UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

FACULDADE DE FARMÁCIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS APLICADAS A PRODUTOS

PARA SAÚDE (PPG-CAPS)

JOANA LUCIUS DE SOUSA RIBEIRO

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

SÍNTESE E AVALIAÇÃO ANTICHAGÁSICA DE DERIVADOS

N-BENZILIDENO-CARBOIDRAZIDA HIDROXILADOS DO SISTEMA

1,6-DIFENIL-1H-PIRAZOLO[3,4-b]PIRIDINA

Niterói – RJ

2017

JOANA LUCIUS DE SOUSA RIBEIRO

SÍNTESE E AVALIAÇÃO ANTICHAGÁSICA DE DERIVADOS

N-BENZILIDENO-CARBOIDRAZIDA HIDROXILADOS DO SISTEMA

1,6-DIFENIL-1H-PIRAZOLO[3,4-b]PIRIDINA

ORIENTADORA: Profª. Drª. LUIZA ROSARIA SOUSA DIAS

Niterói – RJ

2017

Dissertação apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Ciências Aplicadas a

Produtos para Saúde, da Faculdade de

Farmácia da Universidade Federal

Fluminense, como requisito parcial

necessário à obtenção do título de Mestre.

Área de concentração: Pesquisa e

Monitoramento de Produtos para Saúde.

R 484 Ribeiro, Joana Lucius de Sousa.

Síntese e avaliação antichagásica de derivados N-Benzilideno-Carboi-

drazina Hidroxilados do sistema 1,6-Difenil-1H-Pirazolo[3,4-b] Piridina /

Joana Lucius de Sousa Ribeiro; orientadora: Luiza Rosaria Souza Dias. -

Niterói, 2017.

97 f.: il.

Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós-Graduação em Ciências

Aplicadas a Produtos para Saúde, Universidade Federal Fluminense, 2017.

1. Doença de Chagas 2. Heterociclos 3. Tecnologia farmacêutica I.

Dias, Luiza Rosaria Souza, orient. II. Título.

CDD 615.19

Dedico este trabalho à minha família, que foi

indispensável na concretização desse projeto.

Ao meu marido, Robson, por acreditar no meu

sonho e por fazer o possível para transformá-lo em

realidade.

À minha mãe, Lenice, por me substituir nos

cuidados de mãe dispensados ao meu pequeno

Isaac.

Ao meu pai, Wilson, por todo o apoio e incentivo.

Aos meus filhos, Isaac e Giovana, por darem

sentido a todo o esforço.

AGRADECIMENTOS

À Deus pela oportunidade de aprender cada vez mais e por tornar possível essa

conquista.

À Profa. Dra. Luiza R. S. Dias pela orientação, paciência, atenção, compreensão e

acima de tudo pelo exemplo. Obrigada por essa oportunidade e por acreditar no meu

trabalho.

À Profa. Dra. Maria Abadia F. Vera pelos ensinamentos e pela ajuda na

interpretação dos espectros.

Às professoras Dra. Estela M. F. Muri e Dra. Thalita G. Barros pelos ensinamentos,

atenção e convívio no decorrer deste trabalho no laboratório de Química Medicinal

(LQMed).

Ao Dr. Camilo H. S. Lima pela orientação, ensinamentos, apoio e convívio.

Ao prof. Dr. Fernando de Carvalho e toda a equipe do Laboratório Multiusuário de

Ressonância Magnética Nuclear da UFF – LaReMN-UFF pela realização dos

espectros.

Ao colega de pós-graduação Júlio César Vanelis pelo auxílio nas horas difíceis e

pela troca constante de aprendizados.

Aos membros da banca examinadora, pela participação e contribuições

apresentadas.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pelo

financiamento da bolsa de estudos concedida.

Aos colegas de laboratório Pedro Azevedo, Igor Barreto e Igor Ruiz pelo convívio

agradável.

À técnica do laboratório Débora Eiriz por todo auxílio e pela amizade.

RESUMO

A doença de Chagas é considerada uma doença tropical negligenciada que afeta

principalmente a população latino-americana. Os únicos medicamentos disponíveis

para o tratamento etiológico desta doença são eficazes apenas no tratamento de

casos agudos, além de causarem graves efeitos colaterais. Assim, o

desenvolvimento de novos medicamentos contra o agente etiológico T. cruzi ainda é

necessário. Visando investigar a influência do grupo hidroxila em diferentes posições

do grupamento benzilideno de compostos N’-benzilideno-carboidrazida do sistema

1,6-difenil-3-metil-1H-pirazolo[3,4-b]piridina para atividade anti-T.cruzi, neste

trabalho relatamos a síntese, a elucidação estrutural, a avaliação da atividade

tripanocida e estudo de modelagem molecular de derivados desse sistema

heterociclíco. Os novos compostos foram sintetizados em bons rendimentos por

reação de 4-carboidrazida-1,6-difenil-3-metil-1H-pirazolo[3,4-b]piridina com o

derivado benzaldeído apropriado, utilizando glicerol como solvente verde. Os

compostos foram identificados por métodos espectroscópicos e tiveram a atividade

biológica avaliada frente à forma amastigota do protozoário T. cruzi. Os resultados

alcançados indicam o novo derivado 4-(N'-2-hidroxi-benzilideno)carboidrazida-1,6-

difenil-3-metil-1H-pirazolo[3,4-b]piridina como o mais promissor da série devido a

relevante atividade tripanocida e baixa toxicidade apresentadas em ensaios in vitro.

Estudos de ancoramento molecular e simulação de dinâmica molecular indicaram a

enzima cruzaína do T. cruzi como um possível alvo biológico para esse composto.

Palavras-chave: atividade biológica, doença de Chagas, heterociclos, 1H-

pirazolo[3,4-b]piridina, N’-benzilideno-carboidrazida, síntese.

ABSTRACT

Chagas disease is considered a neglected tropical disease that affects mostly the

Latin American population. The only available drugs for the etiological treatment of

this disease are only effective in treating acute cases and cause severe side effects.

Thus, the development of new drugs against the etiologic agent T. cruzi is still

required. Aiming to investigate the influence of the hydroxyl group at different

positions of the benzylidene group of N’-benzylidene-carbohydrazide from 1,6-

diphenyl-3-methyl-1H-pyrazolo[3,4-b]pyridine system for anti-T. cruzi activity, in this

work we report the synthesis, structural elucidation, evaluation of trypanocidal activity

and molecular modelling study of hydroxylated N-benzylidene-carbohydrazide

derivatives of this heterocyclic system. The new compounds were synthesized in high

yields by reaction of 4-carbohydrazide-1,6-diphenyl-3-methyl-1H-pyrazolo[3,4-

b]pyridine and appropriate benzaldehyde derivative using glycerol as a green

solvent. The compounds were identified by spectroscopic methods and had their

biological activity evaluated against the amastigote form of T. cruzi protozoan. The

results obtained indicate the novel 4-(N'-2-hydroxy-benzylidene)carbohydrazide-1,6-

diphenyl-3-methyl-pyrazolo[3,4-b]pyridine derivative as the most promising in the

series due to relevant activity trypanocidal and low toxicity levels reported in vitro

assays. Docking molecular and molecular dynamics simulations studies indicated the

cruzain enzyme of T. cruzi as a possible biological target for this compound.

Keywords: biological activity, Chagas disease, heterocycles, 1H-pyrazolo[3,4-b]

pyridine, N’-benzylidene-carbohydrazide, synthesis.

SUMÁRIO

ÍNDICE DE FIGURAS .................................................................................................. i

ÍNDICE DE TABELAS ................................................................................................ v

ÍNDICE DE QUADROS .............................................................................................. vi

LISTA DE ABREVIATURAS ..................................................................................... vii

1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 1

2. OBJETIVOS ......................................................................................................... 2

2.1. Objetivo Geral ............................................................................................... 2

2.2. Objetivos Específicos .................................................................................. 3

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................................ 3

3.1. Doença de Chagas ....................................................................................... 3

3.2. Formas de Transmissão .............................................................................. 4

3.2.1. Ciclo de Transmissão Oral ...................................................................... 4

3.2.2. Ciclo de Transmissão Vetorial ................................................................. 5

3.3. Epidemiologia da Doença de Chagas ......................................................... 7

3.4. Antiparasitários e Quimioterapia para Doença de Chagas .................... 10

3.4.1. Grupo Arilalquil em Compostos N-Heterocíclicos Antiparasitários ........ 11

3.4.2. Compostos N-Heterocíclicos com Função Hidrazida Ativos como

Antiparasitários ................................................................................................... 12

3.5. Alvos Terapêuticos para Doença de Chagas ........................................... 14

3.5.1. Inibidores da biossíntese de esteróides ................................................. 14

3.5.2. Cruzaína ................................................................................................ 16

4. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................... 19

4.1. Síntese Química ......................................................................................... 19

4.2. Ensaios Biológicos .................................................................................... 20

4.3. Modelagem Molecular ................................................................................ 21

4.3.1. Construção da estrutura tridimensional dos compostos 21 e LQMed 41

21

4.3.2. Simulações de docking molecular ......................................................... 21

4.3.3. Dinâmica Molecular ............................................................................... 22

4.3.4. Análise dos resultados ........................................................................... 23

5. RESULTADOS E DISCUSSÕES ....................................................................... 24

5.1. Síntese dos compostos intermediários: Derivados carbonilados do

sistema 1H-pirazolo[3,4-b]piridina ...................................................................... 25

5.2. Síntese e caracterização dos derivados N’-benzilideno-carboidrazida

hidroxilados do heterociclo 1H-pirazolo[3,4-b]piridina. ................................... 27

5.3. Atividade Biológica .................................................................................... 45

5.4. Modelagem Molecular dos compostos 21 e LQMed 41 .......................... 47

5.4.1. Análise conformacional .......................................................................... 47

5.4.2. Ancoramento (docking) molecular ......................................................... 49

5.4.3. Simulação por Dinâmica Molecular ....................................................... 51

5.4.3.1. Análise do desvio da raiz média quadrática, flutuação quadrática média

e raio de giro da enzima cruzaína ....................................................................... 51

5.4.4. Análise das interações por ligações de hidrogênio ................................ 53

6. CONCLUSÕES .................................................................................................. 56

7. EXPERIMENTAL ................................................................................................ 57

7.1. Metodologia Sintética ................................................................................ 57

7.1.1. Procedimento para obtenção do composto 4-(1,6-difenil-3-metil-1H-

pirazolo[3,4-b]piridina) carboxilato de etila (19). ................................................. 57

7.1.2. Procedimento para obtenção do composto 4-carboidrazida-1,6-difenil-3-

metil-1H-pirazolo[3,4-b]piridina (20). ................................................................... 58

7.1.3. Procedimento geral para obtenção dos derivados 4-(N'-benzilideno)-

carboidrazida-1,6-difenil-3-metil-1H-pirazolo[3,4-b]piridina (21 – 24) ................. 59

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................. 63

9. APÊNDICE ......................................................................................................... 73

i

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1: Derivados N-benzilideno carboidrazida hidroxilados planejados para

atividade antichagásica ............................................................................................... 3

Figura 2: Modelo de transmissão oral pelo consumo de açaí preparado com o fruto

contaminado com o vetor transmissor. (A) vetor presente na plantação, (B)

esmagamento do fruto contaminado, (C) transmissão oral pelo consumo. ................. 5

Figura 3: Esquema representativo do ciclo de vida do T. cruzi nos hospedeiros

vertebrados e invertebrados. ....................................................................................... 6

Figura 4: Ciclos biológicos doméstico e peridoméstico de transmissão do T. cruzi. ... 7

Figura 5: Rotas de migração da América Latina e estimativa de pessoas infectadas.

(Adaptado de COURA; VINAS, 2010) ......................................................................... 8

Figura 6: Estrutura molecular dos compostos heterocíclicos que possuem um ou

mais grupos arilalquil (1 – 6) relatados para atividade antiparasitária. ...................... 11

Figura 7: Funções hidrazida e carboidrazida inseridas na estrutura molecular dos

fármacos antiprotozoários Nifurtimox (7) e Nifuratel (8). ........................................... 12

Figura 8: Derivados carboidrazida do núcleo 1H-fenil-pirazol (9,10 e 11) e do sistema

condensado 1,6-difenil-3-metil-1H-pirazolo[3,4-b]piridina (12 e 13) que

demonstraram atividade tripanocida relevante. ......................................................... 13

Figura 9: Estrutura molecular dos compostos azólicos, inibidores da biossíntese de

ergosterol, testados para Doença de Chagas. .......................................................... 15

Figura 10: Representação em “new cartoon” da estrutura cristalográfica da cruzaína

(Protein Data Bank, código 4KLB), subsítios S1’-S4 (em vermelho) e a tríade

catalítica composta pelos resíduos de aminoácidos cisteína 25 (Cys25), histidina 162

(His162) e asparagina 182 (Asn 182), amarelo = folhas-β; roxo = hélices-α; branco e

ciano=alças. .............................................................................................................. 18

Figura 11: Estrutura molecular de inibidores de cruzaína (13-17) ............................. 19

Figura 12: Estrutura molecular do composto LQMed41 e dos novos derivados (21-

24) N-benzilideno carboidrazida. ............................................................................... 24

ii

Figura 13: Síntese dos derivados carbonilados do sistema 1,6-difenil-3-metil-1H-

pirazolo[3,4-b]piridina (19) e (20). ............................................................................. 26

Figura 14: Proposta de formação de isômeros geométricos dos derivados

N'benzilideno-carboidrazida a partir do composto 20. ............................................... 28

Figura 15: Cálculo para determinação dos deslocamentos químicos dos carbonos

C1''-C4'' ..................................................................................................................... 30

Figura 16: Cálculo para determinação dos deslocamentos químicos dos hidrogênios

H2''-H4''. .................................................................................................................... 31

Figura 17: RMN 2D - HSQC do composto 23 evidenciando o acoplamento do

hidrogênio H2''' com o C2''' ........................................................................................ 34

Figura 18: RMN 2D - HSQC do composto 23 demonstrando o acoplamento dos

hidrogênios H2', H2'', H12 e H5 com os respectivos carbonos C2', C2'', C12 e C5 .. 35

Figura 19: RMN 2D - HSQC do composto 11 demonstrando o acoplamento dos

hidrogênios H6’’’, H5’’’, H2’’’, H3’, H3’’ e H4’ com os respectivos carbonos C6’’’, C5’’’,

C2’’’, C3’, C3’’ e C4’ .................................................................................................. 36

Figura 20: RMN 2D - HMBC do composto 21 evidenciando o acoplamento de longa

distância do H8 (CH3) com os carbonos C3 e C3a. .................................................. 37

Figura 21: RMN 2D - HMBC do composto 23 evidenciando o acoplamento de longa

distância do H8 (CH3) com os carbonos C3 e C3a. .................................................. 37

Figura 22: RMN 2D - HMBC do composto 22 evidenciando o acoplamento de longa

distância do H8 (CH3) com os carbonos C3 e C3a. .................................................. 38

Figura 23: RMN 2D - HMBC do composto 24 evidenciando o acoplamento de longa

distância do H8 (CH3) com os carbonos C3 e C3a. .................................................. 38

Figura 24: RMN 2D - HMBC do composto 23 demonstrando o acoplamento do

hidrogênio H2'' com o carbono C6 ............................................................................ 39

iii

Figura 25: RMN 2D - HMBC do composto 23 evidenciando os seguintes

acoplamentos: δC 148,30 (C4''’) e δH 7,32 (H2’''); δC 145,74 (C3''’) e δH 6,83 (H5’''); δC

125,33 (C1''’) e δH 6,83 (H5’'') ................................................................................... 40

Figura 26: RMN 2D - HMBC do composto 22 evidenciando o acoplamento de longa

distância do H10 com os carbonos C9 e C12. Em vermelho, os sinais duplicados do

hidrogênio H10 e dos carbonos C9 e C12. ............................................................... 41

Figura 27: RMN 2D - HMBC do composto 24 evidenciando o acoplamento de longa

distância do H10 com os carbonos C9 (C=O) e C12(CH). Em vermelho, os sinais

duplicados do H10, C9 e C12. ................................................................................... 42

Figura 28: Proposta das principais fragmentações dos compostos 21-24 na

espectroscopia de massa. ......................................................................................... 45

Figura 29: Ângulos diedros analisados na análise conformacional dos isômeros E e

Z dos compostos 21 e LQMed 41. ............................................................................ 47

Figura 30: Confôrmeros do isômero E do composto 21. (A) Conformações syn (A1) e

anti (A2), em destaque o grupo -C(O)NH-; (B) Representação esquemática de

ligação hidrogênio intramolecular do grupo 2-hidróxifenil. ........................................ 48

Figura 31: Sobreposição dos confôrmeros do isômero Z do composto 21,

destacando o grupo -C(O)NH- em conformação syn. .............................................. 49

Figura 32: Sitio de ligação da enzima CRZ, dividido nos subsítios S1’ (vermelho), S1

(roxo), S2 (azul) e S3 (amarelo) complexado com o isômero E dos compostos 21 (A)

e LQMed 41 (B). As linhas pontilhadas representam as ligações de hidrogênio. ..... 50

Figura 33: (A) Desvio quadrático médio (RMSD) dos átomos de carbono alfa da

cruzaína (CRZ) nos sistemas CRZ-isômero E do composto 21 (linhas pretas) e CRZ-

isômero E do LQMed 41 (linhas vermelhas). ............................................................ 51

Figura 34: Avaliação dos complexos composto 21-CRZ e LQMed 41-CRZ. (A)

Gráfico da flutuação quadrática média dos átomos de carbono-alfa (Cα-RMSF)

durante os últimos 10 ns de simulação por dinâmica molecular; (B) Gráfico do Raio

de giro (Rg) da enzima CRZ nos complexos. ............................................................ 52

Figura 35: Interações por ligação hidrogênio entre a cruzaína e o isômero E do

composto 21, durante os 20 ns de simulação por dinâmica molecular (A) e a

estrutura representativa das principais interações por ligação hidrogênio (B). ......... 54

iv

Figura 36: Interações por ligação hidrogênio entre a cruzaína e o isômero E do

composto LQMed 41, durante os 20 ns de simulação por dinâmica molecular e a

estrutura representativa das principais interações por ligação hidrogênio. ............... 55

v

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1: Casos confirmados de doença de Chagas aguda, segundo Região,

Unidade da Federação de residência e forma de transmissão. Brasil, 2000 a 2013 .. 9

Tabela 2: Condições reacionais e rendimento químico das sínteses dos derivados

N’-benzilideno- carboidrazida (21-24) ...................................................................... 29

Tabela 3: Dados de RMN 1H (500 MHz DMSO) dos compostos 21-24 obtidos por

experimentos de 1D (1H) e deslocamentos químicos calculados. Deslocamentos

químicos (δ) em ppm, relativos ao TMS, J em Hz. ................................................... 33

Tabela 4: Dados de RMN 13C-APT (125 MHz DMSO) dos compostos 21-24 obtidos

por experimentos de 1D (APT). Deslocamentos químicos (δ) em ppm relativos ao

TMS. 43

Tabela 5: Atividade tripanocida frente à forma amastigota do T. cruzi (IC50),

citotoxicidade (CC50) e índice de seletividade (IS) dos novos compostos N’-

benzilideno-carboidrazida (21- 24), LQMed 41 e do fármaco benznidazol (BZD). ... 46

vi

ÍNDICE DE QUADROS

Quadro 1: Relação das Doenças classificadas como Tropicais Negligenciadas pela

OMS ........................................................................................................................... 1

vii

LISTA DE ABREVIATURAS

APT Attached Proton Test

c.c.f cromatografia em camada fina

CRZ Cruzaína

DC Doença de Chagas

DCA Doença de Chagas Aguda

DMSO-d6 Dimetil sulfóxido deuterado

DTN Doenças Tropicais Negligenciadas

d dupleto

dd duplo dubleto

EMAR Espectrometria de Massas de Alta Resolução

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Coherence

HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence

IC50 Concentração inibitória 50%

IV Infravermelho

J constante de acoplamento

m multipleto

OMS Organização Mundial de Saúde

PBS Phosphate-buffered Saline

p.f. Ponto de fusão

ppm Parte por milhão

RPMI Roswell Park Memorial Institute

s singleto

t tripleto

TMS Tetrametilsilano

UV Ultravioleta

WHO World Health Organization

δ Deslocamento químico

1

1. INTRODUÇÃO

A Doença de Chagas faz parte de um grupo de doenças classificadas pela

Organização Mundial de Saúde (OMS) como Doenças Tropicais Negligenciadas

(DTN’s), que engloba 17 doenças (Quadro 1) que recebem essa denominação em

virtude de algumas características em comum que tais doenças compartilham, tais

como: afetar populações em estado de pobreza, com acesso limitado aos serviços

de saúde e em condições precárias de saneamento básico e ocorrer em regiões de

clima tropical favorecendo a proliferação dos vetores de algumas dessas doenças

(WHO, 2013; BERMUDEZ et al., 2016).

Quadro 1: Relação das Doenças classificadas como Tropicais Negligenciadas pela OMS. (WHO,

2013).

Doenças Tropicais Negligenciadas

Dengue Teníase/Cisticercose

Raiva Dracunculíase

Tracoma Equinococose/Hidatidose

Úlcera de Buruli Trematodíases Alimentares

Treponematoses Endêmicas Filariose Linfática

Lepra Oncocercose

Doença de Chagas Esquistossomose

Tripanossomíase Humana Africana Helmintíases

Leishmaniose

De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS), 149 países são

endêmicos para ao menos uma dessas doenças, sendo que alguns desses países

são endêmicos para 6 ou mais doenças (WHO, 2012). Em 2010, a OMS publicou o

primeiro relatório sobre as DTN’s e, em 2013 um segundo relatório foi publicado com

uma avaliação dos avanços na prevenção e controle dessas doenças. A OMS tem

na interrupção da transmissão e no atendimento dos pacientes os pilares para a

erradicação da doença de Chagas (WHO, 2013).

Para que a doença de Chagas seja retirada do rol das doenças

negligenciadas é necessário evidenciar as lacunas existentes no diagnóstico e no

tratamento para atender melhor os pacientes, tais como: melhores tratamentos com

medicamentos que produzam menos efeitos adversos; medicamentos que

apresentem efetividade nas fases aguda e crônica; esquemas de tratamento com

menor duração para aumentar a adesão; medicamentos que possam ser aplicados

2

com segurança também em crianças, gestantes e mulheres em amamentação;

tecnologias que possibilitem avaliar a efetividade de um tratamento; melhores testes

de diagnóstico, incluindo diagnóstico precoce em assintomáticos; possibilidade de

vacinas; e inseticidas mais efetivos e menos tóxicos (FEHR; THURMANN; RAZUM,

2006; REIS et al., 2009; WIGGERS et al., 2013).

O Tropical Disease Research (TDR), programa especial de pesquisa e

treinamento em doenças tropicais da OMS, impulsionou o interesse pela pesquisa

científica na DC. A melhoria geral na comunicação global foi outro fator que

contribuiu para uma organização sistemática de reuniões especializadas. Esses

fatores contribuíram para um crescente aumento do número de publicações sobre a

DC, entretanto menos de 10% das publicações se referem a estudos clínicos

(BERMUDEZ et al., 2016). Assim, apesar do aumento no número de publicações

sobre DC nos últimos anos, há a necessidade de ampliação das pesquisas sobre o

tema visando resultados que possam ser traduzidos em oportunidades de controle

da doença.

Em face do cenário atual, são necessárias pesquisas que visem à obtenção

de um fármaco mais eficiente e com um menos efeitos colaterais, para o tratamento

e prevenção dessa doença. Nesse sentido, dando continuidade a linha de pesquisa

para obtenção de novos agentes antiparasitários, visamos neste projeto a obtenção

de análogos estruturais do derivado do núcleo 1H-pirazolo[3,4-b]piridina que

demonstrou melhor atividade antichagásica em trabalhos anteriores de nosso grupo

de pesquisa (DIAS et al., 2007), de maneira a mapear as características estruturais

essenciais que estejam correlacionadas à atividade tripanocida desses derivados.

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo Geral

Síntese e investigação da atividade antichagásica de novos derivados N-

benzilideno-carboidrazida hidroxilados do sistema heterocíclico 1,6-difenil-1H-

pirazolo[3,4-b]piridina (Figura 1).

Nifurtimox (01) Nifurtimox (01)

3

Figura 1: Derivados N-benzilideno carboidrazida hidroxilados planejados para atividade antichagásica

2.2. Objetivos Específicos

1. Sintetizar novos derivados 4-(N'-benzilideno)-carboidrazida-1,6-difenil-3-

metil-1H-pirazolo[3,4-b]piridina substituídos com grupamento hidroxila em

diferentes posições: 2-OH-fenil, 3-OH-fenil, 3,4-di-OH-fenil e 3-OH-4-

OCH3-fenil (Figura 1);

2. Realizar a caracterização estrutural dos novos compostos por métodos

espectroscópicos;

3. Avaliar a atividade antichagásica dos novos compostos sintetizados sobre

a forma amastigota do parasita T. cruzi e de citotoxicidade em ensaios

biológicos in vitro;

4. Avaliar a influência do grupo hidroxila em diferentes posições do

grupamento benzilideno na atividade antichagásica;

5. Realizar estudos de modelagem e dinâmica molecular para avaliação da

cruzaína como possível alvo.

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1. Doença de Chagas

A doença de Chagas (DC), ou também denominada tripanossomíase

americana, caracteriza-se por uma infecção causada pelo protozoário Trypanosoma

cruzi. Este protozoário apresenta um complexo ciclo de vida com diferentes estádios

evolutivos e pode se desenvolver tanto em hospedeiros vertebrados (mamíferos)

4

como em hospedeiros invertebrados (triatomíneos). Nos hospedeiros, o T. cruzi

apresenta as seguintes formas evolutivas: as formas tripomastigota (forma infectante

extracelular) e amastigota (forma reprodutiva intracelular) estão presentes nos

mamíferos; e as formas epimastigota (forma reprodutiva) e tripomastigota (forma

infectante extracelular) estão presentes nos triatomíneos (COURA; MOREIRA;

JUNQUEIRA, 2012; COURA; BORGES-PEREIRA, 2012; SOUZA; MONTEIRO,

2013).

A evolução da doença no homem apresenta três formas clínicas: a fase

inicial ou aguda, a fase indeterminada e a fase crônica (DUSCHAK; COUTO, 2009).

A fase aguda se caracteriza pela presença do parasito no sangue periférico e pode

apresentar sintomas como febre prolongada que podem ser confundidos com os

sintomas de outras infecções como a malária e a febre tifóide. Na fase inicial, vários

tipos de células podem ser infectados. A fase indeterminada compreende um

período entre as fases aguda e crônica e pode ter duração de 10 a 20 anos com

ausência de sintomas (DUSCHAK; COUTO, 2009). Na fase crônica, a redução do

número de parasitos na corrente sanguínea é observada e as manifestações clínicas

podem ocorrer após anos de infecção, após um período de latência clínica. Nessa

fase, as células mais afetadas são as dos tecidos cardíaco e entérico. (SOUZA;

MONTEIRO, 2013).

3.2. Formas de Transmissão

A doença de Chagas pode ser transmitida por diferentes vias: vetorial,

transfusional, transplante de órgãos, oral (digestiva) e congênita. A transmissão

vetorial apresenta um ciclo bem definido descrito na literatura. A transmissão por via

oral ocorre pela contaminação de alimentos com os triatomíneos ou suas dejeções

nos locais de processamento dos alimentos. (SOUZA; MONTEIRO, 2013).

3.2.1. Ciclo de Transmissão Oral

A transmissão oral pode ocorrer de forma externa, ou seja, pela ingestão de

alimentos contaminados com os triatomíneos ou suas fezes. Sucos de açaí, de

cana, bacaba estão entre os alimentos contaminados já relatados (FERREIRA,

BRANQUINHO; LEITE, 2014). No período de 2000 a 2013, a transmissão por via

5

oral foi a forma mais frequente em todos os anos para os casos de DCA confirmados

no Brasil (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2015). A transmissão oral também pode ocorrer

de forma natural pela ingestão de carne semicrua de animais infectados. Dezenas

de espécies da subfamília Triatominae (Reduviidae) podem transmitir o T. cruzi,

principalmente dos gêneros Triatoma, Panstrogylus e Rhodnius. A figura a seguir

ilustra o modelo de transmissão oral ocorrido no município de Mazagão, no estado

do Amapá, com o registro de 17 casos de infecção aguda em que a provável fonte

de infecção foi o suco de açaí preparado em máquinas elétricas contaminadas com

partes dos insetos vetores ou suas fezes (SOUZA; CARVALHO; BARRIAS, 2010;

COURA; MOREIRA; JUNQUEIRA, 2012).

Figura 2: Modelo de transmissão oral pelo consumo de açaí preparado com o fruto contaminado com o vetor transmissor. (A) vetor presente na plantação, (B) esmagamento do fruto contaminado, (C) transmissão oral pelo consumo. (Adaptado de COURA; MOREIRA; JUNQUEIRA; 2012)

3.2.2. Ciclo de Transmissão Vetorial

O ciclo de transmissão vetorial inicia quando o triatomíneo infectado pica o

hospedeiro vertebrado e, durante o repasto sanguíneo, o inseto deposita as suas

fezes na pele do hospedeiro. As formas tripomastigotas metacíclicas ali presentes

penetram na pele e invadem diferentes tipos celulares no hospedeiro vertebrado.

Dentro das células, as formas tripomastigotas se transformam em amastigotas, que

6

iniciam o processo de replicação celular por divisão binária. Dentro de

“pseudocistos” as formas amastigotas assumem a forma tripomastigota novamente.

Então, os “pseudocistos” se rompem liberando as formas tripomastigotas para a

corrente sanguínea e reiniciam o processo de infecção em novas células. Os vetores

são infectados ao picarem os hospedeiros vertebrados infectados. Dessa maneira,

as formas tripomastigotas presentes no sangue dos vertebrados alcançam o

intestino do inseto e transformam-se na forma epimastigota, forma reprodutiva no

inseto. Após multiplicação por divisão binária das formas epimastigotas, estas

transformam-se novamente em tripomastigotas metacíclicas (forma infectante) na

porção final do tubo digestivo do inseto vetor, sendo eliminadas nas fezes ou urina

no momento em que o inseto vetor pica o hospedeiro vertebrado, reiniciando o ciclo

do parasito (Figura 3) (COURA; BORGES-PEREIRA, 2012; COURA; MOREIRA;

JUNQUEIRA, 2012).

Figura 3: Esquema representativo do ciclo de vida do T. cruzi nos hospedeiros vertebrados e invertebrados.

Diferentes modelos de ciclos biológicos do T. cruzi estão descritos na

literatura, incluindo o ciclo doméstico e o ciclo peridoméstico. O primeiro envolve a

domiciliação dos triatomíneos, e o segundo se caracteriza pela adaptação desses

insetos em áreas em torno das habitações humanas. Portanto, o homem pode se

infectar no ambiente doméstico através da picada do inseto infectado enquanto

7

dorme à noite (Figura 4). Uma outra forma se dá pela exposição ao vetor durante o

trabalho de extração de fibras (COURA; MOREIRA; JUNQUEIRA, 2012).

Figura 4: Ciclos biológicos doméstico e peridoméstico de transmissão do T. cruzi.

3.3. Epidemiologia da Doença de Chagas

A Doença de Chagas, endêmica na América Latina, representa um grave

problema socioeconômico para essa região do continente americano. A distribuição

do vetor e reservatórios silvestres do T. cruzi nas Américas se estende dos Estados

Unidos até a Argentina e Chile, somando um total de 22 países endêmicos para a

doença (COURA; VIÑAS, 2010). A Bolívia tem a maior taxa de prevalência de

infecção humana. A partir da década de 40, a doença de Chagas emergiu como um

problema médico e social em decorrência da urbanização das populações rurais. Na

década de 60, foi identificada uma nova forma de transmissão dessa doença através

da transfusão sanguínea e foi estimado pela OMS cerca de 7 milhões de novos

casos por ano a partir dessa forma de transmissão. Esses dados contribuíram para a

implementação de novas políticas para controle nos bancos de sangue, embora em

alguns países latino americanos, como no caso da Bolívia, esses controles ainda

sejam precários (COURA; VIÑAS, 2010).

Com o aumento da migração de pessoas oriundas de países latino

americanos para países não endêmicos, como os Estados Unidos, Canadá, Japão,

8

Austrália, Espanha, França e Reino Unido, o risco de infecção nesses países está

associado a transfusão sanguínea, a transmissão vertical, de mãe para filho e

transplante de órgãos. Há uma estimativa de pessoas infectadas superior a 300.000

nos Estados Unidos, 5.500 no Canadá, 80.000 na Europa, 3.000 no Japão e 1.500

na Austrália (Figura 5), de maneira que a propagação dessa doença para países não

endêmicos consiste em um novo desafio mundial (COURA; VIÑAS, 2010).

Figura 5: Rotas de migração da América Latina e estimativa de pessoas infectadas. (Adaptado de

COURA; VINAS, 2010)

No Brasil, as maiores incidências da DC concentram-se na região Norte com

predominância da transmissão por via oral, embora as formas de transmissão

vetorial e vertical ainda sejam identificadas. Os casos de transmissão oral

prevalecem também nas regiões Nordeste e Sul. Por outro lado, na região Centro-

oeste prevalece a transmissão vetorial, conforme ilustrado na tabela 1. A região

Sudeste, que registra o menor número de casos, é a região que possui o maior

número de casos em que a forma de transmissão da doença não foi notificada. O

estado do Rio Grande do Sul concentrou 50% dos casos de transmissão vertical

(Tabela 1). (MINISTÉRIO DE SAÚDE, 2015).

Em estudo realizado no período de 2000 a 2013 (Tabela 1) pela Secretaria

de Vigilância em Saúde - Ministério da Saúde – constatou-se que 75% dos casos de

DCA registrados no Brasil são do estado do Pará. A maior incidência dos casos de

DCA no estado do Pará está relacionada com a produção do açaí. (FERREIRA,

BRANQUINHO; LEITE, 2014; MINISTÉRIO DE SAÚDE, 2015).

9

Tabela 1 - Casos confirmados de doença de Chagas aguda, segundo Região, Unidade da Federação

de residência e forma de transmissão. Brasil, 2000 a 2013. (MINISTÉRIO DA SAÚDE. 2015).

Região/

Unidade da

Federação

Forma de transmissão

Total % Oral Vetorial Vertical Ignorada* Outras**

Norte 1023 70 1 329 7 1430 91,1

Rondônia 0 2 0 0 0 2 0,1

Acre 5 2 0 0 0 7 0,4

Amazonas 56 14 0 7 1 78 5,0

Roraima 0 0 0 1 0 1 0,1

Pará 812 49 1 306 5 1173 74,7

Amapá 131 1 0 13 1 146 9,3

Tocantins 19 2 0 2 0 23 1,5

Nordeste 33 14 1 23 2 73 4,6

Maranhão 11 7 0 5 1 24 1,5

Piauí 0 3 0 1 0 4 0,3

Ceará 8 1 0 0 0 9 0,6

Rio Grande do

Norte 1 0 1 0 0

2 0,1

Paraíba 0 0 0 1 0 1 0,1

Pernanbuco 0 2 0 15 0 17 1,1

Sergipe 0 1 0 1 0 2 0,1

Bahia 13 0 0 0 1 14 0,9

Sudeste 0 2 1 8 1 12 0,8

Minas Gerais 0 0 0 6 0 6 0,4

Espírito Santo 0 0 0 0 1 1 0,1

Rio de Janeiro 0 1 0 0 0 1 0,1

São Paulo 0 1 1 2 0 4 0,3

Sul 25 0 3 0 0 28 1,8

Santa

Catariana 24 0 0 0 0

24 1,5

Rio Grande do

Sul 1 0 3 0 0

4 0,3

Centro-Oeste 0 14 0 12 1 27 1,7

Mato Grosso 0 4 0 0 0 4 0,3

Goiás 0 10 0 12 1 23 1,5

Brasil 1081 100 6 372 11 1570 100,0

* Foram incluídos os casos com a variável “forma provável de transmissão” em branco.

** Transmissão acidental e transfusional.

10

O primeiro surto da doença de Chagas aguda por transmissão oral ocorreu

no ano de 2005 no estado de Santa Catarina, demonstrando que essa forma de

transmissão poderia assumir maior importância na cadeia de transmissão. A partir

desse surto, notou-se uma maior sensibilidade da vigilância e novos casos ou surtos

passaram a ser identificados com maior frequência. Dessa forma, surgiu a

necessidade de se estabelecer uma interface entre a Vigilância Epidemiológica e a

Vigilância Sanitária com o intuito de melhorar as ações de controle e prevenção,

assim como aprimorar o diagnóstico e tratamento adequado para as complicações

associadas à doença (MINISTÉRIO DE SAÚDE, 2015).

3.4. Antiparasitários e Quimioterapia para Doença de Chagas

A quimioterapia da doença de Chagas ainda é insatisfatória, sendo baseada

em nitrofuranos e nitroimidazóis pouco ativos na fase crônica da doença.

Normalmente, a fase crônica é tratada apenas sintomaticamente, com monitorização

mensal dos pacientes.

Atualmente, há apenas dois compostos heterocíclicos no mercado, o

benznidazol (1) (Figura 6) e o nifurtimox (7) (Figura 7), os quais são preconizados

para o tratamento da infecção por T. cruzi na fase aguda da doença, infecções

recentes e casos congênitos, e apresentam frequentes efeitos colaterais.

O nifurtimox (7) apresenta entre os efeitos colaterais relatados a perda de

peso, algumas manifestações digestivas como náuseas, vômitos e cólicas

intestinais. As reações adversas associadas ao uso do benznidazol (1) normalmente

ocorrem entre o 5o e 10o dia de tratamento. Entre as reações mais frequentes estão

as manifestações de hipersensibilidade, como dermatite, dores musculares e

articulares; depressão da medula óssea; polineuropatia periférica e distúrbios

gastrointestinais (DIAS et al., 2009; COURA; MOREIRA; JUNQUEIRA, 2012).

Desde a década de 70, nenhuma classe química de compostos foi

adicionada à quimioterapia da doença de Chagas. O nifurtimox (7) não está mais

disponível no Brasil desde os anos 90, sendo utilizado somente nos EUA.

Entretanto, o benznidazol (1), que não é utilizado nos EUA, é o fármaco de escolha

nos países da América Latina (COURA; CASTRO, 2002; COURA, 2009; CDC,

2015).

11

Em face do cenário atual, existe a necessidade da obtenção de um fármaco

mais eficiente e com menos efeitos colaterais, para o tratamento e prevenção desta

doença.

3.4.1. Grupo Arilalquil em Compostos N-Heterocíclicos Antiparasitários

Os fármacos benznidazol (1) e nifurtimox (7) foram disponibilizados para a

terapia antichagásica no início da década de 70 (COURA; CASTRO, 2002). Nos

anos seguintes, diversos compostos contendo um grupo arilalquil foram relatados

para atividade antiparasitária (DUSCHAK, 2011; PATTERSON; WYLLIE, 2014). Os

fármacos cetoconazol (6), itraconazol (4) e posaconazol (5) possuem um grupo

arilmetil e arilmetóxi, o fexinidazol (3) apenas um grupo arilmetóxi, e o metronidazol

(2) um grupo hidróxietil, ligado ao anel heterocíclico (Figura 6). Observa-se também

que o fármaco benznidazol (1), único disponibilizado no Brasil para o tratamento da

doença de Chagas (COURA, 2009; CDC, 2015), possui dois grupos arilmetil: benzil

e hetero-arilmetil (Figura 6).

Figura 6: Estrutura molecular dos compostos heterocíclicos que possuem um ou mais grupos arilalquil

(1 – 6) relatados para atividade antiparasitária.

12

3.4.2. Compostos N-Heterocíclicos com Função Hidrazida Ativos como

Antiparasitários

A função hidrazida (RNH-N=CR’) encontra-se em diversos compostos

relatados para atividade antimicrobiana e antiparasitária (BANERJEE; HKS;

BANERJEE, 2012; DIAS; SALVADOR, 2012). Em alguns compostos observa-se

esta função ligada a uma porção arilideno, como nos fármacos com ação

antiprotozoário nifurtimox (7) e nifuratel (8) (Figura 7), este último uma carboidrazida

(RC(O)NH-N=CR’), devido a presença da carbonila internalizada no anel

oxazolidona (SWISS PHARMACEUTICAL SOCIETY, 2000; BANERJEE; HKS;

BANERJEE, 2012).

Figura 7: Funções hidrazida e carboidrazida inseridas na estrutura molecular dos fármacos

antiprotozoários Nifurtimox (7) e Nifuratel (8).

Nesse sentido, derivados carboidrazida do anel 1H-fenil-pirazol, substituídos

na posição para- do grupo fenilmetileno foram relatados como antiparasitários.

Derivados deste núcleo com uma unidade espaçadora (grupo etilênico) entre o anel

heterocíclico e a função carboidrazida apresentaram atividade antiparasitária contra

T. cruzi, sendo (11) o composto mais ativo contra forma tripomatigota (IC50 = 50 μM),

sem demonstrar toxicidade (VERA-DIVAIO et al., 2009; DIAS; SALVADOR, 2012)

(Figura 8). Por outro lado, derivados carboidrazida do anel 1H-fenil-pirazol sem a

unidade espaçadora, substituídos no grupo fenilmetileno com hidroxila (9) ou cloro

(10) (Figura 8) foram relatados para atividade antimalárica e leishmanicida,

respectivamente (DIAS; SALVADOR, 2012).

Em estudos anteriores nosso grupo de pesquisa desenvolveu três séries de

derivados N’-(4-substituído)-benzilideno-carboidrazidas do sistema heterocíclico

condensado 1H-pirazolo[3,4-b]piridina, apresentando cada série um dos grupos fenil,

metil ou trifluorometil na posição C-6, que foram avaliados para atividade

antiparasitária contra T. cruzi. Dentre os quais apenas a série com o grupo fenil em

13

C-6 apresentou um perfil promissor como tripanocida (DIAS et al., 2007;

SALVADOR, 2012), indicando que a alteração dos parâmetros eletrônicos e de

lipofilicidade relacionada a esses grupos afetam a atividade tripanocida dessa classe

de compostos (SALVADOR et al., 2016). Os derivados mais ativos foram o 4-hidróxi-

fenilmetileno (12), denominado LQMed 41, (IC50 = 4,25 μM) e o 4-dimetilamino-

fenilmetileno (13) (IC50 = 82,81 μM) (DIAS et al., 2007), ambos contra a forma

tripomastigota do parasita (Figura 8).

Os resultados demonstraram que o grupo fenil na posição C-6 é importante

para a atividade antichagásica nessa classe de compostos, uma vez que a

substituição nessa posição pelos grupos metil ou trifluorometil conduziu a ausência

de atividade em compostos análogos (DIAS et al., 2007; SALVADOR, 2012), e

apontaram para a continuidade da pesquisa de compostos carboidrazida do núcleo

1,6-difenil-1H-pirazolo[3,4-b]piridina, substituídos pelo grupo hidroxila na porção

fenilmetileno para atividade antichagásica (SALVADOR et al., 2016).

Figura 8: Derivados carboidrazida do núcleo 1H-fenil-pirazol (9,10 e 11) e do sistema condensado

1,6-difenil-3-metil-1H-pirazolo[3,4-b]piridina (12 e 13) que demonstraram atividade tripanocida

relevante.

14

3.5. Alvos Terapêuticos para Doença de Chagas

A identificação de alvos terapêuticos para doença de Chagas vem sendo

viabilizada em decorrência do sequenciamento dos genomas, que contribuiu para a

identificação de diversos genes do T. cruzi, os quais não estão presentes no

homem. Os alvos descritos na literatura englobam as proteases, a via glicolítica, o

metabolismo dependente de grupos tióis, a transferência de ácido siálico, as DNA

topoisomerases e a biossíntese de esteróides. (SUETH-SANTIAGO et al., 2015).

Dentre estes, a principal cisteína-protease do T. cruzi, a cruzaína tem sido

amplamente investigada (MCKERROW et al., 2008; DUSCHAK; COUTO, 2009; LEE

et al., 2012; WIGGERS et al., 2013; VITAL et al., 2014; HOELZ et al., 2016).

3.5.1. Inibidores da biossíntese de esteróides

Após os fármacos benznidazol (1) e nifurtimox (7), os inibidores da

biossíntese de esteroides foram os únicos que conseguiram chegar a triagens

clínicas avançadas como candidatos a fármacos antichagásicos. Dentre os

inibidores da biossíntese de esteróides, destacam-se os fungicidas azólicos,

inibidores da CYP51 (lanosterol 14 alfa desmetilase). A inibição dessa enzima leva

ao acúmulo de precursores do ergosterol na membrana celular do T. cruzi e

compromete a sua integridade, uma vez que o ergosterol é fundamental para a

membrana dos tripanosomas. Uma das vantagens na utilização desse alvo é que as

células dos hospedeiros vertebrados são dependentes do colesterol e não do

ergosterol. Porém, os fungicidas azólicos fluconazol (9), itraconazol (4) e

cetoconazol (6) testados contra o T. cruzi não apresentaram resultados satisfatórios

nos ensaios clínicos (SUETH-SANTIAGO et al., 2015).

Outros derivados triazólicos inibidores da enzima esterol C14 α- desmetilase

(CYP51A1) já foram selecionados para ensaios clínicos: o D0870 (11) e o

posaconazol (5) (Schering-Plough Research Institute). Estes compostos atuam

inibindo a esterol C14 α- desmetilase tanto de fungos quanto de protozoários. Nos

testes realizados em camundongos, induziram a cura parasitológica nas fases

crônica e aguda da DC, sem apresentarem efeitos tóxicos às células hospedeiras.

Esses compostos apresentam atividade tripanocida potente e seletiva frente às

diferentes formas evolutivas do parasita. No entanto, o composto o D0870 (11)

15

(Figura 9) apresentou efeitos colaterais importantes e o seu desenvolvimento foi

interrompido (SUETH-SANTIAGO et al., 2015).

Figura 9: Estrutura molecular dos compostos azólicos, inibidores da biossíntese de ergosterol,

testados para Doença de Chagas.

Outro composto azólico que demonstrou atividade contra o T. cruzi foi o

TAK-187 (12) (Figura 9), o qual demonstrou atividade contra as formas epimastigota

e amastigota. Também foi observado após estudos realizados com camundongos

que levou a 80-100% de sobrevivência com 80-100% de cura parasitológica, além

de não demonstrar efeitos secundários tóxicos, caracterizando o TAK-187 (12) para

estudos avançados para o tratamento da DC (SUETH-SANTIAGO et al., 2015).

O tipifarnibe (10) (Figura 9), um inibidor da proteína humana

farnesiltransferase, demonstrou ação contra o T. cruzi pelo bloqueio da biossíntese

de ergosterol através da inibição da lanosterol 14α-desmetilase. Mas, por apresentar

ação de inibição da farnesiltransferase humana, foram conduzidos estudos para o

desenvolvimento de análogos do tipifarnibe (10) capazes de bloquear a lanosterol

14α-desmetilase e, ao mesmo tempo, que não apresentassem ação sobre a

farnesiltransferase humana. Vários compostos com ação tripanocida e desprovidos

de atividade contra a farnesiltransferase humana foram desenvolvidos a partir da

alteração do substituinte ligado ao grupamento fenil da posição 4 do anel quinolínico

16

e pela substituição do grupo amino pelo metóxi. Esta última substituição tornou os

compostos mais hidrofóbicos resultando em melhor penetração dos compostos na

célula hospedeira e na membrana do parasita (KRAUS et al., 2010).

3.5.2. Cruzaína

As proteinases do T. cruzi participam de diversos processos como a invasão

do parasita no hospedeiro, a migração do parasita pelas barreiras teciduais, a

degradação da hemoglobina e outras proteínas do sangue e na evasão do parasita

frente ao sistema imune do hospedeiro. Em decorrência das diferentes atividades

apresentadas por essas enzimas proteolíticas do T. cruzi, elas podem ser

consideradas como alvos interessantes no desenvolvimento de fármacos para o

tratamento da doença de Chagas.

As proteinases são classificadas de acordo com os resíduos que formam os

seus sítios catalíticos, sendo cisteíno proteinases, serino proteinases, treonino

peptidases, metalopeptidases e aspartato peptidases as principais enzimas

estudadas no desenvolvimento de inibidores para o T. cruzi. Inibidores de cisteíno e

de serino proteinases têm sido descritos, porém, as classes de metalopeptidases e

aspartato peptidases ainda não possuem inibidores reportados (GRZONKA et al.,

2001; DUSCHAK, 2011).

A atividade enzimática das cisteíno proteases está relacionada à presença

dos resíduos catalíticos de cisteína (Cys25), histidina (His162) e asparagina

(Asn182). Nas reações de hidrólise catalisadas por essas enzimas ocorre ataque

nucleofílico do ânion tiolato do resíduo cisteína no grupo carbonila da ligação

peptídica a ser hidrolisada, formando uma unidade intermediária S-acil (EAKIN et al.,

1992; GRZONKA et al., 2001).

No parasita T. cruzi a principal cisteína protease é a cruzipaína, uma

glicoproteína que pertence à superfamília das papaínas. A cruzaína (CRZ), obtida

por recombinação genética da cruzipaína, é constituída por 215 aminoácidos, sendo

a tríade catalítica formada pelos resíduos Cys25, His162 e Asn182 (Figura 10)

(EAKIN et al., 1992). De acordo Durrant e colaboradores (2010), o sitio ativo desta

enzima pode ser dividido em quatro subsítios (S) (Figura 10).

17

Diversos estudos relatam a importância dessa protease para a sobrevivência

do parasita, uma vez que é expressa em todos os estágios do ciclo de vida do

protozoário (CASTRO et al., 2011; MARTINEZ-MAYORGA et al., 2015). Na forma

tripomastigota, a CRZ está armazenada no bolso flagelar sendo secretada para

estimular a produção de quininas pró-inflamatórias, principalmente a bradicinina, que

após o reconhecimento pelos receptores bradicinina B2, desencadeia a mobilização

de Ca2+, facilitando a internalização do parasita (SILVA; PEREIRA; FERREIRA,

2016).

Após a invasão celular, o vacúolo parasitófago contendo a forma

tripomastigota se funde com lisossomos promovendo a diminuição do pH no interior

do fagossoma, desencadeando a diferenciação do T. cruzi na sua forma replicativa

amastigota (TOMLINSON et. al., 1995).

Após a transformação na forma amastigota, a CRZ fica ancorada na

superfície celular (MORAIS et. al., 2015), induzindo a expressão e ativação da

enzima arginase-1, resultando no aumento de capacidade fagocítica do macrófago,

e a liberação de citocinas IL-4, IL-10 e TGF-β, diminuindo as funções citotóxicas e

antimicrobianas, principalmente pela redução da produção de óxido nítrico,

resultando em um pH em torno de 5,5 (HAMANO et al, 2003; STEMPIN, et.al., 2010;

AOKI, et. al., 2012; GUIÑAZÚ, et. al., 2010; BRANQUINHA et al., 2015).

Devido as funções da CRZ na fisiologia e patologia do parasita, essa enzima

tem sido descrita como um promissor alvo terapêutico para o desenvolvimento de

novas substâncias para combater a doença de Chagas (CAZZULO; STOKA; TURK,

2001; ROGERS et al., 2012; FERREIRA et al., 2014).

No Protein Data Bank (PDB) encontram-se disponíveis diversas estruturas

da CRZ obtidas por difração de raios-X com diferentes ligantes, dentre as quais, o

complexto 4KLB (Figura 10) depositado no PDB e descrito em diversos estudos

(WIGGERS et al., 2013; MARTINEZ-MAYORGA et al., 2015; HOELZ et al., 2016).

18

Figura 10: Representação em “new cartoon” da estrutura cristalográfica da cruzaína (Protein Data Bank, código 4KLB), subsítios S1’-S4 (em vermelho) e a tríade catalítica composta pelos resíduos de aminoácidos cisteína 25 (Cys25), histidina 162 (His162) e asparagina 182 (Asn 182), amarelo = folhas-β; roxo = hélices-α; branco e ciano=alças.

Várias classes de compostos já foram descritos como inibidores da enzima

cruzaína de maneira irreversível (JACOBSEN; CHRISTIANS; BENET, 2000;

DUSCHAK; COUTO, 2009), ou de modo reversível (DU et al., 2002; MOTT et al.,

2010; WIGGERS et al., 2013; FERREIRA et al., 2014).

Alguns compostos descritos como inibidores, por interagirem com subsítios

da enzima por ligações não covalentes, são: tiossemicarbazonas (13), oxadiazóis

(14), hidrazonas (15,16) e até mesmo alguns antibióticos β-lactâmicos (17)

(MARTINEZ-MAYORGA et al., 2015; PALOS et al., 2017). Dentre estes, com

exceção do composto β-lactâmico, se evidencia a presença do subgrupo hidrazida

(RNH-N=CR’) nos compostos: 16, entre duas unidades arilas; na cadeia lateral dos

compostos 13 e 15, e internalizada no anel pirazol do composto 14. Nos compostos

13, 15 e 16 este subgrupo está diretamente ligado a uma subunidade de ligação

dupla entre carbono e enxofre ou nitrogênio (C=S ou C=N), conferindo a estes

compostos uma similaridade com a função carboidrazida (Figura 11).

19

Figura 11: Estrutura molecular de inibidores de cruzaína (13-17)

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1. Síntese Química

O monitoramento de todas as reações foi realizado por cromatografia em

camada fina (c.c.f), utilizando cromatofolhas de alumínio de Kiesegel 60F, espessura

de camada 0,2 mm (Merck-Darmstadt). Os eluentes foram preparados por mistura

de solventes volume à volume (v/v).

Os evaporadores rotativos foram utilizados para a remoção parcial de

solventes e para a remoção total de solventes foi utilizado um sistema de alto vácuo

com pressão variável. Os rendimentos foram calculados considerando o peso bruto

dos produtos obtidos nas reações.

A determinação dos pontos de fusão de todos os compostos foi efetuada em

aparelho Fisher-Johns e a análise de absorções na região do infravermelho foi

realizada em espectrofotômetro modelo FT-IR Spectrum Two™, da PerkinElmer,

usando pastilhas de brometo de potássio anidro. As análises por espectrometria de

massas de alta resolução foram conduzidas em espectrômetro de massas ESI-Q-

20

TOF (Bruker) usando ionização positiva, no Centro de Espectrometria de Massas de

Biomoléculas da UFRJ.

As análises espectroscópicas de Ressonância Magnética Nuclear (RMN)

foram realizadas em espectrômetro Varian VNMRS 500 MHz e 300 MHz do

Laboratório Multiusuário de Ressonância Magnética Nuclear do Instituto de Química

da UFF (LaReMN-IQ-UFF). Nas análises de RMN 1H e RMN 13C utilizou-se o

tetrametilsilano (TMS) como referência interna e os valores de deslocamento

químico referidos em parte por milhão (ppm) em relação ao TMS. As constantes de

acoplamento foram expressas em Hertz (Hz). Para auxiliar a identificação dos

compostos foram calculados os deslocamentos químicos teóricos, de acordo com

valores tabelados descritos na literatura (PRETSCH; BÜHLMANN;

BADERTSCHER, 2005). A identificação dos sinais nos espectros de RMN13C foi

auxiliada por Attached Proton Test (APT).

4.2. Ensaios Biológicos

Os ensaios biológicos foram realizados no Departamento de Análises

Clínicas, Toxicológicas e Bromatológicas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas

de Ribeirão Preto na USP. A atividade tripanocida dos novos compostos foi avaliada

frente à forma intracelular amastigota de clones B5 da cepa CL Brener do

Trypanosoma cruzi (BRENER, 1962).

Os ensaios contra as formas amastigotas intracelulares foram realizados em

células LLCMK2. As células foram previamente cultivadas em microplacas de 96

poços em meio RPMI (Roswell Park Memorial Institute). Após 2 horas, formas

tripomastigotas obtidas de uma cultura celular anterior foram adicionadas e

incubadas por 4 horas. Para a remoção dos parasitas extracelulares os poços foram

lavados com PBS (Phosphate-buffered Saline). Na sequência, os compostos

testados foram adicionados nas concentrações de 0,2, 2,0, 8,0 e 32 μM e a

microplaca incubada em atmosfera de CO2 a 37 °C, durante 72 horas.

O meio de cultura RPMI foi utilizado como controle negativo e o Benznidazol

como controle positivo. Os resultados foram expressos como IC50, calculados por

método de regressão linear.

21

Os ensaios de citotoxicidade foram realizados em células LLCMK2 em

microplacas de 96 poços usando teste de exclusão de Trypan Blue. As células foram

adicionadas a microplacas (103 células/poço) e mantidas na incubadora em

atmosfera de CO2 a 37 °C durante 2 horas. O perfil de citotoxicidade dos derivados

foi avaliado em 0,5, 2,0, 8,0 e 32 μM nas mesmas condições descritas acima

durante 72 horas. A solução Triton X de 10% (peso / volume) foi utilizada como

controle positivo e a solução de DMSO a 0,6% foi usada como controle negativo.

4.3. Modelagem Molecular

4.3.1. Construção da estrutura tridimensional dos compostos 21 e LQMed 41

As estruturas tridimensionais dos compostos 21 e LQMed 41 foram

construídas usando o programa Spartan’10 (Wavefunction, Inc.) (DEWAR et al.,

1985). A seguir, esses ligantes foram submetidos a uma análise conformacional pelo

método de Monte Carlo, em busca da conformação mais estável, usando o método

de mecânica molecular com campo de forças MMFF (HALGREN, 1996). As

conformações mais estáveis para cada ligante tiveram suas cargas atômicas parciais

calculadas pelo método Hartree-Fock com o conjunto de função de base 6-31+G(d),

disponível no programa Spartan’10.

4.3.2. Simulações de docking molecular

Para o estudo de ancoramento molecular, foi selecionada no banco de

dados Protein Data Bank (PDB) do Research Collaboratory for Structural

Bioinformatics (RCSB) (BERMAN et al., 2000) a estrutura cristalográfica, obtida por

difração de raios-X, da CRZ complexada com o ligante 1RV (PDB ID: 4KLB, R=2,62

Å) (WIGGERS et al., 2013). Esse complexo foi utilizado para validação do protocolo

de ancoramento (docking) molecular utilizando o método de redocagem molecular.

Para o ancoramento molecular, foi utilizado o programa Autodock4.2

(MORRIS et al., 2009), sendo que a preparação da proteína e do ligante foi realizado

utilizando a extensão Python Molecular Viewer do programa ADT (Autodock tools).

Para a proteína, foram adicionados os hidrogênios polares e as cargas dos átomos

foram assinaladas pelo método Kollman. O mapa de rede (grid) foi centrado no

átomo de enxofre do resíduo Cys25 (x: 32,549; y:4.48; z: -27,088), com

22

espaçamento de rede de 0,375 e dimensões 40x40x40. A afinidade e o potencial

eletrostático foram calculados para cada tipo de átomo do ligante.

A função de busca utilizada para o estudo de ancoramento molecular foi o

algoritmo genético (GA), utilizando os seguintes parâmetros: população de 600,

número máximo de 2500000 avaliações de energia, número máximo de 27000

gerações, mutações de 0,02, taxa de cruzamento (crossover) de 0,8 e número de

corridas de 50.

Após o ancoramento molecular, todas as estruturas geradas foram

separadas em agrupamentos (clusters) com base em uma tolerância de RMSD de

2Å a partir da estrutura de menor energia. Para identificar o melhor resultado,

considerou-se a pose de menor energia do maior cluster. A avaliação da interação

por ligação hidrogênio foi realizada utilizando o programa Discovery Studio 3.1

(“Discovery Studio 3.1”, 2010) e as figuras foram geradas no programa PyMOL

(DeLanoScientific).

4.3.3. Dinâmica Molecular

A pose de menor energia de cada derivado foi selecionada após o

ancoramento molecular para realizar as simulações de dinâmica molecular,

utilizando o programa GROMACS 5.1.4 (BERENDSEN, VAN DER SPOEL; VAN

DRUNEN, 1995; PRONK et al., 2013; VAN DER SPOEL et al., 2005) com o campo

de força AMBER (KAMINSKI et al., 2001).

Para os ligantes foram criados arquivos de topologia (.itp) utilizando o script

MKTOP (RIBEIRO; HORTA; ALENCASTRO, 2008) e as cargas atômicas parciais

utilizadas foram as calculadas no programa Spartan’10.

A protonação dos aminoácidos Aspartato, Glutamato e Histidina da proteína

foi calculada utilizando o servidor PDB2PQR, considerando o pH 5,5, que é o pH no

interior do macrófago infectado com o T. cruzi. Os complexos CRZ- ligante foram

inseridos e centralizados dentro de uma caixa periódica triclínica e solvatados com

moléculas de água do tipo TIP4P. A seguir, cada complexo foi neutralizado com oito

íons sódio. Os sistemas foram simulados em condições periódicas de contorno para

eliminar possíveis efeitos de superfície indesejáveis (NAMBA; SILVA; SILVA, 2008).

23

A seguir, os sistemas foram submetidos a etapas de minimização de

energia, usando os algoritmos de máximo declive com restrição de posição para os

ligantes/substrato (steepestdescent position restrained – stpr) e critério de

convergência de 1000 kJ.mol-1.nm-1, seguido por máximo declive sem restrição de

posição, e gradiente conjugado (conjugategradient - cg) até uma energia de 100

kJ.mol-1.nm-1.

Na etapa de termalização dos complexos minimizados, os sistemas foram

submetidos a duas simulações de Dinâmica Molecular (DM), considerando as

posições restritas para todo o sistema, exceto para as moléculas de água, à

temperatura de 300 K e pressão de 1 bar. Na primeira simulação, foram

considerados constantes o número de partículas, o volume e a temperatura

(conjunto canônico ou ensemble NVT). Na segunda etapa, o sistema foi considerado

isotérmico-isobárico (temperatura e pressão constantes ou ensemble NPT).

No controle da temperatura, utilizou-se o termostato V-rescale (BUSSI;

DONADIO; PARRINELLO, 2007) e no controle da pressão, utilizou-se o barostato

Parrinello-Rahman (PARRINELLO; RAHMAN, 1981). Além disso, todas as ligações

que envolvem átomos de hidrogênio no complexo foram congeladas usando o

algoritmo LINCS (Linear Constraint Solver; HESS et al., 1997). As interações

eletrostáticas a longa distância foram tratadas utilizando o algoritmo PME (Particle-

MeshEwald) (DARDEN; YORK; PEDERSEN, 1993; ESSMANN et al., 1995) e o raio

de corte aplicado para as interações de van der Waals e de Coulomb foi de 1 Å.

Após a termalização do sistema, realizaram-se simulações de DM durante

20 ns, considerando o ensemble NPT, sem qualquer restrição, usando tempo de

integração de 2 fs e um raio de corte para as interações a longa distância de 10 Å.

4.3.4. Análise dos resultados

Após a obtenção das trajetórias das simulações por dinâmica molecular,

utilizou-se de diferentes programas para a análise desses resultados. A análise do

desvio da raiz média quadrática (RMSD) foi realizada pelo módulo RMS disponíveis

no programa GROMACS 5.1.4 (BERENDSEN; VAN DER SPOEL; VAN DRUNEN,

1995; PRONK et al., 2013; VAN DER SPOEL et al., 2005).

24

Para a análise das ligações hidrogênio foi utilizado o módulo HBOND,

disponível no GROMACS 5.1.4, associado ao programa hbmap2grace (2009). O

programa Visual Molecular Dynamics (VMD) foi utilizado para visualização e

elaboração de figuras referentes às estruturas dos sistemas (HUMPHREY; DALKE;

SCHULTEN, 1996). Os gráficos de variação de RMSD formados ao longo das

simulações foram construídos no programa Grace (STAMBULCHIK, 1996). O cálculo

do tempo médio das ligações hidrogênio ao longo da simulação foi realizado

utilizando um script empregando a linguagem Python.

5. RESULTADOS E DISCUSSÕES

Em trabalhos anteriores do nosso grupo de pesquisa com derivados N-

benzilideno-carboidrazida do sistema 1H-pirazolo[3,4-b]piridina, constatou-se que a

inserção de diferentes substituintes na posição para- da porção benzilideno permitiu

modular a potência desses compostos quanto à atividade tripanocida. Nesse estudo,

o derivado para-hidróxi-benzilideno-carboidrazida (LQMed41) (Figura 12), mostrou a

melhor atividade tripanocida (DIAS et al., 2007) com IC50 4,25µM frente à forma

tripomastigota do T. cruzi, e estudos adicionais de relação estrutura-atividade

indicaram a necessidade do grupo fenil na posição C-6 para essa atividade

(SALVADOR et al., 2016). Esses dados nos conduziram a planejar novos derivados

N’-hidroxi-benzilideno-carboidrazida do sistema 1,6-difenil-3-metil-1H-pirazolo[3,4-b]

piridina, de maneira a avaliar a influência do grupo hidroxila em diferentes posições

do grupamento benzilideno na atividade antichagásica.

Figura 12: Estrutura molecular do composto LQMed41 e dos novos derivados (21-24) N-benzilideno

carboidrazida.

25

5.1. Síntese dos compostos intermediários: Derivados carbonilados do

sistema 1H-pirazolo[3,4-b]piridina

Compostos heterocíclicos nitrogenados contendo o grupamento N’-

benzilideno-carboidrazida geralmente são obtidos utilizando-se como intermediários

derivados carbonilados do anel heterocíclico em reação de interconversão de

grupamento funcional com hidrato de hidrazina, seguido de reação de adição-

eliminação com benzaldeídos, em meio etanólico e catálise ácida (DIAS et al., 1994,

2007; BERNARDINO et al., 2006; VERA-DIVAIO et al., 2009; MALVAR et al., 2014).

Por sua vez, os intermediários ésteres carboxílicos geralmente são obtidos na etapa

de síntese do heterocíclo ou por interconversão dos grupamentos funcionais nitrila e

ácido carboxílico (DIAS et al., 2007; VERA-DIVAIO et al., 2009; SALVADOR et al.,

2016).

Derivados ésteres do sistema 1-H-pirazolo[3,4-b]piridina tem sido

sintetizados em reações de ciclocondensação do tipo Guareschi-Thorpe entre

amino-pirazóis e espécies carboniladas 1,3-funcionalizadas (DIAS et al., 1994, 2007;

CHEBANOV et al., 2007; VOLOCHNYUK et al., 2010; SALVADOR et al., 2016).

Nesse sentido, o composto 1,6-difenil-3-metil-1-H-pirazolo[3,4-b]piridina-4-

carboxilato de etila (19) pode ser obtido a partir de 5-amino-3-metil-1-fenil-1H-pirazol

(18) em reação one-pot com piruvato de etila e benzaldeído (DIAS et al., 2007) ou

em reação com 4-fenil-2,4-dioxobutanoato de etila (VOLOCHNYUK et al., 2010;

SALVADOR et al., 2016) (Figura 13).

Devido a simplicidade de utilização e bom rendimento reacional, neste

trabalho optou-se pelo método que utiliza o composto 1,2,4-tricarbonilado (4-fenil-

2,4-dioxobutanoato de etila) na reação de ciclocondensação com 18, para obtenção

do derivado éster (19). As condições já relatadas para esta reação utilizam ácido

acético em temperatura de refluxo ou dimetilformamida (DMF) em temperatura de

banho maria (VOLOCHNYUK et al., 2010). Neste trabalho reproduzimos o método

convencional que utiliza o ácido acético como meio reacional e propomos um

método alternativo utilizando o glicerol (1,2,3-propanotriol).

Devido a característica de versatilidade como solvente em reações químicas

e de possuir constante dielétrica e polaridade próximas ao DMF (GARCÍA et al.,

2010; GARCÍA; GARCÍA-MARÍN; PIRES, 2014; OLIVEIRA et al., 2014), o glicerol foi

26

utilizado em substituição do DMF. Além disso, a utilização do glicerol minimiza

questões ambientais, uma vez que é obtido como principal resíduo da reação de

transesterificação de óleos vegetais na produção de biodiesel, biolubrificantes e

outros derivados de biomassa (CINTAS et al., 2014; TOBISZEWSKI; NAMIEŚNIK;

PENA-PEREIRA, 2017). O glicerol também possui características que o classificam

como solvente verde, possuindo alto ponto de ebulição, que proporciona redução da

emissão de vapores para a atmosfera, e de não gerar gases poluentes ao se

volatizar, como a maioria de solventes geralmente utilizados (GARCÍA; GARCÍA-

MARÍN; PIRES, 2014; OLIVEIRA et al., 2014).

Figura 13: Síntese dos derivados carbonilados do sistema 1,6-difenil-3-metil-1H-pirazolo[3,4-b]piridina

(19) e (20).

Comparando os dois métodos utilizados na obtenção do composto 1,6-

difenil-3-metil-1H-pirazolo[3,4-b]piridina-4-carboxilato de etila (19), observamos que

o método que utilizou glicerol forneceu o produto com menor grau de impureza

27

cromatográfica, visualizada em CCF sob luz ultravioleta (UV), sendo o produto

obtido com rendimento químico de 74% após recristalização em etanol.

Espectroscopia no infravermelho (IV) do composto 19 mostrou os sinais de

absorção em 1735 cm-1, referente a deformação axial de C=O, e em torno de 1243

cm-1, referente à deformação axial de C-O, compatíveis com a função éster

carboxílico.

A reação de interconversão do grupo funcional éster carboxílico do

composto 19 em carboidrazida 20, foi realizada através do método amplamente

disseminado na literatura científica que utiliza hidrazina monoidratada em condições

de temperatura de refluxo (DIAS et al., 1994, 2007; VERA-DIVAIO et al., 2009;

SALVADOR et al., 2016).

5.2. Síntese e caracterização dos derivados N’-benzilideno-carboidrazida

hidroxilados do heterociclo 1H-pirazolo[3,4-b]piridina.

A síntese dos novos compostos foi realizada pela reação de adição-

eliminação do composto intermediário (20) com os seguintes benzaldeídos

substituídos: 2-hidroxibenzaldeído, 3-hidroxibenzaldeído, 3,4-diidroxibenzaldeído, 3-

hidroxi-4-metóxi-benzaldeído. Os aldeídos foram escolhidos considerando o

potencial de interação por ligação de hidrogênio dos compostos-objetivo com o sítio

receptor do alvo biológico investigado, uma vez que esses grupos substituintes

possuem características de doadores e aceptores de ligação de hidrogênio.

Nesta etapa, o grupo carbonila dos derivados benzaldeídos sofre ataque

nucleofílico por uma de suas faces, si ou re, pelo grupo –NH2 da carboidrazida (20),

levando à formação de um intermediário dipolar instável. A formação deste

intermediário desencadeia uma reação ácido-base intramolecular em que o par de

elétrons do oxigênio aniônico captura o hidrogênio ionizável ligado ao nitrogênio

catiônico, resultando na formação de um aminoálcool. Em seguida, ocorre a captura

de um hidrogênio do meio reacional pela hidroxila e consequente perda de água, e o

par de elétrons não ligantes do nitrogênio é então deslocado formando uma dupla

ligação entre o nitrogênio e o carbono. A formação da ligação dupla C=N, presente

no grupamento N’-benzilideno-carboidrazida, pode resultar na obtenção de isômeros

geométricos Z e E (Figura 14).

28

Figura 14: Proposta de formação de isômeros geométricos dos derivados N'benzilideno-carboidrazida

a partir do composto 20.

Inicialmente, as reações do composto (20) com 3-hidroxibenzaldeído e 3,4-

diidroxibenzaldeído foram conduzidas utilizando etanol como meio reacional, sob

catálise ácida (ácido clorídrico) em temperatura de refluxo (DIAS et al., 1994, 2007;

VERA-DIVAIO et al., 2009), porém observou-se a formação de subprodutos. Por

outro lado, a realização dessas reações na ausência de catálise ácida ocorreu com a

formação de um único produto, embora tenha aumentado o tempo reacional de três

para seis horas, com o 3-hidroxibenzaldeído, e de duas para três horas, com o 3,4-

diidroxibenzaldeído. A reação com o 3-hidroxi-4-metóxi-benzaldeído também foi

realizada sem catálise ácida, no período de três horas.

Na tentativa de melhorar o rendimento reacional do composto (23), obtido

em 52%, o etanol foi substituído pelo glicerol como meio reacional, pois além de

possuir características de solvente verde também possui maior ponto de ebulição

(GARCÍA; GARCÍA-MARÍN; PIRES, 2014). A realização da reação em glicerol,

utilizando temperatura controlada de 110-120 °C elevou o rendimento químico do

composto (23) para 98% e reduziu o tempo reacional para duas horas (Tabela 2). O

29

aumento da temperatura possibilitada pelo uso do glicerol e também a maior

proporção do aldeído utilizado, contribuíram com esse resultado. Além disso, a

utilização do glicerol como meio reacional nessa reação facilita o isolamento do

produto, pois proporciona a dissolução dos reagentes benzaldeídos, enquanto que o

produto formado é precipitado nesse meio.

Devido ao resultado alcançado na síntese do composto (23), com o método

que utiliza glicerol como meio reacional, o mesmo método foi utilizado na síntese do

derivado N’-2-hidróxi-benzilideno-carboidrazida (21). O composto (21) foi então

obtido com o menor tempo reacional e com alto rendimento (Tabela 2). Da mesma

forma, os compostos (22) e (24) foram novamente sintetizados pelo método que

utiliza o glicerol como solvente, resultando em melhor rendimento na obtenção

desses compostos e redução do tempo reacional de 6h para 1h na obtenção do

composto (22) (Tabela 2).

Tabela 2: Condições reacionais e rendimento químico das sínteses dos derivados N’-benzilideno-

carboidrazida (21-24)

A elucidação estrutural dos derivados sintetizados foi efetuada pelos

seguintes métodos espectroscópicos: espectroscopia na região do infravermelho

(IV), espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) 1D (1H e 13C-APT) e

2D (HMBC e HSQC) e por espectrometria de massas de alta resolução (EMAR). A

medição do ponto de fusão de todos os compostos também foi efetuada.

Aldeído Solvente Estequiometria Tempo de

reação Rendimento Derivado

2-hidroxibenzaldeído Glicerol 1 (C)*: 2 (A)** 1h 96% 21

3-hidroxibenzaldeído Etanol 1 (C)*: 1 (A)** 6h 94%

22 Glicerol 1 (C)*: 2 (A)** 1h 99%

3,4-diidróxibenzaldeído Etanol 1 (C)*: 1 (A)** 3h 52%

23 Glicerol 1 (C)*: 2 (A)** 2h 98%

3-hidroxi-4-metóxi-benzaldeído

Etanol 1 (C)*: 1 (A)** 3h 79% 24

Glicerol 1 (C)*: 2 (A)** 3h 90%

* (C) carboidrazida (20)

** (A) aldeído utilizado na reação

30

Na espectroscopia de IV desses compostos (21-24) foram observados sinais

em torno de 1650 cm-1, 3200 cm-1 e 3300 cm-1, que foram relacionados aos

grupamentos carbonila, –NH e hidroxila, respectivamente.

Na análise dos espectros de RMN, cálculos dos deslocamentos químicos

dos núcleos 1H e 13C foram efetuados para direcionar o assinalamento dos sinais

nos respectivos espectros. Núcleos de 13C presentes nos anéis benzênicos

monossubstituídos tiveram o deslocamento químico calculado considerando a

fórmula δCi = 128.5 + Zi. Dessa forma, os núcleos C1’-6’, C1’’-6’’, C1’’’-6’’’ tiveram os

deslocamentos químicos calculados levando em consideração os diferentes

substituintes de cada anel benzênico presente nas estruturas dos compostos (21-

24), como exemplificado na figura 15. Os demais núcleos de 13C dos compostos (21-

24) também tiveram os valores de deslocamentos químicos calculados

considerando-se o efeito dos seus respectivos substituintes.

Figura 15: Cálculo para determinação dos deslocamentos químicos dos carbonos C1''-C4''

De forma semelhante, núcleos de 1H presentes nos anéis benzênicos

tiveram o deslocamento químico teórico calculado considerando a fórmula δHi = 7.34

+ Zi (tabela 3). Os cálculos realizados para obtenção dos deslocamentos químicos

dos hidrogênios H2’’-4’’ estão ilustrados na figura 16. Os demais núcleos de 1H dos

compostos (21-24) também tiveram os valores teóricos de deslocamentos químicos

calculados.

31

Figura 16: Cálculo para determinação dos deslocamentos químicos dos hidrogênios H2''-H4''.

Em seguida, os valores calculados obtidos foram tomados como referência e

auxiliaram na determinação dos núcleos de 1H e 13C quando comparados com os

deslocamentos químicos experimentais obtidos para os derivados N’-benzilideno

carboidrazida (21-24) (tabelas 3 e 4).

Os hidrogênios do sistema 1,6-difenil-1H-pirazolo[3,4-b]piridina dos novos

compostos (21-24) apresentaram deslocamentos químicos semelhantes. Conforme

esperado, somente os hidrogênios do grupo benzilideno apresentam diferenças nos

deslocamentos químicos em virtude do padrão diferenciado de substituição do

grupamento hidroxila (Tabela 3).

Nos quatro compostos foi observado o sinal do tipo singleto em δ 2,62 ppm

referente ao H8 (CH3). O sinal do tipo singleto referente ao H10 (NH) foi identificado

somente nos derivados 21 e 24 em δ 12,39 e δ 12,04 ppm, respectivamente. O

composto 24 foi o único derivado que apresentou um sinal do tipo singleto em δ 9,29

ppm, relacionado ao grupo OH. Os sinais com deslocamentos químicos entre δ 8,08

e 8,10 ppm foram atribuídos ao hidrogênio H5 de cada composto.

Os sinais observados na faixa de δ 8,31 - 8,36 ppm foram relacionados aos

deslocamentos químicos dos hidrogênios aromáticos H2’ e H6’, e os sinais com

deslocamentos químicos muito próximos na faixa de δ 7,57 - 7,63 ppm foram

relacionados aos hidrogênios H3’, H5’, H4’’, H3’’ e H5’’.

32

Os sinais entre δ 8,28 e 8,30 ppm foram atribuídos ao deslocamento dos

hidrogênios H2’’ e H6’’, e os sinais entre δ 7,32 e 7,38 ppm ao deslocamento do

hidrogênio H4’, demonstrando o mesmo padrão de comportamento com em relação

aos demais hidrogênios do sistema 1,6-difenil-1H-pirazolo[3,4-b]piridina.

O hidrogênio H12 apresentou maior variação de deslocamento entre os

quatro compostos, na faixa de δ 8,23 - 8,64 ppm. Tal diferença pode ser explicada

em virtude da proximidade desse hidrogênio com o anel aromático substituído com o

grupamento OH em diferentes posições, que promove uma variação na densidade

eletrônica, desencadeando maior ou menor blindagem do H12.

33

Tabela 3: Dados de RMN 1H (500 MHz DMSO) dos compostos 21-24 obtidos por experimentos de 1D

(1H) e deslocamentos químicos calculados. Deslocamentos químicos (δ) em ppm, relativos ao TMS, J

em Hz.

34

Para confirmar o assinalamento dos sinais, alguns núcleos de maior

relevância foram tomados para análise nos espectros de RMN 2D – HMBC

(Heteronuclear Multiple Bond Coherence) e HSQC (Heteronuclear Single Quantum

Coherence). Os espectros bidimensionais HMBC e HSQC foram editados com o eixo

horizontal correspondendo aos δH e o eixo vertical correspondendo aos δC (KAISER,

2000).

Os espectros de RMN 2D – HSQC permitem correlacionar hidrogênios e

carbonos com relação escalar (JC,H). Com essa técnica, foi possível identificar os

carbonos que possuem hidrogênios tomando como referência os núcleos 1H

previamente assinalados no RMN 1D - 1H.

O espectro de RMN 2D-HSQC auxiliou na determinação dos carbonos C2’’’

e C5 do composto (23), uma vez que os sinais de δ113,17 ppm e δ112,97 ppm

estão muito próximos no espectro de 13C-APT. Para isso, os deslocamentos dos

hidrogênios H2’’’ e H5 foram tomados como referência para auxiliar na determinação

dos respectivos carbonos C2’’’ e C5. O espectro demonstra o acoplamento do sinal

em δ7,32 ppm atribuído ao H2’’’, com o sinal em δ113,17 ppm. Portanto, este sinal

foi atribuído ao C2’’’ (Figura 17). Dessa forma, o sinal em δ112,97 ppm foi atribuído

ao C5, confirmando-se o acoplamento deste carbono com o hidrogênio H5 no

espectro RMN 2D-HSQC (Figura 18).

Figura 17: RMN 2D - HSQC do composto 23 evidenciando o acoplamento do hidrogênio H2''' com o

C2'''.

35

Em seguida, os carbonos C2’, C2’’ e C12 também foram assinalados no

RMN 2D-HSQC, tomando como referência os deslocamentos dos hidrogênios H2’,

H2’’, H12. Dessa forma, os seguintes acoplamentos foram evidenciados: δC 120,50

(C2’) e δH 8,34 (H2’); δC 127,37 (C2’’) e δH 8,30 (H2’’); δC 149,48 (C12) e δH 8,23

(H12); δC 112,97 (C5) e δH 8,08 (H5) (Figura 18).

Figura 18: RMN 2D - HSQC do composto 23 demonstrando o acoplamento dos hidrogênios H2', H2'',

H12 e H5 com os respectivos carbonos C2', C2'', C12 e C5.

Os deslocamentos dos hidrogênios H6’’’, H5’’’ e H2’’’ também foram

avaliados no espectro bidimensional RMN – HSQC para a determinação dos

carbonos C6’’’, C5’’’ e C2’’’. O sinal do duplo dubleto em δ7,01 ppm, referente ao

H6’’’, demonstrou acoplamento com o sinal em δ 120,84 ppm, sendo este atribuído

ao C6’’’. O sinal do dubleto em δ 6,83 ppm, referente ao H5’’’, demonstrou

acoplamento com o sinal em δ115,61 ppm, que foi então atribuído ao C5’’’. O

dubleto em δ 7,32 ppm referente ao H2’’’ demonstrou acoplamento com o sinal em

δ113,17 ppm sendo este atribuído ao C2’’’. O multipleto entre δ 7,63-7,57 referente

aos hidrogênios H3’, H3’’ e H4’ demonstrou acoplamento com os sinais em δ129,15,

36

δ128,96 e δ130,02 ppm, que foram atribuídos aos carbonos C3’, C3’’ e C4’’,

respectivamente. Finalmente, o sinal de tripleto em δ7,36 ppm demonstrou

acoplamento com o sinal em δ125,68 ppm, o qual foi atribuído ao C4’ (Figura 19).

Dessa forma, todos os carbonos do composto (23) que possuem hidrogênios foram

determinados.

Figura 19: RMN 2D - HSQC do composto 11 demonstrando o acoplamento dos hidrogênios H6’’’,

H5’’’, H2’’’, H3’, H3’’ e H4’ com os respectivos carbonos C6’’’, C5’’’, C2’’’, C3’, C3’’ e C4’.

O hidrogênio H8 em δ 2,62 ppm foi tomado como referência para

determinação dos carbonos C3 e C3a nos compostos (21) e (23) verificando-se o

acoplamento de longa distância esperado para esses núcleos no espectro RMN 2D-

HMBC. Tais acoplamentos foram confirmados nos espectros de RMN 2D – HMBC

dos compostos (21) (Figura 20) e (23) (Figura 21).

Análise dos espectros de RMN 2D-HMBC dos compostos (22) (Figura 22) e

(24) (Figura 23) também evidenciou o acoplamento de longa distância do H8 com os

carbonos C3 e C3a destes compostos.

37

Figura 20: RMN 2D - HMBC do composto 21 evidenciando o acoplamento de longa distância do H8

(CH3) com os carbonos C3 e C3a.

Figura 21: RMN 2D - HMBC do composto 23 evidenciando o acoplamento de longa distância do H8

(CH3) com os carbonos C3 e C3a.

38

Figura 22: RMN 2D - HMBC do composto 22 evidenciando o acoplamento de longa distância do H8

(CH3) com os carbonos C3 e C3a.

Figura 23: RMN 2D - HMBC do composto 24 evidenciando o acoplamento de longa distância do H8

(CH3) com os carbonos C3 e C3a.

39

No espectro RMN 2D – HMBC do composto 23 (Figura 24), o hidrogênio H2’’

foi avaliado para a determinação do carbono C6. O dubleto em δ 8,30 ppm, referente

ao H2’’, demonstrou acoplamento com o sinal de carbono em δ 156,18 ppm, que foi

então atribuído ao C6. Nesse espectro também pode-se evidenciar a duplicação do

sinal singleto relacionado ao H5, em δ 7,94 e 8,08 ppm. O singleto em δ 7,94

apresenta acoplamento com o sinal de carbono em δ 167,23 ppm, evidenciando o

acoplamento do sinal duplicado do carbono C9 com o sinal duplicado do hidrogênio

H5, ambos relativos ao isômero presente em menor proporção (Figura 24).

Figura 24: RMN 2D - HMBC do composto 23 demonstrando o acoplamento do hidrogênio H2'' com o

carbono C6.

40

Os carbonos C1’’’, C3’’’ e C4’’’ do grupamento benzilideno do composto 23

também foram determinados com o auxílio do espectro RMN 2D – HMBC (Figura

25), observando-se os acoplamentos com os hidrogênios H2’’’, H6’’’ e H5’’’. O sinal

em δ 148,30 ppm apresentou acoplamento com os hidrogênios H2’’’, H6’’’ e,

portanto, foi atribuído ao carbono C4’’’, pois este apresenta 3 ligações de distância

tanto para o H2’’’ como para o H6’’’ e tal acoplamento com esses 2 hidrogênios seria

esperado. O sinal em δ145,74 ppm apresentou acoplamento com o hidrogênio H5’’’,

sendo atribuído ao C3’’’, pois este apresenta 3 ligações de distância para o

hidrogênio H5’’’ justificando tal acoplamento. E o sinal em δ125,33 ppm apresentou

acoplamento com o hidrogênio H5’’’, sendo atribuído ao C1’’’, pois este apresenta 3

ligações de distância para o hidrogênio H5’’’.

Figura 25: RMN 2D - HMBC do composto 23 evidenciando os seguintes acoplamentos: δC 148,30

(C4''’) e δH 7,32 (H2’''); δC 145,74 (C3''’) e δH 6,83 (H5’''); δC 125,33 (C1''’) e δH 6,83 (H5’'').

41

Nos espectros de RMN1H e de RMN13C-APT dos compostos (21-24) foi

evidenciado o desdobramento de alguns sinais (Espectros 2, 8, 14 e 20) e as

análises de RMN 2D – HMBC auxiliaram a identificação dos sinais duplicados. A

duplicação de sinais nos espectros de RMN pode ser associada a presença de

isômeros E e Z desses compostos, devido a ligação N=CH do grupamento

benzilideno (SYAKAEV et al., 2006; LOPES et al., 2013). Outro fator também

associado a duplicação de sinais nos espectros de RMN seria a presença de

confôrmeros anti e sinperiplanar, em decorrência da ligação C(O)-N (LOPES et al.,

2013).

Nos espectros de RMN 2D – HMBC dos compostos 22 (Figura 26) e 24

(Figura 27) também foi possível evidenciar a duplicação dos sinais referentes ao

hidrogênio H10 e aos carbonos C9 e C12, ocasionada pela formação dos isômeros

E e Z na obtenção desses compostos. O acoplamento de longa distância do sinal

duplicado do hidrogênio H10 (NH) com os sinais duplicados dos carbonos C9 (C=O)

e C12(CH), ambos referentes ao isômero menos abundante corrobora a hipótese de

duplicação dos sinais em virtude da presença dos isômeros E e Z.

Figura 26: RMN 2D - HMBC do composto 22 evidenciando o acoplamento de longa distância do H10

com os carbonos C9 e C12. Em vermelho, os sinais duplicados do hidrogênio H10 e dos carbonos C9

e C12.

42

Figura 27: RMN 2D - HMBC do composto 24 evidenciando o acoplamento de longa distância do H10

com os carbonos C9 (C=O) e C12(CH). Em vermelho, os sinais duplicados do H10, C9 e C12.

Nos espectros bidimensionais (RMN 2D – HMBC) dos compostos N’-

benzilideno-carboidrazida hidroxilados (21-24), apenas o carbono C7a não

apresentou acoplamento, sendo seu deslocamento químico assinalado por exclusão.

Dessa forma, todos os sinais nos espectros de RMN 13C-APT foram assinalados

(Tabela 4).

43

Tabela 4: Dados de RMN 13C-APT (125 MHz DMSO) dos compostos 21-24 obtidos por experimentos

de 1D (APT). Deslocamentos químicos (δ) relativos ao TMS.

44

Análises de espectrometria de massas de alta resolução (EMAR ou HRMS)

complementaram a caracterização espectroscópica dos compostos 21-24. As

análises foram realizadas no modo positivo, sendo observados os respectivos íons

moleculares dos compostos (M+1): m/z 448,1766 (21), m/z 448,1766 (22), m/z

464,1715 (23), e m/z 478,1871 (24). Os compostos 22, 23 e 24 apresentaram o pico

do íon molecular com intensidade de 100%. Porém, o pico base do composto 21

(m/z 470,1587) foi relacionado ao M+Na, sendo o pico do íon molecular (M+1) o

segundo de maior intensidade (52%).

A análise da exatidão da massa, também conhecida como cálculo de erro

(E), foi calculada pela diferença entre a massa teórica (T) e a experimental (Exp),

expressa em parte por milhão (ppm), seguindo a definição (FERREIRA, 2012): E=

(T – Exp)/T x 106. Os cálculos indicaram que os compostos apresentaram grau de

pureza aceitável, como valores na faixa de E= 0,2154 - 0,6273 ppm.

Adicionalmente foi conduzida a fragmentação dos picos dos íons

moleculares dos compostos. Os resultados indicaram um padrão de fragmentação

em comum para esses compostos, com os seguintes picos de maior intensidade:

m/z 286,1338, m/z 329,1396 e m/z 327,1239 (Espectros 2, 8, 14 e 20).

O pico m/z 286,1338 foi a fragmentação de maior intensidade para todos os

compostos (Espectros 2, 8, 14 e 20), sendo este compatível com a perda do

grupamento fenilmetileno-carboidrazida. Os picos m/z 329,1396 e m/z 327,1239

apresentaram intensidade um pouco menores. O pico m/z 329,1396 é compatível

com a perda de um grupamento cianofenol formado por Rearranjo de McLafferty

(Figura 28).

45

Figura 28: Proposta das principais fragmentações dos compostos 21-24 na espectroscopia de massa.

5.3. Atividade Biológica

Os novos compostos sintetizados (21-24) foram submetidos a testes

biológicos para investigação da atividade antichagásica e de citotoxicidade in vitro,

visando a avaliação da influência do grupo hidroxila em diferentes posições do

grupamento benzilideno monosubstituído: 2-hidróxi- (21) e 3-hidróxi (22), e

disubstituídos: 3,4-dihidróxi (23) e 3-hidróxi,4-metóxi (24), em comparação com o

derivado 4-hidróxi (LQMed41) com atividade sobre a forma tripomastigota do

parasita T. cruzi (DIAS et al., 2007).

A atividade antichagásica foi investigada quanto a ação tripanocida dos

novos compostos 21-24 e do composto 4-hidróxi (LQMed41) frente à forma

intracelular amastigota do clone B5 da cepa CL Brener do T. cruzi, utilizando o

46

fármaco benznidazol como controle positivo. A citotoxicidade foi investigada

utilizando células de rim de Macaca mulatta (LLCMK2) como células de mamíferos

(Tabela 5).

Tabela 5: Atividade tripanocida frente à forma amastigota do T. cruzi (IC50), citotoxicidade (CC50) e

índice de seletividade (IS) dos novos compostos N’-benzilideno-carboidrazida (21- 24), LQMed 41 e

do fármaco benznidazol (BZD).

Composto R IC50a (µM) CC50

a (µM) ISb

21 2- OH 0,85 >200,00 >235,00

22 3-OH 23,18 69,59 3,00

23 3,4-di-OH 22,89 71,24 3,11

24 3- OH,4-OCH3 20,97 53,00 2,52

LQMed 41 4-OH 21,42 22595,00 1054,86

BZD ------ 3,98 >100,00 >25,12

a Média dos valores obtidos em duplicata; b IS = CC50/IC50

Os novos compostos di-substituídos (23 e 24) e o composto 3-hidróxi (22)

apresentaram o mesmo perfil de atividade tripanocida, com valores de IC50 entre

20,97 e 23,18 µM. Entretanto, esses compostos apresentaram baixos valores

citotoxicidade (Tabela 5), demonstrando serem muito pouco seletivos para ação

tripanocida desejada. O composto 4-hidróxi (LQMed 41) também apresentou

atividade sobre a forma amastigota, em concentração próxima a dos compostos 22 -

24 (Tabela 5). Porém, o composto (LQMed 41) não apresentou citotoxicidade,

demonstrando um alto índice de seletividade - uma medida para avaliar o quanto o

composto se apresenta ativo contra o parasita, sem causar danos a célula

hospedeira (CHATELAIN, 2015).

Por outro lado, o composto 2-hidróxi (21) apresentou o melhor perfil de

atividade contra a forma amastigota (IC50 = 0,85 µM) e um bom índice de

seletividade (IS > 235), sendo mais potente e menos tóxico que o fármaco

benznidazol nos testes realizados. Em comparação com o composto 4-hidróxi

(LQMed 41), o composto 21 apresentou uma potência 25 vezes maior (Tabela 5).

Esses resultados evidenciam a importância da posição do substituinte hidroxila no

47

grupamento N’-benzilideno-carboidrazida para atividade tripanocida contra a forma

intracelular amastigota.

5.4. Modelagem Molecular dos compostos 21 e LQMed 41

5.4.1. Análise conformacional

Visando obter informações sobre o modo de ação dos derivados 2-hidróxi

(21) e 4-hidróxi (LQMed 41) contra a forma amastigota do T. cruzi, foram realizados

estudos de modelagem molecular para análise do isômero e confôrmero mais

estáveis e simulação de ancoramento (docking) molecular no sítio ativo da enzima

cruzaína, sendo este um possível alvo para essa classe de compostos.

A análise conformacional de 21 e LQMed 41 considerou os dois possíveis

isômeros (E e Z) desses compostos. A partir das estruturas de ambos isômeros,

foram considerados 5 ângulos diedros, analisados pelo método semi-empírico RM1,

que resultaram em 72 conformações possíveis para cada isômero (Figura 29).

Figura 29: Ângulos diedros analisados na análise conformacional dos isômeros E e Z dos compostos

21 e LQMed 41.

A análise conformacional do composto 21 identificou 31 conformações do

isômero E e 65 conformações do isômero Z, enquanto do composto LQMed 41

foram identificados 27 confôrmeros do isômero E e 24 confôrmeros do isômero Z,

correspondendo a mais de 90% da população, com uma diferença de energia de até

10 KJ/mol (aproximadamente 3 kcal/mol) acima do mínimo local, isto é, os

confôrmeros mais estáveis.

R = 2-OH ou 4-OH

48

Os confôrmeros identificados para cada isômero dos compostos 21 e

LQMed 41 foram submetidos a cálculos de otimização de geometria, considerando o

método Hartree-Fock com o conjunto de função de base 6-31+G(d). O isômero E do

composto 21 apresenta 3 confôrmeros representativos da população obtida na

análise conformacional. A principal diferença entre os confôrmeros é apresentada

pelo grupo -C(O)NH- que assume a conformação anti como sendo preferencial

(66,6%). Entretanto, a conformação do grupo fenilmetileno se mantém constante nos

confôrmeros syn- e anti-, devido a uma interação por ligação hidrogênio

intramolecular (Figura 30).

Figura 30: Confôrmeros do isômero E do composto 21. (A) Conformações syn (A1) e anti (A2), em

destaque o grupo -C(O)NH-; (B) Representação esquemática de ligação hidrogênio intramolecular do

grupo 2-hidróxifenil.

Por outro lado, o isômero Z do composto 21 apresenta duas conformações

que são representativas da população de conformações obtidas da análise

conformacional, e o grupo -C(O)NH- apresenta preferencialmente a conformação

syn, enquanto a conformação do grupo fenilmetileno assume conformações

diferentes, o que pode ser associado a ausência da ligação hidrogênio

intramolecular nesse isômero (Figura 31).

49

Figura 31: Sobreposição dos confôrmeros do isômero Z do composto 21, destacando o grupo -

C(O)NH- em conformação syn.

Utilizando o método Hartree-Fock foram calculados 13 confôrmeros do

isômero E e 4 confôrmeros do isômero Z do composto LQMed 41, que

correspondem a 98,3% e 95,7%, respectivamente da população identificada pela

análise conformacional.

A diferença de energia de 7,7 e 4,9 kcal/mol entre os isômeros E e Z dos

compostos 21 e LQMed 41, respectivamente, indicam o isômero E como

preferencialmente presente. Estes dados corroboram com o descrito na literatura

(AYDIN et al, 2014; SARIGÖL et al, 2015).

5.4.2. Ancoramento (docking) molecular

Sendo a cruzaína uma cisteína protease essencial no ciclo de vida do T.

cruzi, essa enzima foi avaliada como possível alvo biológico dos compostos 21 e

LQMed 41 no estudo de simulação da interação enzima-ligante, conhecida como

ancoramento ou docking molecular (SHOICHET, 2004). O protocolo deste estudo foi

validado por redocagem (re-docking), com o objetivo de recuperar, a partir da

simulação computacional, a posição original de um ligante presente em uma

estrutura cristalográfica de um complexo binário proteína-ligante (HEVENER et al.,

2009).

Foi utilizado como ligante o inibidor catalogado no Protein Data Bank (PDB)

sob o código 1RV (WIGGERS et al., 2013), co-cristalizado com a enzima cruzaína

(CRZ), sendo o complexo enzima-ligante, catalogado no PDB com código 4KLB.

(HOELZ et al., 2016). O resultado obtido foi similar ao descrito por Barreto (2017),

onde o valor de RMSD entre a pose do ligante co-cristalizado e a pose predita no

50

“re-docking” foi igual a 0,68 Å, indicando que o algoritmo e os parâmetros utilizados

são confiáveis (MUKHERJEE; BALIUS; RIZZO, 2010).

Em seguida, os complexos de menor energia entre a enzima CRZ e os

isômeros E dos compostos 21 e LQMed 41, obtidos pelo protocolo de docking

molecular validado, foram selecionados para análise. Para facilitar a discussão das

interações observadas entre os compostos ligantes (21 e LQMed 41) e a enzima

CRZ, o sítio de ligação foi dividido em 4 regiões, denominadas: subsítio S1’: Gln19,

Ala141, Met145, Asp161, His162, Trp184; subsítio S1: Gly23, Cys25, Trp26, Cys63,

Gly65; subsítio S2: Gly66, Leu67, Met68, Asn70, Ala138,Gln159, Leu160, Glu208 e

subsítio S3: Asp60, Ser61, Ser64, Thr59 (Figura 32).

No docking molecular observamos que os isômeros E dos compostos 21 e

LQMed 41 são ambos capazes de interagir com subsítios do sítio catalítico da

enzima CRZ, por ligações de hidrogênio com os seus respectivos grupos hidroxila.

Entretanto, a hidroxila situada na posição orto- do grupo fenilmetileno (21) faz duas

interações com o resíduo Gly66 no subsítio S3, enquanto que a hidroxila situada em

para- (LQMed 41) pode fazer ligações de hidrogênio com os resíduos Asp60 e

Asn70 (Figura 32).

Figura 32: Sitio de ligação da enzima CRZ, dividido nos subsítios S1’ (vermelho), S1 (roxo), S2 (azul)

e S3 (amarelo) complexado com o isômero E dos compostos 21 (A) e LQMed 41 (B). As linhas

pontilhadas representam as ligações de hidrogênio.

51

5.4.3. Simulação por Dinâmica Molecular

Os complexos obtidos no estudo de docking molecular foram utilizados como

estrutura de partida para as simulações de dinâmica molecular, com objetivo de

avaliar as interações intermoleculares quando o ligante e a enzima possuem

liberdade conformacional na presença de moléculas de água.

5.4.3.1. Análise do desvio da raiz média quadrática, flutuação quadrática média e

raio de giro da enzima cruzaína

Ao compararmos os valores do desvio quadrático médio de todos os átomos

de carbono-alfa (C-RMSD) da CRZ em relação às estruturas de partida,

observamos que os dois sistemas atingem a estabilidade com aproximadamente 3

ns de simulação, apresentando valores de RMSD entre 0,5 e 1,5 Å (Figura 33).

Figura 33: (A) Desvio quadrático médio (RMSD) dos átomos de carbono alfa da cruzaína (CRZ) nos

sistemas CRZ-isômero E do composto 21 (linhas pretas) e CRZ-isômero E do LQMed 41 (linhas

vermelhas).

Adicionalmente, para analisar a estabilidade da estrutura da CRZ em cada

segmento, calculamos as flutuações quadráticas médias de todos os átomos de

carbono alfa (C-RMSF) ao longo dos últimos 10 ns de simulação (Figura 34A).

52

Com o composto 21 observamos aumento de mobilidade (RMSF > 1,0 Å) em todos

os subsítios, principalmente para os resíduos Met145 (subsítio S1’), Cys63 e Gly65

(subsítio S1), Gly66, Leu67 e Met68 (subsítio S2), Asp60, Ser61 e Ser64 (subsítio

S3). Entretanto, a presença do composto LQMed 41 como ligante no sitio ativo da

enzima CRZ não ocasionou variações significativas (RMSF < 1,0 Å) para os

resíduos dos subsítios.

Além disso, a análise do raio de giro (Rg) da CRZ com esses compostos (21

e LQMed 41) mostra valores entre 16,0 e 16,4 Å, ao longo dos 20 ns de simulação

por dinâmica molecular (Figura 34B). De modo generalizado, o complexo composto

21-CRZ apresenta uma baixa compactação da sua estrutura secundária, ou seja,

apresenta mais alças do que α-helice ou folhas-β (Rg entre 16,3 e 16,4 Å), o que

pode estar associado a maior mobilidade (RMSF > 1,0 Å) dos resíduos dos subsítios

descritos na analise de RMSF.

Figura 34: Avaliação dos complexos composto 21-CRZ e LQMed 41-CRZ. (A) Gráfico da flutuação

quadrática média dos átomos de carbono-alfa (Cα-RMSF) durante os últimos 10 ns de simulação por

dinâmica molecular; (B) Gráfico do Raio de giro (Rg) da enzima CRZ nos complexos.

53

5.4.4. Análise das interações por ligações de hidrogênio

A análise das interações dos compostos 21 e LQMed 41 com a cruzaína

demonstrou que eles seriam capazes de interagir por ligação hidrogênio,

principalmente, com os resíduos dos subsítios S1’ (Asp161) e S2 (Gly66, Leu67,

Gln159 e Leu160) (Figura 35 Figura 36). Ressalta-se que o resíduo Gly66 também

foi descrito na literatura como ponto de interação do ligante 1RV da série NEQ de

inibidores não covalentes (WIGGERS et al., 2013).

Na simulação com o composto 21 foram observadas com os resíduos Gly66,

Leu67, Gln159, Leu160 e Asp161 (Figura 35). As interações com tempo de vida

superior a 10% ocorrem entre -NH (N4) e o oxigênio de carbonila da cadeia principal

de Leu160, o nitrogênio da cadeia principal do resíduo Gly66 e o nitrogênio do anel

piridina (N3) e entre o nitrogênio E2 do resíduo Gln159 e o oxigênio carbonila do

grupo carboidrazida (O1), com persistências de 20,74, 13,47 e 10,55 %,

respectivamente. Também é possível observar interações com baixo tempo de vida

(< 10%) com os resíduos Leu67, Gln159 e Asp161, que auxiliam na manutenção do

composto dentro do sítio ativo.

Já na simulação com o composto LQMed 41 foram observadas interações

dos grupos carbonila (O1) e hidroxila (O2) com Ser61, Gln159 e Asp60 (Figura 36).

O1 realiza interação com Gln159 do subsítio S2 (tempo de vida = 17.70 %) e O2

realiza duas interações por ligação hidrogênio com Ser61 do subsítio S3, atuando

como aceptor de ligação hidrogênio (tempo de vida = 43.21 e 65.56 %) e com Asp60

(tempo de vida = 13.10 %), atuando como doador de ligação hidrogênio.

Comparando os resultados de simulação por ancoramento (docking) e

dinâmica molecular, podemos observar a importância da variação estrutural relativa

a posição do substituinte hidroxila do ligante no complexo CRZ-ligante, o que

permite o surgimento de novas interações que são importantes para entender a

atividade biológica.

54

A

B

Figura 35: Interações por ligação hidrogênio entre a cruzaína e o isômero E do composto 21, durante

os 20 ns de simulação por dinâmica molecular (A) e a estrutura representativa das principais

interações por ligação hidrogênio (B).

1

2

3

4

51

2

55

(A)

(B)

Figura 36: Interações por ligação hidrogênio entre a cruzaína e o isômero E do composto LQMed 41,

durante os 20 ns de simulação por dinâmica molecular e a estrutura representativa das principais

interações por ligação hidrogênio.

56

6. CONCLUSÕES

Os novos derivados hidroxilados do sistema N’-fenilmetilideno-3-metil-1,6-

difenil-1H-pirazolo[3,4-b]piridina-4-carboidrazida foram sintetizados em rendimentos

variáveis, conforme as condições reacionais e reatividade dos aldeídos utilizados. As

reações tanto de obtenção do composto intermediário 1,6-difenil-3-metil-1-H-

pirazolo[3,4-b]piridina-4-carboxilato de etila quanto dos produtos finais, realizadas

utilizando o glicerol como meio reacional, proporcionaram a obtenção dos produtos

em menor tempo reacional e bons rendimentos químicos, além de facilitar o

procedimento de isolamento.

Os novos compostos foram caracterizados pela combinação das técnicas

espectroscópicas na região do infravermelho, ressonância magnética nuclear

unidimensional (RMN1H e 13C-APT) e bidimensional (HMBC e HSQC), e

espectrometria de massas de alta resolução.

Avaliação em ensaios in vitro dos derivados hidroxilados quanto a

citotoxicidade sobre células de mamíferos, demonstrou que a monosubstituição com

hidroxila no grupamento fenilmetilideno em orto- (21) e em para- (LQMed 41)

resultou em compostos com baixa citotoxicidade, inferior a apresentada pelo

fármaco benznidazol. Entretanto o melhor perfil de atividade tripanocida frente às

formas amastigotas do T. cruzi foi demonstrado pelo composto 21 (orto-substituído),

com IC50 0,85 µM, sendo cerca de 24 vezes mais ativo do que o LQMed 41 e 4

vezes mais ativo que o benznidazol.

Os estudos de modelagem molecular demonstraram o isômero E como o

mais predominante dos compostos 21 e LQMed 41, e os resultados de simulação

molecular demonstraram que estes são capazes de realizar interações por ligação

de hidrogênio com subsítios do sítio ativo da enzima cruzaína do T. cruzi,

demonstrando que este pode ser um alvo biológico para esses compostos.

Os resultados alcançados indicam o composto 21 como o mais promissor da

série, sendo selecionado para posterior avaliação biológica em testes in vivo. Outra

perspectiva de estudo é a separação doa isômeros E e Z, observada nas análises

espectroscópicas, e posterior avaliação biológica dos isômeros isolados.

57

7. EXPERIMENTAL

7.1. Metodologia Sintética

7.1.1. Procedimento para obtenção do composto 4-(1,6-difenil-3-metil-1H-

pirazolo[3,4-b]piridina) carboxilato de etila (19).

Em um balão de fundo redondo foi colocado 0,5 g (2,8 mmol) do composto

5-amino-1-fenil-3-metil-1H-pirazol (18) e 12 mL de glicerol. A mistura foi aquecida à

temperatura de 80 °C, permanecendo sob agitação magnética até dissolução. Em

seguida, adicionou-se 0,616 g (2,8 mmol) do composto 2,4-dioxo-4-fenilbutanoato de

etila. O meio reacional foi então mantido sob agitação magnética e temperatura de

110-120°C por 3 horas. O término da reação foi observado por c.c.f. (eluente:

mistura 1:1 (v/v) de hexano e acetato de etila). O isolamento do produto foi realizado

por concentração do solvente, e posterior adição de água gelada. Após precipitação,

o sólido obtido foi filtrado à vácuo e seco em dessecador, sendo posteriormente

purificado por recristalização em etanol. O produto foi obtido como sólido amarelo,

em rendimento de 74%, com ponto de fusão de 129-131 °C.

Análise Espectroscópica:

IV (KBr, ν cm-1): 1735 (C=O), 1243 (C-O). De acordo com a literatura (DIAS et al.,

2007).

58

7.1.2. Procedimento para obtenção do composto 4-carboidrazida-1,6-difenil-3-metil-

1H-pirazolo[3,4-b]piridina (20).

Em um balão de fundo redondo foi colocado 0,6 g (1,68 mmol) do derivado

éster (19) e 20 mL de metanol. A mistura foi aquecida à temperatura de cerca de

50°C, permanecendo sob agitação magnética até dissolução. Após completa

dissolução, adicionou-se 7 mL de hidrazina monoidratada e manteve-se o meio

reacional sob agitação e temperatura de refluxo por 2 horas. O término da reação foi

observado por c.c.f. (eluente: mistura de 1:1 (v/v) de hexano e acetato de etila). O

isolamento do produto foi realizado por concentração do solvente, e posterior adição

de água gelada. O sólido obtido foi filtrado à vácuo e seco em dessecador, e

posteriormente purificado por recristalização em etanol. O produto foi obtido como

sólido amarelo claro, em rendimento de 95%, com ponto de fusão de 218-220 °C.

Análise Espectroscópica:

IV (KBr, ν cm-1): 3300 (N-H), 1650 (C=O). De acordo com a literatura (DIAS et al.,

2007).

59

7.1.3. Procedimento geral para obtenção dos derivados 4-(N'-benzilideno)-

carboidrazida-1,6-difenil-3-metil-1H-pirazolo[3,4-b]piridina (21 – 24)

METODO A

Em um balão de fundo redondo foi colocado o derivado carboidrazida (20) e

10 mL de etanol absoluto. A mistura foi aquecida a 50 ºC permanecendo sob

agitação magnética até dissolução. Após dissolução, adicionou-se quantidade

equimolar do benzaldeído correspondente, mantendo a mistura reacional sob

agitação magnética e temperatura de refluxo. A formação dos produtos foi

visualizada por c.c.f (eluente: mistura de 1:1 (v/v) de hexano e acetato de etila),

sendo os derivados N’-benzilideno-carboidrazida (21-24) obtidos em tempos

variáveis de 1 a 6 horas. O isolamento dos produtos foi efetuado por concentração

do solvente, vertendo posteriormente sobre água gelada. O sólido obtido foi filtrado

por filtração a vácuo e seco em dessecador. Os produtos foram obtidos como

sólidos, com tonalidades de amarelo claro a escuro, em rendimentos de 50 - 95%.

Todos os produtos foram purificados por recristalização em etanol.

METODO B

Em um balão de fundo redondo foi colocado o derivado carboidrazida (20) e

10 mL de glicerol. A mistura foi aquecida a 50 ºC permanecendo sob agitação

magnética até dissolução. Após dissolução, adicionou-se o benzaldeído

correspondente na proporção de 2(Benzaldeído):1(Carboidrazida), mantendo a

mistura reacional sob agitação magnética e temperatura na faixa de 110-120 ºC. A

formação dos produtos foi visualizada por c.c.f (eluente: mistura de 1:1 (v/v) de

60

hexano e acetato de etila), sendo os derivados N’-benzilideno-carboidrazida (21-24)

obtidos em tempos variáveis de 1 a 3 horas. O isolamento dos produtos foi efetuado

vertendo a mistura reacional sobre água gelada. O sólido obtido foi filtrado por

filtração a vácuo e seco em dessecador. Os produtos foram obtidos como sólidos,

com tonalidades de amarelo claro a escuro, em rendimentos de 68 - 96%. Os

produtos foram purificados por recristalização em etanol.

4-(N'-(2-hidroxifenil)metilideno)carboidrazida-1,6-difenil-3-metil-1H-pirazolo[3,4-

b]piridina (21)

Sólido amarelo, rendimento de 96% (método B). Ponto de fusão: 253-254°C / 256-

257°C.

Análise Espectroscópica:

IV (KBr, ν cm-1): 3200 (N-H), 1648 (C=O)

RMN 1H (500 MHz) DMSO/TMS (δ ppm): 2,62 (s, 3H, H8); 12,39 (s, 1H, H10); 8,64

(s, 1H, H12); 8,1 (s, 1H, H5); 8,31 (dd, 2H, J=1 Hz; J=8,5 Hz, H2’); 7,63-7,57 (m, 6H,

H3’, H3’’, H4’’, H6’’’); 8,28 (dd, 2H, J=8,5 Hz; J=1,5 Hz, H2’’); 7,37 - 7,32 (m, 2H, H4’,

H4’’’); 6,98 - 6,93 (m, 2H, H3’’’, H5’’’).

RMN 13C-APT (125 MHz) DMSO/TMS (δ ppm): δ C-3 142,18; δ 111,61 C-3a; δ

137,73 C-4; δ 113,27 C-5; δ 156,3 C-6; δ 151,09 C-7a; δ14,32 C8 (CH3); δ 161,56

C9 (C=O); δ 149,25 C12; δ 138,88 C-1'; δ 120,63 C-2'; δ 129,25 C-3'; δ 124,8 C-4'; δ

138,1 C-1''; δ 127,38 C-2''; δ 129,17 C-3''; δ 128,99 C-4''; δ 118,59 C-1'''; δ 157,43 C-

2'''; δ 116,5 C-3'''; δ 131,86 C-4'''; δ 120,34 C-5'''; δ 130,09 C-6'''.

4-(N'-(3-hidroxifenil)metilideno)carboidrazida-1,6-difenil-3-metil-1H-pirazolo[3,4-

b]piridina (22)

Sólido amarelo claro, rendimento de 94% (método A) e 99% (método B). Ponto de

fusão: 240-242°C / 246-247°C.

Análise Espectroscópica:

IV (KBr, ν cm-1): 3331,5 (O-H), 3252,66 (N-H), 1666 (C=O)

RMN 1H (500 MHz) DMSO/TMS (δ ppm): 2,62 (s, 3H, H8); 8,35 (s, 1H, H12); 8,1

(s,1H, H5); 8,35 (dd, 2H, J=1 Hz, J=9 Hz, H2’); 7,63 - 7,58 (m, 5H, H3’, H3’’, H4’’);

61

8,31 (d, 2H, J=8,5 Hz, H2’’); 7,37 (t, 1H, J=7,5 Hz, H4’); 7,28 (sl, 1H, H2’’’); 6,89 (ddd,

1H, J=0,5Hz; J=2Hz, J=8Hz H4’’’); 7,29 (t, 1H, J=7,5Hz, H5’’’), 7,17 (d, 1H, J=7,5Hz,

H6’’’).

RMN 13C-APT (125 MHz) DMSO/TMS (δ ppm): δ 142,05 C-3; δ 111,56 C-3a; δ

137,68 C-4; δ 113,08 C-5; δ 156,13 C-6; δ 150,97 C-7a; δ 14,32 C8 (CH3); δ 161,54

C9 (C=O); δ 149,17 C12; δ 138, 83 C-1'; δ120,43 C-2'; δ 129 C-3'; δ 125,58 C-4'; δ

138,5 C-1''; δ 127,26 C-2''; δ128,83 C-3''; δ129,74 C-4''; δ135,06 C-1'''; δ112,9 C-2''';

δ156,13 C-3'''; δ117,7 C-4'''; δ129,9 C-5'''; δ120,44 C-6'''

4-(N'-(3,4-diidroxifenil)metilideno)carboidrazida-1,6-difenil-3-metil-1H-

pirazolo[3,4-b]piridina (23)

Sólido amarelo escuro, rendimento de 52% (método A) e 98% (método B). Ponto de

fusão: 209-211°C / 238-240°C.

Análise Espectroscópica:

IV (KBr, ν cm-1): 3433,35 (O-H), 3349,73 (O-H), 3183,05 (N-H), 1643 (C=O)

RMN 1H (500 MHz) DMSO/TMS (δ ppm): 2,62 (s, 3H, H8); 8,23 (s, 1H, H12); 8,08 (s,

1H, H5); 8,34 (d, 2H, J=8 Hz, H2’); 7,63 - 7,57 (m, 5H, H3’, H3’’, H4’’); 8,30 (d, 2H;

J=7,5 Hz, H2’’); 7,36 (t, 1H, J=7,5 Hz, H4’); 7,32 (d, 1H, J=2, H2’’’); 6,83 (d, 1H,

J=8Hz, H5’’’); 7,01 (dd, 1H, J=2, J=8,5Hz, H6’’’).

RMN 13C-APT (125 MHz) DMSO/TMS (δ ppm): δ142,19 C-3; δ111,73 C-3a; δ137,78

C-4; δ112,97 C-5; δ156,18 C-6; δ151,04 C-7a; δ14,33C8 (CH3); δ161,28 C9 (C=O);

δ149,48 C12; δ138,9 C-1'; δ120,5 C-2'; δ129,15 C-3'; δ125,68 C-4'; δ138,93 C-1'';

δ127,37 C-2''; δ128,96 C-3''; δ130,02 C-4''; δ125,33 C-1'''; δ113,17 C-2'''; δ145,73 C-

3'''; δ148,3 C-4'''; δ115,61 C-5'''; δ120,84 C-6'''.

4-(N'-(3-hidróxi-4-metóxifenil)metilideno)carboidrazida-1,6-difenil-3-metil-1H-

pirazolo[3,4-b]piridina (24)

Sólido amarelo, rendimento de 79% (método A) e 90% (método B). Ponto de fusão:

223-225°C / 247-248°C.

62

Análise Espectroscópica:

IV (KBr, ν cm-1): 3391,59 (O-H), 3208,57 (N-H), 1651,75 (C=O), 1601,01 (C=N), 1505

(C=C).

RMN 1H (500 MHz) DMSO/TMS (δ ppm): 2,62 (s, 3H, H8); 12,04 (s, 1H, H10); 8,28

(s, 1H, H12); 8,1 (s, 1H, H5); 8,36 (dd, 2H, J=1 Hz, J=9 Hz, H2’); 7,63 - 7,58 (m, 5H,

H3’, H3’’, H4’’); 8,30 (dd, 2H, J=1 Hz, J=8,5 Hz, H2’’); 7,38-7,34 (m, 2H, H4’’, H2’’’);

7,01 (d, 1H, J=8,5, H5’’’); 7,13 (dd, 1H, J=2; J=8,5; H6’’’); 9,29 (s,1H, OH); 3,84 (s,

3H, OCH3).

RMN 13C-APT (125 MHz) DMSO/TMS (δ ppm): δ142,06 C-3; δ111,61 C-3a; δ137,66

C-4; δ113,08 C-5; δ156,06 C-6; δ150,93 C-7a; δ14,24 C8 (CH3); δ161,26 C9 (C=O);

δ149,03 C12; δ138,83 C-1'; δ120,39 C-2'; δ129,03 C-3'; δ125,56 C-4'; δ138,7 C-1'';

δ127,29 C-2''; δ128,84 C-3''; δ129,9 C-4''; δ126,64 C-1'''; δ111,84 C-2'''; δ146,83 C-

3'''; δ149,99 C-4'''; δ112,48 C-5'''; δ120,44 C-6'''; δ55,49 OCH3).

63

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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73

9. APÊNDICE

ESPECTRO 1 IV do composto 21

ESPECTRO 2 EMAR do composto 21

ESPECTRO 3 RMN 1H do composto 21

ESPECTRO 4 RMN 13C-APT do composto 21

ESPECTRO 5 RMN 2D – HSQC do composto 21

ESPECTRO 6 RMN 2D – HMBC do composto 21

ESPECTRO 7 IV do composto 22

ESPECTRO 8 EMAR do composto 22

ESPECTRO 9 RMN 1H do composto 22

ESPECTRO 10 RMN 13C-APT do composto 22

ESPECTRO 11 RMN 2D – HSQC do composto 22

ESPECTRO 12 RMN 2D – HMBC do composto 22

ESPECTRO 13 IV do composto 23

ESPECTRO 14 EMAR do composto 23

ESPECTRO 15 RMN 1H do composto 23

ESPECTRO 16 RMN 13C-APT do composto 23

ESPECTRO 17 RMN 2D – HSQC do composto 23

ESPECTRO 18 RMN 2D – HMBC do composto 23

ESPECTRO 19 IV do composto 24

ESPECTRO 20 EMAR do composto 24

ESPECTRO 21 RMN 1H do composto 24

ESPECTRO 22 RMN 13C-APT do composto 24

ESPECTRO 23 RMN 2D – HSQC do composto 24

ESPECTRO 24 RMN 2D – HMBC do composto 24

74

Espectro 1 - Espectro de Infravermelho do derivado 21

75

Espectro 2 - Espectro de Massas de Alta Resolução do derivado 21

76

Espectro 3 - Espectro de 1H RMN (500 MHz; DMSO-d6) do derivado 21

77

Espectro 4 - Espectro de 13C-APT (125 MHz; DMSO-d6) do derivado 21

78

Espectro 5 - Espectro de RMN 2D – HSQC (125 MHz e 500 MHz; DMSO-d6) do derivado 21

79

Espectro 6 - Espectro de RMN 2D – HMBC (125 MHz e 500 MHz; DMSO-d6) do derivado 21

80

Espectro 7 - Espectro de Infravermelho do derivado 22

81

Espectro 8 - Espectro de Massas de Alta Resolução do derivado 22

82

Espectro 9 - Espectro de 1H RMN (500 MHz; DMSO-d6) do derivado 22

83

Espectro 10 - Espectro de 13C-APT RMN (125 MHz; DMSO-d6) do derivado 22

84

Espectro 11 - Espectro de RMN 2D – HSQC (125 MHz e 500 MHz; DMSO-d6) do derivado 22

85

Espectro 12 - Espectro de RMN 2D – HMBC (125 MHz e 500 MHz; DMSO-d6) do derivado 22

86

Espectro 13 - Espectro Infravermelho do derivado 23

87

Espectro 14 - Espectro de Massas de Alta Resolução do derivado 23

88

Espectro 15 - Espectro de 1H RMN (500 MHz; DMSO-d6) do derivado 23

89

Espectro 16 - Espectro de 13C-APT RMN (125 MHz; DMSO-d6) do derivado 23

90

Espectro 17 - Espectro de RMN 2D - HSQC (125 MHz e 500 MHz; DMSO-d6) do derivado 23

91

Espectro 18 - Espectro de RMN 2D - HMBC (125 MHz e 500 MHz; DMSO-d6) do derivado 23

92

Espectro 19 - Espectro de Infravermelho do derivado 24

93

Espectro 20 - Espectro de Massas de Alta Resolução do derivado 24

94

Espectro 21 - Espectro de 1H RMN (500 MHz; DMSO-d6) do derivado 24

95

Espectro 22 - Espectro de 13C-APT RMN (125 MHz; DMSO-d6) do derivado 24

96

Espectro 23 - Espectro de RMN 2D – HSQC (125 MHz e 500 MHz; DMSO-d6) do derivado 24

97

Espectro 24 - Espectro de RMN 2D – HMBC (125 MHz e 500 MHz; DMSO-d6) do derivado 24