desenvolvimento de uma nova metodologia de extração para...

Universidade de São Paulo – Escola de Engenharia de Lorena

Desenvolvimento de uma nova metodologia de extração para análise do teor de

Pilocarpina das folhas do Jaborandi (Pilocarpus microphyllus) utilizando fatoriais

fracionados

Jonas Oliveira de Mello

Lorena – São Paulo

Novembro de 2011

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Jonas Oliveira de Mello

Desenvolvimento de uma nova metodologia de extração para análise do teor de

Pilocarpina das folhas do Jaborandi (Pilocarpus microphyllus) utilizando fatoriais

fracionados

Orientador: Prof. Dr. Messias Borges Silva

Lorena – São Paulo

Novembro de 2011

Trabalho de Conclusão de Curso de

Engenharia Química ministrada pela

Escola de Engenharia de Lorena –

Universidade de São Paulo, como

parte dos requisitos para a graduação

em Engenharia Química.

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DEDICATÓRIA

Primeiramente a Deus, pois sem ele nada existiria.

Aos meus pais que me apoiaram desde o início de minha vida em todas as etapas.

A minha família por sempre estar ao meu lado.

Aos meus amigos que nestes anos conviveram comigo bons e maus momentos, me

apoiaram e me deram muitas sugestões.

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AGRADECIMENTOS

A Deus por todas as bênçãos que recebi e desafios que me ajudou a superar

Ao Professor Messias Borges da Silva por ter acreditado na minha idéia e pela orientação.

Ao Professor Antonio Aarão Serra e a Professora Jayne Carlos de Souza Barbosa que de

maneira indireta me ajudaram muito no desenvolvimento deste projeto.

À empresa Sourcetech Química e todos os seus funcionários por todo suporte que foi

dado a esta pesquisa e a oportunidade de estar aplicando meus conhecimentos.

A todos os meus amigos que cansaram de ouvir sobre o tema deste projeto e todos os

momentos que passamos juntos.

A todos de forma direta ou indireta ajudaram a concluir meu trabalho de graduação.

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EPÍGRAFE

“Não basta ter belos sonhos para realizá-los. Pois ninguém realiza grandes obras se não

for capaz de sonhar grande. Podemos mudar o nosso destino se nos dedicarmos à luta

pela realização de nossos ideais. É preciso sonhar, mas com a condição de crer em nosso

sonho, de examinar com atenção a vida real, de confrontar nossa observação com nosso

sonho, de realizar escrupulosamente nossa fantasia. Sonhos: acredite neles.”

LENIN

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RESUMO

Jaborandi é o nome comumente dado a diversas árvores pertencentes à família

Rutaceae, do gênero Pilocarpus, nativa do Brasil (Oliveira et al., 1991; Pinheiro, 2002). As

folhas dessas plantas são utilizadas pelos indígenas como medicamento natural que

auxilia na produção de secreções (Corrêa, 1984). Essa característica ocorre devido a um

alcalóide presente em suas folhas, a Pilocarpina (Scheerer, 2001). Contudo este alcalóide

não se encontra isolado, possuindo isômeros e estruturas semelhantes, sendo eles a

Epiisopiloturina, Isopilocarpina, Pilosina e Isopilosina (Merck, 1983). A Pilocarpina possui

alto valor agregado no mercado farmacêutico, sendo utilizada no combate ao Glaucoma

(Migdal, 2000; Webster et al., 1993), e no tratamento de Xerostomia, também conhecido

como boca seca (Davies et al., 2001 e Wynn, 1996). Os demais alcalóides presentes não

possuem utilidade comercial. O processo convencional de extração de Pilocarpina usa

como solventes Clorofórmio e Soluções alcalinas e ácidas, utilizando a técnica de

alternância de extremos de pH (Sternitzke et al., 1992). Esta técnica requer muito tempo,

em torno de 4 horas, e muita atenção do pesquisador, pois erros são facilmente

cometidos.

Esta pesquisa tem como objetivo o desenvolvimento de uma nova metodologia de

extração para análise do teor de Pilocarpina das folhas do Jaborandi utilizando o método

dos fatoriais fracionados com 4-1 fatores.

A extração utilizada nesta dissertação é uma extração ácida com agitação vigorosa

e constante. Em meio ácido, a Pilocarpina é extraída devido à boa solubilidade do sal de

Pilocarpina formado. Este patamar foi alcançado por um misturador do tipo Turrax, que é

responsável por rotações de até 15.000 RPM. As folhas serão colocadas em um frasco de

amostra, com o intuito de extrair os alcalóides presentes, separando-os dos óleos

estruturais, graxas e clorofila. Este método se contrapõe as extrações tradicionais o qual

consiste nas etapas de preparo da matéria-prima, seguida de extração e purificação dos

princípios ativos através da alternância de pH, se assemelhando ao processo industrial,

contudo em escala laboratorial.

Os fatores investigados foram à variação da velocidade de agitação em dois

patamares pré-estabelecidos, assim como o tempo desta agitação, novamente em dois

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patamares, um de curta duração e um de longa duração, dois volumes distintos de ácidos

na amostra, um com grande concentração de ácido para as amostras e outro com pouca

concentração de ácido e influência da temperatura ambiente e a mistura submetida a

uma temperatura controlada.

A variável resposta será o teor de Pilocarpina presente na folhas. O método de

análise continuará sendo o mesmo apresentada na literatura, utilizando cromatografia

líquida de alta eficiência (HPLC) para análise do extrato diluído (Avancini, 2003).

A redução do tempo de preparo das amostras foi de 50% em relação ao método

convencional. Contudo o método se mostrou eficiente para folhas com teor nominal de

até 0,9% de Pilocarpina, acima deste valor o método se mostrou ineficiente, não extraindo

toda a Pilocarpina presente nas folhas. O consumo de reagentes alcançou um patamar

muito melhor que vislumbrávamos, essa redução foi superior a 90% em relação ao

método convencional, além da eliminação de diversas etapas dispendiosas, simplificando

a análise, diminuindo os possíveis erros experimentais.

Palavras chaves: Jaborandi, Pilocarpina, extração, degradação

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ABSTRACT

Jaborandi is the name commonly given to several trees belonging to the family

Rutaceae, genus Pilocarpus, a native of Brazil (Oliveira et al. 1991; Pinheiro, 2002).The

leaves of these plants are used by Indians as a natural medicine that assists in the

production of secretions (Corrêa, 1984). This characteristic is due to an alkaloid present in

their leaves, Pilocarpine (Scheerer, 2001). However this alkaloid is not isolated, and

isomers possessing similar structures, and they Epiisopiloturine, Isopilocarpine, and

Pilosina Isopilosina (Merck, 1983). The Pilocarpine has high value in the pharmaceutical

market, being used to fight glaucoma (Migdal, 2000, Webster et al., 1993), and treatment

of Xerostomia, also known as dry mouth (Davies et al., 2001 and Wynn, 1996). The other

alkaloids do not have commercial utility. The conventional process of extraction of

Pilocarpine used as solvents chloroform and alkaline and acid solutions, using the

technique of alternating extremes of pH (Sternitzke et al., 1992). This technique requires a

long time, around 4 hours, and the researcher's attention, because mistakes are easily

made.

This research aims to develop a new extraction methodology for analyzing the

content of the leaves of Pilocarpine Jaborandi using the method of fractional factorial

designs with factors 4-1.

The extraction used in this dissertation is an acid extraction with vigorous stirring

and constant. In an acid medium, Pilocarpine is extracted due to good solubility of the salt

formed Pilocarpine. This threshold was reached by a Turrax mixer type, which is

responsible for rotations of up to 15,000 RPM. The leaves are placed in a sample bottle, in

order to extract the alkaloids present, separating them from the structural oils, greases

and chlorophyll. This method contrasts the traditional extraction which consists of the

steps of preparing the raw material, followed by extraction and purification of the active

ingredients by alternating pH, similar to the industrial process, yet at the laboratory scale.

The factors investigated were the variation of agitation speed on two pre-

established thresholds, as well as the time of this agitation, again in two levels, one short

and one long-term, two different volumes of acid in the sample, with a large acid

concentration for samples and other low acid concentration and the influence of ambient

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temperature and the mixture subjected to a controlled temperature.

The response variable is the amount of Pilocarpine present in the leaves. The

method of analysis remains the same presented in the literature, using high performance

liquid chromatography (HPLC) for analysis of the diluted extract (Avancini, 2003).

Reducing the time of preparation of the samples was 50% compared to the

conventional method. However the method has proved effective for sheets with nominal

content of up to 0.9% of Pilocarpine, above this value the method proved inefficient, not

drawing any Pilocarpine present in the leaves. The reagent consumption reached a level

much better than glimpsed; this reduction was greater than 90% over the conventional

method, in addition to eliminating several costly steps, simplifying the analysis, reducing

the possible experimental errors.

Keywords: Jaborandi, Pilocarpine, extraction, degradation

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LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 – Pilocarpus microphyllus pág. 18

Figura 2 – Estrutura molecular da Pilocarpina pág. 20

Figura 3 – Degradação da Pilocarpina pág. 21

Figura 4 – Estrutura dos alcalóides isômeros a Pilocarpina pág. 23

Figura 5 – Extração convencional de alcalóides do Jaborandi pág. 25

Figura 6 – Fluxogramas dos procedimentos de extração da Pilocarpina das

folhas de Jaborandi pág. 32

Figura 7 – Cromatograma da primeira extração convencional pág. 43

Figura 8 – Cromatograma da segunda extração convencional pág. 44

Figura 9 – Cromatograma da terceira extração convencional pág. 45

Figura 10 – Cromatograma da quarta extração convencional pág. 46

Figura 11 – Cromatograma da Primeira Extração, série 1 pág. 47



Figura 14 – Cromatograma da Segunda Extração, série 1 pág. 50



Figura 17 – Cromatograma da Terceira Extração, série 1 pág. 53



Figura 20 – Cromatograma da Quarta Extração, série 1 pág. 56



Figura 23 – Cromatograma da Quinta Extração, série 1 pág. 59



Figura 26 – Cromatograma da Sexta Extração, série 1 pág. 62



10

Figura 29 – Cromatograma da Sétima Extração, série 1 pág. 65



Figura 32 – Cromatograma da Oitava Extração, série 1 pág. 68



Figura 35 – Cromatograma da primeira extração da comprovação do método pág. 71

Figura 36 – Cromatograma da segunda extração da comprovação do método pág. 72

Figura 37 – Cromatograma da terceira extração da comprovação do método pág. 73

Figura 38 – Cromatograma da quarta extração da comprovação do método pág. 74

Figura 39 – Cromatograma da primeira extração da comprovação do método

modificado pág. 75

Figura 40 – Cromatograma da segunda extração da comprovação do método

modificado pág. 76

Figura 41 – Cromatograma da terceira extração da comprovação do método

modificado pág. 77

Figura 42 – Cromatograma da quarta extração da comprovação do método

modificado pág. 78


modificado, redução de massa de folhas pág. 79





Figura 46 – Cromatograma da quarta extração da comprovação do método modificado,

redução de massa de folhas pág. 82

11

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Patamares pág. 30

Tabela 2 – Matriz de Experimentos pág. 31

Tabela 3 – Porcentagem de Pilocarpina proveniente da extração

convencional pág. 33

Tabela 4 – Matriz de Experimentos pág. 33

Tabela 5 – Monitoramento da Primeira série de extrações pág. 34

Tabela 6 – Monitoramento da Segunda série de extrações pág. 34

Tabela 7 – Monitoramento da Terceira série de extrações pág. 34

Tabela 8 – Matriz de Experimentos com Variáveis Respostas pág. 35

Tabela 9 – Matriz de Efeitos pág. 35

Tabela 10 – Melhor ajuste do Método pág. 36

Tabela 11 – Porcentagem de Pilocarpina extraída para comprovação do

método pág. 36


método modificado pág. 37


método, redução de massa de folhas pág. 38

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SUMÁRIO

1. OBJETIVO GERAL ...................................................................................................... 14

1.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................................... 14

1.2. JUSTIFICATIVA ........................................................................................................... 14

2. INTRODUÇÃO............................................................................................................ 15

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ......................................................................................... 18

3.1. Jaborandi .................................................................................................................. 18

3.2. Pilocarpina ................................................................................................................ 19

3.3. Epiisopiloturina, Pilosina, Isopilosina e Epiisopilosina ........................................... 22

3.4. Extração Convencional ............................................................................................. 24

3.5. Extração Proposta .................................................................................................... 26

4. MATERIAIS ................................................................................................................ 28

4.1. Matéria Prima ........................................................................................................... 28

4.2. Padrões de Pilocarpina ............................................................................................. 28

4.3. Fase móvel ................................................................................................................ 28

4.4. Reagentes ................................................................................................................. 28

4.5. Solventes................................................................................................................... 28

4.6. Equipamento de extração e extração ...................................................................... 29

4.7. Equipamento de identificação e quantificação ....................................................... 29

5. MÉTODO ................................................................................................................... 30

5.1. Extração da Pilocarpina ............................................................................................ 30

5.2. Análise do teor de Pilocarpina via HPLC .................................................................. 31

5.3. Fluxogramas do Processo ......................................................................................... 31

6. RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................................... 33

7. CONCLUSÃO ......................................................................................................... 39

13

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................ 40

APÊNDICE A – CROMATOGRAMAS DAS EXTRAÇÕES CONVENCIONAIS ............................ 43

APÊNDICE B – CROMATOGRAMAS DO MÉTODO EXPLORATÓRIO ..................................... 47

APÊNDICE C – CROMATOGRAMAS DE COMPROVAÇÃO DO MÉTODO .............................. 71

APÊNDICE D – CROMATOGRAMAS DA COMPROVAÇÃO DO MÉTODO MODIFICADO ...... 75

14

1. OBJETIVO GERAL

Esta pesquisa tem como objetivo o desenvolvimento de uma nova metodologia de

extração para análise do teor de Pilocarpina das folhas do Jaborandi utilizando o método

dos fatoriais fracionados com 4-1 fatores.

1.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

- Redução do tempo de análise;

- Simplificação da análise;

- Redução dos gastos de reagentes.

1.2. JUSTIFICATIVA

A pesquisa no campo da Pilocarpina se mostra de grande interesse na indústria

farmacêutica, pois se trata de um produto de alto valor agregado no mercado mundial.

As extrações realizadas em laboratórios requerem muito tempo e muita atenção

dos operadores, além de consumirem elevados volumes de reagentes.

O trabalho tem por finalidade criar uma nova metodologia, sendo ela simplificada,

econômica e com menor tempo gasto.

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2. INTRODUÇÃO

As plantas desde a antiguidade são principalmente utilizadas como fonte de

alimentos, contudo alguns vegetais também apresentam características medicinais usados

para combater enfermidades desde o Alto Império Egípcio, passando pela Grécia, Roma e

até mesmo pelos indígenas americanos, como os Incas, Maias, Astecas e os Tupis-

Guaranis. Além de serem usados como cosméticos, perfumes e até como armas, na

fabricação de venenos (Agra et al., 1994). Plantas medicinais são aquelas que exercem

funções farmacológicas, quando administradas de forma correta, ao homem ou a animais.

Este fato ocorre devido à presença de princípios ativos, presentes na estrutura das

plantas, que são utilizadas como matéria prima para a indústria farmacêutica (Rizzini e

Mors, 1995).

Os princípios ativos se encontram em elementos estruturais das plantas na forma

de alcalóides, flavonóides, glicosídeos, mucilagens, óleos essenciais e taninos. Podendo

ser encontrados nas folhas, sementes, raízes e cascas (Bentley, 1965). O grupo químico o

qual os alcalóides pertencem apresentam um amplo emprego farmacológico, tornando

muito importante as proposições e novas metodologias que envolvam sua obtenção e

purificação. O Brasil apresenta cerca de 20% da biodiversidade do planeta, constituindo

um mercado economicamente atraente, pois possibilita a pesquisa de novos

medicamentos que podem ser a cura de diversas doenças como malária, câncer e AIDS.

Em 1999, os fitofármacos, medicamentos produzidos a partir de princípios ativos das

plantas, foram responsáveis por 30% do mercado de medicamentos. Neste mesmo ano, a

indústria farmacêutica brasileira movimentou 9 bilhões de dólares, ocupando o décimo

maior mercado do mundo. (Petrovick et al., 1999). Para o desenvolvimento de um

produto farmacêutico, cosmético ou alimentício a partir de produtos naturais são

necessários processos de extração, concentração e/ou purificação do princípio ativo.

Utilizando folhas como matéria prima, a dificuldade aumenta, pois a concentração do

principio ativo é baixa, sendo necessária grande demanda de material para produção

desejada. Os processos tradicionais de extração e purificação utilizam, em sua maioria,

solventes químicos e que por muitas vezes são os mesmos utilizados há muitas décadas,

consomem muito tempo produtivo, em alguns casos utilizam e/ou produzem substâncias

16

tóxicas e, em sua maioria, utilizam condições severas de processo, facilitando a

degradação do produto final, podendo oferecer riscos de acidentes operacionais e ao

meio ambiente. (Luque de Castro e Garcia-Ayuso, 1998.)

O conhecimento prévio do teor dos princípios ativos presentes nos vegetais é de

suma importância para indústria farmacêutica, pois se trata de um composto com grande

variabilidade externa, devido a umidade do solo, volume de pluviosidade, temperaturas e

a sazonalidade das estações do ano. Desta forma é possível calcular, com grande exatidão,

as concentrações e quantidades de reagentes necessários para o processo, evitando

desperdícios e geração de resíduos.

Tratando-se de um processo antigo, leva-se muito tempo para o preparo e análise

deste teor. O método de extração convencional é, em suma, uma miniaturização do

processo produtivo o qual consiste nas etapas de preparo da matéria-prima, seguida de

extração e purificação dos princípios ativos através da alternância de pH (Avancini, 2003).

A Pilocarpina é um alcalóide presente nas folhas do Jaborandi (Pilocarpus

microphyllus), que é uma árvore nativa da flora brasileira, que vem sendo importante a

algumas décadas para indústria farmacêutica, sendo explorada comercialmente (Pinheiro,

2002). A Pilocarpina possui alto valor agregado, sendo utilizada no combate ao glaucoma

(Migdal, 2000; Webster et al., 1993). E no tratamento de xerostomia, também conhecido

como boca seca (Davies et al., 2001 e Wynn, 1996).

A importância da Pilocarpina como principio ativo dos medicamentos utilizados no

tratamento do glaucoma e xerostomia pode ser avaliada através dos dados

disponibilizados pela ABIQUIF (2008), os quais mostram que em 2007, o cloridrato e o

nitrato de Pilocarpina ocuparam o segundo lugar entre os produtos brasileiros

farmacêuticos mais exportados, atingindo 8,6 milhões de dólares.

A extração convencional utiliza como solventes clorofórmio e soluções de

hidróxido de amônia e ácido sulfúrico através da alternância de pH. Este quadro favorece

a degradação da Pilocarpina, transformando-a em Isopilocarpina e ácido isopilocárpico

(Sternitzke et al.1992), além de ser lento, como foi dito anteriormente. Não foi

encontrado nenhum processo de extração que possuísse um tempo de extração curto,

com custos semelhantes aos dos processos convencionais. Foram encontrados trabalhos

utilizando fluídos em estado supercrítico (Saldanã, 2002 e Barnabé, 2008), mas devido ao

elevado custo inviabiliza o projeto em escala laboratorial.

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O objetivo desta pesquisa é o desenvolvimento de uma nova metodologia de

extração para análise com a finalidade de reduzir o tempo de extração para a análise do

teor de Pilocarpina presente nas folhas do Jaborandi (Pilocarpus microphyllus), utilizando

o método dos fatoriais fracionados com 4-1 fatores, conseqüentemente uma simplificação

do processo e ter respostas sólidas sobre o teor do alcalóide, este fato pode gerar

melhorias futuras para o processo produtivo.

18

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1. Jaborandi

Jaborandi é o nome popular para um grupo de espécies pertencentes à família

Rutaceae, do gênero Pilocarpus sendo que as principais espécies são microphyllus,

Jaborandi e pennatifolius. Contudo estão presentes outras treze espécies (Kaastra, 1982).

O Jaborandi pode ser classificado como um arbusto, medindo entre 3 a 7,5 m de altura,

com folhas claras de 2 a 6 cm de comprimento apresentando bordas variando de

lanceolado a oval, como mostrado na Figura 1 (Oliveira et al., 1991; Pinheiro, 2002).

Figura 1 – Pilocarpus microphyllus

Na língua Tupi guarani Jaborandi, ou ia-mbor-endi, significa “que faz babar”, pois

induz a produção de secreções, no caso quando mastigada a salivação (Corrêa, 1984).

Dentre as três espécies conhecidas, a microphyllus e a Jaborandi, foram as mais

19

estudadas, pois a Pilocarpina apresenta em maior quantidade nas suas folhas, e pela sua

vasta distribuição geográfica, que engloba praticamente todo o território nacional, desde

o Pará até o Rio Grande do Sul (Avancini, 2003; Pinheiro, 2002), contudo a região onde

essas espécies produzem maiores proporções de Pilocarpina são as regiões de clima

quente e úmido o ano inteiro, sendo a floresta amazônica no território brasileiro.

O Jaborandi é uma espécie nativa da flora brasileira, sendo o único produtor no

mundo (DECEX, 1994). Dessa forma foi muito explorada nas últimas décadas, sendo o

Maranhão o estado que participa com 95% da produção nacional (Pinheiro, 2002). A

exploração desta árvore era realizada de forma extrativista e de forma descontrolada,

sendo podados vários galhos e muitas vezes destruindo a árvore. Desde 1992, porém, a

planta faz parte da Lista Oficial de Espécies da Flora Brasileira Ameaçadas de Extinção,

publicada pelo Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis,

devido à sua exploração descontrolada (IBAMA, 1992).

Em 1970 foram implantadas duas importantes indústrias na região para produção

de Pilocarpina uma em São Luiz, no estado do Maranhão, pelo grupo MERCK e outra na

Parnaíba pelo grupo KLABIN – PLANTEX. A inovação destes grupos foi a criação de

fazendas regulamentadas para a produção de folhas de Jaborandi, controlando assim o

desmatamento da árvore nativa.

3.2. Pilocarpina

A característica de induzir a produção de secreções ocorre devido a um alcalóide

presente em suas folhas, a Pilocarpina. Este alcalóide apresenta concentrações entre 0,4 e

1,2% da sua massa total. A concentração da Pilocarpina é dependente de fatores

climáticos e também do solo local. As folhas mais jovens apresentam maior quantidade de

Pilocarpina que as folhas mais velhas, pois é na fase jovem da planta que ocorre a

formação de enzimas para o desenvolvimento dos processos de diferenciação nos tecidos,

esta fase é dependente deste alcalóide (Scheerer, 2001).

Alcalóides são substâncias de caráter básico, devido a pelo menos um átomo de

nitrogênio presente em usa estrutura, definidos pela função amina, podendo ser de

origem vegetal ou animal (Costa, 1975 e Dewick, 1997).

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A Pilocarpina possui um núcleo imidazólico e outro pentagonal lactônico sendo um

alcalóide derivado, provavelmente do aminoácido histidina (Dewick, 1997). Este alcalóide

foi isolado em 1875, por Hardy. A sua constituição foi proposta por Pinner e a primeira

síntese realizada em 1933 pelo químico Preobrashenski (Mingoia, 1967).

Este alcalóide pode ser obtido na forma de cristais puros ou como óleos viscosos,

cristalizando em baixa temperatura, sendo altamente higroscópicos (Pinner, 1902),

contudo este alcalóide não se encontra isolado, possuindo isômeros e estruturas

semelhantes, sendo eles a Epiisopiloturina, Isopilocarpina, Pilosina e Isopilosina. A

Pilocarpina é solúvel em água, álcool e clorofórmio (Hardy, 1875; Jowett, 1900), bastante

solúvel em benzeno (Petit, 1897) e pouco solúvel em éter ou éter de petróleo (Jowett,

1900). Sua estrutura molecular é apresentada na Figura 2. Sua fórmula química é

C11H16N2O2, e sua massa molecular é 208,26 g/gmol. Seu ponto de fusão é 34ºC e o de

ebulição é 260ºC, sendo acima de 34ºC inicia-se uma conversão parcial da Pilocarpina em

Isopilocarpina. A Pilocarpina é solúvel em água, álcool e clorofórmio (MERCK, 1983).

Figura 2 – Estrutura molecular da Pilocarpina

A degradação da Pilocarpina ocorre devido a temperaturas superiores a 35ºC e a

mudanças de pH. Além desses dois meios, em solução aquosa ocorre a hidrolise da

molécula e a epimerização. Esses meios de degradação são dependentes dos fatores

como mostra a Figura 3. Sua estabilidade decresce com aumento do pH e a elevação da

temperatura. (Bundgaard et al. 1986; Neville et al., 1975; Fan et al. 1966). Elevadas

temperaturas favorecem a epimerização (Nevile et al., 1975).

A isomerização pode ocorrer na própria planta, devido a sua idade. Para evitar

21

esse tipo de degradação as folhas são processadas assim que colhidas. (Petit, 1987).

Figura 3 – Degradação da Pilocarpina (Chung et al., 1970).

A Pilocarpina hidroclorada em fase de etanol foi mantida por três semanas a uma

temperatura de 21ºC e não houve degradação da sua estrutura (Saldaña, 2002).

O efeito de induzir secreções, sendo elas salivares, sudoríparas, entre outras é

causado pela estrutura imidazólica da Pilocarpina. (Mingoia, 1967; Swan, 1967). A

aplicação farmacêutica mais importante da Pilocarpina é na produção de colírios para o

tratamento de glaucoma, pois apresenta a capacidade de reduzir a pressão intra-ocular,

por causar a constrição da pupila, também é utilizada em cirurgias oculares, pelo mesmo

motivo (Migdal, 2000; Webster et al., 1993). O glaucoma é a segunda causa de cegueira

nos EUA, essa doença se manifesta de forma lenta, degenerativa e gradual (Di Stasi, 1996).

Além desta aplicação, a Pilocarpina tem sido recomendada para o tratamento de

xerostomia, popularmente conhecido como boca seca, que é a redução da produção de

saliva, comum em paciente que foram submetidos à radioterapia e quimioterapia, assim

como pacientes com síndrome de Sjögren (Davies et al., 2001 e Wynn, 1996), pois ativa as

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glândulas salivares.

A Pilocarpina é um fármaco cujos efeitos estimulam de forma direta e involuntária

os receptores responsáveis pela liberação neurotransmissores. Alguns dos produtos

contendo sais de Pilocarpina (cloridrato e nitrato) disponíveis no mercado são

encontrados com os nomes de Adsorbocarpine, Akarpine, Almocarpine, I-pilocarpine,

Isopto carpine, Minims Pilocarpine, Miocarpine, Ocu-carpine, OcusertPilo, Pilocar, Pilokair,

Pilopine HS, Piloptic, Pilostat, P.V. Carpine, P.V. Carpine Liquifilm, Spectro-pilo,

Spersacarpine (Cosentino, 1998).

3.3. Epiisopiloturina, Pilosina, Isopilosina e Epiisopilosina

A Pilocarpina não é o único alcalóide presente nas folhas do Jaborandi, são

encontrados a Pilosina, Isopilosina, Epiisopiloturina, além de óleos essenciais (Merck,

1983).

Até os dias de hoje os demais alcalóides presentes nas folhas do Jaborandi não

apresentam utilidade comercial. As estruturas deles são apresentadas na figura 4. Estes

isômeros são de difícil separação, mas recentemente foram separados, identificados e

quantificados por Abreu (2007).

23

Figura 4 – Estrutura dos alcalóides isômeros a Pilocarpina (Scheerer, 2001).

O processo industrial de extração de Pilocarpina das folhas do Jaborandi gera um

resíduo semi-sólido rico em Epiisopiloturina, mas que contém também os outros

isômeros.

A Epiisopiloturina é uma base cristalina opticamente ativa, solúvel em benzeno ou

clorofórmio e pouco solúvel em éter. Cristaliza em água, álcool ou acetona (Pyman, 1912),

sem nenhum valor comercial até hoje.

O alcalóide Epiisopiloturina foi isolado e identificado em 1978. Sua fórmula é

C15H18N2O3 e sua massa molecular é 274,32 (Voigtlander et al., 1978). Nas folhas do

Jaborandi também são encontrados óleos essenciais, que são constituídos por 2-

tridecanona, β-cariofileno, 2-pentadecanona, óxido de cariofileno, D-germacreno, entre

outros (Taveira et al., 2003).

Para alcançar o produto final é necessária a reação com ácido clorídrico e nítrico,

para produzir o cloridrato de Pilocarpina e nitrato de Pilocarpina. Além de serem de difícil

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separação, todos os alcalóides reagem com ácido clorídrico e ácido nítrico, gerando um

gasto excessivo de reagentes, assim como dificultam a separação nas etapas posteriores

ao processo de purificação, pois todos se transformam em sais solúveis em etanol.

3.4. Extração Convencional

Os processos usados podem ser separados em duas grandes partes: a extração e a

purificação.

Ambas são baseadas em propriedades físico-químicas da Pilocarpina e dos demais

alcalóides. A maioria dos alcalóides é pouco solúvel em água, contudo são solúveis na

maioria dos solventes orgânicos. Entretanto os sais provenientes dos alcalóides são

solúveis em água, tanto quanto etanol e pouco solúveis em solventes orgânicos.

A Figura 5 apresenta o fluxograma de uma extração convencional de alcalóides de

Jaborandi, a qual consiste nas etapas de preparo da matéria-prima, seguida de extração e

purificação dos princípios ativos através da alternância de pH. Este tipo de extração é

caracterizado por ser demorado, além de utilizar grande quantidade de solventes

orgânicos (Saldaña, 2002).

Um trabalho realizado por Avancini (2003) avaliou métodos de extração

convencional, em escala industrial, de Pilocarpina das folhas de Jaborandi, o qual se

resume no fluxograma a seguir (Avancini, 2003).

25

Figura 5 – Extração convencional de alcalóides do Jaborandi (Saldaña, 2002).

A etapa de extração consiste nas seguintes etapas:

I. Moagem das folhas em um diâmetro médio pré-determinado para o

processo. Este diâmetro foi determinado através de testes experimentais

de produção, cujos dados serão omitidos por sigilo empresarial.

II. Adição de volume pré-determinado de hidróxido de amônia. E deixar em

repouso por um tempo pré-determinado.

III. Agitação do meio em um reator específico para extração de alcalóides por

tempo pré-determinado.

IV. Transferência para um segundo reator com volume pré-determinado de

ácido clorídrico diluído. Com a finalidade de realizar a alternância de pH do

26

meio. Esta etapa é onde ocorre a separação dos alcalóides presentes nas

folhas.

V. Centrifugação do meio reacional para separar os alcalóides que são menos

densos que a clorofila, graxas, óleos essenciais e material particulado.

VI. É realizada uma decantação para separar materiais mais densos ainda

presentes na solução e para separar a fase orgânica da inorgânica. A fase

orgânica contém os alcalóides presentes nas folhas.

VII. É então adicionado clorofórmio em meio alcalino, sendo utilizado hidróxido

de amônia para este fim, para separar impurezas dos alcalóides presentes.

A partir desta etapa existem apenas solventes e os cinco alcalóides.

VIII. É realizada concentrações para reduzir os volumes dos solventes. Esta é a

última etapa do processo de extração.

As etapas de purificação serão omitidas, pois o trabalho tem como objetivo

desenvolver um novo método de extração de Pilocarpina. De forma resumida, são

realizadas várias lavagens, concentrações e adição de ácido clorídrico ou ácido nítrico,

para produzir o cloridrato de Pilocarpina e o nitrato de Pilocarpina.

3.5. Extração Proposta

O método de extração proposto consiste em utilizar ácido clorídrico que é o

responsável pela retirada dos alcalóides presentes nas folhas utilizando, e ao invés da

alternância de pH realizada no método convencional, utilizar a força de colisões

mecânicas.

Estas colisões são geradas por um equipamento chamado TURRAX, o qual é

constituído de um motor elétrico capaz de alcançar altas rotações por minuto, até um

limite de 15000 RPM. O material exposto passa pelas aberturas no material, onde é

submetido a fortes colisões, o sistema também atua como uma bomba centrífuga para

recircular o líquido e os sólidos suspensos.

Através das colisões é retirado tanto a Pilocarpina e demais alcalóides, como parte

da clorofila e óleos essenciais. Contudo o intuito é obter um novo método de extração de

27

Pilocarpina, sem a importância de sua separação do meio.

Até o momento nenhum estudo foi realizado nesta área, utilizando uma extração

ácida por colisões. Existem estudos diferentes na área de extração da Pilocarpina, como a

extração em fluídos supercríticos realizada por Saldaña (2002) e Barnabé (2008).

28

4. MATERIAIS

4.1. Matéria Prima

Folhas de Jaborandi provenientes da cidade de Barra da Corda-MA, fornecidas pela

empresa Quercegen®, com teores nominais variando de 0,80% à 1,10%.

4.2. Padrões de Pilocarpina

Os padrões utilizados foram da USP, United State Pharmacopeial.

4.3. Fase móvel

Trietilamina, solução ácida e álcool, dados omitidos por sigilo industrial.

4.4. Reagentes

Soluções ácidas e alcalinas de diferentes concentrações e empresas, que por

motivos de sigilo industrial todas as informações serão omitidas.

4.5. Solventes

Água destilada

29

4.6. Equipamento de extração e extração

Homogeneizador ULTRA TURRAX T25 Digital IKA

Bomba de vácuo

4.7. Equipamento de identificação e quantificação

Cromatógrafo de Alta Eficiência Líquida.

Coluna: Duratech – AnalysentechnikGmbH Multospher 120RP 18 HP

Detector: Knauer detector UV K-2001

30

5. MÉTODO

5.1. Extração da Pilocarpina

O procedimento experimental de extração consiste em pesar cerca de 1g de folhas

de Jaborandi previamente trituradas, provenientes de uma operação unitária ocorrida na

produção.

Depositá-las em um frasco de amostra com 7 cm de diâmetro e 12 cm de altura,

juntar a ela água e ácido necessário para extração (o ácido será omitida por sigilo

industrial), pré-determinados pelos patamares na tabela 1 e pela matriz de experimentos

na tabela 2, afim de completar o volume para 50 mL de solução.

As folhas foram submetidas à agitação constante realizada por um

Homogeneizador ULTRA TURRAX T25, em tempos pré-determinados pelos patamares na

tabela 1 e pela matriz de experimentos na tabela 2.

O extrato foi filtrado em um funil de Büchner, com auxílio de papel de filtro.

O filtrado foi armazenado e a torta de filtração foi colocada novamente no frasco

de amostra, para realizar mais duas extrações, sendo utilizado 25mL na segunda e na

terceira extração.

O filtrado proveniente das três extrações será medido e analisado em HPLC, para

determinar o teor de Pilocarpina presente nas folhas.

Tabela 1 – Patamares do experimento proposto

Parâmetros Valor Alto (+) Valor Baixo (-)

Velocidade (A) Agitação vigorosa Agitação moderada

Tempo (B) Tempo longo Tempo curto Temperatura (C) Temperatura controlada Temperatura ambiente

Volume de ácido (D) Volume alto Volume baixo

31

Tabela 2 – Matriz de Experimentos

Experimentos

Parâmetros

Velocidade Tempo Temperatura Volume do ácido

1 - + - +

2 - - - - 3 + + + +

4 - + + -

5 - - + +

6 + - - + 7 + + - -

8 + - + -

5.2. Análise do teor de Pilocarpina via HPLC

Foi retirada uma alíquota proveniente da solução, que é composta das três

extrações, que foi diluída em um balão volumétrico de 25mL. Foram colocados 2mL de

solução e o balão foi completado com água destilada. Depois de realizada a

homogeneização, a solução diluída foi injetada no cromatógrafo, onde após um tempo

predeterminado ocorreu a separação de todas as substâncias presentes na amostra.

A Pilocarpina foi quantificada através de um padrão interno no próprio

equipamento. Utilizando os valores de massa real das folhas, volumes provenientes das 3

extrações e o valor das áreas fornecidas pelo equipamento foi possível calcular a

concentração real das folhas.

Fórmula do cálculo do teor de Pilocarpina real:

5.3. Fluxogramas do Processo

Na figura 6 são mostrado o fluxograma do procedimento analítico de extração de

Pilocarpina das folhas de Jaborandi e o procedimento proposto para melhoria, assim

32

como o tempo aproximado de cada etapa.

Figura 6 – Fluxogramas dos procedimentos de extração da Pilocarpina das folhas

de Jaborandi

33

6. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Foram realizadas 4 extrações da maneira convencional, com a finalidade de

comparar os valores com o procedimento proposto. O sinal resposta esta expresso em

cromatogramas, estes em APÊNDICE. Os anexos correspondentes a estas análises são os

cromatogramas de 1 a 4, presentes no APÊNDICE A.

Como teor nominal deste lote é de 0,79% de Pilocarpina, valor fornecido pelo

produtor. E os valores das 4 extrações convencionais são expostos na tabela 3.

Tabela 3 – Porcentagem de Pilocarpina proveniente da extração convencional

Extração Porcentagem de Pilocarpina 1 0,7921%

2 0,6972%

3 0,8043%

4 0,7937%

Desta forma o teor das folhas de Jaborandi, calculado pelas extrações

convencionais foi de (0,7967+0,0001)%. O valor em negrito foi descartado por se tratar de

um ponto muito distante dos demais. Esta média apresenta-se muito próxima do valor

nominal fornecido pelo produtor.

Utilizando a metodologia de fatoriais fracionados a tabela apresenta 8

experimentos independentes, com o monitoramento de 4 parâmetros em 2 patamares

cada um. Segue a tabela 4, que mostra os parâmetros adotados em cada experimento.

Tabela 4 – Matriz de Experimentos

Experimentos Parâmetros

Velocidade (A) Tempo (B) Temperatura (C) Volume do ácido (D)

1 - + - +

2 - - - -

3 + + + + 4 - + + -

5 - - + +

6 + - - +

7 + + - - 8 + - + -

34

Foram monitorados valores de pH e os volumes finais de cada uma das extrações

assim como as temperaturas iniciais e finais de cada extração, estes valores são expressos

nas tabelas 5, 6 e 7.

Tabela 5 – Monitoramento da Primeira série de extrações

Extração m (g) pH T0(°C) T(°C) V(mL)

1 1,0011 1,8 20 30 85

2 1,0691 2 24 27 93

3 1,0844 1,8 0 11 95

4 1,0615 2,1 0 11 97

5 1,0544 1,6 0 14 14

6 1,0060 1,8 24 27 27

7 1,0087 2,1 20 30 30

8 0,9833 2,2 0 16 16

Tabela 6 – Monitoramento da Segunda série de extrações


1 1,0182 1,8 26 30 95

2 0,9755 2 26 29 97

3 0,9715 1 0 10 94

4 1,0582 1 0 9 97

5 0,9557 1,2 0 8 95

6 0,9935 1,6 23 28 98

7 1,021 2 18 21 94

8 0,9898 2 0 10 97

Tabela 7 – Monitoramento da Terceira série de extrações


1 1,0457 1,7 18 23 94

2 1,0073 1,9 19 23 97

3 1,0113 1,7 0 19 98

4 1,0457 1,9 0 17 96

5 1,0074 1,7 0 14 96

6 1,0251 1,7 20 29 95

7 0,9961 2 21 35 96

8 1,083 2 0 13 93

35

As variáveis repostas para cada experimento e suas replicatas estão expressas na

tabela 8 e os cromatogramas que representas as análises estão em anexo, sendo os

cromatogramas de 1 a 24, no APÊNDICE B.

Tabela 8 – Matriz de Experimentos com Variáveis Respostas

Experimentos Parâmetros Teor de Pilocarpina

A B C D 1a Extração 2a Extração 3a Extração

1 - + - + 0,7404 0,8351 0,7524

2 - - - - 0,5559 0,5399 0,5903

3 + + + + 0,7517 0,7779 0,7956

4 - + + - 0,7996 0,7879 0,7956 5 - - + + 0,7994 0,7360 0,8548

6 + - - + 0,4812 0,7073 0,7312 7 + + - - 0,7655 0,6812 0,7421

8 + - + - 0,7186 0,6684 0,7145

Os valores em preto foram descartados, pois se tratam de valores divergentes dos

valores reais apresentados para o mesmo experimento.

O objetivo é identificar a condição experimental onde ocorre a extração mais

eficaz da Pilocarpina presente nas folhas de Jaborandi.

Utilizando a teoria de Efeitos e Influências de Design de Experimentos, foram

determinados os parâmetros e as interações que são relevantes para o modelo.

Tabela 9 – Matriz de Efeitos

Efeitos Respostas

EA 0,01628333 tA 0,561826797

EB 0,06876667 tB 2,372668746 Relevante +

EC 0,07530833 tC 2,598377055 Relevante +

ED 0,05267500 tD 1,817455058

EAB -0,02223333 tAB -0,767120724

EAC -0,06602500 tAC -2,278072524 Relevante -

EAD -0,04069167 tAD -1,40399194

EBC -0,04069167 tBC -1,40399194

EBD -0,06602500 tBD -2,278072524 Relevante -

ECD -0,02223333 tCD -0,767120724

Os valores utilizados como base para determinar se o efeito é relevante foram os

36

graus de liberdade, assim como a confiança. Este experimento apresenta 12 graus de

liberdade (GL) e foi adotada uma confiança de 95%. Desta forma os níveis dos parâmetros

fora: a temperatura controlada e o tempo de extração longo, a interação entre velocidade

e temperatura e a interação tempo e volume.

Desta maneira a melhor situação ocorreu no experimento 4 e está apresentada na

tabela 10.

Tabela 10 – Melhor ajuste do Método.

Velocidade Agitação moderada

Tempo Tempo longo Temperatura Temperatura controlada

Volume de Ácido Volume baixo de acido

Para comprovação do método foram realizados 4 testes em duplicatas com folhas

de teor nominal de 1,02% Pilocarpina. A mudança no teor foi adotada, pois se trata de

uma pesquisa com caráter industrial e as folhas processadas abrangem concentrações de

0,70% à 1,10% de Pilocarpina presente em folhas. Os cromatogramas destes testes podem

ser observados nos cromatogramas 1 à 4, no APÊNDICE C. Na tabela 11, podem ser

observadas as porcentagens de Pilocarpina extraída das folhas pelo método.

Tabela 11 – Porcentagem de Pilocarpina extraída para comprovação do método

Experimento Sinal Resposta

1 0,9537 2 1,1003

3 1,0028

4 0,7976

Os resultados não foram satisfatórios, pois não houve um padrão obedecido, não

ocorrendo à extração por completo, as causas eram diversas desde influência de material

inerte no meio de extração devido à baixa massa utilizada, aumento da temperatura da

solução, ocasionando a degradação da Pilocarpina extraída, ocorrida pelo baixo volume

de solução, dificultando a troca térmica, baixa quantidade de Pilocarpina a ser extraída,

entre outros.

37

Como rota alternativa trabalhou-se nos valores de massa e volumes da solução. A

alternativa foi tornar o meio de extração mais robusto. A massa utilizada passou a ser 4

vezes maior que a anterior (de 1g para 4g), o volume de extração 2 vezes maior (de 100

mL totais para 200 mL totais) e o aumento do tempo de extração de sendo na segunda

extração este tempo foi dobrado, os tempos da primeira e a terceira extração foram

mantidos.

A massa foi alterada para reduzir a influência de materiais inertes no meio, sendo

que com uma massa maior alguma parte da folha não processada ou que não contenha

alcalóides não influenciem muito na resposta final.

O aumento no volume se deu por estudo de temperatura, quanto maior o volume,

menor será o aumento de temperatura submetido a um mesmo tempo. Desta forma a

temperatura não chega a um patamar para degradar a Pilocarpina presente no meio.

O acréscimo no tempo de extração foi utilizado para ocorrer à extração completa

da folha, sendo que algumas folhas apresentavam-se intactas após o período inicial,

seguindo este ponto houve um aumento geral de 25% do tempo de extração.

Foram realizados 4 testes para comprovação das mudanças, utilizando folhas com

o mesmo teor de Pilocarpina (1,02%). Os cromatogramas referentes a esta etapa estão

presentes em anexo, sendo os cromatogramas de 1 a 4, no APÊNDICE D. Na tabela 12,

podem ser observadas as porcentagens de Pilocarpina extraída das folhas pelo método.

Tabela 12 – Porcentagem de Pilocarpina extraída para comprovação do método

modificado

Experimento Sinal Resposta 1 1,1156%

2 1,1860%

3 1,1304%

4 1,1710%

Desta maneira os resultados se mostraram satisfatórios. Obedecendo a uma

margem de erro de 3,5%. Contudo tornou-se dispendioso o tempo, devido à grande

quantidade de massa de folhas, dificultando a filtração. Esta etapa se mostrou a mais

dispendiosa em comparação com as demais etapas do processo. Tendo em vista o tempo

38

total da análise foi de aproximadamente 2 horas e 30 minutos.

Como ganho adicional observou-se que a Pilocarpina presente nas folhas foi

extraída com maior eficácia, pois folhas com teor nominal de 1,00% apresentaram um

ganho de 10% na sua extração. O que mostra que o método é mais eficaz que o utilizado

pela própria produtora.

Sabendo que os parâmetros de tempo e volume foram satisfatórios, aplicou-se

uma segunda proposta para melhoria, neste caso específico a redução no tempo de

filtração. Como artifício reduziu-se a massa utilizada. Ao invés de 4 gramas de folha, foram

utilizados 3 gramas de folhas.

Para comprovar se a mudança no processo era efetiva, foram realizados 4 testes

com os patamares descritos anteriormente. Este testes podem ser observados nos

cromatogramas de 1 a 4, no APÊNDICE E. As folhas utilizadas foram as mesmas dos

experimentos anteriores, com teor de 1,02% de Pilocarpina. Na tabela 13, podem ser

observadas as porcentagens de Pilocarpina extraída das folhas pelo método.

Tabela 13 – Porcentagem de Pilocarpina extraída para comprovação do método,

redução de massa de folhas

Experimento Sinal Resposta

1 1,1584%

2 1,1516%

3 1,1320% 4 1,1297%

Os resultados obtidos foram satisfatórios, as folhas foram extraídas por completo.

O tempo de extração e análise foi aproximadamente 2 horas.

O método ainda apresentou a mesma particularidade que o método anterior, as

extrações foram mais eficazes, na mesma ordem, sendo 10% de ganho.

39

7. CONCLUSÃO

O novo método se mostrou eficaz ao que foi proposto que era ser uma alternativa

mais rápida e simples sem deixar de ser confiável para análise de folhas de Jaborandi. Em

relação à redução de tempo o método reduziu o tempo de preparo em 2 horas

aproximadamente, principalmente nas etapas de extração e preparo da amostra para

injeção no HPLC. Anteriormente era de 210 minutos em contrapartida o novo método

possui tempo de extração e preparo inferior a 70 minutos.

A robustez do método evita erros crassos, pois diminui o número de etapas de

manuseio da amostra e mistura com outros reagentes. Esta simplificação reduziu também

o gasto com solventes e reagentes.

Como vantagem não descrita inicialmente no processo o rendimento da extração

se mostrou superior à extração convencional sendo em torno de 10%. Este fator se dá,

pois as condições de extração do meio são mais eficazes comparadas ao do meio

convencional.

Desta maneira a proposta se mostrou totalmente viável para a aplicação no

Laboratório de Controle de Qualidade e no monitoramento do processo industrial.

40

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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43

APÊNDICE A – CROMATOGRAMAS DAS EXTRAÇÕES CONVENCIONAIS

Cromatograma 1 - Primeira Extração Convencional

Figura 7 – Cromatograma da primeira extração convencional

Sinal: 0,0878

Porcentagem de Pilocarpina extraída das folhas: 0,7921%

44

Cromatograma 2 - Segunda Extração Convencional

Figura 8 – Cromatograma da segunda extração convencional

Sinal: 0,0641


45

Cromatograma 3 – Terceira Extração Convencional

Figura 9 – Cromatograma da terceira extração convencional

Sinal: 0,0863


46

Cromatograma 4 – Quarta Extração Convencional

Figura 10 – Cromatograma da quarta extração convencional

Sinal: 0,0821

Porcentagem de Pilocarpina extraída das folhas: 0,7937

47

APÊNDICE B – CROMATOGRAMAS DO MÉTODO EXPLORATÓRIO

Cromatograma 1 – Extração 1, série 1

Figura 11 – Cromatograma da Primeira Extração, série 1

Sinal: 0,0872


48


Figura 12 – Cromatograma da primeira extração, série 2

Sinal: 0,0895


49


Figura 13 – Cromatograma da primeira extração, série 3

Sinal: 0,0837


50


Figura 14 – Cromatograma da segunda extração, série 1

Sinal: 0,0639


51



Sinal: 0,0543


52



Sinal: 0,0613


53


Figura 17 – Cromatograma da terceira extração, série 1

Sinal: 0,0856


54



Sinal: 0,0888


55



Sinal: 0,0821


56


Figura 20 – Cromatograma da quarta extração, série 1

Sinal: 0,0875


57



Sinal: 0,0887


58



Sinal: 0,0815


59


Figura 23 – Cromatograma da quinta extração, série 1

Sinal: 0,0869


60

Cromatograma 14 – Extração 5, Série 2


Sinal: 0,0800


61



Sinal: 0,0897


62


Figura 26 – Cromatograma da sexta extração, série 1

Sinal: 0,0515


63



Sinal: 0,0717


64



Sinal: 0,0789


65


Figura 29 – Cromatograma da sétima extração, série 1

Sinal: 0,0796


66



Sinal: 0,0740


67



Sinal: 0,0770


68

Cromatograma 22, Extração 8, série 1

Figura 32 – Cromatograma da oitava extração, série 1

Sinal: 0,0736


69



Sinal: 0,0682


70



Sinal: 0,0832


71

APÊNDICE C – CROMATOGRAMAS DE COMPROVAÇÃO DO MÉTODO

Cromatograma 1 – Primeira Extração


Sinal: 0,1009


72

Cromatograma 2 – Segunda Extração


Sinal: 0,1146


73

Cromatograma 3 – Terceira Extração


Sinal: 0,1014


74

Cromatograma 4 – Quarta Extração

Figura 38 – Cromatograma da quarta extração da comprovação do método

Sinal: 0,0931


75

APÊNDICE D – CROMATOGRAMAS DA COMPROVAÇÃO DO MÉTODO MODIFICADO


Figura 39 - Cromatograma da primeira extração da comprovação do método modificado

Sinal: 0,0963


76


Figura 40 - Cromatograma da segunda extração da comprovação do método modificado

Sinal: 0,1047


77


Figura 41 - Cromatograma da terceira extração da comprovação do método modificado

Sinal: 0,1096


78


Figura 42 - Cromatograma da quarta extração da comprovação do método modificado

Sinal: 0,1081


79

APÊNDICE E – CROMATOGRAMAS DA COMPROVAÇÃO DO MÉTODO MODIFICADO

REDUÇÃO DE MASSA DE FOLHAS


Figura 43 - Cromatograma da primeira extração da comprovação do método modificado,


Sinal: 0,0967


80


Figura 44 - Cromatograma da segunda extração da comprovação do método modificado,


Sinal: 0,0954

Porcentagem de Pilocarpina extraída das folhas: 1,1516

81

Cromatograma 3 – Terceira Extração

Figura 45 - Cromatograma da terceira extração da comprovação do método modificado,


Sinal: 0,0912


82


Figura 46 - Cromatograma da quarta extração da comprovação do método modificado,


Sinal: 0,0915


desenvolvimento de uma nova metodologia de extração para...

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