo para o ensaio V


indução. .................................................................................................................................... 47


crescimento específico em vermelho (○) em função do tempo de cultivo para o ensaio VII


indução. .................................................................................................................................... 48

Figura 13: Eletroforese de amostras purificadas. A seta representa a banda da proteína de

interesse. De acordo com as colunas: (1) Marcador de bandas proteicas padrão; (2) Amostra do

instante de 3 h do ensaio III (IPTG a 100 M e DO600 0,5) de maior proteína total; (3) Amostra

do instante de 7 h do ensaio III (IPTG a 100 M e DO600 0,5) de maior proteína total; (4) Instante

de 3 h do ensaio X (lactose a 1 g/L e DO600 0,5); (5) Instante de 8 h do ensaio XI (lactose a 1

g/L e DO600 1,0); (6) Instante de 8 h do ensaio X (lactose a 1 g/L e DO600 0,5). ..................... 52

Figura 14: Perfil de Biomassa em preto (■), concentração de proteínas totais em azul (○) e ácido

acético em laranja (▲) em função do tempo de cultivo para o ensaio IX utilizando lactose como

indutor de concentração 0,1 g/L e DO600 de 0,5. A seta representa o instante de indução. ..... 55


acético em laranja (▲) em função do tempo de cultivo para o ensaio X utilizando lactose como

indutor de concentração 1 g/L e DO600 de 0,5. A seta representa o instante de indução. ........ 55


acético em laranja (▲) em função do tempo de cultivo para o ensaio XI utilizando lactose como

indutor de concentração 1 g/L e DO600 de 1,0. A seta representa o instante de indução. ........ 56


acético em laranja (▲) em função do tempo de cultivo para o ensaio XII utilizando lactose

como indutor de concentração 10 g/L e DO600 de 0,5. A seta representa o instante de indução.

.................................................................................................................................................. 56

Figura 18: Perfil de produtividade de proteínas totais em células em preto (■) e velocidade de

crescimento específico em vermelho (○) em função do tempo de cultivo para o ensaio IX

utilizando lactose a 0,1 g/L como indutor e DO600 0,5. A seta representa o instante de indução.

.................................................................................................................................................. 61


crescimento específico em vermelho (○) em função do tempo de cultivo para o ensaio X

utilizando lactose a 1 g/L como indutor e DO600 0,5. A seta representa o instante de indução.

.................................................................................................................................................. 61


crescimento específico em vermelho (○) em função do tempo de cultivo para o ensaio XI


.................................................................................................................................................. 62


crescimento específico em vermelho (○) em função do tempo de cultivo para o ensaio XII


.................................................................................................................................................. 62

Figura 22: Curva de calibração para a determinação da biomassa a partir da leitura da DO600.

.................................................................................................................................................. 80

Figura 23: Curva de calibração para determinação de ácido acético a partir da leitura da

intensidade dos picos no HPLC. ............................................................................................... 81

Figura 24: Correlação do massa molecular dos padrões inibidor de tripsina (20,1 kDa), anidrase

carbônica (30,0 kDa), albumina (66,0 kDa) e fosforilase b (97,0 kDa) e a distância percorrida

no gel de eletroforese da Figura 13. ......................................................................................... 82


acético em laranja (▲) em função do tempo de cultivo para o ensaio II utilizando IPTG como

indutor de concentração 20 M e DO600 de 1,0. A seta representa o instante de indução........ 83


acético em laranja (▲) em função do tempo de cultivo para o ensaio IV utilizando IPTG como



acético em laranja (▲) em função do tempo de cultivo para o ensaio VI utilizando IPTG como



acético em laranja (▲) em função do tempo de cultivo para o ensaio VIII utilizando IPTG como

indutor de concentração 1000 M e DO600 de 1,0. A seta representa o instante de indução.... 85


crescimento específico em vermelho (○) em função do tempo de cultivo para o ensaio II


indução. .................................................................................................................................... 85


crescimento específico em vermelho (○) em função do tempo de cultivo para o ensaio IV


indução. .................................................................................................................................... 86


crescimento específico em vermelho (○) em função do tempo de cultivo para o ensaio VI


indução. .................................................................................................................................... 86


crescimento específico em vermelho (○) em função do tempo de cultivo para o ensaio VIII


indução. .................................................................................................................................... 87

Figura 33: Teste Tukey com os dados de biomassa máxima dos ensaios de I a VIII utilizando

IPTG como indutor da Tabela 3. Valores com asterisco na mesma coluna não apresentam

diferenças significativas com 95% de confiança. ..................................................................... 88

Figura 34: Teste Tukey com os dados de proteína máxima dos ensaios de I a VIII utilizando

IPTG como indutor da Tabela 4. Valores com asterisco na mesma coluna não apresentam


Figura 35: Teste Tukey com os dados de biomassa máxima dos ensaios de IX a XII utilizando

lactose como indutor da Tabela 5. Valores com asterisco na mesma coluna não apresentam


Figura 36: Teste Tukey com os dados de proteína máxima dos ensaios de IX a XII utilizando

lactose como indutor da Tabela 6. Valores com asterisco na mesma coluna não apresentam


LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Composição do meio de cultivo 2xTY (VAZ, 2011). ............................................. 30

Tabela 2 – Planejamento experimental para avaliação da influência do instante de indução e

dos indutores IPTG e lactose na expressão do antígeno 503. ................................................... 31

Tabela 3: Parâmetros cinéticos de crescimento celular máximos obtidos nos ensaios de indução

com IPTG. ................................................................................................................................ 45

Tabela 4: Padrão de produção de proteínas e produtividade do ponto de máximo obtidas nos

ensaios utilizando IPTG como indutor. .................................................................................... 52

Tabela 5: Parâmetros de biomassa dos ensaios realizados com lactose. .................................. 59

Tabela 6: Parâmetros de proteína dos ensaios utilizando a lactose. ......................................... 64

Tabela 7: Comparação de diferentes parâmetros obtidos na utilização de IPTG e lactose como

molécula indutora. .................................................................................................................... 65

LISTA DE SIGLAS

LVA Leishmania Visceral Americana

IPTG Isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo

DEQ Departamento de Engenharia Química

UFRN Universidade Federal do Rio Grande do Norte

DO Densidade óptica

DO600 Densidade óptica a 600 nm

LV Leishmania Visceral

CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

IMAC Cromatografia de afinidade por íons metálicos imobilizados

SDS Dodecil sulfato de sódio

SDS-PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de Dodecil Sulfato de

Sódio

APS Persulfato de amônio

Px Produtividade em células (g/h)

Pp Produtividade em proteínas (g/h)

Pp/x Produtividade de células em proteína (g/g)

x Velocidade de crescimento específica

xm Velocidade de crescimento específica máxima

Capítulo 1

Introdução

Capítulo 1. Introdução 14


1. Introdução

As leishmanioses compreendem um complexo de doenças com enorme diversidade

clínica e epidemiológica causadas por protozoários do gênero Leishmania (Ordem

Kinetoplastidae, família Trypanosomatidae), transmitidos por insetos flebotomíneos. Desse

modo, o indivíduo infectado manifesta sinais e sintomas de acordo com a espécie do

protozoário, podendo apresentar as formas cutânea, mucocutânea, cutânea difusa e visceral. O

tipo mais perigoso dentre as variações da Leishmaniose visceral americana (LVA) é a sua forma

visceral (AYATOLLAHI; BAFGHI; SHAHCHERAGHI, 2015; BRAZ et al., 2002; KARAMI;

DOUDI; SETORKI, 2013; WILSON; JERONIMO; PEARSON, 2005).

A LVA é uma doença infectocontagiosa presente em 75 países. O Brasil está entre os 6

países que representam 90% das ocorrências da mesma no mundo todo. Na América latina as

formas mais comuns da doença são as cutâneas e mucocutâneas, com quase 90% dos casos

desta última ocorrendo na Bolívia, Peru e Brasil onde a forma da doença é associada a zonas

rurais e ou regiões de pobreza (ESTEVA; VARGAS; VARGAS DE LEÓN, 2017; SOUSA-

GOMES et al., 2017)

Em geral são estimados, anualmente, cerca de 900.000 a 1.3 milhão de novos casos da

doença com aproximadamente 20.000 a 30.000 mortes relacionadas a mesma ao redor do

mundo. Devido a expansão da população humana para regiões selváticas, é estimado que cerca

de 350 milhões de pessoas estejam em risco de contrair qualquer forma da doença (WHO,

2016).

No Brasil, a LVA tem uma taxa anual de incidência de 4.200 a 6.300 casos anualmente.

Na região do Nordeste, a Leishmaniose consegue atingir cerca de duas mil pessoas a cada ano.

O acréscimo do número de pessoas que tem chance de serem infectadas deve-se as condições

geográficas, principalmente, por condições climáticas, na qual a alta pluviosidade favorece a

proliferação do mosquito vetor da doença e mais pessoas, assim, são propensas a correrem o

risco de serem contaminadas, com uma taxa de mortalidade de 7,0% (JERONIMO et al., 2004;

SELVAPANDIYAN et al., 2012; SOUSA-GOMES et al., 2017).

Entretanto, ainda não existe uma vacina capaz de prevenir a LVA em humanos, apesar

dos avanços nas áreas de biologia molecular e da imunologia. Assim, se faz necessário a

produção de antígenos recombinantes para a produção de vacinas e kits de diagnóstico. Nesse

contexto, o desenvolvimento da engenharia genética possibilitou a expressão de tais proteínas

recombinantes em organismos hospedeiros, desde organismos pequenos como bactérias e

fungos, até plantas e mamíferos (BORZANI et al., 2001; VALDEZ-CRUZ et al., 2010).

Capítulo 1. Introdução 15


Como cada proteína recombinante é diferente, a expressão da mesma deve ser definida

de acordo com o caso em particular. Existem várias escolhas a se fazer ao produzir proteínas

recombinantes, como por exemplo, o sistema de expressão, o meio e as condições de cultivo

(KRAUSE; NEUBAUER; NEUBAUER, 2016)

A estratégia de indução e, por consequência, a seleção do indutor, tem seu papel

importante na resposta celular pós-indução, em virtude que o indutor não afetar somente o

crescimento celular mas, também, o gene a ser ativado para a expressão e, consequentemente,

o conjunto de proteínas acumuladas nas células (VÉLEZ et al., 2014).

Nesse contexto, a maioria das publicações focam no uso do isopropil-β-D-

tiogalactopiranosídeo (IPTG) como indutor da expressão da proteína recombinante (CHENG

et al., 2007; LIN; HSIAO; CHOU, 2002; LIU; CHANG; LEE, 1999; WEN et al., 2005). Apesar

disso, o fato do IPTG ser de alto custo e potencialmente tóxico para as células restringe suas

aplicações com indutor de proteínas recombinantes em escala industrial. A lactose, por outro

lado, é um indutor mais acessível financeiramente, natural e biodegradável, que pode também

ser usado em sistemas de expressão baseados no operon lac (BRIAND et al., 2016; VÉLEZ et

al., 2014).

Em trabalhos anteriores do grupo de pesquisa em Engenharia de Bioprocessos do

Departamento de Engenharia Química (DEQ) da Universidade Federal do Rio Grande do Norte

(UFRN), foram otimizados processos para viabilizar a produção e utilização do antígeno 503

de Leishmania i. chagasi expresso em E. coli. Por exemplo, Vaz (2011) analisou a influência

das condições de cultivo na produtividade do antígeno, obtendo seu maior valor quando

utilizado o meio de cultivo 2xTY em biorreator de bancada, com a indução sendo realizada na

fase exponencial com lactose a 10 g/L e 400 rpm. Além disso, Sousa Júnior, (2015) e Leitão,

(2016) avaliaram a recuperação e a purificação do antígeno 503 de Leishmania chagasi

expresso em E. coli utilizando a adsorção em leito expandido, de modo a viabilizar o processo

e remover toxinas.

Dessa forma, o presente estudo tem como objetivo analisar a influência de indutores

(IPTG e lactose) na expressão da proteína de interesse – antígeno 503 – avaliando-se diferentes

estratégias de indução como o uso de diferentes densidades ópticas (DO) do meio no momento

de indução e a concentração do indutor.

Capítulo 2

Objetivos

Capítulo 2. Objetivos 17


2. Objetivos

2.1. Objetivo geral

Determinar as concentrações de IPTG e lactose como diferentes estratégias de indução

para a máxima expressão do antígeno 503 expresso em E. coli.

2.2. Objetivos específicos

o Para cada ensaio proposto, avaliar os níveis de proteínas totais, biomassa, ácido acético,

produtividade de produtos em células e a velocidade de crescimento específica;

o Avaliar a influência da concentração do indutor, e a densidade óptica (DO) na expressão

do antígeno 503 em cultivos realizados em shaker;

o Estudar a influência do IPTG e da lactose nas condições de indução (concentração do

indutor e DO no instante da indução) durante o cultivo;

o Averiguar o efeito da concentração do indutor e do tipo (IPTG ou lactose) empregadas

sobre os parâmetros da máxima expressão do produto de interesse, comparando-os com

trabalhos anteriores.

Capítulo 3

Revisão bibliográfica

Capítulo 3. Revisão bibliográfica 19


3. Revisão bibliográfica

3.1. Leishmaniose visceral americana

A Leishmaniose visceral americana é um tipo de doença que é causada por um

protozoário do gênero da Leishmania. Este para completar seu ciclo de vida necessita de no

mínimo dois hospedeiros e, assim, é classificada como uma zoonose, um tipo de doença que

pode ser transmitida entre animais vertebrados, incluindo o ser humano (GILLESPIE et al.,

2016; SAÚDE, 2014).

Diferentes espécies do protozoário podem causar Leishmaniose em humanos,

apresentando diferentes manifestações: visceral, cutânea e mucocutânea. Entre estes existem a

L. chagasi, L. donovani e a L. (V.) braziliensis. A Leishmaniose Visceral (LV) ou Leishmaniose

Visceral Americana (LVA), é letal se deixada sem tratamento sendo a Leishmaniose Cutânea a

forma mais comum da doença. Os chamados vetores da LVA são mosquitos denominados de

flebotomíneos, que compreendem o gênero Lutzomyia e Phlebotomus, conhecidos comumente

no Brasil como mosquito palha, birigui, asa dura, tatuquira entre outros (REY, 2008;

MOHAMED AHMED AL-KAMEL, 2017)

É importante destacar também que pode ocorrer transmissão da doença por meio de

transfusões sanguíneas, uma vez que nenhum teste de triagem para Leishmania no sangue de

doadores de sangue é realizado como rotina. Ademais, a transmissão da doença pode ser

aumentada pelo uso compartilhado de seringas, como ocorre em parte dos usuários de drogas

injetáveis (FIGUEIRÓ FILHO et al., 2005).

A LV, em sua forma clássica, pode causar hepatoesplenomegalia, febre, assim como um

grave comprometimento da saúde geral. Estes sintomas podem progredir para náuseas, diarreia,

vômitos, tosse, entre outros. À medida que a doença progride e fica mais grave, o indivíduo

pode sentir dores de cabeça, sofrer de desnutrição, icterícia, hemorragias e outros sintomas.

Caso o paciente não seja tratado, a doença pode evoluir para óbito no período de dois anos

(COSTA et al., 2011; DRUMOND; COSTA, 2011; JERONIMO et al., 2004).

A LV é a forma mais severa da Leishmaniose, chegando a ser fatal em 95% dos casos

quando os mesmos são deixados sem tratamento. Cerca de 200.000 a 400.000 novos casos por

ano da LV são estimados ocorrer globalmente (ALVAR et al., 2012; PAHO, 2015; WHO,

2016). Não obstante, a mesma é autóctone em 12 países da América, com um total de 45.490

casos registrados entre 2011 e 2013, com uma média de 3499 casos por ano. Em 2013, a maior

taxa de incidência em humanos (4,35 novos casos por 100.000 habitantes) foi reportado no



Brasil dentre 8 países da América dentro da zona de transmissão da LV (PAHO, 2015). O Brasil

se enquadra entre os seis países no mundo que contabilizam até 90% dos casos de LV, como

mostra a distribuição da doença na Figura 1 (WHO, 2015). Além disso, a LV inicialmente era

uma doença endêmica em zonas rurais e ganhou espaço a partir da década de 1980. Atualmente,

está presente em 21 dos 27 estados do Brasil com mais de 70% dos casos ocorrendo em

municípios com mais de 100.000 habitantes (LEAL et al., 2018; WERNECK, 2016).

Figura 1: Mapa da distribuição de casos reportados da Leishmaniose Visceral no mundo em 2013. Adaptado

(WHO, 2015).

Além de sua grande distribuição e elevada incidência no Brasil, a LV pode ser fatal

quando associada a quadros de má nutrição e outras comorbidades, uma vez que dificulta a

recuperação e a qualidade de vida do paciente. Com enfoque na região Nordeste do Brasil, a

Leishmaniose Visceral tem uma ampla abrangência e incidência, chegando a aproximadamente

duas mil pessoas por ano. Devido ao ciclo de vida variado que este parasita possui, novos modos

de combate à doença são discutidos ao passo da crescente urbanização das cidades. O

hospedeiro em que o protozoário se encontra é um fator que difere a zona de risco que a doença

pode se proliferar. As condições climáticas e geográficas podem favorecer a reprodução dos

vetores, tornando a região com alta incidência da doença (JERONIMO et al., 2004;

SELVAPANDIYAN et al., 2012).

Apesar dos avanços no assunto e de existirem diferentes técnicas para o diagnóstico da

Leishmaniose, não existe ainda um teste que tenha uma sensibilidade de 100% para a detecção



da doença. O que existe é uma análise complexa, identificando o parasita por meio de testes

parasitológicos, uma vez que o quadro de sintomas se confunde também com outras patologias

como malária, doença de chagas, tuberculose, entre outros (GONTIJO, CÉLIA MARIA

FERREIRA; MELO, 2004).

Sendo, geralmente, efetiva, a quimioterapia é o tratamento principal de todas as três

formas da Leishmaniose. Entretanto, fatores como custo elevado, toxicidade e regimes

complicados e longos prejudicam a maioria das opções quimioterapêuticas (GILLESPIE et al.,

2016). Dessa forma, a prevenção à doença é a melhor escolha.

O desenvolvimento de uma vacina poderia representar um dos melhores meios em relação

ao custo benefício de controlar ou eliminar a LVA. Até mesmo uma vacina que promovesse a

proteção por 5 anos a 50% de eficácia ainda sim seria economicamente viável quando

comparado aos tratamentos atuais. Uma vez que o antígeno tem o potencial de desencadear uma

resposta imunológica, além do possível desenvolvimento da vacina, pode-se utilizar o antígeno

na tentativa de desenvolver kits para a identificação da doença por meio de testes de

diagnósticos na ausência de sintomas que possam reconhecer a doença (GILLESPIE et al.,

2016; MARTINS et al., 2006).

3.1.1. Antígeno 503

Anteriormente descrita por Cañavate et al., (2002), o antígeno 503 é uma proteína de

aproximadamente 56 kDa que possui 100% de identidade com o fator de alongamento 1-

(Figura 2) de L. infantum. O mesmo foi posteriormente identificado por Martins et al., (2006)

por meio de comparações com bibliotecas de cDNA da Leishmania i. chagasi.

1 mtykllaplh pesaraqkim vaaayanvdv elkvcqygqe netpefarnc spcmrfpsmq

61 teegylfesn aimrhiarve ksgaklygat pfessqvdmw ldfasselda hnmpylmetf

121 agipaaesam atleeslagl elwletrtfl vgermtvadi svafalqwvy rmnvkhgeel

181 tkkyrnayrl yntvmqqpkt vevlkqwgat fgpakapkka aeakpkaekk pkeavgdeee

241 qsakeekkan pldalppssf vldaykreys ntdtrtvaap yffehydteg ytcfwaryky

301 nednkkqfmt anlvrgwfqr mehvrkyafg valiigedaa helvsfwvfr gkgmpeivse

361 vvdtelfewe eikdvqaeke kitdylcweg ptiprpvleg rcfk

Figura 2: Esquema do fator de alongamento 1- de L. infantum mostrando sua sequência de aminoácidos. Fonte:

GenBank número CAC35543.1



Este fator de alongamento, por sua vez, é uma subdivisão do fator de alongamento 1 (EF-

1), que desempenha sua função na tradução de proteínas em células eucarióticas, a proteína G.

Esta, exibe uma semelhança estrutural com os genes que codificam o fator de alongamento 1,

descrito em vários eucariotas: 32% com o EF 1- de Homo sapiens (CAÑAVATE et al., 2002).

O antígeno 503 foi expresso na E. coli e, em seguida, avaliado frente a soros de pacientes

infectados com Leishmania i. chagasi. A avaliação mostrou que grande parte dos indivíduos

com LV testados apresentaram anticorpos contra o antígeno 503, indicando que o paciente

infectado com LV exibe uma resposta imune celular e humoral ao antígeno, sugerindo o seu

potencial como um candidato à vacina ou teste de diagnóstico específico da enfermidade

(MARTINS et al., 2006).

3.2. Tecnologia do DNA recombinante

No contexto das biomoléculas produzidas em escala industrial, o termo biotecnologia

entra em cena. Processos como a produção de álcool, de proteínas, hormônios, enzimas e outras

biomoléculas estão englobadas neste contexto, que se alavancou com o desenvolvimento da

engenharia genética, no que se chamou de tecnologia do DNA recombinante. Essa tecnologia

surgiu dentre os anos de 1971 e 1973, causando um grande enfoque para esta área na

comunidade cientifica. Sendo assim, esta tecnologia, hoje, é a base para as transformações

biotecnológicas. A técnica dá subsídio para que possam produzir cópias de parte de um DNA

em cerca de duas horas (COMBETTES-SOUVERAIN; ISSAD, 1998; LUBINIECKI, 1997;

SALOMAA; STINSON; KARK, 1995; WALSH, 2000).

A produção de proteínas recombinantes é um importante processo biotecnológico, uma

vez que provê os meios necessários para produzir um produto específico em quantidades

desejadas. Aplicações deste processo variam desde a produção de catalisadores industriais,

como enzimas, até diversos tipos de biofarmacêuticos, como hormônios e antígenos. Uma

condição para tal processo é que a proteína recombinante seja produzida em um hospedeiro

recombinante. Existem vários hospedeiros eucarióticos e procarióticos, como bactérias, fungos,

plantas, insetos, entre outros. Devido ao cruzamento de espécies, a sequência genética original,

que contém a informação do produto de interesse, precisa ser modificada de modo a se obter

uma expressão satisfatória (HABIBI et al., 2014).

O DNA recombinante é o termo aplicado às moléculas híbridas de DNA que são

construídas in vitro, em seguida, propagadas em uma célula ou organismo hospedeiro. O DNA

recombinante básico consiste em dois segmentos de DNA: um vetor e o segmento de inserção.



O vetor é uma região do DNA que se duplica como uma unidade individual, capaz de se

propagar nas células de escolha. O mesmo é dotado de uma fonte de replicação funcional sendo

tipicamente projetado para acomodar as inserções convenientemente. Os vetores mais usados

são plasmídeos bacterianos e vírus. As inserções podem ser de qualquer tipo - segmentos longos

ou curtos de DNA, de fontes naturais ou sintéticas. Os DNAs recombinantes são isolados em

clones celulares ou virais. O processo de produção desses recombinantes é frequentemente

chamado de “clonagem de DNA” ou “clonagem de genes” (CARROLL, 2013).

Adicionalmente, a implantação das tecnologias da biologia molecular de DNA

recombinante permitiu formação de compostos integrados pela combinação de genes

codificadores dos produtos de interesses, assim, a produção de produtos de interesse ligados a

outros compostos se tornaram possíveis. Uma destas possibilidades é a introdução de caudas

(tags) em proteínas que inicialmente não as continham, tal como na fusão de histidinas na

porção C ou N-terminal do produto de interesse, o que confere a tal a possibilidade da utilização

de purificações antes não possíveis, como a cromatografia de afinidade por íons metálicos

imobilizados (IMAC) (BRESOLIN; MIRANDA; BUENO, 2009).

3.3. Proteínas recombinantes expressas em Escherichia coli

A escolha do microrganismo hospedeiro do plasmídeo, contendo o gene que após a

transcrição e tradução produzirá o composto de interesse, é de fundamental importância quando

se objetiva a produção em larga escala. Além de bactérias, fungos, vírus, entre outros podem

ser utilizados. Não obstante, cada um tem suas vantagens e desvantagens levando em

consideração, também, a molécula heteróloga de interesse. Por exemplo, se são necessárias

mudanças após a produção do componente desejado, no âmbito de uma modificação pós-

traducional eucariótica, não se escolheria um sistema procarioto como hospedeiro para tal, uma

vez que esta não tem a capacidade de fazer tais alterações necessárias (ADRIO; DEMAIN,

2010; DEMAIN; VAISHNAV, 2011; SAHDEV; KHATTAR; SAINI, 2008).

A partir da década dos anos 70, logo após o desenvolvimento da técnica do DNA

recombinante, a comunidade científica se voltou para a bactéria Escherichia coli. Isso ocorreu

pelo fato de que esta bactéria passou a ser estudada como microrganismo hospedeiro para a

produção de compostos heterólogos (LIMA, 2004).

Por várias razões a E. coli ainda é a escolha preferida como sistema hospedeiro para a

produção de proteínas. Com custos relativamente baixos pode-se atingir altos níveis de

biomassa e rendimento de produtos de interesse em curtos tempos de cultivo. Assim, a E. coli



é extremamente bem estudada em suas características bioquímicas e fisiológicas. Destaca-se

que a mesma também pode ser facilmente manipulada geneticamente (KRAUSE;

NEUBAUER; NEUBAUER, 2016)

Mesmo com todas as vantagens da utilização da E. coli como hospedeiro, existem vários

pontos a serem melhor investigados para a otimização dos processos envolvendo esta bactéria

dentre suas limitações. Dessa forma, a maior parte dos cultivos se dá em condições aeróbicas,

uma vez que situações anaeróbicas fornecem menos energia para o metabolismo de crescimento

e produção de proteínas, estimulando a produção de acetato, sendo este um inibidor para a

célula (AHAMED; VERMETTE, 2010).

Embora exista considerável conhecimento acerca desta bactéria e de seus mecanismos de

reprodução, ainda são encontradas barreiras e limitações na utilização da mesma na expressão

de proteínas heterólogas. Como por exemplo, utilizando meios de cultivo complexos a

densidade celular alcançada chega a menos de 0,1% do limite teórico obtido da literatura

(SEZONOV; JOSELEAU-PETIT; D’ARI, 2007). Desse modo, existe a necessidade de

adicionar um processo de rompimento da célula para a liberação do produto de interesse, caso

o mesmo se encontre intracelularmente, uma vez que a E. coli não possui em seu maquinário

um meio de liberação da proteína (TOMAZETTO et al., 2007).

Após a duplicação de uma célula contendo o plasmídeo, existe a possibilidade do mesmo

não ser repassado para ambas as células sucessoras da célula original. Chamado de instabilidade

segregativa, a má distribuição do plasmídeo tem como consequência células improdutivas que

diminuem o rendimento do processo. Dessa forma, com o objetivo de minimizar esta ação,

explora-se a utilização de antibióticos no meio de cultura. Assim, células que não possuem o

plasmídeo, que contém um gene resistente a antibiótico, morrem e dão lugar somente as células

com plasmídeo (LIMA, 2004; TOMAZETTO et al., 2007; VIDAL et al., 2005).

Ter o plasmídeo inserido na célula não significa que a proteína de interesse será

produzida. A célula possui várias funções metabólicas, dessa forma, para a produção da proteína

heteróloga é necessária a expressão da mesma. Obter altos níveis de expressão significa que a

bactéria está desviando seu metabolismo para a produção da proteína e, portanto, esta é uma

etapa crucial para a otimização e a viabilidade do processo. Apesar disto, não existe um passo

a passo correto que funcione para todos os tipos de expressão para se obter a máxima expressão.

Diversos fatores têm seu peso e influência sobre as rotas metabólicas escolhidas pelo organismo

hospedeiro como, por exemplo, o tipo do indutor e sua concentração durante o cultivo, o

momento da indução e sua frequência, a composição do meio de cultivo, os níveis de inibidores

presente e até mesmo as condições operacionais do processo. Isto denota que cada sistema é



único, do modo que cada variável tem que ser cuidadosamente ponderada e analisada para

identificar sua influência no processo como um todo (BERRY; PATON, 2000; CARVALHO

et al., 2012; LARENTIS et al., 2011).

3.4. Operon lac

A expressão da proteína se dá a partir da utilização de um componente que induz a

bactéria a fazer a leitura do plasmídeo inserido no vetor. Este processo foi melhor compreendido

a partir do estudo dos promotores e repressores existentes no genoma de E. coli, o que permitiu

o desenvolvimento para a produção de proteínas heterólogas a partir do operon lac (ETTINGER

et al., 2009). O operon lac é um mecanismo de regulação gênica, o qual é formado pelo conjunto

de genes que codificam a expressão de enzimas que são necessárias para o metabolismo da

lactose. Dessa forma, na presença de lactose, uma bactéria contendo o operon lac em seu código

genético, inicia uma resposta ao metabolismo da mesma, como ilustra a Figura 3. Por meio da

engenharia genética, é inserido no plasmídeo contendo o operon lac o código genético de uma

proteína de interesse. Consequentemente, atrelado ao metabolismo da lactose, o microrganismo

modificado também irá produzir a proteína alvo (TIAN et al., 2011).

Figura 3: Ilustração do funcionamento do operon lac (VAZ, 2011)



Os genes compreendidos no operon lac são os chamados lacZ, lacY e lacA. O lacZ

corresponde a β-galactosidase, enzima responsável pela quebra da lactose em glucose e

galactose, além de ser responsável pela produção a alolactose, o indutor natural do operon lac

(MARBACH; BETTENBROCK, 2012). O lacY codifica a enzima permease da lactose, sendo

responsável então pelo transporte da lactose para dentro da célula (LIN; LYNCH, 1996), e por

último, o lacA codifica a transacetilase, que aparenta ter a função de detoxificação

(RODERICK, 2005).

Pela a necessidade que alguns microrganismos possuem em apresentar uma rápida

resposta ao meio em que se encontram, é de se esperar que genes que atuam sobre um

determinado composto sejam co-traduzidos. Dessa forma, conforme mostrado na Figura 3, em

se tratando do chamado operon lac, o modo de transcrição é realizado pela seqüência operadora

o, que está próximo ao sítio que dá início a transcrição e ao sítio em que a RNA polimerase se

conecta (região promotora p). Desse modo, a transcrição do operon lac é dependente da

repressão do produto gênico do gene lacI, uma vez que regula a sequência operadora

(DEUTSCHER; FRANCKE; POSTMA, 2006). O repressor I, em presença de um tipo de

composto específico, também chamado de indutor, muda a sua estrutura ao ligar-se ao mesmo,

não podendo se ligar mais ao operador, permitindo assim que a RNA polimerase faça a

transcrição do operon lac. Dessa forma, na presença de lactose, ou de um análogo estrutural da

lactose não metabolizável tal como o isopropil-β-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG), o operon

ficará ativo, de forma que os três genes (lacZ, lacY e lacA) serão traduzidos. De forma análoga,

na ausência de uma molécula que se ligue ao repressor I, esta conseguirá se conectar a parte

do operador e, desse modo, impedir a transcrição do operon lac (VAZ, 2011).

3.5. Estratégias de indução e produção de ácido acético

No biorreator, as células em condições propícias estão se reproduzindo continuamente e

para a produção de algum composto de interesse é necessário o desvio de seu metabolismo,

para que as mesmas possam produzir a proteína heteróloga. Caso esse desvio do metabolismo

ocorra de forma muito intensa, o crescimento celular é então prejudicado. Processo esse

conhecido como carga metabólica (metabolic burden). Esta perda no crescimento pode ser

minimizada utilizando um controle na expressão da proteína alvo, ao se escolher o tipo de

indutor (HADDADIN; HARCUM, 2005). Este indutor pode ser um composto químico ou

algum fator físico, como a temperatura, desde que seja capaz de iniciar uma resposta no código

genético atribuído a proteína de interesse. A intensidade desde indutor e a estratégia utilizada



de indução pode influenciar no rendimento dos produtos heterólogos de interesse (SHIN et al.,

1997).

A quantidade de indutor a ser utilizada de forma a obter a melhor resposta de expressão

depende de uma série fatores, entre eles a força que o gene promotor tem, se existe ou não uma

carga genética de repressão encontrada no código genético inserido no microrganismo, o local

onde o produto de interesse será encontrado com relação à célula, a resposta dessa célula quando

em contato com um componente indutor, e fatores específicos da proteína de interesse como

sua solubilidade e características individuais. Desse modo, esta quantidade deve ser suficiente

para que possa romper as barreiras de repressão que possam existir, em função da densidade

celular e também da concentração da molécula indutora utilizada. Assim, se faz necessário

avaliar a condição de indução a fim de se elevar ao máximo a formação da proteína heteróloga

alvo (CSERJAN-PUSCHMANN et al., 2002; DONOVAN; ROBINSON; CLICK, 1996).

No que se refere ao cultivo celular utilizando a bactéria E. coli como hospedeira para a

produção de compostos heterólogos, as condições de cultivo para a obtenção dos mesmos e as

estratégias empregadas no cultivo são de extrema importância para maximizar o rendimento do

produto de interesse (GOMBERT; KILIKIAN, 1997; LULI; STROHL, 1990; RIESENBERG

et al., 1990; WANG et al., 2010).

A E. coli, com sua alta velocidade de duplicação, em se tratando de sistemas

recombinantes de expressão, pode ser induzida a sofrer um desvio do metabolismo (nos

sistemas que exigem indução para expressão do produto heterólogo), uma vez que estando em

crescimento existiria a necessidade da mudança de metabolismo para a expressão do

componente de interesse. Esta transição do metabolismo pode ocorrer de forma a gerar um

estresse metabólico na célula, acarretando na diminuição de sua reprodução (BENTLEY et al.,

1990). Devido a este fenômeno, os meios de cultivo de alta densidade são planejados de forma

a melhor aproveitar a produção da proteína de interesse (CHOI; KEUM; LEE, 2006).

Como os nutrientes oferecidos à E. coli influenciam diretamente na sua produtividade,

condições de grande estresse metabólico levam a um menor rendimento. Não obstante, em

situações de grande densidade celular, também existe a possibilidade do aumento rápido de

subprodutos indesejáveis do ciclo metabólico da bactéria, como o ácido acético, que agem como

inibidores da produção da mesma (HOFFMANN et al., 2004; KILIKIAN et al., 2000;

VALDEZ-CRUZ et al., 2010). Destaca-se que esta liberação de ácido acético durante os

cultivos de E. coli pode ser acatada como uma limitação para a utilização desse organismo uma

vez que este composto, mesmo sendo liberado por sua via metabólica, é uma substância



inibidora à produção de proteína heterólogas (EITEMAN; ALTMAN, 2006; KILIKIAN et al.,

2000; XUE et al., 2010).

3.5.1. IPTG e lactose

Em se tratando de sistemas recombinantes em E. coli com controle promovido pela

indução do operon lac, o repressor do mesmo regula o acesso ao gene recombinante. Assim, a

indução da expressão da proteína heteróloga é impulsionada pela adição ao meio cultivo do

indutor IPTG (BRIAND et al., 2016).

Com o intuito de alcançar o máximo rendimento de produtos heterólogos de interesse,

diversas variáveis são monitoradas e controladas durante o cultivo. Entre estas se destaca a

qualidade e a quantidade das moléculas indutoras que irão promover a expressão dos sistemas.

Principalmente em larga escala, a escolha do indutor e os fatores que giram ao redor do processo

de indução durante o cultivo de sistemas recombinantes tem alto impacto no rendimento final

do produto e nos custos do processo, podendo até mesmo se apresentar com um impacto

negativo na rentabilidade celular, devido à influência tóxica para os microrganismos

hospedeiros (EINSFELDT et al., 2011).

Várias estratégias são desenvolvidas para melhorar a expressão destes sistemas.

Atualmente a adição de IPTG é o método mais utilizado para induzir a expressão da proteína

recombinante, entretanto, sua eficácia é contraposta com diversas limitações: não tem boa

compatibilidade com aumento de escala industrial, apresenta limitações toxicológicas e tem

baixa relação custo-benefício. Como alternativa ao IPTG, a lactose pode ser utilizada como

molécula indutora. E, apesar de superar seu competidor em termos de toxicidade e custo, seu

uso também possui limitações como a necessidade da avaliação das condições adequadas para

sua indução, pois também é fonte de carbono e energia para a célula (BRIAND et al., 2016;

MESGARI-SHADI; SARRAFZADEH, 2017).

Após a indução, as características de crescimento e atividade metabólica da célula

hospedeira são frequentemente influenciadas pela expressão do produto recombinante. Por esta

razão é interessante analisar se possíveis efeitos positivos podem aparecer, decorrentes da

indução da cultura celular a diferentes densidades celulares - que se refletem em diferentes

tempos de cultivo - , com tipos distintos indutores e suas diferentes concentrações (MESGARI-

SHADI; SARRAFZADEH, 2017; NORSYAHIDA; RAHMAH; AHMAD, 2009).

Capítulo 4

Material e métodos

Capítulo 4.Material e métodos 30


4. Material e métodos

4.1. Microrganismo

Para a realização dos experimentos, foi utilizada a cepa da Escherichia coli M15

geneticamente modificada que abriga o plasmídeo pQE-30 (Qiagen, Califórnia/Estados

Unidos) o qual contém em seu código genético o gene para expressão do antígeno 503 de

Leishmania i. chagasi. Este antígeno possui em sua extremidade terminal seis resíduos de

histidina e massa molecular de aproximadamente 56 kDa (MARTINS et al., 2006). Esta cepa

recombinante foi gentilmente cedida pela Dra. Mary Wilson (Universidade de Iowa, Estados

Unidos).

4.2. Meio de cultivo

O meio de cultivo 2xTY com pH 7,0, e com composição apresentada na Tabela 1, foi

utilizado para os ensaios em shaker (incubadora com agitador orbital) (SOUSA JUNIOR,

2015). Deste meio foram pesados os componentes que posteriormente foram solubilizados em

água destilada e, em seguida, esterilizados utilizando o equipamento autoclave, juntamente com

seus recipientes, pelo tempo de 20 minutos sob 1,0 atm de pressão, previamente ao seu uso.

Tabela 1 - Composição do meio de cultivo 2xTY (VAZ, 2011).

Nutrientes Concentração (g/L)

NaCl 5,0

Extrato de levedura 10,0

Triptona 16,0

4.2.1. Antibióticos

De forma a se assegurar a reprodutibilidade somente dos microrganismos contendo o

plasmídeo, foram adicionados ao meio os dois antibióticos: a ampicilina (100µg/mL) e a

canamicina (25µg/mL) (Sigma-Aldrich). Estes foram armazenados a -20 ºC e, previamente ao

uso, foram preparados em condições de assepsia e esterilizados utilizando um filtro de 22 µm

de poro (SOUSA JUNIOR, 2015).



4.3. Inóculo

Para a produção do inóculo, efetuou-se a ativação do microrganismo que estava

armazenado em glicerol 50% a -80 ºC no laboratório de imunogenética da UFRN. Assim, 200

µL da solução da cepa foram colocados em Erlenmeyers de 250 mL juntamente com 50 mL da

solução 2xTY com antibióticos. A ativação foi realizada em ambiente asséptico em shaker

durante 12 horas a 200 rpm e 37 ºC. O inóculo, então, foi preparado com 5 mL da solução da

ativação juntamente com 45 mL de solução do meio 2xTY durante 6 horas a 200 rpm e 37 ºC

(LEITÃO, 2016).

4.4. Ensaios em shaker

Os experimentos foram realizados em shaker, conforme planejamento mostrado na

Tabela 2, utilizando 5 mL do inóculo juntamente com 45 mL de meio 2xTY em Erlenmeyers

de 250 mL. Estes foram realizados com os seguintes parâmetros: 10 horas de cultivo a 200 rpm

e 37 ºC. Tais parâmetros já otimizados em trabalhos anteriores, por Vaz (2011).

Tabela 2 – Planejamento experimental para avaliação da influência do instante de indução e dos indutores IPTG

e lactose na expressão do antígeno 503.

Ensaios Instante de

indução (DO600)

Concentração do Indutor

IPTG (μM) Lactose (g/L)

I 0,5 20 -

II 1 20 -

III 0,5 100 -

IV 1 100 -

V 0,5 500 -

VI 1 500 -

VII 0,5 1000 -

VIII 1 1000 -

IX 0,5 - 0,1

X 0,5 - 1

XI 1 - 1

XII 0,5 - 10



4.4.1 Avaliação da influência dos indutores na expressão do antígeno 503

No presente estudo foram realizados 12 ensaios com o objetivo de se encontrar a melhor

condição para expressão do antígeno, conforme Tabela 2. Estes ensaios foram divididos entre

4 diferentes concentrações de IPTG (20 M, 100 M, 500 M e 1000 M) e 3 concentrações

diferentes de lactose (0,1 g/L, 1 g/L e 10 g/L) a 2 diferentes concentrações celulares (DO600)

(0,5 e 1,0), ensaios esses que foram realizados em shaker (TE-421, Tecnal, Brasil). Para isto

amostras foram coletadas, na qual se analisou a concentração celular (X), a concentração de

ácido acético e a expressão do antígeno 503. Todos os cultivos ocorreram por um período de

10 h e tiveram 6 alíquotas de 2 mL retiradas no tempo zero, no instante da indução e a cada

hora de cultivo.

Trabalhos anteriores realizados pelo nosso grupo, utilizaram a indução com IPTG na

concentração de 1000 M (Vaz et al., 2015), bem como Leitão (2016) e Sousa Júnior (2015)

com a lactose a 10 g/L. Uma vez que o objetivo do trabalho é maximizar a produção do antígeno

de forma a viabilizar o produto, a escolha das concentrações de IPTG e lactose foram feitas de

modo a avaliar se uma indução com menor utilização de indutores ainda sim seria suficiente ou

até mesmo melhor para a expressão máxima do antígeno.

Por isso, foram escolhidas as concentrações duas vezes, dez vezes e cinquenta vezes

menor do que a de 1000 M já utilizadas para o IPTG; bem como concentrações dez vezes e

cem vezes menor do que a 10 g/L já utilizadas para a lactose. Estas ordens de grandeza foram

exploradas de forma a contemplar um pico na produção do antígeno quando utilizado uma

concentração dentro dos parâmetros estabelecidos.

4.4.2. Indução em shaker

A lactose e o IPTG foram adicionados no meio reacional durante os experimentos. A

lactose de concentração final a depender do experimento (conforme Tabela 2) foi manipulada

a partir de uma solução estoque de 200 g/L, e o IPTG a partir de uma solução de 100 mg/mL,

previamente esterilizados com filtro de 22 µm de poro (SOUSA JUNIOR, 2015).



4.5. Estratégia experimental

Em cada um dos 12 ensaios, as alíquotas coletadas para posterior análise de composição

foram inicialmente centrifugadas a 13.400 g durante 30 minutos de forma a separar o

sobrenadante das células cultivadas (VAZ, 2011). As células foram quantificadas em massa, e

a proteína de interesse determinada por método qualitativo (eletroforese) e quantitativo

(Lowry). Do sobrenadante, por sua vez, foram analisados os níveis de ácido acético (inibidor),

como mostra o esquema da Figura 4 a seguir:

Figura 4: Estratégia experimental do estudo. Fonte: Autor.

4.5.1. Determinação da biomassa

A determinação da densidade celular ocorreu com a realização da leitura da solução

contendo as células diluídas em espectrofotômetro modelo Genesys 10 uv (Thermo Spectronic,

EUA) a 600 nm. A diluição foi feita com o meio 2xTY estéril. O resultado obtido pela leitura

fora então comparado com os valores de uma curva padrão pré-estabelecida a partir da massa

seca do microrganismo em questão, conforme a metodologia de Rodrigues et al (2003).



4.5.2. Determinação do ácido acético

O sobrenadante foi filtrado utilizando uma membrana de 0,22 µm e, em seguida, o ácido

acético foi quantificado por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) empregando o

cromatógrafo modelo Acella (Thermo Scientific, EUA). Para isto utilizou-se de uma coluna

Shim-Pack SCR-101H (Shimadzu Co., Japão) a temperatura de 65 ºC. Para a fase móvel foi

utilizada uma solução de ácido sulfúrico 0,005 M com um fluxo de 0,6 mL/min (LU et al.,

2009; XIE et al., 2011). O volume de injeção foi de 20 µL e o valor de resposta foi comparado

com uma curva padrão obtida previamente (LU et al., 2009).

4.5.3. Avaliação do rompimento celular

De modo a quantificar as proteínas de interesse, as células foram armazenadas em banho

de gelo por 15 minutos. Após isso foram ressuspendidas e rompidas, uma vez que a proteína é

intracelular, utilizando-se um tampão de rompimento celular a base de ureia. O tampão utilizado

apresenta composição formada por NaH2PO4 (100 mM), uréia (8 M), Tris-Cl (10 mM) e pH de

8.0, que então foi homogeneizado em agitador de tubos tipo vórtex (AP56, Phoenix, Brasil) a

temperatura ambiente (25 ± 2 °C) por 15 minutos. Por fim, realizou-se uma centrifugação com

o objetivo de remover resíduos celulares a 13.400 g durante 30 minutos (VAZ, 2011).

4.5.4. Recuperação do antígeno 503

A recuperação do antígeno foi realizada utilizando a cromatografia de afinidade por metal

imobilizado (IMAC) com uma resina de Níquel Sepharose Fast Flow (GE Healthcare, Suécia).

Tal metodologia foi utilizada diante da possibilidade da utilização do IMAC devido a

incorporação de uma calda de histidina ao antígeno de interesse, o que possibilita a afinidade

deste aminoácido com a resina utilizada. Para isto, 2,0 mL da solução do sobrenadante foi

adicionada a 0,5 mL da resina a 50% v/v e, em seguida, agitada em shaker durante 30 minutos,

a 200 rpm e temperatura ambiente. Logo depois, o conteúdo foi despejado na coluna vazia com

sua parte inferior vedada, de modo a permitir a passagem da solução e não da resina. A parte

inferior foi aberta de forma a coletar as amostras sob fluxo contínuo. Em seguida, o eluído fora

lavado com duas rodadas de 4 mL de Tampão C - composto por NaH2PO4 (100 mM), ureia (8

M), Tris-Cl (10 mM) a um pH de 6,3 - e então a proteína foi eluída duas vezes com Tampão D



- composto por NaH2PO4 (100 mM), ureia (8 M), Tris-Cl (10 mM) a um pH de 4,5 – utilizando

1 mL do mesmo e colhidos para posterior análise de concentração (VAZ, 2011).

4.5.4.1. Eletroforese de proteínas sob condições desnaturantes (SDS-PAGE)

Eletroforese em gel de poliacrilamida 12%, sob condições desnaturantes (SDS-PAGE),

foi realizada conforme Laemmli (1970), empregando-se uma cuba vertical MiniVE (GE

Healthcare, Suécia).

Para tal, fora utilizado um tampão de corrida de composição: Tris-HCl 25mM, glicina

192 mM e SDS 0,1% (m/v) e pH 8,3; Tampão de amostra: Tris-HCl 0,5 M, glicerol 10% (v/v),

SDS 10% (m/v), 2-mercaptoetanol 5% (v/v), azul de bromofenol 5% (v/v) e pH 6,8.

O gel de separação a 15% de malha tinha como constituintes acrilamida 30%, Tris-HCl

1,5M (pH 8,8), SDS 10%, APS 10%, Temed e água deionizada. Por sua vez, o gel de

concentração possuía acrilamida 30%, Tris-HCl 0,5M (pH 6,8), SDS 10%, APS 10%, Temed e

água deionizada. Utilizou-se como padrão o kit de calibração de baixa massa molecular para

SDS-PAGE (GE Healthcare, Estados Unidos) contendo as proteínas α-lactolbumina (14,4

kDa), inibidor de tripsina (20,1 kDa), ovalbumina (45,0 kDa), albumina (66,0 kDa) e fosforilase

b (97,0 kDa).

Para revelação das bandas proteicas, os géis foram corados com prata (BLUM; BEIER;

GROSS, 1987). Para isso, os géis após a corrida foram deixados com uma solução de etanol

50% por 20 minutos por 3 vezes. Em seguida, foi deixada em contato com uma solução de

tiossulfato de sódio (0,2 g/L) por 1 minuto, lavado por 3 vezes com água destilada. Logo após,

foi deixado em contato com uma solução de nitrato de prata (2g/L + 74 L de formaldeído)

durante 20 minutos. Acabado o tempo, o gel foi lavado rapidamente por 3 vezes com água

destilada e deixado em contato com a solução reveladora (60 g/L de carbonado de sódio + 50

L de formaldeído + 2 mL solução de tiossulfato de sódio) até o aparecimento das bandas,

posteriormente interrompida a reação com a adição de solução de ácido acético 13% (v/v).

4.5.4.2. Análise quantitativa

Com a finalidade de determinar a quantidade de proteínas totais, utilizou-se o método

descrito por Lowry et al. (1951). As concentrações de proteínas das amostras foram estimadas

a partir de uma curva padrão determinada previamente, tendo como padrão a albumina de soro

bovina (Sigma-Aldrich, EUA) na faixa de concentração de 20 a 420 g/L.



Para a análise do antígeno 503, este foi avaliado também por eletroforese como descrito

no item 4.5.4.1. Para determinar a quantidade do antígeno, os geis foram corados com uma

solução a base de prata e em seguida feita a digitalização da imagem dos géis, de forma que a

mesma pudesse ser analisada pelo software ImageJ (versão 1,51. Wayne Rasband, National

Institutes of Health, Estados Unidos). Neste, as imagens das bandas de proteínas coradas foram

relacionadas de acordo com sua intensidade de coloração, gerando picos de intensidade que

foram, então, transformados em valores numéricos. Assim, somando as intensidades de todas

as bandas teve-se a quantidade de proteínas totais no gel, e só as bandas correspondentes a

proteína de interesse, ou seja, a quantidade do antígeno (LEITÃO, 2016).

4.6. Determinação dos parâmetros cinéticos

Os parâmetros cinéticos de um cultivo são necessários de forma a comparar os diferentes

comportamentos destes parâmetros frente às diferentes condições impostas aos cultivos. Assim,

o cálculo destes parâmetros permite para avaliar os objetivos deste estudo. As equações foram

retiradas de Borzani e colaboradores (2001).

4.6.1. Cálculo das velocidades específicas de transformação

A velocidade específica de formação de células (µx) foi estimada conforme Equação (1).

Sendo, X a concentração celular (X) durante o cultivo.

μ𝑋 =1

𝑋

𝑑𝑋

𝑑𝑡 (1)

4.6.1.1. Velocidade específica de crescimento máxima (μXm)

A velocidade específica de crescimento máxima (µxm) foi estimada conforme Equação

(2):

ln𝑋𝑓

𝑋𝑖= μ𝑋𝑚. (𝑡𝑓 − 𝑡𝑖) (2)



Sendo que o Xf e Xi as concentrações de células corresponde ao tempo final e o tempo

inicial, respectivamente, que fornece o maior coeficiente de regressão.

4.6.2. Cálculo da produtividade em células e de produto em células

A produtividade é analisada com respeito as células e ao produto de interesse, de forma a

quantificar a produção de ambos os parâmetros com relação ao volume do meio de cultivo e ao

tempo de produção deste parâmetro. A produtividade em células (PX) e a produtividade de

proteínas em células foram estimadas pelas Equações (3) e (4), respectivamente (BORZANI et

al., 2001).

𝑃𝑋 =𝑋

𝑡 (3)

𝑃𝑃/𝑋 =𝑃𝑃𝑋

(4)

4.7. Análise estatística

Para determinar se as variações nas médias dos valores dos parâmetros cinéticos de

biomassa e proteínas foram significantes ou não, foi realizada a Análise de Variância (ANOVA)

seguida do teste de Tukey, com nível de confiança de 95% (p=0,05). Para isso, utilizou-se do

software Statistica (versão 8,0; StatSoft, Inc.; Estados Unidos) para a realização do cálculo dos

parâmetros. As tabelas geradas pelo software estão no Apêndice 5. As leituras de biomassa

foram feitas em duplicata e proteínas em triplicata.

Capítulo 5

Resultados e Discussão

Capítulo 5. Resultados e Discussão 40


5. Resultados e Discussão

5.1. Influência da concentração de IPTG e do instante de indução

A concentração de IPTG e a concentração celular no instante de indução são fatores

relevantes e devem ser avaliados para maximizar a expressão de uma proteína heteróloga em

E. coli. Neste contexto, a Figura 5 ilustra o perfil apresentado pela biomassa, proteínas totais e

concentração de ácido acético para o ensaio utilizando IPTG com concentração 20 M com

DO600 de 0,5. Destaca-se que a escolha dos valores de concentração de IPTG e do instante de

indução teve como base nos estudos anteriores que avaliaram a expressão do antígeno 503, por

Sousa Júnior (2015), Vaz (2011) e Leitão (2016).

Comparando as variáveis de processo analisadas (biomassa, proteínas produzidas e ácido

acético) do ensaio I ( Figura 5: IPTG 20 M eDO600 0,5) com os das Figuras 6, 7 e 8 (dos

ensaios III, V e VII de DO600 0,5 e de concentração, respectivamente, IPTG 100 M, 500 M

e 1000 M), nota-se que a concentração de IPTG influenciou o perfil das variáveis analisadas.

Entretanto, embora os perfis sejam diferentes, ao se comparar os ensaios de mesma

concentração de IPTG, porém com densidades ópticas diferentes, estes ficaram dentro da

mesma ordem de grandeza. Devido a esta baixa influência da DO600, os gráficos dos ensaios

com IPTG de DO600 1,0 estão no apêndice 4. Adicionalmente, para todos os cultivos de E. coli

sob indução com IPTG não foi observada a fase de adaptação do microrganismo ao meio (fase

lag), sugerindo uma boa adaptação ao meio de cultivo durante as etapas de ativação e preparo

do inóculo.

As análises do antígeno se deram inicialmente de forma indireta, avaliando os níveis de

proteína total. Assim, supondo que concentrações maiores de proteína total teriam

proporcionalmente valores maiores de antígeno, a escolha e determinação de maiores níveis do

produto de interesse fora visto pelos níveis de proteína total, seguido posteriormente pela

comprovação do mesmo, apresentada no item 5.1.3.



Figura 5: Perfil de biomassa em preto (■), concentração de proteínas totais em azul (○) e ácido acético em

laranja (▲) em função do tempo de cultivo para o ensaio I utilizando IPTG como indutor de concentração 20

M e DO600 de 0,5. A seta representa o instante de indução.


laranja (▲) em função do tempo de cultivo para o ensaio III utilizando IPTG como indutor de concentração 100





laranja (▲) em função do tempo de cultivo para o ensaio V utilizando IPTG como indutor de concentração 500



laranja (▲) em função do tempo de cultivo para o ensaio VII utilizando IPTG como indutor de concentração

1000 M e DO600 de 0,5. A seta representa o instante de indução.

Corroborando com a baixa influência da DO600 a 0,5 e a 1,0 nos parâmetros avaliados,

Haq e Akram (2017) investigaram a produção da enzima CenC em E. coli com o operon lac, e

observaram que a indução a DO600 a 0,5 e a 0,9 apresentava uma diferença de menos de 20%



entre os valores de atividade relativa da enzima com 6 e 8 horas após a indução. No presente

estudo, a diferença entre os valores de proteína total com 6 horas após a indução entre os pares

de ensaios (DO600 de 0,5 e 1,0) I-II (IPTG 20 M), III-IV (IPTG 100 M), V-VI (IPTG 500

M) e VII-VIII (IPTG 1000 M) foram, respectivamente: 12,7%, 10,5%, 6,6% e 23,8%. Apesar

do último par de ensaio ter sido maior que 20%, os outros pares mostraram que variação da

DO600 de 0,5 para 1,0 não apresentou grande influência.

O trabalho de Haq e Akram (2017) também mostrou que a indução a DO600 de 0,6 foi a

melhor encontrada, com uma diferença nos valores de atividade enzimática também de cerca

de 20% para com os valores a DO600 de 0,5 e por volta de 40% para com a de DO600 1,0. Ou

seja, quando comparado nos extremos, a diferença do parâmetro avaliado (no exemplo a

atividade enzimática e aqui a concentração de proteína) não foi tão grande quanto comparado

com a DO600 de melhor rendimento (para eles, 0,6). Dessa forma, não se descarta a possibilidade

de que o presente trabalho possa estar neste mesmo segmento, podendo abrir espaço para uma

diferença mais significativa quando testado com valores mais próximos (como por exemplo a

DO600 de 0,6; 0,7; 0,8 e 0,9) de modo a sanar a abertura que a indução entre os termos de 0,5 e

1,0 da DO600 forneceu.

De certo modo, aparentemente, deve existir um balanço para alcançar a otimização da

DO600 na máxima expressão do antígeno de interesse. Por um lado, a DO600 muito baixa não se

tem uma quantidade celular satisfatória para a expressão. Entrando mais na faixa desejada,

dependendo da oferta de carbono, com uma densidade celular um pouco maior deve-se

encontrar uma biomassa que possa levar a produção máxima do produto de interesse.

Entretanto, devido à repressão catabólica, a célula pode “desligar” o mecanismo regulatório de

iniciação do operon lac enquanto houver glicose disponível para a mesma. Devido a esta

preferência da célula, a densidade celular juntamente com o nível de depleção da fonte de

carbono pode ser o ponto chave para que a célula permita ou não a ação do promotor de modo

a iniciar a transcrição do gene heterólogo. Em níveis mais altos da DO600 por sua vez, pode-se

haver um estresse celular caso a indução ocorra de forma intensa, diminuindo assim a eficiência

da expressão (DEUTSCHER; FRANCKE; POSTMA, 2006).

Não obstante, outro fator que pode agregar a não diferença dos parâmetros com a

mudança da densidade celular é a estabilidade do plasmídeo. Collins e colaboradores (2013)

analisaram a influência do instante de indução utilizando IPTG em sistema de E. coli para a

produção de SELPs na estabilidade do plasmídeo. Como resultado, viram que a indução durante

a fase exponencial levou a queda da porcentagem de células contendo o plasmídeo de 100%

para aproximadamente 45% dentro de 2 horas. Ao passo de que quando a indução foi feita ao



final da fase exponencial, com 2 horas após a indução as células apresentaram uma queda maior

na estabilidade, com somente 20% das mesmas apresentando o plasmídeo. Nesta linha de

raciocínio, mesmo com a indução feita com uma DO600 maior, a estabilidade do plasmídeo pode

ser menor, fazendo um balanço entre quantidade de células e perda do número das mesmas que

podem expressar o antígeno.

É notória a influência da concentração do IPTG na formação de biomassa, sendo que na

concentração de 100 M o efeito da carga metabólica é bastante evidente. Para menores valores

da DO600, ou seja, menor instante de indução a célula disponibiliza recursos para a expressão

de proteínas em detrimento da síntese de biomassa. Destaca-se que nesse caso, para

concentração de IPTG 100 M (Figura 6), a concentração de biomassa alcança valores de 1,51

g/L. Esse é o menor valor de biomassa obtido durante todos os cultivos. Por outro lado, ao se

utilizar a maior concentração de IPTG (1000 M, Figura 8) obtém-se os valores mais elevados

de biomassa, atingindo 2,40 g/L. Esses resultados corroboram com os obtidos por Vaz et al.,

(2015) para a cepa de E. coli expressando o antígeno 648 de Leishmania i. chagasi, que

apresentou maior produção de biomassa nos cultivos induzidos com IPTG 1000 M em relação

aos cultivos não induzidos.

Por outro lado, em relação à concentração de proteínas totais, o ensaio III (IPTG 100 M,

Figura 6) mostrou uma tendência de maior produção, chegando a atingir aproximadamente 0,95

g/L após 7 horas de cultivo. No que se refere à concentração de ácido acético nestes ensaios, a

mesma não aparenta ter uma correlação direta junto aos parâmetros de biomassa e proteína

total. Observa-se que os valores de concentração flutuaram ao longo do cultivo, mas sempre

em valores menores que 0,4 g/L, indicando que para as condições estudadas essa concentração

de ácido não foi suficiente para inibir o crescimento. Sabe-se que em concentrações de ácido

acético acima de 0,9 g/L Vaz et al., (2015) ou de 1,95 g/L (Luli; Strohl, 1990; Shiloach; Bauer,

1975) tal inibição pode ocorrer.

Pode-se observar na Figura 5 que o perfil para biomassa e proteínas totais, apesar de

ligeiramente diferente, é muito menos influenciado quando se utiliza a concentração de IPTG

de 20 M. Assim, a concentração mais baixa do IPTG induz um menor estresse para a célula,

quando comparada, por exemplo, com o uso do indutor na concentração mais elevada. Nessa

última condição, os perfis dos três parâmetros avaliados mostram-se completamente diferentes

ao se comparar os diferentes instantes de indução (Figura 8).

Vaz (2011) avaliou a capacidade da cepa de E. coli recombinante para a produção do

antígeno 503. Nesse caso, foi utilizado a concentração de 1000 µM de IPTG sendo que a

indução foi efetuada quando a DO590 atingia 0,4 - 0,5. Observa-se que os valores obtidos no



presente estudo estão em conformidade com aquele reportado por Vaz (2011) que obteve

concentração máxima de células de 2,1 g/L e concentração de ácido acético de 0,46 g/L, que

estão próximos a 2,41 g/L e 0,3 g/L, para células e ácido acético, respectivamente, obtido no

ensaio VII (Figura 8).

A Tabela 3 ilustra alguns parâmetros cinéticos, a produtividade máxima em células e a

velocidade específica de crescimento máxima. Novamente, fica evidente que para os ensaios

III e IV, com concentração de IPTG 100 M, a produtividade em biomassa e velocidade

específica de crescimento máxima são as menores entre todos os ensaios em que se avalia a

influência do IPTG. Adicionalmente, o teste Tukey mostra que com relação a biomassa máxima

os ensaios III, IV e V não possuem diferença significativa em seus valores (mesma letra “e” na

coluna da Tabela 3), o que também acontece com os pares de ensaios (de DO600 diferentes e

mesma concentração de IPTG) I e II (letra “c”). Isso reforça a baixa influência da DO600 de 0,5

e 1,0 neste parâmetro e a grande influência com a mudança de concentração do IPTG.

Tabela 3: Parâmetros cinéticos de crescimento celular máximos obtidos nos ensaios de indução com IPTG.

Ensaios DO600 - [IPTG µM] Biomassa

máxima (g/L) Pxm (g/L.h) xm (1/h)

VIII 1,0 - 1000 2,57 ± 0,02a 2,56 0,29

VII 0,5 - 1000 2,40 ± 0,02b

2,56 0,33

II 1,0 - 20 1,83 ± 0,01c

3,05 0,18

I 0,5 - 20 1,78 ± 0,02c

3,05 0,18

VI 1,0 - 500 1,66 ± 0,03d

3,08 0,20

IV 1,0 - 100 1,55 ± 0,02de

2,05 0,12

V 0,5 - 500 1,54 ± 0,01e

3,08 0,23

III 0,5 - 100 1,51 ± 0,03e

2,05 0,11 Valores com letras diferentes na biomassa apresentam diferenças significativas de acordo com o teste Tukey

(Figura 33 do Apêndice 5).

5.1.2. Produtividade de proteínas em células (Pp/x) e velocidade de crescimento

específico (x)

A Figura 9 ilustra a produtividade de proteínas totais em células (Pp/x) e velocidade de

crescimento específico (x) em função do tempo de cultivo para o ensaio I utilizando IPTG

como indutor na concentração de 20 M. Nota-se que de forma análoga ao observado para a

concentração celular e a concentração de proteínas totais, o instante de indução (setas nas



figuras) e a concentração do IPTG influenciam o perfil de Pp/x e x. Assim, desde que uma

maior concentração de IPTG favoreceu a maior produção de biomassa, e considerando o efeito

da carga metabólica, implicando em menor síntese proteica, o uso de menores concentrações

de IPTG poderia favorecer a produtividade em células. A produtividade de proteínas em células

dos ensaios de concentração de IPTG 100 M (III), 500 M (V) e 1000 M (VII) pode ser

observada nas Figuras 10, 11 e 12 respectivamente. De modo análogo aos gráficos anteriores,

devido à baixa influência da DO600, os gráficos referentes aos ensaios II, IV e VI de DO600 1,0

destes parâmetros cinéticos estão no Apêndice 4.

Figura 9: Perfil de produtividade de proteínas totais em células em preto (●) e velocidade de crescimento

específico em vermelho (○) em função do tempo de cultivo para o ensaio I utilizando IPTG com concentração 20





específico em vermelho (○) em função do tempo de cultivo para o ensaio III utilizando IPTG com concentração



específico em vermelho (○) em função do tempo de cultivo para o ensaio V utilizando IPTG com concentração





específico em vermelho (○) em função do tempo de cultivo para o ensaio VII utilizando IPTG com concentração


Destaca-se que os valores de velocidade de crescimento específico dentro do mesmo par

de ensaios (mesma concentração e DO600 diferente) se mostraram semelhantes em seu perfil, o

que não ocorre com a mudança de concentração do indutor. Pode-se notar que nos ensaios a

partir de 100 M houve um decaimento rápido do x após a indução, uma vez que o

metabolismo da célula passa a demandar recursos para a expressão das proteínas. Isso não

ocorre com clareza no ensaio VII de concentração de IPTG 1000 M (Figura 12), mas que após

um período de aumento, o mesmo logo apresenta uma queda brusca no x. Considerando que

os ensaios de 100 M foram os divisores entre pouco indutor (abaixo de 100 M) e muito

indutor (acima de 100 M), este comportamento faz sentido uma vez que pouco IPTG pode

não afetar tanto no comportamento de crescimento da célula. Analogamente, valores acima

deste crítico podem ter desviado o metabolismo celular de forma mais impactante, mesmo que

isto não esteja representado linearmente em um acréscimo na concentração de produto

encontrada.

Comportamento semelhante ocorreu com os trabalhos de Yoon e colaboradores (1994) e

Norsyahida e colaboradores (2009), mostrando que mesmo com altos valores de x no intervalo

da fase de indução (notavelmente visto no ensaio VII, Figura 12) houve as maiores produções



de biomassa, em consequência da queda de rendimento de seus produtos de interesse (também

utilizando sistema recombinante de E. coli e indução com IPTG).

A queda da velocidade de crescimento específica pode ter sido ocasionada pela forte

influência do indutor. Se isto acontece, então mais indutor pode significar mais expressão e

então mais proteína. Porém, uma vez que o nível de expressão não foi acompanhado com altos

níveis de proteína, o que pode ter acontecido é que o microrganismo foi induzido (o que é

explicado pela queda brusca no x), mas pode ter sofrido degradação por proteases. Isto pode

ter acontecido devido à alta uma expressão (como consequência da alta concentração do

indutor) o que pode estar influenciando na alta produção de proteases também. O que significa

dizer que a alta indução pode levar sim a alta expressão.

Ainda nesta linha de raciocínio, no qual a influência do IPTG afetou nos pares de ensaios,

uma vez que o nível do IPTG de concentração 100 M parece ser o valor crítico para a variação

dos parâmetros de x e proteína total, nota-se que para os ensaios com indução a concentração

mais baixas, as flutuações no x foram menores. Outros trabalhos também utilizaram de

sistemas recombinantes de E. coli baseados no operon lac para avaliar a influência de diferentes

concentrações de IPTG na indução para a produção de produtos heterólogos. Pinsach et al

(2008) variaram o IPTG de 0 a 50 M para a produção de rhamnulose 1-fosfato aldolase e

constataram que o melhor resultado foi visto quando a cultura foi induzida a 20 M de IPTG a

0,13 g/L de células em massa seca. Tal resultado mostrou que para este sistema, valores

menores que 20 M não obtinham diferença significativa no crescimento da cultura, e acima

destes, os valores de crescimento específico foram altamente afetados, bem como acontece no

presente trabalho.

Agregando ao suposto comportamento do x com o aumento do IPTG, nota-se que o

perfil da produtividade de proteínas em células segue a mesma tendência da proteína total na

maioria dos ensaios, exceto nos de maior concentração de indução de IPTG (1000M).

Comparando os gráficos da Figura 8 com a Figura 12, é visto que neste ensaio o Pp/x apresentou

um comportamento de queda significante até as 3 horas de cultivo, enquanto que a proteína

total apresentou, respectivamente, um crescimento e um leve decaimento. Tal comportamento

mostra que a biomassa teve uma maior influência com relação aos outros ensaios nos valores

de proteína total. Observando o crescimento da biomassa neste mesmo período, supõe-se que o

nível elevado do IPTG afetou no desvio do metabolismo celular, mas que mesmo assim não foi

suficiente para contrabalancear seu crescimento na mesma proporção da produção do antígeno.

Norsyahida et al (2009) compararam a adição de IPTG a 1000 M e a 5000 M com a

indução feita no final da fase exponencial de crescimento do microrganismo para a produção



do antígeno BmR1 para a Elefantíase. Os autores constataram que a biomassa obtida com

utilização do IPTG de 1000 M (com o cultivo de 6 h pós indução) foi ligeiramente menor que

a de 5000 M, mas em compensação, a concentração do produto de interesse por sua vez foi

22% maior. Dessa forma, nota-se que a influência do IPTG no presente estudo está de acordo

com a literatura reportada, evidenciando que cada sistema de expressão tem sua faixa de

indução específica, e que a determinação da concentração ótima do indutor é subjetiva ao

produto e ao sistema do microrganismo utilizado.

Outro ponto que corrobora com o motivo da diminuição da concentração de proteína com

o aumento do IPTG, são as diferenças nos níveis de Pp/x logo após a indução. Apesar das

flutuações, às 4 horas de cultivo os ensaios com indução a 500 M e 1000 M (mais altos que

o de 100 M) apresentaram valores nas suas produtividades de proteínas totais em células em

torno de 0,3 g/g (grama de proteína total a cada 1g de células), em contraste, os ensaios com

indução a 20 M e 100 M apresentaram seus valores de Pp/x as 4 horas de cultivo em torno

de 0,48 g/g e 0,58 g/g, respectivamente. Estes valores mostram que com quantidades menores

de IPTG a especificidade na expressão foi maior. Isto suporta o resultado de maiores valores de

proteína encontrados mesmo com baixos níveis de biomassa, no sentido de que estas, mesmo

com menores níveis produziram de forma mais específica o antígeno.

Em contrapartida, os ensaios com maiores valores de IPTG levaram a mais biomassa,

porém, com menor rendimento de produto de interesse por grama de célula. Vários trabalhos

reportaram que a alta densidade celular e até mesmo a indução na fase final do crescimento

exponencial (no qual consequentemente a indução é feita no instante que tem maior densidade

celular) levam a maiores concentrações do produto de interesse (YEE; BLANCH, 1993;

ZANETTE et al., 1998). Porém, a concentração celular específica (Pp/x), como também

apresentado por Manderson e colaboradores (2006), foi diminuída. Visto que uma maior

biomassa poderia levar a mais produção de proteína, a estabilidade pode ter sido a real causa.

A perda do plasmídeo virtude aos altos valores de IPTG após a indução pode ter levado a essa

diminuição da produção específica do microrganismo.

5.1.3. Antígeno

Habitualmente o IPTG é empregado na concentração final entre 100 e 1000 µM para

indução da expressão de proteínas recombinantes que usam o sistema operon lac (SANTOS,

2017). Entretanto, não existe uma estratégia universal para expressão de proteínas heterólogas



e a melhor concentração deve ser avaliada caso a caso, em função da proteína de interesse e do

sistema de expressão utilizado (SARGO, 2011). Neste contexto, avaliou-se a influência das

condições de indução (concentração de IPTG e instante de indução) na expressão do antígeno

503.

Para determinar a concentração de antígeno 503 em cada ensaio, inicialmente utilizou-se

a cromatografia de afinidade por metal imobilizado (IMAC) de acordo com Vaz (2011), de

modo a recuperar a proteína de interesse a partir do homogeneizado celular de E. coli. A

metodologia utilizada na purificação do antígeno foi escolhida pela praticidade do método, uma

vez que o objetivo da purificação no presente estudo foi para efeito comparativo entre as

estratégias utilizadas, e não para a otimização da purificação em si. Deste modo, com a cepa da

E. coli geneticamente manipulada, a proteína de interesse é produzida juntamente com uma

cauda de histidina, conferindo ao antígeno a possibilidade de purificação por IMAC

(BRESOLIN; MIRANDA; BUENO, 2009). Para cada ensaio realizado elegeu-se o instante de

cultivo com maior concentração de proteína total para realizar a recuperação.

A concentração de proteína total é aquela logo após o rompimento das células,

compreendendo todas as proteínas possíveis presentes intracelular e extracelular; a proteína

recuperada são os níveis de proteína que passaram pela etapa de purificação. Devido a

purificação ter sido por metal imobilizado, a calda de histidina presente na proteína de interesse

tem afinidade com a resina utilizada, porém, outras proteínas contaminantes também poder ser

levadas junto no processo. Desse modo, os valores de proteína recuperada representam os níveis

do antígeno mais purificado, mas com alguns contaminantes. Para separar mais ainda o valor

real do antígeno, é que fora realizado a análise com o software do ImageJ, identificando qual a

proporção do antígeno dentro da quantificação das proteínas recuperadas.

Deste modo, o valor de proteína recuperada para cada ensaio é apresentado na Tabela 4.

Assim, o valor do antígeno mostrado na Tabela 4 é referente à quantidade de proteína de

interesse estimada pelo software ImageJ, que foi de aproximadamente 55% da concentração de

proteína recuperada para os experimentos utilizando o IPTG.

Como observado na Figura 13, as colunas 2 e 3 apresentam as bandas proteicas de um

mesmo ensaio utilizando IPTG em momentos diferentes do cultivo. Com isso pôde-se

comprovar que o perfil de proteínas após a indução e a purificação utilizando a metodologia

escolhida, a diferentes instantes do cultivo permanecia, e assim aplicar a porcentagem de

antígeno nas amostras quantificadas.



Figura 13: Eletroforese de amostras purificadas. A seta representa a banda da proteína de interesse. De

acordo com as colunas: (1) Marcador de bandas proteicas padrão; (2) Amostra do instante de 3 h do ensaio III

(IPTG a 100 M e DO600 0,5) de maior proteína total; (3) Amostra do instante de 7 h do ensaio III (IPTG a 100

M e DO600 0,5) de maior proteína total; (4) Instante de 3 h do ensaio X (lactose a 1 g/L e DO600 0,5); (5)

Instante de 8 h do ensaio XI (lactose a 1 g/L e DO600 1,0); (6) Instante de 8 h do ensaio X (lactose a 1 g/L e

DO600 0,5).

Portanto, nota-se na Tabela 4 que os maiores valores de antígeno alcançados foram com

os ensaios de concentração de IPTG 100 M, sendo o ensaio III ligeiramente maior que o IV,

atingindo 0,0867 g/L. Similarmente ao observado neste trabalho, Yang, Shan e Wang (2017)

obtiveram a máxima expressão da enzima recombinante ciclodextrina glicosiltransferase em

E. coli, quando utilizaram a concentração de IPTG de 100 M. Os mesmos autores relataram

que o aumento da concentração do indutor de 100 a 1500 M acarretou em gradativa

diminuição na expressão da proteína recombinante.

Adicionalmente, o teste Tukey confirma a baixa influência da DO600 e a significância dos

ensaios de maior proteína serem o de IPTG a 100 M pelas letras iguais na mesma coluna da

Tabela 4, tendo em vista que não há diferença estatística entre os pares de mesma concentração

de indutor nos melhores ensaios (III e IV) de instantes de indução diferentes (mesma letra “a”

na coluna da proteína total máxima).

Tabela 4: Padrão de produção de proteínas e produtividade do ponto de máximo obtidas nos ensaios utilizando

IPTG como indutor.

Ensaio –

concentração de

IPTG – DO600

Tempo para

concentração

de proteína

máxima (h)

Proteína total

máxima (g/L)

Proteína

Recuperada

(g/L)

Pp/x

(g/g) Antígeno

(g/L)



III - 100 M - 0,5 7 0,984 ± 0,056a 0,158 ± 0,034 0,663 0,087 ± 0,018

IV - 100 M - 1 7 0,971 ± 0,020ba

0,132 ± 0,029 0,658 0,072 ± 0,016

V - 500 M - 0,5 7 0,745 ± 0,028cb

0,050 ± 0,022 0,523 0,027 ± 0,012

II - 20 M - 1 6 0,722 ± 0,004c 0,102 ± 0,026 0,537 0,056 ± 0,014

VII - 1000 M - 0,5 7 0,696 ± 0,058c 0,079 ± 0,019 0,322 0,044 ± 0,010

VIII - 1000 M - 1 5 0,695 ± 0,019c 0,072 ± 0,021 0,356 0,039 ± 0,011

I - 20 M - 0,5 7 0,652 ± 0,058c 0,082 ± 0,021 0,402 0,045 ± 0,011

VI - 500 M - 1 8 0,544 ± 0,041c 0,051 ± 0,004 0,336 0,028 ± 0,002

Valores com letras diferentes na proteína total apresentam diferenças significativas de acordo com o teste

Tukey (Figura 34 do Apêndice 5).

A produtividade de proteínas totais em células (Pp/x) também foi maior para estes ensaios

(III e IV), mostrando que o microrganismo ao utilizar essa concentração de IPTG há um

favorecimento à expressão do antígeno 503 quando comparado com outros ensaios. Além disso,

os pontos durante o cultivo que obtiveram maiores níveis de proteína total ficaram por volta de

6 a 8 horas de cultivo, mostrando que talvez as células apresentem certo tempo de latência para

se atingir uma alta produção do produto recombinante. Uma vez que a biomassa ainda tinha

uma tendência ao crescimento, a produção pode ter ocorrido no instante da indução, mas no

geral, seu pico ocorreu aproximadamente entre 6 e 7 h após a indução.

Em estudo prévio realizado por Vaz (2011) utilizando a mesma cepa recombinante para

a produção do antígeno 503, ao utilizar o meio 2xTY em incubador rotativo e indução com

1000 µM de IPTG, obteve-se 0,05 g/L da proteína de interesse. Resultado similar ao obtido nos

ensaios VII (0,044 ± 0,010 g/L) e VIII (0,039 ± 0,011 g/L), em que se empregou a mesma

concentração de indutor. Por outro lado, no presente estudo, ao reduzir em 10 vezes a

concentração de IPTG usada anteriormente por Vaz (2011), a expressão do antígeno 503 foi

elevada para 0,0867 ± 0,018 g/L (Ensaio III), resultando em melhoria na eficiência do processo,

uma vez que a diminuição na concentração do indutor significa redução dos custos.

Destaca-se que a massa molar do antígeno 503 estimada (Apêndice 3) foi de 52,3 KDa

que está próximo do valor relatado por Vaz (2011), Sousa Júnior (2015) e Leitão (2016) que

relataram o valor de 56 KDa. Quando se utiliza meios de cultivo complexos, como o empregado

neste trabalho, pode-se observar pequenas variações na massa molar da proteína recombinante

produzida (VAZ et al., 2011). Além disso, segundo Diederichs e colaboradores (2014), ao

utilizar diferentes lotes de componentes complexos podem ocorrer variações na composição

específica de nutrientes do meio, devido a diferenças em ingredientes complexos de matérias-

primas e na produção desses componentes. Essas variações de lote podem afetar as taxas de



crescimento, além do rendimento e qualidade do produto em investigações laboratoriais e

obtenção de produtos biofarmacêuticos.

5.2. Avaliação dos ensaios utilizando lactose

Analogamente aos ensaios utilizando o IPTG, as concentrações de indutor utilizadas nos

cultivos empregando lactose foram escolhidas baseadas em trabalhos anteriores de sistemas

recombinantes de E. coli, com expressão empregando o sistema do operon lac. Adicionalmente,

Sousa Júnior (2015) e Leitão (2016) fizeram uso do mesmo sistema do presente trabalho

utilizando uma concentração de 10 g/L de lactose para induzir a expressão do antígeno 503.

Dessa forma, foram determinados os valores de diferentes concentrações de lactose, tendo como

base a concentração 10 g/L, bem como avaliando-se a redução nessa concentração em dez e

cem vezes.

5.2.1. Biomassa, proteína total e densidade celular

Visto que a DO600 no instante de indução (0,5 ou 1,0) para os pares de ensaios com IPTG

de mesma concentração não influenciou com eficácia o perfil de biomassa e proteína total

máxima, fora realizado um teste para averiguar se isso equivaleria também para o uso da

lactose. Assim, inicialmente realizou-se um ensaio com lactose a 1 g/L para determinar se o

mesmo comportamento também se aplicava a este indutor. Desse modo, os ensaios X e XI

avaliaram a indução com 1 g/L de lactose no instante em que a DO600 foi 0,5 e 1,

respectivamente.

Como pode ser observado nos Figura 15 e 16 (ensaios com lactose com concentração de

1 g/L), o comportamento da influência da DO600 se manteve para o sistema com lactose (pouca

influência da DO600 entre 0,5 e 1,0 nos parâmetros avaliados). Dessa forma, para os demais

ensaios, foi fixado o instante de indução de DO600 0,5 - para as concentrações de 0,1 e 10 g/L

deste indutor - respectivamente para as Figuras 14 e 17.

Assim, bem como ocorreu com os ensaios induzidos por IPTG, os perfis de

comportamento da biomassa e proteína máxima variaram com a mudança na concentração de

lactose. Observa-se ainda que a biomassa também mostrou uma tendência crescente acentuada

com o decorrer de todos o cultivo e que os níveis de proteínas totais flutuaram sem um padrão

aparente.



Figura 14: Perfil de Biomassa em preto (■), concentração de proteínas totais em azul (○) e ácido acético em

laranja (▲) em função do tempo de cultivo para o ensaio IX utilizando lactose como indutor de concentração 0,1

g/L e DO600 de 0,5. A seta representa o instante de indução.


laranja (▲) em função do tempo de cultivo para o ensaio X utilizando lactose como indutor de concentração 1





laranja (▲) em função do tempo de cultivo para o ensaio XI utilizando lactose como indutor de concentração 1



laranja (▲) em função do tempo de cultivo para o ensaio XII utilizando lactose como indutor de concentração 10




Destaca-se que após a indução, ocorre um crescimento nos perfis de biomassa em todos

os ensaios utilizando a lactose como indutor sem fase lag. A tendência crescente e quase linear

da biomassa permaneceu em todos os ensaios utilizando a lactose como molécula indutora.

Ademais, após a indução, observa-se um comportamento semelhante nas proteínas totais

durante aproximadamente 1,5 h, de forma que nos ensaios X (Figura 15) e XI (Figuras 16), de

concentração de lactose 1 g/L e DO600 0,5 e 1, respectivamente, os níveis de proteínas totais

apresentaram comportamento decrescente até retornar a crescer com o decorrer do cultivo.

Comportamento este que não ocorreu para com o ensaio IX, com lactose de concentração 0,1

g/L (Figura 14), que ao contrário daquele, sofreu um leve aumento após a indução, e com o

ensaio XII (Figura 17), de concentração 10 g/L que elevou a concentração destas proteínas para

um pico as 3 h de cultivo.

Apesar deste rápido aumento na concentração de proteínas totais observado no ensaio XII

e no leve incremento apresentado pelo ensaio IX, ambos não forneceram os melhores resultados

para a proteína total. Assim, a produção de proteínas totais para a célula talvez apresente uma

mudança no metabolismo diferente para as concentrações de lactose utilizadas, uma vez que a

mesma, ao contrário do IPTG, pode ser metabolizada e utilizada como fonte de energia.

Vale destacar também que os ensaios que obtiveram uma espécie de fase de latência para

produção das proteínas totais foram os que atingiram os maiores valores de proteína total,

correspondendo aos ensaios utilizando a lactose a 1 g/L.

Os ensaios que atingiram valores de biomassa mais elevados utilizaram as concentrações

de lactose de 0,1 e 10 g/L (Figuras 14 e 17, respectivamente). Por outro lado, os ensaios de

concentração intermediária de lactose (1 g/L, Figuras 15 e 16) foram os que obtiveram menores

níveis de biomassa, porém, como aconteceu com o IPTG, renderam maiores concentrações de

proteína total.

Estudos anteriores também variaram a lactose na determinação de produtos

recombinantes de interesse. Su et al (2015) variaram a concentração da lactose entre 2 – 20 g/L

na expressão da lipase Serratia marcescens H30 para a indução a DO600 entre 0,6 – 0,8 e

verificaram que a melhor concentração para a maior atividade do produto de interesse foi com

a indução com lactose a 15 g/L.

Tian et al (2011) testaram a influência da lactose na produção do fator de crescimento 2

de queratinócitos, utilizando a indução da mesma na DO600 entre 0,8 – 1 com valores de

concentração do indutor de 2 – 50 g/L. Os resultados mostraram que a o aumento na

concentração da indução com lactose até 10 g/L rendeu maiores níveis do produto de interesse,



e que valores maiores que 10 g/L levaram a supressão da produção da proteína alvo, sendo este

valor considerado o melhor para este caso.

Os trabalhos corroboram ao mostrar que níveis intermediários de lactose têm que ser

testados devido a dinâmica que cada sistema de expressão (contando com plasmídeo, cepa, gene

de expressão, entre outros) apresenta. Por isto, a diferença nos valores de proteínas totais para

cada ensaio com concentrações de lactose distintas pode ser avaliada no sentido de que o valor

ótimo ainda pode ser encontrado utilizando uma faixa de concentração mais estreita, uma vez

que os valores utilizados no presente estudo foram distintos o suficiente para avaliar em que

nível de concentração do indutor teria melhor influência – decimal (0,1 g/L), unitário (1 g/L)

ou na casa da dezena (10 g/L).

Não obstante, os níveis de ácido acético não permaneceram em um patamar tão linear

quanto apareceram com os ensaios utilizando o IPTG. Assim, o fato da lactose ser utilizada

como substrato, pode influenciar de forma diferente o metabolismo do microrganismo, levando-

o a níveis mais elevados deste subproduto que quando utilizado o IPTG. Destaca-se que os

ensaios induzidos com lactose, que renderam mais biomassa, obtiveram grandes flutuações em

seus níveis de ácido acético, provavelmente devido ao diferente metabolismo da lactose

comparado com o IPTG.

O ensaio X (Figura 15) mostra a formação de ácido acético a partir da 3ª hora de cultivo,

no mesmo momento em que a biomassa começou a se estabilizar na fase exponencial de

crescimento do microrganismo e que os níveis de proteína total cresceram consideravelmente.

No ensaio XI (Figura 16) o pico de ácido acético foi visível no instante da indução,

acompanhado pelo crescimento exponencial do microrganismo e seguido de um decaimento

nos níveis de proteína total. O ensaio XII (Figura 17), por sua vez, obteve uma diminuição no

instante da indução, quando os níveis de biomassa e de proteína total seguiram curso com um

aumento.

Deste modo, observa-se que as variações nos níveis de ácido acético não seguiram um

comportamento simples de modo a correlacionar com as variações dos parâmetros de biomassa

e proteínas totais. Pode-se sugerir que após o pico máximo de produção, este metabólito foi

parcialmente reassimilado pelas células de E. coli, como observado no ensaio XII (Figura 17).

Neste sentido, Xue et al, (2010) descreveram previamente que na ausência de fontes de carbono

facilmente assimiláveis, como glicose, E. coli pode oxidar parcialmente o ácido acético, e

utilizar este metabólito como fonte de carbono e energia.

Como nota-se na Tabela 5, a produtividade em células máxima (Pxm) e a velocidade de

crescimento específica máxima (xm) não se relacionaram da mesma forma com a biomassa



para os ensaios com IPTG, apontando que maiores Pxm, para os ensaios utilizando a lactose,

levaram a menor concentração máxima de biomassa e xm. Em se tratando da velocidade de

crescimento específica máxima, os ensaios de menor e maior concentração de lactose foram os

que obtiveram maiores valores de xm, com quase 3 vezes mais que o ensaio de maior produção

de proteína total. Não obstante, o ensaio XI (Figura 16) que obteve mais que o dobro do xm

do que o ensaio X (Figura 15) não teve sua proporcionalidade refletida nas proteínas totais, uma

vez que seus valores são quase idênticos.

Analogamente aos resultados do teste Tukey da Tabela 4, a análise estatística (Tabela 5)

evidencia que os dois instantes de indução testados não alteram de maneira significativa os

parâmetros avaliados (mesma letra “b” nos ensaios X e XI) e que os ensaios de concentração

menor (IX) e maior (XII) não apresentaram diferenças significativas em seus valores de

biomassa máxima.

Tabela 5: Parâmetros de biomassa dos ensaios realizados com lactose.

Ensaios DO600 - [lactose g/L] Concentração máxima

de Biomassa (g/L) Pxm

(g/L.h) xm (1/h)

IX 0,5 - 0,1 2,87 ± 0,01a 2,05 0,33

XII 0,5 - 10 2,69 ± 0,01a 2,05 0,33

X 0,5 - 1 2,45 ± 0,02b 2,93 0,12

XI 1 - 1 2,30 ± 0,03b 2,93 0,26

Valores com letras diferentes na biomassa apresentam diferenças significativas de acordo com o teste Tukey

(Figura 35 do Apêndice 5).

Essa diferença nos valores de biomassa máxima devido a variação na concentração de

lactose na indução, ressalta a complexidade da mesma como molécula indutora. Um dos

principais inconvenientes de induzir sistemas utilizando a lactose é o mecanismo de repressão

catabólica. Neste caso, pela dinâmica deste composto, o real indutor neste sistema é a

alolactose, que é um produto intermediário produzido pela β-galactosidase durante a conversão

da lactose em glucose e galactose. Se no caso existir uma repressão, a alolactose não é produzida

e não se liga ao repressor de forma significante para fornecer uma boa expressão (WANG et

al., 2010). Entretanto, como os ensaios utilizando a lactose apresentam diferenças nos níveis de

biomassa com os ensaios utilizando o IPTG, fica evidente a utilização da lactose como fonte de

carbono (bem como os altos níveis de ácido acético) mais do que para a produção do antígeno.



5.2.2. Produtividade de proteína em células (Pp/x) e velocidade de crescimento

específica (x)

Do mesmo modo que ocorreu com o IPTG, o perfil do Pp/x também tendeu a seguir o

comportamento das proteínas totais quando utilizando lactose. Após a indução, os ensaios IX,

X e XI (Figuras 18, 19 e 20, respectivamente) ocorre uma redução brusca no valor do Pp/x, ou

seja, exceto para o ensaio XII (Figura 21), esse parâmetro não foi favorecido pela indução.

Sendo este último ensaio com o maior valor de lactose utilizado (10 g/L), provavelmente

a grande oferta de substrato presente no meio, favoreceu também a expressão das proteínas

totais. Ou seja, as condições de cultivo foram suficientes para suprir os recursos da célula tanto

para formação de biomassa, quando para a síntese proteica. É notável, entretanto, que para os

ensaios X e XI (de concentração de lactose utilizada 1 g/L) ocorreu tanto a queda do Pp/x quanto

para proteínas totais, sendo estes comportamentos revertidos logo em seguida. Isto pode

significar que as vias metabólicas tenham sido direcionadas para o crescimento celular no

início, mas que como o Pp/x destes ensaios ficaram em níveis maiores que os ensaios IX e XII,

a especificidade da produção de proteínas foi maior no decorrer do cultivo, o que é mostrado

também pelo fato dos maiores valores de proteína total se encontrarem em aproximadamente 7

horas de cultivo. Assim, parece existir um período de adaptação do uso da lactose que era usado

para o crescimento convertido para uma maior expressão.



Figura 18: Perfil de produtividade de proteínas totais em células em preto (■) e velocidade de crescimento

específico em vermelho (○) em função do tempo de cultivo para o ensaio IX utilizando lactose a 0,1 g/L como

indutor e DO600 0,5. A seta representa o instante de indução.


específico em vermelho (○) em função do tempo de cultivo para o ensaio X utilizando lactose a 1 g/L como





específico em vermelho (○) em função do tempo de cultivo para o ensaio XI utilizando lactose a 1 g/L como



específico em vermelho (○) em função do tempo de cultivo para o ensaio XII utilizando lactose a 10 g/L como




A lactose se apresenta como um indutor competitivo (competição entre expressão e

crescimento). Devido a isso, sua concentração deve ser otimizada com mais afinco de modo a

compensar o crescimento celular pela requerida indução da cultura. Observa-se, também, que

há uma tendência a redução de x ao longo do cultivo, independente da concentração de lactose

usada.

5.2.3. Antígeno

De acordo com a Figura 13, nota-se que o perfil de composição das amostras de proteína

recuperadas, dos ensaios induzidos com a lactose, em se tratando da comparação de pontos de

instantes distintos do mesmo cultivo, foram semelhantes entre si. Nas colunas 3 e 5 nota-se que

mesmo com pontos diferentes, as bandas intensas são idênticas aparecendo em ambas as

colunas na mesma magnitude. Com a coluna 4, compara-se o mesmo instante de cultivo onde

a indução foi feita a densidades óticas diferentes. Assim, constata-se também que ambas

possuem o mesmo perfil, mesmo em ensaios diferentes.

Deste modo, a partir do ImageJ obteve-se uma porcentagem de antígeno da proteína

recuperada de aproximadamente 22% com os ensaios induzidos com lactose. Em comparação

com os de IPTG, percebe-se que a indução por lactose favorece a expressão de outras proteínas,

em relação ao antígeno 503. Assim, fazendo com que sua expressão fosse reduzida de

aproximadamente 55% da quantidade de proteína recuperada com os ensaios induzidos com

IPTG, para apenas 22% com a lactose.

Como se observa na Tabela 6, a produtividade de proteína em células total foi maior nos

ensaios X e XI, o que está de acordo com os maiores níveis de proteína recuperada e do antígeno

503, sendo o ensaio X utilizando 1 g/L de lactose o de maior concentração de antígeno, 0,0153

g/L. Os valores de produtividade de proteína em células do ponto de maior proteína por sua vez

mostram que os maiores valores ficaram por conta dos ensaios que obtiveram maior

concentração de proteína total, ou seja, os ensaios X e XI.

Adicionalmente, o teste Tukey confirma a baixa influência da DO600 nos valores de

proteína (pelos ensaios X e XI de DO600 diferentes apresentarem a letra “a” na mesma coluna)

e a significância dos ensaios de maior proteína por exibirem letras diferentes na mesma coluna

da Tabela 6 quando utilizado concentrações de lactose diferentes de 1,0 g/L.



Tabela 6: Parâmetros de proteína dos ensaios utilizando a lactose.

Ensaios DO600 -

[lactose

g/L]

Ponto de

proteína

máxima

(h)

Proteína total

máxima (g/L) Pp/x

(g/g) Proteína

purificada (g/L) Antígeno (g/L)

XI 1 - 1 10 1,028 ± 0,021a 0,447 0,050 ± 0,0058 0,011 ± 0,0012

X 0,5 - 1 8 1,018 ± 0,020a 0,473 0,070 ± 0,0112 0,015 ± 0,0024

IX 0,5 - 0,1 8 0,878 ± 0,018b 0,346 0,017 ± 0,0028 0,004 ± 0,0006

XII 0,5 - 10 3 0,759 ± 0,023c 0,420 0,007 ± 0,0012 0,002 ± 0,0002

Valores com letras diferentes na proteína total apresentam diferenças significativas de acordo com o teste

Tukey (Figura 36 do Apêndice 5).

Deste modo, é notável que a escolha da concentração de lactose que melhor se adapte ao

sistema de produção do produto heterólogo é individual e dependente de vários fatores pontuais

como a cepa, produto de interesse, plasmídeo inserido, metabolismo intracelular, gradiente de

concentração do indutor dentro e fora da célula entre outros.

5.3. IPTG versus lactose

Quando comparando os ensaios induzidos com IPTG e com lactose, é notável a diferença

no perfil de proteínas visto na Figura 13. As colunas 2 e 3 mostram a composição proteica das

amostras de um ensaio quando induzido com IPTG, enquanto que as colunas 4, 5 e 6 são dos

ensaios induzidos com lactose. O perfil induzido com o IPTG mostra-se com menos

contaminantes, ou seja, menos bandas além da apontada pela seta (a que representa o antígeno).

Esse resultado evidencia a diferença do metabolismo da lactose e do IPTG na célula, mostrando

que até mesmo outras proteínas são produzidas quando a E. coli é induzida com lactose,

podendo aparecer no perfil de proteínas da eletroforese.

Mesmo com tendências semelhantes de produção de biomassa, a indução usando IPTG

atingiu níveis de expressão de proteínas maiores que os ensaios que usaram lactose.

Comparando seus níveis máximos de antígeno 503, o ensaio com IPTG obteve uma

concentração aproximadamente 5,6 vezes maior que o de lactose. Por outro lado, a biomassa

foi favorecida ao se utilizar a lactose com aproximadamente 1,5 vezes a concentração de IPTG.

Este comportamento foi visto também por Haq e colaboradores (2017) que utilizaram lactose e

IPTG para avaliar a expressão de CenC em E. coli, no qual foi observado o sucesso na utilização

da lactose como molécula indutora, onde a mesma conseguiu produzir maiores níveis de

biomassa com concentrações equiparáveis do produto de interesse quando induzido com IPTG.



A Tabela 7 resume os principais parâmetros relacionados às melhores condições

encontradas para expressão do antígeno de interesse quando utilizando IPTG ou a lactose como

molécula indutora.

Tabela 7: Comparação de diferentes parâmetros obtidos na utilização de IPTG e lactose como molécula

indutora.

Parâmetro Indutor

IPTG Lactose

Concentração do melhor

ensaio 100 M 1 g/L

DO600 0,5 0,5

µxm 0,11 h-1 0,12 h-1

Intervalo da fase

exponencial 2 - 3 h 0,5 - 3 h

Tempo para biomassa

máxima 6 h 10 h

Biomassa máxima 1,51 g/L 2,30 g/L

Pxm 2,05 g/L.h 2,93 g/L.h

Pp/x máximo pós indução 0,663 g/g 0,473 g/g

Tempo para proteína

máxima 7 h 8 h

Proteína total máxima 0,93 g/L 1,018 g/L

Antígeno 503 0,09 g/L 0,02 g/L

Ácido acético máximo 0,21 g/L 0,48 g/L

A complexidade e a diferença da lactose ser utilizada como indutor com o IPTG também

é evidenciada pela comparação nos valores de proteínas totais e Pp/x nos melhores ensaios de

cada na Tabela 7. Mesmo obtendo um valor de proteína total maior quando utilizando a lactose,

seu valor de Pp/x é menor, mostrando que a expressão da proteína de interesse por quantidade

de microrganismo quando empregado a lactose é menor. Além disso, como foi visto na Figura

13 a disparidade na composição pós purificação mostra como a lactose influenciou em menor

peso (quando comparado com o IPTG) na especificidade por expressar em menor proporção o

antígeno 503 com relação a outras proteínas apresentadas na eletroforese.

Dessa forma, desde que a concentração do antígeno 503 é 4,5 vezes maior ao se utilizar

o IPTG que a lactose, e ainda com tempo para obtenção desse máximo sendo menor, indicando



maior produtividade, fica claro que o IPTG é o melhor indutor para a expressão do antígeno

503 para o presente sistema. Por outro lado, por se tratar de um indutor que também pode ser

utilizado como fonte de carbono para o microrganismo, os ensaios com lactose levaram os

níveis de biomassa maiores que os apresentados ao se utilizar o IPTG, porém não se refletindo

na expressão do antígeno 503. Adicionalmente, o comportamento metabólico da E. coli M15

depende do indutor, mesmo ambos agindo no mesmo ambiente do operon lac, no que se refere

ao balanço biomassa/expressão, conforme perfil eletroforético mostrado na Figura 13. Assim,

uma vez que nos dois casos, os cultivos tiveram uma tendência crescente de biomassa, mostra-

se que a regulação repressor/indutor parece ser favorecida pela presença de IPTG.

Para o presente sistema, a expressão do gene heterólogo certamente é influenciada pela

capacidade da molécula indutora de entrar no microrganismo e pela sua toxicidade (quando se

tratando do IPTG) que seria dependente da concentração do indutor, e como o indutor é

consumido/utilizado por diferentes rotas metabólicas (quando se tratando da lactose). Esta

concentração dentro da célula por sua vez pode variar no decorrer do cultivo, uma vez que a

lactose pode ser consumida pela célula e clivada gerando glicose que regula o próprio

metabolismo da lactose em E. coli.

Não obstante, os mecanismos de transporte do IPTG por meio da membrana celular é

também um fator considerável na expressão de genes heterólogos, entretanto, ainda não está

suficientemente caracterizado (DREISIGMEYER et al., 2008). Apesar disto, já foi reportado

para o controle do IPTG intracelular que o mesmo pode passar pela membrana celular

independentemente da permease da lactose (HANSEN; KNUDSEN; SØRENSEN, 1998) e que

ele é ativamente transportado pelo lacY (JENSEN; WESTERHOFF; MICHELSEN, 1993). Isso

evidencia a complexidade na determinação da concentração de ambos os indutores

intracelularmente, o que pode ser o caminho a explicar as diferenças na força e forma de

expressão do IPTG e lactose nos produtos heterólogos e no presente trabalho.

O IPTG, então, conseguiu ser o candidato mais eficiente ao expressar mais antígeno

quando utilizado na concentração de 100 M em comparação com a lactose e com trabalhos

anteriores do grupo. Assim, onde anteriormente era utilizada uma concentração de 1000 M

deste composto para a expressão do antígeno, o trabalho mostrou que a expressão foi otimizada

com uma maior produção de antígeno quando a indução foi drasticamente reduzida para 10

vezes (100 M) seu valor original.

Capítulo 6

Conclusões

Capítulo 6. Conclusões 68


6. Conclusões

A densidade ótica a 600 nm (0,5 ou 1,0 de absorbância) no instante da indução não

impactou de forma significativa na produção do antígeno de interesse, independente do

indutor (IPTG ou lactose) utilizado;

Os níveis de ácido acético ficaram abaixo dos reportados na literatura como inibidores,

de modo que o mesmo não desfavoreceu o crescimento celular e expressão do antígeno

nos cultivos avaliados;

A lactose servindo tanto como substrato quanto molécula indutora demonstrou produzir,

de forma geral, mais biomassa que os ensaios induzidos com IPTG, exibindo uma menor

especificidade na produção do antígeno (menor expressão com mais biomassa);

A concentração de lactose que mais favoreceu a expressão do antígeno de interesse foi

de 1 g/L, valor este menor que normalmente utilizado pela literatura, o que representa

vantagem em termos redução de custos e rendimento do processo;

Para indução com IPTG, a máxima produção do antígeno foi observada na concentração

de 100 M, o que é também menor que a normalmente citada pela literatura;

Comparando os indutores entre si, o IPTG é o melhor candidato para a produção do

antígeno de interesse, uma vez que a produção máxima do antígeno 503 foi alcançado

com níveis de 0,0867 g/L que representam um valor 5,6 vezes maior que a concentração

máxima produzida quando empregada a lactose;

A concentração com IPTG a 100 M representa uma redução drástica de 10 vezes o

valor usado em trabalhos anteriores (de 1000 M), obtendo maiores níveis do antígeno.

Referências bibliográficas

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Apêndices

Apêndices 80


APÊNDICE 1

De modo a manter monitorado durante todo o tempo de cultivo o valor da concentração

de células do sistema, foi necessário obter uma função que estabelecesse a relação entre a leitura

no espectrofotômetro a DO600 da amostra do sistema com a concentração de biomassa da

mesma. Assim, a Figura 22 mostra o gráfico com a reta padrão usada para determinar os valores

de biomassa subsequentes, a partir de uma amostra com 5 pontos feitos a partir da determinação

da massa seca como apresentado no item 4.6.1.

Figura 22: Curva de calibração para a determinação da biomassa a partir da leitura da DO600.

A regressão linear foi realizada obtendo um coeficiente de determinação (R2) de 0,9822,

mostrando que o modelo se ajusta bem aos pontos experimentais, e a função da reta y = 0,4084x

+ 0,8205.

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

0 1 2 3 4 5 6

Bio

mas

sa (

g/L)

DO600

Apêndices 81


APÊNDICE 2

De modo análogo a curva padrão da biomassa vs DO600 em termos de comparação para

obtenção dos dados subsequentes, o modelo do ácido acético se relacionou com os valores de

picos de intensidade da área representativa a concentração da amostra analisada, a partir de sua

determinação no HPLC. Assim, a Figura 23 do gráfico abaixo mostra os 10 pontos utilizados

para o ajuste do modelo dado pela equação y = (10^-6)x – 0,0652 e R2 = 0,9996, também com

bom ajuste do mesmo.

Figura 23: Curva de calibração para determinação de ácido acético a partir da leitura da intensidade dos picos no

HPLC.

0

2

4

6

8

10

12

0 2000000 4000000 6000000 8000000 10000000 12000000

Áci

do

acé

tico

(g/

L)

Área do pico

Apêndices 82


APÊNDICE 3

Para estimar a massa molecular do antígeno 503 obtido neste trabalho, utilizou-se

inicialmente, o padrão de proteínas de massa molar conhecida para se construção de uma curva

de calibração correlacionando a distância percorrida pelo padrão no gel com o logaritmo na

base 10 da sua respectiva massa. Como mostrado na Figura 24, obteve-se a função y = -1,2574x

+ 5,0702, e interpolando-se a distância percorrida pela proteína de interesse, encontrou-se que

a banda correspondente (seta na Figura 13) apresenta massa molecular de 52,3 KDa,

confirmando a presença do antígeno.

Figura 24: Correlação do massa molecular dos padrões inibidor de tripsina (20,1 kDa), anidrase carbônica (30,0

kDa), albumina (66,0 kDa) e fosforilase b (97,0 kDa) e a distância percorrida no gel de eletroforese da Figura 13.

4

4.2

4.4

4.6

4.8

5

5.2

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6Log1

0 P

eso

mo

lecu

lar

(KD

a)

Distância percorrida

Apêndices 83


APÊNDICE 4

Os gráficos respectivos aos ensaios II, IV, VI e VIII utilizando IPTG de concentrações

20 M, 100 M, 500 M e 1000 M e DO600 1 estão nas Figuras 25, 26, 27 e 28,

respectivamente. Além disso, os gráficos dos parâmetros cinéticos destes ensaios estão

respectivamente nas Figuras 29, 30, 31 e 32.


laranja (▲) em função do tempo de cultivo para o ensaio II utilizando IPTG como indutor de concentração 20


Apêndices 84



laranja (▲) em função do tempo de cultivo para o ensaio IV utilizando IPTG como indutor de concentração 100



laranja (▲) em função do tempo de cultivo para o ensaio VI utilizando IPTG como indutor de concentração 500


Apêndices 85



laranja (▲) em função do tempo de cultivo para o ensaio VIII utilizando IPTG como indutor de concentração



específico em vermelho (○) em função do tempo de cultivo para o ensaio II utilizando IPTG com concentração


Apêndices 86



específico em vermelho (○) em função do tempo de cultivo para o ensaio IV utilizando IPTG com concentração



específico em vermelho (○) em função do tempo de cultivo para o ensaio VI utilizando IPTG com concentração


Apêndices 87



específico em vermelho (○) em função do tempo de cultivo para o ensaio VIII utilizando IPTG com

concentração 1000 M e DO600 de 1,0. A seta representa o instante de indução.

Apêndices 88


APÊNDICE 5

As figuras abaixo representam o teste Tukey HSD realizado pelo software Statistica dos

parâmetros cinéticos, de forma a avaliar suas diferenças significativas.

Figura 33: Teste Tukey com os dados de biomassa máxima dos ensaios de I a VIII utilizando IPTG como indutor

da Tabela 3. Valores com asterisco na mesma coluna não apresentam diferenças significativas com 95% de

confiança.

Figura 34: Teste Tukey com os dados de proteína máxima dos ensaios de I a VIII utilizando IPTG como indutor

da Tabela 4. Valores com asterisco na mesma coluna não apresentam diferenças significativas com 95% de

confiança.

Apêndices 89


Figura 35: Teste Tukey com os dados de biomassa máxima dos ensaios de IX a XII utilizando lactose como

indutor da Tabela 5. Valores com asterisco na mesma coluna não apresentam diferenças significativas com 95%

de confiança.

Figura 36: Teste Tukey com os dados de proteína máxima dos ensaios de IX a XII utilizando lactose como

indutor da Tabela 6. Valores com asterisco na mesma coluna não apresentam diferenças significativas com 95%

de confiança.

dissertaÇÃo de mestrado...tecnologia do dna recombinante..... 22 3.3. proteínas recombinantes...

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