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DESENVOLVIMENTO E ESTUDO DE ARCABOUÇOS A BASE DE

OVOALBUMINA PARA ENGENHARIA DE TECIDOS.

J.T.Colque¹;J.J.Bonvent¹ ¹Centro de Ciências Naturais e Humanas (CCNH) - Universidade Federal do ABC

[email protected]

RESUMO

A ovoalbumina (OVA) é um biopolímero e glicoproteína encontrado em clara

de ovos de galinha sendo 10% dos seus aminoácidos sequenciados como albumina

de soro humano. No presente trabalho, foram investigadas as propriedades físico-

químicas de arcabouços a base de OVA e a cinética de liberação de um

antibacteriano (cloridrato de tetraciclina - CT). Os arcabouços foram obtidos por

gelificação em presença de glutaraldeído (GA), seguida por lixiviação com NaCl; a

incorporação do antibacteriano foi feita por imersão do arcabouço numa solução de

CT. Microscopia eletrônica de varredura (MEV), espectroscopia de infravermelho

(FTIR), termogravimetria (TGA), absorção de fosfato-salino (PBS) e liberação da CT

foram feitas para analisar as propriedades morfológicas, químicas, térmicas, de

absorção e o processo de liberação da CT. Os resultados mostraram que estruturas

tridimensionais com poros interconectados foram produzidas; ocorre um aumento da

estabilidade química dos arcabouços pelo processo de reticulação com GA;

evidencia-se também um alto poder de absorção PBS após reticulação por GA,

evitando uma deterioração precoce do arcabouço. Concluiu-se que os arcabouços

obtidos a base de OVA tem propriedades físico-químicas e potencial bactericida

para aplicação em engenharia de tecidos.

Palavras-Chave: Ovoalbumina, biopolímero, arcabouço, engenharia de tecido.

INTRODUÇÃO

As incidências de patologias e lesões envolvendo tecidos humanos estão

aumentando por vários motivos tais como queimaduras [1] e osteoporose [2].

Segundo pesquisadores da Universidade de São Paulo (USP), estimasse que 58,8%

da população brasileira utiliza o Sistema Único de Saúde (SUS) [3]. Considerando a

9º Congresso Latino-Americano de Orgãos Artificiais e Biomateriais13º Congresso da Sociedade Latino Americana de Biomateriais, Orgãos Artificiais e Engenharia de Tecidos - SLABO

24 a 27 de Agosto de 2016, Foz do Iguaçu, PR

798

questão socioeconômica brasileira e a alta demanda do uso do SUS, existe uma

necessidade de desenvolver novos biomateriais para a engenharia de tecidos que

sejam economicamente viáveis para a população. Biopolímeros são bons candidatos

para a produção de arcabouços para a engenharia de tecido [4].

A albumina consiste em um grupo de proteínas globulares, sendo solúveis em

água e encontrados principalmente no plasma sanguíneo humano [5]. É possível

encontra albumina também em ovos, no caso chamado de Ovoalbumina (OVA), que

é extraída do albúmen (clara) de ovo. A OVA é uma fosfoglicoproteína de massa

molecular de 45 kDa, que tem 386 resíduos de aminoácidos, sendo metade é

hidrofóbica e um terço é carregado negativamente; além disso, 10% dos

aminoácidos da OVA são iguais da albumina do ser humano. Este biopolímero forma

uma estrutura secundária, com 3 β-folhas e nove α-hélice, que pode ser alterada

pela temperatura e pelo pH. [6].

A produção de arcabouço de OVA, ou seja uma estrutura tridimensional, é

necessário realizar a reticulação pela adição, por exemplo, de glutaraldeído(GA).

Este agente reticulante pode altera as interações celulares e a resposta celular de

osteoblastos pelo arcabouço. Entretanto, estudos feitos sobre a reticulação de

outros biopolímeros como o alginato e a queratina utilizando o GA não evidenciaram

citotoxicidade dos arcabouços produzidos [7,8].

Determinadas estruturas poliméricas tridimensionais possuem a capacidade de

liberação controlada de substancias, tal como como o cloridrato de tetraciclina (CT),

quando incorporadas no seu interior. O cloridrato de tetraciclina (CT) é conhecido

pelo seu efeito bactericida e já foi investigado em vários arcabouços poliméricos [9].

MATERIAIS E MÉTODOS

Materiais

Para a preparação dos arcabouços foram utilizados os seguintes materiais:

albumina de ovo branco de galinha, grau II (Sigma Aldrich); solução tampão fosfato-

salino (PBS) 1 M (Sigma Aldrich); cloreto de sódio 99,5% (Sigma Aldrich); solução

de glutaradeído, grau II, 25% em água (v/v) (Cromaline); glicina de fonte não animal

(Sigma Aldrich); Cloridrato de tetraciclina (Sigma Aldrich).



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Preparação dos arcabouços

Foi dissolvido 1,0 g de ovoalbumina (OVA) em 8 ml de água deionizada, por

meio de um agitador magnético, durante 3 dias a temperatura ambiente. Uma vez

homogeneizada, a solução de OVA foi estocada em um refrigerador para uso

posterior. Para as amostras com cloridrato de tetraciclina (CT), o processo foi

mesmo, porém com adição de 5 mg/mL e 2,5 mg/mL de CT na água deionizada,

obtendo-se 3 grupos diferentes de amostra.

Para a fabricação das estruturas tridimensionais (arcabouços), foram

realizados dois grupos de amostras, sendo ambas de soluções de OVA tratadas

com glutaraldeído (GA) e NaCl sólido (~100 µm). Vale ressaltar que o NaCl foi

empregado como agente porogênico, para realização do processo de lixiviação. No

grupo sem CT, foi realizada a mistura de 2 ml de solução OVA, com três diferentes

concentrações de GA, ou seja, 3%, 6% e 9% e 0,8 g de NaCl a cada 2 mL de

solução polimérica. Na solução com CT, foi realizado o mesmo processo, porém

com apenas 3% e 6% de GA. Todas as amostras foram depositadas em uma placa

de 24 poços por um dia para a reticulação do biopolímero OVA.

Após o processo de reticulação, os dois grupos de amostras (sem e com CT)

foram submersas em 200 ml de glicina (0,1M) a fim de provocar a saída do excesso

de glutaraldeido e, em seguida, foram lixiviadas por imersão em água milliQ por 2

dias, trocando duas vezes por dia a água, para a retirada total do sal. Em seguida,

as amostras foram submetidas ao processo de gelificação a -25°C durante um dia e

posterior remoção do líquido por vácuo (pressão manométrica de -250 mmHg) por

um dia. Ao final do processo, as amostras CT foram mergulhadas em soluções com

igual concentração inicial de CT (5 mg/mL e 2,5mg/m) afim de compensar a perda

de CT nos processos anteriores.

Para a manutenção de suas características, as amostras foram guardadas a

vácuo dentro de um refrigerador. Na realização dos ensaios de caracterização, as

amostras foram secadas a temperatura ambiente para não haver influência da água

presente no arcabouço e para o MEV, foi realizado a secagem a ponto crítico. No

teste de TGA foi somente utilizado as amostras sem CT em todas as 3

concentrações de GA, nos demais testes foram utilizadas apenas os de

concentração 3% e 6% de GA.



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CARACTERIZAÇÃO DOS ARCABOUÇOS

Análise morfológica por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

Para analisar a morfologia dos arcabouços fabricados a partir da OVA, foi

utilizada a técnica de Microscopia eletrônica de varredura (MEV), no equipamento da

marca Jeol, modelo JCM-6000, na UFABC. As amostras foram submetidas a um

processo de metalização com ouro, a fim de evitar a sua deterioração pela

exposição ao feixe eletrônico.

Análise da estrutura química dos arcabouços

A espectroscopia de infravermelho é uma técnica espectroscópica para

identificar ou investigar a composição química de uma amostra. Os espectros foram

obtidos utilizando a técnica de espectrofotometria infravermelho por transformada de

Fourier (FTIR) em modo de reflexão total atenuada (ATR), em que as bandas de

vibração são identificadas com seus respectivos grupos químicos.

Análise Termogravimétrica (TGA)

A Análise Termogravimétrica ou TGA (ThermogravimetricAnalysis) é uma

técnica utilizada para medição da perda de massa de determinado material em

relação ao tempo e aumento de temperatura, em condições controladas. O

equipamento utilizado foi Q500 da TA Instruments (da Central experimental

multiusuário da UFABC).

Absorção de PBS, degradação da massa e variação de pH em temperatura

biológica

Os testes de absorção de PBS foram realizados com a retirada de determinada

massa de cada amostra de OVA e secagem à temperatura ambiente. Após a

secagem, as amostras foram imersas em uma solução de PBS e sua massa foi

medida depois de 24 horas e levadas a estufa a 37°C. A porcentagem de água

absorvida (S1) é determinada pela eq. A.



801

(A)

Com m0 e mf as massas antes e depois da secagem na estufa,

respectivamente.

Para determinar a degradação do biomaterial, o mesmo método foi empregado,

porém as amostras foram levadas à estufa a 80°C por 1 hora. A porcentagem de

degradação (G) foi determinada pela eq.B

(B)

O efeito da degradação dos arcabouços sobre o pH foi analisado, monitorando

a variação do pH nas soluções de PBS contendo as amostras, após 24 horas de

imersão.

Liberação do cloridato de tetraciclina

Para a analisar a liberação de droga dos arcabouços com CT, as amostras

foram imersas em uma solução de 10 mL de PBS à 37°C e foram retiradas alíquotas

de 2 mL nos intervalos 0,25, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 e 24 horas. No mesmo instante

da retirada das alíquotas, foram repostos 2 mL de solução PBS. A determinação da

concentração de CT liberada foi feita mediante medidas de absorbância. Os

espectros uv-visível foram obtidos num espectrofotômetro da marca Varian, modelo

Cary 50. A relação entre a absorbância e a concentração foi previamente

determinada mediante uma curva de calibração, com concentrações conhecidas de

CT, entre 0.1 ug/mL e 50 µg/mL.



802

RESULTADOS

Análise morfológica

As imagens dos arcabouços obtidas por MEV são mostradas na Figura 4. Com

a secagem supercrítica, foi possível analisar a estrutura do arcabouço sem a

presença de água sendo possível encontrar poros diversificados nas estruturas. Os

poros encontrados têm diâmetros entre 50 e 400 µm. Porém, podemos destacar a

influência da CT nas amostras, uma vez que existem poros mais regulares nos

arcabouços sem CT. A adição do GA também afeta a estrutura do arcabouço, uma

vez que o aumento da concentração de GA provoca a formação de uma estrutura

com poros maiores e irregulares.

Figura 1. Imagens de MEV de arcabouços OVA. (a) 6% GA (b) 3% GA (c) 6% GA +

2,5mg/mL CT (d) 6% GA + 5mg/mL CT (e) 3% GA + 5mg/mL CT (f) 3% GA +

2,5mg/mL CT

(a) (b)

(c) (d)

(e) (f)



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Análise da estrutura química dos arcabouços

A Figura 2 apresenta os espectros FTIR dos diferentes arcabouços, com e sem

CT. A banda de absorção entre 3200 e 3600 cm-1 é associada aos grupos funcionais

OH e NH, e seu estiramento, que tende a aumentar com a concentração de GA. Os

grupos aminas I, II e III podem ser analisadas a partir da intensidade dos picos em

1633, 1533 e 1309 cm-1, respectivamente [18]. Pode-se notar que houve um

aumento da amplitude apenas nas aminas do tipo I e II, com o aumento de GA. As

bandas associadas a tetraciclina podem ser observadas em 1045, 1075 e 1120 cm-1,

conforme esperado da literatura [10].

Figura 2. Espectros FTIR das amostras de OVA com e sem HCT. (e) 3% GA (b) 6%

GA (c) 6% GA + 5mg/mL CT (d) 6% GA + 2,5mg/mL CT (e) 3% GA + 2,5mg/mL CT

(f) 3% GA + 5mg/mL CT.

Análise Termogravimétrica (TGA)

A análise das curvas de TGA (Figura 3) indicam que os arcabouços produzidos

a partir da OVA pura apresentam uma maior resistência no intervalo de 150°C e

250°C. As variações de GA nas amostras com OVA e OVA pura não mostraram

diferenças significativas, principalmente para as concentrações de 6% e 9% de GA.



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Figura 3 . Curva de TGA das amostras de OVA sem CT. (a) OVA pura; (b) e (e)

OVA 3% GA; (c) OVA 6% GA; (d) OVA 9% GA.

Absorção de PBS e variação de pH em temperatura biológica

Os dados obtidos a partir dos testes de absorção de PBS dos diferentes

arcabouços produzidos com OVA, GA e CT são apresentados na Tabela 1.

Tabela 1. Valores de variação de massa e pH dos diferentes arcabouços

% Massa ganha pH Var. de pH

Arcabouço 3% GA 220,62 ± 10,49 7,39 - 0,15

Arcabouço 3% GA com 2,5mg/mL CT 260,82 ± 3,12 7,50 -0,04

Arcabouço 3% GA com 5mg/mL CT 304,12 ± 15,88 7,36 -0,18

Arcabouço 6% GA 237,12 ± 16,04 7,30 -0,24

Arcabouço 6% GA com 2,5mg/mL CT 223,51 ± 5,55 7,25 -0,29

Arcabouço 6% GA com 5mg/mL 265,30 ± 33,18 7,24 -0,30

É possível notar que todos os arcabouços têm um alto poder de absorção de

PBS. Vale destacar que o aumento de GA é acompanhado de um aumento de

absorção de PBS pelos arcabouços. Este comportamento se deve ao fato que uma



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maior reticulação das amostras induz uma menor perda de material no meio,

aumentando assim a capacidade de absorção de PBS. Considerando o pH humano

aproximadamente 7,4 e que a faixa ideal é entre 7,1 e 7,5, a variação do pH

observada nas amostras está de acordo com esta faixa de tolerância de pH, com

exceção da amostra de 6% GA com 5 mg/mL de CT, que apresenta uma variação

de pH limítrofe. A presença de CT afeta também a absorção de PBS pelo

arcabouço, sendo que um aumento da sua concentração é acompanhado por uma

absorção maior, em decorrência do aumento da porosidade.

Liberação do clorado de tetraciclina

As curvas de liberação da tetraciclina dos diferentes arcabouços são mostradas

na Figura 4. Pode-se observar que a cinética de liberação do CT depende

fortemente das condições de produção do arcabouço. Nota-se, como esperado, que

a incorporação mais elevada de CT no arcabouço gerou uma maior liberação da

droga. Destaca-se a influência do GA no processo de liberação da tetraciclina. O

aumento da reticulação tendo a dificultar a liberação da droga.

Figura 4. Curva de Liberação de CT para os arcabouços obtidos com (a) 3% GA + 5

mg/mL CT; (b) 3% GA + 2.5 mg/mL CT; (c) 6% GA + 5 mg/mL CT; (d) 6% GA + 2,5

mg/mL CT.



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Discussão e conclusão

Os experimentos e análises feitas até o momento mostram que a concentração

do agente reticulante, o GA, utilizada nos arcabouços, influência fortemente as

propriedades morfológicas e estruturais dos arcabouços de OVA, como evidenciado

pelas caracterizações feitas por FTIR, MEV, TGA, Absorção (PBS), degradação da

massa e variação de pH em temperatura biológica. A incorporação de tetraciclina

provoca um aumento notável da porosidade do arcabouço. A adição de GA altera a

estrutura química do arcabouço, evidenciado pelo aumento da intensidade de

determinadas bandas, associadas ao processo de reticulação do OVA. Para

aplicação com maior resistência à temperatura, arcabouços obtidos com GA mas

sem lixiviação parecem mais indicados. Também vale ressaltar que a variação de

pH pela degradação do arcabouço em PBS é consistente com a faixa de tolerância

biológica. A absorção de PBS pelos arcabouços decorre do aumento do processo de

reticulação pelo GA, que reduz a exposição das regiões hidrofílicas da OVA. A

liberação de tetraciclina mostrou-se satisfatória e condizente com o esperado, uma

vez que quanto menor a concentração de GA empregada, maior é a sua

degradação, contribuindo para uma maior e mais rápida liberação do CT. Tendo em

vista a possibilidade de controlar as propriedades morfológicas e a cinética de

liberação de uma droga incorporada no arcabouço por adição de GA e pelo

processo de lixiviação, estudos de viabilidade, adesão e crescimento celular devem

ser feito para comprovar o potencial de uso de arcabouço a base de OVA para

aplicações na engenharia de tecido.

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ABSTRACT

The ovalbumin (OVA) is a biopolymer and glycoprotein from chicken eggs with 10%

amino acid sequenced as human serum albumin. This work investigated physical-

chemical properties of scaffolds of OVA and the release kinetics of a drug

antibacterial (Hydrochloride Tetracycline -TCH). The scaffolds were obtained by

gelation in glutaraldehyde(GA) before of salt-leaching technique with NaCl; the

incorporation of antibacterial was by immersion of OVA scaffolds in a TCH solution.

Scanning Electron Microscopy (SEM), Infrared Spectroscopy (FTIR),

thermogravimetry (TGA), phosphate salt absorption (PBS) and TCH release were

made to analyze morphological properties, chemical, thermal, absorption and TCH

liberation process. The results showed a dimensional structures with interconnected

pores; chemical stability of scaffolds in crosslinking process with GA; It is evident a

high PBS absorption power by reticulation with GA, avoiding a premature

deterioration of the scaffold. It were concluded que scaffolds obtained from OVA has

physical-chemical properties and bactericide with potential application to Tissue

Engineering.

Keywords: ovalbumin, biopolymer, scaffold, tissue engineering.

RESÚMEN

La Ovoalbúmina (OVA) es un biopolímero y glicoproteína encontrado en huevos de

gallina, siendo el 10% de sus aminoácidos secuenciado como albúmina de suero

humano. En el presente trabajo, fueron investigadas las propiedades físico-químicas

de los scaffolds a base de OVA y la liberación cinética de un antibacteriano

(Tetraciclina Clorhidrato -TCH). Los scaffolds de OVA se obtuvieron por gelificación

en presencia de glutaraldehído (GA), seguido por la lixiviación con NaCl; la

incorporación del antibacteriano se ha hecho por la inmersión del material a una

solución de TCH. Microscopía Electrónica de Barrido (SEM), espectroscopia

infrarroja (FTIR), termogravimetría (TGA), la absorción de sal de fosfato (PBS) y la

liberacion del TCH se realizaron para analizar propiedades morfológica, química,

térmica, absorción y liberación del TCH. Los resultados mostraron que las

estructuras tridimensionales fueron producidos con poros interconectados;

estabilidad química de los scaffolds en el proceso de crosslink por GA; También

claramente se observó la alta absorción de PBS luego después de la reticulación en

GA que evito la deterioración prematura del scaffold. Se concluyó que los scaffolds

obtenidos a partir de una base de OVA tienen propiedades físico-químicas y

bactericida con potencial aplicación para ingeniería de tejidos.

Palabras clave: ovoalbúmina, biopolímero, scaffold, Ingeniería de Tejidos.



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