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IV ENDICT - Encontro de Iniciação Científica

Câmpus Toledo

20 e 21 de outubro de 2016

DESENVOLVIMENTO DE UM MÉTODO QUIMIOMÉTRICO PARA QUANTIFICAÇÃO DE AZEITE DE OLIVA EM MISTURAS

TERNÁRIAS COM ÓLEOS DE SOJA E CANOLA

Kelly Laís Mariani 1 Lucas Wahl da Silva 1

Clayton Antunes Martin 2

O azeite de oliva (AO) possui um elevado valor econômico comparado a outros óleos vegetais, o que o torna alvo de adulterações envolvendo óleos vegetais refinados. Além disso, o AO também tem sido comercializado em vários países, incluindo o Brasil, misturado com outros óleos vegetais. O propósito deste trabalho foi determinar o teor de AO em misturas com óleo de soja e canola, utilizando a espectroscopia no infravermelho e calibração multivariada por mínimos quadrados parciais (PLS). Foram preparadas 128 misturas de AO, óleo de soja e óleo de canola, com as concentrações de AO variando de 0,00 a 100,00 g 100 g-1 de mistura. Os espectros foram obtidos em espectrofotômetro infravermelho, na faixa de 3500 a 650 cm-1, e tiveram seus dados normalizados, com as intensidades variando entre 0 e 1. As misturas foram divididas em conjuntos de calibração (n = 95) e validação (n = 33), pelo algoritmo de Kennard-Stone. O espectro foi dividido em segmentos que variaram de 1 a 100, sendo aplicada a correção do espalhamento multiplicativo e a centralização dos dados na média, para cada intervalo da segmentação. O intervalo espectral mais adequado para a calibração por PLS, foi determinado com o pacote iToolbox, utilizando o software MATLAB. O intervalo 13, da segmentação com 15 intervalos, apresentou o menor valor para a raiz quadrada do erro médio de validação cruzada (RMSECV), que foi 3,35, e o maior valor para coeficiente de correlação (r = 0,988) entre os valores conhecidos e preditos pelo modelo. Foram identificados 10 outliers no conjunto de calibração, que após a exclusão resultou na melhoria do modelo (RMSECV = 1,44; r = 0,998). O modelo obtido apresentou capacidade preditiva adequada podendo ser utilizado na quantificação de AO em óleos mistos com óleos de soja e canola e em AO adulterado com estes óleos. Palavras-chave: adulteração, óleos mistos, quantificação, PLS

1 INTRODUÇÃO

A partir da polpa do fruto da oliveira Olea europaea sativa pode-se obter o

azeite de oliva, sendo que o azeite de oliva extra virgem (AOEV) é um dos óleos que

possui maior valor agregado e tem sido adulterado com outros azeites ou óleos

vegetais. Se uma mistura de AOEV não corresponde as proporções do rótulo ou se a

mistura é comercializada como pura, isto significa que o azeite é adulterado, pois ele

deve ser preparado apenas com produtos apropriados (BELITZ, 1997; ULBERTH,

BUCHGRABER, 2000).

As técnicas cromatográficas são as mais utilizadas para detectar a

adulteração em azeite de oliva, entretanto, a espectroscopia no infravermelho

quando associada à métodos quimiométricos também possibilita a obtenção de

1 Acadêmico(a) do curso de Tecnologia de Processos Químicos 2 Docente do curso de Tecnologia de Processos Químicos


Câmpus Toledo


resultados semelhantes. A espectroscopia no infravermelho com refletância total

atenuada (Fourier transform infrared – attenuated total reflectance – FTIR-ATR) é

uma técnica analítica não destrutiva, que não utiliza solventes na análise e não

requer nenhuma etapa de preparo da amostra (LI-CHAN, GRIFFITHS, CHALMERS,

2010).

A combinação da FTIR-ATR com métodos quimiométricos, como a regressão

por mínimos quadrados parciais (partial least square – PLS) tem possibilitado a

obtenção de resultados satisfatórios em várias análises físico-químicas de óleos e

gorduras (SEDMAN et al., 1998; CHE MAN; SETIOWATY, 1999; QUIÑONES-ISLAS

et al, 2013; TRIYASMONO; RIYANTO; ROHMAN, 2013).

Na regressão por PLS, a calibração multivariada pode ser realizada utilizando

a informação de toda faixa espectral, para construir um modelo de regressão

correlacionado com a propriedade de interesse. No entanto, considerando o

grande número de variáveis fornecidas por toda a faixa espectral, algumas destas

variáveis podem interferir na modelagem, além de tornar o tratamento dos dados

mais lento. Portanto, para melhorar o desempenho de técnicas de calibração

multivariada, têm sido utilizados procedimentos apropriados para a seleção das

regiões espectrais (NORGAARD et al., 2000).

Este trabalho teve como propósito desenvolver e validar um método para

determinar o teor de azeite de oliva em óleos mistos, contendo os óleos de soja e

canola, aplicando a espectrofotometria no infravermelho médio e a calibração

multivariada por meio da regressão por mínimos quadrados parciais.

2 Material e métodos

2.1 Preparo das misturas

O azeite de oliva extra virgem e os óleos de soja e canola utilizados neste

estudo foram adquiridos no comércio da região de Toledo-PR. Foram preparadas

misturas de azeite de oliva, óleo de soja e canola, cujos teores de azeite de oliva

variaram de 0 a 100% (w/w), totalizando 128 misturas. As misturas foram

acondicionadas em frascos âmbar e armazenadas em freezer (-20 oC) até a

realização da análise. Antes da análise, as misturas foram descongeladas e

submetidas à homogeneização por meio de agitador vortex.


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2.2 Espectroscopia no infravermelho médio

A aquisição dos espectros foi realizada em espectrofotômetro infravermelho,

com transformada de Fourier e módulo de refletância total atenuada (Spectrum 65,

Perkin Elmer). O cristal utilizado nesta técnica contém diamante na parte superior e

seleneto de zinco no elemento focalizador. Antes da obtenção de cada espectro, o

cristal foi limpo com lenços de papel umedecido com álcool isopropílico. Após a

obtenção de cada espectro foi realizada a correção do sinal de fundo. Foram

adicionados ao cristal 200 L de mistura e a obtenção dos espectros foi realizada em

ambiente com temperatura controlada (25 oC). Todos os espectros foram obtidos em

absorvância, com duas replicatas para cada mistura. O espectro médio de cada

mistura foi utilizado nos cálculos subsequentes.

2.3 Calibração multivariada

Os espectros foram normalizados e suas intensidadades variaram de 0 a 1.

As misturas foram divididas em conjuntos de calibração (n = 95) e validação (n = 33)

pelo algoritmo de Kennard-Stone. Os espectros foram divididos em segmentos que

variaram de 1 a 100, sendo aplicada a correção multiplicativa do sinal (MSC –

multiplicative scatter correction) e a centralização dos dados na média,

respectivamente, para cada intervalo da segmentação. A regressão por mínimos

quadrados parciais (PLS - partial least square) foi realizada para cada intervalo das

segmentações, com o número das variáveis latentes dos modelos variando de 1 a

15, e sendo determinado por meio da raiz quadrada do erro médio quadrático de

validação cruzada (RMSECV – root mean square error of cross validation). Na

validação cruzada do modelos, o conjunto de calibração foi dividido em 15 blocos.

Para cada segmentação do espectro foi determinado o intervalo que resultou no

menor valor de RMSECV. A partir destes 100 intervalos foi selecionado o intervalo

que apresentou o menor valor para a RMSECV. A avaliação de amostras anômalas

(outliers) foi realizada por meio do leverage extremo e dos resíduos studentizados,

para os conjuntos de calibração e validação. O modelo obtido foi validado pelo

método de validação externa.


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2.5 Figuras de mérito

A validação de métodos analíticos requer a estimação dos parâmetros

exatidão, precisão, ajuste, linearidade, sensibilidade, limites de detecção e

quantificação. A exatidão foi determinada a partir da raiz quadrada do erro médio

quadrático, para os conjuntos de calibração (RMSEC) e validação RMSEP, conforme

descrito por Kalivas and Gemperline (2006). A precisão foi estimada como

repetibilidade (Moffat, Trafford, Jee & Graham, 2000; ASTM Standard, 2000). A

sensibilidade e os limites de detecção e quantificação foram determinados conforme

proposto por Allegrini e Olivieri (2014) e Olivieri (2015). O sinal analítico líquido (NAS

- net analytical signal) utilizado na avaliação do ajuste do modelo foi determinado

conforme Bro and Andersen (2003).

2.6 Software

Os cálculos foram realizados utilizando o software Matlab, versão 7.8

(Mathworks, USA) com a interface gráfica SPA_GUI (Paiva et al, 2012), com as

rotinas dos pacotes iToolbox (Norgaard et al 2000), e MVC1 (Olivieri; Goicoechea;

Iñón, 2004). Para a detecção de outliers foi utilizada uma rotina escrita pelo nosso

grupo de pesquisa.

3. Resultados e discussão

A figura 1 apresenta os espectros das misturas de azeite de oliva, óleo de

soja e óleo de canola na região do infravermelho médio. Em 3005 cm-1 ocorre a

absorção correspondente ao estiramento CH=CH de duplas ligações cis. A região de

2922–2853 cm-1 é caracterizada por bandas intensas, devido aos estiramentos C-H

dos grupos metileno e metil terminais das cadeias de ácidos graxos dos

triacilgliceróis (Dobson, 2001). Na região de 1744 cm-1 ocorre o estiramento C=O do

grupo éster dos triacilgliceróis (PEÑA, 2005).


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Figura 1: Espectros na região de região do infravermelho médio das misturas

utilizadas na obtenção dos modelos PLS

Fonte: Autoria própria

As bandas na região de 1400-1200 são atribuídas a deformações angulares

de CH2 e CH3, como a deformação angular simétrica em 1377 (HCH) e a tesoura em

1462 cm-1 (de la Mata et al (2012). Em 1119 e 1095 cm-1 estão relacionadas com o

estiramento C-O. Em 965 cm-1 ocorre a deformação fora do plano (C-H) de

hidrogênios olefínicos de duplas ligações trans, e em 926 cm-1 corresponde a

deformação fora do plano de O-H de ácidos carboxílicos (Fritsche and Steinhart,

1997). A banda em 722 cm-1 ocorre devido a sobreposição do balanço da cadeia

(CH2)n com a deformação fora do plano (C-H) de hidrogênios olefínicos de duplas

ligações cis.

Os resultados obtidos para a regressão PLS indicaram que a segmentação do

espectro em 15 intervalos resultou no modelo com menor valor de RMSECV, obtido

para o intervalo 13 (1219-1030 cm-1), cujo valor foi 3,35, com 6 variáveis latentes

(Figura 2). O coeficiente de correlação (r) entre os valores conhecidos e preditos

pelo modelo foi 0,988.


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Figura 2: RMSECV dos modelos global com 15 variáveis latentes (linha

pontilhada) e obtidos com a segmentação em 15 intervalos (o valor em cada

barra corresponde ao número de variáveis latentes que resulta no menor valor

de RMSECV).


O modelo selecionado foi avaliado com relação a presença de outliers, que foi

realizada pela análise do gráfico dos resíduos de Student versus leverage (Figura 3).

Foram identificados 10 outliers no conjunto de calibração (Tabela 1), que após a

exclusão resultou na melhoria do modelo (RMSECV = 1,44; r = 0,998).

Amostras cujos resíduos studentizados e a leverage são altos devem

excluídas. Quando as amostras apresentam baixos valores de leverage, e altos

valores para os resíduos studentizados há a suspeita de erros na concentração.

Amostras com altos valores de leverage e baixos resíduos studentizados podem

apresentar erros espectrais ou serem amostras com valores de concentração

localizados nas extremidades dos conjuntos de calibração e validação. Dessa forma,

estas amostras devem ser examinadas antes de serem removidas (Boysworth and

Booksh, 2008).


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Figura 3: Resíduos studentizados versus leverage do modelo PLS, no intervalo

espectral selecionado, para o conjunto de calibração Fonte: Autoria própria

No conjunto de validação foi encontrado 1 outlier (Figura 4). O valor da raiz

quadrada do erro médio quadrático de predição (RMSEP) para este conjunto foi 1,89

e o valor de r foi 0,998. Após a exclusão deste outlier o valor de RMSEP diminuiu

para 1,23, e o valor de r passou para 0,999. A avaliação subsequente deste conjunto

não mostrou a presença de outliers.

Figura 4: Resíduos studentizados versus leverage do modelo PLS, no

intervalo espectral selecionado, para o conjunto de validação Fonte: Autoria própria


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A linearidade da calibração foi avaliada pelo gráfico de dispersão dos resíduos

(Figura 5), onde é possível observar uma distribuição aleatória de erros. Essa forma

de distribuição dos erros é um indicativo do comportamento linear (Martens & Naes,

2002).

Figura 5: Resíduos versus valores de referência para o teor de azeite de oliva, (o) conjunto de calibração, (+) conjunto de validação


O ajuste do modelo foi avaliado pelo gráfico dos valores preditos em função

dos valores de referência, para o teor de azeite de oliva nas misturas com óleos de

soja e canola (Figura 6).

Figura 6: Valores de preditos pelo modelo PLS para o teor de azeite de oliva versus teores de referência, (o) conjunto de calibração, (+) conjunto de

validação Fonte: Autoria própria


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Também foi avaliada a relação entre os teores de referência para o azeite de

oliva e a norma do sinal analítico líquido (NAS) (Figura 7) para cada amostra, que

corresponde à representação do modelo de calibração multivariada na sua forma

pseudo-univariada. Para esta curva, o coeficiente de correlação foi 0,999 e a

equação obtida foi y = 1412,3.||nas|| - 4,6585. Em ambos os gráficos foi observado

um comportamento linear.

Figura 7: Valores de referência para o para o teor de azeite de oliva versus a norma do sinal analítico líquido (NAS), (+) conjunto de calibração,

(o) conjunto de validação Fonte: Autoria própria

A tabela 1 apresenta os resultados obtidos para as figuras de mérito

estimadas para o modelo de calibração PLS, utilizado na determinação do teor de

azeite de oliva em misturas com óleos de soja e canola. A precisão foi estimada

como repetibilidade, cujo valor foi 0,39 g 100 g-1. Os limites de detecção (LOD) e

quantificação (LOQ), inferior e superior, foram respectivamente, 1,6 e 3,1 g 100 g-1

de mistura e 4,8 e 9,3 g 100 g-1. Conforme Alegrini e Olivieri (2014) é adequado em

calibração multivariada considerar o LOD e LOQ como faixas de concentração

(limites inferior e superior), pois cada amostra no conjunto de calibração tem um

valor específico para o LOD e LOQ. A sensibilidade analítica foi 2,80 (100 g g-1). O

inverso da sensibilidade analítica (0,36 g 100 g-1) indica que o método proposto é


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capaz de distinguir entre amostras que apresentam diferença de 0,36 g 100 g-1 de

azeite de oliva (Munoz, 2002).

Tabela 1: Figuras de mérito estimadas para o modelo PLS

Parâmetro Valor

Exatidão - RMSECVa 1,44

Exatidão - RMSECa 1,49

Exatidão - RMSEPa 1,23

Precisão - repetibilidadea 0,93

Ajuste (preditos x referência) - r 0,9987

Ajuste (NAS) - r 0,9988

Sensibilidade 0,00071

Sensibilidade analíticaa 2,8

Limite de detecçãoa 1,6 – 3,1

Limite de quantificaçãoa 4,8 – 9,3

a g 100 g-1

4. Conclusão

O método desenvolvido foi considerado exato, preciso, linear e com

sensibilidade adequada para a faixa de 9,3-90 g 100 g-1 de mistura, podendo ser

utilizado na quantificação de azeite de oliva em óleos mistos com óleos de soja e

canola e em azeite de oliva adulterado com estes óleos.

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