I

Universidade Camilo Castelo Branco Instituto de Engenharia Biomdica

DBORA ALICIA BUENDA PALACIOS

OZONIZAO E CARACTERIZAO DE LEOS VEGETAIS PARA USO DERMATOLGICO

So Jos dos Campos - SP 2010

II

Dbora Alicia Buenda Palacios

Ozonizao e caracterizao de leos vegetais para uso dermatolgico

Orientador: Prof. Dr. Renato Amaro Zngaro

Dissertao de Mestrado apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Bioengenharia da Universidade Camilo Castelo Branco, como complementao dos crditos necessrios para obteno do ttulo de Mestre em Bioengenharia.

So Jos dos Campos, SP 2010

III

IV

V

DEDICATRIA

Dedico este trabajo a mi famila, Mis paps: Ariel y Deborita

Mis hermanos: Ernesto, Eliana y Diana

Mis abuelos (in memoriam): Enrique y Dbora, Antonio y Alicia

Que han compartido conmigo alegras, tristezas, triunfos y sobre todo momentos, simples e inolvidables. Me han enseado a vivir y a amar sin medida. Se han convertido en el motor que mueve mi alma y no permite que desista ante nada, que me ayuda a crecer, a creer en m y me da la confianza de que pase lo que pase siempre vamos a estar bien y unidos.

No imaginan cuanto los amo!

VI

AGRADECIMENTOS

A Deus que me guia e fortalece. Universidade Camilo Castelo Branco, pela oportunidade de alcanar uma meta, realizao de um objetivo profissional e pela possibilidade de contemplar um horizonte mais amplo. Ao meu orientador: Prof. Dr. Renato Amaro Zngaro, pessoa a qual admiro, pois com muita pacincia e sabedoria me ajudou a culminar esta etapa! Ao Professor Dr. Landulfo Silveira Junior, que colaborou e me ensinou com grande disponibilidade. Aos professores: Luis Carlos de Lima, Marcos Tadeu Tavares Pacheco, Marco Antonio de Oliveira, Fernando Ortega, Ktia Calligaris. Nidia Lucia que sempre foi atenciosa, esteve disposta a ajudar e tornou-se uma amiga. Helena Maria de Oliveira: amiga, que me escutou, apoiou, animou e ajudou, infinitamente. minha famlia que me ama, acredita em mim e sempre est comigo. Aos colegas de estudo: Ariane, Dani, Rogrio, Milene, Leandro, Erik. Aos Amigos: Jenny, Sonia, Jozi, Angelita, Gaby, Edna, Judy, Norma, Caro, Natalia, Guille, Zamir, Andrs A todas as pessoas que colocaram seu gro de areia para que fosse possvel a finalizao de esta fase, to importante na minha vida.

Cuando uno ensea lo que sabe, recibe una enorme recompensa: El brillo de unos ojos que han entendido, que han comprendido, que han aprendido algo

nuevo y un eterno sentimiento de gratitudINFINITAS GRACIAS! Dbora.

VII

EPGRAFE

H homens que lutam um dia, e so bons; H outros que lutam um ano, e so melhores;

H aqueles que lutam muitos anos, e so muito bons; Porm h os que lutam toda a vida

Estes so os imprescindveis

Bertold Brecht

VIII

OZONIZAO E CARACTERIZAO DE LEOS VEGETAIS PARA USO DERMATOLGICO

RESUMO

O objetivo deste trabalho ozonizar 5 leos vegetais (leo de girassol, glicerina, azeite de oliva, leo de soja, e vaselina) e caracteriz-los espectral e morfometricamente. Os leos vegetais ozonizados so uma excelente opo para armazenar o oznio facilitar a manipulao do oznio teraputico, evitar sua rpida degradao e realizar tratamento de oznio terapia no ramo extra-hospitalar. Ainda, este trabalho pode contribuir para os profissionais que atuam na rea de oznio terapia, pois o conhecimento das particularidades dos leos vegetais ozonizados e a reao do oznio com os leos e suas vantagens teraputicas tm se tornado objeto de estudo. A metodologia do trabalho se caracteriza pela observao analtica. Para descrever as caractersticas espectrais e morfomtricas dos cinco leos vegetais ozonizados foram utilizadas tcnicas pticas confiveis, rpidas e no destrutivas, sendo estas: a espectroscopia Raman e a microscopia ptica. Os resultados mostraram mudanas espectrais, observadas na tcnica Raman, durante o processo de ozonizao o azeite de oliva no evidenciou mudanas, j o leo de girassol, a glicerina o leo de soja e a vaselina mudaram mostrando quebra das ligaes duplas correspondentes a insaturao e novos produtos derivados da oxidao lipdica. Com a microscopia ptica evidenciou-se a presena de bolhas de oznio dentro dos leos vegetais e permitiu definir a estabilidade do produto, sendo o leo de girassol o mais estvel.

Palavras chave: ozonioterapia, leos vegetais ozonizados, espectroscopia Raman, microscopia ptica.

IX

OZONIZATION AND CHARACTERIZATION OF VEGETABLE OILS FOR DERMATOLOGICAL USE

ABSTRACT

The aim of this paper is ozonate 5 vegetable oils (sunflower oil, glycerin, olive oil, soybean oil and vaseline) and characterize them spectrally and morphologically. Ozonized vegetable oils are an excellent option for storing ozone, facilitate therapeutic ozone manipulation, avoiding their rapid degradation and perform ozone therapy at the extra-hospitalary treatments. This work can assist professionals working in the field of ozone therapy, since knowledge of the characteristics of ozonized vegetable oils, the reaction of ozone with the oils and their therapeutic benefits have become an object of study. The methodology of work is characterized by analytical observation. To describe the spectral and morphometric characteristics of five ozonized vegetable oils were used optical techniques reliable, fast and non-destructive, which are: Raman spectroscopy and optical microscopy. Results showed spectral changes observed by Raman technique during the ozonation process. Olive oil showed no changes, bat sunflower oil, glycerin, soybean oil and vaseline changed showing breakdown of a corresponding unsaturated double bonds of fatty acids and new products of lipid oxidation. With optical microscopy showed the presence of ozone bubbles into vegetable oils and helped define the stability of the product, being the most stable is a ozonized sunflower oil.

Keywords: ozonetherapy, ozonized vegetables oils, Raman spectroscopy, optical microscopy.

X

OZONIZACIN Y CARACTERIZACIN DE ACEITES VEGETALES PARA USO EN DERMATOLOGIA

RESUMEN

El objetivo de este trabajo es ozonizar 5 aceites vegetales (aceite de girasol, glicerina, aceite de oliva, aceite de soya y vaselina) y caracterizarlos espectral y morfolgicamente. Los aceites vegetales ozonizados son una excelente opcin para almacenar el ozono, facilitar la manipulacin del ozono teraputico, evitar su rpida degradacin y realizar tratamientos de ozono terapia a nivel extra-hospitalario. Este trabajo contribuye para profesionales que actan en el rea de ozono terapia, pues el conocimiento de las particularidades de los aceites vegetales ozonizados, la reaccin del ozono con los aceites y sus ventajas teraputicas se han tornado objeto de estudio. La metodologa del trabajo se caracteriza por la observacin analtica. Para describir las caractersticas espectrales y morfomtricas de los cinco aceites vegetales ozonizados fueron utilizadas tcnicas pticas confiables, rpidas y no destructivas, siendo estas: la espectroscopia Raman y la microscopa ptica. Los resultados mostraron cambios espectrales observados por medio de la tcnica Raman durante el proceso de ozonizacin. El aceite de oliva no evidenci cambios; el aceite de girasol, la glicerina, el aceite de soya y la vaselina cambiaron, mostrando ruptura de enlaces dobles correspondientes a la insaturacin de cidos grasos y nuevos productos de oxidacin lipdica. Con la microscopa ptica se evidenci la presencia de burbujas de ozono dentro de los aceites vegetales y permiti definir la estabilidad del producto, siendo el aceite ms estable el aceite de girasol ozonizado.

Palabras clave: ozonoterapia, aceites vegetales ozonizados, espectroscopia Raman, microscopia ptica.

XI

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Rotas de aplicao do oznio medicinal por via parenteral 25 Figura 2. Rotas de aplicao do oznio medicinal por via tpica regional 26 Figura 3. Sistema para gerao de leos vegetais ozonizados 28 Figura 4. Equipamento gerador de oznio 34 Figura 5. Sistema para ozonizao de leos vegetais 35 Figura 6. Microfotografias dos leos vegetais ozonizados 36 Figura 7. Sistema Raman Dispersivo utilizado na coleta dos dados espectrais 38 Figura 8. Microfotografia da amostra do leo de girassol ozonizado 40 Figura 9. Passos realizados nas microfotografias para anlise digital 40 Figura 10. Microfotografia da glicerina ozonizada 41 Figura 11. Microfotografia do azeite de oliva ozonizado 41 Figura 12. Microfotografia do leo de soja ozonizado e imagem binarizada 42 Figura 13. Microfotografia da vaselina ozonizada e imagem binarizada 42 Figura 14. Histograma de distribuio bolhas para leo de girassol ozonizado 44 Figura 15. Histograma de distribuio bolhas para glicerina ozonizada 44 Figura 16. Histograma de distribuio bolhas para azeite de oliva ozonizado 45 Figura 17. Histograma de distribuio bolhas para leo de soja ozonizado 45 Figura 18. Histograma de distribuio bolhas para vaselina ozonizada 46 Figura 19. Curva de distribuio acumulada (FUI) para leos vegetais ozonizados 46 Figura 20. Espectros Raman dos leos vegetais ozonizados 49 Figura 21. Espetros do PC1 e PC2 do oleo de girassol ozonizado 51 Figura 22. Espetros do PC1 e PC2 da glicerina ozonizada 52 Figura 23. Espetros do PC1 e PC2 do azeite de oliva ozonizado 53 Figura 24. Espetros do PC1 e PC2 do oleo de soja ozonizado 54 Figura 25. Espetros do PC1 e PC2 do oleo da vaselina ozonizada 55 Figura 26. PC1 e PC2 em funo do tempo, dos leos vegetais ozonizados 57

XII

LISTA DE EQUAES

Equao 1. Catalise do oxignio em oznio por raios U.V solares 19 Equao 2. Dose de oznio com aplicao teraputica 23 Equao 3. ndice de uniformidade 31

XIII

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Efeitos txicos do oznio nos seres humanos 20 Tabela 2. Concentrao teraputica de oznio para diferentes enfermidades 24 Tabela 3. Descrio de etapas e comandos utilizados para processamento de imagens em ImageJ 37 Tabela 4. Parmetros medidos em cada amostra de leo vegetal ozonizado 43 Tabela 5. Valores de densidade e viscosidade dos leos vegetais (a 20C) 61 Tabela 6. Possveis grupos funcionais novos, derivados do oxignio no espectro de leos vegetais ozonizados 62

XIV

SUMRIO 1. INTRODUO 15

1.1. Objetivo geral 18 1.2. Objetivos especficos 18

2. REVISO BIBLIOGRFICA 19 2.1. Ozonioterapia 19 2.1.1. Gerao de oznio teraputico e concentraes adequadas 22 2.1.2. Aplicao do oznio medicinal 24 2.2. leos vegetais ozonizados 25 2.2.1. Produo de leos vegetais ozonizados 26 2.3. Microscopia ptica 29 2.4. Espectroscopia Raman 30

3. MATERIAIS E MTODOS 32 3.1. Tipologia do estudo 32 3.2. Amostras 32 3.3. Gerao de oznio 32 3.4. Ozonizao de leos vegetais 33 3.5. Microscopia ptica 34 3.5.1. Aquisio de imagens 34 3.5.2. Processamento de imagens 36 3.6. Espectroscopia Raman 37 3.6.1. Aquisio dos espectros 38 3.6.2. Tratamento dos espectros 38

4. RESULTADOS 39 4.1. Microscopia ptica 39 4.2. Espectroscopia Raman 46

5. DISCUSSO 56 6. CONCLUSO 61 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS 62

15

1. INTRODUO

A Histria revela que ao longo das ltimas dcadas, o uso do oznio vem apresentando inmeros benefcios no tratamento de diferentes doenas, tanto na medicina tradicional quanto na medicina alternativa. Por mais de 150 anos, milhes de pessoas tm sido favorecidas com os efeitos positivos do oznio que elimina focos de doenas e permite, por meio de respostas naturais, a melhora do organismo aproveitando a ao do gs. O qumico Alemo Christian Frederick Schnbein foi o primeiro a us-lo com fins industriais em 1840, ele sintetizou-o e deu-lhe o nome de oznio, depois em 1875 foi usado pelo cientista Von Marum, tambm para aplicaes industriais. Na odontologia foi usado primeiramente pelo Dr. Fisch (1915) e na medicina pelo Dr. Wolf (1914 -1918) durante a primeira guerra mundial, em combatentes, na limpeza e desinfeco de ferimentos. Posteriormente Payr apresentou, em 1935, trabalhos sobre os efeitos cicatrizantes do oznio no Congresso da Sociedade de Cirurgia de Berlim. Em 1936, Auborg incluiu a ozonioterapia por insuflao retal e, em 1950, Joachim Hasler desenvolveu um equipamento de uso eletromdico para dosificao do oznio no mbito teraputico. Em 1972, foi fundada a Sociedade Mdica Alem de Ozonioterapia (Bocci, 2005). Em 1980, a mesma declarou que at esse ano foram tratados com oznio 384.775 pacientes, com um mnimo de 5.579.238 aplicaes e taxa de efeitos colaterais de 0.0005% por aplicao, resultando em 279 pessoas afetadas pelo tratamento. Comparativamente, em 1978, nos Estados Unidos, foram internadas 1.500.000 pessoas como consequncia do uso de medicamentos prescritos, indicando que a ocorrncia de efeitos colaterais do oznio teraputico so muito menores com a aplicao correta desta tcnica (Nagib, 2006).

Em Cuba, por ausncia de medicamentos, um grupo interdisciplinar de terapeutas tem usado o oznio para o tratamento de doenas severas e confirmaram suas mltiplas propriedades farmacolgicas. Em 1988, o grupo comeou um projeto para demonstrar os mecanismos de ao do oznio no sangue e no corpo humano. Hoje totalmente claro que o oznio se dissolve rapidamente na gua, no plasma e em fluidos biolgicos, imediatamente reage com as biomolculas e gera mensageiros importantes como: ROS (espcies reativas do oxignio) e LOPs (produtos de oxidao lipdica) e desaparece, sua atuao pode

16

ser explicada com conhecimentos clssicos de bioqumica, fisiologia e farmacologia. Tem sido testado e demonstrado, em diversas enfermidades, que o oznio induz a adaptao do estresse oxidativo crnico equilibrando tanto o sistema antioxidante quanto a liberao de protenas antioxidantes. Assim, esses benefcios do oznio restauram a sade e reativam funes biolgicas (Bocci, 2005).

Como opo para facilitar a manipulao do oznio teraputico, melhorar seu armazenamento, evitar sua rpida degradao e permitir um tratamento extra-hospitalar, desenvolveu-se uma frmula de oznio derivado com leo vegetal ozonizado. um produto 100% natural, livre de aditivos, com boa estabilidade e atividade biolgica. Foi aprovado pelos ensaios de toxicidade estabelecidos internacionalmente como LD50 oral e intraperitoneal, irritao oftlmica e drmica, sensibilizao, foto toxicidade e teratogenicidade (Rodrguez et al., 1990). Apresenta tambm excelente atividade biolgica local e efeito teraputico similar ao do oznio gasoso. A utilizao de leos vegetais ozonizados representa uma alternativa cada vez mais explorada e promissora para o tratamento de mltiplas doenas, causadas por: bactrias, fungos, vrus, e problemas dermatolgicos em geral, porm tem limitada evidncia cientfica com respeito s caractersticas fsico-qumicas e estruturais, o que dificulta sua incorporao prtica clnica (Diaz et al., 2008).

Foram caracterizados cinco leos vegetais ozonizados, sendo eles: girassol, glicerina, azeite de oliva, soja e vaselina. Estes leos foram escolhidos como amostras a ser ozonizados porque so validados para consumo humano e de uso comercial. Consideraram-se suas propriedades teraputicas e dados bibliogrficos destacando suas aplicaes farmacolgicas, dermatolgicas e cosmticas.

As tcnicas de diagnstico utilizadas so rpidas, no destrutivas e podem ser empregadas para controle de qualidade, sendo a espectroscopia Raman utilizada para leos vegetais comestveis e a microscopia ptica para caracterizao de espumas de consumo humano. Permitem avaliar as mudanas apresentadas nos leos, depois do processo de ozonizao, e permitem analisar a estabilidade dos produtos partindo da capacidade dos mesmos de servir como reservatrio do gs.

A Espectroscopia Raman uma tcnica ptica que fornece em poucos segundos informao qualitativa e quantitativa das frequncias vibracionais dos grupos funcionais de qualquer material ou composto orgnico. Diferentes estudos tm validado esta tcnica para determinar o grau de insaturao de cidos graxos em leos vegetais (Baeten et al., 1998; Sadeghi-Jorabchi et al., 1990). Isso

17

relevante para detectar alteraes espectrais nos leos vegetais ozonizados. Ainda, a tcnica Raman permite visualizar e analisar, claramente, o que acontece molecularmente, nos leos vegetais, quando ozonizados, tanto no referente a reao entre os produtos e mudanas apresentadas, em relao ao tempo de ozonizao, presena de aditivos, dose de oznio aplicada, e outros aspectos que ressaltam a versatilidade da tcnica e a repetibilidade do processo quando necessria.

A Espectroscopia Raman tem se tornado til para o controle de qualidade de leos comestveis permitindo determinar a pureza dos mesmos e quantificar o contedo de gorduras, e saturao, aspecto que favorece a aplicao da tcnica para ser utilizado tambm no controle de qualidade de leos vegetais ozonizados.

O estudo por microscopia ptica permite verificar a presena de bolhas de oznio dentro dos leos vegetais e possibilita realizar a anlise morfomtrica das mesmas, sua relao com a estrutura do produto e sua qualidade (Castillo Castaeda et al., 2006).

18

1.1. Objetivo geral

Ozonizar e caracterizar cinco leos vegetais, dirigidos aplicao dermatolgica, utilizando espectroscopia Raman e microscopia ptica.

1.2. Objetivos especficos

1.2.1. Ozonizar leos vegetais utilizando o mtodo de insero de bolhas; 1.2.2. Caracterizar morfometricamente bolhas de oznio inseridas em diferentes leos vegetais usando microscopia ptica; 1.2.3. Analisar as caractersticas espectrais de leos vegetais ozonizados utilizando espectroscopia Raman.

19

2. REVISO BIBLIOGRFICA

2.1. Ozonioterapia

O oznio uma molcula com trs tomos de oxignio, podendo ser definido como oxignio em seu estado mais ativo (Kunz et al., 1999). considerado uma molcula natural, instvel, mas em equilbrio dinmico. O oznio geralmente encontrado na estratosfera a uma altura de 22 km, em condies ideais incolor e de odor pungente, considerado um agente oxidante forte, depois do flor e do persulfato, permitindo-lhe reagir com uma grande classe de compostos. Em altas concentraes, sua cor azul, sua densidade 1,66 g/cm3, seus pontos de fuso e ebulio so 193 e 112C respectivamente, pouco solvel em gua (1,09 g/L a 0C). Decompe-se espontaneamente, seu tempo de vida depende da temperatura, por exemplo: a 30oC se desintegra em 25 minutos, a 20C se desintegra em 40 minutos, e a -50C pode levar at trs meses para se decompor. A concentrao mxima na estratosfera de 10 p.p.m (partes por milho), equivalente a 0,02 g/mol (Bocci, 2005).

Os raios U.V solares so catalisadores na produo do oznio:

[Eq. 1]

Equao 1: Catlise do oxignio em oznio por raios U.V solares. Fonte: Bocci, 2005

A presena do oznio na atmosfera muito importante, pois absorve os raios U.V emitidos pelo sol e protege os sistemas biolgicos. No entanto, o excesso de solventes, tais como NO (xido nitroso), derivados do cloro (CFCS), monxido de carbono (CO) e metano (CHA) dissociam o oznio existente e evita a formao de novas molculas de O3. O oznio puro ou associado a outros componentes, txico para pulmes, olhos, nariz, pele, em particular para a mucosa respiratria (Nagib, 2006). A Tabela 1 mostra os efeitos txicos do oznio em organismos vivos quando inalado.

20

Tabela 1: Efeitos txicos do oznio nos seres humanos. Fonte: Bocci, 2005

Concentrao de oznio no ar (p.p.m) Efeitos txicos

0,1 Lacrimao e irritao do sistema pulmonar

1,0 - 2,0 Rinite, dor de cabea, nusea e refluxo, agrava predisposio a asma.

2,0 - 5,0 (10 - 20 minutos) Diarria que se incrementa progressivamente, espasmo bronquial.

5,0 (60 minutos) Edema pulmonar e ocasionalmente paralisia respiratria. 10,0 (4 horas) Morte 50,0 Morte instantnea

O oznio pode ser protetor ou ofensivo para seres humanos dependendo da concentrao e via de contato, por isso sua utilizao em medicina controversa, embora existam muitos estudos que demonstrem a eficcia teraputica. muito importante no us-lo em presena de NO2 (dixido ntrico), CO2 (dixido de carbono) e CO (monxido de carbono). As anlises tm ajudado a definir os mecanismos de ao do O3, quais as doses que representam perigo a sade e quais as no-prejudiciais. Segundo a OMS (Organizao Mundial da Sade) o limite permitido para o trabalho com oznio de 8 h com uma concentrao de 0,06 p.p.m (0,12 g/L) (Bocci, 2005).

De acordo com a patologia apresentada pelo paciente, a ozonioterapia pode ser aplicada por via vaginal, retal (por insuflao), local, hemtica, endovenosa, infiltraes, mesoterapia e atravs de pontos de acupuntura (sistmica), em gua ou leo. As mudanas qumicas que surgem dependem dos altos e baixos nas relaes do oxignio no metabolismo e no ciclo de Krebs, na formao de altas quantidades de prtons necessrios para restaurar as capacidades tampo de oxidantes que defendem o sistema dos radicais livres e dos pr-oxidantes. O oznio capaz de manter o equilbrio dinmico do metabolismo das membranas celulares e o poder desinfetante do mesmo se d pela sua capacidade e habilidade de destruir,

21

neutralizar e suprimir o crescimento de micro-organismos patognicos. Uma concentrao de 0,35 mg/L de oznio, reduz pelo menos, 5 escalas logartmicas na populao de aproximadamente 1x106 bactrias de Eschirichia coli, Nibrio cholerhae, Salmonella typhy, Yersenia enterocoltica, Pseudomona aeruginosa, Aeromona hidrophilae, Disteria monoyitegenes e Staphylococus aureus, quando se compara concentrao de 0,5 mg/mL de cloro se observa a ao similar dos componentes, mas com concentrao de oznio menor que 1 milsimo (Nagib, 2006).

Ao tratamento com oznioterapia so atribudos efeitos como:

Inibio e destruio de micro-organismos patognicos em qualquer parte do corpo graas ao poder que o O3 tem de penetrar e difundir-se nos tecidos; Aumento da elasticidade ao nvel hemtico, permitindo maior penetrao do oxignio na micro circulao; Produo de 2,3 difosfoglicerato que atua como intermedirio da gliclise: processo no qual os acares se decompem para converterem-se em energia e gua, elementos necessrios para manter os tecidos oxigenados; Aumento da formao de peroxidase com papel primordial no metabolismo celular atravs do sistema redox, devido ao oznio que se une s cadeias duplas dos cidos graxos insaturados da poro fosfolipdica da membrana celular dos glbulos vermelhos; Afinidade com o grupo sufidrilo (-SH) caractersticos nos aminocidos essenciais, cistena e metonina, que permite interferir no metabolismo das protenas, proporcionando um papel imuno-modelador e imuno-restaurador (Valacchi & Bocci, 2000).

A ozonioterapia aceita como uma tcnica que consiste na aplicao de doses em baixas quantidades do gs, aplicadas no corpo por diversas vias e que produz no organismo mudanas qumicas que dependem da concentrao, e seu papel se torna essencial devido ativao das reaes dependentes do oxignio (Esterbauer, 1991). Nos ltimos 40 anos, houve o incremento da prtica da ozonioterapia que mostrou excelentes resultados dependendo das tcnicas, dos mtodos de uso e dos equipamentos utilizados. Diferentes sociedades mdicas tem implementado o uso da ozonioterapia, sendo essa terapia avanada nos seguintes pases: Alemanha, Cuba, Itlia, Espanha, Japo, Rssia, Estados Unidos, Argentina,

22

Chile e Mxico. Da mesma maneira, em todos estes pases, existe a preocupao de como manipulado o oznio e os efeitos que ele produz (Daz et al., 2008).

2.1.1. Gerao de oznio teraputico e concentraes adequadas

Os geradores de oznio devem ser seguros, no txicos, reproduzveis e construdos com materiais resistentes ao gs, como: ao inoxidvel 31GL, titnio puro grau dois, vidro, teflon ou poliuretano. comum que os geradores de oznio medicinal tenham como princpio dois tubos metlicos, circuncntricos e separados por um material isolante. A estes dois tubos metlicos aplicada uma diferena de potencial entre 4 e 13 kV (efeito corona) e por eles passam uma determinada concentrao de oxignio. Essa tcnica produz como resultado, um gs contendo 5% oznio e 95% de O2. O rendimento de gerao de oznio varia entre 1 a 4% para sistemas de alimentao com ar e de 6 a 14% para sistemas alimentados com oxignio (Kunz et al., 1999). A concentrao de oznio durante a produo, dependente dos seguintes fatores: Tenso: maior tenso de polarizao implica no aumento da concentrao do oznio; Espao entre eletrodos: a gerao de oznio aumenta com a diminuio da espessura da camada dieltrica, respeitando-se o limite de isolao; Fluxo de oxignio: a concentrao de oznio diretamente proporcional ao fluxo de oxignio por unidade de tempo, sendo expresso em volume (L/min) e normalmente regulado por 1/10 L/min.

O critrio de clculo das doses de oznio funo de:

Concentrao de oznio expresso por g/mL; Presso baromtrica (mmHg), diferente da normal, por razes de segurana usa-se presso hiperbrica, Volume total da mistura de gs composta por oxignio e oznio.

23

A dose de oznio equivalente ao volume de gs (VG) expresso em mL, multiplicado pela concentrao de oznio (CO) expresso em g/mL, sendo definido conforme a equao 2 (Bocci, 2005):

Dose de O3 = VG [mL] x CO [g/mL] [Eq. 2]

Equao 2: Dose de oznio com aplicao teraputica. Fonte: Bocci, 2005

A dose de oznio para uso medicinal est entre 1-100 g/mL, segundo a sociedade mdica europia. Os geradores de oznio medicinal devem produzir concentraes equivalentes a 2, 5, 10, 20, e 30 g/mL. Para medir a concentrao de oznio em tempo real so aplicadas tcnicas fotomtricas, isto possvel porque o oznio tem importante absoro na regio espectral prxima a 253 nm e 600 nm. Outro mtodo aceito para medio de concentraes de oznio (especialmente para leos ozonizados) considerado padro pela IOA (International Ozone Association) na Europa o iodomtrico descrito por Masschelern et al. (1996). de grande importncia em todos os mtodos de anlise, aplicar o gs de maneira imediata para que no ocorram mudanas ( 1%) na concentrao do mesmo (KUNZ et al., 1999). Na Tabela 2 se mostra um guia de concentraes teraputicas de oznio para diferentes enfermidades.

Tabela 2: Concentrao teraputica de oznio para diferentes enfermidades. Fonte: Bocci, 2005

Enfermidade Concentrao de O3 (g/mL)

Inicio Final

Infecciosa 20-25 70

Vascular 20 40

Degenerativa 20 30-40

Respiratria 10 30-40

Auto-imune 50 80

Tumores metastticos 25 70-90

24

2.1.2. Aplicao do oznio medicinal

Existem vrias vias de aplicao do oznio teraputico, dentre elas as parenterais e tpicas que so mostradas nas figuras 1 e 2. Atualmente, a ozonioterapia utilizada em diferentes modalidades, o mtodo mais utilizado a auto-hemoterapia, porm desenvolveram-se outras opes especialmente as de exposio corporal ao oznio e aplicaes tpicas, em que se destaca o uso de leos ozonizados (Werkmeister, 1995).

Bocci (2002) realizou estudos dos efeitos biolgicos induzidos pelo oznio no corpo humano e afirma que o sangue o melhor veculo para transmitir os mensageiros gerados pelo O3, em segundo lugar vem a pele, o tecido subcutneo, msculos e, por fim o lmen.

Administrao por via parenteral

Subcutneo

Intravenoso

Intra-arterial

Intramuscular

Intraperitoneal

Intralesional

Intra-articular

Miofasial

Intradiscal

Periarticular

Figura 1: Rotas de aplicao do oznio medicinal por via parenteral. Fonte: adaptado de Werkmeister, 1995

25

A ozonioterapia uma tcnica amplamente utilizada em diferentes enfermidades e se combinada com as terapias convencionais, os resultados so potencializados. Entre suas principais aplicaes destacam-se o tratamento de enfermidades isqumicas, vasculares, (causadas por arterioscleroses, diabetes, uremia, etc.), cura de feridas crnicas (p diabtico, chagas, fistulas, leses da pele e boca) e infeces vaginais e retais.

Administrao por via tpica

Nasal 30-60s, 20g/ml

Oral 30-60s, 20grml

Auricular

Uretero-vesilcal 3-5-15 g/ml

Vaginal 50-100g/ml

Intravesical

Retal

Cutnea

Dental

Figura 2: Rotas de aplicao do oznio medicinal por via tpica ou regional. Fonte: adaptado de Werkmeister, 1995

2.2. leos vegetais ozonizados

O leo vegetal ozonizado o produto da reao entre o oznio e o leo vegetal em condies apropriadas, sendo considerado um medicamento 100% natural que se apresenta em diferentes formas: lquido oleoso, emulses, cremes, pomadas, supositrios, cpsulas lquidas, entre outros; tem atividades biolgicas locais e

26

efeitos teraputicos similares ao do oznio gasoso ministrado (SAKASAKI et al., 2006).

O leo ozonizado foi criado por mdicos alemes no ano de 1905 com a finalidade de obter formulaes de oznio derivados, que possuem boa estabilidade (Diaz et al., 2008), para: facilitar a manipulao do oznio gasoso, melhorar seu armazenamento, evitar sua rpida degradao, permitir um tratamento extra-hospitalar e diminuir o risco de us-lo na forma gasosa, em doses altas e inadequadas. O cientista Nicola Tesla aperfeioou a tcnica borbulhando o oznio de forma contnua durante trs semanas atravs do leo, criando um gel natural com oznio em suspenso. Este produto foi chamado ozo-oil.

Em 1954, o Dr. William Torska da universidade de A&M no Texas descobriu que o processo de ozonizao de leos vegetais gera uma vasta cadeia de espcies reativas do oxignio (ROS) C10H1803 (MORALEDA, 2008). Desde o final de 1986 no laboratrio de oznio do Centro Nacional Cubano de Investigaes Cientficas (CNIC) tm sido realizados diferentes estudos sobre as possibilidades teraputicas oferecidas pelos leos ozonizados em diversas enfermidades, dando prioridade sua ao anti-virica, anti-bacteriana e anti-mictica. Atualmente, existe no mercado Cubano um produto chamado OLEOZN, registrado pela Doutora Renate Viebann. O produto leo de girassol ozonizado destinado ao tratamento da tnia perdis, lceras, bactrias e fungos, entre outros (SECHI et al., 2001). Tambm existe outro medicamento denominado Bioperoxoil composto por leos ozonizados com adio de cido -lipoico, foi criado na Universidade de Alfenas, na Espanha. No Hospital Universitrio de Siena foi produzida uma preparao de leo de oliva ozonizado, colocando oznio no leo em banho-maria pelo menos por 30 minutos ou at dois dias quando se solidifica e este usado para tratamentos intra-hospitalares e no comercial. Apesar do leo ozonizado estar disponvel em vrios pases, no h uma norma de preparao regularizada (Zanardi et al., 2008).

2.2.1 Produo de leos vegetais ozonizados

Os leos vegetais ozonizados so gerados por meio do mtodo de injeo direta de bolhas a qual consiste em inserir os leos vegetais puros num recipiente com difusor de gs por onde injetado o oznio de uma maneira contnua a um fluxo constante. A Figura 3 mostra o diagrama desta operao.

27

O rendimento dos compostos oxigenados dos leos ozonizados depende das condies de reao como: meio, presena de aditivos, temperatura, tipo de reator, dose de oznio aplicada e tempo de ozonizao (Travagli et al., 2010).

Gerador de oznio

Recipiente com leo vegetal

Vlvula de alvio de presso

Difusor de gs

Fluxo constante de oznio

Figura 3: Sistema para gerao de leos vegetais ozonizados.

O mtodo de produo de leos ozonizados pode ser diretamente relacionado ao mtodo padronizado para gerao de espumas por meio da difuso de gs. Este mtodo detalhadamente descrito por Kingsley et al. (2001) e Leduc (2007), os quais explicam o processo de oxidao em fase lquida quando um gs base de oxignio injetado no interior do recipiente de um reator de coluna de bolhas que contm um lquido orgnico oxidvel. Este um sistema de alta energia que produz bolhas uniformes de dimetro pequeno, fortemente impulsionado na forma de jato tendo como resultado uma espuma (Gardiner et al., 1999). Esta tcnica tambm conhecida como CAF (Compressed Air Foam) e tem sido usada durante vrias dcadas em poos de petrleo, na indstria de alimentao, cosmtica e farmacutica, entre outras (Magrabi et al., 2002). A estabilidade do produto resultante est fortemente influenciada pelo tamanho das bolhas, assim como a frao de gs lquido (Bawel et al., 1993; Gardiner & Dlugogorski, 1998; Castillo Castaeda et al., 2006), tambm existem vantagens frente a circularidade das bolhas que o fator determinante da persistncia das mesmas. medida que as bolhas so menores e circulares, sua distribuio mais uniforme e alta. Em relao inicial de gs-volume, o leo ser de excelente qualidade, ter uma tima estabilidade e seu tempo de decomposio ser maior. O comportamento ideal dos

28

leos vegetais ozonizados como espuma se d quando as bolhas de oznio so mais uniformes, com uma circularidade prxima a 1. Diferentes estudos tm demonstrado que a variao de parmetros como presso de injeo do gs e o fluxo do mesmo no so determinantes na qualidade do produto e sim o tempo de borbulhamento, o tamanho dos poros do difusor de bolhas, a dose de oznio aplicada e o tamanho das bolhas (Castillo Castaeda et al., 2006, Magrabi & Dlugogorski, 1999).

A reao do oznio com leos vegetais e lipdios ocorre, exclusivamente, nas ligaes duplas de carbono-carbono presentes na insaturao dos cidos graxos (Martnez et al., 2005). So formadas diferentes espcies oxigenadas como: perxidos, ROS (espcies reativas do oxignio), aldedos, cidos carboxlicos entre outros elementos que so responsveis pela atividade microbiolgica presentes nos leos vegetais ozonizados. Alm de desempenhar no organismo funes que incluem estimulao de vrios sistemas enzimticos de xido-reduo a qual influi, possivelmente, sobre o transporte do oxignio aos tecidos e cadeia respiratria mitocondrial, bloqueio de receptores virais e morte das clulas infectadas por vrus assim como um efeito sinrgico que refora a capacidade fagocitria (Daz Gomez & Gavn Sazatornil, 2005; Diaz et al., 2005b; Diaz et al., 2006).

Segundo o mecanismo de Criegge que descreve o processo de ozonizao de compostos insaturados, durante a reao se formam diferentes produtos oxigenados que ampliam o ndice de perxidos e contribuem com o aumento do contedo de oxignio nas amostras ozonizadas (Bailey, 1978; Rodrguez et al., 1990; Bocci et al., 2005; Daz Gomez & Gavn Sazatornil, 2005; Daz et al., 2005b; Daz et al., 2006; Lee & Chan, 2007; Zanardi et al., 2008) o qual incrementa seu poder benfico a nvel teraputico. Este mtodo foi exposto pela primeira vez por R. Criegge em 1975, (Bailey, 1978) e, cuidadosamente, detalhado por Lee & Chan (2007).

Muitos estudos foram feitos para desenvolver novas tcnicas analticas do leo ozonizado que implicam a mnima manipulao da amostra e que permitem identificar leos vegetais e lipdios, porm so escassos na literatura dados sobre os espectros de cidos graxos ozonizados e anlises morfomtricas das bolhas no leo ozonizado.

Nas pesquisas realizadas para caracterizao de leos vegetais ozonizados destacam-se tcnicas de diagnstico como: determinao do ndice de perxidos,

29

anlise elementar e cromatografia gasosa (especialmente para parmetros de qualidade) (Zanardi et al., 2008; Daz et al., 2006); Tambm tem se utilizado mtodos espectroscpicos, cromatogrficos (Sadowska et al., 2008), 1H NMR (Daz Gomez & Gavn Sazatornil, 2005), e NMR (Daz & Gavn, 2007), entre outros. Estas pesquisas coincidem que a reao dos leos vegetais com o oznio e seus produtos so identificados de acordo com o mecanismo de Criegge.

2.3. Microscopia ptica

A microscopia ptica uma ferramenta de grande ajuda que reduz as limitaes da viso humana, com esta tcnica pode-se observar o tamanho, morfologia, quantidade, distribuio das bolhas de oznio dentro do leo vegetal; estes aspectos permitem definir seu padro micro-estrutural. Geralmente apia-se de programas especficos para anlise digital das imagens captadas (microfotografias) (Campbell & Mougeot, 1993).

O trabalho de Castillo Castaeda et al. (2006) prope uma metodologia baseada na microscopia ptica e o processamento digital de imagens para a extrao automatizada de caractersticas importantes em um lquido impregnado de bolhas, como o leo vegetal ozonizado. A simples observao das imagens permite obter uma descrio qualitativa dos parmetros do leo vegetal ozonizado, porm para que estes parmetros sejam vlidos necessrio obter informao quantitativa confivel e seguir um conjunto de etapas sequenciais: aquisio, processamento, anlise das imagens e interpretao dos resultados. Normalmente, todo o processo de aquisio de imagens se encontra exposto a condies prprias do experimento que podem reduzir, severamente, a capacidade de extrair caractersticas geomtricas de forma precisa. Os possveis problemas apresentados so: sistemas de iluminao deficiente, regies da imagem fora de foco, escassa uniformidade na cor das partculas, baixa resoluo do dispositivo de digitalizao; estes problemas so solucionados com aplicao de algoritmos de deteco, contagem e medio de partculas (neste caso, bolhas de oznio dentro do leo vegetal). Estes algoritmos so suficientemente robustos para serem aplicados de forma automtica a um nmero considervel de imagens.

Os parmetros utilizados para avaliao de espumas por meio de microscopia ptica e digitalizao de imagens so:

30

Uniformidade: depende da quantidade de bolhas, do tamanho das mesmas e da relao destes parmetros. Uma espuma ser considerada uniforme quando suas bolhas apresentarem o mesmo tamanho. O ndice de uniformidade (FUI) pode ser calculado por meio da equao mostrada na equao 3, descrita por Bayvel & Orzechowski (1993).

=

=m

iin

DDFUI

1

1,09,0 )()( [Eq. 3]

Equao 3: ndice de uniformidade numa espuma. Fonte: Bayvel & Orzechowxki (1993)

Onde (D0,9) e (D0,1) so valores correspondentes 90% e 10% da distribuio acumulada (D) e ni a somatria do nmero de bolhas dos m intervalos compreendidos entre (D0,9) e (D0,1). O FUI varia sempre entre 0 e 1 sem atingir os extremos, os valores prximos de zero correspondem baixa uniformidade e os prximos do um correspondem uniformidade elevada. Persistncia: Entende-se como sendo a capacidade do leo vegetal em reter as bolhas de oznio e est ligada mdia da circularidade das bolhas, quando as bolhas so mais circulares (valor mdio prximo a 1) menor a probabilidade de ruptura das mesmas (Bayvel & Orzechowski, 1993).

2.4. Espectroscopia Raman

O efeito Raman uma disperso inelstica da luz, em que se observa uma mudana de frequncia em um fton incidente, quando este interage com o material. Foi definido, em 1928, por Chandrasekhara Vekata Raman, o qual chamou inicialmente de fluorescncia fraca e mais tarde de nova radiao (Clark & Hester, 1985).

O resultado prtico de uma medida espectroscpica um espectro que consiste de intensidades versus energia do fton, expressa em nanmetros (nm), Hertz (Hz), eltron volt (eV) ou centmetros recprocos (cm-1). Os espectros so um conjunto de picos derivados de aspectos fundamentais, relacionados aos modos vibracionais normais de uma molcula, estes picos aparecem combinados ou

31

sobrepostos formando bandas de um espectro. Cada pico ou banda caracterizado pela: posio mxima do pico (max), intensidade do pico mxima e integrada (Imax e lint, respectivamente) e largura a meia altura (FWHM), na qual max d informaes sobre o tipo de vibrao, Imax fornece informao do nmero de grupos moleculares vibrando com determinada freqncia e FWHM depende das condies do instrumental utilizado (largura da fenda do espectrmetro, rede de difrao, qualidade espectral do feixe de excitao, etc.) e das condies intrnsecas da molcula (nmero e natureza das interaes fsicas com a molcula vizinha) (Hollas, 2004).

As primeiras aplicaes biomdicas da espectroscopia Raman datam do final dos anos 80 e incio dos anos 90, a tcnica se tornou uma ferramenta potencialmente importante na anlise bioqumica de tecidos biolgicos. Atualmente, permite o estudo de doenas humanas in vitro por meio da deteco de componentes bioqumicos em diferentes produtos, promovendo diagnsticos em tempos muito curtos e no invasivos (Dou et al., 1997).

A espectroscopia Raman tem sido vastamente utilizada para caracterizao e anlises de leos vegetais, especialmente na rea de controle de qualidade, na qual se tem estabelecido bandas espectrais dos mesmos e identificado claramente seus componentes e o efeito que produz diferentes processos (especialmente frituras) sobre estes leos.

Lee et al. (2007) foi uns dos primeiros a utilizar espectroscopia Raman para o estudo de leos ozonizados e sustenta que esta tcnica totalmente eficaz e confivel para analisar as reaes causadas pelo oznio a diferentes substncias (particularmente a leos vegetais), seja a curto, mdio ou longo prazo. Em seu estudo tambm demonstrou a formao de produtos por oxidao lipdica sendo predominantes os grupos: perxidos, oznidos (O-O), carbonlicos (C=O) e hidroxlicos (O-H).

Os diagnsticos de processos biolgicos e qumicos (entre outros) por meio da espectroscopia Raman diminuem o tempo de anlises, facilita a manipulao da amostra e tem mostrado excelentes resultados, por essa razo se tem implementado o uso desta tcnica em laboratrios, tendo como consequncia direta avanos na tcnica e no instrumental (Dou et al., 1997).

32

3. MATERIAIS E MTODOS

3.1. Tipologia do estudo

O presente estudo observacional analtico, planificado para caracterizar cinco leos vegetais submetidos ozonizao. Essa caracterizao realizou-se por tcnicas pticas, rpidas e no destrutivas.

3.2. Amostras

Foram utilizados cinco leos vegetais comerciais, validados para consumo humano, de marcas conhecidas no Brasil e uso comercial, sendo eles: leo de girassol, glicerina, azeite de oliva, leo de soja, e vaselina, todos com apresentao lquida. Para a escolha das amostras, consideraram-se estudos de ozonizao realizados anteriormente e os registros sobre sua aplicao nos aspectos farmacolgico, dermatolgico e cosmtico (Rodrguez et al., 1990; de la Cruz, 1997; Carelli, 1998; Devlin, 2004; Zanardi et al., 2008).

3.3. Gerao de oznio

O mtodo usado para gerao de oznio, conhecido como efeito corona, foi descrito por Kunz A, et al (1999). O oznio se produz pela passagem de ar com fluxo constante atravs de uma cmara hermeticamente selada que contm dois eletrodos submetidos a uma elevada diferena de potencial que causa a dissociao do oxignio presente, sendo a formao de oznio consequncia da recombinao de espcies radicais de oxignio com as molculas existentes no sistema.

O equipamento gerador de oznio de marca DISUFIL (Colmbia), modelo Ozonofil JE9000 (Figura 4). Este equipamento constitudo por um compressor que proporciona um fluxo constante de 270 L/h e um reator que utiliza uma tenso de entrada de 5 kV. Dentro da cmara geradora de oznio, encontram-se duas malhas metlicas de formato tubular concntricas, separadas por um material dieltrico e neste caso composto por um tubo de vidro. s malhas metlicas se aplicam a tenso de 5 kV, enquanto o ar do compressor circula pelo interior da cmara. O

33

produto final oznio com uma concentrao de 2,7 g/L (1,35 p.p.m) quando alimentado com oxignio e 0,10 g/L (0,05 p.p.m) quando alimentado com ar (presente caso).

Figura 4: Equipamento gerador de oznio utilizado (marca DISUFIL, modelo Ozonofil JE9000).

3.4. Ozonizao de leos vegetais

Para a ozonizao de leos vegetais utiliza-se um reator de coluna de bolhas, composto por um cilindro de ao inoxidvel (Figura 5) com capacidade de 150 mL de fludo. Ele contm um compartimento que aloja uma cpsula porosa de slica (poros entre 50 m e 100 m), uma entrada de oznio posicionada na parte inferior e a sada do gs na parte superior.

Figura 5: Sistema para ozonizao de leos vegetais.

34

Para o procedimento de ozonizao de leos vegetais, utilizou-se 100 mL de cada amostra (leo de girassol, glicerina, azeite de oliva, leo de soja, e vaselina; respectivamente) mantidos no reator de bolhas durante um perodo contnuo de 11 h (cada amostra de leo, respectivamente) a uma temperatura ambiente de 22C.

3.5. Microscopia ptica

3.5.1. Aquisio de imagens

Foram obtidas microfotografias com um microscpio LEICA DIASTAR QG2-32, com os objetivas de 4X/0,10, 10x/0,22, L20X/0,30 e L40X/0,50, armazenadas em um PC mediante o software QWin (verso V2.5) com formato TIF e com resoluo de 764x574 pixels. Foi adquirido um total de 60 imagens (12 imagens para cada leo ozonizado dividido em grupos de trs para cada objetiva), dentre as quais foram selecionadas as que apresentavam maior nitidez, sendo estas, processadas digitalmente. Analisaram-se 20 fotos no total, quatro para cada leo ozonizado (um por objetiva). A figura 6 (a-t) mostra as microfotografias selecionadas para a anlise.

35

a) leo de girassol ozonizado, objetiva 4X/0,10

b) leo de girassol ozonizado, objetiva

10X/0.22

c) leo de girassol ozonizado, objetiva

20X/0.30

d) leo de girassol ozonizado, objetiva

L40X/0.50do

e) leo de oliva ozonizado, objetiva 4X/0,10

f) leo de oliva ozonizado, objetiva 10X/0.22

g) leo de oliva ozonizado, objetiva 20X/0.30

h) leo de oliva ozonizado, objetiva L40X/0.50do

i) leo de soja ozonizado, objetiva 4X/0,10

j) leo de soja ozonizado, objetiva 10X/0.22

k) leo de soja ozonizado, objetiva 20X/0.30

l) leo de soja ozonizado, objetiva L40X/0.50do

m) Glicerina ozonizada, objetiva 4X/0,10

n) Glicerina ozonizada, objetiva 10X/0.22

o) Glicerina ozonizada, objetiva 20X/0.30

p) Glicerina ozonizada, objetiva L40X/0.50do

q) Vaselina ozonizada, objetiva 4X/0,10

r) Vaselina ozonizada, objetiva 10X/0.22

s) Vaselina ozonizada, objetiva 20X/0.30

t) Vaselina ozonizada, objetiva L40X/0.50do

Figura 6: Microfotografias dos leos vegetais ozonizados.

36

3.5.2. Processamento de imagens

O processamento de imagens foi realizado com o software ImageJ (Wayne Rasband, National Institute of Health, USA), conforme procedimento descrito na tabela 3.

Tabela 3: Descrio de etapas e comandos utilizados para processamento de imagens em ImageJ.

Procedimento Opo de menu Comando

Abrir imagem File Open

Retirar borda da imagem Seleo retangular Seleo de imagem

Edit Clearoutside

Converter intensidade da cor em cada pixel Image

Type 8 bit

Calibrar programa com microscpio para realizar medies

Open Seleo de imagem

Seleo de linha Medir imagem

Analyse Set scale (ajustar valores, global e ok)

Ajuste para maior visualizao de bolhas

Edit Invert

Image Adjust Brigthness/contrast

Image Adjust Threshold

Medies

Analyse Set measurements (seleccioar medidas a realizar)

Analyse Analyse particles

Results Summarize

37

3.6. Espectroscopia Raman

Foi utilizado um espectrmetro Raman dispersivo (modelo P1-, Lambda Solutions, Inc., MA, USA) que utiliza um laser de diodo multimodo estabilizado, sintonizado em 830 nm e 350 mW de potncia de sada (Figura 7). Este sistema possui um cabo de fibras pticas Raman probe para excitao e coleta do sinal Raman da amostra. Este cabo foi posicionado a 5 mm da parede lateral do porta-amostras, que continha o leo em processo de ozonizao, de maneira que as alteraes espectrais pudessem ser acessadas via fibra ptica, com repetibilidade da geometria de excitao e coleta do sinal.

O espectrmetro do sistema Raman possui resoluo de aproximadamente 2 cm-1, com faixa espectral til entre 800 a 1800 cm-1. A deteco do sinal luminoso espalhado pela amostra efetuada por uma cmera CCD back thinned, deep-depletion 1340X100 pixels refrigerada por elemento termoeltrico (Peltier) ventilado, atingindo uma temperatura de trabalho de -75C.

O espectrmetro foi calibrado utilizando as posies das bandas principais do naftaleno, que possui bandas intensas e caractersticas na regio espectral de interesse (fingerprint). A calibrao espectral de intensidade foi realizada pelo fornecedor do equipamento e consiste na coleta do espectro de uma lmpada de filamento de tungstnio com espectro rastreado pelo NIST (National Institute of Standards and Technology).

Figura 7: Sistema Raman Dispersivo utilizado na coleta dos dados espectrais.

38

3.6.1. Aquisio dos espectros

A aquisio dos espectros foi realizada com o software RamanSoft, que coletou o espectro Raman a cada 15 min (o espectro possui tempo de leitura de 20s), por um perodo de 5 horas durante o processo de ozonizao. A primeira aquisio para cada amostra foi no tempo zero do processo de ozonizao, fornecendo espectro original de cada leo. As aquisies seguintes tiveram como objetivo, verificar os efeitos do oznio no espectro dos leos identificando elementos de oxidao lipdica, observado atravs das alteraes nas bandas espectrais das ligaes duplas e ao aparecimento de novas espcies oxigenadas. De maneira a refinar-se os dados, os espectros Raman tambm foram submetidos Anlise de Componentes Principais.

3.6.2. Tratamento dos espectros

Os espectros obtidos passaram por diversas etapas de pr-processamento, que incluem calibrao em frequncia (eixo deslocamento Raman), subtrao do espectro de fluorescncia de fundo das amostras (sinal de baixa frequncia) e filtragem do rudo de alta frequncia. Essas operaes facilitam a interpretao dos dados e contribuem para simplificar a anlise estatstica. A filtragem realizou-se por um filtro digital e implementado com a utilizao do software Matlab (The Mathworks, MA, USA, verso 4.2) conforme descrito por Cunha et al. (2003).

39

4. RESULTADOS

4.1. Microscopia ptica

Na Figura 8 observa-se a microfotografia do leo de girassol ozonizado, da primeira amostra analisada, na Figura 9 se mostram os passos da digitalizao das microfotografias, tendo como exemplo o leo de girassol.

Figura 8: Microfotografia da amostra do leo de girassol ozonizado.

leo de girassol ozonizado - 8 bits leo de girassol ozonizado aps tratamento digital leo de girassol ozonizado

Imagem binarizada

Figura 9: Passos realizados nas microfotografias para anlise digital.

Nas Figuras 10 a 13 mostram-se as microfotografias da glicerina ozonizada, do azeite de oliva ozonizado, do leo de soja ozonizado e da vaselina ozonizada, respectivamente, com imagem binarizada das mesmas.

40

a) Glicerina ozonizada b) Glicerina ozonizada - Imagem binarizada

Figura 10: Microfotografia da glicerina ozonizada e imagem binarizada.

a) Azeite de oliva ozonizado b) Azeite de oliva ozonizado - Imagem binarizada

Figura 11: Microfotografia do azeite de oliva ozonizado e imagem binarizada.

41

a) leo de soja ozonizado b) leo soja ozonizado - Imagem binarizada

Figura 12: Microfotografia do leo de soja ozonizado e imagem binarizada.

a) Vaselina ozonizada b) Vaselina ozonizada - Imagem binarizada

Figura 13: Microfotografia da vaselina ozonizada e imagem binarizada.

Na Tabela 4 so mostrados os valores mdios encontrados para cada uma das amostras analisadas.

42

Tabela 4: Parmetros medidos em cada amostra de leo vegetal ozonizado.

leo ozonizado Nmero de bolhas Mdia da rea

das bolhas (m) Mdia de

circularidade das bolhas

Desvio Padro

Girassol 1167 1,16 0,95 0.11

Glicerina 639 7,68 0,87 0.17

Oliva 1098 1,42 0,97 0.08

Soja 77 0,58 0,87 0.20

Vaselina 543 0,01 0,69 0.19

Nas Figuras 14 a 18, so mostrados os histogramas de distribuio das bolhas de oznio para cada leo vegetal.

Figura 14: Distribuio de bolhas para leo de girassol ozonizado.

43

Figura 15: Distribuio de bolhas para glicerina ozonizada.

Figura 16: Distribuio de bolhas para azeite de oliva ozonizado.

44

Figura 17: Distribuio de bolhas para leo de soja ozonizado.

Figura 18: Distribuio de bolhas para a vaselina ozonizada.

45

Outra forma de visualizar as informaes contidas nos histogramas atravs da distribuio acumulada, conforme pode ser observado na Figura 19.

Figura 19: Curva de distribuio acumulada (FUI) para leos vegetais ozonizados.

A regio da curva cuja derivada mxima, explicita uma alta concentrao de bolhas de oznio com grande uniformidade. Analogamente, a regio da curva cuja derivada mnima, explicita uma alta concentrao de bolhas de oznio com pequena uniformidade, ou seja grande variaes de dimetros destas bolhas.

A partir da Equao 3, pode-se calcular os ndices de uniformidade das bolhas de oznio para os diferentes leos, so eles: leo de girassol: 0,95 Glicerina: 0,30 Azeite de oliva: 0,92 leo de soja: 0,81 Vaselina: 0,19

46

4.2. Espectroscopia Raman

A Figura 20 mostra o espectro Raman normalizado dos leos vegetais ozonizados: leo de girassol (20a), glicerina (20b), azeite de oliva (20c), oleo de soja (20d) e vaselina (20e) respectivamente.

Nos espectros Raman dos leos vegetais ozonizados podem ser observados os picos Raman correspondentes ao espectro Raman caracterstico dos leos vegetais (girassol, glicerina, oliva, soja vaselina) de uso comercial descritos por Silveira Jr., L, et al, (2010). Estes espectros apresentam picos com intensidades atribudas aos modos vibracionais dos diferentes grupos moleculares de cidos graxos. Na regio compreendida entre 1500-1700 cm-1 observado um pico em 1567 cm-1 que caracterstico da vibrao C-C de molculas oleofnicas, na regio entre 1100 e 1500 cm-1 encontram-se trs picos correspondentes a 1443 cm-1, 1263 cm-1 e 1301 cm-1, o primeiro indica a deformao-vibrao de CH do CH2, e os dois seguintes correspondem a enlaces duplos nos conjugados do cis ou insaturao; na regio entre 900-1100 cm-1, se encontram picos caractersticos da cadeia bsica de carbono e vibraes com enlaces de CO.

Nas Figuras 21 a 25 podem ser observados os espectros do PC1 e PC2 de cada leo vegetal ozonizado, em que o PC1 mostra o espectro do componente principal do mesmo, sendo este (em todos os casos) o espectro original do leo vegetal. O espectro do PC2 o segundo componente principal, buscando evidenciar as mudanas espectrais dos leos em funo da incorporao de oznio.

Na Figura 26 (a-j) so mostrados os dois primeiros vetores PC dos cinco leos vegetais ozonizados, objetos do presente estudo. Esses vetores apresentam componentes principais, evidenciando que a intensidade das bandas aumenta com o tempo e mostram as mudanas dos componentes principais dos leos vegetais em funo do tempo de ozonizao.

47

a.

b.

c.

d.

e.

Figura 20: Espectros Raman dos leos vegetais ozonizados.

48

Figura 21: Espectros do PC1 e PC2 do leo de girassol ozonizado.

49

Figura 22: Espectros do PC1 e PC2 da glicerina ozonizada.

50

Figura 23: Espectros do PC1 e PC2 do azeite de oliva ozonizado.

51

Figura 24: Espectros do PC1 e PC2 do leo de soja ozonizado.

52

Figura 25: Espectros do PC1 e PC2 da vaselina ozonizada.

As diferenas espectrais mais importantes em cada um dos leos vegetais ozonizados so enumeradas a seguir: leo de girassol: Evidenciou-se a presena de um novo pico em 829 cm-1 que correspondente a formao de perxidos, os picos que determinam as ligaes duplas entre C=C foram quebradas isto determinado pelo decaimento dos picos

53

encontrados ao redor dos 1443 cm-1, 1263 cm-1 e 1301 cm-1. O pico encontrado nos 1661 cm-1 teve um deslocamento que representa o decaimento da ligao dupla do cis.

Glicerina: Apresentou mudanas nas regies espectrais correspondentes a 800 - 1000 cm-1, 1000 cm-1 - 1200 cm-1 e 1400 - 1600 cm-1, na primeira regio tm um deslocamento no pico de 852 cm-1 atribudo ao resultado da ozonlise e ao CH3, em 1055 cm-1 evidenciou-se tambm um deslocamento do pico que indica a presena de novos elementos na cadeia bsica de carbonos. Azeite de oliva: O espectro Raman do azeite de oliva no evidenciou mudanas espectrais, isto confirmado pelo PCA aplicado ao mesmo. leo de soja: Na regio dos 974 cm-1 - 1081 cm-1 se apresentou um pico nos 1075 cm-1 que pode ser designado ao CO, nos picos correspondentes as ligaes duplas de C=C mostraram decaimento (1265 cm-1 1300 cm-1), teve um deslocamento no pico correspondente a vibrao do CH e CH2 , e, finalmente, apresentou um decaimento no pico assinado pelas molculas oleofinicas. Vaselina: Os efeitos ocasionados pelo oznio nos grupos moleculares presentes na vaselina foram de uma baixa intensidade, mesmo assim podem ser observadas mudanas nos picos correspondentes a 912 cm-1, 1044 cm-1, (formao de perxidos e ozonidos), 1332 cm-1 - 1433 cm-1 (reduo de ligaes duplas de C=C) e decaimento da intensidade nos 1632 cm-1.

A Figura 26 mostra o comportamento dos leos vegetais, no que tange ao tempo de ozonizao.

54

a. PC1 do oleo de girassol ozonizado

b. PC2 do oleo de girassol ozonizado

c. PC1 da Glicerina ozonizada

d. PC2 da Glicerina ozonizada

e. PC1 do azeite de oliva ozonizado

f. PC2 do azeite de oliva ozonizado

R2 = 0.0008

0.10

0.12

0.14

0.16

0.18

0.20

0.22

0.24

0 50 100 150 200 250 300Tempo (min)

Inte

nsi

dade

(ar

b. un.)

PC1

g. PC1 do leo de soja ozonizado

R2 = 0.3625

-0.50

-0.40-0.30

-0.20

-0.100.00

0.10

0.200.30

0.40

0 50 100 150 200 250 300

Tempo (min)

Inte

nsid

ade

(ar

b. un.)

PC2

h. PC2 do leo de soja ozonizado

R2 = 0.4441

-0.23

-0.23

-0.22

-0.22

-0.22

-0.22

-0.220 50 100 150 200 250 300

Tempo (min)

Inte

nsid

ade

(arb.

un.)

PC1

i. PC1 da vaselina ozonizada

R2 = 0.0955

-0.80

-0.60

-0.40

-0.20

0.00

0.20

0.40

0.60

0 50 100 150 200 250 300

Tempo (min)

Inte

nsid

ade

(ar

b. un.)

PC2

j. PC2 da vaselina ozonizada

Figura 26: PC1 e PC2 em funo do tempo, dos leos vegetais ozonizados.

55

O PC 1 corresponde ao espectro de cada leo vegetal na qual observada a composio original dos leos e que estes apresentam um comportamento estvel, com exceo da vaselina que mostra um comportamento aleatrio. J no PC2 observou-se o comportamento das mudanas espectrais com relao a adio de oznio e ao tempo de ozonizao.

No leo de girassol as mudanas foram contnuas, e, diretamente proporcionais ao tempo de ozonizao. A glicerina mostrou um comportamento exponencial negativo que representa o decaimento do sinal Raman, atingindo a saturao aos 120 minutos de ozonizao, aproximadamente. O azeite de oliva no apresentou diferenas espectrais na presena do oznio, nem em relao ao tempo de ozonizao. O leo de soja apresentou um incremento positivo, atingindo a saturao, aproximadamente, aos 120 minutos de ozonizao. A vaselina teve inicialmente um comportamento aleatrio, pois as mudanas espectrais se apresentaram entre os 100 e 150 minutos de ozonizao, para em seguida decrescer e estabilizar.

56

5. DISCUSSO

O oznio tem reconhecidamente uma efetiva ao bactericida, mas sua utilizao foi limitada devido as suas propriedades oxidativas, sendo que somente na ltima dcada se estabeleceu o parmetro dose especfica, visando controlar sua reatividade. O conhecimento de oznio derivados, com propriedades teraputicas quando combinado com substratos insaturados, permitiu desenvolver produtos como os leos vegetais ozonizados que so eficazes e estveis para o uso teraputico.

Os leos vegetais ozonizados, objeto deste estudo, encontram-se na forma lquida, impregnados com bolhas de oznio em suspenso. Para sua anlise foram propostas duas tcnicas pticas que se destacam por serem no destrutivas, reproduzveis, evitando extensas manipulaes das amostras, sendo estas a microscopia ptica e a espectroscopia Raman.

A dose de oznio gerada pelo equipamento utilizado foi de 0,05 p.p.m, ou seja, dentro dos limites da dose definida para uso teraputico. Considerando que a concentrao de oznio gerada constante, as respostas espectrais e as caractersticas morfomtricas das bolhas de oznio, dependem do tempo de ozonizao dos leos (Castillo Castaeda et al., 2006; Travagli et al., 2010).

As anlises, morfolgica e morfomtrica das bolhas, podem auxiliar na obteno de dados importantes para a estabilidade do produto, ou seja, o leo ozonizado. Neste sentido a quantidade de bolhas em cada amostra, seu tamanho mdio e circularidade permitiram definir aspectos como a uniformidade e a persistncia que so empregados na hora de avaliar a qualidade final do produto (Campbell & Mougeot, 1993). As ferramentas estatsticas para anlise de uniformidade e persistncia so geralmente empregadas em estudos de granulometria de partculas slidas e em anlise de atomizao de lquidos (Castillo Castaeda et al., 2006; Bayvel & Orzechowski, 1993; Du et al., 2001). Essas ferramentas definem como ideal o produto com bolhas de menor dimetro e de mesma rea (comparado com um padro), e uma mdia de circularidade prximo ou igual a 1. Estes parmetros determinam a capacidade do produto em reter bolhas (Mangas et al., 1999) com consequente menor probabilidade de ruptura das mesmas.

57

No presente trabalho, a uniformidade entende-se como a variabilidade de rea das bolhas de oznio. A primeira idia de uniformidade foi obtida a partir dos histogramas de distribuio de bolhas mostrados nas Figuras 14 a 18, estes histogramas correspondem as microfotografias dos leos vegetais ozonizados, nos quais pode ser observado que, para o leo de girassol a maior quantidade de bolhas situa-se entre 0,05 m2 e 0,1 m2, apresentando nesta faixa, nmero superior a 400 bolhas de oznio, j na glicerina evidenciou-se que a maior quantidade de bolhas situa-se entre 0 e 1 m2 (>130 bolhas), enquanto no azeite de oliva o intervalo com maior quantidade de bolhas situa-se entre 0,2 e 0,25 m2 (>118 bolhas). No leo de soja a maior quantidade de bolhas situa-se entre 0,05 m2 e 0,1 m2 (>23 bolhas), coincidindo com o girassol no mesmo intervalo de dimenses, porm, com um nmero bastante inferior de bolhas. A vaselina teve o maior nmero de bolhas com rea da ordem de 2,5X103 m2 (>87 bolhas).

Neste trabalho, conforme anteriormente evidenciado, a curva de distribuio acumulada (Figura 19), explicita a concentrao de bolhas de oznio com pequena ou grande uniformidade em funo da taxa da derivada da curva. Da mesma forma, Du et al. (2001), em seu trabalho sobre caracterizao de espumas utiliza tambm esse tipo de informao para evidenciar as caractersticas do seu produto, levando a resultados anlogos. No presente trabalho, o melhor ndice de uniformidade foi obtido com o leo de girassol, seguido pelo azeite de oliva e o leo de soja.

O ndice de circularidade das bolhas de oznio nos leos vegetais podem definir sua persistncia no interior destes leos, conforme mostra Ligier-Belair et al. (1999). Estatisticamente, a circularidade mdia um ndice que caracteriza um determinado conjunto de bolhas uniformes e determina a persistncia destas dentro do substrato. Neste trabalho, maiores valores de circularidade, ou seja, prximos de 1, evidenciaram que maior persistncia das bolhas no interior do substrato, neste caso caractersticas apresentadas pelo azeite de oliva e leo de girassol.

As diferenas morfomtricas das bolhas de O3 nos leos vegetais podem ser atribudas s caractersticas reolgicas de cada leo como densidade e viscosidade, uma vez que, anlises qumicas e moleculares evidenciam que estes leos apresentam caractersticas similares. As caractersticas reolgicas dos materiais analisados neste trabalho so mostradas na Tabela 5 (Gardiner & Dlugogorski, 1998; Rabelo et al., 2000).

58

Tabela 5: valores de densidade e viscosidade dos leos vegetais (a 20C). Fonte: Rabelo et al., 2000

leo de girassol Glicerina

Azeite de oliva

leo de soja Vaselina

Densidade (g/cm3) 0,89 1,2613 8,19 0,819 0,856

Viscosidade (Pa.s) 58,3 1,5 79,7 59 10,08

De posse das definies anteriores e em uma primeira anlise, pode-se estabelecer uma relao entre a densidade e os parmetros morfomtricos dos leos analisados, mostrando que girassol, glicerina e oliva, seriam mais apropriados para armazenar bolhas de oznio.

A escolha da espectroscopia Raman como tcnica para caracterizao de leos vegetais ozonizados se fundamenta em estudos anteriores (Sadeghi-Jorabchi et al., 1990; Baeten et al., 1998; Palacios et al., 2000; Lee & Chan, 2007; Silveira et al., 2010) nos quais utilizada esta tcnica para determinar o grau de insaturao em leos vegetais prprios do consumo humano. Os espectros dos leos vegetais ozonizados em funo do tempo de ozonizao so mostrados na Figura 20, sendo as bandas Raman associadas aos modos vibracionais dos grupos funcionais caractersticos dos cidos graxos. Uma primeira avaliao destes espectros, no mostra mudanas significativas nos espectros dos leos ozonizados, tendo sido necessria aplicao da anlise multivariada de componentes principais (Figuras 21 a 26). Resultados preliminares indicam que o mtodo Criegge (1975) descreve a reao do oznio com leos vegetais e que a espectroscopia Raman pode ser bastante eficiente na deteco de mudanas espectrais resultantes da oxidao lipdica promovida pela presena do oznio, evidenciando como resultado o consumo das bandas correspondentes s ligaes duplas de C=C ou insaturao (1263 cm-1 e 1301 cm-1). Tambm possvel evidenciar a apario de novos grupos funcionais derivados do oxignio e identificados na Tabela 6.

59

Tabela 6: Possveis grupos funcionais derivados do oxignio no espectro de leos vegetais ozonizados.

Fonte: Lee & Chan (2007)

Grupo funcional Regio espectral

(cm-1) Assinatura

Perxido ~800 900 O-O - estiramento

Oznido ~700 900 O-O - estiramento

Eter ~830 890 C-O-C - estiramento Simtrico

Epxido ~750 950 deformao do anel

lcool ~800 900 C-C-O - estiramento em fase

Os dados da Tabela 6 foram corroborados por Lee & Chan (2007) que demonstrou a presena de ozonidos (O-O) e perxidos ao redor do pico centrado em 850 cm-1, compostos carbonila na regio de 1700 -1800 cm-1 e compostos hidroxlicos nas regies de 3300 cm-1 e 3600 cm-1.

As diferenas espectrais mais importantes nos leos vegetais ozonizados foram: O decaimento nas intensidades dos picos correspondentes s ligaes duplas de C=C, decaimento este observado no leo de girassol, leo de soja e vaselina, e a presena de novos grupos moleculares como perxidos e ozonidos, evidenciados em todos os leos exceto, no azeite de oliva.

Nos espectros de leos vegetais ozonizados, analisados no presente estudo, foram observados que, o leo de girassol, o leo de soja, glicerina e vaselina apresentam mudanas espectrais em funo do tempo de ozonizao. Fato este no observado com o azeite de oliva.

importante ressaltar que o rendimento e qualidade dos produtos de derivados de ozonizao dependem de parmetros tais como: tipo do gerador de oznio, tempo de ozonizao, presena de gua ou catalisadores, fluxo do gs, e tipo de alimentao de gs (oxignio ou ar). Todos estes parmetros foram determinantes nos resultados obtidos neste trabalho.

No presente estudo, a espectroscopia Raman e a microscopia ptica se complementam, uma vez que a primeira gera informao qumica (molecular e

60

espectral) e a segunda gera informao fsica e morfomtrica que permitiram analisar pontualmente cada aspecto relevante dos leos ozonizados.

61

6. CONCLUSO

No presente estudo, foram ozonizados 5 tipos de leo, saber: girassol, soja, oliva, glicerina e vaselina e apresentadas duas tcnicas para o estudo e caracterizao dos leos. As tcnicas so rpidas, robustas, confiveis, no destrutivas e permitiram realizar o procedimento com reprodutibilidade.

Foi verificado que o oznio produz mudanas espectrais nos leos caracterizados.

Observou-se ainda que, os leos vegetais ozonizados mais estveis so o leo de girassol e o azeite de oliva, o que os torna mais adequados para funcionar como reservatrios de oznio teraputico.

A metodologia proposta eficaz e uma das primeiras a associar a espetroscopia Raman com a microscopia ptica para anlise e caracterizao de leos vegetais ozonizados. Estudos posteriores so necessrios para evidenciar a ao do oznio em leos, em funo da sua concentrao.

62

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

BAETEN, V.; HOURANT, P.; MORALES, M. T.; APARICIO, R. Oil and fat classification by FT-Raman spectroscopy. J. Agric. Food. Chem. 46(7): 2638-2646, 1998.

BAILEY, P. S. Ozonization in Organic Chemistry. Vol. 1: Olefinic Compounds. New York: Academic Press, 1978, p 9.

BAYVEL, L.; ORZECHOWSKI, Z. Liquid Atomization (Combustion: An International). London: Taylor & Francis, 1993, 475 p.

BOCCI, V. Oxygen-Ozone Therapy, A Critical Evaluation. Norwell: Kluwer Academia Publishers, 2002, 440 p.

BOCCI, V. Ozone: A New Medical Drug. Norwell: Springer, 2005, 295 p.

CAMPBELL, G. M., MOUGEOT, E. Creation and characterisation of aerated food products. Trends Food Sci. Tech. 10(9): 283-296, 1993.

CARELLI, A. A. Anlisis cuantitativo de ceras en aceites y grasas. A&G Magazine 10: 244-249, 1998.

CASTILLO CASTAEDA, E.; COURTOIS, F.; RELKIN, P. Cuantificacin de la persistencia y homogeneidad de espumas mediante procesamiento de imgenes. Cienc. Tecnol. Aliment. 5(2): 147-155, 2006.

CLARK, R.J.H., HESTER, R.E. Advances in Infrared and Raman Spectroscopy. Chichester: John Wiley & Sons, 1985, 360 p.

CUNHA JR., A. P.; CUNHA, V. P. P.; SILVEIRA, L.; MARTIN, A. A. Modelo de calibrao da concentrao de metilmetacrilato em soluo aquosa utilizando espectroscopia de absoro no ultravioleta. Qum. Nova 26(6): 850-854, 2003.

63

DE LA CRUZ, M. G. F. Plantas medicinais utilizadas por raizeiros: uma abordagem etnobotnica no contexto da sade e doena. 1997. 175 p. Mestrado (Sade e Ambiente) Instituto de Sade Coletiva, Universidade Federal de Mato Grosso, Cuiab - MT.

DEVLIN, T. M., Bioqumica: Libro de Texto con Aplicaciones Clnicas. Barcelona: Editorial Revert, 2004, 1218 p.

DAZ GOMEZ, M. F.; GAVN SAZATORNIL, J. A. Ozonizacin del aceite de girasol. Seguimiento de la reaccin por Resonancia Magntica Nuclear protnica, Rev. CENIC Cienc. Qum. 36(3): 159-162, 2005.

DAZ M. F.; GAVN, J. A.; GMEZ, M.; CURTIELLES, V.; HERNNDEZ, F. Study of ozonated sunflower oil using 1H NMR and microbiological analysis. Ozone-Sci. Eng. 28(1): 1-5, 2005(a).

DAZ, M. F.; HERNNDEZ, R.; MARTNEZ, G.; VIDAL, G; GMEZ M.; FERNNDEZ, H.; GARCS, R. Comparative study of ozonized olive oil and ozonized sunflower oil. J. Braz. Chem. Soc. 17(2): 403-407, 2006.

DAZ, M. F., GAVN, J. A. Characterization by NMR of ozonized methyl linoleate. J. Braz. Chem. Soc. 18(3): 513-518, 2007.

DAZ, M. F.; ROMAY, C.; ROJAS, E.; GONZLEZ, R. Efecto del aceite de teobroma ozonizado sobre la respuesta inflamatoria inducida en el modelo de edema en la oreja de ratn. RECVET - Rev. Electr. Clin. Vet. 3(9): 1:6, 2008. Disponvel em http://www.veterinaria.org/revistas/recvet/n090908/090901.pdf, acesso em junho de 2009.

DIAZ GOMEZ, M. F.; MARTINEZ TLLEZ, G.; MENEAU HERNNDEZ, R. I,; ALAIZ, M.; GARCZ, R. Estudio analtico de espcies oxigenadas en el aceite de teobroma ozonizado. Qum. Nova 31(3): 610-613, 2008.

DOU, X.; YAMAGUCHI, Y.; YAMAMOTO, H.; DOI, S.; OSAKI, Y. A highly sensitive

64

compact Raman system without a spectrometer for quantitative analysis of biological samples. Vibr. Spectrosc. 14(2): 199-205, 1997.

DU, L.; DING, Y.; PROKOP, A.; TANNER, R. D. Measurement of bubble size distribution in protein foam fractionation column using capillary probe with photoelectric sensors. Appl. Biochem. Biotechn. 91-93: 387-404, 2001.

ESTERBAUER, H., SCHAUR, R. J.; ZOLLNER, H. Chemistry and biochemistry of 4-hydroxynonenal, malonaldehyde and related aldehydes. Free Radic. Biol. Med. 11(1): 81-128, 1991.

GARDINER, B. S.; DLUGOGORSKI, B. Z.; JAMESON, G. J. Prediction of pressure losses in pipe flow of aqueous foams. Ind. Eng. Chem. Res. 38(3): 1099-1106, 1999.

GARDINER, B. S.; DLUGOGORSKI, B. Z.; JAMESON, G. J. Rheology of fire-fighting foams. Fire Safety J. 31: 61-75, 1998.

HOLLAS, J. M. Modern Spectroscopy. Chichester: John Wiley & Sons, 2004, 452 p.

KINSGLEY, J. P.; DAY, R. W; LINZ, L. M. Inyeccin directa de oxigeno en rector de columna de burbujas. Praxair Technology, Inc, Patente B01J19/00, B01J19/24, B01J10/00, Espanha, 2001.

KUNZ, A.; FREIRE, R. S.; ROHWEDDER, J. J. R.; DURAN, N.; MANSILLA, H.; RODRIGUEZ, J. Construo e otimizao de um sistema para produo e aplicao de oznio em escala de laboratrio. Qum. Nova 22(3): 425:428, 1999.

LEDUC, A. Method of generating stable foam for oil gas well cleanouts. US Patent 7278488, U.S.A., 2007. Disponvel em: http://www.google.com/patents/US7278488. Acesso em 10 out 2010.

LEE, A. K. Y.; CHAN, C. K. Single particle Raman spectroscopy for investigating atmospheric heterogeneus reactions of organic aerosols. Atmos. Environ. 41(22): 4611-4621, 2007.

65

LIGER-BELAIR, G.; MARCHAL, R.; ROBILLARD, B.; VIGNES-ADLER, M.; MAUJEAN, A.; JEANDET, P. Study of effervescence in glass of champagne: frequencies of bubble formation, growth rates, nd velocities of rising bubbles. Am. J. Enol. Vitic. 50(3): 317-323, 1999.

MAGRABI, S. A.; DLUGOGORSKI, B. Z.; JAMESON, G. J. Comparative study of drainage characteristics in AFFF and FFFP compressed - air fire - fighting foams. Fire Safety J. 37(1): 21-52, 2002.

MAGRABI, S. A.; DLUGOGORSKI, B. Z.; JAMESON, G. J. Bubble size distribution and coarsening of aqueous foams. Chem. Eng. Sci. 54(18): 4007-4022, 1999.

MANGAS, J. J.; MORENO, J.; RODRGUEZ, R.; PICINELLI, A.; SUREZ, B. Analisys of polysaccharides in cider: their effect on sensory foaming properties. J. Agric. Food Chem. 47(1): 152-156.

MARTNEZ TELLES, G.; HERNNDEZ TAPANEZ, R.; DAZ GOMEZ, M. Determinacin de hidroperxidos en aceite de girasol ozonizado. Grasas Aceites 56(2): 148-153, 2005.

RAKNESS, K.; GORDON, G.; LANGLAIS, B.; MASSCHELEIN, W.; MATSUMOTO, N.; RICHARD, Y.; ROBSON, C. M.; SOMIYA, I. Guideline for measurement of ozone concentration in the process gas from an ozone generator. Ozone-Sci. Eng. 18: 209-229, 1996.

MORALEDA, M. G. Actividades biolgicas de la ozonoterapia y las sustancias naturales ozonizadas, fundamentales y aplicaciones. Disponvel em: http://www.naturozone.com. Acesso em dez. de 2008.

NAGIB, E. C. Desenvolvimento de tcnica operatria minimamente invasiva com instrumento de ultra-baixa rotao e terapia de oznio, assistida por diagnstico de crie com fluorescncia induzida por laser. 2006. 159 p. Dissertao (Mestrado em Bioengenharia) Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento, Universidade do Vale do

66

Paraba, So Jos dos Campos, SP.

PALACIOS, D. A. B; SCHMIDT. E. M. M.; SILVEIRA, L.; ZNGARO, R. A. Estudio analtico de aceite de girasol ozonizado por espectroscopia Raman y microscopa ptica. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE ENGENHARIA BIOMDICA, 22, 2010, Tiradentes, MG. Anais do XXII Congresso Brasileiro de Engenharia Biomdica. Tiradentes, MG, 2010. 1: 96:99.

PICINELLI, A.; SUREZ, B.; GARCA, L.; MANGAS, J. J. Changes in phenolic contents during sparkling apple winemaking. Am. J. Enol. Vitic. 51(2): 144-149, 2000.

RABELO, J.; BATISTA, E.; CAVALERI, F. W.; MEIRELLES, A. J. A. Viscosity prediction for fatty systems. J. Am. Oil Chem. Soc. 77(12): 1255-1262, 2000.

RODRGUEZ, M. D.; MENNDEZ, S.; GMEZ, M. Estudio teratognico del aceite ozonizado. In: Congreso Ibero latinoamericano de Aplicaciones del Ozono, 1, 1990, Havana, Cuba. Anais do Primer Congreso Ibero Latinoamericano de Aplicaciones del Ozono. Havana, Cuba, 1990.

SADEGHI-JORABCHI, H.; HENDRA, P. J.; WILSON, R. H.; BELTON, P. S. Determination of the total unsaturation in oils and margarines by Fourier transform Raman spectroscopy. J. Am. Oil Chem. Soc. 67: 483-486, 1990.

SADOWSKA, J.; JOHANSSON, B.; JOHANNESSEN, E.; FRIMAN, R.; BRONIARZ-PRESS, L.; ROSENHOLM, J. B. Characterization of ozonated vegetable oils by spectroscopic an chromatographic methods. Chem. Phys. Lipids 151(2): 85-91, 2008.

SAKAZAKI, F.; KATAOKA, H.; OKUNO, T.; UENO, H.; SEMMA, M.; ICHIKAWA, A.; NAKAMURO, K. Ozonated olive oil enhances the growth of granulation tissue in a mouse model of pressure ulcer. Ozone-Sci. Eng. 29(6): 503-507, 2007.

SECHI, L. A.; LEZCANO, I.; NUEZ, N.; ESPIM, M.; DUPRE, I.; PINNA, A. Antibacterial

67

Activity of Ozonized Sunflower Oil (OLEOZON). J. Appl. Microbiol. 90(2): 279, 2001.

SILVEIRA, F. L.; SILVEIRA, L.; VILLAVERDE, A. B.; PACHECO, M. T. T.; PASQUALUCCI, C. A. Use of dispersive Raman spectroscopy in the determination of unsaturated fat in commercial edible oil- and fat- containing industrialized foods. Instrum. Sci. Tech. 38: 107-123, 2010.

TRAVAGLI, V.; ZANARDI, I.; VALACCHI, G.; BOCCI, V. Ozone and ozonated oils in skin diseases: A Review. Mediat. Inflamm. 2010(2010): Article ID 610418, 1-9, 2010.

VALACCHI, G.; BOCCI, V. Studies on the biological effects of ozone: 11. Release of factors from human endothelial cell. Mediat. Inflamm. 9(6): 271-276, 2000.

WERKMEISTER, H. Dekubitalgesch wure and die behandlung mit der ozon- unterdruckbegasung. In: VIEBAHN-HNSLER, R.; KNOCH, H. G. Ozon-Handbuch. Grundlagen. Prvention. Therapie. Landsberg: Ecomed, 2001, 11-122.

ZANARDI, I.; TRAVAGLI, V.; GABBRIELLI, A.; CHIASSERINI, L.; BOCCI, V. Physico-chemical characterization of sesame oil derivates. Lipids 43(9): 877-886, 2008.