dissertação vanessa lima

8/17/2019 Dissertação Vanessa Lima

1/88

222UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA

VANESSA CRISTINA OLIVEIRA DE LIMA

EFEITO GRASTROPROTETOR DE ISOLADOS PROTEICOS DE

SEMENTES DE Erythr ina velut ina COM AÇÃO INIBITÓRIA

SOBRE ELASTASE DE NEUTRÓFILOS EM MODELO DE

ÚLCERA EXPERIMENTAL

NATAL/RN

2014


2/88


3/88


4/88


5/88

Aos meus amados pais, Deusimar e Irene, dedico.“Porque metade de mim é amor, e a outra metade também”

Oswaldo Montenegro


6/88


7/88

incentivar tanto, por ser o cara especial que você é. Espero que esse seja só o começo

de uma longa e bela jornada. Amo você.

Agradeço a minha Orientadora, Ana Heloneida, por ter acreditado em mim.

Obrigada por me fazer sonhar com coisas grandes, e hoje me despertar pra um futuro

que pouco a pouco vai se concretizando. Hoje devo a você muito do que já construí.

Poucos professores atentam para o significado que possuem na vida de seus alunos.

Eu que nunca pensei em chegar aqui, já quero ir mais longe. Obrigada professora, por

ter mudado minha história.

Agradeço a Professora Adriana, pela acolhida. Obrigado por ter me recebidotão gentilmente e por ter feito tanto por mim. Pelos ensinamentos não só de bancada,

mas ensinamentos de vida. Eu espero um dia ser uma professora tão boa quanto você

é.

“...Quando tudo parece que estar perdido É nessa hora que você vê

Quem é parceiro, quem é bom amigoQuem tá contigo quem é de correr

A sua mão me tirou do abismoO seu axé evitou o meu fim

Me ensinou o que é companheirismoE também a gostar de quem gosta de mim...”

Agradeço as minhas queridas amigas! Da universidade para vida: Raphaela,

Juliana, Pammela, Fernanda, Sarine, Anny e Theresa. Minhas piris, todos os

momentos vividos com vocês foram e são muito especiais. Amo vocês! Obrigada pelo

apoio e incentivo de sempre! Fico muito feliz em compartilhar com vocês mais essa

vitória, e estar presente nas vitórias de vocês.

A Bel e a Karol, pela amizade, pela maravilhosa companhia, pelas muitas

risadas juntas e pelas lamentações também. Passamos pelo estresse das disciplinas, a

angústia de ter que tirar sempre A para não perder a bolsa, e o perrengue que é ser

pós-graduando. Meninas espero em um futuro não muito distante, apenas

comemorarmos! Aos meus colegas de mestrado, Moacir, Ingrid, Márcia, Gabriel,

Keith, Luiza, pelo aprendizado, pelo crescimento não só intelectual, aprendi muito

mais com cada um de vocês


8/88

A Richele, por ter me ensinado muito do que eu sei hoje, ter sido tão paciente e

sempre disposta a ajudar. Sua colaboração nesse trabalho foi essencial. Obrigada

amiga e sucesso! A Norberto, pela colaboração e sugestões.

A Tici (Bebê!!!), pela companhia, pelas conversas, pelos almoços juntas. Espero que

seus sonhos se concretizem, você merece! A negão (Anderson) por ser tão prestativo e

paciente e a Jonalson, sempre disposto a ajudar. Sem vocês dois o Laboratório jamais

seria o mesmo. A Paulinha, Antônio, Luciana, Russi, Serquiz, Patrícia, pela

convivência, pelas conversas sem futuro, pelas boas risadas, vocês com certeza

fizeram mais leve meu dia a dia. As meninas do laboratório: Iana, Iane, Ana Glória,

Espanhola (Guiulliana) e Isabela, obrigada pela companhia.

“...Na hora que a gente menos esperaNo fim do túnel aparece uma luz

A luz de uma amizade sinceraPara ajudar carregar nossa cruz

Foi Deus quem pôs você no meu caminhoNa hora certa pra me socorrerEu não teria chegado sozinho

A lugar nenhum se não fosse você...”

A professora Christina pela imensa colaboração e pelo apoio e todo o pessoal dolaboratório de práticas histológicas. A Ibson, pela ajuda imprescindível nesse

trabalho. Sou muito grata pela colaboração. A Izael, sempre muito esforçado e

prestativo, obrigada pela força e pela disposição. Agradeço também a Alexandre e a

equipe do Biotério da UNP, por gentilmente terem cedido o espaço e as ferramentas

para o nosso trabalho, obrigada pela ajuda, sou muito grata.

Aos professores Elizeu, Bruna e Sandra pelo cuidado com que olharam meu trabalho

e pela valiosa contribuição que fizeram. Agradeço as professoras Aurigena Antunes e

Liziane Lima por se disponibilizarem a acrescentar ainda mais ao trabalho. Meu

muito obrigada. A todos os funcionários e professores do departamento de

Bioquímica da UFRN. Ao programa de Pós-Graduação em Bioquímica. Ao CNPq e a

Capes pelo auxílio financeiro.

“...Quando o vento parou e a água baixou

Eu tive a certeza do seu amor” Zeca Pagodinho


9/88

“Cada um de nós compõe a sua história Cada ser em si

Carrega o dom de ser capazDe ser feliz”

Almir Sater


10/88

RESUMO

A úlcera gástrica é uma patologia inflamatória na qual ocorre um desequilíbrio entre

os fatores protetores e agressores da mucosa, nos quais a elastase de neutrófilo

humano (ENH) está inserida e cuja hiperatividade corrobora no processo

inflamatório. Os inibidores de tripsina e quimotripsina da espécie Erythrina velutina já

foram anteriormente isolados, e tiveram sua ação anti-inflamatória atestada. Logo,

esse estudo tem por objetivo avaliar o efeito gastroprotetor por ação inibitória sobre

ENH de isolados proteicos com atividades antitríptica e antiquimotríptica de

sementes de E. velutina em modelo experimental de úlcera gástrica. Para tal, os

isolados proteicos foram obtidos por extração, saturação com sulfato de amônio ecromatografia em coluna de afinidade com matriz sepharose, derivatizada com as

respectivas enzimas imobilizadas inibidas por cada isolado. Após atestada as

atividades antitríptica e antiquimotríptica dos isolados, estes foram denominados

IPAT e IPAQ respectivamente. Foi determinado para IPAT a IC50, a Ki para ENH e a

estabilidade em diferentes pH e temperaturas. Para avaliar o feito gastroprotetor dos

isolados proteicos, foram utilizados seis grupos de animais (ratas wistar ; 8 semanas;

180-220g; n = 6): dois grupos receberam IPAT (0,2 e 0,4 mg/kg), um terceiro gruporecebeu IPAQ (0,035 mg/kg); como controle negativo, um quarto grupo recebeu o

Cloridrato de Ranitidina (50 mg/kg) como controle positivo; um quinto grupo recebeu

a solução salina 0,9%; e um último grupo, não sofreu intervenção (Sham). Após

cinco dias de administração, foi induzida em cinco grupos de animais, a úlcera

gástrica com etanol 99%. Como resultado, o IPAT apresentou alta afinidade e

atividade inibitória sobre ENH com valores de Ki de 0,4 µg/mL e uma IC50 de 1,0

µg/mL, além de estabilidade e em uma ampla faixa de temperatura (37 a 100°C) ede pH (2 a 14). Ambos os isolados proteicos foram eficazes em proteger contra

danos à mucosa gástrica, principalmente as lesões hemorrágicas, apresentando

resultados estatisticamente significativos. Além disso, não apresentaram efeitos

tóxicos aos animais. Dessa forma, IPAT e IPAQ mostraram-se eficientes

gastroprotetores, despontando como uma terapêutica alternativa na prevenção da

úlcera gástrica.

Palavras-chave: Atividade neutrofílica. Mucosa gástrica. Úlcera gástrica. Atividade

antitríptica. Atividade antiquimotríptica.


11/88

ABSTRACT

Gastric ulcer is an inflammatory condition that is a consequence of an imbalance

between aggressive and protective factors of the mucosa, in which the human

neutrophil elastase (HNE) is inserted and whose hyperactivity supports the

inflammatory process. The trypsin and chymotrypsin inhibitors from Erythrina velutina

species were previously isolated and had a certified anti-inflammatory action.

Therefore, this study aims to evaluate the gastroprotective effect by inhibitory action

on protein isolates from HNE, antitryptic and antichymotryptic activities of E. velutina

seeds in experimental gastric ulcer. To this end, the protein isolates were obtained by

extraction saturation with ammonium sulfate and chromatography on sepharoseaffinity matrix column derivatized with the respective immobilized enzymes inhibited

by each isolate. After confirmed the isolated activities of antitryptic and

antichymotryptic, these PIAT and PIAQ were named respectively. PIAT was

determined for IC50, the Ki for HNE and stability at different pH and temperatures. To

assess the gastroprotective made of protein isolates, six groups of animals (male

Wistar , 8 weeks, 180-220g, n = 6) were used: two groups received PIAT (0.2 and 0.4

mg / kg), a third group received PIAQ (0.035 mg / kg); as negative control, a fourthgroup received ranitidine hydrochloride (50 mg / kg) as a positive control; a fifth

group received 0.9% saline; and a final group suffered no intervention (Sham). After

five days of administration, gastric ulcer with 99% ethanol was induced in five groups

of animals. As a result, the PIAT showed high affinity and inhibitory activity of HNE

with Ki values of 0.4 mg / ml and an IC50 of 1.0 mg / mL, in addition to stability and a

wide temperature range (37-100 ° C) and pH (2 to 14). Both protein isolates were

effective in protecting against damage to the gastric mucosa, mainly hemorrhagiclesions, showing statistically significant results. Besides, the animals did not show

any toxic effects. Thus, PIAT and PIAQ were effective gastroprotectors, emerging as

an alternative therapy in the prevention of gastric ulcer.

Keywords: Neutrophil activity. Gastric mucosa. Gastric ulcer. Antitryptic activity.

Antichymotryptic activity.


12/88

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1. Representação da mucosa gástrica e seus respectivos componentes

celulares.....................................................................................................................20

FIGURA 2. Esquema da produção da secreção ácida nas células parietais.............21

FIGURA 3. Esquema do sistema de proteção antioxidante.......................................29

FIGURA 4. Erytrina velutina. A) Árvore. B) Flores. C) Sementes..............................40

FIGURA 5. Erythrina velutina. A) Sementes. B) Cotilédones. C) Farinha..................46

FIGURA 6. Esquema de extração em tampão e fracionamento com sulfato de

amônio em três percentuais de saturação (0 –30%, 30 –60%, 60 –90%) das sementes

de E. velutina..............................................................................................................49

FIGURA 7. Desenho experimental do modelo de ulceração gástrica........................56

FIGURA 8. Percentual (%) de Inibição da atividade da tripsina pelo extrato bruto e

frações proteicas F1, F2, e F3 (saturação com sulfato de amônio em 0 – 30%, 30 –

60%, 60 – 90%, respectivamente) de sementes de E. velutina.................................59

FIGURA 9. A) Perfil cromatográfico da F2 (saturação com 30 – 60% de sulfato de

amônio) de sementes de Erythrina veluntina em cromatografia de afinidade Tripsina-Sepharose CNBr 4B. B) Eletroforese em gel de poliacrilamida a 12%......................60

FIGURA 10. A) Estabilidade de IPAT extraído de sementes de Erythrina velutina em

diferentes condições de pH e B) temperatura............................................................61

FIGURA 11. Determinação do IC50 e do Ki isolado proteico com atividade antitríptica

obtido de sementes de Erythrina velutina para HNE..................................................62


13/88

FIGURA 12. Percentual (%) de Inibição da atividade da quimotripsina pelo extrato

bruto e frações proteicas F1, F2, e F3 (saturação com sulfato de amônio em 0 –

30%, 30 – 60%, 60 – 90%, respectivamente) de sementes de E. velutina................63

FIGURA 13. A) Perfil da F2 (saturação com 30 – 60% de sulfato de amônio) de

sementes de Erythrina velutina em cromatografia de afinidade Quimotripsina-

Sepharose CNBr 4B. B) Eletroforese em gel de poliacrilamida a

12%............................................................................................................................64

FIGURA 14. Gráfico da plotagem do Índice de Lesão Ulcerativa (ILU) dos grupos

IPAT 0,2 e 0,4 mg/kg e IPAQ 0,035 mg/kg em relação ao controle positivo (soluçãosalina 0,9%) e ao controle negativo (Cloridrato de Ranitidina) .................................66

FIGURA15. Estômagos dos animais que receberam os isolados proteicos obtidos de

sementes de E. velutina, dissecados e abertos pela curvatura maior e lavados com

solução salina 0,9%, representando cada grupo do experimento (n= 6) ..................67

FIGURA 16. Cortes histológicos dos estômagos dos animais aos quais administrou-se os isolados proteicos obtidos de sementes de E. velutina, dissecados e abertos

pela curvatura maior e lavados com solução salina 0,9%, representando cada um

grupo do experimento (n= 6), corados com HE em aumento de 10 x........................69

FIGURA 17. Cortes histológicos dos fígados e pâncreas dos animais que receberam

IPAT (Isolado Proteico com Atividade Antitríptica) obtidos de sementes de E.

velutina, corados com HE, em aumento de 10 x........................................................70


14/88

LISTA DE TABELAS

TABELA 1. Família de inibidores de proteinases de plantas.....................................39

TABELA 2. Escores e parâmetros de análise macroscópica do dano epitelial para

modelo experimental de úlcera gástrica.....................................................................57


15/88

LISTA DE ABREVIATURAS / SIGLAS

AINE – Anti-inflamatório Não EsteroideAMPc – Adenosina 3’,5’ Monofosfato Cíclico

BApNa – Nα-Benzoyl-L-arginine 4-nitroanilide hydrochloride

BSA – Albumina Sérica Bovina

CEUA – Comitê de Ética em Uso animal

COX – Clicooxigenase

CRF – Corticotrofina

DMSO – DimetilsufóxidoDUP – Doença da Úlcera Péptica

EB – Extrato Bruto

EGF-R – Receptor do Fator de Cescimento

ENH – Elastase de Neutrófilo Humano

EP1-R – Receptor da Prostaglandina 1

ERO – Espécies Reativas de Oxigênio

ETI – Inibidor de Tripsina de Erythrina variegata

EvCI – Inibidor de Quimotripsina de Erythrina velutina

EvTI – Inibidor de Tripsina de Erythrima velutina

GPx – Glutationa Peroxidase

GR – Glutationa Redutade

GSH – Glutationa Reduzida

GSSG – Glutationa Oxidada

HE – Hematoxilina/Eosina

HPLC – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

IBP – Inibidor da Bomba de Prótons

ICMBio/MMa – Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade

IGF-1 – Fator de Crescimento Semelhante a Insulina

IPAQ – Isolado Proteico com Atividade Antiquimotríptica

IPAT – Isolado Proteico com Atividade Antitríptica

MPO – Mieloperoxidase

NADP – Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Fosfato


16/88

NADPH – Nicotinamida Adenina Dinucleotído Fosfato Reduzida

NC- IUBMB – Enzyme Nomenclature of the Committee of the International Union of

Biochemistry and Molecular Biology

NO – Óxido Nítrico

NOS – Óxido Nítrico Sintase

NOSe – Óxido Nítrico Sintase endotelial

NOSi – Óxido Nítrico Sintase induzível

NOSn – Óxido Nítrico Sintase neuronal

PAF – Fator Ativado de Plaquetas

PG – Prostaglandina

SOD – Superóxido Dismutase

TFF – Trefoil Factor Family


17/88

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ................................................................................................... 19

1.1 O ESTÔMAGO E A MUCOSA GÁSTRICA ................................................. 19

1.2 FATORES DE PROTEÇÃO ......................................................................... 22 1.2.1 Camada de muco e bicarbonato ............................................................ 22 1.2.2 Fatores Epiteliais ................................................................................... 23 1.2.3 Fatores Sub-endoteliais ......................................................................... 25 1.2.4 Sistema Antioxidante ............................................................................. 27

1.3 ÚLCERA GÁSTRICA ................................................................................... 29

1.3.1 Conceito e etiologia ............................................................................... 29 1.3.2 Sintomatologia e Tratamento ................................................................. 32

1.4 PROTEASES ............................................................................................... 35

1.5 INIBIDORES DE PROTEASES ................................................................... 37

1.6 Erythrina velut ina ....................................................................................... 39

JUSTIFICATIVA ........................................................................................................ 43

2. OBJETIVOS ....................................................................................................... 45

2.1 OBJETIVO GERAL...................................................................................... 45

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................ 45

3. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................... 46

3.1 MATERIAL ................................................................................................... 46 3.1.1 Sementes .............................................................................................. 46 3.1.2 Animais .................................................................................................. 46 3.1.3 Reagentes ............................................................................................. 47 3.1.4 Equipamentos ........................................................................................ 48

3.2.1 Obtenção do extrato bruto de E. Velutina .............................................. 48 3.2.2 Fracionamento do extrato bruto proteico de sementes de E. velutina porprecipitação com sulfato de amônio ................................................................... 49 3.2.3 Quantificação de proteínas .................................................................... 50 3.2.4 Preparo das soluções usadas como substrato ...................................... 50 3.2.5 Atividade antiquimotríptica ..................................................................... 50 3.2.6 Atividade antitríptica .............................................................................. 51 3.2.7 Atividade antielastásica neutrofílica ....................................................... 51 3.2.8 Cromatografia de Afinidade em Tripsina-Sepharose CNBr 4B .............. 51 3.2.9 Cromatografia de Afinidade em Quimotripsina-Sepharose CNBr 4B ..... 52


18/88

3.2.10 Avaliação do grau de pureza e estimativa da massa molecular dosisolados proteicos por eletroforese em Gel de Poliacrilamida Descontínuo eDesnaturante (SDS-PAGE) ................................................................................ 53 3.2.11 Estabilidade em variação de pH ............................................................ 54 3.2.12 Estabilidade térmica .............................................................................. 54 3.2.13 Determinação da IC50 para ENH de IPAT .............................................. 54 3.2.14 Avaliação do efeito gastroprotetor de IPAT e IPAQ ............................... 55 3.2.15 Análise Estatística ................................................................................. 58

4. RESULTADOS ................................................................................................... 59

4.1 Determinação da atividade inibitória sobre tripsina das fraçõesproteicas de sementes de Erythrina velut ina .................................................... 59

4.2 Isolamento proteico em cromatografia de afinidade de Tripsina-

Sepharose CNBr 4B ............................................................................................. 60

4.3 Estabilidade de IPAT em diferentes pH e temperatura ........................... 61

4.4 Determinação da IC50, da Ki e do mecanismo de inibição do IPAT paraENH 61

4.5 Determinação da atividade inibitória sobre quimotripsina das fraçõesproteicas de sementes de Erythrina velut ina .................................................... 63

4.6 Isolamento proteico em cromatografia de afinidade de Quimotripsina-Sepharose CNBr 4B ............................................................................................. 63

4.7 Avaliação do efeito gastroprotetor de IPAT e IPAQ em modeloexperimental de úlcera induzida por etanol ...................................................... 64

4.7.1 Avaliação Macroscópica ........................................................................ 64 4.7.2 Avaliação Histomorfológica ................................................................... 68 4.7.3 Análise Toxicológica .............................................................................. 70

5. DISCUSSÃO ...................................................................................................... 71

6. CONCLUSÃO ..................................................................................................... 77

REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 78


19/88

19

1. INTRODUÇÃO

1.1 O ESTÔMAGO E A MUCOSA GÁSTRICA

O estômago é a região mais dilatada do tubo digestivo, responsável pela

formação e processamento do alimento ingerido em um fluido denso e ácido

conhecido como quimo. Este órgão liquefaz os alimentos, continuando sua digestão

por meio da produção de ácido clorídrico e das enzimas pepsina, renina e lipase

gástrica, e da produção de hormônios parácrinos. Anatomicamente, possui uma

curvatura menor, côncava, e uma maior, convexa, e é dividido em quatro regiões:

cárdia, fundo, corpo e antropilórico (região pilórica) (GARTNER; HIATT, 2007).

Na mucosa gástrica, a diversidade de funções das células que compõem o

tecido gástrico acaba por manter esse epitélio em um ambiente luminal hostil, com

condições extremas de acidez e presença de proteases agressivas, capazes de

digerir o próprio tecido que as gerou. Somando-se a tudo isso a contínua exposição

a patógenos externos possivelmente veiculados por alimentos, alimentos ingeridos a

altas temperaturas ou alta osmolaridade, álcool, dentre outros. Entretanto, apesar da

exposição contínua a estes fatores prejudiciais, sob condições normais, uma série

de mecanismos de defesa evita danos locais e mantem a integridade estrutural e

funcional dessa mucosa (NAYEB-HASHEMI; KAUNITZ, 2009; TULASSAY;

HERSZÉNYI, 2010).

A mucosa gástrica é constituída por três componentes usuais: o epitélio que

reveste o lúmen, o tecido conjuntivo subjacente chamado de lâmina própria e a

camada muscular lisa. O epitélio do corpo e do fundo (mucosa oxíntica ou glandular)

possui vários tipos celulares: células parietais ou oxínticas (presentes no fundo dasglândulas oxínticas), as células principais ou zimogênicas, células mucosas

superficiais e as células enteroendócrinas secretoras de hormônios. Já a mucosa

glandular possui células mucosas na região do colo das glândulas gástricas, além de

células estaminais, que atuam na regeneração do epitélio superficial (Figura 1)

(GARTNER; HIATT, 2007; GYIRES; NÉMETH; ZÁDORI, 2013).


20/88

20

Figura 1: Representação da mucosa gástrica e seus respectivos componentes celulares. Fonte:

Traduzido de http://higheredbcs.wiley.com/

As glândulas gástricas produzem aproximadamente 2 a 3 litros de suco

gástrico por dia, o qual é formado por água, derivada do fluido extracelular do tecido

conjuntivo e liberada pelas células parietais, ácido clorídrico (HCl) e fator intrínseco

produzidos pelas células parietais, as enzimas pepsina, renina e lipase gástrica,

produzidas pelas células principais e o muco solúvel produzido pelas células

mucosas do colo. Uma pequena absorção dos produtos alimentares ocorre no

estômago, embora algumas substâncias como álcool, possam ser absorvidas

diretamente pela mucosa gástrica (GUYTON; HALL, 2009; MILLS; SHIVDASANI,

2011).

A secreção de HCl no estômago tem importante papel na funcionalidade do

órgão, embora envolvida na patogênese da maioria das doenças de acometimento

gástrico. Também, está envolvida com a desnaturação proteica, a absorção de ferro,

cálcio e cobalamina e ainda atua como agente microbicida. O HCl ativa ainda a

proenzima pepsinogênio, transformando-a na pepsina proteoliticamente ativa,

gerando as condições de baixo pH necessárias à sua atividade. A liberação de HCl

pode se dar por fatores psicológicos, sensoriais ou pela presença de alimento no

http://higheredbcs.wiley.com/http://higheredbcs.wiley.com/


21/88

21

trato gastrointestinal, além de moléculas indutoras como a histamina, a acetilcolina e

o hormônio gastrina (LAINE; TAKEUCHI; TARNAWISKY, 2008).

Quando as moléculas indutoras se ligam aos receptores na membrana da

superfície basal das células parietais, ocorre a sinalização para liberação de HCl

para o canalículo celular, que por estimulação, se abre na membrana apical da

célula, a qual também possui um sistema túbulo-vesicular rico em bombas de

prótons (H+/K+-ATPase) secretoras de hidrogênio (H+) (Figura 2). A atividade da

bomba protômica é regulada por proteínas quinases, cuja atividade depende das

concentrações intracelulares de adenosina 3’,5’ monofosfato cíclico (AMPc) e

diacilglicerol. Uma vez ativada a célula, o sistema túbulo-vesicular funde-se a

membrana projetando as microvilosidades nos canalículos, aumentando o contato

dessa porção da membrana com o lúmen gástrico (GANONG, 2006).

Figura 2: Esquema da

produção da secreção ácida nas células parietais. Fonte: Traduzido de

http://z7.invisionfree.com/Farmacoterapia_USP/index.php?showtopic=17

Dessa forma, as moléculas de H+/K+-ATPase ficam expostas ao potássio (K+)

extracelular e passam a trocar H+ por K+. O íon H+ é proveniente da dissociação do

ácido carbônico (H2CO3), formado a partir da hidratação do gás carbônico (CO2), pelaação da enzima anidrase carbônica. O HCO3

- assim formado deixa a célula parietal

http://z7.invisionfree.com/Farmacoterapia_USP/index.php?showtopic=17http://z7.invisionfree.com/Farmacoterapia_USP/index.php?showtopic=17http://z7.invisionfree.com/Farmacoterapia_USP/index.php?showtopic=17


22/88

22

através de um antitransportador presente na membrana basolateral que troca o

bicarbonato por cloreto (Cl-). Por ser o ânion mais abundante no líquido extracelular,

o Cl- difunde-se para o lúmen a favor do seu gradiente de concentração (GUYTON;

HALL, 2009).

1.2 FATORES DE PROTEÇÃO

1.2.1 Camada de muco e bicarbonato

A superfície epitelial é recoberta por gel de muco, bicarbonato (HCO3-) e

fosfolipídios surfactantes, que juntos constituem a primeira linha de defesa da

mucosa (ALLEN; FLEMSTRÖM, 2005). O muco gástrico consiste de um gel viscoso,

elástico, aderente e transparente, secretado pela porção apical das células epiteliais

da superfície da mucosa, formado por aproximadamente 95% de água e 5% de

mucina, uma glicoproteína rica em resíduos de serina, treonina e tirosina, cuja

agregação é essencial à característica de gel da estrutura. Sua secreção é

estimulada pelos hormônios gastrina, secretina e agentes colinérgicos (TULASSAY;

HERSZÉNYI, 2010).

Existem quatro tipos de mucinas gelificantes (MUC2, MUC5AC, MUC5B, e

MUC6) cujas estruturas já foram elucidadas. No estômago, MUC5AC é expressa na

superfície epitelial das células da cárdia, do fundo e do antro. Já MUC6 é secretada

na porção média das células glandulares do fundo e do antro. MUC5AC e MUC6 se

organizam em estratos alternados na formação da camada de muco em humanos. O

gel mucoso é secretado juntamente com peptídeos de baixo peso molecular

conhecido como TFF (Trefoil Factor Family ). TFF são partes integrantes das

vesículas secretoras de muco e desempenham papel na montagem intracelular das

moléculas de mucina, estabilizando a rede do gel, além de aumentar sua

viscosidade (THIM; MADSEN; POULSEN, 2002; ZAK; SHAH; BLIN, 2009).

O HCO3- é secretado pelas células epiteliais e sua função consiste em

neutralizar os íons H+ que se difundem pela camada de muco aderente, de modo a

criar um microambiente com pH estável próximo a neutralidade na interface entre o

muco e a superfície da mucosa. A produção de HCO3- perfaz apenas 10% do total

de HCl produzido. Apesar da baixa produção de HCO3- em relação à secreção ácida,a viscosidade da barreira de muco retém o HCO3

-, evitando que o mesmo se difunda


23/88

23

na luz estomacal, minimizando assim as perdas. A barreira mucosa também retém a

pepsina liberada no espaço luminal, impedindo que a enzima alcance a mucosa e

cause digestão do epitélio (TULASSAY; HERSZÉNYI, 2010).

Estudos tem mostrado que o cotransporte Na+/HCO3- através da membrana

basolateral auxilia na captação de bicarbonato. Estudos utilizando a mucosa gástrica

de ratos e coelhos demonstraram a expressão de trocadores aniônicos de Cl-/HCO3-

nas membranas apicais de células epiteliais da superfície gástrica (TAKEUCHI et al .

1997; ROSSMANN et al. 1999). No estômago, prostaglandinas estimulam a

secreção de HCO3- por meio dos receptores EP1 ( prostaglandin E receptor 1). A

secreção ácida, o fator liberador de corticotropina (CRF), a melatonina, a

uroguanilina e orexina também estimulam a secreção de bicarbonato (ALLEN;

FLEMSTRÖM, 2005).

A eficácia das propriedades protetoras da barreira de muco não depende

apenas da estrutura do gel, mas também da quantidade ou espessura da camada

que cobre a superfície mucosa. A espessura da camada de muco por sua vez é

resultante do balanço entre sua produção e a erosão mecânica causada pelo

processo digestivo e químico, devido à ação proteolítica, principalmente em relação

à pepsina luminal. Porém, apesar da presença de fatores agressores ser umaconstante, a camada mucosa mantém uma aderência fisicamente única, não

sofrendo dispersão, nem alteração das suas propriedades reológicas (TULASSAY;

HERSZÉNYI, 2010).

A barreira de muco/bicarbonato é a única barreira pré-epitelial entre lúmen e

epitélio. Quando este mecanismo de proteção se encontra sobrecarregado ou o

equilíbrio entre fatores protetores e agressores se rompe, como nas doenças, a

próxima série de mecanismos de proteção entra em jogo, incluindo a neutralizaçãointracelular do ácido, a rápida reparação epitelial e a manutenção e distribuição do

fluxo sanguíneo da mucosa (LAINE; TAKEUCHI; TARNAWISKY, 2008).

1.2.2 Fatores Epiteliais

A linha de defesa subsequente à barreira de muco é a camada epitelial,

formada por células que produzem prostaglandinas (PG), proteínas de choque

térmico, proteínas da família Trefoil Factor Family (TFF), e catelicidinas. Devido à

presença de fosfolipídios de superfície, estas células apresentam caráter


24/88

24

hidrofóbico, repelindo agentes agressores solúveis em água e em ácido (LAINE;

TAKEUCHI; TARNAWISKY, 2008). Um estudo demonstrou que a membrana apical

de uma cultura de células principais apresentou resistência em pH fortemente ácido

(pH 2,0), enquanto as regiões basais das mesmas células apresentaram

sensibilidade a condições de pH levemente ácido (pH 5,5), ressaltando a

importância da justaposição celular como mecanismo de proteção contra a difusão

de ácido às camadas mais profundas (SANDERS et al., 1985).

Apesar de constituir uma barreira física que separa o ambiente luminal do

meio interno do organismo, a camada epitelial deve promover uma permeabilidade

seletiva, de modo a atender a função fisiológica do órgão (absorção de nutrientes e

secreções gástricas, por exemplo) e ao mesmo tempo impedir a penetração de

microrganismos e outros patógenos externos porventura contidos em alimentos. Os

elementos cruciais que garantem essa função são as junções intercelulares,

tornando as células epiteliais metabolicamente e eletricamente interligadas,

fornecendo vias para o transporte transepitelial de forma intercelular e paracelular

(MATYSIAK-BUDNIK; HEYMAN; MÉGRAUD, 2003).

Dentre os fatores de proteção produzidos pelas células epiteliais, pode-se

destacar as proteínas de choque, geradas em resposta ao estresse térmico,oxidativo e agentes citotóxicos (OYAKA et al., 2006). Elas impedem desnaturação

por conduzir o correto dobramento proteico e a agregação de proteínas, protegendo

as células contra lesões. Catelicidinas e β-Defensinas são peptídeos catiônicos que

desempenham um papel no sistema de defesa inato na superfície mucosa,

prevenindo a colonização bacteriana. Foi demonstrado que esses elementos são

capazes de acelerar a cicatrização de úlceras (TANAKA et al., 2007). As TFF

secretadas no muco também asseguram a integridade da mucosa, regulando areepitelização por migração celular, inibindo apoptose e inflamação e protegendo as

células contra uma série de substâncias tóxicas (HERNANDÉZ et al., 2009).

A mucosa gástrica também produz as PG PGE2 e PGI2, as quais são

essenciais para manutenção da integridade da mesma, protegendo contra agentes

necróticos e ulcerogênicos. Atuando em receptores E2 ligados à proteína G, essas

prostaglandinas inibem a secreção ácida, estimulam a secreção de muco, HCO3- e

fosfolipídios, além de aumentar o fluxo sanguíneo e estimular a regeneração

epitelial. PG também inibem a ativação de mastócitos e leucócitos e a adesão de


25/88

25

plaquetas ao endotélio vascular (ATAY; TARNAWSKI; DUBOIS, 2000;

BRZOZOWSKY et al., 2005).

A manutenção da integridade epitelial também requer um equilíbrio preciso

entre proliferação e morte celular. Assim, o epitélio é continuamente renovado por

um processo de proliferação celular altamente coordenado e controlado, que permite

a substituição da superfície danificada ou envelhecida por células estaminais. As

células da mucosa do estômago apresentam altas taxas de rotatividade e morrem

em poucos dias após a sua formação. A substituição completa do epitélio estomacal

leva entre três e sete dias, enquanto a substituição de células glandulares pode levar

meses (MURPHY, 1998).

A proliferação de células estaminais é controlada pelo receptor do fator de

crescimento (EGF-R), derivado de saliva, células esofágicas e glândulas duodenais.

Os principais fatores de crescimento que ativam esse receptor são o fator de

crescimento transformante α (TGF-α) e o fator de crescimento semelhante à insulina

1 (IGF-1). A ativação de EGF-R desencadeia a cascata de fosforilação iniciada pela

proteína cinase ativada por mitógeno, iniciando a ação trófica na mucosa. Além de

estimularem a proliferação de células epiteliais após um ferimento, também podem

atuar estimulando a produção de muco e controlando a secreção ácida (LAINE et al.,2007).

1.2.3 Fatores Sub-endoteliais

A microcirculação gástrica é formada por uma densa rede capilar que permeia

a mucosa gástrica desde a lâmina própria até as células epiteliais glandulares

(Figura 1). No nível da camada muscular da mucosa, vasos capilares oriundos das

artérias submucosas avançam para dentro do tecido em direção as glândulas

gástricas, convergindo em vênulas coletoras na região mais luminal da lâmina

própria subjacente às células mucosas da superfície. As células endoteliais que

compõem a microcirculação estão interligadas por intermédio de junções aderentes,

formando uma barreira endotelial que evita a difusão entre os espaços

intercelulares. Essas células também atuam permitindo a troca de solutos, oxigênio,

CO2 e nutrientes, com especial atividade na produção de fatores de coagulação,

substâncias vasoativas, hormônios, fatores de crescimento e citocinas

(TARNAWSKI; AHLUWALIA; JONES, 2012)


26/88

26

A modulação da microcirculação da mucosa gástrica desempenha um papel

essencial na manutenção da sua integridade, especialmente para o fornecimento de

oxigênio e nutrientes, e a remoção de substâncias tóxicas. As artérias gástricas,

mais calibrosas, se ramificam em finos capilares, e penetram na lamina própria, na

proximidade de células epiteliais glandulares gástricas. Na base das células

epiteliais da superfície, os vasos capilares convergem em vênulas coletoras (LAINE

et al., 2007; TULASSAY; HERSZÉNYI, 2010).

Quando a mucosa gástrica é exposta a uma substância irritante ou quando

ocorre a difusão do HCl do espaço luminal para o epitélio gástrico, é verificado um

rápido e acentuado aumento do fluxo sanguíneo na mucosa. Este aumento permite

a remoção e /ou diluição do ácido difundido ou dos agentes tóxicos e a redistribuição

sanguínea, tamponando o tecido. O HCO3- produzido pelas células parietais é

transportado para corrente sanguínea, alcalinizando o sangue, de modo a neutralizar

possíveis íons H+ que se difundam. Este fenômeno é conhecido como “Maré

Alcalina”. Esta resposta se mostra essencial para a defesa da mucosa porque, uma

vez abolida por meio de restrição mecânica do fluxo sanguíneo, leva à necrose

hemorrágica. Esta resposta por hiperemia é mediada por nervos aferentes

sensoriais (HOLZER, 2006).O aumento do fluxo de sangue da mucosa em resposta à secreção ácida é

mediado, pelo menos em parte, pelo aumento do óxido nítrico (NO), gerado pela

enzima óxido nítrico sintase (NOS), a partir do aminoácido L-Arginina. A NOS está

presente em três isoformas, duas constitutivas, sendo uma neuronal (NOSn) e outra

endotelial (NOSe), mais importantes no trato gastrointestinal, e uma terceira

isoforma induzível (NOSi) (BRZOZOWSKI et al., 2004). O NO tem potente efeito

vasodilatador, além de regular a produção de muco, inibir a agregação de neutrófilose auxiliar no processo de cicatrização da úlcera. NO protege a mucosa gástrica

contra lesões por etanol e endotelina-1, enquanto que a inibição de sua síntese

aumenta a lesão gástrica por ativação de mastócitos e liberação de histamina e fator

ativador de plaquetas (PAF), levando ao aumento da produção de HCl (HOLZER,

2006).

A interação de neutrófilos com o endotélio vascular é essencial para seu

recrutamento à área de injúria. As consequências celulares dessa interação incluem

a abertura das junções celulares endoteliais e aumento da permeabilidade,

facilitando a migração neutrofílica para o ponto de injúria, o que, em condições


27/88

27

patológicas ocorre de forma descontrolada, levando ao dano vascular agudo por

ação enzimática da elastase e consequente hemorragia (FRIEDRICH et al., 2011).

Juntamente com a microcirculação, a inervação gástrica tem fundamental

importância na manutenção da hemostasia. Vasos da mucosa e submucosa gástrica

são inervados por neurônios sensoriais aferentes primários e nervos formando um

denso plexo na base da mucosa. As fibras nervosas desse plexo entram na lâmina

própria, acompanhando os vasos sanguíneos, e terminam logo abaixo das células

epiteliais da superfície. Essas terminações nervosas monitoram o conteúdo ácido

luminal e a difusão de ácidos na mucosa, através de canais sensíveis a ácidos. A

ativação desses nervos afeta diretamente o tônus das arteríolas da submucosa,

alterando o fluxo sanguíneo na região. A estimulação dos nervos sensoriais gástrico

leva à liberação de neurotransmissores como o peptídeo relacionado ao gene da

calcitonina e a substância P em nervos inseridos ou próximos a grandes vasos da

mucosa, desencadeado resposta de defesa (HOLZER, 2007).

1.2.4 Sistema Antioxidante

Devido às implicações geradas pelas Espécies Reativas de Oxigênio (ERO),as células desenvolveram importantes sistemas antioxidantes de proteção,

envolvendo componentes enzimáticos e não enzimáticos. Em organismos aeróbios,

ERO são gerados frequentemente em decorrência do metabolismo do oxigênio,

processos inflamatórios ou outros eventos não fisiológicos. As ROS incluem todos

os radicais de oxigênio como hidroxila (OH•), superóxido (O2•-), alquila (L•), alcoxila

(LO•) e peroxila (LOO•), as quais apesar de apresentarem efeito protetor até certo

ponto, quando produzidas de forma descontrolada causam danos às membranas,

alterando sua estabilidade e a permeabilidade e o fluxo de substâncias. ERO

também podem causar dano ao material genético celular (HELLOU; ROSS; MOON,

2012).

A catalase, um dos componentes enzimáticos desse sistema, é uma heme

proteína heterotetramérica, que contém um grupo porfirina por subunidade. Catalisa

a redução de peróxido de hidrogênio (H2O2) em água e oxigênio, na qual o NADP,

produzido da via das pentoses fosfato, se liga aos tetrâmeros da enzima,

protegendo-a contra inativação causada pelo seu próprio substrato. Localizada nas

mitocôndrias e nos peroxissomos, a catalase se faz presente em todos os


28/88


29/88

29

Figura 3: Esquema do sistema de proteção antioxidante. Fonte: PRADO (2013). CAT: Catalase; SOD:

Superóxido Dismutase; GPx: Glutationa Peroxidade; GSH: Glutationa Reduzida; GSSG: Glutationa

Oxidada; GR: Glutationa Redutase.

1.3 ÚLCERA GÁSTRICA

1.3.1 Conceito e etiologia

A úlcera gástrica é uma lesão necrótica profunda, que penetra através da

mucosa, onde tanto os componentes do tecido epitelial quanto conectivo, incluindo

miofibroblastos subepiteliais, células do músculo liso, vasos e nervos são destruídos.Devido às suas grandes semelhanças com úlceras em outras partes do trato

digestivo, a úlcera gástrica é frequentemente referenciada com úlceras esofágicas e

duodenais em conjunto, como a doença de úlcera péptica (DUP). Embora não seja

tão comum como as úlceras duodenais, úlceras gástricas são frequentemente mais

propensas a desenvolver malignidade (FREINSTEIN, 2010).

No estômago, as úlceras localizam-se mais frequentemente no antro (60%) e

na junção do antro com o corpo (25%). Apesar de sua natureza robusta e

multifacetada, muitos fatores diretamente relacionados à deficiência na defesa da

mucosa podem alterar a barreira epitelial e incentivar a formação da lesão, dentre os

mais importantes estão: secreção ácida, bactérias e seus produtos, anti-

inflamatórios não esteroides, álcool, espécies reativas de oxigênio, bem como

diferentes compostos químicos. Seus efeitos sobre a barreira gástrica representam

importantes mecanismos de patogênese da úlcera gástrica, gastrite crônica e outras

doenças gástricas (TULASSAY; HERSZÉNYI, 2010).

Durante décadas a secreção gástrica foi consagrada como agente causador

da úlcera, uma vez que o manejo terapêutico baseado na sua redução apresentava


30/88

30

efeitos satisfatórios, sendo intensamente estudados os mecanismos pelos quais o

ácido clorídrico produziria a úlcera. Com o advento de novas terapêuticas e a

descoberta da importância de Helicobacter pylori na patogênese, retirou-se o foco da

secreção como agente único, embora a presença de hipersecreção de ácidos

continua a ser uma condição necessária para a produção da úlcera e uma variedade

de distúrbios gastrointestinais comuns (GUSTAFSON; WELLING, 2010).

Apesar de facilitar os processos digestivos e absortivos, a secreção ácida,

quando em níveis elevados, sobrecarrega o sistema de defesa da mucosa, levando

ao desenvolvimento, além da úlcera, de doenças como refluxo gastroesofágico e

esôfago de Barrett. O provável mecanismo da lesão se dá por acesso ao conteúdo

luminal por canais abertos na camada de muco criados pela relativa alta pressão

hidrostática intraglandular gerada durante a hipersecreção (JOHANSSON;

SYNNERSTAD; HOLM, 2001).

Outro importante agente etiológico é a bactéria H. pylori , apresentando

prevalências superiores a 90% em países em desenvolvimento e constituindo um

importante problema de saúde pública. Este bacilo gram-negativo sobrevive mal no

lúmen gástrico, porém multiplica-se eficientemente na mucosa gástrica e nas

proximidades, ou até mesmo em anexo a camada epitelial. Por meio da produção deurease, a H. pylori consegue criar um microambiente neutro em meio à acidez

gástrica. Os metabólitos da produção de urease são extremamente tóxicos para o

epitélio gástrico, desencadeando o mecanismo ulcerativo. Dos indivíduos

acometidos, 10% a 15% desenvolvem úlcera e 1% a 2%, um processo neoplásico

(HANDA; NAITO; YOSHIKAWA, 2010; ERNEST; GOLD, 2000).

A utilização de medicamentos do tipo anti-inflamatórios não esteroides (AINE)

também é um fator que predispõe o processo ulcerogênico. Os AINE estão entre osmedicamentos mais utilizados no mundo sendo que 90% das prescrições são

destinadas a pessoas com mais de 65 anos devido ao aumento da incidência de

doenças reumáticas. O principal mecanismo por meio do qual os AINE provocam

úlceras e complicações gastrointestinais é provavelmente por inibição da

ciclooxigenase (COX), uma enzima chave na biossíntese de prostaglandinas (PG)

(LAINE et al., 2007).

Há duas isoformas da COX, a COX1 e a COX2. A isoforma COX1 é expressa

na maioria dos tecidos, produzindo as prostaglandinas que desempenham um papel

essencial na proteção do estômago por estimular a síntese e secreção de muco e


31/88

31

HCO3-, o aumento no fluxo de sangue da mucosa e a proliferação epitelial

(SULEYMAN; AKCAY; ALTINKAYNAK, 2002). A COX2 tem pouca ou nenhuma

expressão na maioria dos tecidos, mas é rapidamente induzida em resposta a

estímulos inflamatórios. Por meio do mecanismo dos AINE, inibindo as COX de

forma não seletiva, cria-se um ambiente gástrico que é mais suscetível ao ataque

por fatores endógenos e exógenos (BIAS et al., 2004).

O álcool figura como importante fator etiológico devido ao amplo consumo

mundial. Entre os vários sistemas de órgãos que medeiam os efeitos do álcool sobre

o corpo humano, o trato gastrointestinal desempenha um papel particularmente

importante. O álcool pode interagir diretamente com a mucosa gástrica, ou pode

atuar por meio de um mecanismo mais geral que afeta a liberação de hormônios e a

regulação das funções nervosas envolvidas na secreção de ácido. A formação de

úlcera por efeito do etanol é uma resposta inflamatória, sendo a injúria iniciada pela

mediação de fatores inflamatórios que induzem vasoconstrição, isquemia e morte

celular (DUFFIN; SHAW, ROSSI, 2008).

A administração intragástrica de etanol em ratos produz lesões na mucosa

gástrica que são comumente utilizadas no estudo da patogênese da doença e

desenvolvimento de novos métodos terapêuticos. As lesões são produzidas deforma confiável e simples utilizando-se volumes variados de etanol concentrado.

Dependendo da quantidade administrada, 10 a 40% das regiões glandulares do

estômago tornam-se cobertas de erosões hemorrágicas quando examinadas cerca

de uma a duas horas após a indução (SZABO et al., 1985).

A atividade neutrofílica é outro fator comumente relacionado à injúria gástrica,

e está intimamente ligado a dano gerado pelo consumo de etanol. Os neutrófilos e

os fatores deles derivados desempenham um importante papel em diversas formasde modelos de ulceração gastrointestinal e inflamação. O dano epitelial mais

comumente relacionado à atividade neutrofílica é a isquemia e o dano hemorrágico.

Fatores expressos pelos neutrófilos como integrinas reagem com moléculas de

adesão endotelial desempenhando importante papel na infiltração neutrofílica

(KVIETYS et al., 1990, KUJBIDA et al., 2008).

A elastase de neutrófilo humano (ENH) presente nos grânulos primários dos

leucócitos polimorfonucleares, constitui-se, em condições fisiológicas, um importante

mecanismo de defesa contra microrganismos invasores. Devido à importância de

manter sua atividade equilibrada, o organismo dispõe de proteínas inibidoras da


32/88

32

elastase, como a α1-antitripsina, α2-macroglobulina e o inibidor de leucoprotease

secretória (SHAPIRO, 2002; SHAPIRO et al., 2003), que limitam a área de ação da

enzima, devido à sua ubiquidade diminuindo assim a exposição de tecidos

saudáveis e proteínas de vias biológicas importantes à degradação desnecessária.

Esse equilíbrio inibidor-elastase é rompido no processo inflamatório, culminando em

danos teciduais severos (TRAVIS; SALVESEN, 1983; BODE et al., 1989).

O desenvolvimento de isquêmia-reperfusão causada na mucosa por uma

injúria externa com consequente ativação neutrofílica, desempenha papel

fundamental no dano epitelial. Os neutrófilos uma vez ativados liberam enzimas que

podem levar a alterações na permeabilidade da mucosa. A mieloperoxidase (MPO)

está relacionada ao dano por sua atuação na geração de ERO (TAKEUCHI et al.,

1998). Além da MPO, a elastase tem potencial ação lesiva por catalisar a

degradação da elastina, importante proteína envolvida na integridade da matriz

tecidual. A redução da atividade anti-inflamatória dos neutrófilos por meio da

utilização de inibidores externos é vista como uma terapêutica promissora na

prevenção da úlcera bem como outras doenças inflamatórias (ROCHA et al., 2011).

1.3.2 Sintomatologia e Tratamento

O sintoma predominante da úlcera gástrica é a dor epigástrica, a qual pode

ser acompanhada por outros sintomas dispépticos como inchaço, saciedade precoce

e náuseas. Entretanto, as úlceras crônicas podem ser assintomáticas; em particular,

esta ausência de sintomas é observada nas úlceras induzidas por AINE, onde o

sangramento ou perfuração é a primeira manifestação clínica da doença

(MALFERTHEINER et al., 2009).

Por muito tempo a úlcera foi controlada de maneira cirúrgica, o que resultava

em altas taxas de morbidade e mortalidade. A maioria das cirurgias realizada

atualmente é de caráter de urgência, devido a hemorragias e perfurações, e

procedendo-se a cirurgia de controle dos danos, não sendo realizada cirurgia

redutora de ácido. Devido aos bons resultados do tratamento médico, o tratamento

cirúrgico da úlcera não complicada tornou-se obsoleto. Hoje, com as terapêuticas

disponíveis, é possível tratar conservadoramente cerca de 90% dos casos (GOMES;

MARQUES; PINHEIRO, 2013).


33/88

33

A supressão farmacológica eficaz da secreção de ácido iniciou em meados da

década de 70, com a introdução dos antagonistas de receptores histaminérgicos H2.

A secreção gástrica de ácido produzido pelas células parietais da mucosa do

estômago é controlada pela histamina, gastrina, acetilcolina e prostaglandinas (E2 e

I2). A ligação da histamina, acetilcolina ou gastrina a seus receptores produz a

ativação de uma bomba de prótons H/K-ATPase, que secreta HCl para a luz do

estômago, enquanto a ligação das prostaglandinas aos seus receptores diminui a

produção de ácido gástrico (ARAWAKA et al., 2012).

Os bloqueadores de receptor histaminérgico H2 agem como antagonistas

reversíveis de receptores H2 situados no estômago, em vasos sanguíneos e em

outros locais. Possuem a ação de inibir totalmente a secreção de ácido clorídrico

induzido por histamina ou gastrina. Exemplos de fármacos amplamente

comercializados são a ranitidina, a cimetidina e a famotidina. A ranitidina tem ação

mais prolongada do que a cimetidina, e cinco a dez vezes mais potente. A

famotidina é três a dez vezes mais potente do que a ranitidina, e também tem a ação

prolongada (CHUBINEH; BIRK, 2012). Até a década de 90 foram os fármacos mais

prescritos no mundo, reduzindo as cirurgias em mais de 80% (JAIN et al., 2007).

Os antagonistas dos receptores H2 foram gradualmente substituídos por umaclasse de drogas inibidoras de ácido mais potente, os inibidores da bomba de

prótons (IBP). Esses fármacos pertencentes à classe dos benzimidazóis foram

substituídos, sendo comercialmente conhecidos como omeprazol, lanzoprazol,

pantoprazol e esomeprazol. Os IBP são medicamentos que bloqueiam seletivamente

a bomba de prótons (H+, K+-ATPase) da célula parietal, suprimindo a secreção de

íons hidrogênio para a luz do estômago (NAJM, 2011).

Em pH neutro, esses fármacos são quimicamente estáveis, lipossolúveis,formando bases fracas e sem atividade inibidora. Ao atingir as células parietais

gástricas, se difundem para os canalículos secretores onde ficam retidos, tornando-

se protonados. O agente protonado se rearranja para formar um ácido sulfênico e

uma sulfenamida. A sulfenamida interage de forma covalente com os grupamentos

sulfidrila em pontos críticos do domínio extracelular da bomba protômica da

superfície da membrana (NAJM, 2011).

Um terceiro grupo de drogas é direcionado para o reforço da barreira mucosa,

do qual se destaca o misoprostol, um análogo de prostaglandina, único do grupo

aprovado para comercialização, necessitando de altas dosagens para surtir efeito


34/88

34

biológico (MALFERTHEINER et al., 2009). Os análogos das prostaglandinas são

menos eficazes do que os antagonistas H2. Assim, tem sido recomendado somente

em pacientes que necessitam do uso de AINE prolongado em função do risco de

desenvolverem úlcera péptica, principalmente em idosos ou pacientes com

complicações ulcerosas. Quando a H. pylori está presente, o tratamento enfoca a

sua erradicação com o uso dessas drogas combinadas com antibióticos (NAJM,

2011).

Entretanto, apesar da grande efetividade apresentada pelos antagonistas dos

receptores H2 e IBP, esses medicamentos podem apresentar alguns inconvenientes

quando utilizados por longos períodos devido à intensa supressão do ácido. Dentre

esses efeitos, podemos citar a osteoporose, riscos aumentados de infecções

entéricas, metabolismo alterado de outros medicamentos, e desenvolvimento de

pólipos gástricos que podem evoluir para câncer gástrico (CHUBINEH; BIRK, 2012;

ROHSS; HASSELGREN; HEDENSTROM, 2002).

Constipação, cefaleia e tonturas são efeitos colaterais advindos do uso de

antagonistas dos receptores H2. Em pacientes idosos o uso prolongado de

cimetidina pode provocar confusão e alucinações devido à ação no sistema nervoso

central. A cimetidina também pode causar efeitos endócrinos como ginecomastia egalactorréia. Cefaleia, diarreia e rash cutâneo, prurido, vertigem, fadiga, obstipação,

e vômitos, flatulência, artralgia, mialgia são efeitos relatados no uso de IBP.

Aumento do risco de infecções gastrointestinais pode ocorrer em decorrência da

redução da produção de ácido. No Brasil, a venda de medicamentos à base de

misoprostol está restrito e sujeito a controle criterioso devido ao seu uso clandestino

como agente abortivo (CHUBINEH; BIRK, 2012; FITTIN; WISEMAN, 1996; BALDI;

MALFERTHEINER, 2003).Uma variedade de produtos botânicos tem sido relatada na literatura pela sua

atividade antiulcerogênica, sendo esta constatação baseada principalmente na ação

farmacológica em animais experimentais (GADEKAR et al., 2010). Existem vários

produtos botânicos com potenciais aplicações terapêuticas, devido à sua alta

eficácia e baixa toxicidade. Destes, destacam-se substâncias extraídas de plantas,

isoladas e atestados os seus efeitos biológicos, muitas vezes comprovando o seu

emprego na medicina popular, como o exemplo do Plaunotol, um diterpeno acíclico

extraído de uma planta chamada plau noi, muito utilizada como agente


35/88


36/88

36

3.4.25). Serinoproteases, treoninoproteases e cisteinoproteases são cataliticamente

muito diferentes das proteases aspárticas e as metaloproteases em que o nucleófilo

presente no sítio catalítico do primeiro grupo é parte de um aminoácido, enquanto

que nos dois últimos, é uma molécula de água ativada (HARTLEY, 1960).

Diferentes tipos de proteases possuem uma proximidade evolutiva visualizada

por semelhanças estruturais. De acordo com a sequência aminoacídica, as

proteases podem ser agrupadas em famílias ou clãs. As proteases que

compartilhavam homologia entre si foram colocadas dentro de uma mesma família, e

as famílias as quais se acreditava ter um ancestral comum, apesar da divergência

evolutiva, foram agrupadas dentro do mesmo clã. A clara evidência entre clã e

família está contida na semelhança da estrutura tridimensional, a qual se relaciona

diretamente a disposição de resíduos de aminoácidos na cadeia polipeptídica

(RAWLINGS et al., 1993; BARRETT, 2001).

De acordo com a reação catalisada, as proteases estão divididas em dois

grupos: as exopeptidases, que clivam um ou poucos resíduos de aminoácidos da

extremidade N- ou C- terminal, e as endopeptidases, que atuam em ligações

internas de cadeias polipeptídicas. Em relação à nomenclatura, o termo

“proteinases” refere-se apenas às endopeptidases, enquanto que “proteases” e“peptidases” incluem, além das endopeptidases, as exopeptidases. A clivagem das

ligações peptídicas não é limitada à transformação de proteínas maduras em

aminoácidos livres, como também é relevante à modificação e maturação proteica

(BARRETT, 2001).

As serinoproteases são um grupo diverso de enzimas que são caracterizadas

pela presença do aminoácido serina no sítio ativo, o qual é formado por uma tríade

catalítica representada pelos resíduos de Serina, Histidina e Asparagina. Quase umterço das proteases pode ser classificada como serinoproteases e estão presentes

em importantes processos fisiológicos como digestão, proliferação e diferenciação

celular, inflamação, reabsorção óssea, coagulação sanguínea e respostas imunes,

como fatores do complemento B, C e D (SIM; TSIFTSOGLOU, 2004).

O mecanismo básico de ação de serinoproteases envolve a transferência do

grupamento acil de um substrato para um grupo funcional da enzima. Os dois

passos básicos de catálise realizados por este grupo de enzimas incluem, primeiro,

a formação de um éster entre o átomo de oxigénio de serina e o grupamento acil do

substrato, o qual produz um intermediário tetraédrico e libera a parte amino do


37/88

37

substrato e, em seguida, o ataque da água no intermediário acil-enzima, que quebra

e libera o produto acídico, enquanto ocorre a regeneração da forma original da

enzima (ANTÃO; MALCATA, 2005).

Dentre os exemplos clássicos de serinoproteases, destacam-se a tripsina, a

quimotripsina e a elastase, que pertencem a uma superfamília de proteínas, que

parecem ter evoluído de um ancestral comum, por apresentarem semelhanças na

estrutura e mecanismo de reação e são responsáveis para a digestão inicial de

proteínas no intestino da maioria dos animais superiores (GARCIAOLMEDO et al.,

1987).

In vivo, as serinoproteases atuam clivando cadeias polipeptídicas

essencialmente intactas em peptídeos curtos, que então sofrem ação de

exopeptidases para gerar os aminoácidos, os produtos finais de digestão de

proteínas. As serinoproteases se distuinguem com base na sua especificidade:

tripsina cliva especificamente na porção C-terminal entre resíduos que possuem

uma cadeia lateral básica (Lys, Arg); quimotripsina mostra uma preferência para a

clivagem C-terminal de resíduos de aminoácidos que possuem a cadeia lateral

hidrofóbica (Phe, Tyr, Leu); e elastase que mostra uma preferência pela clivagem na

porção C-terminal de resíduos que possuem uma pequena cadeia lateral neutra(Ala, Gly) (RYAN, 1990).

1.5 INIBIDORES DE PROTEASES

Qualquer composto que reduza a taxa de catálise de um substrato é, em

princípio, um inibidor enzimático. Proteínas capazes de formar complexos nas

enzimas proteolíticas inibindo a atividade das mesmas são denominadas inibidores

de proteases. Estes são amplamente distribuídos entre plantas, animais e

microrganismos, podendo possuir massas moleculares que variam entre 10 e 90

kDa (NEURATH, 1989; RAO et al., 1998).

Os inibidores de proteases atuam na regulação da proteólise, e são

importantes para proteger fluídos ou tecidos de degradação por atividades

proteolíticas indesejadas, principalmente os que estão sujeitos à ação de proteases

externas, a exemplo do sangue, ácinos pancreáticos e tecidos de armazenamento

de plantas (NEURATH, 1990). As famílias de inibidores encontrados são específicas

para quatro classes mecanicistas de enzimas proteolíticas: serina, cisteína,


38/88

38

aspárticas e metaloproteases. A expressão dos inibidores varia de acordo com o

estado fisiológico do organismo. Em plantas, os níveis destes inibidores dependem

da fase de maturação, localização do tecido, tempo de colheita e de

armazenamento, como também da variedade da planta, com a possível coexistência

de diferentes classes de inibidores, bem como uma variedade de isoformas num

único tecido ou órgão (SANTOS et al., 2012).

Existem duas amplas classes de inibidores de enzima: Os reversíveis, cuja

interação com a enzima é estabilizada pela somação de ligações fracas, e os

irreversíveis, que se ligam a enzima de forma covalente, podendo até destruir o

grupamento funcional da mesma. Os inibidores que realizam interações reversíveis

são agrupados quanto ao tipo de interação, esta podendo ser competitiva, não

competitiva e mista. Inibidores competitivos competem com o substrato pelo sítio

ativo da enzima por muitas vezes possuir estrutura similar ao substrato. Os

inibidores não competitivos ligam-se a um sítio distinto do sítio ativo do substrato, e

diferentemente dos inibidores competitivos, se ligam ao complexo enzima-substrato.

Já nos inibidores mistos podem se ligar tanto a enzima livre como ao complexo

(NELSON; COX, 2011).

As diversas classes de inibidores foram subdivididas em várias famíliasbaseando-se em características tais como homologia entre os membros, relações

topológicas entre pontes dissulfeto e localização do sítio ativo. A classe de inibidores

mais bem caracterizada é a das serinoproteases, amplamente distribuída no reino

vegetal, principalmente em plantas das famílias brassicaceae, curcubitaceae,

salicicaceae, glycinaceae, leguminosae, solanaceae, fabaceae. Estes inibidores

foram agrupados em oito subfamílias: Bowman –Birk, Kunitz, Batata I, Batata II,

Abóbora, Cereal, Taumatina e RagiA1. As mais bem caracterizadas famílias deinibidores de serinoproteases são os inibidores do tipo Kunitz e Bowman-Birk

(Tabela 1) (HAQ; ATIF; KHAN, 2004; RAMOS et al., 2008).

Os inibidores de serinoproteases do tipo Kunitz possuem massa molecular de

18 a 22 kDa, com estrutura primária composta por cerca de 181 resíduos de

aminoácidos, um único sítio ativo que se liga a tripsina, uma ou duas cadeias

polipeptídicas e um baixo teor de cistina. Geralmente as pontes dissulfeto são

estabilizadas por quatro resíduos de cisteína, cuja ligação uma vez rompida,

acarreta perda da atividade biológica de inibição. Já os inibidores do tipo Bowman-

Birk apresentam baixa massa molecular, a qual varia entre 8 e 10 kDa, um alto teor


39/88

39

de cistina e dois sítios ativos por molécula, cada um com uma afinidade por uma

faixa de serinoproteases como tripsina, quimotripsina, elastase e calicreína.

Diferente dos inibidores tipo Kunitz, que são codificados por um único gene, a família

Bowman-Birk é codificada por pelo menos três genes para a síntese das suas

isoformas (HABIB; FAZILLI, 2007; BIRK, 1985).

TABELA 1. Família de inibidores de proteinases de plantas

Proteinases Classes de inibidores Famílias de inibidores

Serínicas Inibidores de proteinasesserínicas

Bowman-Birk

KunitzBatata I

Batata II

Superfamília de Cereais

Taumatina

RagiA1/milho

Cisteínicas Inibidores de proteinases

cisteínicas

Fitocistatinas

Aspárticas Inibidores de proteinasesaspárticas

Inibidores de proteinasesaspárticas

Metalo-proteinases Inibidores de metalo-proteinases

Inibidores de carboxipeptidases A e B

Fonte: RYAN, 1990

1.6 Erythrina v elut ina

A grande diversidade de plantas atualmente conhecidas e utilizadas pelo

homem é resultado da histórica procura em seu ambiente natural de meios que

viessem suprir suas necessidades alimentícias, industriais, médicas e até mesmo

ritualísticas. A partir do século XIX, com o avanço na pesquisa de produtos naturais,

começou-se a ter ideia do rico arsenal de compostos bioativos presentes na

natureza, cuja atividade biológica era continuamente confirmada cientificamente

(MIGUEL; MIGUEL, 2004).


40/88

40

Dentre as plantas de interesse científico, o gênero Erythrina destaca-se pelo

grande potencial para prospecção de moléculas com ampla gama de atividades

biológicas. É composto por plantas arbóreas da família Fabaceae, subfamília

Papillionoideae; Compreende cerca de 120 espécies tropicais em regiões quentes,

temperadas e é dividido em cinco subgêneros e 26 seções. No Brasil, existem 12

espécies conhecidas, das quais oito estão localizadas no nordeste e em Minas

Gerais (LORENZI; MATOS, 2008). A espécie E. velutina, popularmente conhecida

como “mulungu”, “suinã”, “canivete” ou “corticeira”, é um arbusto pequeno, de caule

tortuoso e flores vermelho-alaranjadas (Figura 4) (EPAMIG, 1993).

Figura 4: Erytrina velutina. A) Árvore. B) Flores. C) Sementes.

As várias espécies de Erythrina têm sido amplamente exploradas em estudos

das mais diversificadas aplicações biológicas. Um estudo sobre a atividade do

extrato alcóolico de E. velutina no sistema nervoso demonstrou a presença de efeito

ansiolítico com doses agudas e crônicas do extrato em modelo animal para

ansiedade, utilizando o teste T-maze (RIBEIRO et al., 2006). Outro estudo realizado

com a administração intraperitoneal de um extrato aquoso de E. velutina demonstrou

prolongamento da duração do sono induzido por pentobarbital de sódio em doses

mais elevadas e bloqueou a aquisição de memória em modelo de choque na pata

em doses mais baixas (DANTAS et al., 2004).

Essa atividade biológica está atrelada à presença de alcalóides e flavonóides,

particularmente isoflavonóides nas sementes de E. velutina, corroborando assim o

uso na medicina popular da planta como tranquilizante natural (CHACHA; BOJASE-


41/88


42/88

42

inflamatório, a ENH, ressalta-se a necessidade de explorar essa ação em outros

modelos experimentais de inflamação.


43/88

43

JUSTIFICATIVA

Elastase de Neutrófilos Humano (ENH) é uma protease que quando hiperativa

está envolvida na destruição de tecidos e inflamação que caracterizam muitas

doenças, incluindo enfisema hereditário, doença pulmonar obstrutiva crônica, fibrose

cística, síndrome da angústia respiratória do adulto, lesão de isquemia-reperfusão,

artrite reumatoide e úlcera gástrica. Assim, ENH tem sido objeto de extensa

pesquisa para identificar inibidores potentes visando combater a sua ação destrutiva

e inflamatória. A pesquisa na área e a procura dessas moléculas se voltam à busca

de novas fontes ou a nova aplicação de moléculas já bem estudadas, sejam elas

sintéticas, recombinantes ou de ocorrência natural (HENRIKSEN, 2014).

Os inibidores de serinoproteases, moléculas de ocorrência extremamente

comum, os quais vêm sendo isoladas, purificadas e caracterizadas de um grande

número de organismos, principalmente de plantas, concorrem como fortes

candidatos em função de seu amplo espectro de ações heterólogas em processos

biológicos de interesse científico, dentre eles o processo inflamatório (VALUEVA;

MOSOLOV, 2004; CHRISTELLER, 2005; HAQ; ATIF; KHAN, 2004). Muitos estudos

demonstraram que inibidores de serinoproteases têm a capacidade de inibir a ENH.

Muitos extratos de sementes de leguminosas, tais como aqueles obtidos a partir de

feijão lima (Phaseolus limensis), feijão comum (Phaseolus vulgaris), feijão adzuki

(Phaseolus angularis), lentilha (Lens Culinares), ervilha (Pisum sativum) e de

tamarindo (Tamarindus indica) mostraram ser ricas fontes desses inibidores com

potencial anti-inflamatório (HOJIMA; PISANO; CHOCRANE, 1983; LARIONOVA,

1993; FOOK et al., 2005).

De todos os trabalhos envolvendo E. velutina, os estudos realizados por Mo

nteiro (2011) e Machado et al., (2013) são de especial interesse. Monteiro (2011)

purificou um inibidor de quimotripsina com atividade antielastásica, avaliou seus

parâmetros cinéticos para ENH, tolerância em diferentes pH e temperaturas,

demonstrou seu potencial anti-inflamatório e sua ação inibitória sobre a ENH, além

da ausência de toxicidade celular. Machado (2012) purificou um inibidor de tripsina,

com atividade anti-inflamatória por redução da liberação de citocinas, entretanto suaatividade antielastásica reduzia significativamente junto com a purificação, sendo


44/88

44

marcante no isolado proteico com atividade antitríptica. O potencial efeito em

modelos que envolvam dano tecidual por ação da ENH atestado por esses estudos

despertou o interesse em utilizar isolados proteicos contendo os respectivos

inibidores, norteando a elaboração deste trabalho.


45/88

45

2. OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Avaliar o efeito gastroprotetor de isolados proteicos com atividades antitríptica

e antiquimotríptica de sementes de Erythrina velutina em modelo experimental de

úlcera gástrica induzida por etanol.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Obter isolados proteicos com atividade antitríptica e antiquimotríptica de

sementes de Erythrina velutina;

Caracterizar o isolado proteico com atividade antitríptica quanto a estabilidade

térmica e a diferentes pHs;

Estimar a massa molecular das proteínas do isolado proteico com atividade

antitríptica;

Caracterizar a especificidade para a enzima elastase neutrofílica do isoladoproteico com atividade antitríptica – IC50 e KI;

Analisar o dano tecidual da mucosa gástrica de ratas wistar que receberam os

isolados proteicos com atividade antitríptica e antiquimotríptica

macroscopicamente e histomorfológicamente;

Avaliar a toxicidade resultante da administração dos isolados proteicos com

atividade antitríptica nas concentrações analisadas.


46/88

46

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 MATERIAL

3.1.1 Sementes

As sementes de Mulungu (Erythrina velutina) foram gentilmente fornecidas

pelo banco de sementes da Floresta Nacional de Nísia Floresta, Instituto Chico

Mendes de Conservação da Biodiversidade - ICMBio/MMA.

Figura 5: Erythrina velutina. A) Sementes. B) Cotilédones. C) Farinha. Fonte: Monteiro, 2011.

3.1.2 Animais

Ratas (Rattus norvegicus) da linhagem Wistar , com dois meses de idade,

pesando entre 180 –220 g foram obtidas no biotério da Universidade Potiguar-

RN/Brasil. Os animais foram mantidos em gaiolas coletivas com, no máximo, seis

animais por gaiola, em fotoperíodo de 12/12 horas, à temperatura aproximada de 25

± 2 ºC, água e alimentos ad libitum. Todos os experimentos envolvendo animais

estão de acordo com as normas da comissão de ética no uso de animais (CEUA) –

Universidade Federal do Rio Grande do Norte sob protocolo de aprovação 042/2009.


47/88


48/88

48

3.1.4 Equipamentos

Agitador Magnético Tecnal TE-081;

Balança analítica eletrônica Tecnal classe II;

Banho – Maria Tecnal – Te 056;

Centrífuga HITACHI CR 21;

Centrífuga Mikro 200R Eppendorf;

Concentrador 5301 Eppendorff;

Espectrofotômetro U-2000 (HITACHI);

Liofilizador L108;

Leitor de microplaca com incubação (Bio-Tek PowerWave HT - USA);

Moinho refrigerado TE 631/2 TECNAL;

Microcentrífuga Eppendorf 5410;

Microscópio Trifocal Leipzig;

Estereoscópio;

Phmetro PHTEK;

Purificador de água Milli-Q Water System da Millipore Corp. (Bedford, MA,

USA);

Sistema de Eletroforese Unidimensional.

3.2 MÉTODOS

3.2.1 Obtenção do extrato bruto de E. Velutin a

As sementes de Mulungu (E. velutina) foram descascadas e os cotilédones

triturados em um processador refrigerado (6 oC) até a obtenção de uma farinha de

granulação fina, a qual foi padronizada com uma peneira de 40 mesh. Em seguida, a

farinha foi homogeneizada em tampão Tetraborato de sódio 20 mM, pH 7,5 na

proporção 1:10 (p/v) sob agitação constante por 3 horas à temperatura ambiente. O

homogenato foi centrifugado a 8.000 x g por 30 minutos a 4 0C. O sobrenadante

resultante dessa centrifugação foi denominado extrato bruto (EB).


49/88

49

3.2.2 Fracionamento do extrato bruto proteico de sementes de E.velut ina por precipitação com sulfato de amônio

O extrato bruto foi fracionado por meio da precipitação com sulfato de amônioem três percentuais de saturação: 0 –30%, 30 –60%, 60 –90%. Após cada etapa de

precipitação, a mistura permaneceu a 4 0C por aproximadamente 24 horas e

posteriormente foi centrifugada a 8.000 x g por 30 minutos a 4 0C. Os precipitados

obtidos foram ressuspensos em tampão Tetraborato de sódio 20 mM, pH 7,5 e

submetidos à diálise por aproximadamente 48 horas contra o mesmo tampão (Figura

6). Após a diálise, as frações denominadas como F1(0-30%), F2(30-60%) e F3(60-

90%) foram congeladas a -20 ºC.

Figura 6: Esquema de extração em tampão e fracionamento com sulfato de amônio em três

percentuais de saturação (0 –30%, 30 –60%, 60 –90%) das sementes de Mulungu (E. velutina). A

extração e o isolamento seguiram a metodologia descrita por Monteiro (2011) e Machado (2012).


50/88

50

3.2.3 Quantificação de proteínas

As proteínas foram quantificadas pelo método de Bradford (1976), utilizando

albumina sérica bovina (BSA) como padrão, sendo as leituras das absorbânciasrealizadas em espectrofotômetro em comprimento de onda de 595 nm.

3.2.4 Preparo das soluções usadas como substrato

Azocaseína a 1% (substrato proteico para quimotripsina) foi preparada

pesando-se 1 g de azocaseína, que foi dissolvida em 100 mL de tampão Tris-HCl 50

mM, pH 7,5 e fervida por cerca de 15 minutos, após resfriamento o volumeevaporado foi completado com água destilada. A solução foi conservada no

congelador até sua utilização.

BApNA a 1,25 mM (substrato sintético específico para tripsina) foi dissolvido

em DMSO (1%, v/v) e o volume completado para 100 mL com tampão Tris-HCl 50

mM, pH 7,5.

MeOSucAAPVpNA a 5 mM (substrato sintético para elastase), foi preparado

uma solução de 15 mM (solução estoque) em DMSO 100%. Posteriormente, para os

ensaios, foi preparada uma solução de 5 mM diluída em PBS 150 mM, pH 7,4.

3.2.5 Atividade antiquimotríptica

As atividades inibitórias sobre a quimotripsina do EB e das frações foram

determinadas utilizando azocaseína como substrato (XAVIER-FILHO et al., 1989).

Alíquotas de 10 L de solução de quimotripsina bovina (0,1 mg/mL em tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, contendo CaCl2 20 mM) foram pré-incubadas com tampão Tris-

HCl 50 mM, pH 7,5, contendo CaCl2 20 mM e 100 L das amostras por 15 minutos a

37 0C. Após esse período a reação foi iniciada adicionando-se 200 L de azocaseína

a 1%. Decorridos 30 minutos, a reação foi interrompida adicionando-se 300 L de

solução de TCA a 20%. A mistura de reação foi centrifugada a 12000 x g por 10

minutos e o sobrenadante alcalinizado com NaOH 2 N na proporção de 1:1. A

absorbância foi medida em espectrofotômetro na faixa de comprimento de onda de


51/88

51

440 nm. Provas em branco foram realizadas e os ensaios foram feitos em triplicata.

Os resultados foram expressos em percentual de inibição.

3.2.6 Atividade antitríptica

As atividades antitrípticas do EB e das frações foram determinadas utilizando

BApNA como substrato (KAKADE et al., 1969). Alíquotas de 10 L de solução de

tripsina bovina (0,3 mg/mL em tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,5) foram pré-

incubadas, por 10 minutos a 37 0C, com 120 L de HCl 2,5 mM, 270 L de tampão

Tris-HCl, 50 mM, pH 7,5 e 100 L das amostras. Após esse período a reação foi

iniciada adicionando-se 500 L de BApNA a 1,25 mM. A reação prosseguiu por mais

15 minutos nas mesmas condições de incubação, sendo interrompida adicionando-

se 120 L de ácido acético 30%. A formação de p-nitroanilida foi monitorada em

absorbância por espectrofotômetro em comprimento de onda de 410 nm. Provas em

branco foram realizadas e os ensaios foram feitos em triplicatas. Os resultados

foram expressos em percentual de inibição.

3.2.7 Atividade antielastásica neutrofílica

Para o ensaio de inibição da ENH foi determinada utilizando

MeOSucAAPVpNA com substrato (JOHANSSON et al., 2002). Alíquotas de 10 µL de

solução da elastase neutrofílica sintética (0,4 µg/µL em PBS 150 mM, pH 7,4) foram

pré-incubada com 50 µL de IPAT e IPAQ (10 µg) e 680 µL de tampão PBS 150 mM,

pH 7,4 por 15 minutos a 37 °C. Em seguida a reação foi iniciada com a adição de 5

µL de substrato MeOSucAAPVpNA a 5 mM. Após 2 horas a reação foi parada com aadição de 250 µL de ácido cítrico 2%. Os tubos foram centrifugados por 10 minutos

a 10.000 x g a 25°C, e então foi realizada a leitura da absorbância no

espectrofotêmetro a 405 nm. Provas em branco foram realizadas e os ensaios foram

feitos em triplicatas. Os resultados foram expressos em percentual de inibição.

3.2.8 Cromatografia de Afinidade em Tripsina-Sepharose CNBr 4B

A cromatografia foi realizada seguindo metodologia descrita por Machado

(2012). Cerca de 7 mg da F2 (30-60%), que apresentou a melhor atividade


52/88

52

antiríptica, foram aplicados em uma coluna de afinidade, preenchida com resina

Sepharose derivatizada com tripsina. A coluna foi eluída com tampão Tetraborato de

sódio 2,0 x 10-2 M, pH 7,5 para a remoção do material não-retido. As proteínas

adsorvidas na matriz foram eluídas com HCl 5,0 x 10 -3 M e coletadas em alíquotas

de 5 mL a um fluxo de 2 mL/min. O conteúdo proteico das frações coletadas foi

acompanhado por espectrofotometria com leituras de absorbância em comprimento

de onda de 280 nm. As frações obtidas por cromatografia de afinidade foram

dialisadas contra água, liofilizadas e submetidas a ensaios de inibição de tripsina

utilizando BApNA, conforme descrito no item 3.2.6. Em seguida o material foi

congelado e armazenado em freezer a -20°C. Já o material não retido foi utilizado

para obtenção do isolado proteico com atividade antiquimotripsina.

3.2.9 Cromatografia de Afinidade em Quimotripsina-SepharoseCNBr 4B

A cromatografia foi realizada seguindo metodologia descrita por Monteiro

(2011). O material não retido obtido de duas cromatografias de tripsina-sepharose,

com cerca de 8,0 mg de proteína, foi aplicado em coluna de afinidade preenchida

com resina Sepharose derivatizada com quimotripsina. O material foi eluído com

tampão Tetraborato de sódio 2,0 x 10-2 M, pH 7,5. As proteínas adsorvidas na matriz

foram eluídas com HCl 5,0 x 10-3 M com volume de fracionamento de 5 mL a um

fluxo de 2 mL/min. O perfil proteico foi acompanhado pela leitura da absorbância por

espectrofotometria a 280 nm. As frações obtidas por cromatografia de afinidade

foram dialisadas contra água, liofilizadas e submetidas a ensaios de inibição de

quimotripsina utilizando a Azocaseína e de tripsina utilizando o BApNA como

substratos, descritos no item 3.2.5 e 3.2.6, respectivamente. Assim, denominados de

isolado proteico com atividade antitríptica (IPAT) e isolado proteico com atividade

antiquimiotríptica (IPAQ). Em seguida o material foi congelado e armazenado em

freezer a -20 °C.


53/88


54/88

54

3.2.11 Estabilidade em variação de pH

Para avaliar a estabilidade de IPAT à var

dissertação vanessa lima

Documents