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IBMR – LAUREATE INTERNATIONAL UNIVERSITIES
PAMELLA LOMAR DE ALBUQUERQUE
DIAGNÓSTICO DE ARBOVIROSES EM AMOSTRAS DE URINA:
PESQUISA DE DENV E CHIKV EM URINAS NEGATIVAS PARA
ZIKV, ATRAVÉS DE qRT-PCR.
Rio de Janeiro
2017
PAMELLA LOMAR DE ALBUQUERQUE
DIAGNÓSTICO DE ARBOVIROSES EM AMOSTRAS DE URINA:
PESQUISA DE DENV E CHIKV EM URINAS NEGATIVAS PARA
ZIKV, ATRAVÉS DE qRT-PCR.
Trabalho de conclusão de curso realizado no setor de Biologia Molecular do Lacen RJ em parceria com o Departamento de Virologia do Instituto de Microbiologia Paulo de Góes da UFRJ e apresentada ao IBMR – Laureate International Universities como requisito parcial para a obtenção do grau de Bacharel em Biomedicina. Orientador: Prof. Dra. Renata Campos Azevedo
Rio de Janeiro
2017
PAMELLA LOMAR DE ALBUQUERQUE
DIAGNÓSTICO DE ARBOVIROSES EM AMOSTRAS DE URINA:
PESQUISA DE DENV E CHIKV EM URINAS NEGATIVAS PARA
ZIKV, ATRAVÉS DE qRT-PCR.
Trabalho de conclusão de curso realizado no setor de Biologia Molecular do Lacen RJ em parceria com o Departamento de Virologia do Instituto de Microbiologia Paulo de Góes da UFRJ e apresentada ao IBMR – Laureate International Universities como requisito parcial para a obtenção do grau de Bacharel em Biomedicina.
Orientador: Prof. Dra. Renata Campos Azevedo
Aprovada em ___ de _______de 2017.
BANCA EXAMINADORA
_____________________________________________ Prof. Dra. Gisela Maria Vieira Rodrigues de Carvalho IBMR - Laureate International Universities _____________________________________________ Prof. Dr. Sérgio Henrique Seabra IBMR - Laureate International Universities
Dedico este trabalho à minha família, que com amor
incondicional sempre me apoiou e me incentivou
em todas minhas escolhas e decisões. Sem ela
qualquer caminho seria mais difícil.
AGRADECIMENTOS
À Deus, por me guiar pelos caminhos certos para chegar até aqui e me fazer forte para
não desistir, mesmo diante às dificuldades e quando tudo parecia incerto.
À minha mãe, meu pai, meu irmão e toda minha família, por serem minha base, meus
alicerces, meus exemplos de força e união. É por vocês que me esforço para ser melhor a cada
dia e construir um futuro onde sejamos ainda mais felizes.
À minha orientadora, Prof. Dra. Renata Campos Azevedo, por toda paciência, atenção e
dedicação para que esse trabalho fosse realizado. Obrigada por sempre me colocar para cima
todas as vezes que cheguei ao laboratório preocupada e desanimada.
Ao Prof. Dr. Marcelo Damião, por todo apoio profissional, acadêmico e pessoal desde
a minha chegada ao Lacen RJ. E por ter sido o idealizador inicial deste trabalho.
Ao Lacen RJ, por me proporcionar ser melhor a cada dia na profissão que eu escolhi
seguir. E pelos excelentes amigos de trabalho que ali estão e tornam o dia-a-dia mais agradável.
Ao Departamento de Virologia do Instituto de Microbiologia Paulo de Góes da UFRJ,
por me acolherem e me darem a oportunidade de realizar esse trabalho. Que outros como esse
possam vir e eu tenha a chance de retribuir os conhecimentos adquiridos.
À banca examinadora, pelo tempo e atenção dedicados, por contribuir com a
apresentação e complementar esse trabalho de conclusão de curso.
Ao IBMR, por tornar possível a realização desse sonho. Durante esses quatro anos e
meio, tive o prazer de conviver com professores e funcionários que doaram um pouco deles
para fazer de nós, formandos, profissionais éticos e competentes.
E a todos os amigos que aqui fiz e aos que já me acompanhavam, pelas risadas e
brincadeiras, consolos e conselhos. A caminhada se torna mais fácil quando se tem com quem
dividir.
“Hoje, neste tempo que é seu, o futuro está sendo plantado. As escolhas que você procura, os amigos que você cultiva, as leituras que você faz, os valores que você abraça, os amores que você ama, tudo será determinante para a colheita futura.” Padre Fábio de Melo
RESUMO
O Brasil apresenta a circulação dos quatro sorotipos do vírus da Dengue (DENV) e
recentemente enfrentou a introdução de dois arbovírus, Zika (ZIKV) e Chikungunya (CHIKV),
que estão associados a patologias mais severas tornando essencial o diagnóstico conclusivo
dessas arboviroses. A co-circulação de vírus de uma mesma família e a evidência de forte reação
cruzada na pesquisa de anticorpos impossibilitou o diagnóstico baseado apenas nesta
metodologia. Para ampliar a possibilidade de detecção desses vírus e a compreensão da
patogênese causada, diversos estudos foram realizados para caracterizar a presença desses vírus
em fluidos corporais. Foi observado que o ZIKV é excretado em grande quantidade na urina de
pacientes durante a fase aguda e na fase convalescente. Esse estudo visa investigar na urina de
pacientes suspeitos de ZIKV sem diagnóstico confirmado a presença de outros arbovírus
(DENV e CHIKV). Para isso, 1830 urinas foram selecionadas aleatoriamente a partir das
amostras negativas para diagnóstico de zika. Os testes de qRT-PCR para DENV e CHIKV
foram realizados. A amostragem selecionada era na sua maioria proveniente de mulheres
gestantes e coletadas nos primeiros 5 dias de sintomas (dps). Do total de amostras analisadas,
73 apresentaram detecção dos vírus investigados, sendo 44 amostras positivas para DENV e 29
para o CHIKV. O vírus da DENV foi detectado, principalmente, após o 5º dps e a carga viral
permaneceu constante nas diferentes fases da doença. O CHIKV foi detectado, principalmente,
na fase aguda da doença e a carga viral foi maior nessa, do que no período de convalescença.
Entretanto, a detecção tardia após o 16º dps foi observada para ambos os vírus, sugerindo a
urina como uma opção para o aumento da janela de detecção viral. A amostragem utilizada
identificou, no período do estudo, a Região Serrana como a região do estado do Rio de Janeiro
com maior taxa de circulação dos vírus da DENV e CHIKV
Palavras-chave: ARBOVIROSES. DIAGNÓSTICO. URINA.
ABSTRACT
Brazil presents the circulation of the four serotypes of Dengue virus and recently faced the
introduction of two other arboviruses (Zika e Chikungunya), both are also related to sever
pathologies making the conclusive diagnosis essential. The co-circulation of viruses from the
same family and the evidence of strong cross-reactivity on antibodies tests made impossible the
diagnosis based only on immunologic marker. In order to increase the chances of virus
detection and the understanding of the pathology produced, several studies were performed to
detect those viruses in different body fluids. It was observed that ZIKV is excreted in high
quantity in the urine of patients during the acute and the convalescent periods. This study
objects the investigation of other arboviruses (DENV and CHIKV) on the urine of patients
suspect of ZIKV infection. Therefore, 1830 urines were randomly selected from ZIKV negative
samples. The qRT-PCR tests for DENV and CHIKV were performed. The sampling selected
was composed, mostly, by pregnant women and the samples were collected during the first 5th
day's post symptoms (dps). From the total of samples investigated, 73 were positive for the
viruses evaluated, 44 samples were positive for DENV and 29 for CHIKV. The DENV was
detected mainly after the 5th dps and the viral load remained the same at the different periods
of the disease. The CHIKV was detected mainly during the acute phase of the disease and the
viral load was higher when compared to the convalescence period. However, the later
detection, after the 16th dps was observed for both viruses, suggesting the use of urine as an
option to increase the frame detection. The sampling revealed, during the period of study, that
the Região Serrana was the region presenting the highest circulation of DENV and CHIKV.
Keywords: ARBOVIROSIS. DIAGNOSIS. URINE.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Representação gráfica do genoma dos flavivírus. ................................................... 16
Figura 2 - Representação gráfica do genoma dos alfavírus. ..................................................... 17
Figura 3 - Ciclo de transmissão da dengue. .............................................................................. 18
Figura 4 - Representação da correlação da intensidade de sintomas das arboviroses em estudo.
.................................................................................................................................................. 21
Figura 5 - Sensibilidade das técnicas de diagnóstico de dengue por dia pós-sintomas. ........... 23
Figura 6 - Distribuição dos vírus detectados pelas regiões do estado do Rio de Janeiro. ........ 34
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1 - População distribuída por idade. ............................................................................ 30
Gráfico 2 - Percentual de pacientes estudados por região do estado do Rio de Janeiro. .......... 31
Gráfico 3 - Distribuição de amostras de urinas analisadas por dia pós-sintomas..................... 32
Gráfico 4 - Porcentagem de amostras positivas para DENV e CHIKV por dia pós-sintomas. 33
Gráfico 5 - Média de CTs por dia pós-sintomas. ...................................................................... 33
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Distribuição da população e amostras analisadas de acordo com o gênero. ........... 30
Tabela 2 - Frequência dos vírus detectados no número total de amostras de urinas analisadas
no estudo. .................................................................................................................................. 32
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
C – Proteína do capsídeo
CAP – ligação nucleotídica de uma 7-metilguanosina na extremidade 5´ da molécula de RNA
CEP – Comitê de ética em pesquisa
CHIKV – Chikungunya virus
CT – Cycle threshold
DNA – Ácido desoxirribonucleico (do inglês: deoxyribonucleic acid)
DENV – Dengue virus
dps – Dia pós-sintoma
E – Proteína do envelope
ELISA – Ensaio de imunoabsorção enzimática (do inglês: enzyme linked immunosorbent assay)
FHD – Febre Hemorrágica da Dengue
GAL – Gerenciador de Ambiente Laboratorial
IBMP – Instituto de Biologia Molecular do Paraná
IGG – Imunoglobulina G
IGM – Imunoglobulina M
Kb – kilobase (= 1.000 pb)
LACEN-RJ – Laboratório Central Noel Nutels
M – Proteína de membrana
MAYV – Mayaro
NCR – Região não codificante (do inglês: non coding region)
NS – Proteínas não estruturais
nsP – Proteínas não estruturais
OMS – Organização Mundial da Saúde
ORF – Sequência de leitura aberta (do inglês: Open Reading Frame)
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase (do inglês: polymerase chain reaction)
Pb – Pares de base
qRT-PCR – RT-PCR quantitativo em tempo real (do inglês: Real-Time Quantitative Reverse
Transcription PCR)
RNA – Ácido ribonucleico (do inglês: ribonucleic acid)
ROCV - Rocio virus
RT-PCR – Reação em Cadeia da Polimerase precedida por Transcrição Reversa (do inglês:
reverse transcription polymerase chain reaction)
SUS – Sistema Único de Saúde
UFRJ – Universidade Federal do Rio de Janeiro
VFA – Vírus da Febre Amarela
ZIKV – Zika virus
SUMÁRIO
1.INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 15
1.1. ARBOVIROSES ........................................................................................................ 15
1.2. FAMÍLIAS VIRAIS .................................................................................................. 15
1.2.1. Flaviviridae ............................................................................................................ 15
1.2.2 Togaviridae .............................................................................................................. 16
1.3. EPIDEMIOLOGIA DAS ARBOVIROSES .............................................................. 17
1.3.1. Dengue .................................................................................................................... 18
1.3.2. Zika ......................................................................................................................... 19
1.3.3. Chikungunya ........................................................................................................... 20
1.4. CORRELAÇÃO DOS SINTOMAS NAS ARBOVIROSES EM ESTUDO ................ 21
1.5. DIAGNÓSTICO DE DENV, ZIKV E CHIKV ............................................................. 22
1.5.1. Detecção viral em diferentes fluidos corporais ...................................................... 25
2. OBJETIVOS ......................................................................................................................... 27
2.1. OBJETIVO GERAL ...................................................................................................... 27
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................................ 27
3. METODOLOGIA ................................................................................................................. 28
3.1. TIPO DE ESTUDO ....................................................................................................... 28
3.2. CRITÉRIOS DE INCLUSÃO E EXCLUSÃO ............................................................. 28
3.2.1. Critérios de Inclusão ............................................................................................... 28
3.2.2 Critérios de Exclusão ............................................................................................... 28
3.3. EXTRAÇÃO DE RNA E AMPLIFICAÇÃO POR qRT-PCR. .................................... 29
4. RESULTADOS .................................................................................................................... 30
4.1. ASPECTOS DEMOGRÁFICOS DA POPULAÇÃO ESTUDADA ............................ 30
4.2. CARACTERIZAÇÃO CLÍNICA DOS PACIENTES ESTUDADOS ......................... 31
4.3. FREQUÊNCIA DOS VÍRUS DETECTADOS ............................................................. 32
5. DISCUSSÃO ........................................................................................................................ 35
6. CONCLUSÕES .................................................................................................................... 39
7. REFERÊNCIAS ................................................................................................................... 40
ANEXOS .................................................................................................................................48
15
1.INTRODUÇÃO
1.1. ARBOVIROSES
As arboviroses são doenças causadas por vírus que possuem a capacidade de replicação
em vetores vertebrados e invertebrados, em que a grande maioria, estabelece um ciclo alternado
entre um vetor artrópode hematófago e um hospedeiro vertebrado. A expressão “arbovirus” é
derivada do termo inglês arthropod-borne virus, e não é taxonômica. Os arbovírus estão
distribuídos em pelo menos seis famílias: Reoviridae, Rhabdoviridae, Togaviridae,
Flaviviridae e Bunyaviridae. Dessas famílias, três agrupam os vírus com maior importância
para a saúde humana (Togaviridae, Flaviviridae e Bunyaviridae) (CIOTA; KRAMER, 2010).
1.2. FAMÍLIAS VIRAIS
1.2.1. Flaviviridae
A família Flaviviridae está dividida em quatro gêneros, são eles: Hepacivirus,
Pestivirus, Flavivirus e Pegivirus (incluído recentemente). As principais espécies de arbovírus
com impacto para saúde pública no Brasil fazem parte do gênero Flavivirus dentre eles
podemos citar Dengue virus (DENV), Zika virus (ZIKV) e Vírus da Febre Amarela (VFA)
(ICTV, 2017; SCHMALJOHN; MCCLAIN, 1996). A origem do nome Flavivirus vem do
termo em latim, Flavus, que significa “amarelo” e faz referência a icterícia decorrente da
disfunção hepática causada pelo vírus da febre amarela. (LINDENBACH; RICE, 2003)
As partículas virais dos flavivirus medem cerca de 50nm de comprimento, possuem
forma esférica com presença de capsídeo icosaédrico recoberto por envelope. O genoma dos
flavivírus é constituído por RNA de fita simples, polaridade positiva, que possui CAP na
extremidade 5′, mas não apresenta a extremidade 3′ poliadenilada (Figura 1) (SCHMALJOHN;
MCCLAIN, 1996). Esse genoma possui uma única sequência de leitura aberta (ORF, open
reading frame), que codifica as proteínas virais, sendo três delas proteínas estruturais: C
(capsideo), E (envelope) e M (membrana). Sete proteínas não estruturais são sintetizadas nas
células infectadas, NS1, NS2a, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5 e estão envolvidas no processo
de replicação do genoma viral. As duas regiões não codificantes (NCR, non coding region) que
flanqueiam o genoma são importantes para a regulação e a expressão do vírus (ICTV, 2017;
SANTOS; ROMANOS; WIGG, 2015).
16
A molécula de RNA apresenta CAP na região 5’ não codificante (5’NCR) e não apresenta cauda poli A na região 3’ não codificante (3’NCR). O genoma é traduzido em uma única poliproteína que sofre clivagens dando origem as proteínas na conformação funcional. As setas indicam os pontos de clivagem. Extraído de: SANTOS et al. Virologia humana. 3. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2015. P 1068.
1.2.2 Togaviridae
A família Togaviridae está dividida nos gêneros Alphavirus e Rubivirus, sendo o
Alphavirus o gênero que agrupa os principais vírus de impacto para a saúde pública, entre eles
Chikungunya virus (CHIKV) e Mayaro (MAYV) (ICTV, 2011).
Os alfavírus são vírus de aproximadamente 70nm de diâmetro, com capsídeo
icosaédrico e envelope lipoproteico contendo espículas de glicoproteínas virais. Os genomas
dos alfavírus constituem-se de RNA fita simples, polaridade positiva que variam de 9.7 a 11.8kb
(SCHMALJOHN; MCCLAIN, 1996). O RNA genômico é capeado na terminação 5’ e
poliadenilado na terminação 3’ e se divide em duas ORFs onde a primeira codifica uma
poliproteína precursora de quatro proteínas não estruturais (nsP1-nsP4) e a segunda é traduzida
a partir do RNA subgenômico em uma poliproteína precursora das proteínas estruturais: a
proteína de capsídeo (C); duas glicoproteínas de envelope (E1 e E2) e dois pequenos peptídeos
denominados E3 e 6k. As proteínas não estruturais (nsP1-4) são responsáveis pela codificação
da maquinaria de replicação viral (Figura 2) (ICTV, 2011; SANTOS; ROMANOS; WIGG,
2015).
Figura 1 - Representação gráfica do genoma dos flavivírus.
17
O genoma dos alfavírus apresenta CAP na região 5’, cauda poli A na região 3’ e se divide em duas ORFs. Quatro proteínas estruturais (nsP1 – nsP4) são codificadas pela ORF 5’a partir do genoma. A ORF 3′ é traduzida em um RNA subgenômico que codifica as proteínas de capsídeo (C), três glicoproteínas do envelope (E1, E2 e E3) e uma proteína associada à membrana (6k). Adaptado de: VIROLOGY TIDBITS, 2014 Disponível em: <http://virologytidbits.blogspot.com.br/2014/08/> Acesso em out. 2017
1.3. EPIDEMIOLOGIA DAS ARBOVIROSES
Os arbovirus se caracterizam pela transmissão principalmente através de vetores
invertebrados e algumas doenças causadas por eles são consideradas zoonoses, pois apresentam
um ciclo silvestre e o homem é um hospedeiro acidental. O VFA, MAYV e Rocio virus (ROCV)
estão entre os arbovírus de ciclo silvestre de maior importância para a saúde pública do Brasil
(CASSEB et al., 2013). Em alguns casos, como na dengue, o ciclo de transmissão urbana foi
estabelecido (Figura 3). Nesses, a distribuição geográfica é bastante ampla abrangendo todos
os continentes, tanto nas regiões temperadas como nas tropicais com predominância nestas
últimas, certamente por oferecerem condições ecológicas mais favoráveis. Nos trópicos, os
vetores coexistem com os hospedeiros vertebrados em todas as estações do ano, ao passo que,
nos países de clima temperado, o ciclo de transmissão é interrompido durante o inverno,
reiniciando-se na primavera ou verão (LEÄO et al., 1997).
Figura 2 - Representação gráfica do genoma dos alfavírus.
18
O ciclo de transmissão silvestre envolve macacos e mosquitos Aedes albopictus, enquanto os ciclos urbanos envolvem o homem e mosquitos Aedes aegypti. Extraído de: SANTOS et al. Virologia humana. 3. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2015. P 1072.
Os arbovírus estão frequentemente associados com grandes epidemias como a febre
amarela no início do século XX e a tríplice epidemia de zika, dengue e chikungunya no início
de 2016, todas transmitidas pelo Aedes aegypti principal vetor de área urbana reconhecido até
o momento no país (AUGUSTO et al., 2016; CARNEIRO et al., 2016).
1.3.1. Dengue
A dengue é a arbovirose mais rapidamente disseminada no mundo. Estima-se que cerca
de 2,5 bilhões de pessoas vivam em áreas onde a dengue é endêmica. A Organização Mundial
de Saúde (OMS) estima que 50 a 100 milhões de infecções ocorrem anualmente, incluindo
500.000 casos de FHD e 22.000 mortes, principalmente entre crianças. (CDC”, [s.d.])
O vírus da dengue é um arbovirus do gênero Flavivirus, que foi reintroduzido no Brasil
na década de 80 e que, a partir de então, várias epidemias foram observadas com a circulação
dos quatro sorotipos (DENV-1 a DENV -4) (LOPES; NOZAWA; LINHARES, 2014). Nos
últimos anos, foi claramente evidenciado a alternância dos sorotipos nas diversas regiões no
Brasil, onde, na segunda metade do ano de 2009, ocorreu a substituição do DENV-2 pelo
DENV-1 como sorotipo predominante, levando a uma grande circulação do vírus ao longo do
ano de 2010. Em 2013, com a circulação predominante de DENV-4 e DENV-1, foi registrada
a maior epidemia de dengue da história do País (BRASIL. MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2015).
Figura 3 - Ciclo de transmissão da dengue.
19
O período de incubação da dengue é de dois a sete dias. A doença pode se desenvolver
de forma branda, com poucos sintomas como febre, dores no corpo, cefaleia, com presença ou
não de exantema maculopapular pruriginoso, ou levar à quadros mais graves, cursando com
hepatite fulminante, extravasamento vascular com hipovolemia, trombocitopenia e
manifestações hemorrágicas, podendo levar à Febre Hemorrágica da Dengue (FHD) e até
mesmo morte. (LUM et al., 2002; MASERA et al., 2011).
1.3.2. Zika
O vírus Zika (ZIKV), também um flavivírus, foi isolado pela primeira vez em primatas
não humanos na região de Uganda, na floresta Zika, no ano de 1947 (DICK; KITCHEN;
HADDOW, 1952). O ZIKV possui três linhagens descritas até o momento, sendo duas africanas
e uma asiática (FAYE et al., 2014).
O primeiro relato de epidemia pelo vírus Zika ocorreu em 2007 na ilha Yap, na
República da Micronésia (DUFFY et al., 2009), mas foi durante o surto na Polinésia Francesa,
ocorrido em 2013-2014, que se registraram os primeiros casos de transmissão perinatal. (ECDC
2014). Após o surto na Polinésia Francesa o vírus foi detectado na Ilha de Páscoa, Chile e em
seguida no Brasil. Os primeiros casos foram confirmados em pacientes suspeitos de dengue que
não apresentaram diagnóstico laboratorial confirmado. A investigação para outros flavivírus
evidenciou a presença do ZIKV (CAMPOS; BANDEIRA; SARDI, 2015).
Durante o surto de ZIKV, principalmente no estado de Recife, um aumento alarmante
no número de casos de microcefalia foi observado. Uma hipótese de associação foi formulada
e, posteriormente, a microcefalia associada ao ZIKV foi confirmada em estudos de casos, nos
quais o vírus foi detectado no líquido amniótico (CALVET et al., 2016) e no cérebro de fetos
com má formação (ECDC, 2015; MLAKAR et al., 2016). Um estudo realizado por Oliveira
Melo e colaboradores teve uma contribuição importante para elucidar a relação do ZIKV com
a microcefalia e pode ter sido um dos pioneiros em diagnosticar a transmissão intrauterina do
vírus. Esse diagnóstico deu-se através da detecção do vírus no líquido amniótico de duas
gestantes com sintomas de doença exantemática e fetos diagnosticados com microcefalia
através de imagens de ultrassom.
A associação do vírus com a microcefalia e outras sequelas neurológicas, assim como a
comprovação da transmissão sexual do vírus, nas vésperas dos Jogos Olímpicos, impactou o
país, e o surto de zika foi declarado uma “Emergência Global” pela OMS. (PETERSEN et al.,
2016)
20
A infecção pelo ZIKV resulta em uma doença exantemática, cujos sintomas mais
comuns são febre, erupção cutânea, dor de cabeça, artralgia, conjuntivite (olhos vermelhos) e
dor muscular, mas pode frequentemente cursar sem sintomas (CARDOSO et al., 2015; CDC,
2014).
Diversas outras doenças exantemáticas, entre elas sarampo, rubéola, parvovírus, dengue
e febre chikungunya, podem cursar de forma semelhante e tornar complicado o diagnóstico
clínico, sendo necessária a realização de exames diferenciais (FANTINATO et al., 2016).
1.3.3. Chikungunya
A chikungunya é uma doença febril aguda causada por um arbovírus do gênero
Alphavirus da família Togaviridae (ROBINSON, 1955; THIBERVILLE et al., 2013). O
CHIKV possui três linhagens descritas e foi reportado em diversos surtos na África, Ásia,
Europa e Oceanos Índico e do Pacífico até 2013. Em dezembro desse mesmo ano foi
identificado o primeiro caso autóctone nas Américas, durante um surto ocorrido nas ilhas do
Caribe. Desde então, cerca de dois milhões de casos já foram relados em toda a América. (CDC,
2016, [s.d.]; FIGUEIREDO et al., 2014; POWERS et al., 2000). Essa rápida disseminação do
CHIKV pode estar ligada as altas taxas de ataque em cada surto, à uma viremia muito alta nos
pacientes, além da ampla distribuição dos vetores (ALBUQUERQUE et al., 2012).
A infecção por CHIKV tem sintomas de início abrupto com febre alta, dor de cabeça,
mialgia, forte artralgia (pode durar até meses ou anos) e erupção cutânea, podendo chegar a
formas mais graves como meningoencefalite e outros sintomas neurológicos (WHO, 2017). Há
relatos de pacientes com sintomas urinários, como retenção urinária aguda e crônica, associados
à infecção por CHIKV. Esses sintomas provavelmente estão relacionados com a replicação do
vírus nos rins e bexiga (BAISHYA et al., 2010; JONES; OKEOMA, 2015).
A artralgia incapacitante é o sintoma que permite diferenciar clinicamente a infecção
por CHIKV de outras doenças com vetores e sintomas semelhantes. Os sintomas surgem
geralmente três a sete dias após a picada do mosquito e duram em média sete dias
(ALBUQUERQUE et al., 2012).
21
1.4. CORRELAÇÃO DOS SINTOMAS NAS ARBOVIROSES EM ESTUDO
Diversos autores produziram correlações da intensidade de sintomas entre as três
arboviroses transmitidas pelo Aedes aegypti, com o objetivo de orientar os clínicos e a
população. Sintomas de maior intensidade e predominante em cada uma das doenças auxiliam
no diagnóstico clínico (Figura 4). Variações podem ser encontradas nesses dados e
possivelmente estão relacionadas com o histórico imunológico da população atingida (IOOS et
al., 2014; RODRIGUEZ-MORALES et al., 2016; VILLAMIL-GÓMEZ et al., 2016).
Figura 4 - Representação da correlação da intensidade de sintomas
das arboviroses em estudo. R raro, + leve/eventual, ++ moderado/frequente, +++ intenso/muito frequente. Adaptado de: IOOS et al., 2014; Dados complementares em Brasil, Ministério da Saúde. Prevenção e combate Dengue, Chikungunya e Zika
SINTOMAS DENGUE ZIKA CHIKUNGUNYA
Febre +++ ++ +++
Cefaléia +++ ++ ++Mialgia +++ ++ +++
Artralgia + ++ +++Edema nas
extremidadesR ++ ++
Rash cutâneo + +++ ++
Dor retro-orbital ++ ++ +Conjuntivite R +++ +Hemorragia + - -
22
1.5. DIAGNÓSTICO DE DENV, ZIKV E CHIKV
A dengue, a febre de chikungunya e a febre pelo vírus Zika são doenças de notificação
compulsória e estão presentes na Lista Nacional de Notificação Compulsória de Doenças,
Agravos e Eventos de Saúde Pública pois, a partir da suspeita, pode-se verificar a necessidade
de adoção de medidas de controle, principalmente do vetor (BRASIL. MINISTÉRIO DA
SAÚDE, [s.d.]). No entanto o diagnóstico dessas arboviroses é um desafio para a saúde pública,
uma vez que as mesmas apresentam sintomas semelhantes o que demanda uma confirmação
laboratorial. Devido ao grande número de espécies pertencentes em cada gênero, reações
cruzadas nos testes sorológicos utilizados para detecção desses arbovírus em hospedeiros
vertebrados já foi observada, dificultando o diagnóstico acurado (LIMA-CAMARA, 2016).
O fluxo de diagnóstico foi primeiramente estabelecido para a comprovação dos casos
de Dengue e avaliação dos casos graves, envolvendo critérios clínico-laboratoriais, sendo as
alterações laboratoriais apresentadas sob dois aspectos: os exames inespecíficos e os exames
específicos. Os exames inespecíficos incluem o hemograma, que além da possível
trombocitopenia não apresenta diferenças em relação com outras viroses, e a avaliação de
marcadores de coagulação e inflamação, sendo este último utilizado para o estadiamento dos
pacientes. Os exames específicos têm por objetivo a pesquisa da produção de anticorpos
(sorologia), a confirmação da infecção aguda com o vírus da dengue através do isolamento viral
e a detecção de antígenos virais (NS1) e ácido nucleico viral através da Reação em Cadeia da
Polimerase precedida por Transcrição Reversa (RT-PCR). Métodos esses que, devido ao custo
e a complexidade nem sempre estão disponíveis para o diagnóstico do DENV, ficando apenas
para esclarecimento de casos graves, óbitos, vigilância e pesquisa. ( CDC, [s.d.]; XAVIER et
al., 2014).
23
O diagnóstico de dengue foi estabelecido utilizando o soro como material de escolha.
Inicialmente, durante a fase aguda, a amostra era destinada para o isolamento viral em cultura
de células seguida de imunofluorescência para tipificação. Após a fase aguda, o material era
direcionado para detecção de anticorpos IgM (FUNASA, 1998). O avanço das técnicas de
biologia molecular permitiu a tipificação direta das amostras, através da detecção do material
genômico viral. Essa técnica por ser mais rápida e com maior sensibilidade substituiu, em
muitos casos, o isolamento viral. Atualmente, três estratégias estão disponíveis no mercado na
forma de kits: pesquisa de anticorpos (IgM e IgG); material genômico do vírus (RT-PCR) e
detecção do antígeno viral NS1 através da metodologia de ELISA (ensaio de imunoabsorção
enzimática - Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). Foi observado que durante a fase de
replicação do vírus, as células secretam a proteína não estrutural NS1, que passa a apresentar
alto título na corrente sanguínea, se tornando um bom marcador de fase aguda. Essas
metodologias devem ser utilizadas de acordo com o tempo de surgimento dos marcadores
biológicos durante a infecção (Figura 5). (BARRA et al., 2011; GUZMÁN; KOURÍ, 2004;
CDC, [s.d.])
A detecção do ácido nucleico e/ou antígeno viral coincide com a viremia e a fase febril do início da doença. O anticorpo IgM é o primeiro isotipo da imunoglobulina a aparecer e quando presentes, indicam uma provável recente infecção, porem podem permanecer elevados por 2 a 3 meses após a doença. A IgG anti-dengue é detectável em baixo título no final da primeira semana de doença e aumenta lentamente. Fonte: CDC, [s.d.]
Figura 5 - Sensibilidade das técnicas de diagnóstico de
dengue por dia pós-sintomas.
24
A determinação de anticorpos específicos, das classes IgM e IgG nos espécimes de soro
coletados após cinco ou mais dias de sintomas é realizado através de imunoensaio. No entanto,
a curva de surgimento dos anticorpos pode ser consideravelmente alterada diante de uma
infecção secundária de dengue. Os resultados positivos de IgG não fornecem informações sobre
o momento da infecção, pois a detecção desses antígenos pode decorrer de uma infecção
ocorrida em meses ou anos anteriores (CDC, [s.d.]).
Os primeiros casos de ocorrência do ZIKV em humanos foram relacionados com uma
virose de patologia branda, logo, não houve incentivo para o desenvolvimento de ferramentas
específicas para o diagnóstico. Após a grande epidemia no Brasil e associação com a síndrome
congênita, a necessidade de ferramentas para o diagnóstico ficou evidente. Além disso, foi
observada uma alta reação cruzada entre os anticorpos produzidos pelos flavivírus (por
exemplo, vírus do Nilo Ocidental, vírus da febre amarela e DENV), principalmente em casos
de infecção secundária, levando a resultados de diagnóstico falso-positivos (TYLER M.
SHARP, 2014).
Durante uma investigação laboratorial realizada por Fantinato et al. (2016) foi
identificada a presença do vírus Zika associados com IgM reagentes para dengue, sugerindo
reação cruzada. O trabalho ressaltou a importância de uma implantação do diagnóstico
diferencial para doenças exantemáticas e a necessidade do desenvolvimento de testes
diagnósticos mais específicos, minimizando a reação cruzada com sorologia para dengue.
De acordo com o Ministério da Saúde, a confirmação da infecção por ZIKV se dá
mediante caso suspeito com um dos seguintes testes positivos/reagentes específicos para
diagnóstico de zika: Isolamento viral; Detecção de RNA viral por reação da transcriptase
reversa (RT-PCR); Sorologia IgM (em populações onde existe a co-circulação do vírus da
dengue há uma alta chance de ocorrer reações falso positivas). Contudo, após a confirmação de
circulação autóctone, os demais casos agudos de Zika, segundo recomendação do Ministério da
Saúde, devem ser confirmados por critério clínico-epidemiológico, exceto gestantes,
manifestações neurológicas e óbitos (SVS/MS, 2016).
25
O diagnóstico de chikungunya é geralmente realizado através da pesquisa de anticorpos,
anti-CHIKV, IgM e IgG usando o ELISA. O IgM é detectado cinco a sete dias após a infecção
e podem permanecer por meses a depender dos sintomas crônicos da doença. Dentre as outras
formas de diagnóstico específico na fase aguda da doença, estão o isolamento viral e a RT-
PCR. (PANNING et al., 2008; POWERS, 2010; STAPLES; BREIMAN; POWERS, 2009).
Técnicas de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) tem a vantagem de serem mais rápidas e
fornecer uma indicação da carga viral, no entanto ainda possuem custo elevado (DASH;
MOHANTY; PADHI, 2011; LAURENT et al., 2007; MADARIAGA; TICONA;
RESURRECION, 2016; POWERS, 2010).
Vários países das Américas agora têm múltiplas arboviroses circulando, todas cursando
com sintomatologia semelhante. Com isso, teste laboratoriais rápidos e sensíveis, que
diferenciem essas doenças se tornaram fundamentais. No entanto, devido à forte reação cruzada
nas sorologias de ZIKV, DENV e outros flavivírus, o diagnóstico molecular deve ser priorizado.
(CDC, 2016)
O laboratório Bio-Manguinhos da Fundação Oswaldo Cruz desenvolveu um kit de teste
para detecção simultânea de infecções por zika, dengue e chikungunya por meio de RT-PCR.
O kit molecular ZDC permite identificar qual arbovirose está presente na amostra, através da
detecção do material genético dos três vírus, no entanto não faz a distinção entre os sorotipos
da dengue. Já em fase de produção, o kit foi desenvolvido em conjunto com o Instituto de
Biologia Molecular do Paraná (IBMP), sob coordenação do Ministério da Saúde e será em breve
implantado na rede pública de saúde.
1.5.1. Detecção viral em diferentes fluidos corporais
Diante do novo padrão de patogênese apresentado pelo ZIKV, vários autores
começaram a investigar a presença do vírus nos demais fluidos biológicos. Dessa forma, o vírus
pôde ser detectado na saliva (BARZON et al., 2016), urina (GOURINAT et al., 2015), sêmen
(NICASTRI et al., 2016), secreção vaginal (VISSEAUX et al., 2016) e leite materno (COLT et
al., 2017).
26
Os ensaios moleculares, como a Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real
(qRT-PCR), são ferramentas rápidas e sensíveis para o diagnóstico de infecções por esses vírus
nos primeiros estágios virêmicos da doença (FIGUEIREDO et al., 2014). E a evidência de
excreção desses vírus na urina permite uma nova abordagem diagnóstica (KUTSUNA et al.,
2014; MIZUNO et al., 2007; MUSSO et al., 2016). Estudos sugeriram que a detecção de ZIKV
na urina tem uma janela mais longa de detecção uma vez que o ZIKV pode ser eliminado na
urina, em média, até 14 após o início dos sintomas. (CAMPOS et al., 2016; GOURINAT et al.,
2015).
Rozé e colaboradores (2016) em seu estudo de caso com dois pacientes portadores de
sintomas neurológicos decorrentes de infecção por ZIKV, detectaram o vírus na urina após 21
dias pós-sintomas (dps), não encontrando positividade no plasma. A urina é uma amostra clínica
interessante para o diagnóstico, pois é excretada em grande quantidade, além de não precisar
de métodos invasivos para sua coleta.
27
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GERAL
Investigar na urina outros arbovírus (DENV e CHIKV) que apresentam sintomatologia
semelhante e co-circulam com o vírus Zika no estado do Rio de Janeiro.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Avaliar em amostras de urina, negativas para ZIKV, a presença dos vírus da dengue e
da chikungunya pelo método de qRT-PCR
• Analisar a carga viral dos vírus detectados nesse trabalho, através do CT encontrado na
amplificação por qRT-PCR dos RNAs extraído das urinas selecionadas.
• Distribuir os vírus detectados na urina, por regiões do estado do Rio de Janeiro, para
uma breve análise epidemiológica.
28
3. METODOLOGIA
3.1. TIPO DE ESTUDO
Esse trabalho foi realizado no setor de Biologia Molecular do Laboratório Central Noel
Nutels (LACEN-RJ) em parceria com o Departamento de Virologia do Instituto de
Microbiologia Paulo de Góes da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ). A parceria
permite o uso das amostras para pesquisas com a finalidade de aprimorar o diagnóstico da
vigilância epidemiológica. Esse estudo é aprovado pelo comitê de ética e pesquisa (CEP)
HUCFF/UFRJ número 37724 (ANEXO A).
O estudo foi do tipo descritivo, transversal com amostras de conveniência. A população
estudada era composta na sua maioria por mulheres, mas também homens e crianças. As
amostras de urina foram coletadas de preferência até o 8º dps, nas unidades do Sistema Único
de Saúde (SUS) e encaminhadas para o Lacen RJ conforme recomendado no Protocolo de
Vigilância e Resposta à Ocorrência de Microcefalia e/ou Alterações do Sistema Nervoso
Central (MS, 2016). As informações para o banco de dados das amostras estudadas foram
obtidas no sistema GAL (Gerenciador de Ambiente Laboratorial), que é um sistema
informatizado desenvolvido para a Rede Nacional de Laboratórios de Saúde Pública.
Um número elevado de amostras foi possível devido ao surto de grande impacto causado
pelo vírus da Zika entre 2015 e 2016. O risco de microcefalia associado ao ZIKV fez com que
o número de atendimento clínico a gestantes com sintomas exantemáticos aumentasse
consideravelmente e o diagnóstico específico se fez necessário. A partir das amostras de urina
encaminhadas para o diagnóstico de zika e testadas negativas, foram selecionadas
aleatoriamente 1830 amostras para esse estudo.
3.2. CRITÉRIOS DE INCLUSÃO E EXCLUSÃO
3.2.1. Critérios de Inclusão
Foram aceitas amostras de urinas de pacientes como sintomatologia de febre exantemática,
coletadas, preferencialmente até o 8º dps, com resultado de qRT-PCR negativo para o ZIKV.
3.2.2 Critérios de Exclusão
Foram excluídas amostras urinas de pacientes como sintomatologia de febre exantemática,
coletadas, preferencialmente até o 8º dps, com resultado de qRT-PCR positivo para o ZIKV.
29
3.3. EXTRAÇÃO DE RNA E AMPLIFICAÇÃO POR qRT-PCR.
O RNA viral foi extraído a partir de 200µl de urina usando o kit QIAamp Viral RNA
Mini Kit, eluídos em 50µl de Tampão AE e armazenados a -80ºC. A amplificação de ácidos
nucleicos nos RNAs extraídos a partir das amostras de urinas foi realizada utilizando a enzima
GoTaq® Probe 1-Step RT-qPCR System (Promega), e o uso dos primers/probe seguiram o
protocolo in house recomendado para DENV (JOHNSON; RUSSELL; LANCIOTTI, 2005) e
CHIKV (LANCIOTTI et al., 2007). Foram usados 5µl de RNA extraído em um volume final
de reação de 20µl. A amplificação foi realizada no equipamento de qRT-PCR ABI 7500
(Applied Biosystems).
O threshold ou limiar de detecção (nível de fluorescência onde a reação é detectada
durante a fase exponencial) foi definido na altura em que se inicia a porção linear da fase
exponencial da emissão de fluorescência na amplificação. O ponto em que a amplificação da
amostra cruza com a linha de threshold, permite determinar o número de ciclos necessários para
o início da amplificação da sequência alvo. Este valor é denominado CT (Cycle Threshold) e
permite a quantificação relativa do DNA/RNA de cada uma das amostras (NASCIMENTO;
SUAREZ; PINHAL, 2010). Os resultados foram analisados utilizando o CT de corte definido
em cada uma das referências.
30
4. RESULTADOS
4.1. ASPECTOS DEMOGRÁFICOS DA POPULAÇÃO ESTUDADA
De outubro de 2015 a dezembro de 2016 o LACEN-RJ recebeu 20996 amostras para
pesquisa de ZIKV. Desse total, 8970 eram urina e 8005 apresentaram resultado negativo para
a pesquisa de RNA do ZIKV através de qRT-PCR. Nessa população, foram selecionadas
aleatoriamente 1830 amostras para esse estudo.
Das amostras selecionadas apenas sete eram de homens e 1766 eram mulheres, dentre as
quais pelo menos 1608 eram gestantes (Tabela 1).
Tabela 1 - Distribuição da população e amostras analisadas de acordo com o gênero.
Fonte: Autoria própria.
Quando a população foi distribuída por idade, verificou-se que as faixas etárias
predominantes coincidiam com a idade reprodutiva (16 a 35 anos) uma vez que está composta
por uma maioria gestante (Gráfico 1).
Gráfico 1 - População distribuída por idade.
Fonte: Autoria própria.
Total Feminino MasculinoAmostras de urina 1830 1823 7Pacientes 1773 1766 7Gestantes - 1608 -
743
358503
385303
13131
642
0 100 200 300 400 500 600
0 a 1213 a 1516 a 2021 a 2526 a 3031 a 3536 a 4041 a 4546 a 50
>50NI
Número de pacientes
Faix
a et
ária
P ac ientes po r id ade
31
De acordo com as regiões do Estado do Rio de Janeiro, a maioria da população estudada
ficou concentrada na área metropolitana, totalizando 81% (Gráfico 2).
Gráfico 2 - Percentual de pacientes estudados por região do estado do Rio de Janeiro.
Fonte: Autoria própria.
4.2. CARACTERIZAÇÃO CLÍNICA DOS PACIENTES ESTUDADOS
Dentre os principais sintomas relatados e registrados na ficha do GAL podemos
destacar: exantema, febre, artralgia, cefaleia, mialgia, prurido e hiperemia conjuntival.
Em relação a fase da doença, observamos uma maior distribuição de amostras de urina
coletadas na fase aguda, isto é, com até cinco dias de surgimento dos sintomas, representando
72% da população analisada (Gráfico 3).
6%0%
2%3%
81%
1% 2%5%
Pacientes por região do estado do Rio de Janeiro
Baixadas Litorâneas
Centro-Sul Fluminense
Costa Verde
Médio Paraíba
Metropolitana
Noroeste Fluminense
Norte Fluminense
Serrana
32
Gráfico 3 - Distribuição de amostras de urinas analisadas por dia pós-sintomas.
Fonte: Autoria própria.
4.3. FREQUÊNCIA DOS VÍRUS DETECTADOS
Após amplificação de ácidos nucleicos nos RNAs extraídos a partir das amostras
estudadas foi verificado que: do total de amostras analisadas, 73 apresentaram detecção dos
vírus investigados. O vírus da dengue foi detectado em 44 amostras e 29 urinas foram
detectáveis para o CHIKV (Tabela 2).
Tabela 2 - Frequência dos vírus detectados no número total de amostras de urinas
analisadas no estudo.
Fonte: Autoria própria.
Quanto a positividade dos vírus por dias de sintomas, para o vírus da dengue foi
observada um aumento da detecção a partir do 5ºdps. Das 29 positivas para CHIKV, 26 eram
de fase aguda (0 a 5 dps) e duas estavam entre o 16º e 20ºdps (Gráfico 4).
1323
149106
6630 18 9 4 8 4 11
102
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
0 a 5 6 a 10 11 a 15 16 a 20 21 a 25 26 a 30 31 a 35 36 a 40 41 a 45 46 a 50 >50 ND
Amos
tras
de
urin
a
DPS
Amostras analisadas por dias pós-sintomas
Total DENV1 DENV 4 ChikV Amostras de urina 1830 37 7 29Porcentagem 2,02% 0,38% 1,58%
33
Gráfico 4 - Porcentagem de amostras positivas para DENV e CHIKV por dia pós-
sintomas.
Fonte: Autoria própria.
Foi observada uma média constante de CTs na detecção dos vírus da dengue desde
a fase aguda até 20 dps. Sendo que no DENV-4 os valores foram mais altos, indicando
uma carga viral mais baixa que no DENV-1 (CT alto = carga viral baixa). Já o CHIKV
apresentou CTs mais baixos na fase aguda da doença, o que significa uma carga viral mais
alta nos cinco primeiros dias de sintomas (Gráfico 5).
Gráfico 5 - Média de CTs por dia pós-sintomas.
Fonte: Autoria própria.
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
0 a 5 6 a 10 11 a 15 16 a 20 ND
Posit
ivid
ade (
%)
DPS
Positividade X DPS
POS DENV (%) POS CHIKV (%)
n = 1323 n = 149 n = 106 n = 66 n = 102
34,3 33,6 34,2 35,538,6 39,0
27,8
37,0
33,5
0
5
10
15
20
25
30
35
400 a 5 6 a 10 11 a 15 16 a 20 ND
Méd
ia do
val
ores
ct
Dias pós sintomas
Média de CTs por DPS
DENV1 DENV 4 CHIKV
Méd
ia d
os v
alor
es d
e C
T
DPS
34
Em relação a distribuição dos vírus detectados nas amostras analisadas por região do
estado do Rio de Janeiro, o maior percentual ficou concentrado na Região Serrana (27,3%),
seguido da Região Centro-Sul Fluminense. A Região Metropolitana apesar do grande número
de amostras (81%) apresentou uma das menores taxas de positividade (2,3%) (Figura 6).
Adaptado de: CEPERJ, 2013 Disponível em: <http://www.ceperj.rj.gov.br/ceep/info_territorios/Reg%20Gov_2013.pdf> Acesso em out. 2017.
27,3%
2,0%6,3 %
7,5%
14,3%
2,3%
16,7%
3,3%
Figura 6 - Distribuição dos vírus detectados pelas regiões do estado do Rio de Janeiro. O mapa apresenta as regiões do estado e a porcentagem de detecção viral encontrada em cada região.
35
5. DISCUSSÃO
A atual co-circulação de três arbovírus no país (DENV; CHIKV e ZIKV) traz um desafio
para a área de diagnóstico. A sintomatologia clínica é muito semelhante e o diagnóstico baseado
em anticorpos pode ser impreciso devido a reação cruzada apresentada, principalmente, por
pacientes em uma segunda infecção por vírus de uma mesma família. Para as arboviroses a
amostra de escolha utilizada sempre foi o soro do paciente. No entanto a urina é um espécime
de fácil coleta, e menos invasiva quando comparada ao soro. Dessa forma, um dos objetivos
desse estudo foi investigar na urina de pacientes suspeitos de infecção por ZIKV a presença de
outros arbovírus (DENV e CHIKV) que também circularam no estado do Rio de Janeiro.
A febre zika foi considerada inicialmente uma doença de curso benigno sem impacto
para saúde pública. Contudo, o diagnóstico laboratorial se tornou essencial após a associação
da infecção pelo ZIKV e os casos de microcefalia. Dessa forma, as gestantes foram priorizadas
para o diagnóstico molecular que, ainda hoje, é a principal ferramenta para um diagnóstico
conclusivo. Por isso, durante a grande epidemia de 2015 a 2016 a quase totalidade de amostras
recebidas para essa análise foram provenientes de mulheres em período de gestação ou do
puerpério cujo os recém-nascidos apresentaram sintomas associados a Síndrome Congênita do
ZIKV (Gráfico 1). Devido à localização do LACEN-RJ e dos inúmeros pontos de coleta do
município do Rio de Janeiro, a maior parte das amostras recebidas para o diagnóstico de zika
são provenientes da região metropolitana. Entretanto amostras de todas as regiões do estado do
Rio de Janeiro foram analisadas (Gráfico 2).
Quanto às urinas enviadas para o diagnóstico de zika no Lacen RJ, das 8970 amostras
recebidas, 965 foram positivas, o que representa 10,7% de detecção de ZIKV. Nas 1830
amostras selecionadas para esse trabalho, detectamos 44 DENV (37 DENV-1 e 7 DENV-4) e
29 CHIKV (Tabela 2). Essa porcentagem inferior ao observado para ZIKV pode estar
relacionada à seleção clínica que as amostras tiveram, uma vez que foram coletadas de pacientes
com suspeita de zika. Alguns sintomas como o surgimento de conjuntivite e a febre branda
contribuem para a discriminação de ZIKV, já a artralgia intensa sugere a infecção pelo CHIKV.
36
No século XX e início do século XXI a Dengue foi a principal arbovirose em circulação
no país. Devido ao custo e a complexidade do diagnóstico laboratorial, esforços foram
empregados pelo sistema público de saúde no estadiamento clínico correto do paciente e a
investigação completa ficou restrita aos casos graves e na determinação de novos sorotipos
(GUZMÁN; KOURÍ, 2004; FUNASA, 1998). Essa vigilância era principalmente baseada no
isolamento viral, seguido de confirmação do sorotipo através da imunofluorescência. Apenas
as amostras de pacientes em fase aguda eram próprias para o isolamento viral (0 a 6 dps),
deixando uma pequena janela para investigação. Após o 7o dps as amostras eram encaminhadas
para pesquisa de anticorpos IgM (FUNASA, 1998). A introdução de pesquisa do RNA viral
diretamente nas amostras trouxe agilidade e uma maior sensibilidade para pesquisa dos
sorotipos circulantes. Contudo, a janela de investigação para detecção do vírus não variou, por
que continuava restrita ao período de viremia. Dessa forma, a possibilidade de excreção do
vírus em outros fluidos contribui para um diagnóstico preciso mesmo após a diminuição dos
sintomas. Na amostragem estudada, 44 amostras foram positivas para dengue, sendo 31 até o
5o dps, e 13 entre os 6º e 20º dps. Detectamos um aumento no percentual de amostras positivas
a partir do 6º dps (12,6% - n=321) em relação a fase aguda (2,3% - n=1323) demonstrando que
o período de excreção do vírus na urina é estendido. A maior porcentagem de positividade foi
observada entre 11 e 15dps (Gráfico 4). É provável que a curva decrescente da excreção do
virus da DENV não pôde ser percebida devido ao baixo número de amostras fase tardia (após
20dps). Esses aumento da taxa de positividade de DENV em urinas coletada após 6 dps também
foi encontrado por Hirayama e colaboradores (2012). De acordo, com o período de excreção
observado na dengue, para a utilização da urina deve ser priorizada a coleta da amostra em fases
tardias da doença. Considerando que esse resultado contribui para o aumento da janela de
detecção do vírus, então o acompanhamento do período de excreção do DENV na urina,
principalmente, em casos graves precisa ser melhor estudado.
37
Em relação ao vírus da chikungunya, durante nossas análises, das 29 amostras de urina
positivas para CHIKV, 26 eram de fase aguda e 2 foram coletadas entre o 16o e 20o dps (Gráfico
4). A maior taxa de positividade para CHIKV foi observada na fase aguda da doença (89,6%).
Musso e colaboradores (2016) também detectaram uma alta taxa de positividade de CHIKV em
urinas de fase aguda, não encontrando positividade após 1 (uma) semana de sintomas. No
trabalho de Bandeira e colaboradores (2016), o vírus da chikungunya foi detectado em urinas
coletadas após 30 dps, quando no soro os resultados eram negativos. Enquanto Jones & Okeoma
(2015) no seu estudo com camundongos, encontrou positividade nos dias 1, 3, 5, 7, 9, e 30 pós-
infecção. Esses resultados mostram que as taxas de detecção de CHIKV na urina vão desde a
fase aguda até fases tardias da doença. A urina pode, então, ser uma ferramenta complementar
ao diagnóstico conclusivo de chikungunya, durante um longo período após o início dos
sintomas. No entanto um acompanhamento em pacientes com infecção confirmada por CHIKV
e diferentes intensidades de sintomas deve ser realizado para estabelecer os melhores critérios
de diagnóstico nesse espécime.
Quanto à quantidade de vírus excretada, alguns estudos comprovaram que a eliminação
do ZIKV na urina era intensa e assim alta carga viral podia ser detectada através de RT-PCR
(CAMPOS et al., 2016; GOURINAT et al., 2015). Já no que diz respeito ao DENV na urina,
Andries e colaboradores visualizaram um aumento progressivo da carga viral do 2º ao 5ºdps,
quando diminuía um pouco, porém se mantinha bem próximo até o 9º dia. Quando comparado
ao soro, os valores eram mais baixos na urina. Nas amostras analisadas nesse estudo foi
observada uma média constante de CTs na detecção dos vírus da dengue entre a fase aguda e
os outros dias de sintomas (Gráfico 5). O que sugere que a excreção de DENV na urina se
mantém continua entre as fases da doença. Quando comparamos o DENV-1 e o DENV-4
observamos uma maior carga viral nas amostras de DENV 1 (CTs altos representam uma carga
viral baixa).
38
No presente estudo, amostras de CHIKV detectadas em fase aguda apresentaram maior
carga viral quando comparadas com as amostras detectadas entre 16 a 20 dps (Gráfico 5).
Apenas um estudo do nosso conhecimento mostrou o quantitativo de RNA viral do CHIKV na
urina. Esse estudo foi realizado por Jones & Okeoma em urina de camundongos coletadas com
plasma autólogo. A curva da quantidade de RNA viral detectada na urina e em comparação ao
soro mostrou alta carga viral no 3º dia de infecção e entre os dias 9 a 30 dps. Esse padrão é
semelhante ao encontrado no nosso estudo e sugere, então, que o período de excreção de
CHIKV em pacientes confirmados com febre chikungunya deve ser melhor investigado. A alta
carga viral encontrada para esse vírus na fase aguda da doença, pode significar uma elevada
taxa de excreção já nos primeiros dias da infecção.
Ao distribuir os vírus detectados nas urinas por regiões do estado do Rio de Janeiro, foi
possível perceber que a Região Metropolitana, mesmo com o maior número de amostras
pesquisadas (81%), apresentava uma das menores taxas de circulação para os vírus da dengue
e chikungunya (2,3%), enquanto regiões com baixos número de amostras foram capazes de
evidenciar uma maior circulação desses vírus. A Região Serrana apresentou o maior percentual
de circulação viral (27,3%), mesmo contribuindo com apenas 5% do total de amostras
analisadas (Figura 6). Esses resultados dão uma visão sugestiva da distribuição viral pelo
território do estado do Rio de Janeiro. A vigilância de arboviroses permite monitorar a
emergência de casos e estimar a real ocorrência dessas infecções, podendo então facilitar o
diagnóstico, manejo clínico e medidas de controle. Esse trabalho em conjunto com outros, já
publicados, mostrou o aumento da janela de detecção desses vírus com o uso da urina. Por isso,
se levarmos em consideração a coleta de espécimes (soro e urina) de acordo com a melhor fase
de detecção, então um maior número de casos com diagnóstico fechado poderia ser obtido. Isso
seria muito importante para a vigilância epidemiológica dessas arboviroses, uma vez que seria
possível um melhor panorama da circulação viral.
Os dados desse estudo apontam a aplicabilidade da urina como amostra para o
diagnóstico das arboviroses principalmente em fase convalescente. A urina por, geralmente,
não precisar de procedimentos invasivos para sua obtenção, permite a coleta de várias amostras
sequenciais sem causar danos ao paciente e diminui os custos. Um acompanhamento do período
de excreção dos vírus deve ser realizado em pacientes com diagnóstico confirmado das referidas
arboviroses, afim de padronizar o manejo clínico e aprimorar os serviços de vigilância.
39
6. CONCLUSÕES
O vírus da dengue e o vírus Chikungunya foram detectados nas amostras clinicamente
triadas como suspeitas de infecção por ZIKV.
O vírus da dengue foi detectado, principalmente, após o 5º dps. O título viral durante a
excreção, nas diferentes fases da doença, permaneceu constante.
O Vírus Chikungunya foi detectado, principalmente, na fase aguda da doença. O título
viral durante a excreção foi maior na fase aguda da doença do que no período de
convalescença.
A detecção tardia após o 16º dps foi observada tanto para o vírus da dengue quanto para
o CHIKV, demonstrando que a urina é uma opção para o aumento da janela de detecção viral.
A amostragem utilizada permitiu identificar que a Região Serrana era, no período do
estudo, a região do estado com maior circulação dos vírus da dengue e da chikungunya.
40
7. REFERÊNCIAS
ALBUQUERQUE, I. G. C. et al. Chikungunya virus infection: report of the first case
diagnosed in Rio de Janeiro, Brazil. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical,
v. 45, n. 1, p. 128–129, fev. 2012.
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new perspective for diagnosis and implications for transmission. IDCases, v. 6, n.
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48
ANEXOS
Pesquisador:
Título:
Instituição:
Versão:
CAAE:
PARECER CONSUBSTANCIADO DO CEP
Número do Parecer:
Data da Relatoria:
Análise de soro de pacientes enviados ao LACEN com suspeita de Dengue: Caracterizaçãomolecular do vírus, análise dos resultados negativos, associação do quadro clínico com co-infecções e busca de marcadores de gravidade da doença.
Davis Fernandes Ferreira
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DEJANEIRO - INSTITUTO DE MICROBIOLOGIA
1
00534012.6.0000.5257
37724
31/05/2012
Hospital Universitário Clementino Fraga Filho ((HUCFF/ UFRJ))
Plataforma Brasil - Ministério da Saúde
PROJETO DE PESQUISA
Área Temática:
Apresentação do Projeto:
Constam os seguintes documentos no protocolo apresentado: Folha de Rosto, Concordância Colaboradores,Concordância Departamento, Concordância Noel Nutels (Co-participante), Termo de Cooperação Técnica, Fichade Estudo, Isenção TCLE, Cronograma Detalhado, Currículos Colaboradores, Projeto.
Objetivo da Pesquisa:
Objetivo Primário:Buscar um melhor entendimento das epidemias e suas conseqüências para a população do Estado do Rio deJaneiro, utilizando amostras de fluídos e excreções biológicas enviadas ao LACEN para pesquisa epidemiológicae básica.Objetivo Secundário:- Caracterização dos vírus dengue circulantes no Brasil, com foco no Estado do Rio de Janeiro; - Análise dossoros com diagnóstico negativo, embusca de agentes infecciosos que estejam circulando na população com sintomatologia similar à dengue; - Buscade agentes infecciosos quepossam ser responsáveis por um quadro mais grave no paciente com dengue, mediante à co-infecção; -Utilização das amostras para a detecção demarcadores de gravidade de doenças infecciosas, tornando o diagnóstico mais eficiente e de menor custo.
Avaliação dos Riscos e Benefícios:
Riscos:Não existe risco para pacientes para a realização deste projeto, uma vez que estaremos manejando amostras jácoletadas para diagnóstico e estocadas, e, portanto, não teremos contato com os pacientes. Os riscoscompreendem o manejo de amostras biológicas pelos alunos/técnicos, que são devidamente esclarecidos nasquestões de biossegurança.Benefícios:Os benefícios deste projetos são inúmeros, e aqui estão os principais: - Permitir, através do sequenciamento dasamostras de dengue detectadas, o mapeamento da circulação e modificações genéticas dos vírus circulantes; -Melhoria de testes diagnósticos já estabelecidos; - Detecção de vírus que possam co-infectar os pacientes comdengue e ter papel na patogênese; - Detecção de novos vírus na população; - Esclarecimento dos casosnegativos para dengue, mas com histórico clínico similar à dengue.
Comentários e Considerações sobre a Pesquisa:
Metodologia de Análise de Dados:A análise filogenética será realizada utilizando o programa MEGA 5.0 (www.megasoftware.net) e a edição dasequência nucleotídica será realizadasutilizando o programa BioEdit. Para os levantamentos dos valores de incidência e prevalência, programas deestatística serão utilizados.Desfecho Primário:Primeiramente teremos o sequenciamento do Dengue 4 circulante no Rio de Janeiro, e a pesquisa de agentesinfecciosos nos soros comdiagnóstico negativo para dengue.
Metodologia Proposta:a - Análise molecular dos vírus da dengue - A proteína E do envelope do vírus da dengue obtidos a partir desoros de pacientes em fase aguda da doença será seqüenciada e analisada por árvore filogenética (neighbor-joining phylogenetic tree). As seqüências serão comparadas com seqüências de outros genótipos conhecidos edepositados no GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov). As seqüências serão alinhadas utilizando o programaClustalX(www.ebi.ac.uk/clustalw), e a análise filogenética será feita utilizando o MEGA 4.0 (www.megasoftware.net), deacordo com o modelo de Tamura-Nei.3.2;b - Análise dos soros negativos para dengue - Soros de fase agudacom diagnóstico negativo para dengue serão analisados por PCR para a presença de agentes etiológicos deoutras doenças, que possuem sintomas similares ao da dengue. Dentre estes, os principais agentes serão Febreamarela, rubéola, influenza, sarampo, leptospirose, ricketsias, malária e outras arboviroses, como o vírus Oestedo Nilo, entre outros Flavivirus e alphavirus. A análise será feita primeiramente para reconhecimento dediferentes famílias virais, como flavivirus, alphavirus e bunyavirus (estes três dentro dos grupos dos arbovirus),paramyxovirus e ortomyxovirus. Mediante ao resultado positivo para alguma destas famílias, a amostra seráanalisada para diferentes membros da família viral detectada. Caso negativo nesta primeira análise, serãopesquisados agentes não virais, como leptospirose, malária e ricketsias.c - Pesquisa de co-infecção - Asamostras de dengue serão agrupadas entre os diferentes quadros clínicos, ou seja, dengue clássico, denguecom complicações, dengue hemorrágico, síndrome de choque da dengue. Estas amostras serão analisadas paraa detecção de outros agentes principalmente hepatotrópicos, como Hepatites A, B e C, o vírus da Febre amarelae citomegalovírus. Os resultados serão analisados de forma a detectar padrões estatisticamente significativos deinteração da infecção por diferentes agentes com a infecção pelo vírus da dengue em pacientes.d - Avaliação douso das proteínas recombinantes NS1 dos 4 sorotipos de dengue e de anticorpos policlonais anti-NS1 em testede diagnóstico - A glicoproteína NS1 recombinante previamente clonada será utilizada em testes de ELISA paraavaliar a resposta de IgM e/ou IgG em soros de pacientes infectados com dengue. Para garantir a especificidadedo ensaio, será testada uma gama de amostras provenientes de infecções por diferentes sorotipos e pordiferentes epidemias, assim como amostras de indivíduos infectados com outros flavivírus (febre amarela).Critério de Inclusão:- Serão utilizadas apenas amostras que já tenham sido utilizadas para o fins diagnósticos já realizados noLACEN-RJ, sendo, portanto, amostras que já tiveram seu diagnóstico concluído, estão estocadas e semutilidade para o paciente. - Serão apenas utilizadas amostras que após a utilização pelo LACEN tenha volumede sobra suficiente para a pesquisa a ser realizada e que fique pelo menos 200 uL com o LACEN.Critério de Exclusão:- As amostras serão examinadas para excluir qualquer amostra que não corresponda ao mesmo padrão dequando a amostra foi recebida;b - As amostras serão observadas para a presença de contaminantes, máconservação, informação no tubo ilegível, ou qualquer outro fator que torne a amostra suspeita ou inviável parapesquisa.
Considerações sobre os Termos de apresentação obrigatória:
1. Por se tratar de estudo retrospectivo em amostras já coletadas e estocadas no LACEN, há pedido de isençãodo TCLE. Solicitação atendida.
Recomendações:Recomenda-se que as respostas sejam ordenadas de acordo com a ordenamento da listagenm das pendências.
Conclusões ou Pendências e Lista de Inadequações:
O armazenamento de material biológico pode ser efetuado com finalidade de assistência (comum emlaboratórios de análises clínicas ou patologia) ou para pesquisa. Nessa última eventualidade - objeto desteprotocolo - se caracteriza a existência de um Biobanco, a qual deve obedecer à legislação específica(Resolução CNS n.441 de 12 de maio de 2011 e Portaria n. 2.201 do Ministério de Estado da Saúde, de 14 desetembro de 2011). Este CEP enviou mensagem eletrônica para o cadastro de seus pesquisadores, em 6 demaio de 2012, com o seguinte teor "Lembramos a todos que de acordo com a Resolução CNS 441 de 12 demaio de 2011, encerra-se no próximo dia 12 de maio o prazo para regularização do cadastro de Biobancos.Quaisquer dúvidas poderão ser encaminhadas para [email protected]<http://conselho.saude.gov.br/Web_comissoes/conep/index.html"
Não há orcamento detalhado. Solicita-se apresentação.
Necessita Apreciação da CONEP:
Situação do Parecer:
Pendente
Considerações Finais a critério do CEP:
Nenhuma outra consideração
Não
RIO DE JANEIRO, 17 de Junho de 2012
Carlos Alberto GuimarãesAssinado por: