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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE GENÉTICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA
ANÁLISE DA EXPRESSÃO E LOCALIZAÇÃO SUBCELULAR
DOS HOMÓLOGOS TbEIF4G1 e TbEIF4G2 DO FATOR DE
INICIAÇÃO DA TRADUÇÃO eIF4G de Trypanosoma brucei
Rodrigo Pontes de Lima
Recife, PE 2009
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE GENÉTICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA
Rodrigo Pontes de Lima
ANÁLISE DA EXPRESSÃO E LOCALIZAÇÃO SUBCELULAR
DOS HOMÓLOGOS TbEIF4G1 e TbEIF4G2 DO FATOR DE
INICIAÇÃO DA TRADUÇÃO eIF4G de Trypanosoma brucei
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-
graduação em Genética da Universidade
Federal de Pernambuco (UFPE) como
um dos requisitos para a obtenção do
grau de Mestre em Genética.
Orientador:
Dr. Osvaldo Pompílio de Melo Neto
RECIFE, 2009
Lima, Rodrigo Pontes de Análise da expressão e localização subcelular dos homólogos TbEIF4G1 e TbEIF4G2 do fator de iniciação da traduç ão eIF4G de Trypanosoma brucei / Rodrigo Pontes de Lima. – Reci fe: O Autor, 2009. 102 folhas: il., tab. Orientador: Osvaldo Pompílio de Melo Neto.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Genética, 2009.
Inclui bibliografia.
1. Trypanossoma brucei - Genética 2. Trypanossoma b rucei - Clonagem 3. Tripanossomíase Africana 4. Doença do S ono I Título. 579.4 CDD(22.ed.) UFPE CCB – 2009- 179
AGRADECIMENTOS
Agradeço ao meu orientador, Dr. Osvaldo, pela oportunidade dada e por ser um
exemplo de pesquisador consciente, ético e dedicado e pelo amor ao seu objeto de trabalho,
uma característica nem sempre encontrada entre os pesquisadores, mas muito, muito valiosa.
Aos órgãos fomentadores de pesquisa, sem os quais seria muito mais difícil a
realização de pesquisa científica no Brasil.
Ao Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães, com todos os seus trabalhadores, onde esse
trabalho foi realizado. Em especial aos integrantes do Departamento da Microbiologia, do
NIT e do Biotério, bem como aos da Entomologia, Imunologia, LaViTE: obrigado pelo apoio
sempre diligente e carinhoso (sem vocês seria difícil a realização de tudo o que foi feito aqui).
Ao Departamento de Genética, onde foi desenvolvido o Mestrado, pelos
conhecimentos obtidos e pela oportunidade.
Aos meus familiares e amigos (todos) pelo suporte emocional, pois SEMPRE estavam
perto quando precisei de ouvidos pra reclamar de experimentos que não davam certo e
conselhos pra seguir em frente. Agradeço aqueles que sabem que são meus amigos e os que
não sabem, pois embora não saibam, tem o meu afeto e lhes dou o mesmo valor.
E finalmente, mas não menos importante, a Deus. Pois sem Ele, não haveria criação e
não haveria o que estudar. Sou grato também por ter colocado no coração das pessoas a
dúvida, a curiosidade, o inconformismo e o medo da morte, o que fez com os humanos
criassem todas as Ciências e, dentre essas, a que eu humildemente estudo: a Genética.
DEDICATÓRIA
Às pessoas sempre presentes em meu coração. Todas fizeram parte da minha vida e deixaram sua marca indelével
no tempo, no espaço e na minha história. Em especial, uma que se foi durante o desenvolvimento deste trabalho,
mas que como todas as demais que eu amo, não sai da minha alma.
“Os escritos são a descendência da alma assim como as crianças o são do corpo”.
(Clemente de Alexandria)
“O coração de um homem é uma roda de moinho que trabalha sem cessar; se nada for jogado para moer correrá o risco de que ele triture a si mesmo”.
(Lutero)
ÍNDICE
AGRADECIMENTOS.......................................................................................................... IV
DEDICATÓRIA ......................................................................................................................V
1. LISTA DE FIGURAS E TABELAS ............................................................................. VIII
1. 1. Figuras .......................................................................................................................VIII 1. 2. Tabelas..........................................................................................................................IX
2. LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS ........................................................................X
3. RESUMO...........................................................................................................................XII
3. 1. Resumo....................................................................................................................... XII 3. 2. Abstract......................................................................................................................XIII
4. INTRODUÇÃO ..................................................................................................................14
5. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ..........................................................................................16
5. 1. Ordem Kinetoplastida e Família Tripanosomatidae.....................................................16 5. 2. Trypanosoma brucei.....................................................................................................17 5. 3. Doença do sono ............................................................................................................18
5. 3. 1. Epidemiologia.......................................................................................................18 5. 3. 2. Sintomatologia......................................................................................................20 5. 3. 3. Ciclo de vida.........................................................................................................22
5. 4. Biologia molecular dos tripanossomatídeos.................................................................23 5. 4. 1. Regulação da expressão gênica em tripanossomatídeos.......................................23 5. 4. 2. Organização do genoma .......................................................................................24 5. 4. 3. RNA polimerases..................................................................................................26 5. 4. 4. Processamento em trans (trans-splicing) e poliadenilação dos mRNAs..............28 5. 4. 5. Degradação de mRNAs e grânulos de estresse e P-bodies...................................29
5. 5. Síntese protéica em eucariotos .....................................................................................31 5. 5. 1. Complexo eIF4F e PABP .....................................................................................33 5. 5. 2. Fator eIF4G ..........................................................................................................36
5. 6. Iniciação da tradução em tripanossomatídeos ..............................................................38 6. OBJETIVOS .......................................................................................................................42
6. 1. Objetivo Geral ..............................................................................................................42 6. 2. Objetivos específicos....................................................................................................42
7. MATERIAIS E MÉTODOS..............................................................................................43
7.1. Extração de DNA genômico total de Trypanosoma brucei...........................................43
7. 2. Amplificação dos genes TbEIF4G1 e TbEIF4G2 e fragmentos TbEIF4G1-HD e TbEIF4G2-HD......................................................................................................................44 7.3. Eletroeluição dos fragmentos amplificados por PCR....................................................47 7.4. Clonagem no vetor plasmidial pGEM T Easy...............................................................48 7.5. Extração de DNA plasmidial.........................................................................................49 7. 6. Análise de seqüências dos genes TbEIF4G1 e TbEIF4G2 clonados............................50 7.7. Subclonagem dos genes TbEIF4G1 e TbEIF4G2 e fragmentos TbEIF4G1-HD e TbEIF4G2-HD no vetor plasmidial pET21a ........................................................................52 7. 8. Expressão das proteínas recombinantes TbEIF4G16xHis, TbEIF4G26xHis, TbEIF4G1-HD6xHis e TbEIF4G2-HD6xHis em Escherichia coli...............................................................54 7. 9. Purificação das proteínas TbEIF4G1-HD6xHis e TbEIF4G2-HD6xHis............................55 7. 10. Imunização de coelhos para obtenção do soro policlonal ..........................................56 7. 11. Purificação dos anticorpos obtidos por imunoadsorção .............................................57 7. 12. Ensaios de reconhecimento das proteínas recombinantes pelo soro policlonal .........58 7.13. Ensaios de Imunocitoquímica......................................................................................59 7. 14. Subclonagem dos genes TbEIF4G1 e TbEIF4G2 no vetor p2216 .............................60 7.15. Superexpressão dos fatores in vivo fusionados a proteína fluorescente amarela (EYFP)..................................................................................................................................61
8. RESULTADOS...................................................................................................................63
8. 1. Análise das seqüências dos homólogos TbEIF4G1 e TbEIF4G2 do fator de iniciação da tradução eIF4G encontrados em Trypanosoma brucei....................................................63 8. 2. Amplificação dos fragmentos TbEIF4G1, TbEIF4G1-HD, TbEIF4G1Y, TbEIF4G2, TbEIF4G2-HD e TbEIF4G2Y..............................................................................................67 8. 3. Clonagem no vetor plasmidial pGEM T Easy..............................................................72 8. 4. Análise de seqüências dos genes TbEIF4G1 e TbEIF4G2 clonados em vetor plasmidial pGEM T Easy .....................................................................................................74 8. 5. Subclonagem dos genes TbEIF4G1 e TbEIF4G2 e fragmentos TbEIF4G1-HD e TbEIF4G2-HD no vetor plasmidial pET21a ........................................................................76 8. 6. Expressão das proteínas recombinantes TbEIF4G16xHis, TbEIF4G26xHis, TbEIF4G1-HD6xHis e TbEIF4G2-HD6xHis em Escherichia coli...............................................................78 8. 7. Purificação das proteínas TbEIF4G1-HD6xHis e TbEIF4G2-HD6xHis............................80 8. 8. .Ensaios de reconhecimento das proteínas recombinantes pelo soro policlonal ..........81 8. 9. Ensaios de Imunocitoquímica......................................................................................84 8. 10. Subclonagem dos genes TbEIF4G1 e TbEIF4G2 no vetor plasmidial p2216 ...........85 8. 11. Ensaios de Superexpressão do TbEIF4G2Y fusionado à EYFP................................86
9. DISCUSSÃO .......................................................................................................................88
10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...........................................................................92
Referências eletrônicas:......................................................................................................100
Lima, R. P. VIII
1. LISTA DE FIGURAS E TABELAS
1. 1. Figuras
Figura 1: Cinetoplasto de Trypanosoma lewisi ......................................................................16
Figura 2: Trypanosoma brucei ................................................................................................18
Figura 3: Distribuição e prevalência da doença do sono......................................................19
Figura 4: Mosca tsetsé.............................................................................................................20
Figura 5: Distribuição do T. brucei gambiense e T. brucei rhodesiense...............................21
Figura 6: Ciclo de vida do T. brucei .......................................................................................23
Figura 7: Disposição policistrônica dos genes nos cromossomos dos tripanossomatídeos26
Figura 8: Região STS e áreas de iniciação da transcrição...................................................27
Figura 9: Acoplamento de trans-splicing e poliadenilação em tripanossomatídeos...........28
Figura 10: Vias de degradação do mRNA em eucariotos....................................................30
Figura 11: Esquema simplificado da iniciação da tradução................................................32
Figura 12: Esquema da atuação do fator eIF4F, eIF4B e PABP na iniciação da tradução...........................................................................................................................34
Figura 13: Circularização do mRNA pela interação dos eIF4E e PABP via eIF4G.........36
Figura 14: Esquema do fator eIF4GI.....................................................................................38
Figura 15: Esquema da clonagem dos fragmentos TbEIF4G1 e TbEIF4G1-HD no vetor plasmidial pET21a..........................................................................................................53
Figura 16: Esquema da clonagem dos fragmentos TbEIF4G2Y e TbEIF4G2-HD no vetor plasmidial pET21a..........................................................................................................53
Figura 17: Esquema da subclonagem dos fragmentos TbEIF4G1Y e TbEIF4G2Y no vetor plasmidial p2216.............................................................................................................60
Figura 18: Alinhamento das seqüências de aminoácidos do EIF4G1 dos bancos de dados de genoma de T. brucei, T. cruzi e L. major ..................................................................65
Figura 19: Alinhamento das seqüências de aminoácidos do EIF4G2 dos bancos de dados de genoma de T. brucei, T. cruzi e L. major ..................................................................66
Figura 20: Extração de DNA genômico total de Trypanosoma brucei ................................68
Figura 21: Amplificações por PCR dos fragmentos TbEIF4G1, TbEIF4G1-HD, TbEIF4G1Y, TbEIF4G2, TbEIF4G2-HD e TbEIF4G2Y .............................................71
Figura 22: Eletroeluição dos fragmentos amplificados TbEIF4G1, TbEIF4G1-HD, TbEIF4G1Y, TbEIF4G2, TbEIF4G2-HD e TbEIF4G2Y .............................................72
Figura 23: Digestão das clonagens em pGEM T Easy com as enzimas de restrição BamH I e Hind III .......................................................................................................................74
Lima, R. P. IX
Figura 24: Eletroeluição das digestões das construções plasmidiais com pGEM T Easy..................................................................................................................................77
Figura 25: Digestão das clonagens em pET21a com as enzimas de restrição BamH I e Hind III e Hind III e Not I ..............................................................................................78
Figura 26: Expressão das proteínas recombinantes TbEIF4G1-HD6xHis, TbEIF4G16xHis, TbEIF4G2-HD6xHis e TbEIF4G26xHis..............................................................................79
Figura 27: Purificação das proteínas recombinantes TbEIF4G1-HD6xHis e TbEIF4G2-HD
6xHis com resina de Níquel em condições desnaturantes..............................................81
Figura 28: Reconhecimento das proteínas recombinantes TbEIF4G16xHis e TbEIF4G1-HD6xHis e TbEIF4G26xHis e TbEIF4G2-HD6xHis por seus respectivos anti-soros purificados.......................................................................................................................82
Figura 29: Reconhecimento das proteínas nativas TbEIF4G1 (A) e TbEIF4G2 (B) por seus respectivos anti-soros purificados.........................................................................83
Figura 30: Ensaio de imunocitoquímica dos TbEIF4G1 e TbEIF4G2 nas células procíclica de T. brucei ......................................................................................................................84
Figura 31: Eletroeluição dos fragmentos TbEIF4G1Y, TbEIF4G2Y e p2216 digeridos....85
Figura 32: Digestão das clonagens TbEIF4G1Y/p2216 e TbEIF4G2Y/p2216 com as enzimas de restrição Hind III e BamH I .......................................................................86
Figura 33: Ensaio de superexpressão do TbEIF4G2 fusionado à EYFP nas células procíclica de T. brucei.....................................................................................................87
1. 2. Tabelas
Tabela 1: Seqüência dos primers utilizados para amplificação dos genes TbEIF4G1 e TbEIF4G2 e do domínio HEAT TbEIF4G1-HD e TbEIF4G2-HD.............................46
Tabela 2: Seqüência dos primers utilizados para amplificação dos genes TbEIF4G1 (TbEIF4G1Y) e TbEIF4G2 (TbEIF4G2Y) com sítios de enzimas próprios para clonagem no p2216.........................................................................................................47
Tabela 3: Seqüência dos primers utilizados para sequenciamento dos fragmentos TbEIF4G1 e TbEIF4G1Y clonados no vetor palsmidial pGEM T Easy....................51
Tabela 4: Seqüência dos primers utilizados para sequenciamento do fragmento TbEIF4G2Y clonado no vetor palsmidial pGEM T Easy............................................51
Tabela 5: Fragmentos amplificados com seus respectivos sítios de restrição, tamanho, posição na seqüência original e vetor de destino.........................................................69
Tabela 6: Polimorfismos encontrados para seqüência do gene TbEIF4G1 em relação à depositada em banco de dados de genoma de T. brucei ..............................................75
Tabela 7: Polimorfismos encontrados para seqüência do gene TbEIF4G2 em relação à depositada no banco de dados de genoma de T. brucei ...............................................76
Lima, R. P. X
2. LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
4E-BP eIF4E Binding Protein – Proteína de ligação ao eIF4E
aa aminoácido
BSA Bovine Serum Albumin – Albumina bovina sérica
Dcp Decapping protein – Proteína de decapeamento
D.O. Densidade Ótica
EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid – Ácido etilenodiaminotetraacético
EF Elongation Factor – Fator de elongação
eIF eukaryotic Initiation Factor – Fator de iniciação eucariótico
EJC Exon Junction Complex – Complexo de junção dos éxons
EYFP Enhanced Yellow Fluorescent Protein – Proteína fluorescente amarela de
expressão aumentada
HAT Human African Trypanosomiasis – Tripanossomíase africana humana
HD HEAT Domain – Domínio HEAT
HEAT Huntinting, EF3, PR/65A, e Target of rapamicin 1
HSP Heat Shock Protein – Proteína de choque térmico
IgG Imunoglobulina G
IPTG Isopropil-β-D-tiogalactopiranosídeo
IRES Internal Ribosome Entry Site – Sítio Interno de Entrada Ribossomal
LB meio Luria Bertani
m7GTP cap 7-metilguanosine-triphosphate – cap 7-metilguanosina-trifosfato
Met-tRNAiMet Metionil-tRNA iniciador
Mnk MAP-kinase signal-integrating kinases – Proteína MAP quinase de integração
de sinal
nt nucleotídeo(s)
PABP Poli(A) Binding Protein – Proteína de Ligação à Cauda Poli(A)
PBS Phosphate Buffered Saline – Tampão Fosfato Salino
PVDF Fluoreto de Polivinilideno
RHS Retrotransposons Hot Spot – Domínios hot spots de retrotransposons
RNA pol RNA polymerase – RNA polimerase
SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate – Polyacrylamide Gel Electrophoresis –
Lima, R. P. XI
Eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio
SL RNA RNA Spliced Leader
STS Strand Switch Region – Região de troca de fita
TBP TATA Binding Protein – Proteína de ligação ao motivo TATA
TBS Tris-Buffered Saline – Tampão salino de tris
TBE Tampão Tris-Borato-EDTA
TE Tampão Tris-EDTA
Tritryp Tri-Trypanosomatidae
VSG Variant Surface Glycoprotein - Glicoproteína variante de superfície
WHO World Health Organization – Organização Mundial da Saúde
Xrn1 exor ribonuclease 1
Lima, R. P. XII
3. RESUMO
3. 1. Resumo
Os tripanosomatídeos, agentes causadores de enfermidades de impacto mundial, se destacam
dos demais eucariotos por apresentarem um conjunto de processos moleculares únicos,
inclusive a ausência de controle da sua transcrição. Dessa forma, o controle de sua expressão
gênica deve ocorrer após a transcrição. Assim, um ponto importante de controle é a iniciação
da tradução, um processo ainda pouco conhecido nos tripanosomatídeos. Em eucariotos, de
forma geral, esta começa com a ligação ao mRNA do complexo eIF4F, formado pelos
polipeptídeos: eIF4E, eIF4A e eIF4G. A subunidade eIF4G atua como proteína estruturadora
do complexo se ligando às demais subunidades e a outros fatores de tradução. Em
Trypanosoma brucei foram identificados cinco homólogos do eIF4G, conservados em
Leishmania major, denominados de TbEIF4G1-5. Este trabalho buscou contribuir com a
caracterização dos homólogos TbEIF4G1 e TbEIF4G2 a partir da amplficação e clonagem dos
seus genes, completos e/ou fragmentos contendo seu domínio HEAT central, em vetor de
expressão bacteriano. A análise das sequências clonadas apresentou divergências genéticas
em relação às descritas na literatura, mas, a princípio, de baixo significado biológico. Em
seguida, realizou-se a expressão das respectivas proteínas recombinantes e obtenção de soro
policlonal em coelhos. Estes soros foram utilizados em ensaios de “western-blot” e
imunocitoquímica para analisar a expressão das proteínas nativas e sua localização subcelular.
Os mesmos genes foram também clonados em vetor plasmidial para superexpressão da
proteína recombinante fusionada à EYFP em T. brucei. Observou-se que o TbEIF4G1 é
expresso na fase procíclica, mas é raro ou ausente na sanguínea. Já o TbEIF4G2 é expresso
raramente ou ausente em ambas as fases. Ambas as proteínas se mostraram exclusivamente
citoplasmáticas, o que reforça um papel na tradução que merece ser melhor estudado com as
ferramentas, proteínas e anticorpos, produzidos neste estudo.
Lima, R. P. XIII
3. 2. Abstract
The trypanosomatids, the causative agents of various diseases of worldwide impact, are
distinguished from other eukaryotes by the unique molecular processes which they possess,
including lack of regulation of their gene transcription. Thus, control of gene expression
occurs post-transcriptionally. A relevant target for regulation mechanism would be the
initiation of translation, a process still not well known in trypanosomatids. In eukaryotes, in
general, translation starts with the binding to the mRNA of the eIF4F complex, formed by the
polypeptides eIF4E, eIF4A and eIF4G. The eIF4G subunit is a scaffolding protein which
binds to the other subunits of the complex as well as to other translation initiation factors. In
Trypanosoma brucei five eIF4G homologues have been identified, all conserved in
Leishmania major, named TbEIF4G1-5. This study aimed to contribute to the characterization
of the homologues TbEIF4G1 and TbEIF4G2 through the amplification and cloning of their
genes, full length or fragments containing the central HEAT domain, in a bacterial expression
vector. Analysis of the cloned sequences confirmed several polymorphisms in comparison
with the ones described in the literature, but of little biological significance. Subsequently the
respective recombinant proteins were expressed and used to produce polyclonal sera in
rabbits. These were used in western-blots and immunocytochemistry assays to analyse the
expression of the native proteins and their subcellular localization. Both genes were also
cloned in a plasmid vector for overexpression in T. brucei of recombinant proteins fused with
EYFP. TbEIF4G1 was found to be expressed in the procyclic but not in the bloodstream phase
of the parasite life cycle. TbEIF4G2 is rarely expressed or absent in both phases. Both
proteins are exclusively cytoplasmic, implying a role in translation which needs to be better
investigated with the tools, proteins and antibodies, generated in this study.
Lima, R. P. 14
4. INTRODUÇÃO
Os tripanossomatídeos são protozoários pertencentes à ordem Kinetoplastida e estão
agrupados na família Trypanosomatidae. Seus representantes mais conhecidos são espécies
patogênicas pertencentes aos gêneros Trypanosoma e Leishmania, devido ao impacto na
saúde pública que as doenças causadas por esses parasitas provocam. Esses organismos são
agentes de diferentes enfermidades tropicais, como a doença do sono (Trypanosoma brucei),
doença de Chagas (Trypanosoma cruzi), e as diversas formas de Leishmaniose (Leishmania
sp.). Tais enfermidades apresentam-se como grave problema devido, principalmente, ao
difícil controle e tratamento pouco eficaz. Por isso, avanços nestes campos demandam ainda
um maior conhecimento da biologia básica do seu agente patogênico.
Os tripanossomatídeos possuem um conjunto de características metabólicas que os
diferenciam dos demais eucariotos entre as quais se destaca a ausência de regulação da
expressão gênica em nível transcricional. Portanto, devido às grandes modificações
bioquímicas e morfológicas que esses organismos sofrem na alternância entre os diferentes
hospedeiros, essa regulação tem de ocorrer em nível pós-transcricional, seja por estabilidade
do RNA mensageiro (mRNA), por regulação da taxa de degradação do mesmo, ou por
controle da sua tradução em proteínas. A tradução, apesar de bem descrita em plantas,
mamíferos e leveduras, não se encontra completamente caracterizada nos tripanossomatídeos.
Nos eucariotos de forma geral, ela se inicia pela ligação e reconhecimento do mRNA pelo
complexo de iniciação da tradução eIF4F que sinaliza para o recrutamento da subunidade
menor ribossomal 40S. O eIF4F é um complexo heterotrimérico composto pelas subunidades
polipeptídicas: eIF4E, eIF4A e eIF4G. O eIF4G é a proteína ancoradoura, estruturadora do
complexo, que interage com as demais subunidades do eIF4F, bem como com o mRNA e
outros fatores que atuam na iniciação da tradução.
Lima, R. P. 15
Com a publicação do resultado do projeto genoma de tripanossomatídeos, foram
identificados possíveis homólogos de vários fatores atuantes da tradução, entre os quais 5
homólogos para o eIF4G. A presença desses múltiplos homólogos endossa a hipótese de que
haja certa complexidade na iniciação da tradução, sendo a função destas proteínas um ponto
importante de controle da expressão gênica nesses parasitas. Assim, com o intuito de
contribuir na caracterização da iniciação da tradução nesses parasitas, este trabalho visou o
estudo da localização subcelular de dois dos possíveis homólogos ao fator de iniciação eIF4G
em T. brucei, TbEIF4G1 e TbEIF4G2. Para isso, o trabalho contemplou a clonagem dos genes
completos correspondentes, e/ou fragmentos destes, em vetor de expressão e produção das
respectivas proteínas recombinantes em Escherichia coli. Os fragmentos clonados foram
seqüenciados para verificação da ocorrência de polimorfismos em domínios funcionais em
potencial. As proteínas recombinantes foram utilizadas na produção de soro policlonal que
subsequentemente serviram de ferramenta em ensaios de imunocitoquímica. Os genes foram
clonados também em vetor para superexpressão de proteína recombinante fusionada à
proteína fluorescente amarela (EYFP) em T. brucei para corroborar a localização subcelular
das respectivas proteínas por outra técnica distinta. Os resultados obtidos são importantes para
entendimento da função que essas proteínas desempenham no metabolismo dos
tripanossomatídeos.
Lima, R. P. 16
5. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
5. 1. Ordem Kinetoplastida e Família Tripanosomatidae
Os kinetoplastídeos são protozoários flagelados pertencentes à ordem Kinetoplastida, a
qual abrange desde organismos de vida livre a parasitas obrigatórios (SIMPSON, STEVENS
e LUKES, 2006). Esses protozoários possuem várias organelas e estruturas citoplasmáticas
especiais, tais como peroxissomos, acidocalcissomos, bolso flagelar, reservossomo e
megassomo (DE SOUZA, 2002), mas a sua organela mais marcante, que os distingue e de
onde advém a denominação da ordem, é o cinetoplasto, uma região rica em DNA, presente na
única mitocôndria desses organismos (STUART et al., 2008).
O cinetoplasto (figura 1) se apresenta como uma rede de DNA interligado composta
por milhares de cadeias menores, denominadas minicírculos, entrelaçadas a dúzias de cadeias
maiores, maxicírculos. Os maxicírculos são responsáveis pela codificação de enzimas
mitocondriais essenciais e rRNA e os minicírculos codificam os RNAs mitocondriais
envolvidos principalmente na etapa de edição (LIU et al., 2005; LUKES, HASHIMI e
ZÍKOVÁ, 2005).
Figura 1: Cinetoplasto de Trypanosoma lewisi. A seta indica o cinetoplasto, estrutura em forma de disco
formada pela ligação das diversas cadeias que formam a rede de DNA. Fonte: Adaptado de BUCKELEW, 2009.
Lima, R. P. 17
Dentre os kinetoplastídeos, destaca-se a família Trypanosomatidae devido aos gêneros
Trypanosoma e Leishmania. Estes incluem importantes patógenos de animais domésticos e
humanos, por causarem enfermidades tropicais de caráter endêmico e de grande incidência
(ZELEDÓN, 1996). Ambos os gêneros apresentam como características comuns sua
organização genômica e estruturas celulares similares, assim como ciclo de vida digenético,
envolvendo dois hospedeiros: um invertebrado e outro vertebrado. Devido à grande diferença
entre esses hospedeiros, os parasitas sofrem importantes mudanças morfológicas e
metabólicas durante seus ciclos de vida (STUART et al., 2008).
5. 2. Trypanosoma brucei
Do gênero Trypanosoma, destacam-se duas espécies patogênicas ao homem, o T.
brucei, causador da Tripanossomíase Humana Africana (HAT, do inglês: Human African
Trypanosomiasis), também denominada doença do sono, e o T. cruzi, agente etiológico da
Tripanossomíase Humana Americana, ou doença de Chagas, que diferem em sintomatologia,
hospedeiro invertebrado (inseto vetor), habitat natural e distribuição geográfica (BARRET et
al., 2003).
A espécie T. brucei (figura 2) pode ser subdividida em três sub-espécies: T. b.
gambiense, T. b. rhodesiense e T. b. brucei, das quais apenas as duas primeiras têm o homem
como hospedeiro. Essas subespécies são morfologicamente indistinguíveis entre si
(DESPOMMIER, CHEN, e MURAKAMI, 2004). Todas possuem pleomorfismo, medindo
entre 15-42 µm comprimento (30µm em média), cinetoplasto pequeno e flagelo. Diferenciam-
se do T. cruzi por possuírem uma região terminal posterior mais arredondada (ZELEDÓN, R.
1996).
Lima, R. P. 18
Figura 2: Trypanosoma brucei. Foto de microscopia eletrônica de Trypanosoma brucei. Fonte: BROADHEAD
et al., 2006.
Uma característica interessante do T. brucei é a expressão de glicoproteínas variantes
de superfície (VSG, do inglês: Variant Surface Glycoprotein) apresentadas exclusivamente na
fase tripomastigota (sanguínea). O parasita é coberto em grande parte de sua membrana por
esse antígeno que é mudado com determinada freqüência, em diferentes isoformas
sucessivamente, levando à variação antigênica que possibilita a evasão do parasita às
respostas desenvolvidas pelo sistema imune do hospedeiro vertebrado. A expressão de VSG
cessa quando o parasita deixa a corrente sanguínea e passa a habitar o trato digestivo do inseto
vetor (CUMMINGS e SALVATORE, 2009; MACHADO et al., 2006).
5. 3. Doença do sono
5. 3. 1. Epidemiologia
A doença do sono é fatal se não tratada, ocorre em 36 países da África subSaariana, e
é considerada a terceira doença parasitária mais importante, depois da malária e da
esquistosomose (KENNEDY, 2008). Desses 36 países, em 3 a doença possui caráter
epidêmico; em 8, endêmico; em 10, há endemicidade moderada e nos 15 restantes, não é mais
registrada transmissão da doença há décadas. Não obstante, há grande dificuldade de relatar o
Lima, R. P. 19
real estado epidemiológico dos países devido à falta de vigilância epidemiológica eficaz e à
dificuldade de diagnóstico (WHO, 2006a) (figura 3).
Distribuição mundial da doença do sono
Caráter epidêmico
Endêmico
Endemicidade baixa
Ausência da doença
Figura 3: Distribuição e prevalência da doença do sono. A HAT se restringe à África, especificamente África
subSaariana, devido à presença exclusiva do inseto vetor nessa área. Fonte: Adaptado de WHO, 2009a.
A doença é veiculada por insetos de espécies pertencentes ao gênero Glossina (mosca
tsetsé) (figura 4), estritamente hematófaga, tanto os machos quanto as fêmeas do gênero, e sua
área geográfica de incidência corresponde às regiões de distribuição da mosca, encontradas
em diferentes habitats de acordo com sua espécie: em vegetações adjacentes a rios e lagos,
em matas de galeria e em savanas (GOODING, HAINES e PEARSON, 2005). Entretanto, por
fatores desconhecidos, existem locais onde as moscas são encontradas, mas a doença não se
dissemina (WHO, 2006a).
Lima, R. P. 20
Figura 4: Mosca tsetsé. O vetor da Tripanossomíase africana, um inseto do gênero Glossina, realizando repasto
sanguíneo em humano. Fonte: BYGOTT, 2009.
Em 2006, estimou-se que o nível de infecção chegara a 300.000 novos casos, dos
quais 25.000 foram notificados (WHO, 2006b). Em 2000, acreditava-se que entre 50 e 60
milhões de pessoas viviam em áreas de risco nos 260 focos existentes espalhados por essas
regiões. Ainda assim, grande parte das pessoas infectadas não são diagnosticadas e tratadas,
devido à dificuldade de acesso a centros diagnósticos e do serviço de controle epidemiológico
à população por causa da característica rural da mesma (WHO, 2009a).
5. 3. 2. Sintomatologia
A doença do sono pode ser dividida em duas formas clínicas segundo a subespécie que
a causa: a forma aguda, que tem como agente etiológico o T. brucei rhodesiense e ocorre nas
regiões setentrional e oriental da África, e a crônica, causada pelo T. brucei gambiense,
presente nas regiões central e ocidental (figura 5) (BARRET et al., 2003). Essa prevalência
geográfica das formas se deve à distribuição dos subgrupos de mosca tsetsé que cada
subespécie de tripanossoma está adaptada a ter como seu hospedeiro invertebrado
(DESPOMMIER, CHEN, e MURAKAMI, 2004; ZELEDÓN, R. 1996). A terceira
Lima, R. P. 21
subespécie, o T. brucei brucei, o qual é incapaz de infectar humanos, é responsável por uma
patologia letal em gado, conhecida como “Nagana”, apresentando forte impacto econômico
(WHO, 2009b).
Distribuição das formas da HAT
T. brucei gambiense
T. brucei rhodesiense
Figura 5: Distribuição do T. brucei gambiense e T. brucei rhodesiense. As distintas formas clínicas da doença
do sono se distribuem em regiões diferentes: a forma crônica, causada pelo T. brucei gambiense, na região sub-
Saariana centro-ocidental, e a forma aguda, causada pelo T. brucei rhodesiense, na meridio-oriental. Fonte:
Modificado de KENNEDY, 2008.
A diferença entre as duas formas clínicas deve-se à velocidade da progressão dos
sintomas, visto que em ambas os sinais e sintomas desenvolvidos são similares. A infecção
crônica humana pode levar anos sob a forma latente, enquanto a aguda evolui em poucas
semanas ou meses. Essas formas também podem ser subdivididas em duas fases de acordo
com a localização do parasita no organismo e com os sintomas apresentados: a presença do
parasita na corrente sanguínea do hospedeiro vertebrado causa os sintomas da fase precoce,
Lima, R. P. 22
conhecida como fase hemolinfática, enquanto a sua travessia pela barreira hematoencefálica e
instalação no sistema nervoso central caracteriza a fase neurológica (WHO, 2006a).
A fase hemolinfática compreende nos primeiros dias anemia e o cancro tripanosômico
(cancro de inoculação), este último devido à proliferação do tripanossoma no sítio de
inoculação e reação inflamatória local. Decorridos vários dias da infecção pelo parasita, são
observados cefaléia, vertigens, febre, dores articulares e musculares e linfonodos aumentados.
Um sinal clínico característico da fase precoce da doença é a tumefação dos linfonodos
cervicais, conhecido como sinal de Winterbottom (REY, 2001).
Na fase neurológica ou encefálica, estado avançado da doença, podem ser verificadas
desordens psiquiátricas, de sono, motoras, sensoriais e reflexos anormais culminando, em
geral, com coma e morte. Entretanto, ainda é discutido se estes sintomas seriam devidos à
ação do parasita ou às respostas do sistema imune do próprio hospedeiro (KENNEDY, 2006).
5. 3. 3. Ciclo de vida
O T. brucei é um organismo heteroxênico necessitando de dois hospedeiros, um
vertebrado e outro invertebrado, para realizar todo o seu ciclo de vida. A transmissão do
parasita se inicia com a picada da mosca tsetsé infectada, durante repasto sanguíneo, no qual
ocorre a inoculação intradérmica de formas tripomastigostas metacíclicas (infectantes) do
tripanossoma. Estas logo se diferenciam na forma sanguínea, alongada e delgada, e se
multiplicam por divisão binária no espaço intersticial, podendo ocasionar a formação do
cancro de inoculação. Os parasitas então migram para a linfa e posteriormente para a corrente
sanguínea. No sangue, o tripanossoma pode atravessar a barreira hemato-encefálica e se alojar
no sistema nervoso central, quando causa as complicações neurais. Os tripanossomas que
permanecem na corrente sanguínea podem se diferenciar em formas menores que não se
dividem, capazes de infectar o inseto durante seu repasto. No inseto vetor, após ingeridas,
Lima, R. P. 23
estas formas se desenvolvem em tripomastigotas procíclicas, e se dividem por cerca de 10
dias quando migram do intestino médio para as glândulas salivares do vetor e diferenciam em
epimastigotas. Lá se multiplicam até se desenvolverem em tripomastigotas metacíclicas,
novamente com capacidade infectiva para hospedeiros vertebrados, e reiniciam o ciclo ao
serem inoculados pela mosca (figura 6). Em todas essas fases a reprodução desses organismos
é por divisão binária e eles apresentam parasitismo extracelular, diferentemente dos T. cruzi e
Leishmania sp. (DESPOMMIER, CHEN, e MURAKAMI, 2004).
Figura 6: Ciclo de vida do T. brucei. O ciclo pode ser dividido entre as fases do vetor e do hospedeiro
vertebrado (metades superior e inferior da ilustração, respectivamente). Observam-se as formas epimastigota,
presente apenas no hospedeiro invertebrado, na glândula salivar da mosca tsetsé (setas pretas) e a tripomastigota,
representada no restante da imagem. Fonte: TDR, 2009.
5. 4. Biologia molecular dos tripanossomatídeos
5. 4. 1. Regulação da expressão gênica em tripanossomatídeos
Os tripanossomatídeos atraem um interesse especial devido ao seu parasitismo
obrigatório a diversos vertebrados. Além do que esses organismos se destacam dos demais
Lima, R. P. 24
devido à presença de diversas características em sua biologia molecular que, apesar de
algumas serem encontradas também em outros eucariotos, apresentam-se agrupadas de forma
única nesses parasitas. É o caso da edição de RNAs, a transcrição policistrônica e o trans-
splicing (CAMPBELL, THOMAS e STURM, 2003). Não obstante, sua particularidade mais
marcante é que, diferentemente da grande maioria dos outros eucariotos, a regulação da
expressão gênica nos tripanossomatídeos não é determinada qualitativamente no nível da
iniciação da transcrição (CAMPBELL, THOMAS e STURM, 2003). Isto é evidenciado
devido à escassez de promotores clássicos para RNA polimerase II (RNA pol II)
(CLAYTON, 2002).
Visto que os tripanossomatídeos apresentam transcrição policistrônica constitutiva de
seus genes, não sendo verificada transcrição diferencial entre as distintas fases de seu ciclo de
vida, caracterizadas por grandes dessemelhanças metabólicas (COHEN-FREUE et al., 2007;
MARTINEZ-CALVILLO et al., 2004), os mecanismos que diferenciam a expressão de RNAs
estágio-específicos são eventos de processamento do mesmo e outros eventos pós-
transcricionais, que também podem alterar a estabilidade dos mRNAs, e a sua tradução
(CLAYTON, 2002). Apesar dessa forma de controle da expressão gênica parecer um
desperdício energético, devido à manutenção de uma transcrição constitutiva, é possível que o
fornecimento contínuo desses transcritos possibilite uma rápida adaptação ao meio, auxiliando
a sobrevivência do organismo frente a alterações ambientais (PALENCHAR e
BELLOFATTO, 2006).
5. 4. 2. Organização do genoma
Os tripanossomatídeos apresentam uma grande quantidade de genes conservados
entre diferentes espécies, conforme constatado nos genoma dos três tripanossomatídeos mais
estudados, T. brucei, T. cruzi e L. major (também chamados de Tritryps), com a finalização
Lima, R. P. 25
dos respectivos projetos genomas. Esta observação demonstra um notável grau de
conservação ainda que esses organismos tenham divergido entre 200 e 500 milhões de anos
atrás (BERRIMAN et al., 2005; EL-SAYED et al., 2005a; IVENS et al., 2005; KISSINGER,
2006).
Os genomas dos Tritryps apresentam 22Mb, 33Mb e 55Mb e 9068, 8311 e cerca de
12000 genes para T. brucei, L. major e T. cruzi, respectivamente, dos quais 6158 genes são
ortólogos, com 1262 domínios conservados entre as espécies. Apenas 5% dos domínios
encontrados são espécie-específicos, o que demonstra a proximidade filogenética desses
organismos (KISSINGER, 2006). Não obstante, há notáveis diferenças entre esses parasitas
que decorrem, possivelmente, da adaptação a diferentes vetores e tropismo a diferentes
tecidos. Assim, em T. brucei há expansão gênica para proteínas que codificam para adenilato
e guanilato ciclase e com domínio rico em leucina. Já o T. cruzi apresenta expansões para
glicoproteínas semelhantes à mucina, leishmanolisina e domínios hot spot de retrotransposons
(RHS). Por fim, em L. major, se observa expansões de famílias de proteínas como
carregadores mitocondriais e proteína de choque térmico (HSP) 90 (EL-SAYED et al.,
2005b). Os genes das três espécies são arranjados sintenicamente nos cromossomos e
transcritos em policístrons, mesmo que não possuam funções preditas relacionadas (GINGER,
2005) (figura 7) e aqueles que necessitam de uma maior quantidade de produto gênico são
repetidos em tandem para transcrição de múltiplas cópias de mRNA (IVENS et al., 2005).
Lima, R. P. 26
rRNA RNA pol I Telômero
Genes codificantes de proteínas RNA pol II
tRNA/pequeno RNA (sRNA) RNA pol III
Figura 7: Disposição policistrônica dos genes nos cromossomos dos tripanossomatídeos. Os genes são
dispostos em seqüência sintênicas similares para T. brucei, T. cruzi e L. major e são transcritos
policistronicamente, mesmo que não possuam associação funcional. Modificado de CLAYTON, 2002.
5. 4. 3. RNA polimerases
Em eucariotos são empregadas três diferentes RNA polimerases para transcrever seu
DNA nuclear, RNA pol I, II e III. Cada enzima é responsável pela transcrição de diferentes
tipos de RNA (como pode ser visualizado na figura 7, acima). Em tripanossomatídeos, essas
três enzimas também são encontradas, apesar das diferenças observadas nas maquinarias de
transcrição nesses organismos, como a ausência de alguns fatores basais da transcrição (DAS,
BANDAY e BELLOFATTO, 2008), e também uma RNA polimerase mitocondrial,
(CAMPBELL, THOMAS e STURM, 2003). Além da presença destas três enzimas altamente
conservadas, há também conservação da sua função. A RNA pol I transcreve pré-rRNAs e,
em T. brucei, VSG e prociclinas (essas últimas expressas apenas quando esse parasita infecta
o inseto vetor). Já a RNA pol II sintetiza os mRNAs, como esperado, e o RNA Spliced Leader
(SL RNA), que atua no trans-splicing, enquanto que a RNA pol III transcreve tRNAs, 5S
RNA (outro rRNA) e snRNAs ricos em Uracila (PALENCHAR e BELLOFATTO, 2006).
Lima, R. P. 27
Apesar de verificados promotores para RNA pol I e RNA pol III em T. cruzi, T. brucei
e L. major, o mesmo não ocorre para RNA pol II (CLAYTON, 2002). Em um arranjo
cromossomal típico, uma grande quantidade de genes codificantes transcritos pela RNA pol II
é precedida por uma região não-transcrita de 1-13kb nomeada de região de troca de fitas
(STS, do inglês Strand Switch Region) (figura 8). A partir desta, um segundo grupo de genes
pode ser codificado na outra fita em sentido contrário. Nesta situação a transcrição de ambos
os grupos de genes se inicia bidirecionalmente a partir da região STS, entretanto até o
momento não foram verificadas seqüências promotoras em nenhuma STS (MARTINEZ-
CALVILLO et al., 2003; PALENCHAR e BELLOFATTO, 2006). Foi observado ainda que
enquanto a transcrição pela RNA pol II se inicia a partir das STS distribuídas ao longo dos
cromossomos, ela deve finalizar em áreas onde se inicie a transcrição realizada pela RNA pol
I ou III (CAMPBELL, THOMAS e STURM, 2003; MARTINEZ-CALVILLO et al., 2004).
tRNA
Genes em policístron transcrito pela RNA pol II Região STS
Sítio de iniciação de transcrição de RNA pol II
Figura 8: Região STS e áreas de iniciação da transcrição. Vários blocos de genes são encontrados dispostos
em volta de seqüências STS, de onde partem bidirecionalmente a transcrição pela RNA pol II. Em geral, a
transcrição é terminada próximo aos promotores de RNA pol I e III. Modificado de GINGER, 2005.
Lima, R. P. 28
5. 4. 4. Processamento em trans (trans-splicing) e poliadenilação dos mRNAs
Na maioria dos eucariotos, após a transcrição de um pré-mRNA monocistrônico, este
sofre um processo de cis-splicing (remoção dos íntrons de dentro da seqüência por um
complexo denominado spliceossomo), capeamento (inserção de um cap de 7-metilguanosina-
trifosfato, m7GTP, na extremidade 5’ do transcrito) e poliadenilação (adição de uma cauda de
poliadeninas, cauda poli-A, na região 3’ do pré-mRNA) (MOORE e PROUDFOOT, 2009).
Nos tripanossomatídeos o pré-mRNA policistrônico é maturado por processos acoplados de
trans-splicing, no qual os transcritos são capeados, e poliadenilação que permitem a clivagem
do policístron em monocístrons (HAILE e PAPADOPOULOU, 2007) (figura 9).
ORF I ORF II ORF III
DNA
pré-RNA
RNA maduro
ORF I ORF II ORF III
SL RNA
AAA cauda poli-A
Figura 9: Acoplamento de trans-splicing e poliadenilação em tripanossomatídeos. A maturação do pré-
mRNA em tripanossomatídeos passa pelos processos de trans-splicing e poliadenilação para separação das ORFs
do mRNA policistrônico. Modificado de CLAYTON, 2002.
O trans-splicing é caracterizado pela adição de uma seqüência de 39 a 41nt, o SL
RNA, com uma estrutura cap hipermodificada (o cap4, visto que os 4nt seguintes ao m7GTP
Lima, R. P. 29
são modificados) na porção 5’ de cada cístron (ver figura 9). O sítio de splicing é sinalizado
por uma curta seqüência de polipirimidinas na região não traduzível do mRNA precursor, e
durante o processamento é formada uma estrutura em “Y” que permite tanto a inserção do
cap no transcrito quanto a retirada da região do pré-mRNA que não estará presente no mRNA
maduro (LIANG et al., 2003).
A poliadenilação por sua vez é a adição de uma seqüência de adeninas na porção 3’ de
um mRNA anterior, sendo esta adição sinalizada pela inserção do SL RNA na 5’-UTR do
mRNA seguinte (ver figura 9). A poliadenilação também ocasiona a separação dos mRNAs
anterior e posterior (LEBOWITZ, 1993; MATTHEWS, TSCHUDI e ULLU, 1994; LIANG et
al., 2003) e ocorre entre 80 e 140nt de distância do sinal de splicing para o SL RNA (BENZ et
al., 2005).
Apesar de rara, foi também observada a presença de íntrons em genes de
tripanossomatídeos, apenas quatro exemplos nos três genomas, o que evidencia uma
importância muito reduzida do cis-splicing e corrobora a importância do trans-splicing para
esses parasitas (GINGER, 2005).
5. 4. 5. Degradação de mRNAs e grânulos de estresse e P-bodies
Outros mecanismos importantes pós-transcricionais e que podem desempenhar uma
função imprescindível no controle da expressão gênica nos kinetoplastídeos são aqueles
responsáveis pela degradação do mRNA e que alteram seu tempo de vida (CLAYTON et al.,
2008). Em organismos eucarióticos, de forma geral, essa degradação pode ocorrer em duas
vias. A primeira é iniciada pela desadenilação do mesmo por uma poli-A nuclease e posterior
decapeamento, pelo complexo Dcp1/Dcp2, e conseqüente degradação do RNA nos sentido 5’-
3’ pela exorribonuclease Xrn1 (CLAYTON e SHAPIRA, 2007). Já a segunda, também é
Lima, R. P. 30
precedida de desadenilação, mas é seguida pela ação do complexo exossomo no sentido 3’-5’
(figura 10) (HAILE e PAPADOPOULOU, 2007).
Degradação 5’-3’ Degradação 3’-5’
Dcp1/Dcp2
Exossomo
Xnr1
cap Região UTR
AAAAA cauda poli-A Enzima (ou complexo enzimático)
Figura 10: Vias de degradação do mRNA em eucariotos. As duas principais vias de degradação do mRNA em
eucariotos, em geral, ocorrem após desadenilação de sua região 3’-UTR. Numa via, ocorre primeiro o
decapeamento e posteriormente a degradação no sentido 5’-3’ (ilustração à esquerda), enquanto em outra a
continuação se dá pela ação do exossomo (ilustração à direita). Modificado de CLAYTON, 2002.
O modelo atual para esse processo em tripanossomatídeos é similar ao acima descrito
envolvendo também duas vias e as principais enzimas envolvidas na degradação são ortólogos
daquelas encontradas em outros eucariotos: a via constitutiva, dependente de desadenilação e
que opera com cinética reduzida na degradação de mRNAs estáveis e, possivelmente, de uma
subpopulação de instáveis; e a via regulada, que é rápida e parece ser independente de
desadenilação, com atuação do exossomo e endonucleases, envolvida no controle de
qualidade do RNA (HAILE e PAPADOPOULOU, 2007).
Uma outra forma de controle da expressão gênica em nível pós-transcricional é a
compartimentalização dos mRNAs que não são traduzidos ou são destinados à degradação em
Lima, R. P. 31
grânulos de processamento (P-bodies) e de estresse (CLAYTON e SHAPIRA, 2007). Os P-
bodies estão envolvidos na degradação desses mRNAs e contem enzimas da via de
degradação 5’-3’ (Dcp1/Dcp2 e Xnr). Já os grânulos de estresse são compostos por
complexos de iniciação da tradução que tiveram sua atividade interrompida (fatores de
iniciação da tradução eIF4E, eIF4A, eIF4G, eIF3, eIF2, subunidade ribossomal 40S e PABP)
(BALAGOPAL e PARKER, 2009). Em tripanossomas, foi observada a presença de grânulos
semelhantes aos de estresse e P-bodies, entretanto os grânulos de mRNA são formados
naturalmente quando o parasita habita no trato intestinal do inseto vetor (CASSOLA, DE
GAUDENZI e FRASCH, 2007) e alguns grânulos induzidos por estresse de choque térmico
apresentaram uma composição de enzimas diferente do esperado (KRAMER et al., 2008).
5. 5. Síntese protéica em eucariotos
A tradução do mRNA representa um dos últimos pontos da via da expressão gênica,
imprescindível para a viabilidade celular, e possui também um importante papel na regulação
dessa expressão, visto que esse controle é empregado em uma ampla gama de situações
biológicas, servindo inclusive como um ajuste mais preciso do nível de proteínas (GEBAUER
e HENTZE, 2004). Dois modos gerais de regulação da tradução podem ser destacados: o
global, dirigido à maioria dos mRNAs da célula (ocorre por modificação dos fatores de
iniciação da tradução), e o mRNA-específico, dirigido a um grupo definido de mRNAs que
são modulados sem afetar a biossíntese geral de proteínas (moderado por complexos protéicos
que reconhecem elementos 5’ ou 3’-UTR característicos) (GEBAUER e HENTZE, 2004).
A tradução pode ser dividida em três etapas: 1-iniciação, 2-elongação e 3-término e
reciclagem. A iniciação da tradução é a etapa mais complexa, mais controlada e mais
divergente entre os organismos e tem por funções: evitar a reassociação das subunidades
ribossomais livres e regular sua associação ao mRNA; selecionar o aa-tRNA iniciador;
Lima, R. P. 32
localizar o códon iniciador (AUG) correto e unir as subunidades ribossomais nesse códon
(MARINTCHEV e WAGNER, 2004). Assim, em eucariotos, de forma geral, a etapa de
iniciação é caracterizada pela formação do complexo 43S (subunidade menor ribossomal 40S,
Met-tRNAiMet e alguns fatores de iniciação da tradução), sua ligação ao mRNA e avanço até o
códon iniciador (AUG), quando a subunidade ribossomal maior (60S) se une à menor,
formando o ribossomo completo (80S) (figura 11) (MARINTCHEV e WAGNER, 2004;
PESTOVA et al., 2001).
(1) (2) (3)
Formação do complexo 43S Formação do complexo 48S
(6) (5) (4)
Formação do ribossomo (80S) Localização do códon iniciador
Figura 11: Esquema simplificado da iniciação da tradução. A etapa da iniciação começa com a formação do
complexo 43S (na ilustração, passo 2), prossegue com a ligação desse complexo ao mRNA (3), localização do
códon iniciador (4) e finaliza com o desligamento dos fatores associados no complexo (5) e associação da
subunidade menor à maior (60S) no códon (6). Modificado de ALGIRE e LORSCH, 2006.
Esse processo de iniciação é resultado da atuação de pelo menos 12 fatores
denominados eIFs (do inglês: eukaryotic Initiation Factor), dos quais dois são universalmente
conservados e apresentam a mesma função em arqueobactérias, eubactérias e eucariotos. São
esses fatores que garantem a correta localização do tRNA iniciador, o metionil-tRNA
iniciador (Met-tRNAiMet), no sítio P do ribossomo e seu pareamento com o códon iniciador
(ACKER e LORSCH, 2008).
Lima, R. P. 33
Resumidamente, a iniciação pode ser descrita e divida em quatro fases (simplificação
da iniciação descrita na figura 11):
1. A primeira abrange a formação do complexo ternário eIF2-GTP-Met-tRNAiMet,
composto pela união do fator eIF2 ao GTP e ao tRNAi (ilustração da figura 11,
passo 1), responsáveis pelo reconhecimento do AUG, e subseqüente ligação aos
eIF3, eIF1 e eIF1A e à subunidade menor ribossomal, que resulta na formação do
complexo 43S.
2. A segunda fase compreende o recrutamento do 43S para a região 5’-UTR do
mRNA, indicada pelo cap, o qual é mediado pelos fatores eIF3, eIF4F e PABP. A
união do 43S ao mRNA compõe o complexo 48S.
3. A terceira fase é caracterizada pela varredura da região 5’-UTR do mRNA pelo
48S, que ocorre na presença do eIF4 (eIF4F e eIF4B), até localização do códon
iniciador e seu pareamento com o Met-tRNAiMet.
4. E a fase final resulta na desestabilização do 48S com liberação de seus
constituintes, exceto a subunidade menor ribossomal (40S) e o tRNAi, que
permanecem ligados ao mRNA. Esse evento é sucedido pela ligação da
subunidade menor ribossomal à maior (60S) resultando na formação do ribossomo
completo (80S), onde se inicia a etapa de elongação (ACKER e LORSCH, 2008;
HERSHEY e MERRICK, 2000).
5. 5. 1. Complexo eIF4F e PABP
Os fatores do grupo eIF4 (o eIF4F e o eIF4B) e a PABP (figura 12), que atuam na
segunda e terceira fases da iniciação da tradução citadas anteriormente, são responsáveis pelo
reconhecimento do mRNA e recrutamento do ribossomo. O complexo eIF4F é composto por
três polipeptídeos (ver figura 12), o eIF4E, o eIF4A e o eIF4G, e exerce função primordial na
Lima, R. P. 34
atração do ribossomo ao mRNA. Já a PABP (Poly(A) Binding Protein, proteína de ligação à
cauda poli(A)) reconhece a cauda poli(A) presente na região 3’-UTR desse (GINGRAS,
RAUGHT e SONEMBERG, 1999), enquanto o fator eIF4B atua na estimulação da atividade
do eIF4A, apesar de não ser indispensável para a viabilidade celular (OBERER,
MARINTCHEV e WAGNER, 2005).
Figura 12: Esquema da atuação do fator eIF4F, eIF4B e PABP na iniciação da tradução. Os nomes dos
fatores estão abreviados pela suas finais (4E – eIF4E, 4A – eIF4A, 4G – eIF4G e 4B – eIF4B). O complexo
eIF4F é composto dos três fatores eIF4E, eIF4A e eIF4G, que têm papel fundamental no recrutamento do
ribossomo para o mRNA. Fonte: SONEMBERG e HINNESBUSCH, 2009.
O fator eIF4E é a subunidade do eIF4F responsável pelo reconhecimento da estrutura
cap da região 5’ do mRNA sendo, portanto, indispensável para a tradução cap-dependente.
Não obstante, existe também a tradução cap-independente, notadamente em alguns RNAs
virais e poucos celulares, na qual o eIF4E não se faz necessário (SONEMBERG e
HINNESBUSCH, 2009). Nesse tipo de tradução, a região 5’-UTR do mRNA mimetiza o
próprio cap e alguns eIFs, apresentando sítios internos de entrada ribossomal (IRES, do inglês
Internal Ribossome Entry Site) que recrutam a subunidade ribossomal 40S diretamente para a
região de iniciação (KIEFT, 2008; SONEMBERG e HINNESBUSCH, 2009).
O eIF4E apresenta a forma de uma mão em concha com o reconhecimento do cap
ocorrendo na parte côncava e a interação com o eIF4G e as 4E-BP (proteínas de ligação ao
eIF4E, do inglês eIF4E Binding Protein) na convexa (região dorsal). Ambas proteínas são
Lima, R. P. 35
importantes parceiros de ligação e modulação da iniciação da tradução. A tradução é inibida
pela ligação do eIF4E às com as 4E-BP, que quando hipofosforiladas inibem sua associação
ao eIF4G (RHOADS, 2009), e estimulada pela sua interação com o eIF4G (HAGHIGHAT e
SONEMBERG, 1997). Além disso, a afinidade do eIF4E pelo cap também pode ser
modulada por fosforilação decorrente da ação das Mnk1 e 2 (MAP-kinase signal-integrating
kinases, ou proteínas MAP quinases, que se aproximam do fator via eIF4G) aumentando essa
afinidade (GOODFELLOW e ROBERTS, 2008).
O fator eIF4A é uma RNA helicase bidirecional ATP-dependente pertencente à
superfamília DEAD box de proteínas, responsável pela remoção das estruturas secundárias na
região 5’-UTR próximo ao cap (GINGRAS, RAUGHT e SONEMBERG, 1999). Assim, o
fator facilita a ligação da subunidade menor ribossomal 40S na região proximal ao cap e
promove uma varredura até o códon iniciador, sendo indispensável mesmo se a região
contiver pequenos elementos de estruturas secundárias (MARINTCHEV e WAGNER, 2004).
A PABP é a proteína responsável pela ligação e reconhecimento da cauda poli(A)
presente na extremidade 3’ do mRNA. A cauda poli(A) é adicionada pós-transcricionalmente,
por uma poli(A) polimerase que reconhece um sinal de poliadenilação próximo à extremidade
3’ do mRNA. Essa poliadenilação é importante pois atua na exportação do RNA do núcleo,
estimula a iniciação da tradução, aumenta a estabilidade do RNA à degradação nucleolítica e,
por ser o sítio de ligação da PABP que interage com outros fatores da tradução, modula a
síntese protéica (MARINTCHEV e WAGNER, 2004). Além disso, a PABP, ao interagir com
o eIF4G e este com o eIF4E, promove a circularização do mRNA, pela aproximação da cauda
poli(A) ao cap (figura 13). A circularização aumenta a tradução devido ao reenvio dos
ribossomos já dissociados, liberados da região 3’ do mRNA, para a região 5’ a fim de
reiniciar a síntese e a ligação da PABP ao eIF4F aumenta a afinidade do complexo ao cap
(SACHS e VARANI, 2000; SONEMBERG e HINNESBUSCH, 2009).
Lima, R. P. 36
Figura 13: Circularização do mRNA pela interação dos eIF4E e PABP via eIF4G. A circularização é
realizada pela ligação do eIF4E ao cap e da PABP à cauda poli(A) via ligação de ambos ao eIF4G. Pode também
ser observada a inibição da ligação do eIF4E ao cap pela sua associação às 4E-BP. O círculo vermelho
circunscreve os fatores que compõem o complexo eIF4F (eIF4A, eIF4E e eIF4G) (polyA�poli(A)). Fonte:
Adaptado de SACHS e VARANI, 2000.
5. 5. 2. Fator eIF4G
O fator eIF4G é a proteína-chave de ligação do complexo eIF4F atuando como
ancoradouro de diversos fatores. Dessa forma, o eIF4G promove associações entre proteínas e
facilita o alcance de uma conformação tridimensional adequada para iniciação da tradução,
visto que possui sítios de ligação para os eIF4E, eIF4A, Dcp1, PABP, Mnk, e o mRNA. É
também esse fator que promove o recrutamento do complexo 43S para a região 5’ do mRNA,
pela interação com o eIF3 (ligado à subunidade menor ribossomal) (PREVOT, DARLIX e
OHLMANN, 2003).
Em mamíferos, são encontradas duas isoformas para o eIF4G: o eIF4GI e o eIF4GII,
que apresentam 46% de identidade dos resíduos de aminoácidos. Duas isoformas são também
Lima, R. P. 37
encontradas em outros organismos, como Saccharomyces cerevisae e plantas. Apesar de
ambos, eIF4GI e eIF4GII, terem papéis similares na iniciação da tradução (GINGRAS,
RAUGHT e SONEMBERG, 1999) e se complementarem funcionalmente, um na ausência do
outro, evidências sugerem que há algumas diferenças em sua atuação visto que o eIF4GII, por
exemplo, é seletivamente recrutado no início da diferenciação de megacariócitos (CARON et
al., 2004).
O eIF4GI pode ser subdividido em três regiões resultantes de clivagem enzimática por
proteases picornavirais: porção N-terminal, porção medial e porção C-terminal. A região N-
terminal possui sítios de ligação ao eIF4E e PABP. A C-terminal, sítios para eIF4A e Mnk. E
a porção central, apresenta sítios para eIF4A, eIF3 e para o RNA (SONEMBERG e DEVER,
2003), nos quais está localizado um domínio típico de ligação HEAT, composto de cinco
repetições HEAT (MARCOTRIGIANO et al., 2001). Essas repetições HEAT são compostas
por pares de α-hélices antiparalelas, ligadas por alças curtas e seu nome deriva das primeiras
letras das proteínas nas quais foram primeiramente identificadas essas repetições:
Huntingtina, fator de elongação 3 (EF3), subunidade A (A subunit) da proteína fosfatase 2A e
proteína alvo da rapamicina 1 (TOR1, Target of rapamicin 1). São encontradas em proteínas
envolvidas na associação de grandes complexos protéicos (PREVOT, DARLIX e
OHLMANN, 2003).
Além do domínio HEAT típico encontrado na região medial, nomeado HEAT-
1/MIF4G, são também encontrados mais dois domínios HEAT na porção C-terminal que,
entretanto, não são característicos. Estes se apresentam mais compactos e os ângulos das alças
entre as repetições são diferentes do padrão, apesar de apresentar as repetições como
esperado. Os domínios são denominados HEAT-2/MA3, com capacidade de interação com o
eIF4A e HEAT/W2 com interação com a Mnk (figura 14) (BELLSOLELL et al., 2006).
Lima, R. P. 38
Figura 14: Esquema do fator eIF4GI. O fator eIF4GI, um dos homólogos encontrados em humanos, pode ser
dividido em três regiões por clivagem com protease picornaviral. As setas vermelhas indicam os sítios de
clivagem que o dividem em regiões N-terminal, medial e C-terminal. Nos eIF4Gs humanos são encontrados três
domínios HEAT: HEAT-1/MIF4G, HEAT-2/MA3 e HEAT-3/W2. Fonte: MARINTCHEV et al., 2009.
O eIF4G desempenha também, além do papel já previamente citado na tradução cap-
dependente, função essencial para alguns tipos de tradução cap-independente, como em que
são empregadas IRES. Em alguns mRNAs, o eIF4G recruta o eIF4F sem a necessidade do
eIF4E e promove a ligação das subunidades ribossomais no mRNA. Esse tipo de tradução
cap-independente é utilizado por vírus e células humanas apoptóticas, quando são utilizadas
proteases que clivam o eIF4G abolindo o sítio de interação eIF4G-eIF4E e direcionando,
dessa forma, a tradução para os mRNAs que não possuem cap (PESTOVA et al., 2001;
PREVOT, DARLIX e OHLMANN, 2003).
5. 6. Iniciação da tradução em tripanossomatídeos
Atualmente, a síntese protéica nos tripanosomatídeos ainda não está bem
caracterizada, e a literatura concernente a esse processo nos parasitas ainda é incipiente,
apesar do avanço rápido que tem apresentado, devido inclusive à publicação do genoma dos
mesmos.
Lima, R. P. 39
Com relação à iniciação da tradução, foram identificados, no gênero Leishmania, e
inicialmente caracterizados quatro possíveis homólogos para o fator de iniciação eIF4E,
denominados LmEIF4E1-4 (DHALIA et al., 2005; YOFFE et al., 2004; YOFFE et al., 2006).
Desses, espera-se que o homólogo LmEIF4E realmente atue na tradução e seja capaz de
interagir com o cap específico de tripanossomatídeos, o cap4, tetrametilado, inserido pelo
processo de trans-splicing, (PERRY, WATKINS e AGABIAN, 1987; CLAYTON e
SHAPIRA, 2007) que difere dos outros eucariotos, onde o cap é monometilado (cap1)
(GINGRAS, RAUGHT e SONEMBERG, 1999). Assim, foi verificado que os LmEIF4E1 e
LmEIF4E4 são capazes de interação com o cap1 e o cap4 (DHALIA et al., 2005; YOFFE et
al., 2004), enquanto o LmEIF4E2 interage apenas com o cap1 e o LmEIF4E3 fortemente com
o cap1 e fracamente com o cap4 (YOFFE et al., 2006). Esses resultados, associados aos que
demonstram que os LmEIF4G3, LmEIF4E1 e LmEIF4E4 participam do complexo de ligação
ao cap no parasita, sugerem que os fatores que mais provavelmente estão associados à
tradução são os LmEIF4E1 e LmEIF4E4 (YOFFE et al., 2009).
Para o fator eIF4A, foram encontrados 2 possíveis homólogos, tanto em L. major, os
LmEIF4AI e LmEIF4AIII, quanto em T. brucei, os TbEIF4AI e TbEIF4AIII, assim nomeados
devido à sua similaridade funcional aos eIF4AI e eIF4AIII de humano, como verificado em T.
brucei (DHALIA et al., 2005; DHALIA et al., 2006). Foi constatado que, em L. major, o
LmEIF4AI é bastante abundante na forma promastigota e capaz de interagir com o domínio
HEAT central do fator LmEIF4G3, diferentemente do LmEIF4AIII, que é significativamente
raro nesta mesma forma e incapaz de realizar a mesma interação (DHALIA et al., 2006).
Além disso, o LmEIF4AI apresenta função de RNA helicase ATP-dependente in vitro e
capacidade de ligação ao eIF4G de S. cerevisae (BARHOUMI et al., 2006). Em T. brucei, foi
observado que o TbEIF4AI é muito abundante no parasita e que o TbEIF4AIII é
moderadamente expresso. Ambos são essenciais para a célula, entretanto a depleção do
Lima, R. P. 40
TbEIF4AI interrompe a proliferação celular mais precocemente que o TbEIF4AIII. Não
obstante esse dados obtidos, foi a análise da localização subcelular dos TbEIF4AI e
TbEIF4AIII que direcionou os estudos de seus papéis na célula do parasita. Observou-se que
o primeiro é predominantemente citoplasmático e o segundo exclusivamente nuclear. Esta
observação levantou a possibilidade de que o TbEIF4AI atue na síntese protéica enquanto o
TbEIF4AIII participe em outra via biossintética, como o splicing. De fato a geração de um
mutante dominante negativo do primeiro causa diminuição do crescimento celular, compatível
com inibição da tradução, diferentemente do TbEIF4AIII (DHALIA et al., 2006).
O fator eIF4G tem cinco possíveis homólogos verificados em L. major denominados
LmEIF4G1-5, identificados com base na presença em todos de um domínio HEAT
semelhante ao observado em outros eIF4Gs. Destes uma análise de seqüências revelou que
apenas os LmEIF4G3 e LmEIF4G4 parecem estar relacionados entre si uma vez que ambos
possuem tamanhos próximos (635 aminoácidos para o LmEIF4G3, 765 para o LmEIF4G4) e
estrutura similar com uma extremidade amino-terminal muito curta seguida do domínio
HEAT e de uma região C-terminal que contém elementos conservados em comum (DHALIA
et al., 2005). Dentre todos os homólogos de eIF4G de Leishmania, somente o LmEIF4G3 teve
o início de sua caracterização publicada: foi constatado que essa proteína é moderadamente
abundante na fase proclícica do parasita e é capaz de se ligar especificamente ao eIF4A
humano e ao LmEIF4AI (DHALIA et al., 2006) e aos LmEIF4E1 e LmEIF4E4 (YOFFE et al.,
2009), indicando-o como um provável fator de iniciação da tradução.
Quanto aos demais homólogos de eIF4G de Leishmania, os LmEIF4G2 e LmEIF4G5
são os mais divergentes do homólogo humano (37% de similaridade ambos) (DHALIA et al.,
2005). Os LmEIF4G1 e LmEIF4G2 têm em comum o fato de seus genes estarem localizados
no cromosomo 15, seu grande tamanho (1016 aminoácidos para o LmEIF4G1, 1425 para o
LmEIF4G2), a localização central do domínio HEAT e a incapacidade de seu domínio HEAT
Lima, R. P. 41
interagir com o LmEIF4AI e LmEIF4AIII in vitro, apesar de o LmEIF4G1 ser o mais
conservado ao eIF4G humano (43%). Do ponto de vista de seqüência entretanto, não há
homologia entre os LmEIF4G1 e LmEIF4G2 fora do domínio HEAT. O LmEIF4G1 se
destaca em relação aos demais homólogos de eIF4G por conta de sua carga elétrica geral,
positiva, enquanto os demais são negativos (DHALIA et al., 2005).
Foram também localizados cinco ortólogos dos LmEIF4Gs em T. brucei (TbEIF4G1-
5), mas dados referentes às suas caracterizações ainda não estão disponíveis. Foi referido que
dentre os fatores o que mais se assemelha ao seu ortólogo em L. major é o TbEIF4G5 (60%
de similaridade), enquanto o mais divergente é o TbEIF4G4 (45%). O TbEIF4G1 e o
TbEIF4G2 apresentam 47% e 49% de similaridade, respectivamente, aos seus respectivos
ortólogos de Leishmania e o TbEIF4G3, 55% (DHALIA et al., 2005). Além disso, esses
fatores diferem consideravelmente em tamanho visto que o TbEIF4G1 apresenta 1119
aminoácidos, o TbEIF4G2 879aa, o TbEIF4G3 623aa, o TbEIF4G4 698aa e o TbEIF4G5
750aa. Apesar dos avanços obtidos em alguns estudos, os dados sobre os TbEIF4Gs são
escassos e a caracterização funcional destes fatores é necessária para o entendimento do papel
que essas proteínas desempenham no metabolismo celular dos tripanossomatídeos.
Lima, R. P. 42
6. OBJETIVOS
6. 1. Objetivo Geral
Determinar a localização subcelular de dois homólogos do fator de iniciação da
tradução eIF4G identificados em Trypanosoma brucei, TbEIF4G1 e TbEIF4G2.
6. 2. Objetivos específicos
Clonar os genes TbEIF4G1 e TbEIF4G2 em vetores plasmidiais para expressão em
Escherichia coli (pET21a), fusionados a uma sequência de poli-histidina, ou de
superexpressão em Trypanosoma brucei (p2216), com fusão à proteína EYFP (Enhanced
Yellow Fluorescent Protein);
Seqüenciar os fragmentos clonados de forma a confirmar sua seqüência e identificar
a ocorrência de variações/polimorfismo em relação às seqüências depositadas pelo projeto
genoma de T. brucei;
Realizar a expressão das proteínas fusionadas a histidina em E. coli, seguida de sua
purificação em cromatografia de afinidade com resina de níquel;
Imunizar coelhos com as proteínas recombinantes purificadas;
Analisar a localização subcelular dos fatores TbEIF4G1 e TbEIF4G2 nas células de
T. brucei pela técnica de imunocitoquímica através dos anticorpos obtidos;
Analisar a localização subcelular dos fatores TbEIF4G1 e TbEIF4G2 nas células de
T. brucei através da superexpressão dos genes fusionados a EYFP.
Lima, R. P. 43
7. MATERIAIS E MÉTODOS
7.1. Extração de DNA genômico total de Trypanosoma brucei
Para que o trabalho tivesse início, foi necessária a extração prévia do DNA de
genoma total de Trypanosoma brucei, a fim de que as amplificações dos genes TbEIF4G1 e
TbEIF4G2 e fragmentos correspondentes ao domínio HEAT (HD), TbEIF4G1-HD e
TbEIF4G2-HD, respectivamente, fossem realizadas.
Para a extração, células de T. brucei na fase procíclica, da linhagem celular 427,
foram cultivadas em meio SDM-79 (Sigma-Aldritch Co.), adicionado de soro fetal bovino
(10% v/v), ampicilina e estreptomicina (0,1% v/v, Sigma-Aldritch Co.), até a obtenção de 108
a 109 células em fase logarítmica. A cultura foi, então, centrifugada a 3000 g por 10 minutos
em tubo Falcon. O sobrenadante foi desprezado e o sedimento foi lavado com tampão PBS
(137 mM NaCl, 2,7 mM KCl , 4,3 mM Na2HPO4, 1,47 mM KH2PO4 , pH 7.3) e centrifugado
a 3000 g por 10 minutos, novamente.
As células lavadas com PBS foram ressuspendidas em tampão GTE (EDTA10 mM,
Tris-HCl, pH8,0, 25 mM e glicose 50 mM) e incubadas com 500 µL de SDS 10% e 100 µL
de Proteinase K (10 mg/mL) a 45ºC por 30 minutos. Posteriormente, foi adicionado 5 mL de
fenol da solução Fenol-clorofórmio-álcool isoamílico (28:24:1, v/v, pH 8,0) e homogenizou-
se por inversão durante 2 minutos, seguindo nova centrifugação a 3000 g por 10 minutos. O
sobrenadante foi cuidadosamente recuperado para novo tubo Falcon e a extração com fenol
descrita anteriormente foi repetida.
Após recuperação do sobrenadante, a partir da segunda extração com fenol,
adicionou-se a ele 500µL de acetato de sódio (3 M) e 5 mL de isopropanol 100% e misturou-
se levemente. O sobrenadante, adicionado de acetato e isopropanol foi mantido a –20ºC por
10 minutos e depois centrifugado a 12.850 g por 10 minutos. O sobrenadante foi desprezado e
Lima, R. P. 44
o sedimento foi lavado com etanol 70%, centrifugado por 2 minutos a 12.850 g e o
precipitado seco a temperatura ambiente.
O sedimento seco foi ressuspendido em 500 µL de TE 10:1 (Tris-HCl 10 mM,
EDTA 1 mM) e transferido para um microtubo eppendorf. Foi então adicionado 550 µL de
Fenol-clorofórmio-álcool isoamílico, misturado por inversão por 1 minuto e centrifugado a
20.800 g por 3 minutos. O sobrenadante foi recuperado para outro tubo e foi adicionado a este
550 µL de clorofórmio da solução de Clorofórmio hidratado (1:1, v/v, de clorofórmio e água),
misturou-se por inversão por 1 minuto e centrifugou-se a 20.800 g por 3 minutos.
Ao sobrenadante recuperado foi adicionado 50 µL de acetato de sódio 3 M e 1 mL
de etanol absoluto e, após homogenização, esse foi mantido a –20ºC por no mínimo 2 horas,
seguindo-se centrifugação a 20.800 g por 10 minutos. O sobrenadante foi descartado e o
sedimento foi seco a temperatura ambiente e ressuspendido em 100 µL de TE 1:10 e estocado
a –20ºC. O DNA total extraído foi submetido a eletroforese em gel de agarose 1% corado com
brometo de etídio para visualização da eficiência da extração e quantificação para emprego
nas reações de PCR.
7. 2. Amplificação dos genes TbEIF4G1 e TbEIF4G2 e fragmentos TbEIF4G1-HD e
TbEIF4G2-HD
As amplificações por PCR dos genes TbEIF4G1 (código de acesso no GenBank
XP_824645) e TbEIF4G2 (XP_803855) e de seus domínios mais conservados (a região
HEAT central – TbEIF4G1-HD e TbEIF4G2-HD) foram realizadas visando clonar os genes
primeiramente no vetor plasmidial pGEM T Easy e, posteriormente, subcloná-los no vetor
plasmidial pET21a, para expressão de proteínas recombinantes em Escherichia coli, e p2216,
Lima, R. P. 45
para superexpressão de proteínas recombinantes fusionadas à proteína fluorescente amarela
(EYFP, do inglês “Enhanced Yellow Fluorescent Protein”) em Trypanosoma brucei.
Para cada gene ou a região de interesse, foram empregados dois primers específicos,
na concentração final de 1 µM cada, que flanqueavam o segmento a ser amplificado (tabela
1). Inicialmente, para a clonagem no vetor pET21a, os primers empregados apresentavam
sítios de restrição para as enzimas BamH I, para os primers na posição 5’, e Hind III, para a
posição 3’, a fim de tornar possível a subclonagem dos genes e fragmentos no vetor
plasmidial em fase com a região codificando para a seqüência de poli-hisitidinas. As reações
de PCR foram realizadas utilizando como molde o DNA genômico total extraído de T. brucei,
na concentração final de 1 ηg/µL. A amplificação foi realizada com a enzima Tgo DNA
Polimerase (Invitrogen Co.) (concentração final de 1 U/µL), com a adição de tampão
específico, conforme protocolo especificado pelo fabricante, e de cada deoxinucleotídeo
(Adenina, Citosina, Guanina e Timina) para concentração final de 0,1 mM. As condições da
reação empregadas foram 95°C por 2 minutos para desnaturação prévia do DNA e 35 ciclos
de 95°C por 1 minuto para desnaturação, 50°C (para TbEIF4G1-HD e TbEIF4G2-HD), 60ºC
(para TbEIF4G1) ou 65ºC (para TbEIF4G2) por 30 segundos para pareamento dos primers, e
72°C por 2 minutos para extensão. Ao fim dos ciclos, a temperatura de 72ºC foi mantida por
7 minutos para extensão das fitas que permaneceram incompletas.
Lima, R. P. 46
Tabela 1: Seqüência dos primers utilizados para amplificação dos genes TbEIF4G1 e TbEIF4G2 e do
domínio HEAT TbEIF4G1-HD e TbEIF4G2-HD. A região sublinhada indica o sítio de restrição para as
enzimas BamH I e Hind III para as posições 5’ e 3’, respectivamente. O ATG em negrito, na posição 5’, indica o
códon iniciador da tradução. Todos os primers descritos estão na orientação 5’-3’
Gene Posição Seqüência
TbEIF4G1 5’ CGA GGA TCC CCC GCC ACC ATG AAC TGC TCC G
TbEIF4G1 3’ G ATT CGG TCC CTT GGG GGA AAT AAG CTT ACG
TbEIF4G1-HD 5’ CGT GGA TCC GGG CTC ATG GGA ACC TGT CTT
TbEIF4G1-HD 3’ TCA ACA CCC ACT GCG AAA AGA GCT AAG CTT ACG
TbEIF4G2 5’ GCT GGA TCC CCC GCC ACC ATG CGA ACA AC
TbEIF4G2 3’ GGC GCT GTG AGG CGG GTT AAG CTT TCG
TbEIF4G2-HD 5’ CGA GGA TCC TTT GGT GAC GTA GAG CGG AAG G
TbEIF4G2-HD 3’ CAG TCT GCG TTT GAG GGC AAG CTT TCG
Os genes TbEIF4G1 e TbEIF4G2 foram também amplificados com primers com sítios
de restrição para Hind III na posição 5’ (TbEIF4G1YH e TbEIF4G2YH) e BamH I, na 3’
(TbEIF4G1YB e TbEIF4G2YB) (tabela 2), a fim de cloná-los no vetor pGEM T Easy e,
posteriormente, subcloná-los no vetor p2216. Para facilitar a referência aos amplicons gerados
com esses primers, eles serão denominados de TbEIF4G1Y e TbEIF4G2Y (sendo o “Y”
referente a “EYFP”). As amplificações por PCR foram realizadas de forma similar às
anteriormente descritas (concentrações de reagentes e temperaturas), no entanto, a
temperatura de pareamento dos primers foi de 60ºC para TbEIF4G1Y e 65ºC TbEIF4G2Y).
Lima, R. P. 47
Tabela 2: Seqüência dos primers utilizados para amplificação dos genes TbEIF4G1 (TbEIF4G1Y) e
TbEIF4G2 (TbEIF4G2Y) com sítios de enzimas próprios para clonagem no p2216. A região sublinhada
indica o sítio de restrição para as enzimas Hind III e BamH I para os primers na posição 5’ e 3’, respectivamente.
O ATG em negrito, na posição 5’, indica o códon iniciador. Todos os primers descritos estão na orientação 5’-3’
Primer Posição Seqüência
TbEIF4G1YH 5’ CGA AAG CTT CCG CCA CCA TGA ACT GCT CC
TbEIF4G1YB 3’ G ATT CGG TCC CTT GGG GGA AAT GGA TCC TGC
TbEIF4G2YH 5’ GCA AAG CTT CCG CCA CCA TGA TGC GAA CAA CG
TbEIF4G2YB 3’ GGC GCT GTG AGG CGG GTT GGA TCC TGC
Da mesma forma que o DNA total extraído, as reações de amplificação obtidas foram
analisadas em gel de agarose 1% corado com brometo de etídio para visualização dos
fragmentos amplificados.
7.3. Eletroeluição dos fragmentos amplificados por PCR
Os fragmentos obtidos pela PCR (TbEIF4G1, TbEIF4G1-HD, TbEIF4G1Y,
TbEIF4G2, TbEIF4G2-HD e TbEIF4G2Y) foram purificados por eletroeluição, a qual teve
início com a resolução dos fragmentos amplificados em gel de agarose 1%. Em seguida, as
bandas de interesse do gel foram excisadas, envolvidas em membranas de diálise
separadamente e transferidas para um molde de agarose a 1,5%, onde posteriormente, foi
adicionado TBE 0,5% (Tris-Borato-EDTA). O conjunto foi submetido a uma voltagem de 120
V durante 30 minutos para que o DNA migrasse do gel para o tampão seguido de inversão da
voltagem por 1 minuto para que o DNA que estivesse adsorvido à membrana pudesse desligar
desta. A solução com o DNA, envolvido pela membrana, foi recuperada e o DNA precipitado
por adição de NaCl para concentração final de 0,3 M e 2,5 volumes de etanol absoluto
Lima, R. P. 48
seguido de incubação a –20ºC por no mínimo duas horas e centrifugação a 20.800 g por 10
minutos. O sedimento foi seco a temperatura ambiente e ressuspendido em 20 µL de H2O.
Uma alíquota do DNA eletroeluído foi submetida a eletroforese em gel de agarose 1% corado
com brometo de etídio para verificação do resultado e quantificação do mesmo.
As amplificações purificadas obtidas foram quantificadas através da análise de
intensidade das bandas, utilizando o programa Kodak 1D v.3.5.2 (Eastman Kodak Company),
e tendo como parâmetro a banda de 1650 pb do marcador 1Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen
Co.) que de acordo com a diluição empregada para essa quantificação equivale a 40 ηg. Essa
quantificação do DNA purificado foi necessária para realização da ligação com o vetor pGEM
T Easy.
7.4. Clonagem no vetor plasmidial pGEM T Easy
Para ligação dos fragmentos purificados TbEIF4G1, TbEIF4G1-HD, TbEIF4G1Y,
TbEIF4G2, TbEIF4G2-HD e TbEIF4G2Y com o vetor pGEM T Easy (Promega Co.), foram
utilizadas quantidades de DNA purificado conforme indicado no protocolo do fabricante:
ηηηηg de inserto = (kb do inserto x ηηηηg do vetor / kb do vetor) x taxa molar inserto:vetor
onde “ηg de inserto” - quantidade de inserto purificado que deve ser utilizado na
ligação em nanogramas (ηg);
“kb do inserto” - tamanho do inserto em kilobases (kb);
“ηg do vetor” - quantidade de vetor empregado na reação em nanogramas;
“kb do vetor” - tamanho do vetor em kilobases;
Lima, R. P. 49
“taxa molar inserto:vetor” - razão entre as quantidades de inserto e de vetor
empregadas na ligação (definida arbitrariamente). Neste trabalho, a taxa
definida foi 3:1.
A quantidade de DNA, calculada pela fórmula do fabricante, foi empregada na
reação de adição de adeninas (ATP) ao terminal 3’ de cada lado da fita dupla, conforme
protocolo do fabricante por 30 minutos a 70ºC. Após a adição das adeninas, 25 ηg de vetor e
1,0 µL e 2,0 µL do inserto foram ligados de acordo com o protocolo do pGEM T Easy por 20
horas a 4ºC.
As ligações obtidas foram empregadas na transformação de bactérias Escherichia
coli da linhagem DH10B (com eficiência de transformação maior que 105 unidades
formadoras de colônia – UFC – por µg de DNA). Para isso, 5 µL de cada ligação foi incubado
com 50 µL de célula competente DH10B a 4ºC por 30 minutos. As células foram então
submetidas a um choque térmico a 37ºC por 5 minutos e semeadas em placas de Petri
contendo meio LB (Luria Bertani) com ampicilina (100 µg/mL) para seleção das bactérias
transformadas. As placas contendo as células semeadas foram incubadas a 37ºC por 18 horas.
7.5. Extração de DNA plasmidial
Clones obtidos nas placas de transformação foram selecionados para realização da
extração de DNA plasmidial a fim de verificar a clonagem dos insertos no vetor pGEM T
Easy. Para tanto, as colônias dos clones selecionados foram incubadas em inóculos de 2 mL
de meio líquido LB e ampicilina (100 µg/mL) durante 18 horas a 37°C sob agitação (180
rpm). A partir destes inóculos, foram realizadas minipreparações de DNA (modificado de
SAMBROOK e RUSSEL, 2001), iniciadas com a centrifugação de 1,5 mL do pré-inóculo em
tubo eppendorf a 15.300 g por 5 minutos. O sobrenadante foi descartado e o sedimento
Lima, R. P. 50
ressuspendido em 100 µL de GTE, e a este, foram adicionados 200 µL de uma solução de
NaOH 0,2N, SDS 10%, e o conteúdo do tubo foi misturado por inversão 4 a 5 vezes e
mantido no gelo por 5 minutos. Posteriormente, 150 µL de Tampão Acetato de Potássio
gelado (acetato de potássio 3 M e ácido acético 11,5% v/v) foi adicionado e também
misturado por inversão do tubo 4 a 5 vezes e mantido no gelo por 5 minutos. Os tubos foram
centrifugados a 15.300 g por 5 minutos e o sobrenadante transferido para um novo tubo
eppendorf, onde foi adicionado NaCl para uma concentração final de 0,3 M e 2,5 volumes de
etanol 100% e mantido a –20ºC por pelo menos 1 hora. Os tubos foram novamente
centrifugados a 20.800 g por 10 minutos, o sobrenadante foi descartado e o sedimento seco a
temperatura ambiente. Em seguida, o sedimento foi ressuspendido em 30 µL de H2O com
RNAse A (20 µg/mL) e incubado a 55ºC por 15 minutos e, posteriormente, acondicionado a –
20ºC. Alíquotas das minipreprarações foram resolvidas em gel de agarose 1% corado com
Brometo de Etídio e algumas das minipreparações foram selecionadas para digestão pelas
enzimas de restrição BamH I e Hind III para confirmação da clonagem pelo padrão de bandas
observadas. Após confirmada a clonagem (também ratificada pelo seqüenciamento dessas
extrações de DNA, realizada como descrito no tópico “7.6.” a seguir), algumas
minipreparações foram selecionadas e 5µL destas empregadas na transformação por choque
térmico de células competentes de E. coli da linhagem DH10B para realização de
maxipreparação, extração de DNA em larga escala (SAMBROOK e RUSSEL, 2001), a fim
de realizar as etapas de subclonagem seguintes nos vetores planejados.
7. 6. Análise de seqüências dos genes TbEIF4G1 e TbEIF4G2 clonados
Para o sequenciamento das construções plasmidiais TbEIF4G1/pGEM T Easy,
TbEIF4G1-HD/pGEM T Easy, TbEIF4G1Y/pGEM T Easy, TbEIF4G2-HD/pGEM T Easy e
Lima, R. P. 51
TbEIF4G2Y/pGEM T Easy (a construção TbEIF4G2/pGEM T Easy não foi seqüenciada visto
que não foi obtido sucesso na clonagem do TbEIF4G2 completo flanqueado pelos sítios
BamH I, na extremidade 5’, e Hind III, na 3’), foram empregados os pares de primers
utilizados nas amplificações por PCR dos fragmentos e primers próprios do vetor. Para as
TbEIF4G1/pGEM T Easy, TbEIF4G1Y/pGEM T Easy e TbEIF4G2Y/pGEM T Easy foram
construídos outros primers internos para o sequenciamento (tabelas 3 e 4), a fim de tornar
possível o sequenciamento completo desses fragmentos.
Tabela 3: Seqüência dos primers utilizados para sequenciamento dos fragmentos TbEIF4G1 e TbEIF4G1Y
clonados no vetor palsmidial pGEM T Easy. Além desses, foram empregados os primers utilizados para
clonagem de cada inserto e os próprios do vetor pGEM T Easy (M13F e M13R)
Primer Seqüência
TbEIF4G1S1 GCGCGTACGGTTTCTTATGAT
TbEIF4G1S2 TACGCAACGACGCCTACGCTACGA
TbEIF4G1S3 ATGCTACAAATGGGGATGCTGC
TbEIF4G1S4 CTTTGCTGATGACGGGACTG
TbEIF4G1S5 CCCGTCATCAGCAAAGCAATC
Tabela 4: Seqüência dos primers utilizados para sequenciamento do fragmento TbEIF4G2Y clonado no
vetor palsmidial pGEM T Easy. Além desses, foram empregados os primers utilizados para clonagem do
inserto e os próprios do vetor pGEM T Easy (M13F e M13R)
Primer Seqüência
TbEIF4G2S1 ACTGCGTATTAGACTGCTCCTG
TbEIF4G2S2 CGGCAGTGCGGGGGAACG
Lima, R. P. 52
As construções foram seqüenciadas no Núcleo de Plataformas Tecnológicas do
Instituto Aggeu Magalhães. O resultado dos seqüenciamentos foi analisado pelos programas
EditSeq (para edição dos contigs obtidos e da seqüência consensual gerada), SeqMan (para
junção dos contigs obtidos no sequenciamento) e MegaAlign (para alinhamento das
seqüências finais resultantes com aquelas depositadas no banco de dados do projeto genoma
de T. brucei) do DNASTAR.
7.7. Subclonagem dos genes TbEIF4G1 e TbEIF4G2 e fragmentos TbEIF4G1-HD e
TbEIF4G2-HD no vetor plasmidial pET21a
As maxipreparações das construções plasmidiais TbEIF4G1-HD/pGEM T Easy,
TbEIF4G1/pGEM T Easy, TbEIF4G2-HD/pGEM T Easy e TbEIF4G2Y/pGEM T Easy foram
então digeridas para subclonagem em vetor plasmidial pET21a (Novagen) (figuras 15 e 16).
Uma alíquota do vetor selvagem pET21a e da construção TbEIF4G2Y/pGEM T Easy foram
digeridas pelas enzimas de restrição Hind III e Not I e outra alíquota do mesmo vetor e das
demais construções, digeridas pelas enzimas BamH I e Hind III. Os fragmentos obtidos
foram eletroeluídos conforme descrito anteriormente (tópico “7.3.”). Cada inserto, purificado
e digerido, foi ligado ao vetor, purificado e digerido, com 0,5 µL de enzima T4 DNA Ligase
(400,000 U/mL), sendo mantido na ligação aproximadamente 250 ηg de vetor para cada
reação de ligação, 1 µL do tampão de ligação da T4 DNA Ligase, 0,5 µL da enzima e
variando entre 30 ηg e 150 ηg de inserto. A água foi utilizada para completar um volume de
10 µL por ligação e a reação foi mantida a 18ºC por 20 horas.
Lima, R. P. 53
Figura 15: Esquema da clonagem dos fragmentos TbEIF4G1 e TbEIF4G1-HD no vetor plasmidial pET21a.
Figura 16: Esquema da clonagem dos fragmentos TbEIF4G2Y e TbEIF4G2-HD no vetor plasmidial
pET21a.
As ligações foram empregadas na transformação por choque térmico de células de E.
coli da linhagem DH10B (conforme mencionado no tópico “7.4.”). Alguns clones
TbEIF4G1/pGEM T Easy
TbEIF4G1/pET21a
pET21a
pGEM T Easy TbEIF4G1
TbEIF4G1-HD/pGEM T Easy
TbEIF4G1-HD/pET21a
pET21a
pGEM T Easy TbEIF4G1-HD
Hind III Hind III Hind IIIBamHIBamHIBamHI Hind IIIBamHI
TbEIF4G1/pGEM T Easy
TbEIF4G1/pET21a
pET21a
pGEM T Easy TbEIF4G1
TbEIF4G1-HD/pGEM T Easy
TbEIF4G1-HD/pET21a
pET21a
pGEM T Easy TbEIF4G1-HD
Hind III Hind III Hind IIIBamHIBamHIBamHI Hind IIIBamHI
TbEIF4G2Y/pGEM T Easy
TbEIF4G2Y/pET21a
pET21a
pGEM T Easy TbEIF4G2Y
TbEIF4G2-HD/pGEM T Easy
TbEIF4G2-HD/pET21a
pET21a
pGEM T Easy TbEIF4G2-HD
Not I Not I Hind III Hind IIIBamHIBamHIHind III
Hind III
TbEIF4G2Y/pGEM T Easy
TbEIF4G2Y/pET21a
pET21a
pGEM T Easy TbEIF4G2Y
TbEIF4G2-HD/pGEM T Easy
TbEIF4G2-HD/pET21a
pET21a
pGEM T Easy TbEIF4G2-HD
Not I Not I Hind III Hind IIIBamHIBamHIHind III
Hind III
Lima, R. P. 54
selecionados da transformação foram utilizados para extração de DNA plasmidial e,
posteriormente, digestão pelas enzimas de restrição BamH I e Hind III, para TbEIF4G1-
HD/pET21a, TbEIF4G1/pET21a e TbEIF4G2-HD/pET21a, ou Hind III e Not I, para
TbEIF4G2Y/pET21a, para checagem da clonagem.
7. 8. Expressão das proteínas recombinantes TbEIF4G16xHis, TbEIF4G26xHis, TbEIF4G1-
HD6xHis e TbEIF4G2-HD6xHis em Escherichia coli
As clonagens TbEIF4G1-HD/pET21a, TbEIF4G1/pET21a, TbEIF4G2-HD/pET21a
e TbEIF4G2Y/pET21a confirmadas foram então empregadas na transformação de bactérias E.
coli da linhagem BL21star para realização da expressão das proteínas recombinantes
fusionadas a seqüência de 6 histidinas na região C-terminal (devido a sua clonagem no vetor
pET21a). Para transformação, foram empregadas quantidades de DNA acima de 50 ηg da
extração de DNA plasmidial em larga escala (maxpreparação) e 50 µL de célula E. coli
BL21star competente (com eficiência de transformação maior que 2x103 UFC por µg de
DNA). As células foram submetidas a choque térmico e plaqueadas em ágar LB com
ampicilina (conforme descrito no tópico “7.4.”).
Dos clones obtidos no plaqueamento, alguns foram selecionados para confecção do
pré-inóculo para o ensaio de expressão em pequena escala (mini-indução). Para isso, uma
colônia foi adicionada a 2 mL de meio LB líquido com ampicilina (100 µg/mL) e mantida a
175 rpm por 16 horas a 37ºC. Então, 200 µL desse pré-inóculo foi adicionado ao inóculo de 2
mL de meio líquido LB com ampicilina (100 µg/mL) e mantido a 175 rpm por 2 horas a 37ºC,
quando foi adicionado IPTG (isopropil-tio-β-D-galactopiranosídeo) para uma concentração
final de 0,1 mM . O inóculo foi mantido a 175 rpm por 3 horas a 30ºC para que as células
expressassem as proteínas recombinantes e ao término desse tempo, uma alíquota de 200 µL
Lima, R. P. 55
foi retirada e centrifugada a 15.300 g por 5 minutos, o sobrenadante foi descartado e o
sedimento ressuspendido em tampão de amostra (Laemmli) para gel de proteína SDS-PAGE
duas vezes concentrado (LE2X – 4% SDS, 20% glicerol, 10% 2-mercaptoetanol, 0.02% azul
de bromofenol, 0.125 M Tris-HCl, pH 6.8) e fervido em banho-maria por 5 minutos. Uma
alíquota das expressões foi resolvida em gel SDS-PAGE 15% para checagem do resultado do
ensaio.
Após a verificação dos resultados das mini-induções, foi procedida a expressão das
proteínas recombinantes TbEIF4G16xHis, TbEIF4G1-HD6xHis, TbEIF4G26xHis e TbEIF4G2-
HD6xHis em larga escala (maxi-induções). Para tanto, uma colônia transformada com a
construção do inserto em pET21a foi utilizada para confecção de um pré-inóculo com 20 mL
de meio líquido LB com ampicilina (100 µg/mL), mantido a 175 rpm por 16 horas a 37ºC.
Após isso, uma alíquota de 5 mL do pré-inóculo, foi transferida para 250 mL de meio LB com
ampicilina (100 µg/mL) e mantido a 175 rpm e 37ºC até que atingisse a densidade ótica
(O.D.) de 0,5, quando foi adicionado IPTG para uma concentração final de 0,1 mM e mantido
a 175 rpm por 3 horas a 30ºC. Ao término desse período, a cultura foi centrifugada a 20.800 g
por 10 minutos e as proteínas expressas foram submetidas à purificação por resina de níquel
ou, quando não purificadas, as células sedimentadas foram solubilizadas em LE2x e fervidas.
7. 9. Purificação das proteínas TbEIF4G1-HD6xHis e TbEIF4G2-HD6xHis
Os sedimentos celulares das induções em larga escala obtidos após centrifugação
foram ressuspendidos em 20 mL de tampão PBS e lisados por ultra-sonicação (6 pulsos com
amplitude de 50, duração de 30 segundos cada pulso). Foi então adicionado Triton X-100 para
uma concentração final de 1% (200 µL) às amostras sonicadas e estas foram submetidas à
nova centrifugação a 15.000 g por 10 minutos a 4°C. Os sobrenadantes foram recuperados e a
eles foram adicionados 200 µL de resina Ni-NTA agarose (QIAGEN), lavada previamente
Lima, R. P. 56
por três vezes com 10 mL de PBS. Ao sobrenadante do sonicado e resina, foi também
adicionado imidazol para uma concentração final de 5 mM e estes permaneceram incubando
por 1 hora sob agitação constante a 4ºC. Decorrido o tempo da incubação, o material foi
centrifugado a 3.750 g e a resina lavada três vezes com 1 mL de PBS. Outras duas lavagens
foram realizadas, para desligamento de proteínas ligadas inespecificamente à resina, com
tampão de lavagem (50 mM fosfato de sódio, 300 mM NaCl, 10% glicerol, pH: 6.0)
adicionado de imidazol (concentração final de 20 mM). A eluição das proteínas ligadas à
resina foi realizada através da incubação no tampão de lavagem adicionado de imidazol para
0,5 M e 1,0 M, concentrações finais, por 10 minutos para cada uma das duas eluições. Após
as eluições, a resina foi ressuspendida em 200 µL de PBS e as amostras obtidas (sedimento do
sonicado, sobrenadante de resina, resina, lavagens e eluatos) congeladas a -80°C. Alíquotas
das amostras foram diluídas em LE2X e fracionadas em gel SDS-PAGE 15% e o gel corado
com Azul de Comassie R-250 para verificação da eficiência da purificação.
As proteínas que não foram adequadamente purificadas com a resina, devido
possivelmente à baixa solubilidade das mesmas, foram submetidas a uma variação desse
método de purificação com uréia, para desnaturação e solubilização das proteínas insolúveis.
Nesse método, o sedimento obtido após sonicação é ressuspenso em 6 mL de tampão de
ligação (50 mM fosfato de sódio, 300 mM NaCl, 10% glicerol, 8 M uréia, 10 mM imidazol,
pH: 8.0). As demais etapas são as mesmas, mas todos os tampões de lavagem são adicionados
de uréia para concentração final de 8 M.
7. 10. Imunização de coelhos para obtenção do soro policlonal
Para imunização, 150 µg das proteínas recombinantes TbEIF4G1-HD6xHis e
TbEIF4G2-HD6xHis, solubilizadas diretamente do extrato de E. coli das respectivas maxi-
induções, foram resolvidas em géis SDS-PAGE 15% e estes, em seguida, corados com Azul
Lima, R. P. 57
de Comassie R-250. As bandas referentes às proteínas foram excisadas dos géis e maceradas
por sistema de válvulas adequado. Ao macerado foram adicionados 200 µL de adjuvante de
Freund (Sigma-Aldritch Co.), sendo adjuvante completo para a primeira imunização e
incompleto para as demais, e 1 ml de PBS. A mistura foi aplicada subcutâneamente nos
coelhos em 5 pulsos, com intervalos de 15 dias entre os mesmos. Foi colhido sangue antes da
aplicação da 1ª amostra (soro pré-imune) e 7 dias após as 3ª e 5ª aplicações (sangria de prova
e total, respectivamente). O sangue obtido foi acondicionado a 4°C por 24 horas, para retração
completa do coágulo e em seguida centrifugado a 4.500 g por 10 minutos a temperatura
ambiente para separação do soro e do coágulo. O soro foi recuperado e estocado a -80°C.
7. 11. Purificação dos anticorpos obtidos por imunoadsorção
Para aumentar a especificidade do reconhecimento dos anticorpos obtidos e
melhorar a resposta do sinal, os soros anti-TbEIF4G1 e anti-TbEIF4G2 produzidos foram
submetidos a imunoadsorção. Para isso, 120 µg de proteína recombinante, TbEIF4G1 ou
TbEIF4G2, foram fracionados em gel SDS-PAGE 15% e transferidos para membrana de
transferência de PVDF (Fluoreto de Polivinilideno) (Immobilon-P, Millipore Corporation) e a
membrana, após transferência, corada com Ponceau S (Sigma-Aldritch Co.) em solução de
ácido tricloroacético. A banda correspondente à proteína de interesse foi excisada da
membrana e cortada em pequenos pedaços e transferida para um tubo eppendorf. A
membrana foi então lavada 3 vezes com 1mL de PBS por 5 minutos cada e bloqueada com
solução de leite 5% em PBS-Tween 20 (PBS adicionado de 0,01% Tween 20) durante 30
minutos a 4ºC. A solução bloqueadora foi removida e a membrana lavada rapidamente uma
vez com PBS. Foi então adicionado 1mL do soro obtido da imunização e a membrana
permaneceu incubando por no mínimo 18 horas sob agitação constante. Ao término da
incubação, os anticorpos adsorvidos à membrana foram eluídos com 200 µL de solução de
Lima, R. P. 58
glicina (glicina-HCl 0,1 M, pH 2,5) por agitação vigorosa durante 5 minutos a temperatura
ambiente. Posteriormente, a solução de glicina com os anticorpos eluídos foi recuperada para
novo tubo eppendorf e o pH da solução foi neutralizado pela adição de 20 µL de Tris-HCl
(1 M, pH 8,0). O soro purificado obtido foi estocado a –80ºC.
7. 12. Ensaios de reconhecimento das proteínas recombinantes pelo soro policlonal
O reconhecimento das proteínas TbEIF4G1 e TbEIF4G2 por seus respectivos
anticorpos policlonais foi verificado por ensaios de “western-blot”, sendo empregadas
diferentes diluições para as proteínas purificadas e extratos protéicos totais de fase procíclica
e sanguínea de T. brucei. Também houve variação na concentração dos anticorpos purificados
utilizados. Os ensaios de “western-blot” foram iniciados com o fracionamento das proteínas e
extratos em gel SDS-PAGE 15% e transferência para membranas de PVDF, as quais sofreram
bloqueio em solução de leite a 5% em TBS-Tween 20 (20 mM Tris, 500 mM NaCl, Tween 20
1%, pH 7,5) por 1 hora. Posteriormente, foram incubadas com os anticorpos purificados em
diluições finais de 1:500 ou 1:1000 tanto para o anti-TbEIF4G1 quanto para o anti-TbEIF4G2
em solução de leite a 2,5% em TBS-Tween 20 por 50 minutos. As membranas foram lavadas
3 vezes com TBS-Tween 20 por 7 minutos cada. Realizou-se nova incubação, durante 50
minutos, com o segundo anticorpo (anti-IgG de coelho, Jackson Immunoresearch
Laboratories), marcado com peroxidase, numa diluição fixa de 1:10.000 numa solução de leite
a 1% em TBS-Tween 20. Decorrido esse tempo, foram novamente lavadas 3 vezes com TBS-
Tween 20 por 7 minutos cada. Após essas lavagens, as membranas foram banhadas em 25 mL
de solução quimioluminescente (25 mL de luminol 1,2 mM diluído em solução de Tris-HCl
0,1 M de pH 8,5, adicionado de iodofenol para uma concentração final de 0,4 mM e de
peróxido de hidrogênio para 0,03%) por 1 minuto e secas em seguida e, posteriormente, dois
filmes de auto-radiografia foram expostos às membranas durante 10 minutos e 1 minuto,
Lima, R. P. 59
respectivamente. O filme, impressionado pela reação, foi revelado com uma solução de
Dektol (1:2) até saturação da revelação, cerca de 2 minutos. A reação de revelação foi
interrompida em solução de ácido acético por 1 minuto e fixada por 5 minutos em solução
fixadora.
7.13. Ensaios de Imunocitoquímica
A determinação da localização subcelular das proteínas TbEIF4G1 e TbEIF4G2 foi
iniciada por ensaios de imunocitoquímica. Para tanto, células procíclicas de T. brucei da
linhagem 427 foram cultivadas em fase exponencial em meio SDM 79, com soro fetal bovino
(10% v/v), ampicilina (0,1%) e estreptomicina (0,1%), e 5x106 células cultivadas foram
empregadas para cada reação. A fim de iniciar os ensaios, as células cultivadas foram
centrifugadas a 1600 g por 10 minutos a 25ºC, posteriormente lavadas com PBS e depois
fixadas em meio SDM 79, sem soro e sem hemina, com para-formaldeído, para concentração
final de 3%, por pelo menos 10 minutos a temperatura ambiente. As células foram então
centrifugadas a 1600 g por 10 minutos a 25ºC, lavadas 3 vezes com PBS (a cada lavagem
seguiu-se uma centrifugação de 1600 g por 10 minutos a 25ºC) e aderidas a lamínulas
incubadas previamente com poli-L-lisina (Sigma-Aldritch Co.) por 15 minutos. Após os 15
minutos, as lamínulas foram lavadas por 10 minutos com solução de lavagem PBS-glicina 20
mM e as células a ela aderidas foram permeabilizadas com solução de Triton 100x (Sigma-
Aldritch Co.) a 0,1% por 10 minutos. As lamínulas foram novamente lavadas por 10 minutos
com solução PBS-glicina 20mM e bloqueadas por 20 minutos com solução PBS-glicina
20mM adicionada de BSA 1%. Foi então adicionado o primeiro anticorpo, anticorpo
purificado anti-TbEIF4G1 ou anti-TbEIF4G2, nas diluições de 1:25 ou 1:50, e incubou-se
durante 1 hora a 37ºC. Após a incubação, as lamínulas foram lavadas por mais 10 minutos
com a mesma solução de lavagem e o anticorpo secundário conjugado ao Alexa Flúor 488 foi
Lima, R. P. 60
adicionado para uma diluição final de 1:500. As células foram mantidas no escuro por 1 hora
a 37ºC para ligação do anticorpo secundário, e após esse período, ainda no escuro, as
lamínulas foram lavadas por 10 minutos com solução de lavagem, posteriormente secas e
empregadas na montagem de lâminas com 10 µl de Prolong Gold (Invitrogen Co.). As
lâminas foram acondicionadas a 4ºC e protegidas da luz. O resultado da imunocitoquímica foi
visualizado em microscópio confocal utilizando o comprimento de onda de laser de 514 ηm
para excitação e emissão de 527 ηm e programa de microscopia Leica SPII-AOBS.
7. 14. Subclonagem dos genes TbEIF4G1 e TbEIF4G2 no vetor p2216
A subclonagem dos genes TbEIF4G1 e TbEIF4G2 no vetor p2216 foi realizada a
partir da digestão das construções TbEIF4G1Y/pGEM T Easy, TbEIF4G2Y/pGEM T Easy e
do vetor p2216 pelas enzimas de restrição Hind III e BamH I, e conseqüente eletroeluição,
conforme descrito anteriormente (tópico “7.3.”) e ligação (conforme tópico “7.7.) (figura 17).
Figura 17: Esquema da subclonagem dos fragmentos TbEIF4G1Y e TbEIF4G2Y no vetor plasmidial p2216.
TbEIF4G1Y/pGEM T Easy
TbEIF4G1Y/p2216
p2216
pGEM T EasyTbEIF4G1Y
TbEIF4G2Y/pGEM T Easy
TbEIF4G2Y/p2216
p2216
pGEM T EasyTbEIF4G2Y
BamHI BamHI BamHI BamHIHind IIIHind IIIHind IIIHind III
TbEIF4G1Y/pGEM T Easy
TbEIF4G1Y/p2216
p2216
pGEM T EasyTbEIF4G1Y
TbEIF4G2Y/pGEM T Easy
TbEIF4G2Y/p2216
p2216
pGEM T EasyTbEIF4G2Y
BamHI BamHI BamHI BamHIHind IIIHind IIIHind IIIHind III
Lima, R. P. 61
Depois de obtidas as ligações TbEIF4G1Y/p2216 e TbEIF4G2Y/p2216, as mesmas
foram utilizadas na transformação de bactérias de E. coli da linhagem DH10B e os clones
obtidos, empregados nas minipreparações de DNA plasmidial (descritas no tópico “7.5.”),
para confirmação das clonagens pela digestão com as enzimas de restrição BamH I e Hind III
e, posteriormente, em maxipreparações de DNA plasmidial a fim de obter quantidade de DNA
suficiente para realizar as transfecções em T. brucei.
7.15. Superexpressão dos fatores in vivo fusionados a proteína fluorescente amarela
(EYFP)
As construções TbEIF4G1Y/p2216 e TbEIF4G2Y/p2216 foram empregadas na
transfecção de T. brucei a fim de se verificar a localização subcelular dos fatores TbEIF4G1 e
TbEIF4G2 na forma procíclica desse parasita. Para realização da transfecção, entre 20 e 40 µg
de DNA das construções foi linearizado por digestão com a enzima de restrição Not I. Após
completada a linearização e verificada por migração eletroforética em gel de agarose, o DNA
linearizado foi precipitado, com 0,3 M de NaCl e 2,5 volumes de etanol absoluto por 18 horas
a –20ºC e posteriormente centrifugado a 28.000 g por 10 minutos seguido de ressuspensão em
50 µL de água. As construções linearizadas foram colocadas em cubetas para eletroporação de
eucariotos (gap da cubeta de 0,4 mm) previamente resfriadas. Posteriormente, foi adicionado
às cubetas cerca de 4x107 células procíclicas de T. brucei da linhagem recombinante 29-13.
As células utilizadas na transfecção foram previamente cultivadas em fase
exponencial, em meio SDM-79, adicionado de soro fetal bovino (10% v/v), ampicilina e
estreptomicina (0,1%), higromicina (25 µg/mL) e neomicina (15 µg/mL), e centrifugadas a
600 g por 10 minutos, lavadas com tampão ZPMF gelado (NaCl 4 M, KCl 1 M, Na2HPO4
0,1 M, KH2PO4 0,1 M, acetato de magnésio 0,1 M e acetato de cálcio 0,1 M), centrifugadas
Lima, R. P. 62
novamente a 600 g por 10 minutos e ressuspendidas em 500 µL de tampão ZPMF por reação
(para uma densidade de 4 a 8x107 células/mL).
As células contidas nas cubeta com as construções plasmidiais e uma outra cubeta
sem construção, contendo apenas células e água (controle negativo), foram então submetidas
à eletroporação (3 pulsos, voltagem de 1,7 KV, duração dos pulsos de 150 µs e intervalo entre
os pulsos de 100 µs) e o conteúdo das cubetas foi rapidamente transferido para tubos Falcon
contendo meio SDM-70, adicionado de soro fetal bovino, higromicina (25 µg/mL) e
neomicina (15 µg/mL). A concentração final das células de T. brucei transfectadas foi
monitorada, a cultura diluída quando necessário, de forma a não ultrapassar 5x106 células/mL.
Após 18 horas de incubação a 26ºC, para recuperação das células, foi adicionada fleomicina
(concentração final de 2,5 µg/mL) no meio para seleção dos organismos transfectados,
seleção esta que variou de 10 a 15 dias.
Após a seleção dos transfectados, a concentração de fleomicina foi diminuída para
1,0 µg/mL e, quando os parasitas iniciaram crescimento exponencial, foi adicionado ao meio
tetraciclina (1 µg/mL) para superexpressão das proteínas recombinantes. O resultado da
expressão da proteína TbEIF4G2 fusionadas a EYFP foi visualizado em microscópio confocal
e programa de microscopia Leica SPII-AOBS.
Lima, R. P. 63
8. RESULTADOS
8. 1. Análise das seqüências dos homólogos TbEIF4G1 e TbEIF4G2 do fator de iniciação
da tradução eIF4G encontrados em Trypanosoma brucei
O fator de iniciação da tradução eIF4G, apesar de desempenhar uma função
indispensável na formação do complexo 48S e, dessa forma, mediar o início da biossíntese de
proteínas, apresenta pouca conservação na sua seqüência entre os diversos organismos.
Entretanto, a região HEAT central desse fator, responsável por sua ligação aos eIF4A e
mRNA, apresenta um nível maior de conservação. Devido a esta constatação, essa região
HEAT do eIF4G de humanos e de leveduras foi empregada para identificação de possíveis
homólogos ao fator eIF4G em Leishmania major, e, posteriormente, em Trypanosoma brucei
e Trypanosoma cruzi, através da comparação em bancos de dados de genomas de
tripanossomatídeos. Dessa forma, foram identificados os LmEIF4G1-5, em L. major,
TbEIF4G1-5, em T. brucei e TcEIF4G1-5, em T. cruzi, respectivamente (Dhalia et al., 2005).
Diversos trabalhos têm sido realizados com os fatores LmEIF4G1-5 e TbEIF4G3-5,
trazendo avanços quanto ao conhecimento da importância dessas proteínas em seus parasitas
(Dhalia et al., 2005; Yoffe et al., 2009; Reis C. R. S., Nascimento, D. M. N. e cols,
manuscrito em redação). Não obstante, pouco havia sido feito com relação aos TbEIF4G1-2
após sua identificação.
Neste trabalho, inicialmente, foi realizado o alinhamento múltiplo dos fatores
TbEIF4G1-2 com seus respectivos homólogos em L. major e T. cruzi. No alinhamento
referente ao TbEIF4G1 (figura 18), pôde ser observado pequena diferença no tamanho entre
as proteínas de T. brucei, T. cruzi e L. major. Além disso, há uma grande conservação na
seqüência dos três homólogos, principalmente no que concerne a região N-terminal, onde é
observada uma conservação ainda maior na região correspondente ao domínio HEAT (do
Lima, R. P. 64
resíduo K192 ao V405, numeração do TbEIF4G1), e na porção C-terminal. Nesta porção, foi
verificada a presença de dois resíduos conservados de triptofano (W1068 e W1108,
numeração do TbEIF4G1), sugestivo de um possível motivo W2, responsável no eIF4G
humano pela sua interação com a quinase Mnk1, que atua fosforilando o eIF4E. Estes
resíduos encontram-se conservados nos três ortólogos do EIF4G1 analisados.
No alinhamento do TbEIF4G2 (figura 19) com seus respectivos ortólogos em T.
cruzi e L. major, foram observadas maiores discrepâncias entre os fatores. O fator LmEIF4G2
apresenta-se muito maior que seus respectivos ortólogos nos outros organismos verificados e
os fatores apresentam menor conservação entre suas seqüências. Entretanto, como visto para o
alinhamento do TbEIF4G1, a porção correspondente ao domínio HEAT (L136 ao Q409,
numeração do TbEIF4G2) também apresenta um grau elevado de conservação. Foi também
constatado certo grau de similaridade para a região C-terminal, apesar de menor que a
verificada para o TbEIF4G1 e seus homólogos. De forma similar ao observado para o
TbEIF4G1, há nessa região dois resíduos conservados de triptofano (545W e 607W –
numeração do TbEIF4G2), indicando um possível motivo W2. Todavia, esses resíduos de
triptofano encontram-se numa porção pouco conservada, variável em extensão entre os vários
ortólogos de EIF4G2.
Lima, R. P. 65
⇓ LmEIF4G1 1 MLMETQICRS LIDRERRTES VFRPP-KFVK CVPPHKKTLT ATARPWYPTS A--------- DVEKKPVTPP RLI PAPPTAL GQSPDVKPKS APVLAPLTDL TbEIF4G1 1 MNCSAPGLYS LVTNEVWKPS VFRPPTLQKR SRPVAKTTLT PMAQPWYPSN ANGGCDSTSS GPQSCQKDGP RLLPPP-- AL GQSPTFG--- SDIEKEFPTV TcEIF4G1 1 MFTVTPGPLS LARSETWKPS VFRPPTRIL K AAPLTNRGVT LLPRP----- ---- CNSGSN VAEEQTPKEP RLLPPP-- AL GQSPCLKP-- TPSCANLPPV ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ LmEIF4G1 91 SMQSLQSSLF SPLSTPVHTF FHTI TEVATA ARVYPVEMFM SVRKDASHTP HGVLRWCVQQ YLEVPTLKVP THLQLSMSEV -LNSEDGIS R GALGSGLK- G TbEIF4G1 96 LCS--- SSVV APTATCATRR ASAFTKAAME ARTYPLDMFM SVSKDAAHTP YGVLCWAVKQ YVTCSYLKVP THLQLSLRDF GGRPAEVDAR GLMGTCLK-V TcEIF4G1 88 GSS--- SSSF LSLSADVNTC SQKFTEAATE KRVYPPEMFL SARRDAAHTP YGVLRWVVRH YLHI PSLKVP THLQLSLNET -DEADDGLTR GALGCSLRGG ▲ ▲ DOMÍNIO HEAT-MIF4G ************************************************************************************************************* LmEIF4G1 189 RTRAKPVRQV HHKVMSVLSR ITP QKFTELL QELTQLPLRQ TDESELHEVV KVFFDKAVQE PEYSELYARL FSELCEMKDG ERELEAELRD RLFCNRIN RE TbEIF4G1 192 KSRAKPVRLT HHKVLSILSR LTEAKYDTLL SELKLLPLRQ VEDDELSEIC KI VFEKAVSE PSYTSLYARL AQDVCKEKKE ER--DSSVWN EGFQRRFRRT TcEIF4G1 184 RTRAKPVRLT HHKVMSILSR ITPAKYDVLL DEMMLLPLRQ LEDTELLEIC KVVFEKAVQE PAYSGLYARL AQDVCSMKDG GR-- ETEPRD QSFSRRFRRM DOMÍNIO HEAT-MIF4G ************************************ *************************************************** ********************** LmEIF4G1 289 LLHTCDEEFH RPIE LTADEK VDRTTGKPYS DEEVDMKRTR LKNRLVGNIK FLGELFKI NL VTDRVVENMF KLLVGDFDPS NPVEREDYIF EVFSTLI RTV TbEIF4G1 290 LVKLCEVQFH QPLQLSGDDV VDRTTGTPLD EEEVEMKRSR LKHRLVGNIR FVAELFKVGV LSGRVVTEIV QILV SDYNPD APTAKEEHVF ELFTTLLRLT TcEIF4G1 282 LIAS CEAQFQ RPLQLSADEL VDRVTGVPLG EEEVEGRRTR LKDRLVGNIR FVAELFKIGF VTERVI EDVI RILV RDYNPD EPTAKEEAIF EVFQTLLRHT ▲ DOMÍNIO HEAT-MIF4G ************************************ ************************************ LmEIF4G1 389 GPI LKERRPL VLARYLGVAK AVENSHPRPR I RFLMMDLSD LNKKQGWVST ERVMREADSC DDLQRS---- ----S SMKHI DSVASTSFLQ SSIMSPSEDN TbEIF4G1 390 AAQLKDCEVN LLI RSLGIAK TIELSHPKPR VRFLMMDLGD LNRKNGWVEQ EQIQSHVKEP KQLKKVPGPA PAAPASPTTS TPTAKRAEKL GSRLRDMSSR TcEIF4G1 382 GAVLKEHMPQ LLAQSLGIAK TIELSHPKPR VVFLMMDLSD LNRANGWVSP ELVEQHVQRP TKTGRAKKNN VTAGEKSATI VPPMSLASLV STVEKKTARN ▲ LmEIF4G1 481 TMQRCDFALP RP-------- ---------- -----ASVAF RDNSGFGTSI TI S------- ---------- ---------- ---- PSTPSN SPTLSRAYVP TbEIF4G1 490 CCADAEVSLR KENGNGTQTP GSTSYGNKVA DGCADGGNNK NNNGGVSNAV KTNSNGKHTS RTGIENRSGS DETAKVKPSN GAAVPSSAKQ STNASRRVSH TcEIF4G1 482 SLDAGRTAAS TPPLNGEQEV NGANNPVSVN HVNVHGKEIV KEDGSINNSI I I TCNNNNGN TSNNKNTSGN ---------- ----LK SSLR STERCSRGQH ▲ ⇓ LmEIF4G1 527 PKPAALSPSH LRPSYN---- - APVQSTMPE RRSPASAYIR PSI DLPASHS LSNAPPHSSL PRSRTSMAG- ---------- --ATEV VNIQ EVTQQLIQNF TbEIF4G1 590 NPYCKLSPAN ILDLK NGDAK AASGNSNI PY TESPLSPAA- SSTDLSLSSS SSGHFHNNQG NGGTAMHSGL CSP-FLERDK MVNERKMNI E KI TMQLMALF TcEIF4G1 568 QPYGQLVLTH VVSGSTENYF NSSMDS--LQ LNSPLTPFG- TGSEKMASCQ PDVRPHQINM SQPQTTSEGI RSPHTFVGST PLTDTTVNMK DVTEQLMSLF ▲ ⇓⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ LmEIF4G1 609 NDPREEATVL NGISAMSLKN KVLCLTWWLR QVTTDTSRFD ------E RQR ITE LLSSI LT SCP-SFQPSD LI SAI I EWIR FDI EKAEYHQ CPRMFENMGH TbEIF4G1 688 RT- GDEETTA TI LHTMGLKN MVMCLTWWLR LATTASGNSD NAQCYGDYSK VAALLSALLS IRNDAYATST VFSTVLEWLR FDMEKHEYES FPGMFEKI AQ TcEIF4G1 665 RN- GEEATAV SMLRGMELKN MVVCLTWWLR LATTKTSSFD ------ DRNK VASLLSSLLS NCGGTYDAKT LFLTILEWIR FDVEKGEYDN CPRMFDNMAQ ⇓ ⇓ ⇓ LmEIF4G1 702 MIQRCYAADV STLPNISE VQ NLLHLGLFNV MLHDLTTSNG TDQMVT- LVK SAFSIGVSLL NTIADRKSEA ATLRVALQCR FRI LPYFFSV SNLSETG--- TbEIF4G1 787 MIRQCHLPIT DSLPNVEVVR EIMHGGMFNV LLRELI I NGG ITAP VSDLVK SCHPASAEII CHLHDPADDS QMLFVAAQNR FHFLSYLLCV SSMT------ TcEIF4G1 758 MILQCHLPCN DALPHVDKVR NMVQCGLFNV LLRELTISGG TDQMVT-V VK SCYLVSLQVL KNLHDPDDER QI LRI AAQNR FRLLPYLLSV SSVTSNAMPG ⇓ ⇓ LmEIF4G1 798 I PCIT PQCRT PTTPNTRNI P QMESISS-V G HYDPLSQCML FHKVTDDAEF VVLRRARVDA SER------- TAAWKEALVS LALA-ETGNG STVSQLVQMA TbEIF4G1 880 ------ RIDA QSGFHLRTPL LPPRCNNSQA EWTPLVECLA LPSVASDPES LLFVKMWDHA TNG-----DA ASLWRDEAIR LALETPAGQN STTSSLI SVM TcEIF4G1 857 TPSMRPRVPS SPSLSLRSSP LGESFTN-T G HYDPLAQCLV FPRVTEDPEF VLFRKMRDAA AEVGVFPPTT APRWRDEAVQ LALS- PLGNN STVCELI AVM ⇓ ⇓ ⇓ LmEIF4G1 889 KVI GALLA-- --- CSTVS-- --V NG----- ----TS LLSA TEVDELVCEM LKRRSGPLFQ AMAAMEVIMH HTLSVSGSNP R---K SI RVR QLRLMYSRWC TbEIF4G1 970 RVVGVLLMGL VTKCMTVGAC GTNNGSSGGN ASGAHALAET ADVHYVVSGI LKQHPAPLYQ AATVVELVMH HTRALSGTSE CPTFDNARLK ALKNEFDDWC TcEIF4G1 955 RVVGALLA-- -CSCVTE--- -- NNG----- ----RM LASS ADVDYVVSEI LSKRPGI LYQ GAVAMELIMY HTQTLNDTAE SSKTDSMRLR PLKRI FDQWC ⇓ ⇓ ⇓ LmEIF4G1 968 TLNI FDTTVV LNLLQSLHAP ENSASVYAVY HNALVDAELP WATVLTYLS- - TbEIF4G1 1070 EAGLVDRPAV LELLRVVDAT KDNFNLYPAY HNCVAD-- VP WHVAI RSLGG N TcEIF4G1 1038 AQDI MRRAAV LELLDAFECA GDPFSVYTAY HDNIAD-- VP WHLMLRELRG Y ▲
Figura 18: Alinhamento das seqüências de aminoácidos do EIF4G1 dos bancos de dados de genoma de
T. brucei, T. cruzi e L. major. As proteínas apresentam pequena diferença de tamanho e alta similaridade,
notadamente no domínio HEAT-MIF4G e na região C-terminal. Observa-se a conservação de dois triptofanos
nessa região, indicativos de um possível motivo W2 (setas azuis). Os resíduos de aminoácidos destacados em
vermelho correspondem aos aminoácidos das seqüências originais onde foram encontrados polimorfismos nas
seqüências clonadas empregadas neste trabalho (ver tópico “8. 4.” adiante).
Lima, R. P. 66
LmEIF4G2 1 MEHSGRGVLS PARRCSSVPR NLEGSRSSPS SFYAFPSTLN DILFGPRQRL TKYADGMQAL PYASSAPTIE EAEVAAAGPL ADARAEDAAA ATATEAVKSR TbEIF4G2 1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- TcEIF4G2 1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------M EPLRAASVEK PRRTSSVPGS LmEIF4G2 101 SREAAAKQAA KEKVVTVAPA EQEAASKPLE EDSAAVLAVA PVETESAATA QIGADAPDDA AAPTAAHEAE SMAKEEEGGK TDASLDYVAN EAPSRTFIVV TbEIF4G2 1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- TcEIF4G2 22 LTRASHRRSI PQSLVDALCA ARESFERYGV ISLLETAVRA PVDGVREATL TVLKDDRGEN PQQQQQQMEL STSLPG---- ---------- ---------- LmEIF4G2 201 TADEAEEDTA TTDDAAAAPA GEVANSAGRA DAKTVPEAAA VEQEEGCETA EEAQRSSDAA ERVGAEERET ATVPHNHGRD EATAVAAEPP QLCTTCEMVA TbEIF4G2 1 ---------- ---------- ---------- ---------- -MRTTESSAK PSTNI TEERS EVEEAKTNDN I PR------- ---------- ------- CIP TcEIF4G2 97 ---------- ----VSP APP TTVSSGEAKM EACAASTVRV IGETVEGEMS TTTAVTNKPT SI VSDPPKEK LTASF----- ---------- ------T CLS ⇓ LmEIF4G2 301 FDAAHIAAWM MKYRHETAYV PPGVQRFVHE FNERAAKFTP LRMGGTSPTP SAIGTAAKKG KKVSLSLSSV GSSKTGVGAL ADLPSRDGGG FSSSAALRTG TbEIF4G2 36 YDPEGTVLAM QRLRDVKHRC PAKI ANCLQK I NKEI AEKLT NAGEALSASP STS------- ---------- ---------- ---------- LSSVTVAGPD TcEIF4G2 163 YDATVTREAM KRLKHVVEYC PGRTAAFLEQ LREIV ATTVP EIPAAPPIAV SR-------- ---------- ---------- ---------- LKSNSSAYHT DOMÍNIO HEAT-MIF4G *********************************************** ********************** LmEIF4G2 401 TSVAVKKSNA LEALGDVWEG RQEAPISLAQ GSLRRRGLFG EVEKKKI HHM VVAVLNKVTT DPVKFREVKN ELLRLPIPEA NAEQMTKIVD AFFTKAVREQ TbEIF4G2 99 GRQRTGPPAP LAALPEPWED RLDAPIAVSN TLGRKRGLFG DVERKELHHH VISILNRV AG DATKYREVKN ELLRLPIPEA SDEMLKNIV N VFFMKAVREQ TcEIF4G2 225 ARQ------- LEALSELWGN RRDAPVSVSS TLGRKRGLFG EVERKELHHL VISILNRV SN DTEKYREVKN ELLRLPIPEA NDAMLAKIVD VFFLKAVREQ DOMÍNIO HEAT-MIF4G ************************************ *************************************************** ********************** LmEIF4G2 501 HFSHSYADLI AALCKVPQGQ HIVGDKTQSL EYRLRMALLK RCQAEFLQSI RAEETDASSP TTMATAADDM SSPLVFAIEG AQAIGGETEK ERRDRMCGNV TbEIF4G2 199 HFANLYADLV VELCKVPEGQ RIVGNKSQSL EFRMRQQLLS RCQEEFQRLE EKNIE TANQG ---------- ------ GEDR NTQSADESFK ERRDRACGIV TcEIF4G2 318 HFSNLYADLV SALCKVPGGQ RIVGDKQQSL EYRMRQQLLH RCQMEFRQLE EQSIE RAERG ---------- ------ GEDR ASQGAEESFK ERRDRVCGIV DOMÍNIO HEAT-MIF4G ************************************ *************************************************** ********************** LmEIF4G2 601 RFVCELFLRD IV AASVI SVI FRICCLGSEF G-EFAVPPSY TPTESQVDEI IT VVKTAKER YFVHSAEGRR MLPQLLSQLE YWVKHYAI SR CRFVLMSTVD TbEIF4G2 283 AFVGQLFLRH IVTEKVI MQI LTTTTAGHYG REGLVMPPPY TPSEGQMDEL VKLLGIVDSA FFATPLG- SS MLVVFTDIMV HWSQHHPVLR IR LLLLSVVE TcEIF4G2 402 RFVGELFLRH IVTEKVI GNI LVTACTGLYG REGLCVPPPY TPTESQMDET ITLLGIVD AT FFRTPLG- SS MLVECTQFLQ HWSLRHPVSR IRFLLMSAVE DOMÍNIO HEAT-MIF4G ****************************** LmEIF4G2 700 GLRAMLPKEP ASPMMSGTPS VAAFVTPQLT HISPTQSPPP CDVSEQGVVS AVSPAPLSVA AALPVVTAAD ASGQLSMSST MVGGQPLPAP RSKQVGSVSH TbEIF4G2 382 RLQKKIGEQN AAAQQ-QRQQ QQQQPPGQTR QSAFEGKRPP NSVGDSQRPV SPSSGGNSPL SVSGVPAAVS VAGVEVAARP IQP---- PPA ARN------- TcEIF4G2 501 RLQKLVEERN AAIAA SQEQL QLQQQQQQTT QTADDPQQVQ QSVQDGKRLT NGSVILPQPL SPSNEESYFN STGSRSTSAM AND----MSV KSKQLVFVGG ⇓ LmEIF4G2 800 SDSAGSINGM AATESPVTGA ITRPI VTLTS RSTLQHVRPE AI AKLMAAFS SGQCSADEVA VQLFDTYGNV LPALGAWMDR CLSVVKEEKT RKQTGAVLVA TbEIF4G2 470 SLIPAPRSAA SRQSSI VVTT PLTSTVSTSF AV-KQVATTE TVATYMHNVT RCDCTVDMVV DEI ANAFENV I SVVVVWTER CLTVVKTAKQ RVLFGPFLCS TcEIF4G2 597 KPIPAPRSAA SRQCSVMSIT SSNCFTNFSV QLTKQLATSE NVAQHMQNVT LATRSLEEVV EEI MKSFADY I AVVGVWTER CLTVVKAVKD RSLYGAFLSS ⇓ ⇓⇓ ⇓ LmEIF4G2 900 CVEQLTAHTN ASSEEAAETV AMCREQLHEA AVEALQRAIE GKLYEDLHVF QFWAQLVLSD HARFVYDEEL LNEGLELLVY TAPPAVRSYL VEVGKYMTNV TbEIF4G2 569 VERQCGGTL- ---------- --- KEKLRQV AMDAFRNAVR QKLYEDLAIF KYWTEMICSD TAREVLDETL LNEGLDCVMS FDRSAVRI YL RDVAMQLQQR TcEIF4G2 697 LNRYHKGTS- ---------- --- KQELRKV AMSTFANAVC QRLHEDLGIF KYWAAMILSD TMREVLDEDL LNEALHYLLV NDPAAVKVYL RDVAKHMQAA ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ LmEIF4G2 1000 LVAPEKLPWQ ASTEAQCFVR YRPLLVLHSL VMPGGPSEAQ ALLDNIVSFS DVRQQSLELR LYHAFRTGSP SREVI FEQLR TSPRTTSRDS TLAAEVLSAL TbEIF4G2 655 SSGPQREPSL EKND--- FI R YRPLQVI HAN TAESGVEPI L ALI D----Y P DVRKQSI EI D LYCTIV TDNP PKNVLFDSLA SSP--C LESP LAAAEVFSAL TcEIF4G2 783 SSSP- RTPSD ETTN--- FTR YRPLQVVHRH NTHRKREYEL NVVN---- FP DVRLASMEI H VFCALI TGTP SKEALFDAVR SSS--Y LRCP LMAPEI FSAI ⇓ ⇓ LmEIF4G2 1100 LI AELCSNGD ALVEDNMDLL QITVDGVTRA EREIAI VTEV YEI LR-YTPR PMMMSAAARV LRKFVCMHIV SDETMERADR FYEAERDGAI EKPTQEGVRT TbEIF4G2 746 LHAWLKSGFA NSIQDHVDIC LLAVNNRDRA TREILL LMEL YSVLKNVVPP STRSIEMGEI ALKVLKKGLV TEETRVRAYN YLEPLERNPH HFIG IP---- TcEIF4G2 873 LHAELCSNTT AYLEDNLDLL SLVVDGQDRE I RELLLVAEL YVVLKEGSTE SLRPLSAGAH VMAKLGDSI I SDETRLRAQK YFESRDDCAH HYIG AQ---- LmEIF4G2 1199 LAAPPSAELP RIMDRRGTDD VLLSGSISMR SVNGAVATNS NGNGNNGGGV GGGTGSVDGL QSSNASSFGE FRPRDSHPPR RDADSEHTSS RHSQRQLSPR TbEIF4G2 841 ---------- --------PG SIARSEFES- - SKPVIS TLK ERKSHSGNGS SGAVRRV--- ---------- ---------- ---------- ---------- TcEIF4G2 968 ---------- --------SA QLQARHVPSS GSSSVVNNSS STNSNNNNMN TNSVVRRPAI QRR------- ---------- ---------- ---------- LmEIF4G2 1299 RSNQSNSSFQ TARGGEDNSK RLYRNSYKNR RRSQGEGGNE RQSRAGGSKD ESPQQQPTGS LSTSSNYASS RDGSRHGGGG GRYDRQHGGS RAGRGSGHFD TbEIF4G2 878 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- TcEIF4G2 1013 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- LmEIF4G2 1399 RGRGGSGGGR GNGTALHRGS GGGGKAE TbEIF4G2 878 ---------- ---------- ------- TcEIF4G2 1013 ---------- ---------- -------
Figura 19: Alinhamento das seqüências de aminoácidos do EIF4G2 dos bancos de dados de genoma de
T. brucei, T. cruzi e L. major. O LmEIF4G2 apresenta seqüência maior que seus dois ortólogos e é notada
menor similaridade entre esses do que a verificada para os EIF4G1, não obstante a conservação no domínio
HEAT e região C-terminal, indicativas de um motivo W2 (setas azuis). Os resíduos de aminoácidos
destacados em vermelho correspondem aos aminoácidos das seqüências originais onde foram encontrados
polimorfismos nas seqüências clonadas empregadas neste trabalho (ver tópico “8. 4.” adiante).
Lima, R. P. 67
Apesar das informações obtidas com os alinhamentos múltiplos dos TbEIF4G1-2,
ainda são necessários vários outros ensaios para se identificar o papel que esses fatores
desempenham nos parasitas e sua importância. Assim, para iniciar a caracterização desses
fatores, foi realizada a clonagem dos mesmos e da região correspondente ao seu domínio
HEAT em vetor plasmidial pET21a, para expressão de proteínas recombinantes em
Escherichia coli, a fim de produzir anticorpos policlonais em coelhos com a imunização dos
mesmos com essas proteínas, e em p2216, para superexpressão dos TbEIF4G1-2 fusionados à
EYFP em T. brucei. Ambas metodologias, a superexpressão e o emprego dos anticorpos
obtidos em ensaios de imunocitoquímica, foram úteis na determinação da localização
subcelular dos fatores a partir do qual se pode auxiliar na compreensão de seu papel.
8. 2. Amplificação dos fragmentos TbEIF4G1, TbEIF4G1-HD, TbEIF4G1Y, TbEIF4G2,
TbEIF4G2-HD e TbEIF4G2Y
A fim de que realizar as clonagens dos genes TbEIF4G1 e TbEIF4G2 nos vetores
plasmidiais pET21a e p2216, foi procedida a extração de DNA genômico total de T. brucei
para sua utilização como molde na amplificação dos genes completos TbEIF4G1 e TbEIF4G2
e seus respectivos domínios HEAT. Foi obtida uma banda de alto peso molecular, condizente
com o esperado para o DNA total (figura 20).
Lima, R. P. 68
Figura 20: Extração de DNA genômico total de Trypanosoma brucei. A banda correspondente ao DNA
apresenta alto peso molecular, maior que 12000pb, conforme esperado. Gel de agarose 1% corado com brometo
de etídio.
A partir do DNA total extraído de T. brucei, foram realizadas as PCRs visando
amplificar os fragmentos TbEIF4G1, TbEIF4G1-HD, TbEIF4G2 e TbEIF4G2-HD, para
clonagem no vetor pET21a, a fim de expressar de proteínas recombinantes em E. coli
empregadas na imunização em coelhos e conseqüente produção de soro policlonal, e
TbEIF4G1Y e TbEIF4G2Y, para clonagem no vetor p2216, para superexpressão dessas
proteínas fusionadas à EYFP em T. brucei (tabela 5). Os primers utilizados nas PCRs
apresentavam sítios de restrição para as enzimas BamH I e Hind III, nos primers 5’ e 3’,
respectivamente, para TbEIF4G1, TbEIF4G1-HD, TbEIF4G2 e TbEIF4G2-HD e, 3’ e 5’,
respectivamente, para TbEIF4G1Y e TbEIF4G2Y, a fim de tornar possível a clonagem
adequada desses insertos em seus vetores de destino.
Mar
cado
rDNA g
enôm
ico
tota
l
12000pb
2000pb
1000pbM
arca
dor
DNA gen
ômic
o
tota
l
12000pb
2000pb
1000pb
Lima, R. P. 69
Tabela 5: Fragmentos amplificados com seus respectivos sítios de restrição, tamanho, posição na seqüência
original e vetor de destino.
Fragmento Porção do
gene Sítio 5’ Sítio 3’
Tamanho do gene
correspondente completo
Tamanho do inserto
Peso predito do peptídio
Posição Vetor alvo
TbEIF4G1 gene TbEIF4G1 completo
BamH I Hind III 3357pb 3354pb 122,1kDa 1�3354pb pET21a
TbEIF4G1-HD
domínio HEAT do gene TbEIF4G1
BamH I Hind III 3357pb 882pb 35,47kDa 546�1482pb pET21a
TbEIF4G1Y gene TbEIF4G1 completo
Hind III BamH I 3357pb 3354pb 122,1kDa 1�3354pb p2216
TbEIF4G2 gene TbEIF4G2 completo
BamH I Hind III 2637pb 2634pb 97,34kDa 1�2634pb pET21a
TbEIF4G2-HD
domínio HEAT do gene TbEIF4G2
BamH I Hind III 2637pb 840pb 32,08kDa 408�1248pb pET21a
TbEIF4G2Y gene TbEIF4G2 completo
Hind III BamH I 2637pb 2634pb 97,34kDa 1�2634pb p2216
A partir das reações de PCR, foram obtidos amplicons com 3354pb, correspondente
aos TbEIF4G1 e TbEIF4G1Y, 882pb, correspondente ao TbEIF4G1-HD, 2634pb, relativo aos
TbEIF4G2 e TbEIF4G2Y e 840pb, condizente com o esperado para o TbEIF4G2-HD (figura
21). Apesar de empregadas diversas condições para a amplificação de cada inserto, nem todas
as reações de PCR apresentaram a mesma eficiência. Foi verificado que, enquanto as
amplificações dos TbEIF4G1-HD e TbEIF4G2-HD apresentavam uma única banda de maior
intensidade conforme esperado, as dos TbEIF4G1, TbEIF4G1Y e TbEIF4G2Y apresentavam
diversas outras bandas além da esperada e menor intensidade daquela desejada. A
amplificação do TbEIF4G2 apresentou-se ainda menos eficiente com diversas bandas
inespecíficas e pequena quantidade de DNA de interesse amplificado.
Como pode ser visto a seguir, a eficiência das PCRs teve grande influência no êxito
da clonagem, visto que a partir do DNA amplificado foi realizada ainda a eletroeluição, que
Lima, R. P. 70
reduz a quantidade de material disponível, mas elimina desse material as bandas amplificadas
inespecificamente. Foi verificada uma maior facilidade de clonagem dos TbEIF4G1-HD e
TbEIF4G2-HD, devido possivelmente à maior quantidade de DNA disponível para ligação
em um volume menor, e maior dificuldade para os TbEIF4G1, TbEIF4G1Y e TbEIF4G2Y.
Não foi obtido êxito na clonagem do TbEIF4G2, cuja amplificação foi a menos eficiente.
Lima, R. P. 71
(A) (B) (C)
(D) (E) (F)
Figura 21: Amplificações por PCR dos fragmentos TbEIF4G1 (A), TbEIF4G1-HD (B), TbEIF4G1Y (C),
TbEIF4G2 (D), TbEIF4G2-HD (E) e TbEIF4G2Y (F). As setas pretas indicam os fragmentos de interesse
obtidos nas amplificações por pares de primers específicos, sendo 3354pb para os TbEIF4G1 e TbEIF4G1Y,
visualizados em (A) e (C), 840pb, para TbEIF4G1-HD em (B), 2634pb, para TbEIF4G2 e TbEIF4G2Y em (D) e
(F) e 840pb, para TbEIF4G2-HD em (E).
Após eletroeluição das amplificações obtidas, alíquotas das mesmas foram utilizadas
para checagem do resultado e empregadas também para quantificação do DNA purificado
Mar
cado
rTb
EIF4
G1
2000pb3000pb 3354pb
1000pb
Mar
cado
rTb
EIF4
G1-HD
850pb 882pb
Mar
cado
rTb
EIF4
G1Y
2000pb3000pb
3354pbM
arca
dor
TbEI
F4G1
2000pb3000pb 3354pb
Mar
cado
rTb
EIF4
G1
2000pb3000pb 3354pb
1000pb
Mar
cado
rTb
EIF4
G1-HD
850pb 882pb1000pb
Mar
cado
rTb
EIF4
G1-HD
850pb 882pb
Mar
cado
rTb
EIF4
G1Y
2000pb3000pb
3354pb
Mar
cado
rTb
EIF4
G1Y
2000pb3000pb
3354pb
Mar
cado
rTb
EIF4
G2
2000pb3000pb 2634pb
Mar
cado
rTb
EIF4
G2-
HD
850pb1000pb
840pb
Mar
cado
rTb
EIF4
G2Y
2000pb3000pb 2634pb
Mar
cado
rTb
EIF4
G2
2000pb3000pb 2634pb
Mar
cado
rTb
EIF4
G2
2000pb3000pb 2634pb
Mar
cado
rTb
EIF4
G2-
HD
850pb1000pb
840pb
Mar
cado
rTb
EIF4
G2-
HD
850pb1000pb
840pb
Mar
cado
rTb
EIF4
G2Y
2000pb3000pb 2634pb
Mar
cado
rTb
EIF4
G2Y
2000pb3000pb 2634pb
Lima, R. P. 72
(figura 22), a fim de que pudesse ser realizada a ligação com o vetor plasmidial pGEM T
Easy, conforme indicado pelo protocolo do fabricante.
Figura 22: Eletroeluição dos fragmentos amplificados TbEIF4G1, TbEIF4G1-HD, TbEIF4G1Y, TbEIF4G2,
TbEIF4G2-HD e TbEIF4G2Y. As setas cinzas indicam os fragmentos purificados obtidos de 3354pb para os
TbEIF4G1 e TbEIF4G1Y, 840pb, para TbEIF4G1-HD, 2634pb, para TbEIF4G2 e TbEIF4G2Y e 840pb, para
TbEIF4G2-HD. A banda de 1650pb do marcador 1kb Plus DNA Ladder é utilizada como parâmetro de
comparação para quantificação do DNA e corresponde a 40ηg (seta branca).
8. 3. Clonagem no vetor plasmidial pGEM T Easy
Os insertos, purificados e quantificados, foram ligados ao vetor plasmidial pGEM T
Easy e utilizados na transformação de E. coli. Alguns clones da transformação foram
selecionados e foram realizadas minipreparações com estes. As minipreparações foram
digeridas com as enzimas de restrição BamH I e Hind III para confirmação das clonagens.
Foram confirmadas as clonagens esperadas para o TbEIF4G1 e seus fragmentos:
TbEIF4G1/pGEM T Easy (com a liberação de bandas de 3015pb, do vetor pGEM T Easy, e
Mar
cado
r
2000pb
840pb
2634pb
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2000pb
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2Y-H
D
3354pb
882pb1000pb850pb
3000pb
1650pb
Lima, R. P. 73
3354pb, do inserto TbEIF4G1), TbEIF4G1-HD/pGEM T Easy (bandas de 3015pb e 882pb),
TbEIF4G1Y/pGEM T Easy (3015pb e 3354pb) (figura 23).
Para o TbEIF4G2 e seus fragmentos, foram confirmadas as construções TbEIF4G2-
HD/pGEM T Easy (3015pb e 840pb) e TbEIF4G2Y/pGEM T Easy (3015pb e 2634pb) (figura
23). Não foi obtido êxito na clonagem do TbEIF4G2, que seria subclonado no vetor
plasmidial pET21a, possivelmente devido à baixa eficiência na amplificação desse fragmento
que levou à disponibilidade de pequena quantidade de DNA para tal fim. Entretanto, com a
clonagem do inserto TbEIF4G2Y no pGEM T Easy na direção 3’�5’ (ORF do inserto em
relação ao promotor T7 do vetor plasmidial), surgiu a possibilidade de subcloná-lo no vetor
pET21a com as enzimas de restrição Hind III (sítio de restrição do inserto, criado pelo primer
na posição 5’) e Not I (sítio de restrição do vetor em que está clonado). Uma vez que a
seqüência dos TbEIF4G2 e TbEIF4G2Y são iguais, tendo como única diferença a inversão dos
sítios de restrição nas posições 5’ e 3’, esta estratégia tornou desnecessária nova amplificação
e clonagem do fragmento TbEIF4G2.
Lima, R. P. 74
Figura 23: Digestão das clonagens em pGEM T Easy com as enzimas de restrição BamH I e Hind III. As
construções plasmidiais TbEIF4G1/pGEM T Easy (na figura, apenas TbEIF4G1), TbEIF4G1-HD/pGEM T Easy
(TbEIF4G1-HD), TbEIF4G1Y/pGEM T Easy (TbEIF4G1Y), TbEIF4G2-HD/pGEM T Easy (TbEIF4G2-HD) e
TbEIF4G2Y/pGEM T Easy (TbEIF4G2Y) foram digeridas com as enzimas de restrição BamH I e Hind III para
confirmação das clonagens. Nas digestões (“B/H” é a abreviação da digestão com as enzimas BamH I/Hind III)
foram liberados fragmentos correspondentes a 3015pb, do pGEM T Easy (nessa foto, abreviado para apenas
pGEM), e 3354pb dos TbEIF4G1 e TbEIF4G1Y, 882pb do TbEIF4G1-HD, 840pb do TbEIF4G2-HD e 2634pb
do TbEIF4G2Y, conforme esperado.
8. 4. Análise de seqüências dos genes TbEIF4G1 e TbEIF4G2 clonados em vetor
plasmidial pGEM T Easy
Após checagem das clonagens dos TbEIF4G1/pGEM T Easy, TbEIF4G1-
HD/pGEM T Easy, TbEIF4G1Y/pGEM T Easy, TbEIF4G2-HD/pGEM T Easy e
TbEIF4G2Y/pGEM T Easy pelas digestões com as enzimas de restrição BamH I e Hind III,
foi procedido o sequenciamento dos insertos nessas construções plasmidiais. As seqüências
Mar
cado
rTb
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G1
TbEI
F4G
1-HD
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(B/H
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2634pb3354pb
882pb
2000pb
1000pb850pb
3000pb
Lima, R. P. 75
resultantes de cada amplificação foram unidas pelo programa SeqMan, do DNASTAR, e
alinhados com a seqüência disponível em banco de dados de genoma de T. brucei.
Para maior confiabilidade dos resultados e dirimir dúvidas de que possíveis
polimorfismos encontrados fossem resultantes de erros da amplificação, insertos de
amplificações distintas foram seqüenciados e as seqüências obtidas alinhadas e analisadas.
Pelos resultados dos sequenciamentos pôde ser constatado que a seqüência do
TbEIF4G1 apresentou vários polimorfismos em relação àquela depositada em banco de
dados, em um total de 7 diferenças em nível de aminoácidos (tabela 6). Entretanto, com
relação ao seu domínio HEAT, houve apenas uma modificação (de um resíduo de alanina para
tirosina, A370�Y370, numeração do TbEIF4G1), como já esperado para um domínio que
apresenta alto grau de conservação. Foi também verificado que não houve polimorfismos
quanto aos possíveis resíduos de triptofano conservados na sua região C-terminal (W1068 e
W2008, numeração do TbEIF4G1), apesar de observado uma variação entre resíduos dessa
região (de um resíduo de arginina para prolina, R1076�P1076, numeração do TbEIF4G1)
(ver figura 18).
Tabela 6: Polimorfismos encontrados para seqüência do gene TbEIF4G1 em relação à depositada em
banco de dados de genoma de T. brucei. Na tabela, está indicado a posição do polimorfismo na seqüência de
DNA do gene e na proteína
Posição no DNA
Nucleotídio original
Nucleotídio mutado
Posição na proteína
Mutação
523 A G 175 Arg � Gly 541 G A 181 Ala � Thr 1108 G A 370 Ala � Thr 1375 G A 459 Ala � Thr 1720 C T 574 Pro � Ser 1954 G C 652 Thr � Ala 3227 G C 1076 Arg � Pro
Lima, R. P. 76
O resultado para o sequenciamento do TbEIF4G2, diferentemente, apresentou uma
quantidade bem menor de polimorfismos (tabela 7). Além disso, nenhum dos três
polimorfismos encontrados se situa no domínio HEAT do gene ou próximo a sua extremidade
C-terminal (ver figura 19).
Tabela 7: Polimorfismos encontrados para seqüência do gene TbEIF4G2 em relação à depositada no banco
de dados de genoma de T. brucei. Na tabela, está indicado a posição do polimorfismo na seqüência de DNA do
gene e na proteína
Posição no DNA
Nucleotídio original
Nucleotídio mutado
Posição na proteína
Mutação
91 C A 31 Pro � Thr 283 G T 285 C T
95 Ala � Ser
2567 T G 856 Val � Gly
8. 5. Subclonagem dos genes TbEIF4G1 e TbEIF4G2 e fragmentos TbEIF4G1-HD e
TbEIF4G2-HD no vetor plasmidial pET21a
Após a ratificação das clonagens em vetor pGEM T Easy, pela digestão com as
enzimas de restrição e sequenciamento, as construções plasmidiais TbEIF4G1/pGEM T Easy,
TbEIF4G1-HD/pGEM T Easy, TbEIF4G2-HD/pGEM T Easy e TbEIF4G2Y/pGEM T Easy
foram digeridas pelas enzimas de restrição BamH I e Hind III, para obtenção dos insertos
TbEIF4G1, TbEIF4G1-HD e TbEIF4G2-HD, e Hind III e Not I, para obtenção do
TbEIF4G2Y, para subseqüente subclonagem desses insertos no vetor plasmidial pET21a,
também digerido com as mesmas enzimas. As digestões, tanto dos insertos, quanto do vetor,
foram eletroeluídas (figura 24) e depois esses insertos foram ligados ao vetor.
Lima, R. P. 77
Figura 24: Eletroeluição das digestões das construções plasmidiais com pGEM T Easy. As construções
plasmidiais TbEIF4G1/pGEM T Easy, TbEIF4G1-HD/pGEM T Easy, TbEIF4G2-HD/pGEM T Easy e
TbEIF4G2Y/pGEM T Easy foram digeridas com as enzimas de restrição Hind III e Not I (para a
TbEIF4G2Y/pGEM T Easy) e BamH I e Hind III (para as demais). Os insertos liberados em cada uma das
digestões foi eletroeluído juntamente com o vetor plasmidial pET21a digerido (setas cinzas) (pET21a digerido
com as enzimas Hind III e Not I e eletroeluído não foi mostrado) e posteriormente ligados. “H/N” é uma
abreviação que indica que o inserto foi digerido pelas enzimas Hind III e Not I e “B/H” por BamH I e Hind III.
Os insertos digeridos ligados ao vetor, foram utilizados na transformação de E. coli
da linhagem DH10B para realização de minipreparações para checagem da clonagem. A
clonagem foi ratificada pela digestão com as mesmas enzimas de restrição empregadas na
digestão dos insertos (BamH I e Hind III ou Hind III e Not I). Foi observada a liberação de
fragmentos nos tamanhos esperados de 5420pb e 3354pb para a construção
TbEIF4G1/pET21a, 5420pb e 882pb para TbEIF4G1-HD/pET21a, 5420pb e 840pb para
TbEIF4G2-HD/pET21a e 5420pb e 2634pb para TbEIF4G2Y/pET21a (figura 25).
Mar
cado
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(B/H
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F4G1-
HD (B
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(B/H
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HD (B
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HD (B
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882pb
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Lima, R. P. 78
Figura 25: Digestão das clonagens em pET21a com as enzimas de restrição BamH I e Hind III e Hind III e
Not I. As construções plasmidiais TbEIF4G1-HD/pET21a, TbEIF4G1/pET21a e TbEIF4G2-HD/pET21a foram
digeridas com as enzimas de restrição BamH I e Hind III e TbEIF4G2Y/pET21a com as enzimas Hind III e Not I
para confirmação das clonagens. Nas digestões, foram liberados fragmentos de 5420pb, correspondente ao vetor
pET21a, 882pb do TbEIF4G1-HD, 3354pb do TbEIF4G1, 840pb do TbEIF4G2-HD e 2634pb do TbEIF4G2Y.
8. 6. Expressão das proteínas recombinantes TbEIF4G16xHis, TbEIF4G26xHis, TbEIF4G1-
HD6xHis e TbEIF4G2-HD6xHis em Escherichia coli
As construções TbEIF4G1-HD/pET21a, TbEIF4G1/pET21a, TbEIF4G2-
HD/pET21a e TbEIF4G2Y/pET21a, confirmadas pela digestão, foram empregadas na
transformação de bactérias E. coli da linhagem BL21star para expressão das proteínas
recombinantes com o objetivo de que estas proteínas fossem empregadas na imunização de
Mar
cado
r
TbEI
F4G1/
pET2
1a
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F4G1-
HD/ p
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B/H)
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882pb
2000pb
1000pb850pb
3000pb5420pb
Lima, R. P. 79
coelhos para obtenção de soro policlonal, o qual foi utilizado nos ensaios de
imunocitoquímica.
A expressão das proteínas foi verificada em ensaios de expressão em pequena
escala. A expressão foi induzida pela adição do IPTG nos inóculos e após o tempo de
indução, extratos celulares das células induzidas foram separados em gel SDS-PAGE 15%.
Foi verificada a expressão dos TbEIF4G1-HD6xHis, com cerca de 42kDa, TbEIF4G16xHis, com
cerca de 110kDa, TbEIF4G2-HD6xHis, com cerca de 35kDa e TbEIF4G26xHis, com cerca de
100kDa, conforme esperado (figura 26).
Figura 26: Expressão das proteínas recombinantes TbEIF4G1-HD6xHis, TbEIF4G16xHis, TbEIF4G2-HD6xHis e
TbEIF4G26xHis. Mini-indução das proteínas em E. coli, após a adição de IPTG, onde se observa a ausência de
expressão de proteína recombinante no controle negativo com pET21a (célula transformada só com o plasmídio)
e a expressão dos TbEIF4G1-HD6xHis, com 42kDa, TbEIF4G16xHis, com 110kDa, TbEIF4G2-HD6xHis, com
Mar
cado
r
TbEI
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1-HD 6x
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42,0kDa35,0kDa
100,0kDa
Lima, R. P. 80
35kDa, e TbEIF4G26xHis, com 100kDa (setas pretas) com os pesos moleculares esperados. Gel SDS-PAGE 15%
corado com Azul de Comassie R-250.
Uma vez verificada a expressão das proteínas em mini-induções, foram realizadas
maxi-induções para obtenção de maior quantidade de proteínas. As proteínas obtidas nas
maxi-induções foram purificadas ou diretamente solubilizadas do extrato celular a fim de
empregá-las na imunização de coelhos para obtenção de soro policlonal. Os soros obtidos
após as imunizações foram imunoadsorvidos e utilizados em ensaios de reconhecimento
“western-blot” para verificar a capacidade de reconhecimento dos mesmos.
8. 7. Purificação das proteínas TbEIF4G1-HD6xHis e TbEIF4G2-HD6xHis
As proteínas expressas em larga escala (maxi-indução) foram purificadas com resina
de Níquel (Ni-NTA Agarose). Essa resina foi selecionada para purificação haja vista a
afinidade com que as proteínas recombinantes, clonadas em vetor pET21a, ligam-se a ela
devido à cauda de 6 histidinas (6xHis) codificada pelo vetor pET21a na região C-terminal da
proteína.
As proteínas recombinantes TbEIF4G1-HD6xHis e TbEIF4G2-HD6xHis mostraram-se
insolúveis tanto na purificação pelo protocolo padrão (dados não-mostrados), quanto pelo
protocolo com condições desnaturantes (na presença de uréia) (figura 27). Foi verificado que,
mesmo nas condições desnaturantes, uma grande quantidade das mesmas se acumulou no
sedimento de centrifugação após a sonicação (fração insolúvel dos restos celulares). Portanto,
devido a essa baixa eficiência na purificação das proteínas, foram utilizadas na imunização as
recombinantes TbEIF4G1-HD6xHis e TbEIF4G2-HD6xHis solubilizadas diretamente de extratos
protéicos de E. coli, visto que apenas nesses extratos (não-purificados) havia proteína
suficiente para realizar as imunizações. As proteínas purificadas por resina foram empregadas
nos ensaios de “western-blot”, onde são necessárias quantidades muito menores das mesmas.
Lima, R. P. 81
Figura 27: Purificação das proteínas recombinantes TbEIF4G1-HD6xHis e TbEIF4G2-HD 6xHis com resina de
Níquel em condições desnaturantes. Não foi alcançada eficácia na purificação das proteínas recombinantes
TbEIF4G16xHis e TbEIF4G26xHis mesmo em condições desnaturantes. Pode ser observado que a maior quantidade
da proteína (setas brancas) permaneceu no sedimento do sonicado (fração insolúvel) e apenas pequena parte dela
foi purificada (setas pretas).
8. 8. .Ensaios de reconhecimento das proteínas recombinantes pelo soro policlonal
Após a imunização dos coelhos com as proteínas recombinantes TbEIF4G1-HD6xHis
e TbEIF4G2-HD6xHis, esses foram exsanguinados e os anticorpos dos soros anti-TbEIF4G1 e
anti-TbEIF4G2 resultantes purificados por imunoadsorção e empregados em ensaios de
reconhecimento de “western-blot”.
Para os ensaios, foram empregados extratos de E. coli contendo as proteínas
recombinantes expressas ou as proteínas recombinantes já purificadas. Inicialmente, foi
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cado
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97,0kDa
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TbEIF4G1-HD6xHis TbEIF4G2-HD6xHis
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TbEIF4G1-HD6xHis TbEIF4G2-HD6xHis
Lima, R. P. 82
testado o soro pré-imune e a sangria de prova, para verificação do reconhecimento das
proteínas apenas após as imunizações, como observado (dados não mostrados). Foi verificado
o reconhecimento das respectivas proteínas por seus anti-soros purificados. Constatou-se o
reconhecimento das proteínas TbEIF4G16xHis e TbEIF4G1-HD6xHis, de 110kDa e 42kDa, pelo
anti-TbEIF4G1, e TbEIF4G26xHis e TbEIF4G2-HD6xHis, de 100kDa e 35kDa, respectivamente,
pelo anti-TbEIF4G2 (figura 28). Como pôde ser observado nesses ensaios, os soros
purificados se mostraram sensíveis, detectando baixas quantidades de proteína recombinante
tanto das proteínas completas (6ηg), quanto daquelas contendo apenas os domínios HEAT (2
ηg).
(A) (B)
Figura 28: Reconhecimento das proteínas recombinantes TbEIF4G16xHis e TbEIF4G1-HD6xHis (A) e
TbEIF4G26xHis e TbEIF4G2-HD6xHis (B) por seus respectivos anti-soros purificados. Para esse ensaio de
reconhecimento de “western-blot” foram utilizadas as proteínas recombinantes TbEIF4G16xHis (6ηg) e
TbEIF4G1-HD6xHis (2ηg) e TbEIF4G26xHis (6ηg) e TbEIF4G2-HD6xHis (2ηg) e seus anti-soros purificados anti-
TbEIF4G1 (diluição de 1:500) e anti-TbEIF4G2 (diluição de 1:500), respectivamente. Pode ser observado o
reconhecimento das bandas de 110kDa, do TbEIF4G16xHis, e de 42kDa, do TbEIF4G1-HD6xHis, pelo anti-
TbEIF4G1 (em A), e de 100kDa, do TbEIF4G26xHis, e de 35kDa, do TbEIF4G2-HD6xHis, pelo anti-TbEIF4G2 (em
B). Revelação em filme auto-radiográfico.
TbEI
F4G1 6x
His
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F4G
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100,0kDa
Lima, R. P. 83
Foi também verificado nos ensaios “western-blot”, o reconhecimento das proteínas
em sua forma nativa em extratos protéicos totais das fases procíclica e sanguínea de T. brucei.
Foi constatada a expressão do TbEIF4G1 na fase procíclica do parasita, entretanto na fase
sanguínea essa expressão parece ausente ou bastante discreta. Para o TbEIF4G2, foi
verificado que em ambas as fases, a sua expressão parece bastante escassa, senão ausente
(figura 29).
(A) (B)
Figura 29: Reconhecimento das proteínas nativas TbEIF4G1 (A) e TbEIF4G2 (B) por seus respectivos anti-
soros purificados. O ensaio de reconhecimento de “western-blot” foi também utilizado para verificação da
expressão das proteínas nativas nos extratos protéicos totais das fases procíclica (PCF) e sanguínea (BSF) de T.
brucei. Ambos os extratos continham 107 células. Foi constatado o reconhecimento da forma nativa do
TbEIF4G1 na fase procíclica (seta branca). Entretanto, não foi verificado o reconhecimento do TbEIF4G1 nativo
na fase sanguínea, nem do TbEIF4G2 nativo nas fases procíclica e sanguínea, indicativo de que as expressões
dessas proteínas nessas fases são muito escassas ou ausentes. Foram empregadas também no ensaio as proteínas
recombinantes TbEIF4G16xHis (6ηg) e TbEIF4G1-HD6xHis (2ηg) e TbEIF4G26xHis (6ηg) e TbEIF4G2-HD6xHis
(2ηg) (setas). Os anti-soros purificados foram utilizados na diluição de 1:500.
Mar
cado
r
TbEI
F4G2 6x
His
TbEI
F4G2-
HD 6xHis
PCF
BSF
97,0kDa66,0kDa
35,0kDa
100,0kDa97,0kDa
Mar
cado
r
TbEI
F4G1 6x
His
TbEI
F4G1-
HD 6xHis
PCF
BSF
66,0kDa
110,0kDa
42,0kDa
Mar
cado
r
TbEI
F4G2 6x
His
TbEI
F4G2-
HD 6xHis
PCF
BSF
97,0kDa66,0kDa
35,0kDa
100,0kDa
Mar
cado
r
TbEI
F4G2 6x
His
TbEI
F4G2-
HD 6xHis
PCF
BSF
97,0kDa66,0kDa
35,0kDa
100,0kDa97,0kDa
Mar
cado
r
TbEI
F4G1 6x
His
TbEI
F4G1-
HD 6xHis
PCF
BSF
66,0kDa
110,0kDa
42,0kDa
97,0kDa
Mar
cado
r
TbEI
F4G1 6x
His
TbEI
F4G1-
HD 6xHis
PCF
BSF
66,0kDa
110,0kDa
42,0kDa
Lima, R. P. 84
8. 9. Ensaios de Imunocitoquímica
Com os soros obtidos das imunizações e após os mesmos terem sidos purificados e
testados por “western-blot”, foi procedida a determinação da localização subcelular por
ensaios de imunocitoquímica. O ensaio foi iniciado com o cultivo de células de T. brucei da
linhagem 427, em crescimento exponencial. Uma vez fixadas e imobilizadas em lamínulas
estas foram incubadas com os anticorpos primários purificados anti-TbEIF4G1 e anti-
TbEIF4G2 e o secundário, anti-IgG de coelho conjugado ao Alexa Flúor 488 e o resultado foi
visualizado em microscópio confocal.
Foi observado que tanto o TbEIF4G1 quanto o TbEIF4G2 apresentam distribuição
exclusivamente citoplasmática, não sendo observada sua presença no núcleo do parasita
(figura 30). Nota-se que o resultado é mais nítido para o TbEIF4G1 que para o TbEIF4G2.
Figura 30: Ensaio de imunocitoquímica dos TbEIF4G1 e TbEIF4G2 nas células procíclica de T. brucei. São
observadas as fotos do parasita em microscopia de transmissão, a localização subcelular do fator pela
fluorescência do anticorpo conjugado e a sobreposição de ambas as imagens. Pode-se visualizar a distribuição
Lima, R. P. 85
citoplasmática e não-nuclear de ambas as proteínas TbEIF4G1 e TbEIF4G2. Anti-TbEIF4G1 e anti-TbEIF4G2
em diluição de 1:50. Fotos obtidas em microscópio confocal.
8. 10. Subclonagem dos genes TbEIF4G1 e TbEIF4G2 no vetor plasmidial p2216
Para realização da superexpressão dos TbEIF4G1 e TbEIF4G2 fusionados à EYFP
em T. brucei, foi procedida a digestão das construções plasmidiais TbEIF4G1Y/pGEM T Easy
e TbEIF4G2Y/pGEM T Easy com as enzimas de restrição Hind III e BamH I e,
posteriormente à eletroeluição (figura 31), a ligação dos insertos digeridos com o vetor
plasmidial p2216, também digerido e eletroeluído (figura 31). Após confirmadas as clonagens
com as mesmas enzimas de restrição empregadas anteriormente (figura 32), as construções
foram linearizadas com a enzima de restrição Not I a fim de realizar a transfecção.
Figura 31: Eletroeluição dos fragmentos TbEIF4G1Y, TbEIF4G2Y e p2216 digeridos. As construções
TbEIF4G1Y/pGEM T Easy e TbEIF4G2Y/pGEM T Easy e o vetor plasmidial p2216 foram digeridos com as
enzimas de restrição Hind III e BamH I (“H/B”) e os insertos e vetor liberados foram eletroeluídos e ligados. As
bandas resolvidas em gel foram as esperadas (setas), inclusive a do vetor com 6275pb.
Mar
cado
rTb
EIF4
G1Y
(H/B
)
TbEI
F4G
2Y (H
/B)
2000pb3354pb2634pb
3000pb
p221
6(H
/B)
1000pb
6275pb
Mar
cado
rTb
EIF4
G1Y
(H/B
)
TbEI
F4G
2Y (H
/B)
2000pb3354pb2634pb
3000pb
p221
6(H
/B)
1000pb
6275pb
Lima, R. P. 86
Figura 32: Digestão das clonagens TbEIF4G1Y/p2216 e TbEIF4G2Y/p2216 com as enzimas de restrição
Hind III e BamH I. As construções plasmidiais no p2216 foram digeridas com as enzimas de restrição Hind III
e BamH I para confirmação das clonagens. Houve a liberação das bandas esperadas de 3354pb para o
TbEIF4G1Y, 2634pb para o TbEIF4G2Y e 6257pb para o vetor plasmidial p2216, conforme esperado.
8. 11. Ensaios de Superexpressão do TbEIF4G2Y fusionado à EYFP
As construções plasmidiais linearizadas TbEIF4G1Y/p2216 e TbEIF4G2Y/p2216
foram utilizadas na transfecção de T. brucei a fim de confirmar a localização subcelular dos
fatores TbEIF4G1 e TbEIF4G2 observados na imuncitoquímica. Após transfectados, os
parasitas foram selecionados pela adição de fleomicina ao meio e superexpressaram a proteína
pela adição de tetraciclina. O resultado foi visualizado em microscópio confocal.
Foi observado que o TbEIF4G2 apresentou distribuição exclusivamente
citoplasmática e não foi observada sua presença no núcleo do parasita (figura 33),
corroborando o resultado obtido anteriormente. Entretanto, não foi obtido sucesso na
2000pb3000pb
Mar
cado
rTb
EIF4
G1Y/p
2216
(H/B
)
TbEI
F4G2Y
/p22
16
TbEI
F4G2Y
/p22
16(H
/B)
TbEI
F4G1Y
/p22
16
3354pb2634pb
6275pb
2000pb3000pb
Mar
cado
rTb
EIF4
G1Y/p
2216
(H/B
)
TbEI
F4G2Y
/p22
16
TbEI
F4G2Y
/p22
16(H
/B)
TbEI
F4G1Y
/p22
16
3354pb2634pb
6275pb
Lima, R. P. 87
transfecção dos parasitas com a construção do TbEIF4G1, sendo necessários outros ensaios
para confirmação do resultado.
Figura 33: Ensaio de superexpressão do TbEIF4G2 fusionado à EYFP nas células procíclicas de T. brucei.
O fator localiza-se apenas no citoplasma da célula, não sendo observada sua presença na região nuclear do
parasita.
Lima, R. P. 88
9. DISCUSSÃO
Este trabalho teve por objetivo iniciar a caracterização dos TbEIF4G1 e TbEIF4G2,
dois homólogos ao fator de iniciação da tradução eIF4G encontrados em T. brucei, através da
determinação de sua localização subcelular nas células desse parasita. Essas proteínas foram
selecionadas visto que o estudo dos demais ortólogos encontrados em T. brucei, TbEIF4G3-5,
já se encontra em andamento (REIS et al., manuscrito em redação). O interesse pela
localização desses polipeptídeos é que esta fornece indícios importantes da função que a
proteína desempenha na célula, podendo direcionar o foco da pesquisa.
Tanto o alinhamento do TbEIF4G1 quanto o do TbEIF4G2 com seus respectivos
ortólogos em T. cruzi e em L. major demonstraram conservação da seqüência do domínio
HEAT e da região C-terminal, onde há um possível motivo W2, como esperado para o eIF4G
(PREVOT, DARLIX e OHLMANN, 2003; ARAVIND e KOONIN, 2000), apesar da
similaridade entre as seqüências dos fatores não ser tão elevada (47% entre TbEIF4G1 e
LmEIF4G1 e 49% entre TbEIF4G2 e LmEIF4G2) (DHALIA et al., 2005). Essa conservação
das regiões foi verificada inclusive nas análises de polimorfismos das seqüências clonadas
com relação àquelas depositadas no banco de dados de T. brucei. Foram observadas poucas
variações de seqüência e mesmo as duas que o TbEIF4G1 exibiu nas regiões mais
conservadas (uma no domínio HEAT e outra na região W2, entretanto sem afetar os resíduos
de triptofano) não parecem afetar uma possível função biológica (visto que são resíduos não-
conservados), embora isto deva ser melhor investigado.
Após a clonagem dos genes e expressão das proteínas recombinantes, foram
produzidos os soros policlonais que se mostraram capazes de reconhecer de suas respectivas
proteínas recombinantes, tanto do fragmento correspondente ao domínio HEAT central,
quanto à proteína completa. Esses anticorpos foram empregados em ensaios de “western-blot”
Lima, R. P. 89
com extratos protéicos totais de T. brucei e foi observado o reconhecimento do TbEIF4G1 na
forma procíclica. Entretanto o TbEIF4G1, na forma sanguínea, e o TbEIF4G2, em ambas as
formas, parecem ser raros ou ausentes (ao menos nas fases exponenciais de ambas as formas
de desenvolvimento do parasita). Enquanto para o TbEIF4G1, esse perfil indica expressão
estágio-específica, para o TbEIF4G2, a pequena quantidade de proteína não parece vincula-lo
à síntese protéica diretamente, visto que em geral os fatores associados a essa via são
abundantes (DHALIA et al., 2006), podendo ambos estar relacionados não propriamente à
iniciação da tradução, mas à sua regulação (global ou mRNA-específica) que, nesses
organismos, é pós-transcricional (CLAYTON, 2002). O fato de o TbEIF4G2 ser muito mais
raro que o TbEIF4G1 (como observado pelos ensaios de “western-blot”) também esclarece
porque o ensaio de imunocitoquímica do segundo é mais nítido que o do primeiro.
Os resultados da imunocitoquímica para os TbEIF4G1 e TbEIF4G2 e da
superexpressão, para este último, demonstram claramente que ambas as proteínas são
citoplasmáticas. Esse resultado é similar ao encontrado para o TbEIF4AI, que provavelmente
desempenha função na iniciação da tradução (DHALIA et al., 2006). Entretanto, a análise da
região HEAT-MIF4G dos LmEIF4G1 e LmEIF4G2 demonstrou que estes não possuem
capacidade de interação com o LmEIF4AI (DHALIA et al., 2005) e, visto que estes
LmEIF4Gs possuem maior similaridade aos seus ortólogos em T. brucei do que ao humano
(DHALIA et al., 2005), é possível que os TbEIF4G1 e TbEIF4G2 não sejam capazes também
de se ligar ao TbEIF4AI, o que indicaria novamente que não possuem função na iniciação da
tradução, exercendo possível função regulatória, não obstante seja necessária essa
confirmação por análise de interação.
Outros resultados podem auxiliar a compreensão do papel que esses polipeptídeos
estudados desempenham no metabolismo do parasita. Um exemplo é o fato de que o
LmEIF4G1 consegue interagir com a PABP1 possivelmente através da região N-terminal do
Lima, R. P. 90
primeiro (interação clássica eIF4G/PABP), apesar da ligação dos fatores LmEIF4G3 e
LmEIF4G4, que possuem mais evidências de sua participação na iniciação da tradução,
empregarem possivelmente seu domínio HEAT (REIS, 2009). Isto sugere mais uma vez um
possível papel deste fator na regulação da tradução, visto que ele é incapaz de se ligar ao
LmEIF4AI (DHALIA et al., 2005). Se os fatores forem realmente ortólogos entre si e
apresentarem capacidades de interação semelhantes, pode ser válido inferir o mesmo para o
TbEIF4G1 (mas deve ser confirmado por ensaios de interação adequados). Para os
TbEIF4G3-5 em T. brucei, foi demonstrado que os fatores se mostram essenciais para
viabilidade celular, mas apresentam funções diferentes pois o TbEIF4G4 está associado com a
integridade da morfologia celular e o TbEIF4G3 com a iniciação da tradução propriamente
dita, visto que sua depleção leva à interrupção da proliferação celular e à diminuição da taxa
de síntese protéica (MOURA, 2007; MOURA, comunicação pessoal).
Este trabalho além de fornecer informações novas sobre as proteínas alvo de estudo,
também gerou ferramentas novas que vão impulsionar o conhecimento sobre a função das
mesmas no futuro. Os genes clonados, assim como os soros obtidos contra as proteínas
recombinantes, poderão ser empregados em ensaios de interferência de RNA, a fim de
verificar a viabilidade celular na ausência dos respectivos fatores e sua repercussão no
metabolismo celular. Será possível também a quantificação da expressão dos mesmos, e a
análise dessa expressão nas fases do ciclo de vida do parasita. Ambos os métodos são
importantes para identificar sua função, conforme já observado em outros trabalhos
(DHALIA et al., 2006). Além disso, como mencionado anteriormente nessa discussão, é
imprescindível realizar ensaios como imunoprecipitação, “pull-down” e TAP-TAG, por
exemplo, para verificar a capacidade de interação desses fatores com outros já descritos ou
mesmo proteínas ainda não descritas. Os resultados obtidos nesse trabalho e outros que o
Lima, R. P. 91
sucederem se provam assim importantes no auxílio da caracterização de fatores relevantes
para a iniciação da tradução, e seu controle, nos tripanossomatídeos.
Lima, R. P. 92
10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ACKER, M.G. & LORSCH, J.R. Mechanism of ribosomal subunit joining during eukaryotic
translation initiation. Biochem Soc Trans, v. 36, p. 653-657, 2008.
ALGIRE, M.A. & LORSCH, J.R. Where to begin? The mechanism of translation initiation
codon selection in eukaryotes. Curr Opin Chem Biol , v. 10, p. 480-486, 2006.
ARAVIND, L. & KOONIN, E. V. Eukaryote-specific Domains in Translation Initiation
Factors: Implications for Translation Regulation and Evolution of the Translation System.
Gen Res, V. 10, 1172-1184, 2000.
BALAGOPAL, V. & PARKER, R. Polysomes, P bodies and stress granules: states and fates
of eukaryotic mRNAs. Curr. Opin. Cell Biol , v. 21, p. 403-408, 2009.
BARHOUMI, M. et al. Leishmania infantum LeIF protein is an ATP-dependent RNA
helicase and an eIF4A-like factor that inhibits translation in yeast. FEBS J, v. 273, p. 5086-
5100, 2006.
BARRETT, M.P. et al. The trypanosomiases. Lancet, v. 362, p. 1469-148, 2003.
BELLSOLELL, L. et al. Two structurally atypical HEAT domains in the C-terminal portion
of human eIF4G support binding to eIF4A and Mnk1. Structure, v. 14, p. 913-923, 2006.
Lima, R. P. 93
BENZ, C. et al. Messenger RNA processing sites in Trypanosoma brucei. Mol. Biochem.
Parasitol, v. 143, p. 125-134, 2005.
BERRIMAN, M. et al. The Genome of the African Trypanosome Trypanosoma brucei.
Science, v. 309, p. 416-422, 2005.
BROADHEAD, R. et al. Flagellar motility is required for the viability of the bloodstream
trypanosome. Nature, v. 440, p. 224-227, 2006.
CARON, S. et al. Selective modification of eukaryotic initiation factor 4F (eIF4F) at the onset
of cell differentiation: recruitment of eIF4GII and long-lasting phosphorylation of eIF4E.
Mol. Cell Biol , v. 24, p. 4920-4928, 2004.
CASSOLA, A., DE GAUDENZI, J.G. e FRASCH, A.C. Recruitment of mRNAs to
cytoplasmic ribonucleoprotein granules in trypanosomes. Mol. Microbiol , v. 65, p. 655-670,
2007.
CAMPBELL, D.A., THOMAS, S. e STURM, N.R. Transcription in kinetoplastid protozoa:
why be normal? Microbes Infect, v. 5, p. 1231-1240, 2003.
CLAYTON, C.E. Life without transcriptional control? From fly to man and back again.
EMBO J, v. 21, p. 1881-1888, 4-15-2002.
CLAYTON, C. & SHAPIRA, M. Post-transcriptional regulation of gene expression in
trypanosomes and leishmanias. Mol. Biochem. Parasitol, v. 156, p. 93-101, 2007.
Lima, R. P. 94
CLAYTON, C. Control of mRNA degradation in trypanosomes. Biochem Soc Trans, v. 36,
p. 520-521, 2008.
COHEN-FREUE, G. et al. Global gene expression in Leishmania. Int Jorn Parasitol , v. 37,
p. 1077-1086, 2007.
DAS, A., BANDAY, M. e BELLOFATTO, V. RNA polymerase transcription machinery in
trypanosomes. Eukaryot. Cell, v. 7, p. 429-434, 2008.
DE SOUZA, W. Special organelles of some pathogenic protozoa. Parasitol Res, v. 88, p.
1013-1025, 2002.
DHALIA, R. et al. Translation initiation in Leishmania major: characterisation of multiple
eIF4F subunit homologues. Mol Biochem Parasitol, v. 140, p. 23-41, 2005.
DHALIA, R. et al. The two eIF4A helicases in Trypanosoma brucei are functionally distinct.
Nucleic Acids Res, v. 34, p. 2495-2507, 2006.
EL-SAYED, N.M. et al. The genome sequence of Trypanosoma cruzi, etiologic agent of
Chagas disease. Science, v. 309, p. 409-415, 2005a.
EL-SAYED, N.M, et al. Comparative genomics of trypanosomatid parasitic protozoa.
Science, v. 309, p. 404-409, 2005b.
Lima, R. P. 95
GEBAUER, F. & HENTZE, M.W. Molecular mechanisms of translational control. Moll Cell
Biol, v. 5, p. 827-835, 2004.
GINGER, M.L. Trypanosomatid biology and euglenozoan evolution: new insights and
shifting paradigms revealed through genome sequencing. Protist, v. 156, p. 377-392, 2005.
GINGRAS, A.C., RAUGHT, B. e SONEMBERG, N. eIF4 initiation factors: effectors of
mRNA recruitment to ribosomes and regulators of translation. Annu Rev Biochem, v. 68, p.
913-963, 1999.
GOODFELLOW, I.G. & ROBERTS, L.O. Eukaryotic initiation factor 4E. Int. J. Biochem.
Cell Biol, v. 40, p. 2675-2680, 2008.
GOODING, R. H., HAINES, L. R. e PEARSON, T. W. Tsetse flies, the Glossinidae, and
Transmission of African Trypanosomes. In: MARQUARDT, W. C. et al. Biology of disease
vectors. 2 th Edition. Burlington: Elsevier Academic Press, cap 13, p. 153-158, 2005.
HAGHIGHAT, A. & SONEMBERG, N. eIF4G dramatically enhances the binding of eIF4E
to the mRNA 5'-cap structure. J Biol Chem, v. 272, p. 21677-21680, 8-29-1997.
HAILE, S. & PAPADOPOULOU, B. Developmental regulation of gene expression in
trypanosomatid parasitic protozoa. Curr. Opin. Microbiol , v. 10, p. 569-577, 2007.
HERSHEY, J. W. B. & MERRICK, W. C. The pathway and mechanisms of initiation of
protein synthesis. In: SONEMBERG N, HERSHEY JWB, MATHEWS MB. Translational
Lima, R. P. 96
Control of Gene Expression. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, p.
33-88, 2000.
IVENS, A.C., et al. The genome of the kinetoplastid parasite, Leishmania major. Science, v.
309, p. 436-442, 2005.
KENNEDY, P.G.E. Human African trypanosomiasis neurological aspects. Jorn Neurol, v.
253, p. 411-116, 2006.
KENNEDY, P.G. The continuing problem of human African trypanosomiasis (sleeping
sickness). Ann. Neurol, v. 64, p. 116-126, 2008.
KIEFT, J.S. Viral IRES RNA structures and ribosome interactions. Trends Biochem. Sci, v.
33, p. 274-283, 2008.
KISSINGER, J.C. A tale of three genomes: the kinetoplastids have arrived. Trends Parasitol,
v. 22, p. 240-243, 2006.
KRAMER, S. et al. Heat shock causes a decrease in polysomes and the appearance of stress
granules in trypanosomes independently of eIF2(alpha) phosphorylation at Thr169. J. Cell
Sci, v. 121, p. 3002-3014, 2008.
LEBOWITZ, J.H. et al. Coupling of poly(A) site selection and trans-splicing in Leishmania.
Genes Dev, v. 7, p. 996-1007, 1993.
Lima, R. P. 97
LIANG, X.H. et al. trans and cis splicing in trypanosomatids: mechanism, factors, and
regulation. Eukaryot Cell, v. 2, p. 830-840, 2003.
LIU, B. et al. Fellowship of the rings: the replication of kinetoplast DNA. TRENDS Parsitol,
v. 8, p. 363-369, 2005.
LUKES, J., HASHIMI, H. e ZIKOVÁ, A. Unexplained complexity of the mitochondrial
genome and transcriptome in kinetoplastid flagellates. Curr Gen , v. 48, p 277-299, 2005.
MACHADO, C.R. et al. DNA metabolism and genetic diversity in Trypanosomes. Mut Res,
v. 612, p. 40-57, 2006.
MARCOTRIGIANO, J. et al. A conserved HEAT domain within eIF4G directs assembly of
the translation initiation machinery. Mol. Cell, v. 7, p. 193-203, 2001.
MARINTCHEV, A. & WAGNER, G. Translation initiation: structures, mechanisms and
evolution. Q. Rev. Biophys, v. 37, p. 197-284, 2004.
MARINTCHEV, A. et al. Topology and regulation of the human eIF4A/4G/4H helicase
complex in translation initiation. Cell, v. 136, p. 447-460, 2009.
MARTINEZ-CALVILLO, S. et al. Transcription of Leishmania major friedlin chromosome 1
initiates in both directions within a single region. Mol Cell , v. 11, p. 1291-1299, 2003.
Lima, R. P. 98
MARTINEZ-CALVILLO, S. et al. Transcription initiation and termination on Leishmania
major chromosome 3. Eukaryot. Cell, v. 3, p. 506-517, 2004.
MATTHEWS, K.R., TSCHUDI, C. e ULLU, E. A common pyrimidine-rich motif governs
trans-splicing and polyadenylation of tubulin polycistronic pre-mRNA in trypanosomes.
Genes Dev, v. 8, p. 491-501, 1994.
MOORE, M.J. & PROUDFOOT, N.J. Pre-mRNA processing reaches back to transcription
and ahead to translation. Cell, v. 136, p. 688-700, 2009.
MOURA, D.M.N. Utilização de abordagens moleculares in vivo no estudo de homólogos do
fator de iniciação da tradução 4G (eIF4G) de tripanosomatídeos. 104f. Dissertação
(Mestrado em Genética) – Departamento de Genética, Universidade Federal de Pernambuco,
Recife-PE, 2007.
OBERER, M., MARINTCHEV, A. e WAGNER, G. Structural basis for the enhancement of
eIF4A helicase activity by eIF4G. Genes Dev, v. 19, p. 2212-2223, 2005.
PALENCHAR, J.B. & BELLOFATTO,V. Gene transcription in trypanosomes. Mol.
Biochem. Parasitol, v. 146, p. 135-141, 2006.
PERRY, K.L., WATKINS, K.P. e AGABIAN, N. Trypanosome mRNAs have unusual "cap
4" structures acquired by addition of a spliced leader. Proc Natl Acad Sci U S A, v. 84, p.
8190-8194, 1987.
Lima, R. P. 99
PESTOVA, T.V. et al. Molecular mechanisms of translation initiation in eukaryotes. Proc
Natl Acad Sci U S A, v. 98, p. 7029-7036, 6-19-2001.
PREVOT, D., DARLIX, J.L. e OHLMANN, T. Conducting the initiation of protein synthesis:
the role of eIF4G. Biol Cell, v. 95, p. 141-156, 2003.
REIS, C.R.S. Identificação e mapeamento de domínios de ligação de homólogos do fator
eIF4G de iniciação da tradução de Leishmania major. 199f. Tese (Doutorado em Genética) –
Departamento de Genética, Universidade Federal de Pernambuco, Recife-PE, 2009.
REY, L. Tripanossomíase por Trypanosoma brucei e Doença do Sono. In: Parasitologia. 3ª
Edição. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, cap 14, p. 200-206, 2001.
RHOADS, R.E. eIF4E: New Family Members, New Binding Partners, New Roles. J. Biol.
Chem, v. 284, p. 16711-16715, 2009.
SACHS, A.B. & VARANI, G. Eukaryotic translation initiation: there are (at least) two sides
to every story. Nat Struct Biol, v. 7, p. 356-361, 2000.
SAMBROOK, J. & RUSSEL, D. Introduction to Preparation of Plasmids DNA by Alkaline
Lysis with SDS. In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York, Ed. Cold
Spring Harbor Laboratory Press, vol 1, p.1.31-1.42, 2001.
SIMPSON, A.G., STEVENS, J.R. e LUKES, J. The evolution and diversity of kinetoplastid
flagellates. Trends Parasitol. v. 22, p. 168-174, 2006.
Lima, R. P. 100
SONEMBERG, N. & DEVER, T.E. Eukaryotic translation initiation factors and regulators.
Curr Opin Struct Biol, v. 13, p. 56-63, 2003.
SONEMBERG, N. & HINNESBUSCH, A.G. Regulation of Translation Initiation in
Eukaryotes: Mechanisms and Biological Targets. Cell, v. 136, p. 731–745, 2009.
STUART, K. et al. Kinetoplastids: related protozoan pathogens, different diseases. J. Clin.
Invest, v. 118, p. 1301-1310, 2008.
YOFFE, Y. et al. Cap-binding activity of an eIF4E homolog from Leishmania. RNA, v. 10, p.
1764-1775, 2004.
YOFFE, Y. et al. Binding specificities and potential roles of isoforms of eukaryotic initiation
factor 4E in Leishmania. Eukaryot Cell, v. 5, p. 1969-1979, 2006.
YOFFE, Y. et al. Evolutionary changes in the Leishmania eIF4F complex involve variations
in the eIF4E-eIF4G interactions. Nucleic Acids Res, v. 37, p. 3243-3253, 2009.
Referências eletrônicas:
BUCKELEW, T. P. T. lewisi kinetoplast. Disponível em:
<http://workforce.cup.edu/buckelew/trypanosoma_lewisi%20kinetoplast.htm>, Acesso em:
junho de 2009
Lima, R. P. 101
BYGOTT, D. In: DOOLITTLE, W. F. Tree of Life. Disponível em: http://tolweb.org/online
contributors/app?page=ViewImageData&service =external&sp=37102. Acesso em: julho de
2009
CUMMINGS, R. e SALVATORE, T. Parasitic Infections. In: VARKI, A. et al. Essentials of
Glycobiology. 2 th Edition. Califórnia: The Consortium of Glycobiology Editors, CSH Press,
2009. Disponível em: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book=glyco2&part=
ch40#ch40.s3>. Acesso em: junho de 2009.
DESPOMMIER, D., CHEN, S. X. e MURAKAMI, N. African. Trypanosomiasis. In:
DESPOMMIER, D. e CHEN, S. X. MEDICAL ECOLOGY . 2004. Disponível em:
<www.medicalecology.org/disease /d_african_trypano.html>. Acesso em: maio de 2009.
TDR African trypanosomiasis | Life cycle. Disponível em:
<www.who.int/tdrold/diseases/tryp/lifecycle.htm>. Acesso em julho de 2009.
WHO Fact sheet Nº259, African Trypanosomiasis (sleeping sickness). Suíça, 2006a.
WHO Weekly epidemiological record Nº 8. Suíça, 2006b.
WHO Trypanosomiasis | The Disease. Disponível em:
<www.who.int/trypanosomiasis_african/disease/en/>. Acesso em: maio de 2009.
WHO Trypanosomiasis | The Parasite. Disponível em:
<www.who.int/trypanosomiasis_african/parasite/en/>. Acesso em: maio de 2009.
Lima, R. P. 102
ZELEDÓN, R. A. African Trypanosomiasis. In: BARON, S. Medical Microbiology. 4th
Edition. Texas: Ed. Galveston, University of Texas Medical Branch, 1996. Disponível em:
<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=mmed.TOC&depth=2>. Acesso em: junho
de 2009.