diabetes mellitus tipo 2. -...
TRANSCRIPT
i
VIVIANE TANNURI FERREIRA LIMA FALCÃO
"IMPORTÂNCIA DO CONTATO INTERCELULAR NO
PÂNCREAS ENDÓCRINO MEDIADO PELAS JUNÇÕES
CELULARES E SEU PAPEL NA PATOGÊNESE DA
DIABETES MELLITUS TIPO 2."
Campinas, 2014
ii
iiiiii
iii
iv
v
vi
vii
RESUMO
As junções intercelulares (JIs) e suas proteínas estruturais estão envolvidas em vários
processos celulares tais como adesão e comunicação celular, diferenciação, proliferação e
homeostase celular em diversos órgãos. No pâncreas endócrino, JIs parecem estar
envolvidas na regulação da citoarquitetura das ilhotas pancreáticas, bem como na
biossíntese e secreção de insulina. O objetivo desta tese foi investigar o possível papel do
contato intercelular mediado pelas junções intercelulares e suas proteínas estruturais na
disfunção das células beta pancreáticas na patogênese do Diabetes mellitus tipo 2 (DMT2).
Para tanto, investigamos a distribuição e expressão celular de proteínas juncionais (a saber,
E-, N-, VE-caderinas, ZO-1, β- e α - cateninas) no pâncreas endócrino de camundongos
C57BL/6/JUnib alimentados com uma dieta rica em gorduras (dHL) durante 8 meses.
Inicialmente, foi feita uma caracterização metabólica dos animais e uma análise estrutural e
morfométrica do pâncreas endócrino, já que estudos avaliando o efeito da administração de
dHL por tempo prolongado são escassos. Os animais do grupo dHL (alimentados com
ração contendo 21%g lipídios por 8 meses) tornaram-se obesos, mostrando importante
aumento do ganho de peso (170%) em relação ao grupo controle (que recebeu ração padrão
com 4,5%g lipídios pelo mesmo período de tempo). Ainda, os camundongos obesos
exibiram distúrbios metabólicos característicos e indicativos dos estágios iniciais do
estabelecimento da DMT2, como resistência periférica a insulina, com um aumento (de
27,34%, p=.0,0005) da área sob a curva de ITT, bem como marcada hiperglicemia em
jejum (52%, p<0,0001) e hiperinsulinemia pós-prandial (88%, p=0,0058) em relação ao
grupo controle. Ilhotas pancreáticas isoladas de camundongos alimentados com dHL
mostraram uma deficiência significativa da secreção de insulina estimulada por glicose
(p<0,05), associada a um aumento da expressão do gene da insulina (isoformas 1 e 2),
analisado por qPCR. A histologia do pâncreas endócrino não revelou alterações marcantes
na morfologia e citoarquitetura das ilhotas entre os grupos de animais. Entretanto, os
animais dHL apresentaram um aumento significativo do volume relativo de células β por
pâncreas total (aumento de 57,1%, p<0,036) e da área relativa de células β por ilhota em
relação ao grupo controle (p<0,003), indicando uma expansão compensatória da massa de
célula β, associada com uma significativa diminuição (p<0,003) da área ocupada pelas
células α em relação à área total da ilhota (30%, p<0,003). Com relação à distribuição
celular das proteínas juncionais nas ilhotas pancreáticas, a N-caderina, E-caderina, ZO-1 e
cateninas estão distribuídas na região de contato intercelular das células endócrinas
pancreáticas, enquanto que a VE-caderina está limitada ao endotélio. Verificou-se, por
imunoistoquímica, uma diminuição na marcação intercelular das células β para N-caderina
(p<0,0001), E-caderina (p<0,0001) e α-catenina (p<0,0001) e um aumento na imunoreação
para VE-caderina (p<0,004) nas ilhotas de camundongos diabéticos em relação ao grupo
controle. No caso particular da imunofluorescência para N-caderina, verificou-se um
aumento na marcação difusa do interior das células β, indicando uma redistribuição dessa
viii
proteína da região de contato intercelular para o citoplasma. Entretanto, não observamos
diferenças significativas no grau do conteúdo celular dessas proteínas juncionais, analisado
por Western Blot, em homogeneizados de ilhotas isoladas entre os grupos experimentais.
Conforme revelado por qPCR, um aumento na expressão gênica da VE- e N-caderinas, bem
como de ZO-1, foi observado em ilhotas isoladas de camundongos diabéticos em
comparação com os controles. Em conclusão, as proteínas juncionais estudadas são
expressas por células endócrinas e endoteliais das ilhotas pancreáticas e, em particular, a
distribuição/expressão de N-, E- e VE-caderinas, bem como α-catenina nas ilhotas é
significativamente alterada em camundongos obesos e diabéticos, o que pode ter
repercussão no desenvolvimento da DMT2.
ix
ABSTRACT
Intercellular junctions (IJs) and their cell adhesion molecules (CAMs) participate in
important cellular processes such as adhesion, growth/death and signaling. In the endocrine
pancreas, IJs play a role in regulating islet cytoarchitecture, insulin biosynthesis and
secretion. In this PhD thesis, we investigated the islet histology and cellular distribution and
content of CAMs (E-, N-, VE-cadherins, ZO-1, α- and β-catenins) in the endocrine
pancreas of C57BL/6/JUnib mice fed a high fat (HF) diet for a prolonged time period (8
months). After HF diet exposure, mice became obese and displayed marked metabolic
disturbances indicative of type 2 diabetes mellitus, such as marked peripheral insulin
resistance and hyperglycemia, and moderate hyperinsulinemia. Isolated pancreatic islets of
HF-fed mice showed a significant impairment of glucose-stimulated insulin secretion
associated with an increase in insulin (isoforms 1 and 2) gene expression as revealed by
qPCR. Histology of the endocrine pancreas revealed no marked changes in islet
morphology and cytoarchitecture between animal groups, although HF-fed mice showed a
57% increase in the relative β cell volume (per total pancreas) in comparison with controls.
As shown by immunohistochemistry, ZO-1, E-, N-cadherin and catenins, were expressed at
the intercellular contact site of pancreatic endocrine cells while VE-cadherin was restricted
to the islet vascular compartment. A cellular redistribution of N- and E-cadherins and α-
catenin (from the contact region to the cytoplasm in endocrine cells) and an increase in VE-
cadherin islet content were seen in diabetic mice as compared to controls. No significant
differences in islet immunoreaction for the other CAMs were observed between the animal
groups. As revealed by qPCR, an increase in gene expression of VE- and N-cadherins as
well as of ZO-1, not accompanied by significant changes in islet protein content, was
observed in isolated islets of diabetic mice as compared to the controls. In conclusion,
CAMs are expressed by endocrine and endothelial cells of pancreatic islets and, in
particular, the islet distribution/content of N-, E- and VE-cadherins as well as α-catenin are
significantly altered in obese and diabetic mice.
x
xi
SUMÁRIO
CAPÍTULO 1
1. INTRODUÇÃO................................................................................................ 25
1.1 ESTRUTURA DA PRESENTETESE.......................................................... 25
1.2 INTRODUÇÃO AO TEMA DESSA TESE................................................. 25
1.2.1 JUNÇÕES CELULARES............................................................................. 25
1.2.2 PÂNCREAS ENDÓCRINO: MORFOLOGIA E FUNÇÃO........................ 29
1.2.3 DIABETES MELLITUS TIPO 2 E DISFUNÇÃO DA CÉLULA β.............. 34
1.3OBJETIVOS E RELEVÂNCIA DESSA TESE........................................... 33
CAPÍTULO 2
2. MATERIAL E MÉTODOS............................................................................. 41
2.1 PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS........................................................... 41
2.2 ANIMAIS......................................................................................................... 42
2.3 DIETA HIPERLIPÍDICA............................................................................... 42
2.4 AVALIAÇÃO METABÓLICA DO ANIMAL............................................... 43
2.5 ISOLAMENTO DE ILHOTAS PANCREÁTICAS........................................ 43
2.6 SECREÇÃO ESTÁTICA DE INSULINA....................................................... 44
2.7 AVALIAÇÃO MORFOLÓGICA E MORFOMÉTRICA DO PÂNCREAS
ENDÓCRINO......................................................................................................... 44
2.8 IMUNOISTOQUÍMICA PARA INSULINA................................................... 45
2.9 AVALIAÇÃO DA CITOARQUITETURA DAS ILHOTAS
PANCREÁTICAS................................................................................................. 46
2.10 IMUNOLOCALIZAÇÃO E ANÁLISE DO GRAU DE MARCAÇÃO
DAS PROTEÍNAS JUNCIONAIS EM CORTES DE PÂNCREAS
ENDÓCRINO......................................................................................................... 47
xii
2.11 AVALIAÇÃO DO GRAU DE MARCAÇÃO POR
IMUNOFLUORESCÊNCIA.................................................................................. 48
2.12 WESTERN BLOT.......................................................................................... 49
2.13 PCR EM TEMPO REAL................................................................................ 50
2.14 ANÁLISE ESTATÍSTICA............................................................................. 56
CAPÍTULO 3
3. ARTIGO CIENTÍFICO................................................................................... 57
3.1 INTRODUÇÃO.............................................................................................. 57
3.2 MATERIAL E MÉTODOS........................................................................... 60
3.3 RESULTADOS............................................................................................... 64
3.4 DISCUSSÃO................................................................................................... 70
3.5 FIGURAS........................................................................................................ 81
CAPÍTULO 4
4.1 CONCLUSÕES............................................................................................... 99
4.2 CONCLUSÃO ESQUEMÁTICA................................................................. 101
CAPÍTULO 5
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................... 103
ANEXOS............................................................................................................... 119
xiii
Aos meus filhos,
fonte da minha inspiração:
Felipe,
Thiago,
Marcela e
Germana e Duda que tem um espaço especial em meu coração,
À Marcelo,
Meu amor, meu companheiro...
“O sonho é ver as formas invisíveis
Da distância imprecisa, e, com sensíveis
Movimentos da esperança e da vontade,
Buscar na linha fria do horizonte
A árvore, a praia, a flor, a ave, a fonte ---
Os beijos merecidos da Verdade”.
Fernando Pessoa
xiv
xv
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus que é o Senhor de todas as coisas e nos guia por caminhos que por vezes
não conseguimos entender, e que sempre nos levam ao crescimento.
A Marcelo, Felipe, Thiago e Marcela, marido e filhos que souberam entender meus
momentos longos de ausência, de muito trabalho, de alegrias, de saudades. Se vocês não
estivessem sempre do meu lado, apoiando, cuidando, amando, não sei se teria conseguido
transpor os desafios. Sem o amor de vocês, nada seria possível!
A meus pais Nemyr e Marilene por me mostrarem, que todos os momentos da vida, mesmo
aqueles mais difíceis, nos trazem grandes ensinamentos e que portanto, é preciso respeitá-
los sempre. Amo vocês!
Aos meus irmãos, Eliane, Janine e Flávio e meus cunhados e cunhada, Mauro, Rodolfo e
Adriana e minha irmã de coração, Verônica, vocês são especiais, toda a alegria e torcida,
mesmo que de longe, foi sempre sentida muito de perto...
A minha orientadora Professora Dr Carla Beatriz Collares Buzato, a quem eu gostaria de
agradecer especialmente e muito carinhosamente, sua competência, gentileza e
generosidade em atos e palavras me ensinaram muito. Ensinar é um exercício de
imortalidade. Como disse Cora Coralina Coralina “Feliz aquele que transfere o que sabe e
aprende o que ensina”.
Aos meus queridos Ricardo, Dani e Carol, conviver com vocês nestes 4 anos foi para mim
uma grande experiência! Vocês não podem imaginar a importância que têm em minha vida
e como são especiais para mim, companheiros de bancada, de alegrias, as vezes de tristezas,
de desafios...saudades sempre!!!
xvi
A minha doce Célia, sua generosidade me encanta! Cada mimo, cada palavra, cada gesto,
vêm sempre carregado da sua nobre delicadeza. Só tenho a agradecer a convivência nestes
anos que me fez aprender muito, muito...
A Mariane, Vanessa, Max, Letícia, e Mariana, agradeço pelo carinho, pelo
companheirismo, pelas horas na bancada, no biotério, pelos momentos de descontração,
comendo as delícias da Dani e ou da Célia...muito obrigada!
A Leandro, Bárbara e mais recentemente Valquíria, queria agradecer pelos bons momentos,
boas conversas, pelo ótimo trabalho no laboratório...
Gostaria de agradecer aos professores do DINTER em nome da professora Sarah Arana e
do professor Paulo Juazeiro, vocês foram muito importantes em minha formação. Os
ensinamentos passados foram valiosos...
A todos os professores do DHE, que estiveram sempre disponíveis em auxiliar nos
momentos de necessidade.
A Cíntia, D. Raquel, Natália, Stephanie, técnicas do DHE que em todos os momentos
estavam sempre prontas a contribuir e ajudar.
A todos os estudantes e funcionários do DHE, especialmente os colegas do laboratório da
profa Maria Alice, que estiveram sempre presentes e disponíveis a ajudar quando
necessário.
A Adriana, Nara e Helena que participaram comigo dos momentos difíceis para realização
da técnica do PCR em tempo Real, e que estiveram firmes, apoiando e ensinando sempre!
Meu agradecimento especial.
A todos os técnicos e estudantes do Laboratório do Centro de Onco-hematologia Pediátrica
(HUOC-UPE), fundamentais em meu aprendizado, o meu agradecimento!
xvii
A professora Dra Maria Tereza Cartaxo Muniz, minha co-orientadora, pela ajuda, apoio e
conhecimento compartilhado. Muito obrigada!!
A professora Dra Anna Carolina, que me acolheu, me ensinou, me acompanhou, pegou na
minha mão, trabalhou junto me ensinando não apenas a técnica do qPCR, mas
principalmente a importância de ser solidário. Se existem anjos no universo, certamente
você foi um deles nessa jornada!!! Muito obrigada por tudo.
Ao Professor Dr Marcos Morais – Departamento de Genética da UFPE – Universidade
Federal de Pernambuco, que gentilmente me cedeu o laboratório, para que eu pudesse
desenvolver o qPCR. Muito obrigada!
A todos que fazem a Direção da Faculdade de Enfermagem Nossa Senhora das Graças pelo
apoio, amizade, e compreensão nos períodos em que a ausência foi necessária. Muito
obrigada por tudo!!!
A professora Deuzany Leão, companheira de todas as horas, pela criatividade, carinho,
compreensão e paciência nos momentos longos de ausência.
A professora Vera Gregório que me incentivou e foi muito importante na minha decisão em
cursar o doutorado. Muito obrigada por tudo!!!
As professoras Amparo, Katiúscia, Sandra, Fábia, Betânia, Claúdia e Jael, por conduzirem
brilhantemente a FENSG nos meus períodos de ausência, buscando sempre fazer o melhor.
Ao corpo administrativo da FENSG, a quem agradeço em nome de Léa, Eliete, Madalena,
Sandra, Nadir, Fátima e Vera, todos vocês foram muito importantes no caminhar desta
etapa, meu agradeceimento especial!
xviii
A professora Laurecir, a quem admiro, pelo conhecimento, carinho, apoio, dedicação para
que tudo acontecesse no momento certo e a contento. Só tenho a agradecer pela amizade e
acolhimento. Você foi muito importante em todo este processo!!!
A Universidade de Pernambuco pelo apoio nestes quatro anos a quem gostaria de agradecer
em nome da Professora Dra Viviane Colares, pró-reitora de pós-graduação e pesquisa.
As minhas queridas amigas e companheiras Neves e Izabel, sem o apoio de voês não sei se
teria conseguido. A amizade e o aprendizado construído ficarão para sempre!!! Agradeço
de coração a oportunidade de conviver com vocês e agora enfim...chegou o momento de
podermos dizer...conseguimos!!!
A turma do DINTER com quem aprendi muito, fiz amigos sólidos...estamos todos na reta
final, os momentos que passamos juntos serão sempre lembrados. Parabéns a todos!!!
A Eduardo pelas aulas de Bioquímica tão importantes para o nosso aprendizado!
A Andréa pelo carinho, os lanches no final da tarde ficarão na lembrança!!
Meu agradecimento aos professores membros da banca examinadora, que gentilmente
aceitaram o convite e que certamente terão contribuições valiosas para esta Tese.
A Líliam sempre tão disponível em atender, esclarecer incansavelmente! Obrigada pelo
carinho!
À Universidade Estadual de Campinas e ao Programa de Pós-Graduação em Biologia
Celular e Estrutural, pela oportunidade concedida.
Agradeço às agências de fomento CAPES-DINTER, CNPq e FAPESP pelo apoio
financeiro concedido.
xix
De tudo ficaram três coisas:
A certeza de que estamos sempre começando...
A certeza de que é preciso continuar...
A certeza de que podemos ser interrompidos antes de terminar...
Portanto façamos:
Da interrupção, um caminho novo...
Da queda, um passo de dança...
Do medo, uma escada...
Do sonho, uma ponte...
Da procura, um encontro...
(Fernando Sabino)
xx
xxi
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 2
Tabela I - Composição das Rações Utilizadas........................................... 42
Tabela II - Grau de Alteração da Citoarquitetura........................................ 47
Tabela III - Diluição e Fabricante dos Anticorpos para Imunoistoquímica.. 48
Tabela IV - Diluição e Fabricante dos Anticorpos para Western Blot......... 50
Tabela V - Concentração e Integridade do RNA......................................... 51
Tabela VI - Primers Específicos Utilizados no qPCR.................................. 52
Tabela VII - Valores de Eficiência e slope da Reação de qPCR.................... 54
xxii
xxiii
LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO 1
FIGURA 1 - Representação esquemática das proteínas integrantes e associadas
às junções intercelulares.................................................................. 27
CAPÍTULO 2
FIGURA 2 - Verificação da amplificação dos fragmentos por RT-
PCR................................................................................................ 53
FIGURA 3 - Verificação da amplificação dos fragmentos por RT-
PCR..................................................................................................
. 53
FIGURA 4 - Verificação da especificidade de amplificação dos
primers........................................................................................... 56
CAPÍTULO 3
FIGURA 5 - Camundongos C57BL/6J se tornam obesos e diabéticos após a
alimentação com dieta hiperlipídica (dHL) por tempo
prolongado...................................................................................... 81
FIGURA 6 - Ilhotas pancreáticas de camundongos diabéticos apresentam
diminuição da secreção de insulina estimulada por
glicose............................................................................................ 83
FIGURA 7 - A exposição prolongada à dieta hiperlipídica (dHL) (8 meses)
induz a expansão da massa de células beta, sem alteração
marcante na citoarquitetura da ilhota...............................................
85
FIGURA 8 - A exposição prolongada (8 meses) à dieta hiperlipídica (dHL)
induz uma diminuição significativa no conteúdo juncional de E-
caderina, que não é acompanhada por alterações na expressão
dessa molécula de adesão em células β dos camundongos
diabéticos........................................................................................
87
xxiv
FIGURA 9 - A exposição prolongada à dieta hiperlipídica (dHL) induz
marcada redistribuição celular de N-caderina, que não é
acompanhada por alteração significativa no conteúdo celular
dessa molécula de adesão em células β dos camundongos
diabéticos........................................................................................
89
FIGURA 10 - Aumento na imunomarcação para VE-caderina em ilhotas
pancreáticas de camundongos diabéticos após a exposição
prolongada a dieta hiperlipídica (dHL)............................................
91
FIGURA 11 - A exposição prolongada à dieta hiperlipídica (dHL) induz
diminuição do teor juncional de α-catenina, mas nenhuma
mudança significativa na marcação de ZO-1 e β-catenina em
células β de camundongos diabéticos.............................................. 93
FIGURA 12 - Nenhuma alteração significativa no conteúdo celular de ZO-1, α-
e β-cateninas foi visto em homogeneizados de ilhotas dos
camundongos diabéticos em comparação com os controles............
95
FIGURA 13 -
Efeito da exposição prolongada à dieta hiperlipídica (dHL) sobre
a expressão gênica de proteínas juncionais em estudo e insulina
em ilhotas pancreáticas de camundongos diabéticos em
comparação com os controles.........................................................
97
FIGURA 14 Conclusão Esquemática................................................................... 107
25
Capítulo 1
CAPÍTULO 1
1. INTRODUÇÃO
1.1 ESTRUTURA DA PRESENTE TESE
Essa tese está estruturada em cinco capítulos. O atual Capítulo apresenta uma visão
geral do tema, descrevendo de forma sucinta o pâncreas endócrino com ênfase à célula β,
bem como a importância das interações celulares mediada pelas junções celulares no
processo de secreção de insulina e a repercussão da disfunção da célula β na patogênese da
diabetes mellitus tipo 2. No Capítulo 2, há a descrição detalhada de todas a metodologias e
procedimentos empregados no desenvolvimento dessa tese. O Capítulo 3, por sua vez,
aborda, na forma de artigo científico escrito na língua portuguesa, os resultados obtidos e a
discussão dos mesmos em face à literatura científica, destacando a relevância das
descobertas desse estudo. No Capítulo 4, são apresentadas as conclusões gerais obtidas com
o desenvolvimento desta tese. Por fim, no Capítulo 5, está a lista de referências citadas ao
longo de toda a tese.
1.2 INTRODUÇÃO AO TEMA DESSA TESE
1.2.1 Junções Celulares
As células organizadas em tecidos e/ou órgãos se aderem e interagem entre si por
meio de uma série de especializações da membrana plasmática denominadas junções
intercelulares (Collares-Buzato, 2013; Diamond, 1977). Ultraestruturalmente são
identificados quatro tipos de junções intercelulares: 1) a junção de oclusão (tight junction)
(JO), local onde ocorre uma fusão aparente das membranas plasmáticas de células
adjacentes; 2) a junção aderente (JA) (zonula ou fasciae adherens), região caracterizada
pela aproximação e alinhamento de duas membranas adjacentes, delimitando um espaço
intercelular de 15-20 nm, e onde, na sua face citoplasmática, ocorre ancoragem dos
26
Capítulo 1
microfilamentos do citoesqueleto; 3) o desmossomo (ou maculae adherens), onde as
membranas adjacentes aparecem como duas placas lineares, paralelas e elétron-densas, às
quais se associam os filamentos intermediários do citoesqueleto e 4) a junção comunicante
(ou gap junction), região de íntima aproximação de membranas adjacentes onde se inserem
uma coleção de canais intercelulares, que conectam os citoplasmas de duas células vizinhas
(Collares-Buzato, 2013).
Funções específicas têm sido atribuídas a cada uma das junções intercelulares, tendo
como base sua morfologia e composição bioquímica. Dentre as junções intercelulares, a
junção comunicante foi uma das primeiras a ser estudada e caracterizada bioquimicamente.
A função primordial desta junção é mediar a comunicação intercelular direta (Collares-
Buzato, 2013; Mese et al., 2007; Musil, 1994). Atualmente, sabe-se que os canais
intercelulares das junções comunicantes são formados por proteínas transmembranas
pertencentes à super-família das conexinas, que são codificadas por vários genes e
expressas de maneira animal- e célula- específica (Mese et al., 2007). As junções
comunicantes formam a base morfo-funcional das sinapses elétricas no sistema nervoso
central, permitindo a condução rápida do impulso nervoso (Rozental et al., 2000);
participam do acoplamento celular importante na secreção hormonal pelas glândulas
endócrinas (Meda et al., 1991); em células musculares, a junção comunicante permite que o
músculo cardíaco funcione como um sincício e coordena a contração da musculatura lisa
(Paul, 1995). Algumas doenças têm sido associadas à disfunção da junção comunicante,
como por exemplo, a cardiopatia na Doença de Chagas (Campos de Carvalho et al., 1992),
a Doença de Charcot-Marie-Tooth, uma neuropatia periférica ligada ao cromossomo X
(Ressot & Bruzzone, 2000) e alguns tipos de catarata e surdez hereditárias (Lai-Cheong et
al., 2007; Mathias et al., 2010; Mese et al., 2007).
As outras junções intercelulares, a saber, a JO, a JA e os desmossomos, estão
envolvidas na adesão intercelular. Embora bioquimicamente bem distintas entre si, elas
apresentam uma estrutura molecular análoga. Cada unidade juncional é formada por
proteínas transmembranas específicas que interagem com o citoesqueleto através de um
complexo protéico associado à região citoplasmática da junção (Madara, 1998) (Figura 1).
27
Capítulo 1
Fig. 1. Representação esquemática das proteínas integrantes e associadas às junções
intercelulares constituintes do complexo unitivo (junção de oclusão, aderente e
desmossomos) e suas interações com componentes do citoesqueleto. Esquema adaptado de
Collares-Buzato (2013).
A junção aderente e os desmossomos contém moléculas de adesão dependentes de
cálcio, pertencentes à super-família das caderinas (Ebnet, 2008; Geiger & Ayalon, 1992).
Tais moléculas são glicoproteínas de superfície que promovem a coesão de células
adjacentes e interagem com o citoesqueleto por intermédio das cateninas (α-, β-, δ-
cateninas e p120), alfa-actinina e vinculina, no caso da junção aderente, e do complexo
desmoplaquina/placoglobina, nos desmossomos (Ebnet, 2008; Knudsen et al., 1995;
Mathur et al., 1994). A formação e a manutenção da arquitetura tecidual são conseqüências
da firme adesão entre células vizinhas promovida pela junção aderente e desmossomos
28
Capítulo 1
(Geiger & Ayalon, 1992). A junção aderente está também envolvida na formação e
manutenção da estrutura de todas as junções intercelulares, na conservação da polaridade
celular e no reconhecimento intercelular durante a organogênese (Eaton & Simons, 1995;
Geiger & Ayalon, 1992). O comprometimento do mecanismo de adesão celular pode levar
ao desencadeamento do processo tumoral, à dediferenciação e hipermotilidade celular no
câncer e metástase (Collares-Buzato, 2007; Conacci-Sorrell et al., 2002). A importância
dos desmossomos como estrutura de adesão é também apreciada pelo seu envolvimento no
pênfigo, uma doença dermatológica crônica (pênfigo vulgar e pênfigo foliáceo) (Shimizu et
al., 1995; Waschke, 2008).
A junção de oclusão, por sua vez, exerce um papel fundamental de barreira de
difusão pela via paracelular, essencialmente em endotélios e epitélios de revestimento
(Farquhar & Palade, 1963; Mitic et al., 2000). Além disto, este tipo de junção realiza a
manutenção da distribuição assimétrica (polaridade) de proteínas e lipídios entre os
domínios apical e basolateral da membrana de células epiteliais e funciona como
dispositivo de adesão intercelular em outros tipos celulares (Gumbiner, 1987; Schneeberger
& Lynch, 1992). As proteínas ocludina e claudinas são os principais constituintes da rede
complexa de cordões de vedação que forma a junção de oclusão, responsáveis pelo contato
íntimo entre células adjacentes (Furuse et al., 1993; 1998). Proteínas citoplasmáticas
conhecidas como zonula occludens – ZOs (ZO-1, ZO-2, ZO-3) (Gumbiner et al., 1991),
cingulina (Citi et al., 1988), antígeno 7H6 (Zhong et al., 1993) e simplequinas formam um
complexo proteico que liga as proteínas transmembranas com o citoesqueleto na junção de
oclusão (Anderson, 2001; Ebnet, 2008; Guillemot et al., 2008). A junção de oclusão está
envolvida no processo de absorção intestinal de nutrientes (Madara, 1990), na
espermiogênese (Byers & Pelletier, 1992) e no trânsito de moléculas através dos capilares
cerebrais (Rubbin & Staddon, 1999). A função de barreira desempenhada pela junção de
oclusão pode ser modulada em várias condições experimentais (Collares-Buzato et al.
1994, 1998; Peixoto & Collares-Buzato 2005) bem como estar comprometida em alguns
estados patológicos como na transmigração de patógenos e/ou células através de epitélios e
endotélios durante infecção bacteriana intestinal (Jepson et al., 1995; 2000) e inflamação
(Evans et al., 1983).
29
Capítulo 1
Em adição à sua reconhecida função como dispositivos de adesão, pesquisas têm
indicado que essas junções intercelulares e suas proteínas integrantes estão associadas a
diferentes tipos de vias de transdução de sinais citoplasmáticos (Benmerah et al., 2003;
Conacci-Sorrell et al., 2002; Matter & Balda, 2003). A ideia vigente é que as proteínas
juncionais funcionariam como transdutores de sinais extra e intracelulares, transmitindo e
convertendo tais sinais no interior da célula e, assim, modulando a expressão gênica e
vários processos celulares tais como diferenciação, motilidade, proliferação e morte celular
(Kim et al., 2009; Li et al., 2009; Luebke-Wheeler et al., 2009; Luther et al. 2005; Parnaud
et al., 2011).
Tem sido demonstrado que as cateninas (em especial a β-catenina e a p120) da
junção aderente interagem com receptores de fatores de crescimento (tais como EGF, FGF
e HGF) e regulam a ação destes fatores na célula (Conacci-Sorrell et al., 2002).
Adicionalmente, várias proteínas juncionais, como a beta- e p120-cateninas, as ZOs (ZO-1
e ZO-2), a simplequina e cingulina, podem migrar para o núcleo e ativar fatores de
transcrição gênica (tais como o TCF/LEF-1 e a SAF-B proteína ligante ao DNA)
(Benmerah et al., 2003; Ebnet, 2008; Guillemot et al., 2008; Matter & Balda, 2003).
Apesar do conhecimento que se tem acumulado nesta área da fisiologia celular, o
estudo das junções intercelulares no que se refere à sua composição bioquímica e função
em certos tipos celulares ainda é relativamente escasso. Um exemplo disto é o pâncreas
endócrino.
1.2.2 Pâncreas endócrino: morfologia e função
No pâncreas endócrino, cinco tipos celulares (células β ou B, células α ou A, células
δ ou D, células PP e células ε, produtoras de grelina) se arranjam em unidades morfológicas
e funcionais denominadas ilhotas de Langerhans (Orci, 1976; Orci & Unger, 1975). Cada
ilhota é constituída por cordões de células, estas de formato poliédrico, entremeados por
uma rica rede de capilares sanguíneos do tipo fenestrado. Uma delicada cápsula de tecido
30
Capítulo 1
conjuntivo frouxo rico em fibras reticulares envolve as ilhotas e as separam do tecido
pancreático exócrino adjacente. Esta organização histológica das ilhotas pode estar alterada
em casos de disfunção pancreática, como na diabetes do tipo 2, onde alterações estruturais
têm sido documentadas (Janssen et al., 2003; Hong et al., 2002).
A homeostase glicêmica depende do equilíbrio da liberação dos hormônios do
pâncreas endócrino. Cada um deles tem uma função definida, como a insulina secretada
pelas células β pancreáticas, tem função hipoglicemiante. A insulina é o regulador mais
importante deste equilíbrio metabólico necessário para a manutenção da regulação da
glicose, porém outras substâncias também estão envolvidas no processo de utilização da
glicose, entre elas podemos citar o glucagon. Este hormônio é secretado pelas células α
pancreáticas e quando os níveis sanguíneos de glicose e insulina são baixos, estimula a
glicogenólise e a gliconeogênese pelo fígado e medula renal. No período pós-prandial, a
carga de glicose induz a elevação na insulina e queda do glucagon dando origem a uma
reversão destes processos.
O hormônio somatostatina é secretado pelas células δ (delta), que constituem cerca
de 5% a 10% das células das ilhotas pancreáticas. A somatostatina inibe hormônios
hipofisários, gastrointestinais e pancreáticos após a ingestão de alimentos, além disso,
possui funções neuroendócrinas. Um dos efeitos da somatostatina é aumentar o período de
absorção do alimento para o sangue; também é liberado para inibir a secreção de insulina e
glucagon (Kailey et al., 2012; Strowski et al., 2000) e aumentar o uso pelos tecidos dos
nutrientes absorvidos. Entretanto, não se sabe a real influência endócrina da somatostatina e
raramente ela é quantificada na prática clínica (Strowski, et al., 2000). Os demais
secretagogos do pâncreas endócrino parecem não ter sua função totalmente esclarecida: o
polipeptídeo P parece exercer uma função inibidora na secreção do pâncreas exócrino, e a
grelina, atualmente tem sido relacionada à inibição da secreção de insulina no homem e à
proliferação das células β durante desenvolvimento fetal em roedores (Andralojc et al.,
2009; Ekblad & Sundler, 2002; Kanno et al., 2002; Orci, 1976).
Com relação à disposição ou arranjo dessas células endócrinas na ilhota, temos no
caso de várias espécies (incluindo a de roedores), as células β ocupando o centro e as
31
Capítulo 1
células α e delta, localizadas na periferia da ilhota (Brissova et al., 2005; Carvalho et al.,
2006). As células PP, preferencialmente, também estão dispostas na periferia da ilhota
(Orci, 1984). Esta citoarquitetura ou arranjo preferencial dos tipos celulares dentro da
ilhota parece ser fundamental para o funcionamento deste órgão endócrino. Alterações da
citoarquitetura normal das ilhotas são verificadas durante o desenvolvimento da diabetes
experimental ou em experimentos in vitro: nesses casos, o padrão normal do arranjo das
células endócrinas, conforme anteriormente mencionado, é perdido e células não-β, como
por exemplo, as secretoras de glucagon, passam a ter distribuição aleatória ocupando
inclusive o centro das ilhotas (Cirulli et al. 1993; Hong et al., 2002; Wong et al., 2003).
Em cada ilhota, as diferentes células endócrinas se conectam, homotipica ou
heterotipicamente, por meio das junções intercelulares do tipo oclusão, comunicante,
aderente e desmossomos, como demonstrado por microscopia eletrônica (In’t Veld et al.,
1984; Orci et al., 1975). Tais contatos intercelulares parecem ser cruciais para o perfeito
funcionamento deste órgão. Dentre as junções intercelulares, as junções comunicantes têm
sido as mais estudadas no pâncreas endócrino, sendo documentada a presença de dois
principais subtipos de conexinas expressas pelas células endócrinas pancreáticas, a
conexina 43 (Cx43) e a conexina 36 (Cx36), dentre as quais a Cx36 parece ser a única
expressa pelas células β (Carvalho et al., 2010; Charpantier et al., 2007; Meda et al., 1991;
Nlend et al., 2006; Serre-Beinier et al., 2000, 2009; Vozzi et al., 1995). Há evidências da
importância da adesão e do acoplamento das células β no controle da secreção de insulina.
Células β, isoladas das ilhotas pancreáticas, mostram significante comprometimento da
resposta secretora estimulada de insulina - secreção basal de insulina aumentada, baixa
sensibilidade à glicose, diminuição na biossíntese de insulina. Entretanto, quando os
contatos entre as células β são restabelecidos, há uma rápida reversão dessas disfunções
(Bosco & Meda, 1997; Halban et al., 1982; Pipeleers et al., 1982, 1994). Diversos
procedimentos experimentais conhecidos por induzirem significativa secreção pancreática
de insulina, como exposição a altas concentrações de glicose, a certas drogas como
glibenclamide e ao tratamento com o hormônio prolactina, induzem significante aumento
na expressão de conexina e no acoplamento das células β mediado pelas junções
comunicantes (Collares-Buzato et al., 2001; Meda et al., 1979; Sorenson et al., 1987). Tem
32
Capítulo 1
sido também demonstrado nas linhagens de células β, MIN6 e INS-1E, que um nível
apropriado de interação intercelular e de expressão das conexinas é necessário para uma
adequada secreção de insulina estimulada pela glicose ou por secretagogos não-
metabolizáveis (Calabrese et al., 2003 e 2004; Le Gurun et al., 2003; Leite et al. 2005,
Vozzi et al., 1995). Calabrese e colaboradores (2003) demonstraram que uma significativa
redução da expressão da proteína Cx36 na linhagem MIN6, por meio da exposição ao
oligonucleotídeo antisense desta conexina, induziu um comprometimento marcante na
sincronização das oscilações da concentração intracelular de cálcio entre células adjacentes,
e consequente redução na secreção de insulina. Mais recentemente, foi sugerida a
participação dessas estruturas de membrana e de sua proteína constitutiva, a Cx36, no
processo de disfunção secretora da célula β que ocorre durante a pré-diabetes experimental
(Carvalho et al., 2012).
Com relação à junção de oclusão e à junção aderente, relatos sobre sua composição
bioquímica, bem como sua regulação nas células endócrinas pancreáticas são escassos. A
junção de oclusão parece ser regulada in vitro no pâncreas endócrino, uma vez que é
observado, em criofraturas, um aumento no número de cordões de vedação da junção de
oclusão entre células das ilhotas com aumento da concentração extracelular de glicose
(Semino et al., 1987) e após tratamento de ilhotas com pronase (Orci et al., 1973). A
estrutura molecular da junção de oclusão no pâncreas endócrino in situ ainda permanece
desconhecida. Tem sido demonstrada a presença de moléculas de adesão associadas à
junção aderente, como a E-caderina e a N-CAM (do inglês, Neural Cell Adhesion
Molecule) entre as células endócrinas (Moller et al., 1992). Em adição, tem sido
documentada uma distribuição diferencial da molécula de N-CAM nas células das ilhotas
pancreáticas normais: uma expressão maior nas células localizadas na periferia da ilhota em
comparação à das células β encontradas no cerne da ilhota (Cirulli et al., 1994). Acredita-se
que essa expressão diferencial da N-CAM contribua para a manutenção da citoarquitetura
celular da ilhota (Moller et al., 1992). Experimentos in vitro demonstraram que há uma
relação direta entre o grau de expressão das proteínas de adesão E-caderina e PSA-NCAM
com a secreção induzida de insulina pela glicose na linhagem de células β pancreáticas
MIN6 e em populações de células β isoladas (Bernard-Kargar et al., 2001; Hauge-Evans et
33
Capítulo 1
al., 1999; Lilla et al., 2003; Meda, 2013). Dados do nosso grupo mostram que uma
expressão aumentada de α- e β-cateninas está associada a uma resposta secretora
aumentada de insulina em ilhotas de ratos recém-nascidos em condições in vitro (Collares-
Buzato et al. 2004).
Ainda, recentemente demonstramos que os contatos intercelulares, mediados pelas
proteínas associadas às junções intercelulares, parecem desempenhar um papel importante
no processo de maturação funcional da célula β durante o desenvolvimento (Santos-Silva et
al., 2012). Células β de fetos e recém-nascidos, que sabidamente apresentam baixa resposta
secretora de insulina, mostram um baixo conteúdo celular de ZO-1, N-CAM, cateninas e F-
actina em relação às células β de ratos jovens e adultos, que respondem adequadamente à
glicose. Em adição, na ausência de contatos intercelulares, a secreção de insulina
estimulada por glicose foi completamente bloqueada em ilhotas de ratos adultos isoladas,
mas não afetada em ilhotas de recém-nascidos.
Embora, a participação das junções intercelulares na regulação da secreção de
insulina, em condições in vitro, pareça notória, o papel destas especializações de membrana
na fisiologia e disfunção da célula β pancreática ainda constitui um tema pouco explorado.
Teoricamente, a adesão e reconhecimento intercelular mediadas pelas junções intercelulares
poderiam influenciar a atividade secretora do pâncreas endócrino afetando vários processos
celulares, à semelhança do que acontece em outros órgãos, tais como organização
histológica e citoarquitetura (Yamagata et al., 2002), a comunicação intercelular mediada
pelas junções comunicantes (Rogers et al., 2007; Yamasaki et al., 1999), o grau de
diferenciação celular, e/ou a proliferação e morte celular, bem como na homeostase
funcional da célula/tecido (Carvell et al., 2007; Conacci-Sorrell et al., 2002; Gumbiner,
1996; Morin, 1999; Steinberg & McNutt, 1999).
34
Capítulo 1
1.2.3 Diabetes mellitus tipo 2 e disfunção da célula β
O Diabetes mellitus tipo 2 (DMT2) é uma doença multifatorial, caracterizada por
um estado de hiperglicemia crônica decorrente de defeitos na produção ou na ação da
insulina (Ferrannini, 1998; Pories et al., 2011; Acharjee et al., 2013), e corresponde a forma
mais comum da doença (mais de 90% dos casos de diabetes) (Ashcroft et al., 2012; Sacks
et al., 2011; American Diabetes Association, 2013). Segundo dados da Organização
Mundial de Saúde, DMT2 está entre as doenças mais prevalentes do mundo, com a
expectativa de atingir 350 milhões de pessoas em 2025 (American Diabetes Association,
2013). Essa doença está associada a complicações metabólicas, clínicas e sociais,
relacionadas à urbanização crescente, sedentarismo, dieta inadequada e, sobretudo à
obesidade (Ashcroft et al., 2012; Saini, 2010).
A DMT2 geralmente inicia-se na vida adulta, e é caracterizada inicialmente por
hiperglicemia moderada associada à resistência periférica à insulina, a qual é parcialmente
compensada por hiperplasia das células β. Em fases mais avançadas da doença, ocorre
diminuição da massa e função secretora das células β levando à dependência de reposição
hormonal com insulina (Prentki & Nolan, 2006; Rhodes, 2005; Tripathy & Chaves, 2010).
A patogênese da DMT2 ainda não é totalmente conhecida, contudo estudos apoiam
a opinião da importância da adequada biossíntese de insulina. A insulina, como comentado
anteriormente, é um hormônio com função hipoglicemiante, sintetizada inicialmente como
um polipeptídio precursor com uma única cadeia com 86 aminoácidos chamada de pré-
próinsulina, que após processamento proteolítico e clivagem, formam as cadeias A e B da
insulina ligadas por pontes dissulfeto, e o peptídeo-C (Nelson & Cox, 2011). Tanto a
insulina quanto o peptídeo–C remanescente são embalados em grânulos de armazenamento
ligados a membrana, o estímulo da secreção de insulina resulta na liberação destas
moléculas na circulação porta. Enquanto a insulina é intensamente metabolizada no fígado,
o Peptídeo-C é mais lentamente depurado o que o tornará um marcador útil e preciso de
35
Capítulo 1
secreção endógena de insulina (Nelson & Cox, 2011). A glicose e outros nutrientes regulam
a secreção de insulina pela célula β pancreática (Prentki & Nolan, 2006; Rhodes, 2005;
Tripathy & Chaves, 2010). Ela é transportada por um transportador facilitador de glicose
(GLUT1 em humanos, GLUT2 em roedores). O metabolismo subsequente da glicose pela
célula β altera a atividade dos canais iônicos, levando a secreção de insulina. As incretinas
liberadas pelas células neuroendócrinas do trato gastrintestinal, após a ingestão do alimento
amplificam a secreção de insulina, bem como suprimem a secreção do glucagon (Khan et
al., 2006; Prentki & Nolan, 2006). Um exemplo de incretina é o GLP-1 (peptídio I
semelhante ao glucagon), liberado pelas células L do intestino delgado que estimula a
secreção de insulina, quando a glicose sanguínea está acima do nível de jejum (Prentki &
Nolan, 2006). Análogos de incretinas assim como o GLP-1 vem sendo usados para
aumentar a secreção endógena de insulina (Khan et al., 2006; Prentki & Nolan, 2006).
Depois que a insulina é secretada, é então lançada no sistema venoso portal, onde se liga a
receptores específicos desencadeando eventos bioquímicos para que ocorra sua ligação a
moléculas sinalizadoras intracelulares como os substratos do receptor de insulina (IRS).
Estes iniciam uma cascata de reações de fosforilação e desfosforilação, resultando nos
efeitos metabólicos e mitogênicos generalizados da insulina (Rhodes, 2006). Podemos citar
como exemplo a ativação da via fosfotidilinositol-3’-quinase (PI-3-quinase), que estimula a
translocação de um transportador de glicose (GLUT4) para a superfície celular afim de
efetuar a captação da glicose (Rhodes, 2005; Guo et al, 2014). A homeostasia da glicose
reflete um equilíbrio entre a produção hepática de glicose e captação e utilização periférica
da glicose. Portanto, um declínio adicional na secreção de insulina e um aumento na
produção hepática de glicose resulta na manifestação do diabetes mellitus tipo 2, que tem
como primeiros sintomas a resistência periférica à insulina ditada pela ação prejudicada da
insulina nos tecidos periféricos e órgãos, especialmente o músculo esquelético, o fígado e
os adipócitos (Thipathy e Chaves, 2010).
Não está completamente determinado quais são os fatores que contribuem para a
resistência periférica à insulina (Jonietz, 2012); sabe-se que o excesso de tiglicerídeos livres
pode ser a uma das causas (Ding et al., 2010; Kahn et al., 2006). Outros fazem a relação
com o excesso de peso ou obesidade, e o estímulo de citocinas inflamatórias liberadas a
36
Capítulo 1
partir do tecido adiposo e ainda outros fatores inflamatórios que podem promover a
inflamação em tecidos cincunvizinhos, entre eles a ilhota pancreática (Shoelson et al.,
2006; Lackey et al., 2013).
Na patogênese do DMT2, a célula β promove uma resposta adaptativa modificando
sua função secretora (Sone & Kagawa, 2005; Liew & Andrews, 2008). Como resposta a
esta função, a normoglicemia se mantém, mesmo que haja um quadro bem inicial de
resistência periférica à insulina. Posteriormente, com o aparecimento da hiperglicemia, há o
aumento compensatório da massa de célula β, e, consequentemente, aumento adicional de
insulina (hiperinsulinemia) buscando manter os níveis normais de glicose sanguínea (Kahn
et al., 2006; Prentki & Nolan, 2006). As células β pancreáticas, após um longo tempo
expostas a condição de hiperglicemia e hiperinsulinemia, tem sua função secretora
comprometida (Conget et al, 2001; Hollingdal et al, 2000), levando a um agravamento do
quadro de sensibilidade diminuída à insulina e intolerância à glicose (Liu et al., 2010).
Tem sido bem documentada a associação entre obesidade e diabetes mellitus tipo 2
(DMT2) (Kahn et al., 2006; Acharjee et al., 2013; Tripathy & Chaves, 2010). A gordura,
principalmente a localizada na região abdominal, pode elevar o risco de desenvolver DMT2
em 10 vezes. Para cada aumento de 10% no peso corporal, há aumento de 2 mg/dL na
glicemia em jejum (Jung, 1997). Cerca de 90% dos portadores de DM2 estão acima do peso
ou são considerados obesos (Buchwald, 2009).
Parece haver um sinergismo entre exposição crônica aos ácidos graxos não
esterificados, cuja concentração plasmática normalmente está aumentada na obesidade, e
hiperglicemia, levando a um quadro comumente referido como "glicolipotoxicidade" da
célula β (Del Prato, 2009; Kahn et al., 2006). O declínio da massa relativa de célula β pode
estar relacionada à combinação de exaustão secretora desta célula e a glicolipotoxicidade,
levando a apoptose. Essa disfunção resulta na progressão do DMT2 para um estado
dependente de insulina exógena (Conget, 2001; Hollingdal, 2000; Liu, 2013).
Como mencionado anteriormente, informações relativas às junções intercelulares no
pâncreas endócrino ainda são escassas. Portanto, o estudo dessas especializações da
37
Capítulo 1
membrana plasmática usando como modelo as células pancreáticas endócrinas parece
consistir numa importante área de pesquisa. Estudos dessa natureza auxiliariam no
estabelecimento da verdadeira função e relevância dos contatos intercelulares mediado
pelas junções celulares na fisiopatologia do pâncreas endócrino, contribuindo para o
conhecimento da variabilidade bioquímica e dos diferentes mecanismos de regulação destas
especializações de membrana no organismo.
Diversos modelos in vivo e in vitro tem sido utilizados para estudar o Diabetes
Mellitus tipo 2, podendo envolver o tratamento com dietas de alto teor de gordura, uso de
animais geneticamente modificados e cultura de células especialmente a MIN6. Em nosso
estudo, utilizamos como modelo experimental camundongos que podem desenvolver um
quadro de Diabetes Mellitus tipo 2 como resultado da ingestão de ração com alto teor de
lipídios (De Souza et al., 2005; Surwitt et al., 1988; Shafrir et al., 1999; Winzell and
Ahren, 2004). Dentre as várias linhagens de camundongos, a linhagem C57BL/6J parece
possuir uma vulnerabilidade metabólica maior, devido, possivelmente, a uma pré-
disposição genética, que, quando desafiada por dieta ou outras manipulações, resulta em
obesidade e severo distúrbio da homeostase glicêmica (Surwitt et al., 1988; Ronchi et al.,
2013). Em camundongos C57 pré-diabéticos, o quadro inicial de hiperglicemia moderada é
acompanhado por hiperinsulinemia e por um incremento significativo na massa de célula β
como forma de compensar metabolicamente a resistência periférica à insulina (Carvalho et
al., 2012). Entretanto, a repercussão na função pancreática endócrina da ingestão de dieta
hiperlipídica por um período prolongado tem sido pouco investigada, bem como são
escassos os trabalhos descrevendo alterações funcionais e estruturais do pâncreas endócrino
neste modelo (Ahren et al., 1997; Sone & Kagawa, 2005).
38
39
Capítulo 1
1.3 OBJETIVOS E RELEVÂNCIA DESSA TESE
Nessa Tese de Doutorado, investigamos o possível papel do contato intercelular
mediado pelas junções intercelulares e suas proteínas estruturais na disfunção das células β
pancreáticas em modelo de diabetes mellitus tipo 2.
Para atender o objetivo proposto desenvolvemos as seguintes etapas: 1) a
caracterização metabólica do modelo animal de diabetes tipo 2, avaliando-se o ganho de
peso corpóreo, glicemia em jejum e pós-prandial, a concentração plasmática de insulina e a
secreção estimulada de insulina por ilhota em camundongos C57 tratados com dieta
hiperlipídica pelo período de 8 meses; 2) a avaliação do aspecto morfológico e
morfométrico do pâncreas endócrino frente ao uso de dieta hiperlipídica no modelo animal
empregado; 3) a investigação das possíveis alterações na distribuição celular de proteínas
juncionais (a saber, E-, N-, VE-caderinas, ZO-1, β- e α - cateninas), por imunoistoquímica,
em ilhotas pancreáticas de animais controles e tratados com a dieta hiperlipídica; e 4) a
avaliação das possíveis alterações na expressão gênica e protéica das proteínas juncionais
em estudo, por Western Blot e Real-Time qPCR, em ilhotas pancreáticas de animais
controles e tratados com a dieta hiperlipídica.
A hipótese inicial dessa Tese é que o contato intercelular mediado pelas proteínas
juncionais no pâncreas endócrino desempenharia um papel na patogênese da DMT2. Várias
evidências experimentais, citadas anteriormente, demonstram que as junções intercelulares
e suas proteínas estruturais participam do desenvolvimento e manutenção da estrutura e
citoarquitetura das ilhotas pancreáticas, bem como da função secretora e
proliferação/sobrevida da célula β pancreática em condições in vitro e em animais
transgênicos ou nocaute para moléculas de adesão. A relevância da presente Tese reside no
fato que investigamos a bioquímica e organização das junções associadas à adesão
intercelular na célula β in vivo numa condição fisiopatológica como a diabetes. Trabalhos
como este e os resultados obtidos, através do seu desenvolvimento, podem fornecer
subsídios à investigação sobre terapia celular e genética da diabetes.
40
41
Capítulo 2
CAPÍTULO 2
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Protocolos experimentais
O quadro abaixo representa as etapas desenvolvidas no decorrer desta Tese.
Papel do contato intercelular mediado pelas junções intercelulares na disfunção da célula β
pancreática
Modelo experimental de Diabetes Mellitus tipo 2
Ingestão de dieta hiperlipídica (dHL)
Grupo Controle: camundongos
C57BL/6 em dieta normal por 8 meses
Metodologias:
1. Avaliação metabólica do animal (peso, glicemia, conc. plasmática de insulina,secreção estática de insulina/ilhota;
2. Avaliação morfométrica do pâncreas endócrino;
3. Distribuição celular de proteínas juncionais no pâncreas endócrino (porimunoistoquímica);
4. Expressão gênica e proteica de proteínas juncionais em ilhotas pancreáticas (porqPCR e Western Blot).
Grupo Tratado: camundongos
C57BL/6 em dHL por 8 meses
42
Capítulo 2
2.2 Animais
Camundongos, machos, da linhagem C57BL/6/J Unib, foram obtidos a partir das
colônias de reprodução do Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da
Ciência para Animais de Laboratório (CEMIB) da Universidade Estadual de Campinas
(UNICAMP, Brasil). Os animais foram alojados a 22 ± 1 ° C, em ciclo claro/escuro de 12 h
de luz, e tiveram livre acesso a água ad libidum e ração.
Os camundongos foram utilizados seguindo as diretrizes do Conselho Nacional de
Controle de Experimentação Animal (CONCEA- MCTI, Brasil). Todos os protocolos
experimentais utilizados foram aprovados pelo Comissão de Ética no Uso de Animais
(CEUA) da Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP, Brasil) sob os protocolos
nº1885-1 e 3122-1.
2.3 Dieta hiperlipídica (dHL)
Ao completar 6 a 8 semanas, os camundongos C57BL/6/J Unib foram divididos em
dois grupos. Um grupo (controle) foi alimentado por 240 dias (8 meses) com uma dieta
padrão para roedores (Nuvital CR1, Colombo, Paraná, Brasil) e o outro grupo (tratado) foi
alimentado com uma dieta rica em gordura (dHL) (21% em peso) e hipercalórica, tendo o
cuidado de, nesta ração, manter preservado o conteúdo de sais minerais e vitaminas
necessários ao desenvolvimento do animal. A composição das rações está mostrada na
Tabela I.
Tabela I. Composição das rações utilizadas.
Componentes em g% Ração Padrão Ração Hiperlipídica
Proteínas 22,0 20
Carboidratos 53,0 50,0
Lipídeos 4,5 21,0
Outros* 20,5 8,0
Kcal/g 2,9 4,7
* Fibras, vitaminas e minerais
43
Capítulo 2
2.4 Avaliação metabólica do animal
Todos os animais foram pesados antes do início do período da dieta, e no final do
mesmo; os valores foram expressos como a porcentagem de ganho de peso corporal em
relação ao peso corporal inicial.
A glicemia foi determinada, através de um glicosímetro (Advantage II Accu-Chek,
Roche Diagnostic ®, Mannheim, Alemanha), em amostras de sangue coletado da cauda de
camundongos alimentados (pós-prandial) ou submetidos a 12 horas de jejum. O Teste de
Tolerância à Insulina (ITT) foi realizado através de injeção intraperitoneal de insulina (0,5
U/kg de peso corporal de insulina humana - Biohulin ® R Biobrás, Montes Claros, MG,
Brasil) em animais alimentados (Bonfleur et al., 2010). Subsequentemente, a glicemia foi
medida em amostra de sangue coletado a partir da cauda, nos tempos 0, 10, 15, 30 e 60
minutos, após a administração deste hormônio. Os resultados da área sob a curva glicêmica
foram estimados utilizando o software GraphPad Prism versão 5 for Windows (GraphPad
Software, La Jolla, CA, USA). A concentração plasmática de insulina (em animal
alimentado) foi avaliada através da coleta de alíquotas de sangue da veia cervical em
capilares heparinizados e, após centrifugação, as amostras de plasma foram estocadas a –
20°C. A dosagem de insulina plasmática foi determinada por radioimunoensaio. Todas as
amostras de sangue foram coletadas no período compreendido entre 09:00 e 11:00 horas da
manhã.
2.5 Isolamento de ilhotas pancreáticas
As ilhotas foram isoladas após injeção de 3 ml de solução de colagenase tipo V (EC
3.4.24.3, Sigma, St. Louis, MO, USA) (1,7 mg/mL em solução de Hank’s, pH 7,4;
composição do Hank’s: NaCl 136mM, KCl 5,4mM, CaCl2.2H2O 1,26mM, MgSO4.7H2O
0,81mM, KH2PO4 0,44mM, Na2HPO4 0,34mM, NaHCO3 4,2Mm, suplementada com 5,6
mM de glicose e 1 mg/mL de albumina) no pâncreas, através da canulação do ducto
pancreático, seguido de incubação a 37ºC por 11 min e lavagem das mesmas para remoção
da colagenase com solução de Hank’s. Após a separação com Histopaque 1077 (Sigma), as
44
Capítulo 2
ilhotas pancreáticas foram coletadas individualmente sob lupa, sendo utilizadas tanto para a
determinação da secreção estática de insulina, como homogeneizadas em coquetel anti-
protease para immunoblotting ou em RNAlatter®Tissue Collection (Applied Biosystems,
Carlsbad, CA, USA) para o uso em Real Time-PCR (como descrito a seguir).
2.6 Secreção estática de insulina
Para medir a secreção estática de insulina, após o isolamento, pools de 5 ilhotas
foram colocados em microtubos e pré-incubados em solução de Krebs (composição: 139
mM Na+, 5 mM K+, 1 mM Ca2+, 1mM Mg2+, 123,6 mM Cl-, 24 mM HCO3- ) contendo 5,6
mM de glicose em banho-maria a 37°C durante 30 minutos. Após a aspiração cuidadosa do
tampão, as ilhotas foram divididas em dois grupos, as que foram suplementadas com 2,8
mM de glicose e as suplementadas com 16,7 mM. Após incubação de 1h a 37°C, alíquotas
de 500μl do sobrenadante foram retiradas e armazenadas a – 20ºC para dosagem da
concentração de insulina no meio, determinada por radioimunoensaio (Carvalho et al.,
2010).
2.7 Avaliação histológica e morfométrica do pâncreas endócrino
Para análise do aspecto histológico do pâncreas endócrino, os camundongos (n= 4
animais por grupo experimental) foram sacrificados em câmara de CO2, decapitados e o
pâncreas foi retirado, e fixado em solução de 4% de paraformaldeído (diluído em tampão
fosfato-salina) durante 24 h. Os pâncreas foram seccionados em 5 fragmentos (1,
correspondendo à cabeça e 4 à região da cauda); cada fragmento foi processado pelas
técnicas rotineiras de embebição em parafina (Histosec pastilhas, Merck, Darmstadt,
Germany). Foram obtidas secções semi-seriadas de 5 µm (com espaçamento de 100 µm
entre cortes) até esgotamento total do bloco. As lâminas selecionadas foram coradas com
Hematoxilina-Eosina ou processadas para imunoperoxidase indireta para insulina (Carvalho
et al., 2012; Oliveira et al., 2014).
45
Capítulo 2
Para análise morfométrica do pâncreas, foi medido o volume total de células β em
relação ao pâncreas total (Volume relativo VR células β/pâncreas) utilizando método
estereológico descrito na literatura, com pequenas modificações (Inuwa e Mardi, 2005).
Seis cortes histológicos foram analisados por pâncreas (dois cortes de cada bloco, 1, 3 e 5).
Todos foram fotografados com objetiva panorâmica com o auxílio de uma câmera digital
(Nikon FDX-35) acoplada a um microscópio de luz (Nikon Elipse E800), e as imagens
capturadas por um sistema de análise de imagens (Image Pro Plus for Windows). A medida
do volume relativo das células β (imunomarcadas para insulina) foi realizada utilizando o
software livre ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html). Para tanto, a somatória das
áreas dos perfis das ilhotas imunomarcadas para insulina foi dividida pela respectiva área
da secção histológica do pâncreas, multiplicando-se por 100. Foram analisadas 126 ilhotas
do grupo controle e 112 do grupo tratado, provenientes de 4 animais por grupo.
2.8 Imunoistoquímica para insulina
Após a remoção de parafina, os cortes foram reidratados e lavados com Tris-salina
(TBS; Trisma base 0,01 M, NaCl 0,15 M), em seguida foi feito o bloqueio da peroxidase
endógena com uma solução de 0,3% de peróxido de hidrogênio (em metanol) por 30 min
seguido de incubação com 5% de leite em pó desnatado em solução de TBS/0,1% Tween
20 (TTBS) por 1h. Os cortes foram então incubados com anticorpo anti-insulina (Dako,
diluição 1:50) por 12 horas a 4ºC e após lavagem com TBS, foram incubados com anti-IgG
conjugado com peroxidase (Horseradish Peroxidase, HRP, Sigma, diluição 1:1500), por 1
hora e 30 min à temperatura ambiente (TA). A revelação do complexo antígeno-anticorpo
foi feita com solução de diaminobenzidina a 10% (DAB) (Sigma) e 0,2% de H2O2 (Merck)
em TBS. Em seguida, os cortes foram lavados em água destilada e contra-corados com
solução aquosa de Hematoxilina de Ehrlich (diluída 1:10 em água destilada), desidratados
em soluções crescentes de etanol e, montados em Bálsamo Sintético do Canadá (Synth -
Brasil) para observação ao microscópio de luz.
46
Capítulo 2
2.9 Avaliação do padrão de citoarquitetura das ilhotas pancreáticas
A análise da citoarquitetura das ilhotas pancreáticas foi realizada a partir de reações
de imunofluorescência com dupla marcação para insulina e glucagon em cortes histológicos
de pâncreas preparados conforme anteriormente descrito (seção 2.7). Os cortes foram
incubados com o anticorpo primário policlonal anti-glucagon (Dako, Copenhagen,
Denmark; diluição 1:75 em 3% de leite desnatado em Tris-salina (TBS; Trisma base 0,01
M, NaCl 0,15 M)) por 3h em temperatura ambiente (TA), seguida de lavagem dos cortes
com tampão Tris-salina (TBS, pH 7,4) e posterior incubação overnight a 4°C com o
anticorpo secundário específico conjugado com fluoresceína (Sigma, diluição 1:125 em 1%
de leite desnatado em TBS). Os cortes foram novamente lavados com TBS e incubados
overnight ou, por 3h à TA com o anticorpo primário anti- insulina (Dako, diluição 1:75 em
TBS com 3% de leite desnatado), e em sequência, após nova lavagem com TBS, incubados
com o anticorpo secundário específico conjugado com rodamina (Sigma, diluição 1:100 em
1% de leite desnatado em TBS) por 2h em TA. Por fim, as lâminas foram montadas em
meio de montagem (Vectashield, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) para
observação em microscópio de fluorescência acoplado a um sistema de captura de imagens
(Axio Observer-D1, Zeiss, Germany).
Considerando o padrão típico das ilhotas de roedores (Brissova et al., 2005;
Carvalho et al., 2006), as análises das imagens foram classificadas de acordo com um
sistema de scores que estabeleceu o grau de alteração da citoarquitetura conforme o número
de células α deslocadas, ou não contíguas, do manto periférico formado por esse tipo
celular, posicionado ao redor do core de células β na ilhota. Apenas as células α deslocadas,
observadas a partir da terceira fileira de células endócrinas que constituem o manto, foram
contadas, e foram categorizadas conforme a seguinte classificação descrita na Tabela II.
Para cada ilhota analisada (um total de 138 ilhotas do grupo controle e 117 ilhotas do grupo
tratado referentes a 4 animais por grupo experimental) foi atribuído um score e calculou-se
o valor médio de alteração segundo essa classificação por grupo experimental.
47
Capítulo 2
Tabela II. Grau de alteração da citoarquitetura no pâncreas endócrino
Grau de alteração
da citoarquitetura
Número de células deslocadas da periferia da ilhota
0 Nenhuma célula α deslocada da periferia da ilhota
1 1 a 3 células α deslocadas da periferia da ilhota
2 4 a 6 células α deslocadas da periferia da ilhota
3 Mais que 6 células α deslocadas da periferia da ilhota
A área relativa ocupada por células α e β pancreáticas também foi mensurada nessas
imagens de ilhotas duplamente imunomarcadas. As medidas de área relativa das células α
(glucagon-positivas) e β (insulina-positivas) pancreáticas foram realizadas pelo software
livre ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html) e expressas em porcentagem em
relação à área total da ilhota.
2.10 Imunolocalização e análise do grau de marcação das proteínas juncionais em cortes
de pâncreas endócrino
A localização celular de proteínas juncionais (a saber, E-, N-, e VE-caderinas, α- e
β-cateninas, e ZO-1) foi feita em cortes de congelamento de pâncreas por meio de
imunofluorescência indireta, como previamente descrita (Collares-Buzato et al., 2004;
Santos-Silva et al., 2012). Os cortes de pâncreas dos diferentes grupos experimentais
foram incubados overnight a 4°C, com um dos seguintes anticorpos primários diluídos em
3% leite desnatado em TBS (diluições apresentadas na Tabela III): anti-E-caderina
(ABCam, Cambridge, UK), anti- N-caderina (ABCam), anti-VE-caderina (ABCam), anti-
ZO-1 (Zymed/Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), anti-α-catenina (Sigma), ou anti-β-catenina
(Zymed/Invitrogen). Posteriormente, procedeu-se a incubação dos cortes com o anticorpo
secundário específico conjugado com FITC (Sigma). Quando necessário, foi feita a co-
localização destas proteínas e insulina, realizando uma incubação adicional durante 1hora e
30 minutos com o anticorpo policlonal anti-insulina (diluição 1:100, Dako) seguida de seu
anticorpo secundário policlonal específico conjugado com TRITC (Sigma). Por fim, as
lâminas foram montadas com meio de montagem (Vectashield, Vector) e a localização da
48
Capítulo 2
fluorescência no espécime, detectada por um microscópio de varredura confocal a laser
(TCS SP5 II, Leica, Wetzlar, Germany) e/ou por microscópio de fluorescência
convencional acoplado a um sistema de captura de imagens (Axio Observer-D1, Zeiss,
Hamburg, Germany).
Tabela III. Diluições e fabricantes dos anticorpos primários monoclonais utilizados para a
detecção das proteínas juncionais por meio da técnica de imunofluorescência indireta.
Anticorpo Primário Fabricante Cat number Animal Produzido Diluição
Primário
Diluição
Secundário
ZO-1 Zymed/Invitrogen 617300 Coelho 1:200 1:200
Alfa-catenina Sigma C2081 Coelho 1:1000 1:800
Beta-catenina Zymed/Invitrogen 138400 Camundongo 1:200 1:800
N-caderina ABCam 18203 Coelho 1:50 1:150
E-caderina ABCam 11512 Coelho 1:50 1:150
VE-caderina ABCam 33168 Coelho 1:75 1:175
2.11 Avaliação do grau de marcação por imunofluorescência
Para avaliar a intensidade da fluorescência e garantir a comparação entre os grupos
controle e dHL, as lâminas foram processadas e analisadas na mesma sessão de observação,
utilizando parâmetros idênticos para a captura das imagens no microscópio confocal. Todas
as imagens foram analisadas usando o software ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Nas
imunoreações para ZO-1 e β-catenina, os valores de fluorescência total da ilhota foram
expressos como densidade integrada de pixels e normalizados pela área da ilhota. Nas
imunoreações para E-caderina, N-caderina e α-catenina, a densidade integrada pixels de 50
pontos por ilhota, na região intercelular da célula β (co-imuno marcadas com insulina) foi
medida em todas as imagens capturadas. Para a VE-caderina foi medida a área linear de
imunoreação para essa proteína, expressa em unidade arbitrárias e normalizada pela área da
ilhota. Para a N-caderina, foi utilizada a ferramenta “Grid” do ImageJ, determinando a área
49
Capítulo 2
de marcação citoplasmática difusa para essa proteína na ilhota (como índice de
redistribuição celular), normalizada pela área total da ilhota e expressa em unidades
arbitrárias.
2.12 Western Blot
O conteúdo celular das proteínas juncionais estudadas foi avaliado por Western Blot
em homogeneizados de ilhotas pancreáticas isoladas utilizando protocolo semelhante ao
descrito anteriormente (Santos-Silva et al., 2012). Aproximadamente 300 a 400 ilhotas
isoladas por grupo (conforme descrito anteriormente no item 2.5) foram sonicadas em um
coquetel anti-protease (composição: 10 mM imidazol pH 7,4, 4 mM EDTA, 1 mM EGTA,
200 μM DTT, 0,5 μg/ml pepstatina, 200 KIU/ml aprotinina, 200 μM
fenilmetilsufonilfluoreto e 2,5 μg/ml leupeptina, 30 μg/ml inibidor de tripsina; Sigma).
Alíquotas com 50-70 μg do homogeneizado foram incubadas a 37 oC por 1 h em 30% do
volume de 5x tampão de Laemmli (1 mol fosfato de sódio/ L (pH 7,8), 10% de SDS, 2% de
β-mercaptoetanol, 50% de glicerol e 0,1% de azul de bromofenol, Sigma) e, então,
aplicadas em gel de 8 ou 10% de SDS-PAGE. Após eletroforese, as proteínas foram
transferidas eletroforeticamente para membrana de nitrocelulose (Bio-Rad, Hercules, CA,
USA), e esta corada reversivelmente com solução de Ponceau S (Bio-Rad) para verificação
do perfil protéico e controle da quantidade de proteína aplicada nas linhas do gel. As
proteínas foram detectadas pela incubação da membrana com os mesmos anticorpos
primários utilizados no método de imunofluorescência (com diluições ajustadas ao método
de immunoblotting; Tabela IV) seguida da incubação com os respectivos anticorpos
secundários conjugados com peroxidase (Sigma). As bandas imunorreativas foram
detectadas por quimioluminescência (kit SuperSignal West Pico Chemiluminescent
Substrate, Pierce, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) utilizando filme para
auto-radiografia. Após stripping, as membranas foram reincubadas com um anticorpo anti-
β-actina (Zymed/Invitrogen, diluição 1:1500) e, posteriormente, com seu respectivo
anticorpo secundário conjugado com peroxidase, como um controle interno do conteúdo
protéico total aplicado. A densidade óptica das bandas foi analisada pelo software livre
ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) e expressa uma razão de proteína juncional/β-actina.
50
Capítulo 2
Tabela IV. Diluições e fabricantes dos anticorpos primários monoclonais utilizados para a
detecção das proteínas juncionais por meio da técnica de Western Blot.
Anticorpo
Primário
Fabricante Cat
number
Animal
Produzido
Diluição
Primário
Diluição
Secundário
ZO-1 Zymed/Invitrogen 617300 Coelho 1:300 1:1000
Alfa-catenina Sigma C2081 Coelho 1:1000 1:1000
Beta-catenina Zymed/Invitrogen 138400 Camundongo 1:1000 1:1000
N-caderina ABCam 18203 Coelho 1:600 1:1000
E-caderina ABCam 11512 Coelho 1:500 1:1000
VE-caderina ABCam 33168 Coelho 1:600 1:1000
2.13 PCR em tempo Real
2.13.1 Extração de RNA total
Pools de 300 a 400 ilhotas pancreáticas foram isoladas conforme descrito na seção
2.5, mantendo as mesmas condições experimentais para os grupos controle e tratado,
compondo as triplicatas técnicas e biológicas do estudo. O RNA total, utilizado nos ensaios
de RT-qPCR, foi extraído com o kit RNAqueous®-Micro (Ambion®, WAustin, Texas,
USA), seguindo as orientações do fabricante. A qualidade e concentração do RNA foram
estimadas por leitura em espectrofotômetro Nanodrop ND-1000 UV-Vis (Nanodrop
Technologies, Wilmington, USA), a partir da absorbância a 260 nm, e cálculo da razão
260/280 nm. A integridade da molécula de RNA foi analisada por eletroforese em gel de
agarose 0,8% em tampão TBE (Tris 90mM, ácido bórico 90 mM, EDTA 50 mM, pH 8,0)
na presença de brometo de etídio e posteriormente estocadas a -80ºC até o momento do uso.
A Tabela V abaixo apresenta os dados da quantificação do RNA.
A síntese de cDNA foi realizada utilizando o Kit ImProm™ – II Reverse
Transcription System (Promega, Madison, USA), a partir de amostras de 1μg de RNA total,
acrescidos de Primer Oligo-(dT) (0,5 mg/reação), e H2O q.s.p, para completar um volume
final de 5µl que foi submetida a desnaturação a 70ºC por 5 minutos em termociclador e
51
Capítulo 2
posteriormente a 4ºC por 10min. Em seguida, para a transcrição reversa, adicionou-se a
mistura, água q.s.p. 5µl , solução tampão de Buffer (5X), MgCl2 (3,75 mM), dNTP
(0,5mM/ para cada dNTP), Transcriptase reversa (RT) 1µl, RNAsin (20U) 1µl (MIX II)
para um volume final de 15 µl. As amostras foram, então, colocadas em termociclador a
250C por 5 minutos, seguidos de 420C por 1 hora e ainda 700C por 15 minutos. A
integridade e quantificação do cDNA originado foi verificada como anteriormente descrito
para o RNA. As amostras cDNA foram estocadas a -200C até o procedimento de qPCR.
Tabela V. Concentração e integridade do RNA por leitura em espectrofotômetro
Amostras/
Grupos
Nº
Animais
Nº
Ilhotas
Relação
260/280
Concentração
µg/µl
Vol.
Final
Ctr 9 3 400 2.1 0,386 15µl
Ctr 11 3 310 2.08 0,048 15µl
Ctr 12 3 420 2.1 0,194 15µl
dHL 1 3 270 2.1 0,247 15µl
dHL 6 3 150 1,95 0,4107 15µl
dHL 10 3 310 2.02 0,0603 15µl
dHL 14 3 350 2.05 0,365 15µl
2.13.2 Primers
Os primers foram desenhados a partir da ferramenta Primer-BLAST do NCBI
(National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov), seguindo
os parâmetros de iniciadores utilizados para qPCR (Tabela VI), e posteriormente testados
quanto à capacidade de amplificação e especificidade pela reação de PCR.
52
Capítulo 2
Tabela VI. Primers específicos utilizados nos experimentos de qPCR desenhados através
do Primer Blast (NBCI).
Gene Nº Gene Bank Proteína Sequência do primer 5’ – 3’
ins 1 NM_008386.3
Ins 1 Forward TGACTCCTGAGAGGAAGGTTTATTC
Reverse
TTGCTGTGACTCCCCTGCTA
ins 2 NM_001185083.1
NM_008387.4
NM_001185084.1
Ins 2 Forward
CCGGGAGCAGGTGACCTT
Reverse
GATCTACAATGCCACGCTTCTG
Actb NM_007393.3
β-actina Forward
CTAAGGCCAACCGTGAAAAGAT
Reverse
CACAGCCTGGATGGCTACGT
ctnna1 NM_009818.1 α-catenina Forward
GTGATCAGTGCTGCCAAGAA
Reverse
CTCTCTTCACCAACGGCTTC
ctnnb1 NM_007614.3
β-catenina Forward
CGCGTCAGCTCGTGTCCTGTG
Reverse
CTTCAGGTACCCTCAGGCCCGC
cdh1 NM_009864.2 E-caderina Forward
ATGGGGCACCACCATCAC
Reverse
CTGGGTACACGCTGGGAAAC
cdh2 NM_007664.4 N-caderina Forward
CTGACAATGGAATCCCGCCT
Reverse
CCGCCTCTTGAGGTAACACC
cdh5 NM_009868.4 VE-caderina Forward
CGAACTGGATTCTCGGGGTAA
Reverse
GCAAATTCCGGAGGGTTGTC
tjp1 NM_009386.2
NM_001163574.1
ZO-1 Forward
CAGCCGCATCTTCTTGTG
Reverse
AGGAGCGAGACCCCACTAA
rps29 NM_009093.2
Rps29 Forward GACCAGGAGCTAAAGTTGATTGGA
Reverse
TCTTGGCCAGGGTAAACTTGA
2.13.3 RT-PCR
Para testar os primers quanto à capacidade de amplificação e especificidade foi
realizada a reação de PCR com o kit TaqPlatinum® DNA Polymerase (Invitrogen)
53
Capítulo 2
contendo Tampão de Reação (1X), dNTP (0,1 mM), MgCl2 (0,75 mM), Primer Forward
(sense) e Reverse (antisense) (0,1 μM), cDNA (20ng/µL), Taq DNA polimerase (1U/μL) e
o volume de H2O para uma reação de 25µl tratada com DEPC. As condições estabelecidas
para RT-PCR foram: um ciclo inicial de 94 ̊C por 2 minutos, 35 ciclos de 94̊C por 30
segundos, 61̊C por 30 segundos, 72̊C por 35 segundos e um ciclo final de 72̊C por 2
minutos. Os produtos amplificados foram separados em gel de agarose 2% no tampão de
eletroforese TBE (Tris 90mM, ácido bórico 90 mM, EDTA 50 mM, pH 8,0) na presença de
brometo de etídio. As bandas foram visualizadas no gel sob luz ultravioleta e fotografadas
(Figuras 2 e 3).
Figura 2. Verificação da amplificação dos fragmentos por RT-PCR revelam a presença dos
transcritos para os genes em estudo. Eletroforese em gel de agarose 2% com marcador de peso
molecular Ladder de 100pb (Fermentas), rsp29 (94 pb), actb (96 pb), gapdh (90 pb), ctnna1 (124
pb) ncam (107 pb), cdh5 (98 pb), tjp1 (117pb). Primer ncam (não foi analisado nesta tese).
Figura 3. Verificação da amplificação dos fragmentos por RT-PCR revelam a presença dos
transcritos para os genes em estudo. Eletroforese em gel de agarose 2% com marcador de peso
molecular Ladder de 100pb (Fermentas), ins1 (90 pb), gjd2 (130 pb), cdh1 (118 pb), ins 2 (111 pb)
e cdh2 2 (99 pb). Primer gjd2 (não foi analisado nesta tese).
PM rps29 actb gapdh ctnna1 ncam cdh5 tjp1
3100
pb
54
Capítulo 2
2.13.4 Eficiência de amplificação dos primers
A eficiência de amplificação dos primers sob diferentes concentrações de cDNA foi
avaliada utilizando-se diluições seriadas do cDNA (10 -1, 10 -2, 10 -3, 10-4, 10-5) que foram
submetidas à amplificação em triplicatas. A eficiência da amplificação (E) para cada gene
utilizado foi estimada por quantificação absoluta, obtida pela equação E = 10 (-1/slope)
(Ramakers et al., 2003), onde o slope corresponde ao valor da inclinação da curva em
regressão linear. Estes cálculos foram gerados por SDS Software 1.3.1™ (Applied
Biosystems®). Eficiências com valores entre 90% e 110% (-3.6 > slope > -3.1) foram
consideradas como ideais e utilizadas como 100% para os cálculos de expressão relativa
(Tabela VII).
Tabela VII. Valores de eficiência da reação e slope dos genes utilizados nos ensaios de
qPCR.
Gene Slope R2
ins 1 -3,29 0,99
ins 2 -3,221 0,99
Actb -3,12 0,99
ctnna1 -2,785 0,99
ctnnb1 -3,326 0,99
cdh1 -3,193 0,98
cdh2 -3,31 0.99
cdh5 -3,078 0,999
tjp1 -3,208 0,99
rps29 -3.068 0,99
55
Capítulo 2
2.13.5 Determinação do gene referência
Para iniciar o ensaio de qPCR, foram testados três genes de expressão constitutiva
(housekeeping genes), nos grupos controle e tratado: actb, rps29, gapdH. A média
geométrica dos Cts (cycle threshold) desses genes candidatos foram analisados, assim como
o desvio padrão (SD) da média, a fim de verificar a estabilidade de expressão tanto para o
grupo controle como para tratado. Após plotagem destes dados no software Excel,
verificamos que o gene referência rps29 obteve a menor variação do SD entre todos os
genes alvo, sendo assim selecionado como gene referência em nosso estudo.
2.13.6 Análise de expressão gênica relativa por RT-qPCR
As amplificações por RT-qPCR foram realizadas em triplicatas e utilizando 20 ng
de cDNA por reação. As reações foram preparadas com reagentes padronizados para PCR
em tempo real (SYBR® Green PCR Master Mix, Applied Biosystems) adicionado os
conjuntos de primers (Foward e Reverse) e H2O q.s.p. As condições da reação foram 50 °C
durante 2 minutos, 95 °C durante 10 minutos e 40 repetições de 95 °C por 15 segundos e
61,5 °C por 1 minuto, seguida de uma etapa final para a construção da curva de melting de
95ºC por 15 segundos, 60 ºC por 1min e 95 ºC por 30 segundos e 60 ºC por 15 segundos.
As leituras da fluorescência foram realizadas pelo equipamento 7500 Fast Real-Time PCR
System7500 (Applied Biosystems, USA) a cada ciclo de amplificação e, posteriormente,
analisados pelo Sequence Detection Software (SDS) v1.3 (Applied Biosystems) (Figura 4).
Todas as reações foram submetidas às mesmas condições de análise. A quantidade relativa
(QR) foi calculada utilizando-se o método de Ct comparativo 2-ΔΔCt (Livak & Schimittgen,
2001), seguindo a seguinte fórmula, QR = E-ΔΔCt, onde 2 corresponde à eficiência da
reação, ΔΔCt = ΔCt tratado - ΔCt controle (Livak & Schmittgen et al., 2001) e ΔCt = Ct
gene alvo - Ct gene referência.
56
Capítulo 2
Figura 4. Verificação da especificidade de amplificação dos primers revelam a
presença de transcritos específicos para os genes em estudo. Curva de melting para os
genes cdh2, tjp1, ins 1, cdh1, cdh5, ctnnb1, ins2, ctnna1, actb, rps29, gapdh gerado a partir
do decaimento da fluorescência captada pelo equipamento durante o aumento progressivo
da temperatura.
2.14 Análise Estatística
A significância estatística entre os dois grupos experimentais foi determinada
usando-se o teste t-Student (bicaudal) ou o teste de Mann-Whitney, enquanto que para
múltiplas comparações (como na análise da secreção estática de insulina e RT-qPCR) foi
empregado o teste One Way ANOVA seguido do pós-teste de Bonferroni. Para a análise
estatística da frequência de alteração da citoarquitetura, foi utilizado o teste Chi quadrado.
Todas as análises estatísticas foram feitas com o auxílio do Software Graph Pad Prism
versão 5.00 (GraphPad Software, USA). O nível de significância adotado foi de p<0,05.
57
CAPÍTULO 3: Artigo Científico
ALTERAÇÕES NA DISTRIBUIÇÃO E EXPRESSÃO DE MOLÉCULAS DE ADESÃO NAS CÉLULAS
ΒETA PANCREÁTICAS DE CAMUNDONGOS DIABÉTICOS SUBMETIDOS À DIETA
HIPERLIPÍDICA POR PERÍODO PROLONGADO.
3.1 Introdução
A interação entre células vizinhas, que é fundamental para a homeostase tecidual
(particularmente em epitélios), depende de especializações da membrana plasmática
denominadas junções intercelulares (JIs). São identificados quatro tipos de JIs que são
estruturalmente e funcionalmente distintos, a saber: a junção de oclusão (tight junction)
(JO), a junção aderente (JA) (zonula ou fasciae adherens), os desmossomos (ou maculae
adherens), e a junção comunicante (ou gap junction). Os três primeiros tipos de junções
estão diretamente envolvidos no processo de adesão intercelular, enquanto que a junção
comunicante, umas das primeiras a ser estudada bioquimicamente, tem como função
primordial mediar a comunicação intercelular direta (Ebnet, 2008; Harris & Tepass, 2010;
Mese et al., 2007). Tem sido demonstrado que as JIs e suas proteínas estruturais, além de
serem dispositivos de adesão/comunicação, estão associadas a diferentes tipos de vias de
transdução de sinais citoplasmáticos, modulando a expressão gênica e vários processos
celulares, tais como, motilidade, diferenciação, proliferação e morte celular em diversos
órgãos, inclusive no pâncreas endócrino (Benmerah et al, 2003; Conacci-Sorrell et al,
2002; Ebnet, 2008; Jain &. Lammert, 2009; Meda, 2013).
O pâncreas endócrino é constituído por cinco tipos celulares: as células β,
produtoras de insulina, as células α, sintetizadoras de glucagon, as células δ, produtoras de
somatostatina, as células PP, produtoras do polipeptídeo P e as células ε, produtoras de
grelina (Andralojc et al., 2009, Orci, 1976). Essas células endócrinas possuem um arranjo
típico dentro da ilhota pancreática, definido como citoarquitetura, que é espécie-específica
Capítulo 3
58
(Brissova et al., 2005). No caso de roedores, as células β ocupam a região central e as
demais ficam na periferia da ilhota (Brissova et al., 2005; Carvalho et al., 2006; 2012).
Essas células se conectam homotípica ou heterotipicamente por junções intercelulares (JIs),
do tipo de oclusão, aderente, desmossomos e comunicantes, que parecem ser cruciais para o
perfeito funcionamento do órgão (Halban et al., 1982; Jain &. Lammert, 2009 Orci, 1976).
Embora a bioquímica das JIs seja ainda pouco explorada no pâncreas endócrino,
tem sido demonstrado que as células endócrinas pancreáticas expressam algumas proteínas
juncionais, tais como: Cx36 e Cx30.2 (da junção comunicante) (Carvalho et al., 2010;
Coronel-Cruz et al., 2013; Nlend et al., 2006), a ZO-1 e claudina 8 (da junção de oclusão)
(Collares-Buzato et al., 2004; Meda, 2013; Rieck et al., 2009; Santos-Silva et al., 2010), a
N-CAM, E-, e N-caderinas, bem como as cateninas (da junção aderente) (Carvell et al,
2007; Collares-Buzato et al., 2004; Meda, 2013; Moller et al., 1992; Parnaud et al., 2011;
Santos-Silva et al., 2010). Há evidências experimentais mostrando que tais proteínas
associadas às JIs participam da formação/manutenção da citoarquitetura da ilhota (Esni et
al., 1999; Santos-Silva et al., 2012; Yamagata et al., 2002), do mecanismo de maturação
funcional da célula β que ocorre in vitro e durante o desenvolvimento animal (Collares-
Buzato et al., 2004; Leite et al., 2005; Santos-Silva et al., 2012), do processo de
biossíntese e secreção de insulina (Calabrese et al, 2003; Hauge-Evans et al., 1999; Rogers
et al., 2007), bem como da proliferação e morte da célula β (Wakae-Takada et al., 2013;
Meda 2013; Parnaud et al., 2011). Contudo, estudos investigando o possível papel das
junções intercelulares na disfunção secretora da célula β pancreática são escassos.
Recentemente, demonstramos que camundongos obesos e pré-diabéticos, que exibem
significativo comprometimento da resposta secretora de insulina frente à glicose,
apresentam uma redução na expressão de Cx36 associada com diminuição do número de
canais intercelulares e acoplamento entre as células β mediado pelas junções comunicantes
(Carvalho et al., 2012). Entretanto, no melhor do nosso conhecimento, a participação de
outras proteínas juncionais no processo da patogênese da diabetes melittus tipo 2 (DMT2)
não está ainda esclarecida.
Capítulo 3
59
A DMT2 é uma doença metabólica-endócrina, de alta prevalência na população
mundial nos dias atuais devido a sua associação com o sedentarismo e a obesidade
(Tripathy & Chaves, 2010). A célula β pancreática desempenha um papel fundamental na
patogênese da DMT2, sendo capaz de uma resposta adaptativa, que envolve aumento da
função secretora de insulina e da sua massa relativa no pâncreas endócrino (Liew &
Andrews, 2008; Sone & Kagawa, 2005) na tentativa de compensar o quadro de resistência
periférica à insulina, característico da fase inicial da doença (Chang-Chen et al., 2008;
Tripathy & Chaves, 2010). Num estágio mais avançado da DMT2, entretanto, ocorre a
exaustão funcional das células β, devido em parte ao estado de hiperglicemia crônica,
resultando em morte celular e redução total da secreção de insulina, tornando o indivíduo
dependente de reposição hormonal (Butler et al., 2003).
O uso de camundongos da linhagem C57 alimentados com dieta
hiperlipídica/hipercalórica vem sendo reportado na literatura como um modelo valioso no
estudo da patogênese do diabetes mellitus tipo 2 e de outras doenças associadas à obesidade
(Drolet et al., 2006; Herrera, 2009; Winzell e Ahrén, 2004; Shafrir et al., 1999; Surwitt et
al., 1988). O foco da maioria desses trabalhos reside em investigar a resposta de tecidos
periféricos e os mecanismos de sinalização desencadeados pelo tratamento com tais dietas
por períodos relativamente curtos (dias a semanas), entretanto o efeito da exposição
prolongada (por vários meses) à dieta hiperlipídica/hipercalórica sobre a função e estrutura
do pâncreas endócrino, tem sido pouco explorado (Ahrén & Paccini 2002).
Desta forma, o presente estudo teve como objetivo principal investigar a
distribuição e expressão celular de algumas proteínas juncionais (a saber, E-, N-, VE-
caderinas, ZO-1, β- e α - cateninas) no pâncreas endócrino de camundongos alimentados
com uma dieta rica em gorduras (dHL) durante 8 meses. Como trabalhos avaliando o efeito
da administração de dHL por tempo prolongado são escassos, objetivamos também fazer
uma caracterização metabólica e uma análise funcional, estrutural e morfométrica do
pâncreas endócrino desses animais.
Capítulo 3
60
3.2 Materiais e Métodos
3.2.1. Animais e dieta
Camundongos, machos, da linhagem C57BL/6/J Unib, foram obtidos a partir das
colônias de reprodução do Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da
Ciência para Animais de Laboratório (CEMIB) da Universidade Estadual de Campinas
(UNICAMP, Brasil). Os animais foram alojados a 22 ± 1 ° C, em ciclo claro/escuro de 12 h
de luz, e tiveram livre acesso a água ad libidum e ração. Ao completar 6 a 8 semanas, os
animais foram divididos em dois grupos. Um grupo (controle), foi alimentado por 240 dias
(8 meses), com uma dieta padrão para roedores (Nuvital CR1, Colombo, Paraná, Brasil)
(contendo % em peso: 4,5 g% de lipídios, 53 g% de carboidratos e 23 g% de proteínas), e o
outro grupo (tratado) foi alimentado com uma dieta rica em gordura (dHL) (contendo 21
g% de lipídios, 50 g% de carboidratos e 20 g% de proteínas). Todos os protocolos
experimentais utilizados foram aprovados pelo Comissão de Ética no Uso de Animais
(CEUA) da Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP, Brasil).
3.2.2 Avaliação metabólica do animal
Para investigar o efeito da exposição prolongada à dieta hiperlipídica sobre o estado
metabólico dos animais, foram avaliados os seguintes parâmetros: ganho de peso corpóreo
(percentagem em relação ao peso inicial antes da dieta), glicemia (em jejum de 12 horas ou
no estado alimentado, ou seja, pós-prandial), insulinemia (pós-prandial) e resposta ao teste
de tolerância à insulina (ITT) (Bonfleur et al., 2010; Carvalho et al, 2012; Capítulo 2, seção
2.4). Os resultados da área sob a curva glicêmica do ITT foram estimados utilizando o
software GraphPad Prism versão 5 for Windows (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA).
Todas as amostras de sangue foram coletadas no período compreendido entre 09:00 e 11:00
horas da manhã.
Capítulo 3
61
3.2.3 Secreção estática de insulina em ilhotas pancreáticas isoladas
As ilhotas foram isoladas por digestão do pâncreas com colagenase e separação por
gradiente com Histopaque 1077 (Sigma) (Carvalho et al., 2010; 2012; Capítulo 2, seção
2.5). Pools de 5 ilhotas foram colocados em microtubos e, após pré-incubação em solução
tampão de Krebs contendo 5,6 mM de glicose, foram expostos ao tampão contendo 2,8 mM
(basal) ou 16,7 mM de glicose (estimulada) (Capítulo 2, seção 2.6). A dosagem da
concentração de insulina no meio, determinada por radioimunoensaio.
3.2.4 Avaliação histológica e morfométrica do pâncreas endócrino
Para análise do aspecto histológico do pâncreas endócrino, os camundongos (n= 4
animais por grupo experimental) foram sacrificados em câmara de CO2, decapitados e o
pâncreas foi retirado, pesado e fixado como anteriormente descrito (Capítulo 2, seção 2.7).
Após inclusão em parafina e microtomia, os cortes histológicos selecionados foram corados
com Hematoxilina-Eosina ou processados para imunoperoxidase indireta para insulina
(Oliveira et al., 2014; Carvalho et al., 2012; Capítulo 2, seção 2.7).Para análise
morfométrica do pâncreas, foi medido o volume total de células β em relação ao pâncreas
total (Volume relativo VR células β/pâncreas) utilizando método estereológico descrito na
literatura, com pequenas modificações (Inuwa e Mardi, 2005; Capítulo 2, seção 2.7).
3.2.5 Avaliação do padrão de citoarquitetura das ilhotas pancreáticas
A análise da citoarquitetura das ilhotas pancreáticas foi realizada a partir de reações
de imunofluorescência com dupla marcação para insulina e glucagon em cortes histológicos
de pâncreas preparados conforme anteriormente descrito (Bonfleur et al., 2010; Capítulo 2,
seção 2.9). Considerando o padrão típico das ilhotas de roedores (Brissova et al., 2005;
Carvalho et al., 2006), as análises das imagens foram classificadas de acordo com um
sistema de scores que estabeleceu o grau de alteração da citoarquitetura conforme o número
de células α deslocadas, ou não contíguas, do manto periférico formado por esse tipo
Capítulo 3
62
celular, posicionado ao redor do core de células β na ilhota (Capítulo 2, seção 2.9). A área
relativa ocupada por células α (glucagon-positivas) e células β pancreáticas (insulina-
positivas) também foi mensurada nessas imagens de ilhotas duplamente imunomarcadas
(Capítulo 2, seção 2.9).
3.2.6. Imunolocalização e análise do grau de marcação das proteínas juncionais em
cortes de pâncreas endócrino
A localização celular de proteínas juncionais (a saber, E-, N-, e VE-caderinas, α- e
β-cateninas, e ZO-1) foi feita em cortes de congelamento de pâncreas por meio de
imunofluorescência indireta usando anticorpos primários e, posteriormente, anticorpos
secundários conjugados com fluorocromo, como previamente descrito (Collares-Buzato et
al., 2004; Santos-Silva et al., 2012; Capítulo 2, seção 2.10). Quando necessário, foi feita a
co-localização destas proteínas e insulina, realizando uma incubação adicional com o
anticorpo policlonal anti-insulina seguida de seu anticorpo secundário policlonal específico
conjugado com TRITC. A análise semi-quantitativa da intensidade e distribuição da
fluorescência foi feita nas imagens digitalizadas obtidas das ilhotas imunomarcadas. Foram
avaliados os seguintes parâmetros expressos em unidades arbitrárias: grau de fluorescência
total da ilhota normalizado pela área da ilhota (para as proteínas ZO-1 e β-catenina), grau
de fluorescência da região intercelular das células β normalizado pela área da ilhota (para as
proteínas E-caderina, N-caderina e α-catenina), área linear de imunoreação normalizada
pela área da ilhota (para a VE-caderina) e área de marcação citoplasmática difusa (como
índice de redistribuição celular) normalizada pela área total da ilhota (para a N-
caderina)(Capítulo 2, seção 2.10).
3.2.7 Western Blot
O conteúdo celular das proteínas juncionais estudadas foi avaliado por Western Blot
em homogeneizados de ilhotas pancreáticas isoladas (pools de 300 ilhotas/grupo) utilizando
protocolo descrito anteriormente (Santos-Silva et al., 2012; Capítulo 2, seção 2.12). As
bandas imunorreativas foram detectadas nas membranas por quimioluminescência
Capítulo 3
63
utilizando filme para auto-radiografia. A densidade óptica das bandas foi analisada pelo
software livre ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) e expressa como uma razão da proteína
juncional de interesse/β-actina (controle interno) (Capítulo 2, seção 2.12).
3.2.8 PCR em tempo Real (RT-qPCR)
A expressão gênica das proteínas juncionais em estudo (a saber, E-, N-, e VE-
caderinas, α- e β-cateninas, e ZO-1), bem como de insulina (isoformas 1 e 2), foi avaliada
pelo método de RT-qPCR em pools de ilhotas pancreáticas isoladas dos grupos
experimentais conforme descrito no Capítulo 2 (seção 2.13). O RNA total, utilizado nos
ensaios de RT-qPCR, foi extraído com o kit RNAqueous®-Micro Kit. A síntese de cDNA
foi realizada utilizando o Kit ImProm™ – II Reverse Transcription System (Promega,
Madison, USA). Os primers foram desenhados a partir da ferramenta Primer-BLAST do
NCBI (National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov)
(sequência dos primers mostrada na Tabela V Capítulo 2, seção 2.13.2). As amplificações
por RT-qPCR foram realizadas em triplicatas e utilizando 20 ng de cDNA por reação. As
leituras da fluorescência foram realizadas pelo equipamento 7500 Fast Real-Time PCR
System7500 (Applied Biosystems, USA). A quantidade relativa (QR) de RNAm de cada
gene de interesse analisado foi calculada utilizando-se o método de Ct comparativo 2-ΔΔCt
(Livak & Schimittgen, 2001) em relação ao gene de referência selecionado (gene rps29)
(Capítulo 2, seção 2.13.5)
3.2.9 Análise Estatística
A significância estatística entre os dois grupos experimentais foi determinada
usando-se o teste t-Student (bicaudal) ou o teste de Mann-Whitney, enquanto que para
múltiplas comparações (como na análise da secreção estática de insulina e RT-qPCR) foi
empregado o teste One Way ANOVA seguido do pós-teste de Bonferroni. Para a análise
estatística da frequência de alteração da citoarquitetura, foi utilizado o teste Chi-quadrado.
Todas as análises estatísticas foram feitas com o auxílio do Software GraphPad Prism
versão 5.00 (GraphPad Software, USA). O nível de significância adotado foi de p<0,05.
Capítulo 3
64
3.3 Resultados
Caracterização metabólica dos animais e análise morfológica das ilhotas pancreáticas
após exposição prolongada a uma dieta hiperlipídica.
As Figuras 5 e 6 apresentam os dados relativos à caracterização metabólica do
modelo apresentado. Como a obesidade pode ser um fator preditor do DMT2 e quando
acompanha esta doença é considerada como parte do processo patogênico, em nosso estudo
avaliamos o ganho de peso dos grupos controle e tratado com dieta hiperlipídica (dHL). Na
Fig. 5a, observa-se o ganho de peso de ambos os grupos, entretanto o grupo alimentado
com dieta hiperlipídica (dHL) apresentou, ao longo de todo período de análise, um ganho
de peso significativamente mais elevado (170%) (***p<0,0001) do que o exibido pelos
animais do grupo controle (37%). A Figura 5b mostra o resultado da glicemia pós-prandial,
na qual observa-se que os animais submetidos à dieta hiperlipídica por 8 meses
apresentaram um aumento significativo desse parâmetro em relação aos animais do grupo
controle (*p<0,02). Ao avaliar a glicemia em jejum após a administração da dHL (Fig. 5c),
nota-se que o grupo controle manteve uma média de glicemia em jejum de
aproximadamente 84 mg/dL, o que está dentro de valores normais de concentração de
glicose no sangue. Entretanto, o grupo alimentado com dieta hiperlipídica apresentou uma
glicemia de aproximadamente 130 mg/dL, em média, caracterizando uma significativa
hiperglicemia nestes animais (***p<0,0001). Na Fig. 5d, temos os resultados da
concentração plasmática pós-prandial de insulina determinada por radioimunoensaio. No
grupo dos animais tratados (dHL), houve um aumento significante (de 88%) na
concentração de insulina plasmática em comparação com o grupo mantido em ração padrão
(**p<0,006). As Fig. 5e e 5f apresentam os resultados do teste de tolerância à insulina
(ITT) nos grupos experimentais. Nossos resultados indicam que a exposição à dieta
hiperlipídica por 8 meses (grupo dHL) induz nos camundongos tratados uma significativa
resistência periférica à insulina em comparação com os animais alimentados com dieta
balanceada (área sob a curva de ITT,*** p=0,0005).
Capítulo 3
65
Os dados referentes à secreção estática de insulina são apresentados na Fig. 6.
Nenhuma diferença significativa foi observada entre as ilhotas isoladas dos dois grupos
experimentais (C vs dHL) quanto ao grau de liberação de insulina após exposição à
concentração basal de glicose (2,8 mM). Entretanto, as ilhotas pancreáticas isoladas dos
animais tratados (n=23-30 pools de ilhotas/grupo) apresentaram um comprometimento
significativo da função secretora de insulina quando estimuladas com 16,7 mM de glicose
(3,9±0,4 ng/mL insulina/h) em relação às do grupo controle (7,1±1,2 ng/mL insulina/h,
**p<0,05).
Como mostram as Figuras 7a e b, o aspecto morfológico das ilhotas de
camundongos dos grupos controle e submetido à dieta hiperlipídica foi similar. Em ambos
os grupos, as ilhotas pancreáticas apresentaram uma morfologia normal com sua forma
variando entre arredondado a ovalado, cujo parênquima é constituído por cordões de
células endócrinas entremeados por capilares. Nas Figuras 7c e 7d, observam-se imagens de
ilhotas provenientes de secções de pâncreas submetidas à reação imunoistoquímica de
dupla marcação para insulina (vermelho) e glucagon (verde). Não se observaram diferenças
significativas quanto à citoarquitetura das ilhotas do grupo controle em relação ao grupo
tratado. A citoarquitetura é definida como a disposição diferencial das células endócrinas
dentro da ilhota pancreática, sendo que, no caso do pâncreas endócrino de roedores, as
células β se organizam preferencialmente na região central da ilhota enquanto que as
células não-β formam um manto na periferia. A avaliação da citoarquitetura das ilhotas,
conforme o sistema de ranks utilizado nessa pesquisa (Capítulo 2, seção 2.9), mostrou uma
organização similar entre os grupos experimentais (Figura 7f), onde mais de 50% das
ilhotas foram classificadas como grau 0, ou seja sem alteração da citoarquitetura (Figura
7e). Quanto ao aspecto morfométrico das ilhotas, verificou-se um significativo aumento no
volume relativo da célula β por pâncreas (*p<0,036 Fig 7i) e da porcentagem de células β
por ilhota em animais do grupo tratado com dHL em relação ao grupo controle (**p<0,003,
Fig. 7j), indicando um aumento da massa dessas células, como demonstrado nas imagens
das secções de pâncreas processadas por imunoperoxidase para insulina (grupo controle
Fig. 7g vs grupo tratado Fig. 7h). Ainda, observou-se uma diminuição significativa da
porcentagem da área relativa das células α nas ilhotas dos camundongos diabéticos (11,06 ±
Capítulo 3
66
0,84 % (66) quando comparadas com ilhotas de animais do grupo controle (15,82 ± 1,24 %
(85) (**p<0,003).
Considerando a análise metabólica dos animais e a avaliação
histológica/morfométrica das ilhotas, os dados descritos acima apontam que a exposição
prolongada (por 8 meses) a uma dieta hiperlipídica desde a fase juvenil induz, em
camundongos, um quadro típico de diabetes mellitus tipo 2 (glicemia jejum >130 mg/dL, e
significativa resistência periférica à insulina associada com comprometimento da secreção
estática de insulina). Entretanto, observa-se ainda nos animais tratados uma tentativa de
compensação pancreática frente à maior demanda de insulina traduzida em aumento da
massa de célula β.
Distribuição e conteúdo celular de proteínas associadas às junções intercelulares nas
ilhotas pancreáticas dos animais diabéticos.
As Figuras 8 a 12 revelam a distribuição e o conteúdo celular no pâncreas endócrino
das seguintes proteínas juncionais: as moléculas de adesão, E-caderina, N-caderina e VE-
caderina (Fig 8, 9, 10 respectivamente), e as proteínas adaptadoras ou de ancoragem ao
citoesqueleto, a ZO-1, α- e β-cateninas (Figs 11 e 12).
Pode-se observar que de uma forma geral tanto as proteínas da junção aderente (E-,
N-, VE-caderina) como as de ancoragem ao citoesqueleto (ZO-1, α- e β-cateninas)
apresentaram uma forte e bem definida marcação intercelular, com pouca ou nenhuma
reação citoplasmática destas proteínas nas células endócrinas das ilhotas pancreáticas do
grupo controle. Dentre todas as proteínas juncionais analisadas, somente a N-caderina
mostrou-se específica ao pâncreas endócrino, sendo que todas as outras foram observadas
tanto nas ilhotas como no parênquima exócrino. Ainda, a VE-caderina foi detectada
somente no endotélio tanto no pâncreas endócrino como exócrino. A marcação ZO-1 foi
também observada na forma de linhas no interior das ilhotas e no parênquima exócrino
correspondendo a vasos (na ilhota e pâncreas exócrino) ou ductos (no pâncreas exócrino).
Capítulo 3
67
As Figuras 8a e 8c mostram imagens da dupla imunofluorescência para E-caderina
(em verde), e a sua co-localização para insulina (em vermelho) (Fig 8b e 8d), nas ilhotas do
grupo controle (a e b) e do grupo tratado com dieta hiperlipídica dHL (c e d). Observa-se
que os animais expostos à dHL por oito meses apresentaram uma diminuição da marcação
para esta proteína na região de contato intercelular (Fig. 8c) em comparação com o grupo
controle (Fig. 8a). A análise semiquantitativa do grau de fluorescência da marcação
intercelular para esta proteína, revelou que essa diminuição é estatisticamente significativa
para o grupo tratado (***p< 0,0001, Fig. 8e).
Para a avaliação do grau de expressão da E-caderina, foram realizadas análises dos
extratos protéicos das ilhotas pancreáticas de ambos os grupos por Western Blotting. Pode-
se observar, na Fig 8f, a imunodetecção dessa proteína em homogeneizados de ilhotas
pancreáticas de animais dos grupos controle e dieta. A mesma membrana foi reincubada
para detecção da β-actina, utilizado como controle interno da reação (Fig. 8g). Na Figura
8h, são apresentados os valores da quantificação do extrato proteico, feita através da
medida da densidade óptica das bandas da E-caderina normalizada pelos valores obtidos
para β-actina. O resultado não revelou alterações significativas no conteúdo proteico dessa
molécula de adesão em ilhotas dos camundongos diabéticos em relação às do controle.
Avaliamos por imunoistoquímica, a distribuição celular da molécula de adesão, N-
caderina em ilhotas pancreáticas, tanto para o grupo controle Fig. 9a, como para o grupo
tratado Fig. 9b. Notamos que, em comparação ao grupo controle, as células endócrinas nas
ilhotas de camundongos diabéticos mostram uma redistribuição celular dessa molécula de
adesão, com uma marcação intercelular menos nítida associada a uma reação citoplasmática
mas intensa e difusa para essa proteína. Essa avaliação qualitativa foi comprovada
quantitativamente, como mostram as Fig 9c e 9d, onde em 9c observa-se a avaliação semi-
quantitativa da marcação juncional da N-caderina que revela uma diminuição significativa
na marcação intercelular para essa proteína nas ilhotas dos camundongos diabéticos em
relação às dos animais controle (***p<0,0001). Na Figura 9d, observa-se um aumento
significativo da região da ilhota mostrando marcação citoplasmática difusa para N-
Capítulo 3
68
caderina, quando normalizada pela área da ilhota, no grupo tratado com dHL em relação ao
grupo controle (***p< 0,0001).
Como mostra a Figura 9e, a N-caderina foi imunodetectada em homogeneizados de
ilhotas pancreáticas de animais dos grupos controle e tratado por immunoblotting. A mesma
membrana foi reincubada para detecção da β-actina (controle interno da reação) (Fig. 9f).
Na Figura 9g, são apresentados os valores da quantificação do extrato protéico, feita através
da medida da densidade óptica das bandas da N-caderina normalizados pelos valores
obtidos para β-actina. O resultado não revelou diferenças estatisticamente significantes no
conteúdo de N-caderina nos homogeneizados de ilhotas dos grupos experimentais, embora
tenha sido observada uma tendência de aumento (de aproximadamente 31%) no conteúdo
celular dessa proteína nas ilhotas dos animais diabéticos em relação ao controle.
As Figuras 10a a 10d mostram imagens de imunofluorescência para VE-caderina e
insulina em cortes de pâncreas de camundongos, tanto para o grupo controle (Fig. 10a-b),
como para o grupo tratado com dHL (Fig. 10c-d). Nota-se que a exposição por 8 meses à
dieta HL induziu um aumento na marcação para VE-caderina nas ilhotas pancreáticas dos
animais diabéticos (Fig. 10c) em relação às do grupo controle (Fig. 10a). Esses dados foram
confirmados através da avaliação quantitativa da área linear de marcação para essa proteína
em vasos/capilares, normalizada pela área da ilhota, que mostrou um aumento na
imunofluorescência para VE-caderina sugerindo aumento da vascularização, nas ilhotas dos
camundongos diabéticos (**p=0,0040, Fig. 10e)
Adicionalmente, foi analisada a expressão proteica da VE-caderina, por
immunoblotting, em homogeneizados de ilhotas de ambos os grupos (Fig 10f); a proteína β-
actina foi utilizada como controle interno da reação (Fig. 10g). A densitometria das bandas
da VE-caderina quando normalizada pelos valores obtidos para β-actina (Fig. 10h), não
revelou alterações estatísticas significantes em ambos os grupos, apesar da tendência de
aumento (em 11,2%) verificada no grupo tratado com dHL.
Na Figura 11, observamos imagens de ilhotas, capturadas por microscopia confocal,
processadas por imunofluorescência para detecção das proteínas ZO-1 (Fig. 11 a e c em
Capítulo 3
69
verde, com co-localização de insulina, em vermelho, Fig. 11b e d), α-catenina (Fig. 11 f e h
em verde, com co-localizção de insulina, em vermelho, Fig. 11g e i), β-catenina (Fig. 11 k e
m em verde, com co-localização de insulina, em vermelho, Fig. 11 l e n). Observa-se que,
no caso da α-catenina, houve uma diminuição estatisticamente significante (***p< 0,0001),
da detecção da marcação para essa proteína juncional na região de contato intercelular nas
células β (Fig. 11h e i) em ilhotas dos animais tratados com dHL, quando comparadas às do
grupo controle (Fig. 11f e g). Esses dados foram confirmados através da mensuração do
grau de fluorescência das ilhotas, normalizado pela área da ilhota, como mostrado na Fig
11j. Entretanto, quanto ao grau de imunomarcação nas ilhotas para as proteínas ZO-1 (a-b
grupo controle, c-d grupo tratado) e β-catenina (k-l, controle, m-n tratado) não houve
alterações estatisticamente significantes entre os dois grupos experimentais (Fig. 11e e Fig.
11o, respectivamente).
Ilhotas isoladas dos grupos controle e tratados com dHL foram analisadas quanto à
expressão proteica de ZO-1 (Fig. 12a-c), α-catenina (Fig. 12 d-f), β-catenina (Fig. 12g-i),
por Western Blot. Após a imunotransferência das proteínas, a mesma membrana foi
reincubada com β-actina, garantindo o controle interno da reação, como mostra a Fig. 12b,
e, h, para as proteínas ZO-1, α-catenina, β-catenina, respectivamente. Os valores de
quantificação do extrato proteico foram realizados por densitometria conforme
demonstrado para ZO-1 (Fig. 12c), α-catenina (Fig. 12f) e β-catenina (Fig. 12i). Não foram
observadas diferenças estatisticamente significantes entre os grupos experimentais.
Análise da expressão gênica das proteínas juncionais e de insulina em ilhotas
pancreáticas
A expressão dos genes das proteínas juncionais analisadas nesse estudo (a saber E-,
N-, VE-caderinas, ZO-1, α-catenina, β-catenina) e da insulina (isoformas 1 e 2) foi
analisada por qPCR em ilhotas pancreáticas isoladas de animais controle e tratados com
dHL por 8 meses (Figura 13). Os valores obtidos foram comparados entre si e normalizados
contra o gene de referência (rps29). Observou-se um aumento estatisticamente significativo
de expressão dos genes cdh2 (N-caderina, p<0,01), cdh5 (VE-caderina, p<0,04), tjp1 (ZO-
Capítulo 3
70
1, p<0,02) e de ins2 (p=0,0082) nas ilhotas dos camundongos diabéticos quando comparado
as do grupo controle. Um aumento (de 456%) na expressão gênica de ins1 foi também
verificado nos animais tratados em relação aos controles, embora não tenha atingido
significância estatística.
3.4.Discussão
A incidência do diabetes mellitus tipo 2 (DMT2) vem aumentando em todo o
mundo e despertando a preocupação das autoridades em saúde pública para o problema
(Ashcroft & Rorsman, 2012). Este fato vem promovendo o interesse contínuo em buscar
novas metodologias que se apliquem na terapia celular e molecular dessa disfunção (Tahara
et al., 2011).
Trata-se de uma doença de patogênese bastante complexa e que, em seu estágio
inicial, observa-se uma hiperglicemia moderada, significativa resistência periférica à
insulina e hiperinsulinemia associada com um aumento da massa de células β. Existem
vários modelos animais de diabetes tipo 2, sendo a linhagem de camundongos C57BL/6J
amplamente utilizada para estudar distúrbios metabólicos e seus comprometimentos
relacionados ao diabetes mellitus não dependente de insulina (tipo 2) e à obesidade. Em
geral, estes estudos têm enfocado o efeito de dietas, como as com alto teor de lipídios e/ou
carboidratos, administradas normalmente por períodos curtos (dias a alguns meses) (Ahrén
& Pacini, 2002; Winzell & Ahren, 2004; De Souza, 2005; Drolet et al., 2006, Ghaisas et
al., 2009; Peyot et al., 2010).
No entanto, trabalhos investigando o efeito metabólico da exposição prolongada à
dieta hiperlipídica são raros (Sone & Kagawa 2004; Calligaris et al., 2013). No melhor de
nosso conhecimento, o presente estudo é inédito ao empregar machos alimentados com
dieta com alto teor de lipídios (21% em peso) (dHL) por 8 meses desde a fase juvenil e
avaliar não somente a repercussão sobre a homeostasia glicêmica mas particularmente
sobre a biologia da célula β (estrutura e função secretora). Para tanto, realizamos a
Capítulo 3
71
caracterização metabólica do animal que apresentou um importante ganho de peso,
reforçando a correlação existente entre DMT2 e obesidade.
Como tem sido frequentemente demonstrado, a condição de obesidade adulta em
humanos tem aumentado sua incidência em todo mundo sendo associada à influência de
fatores externos, principalmente a mudança no estilo de vida (Ashcroft & Rorsman, 2012).
Especialmente a obesidade centrípeta ou central, pode ser um fator preditor do DMT2 e,
quando acompanha esta disfunção metabólica, é considerada como parte do processo
patogênico. A maior massa de adipócitos origina maiores níveis de ácidos graxos
circulantes, assim como esses adipócitos secretam adipocinas que regulam o peso corporal,
o apetite, o dispêndio de energia, e ainda modulam a sensibilidade à insulina. Uma maior
produção destes produtos pode levar a resistência à insulina, onde a progressão deste estado
e consequente hiperinsulinemia compensatória, podem tornar as ilhotas pancreáticas
incapazes de preservar o estado normoglicêmico do indivíduo (Prentki & Nolan, 2006;
Kahn et al, 2006; Guilherme et al, 2008). Peyot e colaboradores (2010) também
observaram que, em camundongos C57Bl/6, quanto maior o índice de obesidade, mais
pronunciada é a perturbação da homeostase glicêmica. É importante ressaltar que os
camundongos empregados neste estudo, apresentam entre 12 e 13 meses de vida, portanto
aproximadamente de 30 a 33 anos se comparados com a idade do ser humano (Andreollo et
al, 2012), fase da vida em que normalmente se iniciam os primeiros sintomas do DMT2.
O comprometimento da homeostase glicêmica pode ser observado a partir dos dados
encontrados nos animais alimentados com dHL que apresentaram resistência periférica à
insulina associada à elevada hiperglicemia de jejum e pós-prandial e hiperinsulinemia
moderada. A análise morfológica do pâncreas endócrino não revelou alterações
significativas, entretanto observou-se uma expansão compensatória da massa de células β
por pâncreas (aumento relativo), confirmando que estes animais se encontravam em um
estágio inicial porém já estabelecido do diabetes mellitus tipo 2. Sone e Kagawa (2005)
descreveram, em seu estudo, as alterações causadas pelo aumento da porcentagem relativa
de células β pancreáticas e aumento de massa dessas células após tratamento com dieta
hiperlipídica por 4 meses empregando camundongos C57. Dados recentes do nosso grupo
Capítulo 3
72
mostram que a exposição à dieta hiperlipídica por apenas 60 dias já é o suficiente para
induzir, em camundongos dessa linhagem, pré-diabetes associado com obesidade e
hipercolesterolemia (Carvalho, 2009; Carvalho et al., 2012; Oliveira, 2011; Oliveira et al.,
2014).
Em comparação com os estudos anteriores, notamos que o tratamento por 8 meses
induziu alterações mais severas indicativas de um estágio já estabelecido de DMT2 mas
ainda associado com compensação secretora, embora parcial, do pâncreas endócrino.
Oliveira e colaboradores (2014) mostraram que a expansão de massa da célula β observada
em camundongos C57 tratados com dHL por 60 dias é resultado de hipertrofia e hiperplasia
dessa célula endócrina nas ilhotas pancreáticas. Embora não tenhamos avaliado o tamanho
e número de células β por ilhota no presente estudo, é provável que ambos os eventos
estejam também contribuindo para o aumento da massa de célula β nos animais tratados
com dieta por 8 meses. Provavelmente este aumento é influenciado por uma maior
demanda de insulina exigida pelo organismo para tentar manter a homeostase glicêmica e
contrabalancear a resistência à insulina dos tecidos periféricos, principalmente do músculo
esquelético, tecido adiposo e fígado (Kahn et al., 2006; Prentki & Nolan, 2006).
Adicionalmente, observamos uma diminuição significativa da área ocupada por células α
no grupo tratado com dHL. Estudos recentes mostram que as células α são dotadas de
plasticidade incomum, podendo se transdiferenciar em célula β (Collombat et al., 2009; Liu
& Habener, 2009; Habener & Stanojevic, 2012). Esta transdiferenciação das células α pode
levar a uma diminuição tanto dessa célula endócrina pancreática como da sinalização do
seu secretagogo, o glucagon, que por sua vez, desempenha importante papel na estimulação
de células progenitoras associadas a ductos próximos às ilhotas a expressarem neurogenina
3, promovendo a proliferação dessas células precursoras (Collombat et al., 2009; Liu e
Habener, 2009). Este fato poderia explicar a relação entre a diminuição da área ocupada
pelas células α encontradas no nosso estudo e a fase que antecederia o decaimento da
expansão da massa de células β, a partir do qual dar-se-ia o início à fase tardia ou insulino-
dependente da DMT2.
Capítulo 3
73
Quanto à histologia do pâncreas endócrino, as ilhotas de ambos os grupos
experimentais apresentaram-se como estruturas ovaladas ou arredondadas imersas no
parênquima exócrino e com as células endócrinas pancreáticas dispostas em cordões
anastomosantes entremeados por capilares sanguíneos. Sabe-se que a citoarquitetura (ou
organização das células endócrinas dentro da ilhota) pode diferir conforme a espécie animal
e estado fisiopatológico, inclusive em modelos de diabetes (Gómez-Dumm et al., 1990;
Cabrera et al., 2006; Kim et al., 2010). Em ilhotas de humanos, observa-se uma
organização cordonal trilaminar, onde cada cordão apresenta uma camada de células β entre
duas camadas de células α; nessa organização, as células α são encontradas na região
central da ilhota (Bosco et al., 2010). Os outros tipos celulares parecem ficar entremeados
às células β e α (Cabrera et al., 2006; Bosco et al., 2010). Entretanto, em camundongos,
tem-se que as células β são predominantes e localizadas no centro da ilhota e, as células
não-β formam um manto que se localiza na periferia deste micro-orgão, (Brissova et al,
2006, Cabrera et al, 2006; Kim et al, 2010).
Kim e colaboradores (2010) afirmam que apesar de diferenças na organização
celular das ilhotas entre camundongos e humanos, as mesmas apresentam características
comuns em resposta à demanda por insulina. Ainda em casos de obesidade, diabetes e
gravidez, observou-se que as ilhotas de camundongos, nestas condições, apresentaram uma
redistribuição em sua organização celular, onde as células não-β encontraram-se misturadas
as células β (Kim et al., 2009). Entretanto, salienta-se que os camundongos que exibiram
tal modificação na redistribuição celular das ilhotas apresentaram um valor de glicemia de
aproximadamente 388 mg/dl em 15 semanas, o que provavelmente reflete um estágio
avançado do diabetes, enquanto que em nosso estudo os camundongos C57, com
tratamento prolongado com dHL por 8 meses, apresentaram glicemia de jejum de
aproximadamente 130 mg/dl que reflete um estágio menos tardio do DMT2. Isto
provavelmente explica a ausência de alterações significativas tanto na histologia como na
citoarquitetura das ilhotas pancreáticas nos nossos animais diabéticos.
Embora não tenhamos observado modificações estruturais nas ilhotas dos
camundongos tratados com dHL, as células β desses animais mostraram severo
Capítulo 3
74
comprometimento da secreção estimulada de insulina, demonstrando falha na função
secretora destas células quando estimuladas com 16,7 mM de glicose. Os resultados do
qPCR das isoformas 1 e 2 da insulina revelaram, entretanto, que os animais tratados
apresentaram um aumento de expressão gênica desse hormônio, sugerindo que
provavelmente exista uma disfunção no processo pós-traducional, ou seja, nas etapas de
acoplamento do sinal da secreção de insulina propriamente dita. Como a manutenção da
homeostase glicêmica depende principalmente da capacidade funcional/secretora das
células β, o comprometimento desta função resulta invariavelmente no diabetes mellitus
(Nittala A et al., 2007). O grau de secreção de insulina é ditado pela biossíntese da proteína,
formação dos grânulos, e sua liberação por exocitose pelas células β pancreáticas. A
biossíntese, assim como a secreção basal e estimulada de insulina, dependem da
citoarquitetura da ilhota, de estruturas celulares da célula β, como canais de membrana
(canais de potássio ATP-dependentes e canais de cálcio voltagem dependentes), proteínas
integrais de membrana (transportador GLUT-2, receptor para insulina IR),
proteínas/enzimas citoplasmáticas (IRS, glicoquinase), bem como o citoesqueleto (Suckale
& Solimena, 2006; Kahn et al, 2009), que são influenciados pela expressão diferencial de
moléculas de adesão, Cx36 e proteínas associadas ao citoesqueleto (De Souza et al., 2005;
Jain & Lammert, 2009; Carvalho et al., 2012; Meda, 2013). Os nossos dados, indicando um
comprometimento do processo de acoplamento estímulo-secreção de insulina nas células β
dos animais diabéticos, está em acordo com trabalhos da literatura que mostram que tanto a
hiperglicemia crônica como a obesidade podem comprometer a transdução de sinal para a
insulina tanto nos tecidos periféricos como no pâncreas endócrino (Eldar-Finkelman et al.,
1999; Rhoedes et al. 2005; Liu et al., 2010).
Levando-se em consideração os dados obtidos referentes à caracterização
metabólica dos animais como um todo, podemos afirmar que os camundongos C57BL/6J
tratados com dieta por tempo prolongado (8 meses) apresentaram alterações metabólicas
compatíveis com um quadro já estabelecido de diabetes mellitus tipo 2, já que estão obesos,
hiperglicêmicos (>130mg/dl), e resistentes à insulina, embora ainda apresentem uma
resposta compensatória parcial do pâncreas endócrino revelada por um estado
hiperinsulinêmico e pela massa aumentada de células β.
Capítulo 3
75
Como parte integrante e relevante dos objetivos do presente estudo, fomos
investigar a distribuição e conteúdo celular das proteínas juncionais, de adesão E-, N-, VE-
caderinas, α e β-cateninas e ZO-1, nesse modelo animal de DMT2 com o intuito de
estabelecer uma possível associação entre essa doença e alteração/comprometimento das
junções intercelulares no pâncreas endócrino. Constatamos que, de uma forma geral, tanto
as proteínas da junção aderente (E-, N-, VE-caderina) como as de ancoragem ao
citoesqueleto (ZO-1, α- e β-cateninas) apresentaram uma forte e bem definida marcação
intercelular, com pouca ou nenhuma reação citoplasmática destas proteínas nas células das
ilhotas pancreáticas do grupo controle, mostrando a relação entre sua distribuição e a
manutenção da organização celular da ilhota pancreática e a homeostase glicêmica.
Observamos também que ZO-1 e as caderinas estudadas também são expressas por células
do parênquima exócrino, com exceção da N-caderina que se manteve exclusiva às células
endócrinas na ilhota pancreática. Ainda, a VE-caderina foi detectada somente nas células
endoteliais de vasos encontrados tanto no pâncreas endócrino como exócrino.
As junções celulares no pâncreas endócrino têm um papel importante que é
evidenciado pela observação de que algumas proteínas constitutivas são essenciais para que
as células β se organizem em estruturas tridimensionais, as ilhotas pancreáticas, durante o
desenvolvimento do pâncreas de roedores e para a manutenção dessa estrutura no adulto
(Kim et al., 2009, Bosco et al., 2010; Santos-Silva et al., 2012). Ao investigarmos a
distribuição celular de E-, N-caderina, α-catenina, constatamos que nas ilhotas dos animais
tratados houve uma diminuição na marcação intercelular, que não foi acompanhada de
alteração significativa do conteúdo celular dessas proteínas.
Dentre essas proteínas juncionais, a mais estudada no pâncreas endócrino é a E-
caderina. Há várias evidências experimentais mostrando a importância dessa molécula de
adesão no processo de secreção de insulina e na homeostase da massa de célula β. A
presença na região de contato intercelular e/ou expressão aumentada de E-caderina na
célula β está associada com aumento da secreção estimulada de insulina, do conteúdo total
da proteína e RNAm de pré-pró-insulina (Hauge-Evans et al, 1999; Yamagata et al., 2002;
Calabrese et al., 2004; Bosco et al., 2007; Carvell et al., 2007). Culturas de células MIN6
Capítulo 3
76
organizadas em estruturas tridimensionais (pseudo-ilhotas), que expressam mais E-
caderina, mostram uma maior secreção do que quando essas células estão organizadas em
monocamadas (Hauge-Evans et al, 1999; Calabrese et al., 2004). Ainda, a exposição destas
células a um anticorpo-anti E-caderina resulta em inibição da secreção de insulina
estimulada por glicose em ilhotas isoladas (Rogers et al, 1997; Calabrese et al, 2004).
Embora ainda haja controvérsias, tem sido proposto que o papel da E-caderina no processo
secretório seja indireto por meio de sua função em manter a arquitetura da ilhota ou em
garantir a estrutura das junções comunicantes, e portanto, a comunicação intercelular
(Carvell et al., 2007; Rogers et al., 2007). Além da sua função sobre a secreção de insulina,
a E-caderina também parece desempenhar um papel no processo de proliferação e
sobrevivência da célula β, onde baixa expressão de E-caderina está associada com alta
capacidade de proliferação (Carvell et al., 2007; Wakae-Takada et al., 2013) enquanto que
alta expressão dessa molécula de adesão resulta em proteção da célula β contra apoptose
induzida por agentes citotóxicos como citocinas-pró inflamatórias (Parnaud et al., 2011;
Shirakawa et al., 2011; Ngamjariyawat et a.l., 2013). Carvell e colaboradores (2007)
verificaram que a baixa expressão de E-caderina, em associação com uma diminuição no
contéudo celular de α-catenina, resultou em redução dos níveis de p27Kip1, inibidor de
quinase dependente de ciclina, que é envolvido na fase G1 do ciclo celular, o que pode
justificar a sua íntima relação com a capacidade de proliferação celular. Ainda, uma
possível ativação da via Wnt canônica pode estar também envolvida na proliferação da
célula β mediada pela E-caderina (Maschio, 2014; Wakae-Takada et al., 2013). Portanto, os
dados obtidos no presente trabalho, mostrando uma diminuição no conteúdo juncional de
E-caderina e da α-catenina (proteína de ancoragem ao citoesqueleto) nas células endócrinas
da ilhota dios camundongos diabéticos, podem estar relacionados à reduzida resposta
secretora de insulina e à expansão da célula β verificadas nesses animais.
A N-caderina, cuja função ainda não está bem estabelecida no pâncreas endócrino,
parece desempenhar funções semelhantes à E-caderina no que se refere à secreção de
insulina e sobrevida da célula β frente a condições citotóxicas (Pernaud et al., 2011;
Johansson et al., 2010). Em pâncreas de humanos, a N-caderina está limitada à célula β e
parece ser importante na manutenção e viabilidade desta célula (Parnaud et al., 2011). Em
Capítulo 3
77
estudo com camundongos nocaute para N-caderina, a análise de ablação específica de N-
caderina no pâncreas demonstrou que esta proteína é dispensável para a organogênese e
morfogênese pancreática, mas necessária para o turnover dos grânulos de secreção de
insulina nas células β por um mecanismo ainda desconhecido. O número de grânulos de
secreção de insulina é significativamente reduzido em células β-N-caderina-deficiente e,
como uma consequência deste fato, a secreção de insulina apresenta-se diminuída
(Johansson et al., 2010). Além da diminuição do conteúdo juncional (similar ao verificado
com a E-caderina), que pode estar também relacionada ao comprometimento da secreção de
insulina e aumento da massa de célula β, observamos um aumento da marcação
citoplasmática difusa e aumento na expressão gênica de N-caderina nas ilhotas dos animais
tratados com dHL por 8 meses. Embora não tenhamos uma explicação conclusiva para
esses dados, é possível sugerir que o aumento no pool citoplasmático dessa caderina esteja
relacionada a uma internalização da mesma (e talvez posterior degradação) a partir do pool
intercelular. Quanto à alteração na expressão gênica dessa proteína, Wakae-Takada e
colaboradores (2013) demonstraram que a perda de E-caderina está associada com um
aumento “compensatório” da expressão de outras caderinas (particularmente de N- e VE-
caderinas) em ilhotas de camundongos nocaute para E-caderina (com 1 mês de idade). Em
face desses trabalhos e dos resultados por nós obtidos, é possível sugerir que a N-caderina
desempenhe papéis adicionais na biologia da célula β que poderiam refletir no seu
envolvimento na patogênese da DMT2.
Sabe-se que a função adesiva das caderinas depende da sua associação com
microfilamentos de actina mediada por um complexo protéico formado pelas cateninas
(alfa-, beta- e gama-catenina, e p120) e, na ausência de junção de oclusão, também por ZO-
1 (Aberle et al., 1996; Lewis et al., 1997; Miravet et al., 2003; Perez-Moreno et al., 2003;
Yin e Green, 2004). Tem sido demonstrado que a participação da α- e β-cateninas e ZO-1
não se restrigem apenas a componentes estruturais das junções intercelulares, mas
funcionam como moléculas sinalizadoras, importante em vários processos celulares, tais
como diferenciação e proliferação em outros tecidos/células (Jin et al., 2008; Murtaugh et
al., 2008). Por exemplo, em estudos in vitro, células β da linhagem INS-1, a partir da
inativação de GSK-3β, revelaram estimulação da proliferação celular sendo mediada pela
Capítulo 3
78
estabilização nuclear de β-catenina e indução de ciclina D (Figeac et al., 2009). Ainda,
nosso grupo demonstrou que a maturação da maquinaria secretora de insulina, observada
em condições in vitro e in vivo, ocorre em paralelo com aumento da expressão das
cateninas e ZO-1 em ilhotas pancreáticas de ratos recém-nascidos (Collares-Buzato et al,
2001; 2004; Santos-Silva et al, 2012). Entretanto, no presente trabalho, não verificamos
alterações na distribuição e conteúdo celular de β-catenina e ZO-1 nas ilhotas dos animais
diabéticos, mas somente a α-catenina mostrou uma diminuição da sua imunoreação na
região intercelular nas células β como discutido anteriormente.
Adicionalmente, observamos um aumento da imunodetecção da VE-caderina
verificado nas ilhotas pancreáticas dos animais diabéticos, assim como o aumento
significativo da expressão gênica desta proteína verificado por qPCR. A VE-caderina é uma
proteína expressa por células endoteliais e encontrada exclusivamente nas junções
aderentes do epitélio vascular de outros órgãos (Corada et al., 1999; Breier, et al., 1996;
Dejana et al., 2001; Ahrens et al., 2003), e de acordo com o presente trabalho também é
expressa pelo endotélio no pâncreas endócrino. A ZO-1 também mostrou uma marcação
linear dentro da ilhota, muito semelhante à VE-caderina, indicando que essa proteína
juncional também está associada à parede vascular no pâncreas endócrino, além da sua
presença na região de contato intercelular nas células endócrinas pancreáticas.
Curiosamente, observamos um aumento da expressão gênica de ZO-1 nas ilhotas dos
nossos animais diabéticos. O aumento da área linear e expressão gênica da VE-caderina,
bem como da ZO-1, fortemente sugere um aumento da vascularização das ilhotas
pancreáticas nos animais alimentados com dHL por 8 meses. Sabe-se que a ilhota
pancreática é bastante vascularizada (cinco vezes mais que o pâncreas exócrino), o que está
diretamente relacionado com a sua função endócrina. Tem sido demonstrado, em vários
modelos animais de resistência à insulina, que há a indução da formação de novos vasos
(angiogênese) e/ou dilatação dos vasos já existentes dentro da ilhota (Agudo et al., 2012;
Dai et al., 2013). Em uma interrelação física e funcional com as células β, as células
endoteliais estão envolvidas não somente com o fornecimento de oxigênio e nutrientes às
células endócrinas, mas parecem induzir a expressão do gene da insulina, promover a
proliferação celular e produzir substâncias vasoativas, angiogênicas e fatores de
Capítulo 3
79
crescimento (revisado por Zanone et al., 2008). Fatores de crescimento como o VEGF-A
(fator de crescimento endotelial vascular) liberados pelas células β induzem a formação da
rede capilar e aumento das fenestrações no endotélio, resultando em aumento da
permeabilidade vascular (Zanone et al., 2008). Por outro lado, tem sido demonstrado que
hiperglicemia leva a um aumento no fluxo e pressão sanguínea dos capilares da ilhota
(Zanone et al., 2008). Este aumento poderia, com o tempo, contribuir para o dano do
endotélio e o espessamento da parede capilar, diminuindo assim a perfusão das ilhotas.
Ainda ressalta-se que hiperglicemia induz a produção de NO (óxido nítrico) pelo endotélio,
podendo resultar em citotoxicidade para as ilhotas e assim prejudicar a secreção de insulina
(Henningsson et al., 2002; Zanone et al., 2008). Portanto, o aumento da vascularização,
como revelado pela expressão aumentada de VE-caderina, nas ilhotas dos animais tratados
por tempo prolongado com dHL, pode estar relacionado com o aumento da massa de célula
β (considerando o feedback positivo da célula β sobre a vascularização) (Duvillie et al.,
2002; Zanone et al., 2008) e, ainda, com o comprometimento da secreção de insulina
mediado por fatores potencialmente liberados pelo endotélio exposto a altas concentrações
de glicose (Zanone et al., 2008).
Em conclusão, os resultados obtidos demonstram que o modelo animal, empregando
camundongos C57BL/6 alimentados com dHL por 8 meses, apresentou manifestações
metabólicas de um estágio já estabelecido de diabetes tipo 2, porém ainda associado com
compensação secretora, embora parcial, do pâncreas endócrino. As proteínas juncionais
estudadas foram expressas por células endócrinas e endoteliais das ilhotas pancreáticas e,
em particular, a distribuição/expressão de N-, E- e VE-caderinas, bem como da α-catenina
nas ilhotas é significativamente alterada em camundongos obesos e diabéticos, o que pode
ter relevância no desenvolvimento da DMT2. Se as alterações nas proteínas juncionais
observadas nas ilhotas dos animais tratados com dHL são causa ou efeito das alterações
funcionais verificadas nas células β durante o estado pré-diabético e diabético propriamente
dito, é uma questão a ser esclarecida. Jonas e colaboradores (1999) demonstraram que a
exposição crônica à hiperglicemia desencadeia a perda da diferenciação de célula β em
modelo animal de diabetes. Esse resultado favorece a idéia que as alterações observadas no
presente trabalho são possivelmente consequência da dediferenciação celular já que é bem
Capítulo 3
80
conhecido que esse processo está diretamente associado à perda de expressão de proteínas
juncionais e consequente diminuição da adesão entre as células (Kim et al., 2009; Li et al.,
2009; Luebke-Wheeler et al., 2009; Luther et al., 2005). Por outro lado, as evidências
mostrando que as proteínas juncionais podem interferir diretamente em processos como a
comunicação intercelular (Calabrese et al., 2004; Rogers et al., 2007), a proliferação da
célula β (Kim et al., 2009; Zhang et al., 2012) e, provavelmente, a biossíntese e liberação
de insulina (Saini, 2010; Zanone, 2008), sugerem um efeito causal das alterações nas
junções intercelulares sobre a célula β na diabetes. Estudos futuros empregando animais
transgênicos e/ou nocautes, para algumas das proteínas juncionais e, submetidos à dieta HL
poderão fornecer informações valiosas sobre o papel exato do contato célula β-célula β no
desenvolvimento da DMT2.
Capítulo 3
81
3.5 Figuras
Figura 5. Camundongos C57BL/6J se tornam obesos e diabéticos após a alimentação
com dieta hiperlipídica (dHL) por tempo prolongado.
Dieta hiperlipídica (dHL) por 8 meses induziu um aumento significativo (***p <0,0001) no
ganho de peso corporal de camundongos em comparação com os camundongos controle
(Ctr) alimentados com uma dieta regular (a) (Ctr, n = 25; dieta dHL, n = 25). Glicemia pós-
prandial e de jejum (painéis b e c, Ctr n = 15; dHL, n = 16), bem como os níveis de insulina
no plasma (no estado alimentado) (painel d, Ctr n = 25; dHL, n = 25) também tiveram
aumento estatisticamente significante (* p<0,020 em b; ***p <0,0001 em c e **p<0,006
em d) em camundongos alimentados com dHL. A curva do teste de tolerância à insulina
(ITT) (e) revelou um maior aumento (***p= 0,0005) dos valores de AUC (f) em dHL do
que em camundongos controles (Ctr n = 7; n = 7 dHL). Todos os dados são expressos como
média ± SEM.
Capítulo 3
82
83
Figura 6. Ilhotas pancreáticas de camundongos diabéticos apresentam diminuição da
secreção de insulina estimulada por glicose.
Os pools de ilhotas isoladas de camundongos controle (Ctr) (c) (barras abertas) e
camundongos alimentados com dHL (barras pretas) foram expostos a 2,8 mM ou 16,7 mM
de glicose por 60 min. Em comparação com os Ctr (barras abertas), as ilhotas de
camundongos dHL (barras pretas) mostraram valores semelhantes de secreção de insulina
basal, na presença de 2,8 mM de glucose, mas uma diminuição significativa na liberação de
insulina, quando estimulada por 16,7 mM de glucose (**p<0,05). As barras representam a
média ± SEM de 3 experimentos independentes (23-30 pools de 5 ilhotas isoladas a partir
de 6 camundongos por grupo).
Capítulo 3
84
Figura 7. A exposição prolongada à dieta hiperlipídica (dHL) (8 meses) induz a
expansão da massa de células beta, sem alteração marcante na citoarquitetura da
ilhota.
Nenhuma alteração significativa foi observada na histologia (a, b) e citoarquitetura (como
determinado pela distribuição diferencial de células β insulina-positivas (vermelho) e de
células α glucagon-positivas (verde) (seta) (c, d, e, f) das ilhotas de camundongos tratados
com dHL em comparação com o grupo controle. No entanto, um aumento significativo no
volume relativo das células β por pâncreas (i) (* p<0,036) e na percentagem de células β
das ilhotas por pâncreas (j) (** p <0,003) (j), indicando uma expansão da massa de células
beta no grupo tratado com dHL (h), foi visto em secções de pâncreas processadas por
imunoperoxidase de insulina (setas), em comparação com os controles (g) (6
secções/animal; n= 4-6 animais/grupo). Barras de escala: a, b e c-d, 20 µm. Aumento de 2x
em g-h (barra 500 µm).
Capítulo 3
85
Cap
ítulo
3
Cap
ítulo
3
Capítulo 3
85
86
Figura 8. A exposição prolongada (8 meses) à dieta hiperlipídica (dHL) induz uma
diminuição significativa no conteúdo juncional de E-caderina, que não é
acompanhada por alterações na expressão dessa molécula de adesão em células β dos
camundongos diabéticos.
Imagens a – d correspondem à imunofluorescência para E-caderina, obtidas por
microscopia confocal (verde, a e c), e co-imunomarcadas para insulina (vermelho, b e d) de
ilhotas pancreáticas de camundongos tratados com dHL (painel c e d) e os controles Ctr
(painel a e b). Nota-se que a exposição de 8 meses à dHL induz uma diminuição da
imunomarcação para E-caderina na região de contato intercelular das células β (c) em
relação ao grupo controle (a), que foi confirmado quantitativamente (gráfico em e). Todas
as imagens são representativas de pâncreas de 6 animais por grupo de 3 experimentos
independentes. Barras de escala: 50 µm. O conteúdo total de E-caderina foi determinado
por Western Blot em homogeneizados de ilhotas isoladas de camundongos de ambos os
grupos experimentais (painel f). A mesma membrana foi re-incubada com um anticorpo
anti-β-actina, utilizado como controle interno da reação (painel g). Ilhotas de camundongos
dHL não mostraram alterações significativas nos níveis totais de expressão de E-caderina
em comparação as ilhotas controle (h). As barras representam a média ± SEM de 5
membranas obtidas a partir de 5 experimentos independentes (n = 6
animais/grupo/experimento).
Capítulo 3
87
Cap
ítulo
3
87
Cap
ítulo
3
Capítulo 3
88
Figura 9. A exposição prolongada à dieta hiperlipídica (dHL) induz marcada
redistribuição celular de N-caderina, que não é acompanhada por alteração
significativa no conteúdo celular dessa molécula de adesão em células β dos
camundongos diabéticos.
Imagens a e b correspondem à imunofluorescência para N-caderina, obtidas por
microscopia confocal, de ilhotas pancreáticas de camundongos tratados com dHL (painel b)
e os controles Ctr (painel a). Nota-se que a exposição por 8 meses à dHL induz
redistribuição de N-caderina da região intercelular para o citoplasma das células β,
aumentando a área de células β dentro da ilhota exibindo uma marcação citoplasmática
difusa (seta em b); ambos os parâmetros qualitativos foram confirmados quantitativamente
(gráficos em c e d, respectivamente). Todas as imagens são representativas de pâncreas de 5
animais por grupo de 3 experimentos independentes. Barra de escala: 50 µm. O conteúdo
total de N-caderina foi determinado por Western Blot em homogeneizados de ilhotas
isoladas de camundongos de ambos os grupos experimentais (painel e). A mesma
membrana foi re-incubada com o anticorpo anti- β-actina, utilizado como controle interno
da reação (painel f). Ilhotas de camundongos dHL não mostram alterações significativas
nos níveis de N-caderina em comparação com ilhotas controle (g). As barras representam a
média ±SEM de 6 membranas, a partir de 6 experimentos independentes (n = 4
animais/grupo/experimento).
Capítulo 3
89
Cap
ítulo
3
89
Cap
ítulo
3
Capítulo 3
90
Figura 10. Aumento na imunomarcação para VE-caderina em ilhotas pancreáticas de
camundongos diabéticos após a exposição prolongada a dieta hiperlipídica (dHL).
Imagens a – d correspondem à imunofluorescência para VE-caderina, obtidas por microscopia
confocal (verde, a e c), e co-imunomarcadas para insulina (vermelho, b e d) de ilhotas
pancreáticas de camundongos tratados com dHL (painel c e d) e os controles Ctr (painel a e b).
A VE-caderina foi encontrada exclusivamente em células endoteliais. Nota-se que a exposição
por 8 meses à dHL induz um aumento da marcação da ilhota para VE-caderina (c) em relação
ao grupo controle (a), que foi confirmado quantitativamente (gráfico em e) e sugere aumento
da vascularização das ilhotas nos camundongos diabéticos. Todas as imagens são
representativas de pâncreas de 9 animais por grupo de 3 experimentos independentes. Barra de
escala: 50µm. O conteúdo total de VE-caderina foi determinado por Western Blot em
homogeneizados de ilhotas isoladas de camundongos de ambos os grupos experimentais
(painel f). A mesma membrana foi re-incubada com um anticorpo anti-β-actina, utilizado
como controle interno da reação (painel g). Ilhotas de camundongos dHL mostraram uma
tendência de aumento, embora não significativa, de VE-caderina, em comparação com os
níveis nas ilhotas dos controles (h). As barras representam a média ± SEM de 5 membranas a
partir de 5 experimentos independentes (n= 6 animais por grupo/experimento).
Capítulo 3
91
Cap
ítulo
3
91
92
Figura 11. A exposição prolongada à dieta hiperlipídica (dHL) induz diminuição do
teor juncional de α-catenina, mas nenhuma mudança significativa na marcação de
ZO-1 e β-catenina em células β de camundongos diabéticos.
Imagens a - n correspondem à imunofluorescência para as proteínas ZO-1 (verde, a e c), α
catenina (verde, f e h), β-catenina (verde, k e m) e a correspondente co-imunomarcação para
insulina (vermelho, b,g,l e d,i,n), analisadas por microscopia confocal, em ilhotas
pancreáticas de camundongos dHL (painéis d,i,n) e Ctr (painéis b,g,l). Nota-se que a
exposição por 8 meses à dHL induz uma diminuição da marcação para α-catenina na região
de contato intercelular das células β (h, i), em comparação com o grupo controle (f, g), e
este dado foi confirmado quantitativamente (gráficos em j). No entanto, não houve
diferença significativa em relação ao grau de imunomarcação da ZO-1 (b vs d e gráfico em
e) e da β-catenina (g vs i e gráfico em o) das ilhotas entre os grupos experimentais. Todas
as imagens são representativas de pâncreas de 6 animais por grupo de 5 experimentos
independentes. Barra de escala: 20µm.
Capítulo 3
93
Cap
ítulo
3
93
Cap
ítulo
3
94
Figura 12. Nenhuma alteração significativa no conteúdo celular de ZO-1, α- e β-
cateninas foi visto em homogeneizados de ilhotas dos camundongos diabéticos em
comparação com os controles.
O conteúdo total de ZO-1 (a), α-catenina (d) e β-catenina (g) foi determinado por Western Blot
em homogeneizados de ilhotas isoladas de camundongos de ambos os grupos experimentais.
A mesma membrana foi re-incubada com um anticorpo anti-β-actina, utilizado como controle
interno da reação (painéis b, e, h). Ilhotas de camundongos dHL não apresentaram diferenças
significativas quanto o conteúdo total de ZO-1 (c), α- catenina (f) e β-catenina (i) em
comparação com ilhotas dos controles. As barras representam a média ± SEM de 7 membranas
de pelo menos 7 experimentos independentes (n = 8 camundongos/grupo/experimento).
Capítulo 3
95
Cap
ítulo
3
95
Cap
ítulo
3
96
97
Figura 13. Efeito da exposição prolongada à dieta hiperlipídica (dHL) sobre a expressão
gênica de proteínas juncionais em estudo e insulina em ilhotas pancreáticas de
camundongos diabéticos em comparação com os controles.
A expressão gênica foi determinada por qPCR em homogeneizados de ilhotas de
camundongos diabéticos dHL e controles. Ilhotas de camundongos dHL mostraram um
aumento significativo na expressão dos genes cdh2 (N-caderina, *p<0,01), cdh5 (VE-caderina,
*p<0,04), tjp1 (ZO-1, *p<0,02) e ins2 (**p=0,0082) em comparação com ilhotas de
camundongos controle. Ilhotas de camundongos dHL mostraram uma tendência de aumento,
embora não significativo, na expressão do gene ins 1 em comparação com o grupo controle.
As barras representam a média ±SEM de 6 camundongos por experimento, de 3-4
experimentos independentes.
Capítulo
98
99
CAPÍTULO 4
4.1 Conclusões:
O tratamento dos animais C57BL/6 com dieta hiperlipídica (dHL) por tempo
prolongado (8 meses) induziu significativo ganho de peso corpóreo e resistência
periférica à insulina associada com elevada hiperglicemia de jejum e pós-prandial e
hiperinsulinemia moderada. Essas alterações, como um todo, são indicativas de
estabelecimento de DMT2.
Ainda, ilhotas pancreáticas isoladas de camundongos alimentados com dHL
mostraram uma deficiência significativa da secreção de insulina estimulada por
glicose associada a um aumento da expressão do gene da insulina (isoformas 1 e 2),
revelado por qPCR. Isto sugere um comprometimento do acoplamento estímulo-
secreção (ou seja, pós-traducional) nas células β dos animais diabéticos.
A histologia do pâncreas endócrino não revelou alterações marcantes na morfologia
e citoarquitetura das ilhotas entre os grupos de animais (controle e tratado com
dHL). Entretanto, os animais dHL apresentaram um aumento significativo da massa
relativa de células β, indicando expansão compensatória deste tipo celular, assim
como uma redução significativa no número de células α.
Numa segunda etapa do desenvolvimento dessa Tese, fomos investigar a
distribuição e conteúdo celular das proteínas juncionais, E-, N-, VE-caderinas, α e
β-cateninas e ZO-1 nas ilhotas pancreáticas, desse modelo animal de DMT2, com o
intuito de estabelecer uma possível associação entre essa doença e
alteração/comprometimento das junções intercelulares no pâncreas endócrino. Com
relação à distribuição celular das proteínas juncionais nas ilhotas, a N-caderina, E-
caderina, ZO-1 e cateninas estão distribuídas na região de contato intercelular das
células endócrinas pancreáticas, enquanto que a VE-caderina está limitada ao
endotélio (onde a presença da ZO-1 foi também observada).
Capítulo 4
100
Verificou-se, por imunoistoquímica, uma diminuição na marcação intercelular das
células β para N-caderina, E-caderina e α-catenina, sem modificação significativa
no conteúdo total dessas proteínas avaliado por Western Blot, nos camundongos
diabéticos submetidos à administração prolongada de dHL. A redistribuição celular
destas moléculas de adesão pode estar relacionada com a disfunção secretora e
aumento na proliferação da célula β verificado nos animais diabéticos.
Em adição, as ilhotas dos animais diabéticos mostraram um aumento significativo
na imunoreação e expressão gênica de VE-caderina bem como de ZO-1, sugerindo
aumento da vascularização o que está de acordo com a expansão da massa de
células β observadas nesses animais.
Os nossos resultados em conjunto mostram que a distribuição e expressão celular de
algumas proteínas juncionais se alteram durante o desenvolvimento da DMT2, em
camundongos, o que pode ter relevância na patogênese dessa doença metabólica.
Capítulo 4
101
4.2 Conclusão Esquemática
Figura 14. Conclusão Esquemática.
Este esquema mostra as principais conclusões desta Tese em face à literatura especializada.
Temos as células β pancreáticas e sua relação funcional com as células endoteliais dos
capilares das ilhotas pancreáticas no estado normal (não-diabético) e diabético. Tais células
estão unidas por junções do tipo oclusão, aderente e comunicante que mantém a estrutura e
a citoarquitetura da ilhota. No estado normal, quando a célula β é estimulada pela glicose,
há o desencadeamento de vários eventos intracelulares que incluem: 1) a entrada da glicose
no citoplasma, mediada pelo GLUT2; 2) a metabolização da glicose com aumento da
relação ATP/ADP dentro da célula, levando ao fechamento dos canais de potássio
dependentes ATP dependentes e consequente despolarização da membrana; 3) a abertura
dos canais de Ca+2 voltagem dependentes, levando à entrada de cálcio e aumento deste íon
no citoplasma; 4) reorganização do citoesqueleto resultando em exocitose dos grânulos de
insulina. Os canais intercelulares das junções comunicantes permitem a passagem de íons
Ca+2 entre células vizinhas, diminuindo a heterogeneidade funcional conhecida da
Capítulo 4
102
população de células β. No estado diabético (de hiperglicemia crônica), demonstramos que
a célula β secreta menos insulina quando estimulada, embora a expressão gênica das
isoformas de insulina tenha se mostrado aumentada, indicando que a disfunção secretora
não reside na biossíntese mais provavelmente na tradução de sinal e secreção deste
hormônio pela célula β.
Quanto às proteínas juncionais, observamos uma diminuição do conteúdo juncional da N- e
E-caderinas e α-catenina nas células β, sugerindo um comprometimento do processo de
adesão intercelular. Dados de literatura mostram que diminuição na expressão de E-
caderina, através do emprego de oligonucleotídeos anti-sense ou anticorpos, resulta em
inibição da secreção de insulina estimulada por glicose em linhagem de células β,
provavelmente via inibição da comunicação intercelular mediada por Junções
Comunicantes (Rogers et.al., 1997; Calabrese et al., 2004; Carvel et al., 2007; Roger et al.,
2007)). Portanto, a diminuição do conteúdo juncional das referidas moléculas de adesão nas
células β pode ter uma relação direta/indireta com a disfunção secretora de insulina
reportada nos animais diabéticos.
Ainda, é sabido que as proteínas juncionais funcionam como moléculas sinalizadoras,
migrando inclusive para o núcleo e induzindo expressão gênica de proteínas relacionadas à
proliferação, diferenciação, dentre outras funções celulares (Wakae-Tacada et al., 2013).
Podemos hipotetizar que essas proteínas a E-cad, N-cad e α-catenina, ao serem
internalizadas nas células β dos animais diabéticos, poderiam ter a mesma função e,
portanto, estarem envolvidas no processo de proliferação dessas células endócrinas,
resultando em expansão da sua massa nas ilhotas nos animais diabéticos. Dados da
literatura (Carvell et al., 2007) mostram que uma diminuição da expressão de E-cad, com
oligonucleotídeos anti-sense, está relacionada com alta capacidade de proliferação de
linhagem de célula β.
Quanto à célula endotelial, observamos aumento do conteúdo proteico e da expressão
gênica da VE-caderina, indicando aumento da vascularização das ilhotas dos animais
diabéticos. Essa hipervascularização das ilhotas pode estar relacionada à manutenção da
massa expandida de células β reportada nesses animais.
Dados de literatura mostram que a glicose induz a célula β, bem como a célula endotelial a
expressarem diversos fatores de crescimento (Zanone et al..2008) Os fatores de origem
endotelial podem estar envolvidos no estímulo da proliferação da célula β. O VEGF (fator
de crescimento vascular endotelial), que é conhecido por ser liberado pela célula β no
ambiente em alta concentração de glicose, por sua vez poderia contribuir ou estar envolvido
na hipervascularização da ilhota no estado diabético.
Ainda, sabe-se que a exposição crônica à glicose leva a célula endotelial a liberar Óxido
Nítrico (NO), o qual tem um efeito negativo sobre a secreção de insulina (Henningsson et
al.2002; Zanone el al, 2008). Portanto, é possível sugerir que a hipervascularização da
ilhota, num ambiente de hiperglicemia, poderia também contribuir para o
comprometimento da função secretora da célula β no animal diabético.
Capítulo 4
103
CAPÍTULO 5
5.1 Referências Bibliográficas
Aberle H; Schwartz H; Kemler R. (1996) Cadherin-catenin complex: protein interactions
and their implications for cadherin function. J Cell Biochem 61(4): 514-23. 1996.
Acharjee S.; Ghosh B.; Al-Dhubiab B. E.; Nair A. B. (2013) Understanding type 1 diabetes:
etiology and models. Can J Diabetes 37, 269–276.
Agudo J.; Ayuso E.; Jimenez V.; Casellas A.; Mallol C.; Salavert, A.; Bosch, F. (2012).
Vascular endothelial growth factor-mediated islet hypervascularization and inflammation
contribute to progressive reduction of β-cell mass. Diabetes 61(11), 2851–61.
Ahrén B.; Simonsson E.; Scheurink A. J.; Mulder H.; Myrsén U.; Sundler F. (1997).
Dissociated insulinotropic sensitivity to glucose and carbachol in high-fat diet-induced
insulin resistance in C57BL/6J mice. Metabolism 46(1): 97-106.
Ahrén B; Pacini, G. (2002). Insufficient islet compensation to insulin resistance vs. reduced
glucose effectiveness in glucose-intolerant mice. Am J Physiol Endocrinol Metab 283: E738-
E744.
Ahrens T.; Lambert M.; Pertz O.; Sasaki T.; Schulthess T.; Mège R.-M; Timpl R.; Engel J.
(2003). Homoassociation of VE-cadherin follows a mechanism common to “classical”
cadherins, J. Mol. Biol 325(4):733-742.
American Diabetes Association. (2013). Diagnosis and classification of diabetes mellitus.
Diabetes Care 36 Suppl 1, S67-13.
Anderson, J.M. (2001) Molecular structure of tight junctions and their role in epithelial
transport. News Physiol. Sci. 16, 126-130.
Andralojc K. M.; Mercalli A.; Nowak K. W.; Albarello L.; Calcagno R.; Luzi L.; Bonifacio
E.; Doglioni C.; Piemonti L. (2009). Ghrelin-producing epsilon cells in the developing and
adult human pancreas. Diabetologia 52, 486-93.
Andreollo A. N.; Santos E. F. d.; Araújo M. R.; Lopes L. R. (2012) Rat’s age versus
human’s age: what is the relationship? Arq Bras Cir Dig 25(1):49-5.
Ashcroft F M; Rorsman P. (2012) Diabetes Mellitus and the β Cell: The Last Ten Years.
Cell. 148, 1160-1171.
Benmerah A.; Scott M.; Poupon V.; Marullo S. (2003). Nuclear functions for plasma
membrane associated proteins? Traffic 4, 503-511.
Capítulo 5
104
Bernard-Kargar, C.; Ktorza A. (2001). Endocrine pancreas plasticity under physiological
and pathological conditions. Diabetes 50 (Suppl 1):S30-5.
Bjorntorp P. Abdominal obesity and the development of noninsulin-dependent diabetes
mellitus. Diabetes Metab Rev 4 (6):615-22. 1988.
Bonfleur M. L.; Vanzela E. C.; Ribeiro R. A.; Dorighello. G. G; Carvalho C. P. F.;
Collares-Buzato C. B.; Carneiro E. M.; Boschero A. C.; Oliveira H. C. (2010). Primary
hypercholesterolaemia impairs glucose homeostasis and insulin secretion in low-density
lipoprotein receptor knockout mice independently of high-fat diet and obesity. Biochim
Biophys Acta 1801: 183-190,
Bosco D.; Meda P. (1997) Reconstructing islet function in vitro. In Soria (Ed.), Physiology
and Pathophysiology of the Islets of Langerhans 285-298.
Bosco D.; Rouiller D. G.; Halban P. A. (2007). Differential expression of E cadherin at the
surface of rat beta-cells as a marker of functional heterogeneity. The Journal of
Endocrinology 194(1), 21–9.
Bosco D.; Armanet M.; Morel P.; Niclauss N.; Sgroi A.; Muller Y. D.; Giovannoni L.;
Parnaud G.; Berney T. (2010). Unique Arrangement of α- and β-Cells in Human Islets of
Langerhans. Diabetes 59, 1202-10.
Breier G.; Breviario F.; Caveda L.; Berthier R.; Schnurch H.; Gotsch U.; Vestweber D.;
Risau W.; Dejana E. (1996). Molecular cloning and expression of murine vascular
endothelial-cadherin in early stage development of cardiovascular system. Blood 87:630–
641.
Brissova M.; Fowler M. J.; Nicholson W. E.; Chu A.; Hirshberg B.; Harlan D. M.; Powers
A. C. (2005). Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser
scanning confocal microscopy. J Histochem Cytochem 53(9), 1087–97.
Buchwald H.; Estok R.; Fahrbach K.; Banel D.; Jensen M. D.; Pories W. J.; Bantle J. P.;
Sledge I. (2009). Weigh and type 2 diabetes after bariatric surgery: systematic review and
meta-analyses. Am. J Med. 122(3):248-56.
Butler A. E.; Janson J.; Bonner-Weir S.; Ritzel R.; Rizza R. A.;. Butler P. C. (2003). Beta-
cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes. Diabetes
52(1):102-10.
Byers S.; Pelletier R.M. (1992) Sertoli-sertoli cell tight junctions and the blood-testis
barrier. In M. Cereijido (Ed.), Tight Junctions, pp. 279-304.
Cabrera O.; Berman D. M.; Kenyon N. S.; Ricordi C.; Berggren P.O.; Caicedo A. (2006).
The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell
function. Proc Natl Acad Sci USA 103(7), 2334–9.
Capítulo 5
105
Calabrese A.; Caton D.; Meda P. (2004) Differentiating the effects of Cx36 and E-cadherin
for proper insulin secretion of MIN6 cells. Exp. Cell Res. 294, 379-391.
Calabrese A.; Zhang M.; Serre-Beinier V.; Caton D.; Mas C.; Satin L.S.; Meda, P. (2003)
Connexin 36 controls synchronization of Ca2+ oscillations and insulin secretion in MIN6
cells. Diabetes 52, 417-424.
Calligaris S.D.; Lecanda M.; Solis F.; Ezquer M.; Gutiérrez J. Brandan E.; Leiva A.;
Sobrevia L.; Conget P. (2013) Mice Long-term high-fat diet feeding recapitulates human
cardiovascular alterations: an animal model to study the early phases of diabetic
cardiomyopathy. PLoS ONE 8(4): e60931.
Campos de Carvalho A. C.; Tanowitz H. B.; Wittner M.; Dermietzel R.; Roy C.; Hertzberg
E. L.; Spray D. C. (1992) Gap junction distribution is altered between cardiac myocytes
infected with Trypanosoma cruzi. Circ. Res. 70, 733-742.
Carvalho CP; Barbosa HC; Britan A; Santos-Silva JC; Boschero AC; Meda P; Collares-
Buzato CB. (2010). Beta cell coupling and connexin expression change during the
functional maturation of rat pancreatic islets. Diabetologia, 53(7):1428-37.
Carvalho C. P. F. (2009) Papel da comunicação intercelular mediada pelas junções
comunicantes no mecanismo de secreção de insulina em modelos in vivo de maturação e
disfunção do pâncreas endócrino. 119p. Tese de Doutorado. Universidade Estadual de
Campinas.
Carvalho C. P.; Martins. J. C.; Da Cunha D. A.; Boschero A. C.; Collares-Buzato C. B.
(2006). Histomorphology and ultrastructure of pancreatic islet tissue during in vivo
maturation of rat pancreas. Ann. Anat 188, 221-234.
Carvalho C. P.; Oliveira R. B.; Britan A.; Santos-Silva J. C.; Boschero A. C.; Meda P.;
Collares-Buzato C. B. (2012). Impaired β-cell-β-cell coupling mediated by Cx36 gap
junctions in prediabetic mice. Am J Physiol Endocrinol Metab 303, 144-5.
Carvell M. J.; P. J. Marsh; Persaud S. J.; Jones P. M. (2007) E-cadherin interactions
regulate beta-cell proliferation in islet-like structures. Cell Physiol Biochem 20(5):617-26.
Chang-Chen K. J.; Mullur R.; Bernal-Mizrachi. (2008). E. Beta-cell failure as a
complication of diabetes. Rev Endocr Metab Disord. 9(4):329-43.
Charpantier E; Cancela J.; Meda P. (2007) Beta cells preferentially exchange cationic
molecules via connexin 36 gap junction channels. Diabetologia 50, 2332-2341.
Cirulli V.; Baetens D.; Rutishauser U.; Halban P. A.; Orci L.; Rouiller D. G. (1994)
Expression of neural cell adhesion molecule (N-CAM) in rat islets and its role in islet cell
type segregation. J Cell Sci, 107 ( Pt 6): 1429-36.
Capítulo 5
106
Citi S.; Sabanay H.; Jakes R.; Geiger B.; Kendrick-Jones J. (1988) Cingulin, a new
peripheral component of tight junctions. Nature 333, 272-276.
Collares-Buzato C. B.; Leite A.; Boschero A. C. (2001) Modulation of gap and adherens
junctional proteins in cultured pancreatic islets. Pancreas 23, 177-185.
Collares-Buzato C. B. (2013). Junções Celulares. In: A Célula. Eds: Carvalho, H.F. &
Recco-Pimentel, S.M. Editora Manole, Barueri, pp. 141-165.
Collares-Buzato C. B.; Carvalho C. P. F.; Furtado A. G. & Boschero A. C (2004)
Upregulation of the expression of tight and adherens junction-associated proteins during
maturation of neonatal pancreatic islets in vitro. J Mol Histol. 35, 811-22.
Collares-Buzato C. B.; McEwan G. T. A.; Jepson M. A.; Simmons N. L.; Hirst B. H.
(1994) Paracellular barrier and junctional protein distribution depend on basolateral
extracellular Ca2+ in cultured epithelia. Biochim. Biophys. Acta 1222, 147-158.
Collombat P.; Xu X.; Ravassard P.; Sosa-Pineda B., Dussaud S.; Billestrup N;. Mansouri,
A. (2009) The ectopic expression of Pax4 in the mouse pancreas converts progenitor cells
into alpha and subsequently beta cells. Cell, 138(3), 449–62.
Conacci-Sorrell M.; Zhurinsky J.; Ben-Ze’ev A. (2002) The cadherin-catenin adhesion
system in signaling and cancer. J. Clin. Invest. 109, 987-991.
Conget I.; Fernandez Real. J. M.; Costa A.; Casamitjana R.; Ricart W. (2001) Insulin
secretion and insulin sensitivity in relation to glucose tolerance in a group of subjects at a
high risk for type 2 diabetes mellitus. Med Clin (Barc) 116, 491-92.
Corada M.; Mariotti M.; Thurston G.; Smith K.; Kunkel R.; Brockhaus M.; Lampugnani M.
G.; Martin-Padura I.; Stoppacciaro A.; Ruco A.; McDonald D. M.; Ward P. A.; Dejana E.
(1999) Vascular endothelial-cadherin is an important determinant of microvascular
integrity in vivo. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 96: 9815–9820.1999.
Dai C.; Brissov, M.; Reinert R. B.; Nyman L.; Liu E. H.; Thompson C., Powers; A. C.
(2013) Pancreatic islet vasculature adapts to insulin resistance through dilation and not
angiogenesis. Diabetes, 62(12), 4144–53.
De Souza C. T.; Araújo E. P.; Prada P. O.; Saad M. J. A.; Boschero A. C.; Velloso L. A.
(2005) Short-term inhibition of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma
coactivator-1alpha expression reverses diet-induced diabetes mellitus and hepatic steatosis
in mice. Diabetologia 48(9): 1860–1871.
Dejana E.; Spagnuolo R.; Bazzoni G.(2001) Interendothelial junctions and their role in the
control of angiogenesis, vascular permeability and leukocyte transmigration. Thromb.
Haemost. 86: 308–315. 2001.
Capítulo 5
107
Del Prato S. (2009) Role of glucotoxicity and lipotoxicity in the pathophysiology of Type 2
diabetes mellitus and emerging treatment strategies. Diabet Med 26, 1185-92.
Diamond J. M. (1977) Twenty-first Bowditch lecture. The epithelial junction: bridge, gate,
and fence. Physiologist 20(1):10-8.
Ding Y. L.; Wang Y. H.; Huang W.; Liu G.; Ross C.; Hayden M. R; Yang J. K. (2010)
Glucose intolerance and decreased early insulin response in mice with severe
hypertriglyceridemia. Exp Biol Med (Maywood) 235, 40-6.
Drolet M-C; Roussel E.; Deshaies Y.; Couet J.; Arsenault M. (2006) A high fat/high
carbohydrate diet induces aortic valve disease in C57BL/6J mice. J Am Coll Cardiol 47(4):
850–855.
Duvillié B.; Currie C.; Chrones T.; Bucchini D. Jami ; J. R. L. Joshi; D. J. Hill (2002).
Increased islet cell proliferation, decreased apoptosis, and greater vascularization leading to
beta-cell hyperplasia in mutant mice lacking insulin. Endocrinology, 143: 1530-7.
Eaton S. & Simons K. (1995) Apical, basal and lateral cues for epithelial polarization. Cell,
82, 5-8.
Ebnet K (2008) Organization of multiprotein complexes at cell-cell junction. Histochem
Cell Biol, 130, 1-20.
Ekblad E.; Sundler F. (2002) Distribution of pancreatic polypeptide and peptide YY.
Peptides, 23, 251-61.
Eldar-Finkelman H.; Schreyer S. A.; Shinohara M. M.; LeBoeuf R. C.; Krebs E. G. (1999)
Increased glycogen synthase kinase-3 activity in diabetes- and obesity-prone C57BL/6J
mice. Diabetes 48, 1662-6.
Esni F.; Täljedal I.B.; Perl A.K.; Cremer H.; Christofori G.; Semb H. (1999) Neural cell
adhesion molecule (N-CAM) is required for cell type segregation and normal ultrastructure
in pancreatic islets. J. Cell Biol. 144(2): 325 337.
Evans C. W.; Taylor J. E.; Walker J. D.; Simmons N. L. (1983) Transepithelial chemotaxis
of rat peritoneal exudate cells. Br. J. Exp. Pathol. 64, 644-654.
Farquhar M.G.; Palade. G.E. (1963) Junctional complexes in various epithelia. J. Cell Biol.
17, 375-412.
Ferrannini E. (1998) Insulin resistance versus insulin deficiency in non-insulin-dependent
diabetes mellitus: Problems and prospects. Endocr. Ver. v. 19, n. 4, p. 477-90.
Figeac F. B. U.; Faro M.; Chelali N.; Portha B.; Movassat, J. (2009) Neonatal growth and
regeneration of β-cells are regulated by the Wnt/β-catenin signaling in normal and diabetic
rats. Am J Physiol Endocrinol Metab 298, 245-56.
Capítulo 5
108
Furuse M.; Fujita K.; Hiiragi T.; Fujimoto K.; Tsukita S. (1998) Claudin-1 and –2: novel
integral membrane proteins localizing at tight junctions with no sequence similarity to
occludin. J. Cell Biol. 141, 1539-1550.
Furuse M.; Hirase T.; Itoh M.; Nagafuchi A.; Yonemura S.; Tsukita, S. (1993) Occludin: a
novel integral membrane protein localizing at tight junctions. J. Cell Biol. 123, 1777-1788.
Geiger B.; Ayalon O. (1992) Cadherins. Annu. Rev. Cell Biol. 8, 307-332.
Ghaisas M.; Navghare V.; Takawale A.; Zope V.; Tanwar M.; Deshpande, A. (2009) Effect
of Tectona grandis Linn. on dexamethasone-induced insulin resistance in mice. J
Ethnopharmacol 122, 304-7.
Gomez Dumm C. L.; M. C. Semino; Gagliardino J. J. (1990) Sequential morphological
changes in pancreatic islets of spontaneously diabetic rats. Pancreas, 5(5): 533-9. 1990.
Guilherme A; Virbasiu JV; Puri V; Czech MP. (2008). Adipocyte dysfunctions linking
obesity to insulin resistance and type 2. Diabetes, 9, 367-377.
Guillemot L.; Paschoud S.; Pulimeno P.; Foglia A.; Citi S. (2008) The cytoplasmic plaque
of tight junctions: a scaffolding and signalling center. Biochim Biophys Acta 1778, 601-
613.
Gumbiner B.M. (1987) Structure, biochemistry, and assembly of epithelial tight junctions.
Am. J.Physiol. 253, C749-C758
Gumbiner B. M.; Lowenkopf, T.; Apatira D. (1991) Identification of a 160-kDa
polypeptide that binds to the tight junction protein ZO-1. Proc Natl Acad Sci U S A, 88
(8):3460-4.
Gumbiner B. M. (1996). Cell adhesion: the molecular basis of tissue architecture and
morphogenesis. Cell. 9, 84(3):345-57.
Guo L. X.; Liu J. H.; Yin F. (2014). Regulation of insulin secretion by geniposide: possible
involvement of phosphatidylinositol 3-phosphate kinase. Eur Rev Med Pharmacol Sci,
18(9), 1287–94.
Halban P. A.; Wollhei C. B.; Blondel B.; Meda P.; Niesor E. N.; Mintz D. H. (1982). The
possible importance of contact between pancreatic islet cells for the control of insulin
release. Endocrinology, 111(1): 86-94.
Harris T.J.; Tepass U. (2010). Adherens junctions: from molecules to morphogenesis. Nat.
Rev. Mol. Cell Biol. 11(7): 502-514.
Hauge-Evans A. C.; Squires P. E.; Persaud S. J.; Jones P. M. (1999). Pancreatic beta-cell-
to-beta-cell interactions are required for integrated responses to nutrient stimuli: enhanced
Ca2+ and insulin secretory responses of MIN6 pseudoislets. Diabetes 48(7):1402-8. 1999.
Capítulo 5
109
Henningsson R; Salehi A; Lundquist I. (2002). Role of nitric oxide synthase isoforms in
glucose-stimulated insulin release. Am J Physiol Cell Physiol 283: 296-04.
Herrera P.L. (2009) Transgenic and other experimental models of pancreas and islet
damage. Diabetes Obes Metab, 11(4):81-6.
Hollingdal M.; Juhl C. B.; Pincus S. M.; Sturis J.; Veldhuis J. D.; Polonsky K. S.; Pørksen
N.; Schmitz O. (2000). Failure of physiological plasma glucose excursions to entrain high-
frequency pulsatile insulin secretion in type 2 diabetes. Diabetes 49, 1334-40.
Hong E. G.; Noh H. L.; Lee S. K.; Chung Y. S.; Lee K. W.; Kim, H. M. (2002). Insulin and
glucagon secretions, and morphological change of pancreatic islets in OLETF rats, a model
of type 2 diabetes mellitus. J Korean Med Sci 17, 34-40.
In’t Veld P.A.; Pipeleers D.G.; Gepts, W. (1984) Evidence against the presence of tight
junctions in normal endocrine pancreas. Diabetes 33, 101-104
Inuwa I. M.; El Mardi A. S. (2005). Correlation between volume fraction and volume-
weighted mean volume, and between total number and total mass of islets in post-weaning
and young Wistar rats. J Anat. 206: 185-192.
Jain R.; Lammert, E. (2009). Cell–cell interactions in the endocrine pancreas. Diabetes
Obes. Metab. 11(Suppl. 4): 159– 167.
Janssen S. W.; Hermus A. R.; Lange W. P.; Knijnenburg Q.; Van Der Laak J. A.; Sweep C.
G.; Martens G. J.; Verhofstad A. A. (2003) Progressive histopathological changes in the
pancreatic islets during aging of Zucker Diabetic Fatty rats. Exp. Clin. Endocrinol.
Diabetes 109, 273-282.
Jepson M. A.; Schlech H. B.; Collares-Buzato, C. B (2000) Localization of dysfunctional
tight junctions in Salmonella enterica serovar typhimurium-infected epithelial layers. Infect.
Immun. 68, 7202-7208.
Jepson M. A.; Collares-Buzato C. B.; Clark M. A.; Hirst B. H.; Simmons, N. L. (1995)
Rapid disruption of epithelial barrier function by Salmonella typhimurium is associated
with structural modification of intercellular junctions. Infect. Immun. 63, 356-359.
Jin T. (2008) The WNT signallig pathway and diabetes mellitus. Diabetologia 51, 1771-80.
Johansson J. K.; Voss U.; Kesavan G.; Kostetskii I.; Wierup N.; Radice G. L.; Semb, H.
(2010) N-cadherin is dispensable for pancreas development but required for beta-cell
granule turnover. Genesis 48(6): 374–81.
Jonas J-C.; Sharma A.; Hasenkamp W.; Ilkova H.; Patane G.; Laybutt, R.; Weir G. C.
(1999) Chronic hyperglycemia triggers loss of pancreatic cell differentiation in an animal
model of diabetes. Journal of Biological Chemistry 274(20), 14112–14121.
Capítulo 5
110
Jonietz E. (2012). Cause and effect: Decades of study into the causes of diabetes have
produced no definitive answers. Nature 485, 10-11.
Jung R. T. (1997) Obesity as a disease. Br Med Bull 53(2): 307-321.
Kahn S. E.; Hull R. L.; Utzschneider K. M. (2006). Mechanisms linking obesity to insulin
resistance and type 2 diabetes. Nature 14, 840-6.
Kailey B.; Bunt M. V.; Cheley S.; Johnson P. R.; MacDonald P. E.; Gloyn A. L.; Rorsman
P.; Braun M. (2012) SSTR2 is the functionally dominant somatostatin receptor in human
pancreatic β- and α-cells. Am J Physiol Endocrinol Metab 303:E1107–16.
Kanno T.; Gopel S. O.; Rorsman P.; Wakui, M. (2002). Cellular function in multicellular
system for hormone-secretion: electrophysiological aspect of studies on alpha-beta- and
delta-cells of the pancreatic islet. Neurosci Res 42, 79-90.
Kim A.; Miller. K.; Jo Junghyo; Kilimnik G; Wojcik P; Hara M. (2009) Islet architecture:
A comparative study. Islets 1(2):129-136.
Kim, J. Y.; Lim D. M.; Moon C. I.; Jo K. J.; Lee S. K.; Baik H. W.; Lee K. H.; Lee, K. W.,
Park, K. Y., Kim, B, J. (2010). Exendin-4 protects oxidative stress-induced β-Cell
apoptosis through reduced JNK and GSK3β Activity. J Korean Med Sci 25, 1626-32.
Knudsen K. A.; Soler A. P.; Johnson K. R.; Wheelock W.J. (1995) Interaction of α-actinin
with the cadherin/catenin cell-cell adhesion complex via α-catenin. J. Cell Biol. 130, 67-77.
Lackey D. E.; Burk D. H.; Ali M. R.; Mostaedi R.; Smith W. H.; Park J.; Scherer P. E.;
Seay S. A.; McCoin C. S.; Bonaldo P.; Adams S. H. (2013). Contributions of adipose tissue
architectural and tensile properties toward defining healthy and unhealthy obesity. Am J
Physiol Endocrinol Metab (Vol. no. DOI: 10.1152/ajpendo. 00476)
Lai-Cheong J.E; Arita K.; McGrath J.A. (2007) Genetic diseases of junctions. J Invest
Dermatol 127, 2713-2725.
Le Gurun S.; Martin D.; Formenton A.; Maechle P.; Caille D.; Waeber G.; Meda, P.;
Haefliger,J.A. (2003) Connexin 36 contributes to control function of insulin-producing
cells. J. Biol. Chem.278, 37690-7.
Leite A. R.; Carvalho C. P.; Furtado A. G.; Barbosa H. C.; Boschero A. C.; Collares-
Buzato C. B. (2005). Co-expression and regulation of connexins 36 and 43 in cultured
neonatal rat pancreatic islets. Can J Physiol Pharmacol 83, 142-51.
Lewis J. E.; J. K. Wahl III, Sass K. M.; Jensen P. J., Johnson K. R.; Keith R.; Margaret J.
Wheelock M. J.. (1997). Cross-talk between adherens junctions and desmosomes depends
on plakoglobin. J Cell Biol 136(4): 919-34.
Capítulo 5
111
Li J.; Wang J.; Jiao H; Liao J; Xu X. (2010). Cytokinesis and cancer: Polo loves ROCK’n’
Rho(A). J. Genet. Genomics 37, 159-172
Liew C. G.; Andrews P. W. (2008). Stem cell therapy to treat Diabetes Mellitus. The
Review of Diabetic Studies 5, 203-19.
Lilla V.; G. Webb.; Rickenbach K.; Maturana A.; Steiner D. F.; Halban P. A.; Jean-Claude
Irminger Differential gene expression in well-regulated and dysregulated pancreatic beta-
cell (MIN6) sublines. Endocrinology 144(4): 1368-79. 2003
Livak K. J.; Schmittgen T. D. (2001). Analysis of relative gene expression data using real-
time quantitative PCR and the 2 (-Delta Delta C (T) Method. Methods 25(4), 402–8.
Liu Z.; & Habener J. F. (2009). Alpha cells beget beta cells. Cell, 138(3), 424–6.
Liu Y.; Tanabe K.; Baronnier D.; Patel S.; Woodgett J.; Cras-Méneur C.; Permutt M. A.
(2010) Conditional ablation of GSL-3β in islet beta cells results in expanded mass an
resistance to fat feeding induced diabetes in mine. Diabetologia 53, 2600-10.
Luebke-Wheeler J. L.; Nedredal G.; Yee L.; Amiot B. P; Nyberg S. L. (2009) E-cadherin
protects primary hepatocyte spheroids from cell death by a caspase-independent
mechanism. Cell Transplant 18(12):1281-7.
Luther M. J.; Davies E.; Muller D.; Harrison M.; Bone A. J.; Persaud S. J.; Jones P. M.
(2005) Cell-to-cell contact influences proliferative marker expression and apoptosis in
MIN6 cells grown in islet-like structures. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 288(3):
E502–E509.
Madara J L. (1990) Maintenance of the macromolecular barrier at cell extrusion sites in
intestinal epithelium: physiological rearrangement of tight junctions. J Membr
Biol. 116(2):177-84.
Madara J.L. (1998) Regulation of the movement of solutes across tight junctions. Annu.
Rev. Physiol. 60,143-159.
Maschio D. A. (2014) Possível ativação da via de sinalização Wnt/β-catenina no processo
de hiperplasia compensatória da célula beta pancreática em modelo animal de resistência
periférica à insulina. 83p. Dissertação de mestrado. Universidade Estadual de Campinas.
Mathias R.T.; White T.W.; Gong X. (2010) Lens gap junctions in growth, differentiation,
and homeostasis. Physiol Res 90,179-206.
Mathur M.; Goodwin L.; Cowin P. (1994) Interactions of the cytoplasmic domain of the
desmosomal cadherin Dsg1 with plakoglobin. J. Biol. Chem. 269, 14075-14080.
Matter K.; Balda M. S. (2003) Signalling to and from tight junctions. Nat. Rev. Mol. Cell
Biol. 4, 225-236.
Capítulo 5
112
Meda P. (2013) Protein-Mediated Interactions of Pancreatic Islet Cells. Scientifica. 13, 22.
Meda P.; Chanson M.; Pepper M.; Giordano E.; Bosco D.; Traub O.; Willecke K.; Aoumari
A.E.; Gros D.; Beyer E.C.; Orci L.; Spray, D.C. (1991) In vivo modulation of connexin 43
gene expression. and junctional coupling of pancreatic B-cells. Exp. Cell Res. 192, 469-
480.
Meda, P.; Perrelet A.; Orci L. (1979) Increase of gap junctions between pancreatic B-cells
during stimulation of insulin secretion. J. Cell Biol. 82, 441-448.
Mese G.; Richard G.; White T.W. (2007) Gap junctions: basic structure and functions. J
InvestDermatol 127, 2516-2524.
Miravet S.; Piedra J.; Castaño J.; Raurell I.; Francí C.; Duñach M.; Herreros A. G. (2003)
Tyrosine phosphorylation of plakoglobin causes contrary effects on its association with
desmosomes and adherens junction components and modulates β-catenin-mediated
transcription Mol Cell Biol, 23(20):7391-402.
Mitic L.L.; Van Itallie C.M.; Anderson J.M. (2000) Molecular physiology and
pathophysiology of tight junctions. I. Tight junction structure and function: lessons from
mutant animals and proteins. Am. J.Physiol. 279, G250-G254.
Moller C. J.; Christgau S.; Williamson M. R.; Madsen O. D.; Niu Z. P.; Bock
E, Baekkeskov S. (1992). Differential expression of neural cell adhesion molecule and
cadherins in pancreatic islets, glucagonomas, and insulinomas. Mol Endocrinol 6(8):1332-
42.
Morin P.J. (1999) Beta-catenin signaling and cancer. Bioessays. 21, 1021-1030.
Murtaugh L. C. (2008). The what, where, when and how of Wnt/beta-catenin signaling in
pancreas development. Organogenesis 4, 81-6.
Musil L.S. (1994) Structure and assembly of gap junctions. In S. Citi (Ed.), Molecular
mechanisms of epithelial cell junctions: from development to disease, Molecular Biology
Intelligence Unit, pp. 173-194.Texas, U.S.A.: CRC Press.
Nelson D. L.; Cox M. M. (2011) In: Lehninger: principles of biochemistry-5.ed. New
York: WHF and Company.
Ngamjariyawat A.; Turpaev K.; Vasylovska S.; Kozlova E. N.; Welsh N. (2013). Co-
culture of neural crest stem cells (NCSC) and insulin producing beta-TC6 cells results in
cadherin junctions and protection against cytokine-induced beta-cell death. PloS One, 8(4),
e61828.
Nittala A.; Ghosh S.; Wang X. (2007) Investigating the role of islet cytoarchitecture in its
oscillation using a new b-cell cluster model. PLoS ONE 2(10): e983.
Capítulo 5
113
Nlend R.N.; Michon L.; Bavamian S.; Boucard N.; Caille D.; Cancela J.; Charollais A.;
Charpantier E.; Klee P.; Peyrou M.; Populaire C.; Zulianello L.; Meda P. (2006)
Connexin36 and pancreatic beta cell functions. Arch Physiol Biochem 112, 74-81.
Oliveira R. B. D.; Carvalho C. P. D. F.; Polo C. C.; Dorighello G. D. G.; Boschero A. C.;
Oliveira H. C. F. D.; Collares-Buzato, C. B. (2014) Impaired compensatory beta-cell
function and growth in response to high-fat diet in LDL receptor knockout mice. Int J Exp
Pathol. doi: 10.1111/iep.12084.
Oliveira R.B. (2011). Proliferação e disfunção da célula beta pancreática em modelo animal
de diabetes melito 2: envolvimento da via de sinalização Wnt/beta-catenina. 84p.
Dissertação de Mestrado. Universidade Estadual de Campinas.
Orci L.; Amherdt M.; Henquin J. C.; Lambert A. E.; Unger R. H.; Renold A. E. (1973)
Pronase effect on pancreatic beta cell secretion and morphology. Science 11,
180(4086):647-9.
Orci L. (1984). Patterns of cellular and subcellular organization in the endocrine pancreas.
The Sir Henry Dale lecture for 1983. J Endocrinol 102(1):3-11.
Orci L. (1976). The microanatomy of the islets of Langerhans. Metabolism 25, 1303-13.
Orci L.; Malisse-Lagae F.; Amherdt, M. (1975). Cell contacts in human islets of
Langerhans. J. Clin. Endocrinol. Metab 41, 841-4.
Parnaud G.; Gonelle-Gispert C.; Morel P.; Giovannoni L.; Muller Y. D.; Meier R.; Borot
S.; Berney T.; Bosco D. (2011). Cadherin Engagement protects human β-cells from
apoptosis. Endocrinology 152(12):4601-9.
Paul D.L. (1995) New functions for gap junctions. Curr. Opin. Cell Biol. 7, 665-672.
Peixoto E. B.; Collares-Buzato C. B. (2006) Modulation of the epithelial barrier by
dexamethasone and prolactin in cultured Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells. Cell
Biol Int 30(2):101-13.
Perez-Moreno M.; Jamora C.; Fuchs E. (2003). Sticky business: orchestrating cellular
signals at adherens junctions. Cell, 112(4):535-48.
Peyot M. L; Pepin E.; Lamontagne J.; Latour M. G.; Zarrouki B.; Lussier R.; Pineda M.;
Jetton T. L.; Madiraju M. S. R; Joly E.; Prentki M. (2010) β-cell failure in diet-induced
obese mice stratified according to body weight gain: secretory dysfunction and altered islet
lipid metabolism without steatosis or reduced β-cell mass. Diabetes, 59, 2178–2187.
Capítulo 5
114
Pipeleers D.; in’t Veld P. I.; Maes E.; Van De W. M. (1982) Glucose-induced insulin
release depends on functional cooperation between islet cells. Proc Natl Acad Sci USA
79(23):7322-7325.
Pipeleers D.; Kiekens R.; Ling Z.; Wilikens A.; Schuit F. (1994) Physiologic relevance of
heterogeneity in the pancreatic β-cell population. Diabetologia 37, S57-S64.
Pories W. J.; Mehaffey J. H.; Staton K. M. (2011) The surgical treatment of type two
diabetes mellitus. Surg Clin NA 91, 821–836.
Prentki M.; Nolan C. J. (2006). Islet beta cell failure in type 2 diabetes. J Clin Invest 116,
1802-12.
Ressot C.; Bruzzone R. (2000) Connexin channels in Schwann cells and the development
of the Xlinked form of Charcot-Marie-Tooth disease. Brain Res. Rev. 32, 192-202.
Rhodes C. J. (2005). Type 2 diabetes-a matter of beta-cell life and death? Science 307, 380-
4.
Rieck S.; White P.; Schug J.; Fox A. J.; Smirnova O.; Gao N.; Kaestner K. H. (2009) The
transcriptional response of the islet to pregnancy in mice. Mol Endocrinol 23(10):1702–12.
Rogers G.J.; Hodgkin M. N.; Squires P. E. (2007) E-cadherin and cell adhesion: a role in
architecture and function in pancreatic islet. Cell Physiol Biochem. 20(6):987–994.
Ronchi J. A.; Figueira T. R.; Ravagnani F. G.; Oliveira H. C. F.; Vercesi A. E.; Castilho R.
F. (2013) A spontaneous mutation in the nicotinamide nucleotide transhydrogenase gene of
C57BL/6J mice results in mitochondrial redox abnormalities. Free Radic Biol Med 63,
446–456.
Rozental R.; Giaume C.; Spray D.C. (2000) Gap junctions in the nervous system. Brain
Res. Rev. 32, 4-15.
Rubbin L. L.; Staddon, J. M. (1999) The cell biology of the blood-brain barrier. Annu. Rev.
Neurosci. 22, 11-28.
Sacks D. B.; Arnold M.; Bakris G. L.; Bruns D. E.; Horvath A. R.; Kirkman M. S.;
Lernmark A, Metzger B. E.; Nathan D. M. (2011). Guidelines and recommendations for
laboratory analysis in the diagnosis and management of diabetes mellitus. Clin. Chem.
57(6):e1-e47.
Saini V. (2010) Molecular mechanisms of insulin resistance in type 2 diabetes mellitus
World J Diabetes 1(3):68-75.
Santos-Silva J. C.; Carvalho C. P.; de Oliveira R. B.; Boschero A. C.; Collares-Buzato C.
B. (2012). Cell-to-cell contact dependence and junctional protein content are correlated
with in vivo maturation of pancreatic beta cells. Can J Physiol Pharmacol 90, 837-50.
Capítulo 5
115
Schneeberger E. E.; Lynch R. D. (1992). Structure, function, and regulation of cellular tight
junctions. Am J Physiol Lung 262(6):L647-661.
Semino M. C.; Gagliardino E. E. P.; Gagliardino J. J. (1987) Islet cells-tight junction:
changes in its number induced by glucose. Acta Physiol. Pharmacol. Latinoam. 37, 533-
539.
Serre-Beinier V.; Bosco D.; Zulianello L. Charollais A.; Caille D.; Charpantier E.; Gauthier
B. R.; Diaferia G. R.; Giepmans B. N.; Lupi R.; Marchetti P.; Deng S.; Buhler L.; Berney
T.; Cirulli V.; Meda P. (2009) Cx36 makes channels coupling human pancreatic beta cells
and correlates with insulin expression. Hum Mol Genet 18, 428-439.
Serre-Beinier V.; Le Gurun S.; Belluardo N.; Trovato-Salinaro A.; Charollais A.; Haefliger
J.A.; Condorelli D.F.; Meda P. (2000) Cx36 preferentially connects B-cells within
pancreatic islets. Diabetes 49, 727-734
Shafrir E.; Ziv E.; Mosthaf L. (1999) Nutritionally induced insulin resistance and receptor
defect leading to beta-cell failure in animal models. Ann. N. Y. Acad. Sci. 892, 223-46.
Shimizu H.; Masunaga T.; Ishiko A.; Kikuchi A.; Hashimoto T.; Nishikawa T. (1995)
Pemphigus vulgaris and pemphigus foliaceus sera show an inversely graded binding pattern
to extracellular regions of desmosomes in different layers of human epidermis. J. Invest.
Dermatol. 105, 153-159.
Shirakawa J.; Amo K.; Ohminami H.; Orime K.; Togashi Y.; Ito Y.; Terauchi Y. (2011).
Protective effects of dipeptidyl peptidase-4 (DPP-4) inhibitor against increased β cell
apoptosis induced by dietary sucrose and linoleic acid in mice with diabetes. J Biol Chem
286(29): 25467–76.
Shoelson S. E.; Lee J.; Goldfine A. B. (2006) Inflammation and insulin resistance. J Clin
Invest 116, 1793-801.
Sone H.; Kagawa Y. (2005). Pancreatic beta cell senescence contributes to the pathogenesis
of type 2 diabetes in high-fat diet-induced diabetic mice. Diabetologia 48, 58-67.
Sorenson R. L.; Brelje O. D.; Hegre T. C.; Marshall S.; Anaya P.; Sheridan, J. D. (1987)
Prolactin invitro decreases the glucose stimulation threshold, enhances insulin secretion,
and increases dye couplingamong islet β cells. Endocrinology 121, 1447-1453.
Steinberg, M. S.; McNutt P. M. (1999) Cadherins and their connections: adhesion junctions
have stimulation of insulin secretion. J. Cell Biol. 82, 441-448.
Strowski M. Z.; Parmar R. M.; Blake A. D.; Schaeffer J. M. (2000) Somatostatin inhibits
insulin and glucagon secretion via two receptors subtypes: an in vitro study of pancreatic
islets from somatostatin receptor 2 knockout mice. Endocrinology 141, 111–117.
Capítulo 5
116
Suckale J.; Solimena M. (2008). Pancreas islets in metabolic signaling--focus on the beta-
cell. Front Biosci 13, 7156-7171.
Surwit R. S.; Kuhn C. M.; Cochrane C.; McCubbin J. A.; Feinglos M. N. (1988) Diet-
induced type II diabetes in C57BL/6J mice. Diabetes 37, 1163–1167.
Tahara A.; Matsuyama-Yokono A.; Shibasaki M. (2011). Effects of antidiabetic drugs in
high-fat diet and streptozotocin-nicotinamide-induced type 2 diabetic mice. Eur J
Pharmacol 655, 108-16.
Tripathy D.; Chavez A. O. (2010). Defects in insulin secretion and action in the
pathogenesis of type 2 diabetes mellitus. Curr Diab Rep 10, 184-91.
Vozzi C.; Ullrich S.; Charollais A.; Philippe J.; Orci L.; Meda, P. (1995) Adequate
connexin mediated coupling is required for proper insulin production. J. Cell Biol. 131,
1561-1572.
Wakae-Takada N; Xuan S.; Watanabe K.; Meda P.; Leib R. L. (2013). Molecular basis for
the regulation of islet beta cell mass in mice: the role of E-cadherin. Diabetologia, 56, 856–
866.
Waschke J. (2008) The desmosome and pemphigus. Histochem Cell Biol 130, 21-54.
Winzell M. S.; B. Ahrén. (2004).The high-fat diet-fed mouse: a model for studying
mechanisms and treatment of impaired glucose tolerance and type 2 diabetes. Diabetes 53,
S215-219.
Wong H. Y.; Ahrén B.; Lips C. J.; Höppener J. W.; Sundler F. (2003). Postnatally disturbed
pancreatic islet cell distribution in human islet amyloid polypeptide transgenic mice. Regul
Pept 113, 89-94.
Yamagata K.; Nammo T.; Moriwaki M.; Ihara A.; Iizuka K.; Yang Q.; Satoh T.; Li
M.; Uenaka R.; Okita K.; Iwahashi H.; Zhu Q.; Cao Y.; Imagawa A.; Tochino Y.; Hanafusa
T.; Miyagawa J.; Matsuzawa Y. (2002). Overexpression of dominant-negative mutant
hepatocyte nuclear fctor-1α in pancreatic β-cells causes abnormal islet architecture with
decreased expression of E-cadherin, reduced β-cell proliferation, and diabetes. Diabetes
51(1):114-23.
Yamasaki H.; Krutovskikh V.; Mesnil M.; Tanaka T.; Zaidan-Dagli M.L.; Omori Y. (1999)
Role of connexin (gap junction) genes in cell growth control and carcinogenesis. C. R.
Acad. Sci. III 322, 151- 159.
Yin, T.; K. J. Green. (2004).Regulation of desmosome assembly and adhesion. Semin Cell
Dev Biol, 15(6):665-77.
Zanone M. M.; Favaro E.; Camussi G. (2008). From endothelial to beta cells: insights into
pancreatic islet microendothelium. Current Diabetes Reviews, 4(1), 1–9
Capítulo 5
117
Zhang Y.; Zhang Y.; Bone R. N.; Cui W.; Peng J-B.; Siegal G. P.; Wu H. (2012).
Regeneration of pancreatic non-β endocrine cells in adult mice following a single diabetes-
inducing dose of streptozotocin. PloS One, 7(5), e36675.
Zhong Y.; Saitoh T.; Minase T.; Sawada N.; Enomoto K. & Mori, M. (1993) Monoclonal
antibody 7H6 reacts with a novel tight junction-associated protein distinct from ZO-1,
cingulin and ZO-2. J. Cell Biol. 120, 477-483.
Capítulo 5
118
119
ANEXO
Capítulo 5