desenvolvimento de um procedimento de preparo...
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CUIABÁ - MT FEVEREIRO DE 2018
DESENVOLVIMENTO DE UM PROCEDIMENTO DE PREPARO DE AMOSTRAS PARA A DETERMINAÇÃO DO
TEOR DE SÓDIO EM ALIMENTOS PROCESSADOS INFANTIS
FRANCISCA GRACIELE GOMES PEDRO
CUIABÁ - MT 2018
FRANCISCA GRACIELE GOMES PEDRO
Orientadora: Profª. Drª. Adriana Paiva de Oliveira Coorientador: Prof. Dr. Ricardo Dalla Villa
DESENVOLVIMENTO DE UM PROCEDIMENTO DE PREPARO DE AMOSTRAS PARA A DETERMINAÇÃO DO TEOR DE SÓDIO EM ALIMENTOS PROCESSADOS INFANTIS
Dissertação apresentada ao Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia de Mato
Grosso como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Ciência e
Tecnologia de Alimentos, área de concentração Ciência e Tecnologia de
Alimentos e linha de pesquisa Qualidade de Alimentos, para obtenção do título de Mestre.
Divisão de Serviços Técnicos. Catalogação da Publicação na Fonte. IFMT Campus Cuiabá Bela Vista
Biblioteca Francisco de Aquino Bezerra P372d Pedro, Francisca Graciele Gomes Desenvolvimento de um procedimento de preparo de amostras para a determinação do teor de sódio em alimentos processados infantis. / Francisca Graciele Gomes Pedro._ Cuiabá, 2018 54f. Orientadora: Profª. Drª. Adriana Paiva de Oliveira Coorientador: Prof. Dr. Ricardo Dalla Villa Dissertação (Mestrado em Ciência e Tecnologia de Alimentos)_. Programa de Pós-graduação. Instituto Federal de Educação Ciência e Tecnologia de Mato Grosso. 1. Alimento – Dissertação. 2. Mineral – Dissertação. 3. Cloreto de sódio - Dissertação. I. Oliveira, Adriana Paiva de. II. Villa, Ricardo Dalla. III. Título. IFMT CAMPUS CUIABÁ BELA VISTA CDU 613.22
CDD 664
CUIABÁ - MT 2018
FRANCISCA GRACIELE GOMES PEDRO
DESENVOLVIMENTO DE UM PROCEDIMENTO DE PREPARO DE AMOSTRAS PARA A DETERMINAÇÃO DO TEOR DE SÓDIO EM ALIMENTOS PROCESSADOS INFANTIS
Dissertação apresentada ao Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia de Mato
Grosso como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Ciência e
Tecnologia de Alimentos, área de concentração Ciência e Tecnologia de
Alimentos e linha de pesquisa Qualidade de Alimentos, para obtenção do título de Mestre.
Data de Defesa: 27 de fevereiro 2018.
COMISSÃO EXAMINADORA
Profª. Drª. Adriana Paiva de Oliveira IFMT - Campus Cuiabá – Bela Vista
Prof. Dr. Demétrio de Abreu Sousa IFMT – Campus Cuiabá – Bela Vista
Profª. Drª. Eliana Freire Gaspar de Carvalho Dores UFMT – Campus Cuiabá
ATESTADO Atesto terem sido feitas as correções sugeridas pela Comissão Examinadora
_______________________________________
Profa. Dra. Adriana Paiva de Oliveira Presidente da comissão examinadora
iv
“Que todo o meu ser louve ao Senhor, e que eu não esqueça nenhuma das suas
bênçãos”
Salmos 103:2
À Deus.
Ao Espirito Santo de Deus meu melhor amigo.
À minha amada família.
À minha igreja.
À minha orientadora, professora Adriana.
DEDICO.
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AGRADECIMENTOS
À Deus pela vida, conhecimentos, oportunidades, caminhada, crescimento profissional e humano ofertados ao longo deste trabalho. Ao Espírito Santo que esteve comigo cada segundo desta caminhada pela força, sabedoria, mansidão, paz, fé, temperança e mover sobrenatural de Deus.
A minha família, principalmente meus pais, Maria José Gomes e Clidenor Francisco Pedro agradeço pelas orações em meu favor, por todo o amor, carinho e compreensão.
Agradeço aos meus Pastores Francisco Cassiano da Silva, Loide Lacerda da Silva, ao grupo de jovens e a todo o corpo de Cristo da Assembléia de Deus nova Aliança do CPA II por todas as orações, direcionamento, palavras de incentivo e pelos momentos que estiveram ao meu lado.
Aos meus amigos Danielle, Gyzellen, Bárbara, Natali e Lucas do Laboratório de Contaminantes Inorgânicos (LACI) - UFMT, pelo companheirismo, carinho e pelos momentos que estivemos juntos.
A Myrian e a Talissa pela amizade e companheirismo.
A Anne Carolline Borges dos Passos pela amizade, carinho e dedicação para o desenvolvimento do trabalho.
Ao IFMT e a todo o corpo docente do programa de pós graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos pelo fomento de pesquisa, suporte e aprendizado.
A minha orientadora Profª Drª. Adriana Paiva de Oliveira por todo o suporte, confiança, paciência, aprendizado e empenho dedicado à elaboração deste trabalho, um exemplo de profissional em todos os sentidos, glorifico a Deus pelo privilégio de trabalhar com ela.
A UFMT pelo suporte dado para realização das análises e ao meu co-orientador Prof. Dr. Ricardo Dalla Villa pelo suporte, paciência e dedicação dado para o desenvolvimento deste trabalho.
Ao SENAI em nome da Profª. Drª. Márcia Helena Scabora pelo suporte dado para realização das análises interlaboratoriais.
A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES/FAPEMAT) pela bolsa de estudos concedida.
A banca examinadora pelas contribuições na avaliação do trabalho de conclusão da pesquisa.
A todos que direta ou indiretamente fizeram parte do meu desenvolvimento neste curso.
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RESUMO
PEDRO, Francisca Graciele Gomes. Desenvolvimento de um procedimento de preparo de amostras para a determinação teor de sódio em alimentos processados infantis. Dissertação (Mestrado). Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia de Mato Grosso – Campus Cuiabá Bela Vista. 2018. 54p Este trabalho objetivou desenvolver um procedimento de preparo de amostras simples e de baixo custo para a determinação de sódio (Na) em salgadinho de trigo (ST), salgadinho de milho (SM), papinhas industrializadas para bebês (PB) e macarrão instantâneo (MI). Utilizou-se como preparo de amostras a extração em fase aquosa e, para a quantificação, a fotometria de chama. O procedimento consistiu na transferência de uma fração da amostra para um tubo tipo Falcon, adição de água ultrapura, agitação em sistema vortex por 2 minutos e centrifugação a 4500 rpm por 10 minutos. Em seguida, o sobrenadante foi retirado e diluído em água ultrapura para posterior quantificação do analito por fotometria de chama (FC). A precisão e a exatidão foram avaliadas por meio do teste de adição e recuperação em três níveis de fortificação. A comparação com um procedimento de preparo oficial (decomposição por via úmida), técnica analítica (titulação de Mohr, TM) e outro modelo de fotômetro de chama. A robustez foi verificada pelo teste de Youden, tendo como variáveis: massa da amostra, velocidade de centrifugação e tempo de agitação. O desempenho do procedimento foi verificado por meio da quantificação de Na em amostras de diferentes marcas e sabores coletadas em supermercados de Cuiabá (MT). Os valores dos coeficientes de correlação (r) foram superiores a 0,99 para todos os ensaios, indicando excelente correção entre o sinal analítico e a concentração de Na e, os valores de LDI (Limite de detecção) e LQI (Limite de quantificação) foram 0,08 e 0,25 mg L-1, respectivamente. Na comparação dos resultados obtidos entre diferentes técnicas analíticas e instrumentos, utilizando a extração em fase aquosa, foram verificadas diferenças significativas (p ≤ 0,05) para as amostras de PB e MI, que podem ser atribuídas a maior sensibilidade da fotometria de chama, frente à técnica titulométrica de quantificação indireta de sódio e, às variações instrumentais e operacionais dos dois equipamentos avaliados. As recuperações variaram entre 84,13 a 119,58% para FC e 89,50 a 107,65% para TM, com desvios padrão relativos inferiores a 11%. O procedimento proposto apresentou-se robusto para a variável força centrifuga. Os resultados obtidos na aplicação do procedimento proposto variaram de 128,64 a 300,42 mg de Na/ 25 g para ST e SM, 1,51 a 81,45 mg de Na/ 115 g para PB e, 1117,54 a 1961,99 mg de Na/ 85 g de MI. Frente ao exposto, a extração em fase aquosa apresentou com um procedimento de preparo de amostras promissor para a quantificação de Na em diferentes níveis de concentração, em matrizes alimentares, utilizando para a quantificação técnicas analíticas clássicas e instrumentais, que apresentaram como vantagens: simplicidade, baixo custo, diminuição da geração de resíduos e do tempo de análise e, o não uso de reagentes tóxicos. Palavras-chave: alimento; mineral; cloreto de sódio; composição; validação; segurança alimentar.
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ABSTRACT
PEDRO, Francisca Graciele Gomes. Development of a sample preparation procedure for sodium content in processed infant foods. Masters dissertation. Federal Institute of Education, Science and Technology of Mato Grosso - Campus Cuiabá Bela Vista. 2018. 54p. This work aimed to develop a procedure for sample preparation that is simple and cheap for determination of sodium (Na) in wheat snacks (WS), corn chips (CC), baby food (BF) and instant noodles (IN) using aqueous as preparation of samples and, flame photometry for quantification. The procedure consisted in transferring a fraction of the samples to a Falcon tube, addition of ultrapure water, and stir in vortex system for 2 minutes and centrifugation at 4500 rpm for 10 minutes. Then, the supernatant was removed and, diluted in ultrapure water with subsequent quantification by flame photometry (FP). The precision and accuracy were evaluated by means of addition and recovery tests in three levels of fortification and comparison with the wet decomposition, analytical technique (Mohr Titration, MT) and other flame photometer model. Robustness was verified by the Youden test with variables: mass of the sample, centrifugation speed and time of agitation. The performance of the procedure was applied to the quantification of different brands and flavors samples collected in supermarkets of Cuiabá (MT). The values of correlation coefficient (r) were above the 0.99 for all experiments indicating excellent correction between the analytic signal and Na concentration and, the values of instrumental LOD (limit of detection) and LOQ (limit of quantification) were 0.08 and 0.25 mg L-1, respectively. In the comparison between different analytical techniques and instruments using the aqueous phase extraction, significant differences was verified (p ≤ 0,05) for IN and BF samples, which can be attributed to a greater sensitivity of flame photometry in relation the titulometric technique of indirect sodium quantification and, the instrumental variations of the two operating equipment assessed. Recoveries ranged between 84.13 to 119.58 % for FP and 89.50 to107.65 % for MT, with relative standard deviations of less than 11%. The proposed procedure showed robust ners for the variable centrifugal force for all experiments. The application of the procedure was verified by the quantification of the different brands and flavors of sample collected in the Cuiabá city and, the results ranged from 128.64 to 300.42 mg/ 25 g for WS and CC, 1.51 to 81.45 mg Na/ 115 g for BF and 1117.54 to 1961.99 mg/ 85 g for IN. With this view, the results obtained suggest that the aqueous phase extraction can be a promising samples preparation procedure for quantification of sodium, at different concentration leveis, in food matrices using classical and instrumental analytical techniques for quantification showing as advantages the simplicity, low cost, decreased generation for waste and analysis time, as well as the use of non-toxic reagents. Keywords: food; mineral; sodium chloride; composition; validation; food safety.
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LISTA DE FIGURAS CAPITULO 1 Figura 1. Representação do mecanismo de funcionamento da bomba sódio-potássio. Fonte: GUYTON; HALL, 2011................................................................
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LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 2 Tabela 1. Condições experimentais selecionadas para avaliar a robustez do método (n=3) ...........................................................................................................
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Tabela 2. Resultados (valor médio ± %DPR) obtidos na comparação entre as técnicas analíticas fotometria de chama e titulação de precipitação pelo método de Mohr utilizando o procedimento de preparo de amostra de extração em fase aquosa......................................................................................................................
45 Tabela 3. Resultados (valor médio ± %DPR) obtidos na comparação entre os procedimentos de preparo de amostras por extração em fase aquosa e decomposição por via úmida utilizando a fotometria de chama..............................
46 Tabela 4. Resultados (valor médio ± %DPR) observados na comparação de leituras obtidas em diferentes fotômetros de chama...............................................
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Tabela 5. Resultados obtidos (valor médio ± %DPR) nos testes de adição e recuperação da extração em fase aquosa por fotometria de chama e titulação pelo método de Mohr...............................................................................................
47 Tabela 6. Efeitos observados nas variáveis pesquisadas na avaliação da robustez do método estudo (n=3) ...........................................................................
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Tabela 7. Concentrações (valor médio ± %DPR) de sódio e porcentagem de diferença entre o valor rotulado e o obtido experimentalmente em diferentes marcas e sabores de macarrão instantâneo, salgadinho de milho, salgadinho de trigo e papinhas industrializadas para bebês (n=3) ................................................
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LISTA DE ABREVIAÇÕES
ABIA Associação Brasileira das Indústrias de Alimentação ABIMA Associação Brasileira das Indústrias de Massas Alimentícias ABIP Associação Brasileira da Indústria de Panificação e Confeitaria ABITRIGO Associação Brasileira da Indústria de trigo ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária APHA American Public Health Association (Associação Americana de Saúde
Pública) ATP Trifosfato de Adenosina CTI Cromatografia Líquida de Troca Iónica CV Coeficiente de Variação DPR Desvio Padrão Relativo FAAS Flame Atomic Absorption Spectrometry (Espectrometria de Absorção
Atômica) ESPGHAN Gastroenterologia Herpetologia e Nutrição EUA Estados Unidos da América FDA Food and Drug Administration (Administração de Alimentos e
Medicamentos) FC Fotometria de Chama g Grama GLP Gás Liquefeito de Petróleo IAL Instituto Adolfo Lutz ICP-MS Espectrometria de Massa com de Plasma Indutivamente Acoplado ICP-OES Espectrometria de Emissão Óptica com Plasma Indutivamente Acoplado INMETRO Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia L Litro LD Limite de Detecção LDI Limite de Detecção Instrumental LQ Limite de Quantificação LQI Limite de Quantificação Instrumental mEq Miliequivalente mg Miligrama min Minutos mmol Milimol MRC Material de Referência Certificado MS Ministério da Saúde OMS Organização Mundial de Saúde OPAS Organização Pan-Americana de Saúde RDC Resolução de Diretoria Colegiada Rec% Adição e Recuperação rpm Rotações por minuto TET Titulação Termométrica WASH World Action on Salt and Health (Ação Mundial sobre Sal e Saúde) WHO World Health Organization (Organização Mundial de Saúde)
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SUMÁRIO
CAPÍTULO 1: CONSIDERAÇÕES INICIAIS........................................................... 12 1. Introdução.................................................................................................. 13 2. REVISÃO DE LITERATURA............................................................................ 16 2.1. . Importância do sódio no organismo humano........................................... 16 2.2. Legislação nacional e internacional sobre o teor de sódio em alimentos
.................................................................................................................. 18 2.3. Procedimentos de preparo de amostras e técnicas analíticas utilizadas
na Determinação de sódio em alimentos ................................................ 21 2.4. Validação de métodos analíticos ............................................................. 22 2.4.1. Seletividade/especificidade................................................................. 23 2.4.2. Linearidade......................................................................................... 24 2.4.3. Limite de detecção e de quantificação................................................ 25 2.4.4. Precisão.............................................................................................. 26 2.4.5. Exatidão.............................................................................................. 28 2.4.6. Robustez............................................................................................. 28 REFERÊNCIAS........................................................................................................ 29 CAPÍTULO 2: ARTIGO............................................................................................ 35 EXTRAÇÃO EM FASE AQUOSA COMO PROCEDIMENTO DE PREPARO DE AMOSTRAS PARA A DETERMINAÇÃO DE SÓDIO EM ALIMENTOS PROCESSADOS INFANTIS.................................................................................... 36 1. INTRODUÇÃO.................................................................................................. 39 2. MATERIAL E MÉTODOS................................................................................. 40 2.1. Instrumentação....................................................................................... 40 2.2. Reagentes, soluções e amostras........................................................... 41 2.3. Procedimentos de preparo de amostras................................................. 42 2.4. Validação e figuras de mérito................................................................. 42 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO........................................................................ 44 4. CONCLUSÕES................................................................................................. 52 AGRADECIMENTOS............................................................................................... 52 REFERÊNCIAS........................................................................................................ 52
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CAPÍTULO 1: CONSIDERAÇÕES INICIAIS
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1. Introdução
A globalização e a industrialização atuam como fatores influentes na mudança dos
hábitos alimentares de quase toda a população mundial. Nas grandes cidades e centros
urbanos, a distância entre a residência e o trabalho, bem como, os curtos horários para as
refeições durante o expediente de serviço não possibilitam grandes deslocamentos dos
indivíduos, contribuindo para que alimentos processados, prontos para o consumo, sejam
cada vez mais inseridos na dieta alimentar (BLEIL, 1998; ORTIGOZA, 1997; PINHEIRO,
2008).
No caso dos alimentos processados ingeridos por crianças e adolescentes, o
consumo tem aumentado também por causa de mulheres que trabalham fora do lar, maior
conveniência, preparação rápida, durabilidade e aceitação, influência social, maior poder
de compra da população, crescimento do hábito de comer fora de casa, e grande
publicidade para a venda destes alimentos nos veículos de mídia (RIBEIRO et al., 2013).
Na primeira infância, os minerais e oligoelementos são fundamentais à saúde,
bem-estar e desenvolvimento. Nesse estágio de crescimento do indivíduo, as funções
bioquímicas e vitais estão sendo estabelecidas e, alterações negativas destas podem
resultar em efeitos que perdurarão por toda a vida. Os níveis apropriados dessas
espécies elementares devem ser oferecidos em tempo hábil, para garantir que o
desenvolvimento do lactante não seja afetado (KHAMONI; HAMSHAW; GARDINER,
2017; MIR-MARQUÉS et al., 2015).
A formação dos hábitos alimentares de um indivíduo se inicia nos dois primeiros
anos de vida, sendo que, nesse período, as crianças descobrem a textura, o sabor e
cheiro (o sensorial). O teor de sódio presente na alimentação oferecida pelos pais ou nas
escolas pode determinar um hábito alimentar com preferência por alimentos salgados e,
ainda, associar-se com maiores níveis de pressão arterial na infância e na vida adulta
(BRION, 2008; LONGO-SILVA et al., 2017).
A maior parte dos alimentos processados possui elevadas concentrações de
sódio, cuja ingestão em excesso pode causar graves problemas à saúde como
hipertensão arterial, doenças cardiovasculares, entre outros. A elevada presença de sódio
nesses alimentos é derivada da adição de cloreto de sódio e aditivos alimentares
(DUNFORD; POTI; POPKIN, 2017; GUYTON; HALL, 2002).
Segundo Mello, Barros e Morais (2016), pesquisas verificaram que 98,1% das
crianças na pré-escola de escolas públicas e privadas, em nove cidades brasileiras, têm
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uma média diária de consumo de sódio de 2186,5 mg. No Brasil, a Agência Nacional de
Vigilância Sanitária (ANVISA) estabelece índice de ingestão diária de 2400 mg de sódio,
sem especificação da idade do consumidor. Na Austrália, o Conselho Nacional de Saúde
e Pesquisa recomenda a ingestão de 1000 mg de sódio/dia para crianças de 2-3 anos de
idade, e valores máximos de 2300 mg de sódio/dia para adolescentes (14-18 anos),
sendo estes valores semelhantes aos limites máximos diários recomendados pelo Centro
de Controle de Doenças nos Estados Unidos da América (EUA) (LIEM, 2017). A
Organização Mundial da Saúde (OMS) recomenda que a ingestão diária de sódio não
ultrapasse 2000 mg (WHO, 2012).
A restrição da ingestão de sódio pela área médica tem motivado o
desenvolvimento de métodos analíticos para o controle de qualidade de diversos
alimentos que incluem cereais, conservas, produtos lácteos, sopas e produtos cárneos
(BECKER et al., 2011; CHEKRI et al., 2012; CHU; TAYLOR, 2016; FERREIRA et al.,
2000; MARTINEZ, et al., 2015; OLIVEIRA, T.; OLIVEIRA, A.; VILLA, 2017;
PLOEGAERTS; DESMET; KRIEKEN, 2016; TANASE et al., 2011).
A determinação de metais em alimentos, usualmente, requer uma etapa de
preparo de amostra para a separação de componentes da matriz e a solubilização dos
analitos em solução aquosa (APHA, 2005). A facilidade com que isso é conseguido
depende da natureza da matriz e do analito e, em geral, requer condições agressivas que
envolvem a decomposição por via seca ou decomposição por via úmida com aquecimento
por condução (IAL, 2008). Estes procedimentos de preparo de amostras geram resultados
que apresentam boa precisão e exatidão, porém apresentam desvantagens como uso de
reagentes tóxicos, geração de elevada quantidade de resíduos, perdas por volatilização
dos analitos e elevado tempo de preparo (KRUG, 2006).
A elevada solubilidade da maioria dos sais de sódio em água (MAHAN; MYERS,
1997; SILVA; MARTINS; ANDRADE, 2004) sugerem que o íon sódio possa ser extraído
quantitativamente sem a necessidade de decomposição da matéria orgânica presente na
matriz. Chen et al. (2005) relatam a utilização da água como solvente extrator na
determinação de Na+ em pepino, cogumelo e diversos outros alimentos em conserva.
Piovezan et al. (2010) relatam processo semelhante, porém, para a determinação de Na+,
K+, Ca2+ e Mg2+ em biodiesel proveniente de diversas matrizes, Chu e Taylor (2016)
utilizaram a fotometria de chama para determinação dos íons Li +, Na+, K+ e Ca2+ em seis
marcas diferentes de molho de soja no Reino Unido e, verificaram que a fotometria de
chama é um meio direto para a quantificação de elementos múltiplos à base de água que
pode ser utilizada em diferentes aplicações. Oliveira e colaboradores (2017) utilizaram a
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extração sólido-liquido como preparo de amostra para determinação de Na+ e K+ em
salame, salsicha, presunto e mortadela e os resultados obtidos apresentaram valores
semelhantes aos procedimentos clássicos de preparo de amostra, além de não ser
necessário o uso de reagentes tóxicos, além de apresentar simplicidade, baixo custo e
redução de resíduos.
A quantificação de metais em alimentos comumente é feita por espectrometria de
absorção atômica em chama (FAAS) e espectrometria de emissão óptica com plasma
indutivamente acoplado (ICP-OES). Estas técnicas, embora proporcionem resultados
exatos e precisos, possuem custos operacionais e de manutenção relativamente altos
(DOLAN; CAPAR, 2002). A fotometria de chama (FC) é considerada uma das técnicas
espectrométricas mais simples e pode substituir a EAA e ICP-OES na determinação de
sódio em diversas matrizes, inclusive alimentos (CHEN et al., 2005; CHU; TAYLOR, 2016;
OLIVEIRA, T.; OLIVEIRA, A.; VILLA, 2017).
Desta forma, o desenvolvimento de novos métodos analíticos para a quantificação
de sódio, que agrupem procedimentos de preparo de amostras e técnicas analíticas
instrumentais simples e de fácil operação e manutenção, é de fundamental importância
para a diminuição de custos da análise e a simplificação do controle de qualidade deste
analito em alimentos processados.
Ante ao exposto, o uso da extração em fase aquosa, usando água ultrapura como
solvente extrator como procedimento de preparo de amostras e a fotometria de chama
como técnica analítica instrumental, pode ser uma alternativa simples, versátil, barata e
quimicamente verde a ser aplicada para a determinação de sódio em alimentos
processados infantis.
Considerando os aspectos citados anteriormente, fica demonstrada a relevância
do presente trabalho, cujo objetivo desenvolver um método analítico simples e de baixo
custo, para a determinação da concentração de sódio em alimentos infantis, utilizando
como preparo de amostras a extração em fase aquosa e, para a quantificação a
fotometria de chama.
O tema da presente dissertação será tratado nos capítulos: 1 e 2. O Capítulo 1
aborda as considerações gerais sobre o assunto. O Capítulo 2 apresenta o artigo
intitulado “Desenvolvimento de um procedimento de preparo de amostra para a
determinação da concentração de sódio em alimentos processados infantis” que foi
redigido conforme norma do periódico científico internacional Food Analytical Methods ao
qual o artigo foi submetido para publicação.
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2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Importância do sódio no organismo humano
A osmose é um processo passivo pelo qual a água se difunde de áreas de baixas
concentrações, para aquelas de altas concentrações desse solvente. O sódio tem função
importante nesse processo, protegendo o organismo contra a perda excessiva de líquido.
A água pode ser transportada com gasto de energia através das membranas pelo
cotransportador Na+ - glicose, o transporte de dois íons Na+ e uma molécula de açúcar
está relacionado ao influxo de 210 moléculas de água. Esse mecanismo é um transporte
ativo secundário que pode estar associado a quase metade da absorção de água diária
pelo intestino delgado. O sódio atua também na prevenção da irritabilidade regular dos
músculos e da permeabilidade das células (RAFF; LEVITZKY, 2012; REBECCHI;
FERNANDES, 2008).
O sódio é, quantitativamente, o cátion principal do líquido extracelular, constituindo
juntamente com ânions associados, cerca 90% destes solutos. Esse elemento está
relacionado na maioria das vezes, ao cloreto e ao bicarbonato, na regulação do equilíbrio
ácido-básico. Aproximadamente um terço do teor de sódio presente no organismo se
encontra na porção inorgânica do esqueleto (REBECCHI; FERNANDES, 2008;
WIDMAIER; RAFF; STRANG, 2006).
O transporte ativo do Na+ e K+ compõe um dos processos que consomem energia
no organismo. Em média, esse mecanismo consome cerca de 24% da energia celular,
valor que chega a 70% nos neurônios. Esse processo ocorre por meio do mecanismo
bomba de sódio-potássio-ATPase, regula a concentração desses elementos intra e
extracelular, bombeando íons potássio para dentro da célula e íons sódio para fora
(Figura 1). O bombeamento também estabiliza o volume de água intracelular e é a base
do sistema de transmissão de sinais nervosos por todo o sistema nervoso (GUYTON;
HALL, 2011; WILLIAM; GANONG, 2010).
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Figura 1: Representação do mecanismo de funcionamento da bomba sódio-potássio
Fonte: GUYTON; HALL, 2011.
O transporte ativo trata-se de uma bomba eletrogênica, que transfere três cargas
positivas para o exterior da célula para cada duas cargas que transfere para o interior da
célula, por consequência, esse mecanismo possui uma relação de acoplamento de 3:2,
sendo detectada em todas as partes do organismo. A bomba de sódio-potássio catalisa a
hidrólise do ATP em difosfato de adenosina (ADP) e utiliza a energia para retirar três íons
de Na+ da célula e transportar dois íons de K+ para dentro da célula, para cada molécula
de ATP hidrolisada (WILLIAM; GANONG, 2010).
Em algumas situações, o transporte ativo de Na+ está associado ao transporte de
outras moléculas e, denomina-se como transporte ativo secundário. Nas células do
intestino delgado, as membranas luminais contêm um simportador, que transporta a
glicose para o interior da célula, somente, quando o Na+ liga-se à proteína e é
transportado ao mesmo tempo para o interior da célula. Através das células, a glicose é
transportada ao sangue circulante. No coração, o sódio-potássio-ATPase influencia
indiretamente o deslocamento do Ca2+. Um antiportador nas membranas das células
musculares cardíacas regularmente troca o Ca2+ intracelular pelo Na+ extracelular
(WILLIAM; GANONG, 2010).
A ação da pressão sanguínea sobre a excreção de sódio e de água é um dos
sistemas mais básicos e ativos para a manutenção do balanço entre o sódio e a água,
bem como, para o controle do volume sanguíneo e do líquido extracelular. A concentração
mínima de sódio no organismo adulto, para seu funcionamento adequado, ainda não foi
exatamente definida, mas estima-se em cerca de 200 a 500 mg/dia. Desta forma, o
adequado equilíbrio das concentrações de sódio, em qualquer parte do organismo
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humano, é de vital importância (BANNWART; SILVA; VIDAL, 2014; GUYTON; HALL,
2011).
As doenças causadas pelo déficit e excesso de sódio estão interligadas com o
volume de água no organismo. Em condições normais, o teor de sódio plasmático pode
variar 135 a 145 mEq L-1, sendo que concentrações abaixo desses ocorre um distúrbio
hidroeletrolítico denominado hiponatremia. Rápidas variações nos níveis de volume
extracelular, causada pela hiponatremia, podem provocar efeitos significativos na função
dos órgãos e tecidos, principalmente no cérebro, podendo causar desorientação,
náuseas, letargia, sintomas neurológicos e edema das células cerebrais. Caso ocorra
uma ligeira queda na concentração de sódio, em níveis de 115 a 120 mmol/L, o indivíduo
pode ser levado ao coma, sofrer dano cerebral permanente e até a morte. Quando a
hiponatremia ocorre de forma lenta, outros tecidos e o cérebro respondem transportando
cloreto, potássio, sódio e solutos organismos das células para o líquido extracelular,
atenuando o fluxo osmótico de água para as células, causando o inchaço dos tecidos
(BARROS et al., 2006; GUYTON; HALL, 2011; VIEIRA NETO; MOYSÉS NETO, 2003).
A hipernatremia é caracterizada, quando a concentração de sódio plasmático
ultrapassa 145 mEq L-1, e é menos frequente do que a hiponatremia, sendo mais comum
em pacientes muito jovens, muito velhos e doentes, que não tenham condição de ingerir
líquido em resposta ao aumento de osmolalidade (NETO, O.; NETO, M., 2003). A elevada
ingestão de sódio resulta no aumento dos níveis de sódio sérico seguido por expansão do
volume de líquido extracelular. Essa elevação está associada a doenças
cardiovasculares. Estima-se que 49% das doenças coronarianas e 62% dos casos de
acidente vascular cerebral sejam provocadas pela elevada pressão sanguínea. A elevada
concentração de sódio na dieta também está associada ao câncer gástrico, insuficiência
renal, distúrbios no sistema nervoso central e osteoporose (BANNWART; SILVA; VIDAL,
2014; DOYLE; GLASS, 2010; MIZÉHOUN-ADISSODA et al., 2017).
2.2. Legislação nacional e internacional sobre o teor de sódio em alimentos
Por muitas décadas, a adição de cloreto de sódio nos alimentos foi vista como
mecanismo que auxiliava na prevenção da saúde pública, tendo em vista suas
características de limitar o crescimento de microrganismos patogênicos e organismos
deteriorantes nos alimentos. No entanto, nos últimos anos a ingestão de cloreto de sódio
aumentou consideravelmente, devido ao elevado consumo de alimentos
ultraprocessados, invertendo o conceito de décadas passadas. O sal (cloreto de sódio,
NaCl) é visto atualmente como ameaça para a saúde pública, pois está associado a
19
doenças renais, cardiovasculares, hipertensão dentre outras. Diante desse cenário,
autoridades do mundo todo vêm discutindo formas para a redução da ingestão de sódio
da população (HE; MACGREGOR, 2007; KOTCHEN et al., 2013).
As primeiras iniciativas para a redução de sal na dieta da população ocorreram em
1970, na Finlândia, através de parceiras com as principais empresas do ramo alimentício
e, principalmente, pela conscientização da população por meio de campanhas
publicitárias realizadas pelos principais veículos de comunicação do país. Em 2002, a
presença de cloreto de sódio na excreção urinária diminuiu de 5200 mg por dia para 4000
mg por dia em homem e, cerca de 4200 mg por dia a níveis menores de 3000 mg por dia,
em mulheres no país (KARPPANEN; MERVAALA, 2006; KOTCHEN et al., 2013).
No Brasil, a Resolução - RDC Nº 360, de 23 de dezembro de 2003, estabelece
obrigatoriedade para a identificação do percentual de sódio nas embalagens de alimentos
com concentrações acima de 0,5 mg de sódio, na porção do alimento embalado, sendo o
valor diário recomendado pela mesma de 2.400 mg. A Resolução Nº 24, de 15 de junho
de 2010 da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), que dispõe sobre a oferta,
propaganda, publicidade, informação e outras práticas similares, cujo objetivo seja a
divulgação e a promoção comercial de alimentos, define que o alimento com elevada
concentração de sódio é aquele que possui em sua formulação um teor igual ou superior
a 400 mg de sódio por 1000 mg ou 1000 ml na forma como está exposto à venda, sendo
exigido que em propaganda, oferta, publicidade e, outras práticas de promoção comercial
de alimentos, o produto alimentício, com elevada concentração de sódio, deve vir com
alerta ao consumidor sobre os perigos do consumo excessivo, a partir da seguinte
mensagem "O (nome/ marca comercial do alimento) contém muito sódio e, se consumido
em grande quantidade, aumenta o risco de pressão alta e de doenças do coração"
(BRASIL, 2003b, BRASIL, 2010).
O Ministério da Saúde (MS), associado com a Associação Brasileira da Indústria
de trigo (ABITRIGO), Associação Brasileira das Indústrias de Massas Alimentícias
(ABIMA), Associação Brasileira das Indústrias de Alimentação (ABIA) e a Associação
Brasileira da Indústria de Panificação e Confeitaria (ABIP) assinaram um termo para
estabelecer metas para a redução da adição de sódio nos alimentos processados, sendo
a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) a responsável pelo monitoramento
da redução das concentrações de sódio nesses alimentos. Em 2017, o Ministério da
Saúde assinou um novo acordo para os próximos cinco anos (2017-2022) com a
Associação Brasileira das Indústrias da Alimentação (ABIA), tendo a meta de reduzir
cerca de 28,5 toneladas de sódio da alimentação brasileira e, a primeira categoria de
20
alimentos a ser reduzido são as massas instantâneas, bisnaguinhas e pães (BRASIL,
2015; BRASIL, 2017).
Em 2005, foi criado o grupo World Action on Salt and Health (WASH), com a
finalidade de reduzir o consumo de cloreto de sódio em todo o mundo, através de
parcerias com os governos e indústrias alimentícias, reduzindo a adição de sal em
alimentos processados e conscientizando o consumidor sobre os riscos da elevada
ingestão de sal. Na Hungria e em Portugal, os governos implantaram impostos sobre
alimentos com alta concentração de sal e a medida resultou numa queda de 26% no
consumo de lanches salgados, além da redução de até 85% do teor de sal em diversos
alimentos. O principal motivo das mudanças se deu pelo aumento de preço dos alimentos
alvo, seguido da conscientização dos consumidores sobre a relação da alta ingestão de
sódio e danos à saúde (HE; MACGREGOR, 2007; KLOSS et al., 2015).
No mesmo ano, o Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos Estados
Unidos da América recomendou para sua população valores diários de ingestão de 2300
mg de sódio ou 5800 mg de sal, e para grupos especiais (indivíduos diabéticos,
hipertensos, portadores de doenças renais crônicas e etc.) valores abaixo de 1500 mg de
sódio ou 3800 mg de sal por dia. Na Inglaterra e no País de Gales, o governo traçou uma
meta de redução de sódio para 2400 mg de sódio por dia até 2012. A meta global
estabelecida pela Organização Mundial de Saúde (OMS) é reduzir o consumo diário de
sódio para 2000 mg até 2025 (KOTCHEN et al., 2013).
Em 2014, a Organização Pan-americana de Saúde (OPAS) reuniu seus membros
no seu 53° Conselho Diretor e apoiou por unanimidade um Plano de Ação para
Prevenção da Obesidade em Crianças e Adolescentes. O objetivo é criar um modelo de
perfil nutricional para a OPAS, através de pesquisas e consultas a especialistas da
Organização Mundial de Saúde (OMS), que possui diretrizes atualizadas sobre a máxima
ingestão diária de elementos nutricionais críticos para a saúde pública, como por exemplo
sódio, gorduras e açúcares (PAHO, 2016).
Atualmente, a Organização Mundial de Saúde (OMS) recomenta ingestão diária de
2000 mg de sódio ou de 5000 mg de cloreto de sódio por dia. Esses valores são
ajustados para baixo, quando se trata de crianças e adolescente de 2-15 anos de idade,
de acordo com as necessidades energéticas do organismo (SINGH; CHANDORKAR,
2016; WHO, 2012).
21
2.3. Procedimentos de preparo de amostras e técnicas analíticas utilizadas na
determinação de sódio em alimentos
A determinação de espécies metálicas em matrizes alimentares consiste em duas
etapas fundamentais: a disponibilização/isolamento do analito via diferentes
procedimentos de preparo de amostra e a posterior quantificação através de técnicas
clássicas ou instrumentais. O procedimento de preparo de amostras é a etapa onde se
encontra maiores dificuldades analíticas, pois são necessárias transformações na matriz,
de estado complexo, para uma forma que facilite a detecção do analito pelas técnicas de
quantificação. Os procedimentos oficiais de preparo de amostras para quantificação de
espécies metálicas em alimentos consistem na decomposição da fração orgânica da
amostra, sendo que a eliminação da matéria orgânica pode ser feita por calcinação (via
seca) ou por digestão, em misturas de ácidos com alto poder oxidante (via úmida)
(GONÇALVES, 2006; IAL, 2008; LEITE, 2008).
A decomposição por via seca baseia-se na queima da fração orgânica da amostra
com oxigênio do ar, em forno mufla, obtendo-se um resíduo inorgânico na forma de cinza
solúvel em água e ácidos inorgânicos. Este procedimento é considerado relativamente
simples e de baixo custo e apresenta como vantagem a calcinação de uma grande
quantidade de amostra tendo como resultado uma pequena quantidade de cinzas solúveis
e livres de matéria orgânica. Porém, apresenta como desvantagens as perdas do analito
por volatilização e para a superfície do cadinho e o elevado tempo de decomposição
(KRUG, 2006).
A decomposição por via úmida consiste em converter os componentes da matriz
em sua forma química simples, utilizando ácidos minerais oxidantes. Em geral, a
suspensão da amostra em ácido é aquecida por condução ou micro-ondas até que a
dissolução seja considerada completa pelo total desaparecimento de uma fase sólida
(SKOOG et al., 2007). Este procedimento é o mais utilizado, porém apresenta como
principal desvantagem o uso de reagentes tóxicos e de alta periculosidade.
Outro procedimento de preparo de amostras, que pode ser usado como alternativa
frente aos convencionais ou clássicos, é a extração. A extração fundamenta-se na
transferência de um soluto presente em uma fase para outra fase e, normalmente, tem
como objetivo principal isolar ou concentrar a espécie de interesse, ou separá-la das
espécies interferentes para a posterior quantificação (HARRIS, 2006). Alguns autores
utilizaram este procedimento para quantificação de metais em alimentos, tais como,
22
conservas, produtos cárneos e molhos (CHEN et al. 2005; CHU; TAYLOR 2016;
OLIVEIRA et al., 2017).
A quantificação de sódio em alimentos pode ser realizada de duas maneiras:
diretamente, a partir da determinação de sódio, ou indiretamente, pela quantificação com
base na concentração de cloreto e posterior conversão em sódio, considerando que o
sódio presente na amostra está na forma de cloreto de sódio (CASTANHEIRA et al.,
2009; PLOEGAERTS; DESMET; KRIEKEN, 2016). As técnicas analíticas comumente
utilizadas para a determinação de sódio em alimentos de forma direta encontradas na
literatura são: espectrometria de emissão atômica com plasma indutivamente acoplado
(ICP-OES) e espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado (ICP-MS)
(BUZZO et al., 2014; MIR-MARQUÉS et al., 2015), fotometria de chama (FC) (MARTINEZ
et al., 2015; OLIVEIRA et al., 2017; SINGH; CHANDORKAR, 2016) e espectrofotometria
de absorção atômica em chama (FAAS) (HWANG et al., 2017).
Os métodos indiretos comumente utilizados na determinação de sódio em
alimentos são: titulação termométrica (TET) e cromatografia líquida de troca iônica (CTI)
(PLOEGAERTS; DESMET; KRIEKEN, 2016), titulação de precipitação pelo método de
Mohr (KAMENÍK et al., 2017), titulação potenciométrica (CAPUANO et al., 2013) e
eletrodo seletivo de íons cloreto (PLÁCIDO et al., 2012).
2.4. Validação de métodos analíticos
O estudo pelo qual se estima a eficiência de um método para as aplicações
analíticas praticadas é denominada validação. A validação assegura que um novo
método, adaptações em metodologias já validadas, uso de diferentes equipamentos ou
implementação de um método conhecido não normalizado gere informações confiáveis
sobre a amostra com um nível de incerteza aceitável (RIBANI et al., 2004; TAVERNIERS;
LOOSE; BOCKSTAELE, 2004; VALENTINI; SOMMER; MATIOLI, 2007).
A validação também é aplicada para demonstrar o controle de qualidade de um
laboratório, para a verificação da fidelidade dos resultados de um analista e registros de
novos produtos como pré-requisito para o mesmo obter seu credenciamento nas agências
certificadoras (LEITE, 2008; RIBANI et al., 2004; TAVERNIERS; LOOSE; BOCKSTAELE,
2004).
Algumas agências regulamentadoras brasileiras e protocolos internacionais
definem o termo validação de método: segundo Eurachem Guide (2014), “A validação é
basicamente o processo de definição de um procedimento analítico confirmando que o
23
método em consideração possui capacidades consistentes com o que a aplicação
requer”.
De acordo com a FDA (2011): A validação do processo é definida como a coleta e avaliação de dados, desde a fase de projeto do processo até a produção comercial, que estabelece evidências científicas de que um processo é capaz de fornecer produtos de qualidade. A validação do processo envolve uma série de atividades que ocorrem ao longo do ciclo de vida do produto e do processo.
Fonte: FDA, 2011
Conforme Brasil (2003a), “A validação deve garantir, por meio de estudos
experimentais, que o método atenda às exigências das aplicações analíticas,
assegurando a confiabilidade dos resultados”.
Segundo o INMETRO (2017), a “Validação é a confirmação, por exame e
fornecimento de evidência objetiva de que os requisitos específicos para um determinado
uso pretendido são atendidos e, a verificação na qual os requisitos especificados são
adequados para um uso pretendido”.
Existem dois tipos de validação: a validação no laboratório (“in house validation”) e
a validação completa (“full validation”). A primeira fundamenta-se em analisar as etapas
de validação em um único laboratório e, pode ser considerada como uma etapa preliminar
à validação completa, que inclui, além das etapas da validação “in house”, a verificação
do desempenho do método em uma determinada matriz em vários laboratórios,
caracterizada por um estudo interlaboratorial (RIBANI et al., 2004).
A validação necessita de um planejamento contínuo, durante seu
desenvolvimento, sendo necessário pesquisas que considerem a matriz amostral, a faixa
de concentração do analito a ser trabalhada e com que frequência o método será aplicado
no laboratório, para definir quais serão os parâmetros de validação a serem avaliados. Os
parâmetros analíticos frequentemente estudados para a validação de uma metodologia
são: seletividade/especificidade; linearidade; limite de detecção; limite de quantificação;
precisão; exatidão e robustez (INMETRO, 2017; RIBANI et al., 2004).
2.4.1. Seletividade/especificidade
A seletividade é a capacidade de determinar, com precisão, o analito de interesse
na presença de outros componentes presentes na amostra que possam influenciar na
resposta analítica. Sendo assim, esse parâmetro avalia o grau de interferência de
espécies químicas, que fazem parte naturalmente da composição da matriz, ou são
produtos de degradação e impurezas, bem como outras espécies de características
24
similares presentes na amostra (RIBANI et al., 2004; TAVERNIERS; LOOSE;
BOCKSTAELE, 2004).
Os parâmetros especificidade e seletividade são definidos como idênticos por
alguns autores, enquanto outros dão definições específicas para ambos. A especificidade
se define pela capacidade de um método em detectar um único analito, sem a
interferência de outras espécies presentes na amostra, enquanto que, se o método
produz resposta específica para diferentes analitos com características em comum, o
mesmo é considerado seletivo. Geralmente, se utiliza o termo seletividade, tendo em vista
que há poucos métodos que determinem apenas uma única substância (RIBANI et al.,
2004; TAVERNIERS; LOOSE; BOCKSTAELE, 2004).
A seletividade pode ser estabelecida por meio de leituras de padrões ou materiais
de referência, curva de efeito de matriz, teste de adição e recuperação da espécie
pesquisada em amostra com ou sem o analito. Para o método ser considerado seletivo,
os resultados obtidos devem estar próximos de 100%, em referência ao valor adicionado
(adição e recuperação) ou concentração conhecida (padrões e material de referência
certificado). Outra forma de avaliar esse parâmetro é através de comparação dos
resultados obtidos com a combinação de vários fatores, seguida de determinação por
outras técnicas comprobatórias (BRITO et al., 2003; RELACRE, 2013).
2.4.2. Linearidade
A linearidade é a capacidade de um método de obter resultados linearmente
proporcionais à concentração do analito, em um determinado intervalo de concentrações.
Este parâmetro pode ser avaliado pelo método visual e/ou pela análise do coeficiente de
correlação linear (BRASIL, 2003a; BRITO et al., 2003, INMETRO, 2017).
O método visual é baseado na observação de valores discrepantes entre os níveis
de concentração a partir da construção de um gráfico com as respostas (sinal analítico)
na coordenada y e as concentrações na coordenada x. Um método com boa linearidade
apresenta sinal analítico em proporção direta com as concentrações da substância em
estudo. A ausência de valores discrepantes estabelece uma relação linear aparente que é
confirmada a partir da regressão linear. A regressão linear fornece uma equação da reta
(Equação 1), que se aproxima dos pontos em estudo com coeficientes angular e linear a e
b e coeficiente de correlação r. Este último expressa a relação de x e y na curva, onde o
valor ideal é 1. (BRASIL, 2003a; LEITE, 2008; RIBANI et al., 2004).
25
y= aΧ + b (1)
Onde:
y= sinal analítico;
a= coeficiente linear (inclinação da reta);
Χ= concentração do analito;
b=coeficiente angular (intercepto da reta).
Para a construção da reta é recomendado no mínimo cinco pontos, sem incluir o
ponto zero para evitar possíveis erros associados (LEITE, 2008).
A ANVISA estabelece um coeficiente de correlação mínimo 0,99 e o INMETRO um
valor acima de 0,90 (BRASIL, 2003a; INMETRO, 2003). De acordo com o INMETRO
(2017), o coeficiente de correlação é um bom indicador do quando a reta pode ser
classificada como adequada, porém não conclusivo. Desta forma, se avalia a tendência
no gráfico de resíduos para verificar se o parâmetro de linearidade está ou não adequado
(INMETRO, 2017).
2.4.3. Limite de detecção e de quantificação
O limite de detecção (LD) é a observação da menor concentração do analito, que
pode ser detectada, sem a necessidade de quantificação. Já o limite de quantificação
(LQ) é a determinação da menor concentração do analito, que pode ser quantificada, com
níveis aceitáveis dos parâmetros de precisão e exatidão (RIBANI et al., 2004;
TAVERNIERS; LOOSE; BOCKSTAELE, 2004).
Os métodos utilizados normalmente para determinação dos LD e LQ são: método
visual (somente para o LD), replicatas em branco analítico e por método relacionado aos
parâmetros da curva analítica (RIBANI et al., 2004; TAVERNIERS; LOOSE;
BOCKSTAELE, 2004).
O método visual baseia-se na adição de concentrações conhecidas e
decrescentes da espécie pesquisada até a menor concentração observada que possa ser
identificada entre o ruído e o sinal analítico (BRASIL, 2003a; RIBANI et al., 2004).
Para se determinar o LD e LQ, pelo método de replicata do branco, é necessário
no mínimo dez replicatas do branco e são observados, a partir das equações 2 e 3 para
LD e LQ, respectivamente. Esse experimento é realizado quando o branco apresenta
valores diferentes de zero (TAVERNIERS; LOOSE; BOCKSTAELE, 2004).
26
(2)
(3)
Onde:
X = valor médio das medições do branco;
s = desvio padrão das medições de branco;
A = inclinação da curva ou coeficiente angular da curva analítica obtida por
concentrações próximas ao menor valor detectável.
Em casos em que o valor do branco analítico é igual a zero, os LD e LQ são
determinados pela adição de baixas concentrações conhecidas nos brancos analíticos e
observado o menor nível de concentração detectável. Estes podem ser expressos pelas
equações 4 e 5 (RIBANI et al., 2004; TAVERNIERS; LOOSE; BOCKSTAELE, 2004)).
(4)
(5)
Onde:
s = estimativa do desvio padrão dos brancos, da equação da linha de regressão ou
do coeficiente linear da equação;
A = inclinação ou coeficiente angular da curva analítica.
2.4.4. Precisão
A precisão é a proximidade entre os valores determinados, exatamente, nas
mesmas condições experimentais, ou seja, quanto mais próximos os valores estiverem
entre si, maior será a precisão. Normalmente esse parâmetro é analisado pela repetição
de leituras em réplicas da amostra (SKOOG et al., 2007).
27
A precisão pode ser verificada em três níveis: reprodutibilidade, repetitividade e
precisão intermediária (BRASIL, 2003a; RIBANI et al., 2004).
A reprodutibilidade apresenta a precisão interlaboratorial, onde o experimento é
feito em diferentes condições operacionais de uma mesma matriz e metodologia (BRASIL,
2003a; RIBANI et al., 2004).
A repetitividade avalia a precisão através de análises realizadas nos mesmos
laboratório, dia, instrumento e analista, ou seja, nas mesmas condições experimentais. O
INMETRO determina que sejam realizadas de seis a quinze repetições, para o cálculo do
desvio padrão relativo (INMETRO, 2017). A ANVISA recomenda que sejam feitas nove
leituras em faixa linear do método em três concentrações, sendo essas em nível baixo,
média e alta com três repetições cada (BRASIL, 2003a).
A precisão intermediaria baseia-se em experimentos realizados em distintas
condições operacionais, como: dia, instrumentação e analista. Sendo que a ANVISA
recomenda que as determinações sejam feitas, no mínimo, dois dias diferentes com
analistas distintos (BRASIL, 2003a).
A precisão pode ser expressa em valor numérico através do desvio padrão
amostral (s) e desvio padrão relativo (DPR) ou coeficiente de variação (CV), de acordo
com as equações 6 e 7 (RIBANI et al., 2004; TAVERNIERS; LOOSE; BOCKSTAELE,
2004).
(6)
(7)
Onde:
= média aritmética do número total de medidas;
= valor individual de cada medida;
= número total de medições.
28
2.4.5. Exatidão
A exatidão é a grau de aproximação entre o valor experimental de um método em
estudo e o valor real ou de referência e está relacionada com o erro absoluto de uma
determinação. Os métodos mais utilizados para avaliar este parâmetro são: uso de
material de referência certificado (MRC), a comparação do método pesquisado com um
método oficial e por ensaios de adição e recuperação (BRITO et al., 2003; SKOOG et al.,
2007).
Nos ensaios de adição e recuperação (Rec%) é adicionado (fortificação) o analito
estudado na matriz analisada em, no mínimo, três níveis de diferentes concentrações do
analito dentro do intervalo da faixa de trabalho do método. O valor de recuperação é
obtido pela equação 8 (RIBANI et al., 2004; TAVERNIERS; LOOSE; BOCKSTAELE,
2004).
(8)
Onde:
C1 = concentração média do analito determinado na amostra fortificada;
C2 = concentração teórica.
Os valores observados nas recuperações em estudo devem ser comparados com
as taxas de recuperação estabelecidas pelas agências certificadas.
2.4.6. Robustez
A robustez é a capacidade de um método de manter respostas estáveis, apesar de
pequenas variações nas condições experimentais. Estas variações podem ser em
diferentes dias, equipamento, analistas, reagentes, alterações no preparo de amostra ou
material utilizado. Se os resultados obtidos pelo método não apresentarem variações
significativas, a metodologia é considerada robusta (BRASIL, 2003a; INMETRO, 2017).
A robustez pode ser obtida de forma simples através do teste de YOUDEN. Este
teste baseia-se na aplicação de determinado número de experimentos (no máximo até
oito é o recomendado) sobre uma matriz, realizados de acordo com um plano de controle
de fatores, que podem causar variações no procedimento experimental e como
consequência flutuações dos resultados obtidos. Esse método também permite conhecer
29
a robustez de um método, maior será a aceitação do mesmo em referência à sua precisão
(RELACRE, 2013).
REFERÊNCIAS
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CAPÍTULO 2: ARTIGO
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EXTRAÇÃO EM FASE AQUOSA COMO PROCEDIMENTO DE PREPARO DE
AMOSTRAS PARA A DETERMINAÇÃO DE SÓDIO EM ALIMENTOS
PROCESSADOS INFANTIS
Francisca Graciele Gomes Pedro¹, Anne Carolline Borges dos Passos¹, Ricardo Dalla
Villa², Adriana Paiva de Oliveira*¹
¹Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia de Mato Grosso (IFMT), Campus
Cuiabá - Bela Vista, Av. Juliano da Costa Marques s/n, Bela Vista, 78050-560, Cuiabá –
MT, Brasil.
² Departamento de Química, Instituto de Ciências Exatas e da Terra (ICET), Universidade
Federal de Mato Grosso (UFMT), Campus Cuiabá, Av. Fernando Correa da Costa 2367,
Boa Esperança, 78000 – 000, Cuiabá – MT, Brasil.
*Autor de correspondência. (Adriana Paiva de Oliveira) Endereço: Instituto Federal de Educação, Ciência e
Tecnologia de Mato Grosso (IFMT) – Campus Cuiabá Bela Vista, Av. Juliano da Costa Marques s/n, Bela
Vista, 78050-560, Cuiabá – MT, Brazil. Telefone: + 55 65 3318-5172
E-mail: [email protected].
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Resumo
Este trabalho objetivou desenvolver um procedimento de preparo de amostras utilizando extração em fase
aquosa para determinação de sódio (Na) em salgadinhos de trigo (ST) e de milho (SM), papinhas
industrializadas para bebês (PB) e macarrão instantâneo (MI). O procedimento consistiu basicamente na
extração com água ultrapura, agitação em vortex, centrifugação e quantificação por fotometria de chama
(FC). A precisão e exatidão foram avaliadas pelos testes de adição e recuperação, comparação com a
decomposição por via úmida, método de Mohr (MM) e diferente instrumento. Teste de Youden foi utilizado na
avaliação da robustez tendo como variáveis: massa da amostra, velocidade de centrifugação e tempo de
agitação. Diferenças significativas foram verificadas (p≤0,05) na comparação com o MM e outro
instrumento para PB e MI e, podem ser atribuídas a maior sensibilidade da FC e erros instrumentais. As
recuperações variaram entre 84,13-119,58% para FC e 89,50-107,65% para MM com desvios padrões
relativos menores que 11%. O tempo de agitação e a velocidade de centrifugação apresentaram efeito
positivo na robustez. A aplicação do procedimento foi verificada em diferentes amostras e, os resultados
variaram de 128,64 a 300,42 mg de Na/25 g para ST e SM; 1,51 a 81,45 mg de Na/ 115 g para PB e; 1117,54
a 1961,99 mg de Na/85 g para MI e, apresentou discrepância entre os valores obtidos e rotulados. Neste
contexto, a extração em fase aquosa pode ser uma alternativa simples, de baixo custo e sem uso de reagentes
tóxicos para quantificação de Na em diferentes concentrações frente aos procedimentos tradicionais.
Palavras-chave: alimento; metal; cloreto de sódio; composição; validação.
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Abstract
This work aimed to develop a procedure for the sample preparation using aqueous phase extraction for the
determination of sodium (Na) in wheat snacks (WS), corn chips (CC), baby food (BF) and instant noodles
(IN). The procedure consisted in the ultrapure water extraction, vortex agitation, centrifugation and sodium
quantification by flame photometry (FP). The accuracy and precision were evaluated by means of the
addition and recovery tests, comparison with wet decomposition, Mohr method (MM) and different
instrument. Youden test was used in the evaluation of robustness having as variables: sample mass,
centrifugation speed and stirring time. Significant differences were observed (p ≤ 0.05) in comparison with
MM and another instrument for BF and IN which were sensitivity of the FP and instrumental errors. The
recoveries varied between 84.13-119.58% for FP and 89.50-107.65% for MM with relative standard
deviations less than 11%. The stirring time and centrifugation speed had a positive effect on robustness. The
application of the procedure was verified in different samples and, the results ranged from 128.64 to 300.42
mg Na / 25 g for WS and CC; 1.51 to 81.45 mg Na / 115 g to BF and; 1117.54 to 1961.99 mg of Na / 85 g for
IN and, presented a discrepancy between the values obtained and labeled. In this context, the aqueous phase
extraction can be a simple alternative, of low cost and without use of toxic reagents for sodium quantification
in different concentrations in relation to the traditional procedures.
Keywords: food, metal, sodium chloride, composition, validation.
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Introdução
Os hábitos alimentares de grande parte da população mundial vêm sendo modificados nas últimas
décadas e, o consumo de alimentos processados está cada vez mais conquistando espaço na dieta alimentar da
população, sendo estes muito apreciados pelos consumidores, principalmente crianças e adolescentes
(Kamenik et al. 2017; Pinheiro 2008; Ribeiro et al. 2013).
Os alimentos processados são comumente ingeridos junto ou substituindo as principais refeições
diárias e, correspondem por cerca de 80% do consumo diário de sódio em países desenvolvidos (Kamenik et
al. 2017; Ribeiro et al. 2013).
A primeira infância é a fase em que se inicia o desenvolvimento dos hábitos alimentares do ser
humano, bem como, o conhecimento das sensações gustativas e, o consumo excessivo de sódio nesse estágio
pode influenciar na preferência por alimentos salgados na vida adulta, elevando a probabilidade de
surgimento de doenças associadas ao excesso de sódio no organismo (Brion et al. 2008; Longo-Silva et al.
2017).
O sódio (Na) é um mineral essencial ao organismo humano principalmente na manutenção do
volume plasmático, equilíbrio ácido-base, regulação osmótica, funcionamento da bomba de sódio e
neurotransmissão (Damoradan et al. 2010; Ploegaerts et al. 2016). A elevada concentração de sódio no
organismo humano está associada a doenças cardiovasculares, hipertensão, osteoporose, câncer gástrico,
distúrbios renais, dentre outras. Neste contexto, pesquisadores e autoridades de diferentes áreas da ciência têm
buscado alternativas para redução de sódio na dieta da população mundial, a fim de diminuir os danos
causados à saúde pública (Doyle e Glass 2010; Kotchen et al. 2013).
A Organização Mundial da Saúde (OMS) recomenda a ingestão diária de sódio para um adulto de
2000 mg e, para crianças não há um valor estabelecido, apenas a indicação que o mesmo deve ser ajustado
para baixo com base nos requisitos de energia das crianças em relação aos dos adultos. A Sociedade Europeia
de Pediatria, Gastroenterologia, Herpetologia e Nutrição (ESPGHAN) também não apresenta recomendações
específicas apenas indica como orientação a não adição de cloreto de sódio aos alimentos durante a infância.
No Brasil, a legislação brasileira recomenda ingestão diária de 2400 mg de sódio (Brasil 2003b; Cribb et al.
2012; Liem 2017; Singh e Chandorkar 2016; WHO 2012;).
Desta forma, a fim de trazer metodologias simples e eficientes para a determinação de sódio em
alimentos processados, bem como, o controle de qualidade destes produtos em relação ao teor de sódio
permitido pelos órgãos reguladores, o desenvolvimento de métodos analíticos para a quantificação do teor de
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sódio em alimentos processados é de relevância e tem sido descritos na literatura por diversos autores (Becker
et al. 2011; Chekri et al. 2012; Chu e Taylor 2016; Ferreira et al. 2000; Martinez et al. 2015; Oliveira et al.
2017; Ploegaerts et al. 2016).
A determinação de espécies metálicas em alimentos baseia-se em duas etapas, o preparo de amostra
e, a posterior detecção pelas técnicas de quantificação. A primeira etapa é considerada a de maior grau de
dificuldade, devido a necessidade de transformação química da amostra, na maioria dos casos e, geralmente é
feita por decomposição por via seca ou úmida (Gonçalves 2006; IAL 2008; Leite 2008). Porém, estes
procedimentos possuem desvantagens como, elevado tempo de preparo, perdas por volatilização, elevada
quantidade de resíduo gerado, uso de reagentes tóxicos de alto poder oxidante e a exposição do analista ao
ambiente insalubre (Krug 2006).
A elevada solubilidade da maioria dos sais de sódio em água (Mahan e Myers 1997; Silva et al.
2004), indica que o íon Na pode ser isolado da matriz sem a necessidade de transformações químicas
complexas, utilizando técnicas de extração. As técnicas de extração para a quantificação de espécies metálicas
podem ser uma interessante e eficiente alternativa de preparo de amostras frente aos procedimentos
tradicionais (Oliveira et al. 2012). Sendo assim, o uso da extração em fase aquosa como procedimento de
preparo de amostras para a determinação da concentração de espécies metálicas solúveis em água, como o
sódio, pode contribuir para a diminuição no uso de reagentes químicos tóxicos e geração de resíduos e, além
disso, ser compatível com a detecção por técnicas analíticas instrumentais e clássicas. Alguns autores
utilizaram este procedimento para quantificação de metais em alimentos, tais como, conservas, produtos
cárneos e molhos (Chen et al. 2005; Chu e Taylor 2016; Oliveira et al. 2017).
Ante ao exposto, este trabalho teve como objetivo desenvolver um procedimento de preparo de
amostras, utilizando a extração em fase aquosa, para determinação da concentração de sódio em salgadinhos
de milho e de trigo, macarrão instantâneo e papinha industrializada para bebês por fotometria de chama.
Material e métodos
Instrumentação
As medidas de massa para o preparo de soluções, reagentes e amostras foram feitas em uma balança
analítica (modelo 210, Bel Marck, Monza, Itália) com resolução de ± 0,0001g. Uma estufa com circulação
forçada de ar (Modelo Orion 515, Fanem®, São Paulo, Brasil) foi utilizada para secagem das amostras e, para
a decomposição via úmida foi utilizado um bloco digestor (Modelo A242, Quimis®, São Paulo, Brasil). No
preparo das amostras, utilizaram-se triturador de alimentos MIXER (Britânia, São Paulo, Brasil) e
41
liquidificador (Philips WALITA®, Minas Gerais, Brasil), agitador vortex (Labnet, São Paulo, Brasil) e
centrífuga refrigerada modelo 320R (Hettich, Föhrenstr, Alemanha). Micropipetas (KASVI® basic e
Peguepet®) de volumes ajustáveis foram utilizadas no preparo das soluções padrões e diluições das amostras.
Água ultrapura com resistividade 15 MΩ cm-1, obtida em um deionizador (Elix® Advantage pure water,
Type 2, Millipore, Molsheim, France), foi utilizada no preparo dos padrões analíticos, soluções e amostras.
Para a quantificação do analito foi utilizado um fotômetro de chama (Analyser®, modelo 910, São
Paulo, Brasil), empregando o gás liquefeito de petróleo (GLP) como combustível e ar atmosférico como
comburente. A taxa de aspiração das amostras e padrões analíticos foi ajustada em 2,0 ± 0,2 mL min-1. Para
os ensaios interlaboratoriais, envolvendo a comparação do procedimento de preparo de amostra proposto,
foram utilizados dois diferentes fotômetros de chama das marcas Digimed®, modelo DM-62, São Paulo,
Brasil e Analyser®, modelo 910, São Paulo, Brasil.
Reagentes, soluções e amostras
No preparo das soluções de lavagem de vidrarias foram utilizados Extran alcalino (Merck®), ácido
nítrico ((65% v:v, Qhemis®, São Paulo, Brazil), água corrente e ultrapura. A solução padrão estoque de 1000
mg L-1 de Na foi preparada a partir de cloreto de sódio sólido com ≥ 99,5 % de pureza (Qhemis®, São Paulo,
Brasil). A partir da solução estoque, foram preparadas soluções padrão de trabalho nas concentrações: 0,5;
1,0; 2,0; 2,5; 4,0; 5,0; 7,5; 10,0 mg L-1 de Na. Ácido nítrico de grau analítico (65% v: v, Qhemis®, São
Paulo, Brasil) e peróxido de hidrogênio (30% v: v, Synth®, São Paulo, Brasil) foram utilizados no preparo de
amostra por decomposição via úmida. Nitrato de prata (Qhemis®, São Paulo, Brasil) e indicador cromato de
potássio 5% (m:v) (Tec-larb®, São Paulo, Brasil) foram utilizados nas titulações de precipitação, utilizando o
método de Mohr.
As amostras de salgadinho de milho, salgadinho de trigo, papinhas industrializadas para bebês e
macarrão instantâneo de diferentes marcas e sabores foram coletadas em supermercados da cidade Cuiabá-
MT, no período de maio de 2016 a setembro de 2017. Todas as amostras coletadas estavam dentro do prazo
de validade, bem como, apresentaram coloração, odor e sabor característicos do alimento e, foram mantidas
em armazenamento em local seco até o momento da análise. Para a validação do método proposto, utilizou-se
uma marca e um sabor de cada alimento pesquisado e, posteriormente, aplicou-se o método validado em
diferentes marcas e sabores.
42
Procedimentos de preparo de amostras
Primeiramente, as amostras coletadas foram homogeneizadas (para a amostra macarrão instantâneo,
foi feito um mix com o macarrão e o tempero em pó contidos nas embalagens), reduzidas à amostra
laboratorial e, quando necessário para as amostras sólidas, pulverizadas e secas a 60 °C até peso constante em
estufa. Após este procedimento, 0,5 g das amostras de salgadinho de milho, salgadinho de trigo e macarrão
instantâneo e 1,5 g das amostras de papinhas industrializadas para bebês foram pesadas e submetidas aos
procedimentos de preparo de amostras descritos a seguir.
Para o procedimento de preparo por decomposição por via úmida, 0,5 g de amostra (salgadinho de
milho, salgadinho de trigo e macarrão instantâneo) e 1,5 g de papinha industrializadas para bebê foram
inseridas em tubos digestores e, em seguida, foram adicionados de 5,0 mL de HNO3 65% (v:v) e 1,0 mL de
H2O2 30% (v:v). Posteriormente, as amostras foram submetidas a aquecimento por condução em bloco
digestor a 120 °C, por aproximadamente 3 horas, para a decomposição da porção orgânica da matriz. Após
esta etapa, as amostras decompostas foram transferidas quantitativamente para balões volumétricos de 100
mL, completos até a marca de aferição com água ultrapura para posterior quantificação do analito.
No procedimento por extração em fase aquosa, 0,5 g de amostra de salgadinho de milho e de
salgadinho de trigo e 1,5 g de amostra de papinha industrializada infantil foram transferidos em tubos tipo
Falcon de 15 mL e adicionados 10 mL de água ultrapura. Para a amostra de macarrão instantâneo, 0,5 g da
amostra foi inserido em tubo tipo Falcon de 50 mL e adicionados 40 mL de água ultrapura. Em seguida, os
tubos foram agitados em sistema vortex por 2 minutos e, centrifugados a 4500 rpm (3300xg de força
centrifuga relativa) por 10 minutos a 25 °C (salgadinho de milho, salgadinho de trigo e macarrão instantâneo)
e a 35° C (papinhas industrializadas para bebês). Por fim, alíquotas do extrato sobrenadante foram retiradas
com auxílio de pipetas de Pasteur e, devidamente diluídas em água ultrapura, para posterior quantificação do
analito.
A quantificação de sódio foi feita por fotometria de chama e por titulação de precipitação, utilizando
o método argentométrico de Mohr como técnica analítica comparativa.
Validação e figuras de mérito
Para a determinação dos parâmetros instrumentais e figuras de mérito das quantificações realizadas
por fotometria de chama, foi utilizada uma curva analítica, obtida pelo método da padronização externa, na
faixa de concentração de 0,0; 0,5; 1,0; 2,0; 2,5; 4,0; 5,0; 7,5; 10,0 mg L-1 de Na.
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A linearidade instrumental foi calculada a partir do coeficiente de correlação linear (r) entre a
resposta instrumental e a concentração dos analitos observados pelo método da padronização externa (AOAC
2002). O Limite de Detecção Instrumental (LDI) e o Limite de Quantificação Instrumental (LQI) foram
obtidos a partir dos parâmetros da curva analítica, de acordo com Relacre (2013).
Para a avaliação do parâmetro seletividade, verificou-se possíveis interferentes nas matrizes
pesquisadas pelo método de quantificação fotometria de chama, foram elaboradas curvas de efeito matriz, na
mesma faixa de concentração utilizada nas fortificações do teste de adição e recuperação (INMETRO, 2017).
A precisão e a exatidão instrumental foram obtidas por meio do desvio padrão relativo (%DPR) das
respostas instrumentais obtidas por meio de 20 medidas sucessivas de um padrão analítico. A precisão
instrumental também foi obtida a partir de 15 medidas de um padrão da curva analítica e uma réplica de
amostra pesquisada, intercaladas durante as leituras das amostras.
A precisão e a exatidão do procedimento de preparo de amostra proposto foram verificadas pela
comparação de resultados obtidos por diferentes técnicas analíticas (fotometria de chama e a titulação de
precipitação) e diferentes fotômetros de chama localizados em laboratórios de diferentes instituições de
pesquisa, no caso, a UFMT e o SENAI-MT (Huber 2007; Taverniers et al. 2004).
A precisão e a exatidão do método também foram avaliadas por meio de teste de adição e
recuperação do analito, utilizando o procedimento proposto (extração em fase aquosa) e um procedimento
clássico (decomposição por via úmida). Para isso, 0,5 g das amostras de salgadinho de milho, salgadinho de
trigo e macarrão instantâneo e 1,5 g da amostra de papinhas industrializadas para bebês foram pesadas e
transferidas para tubos tipo Falcon de 15 mL (salgadinho de milho, salgadinho de trigo e papinhas
industrializadas para bebês) e de 50 mL (macarrão instantâneo).
Nas fortificações das amostras de papinha industrializada para bebê e macarrão instantâneo,
diferentes alíquotas de solução aquosa de Na com concentrações de 100 ou 1000 mgL-1 foram adicionadas
aos tubos, a fim de obter níveis de fortificação de 25, 50 e 75% da concentração inicial do analito presente nas
amostras. Já as fortificações das amostras de salgadinho de milho e salgadinho de trigo foram realizadas pela
adição de diferentes quantidades de cloreto de sódio sólido. Após a adição, o conteúdo dos tubos de Falcon
foi deixado em repouso por no mínimo 24 horas, à temperatura de 25 ± 3 °C, para favorecer a interação entre
o analito e as amostras. Após esse período, o procedimento de preparo de amostras por extração foi aplicado
às amostras fortificadas. Todos os ensaios de recuperação foram realizados em sextuplicata e acompanhados
de um branco analítico, para todas as matrizes avaliadas.
44
Para verificar possíveis diferenças significativas entre os resultados, foi aplicado o teste t de Student
(p ≤ 0,05) e utilizado o programa ASSISTAT® versão 7.7 beta (Silva e Azevedo, 2016).
A robustez foi avaliada por meio de mudanças nas condições operacionais utilizadas no
desenvolvimento do preparo de amostras, denominada condição nominal, utilizando-se um planejamento
fatorial fracionário do tipo 2n-1, sendo n, o número de variáveis. As variáveis estudadas, para avaliação da
robustez, foram massa da amostra (g), força centrífuga (xg) e tempo de agitação (s) e, os valores atribuídos
para cada variável, nos níveis baixo (-) e alto (+) de todas as matrizes pesquisadas estão descritos na Tabela 1.
Após a execução dos experimentos, foram calculados os efeitos das variáveis na determinação da
concentração sódio por meio do Teste de Youden, de acordo com as recomendações descritas por Relacre
(2013).
Tabela 1- Condições experimentais selecionadas para avaliar a robustez do método (n = 3).
Amostras
Variáveis estudadas
Massa da amostra (g)
Baixo (-) - alto (+)
Tempo de agitação (min)
Baixo (-) - alto (+)
Velocidade da força
centrifuga (xg)
Baixo (-) - alto (+)
Salgadinho de
milho 0,30 - 0,70 1,5 - 2,5 4000 - 5000
Salgadinho de
Trigo 0,30 - 0,70 1,5 - 2,5 4000 - 5000
Papinhas para
bebês 1,0 – 2,0 1,5 - 2,5 4000 - 5000
Macarrão
instantâneo 0,30 - 0,70 1,5 - 2,5 4000 - 5000
Condição
nominal/Papinhas
de bebês
1,5 2,0 4500
Condição
nominal/demais
amostras
0,5 2,0 4,500
A aplicação do procedimento de preparo de amostras proposto, foi realizada por meio da
quantificação de sódio em amostras de diferentes marcas e sabores, coletadas em supermercados da cidade de
Cuiabá, Mato Grosso, por fotometria de chama. Os resultados obtidos foram comparados com os valores
rotulados e com as Legislações Nacionais e Internacionais Vigentes.
Resultados e discussão
Na determinação por fotometria de chama, os valores de r foram superiores a 0,99 para todos os
ensaios realizados demostrando alta correlação linear entre o sinal analítico e as concentrações de 0,0 mg/L a
15,0 mg/L de sódio utilizadas. Os resultados dos limites de LDI e LQI foram 0,08 e 0,25 mg L-1,
45
respectivamente. Estes valores foram significativamente inferiores às concentrações observadas nas amostras,
indicando precisão e exatidão aceitáveis na faixa de trabalho utilizada.
Apenas a matriz papinha industrializada para bebês apresentou diferença ou possível efeito de
matriz, indicando que na matriz pode conter interferentes que aumentem ou diminuem o sinal instrumental,
afetando os resultados obtidos.
Os valores de %DPR obtidos pela medida de 20 leituras sucessivas de um padrão e 15 leituras de um
padrão e uma réplica de amostra pesquisada, intercaladas durante as leituras das amostras, foram inferiores a
5%, demostrando elevada precisão instrumental (Brasil 2003a).
Na comparação entre as técnicas analíticas de fotometria de chama e a titulação pelo método de
Mohr, utilizando o procedimento de extração em fase aquosa para as diferentes amostras, apenas as matrizes
de macarrão instantâneo e papinhas industrializadas para bebês apresentaram diferenças significativas (p ≤
0,05) (Tabela 2). Isto pode ser justificado devido à maior sensibilidade da técnica instrumental fotometria de
chama frente à técnica clássica de titulação de precipitação, que se trata de um método indireto de
quantificação de sódio. Porém, vale ressaltar que os %DPR obtidos para ambas as técnicas de quantificação
foram inferiores a 5%, indicando precisão nos resultados obtidos (Brasil 2003a).
Tabela 2: Resultados (valor médio ± %DPR) obtidos na comparação entre as
técnicas analíticas de fotometria de chama e titulação de precipitação pelo método
de Mohr utilizando o procedimento de preparo de amostra de extração em fase
aquosa.
Amostra
Fotometria de
chama
Método de
Mohr Unidade de
medida Média ± %DPR*
Macarrão
Instantâneo 2134a ± 2,5 1936b ± 0,2 mg de Na/85g
Salgadinho de
Trigo 254a ± 3,4 269a ± 1,8 mg de Na/25g
Salgadinho de
Milho 270a ± 1,2 262a ± 4,7 mg de Na/25g
Papinha Ind.
para Bebês 8,60b ± 0,7 11,04a ± 0,1 mg de Na/115g
a, b valores seguidos de letras diferentes na mesma linha significa que houve diferença estatisticamente significativa entre as amostras ao nível de 5% de significância pelo teste de t de Student.
* Desvio Padrão Relativo.
Na comparação da extração em fase aquosa com um procedimento oficial de preparo de amostra, a
decomposição por via úmida, não foram observadas diferenças significativas (p ≤ 0,05), em nenhuma das
matrizes pesquisadas (Tabela 3).
No preparo de amostra, via úmida, utilizou-se 5 mL de HNO3 e 1 mL de H2O2, com tempo de
preparo de, aproximadamente, 4 horas. No preparo de amostra por extração em fase aquosa, utilizou-se
46
apenas água ultrapura como solvente, e o tempo de preparo foi de aproximadamente 30 minutos, o que
eliminou a geração de resíduo tóxicos e minimizou a exposição do analista às substâncias nocivas, apresentou
rapidez perante os métodos descritos na literatura para a mesma finalidade. Este último caracterizou-se como
um procedimento de preparo de amostras promissor para a quantificação de Na, em diferentes níveis de
concentração, em matrizes alimentares utilizando para quantificação técnicas analíticas clássicas e
instrumentais.
Tabela 3: Resultados (valor médio ± %DPR) obtidos na comparação entre os
procedimentos de preparo de amostras por extração em fase aquosa e decomposição
por via úmida utilizando a fotometria de chama.
Amostra
Decomposição
por via úmida
Extração em
fase aquosa Unidade de medida
Média ± DPR*
Macarrão
Instantâneo 1995a ± 0,3 2134a ± 2,5 mg de Na/85g
Salgadinho de
Trigo 262a ± 1,8 254a ±3,4 mg de Na/25g
Salgadinho de
Milho 270a ± 4,6 307a ± 7,2 mg de Na/25g
Papinha Ind.
para Bebês 8,61a ± 1,7 8,60a ± 0,7 mg de Na/115g
Na comparação de diferentes modelos e marcas de fotômetros de chama, os resultados obtidos
apresentaram diferenças significativas (p ≤ 0,05) nas matrizes de salgadinho de milho e salgadinho de trigo
para o método de preparo de amostra proposto (Tabela 4). Esta diferença pode ser justificada pelas variações
nas condições instrumentais e operacionais durante os ensaios, que podem gerar erros sistemáticos (Skoog et
al. 2007), visto que essas matrizes também apresentaram diferenças significativas no método oficial de
preparo, decomposição via úmida, na comparação de diferentes modelos e marcas de fotômetros (Tabela 4) e,
não apresentaram diferença significativa nas comparações entre as diferentes técnicas (Tabela 2) e preparo de
amostras (Tabela 3).
a valores seguidos de letras iguais na mesma linha significa que não existe diferença estatisticamente significativa entre as amostras ao nível de 5% de significância pelo teste de t de Student.
* Desvio Padrão Relativo
47
Tabela 4: Resultados (valor médio ± %DPR) observados na comparação de leituras obtidas em diferentes
fotômetros de chama.
Amostra
Fotômetro Fotômetro
Unidade de
medida
UFMT SENAI UFMT SENAI
Extração em fase aquosa Decomposição por via úmida
Média ± %DPR*
Macarrão
Instantâneo 2135a ± 2,5 2106a ± 0,0 1994a ± 0,3 1692a ± 11,1 mg de Na/85g
Salgadinho
de Trigo 254a ± 3,4 201b ± 3,9 262a ± 1,8 209b ± 2,7 mg de Na/25g
Salgadinho
de Milho 307a ± 7,2 241b ± 7,4 270a ± 4,7 221b ± 9,3 mg de Na/25g
Papinha Ind.
para Bebês 8,60a ± 0,7 8,29a ± 2,2 8,61b ± 1,7 9,09a ± 0,7 mg de Na/115g
As porcentagens de recuperação apresentadas nas quantificações, utilizando a fotometria de chama e
a titulação de precipitação pelo método de Mohr, variaram de 84% a 119% e 89% a 107%, respectivamente,
sendo os %DPR inferiores a 10% para ambas as técnicas (Tabela 5).
Tabela 5: Resultados obtidos (valor médio ± %DPR) nos testes de adição e recuperação da extração em fase
aquosa por fotometria de chama e titulação pelo método de Mohr.
Amostra
Fotometria de chama Método de Mohr
Níveis de fortificação (%)
25 50 75 25 50 75
% de recuperação ± DPR* % de recuperação ± DPR*
Macarrão
Instantâneo 112 ± 1,46 108 ± 4,20 119± 0,35 91± 9,22 89 ± 1,32 96 ± 0,94
Salgadinho
de Trigo 110 ± 4,18 113 ± 6,49 105 ± 2,34 102 ± 7,33 107 ± 3,94 105 ± 4,33
Salgadinho
de Milho 114 ± *** 105 ± 4,44 94 ± 7,29 101 ± *** 104 ± 7,05 99 ± 5,66
Papinha
Ind. para
Bebês
85 ± 5,73 99± 5,56 84 ± 4,48 99 ± 10,52 105 ± 6,44 97 ± 8,40
A Association of Offcial Analytical Chemists International (AOAC) recomenda valores de
recuperação entre 80 e 110%, com valores de %DPR ≤ 16% para faixa de concentração de mg kg -1 (AOAC
2002; Huber 2007) e, de acordo com complexidade da matriz, técnica analítica instrumental e método usado,
o intervalo de recuperação pode ser ampliado para 70-120% (FDA 2015; Ribani 2004).
Considerando-se as variações, que podem causar interferência na determinação do analito pesquisado
pelo procedimento de preparo proposto, a robustez foi avaliada por meio da aplicação do teste de Youden, a
partir das variáveis: massa da amostra, tempo de agitação e força centrifuga (Tabela 6). A velocidade de
centrifugação para todas as matrizes e a massa da amostra para as matrizes salgadinho de milho, salgadinho
a, b, valores seguidos de letras diferentes na mesma linha significa que houve diferença estatisticamente significativa entre as amostras
ao nível de 5% de significância pelo teste de t de Student.
* Desvio Padrão Relativo
* Desvio Padrão Relativo
*** Não foi possível calcular.
48
de trigo e papinhas industrializadas para bebês demostraram efeitos negativos (Tabela 6) e indicam que o
método é robusto a essas variáveis.
A variável tempo de agitação apresentou efeito positivo para todas as matrizes, já a variável massa da
amostra demostrou efeito positivo apenas para matriz macarrão instantâneo. O efeito positivo sugere que as
variáveis devem sofrer menor mudança possível na aplicação do procedimento de preparo de amostras
proposto na quantificação de sódio, a fim de evitar possíveis erros sistemáticos e aleatórios.
Tabela 6: Efeitos observados nas variáveis pesquisadas na avaliação da robustez do método estudo (n=3).
Amostras
Variáveis estudadas
Massa da amostra (g) Tempo de agitação (min) Velocidade da força
centrifuga (rpm)
Efeito dos ensaios
Salgadinho de
milho – 24 + 19 – 0,86
Salgadinho de
Trigo – 112 + 3,01 – 8,97
Papinhas ind.
para bebês – 0,88 +0,03 – 0,19
Macarrão
instantâneo + 364 + 7,33 – 42
As concentrações de sódio nas amostras de macarrão instantâneo variaram entre 1117, 54 a 1961,99
mg de Na por 85 g de amostra, sendo que o maior valor de concentração foi verificado na marca A e, apenas,
a amostra MA apresentou concentração de sódio próxima ao valor rotulado (Tabela 7). Buzzo et al. (2014),
em pesquisa sobre elevado teores de sódio em alimentos industrializados consumidos pela população
brasileira, determinaram a concentração de sódio em salgadinho à base de milho, biscoito, hambúrguer,
salsicha e macarrão instantâneo por espectrometria de emissão atômica com plasma de argônio acoplado
indutivamente (ICP - OES) e observaram que, dentre os alimentos estudados, a maior concentração de sódio
foi nas amostras de macarrão instantâneo.
Os teores de sódio obtidos nas amostras de salgadinho de milho variaram de 128,64 a 208,55 mg de
Na por 25 g de amostra, respectivamente, e todas as amostras da marca F obtiveram resultados superiores aos
valores rotulados. Para o salgadinho de trigo, a faixa de concentração variou entre 158,05 a 300,42 mg de Na
por 25 g de amostra e, todos os valores quantificados nas amostras avaliadas foram inferiores aos descritos no
rótulo (Tabela 7).
Em 2011, o Ministério da Saúde (MS) e quatro associações brasileiras de indústrias de alimentos
(Associação Brasileira das Indústrias de Alimentação (ABIA), a Associação Brasileira da Indústria de trigo
(ABITRIGO), a Associação Brasileira das Indústrias de Massas Alimentícias (ABIMA) e a Associação
49
Brasileira da Indústria de Panificação e Confeitaria (ABIP) assinaram o segundo termo de compromisso para
redução de sódio em alimentos processados (Brasil 2015). Dentre os alimentos em monitoramento para a
redução de sódio assinados no primeiro e no segundo acordo estão o macarrão instantâneo e o salgadinho de
milho. Em relatório técnico, disponibilizado pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) em
2015 (Brasil 2015), os resultados de pesquisas em dezenove Estados brasileiros apresentaram valor médio
para esses alimentos de 1623,5 mg de Na por 85 g de amostra e, 210,25 mg de Na por 25g de amostra,
respetivamente (Brasil 2015). Esses resultados demonstram ser superiores aos valores médios de 1545,18 mg
de Na por 85 g de macarrão instantâneo e de 172,11 mg de Na por 25 g de salgadinhos de milho obtidos no
presente estudo (Tabela 7).
Dentre as amostras de papinha industrializadas para bebês, quatro apresentaram resultados acima dos
descritos no rótulo (PC*, PD*, PF* e PI*) e, a concentração de sódio presente nas amostras variaram entre
1,51 a 81,45 mg de Na por 115 g de amostra (Tabela 7). Valores próximos a esta faixa de concentração foram
obtidas por Khamoni e colaboradores (2017), em estudo sobre impacto dos ingredientes no conteúdo
elementar de alimentos para bebês, no Reino Unido.
A Portaria n° 34, de 13 de 1998 do Ministério da Saúde e Secretaria de Vigilância Sanitária (Brasil
1998) descreve o regulamento técnico referente à alimentação de transição para lactentes e crianças de
primeira infância e recomenda que o teor de sódio não deve exceder 200 mg de sódio por 100g do alimento
pronto para consumo, sendo proibida a adição de cloreto de sódio em produtos e sobremesas à base de frutas.
As amostras de papinha industrializadas para bebês apresentaram concentrações de sódio entre 1,31 a 70,83
mg por 100 g de amostras, sendo que as amostras PC*(sabor maçã) e PI* (sabor ameixa) à base de frutas,
apresentou concentração de 25,38 e 7,63 mg de sódio por 100 g de amostra, indicando possível adição de
sódio na formulação.
50
Tabela 7: Concentrações (valor médio ± %DPR) de sódio e porcentagem de diferença entre o valor rotulado e o obtido experimentalmente em diferentes
marcas e sabores* de macarrão instantâneo, salgadinho de milho, salgadinho de trigo e papinhas industrializadas para bebês (n=3).
MACARRÃO INSTANTÂNEO (mg de Na/85g)
Marcas A B C
Amostras MA* MB* MC* MD* ME* MF* MG* MH* MI*
Valor obtido 1520,34 ± 3,04 1670,37 ± 2,16 1961,99 ± 3,19 1332,79 ± 0,88 1117,54 ± 1,55 1243,76 ± 6,79 1824,33 ± 2,43 1575,96 ± 8,31 1659,55 ± 3,89
Valor rotulado 1570 1620 1640 1277 1105 1193 1581 1460 1487
% diferença - 3,16 + 3,11 + 19,63 + 4,37 + 1,05 + 4,25 + 15,39 + 7,94 + 11,60 SALGADINHO DE MILHO (mg de Na/25g)
Marcas D E F
Amostras SA* SB* SC* SD* SE* SF* SG* SH* SI*
Valor teórico 174,09 ± 7,81 208,55 ± 2,49 188,21 ± 6,07 174,89 ± 0,73 141,34 ± 9,21 128,64 ± 13,03 201,78 ± 2,84 185,99 ± 2,60 145,52 ± 0,62
Valor rotulado 437 422 422 181 146 210 177 174 120
% diferença - 60,16 - 50,58 - 55,40 - 3,38 -3,19 - 38,74 + 14 + 6,89 + 21,27
SALGADINHO DE TRIGO (mg de Na/25g)
Marcas G H I
Amostras TA* TB* TC* TD* TE* TF* TG* TH* TI*
Valor teórico 277, 26 ± 3,67 246,57 ± 5,32 252,13 ± 1,39 158,05 ± 1,30 176,55 ± 0,85 159,78 ± 0,90 272,07 ± 5,00 237,28 ± 3,22 300,42 ± 2,91
Valor rotulado 279 247 260 216 208 257 382 368 385
% diferença - 0,62 - 0,17 - 3,03 - 26,83 - 15,12 - 37, 83 - 28,78 - 35,52 - 21,97
PAPINHA INDUSTRIALIZADA PARA BEBÊS (mg de Na/115g)
Marcas J K
Amostras PA* PB* PC* PD* PE* PF* PG* PH* PI*
Valor teórico 81,45 ± 1,85 75,12 ± 1,74 29,19 ± 0,96 41,82 ± 2,51 11,81 ± 2,72 13,74 ± 0,65 9,52 ± 0,75 1,51 ± 0,43 8,78 ± 3,49
Valor rotulado 123 118 27 24 14 9 10 5,85 6,71
% diferença ** - 33,78 - 36,34 + 8,11 + 74,25 - 15,64 + 52,67 - 4,8 - 74,19 + 30,85
MA*: sabor carne; MB*: sabor carne assada; MC*: sabor galinha caipira; MD*: sabor yakissoba; ME*: Bolonhesa; MF*: frango; MG*: galinha temperada; MH*: legumes cozidos;
MI*: tomate temperado.
SA*: sabor pizza; SB*: sabor churrasco; SC*: sabor requeijão cremoso; SD*: sabor queijo; SE*: sabor cebola; SF*: sabor presunto; SG*: sabor parmesão; SH*: sabor presunto; SI*: sabor requeijão.
TA*: sabor churrasco; TB*: sabor salsa e cebola; TC*: sabor pizza; TD*: sabor churrasco; TE*: sabor queijo; TF*: sabor pizza; TG*: sabor bacon; TH*: sabor churrasco; TI: sabor
calabresa. PA*: sabor carne com legumes; PB*: sabor carne com legumes e arroz; PC*: sabor maça; PD*: sabor frutas sortidas com iogurte; PE*: sabor carne, legumes e mandioquinha; PF*:
gema de ovo, carne e legumes; PG*: sabor legumes com carne; PH*: sabor banana com aveia; PI*: sabor ameixa.
*Média e Desvio Padrão Relativo das triplica das amostras analisadas.
**Diferença entre o valor teórico e o valor rotulado.
51
Um teste t de Student de comparação de um valor medido com um valor conhecido, num intervalo de
confiança de 95%, foi aplicado aos resultados da Tabela 7 e aos valores rotulados (Harris 2006; Miller e
Miller 2010) e todas as amostras, exceto as amostras de papinhas industrializadas para bebês PB*, PC* e
PD*, apresentaram diferenças significativas (p ≤ 0,05) entre o teor de sódio calculado e o valor declarado no
rótulo.
Porém, a Resolução RDC nº 360, de 23 de setembro de 2003, que aprova o regulamento técnico
sobre rotulagem nutricional de alimentos embalados, tornando obrigatória a rotulagem nutricional (Brasil
2003b), indica que é permitida uma tolerância de + 20% com relação aos valores de nutrientes declarados no
rótulo e que nos produtos que contenham micronutrientes em quantidade superior à tolerância estabelecida no
item anterior, a empresa responsável deve manter à disposição os estudos que justifiquem tal variação.
Dentre as amostras avaliadas, a amostra SI* (macarrão instantâneo) e as amostras PD*, PF* e PI*
(papinhas industrializadas para bebês) apresentaram teores de sódio acima da tolerância permitida,
respectivamente, ou seja, em desconformidade com a Legislação vigente, sugerindo uma revisão das
formulações e rótulos pelos fabricantes, assim como, a fiscalização pelos órgãos competentes. Silva e
colaboradores (2009) também verificaram desconformidades entre o valor real e o rotulado em relação ao teor
de sódio e potássio em repositores hidroeletrolíticos comercializados no Brasil, sendo que houve diferença
significativa (p ≤ 0,05) entre o teor de pelo menos um eletrólito calculado e o valor declarado no rótulo, sendo
que, em 61,4% das amostras, o teor mensurado diferiu em ±20% do valor rotulado, não satisfazendo, assim, a
RDC 360/2003 da ANVISA.
Considerando a ingestão diária de 2000 mg de sódio, recomendada pela a Organização Mundial de
Saúde (OMS) e os alimentos estudados, pode se observar que, para as maiores concentrações de sódio
obtidas, para cada tipo de amostra, os resultados indicam que a ingestão diária de somente 100 g das amostras
corresponde a 115,41% (macarrão instantâneo), 41,71% (salgadinho de milho), 60,08% (salgadinho de trigo)
e 3,54% (papinhas industrializadas bebês) da ingestão diária permitida. Neste contexto, é importante destacar
que o valor de ingestão diária citado é indicado apenas para consumidores adultos e que, para crianças, não há
um valor estabelecido, apenas apresenta-se uma indicação que o mesmo deve ser ajustado para baixo com
base nos requisitos de energia das crianças em relação aos dos adultos. Sendo assim, o consumo destes
alimentos processados para crianças deve ser feito com restrições, a fim de não acarretar futuramente nas
crianças e bebês doenças relacionadas ao consumo excessivo de sódio.
52
Conclusões
Os resultados obtidos nos testes de adição e recuperação do analito, bem como, nas comparações
com diferente técnica analítica, procedimento de preparo de amostra clássico e instrumento indicaram que o
procedimento proposto possui precisão e exatidão necessárias para a quantificação de sódio nas amostras de
alimentos processados infantis avaliadas neste trabalho. Os ensaios de robustez demostraram que o tempo de
agitação apresentou efeito positivo em todas as amostras avaliadas e, a massa da amostra apresentou efeito
positivo apenas para a amostra macarrão instantâneo, sugerindo que estas duas variáveis devem sofrer a
menor alteração possível durante a aplicação do procedimento, a fim de evitar erros sistemáticos nos
resultados.
Desta forma, o uso da extração em fase aquosa, na determinação de sódio em matrizes alimentares,
combinada com a quantificação por fotometria de chama pode ser uma alternativa promissora frente aos
procedimentos de preparo de amostras clássicos e pode apresentar-se também como vantagens à diminuição
da quantidade de reagentes utilizados, à geração de resíduos tóxicos, aos custos, ao tempo de análise e, pode
ser aplicada em diferentes faixas de concentração. Além disso, os resultados sugerem que a titulação de
precipitação também pode ser usada com técnica indireta de quantificação.
As amostras avaliadas apresentaram discrepância entre os valores obtidos e os rotulados, sugerindo
uma revisão/atualização das formulações e rótulos pelos fabricantes, bem como, uma maior fiscalização pelos
órgãos reguladores, visando garantir a qualidade e segurança alimentar destes produtos.
Agradecimentos
Os autores agradecem a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES/FAPEMAT) pela bolsa de estudos concedida a F.G.G.P., ao IFMT pelo fomento de pesquisa e, ao
Laboratório de Análise de Contaminantes Inorgânicos (LACI) do Departamento de Química da UFMT e a
FATEC – SENAI- MT pela disponibilização de equipamentos e reagentes.
Referências
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alimentos processados, 1-38
53
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