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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

INSTITUTO DO CÉREBRO

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NEUROCIÊNCIAS

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

Uma investigação das sequências de fase Hebbianas d escritas como grafos de assembleias neuronais

Aluno: Daniel Gomes de Almeida Filho

Orientador: Sidarta Ribeiro

Co-orientador: José Garcia Vivas Miranda

NATAL, 22 DE JULHO DE 2014

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DANIEL GOMES DE ALMEIDA FILHO

Uma investigação das sequências de fase Hebbianas d escritas como grafos de assembleias neuronais

Dissertação apresentada ao curso de Pós-Graduação em Neurociências da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito parcial para a obtenção do Grau de Mestre.

Orientador: Prof. Dr. SIDARTA TOLLENDAL GOMES RIBEIRO

Co-orientador: Prof. Dr. JOSÉ GARCIA VIVAS MIRANDA

NATAL, 22 DE JULHO DE 2014

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“Within limits imposed by the needs of exposition, a conceptual system has

been elaborated which relates the individual nerve cell to psychological

phenomena. A bridge has been thrown across the great gap between

the details of neurophysiology and the molar conceptions of

psychology. The bridge is definitely shaky in the middle,

but it is well buttressed at each end…”

Hebb 1949

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SUMÁRIO

• AGRADECIMENTOS…………………………………………………………5

• RESUMO……………………………………………………………………….7

• ABSTRACT…………………………………………………………………….9

• INTRODUÇÃO

o Uma breve história da ciência sobre cérebro e comportamento..11

o Assembleias Neuronais e Sequências de Fase…………………..17

o Grafos de Assembleia…………….…………………………………21

o Classificação Automática de Grafos (Classificador Naive

Bayes)…………………………………………………………………24

o Avaliação da Qualidade da Classificação (Área Sob a Curva

ROC) ………………………………………………………………….28

• OBJETIVOS…………………………………………………………………..32

• RESULTADOS……………………………………………………….………33

o Artigo Original: Almeida-Filho, D.G. ; Lopes-dos-Santos, V.; Vasconcelos, N.A.P., Miranda, J.G.V.; Tort, A.B.L. and Ribeiro, S. (2014), An investigation of Hebbian phase sequences as assembly graphs . Front. Neural Circuits 8:34. doi: 10.3389 / fncir.2014.00034

• DISCUSSÃO………………………………………………………………….47

• CONCLUSÕES…………………………………………………………….…51

• PRODUÇÃO………………………………………………………………….53

• REFERÊNCIAS………………………………………………………...……54

• ANEXOS

I. Poster apresentado na XXXVIII Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Neurociências e Comportamento. Explorando os limites da teoria Hebbiana: Uma investigação das Sequências de Fase como grafos de assembleia neuronal . 2013. (Congresso).

II. Almeida Filho, D.G.; Miranda, J.G.V. and Ribeiro, S. (2012). Neuronal Spike Time-Series Show Self-Affinity Granada Seminar on Computational and Statistical Physics. Apresentação Oral (Projeto anterior de mestrado desenvolvido entre mar/2012 a fev/2013).

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AGRADECIMENTOS

Agradeço a meus pais, minha família, amigos, conhecidos, enfim, todos

aqueles que, na relação, são essenciais para que eu compreenda o que ainda

preciso melhorar em mim mesmo. Especialmente minha esposa e companheira

de estrada, Andréia Lírio, e minha filha que nascerá em breve. Não tem nem

nome ainda, mas já me enche de alegria e energia de vida.

Agradeço a Jair Tércio, eterno mestre, que pelo exemplo de ser humano

que é, não me deixa esquecer que o melhor que posso fazer por mim e pelo

meio em que vivo é buscar sempre ser o melhor que posso ser.

Agradeço imensamente a meus orientadores Sidarta Ribeiro e José

Garcia, que foram essenciais na conclusão deste trabalho; especialmente por

acreditarem em mim no momento em que titubeei sobre minhas capacidades.

A Sidarta, principalmente, que soube ser paciente e amigo quando eu

precisava mais disso do que simplesmente de um orientador científico, e me

guiou a um porto seguro, quando a neblina da dúvida ofuscava o horizonte.

Aos amigos do “container ICe”, que me receberam de braços abertos ao

chegar de outro estado e, além das risadas, sempre compartilham e exploram

idéias inovadoras e profundas durante o cafezinho e no “boas novas”, nunca

deixando morrer a fogueira da curiosidade, tão essencial àquele que quer fazer

ciência. Agradeço especialmente ao amigo Vitor Lopes, com quem pude

compartilhar um foco de trabalho e foi sempre um grande amigo, solícito e

compreensivo, especialmente quando as opiniões sobre os rumos de projeto

eram divergentes. Não posso esquecer também das conversas valiosas com o

Prof. Adriano Tort.

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A Guillermo Cecchi pela ajuda com o artigo e a Pedro Petrovich e

Raimundo Furtado pela ajuda e modificações no software do SpeechGraphs.

Às agências de fomento: CNPq e CAPES.

Enfim, aos colegas de laboratório, colaboradores, funcionários e amigos

do ICe: Bryan e Annie Souza, Pavão, Zé Targino, Anderson, Natália Mota,

Nivaldo, Wilfredo, Anibal, André Fonseca, Hindiael, Hjalmar, Ernesto, Jailson

entre outros.

Muito Obrigado!

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RESUMO

Hebb propôs que sinapses entre neurônios que disparam de forma

síncrona são fortalecidas formando assembleias de células e sequências de

fase. A primeira, numa escala menor, é um conjunto de células sincronizadas,

que funcionam de forma transitória como um sistema fechado de

processamento; a última, numa escala maior, corresponde à ativação

sequencial de assembleias de células neuronais capazes de representar

percepções e comportamentos. Atualmente, o registro de grandes populações

neuronais permite a detecção simultânea de diversas assembleias neuronais.

No âmbito da teoria de Hebb, o próximo passo lógico é a análise das

sequências de fase. Neste trabalho investigamos seqüências de fase como

padrões de ativações consecutivas de assembleias, analisando a relação entre

comportamento animal e atributos de grafos de assembleias. Foram estudados

trens de disparo neuronal registrados no hipocampo e neocórtex de 5 ratos

adultos, antes, durante e depois da exploração de novos objetos (períodos

experimentais). Para definir um grafo de assembleia, cada assembleia

correspondeu a um nó, e cada aresta correspondeu à sequência temporal de

ativação de nós consecutivos. A soma da ativação de todas as assembleias foi

proporcional à taxa de disparo, mas a atividade de assembleias individuais não.

O repertório de assembleias permaneceu estável ao longo dos períodos

experimentais, indicando que a experiência com novos objetos não criou novas

assembleias no rato adulto. Os atributos de grafos das assembleia, por outro

lado, variaram significativamente entre os estados comportamentais e períodos

experimentais e foram distintos o suficiente para permitir a classificação

automática dos períodos experimentais (classificador Naive Bayes; AUROCs

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máximas variaram entre 0,55 a 0,99) e estados comportamentais (vigília, sono

de ondas lentas e sono de movimento rápido dos olhos; AUROCs máximas

variaram entre 0,64 e 0,98). Nossos achados reforçam a teoria Hebbiana de

que as assembleias neuronais correspondem a estruturas primitivas de

representação, quase inalteradas na maturidade, enquanto as seqüências de

fase são instáveis entre os estados comportamentais e mudam após novas

experiências. Os resultados são compatíveis com um papel das sequências de

fase no comportamento e cognição.

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ABSTRACT

Hebb proposed that synapses between neurons that fire synchronously

are strengthened, forming cell assemblies and phase sequences. The former,

on a shorter scale, are ensembles of synchronized cells that function transiently

as a closed processing system; the latter, on a larger scale, correspond to the

sequential activation of cell assemblies able to represent percepts and

behaviors. Nowadays, the recording of large neuronal populations allows for the

detection of multiple cell assemblies. Within Hebb’s theory, the next logical step

is the analysis of phase sequences. Here we detected phase sequences as

consecutive assembly activation patterns, and then analyzed their graph

attributes in relation to behavior. We investigated action potentials recorded

from the adult rat hippocampus and neocortex before, during and after novel

object exploration (experimental periods). Within assembly graphs, each

assembly corresponded to a node, and each edge corresponded to the

temporal sequence of consecutive node activations. The sum of all assembly

activations was proportional to firing rates, but the activity of individual

assemblies was not. Assembly repertoire was stable across experimental

periods, suggesting that novel experience does not create new assemblies in

the adult rat. Assembly graph attributes, on the other hand, varied significantly

across behavioral states and experimental periods, and were separable enough

to correctly classify experimental periods (Naïve Bayes classifier; maximum

AUROCs ranging from 0.55 to 0.99) and behavioral states (waking, slow wave

sleep, and rapid eye movement sleep; maximum AUROCs ranging from 0.64 to

0.98). Our findings agree with Hebb’s view that neuronal assemblies

correspond to primitive building blocks of representation, nearly unchanged in

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the adult, while phase sequences are labile across behavioral states and

change after novel experience. The results are compatible with a role for phase

sequences in behavior and cognition.

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INTRODUÇÃO

Uma breve história da ciência sobre cérebro e compo rtamento

A primeira referência escrita ao cérebro da qual se tem conhecimento

data do século XVII A.C. Trata-se do Papiro Edwin Smith; um texto egípcio,

hoje exposto na sala de livros raros da Academia de Medicina de Nova York.

Nele se descrevem procedimentos cirúrgicos em pessoas com trauma

craniano, inclusive correlacionando lesões cerebrais específicas com

determinados comprometimentos motores (Kandel et al., 2000). Nesta época e

provavelmente antes, já era grande a curiosidade do ser humano acerca da

relação entre o cérebro e o comportamento. Porém, ainda que essa

curiosidade tenha germinado precocemente, quase nada floresceu de forma

consistente até cerca de um milênio depois. Não se sabe ao certo, mas

acredita-se que o contexto sócio-cultural permeado por influências místicas

sobre a compreensão da realidade, somado a métodos incipientes para medir e

avaliar os fenômenos e a restrição do conhecimento formal a pequenos grupos,

tenham contribuído para gerar um ambiente pouco fértil para o

desenvolvimento do pensamento sobre essas questões científicas essenciais

(Gross, 1987; Bear et al., 2007).

Em meados do século V A.C., no berço da filosofia, onde as

observações floresciam em ideias e debates sobre questões essenciais do

viver, o grego Hipócrates, mais conhecido como pai da medicina, compilou

algumas de suas observações, experimentações e reflexões sobre o cérebro e

o comportamento, chegando à conclusão de que:

“…de nenhum outro lugar, mas apenas do encéfalo, vem a alegria, o prazer, o riso e a diversão; o pesar, o luto, o

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desalento e a lamentação. E por isso, de uma maneira especial, nós adquirimos sabedoria e conhecimento; e enxergamos e ouvimos; e sabemos o que é justo e injusto; o que é bom e o que é ruim; o que é doce e o que é insípido… E pelo mesmo órgão nos tornamos loucos e delirantes; e medos e terrores nos assombram… Todas essas coisas nós temos de suportar do encéfalo quando não está sadio… Nesse sentido, opino que é o encéfalo que exerce maior poder sobre o homem.” (Bear et al., 2007).

Nos anos que se seguiram, principalmente durante a Idade Média (entre

os séculos V e XV), houve atraso no pensamento científico em geral, e nas

reflexões e descobertas acerca da relação cérebro-comportamento em

particular. A partir do século XVI, tais estudos desenvolveram-se de forma

crescente em relação ao tempo. No início do século XIX, o sistema nervoso já

havia sido completamente dissecado em suas macroestruturas. Já se sabia

que lesões encefálicas poderiam causar desorganização de sensações,

movimentos e pensamentos, ou levar à morte. Sabia-se também que o cérebro

comunicava-se com o corpo por meio dos nervos. Paul Broca (1824-1880) e

Karl Wernicke (1848-1905), com as evidências que publicaram sobre a

localização do processamento de características específicas da linguagem,

reforçaram a teoria localizacionista, na qual propriedades comportamentais

diferentes apresentavam locais de processamento distintos (Bear et al., 2007).

É importante lembrar aqui que as macroestruturas do sistema nervoso

estavam relativamente bem mapeadas, mas uma pergunta pairava no ar: Qual

o mecanismo utilizado pelo sistema nervoso para produzir e integrar todo tipo

de comportamento? Sabia-se razoavelmente sobre a subdivisão anatômica e

nem tanto sobre a subdivisão funcional do sistema nervoso

macroscopicamente, mas como cada uma das estruturas funcionava era e

ainda é uma incógnita.

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No final do século XIX, com a ajuda do desenvolvimento do microscópio,

técnicas de coloração histológica e corte de tecidos; as ciências do sistema

nervoso exploraram escalas espaciais muito menores. Com a visualização dos

neurônios, uma pergunta essencial foi levantada: Como os neurônios se

organizavam estruturalmente? Era possível enxergar os neurônios e detectar

os chamados neuritos (axônios e dendritos), que são prolongamentos do corpo

celular dos neurônios. A esta época e com o nível de detalhamento que os

microscópios permitiam, era impossível determinar com certeza onde

terminava um neurônio e começava outro. Dada a pobre evidência empírica, as

relações entre neurônios poderiam ser contínuas, formando um grande sincício

celular encefálico, como uma rede contínua semelhante ao sistema vascular

(Teoria Reticularista). Alternativamente, cada neurônio seria uma entidade

individual funcional e estrutural, com minúsculas conexões com os outros

neurônios através dos neuritos (Doutrina Neuronal). Não podemos citar essa

disputa sem falar de dois histologistas, grandes defensores de cada uma das

vertentes: o italiano Camillo Golgi (1843-1926), defensor da Teoria

Reticularista, que, ironicamente inventou o método de coloração de tecidos

com prata, que permitiu que o espanhol Santiago Ramón y Cajal (1852-1934)

produzisse evidências microanatômicas para defender a Doutrina Neuronal

(Ramón y Cajal, 1995).

Apesar de só termos resolvido definitivamente esta querela quando da

introdução da microscopia eletrônica em meados do século XX, nos primeiros

anos deste mesmo século, a maior parte das evidências já sugeria que a

Doutrina Neuronal era a real forma de organização das microestruturas do

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sistema nervoso. Por conseguinte, o neurônio foi considerado como a unidade

funcional básica do encéfalo (Bear et al., 2007).

Uma nova série de perguntas surgiu. Neste contexto, a pergunta

essencial de “como o sistema nervoso se organiza para produzir

comportamento”, tomou um novo corpo: “como os neurônios de diferentes

regiões cerebrais interagem a fim de produzir toda a gama de

comportamentos?”. Era o berço de uma nova vertente das ciências

relacionadas com o sistema nervoso, chamada hoje de Neurociência de

Sistemas (Bear et al., 2007).

Neste contexto, a psicologia evoluía a passos largos no estudo do

comportamento em si. Um dos focos era o condicionamento clássico,

eternizado pelo experimento de Pavlov, no qual o comportamento salivar de um

cão (resposta não-condicionada), previamente associado à apresentação de

alimento (estímulo não condicionado), passa a ser determinado apenas por um

estímulo sonoro (estímulo condicionado), decorrente do prévio treinamento do

cão com a apresentação do estímulo condicionado seguido imediatamente do

estímulo não-condicionado. A investigação destes processos de

condicionamento levou a uma produção científica bastante rica na época,

focada primordialmente na análise do binômio estímulo (informação sensorial)

– resposta (comportamento motor ou glandular) na geração e modificação

comportamentais. Uma das principais teorias levou o nome de Behaviorismo,

como uma clara alusão à importância que se dava à análise do comportamento

(Hebb, 1949).

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Porém, grande parte dos partidários do pensamento behaviorista

pregavam o não-fisiologismo da interpretação do comportamento. Defendiam

que não era necessário recorrer a achados neurofisiológicos para prever os

desfechos comportamentais (Hebb, 1949).

De outro lado, a neurofisiologia tentava responder à pergunta sobre a

relação cérebro-comportamento debruçando-se sobre aspectos específicos e

muito pontuais do sistema nervoso que se prestavam à mensuração naquela

época, mas dando pouca atenção às questões comportamentais (Hebb, 1949).

Donald Olding Hebb, psicólogo e neurofisiologista, talvez por ter se

envolvido em ambos os lados, pensava que psicólogos e neurofisiologistas

estavam tratando do mesmo problema e deveriam, portanto, unir forças e

colaborar para responder a pergunta essencial de como a organização da

função neuronal dá lugar ao comportamento (Hebb, 1949).

Dizia ele que, apesar de o cérebro ser formado por partes com estrutura

e funções aparentemente diferentes, sua atividade claramente organizava-se

como um todo no sentido de produzir ações no meio onde o organismo estava

inserido. Por outro lado, defendia que a análise comportamental por si só não

levava em consideração de forma clara fenômenos como atenção, expectativa

e a atividade contínua subjacente do cérebro; as quais, claramente,

influenciavam na resposta do sistema nervoso a um mesmo estímulo. Logo, o

estudo das estruturas encefálicas separadamente acrescentaria muito na

compreensão do cérebro, mas não sem uma compreensão mais completa do

fenômeno comportamental; assim como o estudo do comportamento não

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poderia deixar de lado as evidências e informações neurofisiológicas se

quisesse concretizar qualquer teoria acerca do comportamento (Hebb, 1949).

Em um esforço dialético entre psicologia e neurofisiologia, Hebb chegou,

em 1949, a uma conclusão teórica no livro “A Organização do

Comportamento”. Nele, Hebb faz um debate científico sobre as evidências da

época e usa de racionalidade filosófica para defender suas teorias, as quais só

têm sido confirmadas nas últimas décadas, devido às limitações tecnológicas

da época.

Em meio ao convite à reflexão científica que Hebb faz no livro, ele

postula qual o mecanismo central que deve guiar a relação entre neurônios,

hoje chamada de “Plasticidade Sináptica”, e cunha dois termos essenciais a

sua teoria: “Assembleia Neuronal” e “Sequência de Fase” (Hebb, 1949), os

quais serão melhor explicados no tópico que se segue.

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Assembleias Neuronais e Sequências de Fase

Uma vez que os neurônios foram identificados como unidades funcionais

do sistema nervoso central, Hebb sugeriu que algumas mudanças deveriam

acontecer entre eles, a fim de que fenômenos como memória e aprendizado

pudessem ser explicados:

“Quando um axônio da célula A está perto o suficiente para excitar a célula B, e repetidamente ou persistentemente participa no seu disparo, algum processo de crescimento ou mudança metabólica acontece em uma ou nas duas células, tal que a eficiência de A, como uma das células que causam o disparo de B, aumenta.” (Hebb, 1949)

Ele também sugeriu que tais mudanças deveriam acontecer nas

sinapses, ou seja, no ponto de maior aproximação física entre dois neurônios.

Por muito tempo, este postulado permaneceu sem evidências que o

comprovassem; porém, a partir da segunda métade do séculos XX, alguns

trabalhos sugeriam que tais mudanças poderiam realmente acontecer (Bliss

and Lømo, 1973; Bliss and Collingridge, 1993; Bi and Poo, 1998).

Hebb desenvolveu seu raciocínio com essa premissa e concluiu que

deveria haver algum processo de integração entre as perturbações geradas por

um mesmo estímulo em neurônios diferentes de um mesma região cortical.

Com isso em mente, ele cunhou o termo Assembleias Neuronais, com o

seguinte postulado:

“… a estimulação repetida de receptores específicos levará lentamente à formação de uma ‘assembleia’ de células de áreas associativas, que podem funcionar momentaneamente como um sistema fechado, depois de cessado o estímulo.” (Hebb, 1949)

Segundo Hebb, com a diminuição da resistência sináptica entre células

de uma mesma assembleia, seria possível explicar como algumas memórias

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são transitórias devido à “reverberação” neste sistema fechado, e outras são

permanentes, pois a repetição e persistência da reverberação e as condições

do estímulo determinariam maiores “mudanças estruturais” nas sinapses, a

ponto de tornar o traço de memória permanente (Hebb, 1949).

Após o advento de técnicas de registro simultâneo de largas populações

neuronais (Buzsáki, 2004; Stevenson and Kording, 2011), foi possível estudar a

relação funcional entre a atividade dos neurônios e testar alguns dos

postulados Hebbianos. Confirmou-se, por exemplo, que existem subgrupos de

neurônios que ativam-se estatisticamente com alta sincronicidade, em janelas

temporais na ordem de milisegundos (Harris et al., 2003; Harris, 2005;

Peyrache et al., 2010; Lopes-dos-Santos et al., 2011; Lopes-dos-Santos et al.,

2013) e que, no hipocampo, região associativa sabidamente relacionada com

memória (Andersen et al., 2006), tais subgrupos estão relacionados com

codificação temporal (MacDonald et al., 2011; Kraus et al., 2013) e espacial

(O'Keefe, 1979; Lee and Wilson, 2002; Dragoi and Tonegawa, 2010). Além

disso, há indícios da sua importância comportamental, pois quando ativadas

em conjunto durante uma tarefa, reativam-se no sono (Wilson and

McNaughton, 1994; Peyrache et al., 2009); e, até mesmo, determinam a

expressão do comportamento de medo ou aversão (Ramirez et al., 2013).

Tais evidências, em geral, sugerem a importância da ativação conjunta e

momentânea de subgrupos de neurônios. Porém, em sua teoria, Hebb supunha

que as assembleias seriam responsáveis apenas pela codificação de estímulos

simples, mas outro tipo de processo deveria acontecer para dar conta do

processamento de estímulos complexos, como é a maioria do que se encontra

na natureza (Hebb, 1949). Como usou evidências da modalidade sensorial da

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visão como alicerce para suas afirmações, Hebb desenvolve sua teoria

defendendo que, do ponto de vista neurofisiológico, todo estímulo complexo

poderia ser reduzido a suas partes elementares (assembleias); no caso da

visão: linhas e ângulos (Hebb, 1949).

Ele fundamenta-se em seus próprios experimentos com ratos criados no

escuro (Hebb 1937a apud Hebb, 1949) e os de Senden (1932 apud Hebb,

1949), onde humanos com cegueira congênita, após cirurgia de correção na

maturidade, aprendem muito lentamente a identificar, por exemplo, a diferença

entre estímulos verticais e horizontais. Conclui então que as assembleias, que

constituiriam os componentes elementares da percepção, seriam formadas

lentamente durante o desenvolvimento cerebral – growth of the assembly – e,

uma vez integradas, continuariam modificando-se gradualmente durante a

maturidade (Hebb, 1949).

Uma vez formadas as partes elementares, em uma ordem superior, elas

seriam integradas de formas diversas para formar percepções complexas; o

que explicaria a capacidade de aprendizado mais rápida na maturidade. Como

o fenômeno cognitivo ocorre de forma contínua, tal integração deveria

acontecer em sequência, de um componente elementar a outro, de uma

assembleia a outra; em outras palavras, a sequência de fase:

“… uma ‘assembleia neuronal’ facilitando a ativação de outros sistemas similares … [ ] … Uma série desses eventos constitui a ‘sequência de fase’ – o processo de pensar. Cada atividade de assembleia pode ser determinada por uma ativação prévia de outra assembleia, por um evento sensorial, ou – comumente – por ambos.”(Hebb, 1949)

Atualmente, existem também evidências que sugerem a codificação de

informação na sequência de ativação de neurônios ou grupos deles, e indicam

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sua importância comportamental (Wehr and Laurent, 1996; Lee and Wilson,

2002; Pastalkova et al., 2008; Dragoi and Tonegawa, 2010; Pfeiffer and Foster,

2013). Hebb defendia entretanto que a estabilidade de uma percepção não

estaria codificada na atividade sustentada de um mesmo subsistema cerebral

(assembleia), mas na tendência de recorrência das fases de um ciclo irregular

(sequência de fase) (Hebb, 1949). Logo, quando se trata da neurofisiologia de

estímulos complexos, é importante investigar codificação não só em

sequências específicas, mas no padrão das múltiplas ativações de

assembleias.

A proposta deste trabalho é avançar na teoria Hebbiana, investigando,

com o auxílio da teoria de grafos, as diferenças no padrão das sequências de

múltiplas ativações de assembleias constituídas por neurônios localizados em

regiões cerebrais distintas, tanto associativas (hipocampo), como primárias

(córtices somatosensorial e visual primários). Para isso, utilizou-se o

paradigma de ratos explorando objetos novos em comportamento livre,

atravessando todo o ciclo sono-vigília (Ribeiro et al., 2007).

21

Grafos de Assembleia

Podemos dizer que o sistema nervoso central é um sistema complexo

devido a algumas de suas características; principalmente, a grande quantidade

de elementos formadores (neurônios), a presença de interações não-lineares

entre eles e a existência de comportamentos emergentes (e.g. memória)

(Nussenzveig and Júnior, 1999); mas também devido às diversas evidências de

ocorrência de padrões clássicos de sistemas complexos, como avalanches,

redes livres de escala, padrões auto-similares, entre outros (R Chialvo, 2004;

Eguiluz et al., 2005; He et al., 2010; Ribeiro et al., 2010).

Um dos principais artifícios matemáticos utilizados para estudar sistemas

complexos é a teoria de grafos. Formalmente, um grafo é definido como

� = (�, �), onde � = �,�, , … � é o conjunto de vértices ou nós da rede e

� = {(, �), (, ), (�, ), … } é o conjunto de arestas, que representam

algum tipo de associação entre os nós, a depender do tipo de rede estudada. O

grafo pode ainda ser direcional ou não direcional, com relação à presença ou

não de simetria na relação entre os nós, e as arestas podem ou não apresentar

peso (valor que determina o grau de associação entre os nós) (Bollobás, 1998).

Existem duas formas principais no uso de grafos como ferramenta de

análise do sistema nervoso central: redes estruturais e redes funcionais. As

redes estruturais são definidas por nós e arestas representando estruturas

físicas do sistema nervoso. Já nas redes funcionais, os nós são geralmente

estruturas físicas e as arestas são determinadas por algum tipo de associação

funcional entre os nós, como por exemplo a correlação entre sinais de

eletroencefalografia, ressonância nuclear magnética funcional,

22

magnetoencefalografia ou matrizes de multieletrodos. (Bullmore and Sporns,

2009)

O presente trabalho propõe o uso da teoria de grafos direcionados e não

ponderados (sem peso) para representar a sequência de múltiplas ativações de

assembleias, a chamada sequência de fase. Nestes grafos, as assembleias

representam os nós e as sequências temporais de ativação consecutiva entre

assembleias representam as arestas (VIDE RESULTADOS – Figura 4A e 4B).

Considerar os nós como assembleias e não como neurônios permite-nos

avaliar a dinâmica do sistema com a dimensionalidade reduzida a subconjuntos

de neurônios com grande potencial de relevância cognitiva, dada a alta

correlação estatística entre a atividade de seus componentes (Lopes-dos-

Santos et al., 2013). Do ponto de vista da teoria Hebbiana, tais subconjuntos de

neurônios (assembleias), seriam unidades perceptivas elementares que, ao

atuarem de forma sequencial, produziriam todo tipo de percepção complexa.

Logo, a teoria de grafos direcionais mostra-se como uma ferramenta bastante

útil na investigação das sequências de fase.

Como primeiro passo, este estudo foca nas possíveis diferenças

estruturais dos grafos gerados em diferentes períodos experimentais (antes –

PRÉ, durante – EXP e após – PÓS a exposição à novidade) e estados

comportamentais (vigília – VIG, sono de ondas lentas – SOL e sono de

movimento rápido dos olhos – sMRO), através da medida de atributos dos

grafos gerados.

Atributos de grafos são características mensuráveis que indicam

propriedades do sistema representado pelo grafo (Bullmore and Sporns, 2009),

23

como número de nós, densidade, grau médio total, entre outras descritas na

Tabela 1 (VIDE RESULTADOS).

Neste estudo, a análise da diferença entre os atributos de grafos de

assembleias foi feita através da classificação automática do conjunto dos seus

atributos em períodos experimentais e estados comportamentais diferentes.

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Classificação Automática de Grafos (Classificador Naive Bayes)

Thomas Bayes foi um matemático inglês que desenvolveu os

fundamentos que descrevem a relação entre as probabilidades condicionais; os

quais, após sua morte, foram generalizados e definidos formalmente com um

teorema que levou seu nome (Bishop, 2006):

�(�|�) = �(�)�(�|�)

�(�) ,

onde �(�) representa a probabilidade de um evento �; �(�), a probabilidade

de um evento �; �(�|�), a probabilidade condicional de � dado � e �(�|�) a

probabilidade condicional de � dado �. Tal teorema é especialmente útil na

determinação da probabilidade de um evento, dada uma informação a priori

(e.g., qual a probabilidade de uma pessoa ser mulher �(�), sabendo-se que ela

tem 1,62 metros (m) de altura�(�)? = �(�|�)?) (Grinstead and Snell, 1998;

Bishop, 2006). Para tanto, é necessário que se disponha de informações sobre

as variáveis estudadas na população de interesse (métodos com esta

característica são chamados supervisionados). Ou seja, é preciso saber qual a

probabilidade de uma pessoa ser mulher (�(�)), qual a probabilidade de uma

pessoa medir 1,62 m de altura (�(�)) e a proporção de pessoas que medem

1,62 m no grupo das mulheres (�(�|�)).

De forma simplificada, o classificador Naive Bayes ou Bayes Ingênuo

usa o teorema de Bayes para definir a probabilidade de que um determinado

evento � (e.g., pessoa com cabelos longos, 162m de altura e 60 kg de massa)

faça parte de cada uma das classes disponíveis � (e.g., mulher ou homem),

determinando a classe do evento testado como aquela de maior probabilidade.

25

Ele é dito ingênuo (Naive) por que assume que as variáveis do evento,

�, ��, …�� (comprimento do cabelo, altura, peso, etc) são independentes

entre si. Na avaliação da probabilidade de múltiplas variáveis em cada uma das

classes, o teorema fica formalmente definido como:

�(��|�, ��, … , ��) =�(�)�(��,��,…��|��)

�(��,��,…��),

onde �(��|�, ��, …��) é a probabilidade de que o evento �, que apresenta o

conjunto de características (variáveis) supostamente independentes

�, ��, …��, faça parte da classe ��, que é uma das classes do conjunto de

classes �, com � = 1, 2, … , ! (Murphy, 2006).

Como resultado, o classificador automático Naive Bayes define que o

evento � (e.g., pessoa com cabelos longos, 1,62m de altura e 60 kg de massa)

pertence, por exemplo, à classe � (mulher), se a probabilidade de que as

características de �(�, ��, …��) pertençam a � for maior do que a

probabilidade de que pertençam a cada uma das outras possíveis classes

(��, � , … "#�$).

As vantagens do uso do método Naive Bayes incluem a rapidez na

classificação, o fato de não ser sensível a variáveis irrelevantes (e.g., usar a

variável cor dos olhos para classificar entre homens e mulheres), ser útil na

classificação com entrada de dados reais (contínuos) ou discretos; e classifica

bem eventos com muitas variáveis de igual relevância (métodos alternativos

como a Árvore de Decisão, ficam comprometidos neste caso) (Bishop, 2006).

As limitações do método Naive Bayes incluem o fato de que ele assume

um pressuposto de independência entre as variáveis, o qual não existe

26

necessariamente (e.g., no exemplo acima de classificação entre homens e

mulheres, altura e massa são variáveis dependentes – pessoas mais altas,

geralmente têm maior massa), porém apresenta bons resultados de

classificação mesmo nos casos em que há grande dependência entre as

variáveis (Domingos and Pazzani, 1997). Além disso, pode tembém apresentar

problemas de classificação se os dados que compõem a amostra a priori forem

muito pequenos e não representem a população estudada; porém os demais

métodos de classificação supervisionados também sofrem com este problema

em maior ou menor grau (Banko and Brill, 2001). Por último, o Naive Bayes é

um método de aprendizado de máquina supervisionado, ou seja, é necessário

saber, a priori, a classe de cada um dos eventos de uma amostra prévia, a fim

de classificar um evento individual (Murphy, 2006).

Porém, o trabalho aqui proposto não visa classificar grafos (eventos) em

estados comportamentais ou períodos experimentais (classes), o que torna

irrelevante o fato do método ser supervisionado. O objetivo é usar os atributos

dos grafos de assembleias (número de nós, número de arestas repetidas,

número de arestas paralelas, etc; VIDE RESULTADOS – Tabela 1) gerados em

cada uma destas condições, para avaliar, através da classificação automática,

se os valores dos atributos de grafo apresentam diferenças suficientes entre

condições para permitir a classificação automática com alta qualidade.

É razoável afirmar que, se os atributos de grafos forem bastante

semelhantes em estados comportamentais e períodos experimentais diferentes

(Figura 1 – gráfico superior), qualquer método de classificação automática,

inclusive o Naive Bayes, certamente apresentará dificuldades para classificar

os grafos, através de seus atributos, em cada uma das condições, o que se

27

refletirá na baixa qualidade do processo de classificação. Logo, a qualidade da

classificação é uma medida indireta da magnitude da distinção entre valores

dos atributos de grafos de assembleias em condições diferentes. Em outras

palavras, um resultado com boa qualidade de classificação, por exemplo, entre

VIG versus SOL, indica, indiretamente, que os grafos produzidos por ativações

de assembléia na VIG têm características estruturais (número de nós, número

de arestas paralelas, etc) diferentes dos grafos do SOL (Figura 1 – gráfico

inferior), suficientes para diferenciar entre classes (VIG versus SOL) através de

um classificador automático.

Figura 1: Exemplos de distribuição do Número de Arestas Paralelas de grafos simulados como se tivessem sido

construídos com ativações de assembleias durante o SOL e durante a VIG. O histograma superior mostra um caso

onde VIG e SOL apresentam distribuições muito similares, inclusive com médias muito próximas (4,6 e 5,3,

respectivamente). O histograma inferior mostra um exemplo onde as distribuições apresentam médias com

maior disparidade que o exemplo anterior (4,2 e 7,1, respectivamente).

28

Avaliação da Qualidade da Classificação (Área Sob a Curva ROC)

Para avaliar a qualidade do processo de classificação é preciso

comparar a condição real com a classificação artificial. No caso dos métodos

supervisionados como o Naive Bayes, um subgrupo de eventos (grafos), dos

quais se sabe a classe a priori, é utilizado para treinamento, e os demais

eventos são utilizados para testar o classificador (Murphy, 2006). Então, uma

matriz de confusão ou tabela de contingência é utilizada para análise dos

dados da amostra teste (Fawcett, 2006), conforme exemplo de classificação

binária da Tabela 1.

Tabela 1: Exemplo de Matriz de Confusão ou Tabela de

Contingência. Comparação entre casos reais de Gravidez e

resultados de teste de gravidez de farmácia.

VERDADEIRO

POSITIVO (VP)

FALSO NEGATIVO

(FN)

FALSO POSITIVO

(FP)

VERDADEIRO

NEGATIVO (VN)

No que diz respeito à avaliação da qualidade de um classificador binário,

a análise ROC (Receiver Operating Characteristic) aparece como um dos

TESTE DE FARMÁCIA

Positiva Negativa

GR

AV

IDE

Z

Aus

ente

Pre

sent

e

29

principais métodos. O espaço ROC é um espaço bidimensional, real, positivo e

normalizado (variando de 0 a 1 em ambas as dimensões), no qual o eixo das

abscissas é representado pela taxa de falsos positivos

(%&� = &� (&� ' �() = 1 )⁄ especificidade) e o eixo das ordenadas é

representado pela sensibilidade ou taxa de verdadeiros positivos (%�� �

�� ��� ' &(�⁄ ) (Fawcett, 2006), conforme a Figura 2.

Figura 2: Exemplo de curvas ROC e AUROCs. Linha azul escura representa a curva ROC de uma classificação

binária aleatória (como o jogar de uma moeda). A sombra azul representa a AUROC deste exemplo. A linha

vermelho escura representa uma curva ROC de classificação com boa performance, ilustrada pela sombra

vermelha (AUROC). O ponto A, em verde, representa uma calssificação hipotética perfeita.

Cada ponto neste espaço representa uma matriz de confusão ou uma

amostra analisada pelo classificador a ser testado (Fawcett, 2006). Quanto

mais superior e à esquerda for o ponto, melhor a performance do classificador

avaliado, ou seja, maior a TVP e menor a TFP. No exemplo Gravidez, se a

30

análise de uma amostra de Testes de Farmácia (classificador) representa

hipoteticamente o ponto (0,1) no espaço ROC, significa que, na amostra

analisada, todos os casos de Gravidez foram detectados pelos Testes de

Farmácia (benefício) e que nenhum caso negativo para Gravidez foi

classificado erroneamente como positivo pelo Teste de Farmácia (risco), ou

seja, o exemplo demonstraria uma classificação perfeita (Figura 2 – Ponto A).

No caso de classificadores binários automáticos (e.g., Regressão Linear,

Árvore de Decisão, Redes Neurais Artificiais, Naive Bayes, etc) e assumindo, a

título explicativo, que todos eles descrevam, como resultado, uma escala

numérica contínua unidimensional (+) e um limite (,) nesta escala, que divide a

classificação em uma classe ou outra; ao variar-se o valor de , em toda a

extensão de +, os pontos no espaço ROC vão variar de (0,0) a (1,1),

descrevendo uma curva entre eles (curva ROC) (Bradley, 1997; Fawcett,

2006).

A área sob a curva ROC (Area Under ROC ou AUROC ou AUC) é um

valor que varia de 0 a 1 e indica a performance do classificador. Como

exemplo, uma AUROC de 0,5 indicaria que há 50% de chance de que uma

pessoa Grávida apresente Teste de Farmácia positivo, ou seja, uma baixa

qualidade de classificação, não diferente de uma classificação aleatória. De

forma empírica, classificações na faixa de 0,5 ≤ AUROCs ≤ 0,6 são

consideradas ruins, 0,6 < AUROCs ≤ 0,8 são boas e 0,8 < AUROCs ≤ 1,0 são

consideradas excelentes classificações (Bradley, 1997).

Em linhas gerais, a AUROC é uma medida da probabilidade de que um

evento será classificado corretamente, o que depende do classificador e da

31

diferença real existente entre as classes. Em outras palavras, se mantivermos

o mesmo classificador, a classificação dependerá do quanto o Teste de

Farmácia de uma mulher Grávida difere do Teste de alguém não-grávida. No

trabalho aqui proposto, a AUROC do classificador Naive Bayes (que será

mantido constante) indicará, indiretamente, se os valores dos atributos dos

grafos de uma determinada condição são suficientemente diferentes dos

atributos de outra condição (e.g. vigília vs. sono de ondas lentas), a ponto de

poderem ser separadas por um classificador automático com boa qualidade.

Isto é o que procuramos demonstrar em artigo recentemente publicado

que constitui o cerne desta dissertação (VIDE RESULTADOS).

32

OBJETIVOS

Geral: Investigar as mudanças na estrutura das sequências de ativação

de assembleias neuronais em ratos, através de grafos de assembleias

extraídos de estados comportamentais e períodos experimentais diferentes, em

um paradigma de exploração de novos objetos.

Específicos:

1. Determinar o melhor tamanho de janela temporal de

contagem de potenciais de ação utilizado para detecção de assembleias

neuronais;

2. Estudar as diferenças na quantidade de assembleias

neuronais detectadas nos diferentes períodos experimentais;

3. Investigar a dependência entre atividade das assembleias e

taxa instantânea de disparo populacional;

4. Comparar a taxa de ativação e coativação de assembleias

neuronais entre os diferentes períodos experimentais e estados

comportamentais;

5. Quantificar a discriminação de estados comportamentais e

períodos experimentais realizada por um classificador automático

alimentado com atributos de grafos de assembleias neuronais.

33

RESULTADOS

ORIGINAL RESEARCH ARTICLEpublished: 08 April 2014

doi: 10.3389/fncir.2014.00034

An investigation of Hebbian phase sequences as assemblygraphs

Daniel G. Almeida-Filho 1, Vitor Lopes-dos-Santos1, Nivaldo A. P. Vasconcelos 2,3, José G. V. Miranda4,Adriano B. L. Tort 1 and Sidarta Ribeiro 1*

1 Brain Institute, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, Brazil2 Circuit Dynamics and Computation Laboratory, Champalimaud Neuroscience Programme, Lisbon, Portugal3 Universitary Center of Rio Grande do Norte , Natal, Brazil4 Physics Department, Federal University of Bahia, Salvador, Brazil

Edited by:

Guillermo A. Cecchi, IBM Watson

Research Center, USA

Reviewed by:

Antonio C. Roque, Universidade de

São Paulo, Brazil

Fernando Montani, CONICET

Argentina, Universidad Nacional de

La Plata, Argentina

*Correspondence:

Sidarta Ribeiro, Laboratory of

Memory, Sleep and Dreams, Brain

Institute, Federal University of Rio

Grande do Norte, Av. Nascimento

de Castro 2155, Natal,

RN 59056-450, Brazil

e-mail: sidartaribeiro@neuro.ufrn.br

Hebb proposed that synapses between neurons that fire synchronously are strengthened,

forming cell assemblies and phase sequences. The former, on a shorter scale, are

ensembles of synchronized cells that function transiently as a closed processing system;

the latter, on a larger scale, correspond to the sequential activation of cell assemblies

able to represent percepts and behaviors. Nowadays, the recording of large neuronal

populations allows for the detection of multiple cell assemblies. Within Hebb’s theory,

the next logical step is the analysis of phase sequences. Here we detected phase

sequences as consecutive assembly activation patterns, and then analyzed their graph

attributes in relation to behavior. We investigated action potentials recorded from the

adult rat hippocampus and neocortex before, during and after novel object exploration

(experimental periods). Within assembly graphs, each assembly corresponded to a

node, and each edge corresponded to the temporal sequence of consecutive node

activations. The sum of all assembly activations was proportional to firing rates, but

the activity of individual assemblies was not. Assembly repertoire was stable across

experimental periods, suggesting that novel experience does not create new assemblies

in the adult rat. Assembly graph attributes, on the other hand, varied significantly across

behavioral states and experimental periods, and were separable enough to correctly

classify experimental periods (Naïve Bayes classifier; maximum AUROCs ranging from

0.55 to 0.99) and behavioral states (waking, slow wave sleep, and rapid eye movement

sleep; maximum AUROCs ranging from 0.64 to 0.98). Our findings agree with Hebb’s

view that assemblies correspond to primitive building blocks of representation, nearly

unchanged in the adult, while phase sequences are labile across behavioral states and

change after novel experience. The results are compatible with a role for phase sequences

in behavior and cognition.

Keywords: cell assembly, phase sequence, graph, sleep, learning and memory

INTRODUCTION

The firing synchronization of groups of neurons is a well-known

phenomenon in the brain (Harris et al., 2003; Buzsáki, 2004;

Harris, 2005; Canolty et al., 2010; Lopes-dos-Santos et al., 2011).

According to the cell assembly hypothesis (Hebb, 1949), neu-

rons transiently synchronize in order to form elementary units of

information processing. Some reports have provided experimen-

tal evidence that assembly activity, i.e., the co-firing of assembly

members, can be related to formation of memories and behav-

ior (Wilson and McNaughton, 1994; Stopfer et al., 1997; Robbe

et al., 2006; Peyrache et al., 2009; Liu et al., 2012; Ramirez

et al., 2013). Furthermore, sensory or electrical stimulation able

to synchronize neuronal firing in the millisecond scale has been

shown to generate sequentially, in the minute to hour scale,

synaptic potentiation, immediate-early gene expression, synap-

tic remodeling and dendritic sprouting (Chang et al., 1991; Bliss

and Collingridge, 1993; Deisseroth et al., 1995; Klintsova and

Greenough, 1999). In principle, this sequence of events satisfac-

torily explains why neurons that fire together wire together, and

vice-versa. However, to date there is still a mechanistic hiatus

between neuronal synchronization and the perception of complex

stimuli, or the planning and execution of complex motor tasks.

The gap between cell assemblies and behavior was anticipated

by Hebb (1949), who proposed that synchronized cell assem-

blies would evolve over time as phase sequences: “Any frequently

repeated, particular stimulation will lead to the slow develop-

ment of a ‘cell-assembly,’ a diffuse structure comprising cells in

the cortex and diencephalon (and also, perhaps, in the basal gan-

glia of the cerebrum), capable of acting briefly as a closed system,

delivering facilitation to other such systems and usually having

a specific motor facilitation. A series of such events constitutes

a ‘phase sequence’—the thought process. Each assembly action

may be aroused by a preceding assembly, by a sensory event,

or—normally—by both.”

Frontiers in Neural Circuits www.frontiersin.org April 2014 | Volume 8 | Article 34 | 1

NEURAL CIRCUITS

Almeida-Filho et al. Phase sequences as assembly graphs

For many years these ideas remained untestable, but in the

past two decades, the detection and tracking of assemblies became

feasible due to major improvements in multi-electrode record-

ing techniques (Nicolelis et al., 2003; Buzsáki, 2004; Schrader

et al., 2008), as well as the development of adequate mathematical

frameworks for the identification of non-random synchroniza-

tion (Berger et al., 2010; Denker et al., 2010; Peyrache et al., 2010;

Lopes-dos-Santos et al., 2011, 2013). As a consequence, studies on

assembly activity and learning were recently published (Peyrache

et al., 2009; Benchenane et al., 2010); there were also demonstra-

tions of information coding by the temporal sequence of neurons

(Ikegaya et al., 2004; Ji and Wilson, 2006; Pastalkova et al., 2008;

Peyrache et al., 2009; Dragoi and Tonegawa, 2010). The hip-

pocampus, in particular, harbors assemblies activated by specific

places or time intervals, forming representational sequences (Lee

and Wilson, 2002; Macdonald et al., 2011; Kraus et al., 2013;

Pfeiffer and Foster, 2013).

In the present work we aimed to advance the investigation

of the next logical step in Hebbian theory, namely the detec-

tion of phase sequences as consecutive multi-assembly activation

patterns. We also set out to investigate the relationship between

phase sequences and cognitive behavior. The developed method

was based on graph theory and it was applied to datasets com-

prising chronic extracellular spike recordings from the primary

visual (V1) and somatosensory (S1) cortices, as well as the CA1

region of the hippocampus (HP), of rats subjected to a novel

object exploration paradigm (Ribeiro et al., 2007).

MATERIALS AND METHODS

EXPERIMENTAL PERIODS OF THE BEHAVIORAL PARADIGM

We used data from five Long-Evans adult male rats (300–350

g) recorded before, during and after a novel object exploration

paradigm (Ribeiro et al., 2007). The behavioral paradigm began

with 1–2 h of recordings as a freely-behaving rat went through

the wake-sleep cycle (PRE period). Next, the animal was allowed

to explore 4 novel objects placed in the corners of the recording

box for 20min (EXP period). Finally, the objects were removed

and the animal was recorded for an additional 1–4 h, freely

traversing the wake-sleep cycle (POST period). Video recordings

with infrared illumination were used to document behavior. The

present study focused on the 1 h PRE and POST periods flanking

EXP (Figure 1A).

MULTIELECTRODE ARRAY IMPLANTATION

Briefly, the rats were anesthetized and surgically implanted with

multielectrode arrays of tungsten microwires (35µm, 1.0–1.2

MOhm at 1 kHz). A screw implanted on the frontal portion of

the skull served as recording ground. The arrays targeted HP,

S1, and V1 in the left hemisphere stereotaxic coordinates in mm

from Bregma with respect to the antero-posterior (AP), medio-

lateral (ML), and dorso-ventral (DV) axes (Paxinos and Watson,

1997): HP (AP:−2.80;ML:+1.5; DV:−3.30); S1 (AP:−3.00;ML:

+5.5; DV: −1.40); V1 (AP: −7.30; ML: +4.00; DV: −1.30). DV

measurements were taken with respect to the pial surface. Arrays

comprised 16–32 microwires spaced at 250mm intervals (4× 4

arrays for S1 and V1, 2× 16 array for HP). In S1 and V1, arrays

were aimed at pyramidal layer V.

ELECTROPHYSIOLOGICAL RECORDINGS AND UNIT SORTING

As described in detail in Ribeiro et al. (2007), action potentials

(spikes) and local field potentials (LFP) were recorded withmulti-

electrode arrays placed in the dorsal CA1 region and dentate gyrus

of HP, in the barrel field of S1, and in V1. Animals were recorded

after a 1-week recovery period following surgery. A 96-channel

multineuron acquisition processor (MAP, Plexon Inc, Dallas, TX)

was used for digital spike waveform discrimination and storage.

Action potentials (spikes) were extracted from the high frequency

band data and sorted into units using supervised online spike

sorting (SortClient 2002, Plexon Inc.) associated with posterior

offline validation (Offline Sorter 2.3, Plexon Inc). LFPs recorded

from the same wires were pre-amplified, filtered, and digitized

using a Digital Acquisition card (National Instruments, Austin,

TX) and a MAP (Plexon Inc). Behaviors were recorded through-

out the entire experiment under infrared illumination, by way of

two CCD video cameras and a videocassette recorder. Video and

neural recordings were synchronized with amillisecond-precision

timer (model VTG-55; For-A, Tokyo, Japan). Within each region,

the amount of units consisted of 42 HP, 33 S1 and 20V1 for rat #

1, 59 HP, 23 S1 and 28V1 for rat # 2, 34 HP, 25 S1 and 23V1 for

rat # 3, 39 HP, 27 S1 and 37V1 for rat # 4 and 45 HP, 39 S1 and

42V1 for rat # 5.

SORTING OF BEHAVIORAL STATES

We used LFP data associated with a behavioral state sorting

algorithm (Gervasoni et al., 2004) to classify the states with 1 s res-

olution. The algorithm is based on a two-dimensional state space

defined by two spectral amplitude ratios calculated by divid-

ing integrated spectral amplitudes at selected frequency bands.

A scatter plot of the two chosen LFP spectral amplitude ratios

(state-space) reveals distinct clusters that correspond to the three

major wake-sleep states studied here: waking (WK), slow wave

sleep (SWS), and rapid eye movement sleep (REM).

ASSEMBLY DETECTION

A cell assembly is a subset of cells that somehow behave as a sin-

gle entity. Here we assumed a linear model. More specifically, we

defined the activity of a cell assembly as a weighted sum of the

activity of individual units. In order to determine the weights of

each neuron to each cell assembly we used a recently developed

framework (Lopes-dos-Santos et al., 2013), which can be briefly

described in four main steps:

(1) The spike train of each neuron was binned into 5ms windows

and z-scored (i.e., variance and mean were set to 1 and 0,

respectively). Thus, the population activity was transformed

in amatrix in which each element represented the normalized

number of spikes of a given neuron in a given time bin. We

referred to this matrix as activity matrix.

(2) Then, the number of statistically significant cell assemblies

was estimated by counting how many principal components

of the activity matrix had associated variances above the

upper bound of the Marcenko-Pastur analytical distribution

of eigenvalues (Marcenko and Pastur, 1967; Peyrache et al.,

2010; Lopes-dos-Santos et al., 2011).

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Almeida-Filho et al. Phase sequences as assembly graphs

FIGURE 1 | Behavioral paradigm and cell assembly detection. (A) Rats

were submitted to three periods of experimentation. During PRE and POST

periods, animals were kept in a rectangular box freely behaving for 1 h,

including complete wake-sleep cycle, sorted here as WK, SWS, and REM.

Within EXP period, 4 novel objects were placed in the corners of the box and

the animals were free to explore them for 20 min. Figure adapted from

Ribeiro et al. (2007). (B) Toy example of assembly detection and projection of

assembly activity time-series. We simulated 30 independent neurons as

Poisson processes with mean 1 spike/bin and created three assemblies (A–C)

by setting 3% of the data (1% for each assembly) as bins with

synchronization between the cells of a specific assembly. In this dataset,

assembly A comprises neurons # 1, # 2, and # 3; assembly B is formed by

neurons # 7, # 8, # 9, and # 10 and neurons # 4, # 5, and # 6 make assembly

C. Top panel shows the spike matrix (white circles mark co-activations of

assembly neurons). Bottom panel shows the assembly activity time-series,

calculated using the ICA-based method described in Lopes-dos-Santos et al.

(2013). Note that the assembly activities peak only when their corresponding

neurons co-fire.

(3) The activity matrix was projected into the subspace spanned

by the principal components with eigenvalues crossing the

statistical threshold and then submitted to Independent

Component Analysis (ICA) (Laubach et al., 1999; Hyvärinen

and Oja, 2000). Independent components can be understood

as assembly patterns that represent assemblies when the lin-

ear model is assumed (Lopes-dos-Santos et al., 2013), i.e.,

the values attributed to each neuron in a pattern define the

weights of the cells in the corresponding assembly.

(4) Individual cell assembly activity was computed by projecting

the activity matrix onto its assembly pattern (Lopes-dos-

Santos et al., 2013), which can be mathematically defined as:

AAb =

Nneurons∑

i= 1

wizib = WTZb,

where AAb is the assembly activity at time bin b, Nneurons is

the total number of neurons, wi is the weight of neuron i in

a specific assembly and zib is the z-scored activity of neuron

i within bin b. We removed the contribution of single units

firing alone (for instance, if a heavily-weighted neuron acti-

vated but others were silent, the assembly activity remained

low).

Figure 1B shows an illustrative example of an activity matrix

(top panel) along with the assembly activities estimated by the

method. For more details, see (Lopes-dos-Santos et al., 2013).

RESULTS

TIME BIN DETERMINATION

We used an empirical approach to adequately choose the size of

the time bins. First, we tested a wide range of bin sizes (2–256ms)

to investigate the relationship between bin size and number of

detected assemblies. As shown in Figure 2A, we found an inverse

relation between bin size and number of assemblies. We analyzed

this closely and found that single assemblies detected with larger

bin sizes could be split in two other assemblies when smaller bin

sizes were used. The raster plot in Figure 2B shows the 20 most

weighted units, sorted from heavier (top) to lighter (bottom),

which comprise the patterns of assembly A (80% of the total

weight). This assembly is one of the assemblies detected using

Frontiers in Neural Circuits www.frontiersin.org April 2014 | Volume 8 | Article 34 | 3

Almeida-Filho et al. Phase sequences as assembly graphs

FIGURE 2 | Time bin size influences the detection of cell assemblies.

(A) Plot between log2 of bin size in milliseconds and the number of detected

assemblies. We assessed bins in a binary scale from 2 to 256 ms. Notice an

inverse correlation between log2 of bin size and the number of assemblies;

inset shows the distribution of slopes of the linear fits in the main panel. Gray

dashed line depicts the 5 ms bin size chosen in our study. (B) (Bottom)

120 ms of assembly activity from animal # 1, showing activity of assembly A

(black line), detected in EXP WK with 16 ms bin size, and of assemblies A′

(blue line) and A′′ (green line), detected with a bin size of 4 ms. (Top)

Rasterplot of the 20 most relevant neurons that constitute assembly A (80%

of the weight), ranked from highest weight to the twentieth highest. Light

gray shadow represents 16 ms intervals, dark gray ones represent 4 ms. Blue

dots exhibit the spike times of neurons contributing to assembly A′ activity

peak (black and red arrows, bottom panel). Green dots mark spikes

contributing to assembly A′′ activity peak (black arrow head, bottom panel).

Colored dots (spike times) are graded from darker to lighter respective to the

weight of the correspondent neuron in the assembly pattern. Note that

neurons participating in assembly A (bin 16 ms) were sorted into assemblies

A′ and A′′ (bin 4 ms), which can be active in sequence (black arrow and arrow

head) or independently (red arrow). (C) Exploring similarities between

assemblies. Panels show the histogram of SI values from 10,000

comparisons made by shuffling the neurons weights within assemblies to

build a null hypothesis (bootstrap procedure). Red dashed line shows the

threshold for significance at p = 0.01. Red circles depict the SI between A

and A′ (0.82, top), A and A′′ (0.51, middle), and A′ and A′′ (0.016, bottom).

Note that assembly A is significantly similar to A′ and A′′ (SI = 0.82 and 0.51,

respectively). The SI between A′ and A′′ was small (SI = 0.016), indicating

that, in addition to the fact that these assemblies have independent activity,

they also have orthogonal membership. A′ and A′′ exhibit strong assembly

activations at different time bins (panel B–arrows vs. arrow head). However,

when 16 ms time bins were used, the activities of these assemblies were

packed in the same time window, causing the merge of A′ and A′′ into A.

a 16ms time bin in rat # 1 dataset, and its activity is shown in

black (Figure 2B, bottom); while the activities of two assemblies

detected using a 4ms bin size (A′ and A′′) are depicted in blue and

green, respectively (Figure 2B, bottom).

To use a quantitative criterion to compare assembly compo-

sition, a Similarity Index (SI) was defined as the absolute value

of the inner product between the assembly patterns (unitary vec-

tors) of two given assemblies, varying from 0 to 1. Thus, if two

assemblies attribute large weights to the same neurons, SI will be

large; if assemblies are orthogonal, SI will be zero. We applied a

permutation test in order to determine whether SIs were signif-

icantly above chance. This test consisted in shuffling the weights

of each pattern across neurons, and then recalculating the SI. We

ran 10,000 permutations in order to construct a null hypoth-

esis distribution. Two patterns were regarded as representations

of the same assembly if their original SI was larger than the

99th percentile of the null hypothesis distribution (i.e., p = 0.01).

Using this process, we found that both A′ and A′′ were signifi-

cantly similar to assembly A (Figure 2C). This indicates that units

with larger weights in assembly A were split in two independent

(SI = 0.016) assemblies A′ and A′′ comprising partially non-

overlapping sets of units (respective action potentials indicated

by blue and green dots in the raster plot of Figure 2B, respec-

tively). Considering that large bin sizes may conceal fast assembly

Frontiers in Neural Circuits www.frontiersin.org April 2014 | Volume 8 | Article 34 | 4

Almeida-Filho et al. Phase sequences as assembly graphs

sequences (Figure 2B), we chose the 5ms bin as a compromise

between a high temporal resolution and the need to avoid small

bin sizes close to the neuronal refractory period.

SEARCHING FOR ASSEMBLIES IN DIFFERENT EXPERIMENTAL PERIODS

After defining bin size, we focused on the assessment of the dif-

ferences among assemblies detected using spike matrices from

different experimental periods (PRE, EXP and POST). Our goal

was to investigate whether the exposure to novel objects changes

the assembly repertoire. At first we ignored sleep states and

extracted assembly patterns from entire PRE, EXP and POST-

WK periods (each one independently). Next, we used the SI to

compare all assemblies between experimental periods.

We found little variation in the numbers of assemblies across

different experimental periods (Figure 3A). Most animals showed

a maintenance or minor decrease in the number of assemblies

from PRE to EXP, except for rat # 2, which showed an increase

of one assembly. From EXP to POST, the number of assemblies

detected also dropped slightly, except for rat # 3, which showed

a stable number of 10 assemblies per period. Rat # 1 showed the

highest variance in the number of assemblies detected across peri-

ods, ranging from 13 in PRE to 10 in POST. Figure 3B illustrates

the substantial similarity between assemblies detected in differ-

ent experimental periods for rat # 2, which overall showed the

largest number of assemblies. To assess assembly conservation

across experimental periods, we then categorized the assemblies

within each experimental period as showing unitary correspon-

dence, non-unitary correspondence, or no correspondence. An

assembly was considered to show unitary correspondence when

it was significantly similar to only one assembly in each of its

flanking experimental period(s) with p < 0.0001; non-unitary

correspondence defined assemblies which showed more than one

correspondence or, in the case of EXP, those with correspon-

dence to one assembly from a flanking period but not with the

other (e.g., correspondence with PRE but not with POST); the

no-correspondence category comprised assemblies showing no

significant correspondences. Group results across different exper-

imental periods (Figure 3C) show that the number of assemblies

exhibiting unitary correspondence was significantly higher than

those showing non-unitary correspondence or no correspon-

dence, including EXP which is flanked by two neighbor periods

(Wilcoxon ranksum test, p < 0.05, Bonferroni corrected).

A comparison across experimental periods reveals that the

percentage in PRE of assemblies with no correspondence was

slightly elevated, while non-unitary correspondence was very

minor. During EXP the percentage of non-unitary correspon-

dences increased, while the percentage of unitary correspon-

dences and no-correspondences decreased. This could represent

the fact that EXP is flanked by two neighbor periods, while PRE

and POST are flanked by only one. Another possible explanation

is that the exposure to novel objects could have changed some

assembly activation patterns, increasing their co-activations (see

Figure 6B), and causing separate assemblies to be detected as one.

This may decrease the SI, leading to non-significance between

similar assemblies, and/or to significant similarity of one assem-

bly with two or more assemblies from flanking periods, compris-

ing significant but lower SIs. The POST period showed the highest

FIGURE 3 | Cell assemblies are highly conserved across experimental

periods. (A) Number of assemblies detected using spike matrices from the

different experimental periods. (B) SI values among assembly patterns of

rat #2 across experimental periods. Assembly patterns were detected

using a 5 ms bin size. Assembly labels were sorted to let highest values in

the main diagonal. (C) For each experimental period, the panels show the

percentages of assemblies within each of the categories defined by the

number of significant correspondences between the assemblies of a given

experimental period and the assemblies from flanking periods (from top to

bottom, PRE, EXP and POST). Two assembly patterns were deemed

correspondent if their SI was above a threshold set by a bootstrap

procedure (p = 0.0001). The categories were defined as unitary

correspondence, non-unitary correspondence and no correspondence,

representing the percentage of assemblies within rats that showed,

respectively, a single correspondence between flanking periods, two or

more flanking correspondences, or no correspondence whatsoever. Note

that the percentage of assemblies within the unitary correspondence

category was considered significantly higher than the other categories for

all experimental periods (Wilcoxon ranksum test, ∗p < 0.05, Bonferroni

corrected).

percentages of assemblies in the unitary correspondence category,

with a very small percentage of assemblies in the non-unitary and

no-correspondence categories. This indicates that the typically

smaller number of assemblies in POST (Figure 3A) comprises a

subset of assemblies that is essentially the same as in EXP. Across

all animals, we found an average of only one EXP assembly per

rat that showed no correspondence to any PRE assembly, and yet

had correspondence with a POST assembly. This points to a very

high conservation of assemblies across experimental periods, and

rules out the possibility that new assemblies are formed within

EXP and reverberate during POST. For this reason, we continued

our investigation of assembly sequences by extracting the assem-

bly patterns from a concatenated spike matrix of all WK intervals

(PRE+EXP+POST), and then projecting the assembly activity

Frontiers in Neural Circuits www.frontiersin.org April 2014 | Volume 8 | Article 34 | 5

Almeida-Filho et al. Phase sequences as assembly graphs

over the entire recording, throughout the wake-sleep cycle. Using

this approach, we detected 11, 18, 10, 13 and 13 assemblies for

rats # 1 to # 5, respectively.

DETECTING ASSEMBLY ACTIVATIONS

In order to improve the time resolution for the analysis of assem-

bly activation sequences, we first re-binned the spike trains from

each unit using 1ms bins, and convolved the data with a Gaussian

kernel (maximum = 1, 80% of the AUC within 5ms windows).

Then we projected the activity of all assemblies, and defined a

threshold (for each assembly) as the 99th percentile of the distri-

bution of activity values across time bins (Figure 4A, red lines).

Figure 4A shows the activity of three exemplary assemblies (A, B,

and C) from rat # 1, which above-threshold peaks are depicted

by red, blue and green letters (assembly activations), respec-

tively. Subsequent assembly activation was only considered after

a “refractory” period of 3ms elapsed.

CALCULATION OF ASSEMBLY GRAPH ATTRIBUTES

We constructed the assembly activation sequence by labeling

and concatenating assembly activations from different assemblies

(Figure 4A, bottom). Graphs were built from this sequence, so

that each assembly corresponded to a node, each edge corre-

sponded to the temporal sequence of consecutive node activa-

tions, and the time intervals between two assembly activations

were considered inter-activation intervals (IAI) (Figure 4A, bot-

tom). The coactivation of two ormore assemblies within the same

time bin was represented as an additional node in the graph,

whose label comprised the labels of the assemblies activated at

the same time. For instance, if assemblies F and J displayed

synchronous activation, a fourth node FJ was added to the graph,

always in the alphabetical order (Figure 4B).

Two parameters shaped the graphs: maximum IAI and num-

ber of activations per graph (activation count). The maximum

IAI parameter defined the threshold IAI within each graph, i.e.,

every time interval between assembly activations within a graph

should be less than or equal to this maximum IAI. Seven different

maximum IAI values ranging from 10 to 1000ms were explored.

An initial assessment of the data varying only the maxi-

mum IAI criterion showed that, in general, the assembly graph

attributes were proportional to the activation count in a graph

(Figure 4C, median of absolute Pearson correlation indexes dis-

tribution = 0.74), while the duration (the interval between the

first and last assembly activation within a graph) was not corre-

lated to assembly graph attributes (Figure 4C, median of absolute

Pearson correlation indexes distribution = 0.18).

A fixed number of assembly activations per graph was used

to control for this variability in the graph attributes. Since the

minimum activation count necessary to maximize the density

of a graph (Table 1) is the square of the number of nodes

–Number of Assemblies2, we evaluated seven values of activa-

tion count as percentages of Number of Assemblies2 (10, 20,

50, 100, 120, 150 and 200%). The custom-made java software

Speechgraphs (Mota et al., 2012; http://neuro.ufrn.br/softwares/

speechgraphs) was used to calculate 13 assembly graph attributes

(Table 1).

CHANGES IN POPULATION RATE DO NOT EXPLAIN THE ACTIVITY OF

INDIVIDUAL ASSEMBLIES

The algorithm to algebraically define assembly activity was the

squared linear combination of the firing rate of the units in a

FIGURE 4 | Determination of sequences of cell assembly activations.

(A) 1.5 s interval showing activity of 3 assemblies (A–C) of rat # 1 (3 top

panels). Thresholds are the 99th percentiles of the activity values for each

assembly. Threshold-crossing peaks are considered assembly activations.

Assembly activation sequence is defined as the series of activation across

different assemblies within subjects; and the time interval between two

subsequent activations is called inter-activation interval (IAI) (bottom panel).

(B) Exemplary graph generated with assembly activations from the first WK

episode of rat # 1 during PRE. (C) Distribution of absolute Pearson correlation

values between graph attributes and two other variables: activation count and

graph duration. Graphs were generated using assembly activation sequences

from behavioral states’ episodes. Panel shows distribution of data from all

episodes. Note that activation count was generally correlated with graph

attribute values in our dataset (median = 0.74, 74% of correlations were

significant with p < 0.05), while the graphs duration were not (median =

0.18, 8% of correlations were significant with p < 0.05).

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Almeida-Filho et al. Phase sequences as assembly graphs

Table 1 | Graph attributes.

Abbreviation Name Definition

Nodes Number of Nodes Number of assemblies activated

and single sets of co-activations

in the graph

RE Repeated Edges Number of edges linking the

same pair of nodes more than

once in one specific direction

PE Parallel Edges Number of edges linking the

same pair of nodes more than

once irrespective of the

direction

L1 Loops with one

node/Self-Loops

Number of edges between one

node and itself

L2 Loops with two

nodes

Number of pairs of edges

between two nodes one in each

direction

L3 Loops with three

nodes

Number of sets of three edges

in one specific direction leaving

one source node, passing

through two other nodes and

coming back to the source node

LCC Largest Connected

Component

Number of nodes comprising

the largest sub-graph in which

each node is connected to each

other through a path in the

sub-graph (applied to the

undirected version of the graph)

LSC Largest Strongly

Connected

Component

Number of nodes comprising

the largest sub-graph in which

all nodes are mutually reachable,

i.e., there is a path from node A

to node B, and one from node B

to node A (applied to the

directed version of the graph)

ATD Average Total

Degree

Mean of the number of edges

pointing to or departing from a

node, across nodes

Density Density of the graph Density number that goes from

0 to 1 representing the

percentage of possible edges

that really exist in the graph

Diameter Diameter of the

Graph

Length of the longest shortest

path between the node pairs of

a network

ASP Average Shortest

Path

Average length of the shortest

path between pairs of nodes of

a network

CC Clustering

Coefficient

Average across nodes, of the

percentage of real edges

between the neighbor nodes of

a node over the total possible

edges between these neighbors

given time bin (Lopes-dos-Santos et al., 2011, 2013). Hence, while

assembly activity is dependent on population firing rate, it is not

fully determined by it, because its projection also depends on the

weight of each unit on that specific assembly.

A plethora of studies have shown that firing rate changes con-

vey behavioral information (Adrian and Zotterman, 1926; Hubel

and Wiesel, 1959; O’Keefe and Dostrovsky, 1971; Moritz et al.,

2008); thus, it was first important to show that assembly activ-

ity is not just an epiphenomenon of population rate. To address

this issue, we plotted the squared mean population rate against

the mean of all assemblies’ activity within each bin along the

whole experiment for each rat (Figure 5A for rat # 1, dark red

dots). The R2 of the linear fit between these two variables was

low for all animals (Figure 5B), indicating that they display a

weak correlation. We then plotted the same squared mean of

the population rate against the mean assembly activity projected

using spike matrices with surrogated rates within each single bin

(Figure 5A, dark green dots). This allowed us to vary one of the

variables that define assembly activity (weights of each unit within

each assembly), while keeping the other unchanged (population

rate). This approach showed linear fits with even lower R2 val-

ues (Figure 5A, light green line for rat # 1 and Figure 5B for

all rats).

Next we investigated activity time-series of individual assem-

blies (Figure 5C, exemplary assembly from rat # 1). Figure 5D

shows R2 values for the linear fits from all individual assem-

blies as in Figure 5C, for all animals (real data—left; surro-

gated data—right). All values are very low, and become even

lower when we use the surrogated dataset, including a sta-

tistically significant difference in R2 values between real and

surrogated datasets, for rats # 1 and # 5. (Figure 5D, aster-

isk, Wilcoxon signed-rank paired test, p < 0.05). Altogether,

these results indicate that the activity of individual assem-

blies is not reducible to fluctuations of the population firing

rate.

ASSEMBLY ACTIVATION RATE AND COACTIVATIONS

We analyzed assembly activation time-series (Figure 6A, exem-

plary plot from rat # 5) from all behavioral states (WK, SWS

and REM) and experimental periods (PRE, EXP and POST).

Considering all rats, we found that the assembly activation rate

during WK was significantly higher in almost all the paired com-

parisons (18 out of 21) of experimental periods between behav-

ioral states (gray lines with asterisk, p < 0.05, Wilcoxon ranksum

test, bootstrap corrected). Moreover, in all rats the assembly

activation rate during POST SWS was significantly higher than

during PRE SWS (Figure 6A, exemplary plot from rat # 5, black

line with asterisk), which suggests that the increase in firing rates

after novel object exploration (Ribeiro et al., 2007) may under-

lie the elevated co-firing of assembly neurons. Interestingly, two

out of the three rats that displayed REM during PRE and POST,

showed elevated activation rate after the experience. Previous

work with larger groups including the present dataset showed

no significant firing rate change between PRE REM and POST

REM (Ribeiro et al., 2007). The distribution of assembly coac-

tivations followed the same pattern of the assembly activation

rate, in which POST SWS displayed higher values than PRE

SWS for all rats. The number of coactivations was also higher

during WK than during sleep (Figure 6B, exemplary plot from

rat # 5); with significant differences in 18 out of 21 possible

comparisons.

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Almeida-Filho et al. Phase sequences as assembly graphs

FIGURE 5 | The activity of individual assemblies is not reducible to rate

fluctuations. (A,C) show exemplary panels from rat # 1 and (B,D) show

group data. (A) Squared mean of the population rate and the mean of all

assemblies’ activity within each 1 ms bin (dark red dots). In order to scramble

associative behavior and keep the firing rate fixed, we also plotted the mean

population rate against the mean assemblies’ activity projected using the

spike matrix with neurons’ labels surrogated within each time bin (dark green

dots). Light red and green lines depict the least square linear fit for each color

coded subset of points along with the correspondent coefficients of

determination (R2). (B) Coefficient of determination distribution for all rats.

For all animals, data surrogation impaired the correlation between firing rate

and assembly activity. (C) The same color code as in (A), but plotting the

mean population rate against the activity of a single exemplary assembly

from rat # 1. (D) Shown are distributions of all rats R2 values for the linear fits

from the correlation between mean population rate and individual

assemblies’ activity (left) and mean population rate and individual assemblies’

activity estimated from surrogated spike matrices (right). Note that both

distributions exhibit very low R2 values and that there is a decreasing trend

from real to surrogated data, with significant difference for rats # 1 and # 5

(∗p < 0.05, Wilcoxon signed-rank paired test).

GRAPH ANALYSIS

We found that graph attributes varied significantly across

behavioral states and experimental periods (Figure 7). We tested

therefore whether a Naïve Bayes classifier could extract, from the

assembly graph attributes, information enough to sort behav-

ioral states and experimental periods (John and Langley, 1995).

We used the java software Weka (http://www.cs.waikato.ac.nz/

ml/weka/) to perform the classifications and estimated their qual-

ity by the area under the receiver operating characteristic curve

(AUROC). Figures 8A,B show that it was possible to sort behav-

ioral states with very high quality of classification, particularly

when WK and REM were compared (maximum AUROCs ranging

from 0.78 to 0.98). WK and SWS could also be distinguished, at a

somewhat lower level (maximum AUROCs ranging from 0.69 to

0.96). The poorest quality of classification was obtained by sort-

ing SWS from REM (maximum AUROCs ranging from 0.64 to

0.78).

The classification quality across experimental periods was not

as good as across behavioral states (median across rats 0.57

vs. 0.69, Wilcoxon ranksum test, p < 0.01), except for rat # 1.

Figures 8C,D show that the maximum AUROC values for the

comparisons between experimental periods ranged from 0.55 to

0.99, with distribution of all values yielding 0.52 and 0.67 as the

first and third quartiles, compared to 0.58 and 0.84, as quartiles

for the comparisons between behavioral states. We found a strong

positive correlation between the AUROC of graph attributes and

activation count for all the comparisons made (e.g., rats # 4 and

# 1 in Figures 8A,C). One example of this correlation is shown

on a plot of the AUROC values from the classification between

PRE WK and PRE SWS vs. the activation count of the graphs

of rat # 1, considering only values obtained using the 1000 ms

maximum IAI (Figure 8E). The figure shows a positive correla-

tion associated with an extremely strong linear fit (R2= 0.95)

and a 1.2× 10−3 slope, in association with major variation in

AUROC values (full range: 0.54–0.80). To test if this was a general

effect of assembly count on AUROCs and to analyze the general

effect of maximum IAI on AUROCs, we plotted the AUROCs

vs. the activation counts along a constant maximum IAI; and

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Almeida-Filho et al. Phase sequences as assembly graphs

FIGURE 6 | Descriptive statistics. Panels show the distribution of

assembly activation rate (A) and co-activation rate (B) (events per second)

during different behavioral states and experimental periods for rat # 5.

Behavioral states boxplots are color coded as red, blue, and green for WK,

SWS and REM, respectively. Experimental periods (PRE, EXP and POST)

are placed together and in chronological sequence within each behavioral

state. Black lines with asterisks reflect significance between two different

experimental periods within a given behavioral state. Gray lines with

asterisks reflect significance between two different behavioral states within

a given experimental period (p < 0.05, bootstrap corrected for multiple

comparisons).

the AUROCs vs. the maximum IAIs considering a constant acti-

vation count for the panels from all rats. Note that activation

count accounts for AUROC variability significantly more than the

maximum IAI, except for rat # 1 (Figure 8F), according to a pos-

itive correlation (Figure 8G). It is important to note that there

was no AUROC above 0.68 when we used maximum IAIs below

20ms. Maximum AUROCs were obtained using each of the seven

different activation counts explored.

DISCUSSION

Our results show that assembly graphs comprising synchronized

neuronal units recorded from the hippocampus and primary sen-

sory cortices can be used to sort behavioral states (maximum

AUROC values ranging from 0.64 to 0.98) and experimental peri-

ods (maximum AUROC values ranging from 0.55 to 0.99) before,

during and after novel object exploration. This sorting is based on

several attributes that reflect the structural properties of assembly

graphs. At this point we do not know whether these attributes

are informative due to a causal relationship with behavior, or

as an epiphenomenon of some other underlying cause. In all,

our investigation corroborates the notion that phase sequences,

understood as specific patterns of assembly activations, reflect

the different regimes of neural processing as animals traverse

the wake-sleep cycle and acquire novel information about the

environment.

Such interpretation of the results cannot be furthered with-

out addressing the problem of the arbitrary definition of time

scale for synchronous firing. As shown in Figure 2A, the number

of assemblies detected decreases with bin size. We showed evi-

dence that this may be due to the tight temporal association of

assemblies detected using smaller bin sizes, which are detected as

a single assembly when larger bin sizes are used. Our choice of bin

size= 5ms for the generation of assembly graphs, well within the

potentiation window of spike time dependent plasticity (STDP)

(Bi and Poo, 1998), represents a compromise between the num-

ber of assemblies detected and the need to avoid extremely low

bin sizes near the neuronal refractory period.

Our results show that the repertoire of assemblies is almost

unchanged across experimental periods, which suggests that

novel experience does not create new assemblies in the hippocam-

pus and primary sensory neocortex of the normal adult rat.

Our finding is compatible with Hebb’s hypothesis that assemblies

correspond to the primitive building blocks of representations,

being slowly formed across development but nearly unchanged

in adulthood. The experience-dependent changes in the structure

of assembly graphs, revealed by the use of a classifier, also cor-

roborates the complementary Hebbian hypothesis that relevant

information about concepts, percepts and behavior in general is

coded at the level of multiple assembly activations, the so called

phase sequences (Hebb, 1949).

We also showed that the activity of single assemblies cannot

be reduced to the changes in firing rate. Changes in neuronal

firing rates constitute well-known indexes of behavior (Adrian

and Zotterman, 1926; Hubel and Wiesel, 1959; O’Keefe and

Dostrovsky, 1971; Moritz et al., 2008). If phase sequences are

indeed important to generate new neural representations, they

should carry more specific information than firing rates. Since

assemblies are subsets of neurons that function transiently as

closed systems, the neurons related to a given perception or

behavior should have their rates affected synchronously, so as to

be detected as assemblies. The calculation of assemblies and the

projection of their activity is a way to reduce the dimension-

ality of a population of neuronal units onto neuronal subsets

which are likely related to behavior. Investigation of whether

phase sequences carry more information than firing rates is

ongoing.

The automatic sorting of behavioral states using the attributes

of assembly graphs reached a very high level, but the sorting of

experimental periods was substantially less accurate. The major

behavioral states comprise markedly different physiological pat-

terns in the brain (Noda et al., 1969; Vanderwolf, 1969; Hobson

andMcCarley, 1971; Gervasoni et al., 2004), likely not the case for

the experimental periods investigated here. One possible cause for

this difference may be the small amount of assemblies detected,

due to the under-sampling of the neuronal units actually involved

in novel object exploration.

Frontiers in Neural Circuits www.frontiersin.org April 2014 | Volume 8 | Article 34 | 9

Almeida-Filho et al. Phase sequences as assembly graphs

FIGURE 7 | Assembly graph attributes vary significantly across

behavioral states and experimental periods. Panels show the

distribution of graph attributes’ values from rat # 5, using 1 s maximum IAI

and 169 activations/graph, for different behavioral states and experimental

periods. As in Figure 6, behavioral states boxplots are color coded as red,

blue, and green for WK, SWS and REM, respectively. Experimental periods

(PRE, EXP and POST) are placed together and in chronological sequence

within each behavioral state. Black lines with asterisks reflect significance

between two different experimental periods within episodes of a given

behavioral state (p < 0.05, Wilcoxon ranksum test, Bonferroni corrected).

Gray lines with asterisks reflect significance between two different

behavioral states within a given experimental period. Note that nearly all

the attributes sorted WK from SWS, during PRE or POST (except for L1

during PRE and L3 during POST). WK was significantly different from REM

during PRE (12 attributes) and POST (11 attributes), SWS was significantly

different from REM during POST (10 attributes), but no attribute could sort

SWS and REM during PRE. Only one attribute was capable of sorting PRE

from EXP within WK. When comparing PRE × POST within WK, 12

attributes could separate them. EXP WK graphs were detected as different

from POST WK graphs by 3 attributes. PRE SWS could be sorted from

POST SWS, and PRE REM could be sorted from POST REM, using any of

the graph attributes studied.

Frontiers in Neural Circuits www.frontiersin.org April 2014 | Volume 8 | Article 34 | 10

Almeida-Filho et al. Phase sequences as assembly graphs

FIGURE 8 | Assembly graph attributes allow for the automatic

classification of experimental periods and behavioral states. (A,C) The

rows of each panel represent the graphs maximum IAI (within the graph,

every IAI is less than or equal to the maximum IAI value), while the columns

correspond to the number of activations within the graphs defined as

percentages of the squared number of assemblies. Color codes vary from 0

to 1 and represent the median AUROC of 50 classifications made for 20

(Continued)

Frontiers in Neural Circuits www.frontiersin.org April 2014 | Volume 8 | Article 34 | 11

Almeida-Filho et al. Phase sequences as assembly graphs

FIGURE 8 | Continued

random graphs from each of the experimental periods compared using a Naïve

Bayes classifier; e.g., 20 graphs from PRE WK compared with 20 graphs from

EXP WK. In some cases of the parameter screening, we could not obtain the

minimum 20 graphs necessary for the classification. For instance, it was

impossible to generate one single graph comprising 200 activations (200% of

Number of Assemblies2 for rat # 3) within the 10 ms maximum IAI. These

conditions were coded blue to indicate no classification. The maximum AUROC

value of each panel is indicated. (A,B) Sorting of behavioral states. (A) Panels

show the classification quality across different maximum IAI and activation

count values for rat # 4. (B) Histograms of AUROC values as in panel (A) for all

rats. Red line depicts the 0.6 AUROC value, which sets the lower bound for a

good classification quality. WK and REM were well sorted by graph attributes,

with maximum AUROC values ranging from 0.68 to 0.98 for all rats within both

PRE and POST periods. The sorting of SWS and REM was substantially less

accurate, with maximum AUROC= 0.78 during POST in rat # 5. The sorting

between WK and REM was very good for all rats during PRE, (maximum

AUROCs from 0.78 to 0.98). (C,D) Sorting of experimental periods. (C) Panels

show the classification quality for rat # 1 across different maximum IAI and

activation count values. (D) Histograms of AUROC values from the panels as in

panel (C) for all rats. All the comparisons yielded maximum AUROCs ranging

from 0.55 to 0.99. (E) Correlation between AUROC and activation count using a

1000 ms maximum IAI from rat # 1 graphs comparing PRE WK and PRE SWS.

The slope of the linear fit indicates that each single activation added to a graph,

adds 0.0012 to the AUROC, with activation counts varying from 12 to 242

(AUROCs vary from 0.54 to 0.80). (F) Distribution of slopes of the linear fits

between activation count and AUROC with fixed maximum IAI value (e.g., panel

E); and between maximum IAIs and AUROC with fixed activation count. We

used the AUROCs from all the comparisons and conditions (maximum IAI and

activation counts) for all animals and considered only fits with three or more

data points. The analysis shows that the maximum IAI contribution to the

AUROC is around zero (mean across rats= 0.0024) and even negative, while

the contribution of the activation count is divergent, with a clear majority of

positive contributions (mean across rats= 0.097), yielding a significant

difference between these two variables, except for rat # 1 (G) Distribution of

Pearson correlations indexes for the comparisons in panel (F). Note that

activation count shows strong positive correlation with AUROCs (medians=

0.92, 0.93, 0.78, 0.80, and 0.91 for rats # 1 to # 5, respectively; 53% of the

values with p < 0.05), while maximum IAIs are scattered, with values spanning

the entire scale, and medians closer to zero or even negative for all rats (0.59,

−0.33,−0.56,−0.39, and 0.12 for rats # 1 to # 5, respectively; 8% of the values

with p < 0.05). Asterisks indicate significant differences between activation

count and maximum IAI distributions of correlation values within the same

animal.

It is important to point out that in the present study we

assumed that the activity of a cell assembly could be described as

a linear combination of the activity of individual neurons. While

this simplification of the assembly model allows for the analy-

sis of large neuronal populations, it also presents some potential

caveats (Lopes-dos-Santos et al., 2013). In particular, strong non-

linear correlations between neurons may lead to spurious results,

since both the determination of the number of assemblies and

the extraction of assembly patterns are based on the linear model.

Nevertheless, because this representation of assemblies is intuitive

and straightforward, it is possible to verify the outcomes of the

analysis; for instance, visual inspection of the raw data confirms

that co-activations of assembly members correspond to peaks

in assembly activity (see Figure 2B, also see examples employ-

ing similar linear methods in (Nicolelis et al., 1995; Peyrache

et al., 2009, 2010; Benchenane et al., 2010; Lopes-dos-Santos

et al., 2011, 2013). In principle, a non-linear method should be

more robust and realistic, but we are not aware of any non-

linear method capable of extracting assembly composition from

the ongoing activity of neuronal populations with dozens of neu-

rons. An ideal method should also incorporate information on

the physiology of specific cell types and neural circuits. Taken

together, our results show that, despite any possible non-linear

correlations that may exist among neurons, the linear ones carry

relevant information that support a role for phase sequences in

behavior and cognition. Future research shall include non-linear

modeling and also consider a neural coding approach, in order

to fully characterize the repertoires of phase sequences, and elu-

cidate the role of specific graph attributes in the representation of

contextual cues, sensory stimuli and motor behavior.

AUTHOR CONTRIBUTIONS

Sidarta Ribeiro collected the data; Daniel G. Almeida-Filho,

Nivaldo A. P. Vasconcelos, Vitor Lopes-dos-Santos, and Sidarta

Ribeiro analyzed the data; Daniel G. Almeida-Filho prepared the

figures; Daniel G. Almeida-Filho, Sidarta Ribeiro, Nivaldo A. P.

Vasconcelos, Vitor Lopes-dos-Santos, Adriano B. L.Tort, and José

G. V. Miranda wrote the manuscript.

ACKNOWLEDGMENTS

Support was obtained from the Pew Latin American Fellows

Program in the Biomedical Sciences, Financiadora de Estudos e

Projetos (FINEP)—Grant 01.06.1092.00, Ministério da Ciência e

Tecnologia e Inovação (MCTI), CNPq Universal 481351/2011-6,

PQ 306604/2012-4, Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal

de Nível Superior (CAPES), FAPERN/CNPq Pronem 003/2011,

Capes SticAmSud, FAPESP Center for Neuromathematics (grant

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working group “Multi-scale analysis of cortical networks.” We

thank N. B. Mota, P. Petrovitch, and R. Furtado for help with the

SpeechGraphs software, A. Karla for administrative help, and D.

Koshiyama for library support.

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ence.8036517

Conflict of Interest Statement: The authors declare that the research was con-

ducted in the absence of any commercial or financial relationships that could be

construed as a potential conflict of interest.

Received: 20 December 2013; accepted: 19 March 2014; published online: 08 April

2014.

Citation: Almeida-Filho DG, Lopes-dos-Santos V, Vasconcelos NAP, Miranda JGV,

Tort ABL and Ribeiro S (2014) An investigation of Hebbian phase sequences as

assembly graphs. Front. Neural Circuits 8:34. doi: 10.3389/fncir.2014.00034

This article was submitted to the journal Frontiers in Neural Circuits.

Copyright © 2014 Almeida-Filho, Lopes-dos-Santos, Vasconcelos, Miranda, Tort and

Ribeiro. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative

Commons Attribution License (CC BY). The use, distribution or reproduction in other

forums is permitted, provided the original author(s) or licensor are credited and that

the original publication in this journal is cited, in accordance with accepted academic

practice. No use, distribution or reproduction is permitted which does not comply with

these terms.

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47

DISCUSSÃO

Nossos resultados indicam que há diferenças entre grafos constituídos

de ativações sequenciais de assembleias neuronais em estados

comportamentais (VIG, SOL e sMRO) e períodos experimentais distintos (PRE,

EXP E PÓS), quando ratos em comportamento livre atravessam todo o ciclo

sono-vigília e são expostos a objetos nunca antes explorados. Tais diferenças

foram avaliadas através de atributos de grafos de assembleia, os quais

funcionam como características mensuráveis da estrutura dos grafos, sendo

usadas como entradas de um classificador binário Naive Bayes. Seria

prematuro afirmar que tais diferenças refletem manifestações

comportamentais, porém a presente investigação sugere que elas expressam

mudanças no padrão temporal de ativação de associações neuronais,

entendido aqui como sequência de fase Hebbiana. A correspondência entre

mudanças estruturais nos grafos e comportamento será aprofundada em

trabalhos futuros.

Um dos fatores primordiais na definição de quantas assembleias seriam

detectadas foi o tamanho da janela temporal usada para calcular e projetar a

atividade das assembleias que compunham os grafos. No conjunto de dados

analisados, quanto maior a janela temporal, menor era o número de

assembleias detectadas (VIDE RESULTADOS – Figura 2A) . Mostramos

evidências de que este fenômeno poderia ter acontecido devido a assembleias

com associação entre si em escalas temporais muito reduzidas (4 ms), terem

sido detectadas como apenas uma assembleia quando janelas temporais

maiores (16 ms) foram utilizadas (VIDE RESULTADOS – Figura 2B). Embora

as evidências experimentais sugiram que a janela temporal para determinar

48

associação entre neurônios esteja em torno de 10-30 ms (Harris et al., 2003;

Harris, 2005), escolhemos arbitrariamente o valor de 5 ms, que está dentro da

janela temporal de potenciação da plasticidade dependente do tempo de

disparo (Spike Time Dependent Plasticity - STDP) (Bi and Poo, 1998), na busca

do equilíbrio entre o menor valor possível (mais assembleias) e valores muito

próximos do período refratário neuronal (~1 ms).

Mostramos também que o repertório de assembleias através de todos os

períodos experimentais é essencialmente o mesmo (VIDE RESULTADOS –

Figura 3), o que sugere que não foram criadas novas assembleias formadas

por neurônios hipocampais e corticais sensoriais primários, devido à exposição

a novos objetos. Isto é compatível com a hipótese Hebbiana de que as

assembleias são representações neurofisiológicas elementares, lentamente

formadas durante o desenvolvimento, sofrendo apenas pequenas mudanças

na maturidade (Hebb, 1968). Ainda sobre a teoria de Hebb, as mudanças

estruturais dos grafos de assembleias após exposição a novos objetos,

mostradas através do uso de um classificador automático, indicam que as

percepções complexas, conceitos e comportamentos em geral podem ser

representadas por múltiplas ativações sequenciais das assembleias, as

chamadas sequências de fase.

Existem evidências mostrando que mudanças na taxa de disparo (TD)

neuronal são marcadores da percepção e do comportamento animal (Adrian

and Zotterman, 1926; Hubel and Wiesel, 1959; O'Keefe and Dostrovsky, 1971;

Moritz et al., 2008). Como o método aqui proposto usa a sincronia entre

disparos neuronais como medida da associação temporal entre neurônios para

definir as assembleias, é importante mostrar que os atributos de grafos de

49

assembleia carregam mais informação que a TD. Como passo inicial nesta

direção, mostramos que a atividade das assembleias individualmente, não

pode ser reduzida a mudanças na TD populacional (VIDE RESULTADOS –

Figura 5), sugerindo que os atributos de grafo carregam informação diferente

da representada pela TD. Em seguida investigamos se os atributos de grafo

carregam mais informação que a TD, e se alterações específicas nos atributos

de grafo podem corresponder a comportamentos específicos não

representados pela TD.

A performance da classificação automática de estados comportamentais

usando atributos de grafo atingiu valores altos, principalmente na separação

entre o estado de vigília e os estados do sono (SOL e sMRO) (VIDE

RESULTADOS – Figura 8). Entretanto, a classificação entre períodos

experimentais mostrou-se inferior. Os estados comportamentais principais

apresentam padrões fisiológicos bastante diferentes entre si (Noda et al., 1969;

Vanderwolf, 1969; Hobson and McCarley, 1971; Gervasoni et al., 2004), o que

não pode ser dito sobre os períodos experimentais investigados. Uma das

causas desta diferença relaciona-se possivelmente com o reduzido número de

assembleias detectadas, devido ao registro extremamente sub-amostrado dos

neurônios potencialmente envolvidos com o comportamento estudado.

É importante salientar que, neste estudo, consideramos que a atividade

das assembleias neuronais poderia ser descrita como uma combinação linear

da atividade de neurônios individuais. Este modelo simplificado de assembleias

permite a análise de grandes populações neuronais, porém apresenta algumas

ressalvas (Lopes-dos-Santos et al., 2013). Em particular, fortes correlações

não-lineares podem levar a resultados espúrios, pois tanto a determinação da

50

quantidade de assembleias quanto a determinação do peso de cada neurônio

nas assembleias são baseadas no modelo linear. No entanto, esta

representação de assembleias é simples e intuitiva, tornando possível verificar

os resultados da análise. Por exemplo, a inspeção visual dos tempos de

disparo confirma que co-ativações de membros da assembleia correspondem

aos picos de atividade das mesmas (VIDE RESULTADOS – Figura 2B). Além

disso, outros trabalhos na literatura aplicam métodos lineares semelhantes

(Nicolelis et al., 1995; Peyrache et al., 2009; Benchenane et al., 2010;

Peyrache et al., 2010; Lopes-dos-Santos et al., 2011; Lopes-dos-Santos et al.,

2013). Métodos não-lineares certamente são mais robustos e realistas, porém

não temos conhecimento de qualquer método não-linear capaz de extrair

assembleias da atividade contínua de populações neuronais na escala de

dezenas de neurônios. Um método ideal também deve incorporar informações

sobre a fisiologia de tipos específicos de células e circuitos neurais. Nossos

resultados mostram que, apesar de todas as possíveis correlações não-

lineares que possam existir entre os neurônios, as lineares carregam

informações relevantes que sugerem um papel para as seqüências de fase no

comportamento e cognição. Pesquisas futuras devem incluir modelos não-

lineares para detecção de assembleias, além de uma abordagem de

codificação neural, de modo a caracterizar melhor as seqüências de fase. É

importante, também, explorar outras representações da dinâmica de grafos

(Casteigts et al., 2011), outros atributos globais e locais, e elucidar o papel dos

mesmos na representação de pistas contextuais, estímulos sensoriais e

comportamento motor.

51

CONCLUSÕES

A neurociência de sistemas tem se aprofundado em estudos de

eletrofisiologia (Buzsáki, 2004) e simulação computacional (Brette et al., 2007)

na tentativa de entender melhor como os neurônios, unidades elementares do

sistema nervoso central, se organizam para produzir comportamento complexo.

Sobre este assunto, Hebb propôs hipóteses na década de 1940 (Hebb, 1949),

que só há pouco tempo começaram a ser testadas. Grupos de neurônios com

alta sincronia temporal em seus disparos, chamadas por ele de assembleias

neuronais, já contam com evidências (Benchenane et al., 2010; Peyrache et al.,

2010; Lopes-dos-Santos et al., 2011; Lopes-dos-Santos et al., 2013). Porém, a

relevância das sequências de fase, ou a ativação sequencial das assembleias

no processamento neurofisiológico de percepções complexas, conceitos,

atividades motoras e comportamentos em geral, ainda necessita ser melhor

investigada.

As assembleias neuronais já mostraram relevância comportamental em

outros trabalhos (Wilson and McNaughton, 1994; Harris, 2005; Ramirez et al.,

2013), porém, nos dados analisados por nós, em geral, não são formadas

novas assembleias após a exposição à novidade. Cogitamos, a partir da

discussão dos resultados deste trabalho, que as mudaças detectáveis

eletrofisiologicamente podem manifestar-se em um nível superior de

processamento, ou seja, a ativação consecutiva de assembleias neuronais,

representada aqui pela teoria de grafos. As diferenças encontradas nas

características destes grafos em estados comportamentais distintos e as

mudanças após a exposição à novidade, reforçam essa idéia e corroboram a

52

teoria Hebbiana, ao sustentar a possibilidade da relevância comportamental

das sequências de fase.

Os achados aqui descritos justificam a investigação mais aprofundada

sobre as sequências de fase utilizando a teoria de grafos, uma vez que outras

formas de composição dinâmica de grafos (Casteigts et al., 2011), e outros

atributos globais e locais podem ser explorados (Bollobás, 1998), otimizando a

representação de redes complexas de assembleias neuronais para investigar

os mecanismos neurais que geram comportamentos.

53

PRODUÇÃO

Artigo Publicado:

Almeida-Filho, D.G. ; Lopes-dos-Santos, V.; Vasconcelos, N.A.P., Miranda,

J.G.V.; Tort, A.B.L. and Ribeiro, S. (2014), An investigation of Hebbian phase

sequences as assembly graphs . Front. Neural Circuits 8:34. doi: 10.3389 /

fncir.2014.00034 (RESULTADOS)

Artigo não publicado:

Almeida Filho, D.G.; Miranda, J.G.V. and Ribeiro, S. (2012). Neuronal Spike

Time-Series Show Self-Affinity. (ANEXO III)

Participação em Eventos:

XXXVIII Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Neurociências e

Comportamento. Explorando os limites da teoria Hebbiana: Uma

investigação das Sequências de Fase como grafos de assembleia

neuronal . 2013. (Congresso).: 1 pôster (ANEXO II)

Granada Seminar on Computational and Statistical Physics. Neuronal Spike

Time-series Show Self-affinity . 2012 (Seminário).: Apresentação Oral

(Projeto anterior de mestrado desenvolvido entre ma r/2012 a fev/2013).

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ANEXO I

Agradecimentos:

Almeida-Filho, DG1 ; Vasconcelos, NAP 2; Lopes-dos-Santos, V1; Miranda, JGV3; Tort, ABL1; Ribeiro, STG1

¹ Instituto do Cérebro, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Brasil; ² CNP, Champalimaud Neuroscience Programme, Lisboa, Portugal; 3 Instituto de Física, Universidade Federal da Bahia, Brasil

Introdução

Objetivo

Métodos

Resultados

Conclusões

Pre (1h) Exp Pós (2h)

Explorando os limites da teoria Hebbiana: Uma

investigação das Sequências de Fase como grafos

de assembléia neuronal

Explorar a dinâmica da sequência de ativação de ACs em situações experimentais

diferentes através de grafos de assembléias em um protocolo de experimentação de novos objetos.

Assembléia Celular (AC) é um conceito criado por D.O. Hebb que descreve a associação de células para

o processamento de informação, através do reforço de suas interações sinápticas. Apesar de muitos

trabalhos terem sido desenvolvidos para detectar ACs e elucidar seu valor cognitivo, pouco tem sido

discutido sobre a sua dinâmica de ativação sequencial. Este é o próximo passo na linha teórica Hebbiana,

a Sequência de Fase (SF)1.

Protocolo Experimental

Quatro ratos da linhagem Long-Evans passaram por 03 momentos experimentais (Pre, Exp e Pós) reclacionados

à exposição a 04 novos objetos. Os animais permaneceram em comportamento livre no escuro, cumprindo

todo o ciclo sono-vigília (Vigília - WK, Sono de ondas lentas - SWS e Sono de movimento rápido dos olhos -

REM) durante o experimento.

Matrizes de microeletrodos implantadas no Hipocampo - HP

(relacionado com processamento de informação espacial,

memória e aprendizagem), Córtex Somatossensorial Primário -

S1 (Córtex Barril - relacionado com processamento de

informação sensorial das vibrissas) e Córtex Visual Primário -

V1 (relacionado com processamento visual)

Detecção e Classificação de Potenciais de Ação (PA)

a)

b)

c)

Limite

a) Sinal adquirido dos eletrodos implantados, em miliVolts (mV). b) PAs de neurônios

detectados como momentos em que o sinal ultrapassa o limite de ruído nos eletrodos.

c) Classificação entre os PAs detectados. Adaptado de Rodrigo Quian Quiroga (2007),

Scholarpedia, 2(12):3583

140.025 141.050 142.075 144.000 145.025

5

10

15

20

25

30

0

10

20

30

40

50

60

Assembléia A (Neurônios 1, 2 e 3)

Assembléia B (Neurônios 7, 8, 9 e 10)

Assembléia C (Neurônios 4, 5 e 6)

0

5

10

15

Ne

urô

nio

s

Tempo (s)

Ati

vid

ad

e d

as

Ass

em

blé

ias

Taxa

de

Dis

pa

ro

Tratamento dos Dados

Detecção e Projeção da Série Temporal de Ativação de Assembléias

Simulação da dinâmica de ativação de 30 neurônios com subconjuntos organizados em assembléias. a) O tempo do experimento

é dividido em pequenas janelas (no exemplo, 25 milisegundos) e é contada a quantidade de PAs dentro de cada janela

(Taxa de Disparo). b) Com o auxílio da Análise de Componentes Principais (PCA) e de Componentes Independentes (ICA), conforme

descrito em 2, é possivel usar a matriz em a) para detectar ACs e projetar a atividade de cada assembléia no tempo.

a)

b)

almeidafilho@neuro.ufrn.br

Fazendo Grafos

6501

6501

6501

6501

A A A

*

* *

* *

*

* *

*

*

BBBB BB B

*

* * *

CC C C

* *

* * *

A A AB BBBB BB BC CC C C

D

Série Temporal de

Ativação de Assembléias

DDDD

D DDDD

A

B

C

D

Momentos Experimentais

Pre x Exp Exp x Pós Pre x Pós

Estados Comportamentais

WK x SWS SWS x REM WK x REM

Nós

Arestas

AR

AP

L1

L2

L3

MCC

MCFC

GMT

Densidade

Diâmetro

CMM

CC

12 8 9 11 11 9

P < 0.05

P > 0.05

Intervalo Interativação

(IIA)

250 ms

Peso = 31.62

0.5 1 1.5 2 2.5 3

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Pe

so d

as

Are

sta

s

IIA (segundos)

WK SWS REM

5

10

15

20

25

Ta

xa

de

Ati

va

ção

da

s A

sse

mb

léia

s (A

A/s

)

WK SWS REM

2

4

6

8

10

12

14

16

WK SWS REM

5

10

15

20

25

Pre

Exp

Pós

WK SWS REM

5

10

15

20

25

30

35

#01

#03 #04

#02

TD

AA

AA

Surrogada

#02

TD Populacional

Assembléia 1 Assembléia 2 Assembléia 3

Ati

vid

ad

e d

a A

sse

mb

léia

R2 Real = 0.894

R2 Surrogado = 0.460R2 Real = 0.001

R2 Surrogado = 0.000

R2 Real = 0.317

R2 Surrogado = 0.710

R2 Real = 0.706

R2 Surrogado = 0.794

Bin Real

Bin Surrogado

Ajuste Linear Real

Ajuste Linear Surrogado

Ati

vid

ad

e T

ota

l da

s A

sse

mb

léia

s

TD Populacional

WK SWS REM0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

Assembléia 3

WK SWS REM0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

Assembléia 2

WK SWS REM0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

Ta

xa

de

Ati

va

ção

de

Ass

em

blé

ias

(AA

/s)

Assembléia 1

Pre

Exp

Pós

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

#01

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

#02

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Aresta

#03Peso

da

Ares

ta

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

#04

ABAC

ADBC

BDCD

DCDB

DACB

CABA

AABB

CCDD AB

ACBC

CBCA

BAAA

BBCC

ABAC

ADAE

AFBC

BDBE

BFCD

CECF

DEDF

EFFE

FDFC

FBFA

EDEC

EBEA

DCDB

DACB

CABA

AABB

CCDD

EEFF

ABAC

ADAE

AFBC

BDBE

BFCD

CECF

DEDF

EFFE

FDFC

FBFA

EDEC

EBEA

DCDB

DACB

CABA

AABB

CCDD

EEFF

AB

CD

ABAC

ADBC

BDCD

DCDB

DACB

CABA

AABB

CCDD

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

Pro

ba

bil

ida

de

AB

CAB

ACBC

CBCA

BAAA

BBCC

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0.45

0.5

AB

CD

EF

ABAC

ADAE

AFBC

BDBE

BFCD

CECF

DEDF

EFFE

FDFC

FBFA

EDEC

EBEA

DCDB

DACB

CABA

AABB

CCDD

EEFF

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

Nó/Aresta

AB

CD

EF

ABAC

ADAE

AFBC

BDBE

BFCD

CECF

DEDF

EFFE

FDFC

FBFA

EDEC

EBEA

DCDB

DACB

CABA

AABB

CCDD

EEFF

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

#01 #02

#03 #04

AB

CD

ABAC

ADBC

BDCD

DCDB

DACB

CABA

AABB

CCDD

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

AB

CAB

ACBC

CBCA

BAAA

BBCC

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

AB

CD

EF

ABAC

ADAE

AFBC

BDBE

BFCD

CECF

DEDF

EFFE

FDFC

FBFA

EDEC

EBEA

DCDB

DACB

CABA

AABB

CCDD

EEFF

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

Pro

ba

bili

da

de

No

rma

liza

da

AB

CD

EF

ABAC

ADAE

AFBC

BDBE

BFCD

CECF

DEDF

EFFE

FDFC

FBFA

EDEC

EBEA

DCDB

DACB

CABA

AABB

CCDD

EEFF

0

0.5

1

1.5

2

2.5

Nó/Aresta

#01 #02

#03 #04 −2. 5 −2 −1. 5 −1 −0. 5 0 0. 5 1 1. 5 2 2. 5

AB BA

AC CA

AD DA

BC CB

BD DB

CD DC

−2.5 −2 −1.5 −1 −0.5 0 0. 5 1 1. 5 2 2. 5

AB BA

AC CA

BC CB

−5 −4 −3 −2 −1 0 1 2 3 4 5

AB BAAC CAAD DAAE EAAF FABC CBBD DBBE EBBF FBCD DCCE ECCF FCDE EDDF FDEF FE

−4 −3 −2 −1 0 1 2 3 4

AB BAAC CAAD DAAE EAAF FABC CBBD DBBE EBBF FBCD DCCE ECCF FCDE EDDF FDEF FE

#01 #02

#03 #04

$ A dinâmica sequencial de ativação de AC apresenta diferença entre grafos de assembléia neuronal de momentos experimentais e

estados comportamentais diferentes;

$ Não há nível padrão de taxa de ativação de AC característico de momentos experimentais ou estados comportamentais;

$ A TD populacional é necessária mas não su+ciente para de+nir a atividade de AC;

$ ACs apresentam dinâmicas diferentes em momentos experimentais e estados comportamentais diferentes;

$ A distribuição de pesos difere entre direções de sequências de ativação envolvendo as mesmas ACs (arestas paralelas);

$ Há probabilidade de ocorrência de sequências com direções preferenciais entre arestas paralelas.

Referências:1 Hebb, D.O. The Organization of Behavior, 1949.2 Lopes-dos-Santos, V. et al, Detecting cell assemblies in large neuronal

population. j neurosci meth, 2013.

*

*

*

* *

* * *

B

C C C C

Peso = 100 ( 1 - IIA )

ANEXO II

Neuronal Spike Time-Series Show Self-Affinity

Almeida Filho, D.G.∗, Miranda, J.G.V.† and Ribeiro, S.∗

∗Brain Institute, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, Brazil.†Physics Institute, Federal University of Bahia, Salvador, Brazil.

Abstract. In neuroscience, the neuronal spike time-series analysis is one of the most importantcontemporaneous methods for studying the nervous system physiology. In this method, the mainfeature used to determine whether a place or region is involved in a specific behavior is the increaseor decrease of the neurons spike frequency (firing rate - FR) during the behavior manifestation. Theaim of our study is to determine whether the temporal fluctuation of FR carries information about theneurons functionality, and consequently, reflects physiological changes during specific behaviors.The dataset analyzed comprises spike trains from four rats recorded across the sleep-wake cycle, asthe animals traverse three experimental intervals: before (01 hour), during (20 minutes) and after(02 hours) the exploration of new objects in the dark. Three different neural regions were recorded:Hippocampus (HP - related to memory acquisition), Somatosensory Cortex (S1 - involved in tactiledetection and discrimination) and Primary Visual Cortex (V1 - involved in visual processing).We used Detrended Fluctuation Analysis (DFA) of a 500 points one-step sliding window of FRfluctuation along the complete time-series, exploring values of Hurst Exponent across behavioralstates and experimental epochs. Preliminary results show a self-affine dynamic for FR bin sizesranging from 5 to 45 milliseconds, indicated by a log X log linear approximation around 99%. Inaddition, neurons within the same region exhibit a high variability of the Hurst Exponent, indicatingno anatomical specificity of the Hurst Exponent in our dataset. Finally, we found major differencesin self- affinity in the same neuron when distinct experimental intervals were considered. Futureanalysis will advance the use of the Hurst exponent and Multifractality to investigate possible self-affinity differences for different behavioral states and experimental epochs.

Keywords: neuronal spike time-series, firing rate, self-affine dynamic, Detrended FluctuationAnalysis (DFA), Hurst exponent.PACS: 05.45.Df

INTRODUCTION

One of the most intriguing questions in neuroscience is: what is the neuronal coding?Many advances have been made answering the question of how neurons communicate.But the next challenge of neuroscience seems to be on the understanding of how theinteraction of these physiological processes of communication give rise to the emergenceof all complex behaviors like conscience, attention and memory.[1]As a first step, its important to detect and study the patterns of the given code. Many

articles have shown complex patterns in the brain using a broad number of approaches[2, 3, 4, 5, 6]. Although, in our previous search, we have not found any work addressingthe study of the neuronal firing rate (FR) fluctuation across time.In current neuroscience, the evaluation of neuronal activity based on the extracellular

recordings with animal implanted microelectrodes is one of the most important methodsused to understand the nervous system physiology [7, 8]. The procedure consists indetecting the firing of action potentials (spikes) of neurons close to the tip of the

microwires, followed by the spike sorting in separate clusters (putative cells) based onthe assumption that different neurons fire with different wave shapes.[9]The FR is the frequency of spikes of a single neuron within a given time interval. It

is known that its increase or decrease can represent the involvement of a specific cellor regions in an observed behavior, reinforced with examples of very good FR baseddecoding processes[10]. But an effort has yet to be made in order to address the questionwhether the fluctuation pattern of FR across time can carry information too.We used Detrended Fluctuation Analysis (DFA) on a sliding window over all data,

exploring Hurst Exponent (HE) to evaluate the fluctuation pattern of FR across time indifferent time scales. The analysis were made on spike trains from four rats acquired byextracellular recordings of neuronal activity before, after and during the exploration ofnovel objects in the dark.DFA was developed by [11] and is an excellent tool used to detect long range cor-

relations (LRC) across scales. These LRC are supposed to be optimal for informationprocessing [12, 13, 14].In the present study, we show our preliminary results exploring the HE in a big picture

where we could detect a self-affine dynamic for FR bin sizes ranging from 5 to 45 msand we could see, in our data set, that there is no species specific, region specific andeven neuron specific self-affinity pattern across the studied time.

MATERIALS AND METHODS

Experimental Protocol

Four Long-Evans male adult rats (300 - 350 g) were chronically implanted withmicroelectrode arrays positioned in the Hippocampus (HP), Somatosensory Cortex (S1)and Primary Visual Cortex (V1), following the protocol described in [15]. These regionswere chosen because HP is related to processing of spacial information, learning andmemory[16]; S1 is responsible for tactile information coding from the rats whiskers[17] and V1 is used here as a negative control due to its supposed non-specific arousalwith relation to the experiment.Animals traversed three experimental intervals: before (01 hour), during (20 minutes)

and after (02 hours) exploration of four novel and texture different objects under infra-red illumination in free behavior, while online spike detection and sorting was beingmade to characterize the extracellular waveforms of putative neurons. Local Field Poten-

tial (LFP) was similarly recorded and analysed by a quantitative spectral algorithm[18]in order to sort the behavioral states across the sleep-wake cycle (WK - Wake, SWS -Slow Wave Sleep, REM - Rapid Eye Moviment Sleep and US - Undefined State) with01 s resolution.

DFA on spikes

The FR is determined by the number of spikes within a sliding non-overlappingwindow (bin) over the spike train. Figure 1A shows an example of a 40 ms bin with

1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 2

2 1 2 1 2 0 1 1 1 0 0 0 2 1 1 1 0 1 1 2 3 2 3 2 0

40 ms

Spike Train (ST)

Firing Rate (FR)

. . . . .

DFA Time-Series

A

Bin

Wa

lk

n = 10

D

B C

Bin

Wa

lk

n = 25

1 1.5 2 2.5 3 3.5 4−0.5

0

0.5

1

log (n)

log

(F

(n))

DFA

α = 0.52225

FIGURE 1. Illustrative example of DFA protocol used in the study.

random simulated data.The protocol consisted in running DFA on a one-step sliding window comprising

a specific number of bins (N). For illustrative purposes, Figure 1A shows a 10 binswindow. 1

First step on DFA calculation is to transform it in a one-dimensional walk ( Figures

1B and 1C ) by integrating the FR series difference from the mean FR of the window,using the function below:

Walk(BIN) =BIN

∑bin=1

FR(bin)−FR (1)

Next, we have to divide the signal in sections containing a specific number of bins(n), defined as scale. Within each section we take the trend by a local least squareapproximation ( LS(bin) ), before taking the root-mean-square deviation from this trend.The process is repeated for different scales generating the fluctuation function ( F(n) ):

1 It is recommended to do DFA on windows comprising not less than 200 points[19].

F(n) =

√

√

√

√

1

N

N

∑bin=1

[Walk(bin)−LS(bin)]2 (2)

Figures 1B and 1C show examples of n = 10 and n = 25 respectively.We can have a visual idea that larger scales tend to show a bigger error in approxima-

tion. If there is self-affine correlations, the function ( F(n) ) tends to assume a power law

manner, represented by the angular coefficient (scale coefficient - α) of the line in theleast square approximation of the log( F(n) ) X log( n ) graphic ( Figure 1D ). The Hurstexponent (H) can be described as F(n)∼ nH , which is a similar way to define the scalecoefficient α . It is important to the definition of LRC as follows:

• 0< α < 0.5: Antipersistent correlation. A step forward in theWalk(bin) defines ahigher probability of a next step backward and vice-versa;

• 0.5 < α < 1: Persistent correlation. A step forward defines a higher probability ofa next step also forward and vice-versa;

• α = 0.5: No correlation or short correlations: Randomic process or a BrownianMotion.

The example in Figures 1B-D in which α = 0.52225, corroborates the prediction sincewe used simulated randomic data.

PRELIMINARY RESULTS

In studies using FR as a measure of neuronal activity, the bin size currently range from20 to 30 ms [20, 15]. We decided to analyse whether bin sizes ranging from 5 to 45 ms(5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 and 45 ms) showed a self-affine pattern. Our results showthat, for a sliding window of 500 bins, the definition of the scale coefficient α by leastsquare approximation for all scales analysed (n = 2 to n = 250) presented a minimum R2

value of 0.937, and 1.0 as maximum, independent of the bin sizes studied, region or rat.The median of R2 = 0.992 indicated that, ranging from 5 to 45 ms, the neuronal spiketime-series show a self-affine behavior.As we were using a new approach in spike train data, we did not know yet whether

the presence of a large quantity of bins without spikes would cause a distortion in Hurstexponent values. However, before testing this hypothesis, we decided to calculate H

using a bin size of 300 ms, which represents the maximum value in the group thatcomprises 90% of the smaller elements of inter-spike intervals (ISI) in our dataset. Thus,we would know that only 10% of the FR bins would be 0 (zero) inside a universe of12.200.000 bins, from 305 neurons, summing the 04 rats.The protocol for DFA calculation was the same used to analyse bin sizes. We took a

500 bins sliding window, analysing scales varying from n = 2 to n = 250.The preliminary results are an overview of H values divided by rats, regions, exper-

imental intervals and behavioral states, showing statistical characteristics of H in eachsubset.

First, we can say that there is no neuron specific pattern of H, since we detecteda value of 0.1669 for the mean difference between the first and third quartiles in H

dispersion for all neurons within all studied interval, which represents a percentage ofaround 17% over the supposed maximum variation of H, ranging between 0 and 1. Toverify if this could be an emergent phenomenon of the FR fluctuation, we made thePearson correlation between H and a time-series of mean FR over the same 500 binsin which each DFA was calculated. The root-mean-square of all correlation coefficientswas around 0.23, with a modular maximum correlation of 0.72 and 95% of the valuesbelow 0.5, rejecting the hypothesis of H being a simple consequence of FR fluctuation.Another approach consisted in analyse whether we could characterize the regions

using H values. Then, we determined a specific H for each neuron by taking the medianof all its H values within the studied interval. Considering each region, we observedthe dispersion of H values representing the neurons. The limits to consider the grade ofdispersion were determined by the difference between minimum and maximum, afterdiscarding the 2.5% lower and 2.5% higher values to avoid outliers influence. Meandifference was around 0.31 (standard deviation = 0.099). This result, also comparedwith the supposed H range (0< H < 1), is too high to determine region specific valuesof H.Finally, we tried to compare the results between different subjects within combina-

tions of conditions (behavioral state, experimental interval and region) to see if we couldgeneralize the results within species. However, this was also not possible due to a sig-nificant difference between rats in 63% of all paired inter-rat comparisons (p < 0.05),showing difference much higher than chance.Future work will consider a protocol changing, including lower bin sizes to guarantee

a better time resolution. Other analysis will explore Multifractality, correlation withother electrophysiological data like LFP and DFA analysis of neuronal assemblies [20].

ACKNOWLEDGMENTS

We thank CAPES for the support; VIOL, A., VISWANATHAN, G. M. ad LOPES-DOS-SANTOS, V. for valuable discussions and The Granada Seminar organizing committeefor the opportunity to make the oral presentation of this work.

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