desenvolvimento de um ensaio de pcr- multiplex para

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA

DESENVOLVIMENTO DE UM ENSAIO DE PCR-

MULTIPLEX PARA IDENTIFICAÇÃO DE ISOLADOS

DE CORYNEBACTERIUM PSEUDOTUBERCULOSIS

E RÁPIDA DETECÇÃO DESSA BACTÉRIA EM

AMOSTRAS CLÍNICAS

LUIS GUSTAVO CARVALHO PACHECO

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

Belo Horizonte – MG

2006

LUIS GUSTAVO CARVALHO PACHECO

DESENVOLVIMENTO DE UM ENSAIO DE PCR-

MULTIPLEX PARA IDENTIFICAÇÃO DE ISOLADOS

DE CORYNEBACTERIUM PSEUDOTUBERCULOSIS

E RÁPIDA DETECÇÃO DESSA BACTÉRIA EM

AMOSTRAS CLÍNICAS

Orientação: Dr. Vasco Azevedo

Co-orientação: Dr. Anderson Miyoshi

Universidade Federal de Minas Gerais

Instituto de Ciências Biológicas

Belo Horizonte, 2006

Dissertação apresentada como requisito parcial

para obtenção do grau de Mestre pelo programa

de Pós-Graduação em Genética, Departamento de

Biologia Geral, Instituto de Ciências Biológicas,

Universidade Federal de Minas Gerais.

Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Genética Celular e Molecular e

realizado com apoio financeiro das seguintes instituições:

� Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG)

� Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

� Financiadora de Estudos e Projetos – MCT (FINEP)

A organização desta dissertação foi baseada em: FRANÇA, J.L.; BORGES,

S.M.; VASCONCELLOS, A.C.; MAGALHÃES, M.H.A. Manual para normalização

de publicações técnico-científicas. 7ª ed. Belo Horizonte: Ed. UFMG, 2004. 242p.

DEDICATÓRIA

Dedico esta dissertação ao meu pai Hilton, minha mãe Marilane, e meus irmãos

Pablo e Carol. Dedico também a todos os meu amigos que estiveram ao meu lado

durante a realização do mestrado.

AGRADECIMENTOS

À Universidade Federal de Minas Gerais, por todas as oportunidades que

me proporcionou nos últimos anos.

À Pós-Graduação em Genética, por todos os ensinamentos fundamentais

para o meu desenvolvimento profissional.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

(CNPq), pela ajuda indispensável.

Aos meus orientadores Dr. Vasco Azevedo e Dr. Anderson Miyoshi, pela

confiança depositada e pelo apoio.

Aos grupos de pesquisa dos doutores Sérgio Costa (UFMG), Roberto

Meyer (UFBA), e Francisco Selmo Alves (EMBRAPA), pela disponibilidade de

material e cooperação científica.

Aos estudantes Roberta Pena e Thiago Castro, pelo companheirismo e

empenho no desenvolvimento deste trabalho.

A todos os amigos do Laboratório de Genética Celular e Molecular:

Anderson Miyoshi

Bruna Savassi

Clarissa Rocha

Estela Mares

Fernanda Dorella

Guilherme Augusto

Kátia Leite

Keila Coelho

Naira Electo

Paula Gonçalves

Ricardo Rabelo

Roberta Pena

Thiago Castro

Vasco Azevedo

“Ando devagar porque já tive pressa

e levo esse sorriso, porque já chorei demais

Hoje me sinto mais forte, mais feliz quem sabe

eu só levo a certeza de que muito pouco eu sei, eu nada sei...”

(Almir Sater e Renato Teixeira – Tocando em Frente)

Gastei uma hora pensando um verso

que a pena não quer escrever.

No entanto ele está cá dentro

inquieto, vivo.

Ele está cá dentro

e não quer sair.

Mas a poesia deste momento

inunda minha vida inteira.

(Carlos Drummond de Andrade – Poesia)

SUMÁRIO

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS.................................................................IV

LISTA DE FIGURAS...............................................................................................VI

LISTA DE TABELAS.............................................................................................VII

RESUMO...............................................................................................................VIII

ABSTRACT.............................................................................................................IX

1. INTRODUÇÃO......................................................................................................1

1.1. Introdução Geral..........................................................................................................2

1.2. Estrutura da Dissertação............................................................................................5

1.3. Revisão da Literatura..................................................................................................6

2. OBJETIVOS.......................................................................................................25

2.1. Objetivo Geral............................................................................................................26

2.2. Objetivos Específicos...............................................................................................26

3. MATERIAIS E MÉTODOS..................................................................................27

3.1. Equipamentos Utilizados..........................................................................................28

3.2. Reagentes, Meios de Cultura e Soluções................................................................29

3.2.1. Reagentes Utilizados................................................................................................29

3.2.2. Meios de Cultura.......................................................................................................31

3.3. Material Biológico......................................................................................................33

3.3.1. Linhagens Bacterianas e Condições de Cultivo.......................................................33

3.3.2. Amostras Clínicas.....................................................................................................35

3.3.2.1. Amostras de Material Purulento.............................................................................35

3.3.2.2. Amostras de Sangue e Soro..................................................................................35

3.4. Métodos......................................................................................................................37

3.4.1. Isolamento Bacteriano e Identificação Bioquímica dos

Isolados...............................................................................................................................37

3.4.2. Extração de DNA Genômico Bacteriano...................................................................38

3.4.2.1. Extração de DNA Genômico de Culturas Bacterianas..........................................38

3.4.2.2. Extração de DNA Genômico Bacteriano a Partir de Amostras Clínicas de Linfadenite

Caseosa...........................................................................................................39

3.4.2.2.1. Extração de DNA Genômico Bacteriano a Partir de Amostras de Pus e Sangue com

os Protocolos CTAB-SDS e PK-

ROCHE...............................................................................................................................39

3.4.2.2.2. Extração de DNA Genômico Bacteriano a Partir de Amostras de Pus e Sangue

com o Protocolo PK-SARCOSIL.........................................................................................40

3.4.2.2.3. Extração de DNA Genômico Bacteriano a Partir de Amostras de Pus e Sangue

com o Kit Wizard® Genomic DNA Purification

(Promega)...........................................................................................................................41

3.4.2.2.4. Extração de DNA Genômico Bacteriano a Partir de Amostras de Soro com o Kit

ChargeSwitch gDNA 1 ml Serum

(Invitrogen)..........................................................................................................................41

3.4.3. Dosagem do DNA Genômico Extraído.....................................................................42

3.4.4. Ensaio de PCR-Multiplex..........................................................................................43

3.4.4.1. Teste de Sensibilidade Analítica............................................................................46

3.4.4.2. Teste de Especificidade.........................................................................................46

3.4.4.3. Teste de Reprodutibilidade....................................................................................46

3.4.4.4. Confirmação dos Produtos Amplificados...............................................................47

3.4.4.5. Limite de Detecção em Amostras Clínicas............................................................47

3.4.4.6. Cálculo da Sensibilidade Diagnóstica....................................................................48

3.4.5. Análise Estatística.....................................................................................................48

3.4.6. Determinação da Equivalência Genômica de C.

pseudotuberculosis.............................................................................................................48

3.4.7. Digestão Enzimática dos Produtos da mPCR..........................................................49

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO……..................................................................50

4.1. ARTIGO: Multiplex PCR Assay for Identification of Corynebacterium

pseudotuberculosis from Pure Cultures and for Rapid Detection of this Pathogen in

Clinical Samples...............................................................................................................51

4.2. Resultados Adicionais..............................................................................................78

4.2.1. Sensibilidade Analítica do Ensaio de mPCR com Diferentes DNA

Polimerases........................................................................................................................78

4.2.2. Equivalência Genômica do Limite de Detecção da mPCR.......................................81

4.2.3. Especificidade do Ensaio de mPCR.........................................................................82

4.2.4. Reprodutibilidade do Ensaio de mPCR....................................................................83

4.2.5. Extração de DNA Genômico de C. pseudotuberculosis a Partir de Amostras Clínicas

de Linfadenite Caseosa......................................................................................................82

4.2.6. Limite de Detecção da mPCR em amostras clínicas................................................85

4.2.7. Detecção de C. pseudotuberculosis em Amostras de

Soro....................................................................................................................................87

4.2.8. Perfil Eletroforético das Digestões Enzimáticas dos Produtos da

mPCR.................................................................................................................................90

5. CONSIDERAÇÕES FINAIS...............................................................................97

5.1. Conclusões.................................................................................................................98

5.2. Perspectivas...............................................................................................................99

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................100

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

INSTITUIÇÕES

CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

EMBRAPA Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária

FAPEMIG Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais

ICB Instituto de Ciências Biológicas

UFBA Universidade Federal da Bahia

UFMG Universidade Federal de Minas Gerais

TERMOS TÉCNICOS

AgNO3 Nitrato de Prata

BHI Brain Heart Infusion – Infusão Cérebro Coração

CIP Coleção Instituto Pasteur

cols. Colaboradores

CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide

DNA Ácido Desoxirribonucléico

dNTPs Desoxirribonucleotídeos trifosfato

EDTA Ácido etilenodiaminotetracético

fg Fentograma

g Grama

HCl Ácido Clorídrico

µg Micrograma

µl Microlitro

µM Micromolar

mg Miligrama

MgCl2 Cloreto de Magnésio

min Minutos

ml Mililitro

mM Milimolar

MW Molecular Weight

NaAc Acetato de Sódio

NaCl Cloreto de Sódio

NaOH Hidróxido de Sódio

ng Nanograma

O.N. Overnight – durante a noite

PCR Polymerase Chain Reaction – Reação em Cadeia da Polimerase

PEG Polietileno glicol

PM Peso molecular

q.s.p. Quantidade suficiente para

RNase A Ribonuclease A

rpm Revoluções por minuto

Sarcosil Sódio-N-lauroilsarcosina

SDS Sódio Dodecil Sulfato

seg Segundos

Taq Thermus aquaticus

tº Temperatura

U Unidades

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Protocolo passo-a-passo para o desenvolvimento de PCR-multiplex....44

Figura 2. Testes de sensibilidade do ensaio de mPCR.........................................78

Figura 3. Teste de sensibilidade com o sistema Taq DNA Polimerase

Recombinante (Invitrogen), resolvido em gel de poliacrilamida a 6% corado pela

prata........................................................................................................................79

Figura 4. Amplificação do gene 16S rRNA de C. pseudotuberculosis utilizando o

sistema AccuPrime™ (Invitrogen)..........................................................................80

Figura 5. Especificidade da reação de mPCR.......................................................83

Figura 6. Perfis de amplificação de 38 isolados de C.

pseudotuberculosis.................................................................................................84

Figura 7. Limite de detecção da mPCR em amostras clínicas utilizando dois

sistemas de amplificação diferentes.......................................................................87

Figura 8. Reações de PCR para amplificação do 16S rDNA de C.

pseudotuberculosis e do controle positivo de amplificação 12S rDNA, em 8

amostras de soro de animais portadores de linfadenite

caseosa...................................................................................................................89

Figura 9. Amplificação do gene pld a partir de amostras de

soro.........................................................................................................................89

Figura 10. Digestão enzimática das reações de mPCR com DNAs de C. ulcerans

e C. pseudotuberculosis.........................................................................................91

Figura 11. Mapa de restrição da região amplificada do gene 16S rRNA da C.


Figura 12. Mapa de restrição da região amplificada do gene rpoB da C.


Figura 13. Mapa de restrição da região amplificada do gene pld da C.


LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Linhagens bacterianas utilizadas neste estudo......................................34

Tabela 2. Amostras de material purulento utilizadas neste estudo........................36

Tabela 3. Iniciadores utilizados neste estudo.........................................................43

Tabela 4. Reações de mPCR com diferentes polimerases....................................45

RESUMO

Corynebacterium pseudotuberculosis é o agente etiológico da linfadenite

caseosa (LC), uma doença crônica contagiosa que acomete os pequenos

ruminantes e acarreta sérias perdas econômicas para as atividades de ovino e

caprinocultura. Embora o controle desta doença seja baseado primariamente em

detecção e isolamento de animais infectados, ainda não há um método de

diagnóstico completamente satisfatório. Com o objetivo de facilitar a detecção de

C. pseudotuberculosis, no presente trabalho foi desenvolvido um ensaio de PCR-

multiplex (mPCR) que amplifica simultaneamente três genes específicos dessa

bactéria: 16S rDNA (RNA ribossômico 16S), rpoB (subunidade beta da RNA

polimerase), e pld (exotoxina fosfolipase D). Esse novo método permitiu identificar

de forma eficiente 40 isolados de campo de C. pseudotuberculosis; confirmados

através de testes bioquímicos. O ensaio mostrou-se altamente específico, e foi

suficientemente sensível para detectar 1 pg de DNA genômico de C.

pseudotuberculosis. Quando testado com DNA extraído de amostras clínicas de

LC, o limite de detecção foi de 103 UFC desta bactéria. Foi possível detectar C.

pseudotuberculosis diretamente em amostras de pus (n = 56) de ovinos e caprinos

infectados, com alta sensibilidade diagnóstica (94,6%). A possibilidade de detectar

esta bactéria em amostras de soro gerou a perspectiva de identificação de animais

portadores de infecções sub-clínicas. O ensaio de mPCR desenvolvido contribui

significativamente para a detecção rápida de C. pseudotuberculosis e pode ser

usado como alternativa para o diagnóstico da LC.

ABSTRACT

Corynebacterium pseudotuberculosis is the etiological agent of caseous

lymphadenitis (CLA), a debilitating disease of sheep and goats. Accurate diagnosis

of CLA primarily relies upon microbiological examination, followed by biochemical

identification of isolates. In an effort to facilitate C. pseudotuberculosis detection,

we developed a multiplex-PCR (mPCR) assay targeting three genes of this

bacterium: 16S rDNA, rpoB and pld. This method allowed efficient identification of

40 isolates of this bacterium, which had been previously identified by biochemical

testing. Analysis of taxonomically-related species did not generate the C.

pseudotuberculosis mPCR amplification profile, thereby demonstrating the assay’s

specificity. As little as 1 pg of C. pseudotuberculosis genomic DNA was detected

by this mPCR assay, demonstrating the sensitivity of the method. The detection

limit in clinical samples was estimated to be 103 colony-forming units (CFU). We

were able to detect C. pseudotuberculosis directly in pus samples of infected

sheep and goats (n = 56) with a high diagnostic sensitivity (94.6%). The developed

assay significantly improves rapid C. pseudotuberculosis detection and could

supersede bacteriological culture for microbiological and epidemiological diagnosis

of CLA.

1. INTRODUÇÃO

1.1. INTRODUÇÃO GERAL

Corynebacterium pseudotuberculosis é uma bactéria Gram-positiva,

parasita intracelular facultativa, causadora da linfadenite caseosa (LC) – mal do

caroço – em pequenos ruminantes (Dorella e cols., 2006). Essa doença crônica

contagiosa apresenta-se em duas formas principais: uma forma externa,

caracterizada pelo desenvolvimento de abscessos encapsulados em linfonodos

superficiais de ovinos e caprinos; e uma forma interna, em que os abscessos

aparecem nos linfonodos viscerais ou em órgãos como pulmão, fígado, rins, útero

e baço. As duas formas podem se desenvolver concomitantemente (Kuria e cols.,

2001; Williamson, 2001).

A LC é distribuída mundialmente e é altamente prevalente em países onde

a ovinocaprinocultura é intensa, tais como Austrália, Nova Zelândia, África do Sul,

Estados Unidos, Canadá e Brasil (Williamson, 2001; Arsenault e cols., 2003; Paton

e cols., 2003; Dorella e cols., 2006). No Brasil, os Estados da Região Nordeste

são os mais afetados, em razão de possuírem a maior concentração de rebanhos

ovinos e caprinos do país (Alves & Pinheiro, 1997; Ribeiro e cols., 2001). Minas

Gerais, apesar de ainda possuir um rebanho reduzido, tem apresentado

crescimento na atividade de ovinocultura, e a LC já tem sido observada com alta

freqüência principalmente nos criatórios da região Norte do Estado (Faria e cols.,

2004).

As perdas econômicas acarretadas pela LC são evidenciadas em maior

parte através da diminuição na produção de leite, carne e lã, da desvalorização da

pele devido às cicatrizes, e do custo das drogas e da mão-de-obra para tratar os

abscessos superficiais dos animais (Alves & Pinheiro, 1997). Perdas ainda mais

importantes podem acontecer no abate, quando parte ou até mesmo carcaças

inteiras podem ser condenadas (Arsenault e cols., 2003; Paule, 2003).

O uso de antibióticos para controlar a doença não representa uma

estratégia viável, uma vez que as drogas não penetram na cápsula dos abscessos

(Alves & Pinheiro, 1997; Piontikowski & Shivvers, 1998; Williamson, 2001).

Portanto, o controle da LC deve ser realizado primariamente por medidas

profiláticas. Considerando que a eficiência das vacinas existentes ainda não é

bem definida (Piontikowski & Shivvers, 1998; Paton e cols., 2003; Dorella e cols.,

2006), a identificação dos animais infectados e a privação destes animais do

convívio com os saudáveis permanecem como as principais medidas de manejo

para o controle desta enfermidade (Williamson, 2001; Dorella e cols., 2006).

Alguns autores sugerem uma estratégia ainda mais agressiva, envolvendo o abate

de qualquer animal portador da infecção (Baird, 1997). No entanto, a inexistência

de um método de diagnóstico completamente satisfatório para LC representa um

impedimento ao manejo eficaz (Dercksen e cols., 2000; Menzies e cols., 2004;

Dorella e cols., 2006).

Devido aos resultados divergentes obtidos com testes sorológicos

desenvolvidos até então (Dercksen e cols., 2000; Williamson, 2001; Menzies e

cols., 2004; Dorella e cols., 2006), e em razão da necessidade de diferenciar C.

pseudotuberculosis de um outro agente patogênico envolvido com a

sintomatologia de LC, tais como Arcanobacterium pyogenes e Pasteurella

multocida, o isolamento desta bactéria diretamente do material purulento de

linfonodos permanece como um dos procedimentos mais fidedignos de

diagnóstico (Alves & Pinheiro, 1997; Ribeiro e cols., 2001; Williamson, 2001). Além

disso, quando um teste sorológico é aplicado em estudos de prevalência de LC ou

até mesmo em um programa de erradicação dessa doença num rebanho, é

necessária a disponibilidade de um teste confirmatório altamente sensível e

específico (Dercksen e cols., 2000; Williamson, 2001); tal papel ainda é

desempenhado pela cultura bacteriológica seguida por identificação bioquímica de

isolados. O desenvolvimento de um método rápido e específico para detectar C.

pseudotuberculosis pode ser de grande valor no diagnóstico da LC.

Çetinkaya e cols. (2002) propuseram um teste baseado na reação em

cadeia da polimerase (PCR) para identificar isolados de C. pseudotuberculosis

através da amplificação parcial da seqüência do gene do RNA ribossômico 16S

(16S rDNA). No entanto, o teste apresentou limitações, incluindo a inabilidade de

distinguir a bactéria C. ulcerans e a dependência de cultivo bacteriano prévio.

Neste contexto, a proposta do presente trabalho foi desenvolver um ensaio

de PCR-multiplex (mPCR) para amplificar simultaneamente três genes específicos

da C. pseudotuberculosis, quais sejam: 16S rDNA (RNA ribossômico 16S), rpoB

(subunidade beta da RNA polimerase), e pld (exotoxina fosfolipase D). A

amplificação de múltiplos loci numa mesma reação de PCR é uma estratégia

amplamente utilizada para detecção de patógenos, por apresentar uma série de

vantagens, incluindo a identificação altamente específica do microrganismo de

interesse com grande economia de tempo e de reagentes (Edwards & Gibbs,

1995; Halbert e cols., 2005; O’Halloran & Cafferkey, 2005; Persson & Olsen,

2005).

1.2. ESTRUTURA DA DISSERTAÇÃO

O presente trabalho tem início com um artigo de revisão da literatura sobre

C. pseudotuberculosis, do qual participei ativamente da redação, em vias de ser

publicado no periódico científico francês Veterinary Research. Neste artigo são

abordadas as principais questões concernentes à microbiologia e virulência da C.

pseudotuberculosis, bem como os pontos mais importantes relativos ao seu

processo infeccioso em pequenos ruminantes.

Em seguida, são apresentados os objetivos gerais e específicos do

trabalho, os quais se relacionam com o desenvolvimento de um teste molecular

para identificação específica de isolados de C. pseudotuberculosis, além da rápida

detecção desta bactéria em amostras clínicas de animais portadores de LC.

Uma seção detalhada sobre os materiais e métodos utilizados durante o

trabalho foi incluída, para que outros laboratórios possam se beneficiar com estas

metodologias e implementá-las rapidamente.

Os resultados e discussões são apresentados sob a forma de um

manuscrito que será posteriormente submetido para publicação em forma de

artigo em um periódico científico internacional de referência na área de

diagnóstico molecular microbiológico. Ainda nesta seção, são apresentados

resultados adicionais que suportam os dados apresentados no manuscrito do

artigo além de abrirem a possibilidade de confecção de um segundo artigo.

Finalmente, são apresentadas as considerações finais e perspectivas do

trabalho.

1.3. REVISÃO DA LITERATURA

ARTIGO DE REVISÃO:

Corynebacterium pseudotuberculosis: microbiology, biochemical properties,

pathogenesis and molecular studies of virulence.

Fernanda Alves DORELLA, Luis Gustavo Carvalho PACHECO, Sérgio Costa

OLIVEIRA, Anderson MIYOSHI, Vasco AZEVEDO.

Vet. Res., no prelo.

2. OBJETIVOS

2.1. OBJETIVO GERAL

Desenvolver um ensaio de PCR-multiplex (mPCR) para amplificar

simultaneamente três genes específicos de Corynebacterium pseudotuberculosis,

e avaliar sua utilidade para a identificação de isolados bacterianos bem como para

a detecção rápida desse patógeno em amostras clínicas de animais suspeitos de

serem portadores de linfadenite caseosa.

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

� Padronizar uma reação de PCR para amplificação eficiente e simultânea

dos genes 16S rRNA, rpoB e pld de C. pseudotuberculosis.

� Desenhar iniciadores para amplificação específica do gene pld de C.

pseudotuberculosis, permitindo diferenciação de C. ulcerans.

� Testar a especificidade do ensaio de mPCR, utilizando DNAs genômicos de

bactérias taxonomicamente próximas a C. pseudotuberculosis.

� Avaliar a reprodutibilidade do ensaio desenvolvido, utilizando DNA

genômico de bactérias isoladas em campo.

� Padronizar um protocolo de extração de DNA genômico bacteriano

diretamente de amostras de pus, sangue e soro de animais portadores de

linfadenite caseosa.

� Avaliar a sensibilidade do ensaio de mPCR para detectar C.

pseudotuberculosis em amostras clínicas provenientes de animais

sabidamente infectados.

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. EQUIPAMENTOS UTILIZADOS

� Agitador magnético de soluções (TradeLab)

� Aparato para eletroforese Horizon® 58 (Gibco BRL)

� Balança eletrônica (Marte)

� Banho-maria (Precision)

� Capela química (Permution)

� Centrífuga 5417C (Eppendorf)

� Centrífuga refrigerada MR 23i (Jouan)

� Equipamento de fotodocumentação (Kodak)

� Espectrofotômetro (Bio-Rad)

� Estufa incubadora (Nova Ética)

� Fluxo laminar (Veco)

� Forno Microondas (CCE)

� Freezer -20ºC (Electrolux)

� Freezer -80ºC (Sanyo)

� Micropipetas Pipetman® (Gilson)

� pHMETRO (Digimed)

� Seqüenciador automático MegaBACE 1000 (Amersham Biosciences)

� Shaker incubador (Nova Ética)

� Termociclador PTC-100 (MJ Research, Inc.)

� Transiluminador (BioSystematica)

� Vortex (IKA)

3.2. REAGENTES, MEIOS DE CULTURA E SOLUÇÕES

3.2.1. REAGENTES UTILIZADOS

� 1 kb Plus DNA Ladder (Invitrogen)

� AccuPrime Taq DNA Polymerase System (Invitrogen)

� Ácido Bórico (Cirq)

� Acrilamida (Promega)

� Ágar bacteriológico (bioBRÁS)

� Agarose (Eurobio)

� AgNO3 (Synth)

� Água mili-Q autoclavada

� Álcool Isoamílico (Synth)

� Azul de Bromofenol (Synth)

� Bgl I (Stratagene)

� Brain Heart Infusion (Oxoid)

� Brometo de Etídio (Eurobio)

� ChargeSwitch gDNA 1 ml Serum Kit (Invitrogen)

� Cla I (Promega)

� Clorofórmio (Cirq)

� CTAB

� DYEnamic ET Dye Terminator Kit (Amersham Biosciences)

� EDTA (Synth)

� Eppendorf® MasterMix 2.5X (Eppendorf)

� Etanol (Synth)

� Formaldeído (Merck)

� GeneRuler DNA Ladder Mix (Fermentas)

� Glicogênio (Gibco)

� HCl (Merck)

� Lysozyma (USB)

� NaAc (Synth)

� NaCl (Cirq)

� NaOH (Cin. Química)

� NN Metil-bisacrilamida (Promega)

� Persulfato de amônio (Gibco)

� Polietileno glicol (PEG) 8000

� Proteinase K (Invitrogen)

� RNase A (Invitrogen)

� SDS (Synth)

� Sódio-N-lauroilsarcosina (Powder)

� Taq DNA Polymerase, Recombinant (Invitrogen)

� Tris-base (Invitrogen)

� Tween-80

� UltraPure™ Buffer-Saturated Phenol (Invitrogen)

� Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega)

3.2.2. MEIOS DE CULTURA

Caldo “Infusão Cérebro-Coração” (Brain Heart Infusion) e placas BHI ágar:

37 g de BHI em pó (Oxoid, Hampshire, Inglaterra) são adicionados a 1 litro de

água destilada; após homogeneizar, o pH da mistura é acertado para 7,4 e o meio

é então autoclavado por 20 minutos a 120ºC. Este meio é acrescido de ágar

bacteriológico na concentração final de 1,5% para cultura em meio sólido. Para o

preparo de placas BHI ágar-sangue, adiciona-se sangue de carneiro na

concentração final de 5%.

3.2.3. SOLUÇÕES

Acrilamida 29:1 (1 litro): Misturar: 290 g de acrilamida; 10 g de NN Metil-

bisacrilamida; completar com água destilada para 1.000 ml.

Brometo de Etídio: Estocar a 5 mg/ml. Utilizar a 0,1-0,5 µg/ml. Conservar ao

abrigo da luz.

CTAB-NaCl: Misturar: 40 ml de solução de CTAB (10%) e 50 ml de solução de

NaCl (5M).

Fenol:Clorofórmio:Álcool Isoamílico: Misturar em um recipiente de vidro

escuro: 25 ml de solução saturada de fenol; 24 ml de clorofórmio; e 1 ml de álcool

isoamílico.

Glicogênio (20 mg/ml): Adicionar 100 mg de glicogênio a 5 ml de água destilada.

Filtrar a mistura em filtro de 0,45 µµµµm.

Persulfato de amônio (10%): Diluir 10 g de persulfato de amônio em 100 ml de água

destilada. Aliquotar em microtubos de 1,5 ml.

Polietileno glicol (PEG) 8000 (15%): Misturar: 3,75 g de PEG 8000; 3,65 g de NaCl;

completar com água destilada para 25 ml (agitar em banho-maria).

Sarcosil (30%): Diluir 30 g de sódio-N-lauroilsarcosina em 100 ml de água destilada.

Estocar a 4ºC.

Solução de coloração: Misturar: 0,15 g de AgNO3; 50 ml de solução fixadora;

completar com 100 ml de água destilada.

Solução fixadora: Misturar: 100 ml de etanol absoluto; 5 ml de ácido acético;

completar com água destilada para 1.000 ml (homogeneizar por inversão).

Solução reveladora: Misturar: 15 g de NaOH; 3 ml de formaldeído; completar

com água destilada para 1.000 ml (homogeneizar em agitador).

Tampão de Amostra (5X): Glicerol a 50%; Azul de bromofenol a 0,20%; e solvente

TBE a 2,5X. Estocar a 4ºC.

TBE 5X (4 litros): Misturar: 216 g deTris-base; 110 g de ácido bórico; 80 ml de

EDTA (0,5 M; pH 8,0); completar com água destilada para 4.000 ml; homogeneizar

e medir o pH (entre 8,0 e 8,5).

Tris-EDTA-lisozima (Solução II – Extração de DNA genômico): Misturar: 1 ml

de Tris-HCl (1M; pH 7,0); 2 ml de EDTA (0,5M; pH 8,0); 6 ml de NaCl (5M); e 1 g

de lysozyma; completar com água destilada para 100 ml. [Concentrações finais:

Tris-HCl (10mM); EDTA (10mM); NaCl (300mM); lisozima (10 mg/ml)].

Tris-EDTA-RNAse (Solução I – Extração de DNA genômico): Misturar: 1 ml de

Tris-HCl (1M; pH 7,0); 2 ml de EDTA (0,5M; pH 8,0); 6 ml de NaCl (5M); e RNase

A; completar com água destilada para 100 ml. [Concentrações finais: Tris-HCl

(10mM); EDTA (10mM); NaCl (300mM); RNase A (50 µg/ml)].

3.3. MATERIAL BIOLÓGICO

3.3.1. LINHAGENS BACTERIANAS E CONDIÇÕES DE CULTIVO

As linhagens bacterianas utilizadas neste estudo estão listadas na tabela 1.

As bactérias foram cultivadas em caldo “infusão cérebro-coração”, em aerobiose, a

37ºC por 48-72 horas, ou mantidas em placas BHI ágar. Para as linhagens de C. bovis,

Tween-80 foi adicionado ao meio de cultura, na concentração final de 1%.

Tabela 1. Linhagens bacterianas utilizadas neste estudo.

Designação da linhagem Características / Fonte

Arcanobacterium haemolyticum SL2212 Hospital Universitário Ghent,

Bélgica.*

A. pyogenes A93 00085 Hospital Universitário Ghent,

Bélgica.*

A. pyogenes HJ26 BA224.11 Hospital Universitário Ghent,

Bélgica.*

A. pyogenes-like HJ51 B Hospital Universitário Ghent,

Bélgica.*

A. pyogenes-like HJ51 Da Hospital Universitário Ghent,

Bélgica.*

Corynebacterium amycolatum HJ08

I4218 LV

Hospital Universitário Ghent,

Bélgica.*

C. bovis DL BOV23 Hospital Universitário Ghent,

Bélgica.*

C. bovis DL BOV25 Hospital Universitário Ghent,

Bélgica.*

C. pseudotuberculosis biovar equi

CIP 5297

Coleção Instituto Pasteur, França.*

C. pseudotuberculosis biovar ovis

(VD21; VD23; VD27; VD28; VD33; VD36;

VD37; VD38; VD41; VD42; VD43; VD44;

Bactérias isoladas a partir de

animais criados extensivamente e

identificadas como C.

VD45; VD46; VD48; VD50; VD52; VD53;

VD54; VD55; VD56; VD57; VD58; VD59;

VD60; VD61; VD62; VD63; VD99; 01; 05;

08; 09; 11; 12; 21; 217)

pseudotuberculosis biovar ovis

através de testes bioquímicos por

técnicos da UFBA.


T1

Instituto de Ciências da Saúde,

UFBA, Brasil.


1002

Instituto de Ciências da Saúde,

UFBA, Brasil.


ULCC06.334

Hospital Universitário Ghent,

Bélgica.*


CIP 102968T

Coleção Instituto Pasteur, França.*

C. renale CIP 6937 Coleção Instituto Pasteur, França.*

C. renale CIP 103421T Coleção Instituto Pasteur, França.*

C. ulcerans ULCA3.675,1 Hospital Universitário Ghent,

Bélgica.*

C. ulcerans HJ01 BM3796.3 Hospital Universitário Ghent,

Bélgica.*

C. ulcerans HJ02 MN 675.3 Hospital Universitário Ghent,

Bélgica.*

C. ulcerans ULCB12.735,2 Hospital Universitário Ghent,

Bélgica.*

* Bactérias gentilmente cedidas pelo Dr. Mario Vaneechoutte, Ghent University Hospital, Bélgica.

T Linhagem de referência.

3.3.2. AMOSTRAS CLÍNICAS

3.3.2.1. AMOSTRAS DE MATERIAL PURULENTO

Amostras de material purulento (n = 56) foram coletadas assepticamente de

abscessos presentes em linfonodos de ovelhas ou cabras naturalmente

portadoras de linfadenite caseosa (Carminati, 2005). As coletas foram realizadas

em duas regiões endêmicas para esta doença na região Nordeste do Brasil, por

técnicos da UFBA (Salvador – BA) e da EMBRAPA Caprinos (Sobral –CE). A

tabela 2 apresenta o detalhamento das amostras de pus utilizadas neste estudo.

3.3.2.2. AMOSTRAS DE SANGUE E SORO

Amostras de sangue e soro foram obtidas tanto de animais apresentando

sinais clínicos de linfadenite caseosa (n = 19) quanto de animais que não

apresentavam nenhum sinal da doença (n = 20) e pertenciam a rebanhos sem

histórico de infecção por C. pseudotuberculosis. Foi utilizado o sistema

Vacutainer de coleta de sangue (Becton Dickinson, Estados Unidos).

Tabela 2. Amostras de material purulento utilizadas neste estudo.

Animal* Espécie Raça Fonte Animal* Espécie Raça Fonte

100 Ovina ND UFBA 34/05 Ovina ND EMB.

SN Ovina ND UFBA 318 Caprina ND EMB.


52B Ovina ND UFBA 588 Caprina ND EMB.


154 Ovina ND UFBA 10 Caprina ND EMB.

1 (23/08) Caprina ND UFBA 351 Caprina ND EMB.



4 (23/08) Caprina ND UFBA 87 Caprina Can. EMB.

5 (23/08) Caprina ND UFBA SN Caprina ND EMB.


7 (23/08) Caprina ND UFBA 450 Caprina Mox. EMB.


9 (23/08) Caprina ND UFBA 272 Caprina Ang. EMB.

10(23/08) Caprina ND UFBA SN Ovina ND EMB.

11(23/08) Caprina ND UFBA 371 Caprina Ang. EMB.

12(23/08) Caprina ND UFBA 3406 Caprina ND EMB.

13(23/08) Caprina ND UFBA 240 Caprina Mox. EMB.

14(23/08) Caprina ND UFBA 57 Ovina S.In. EMB.

2 (14/07) Caprina ND UFBA 01 Ovina ND EMB.


382 Caprina ND EMB. 3647 Caprina ND EMB.

27/09 Caprina ND EMB. 3556 Caprina ND EMB.


Lab47 Caprina ND EMB. 640 Caprina ND EMB.

35 Caprina ND EMB. 462BNB Caprina ND EMB.


EMB. = EMBRAPA Caprinos. ND = Não definida. Can. = Canindé. Mox. = Moxotó. Ang. = Anglo.

S.In. = Santa Inês.

*Número de identificação do animal na Universidade Federal da Bahia ou na EMBRAPA Caprinos.

3.4. MÉTODOS

3.4.1. ISOLAMENTO BACTERIANO E IDENTIFICAÇÃO BIOQUÍMICA

DOS ISOLADOS

Todas as amostras de pus coletadas foram submetidas a cultivo bacteriano,

como mencionado no item 3.3.1. Teste de Gram foi realizado com as colônias

obtidas que apresentaram morfologia semelhante a C. pseudotuberculosis

(colônias pequenas de coloração creme-alaranjada e opaca). Os isolados que

apresentaram coloração Gram-positiva foram submetidos a testes bioquímicos

para identificação bacteriana (testes de urease, catalase, e fermentação de

glicose) (Smibert & Krieg, 1994; Carminati, 2005). Os que apresentaram

resultados positivos nestes testes bioquímicos foram posteriormente submetidos

aos testes de hemólise sinérgica com Rhodococcus equi ATCC33701 e inibição

de beta-hemólise com Staphylococcus aureus ATCC25923 (Smibert & Krieg,

1994; Carminati, 2005). Confirmação da identificação foi realizada com a bateria

comercial de testes bioquímicos API Coryne (bioMérieux SA, França).

O isolamento e identificação de C. pseudotuberculosis foi utilizado como

padrão-ouro para avaliar a sensibilidade do teste estudado.

3.4.2. EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO BACTERIANO

3.4.2.1. EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO DE CULTURAS

BACTERIANAS

A extração de DNA genômico a partir de culturas foi realizada da mesma

forma para todas as linhagens bacterianas utilizadas neste estudo. Culturas de 20

ml foram centrifugadas a 5.000 rpm, por 10 min., a 4ºC. O sobrenadante foi

descartado e o precipitado ressuspendido em 1 ml de solução I (vide item 3.2.3).

Após vortexar, a mistura foi novamente centrifugada, desta vez a 13.000 rpm, por

10 min., a temperatura ambiente. O sobrenadante foi descartado, e foi adicionado

1 ml de solução II (vide item 3.2.3). Após ressuspender o precipitado, a amostra foi

incubada em banho-maria por 30 min. a 37ºC. Foram adicionados 30 µl de sarcosil

30%; a amostra foi homogeneizada por 15 min. e então deixada em banho-maria a

65ºC por 5 min., seguido por incubação a 4ºC por 5 min.

Para purificação do DNA extraído, foi utilizado um protocolo padrão de

fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (Sambrook e cols., 1989). Em resumo, 1 ml da

solução de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (vide item 3.2.3) foi adicionado à

amostra. Após vortexadas, as amostras foram centrifugadas a 13.000 rpm por 7

min. A fase superior da amostra foi retirada e transferida para um novo microtubo

de 2 ml. Repetiu-se o passo de purificação com fenol:clorofórmio:álcool isoamílico.

Ao final, a fase superior da amostra foi transferida para um novo microtubo, a fim

de proceder-se à precipitação do DNA genômico. Etanol absoluto foi adicionado

numa quantidade equivalente a duas vezes o volume da amostra. Acrescentou-se

solução de NaAC (3M) numa quantidade equivalente a 10% do volume da

amostra, e solução de glicogênio equivalente a 1% do volume total. O DNA foi

precipitado O.N. a -20ºC. Após centrifugação a 13.000 rpm por 10 min., o

precipitado foi lavado com etanol a 70% e o DNA ressuspendido em água mili-Q

estéril.

3.4.2.2. EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO BACTERIANO A PARTIR DE

AMOSTRAS CLÍNICAS DE LINFADENITE CASEOSA

3.4.2.2.1. EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO BACTERIANO A PARTIR DE

AMOSTRAS DE PUS E SANGUE COM OS PROTOCOLOS CTAB-SDS E PK-ROCHE

Dois protocolos previamente descritos para extração de DNA de

Mycobacterium tuberculosis a partir de amostras clínicas de pacientes portadores

de tuberculose (Honoré-Bouakline e cols., 2003) foram utilizados para extração de

DNA de C. pseudotuberculosis a partir das amostras clínicas de linfadenite

caseosa. Aproximadamente 100 mg de pus ou o precipitado de 2 ml de uma

amostra de sangue foram ressuspendidos em 1 ml de solução II (vide item 3.2.3),

em um microtubo de 2 ml. As amostras foram incubadas em banho-maria a 37ºC

por 1 hora. 20 µl de proteinase K (20 mg/ml) foram adicionados a cada uma das

amostras, que foram incubadas em banho-maria a 56ºC por 2-3 horas. Após o

tempo de incubação, as amostras foram separadas em duas alíquotas de 500 µl.

À primeira alíquota, foram adicionados 35 µl de SDS a 10%; a amostra foi

vortexada e incubada em banho-maria a 65ºC, por 10 minutos. Foram adicionados

90 µl de CTAB-NaCl, e novamente a amostra foi incubada a 65ºC por 10 minutos.

A segunda alíquota de 500 µl foi centrifugada por 5 minutos a 13.000 rpm;

parte do sobrenadante foi retirada com uma pipeta, de forma a restarem 100 µl de

solução no final. A amostra foi então incubada por 15 minutos a 95ºC para

inativação da proteinase K.

O DNA presente em ambas alíquotas foi purificado e precipitado como

descrito no item 3.4.2.1.


AMOSTRAS DE PUS E SANGUE COM O PROTOCOLO PK-SARCOSIL

Aproximadamente 100 mg de pus ou o precipitado de 2 ml de uma amostra

de sangue foram ressuspendidos em 1 ml de solução II (vide item 3.2.3), em um

microtubo de 2ml. As amostras foram incubadas em banho-maria a 37ºC por 1

hora. 20 µl de proteinase K (20 mg/ml) foram adicionados a cada uma das

amostras, que foram incubadas em banho-maria a 56ºC por 2-3 horas. Após o

tempo de incubação, as amostras foram separadas em duas alíquotas de 500 µl.

A cada alíquota foram acrescentados 25 µl de sarcosil 30%. As amostras foram

homogeneizadas por 15 min. e incubadas em banho-maria a 65ºC por 5 min. Após

incubação a 4ºC por 5 min., prosseguiu-se a purificação e precipitação do DNA,

como mencionado no item 3.4.2.1.


AMOSTRAS DE PUS E SANGUE COM O KIT WIZARD® GENOMIC DNA

PURIFICATION (PROMEGA)

Aproximadamente 100 mg de pus ou o precipitado de 2 ml de uma amostra

de sangue foram ressuspendidos em 600 µl de solução II (vide item 3.2.3), em um

microtubo de 2ml. As amostras foram incubadas em banho-maria a 37ºC por 1

hora. Após centrifugação a 13.000 rpm por 2 min., o sobrenadante foi descartado

e foram acrescentados 600 µl de “Nuclei Lysis Solution”; a mistura foi

homogeneizada gentilmente com o auxílio de uma pipeta. Incubou-se em banho-

maria a 80ºC por 5 min.; as amostras foram deixadas para esfriar a temperatura

ambiente. Então, adicionou-se 3 µl de “RNase solution”; após homogeneizar,

novamente as amostras foram incubadas, desta vez a 37ºC por 30 min. Adicionou-

se 200 µl de “Protein Precipitation Solution” e seguiu-se incubação no gelo por 5

min. As misturas foram centrifugadas a 13.000 rpm por 3 min. e o sobrenadante

contendo DNA foi transferido para um novo tubo. A precipitação do DNA foi

realizada como mencionado no item 3.4.2.1.


AMOSTRAS DE SORO COM O KIT CHARGESWITCH gDNA 1 ML SERUM

(INVITROGEN)

A extração de DNA a partir das amostras de soro foi feita de acordo com as

recomendações do fabricante do “ChargeSwitch® gDNA 1 ml Serum Kit”.

Brevemente, a 1 ml de soro foram adicionados 700 µl do tampão de lise (L19), 30

µl de proteinase K e 5 µl de RNase A. A mistura foi misturada gentilmente e

incubada à temperatura ambiente por 20 min. Então, foram adicionados 250 µl do

tampão de purificação (N7) e 30 µl da solução contendo esferas magnéticas. Após

homogeneizar, as amostras foram incubadas à temperatura ambiente por 2 min.;

posteriormente, os microtubos foram colocados na raque magnética por 3 min.

Assim que se formou o precipitado de esferas magnéticas no fundo dos tubos, os

sobrenadantes foram retirados com o auxílio de pipeta e descartados. Os tubos

foram retirados da raque magnética, e o precipitado foi ressuspendido em 1 ml de

tampão de lavagem (W12). Após voltar os tubos para a raque, os sobrenadantes

foram novamente retirados e repetiu-se a lavagem dos precipitados. A fim de eluir

o DNA ligado às esferas magnéticas, 50 µl de tampão de eluição (E5) foram

adicionados a cada amostra; incubou-se por 2 min. à temperatura ambiente e os

tubos foram recolocados na raque magnética até que todas as esferas

precipitassem. O sobrenadante contendo o DNA purificado foi transferido para um

novo microtubo.

3.4.3. DOSAGEM DO DNA GENÔMICO EXTRAÍDO

A dosagem do DNA genômico extraído foi feita com o auxílio de um

espectrofotômetro, como descrito (Brigido, 2003). Basicamente, a medida de

absorbância num comprimento de onda de 260 nm foi multiplicada pelo fator de

conversão para DNA fita dupla (50) e pela diluição da amostra, para obter a

concentração em µg/ml.

3.4.4. ENSAIO DE PCR-MULTIPLEX

A tabela 3 lista os iniciadores utilizados neste estudo. A padronização do

ensaio de PCR-multiplex seguiu basicamente os passos descritos por Henegariu e

cols. (1997), sumarizados na figura 1.

As reações foram feitas para um volume final de 10 µl. A tabela 4 lista as

concentrações de reagentes utilizadas com cada uma das três polimerases

testadas.

Os iniciadores 12S-F e 12S-R (12S rDNA de caprinos e ovinos) são

incluídos nas reações com DNA extraído diretamente de amostras clínicas. O

produto de 274 pb funciona como um controle interno de amplificação não

competitivo (Hoorfar e cols., 2004), o qual permite diferenciar amostras que inibem

a reação de PCR das que são verdadeiramente negativas.

Tabela 3. Iniciadores utilizados neste estudo.

Iniciador Seqüência Gene-alvo [ ] uso Fonte

16S-F 5’-ACCGCACTTTAGTGTGTGTG-3’ 16S rDNA 2 µM

16S-R 5’-TCTCTACGCCGATCTTGTAT-3’ 16S rDNA 2 µM

Çetinkaya e cols., 2002

C2700F 5’-CGTATGAACATCGGCCAGGT-3’ rpoB 2 µM

C3130R 5’-TCCATTTCGCCGAAGCGCTG-3’ rpoB 2 µM

Khamis e cols., 2004

MPLD1 5’-ATAAGCGTAAGCAGGGAGCA-3’ pld 2 µM

MPLD2.1 5’-ATCAGCGGTGATTGTCTTCCAGG-3’ pld 2 µM

Este trabalho.a

12S-F 5’-CCAGCCACCGCGGTCATACG-3’ 12S rDNA 0,2 µM

12S-R 5’-TGAGTTTCGGGCTGTTGCCG-3’ 12S rDNA 0,2 µM

Este trabalho.b

a Iniciadores desenhados de acordo com a seqüência do gene da phospholipase D de C.

pseudotuberculosis (acesso GenBank: L16585). b Iniciadores desenhados de acordo com as seqüências do 12S rDNA de Capra hircus e Ovis aries

(acessos GenBanK: AJ490504 e AJ490503).

Figura 1. Protocolo passo-a-passo para o desenvolvimento e otimização de

PCR-multiplex. TRADUZIDO e ADAPTADO: Henegariu e cols., 1997.

Passo 1. Escolha das seqüências dos iniciadores • GC = 30-60% • 20 pb ou maior • Produtos de amplificação separáveis em gel de agarose

Passo 2. Teste/ alinhe os iniciadores • uns com os outros • BLAST para seqüências repetitivas

Passo 3. PCR singleplex: programa inicial � Amplifique todos os loci individualmente; mesmas condições � Use tampão a 1X, sem adjuvantes � Ajuste somente as condições dos ciclos

Passo 4. PCR Multiplex: mistura equimolar de iniciadores � 0,1 a 0,4 µM de cada iniciador � Use o programa de PCR do passo 3

A. Todos os produtos estão fracos a) Use tempos de extensão maiores b) Diminua tº de extensão para 62-68ºC c) Diminua tº de anelamento em pequenos passos (2ºC) d) Ajuste a conc. de Taq polimerase

B. Produtos pequenos estão fracos a) Aumente a conc. de tampão para 1,4-2X b) Diminua tº de anelamento e ou extensão c) Aumente a conc. de iniciadores para os loci fracos

C. Produtos grandes estão fracos a) Aumente o tempo de extensão b) Aumente tº de anelamento e ou extensão c) Aumente a conc. de iniciadores para os loci fracos d) Diminua a conc. de tampão para 0,7-0,8X mas mantenha MgCl2 constante a 1.5-2 mM

D. Produtos inespecíficos a) grandes: aumente conc. tampão para 1,4-2X b) pequenos: diminua conc. de tampão para 0,7-0,9X c) Aumente gradualmente a tº anelamento d) Diminua a quantidade de molde e enzima e) Aumente MgCl2 (máx. 12 mM)

Passo 5.

Quando necessário, diluições seriadas de duas vezes (1:2, 1:4, 1:8) foram

realizadas com as amostras clínicas, a fim de remover a inibição da PCR.

As reações foram preparadas em microtubos de 200 µl (PerkinElmer) e

realizadas em um termociclador (PTC-100, MJ Research Inc.), nas condições

descritas na tabela 4. Os produtos de amplificação foram visualizados em gel de

agarose a 1% corado com brometo de etídio.

Tabela 4. Reações de mPCR com diferentes polimerases.

Sistemas e Reagentes Concentração

Final

Condições dos

Ciclos

AccuPrime™ Taq DNA polymerase

Tampão 10X II 1X

Iniciadores 2 µM ou 0,2 µM a

Taq DNA polimerase 1,5 U

DNA molde 10-100ng b

H2O mili-Q q.s.p. 10 µl

P1: 95ºC por 3 min.


P3: 58ºC por 40 seg


e 30 seg.

P5: 40 X de P2 a P4


Taq DNA Polymerase, Recombinant

Tampão 10X 1X

dNTPs 2 mM

MgCl2 3 mM

Iniciadores 2 µM ou 0,2 µM a

Taq DNA polimerase 1,5 U





P3: 58ºC por 40 seg


e 30 seg.

P5: 40 X de P2 a P4


Eppendorf® MasterMix (2.5X)

MasterMix (2.5X) 1X



As mesmas

descritas para

AccuPrime™ Taq

DNA polymerase.

a Veja tabela 3. P = Passo. b Somente em reações utilizando DNA extraído de culturas puras.

3.4.4.1. TESTE DE SENSIBILIDADE ANALÍTICA

Para testar a sensibilidade analítica do ensaio de mPCR, DNA genômico de

C. pseudotuberculosis CIP 102968T foi extraído (vide item 3.4.2.1) e dosado em

espectrofotômetro. A concentração do DNA foi acertada para 100 ng/µl e diluições

seriadas de dez vezes foram realizadas, como segue: 10 ng/µl; 1 ng/µl; 100 pg/µl;

10 pg/µl; 1 pg/µl; 100 fg/µl; e 10 fg/µl. Reações de PCR foram feitas em triplicata

com cada uma destas concentrações de DNA, para todas as polimerases

testadas. Os produtos de amplificação foram analisados em gel de agarose 1%.

Uma das séries de reações foi corrida em gel de poliacrilamida a 6% corado

pela prata, para avaliar se haveria diferença na sensibilidade de detecção de

produtos amplificados, comparado ao gel de agarose a 1%.

3.4.4.2. TESTE DE ESPECIFICIDADE

Para testar a especificidade do ensaio de mPCR foram feitas reações

contendo 10 ng de DNA genômico de cada uma das linhagens bacterianas

taxonomicamente próximas a C. pseudotuberculosis, listadas na tabela 1. O perfil

de amplificação de cada linhagem foi analisado em gel de agarose a 1%.

3.4.4.3. TESTE DE REPRODUTIBILIDADE

A reprodutibilidade do ensaio de mPCR foi testada com 40 isolados de C.

pseudotuberculosis, previamente identificados por testes bioquímicos (Tab. 1).

3.4.4.4. CONFIRMAÇÃO DOS PRODUTOS AMPLIFICADOS

Para confirmar a especificidade dos produtos amplificados pelo ensaio de

mPCR, cada um dos três genes foi amplificado separadamente para dez isolados

de C. pseudotuberculosis; os produtos de PCR foram purificados por um protocolo

de precipitação utilizando PEG 8000 (Kusukawa e cols., 1990), e posteriormente

seqüenciados. Basicamente, o produto da reação de PCR foi transferido para um

microtubo de 500 µl. Volume igual de solução de PEG 8000 (15%) foi adicionado e

a mistura foi incubada em banho-maria a 37ºC por 15 min. Após centrifugar a

13.000 rpm por 15 min., o sobrenadante foi cuidadosamente retirado com a pipeta

e descartado. 125 µl de etanol a 80% gelado foram adicionados e centrifugou-se

novamente a 13.000 rpm por 5 min. O sobrenadante foi retirado com a pipeta.

Realizou-se mais uma lavagem com etanol 80%, e o precipitado seco foi

ressuspendido em água mili-Q.

A reação de sequenciamento dos produtos de PCR purificados foi feita

utilizando o kit DYEnamic ET Dye Terminator (Amersham Biosciences), de acordo

com as recomendações do fabricante. As seqüências foram geradas no aparelho

MegaBACE 1000 (Amersham Biosciences).

3.4.4.5. LIMITE DE DETECÇÃO EM AMOSTRAS CLÍNICAS

Para determinar o limite de detecção do ensaio de mPCR em amostras

clínicas, amostras de sangue de caprinos não-portadores de linfadenite caseosa

foram misturadas com diluições de uma cultura de 48 horas de C.

pseudotuberculosis. Essas diluições foram previamente plaqueadas em meio BHI-

ágar para determinar a quantidade de unidades formadoras de colônia (UFC) de

C. pseudotuberculosis por ml. A mistura foi processada por todo o protocolo de

extração descrito no item 3.4.2.2.2. Reações de mPCR foram feitas com os DNAs

extraídos de todas as misturas. O teste de limite de detecção foi realizado em

triplicata e o resultado expresso como uma média dos três valores.

3.4.4.6. CÁLCULO DA SENSIBILIDADE DIAGNÓSTICA

Para calcular a sensibilidade diagnóstica do ensaio de mPCR, foi obtida a

proporção entre as amostras que renderam um resultado positivo no teste e

aquelas que renderam resultados positivos no teste de referência (isolamento e

identificação bacteriana) (McAdam, 2000).

3.4.5. ANÁLISE ESTATÍSTICA

Uma análise foi realizada para avaliar se há diferença na sensibilidade do

ensaio de mPCR quando aplicado em amostras de ovinos ou caprinos. Para tal,

uma tabela 2 x 2 foi construída com os resultados obtidos e aplicou-se o teste qui-

quadrado (Ayres e cols., 2000). O pacote de análises estatísticas STATISTICA

(StatSoft, Inc.) foi utilizado para calcular intervalos de confiança.

3.4.6. DETERMINAÇÃO DA EQUIVALÊNCIA GENÔMICA DE C.

pseudotuberculosis

Para determinar a equivalência em fg do genoma de 1 UFC de C.

pseudotuberculosis extraiu-se o DNA genômico de uma cultura de 10 ml cuja

densidade de células foi determinada por plaqueamento. O DNA extraído foi

dosado em espectrofotômetro e a relação “Quantidade de DNA/ Nº de UFC” foi

calculada.

3.4.7. DIGESTÃO ENZIMÁTICA DOS PRODUTOS DA mPCR

Os produtos de mPCR de 4 linhagens de C. pseudotuberculosis e 4

linhagens de C. ulcerans foram utilizados, diretamente ou após precipitação, em

reações de digestão enzimática com as enzimas de restrição Cla I e Bgl I; as

reações foram feitas de acordo com as recomendações dos fabricantes. Este teste

foi realizado a fim de avaliar se seria possível identificar polimorfismos de

comprimento de fragmentos de restrição entre os isolados.

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1. ARTIGO

Multiplex PCR Assay for Identification of Corynebacterium

pseudotuberculosis from Pure Cultures and for Rapid Detection of this

Pathogen in Clinical Samples

Luis G. C. Pacheco, Roberta R. Pena, Thiago L. P. Castro, Fernanda A. Dorella,

Robson C. Bahia, Renato Carminati, Marcílio N. L. Frota, Sérgio C. Oliveira,

Roberto Meyer, Francisco S. F. Alves, Anderson Miyoshi, Vasco Azevedo.

Este manuscrito será submetido para publicação em forma de artigo num

periódico científico internacional de referência na área de diagnóstico molecular

microbiológico.

Multiplex PCR Assay for Identification of Corynebacterium pseudotuberculosis from

Pure Cultures and for Rapid Detection of this Pathogen in Clinical Samples

Running title: MULTIPLEX PCR FOR DETECTION OF C. PSEUDOTUBERCULOSIS

Luis G. C. Pacheco,1, 2 Roberta R. Pena,1 Thiago L. P. Castro,1 Fernanda A. Dorella,1

Robson C. Bahia,3 Renato Carminati,3 Marcílio N. L. Frota,4 Sérgio C. Oliveira,2 Roberto

Meyer,3 Francisco S. F. Alves,5 Anderson Miyoshi,1 and Vasco Azevedo1*

Departamento de Biologia Geral 1 and Departamento de Bioquímica e Imunologia

2,

Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte – MG, Brazil; Departamento de

Bio-Interação, Universidade Federal da Bahia, Salvador – BA, Brazil;3

Universidade

Estadual Vale do Acaraú, Sobral – CE, Brazil;4 and Centro Nacional de Pesquisa de

Caprinos, Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, Sobral – CE, Brazil.5

* Corresponding author. Mailing address: Departamento de Biologia Geral, Instituto de

Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, Av. Antônio Carlos, 6627,

Belo Horizonte – MG, 31.270-901, Brazil. Phone/ Fax: + 55 31 34 99 26 10. E-mail:

[email protected]

ABSTRACT

Corynebacterium pseudotuberculosis is the etiological agent of caseous

lymphadenitis (CLA), a debilitating disease of sheep and goats. Accurate diagnosis of CLA

primarily relies upon microbiological examination, followed by biochemical identification

of isolates. In an effort to facilitate C. pseudotuberculosis detection, we developed a

multiplex-PCR (mPCR) assay targeting three genes of this bacterium: 16S rDNA, rpoB and

pld. This method allowed efficient identification of 40 isolates of this bacterium, which had

been previously identified by biochemical testing. Analysis of taxonomically-related

species did not generate the C. pseudotuberculosis mPCR amplification profile, thereby

demonstrating the assay’s specificity. As little as 1 pg of C. pseudotuberculosis genomic

DNA was detected by this mPCR assay, demonstrating the sensitivity of the method. The

detection limit in clinical samples was estimated to be 103 colony-forming units (CFU). We

were able to detect C. pseudotuberculosis directly in pus samples of infected sheep and

goats (n = 56) with a high diagnostic sensitivity (94.6%). The developed assay significantly

improves rapid C. pseudotuberculosis detection and could supersede bacteriological culture

for microbiological and epidemiological diagnosis of CLA.

Corynebacterium pseudotuberculosis is a mycolic acid-containing facultative

intracellular actinomycete associated with the development of abscesses in a variety of

mammalian hosts (10, 25, 32). This Gram-positive bacterium most commonly causes

ulcerative lymphangitis in horses and caseous lymphadenitis (CLA) in small ruminants (3,

36). The latter is a chronic disease of sheep and goats, mainly characterized by the

formation of suppurative abscesses in superficial and internal lymph nodes (17, 36). CLA is

globally distributed and causes important economic losses for ovine and caprine

husbandries, due to reduced wool, meat and milk yields, culling of affected animals and

condemnation of carcasses and skins in slaughterhouses (10, 36).

Once established in a herd or flock, CLA eradication is problematic due to the

inefficacy of antimicrobial therapy (27, 34, 36). The most reliable control strategy for this

disease involves vaccinating livestock and identifying and removing infected animals (4,

23). However, this approach is hindered by limitations in current diagnostic techniques (10,

21, 36).

Many serological tests have been proposed for CLA diagnosis, including the

complement fixation test (30), the synergistic hemolysis-inhibition test (5), the

microagglutination assay (20), and a C. pseudotuberculosis-exotoxin (phospholipase D)

antigen-based enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (8). Although these tests may

be of great value for the detection of subclinically infected animals, most present

drawbacks, including low sensitivity, poor specificity, and an inability to distinguish

between previously-exposed animals and those still harboring the pathogen. Thus, it is

questionable whether such techniques should be employed to orient culling programs (6,

36).

Accurate CLA diagnosis is primarily based upon clinical observations (external

abscesses) and identification of C. pseudotuberculosis by phenotypic and biochemical tests;

this is important to differentiate this bacterium from other abscess-inducing pathogenic

agents, such as Arcanobacterium pyogenes or Pasteurella multocida (8, 10, 36).

A 16S rDNA-based polymerase chain reaction assay has been developed to identify

C. pseudotuberculosis isolates (6). Although the assay was useful to estimate the

prevalence of CLA in the animals studied, it presented some limitations: (i) it was

dependent on bacterial culture; and (ii) it was not specific enough to distinguish C.

pseudotuberculosis from Corynebacterium ulcerans (6).

In order to improve C. pseudotuberculosis detection by PCR, we developed a

multiplex PCR (mPCR) assay and adapted a protocol to extract bacterial genomic DNA

directly from clinical samples. Amplification of multiple loci in a single reaction through

mPCR is a powerful and widely-used tool for the rapid and specific identification of

pathogenic bacteria (11, 22, 26, 35). Our mPCR targets three C. pseudotuberculosis genes:

16S rDNA, the gene of choice for most microbial taxonomy studies (6, 16); rpoB, a gene

currently used to study phylogenetic relationships in the genera Corynebacterium and

Mycobacterium (10, 15, 16); and pld, which encodes the exotoxin PLD, a

sphingomyelinase implicated in the virulence of C. pseudotuberculosis, C. ulcerans and A.

haemolyiticum (19). This mPCR enabled specific identification of C. pseudotuberculosis

isolates in culture and its direct detection in pus samples from CLA affected animals.

MATERIALS AND METHODS

Bacterial strains and culture conditions. The bacterial strains used in this study

are listed in Table 1. A total of 40 caprine isolates of C. pseudotuberculosis were obtained

from different sources. One type strain of C. pseudotuberculosis biovar ovis, (strain CIP

102968T - Institute Pasteur Collection), and 13 strains of genetically or morphologically

related-bacteria were also used in the experiments.

Bacteria were routinely grown in Brain Heart Infusion broth (BHI: Oxoid,

Hampshire, England) or in BHI 1.5% bacteriological agar plates, at 37ºC for 48-72 hours.

Tween 80 was added to the medium at a final concentration of 1% for the C. bovis strain.

Clinical specimens. Fifty-six pus samples were aseptically collected from

abscessed lymph nodes of naturally-infected sheep (n = 12) and goats (n = 44) found in two

CLA-endemic areas of Brazil. Microbiological examination, followed by biochemical

identification, was used as a gold standard to confirm infection with C. pseudotuberculosis.

In brief, bacteriological culture was made of pus specimens, and the resultant C.

pseudotuberculosis-resembling colonies that stained Gram positive were further tested for

biochemical properties (glucose fermentation, urease and catalase) (8, 31). Synergistic

hemolysis with Rhodococcus equi ATCC33701 and inhibition of β-hemolysis by

Staphylococcus aureus ATCC25923 were also evaluated (8, 31). Species identification was

confirmed using the API Coryne battery (bioMérieux SA, France).

Blood samples were taken from confirmed C. pseudotuberculosis-infected animals

(n = 19) and from healthy animals (n = 20), using the Vacutainer® blood collection system

(Becton Dickinson, USA).

DNA isolation. Two different protocols were adapted for extracting DNA from

pure bacterial cultures and clinical samples.

(i) Bacterial cultures. Chromosomal DNA-extraction was performed in the same

manner for all bacterial strains. A 20 ml 48-72 hour-culture was centrifuged at 4ºC and

2,000 X g for 20 min. Cell pellets were resuspended in 1 ml of Tris-EDTA-RNase (Tris-

HCl 10 mM pH 7.0; EDTA 10 mM pH 8.0; NaCl 300 mM; RNase A 50 µg/ml) and

centrifuged again under the same conditions. Supernatants were discarded and pellets

resuspended in 1 ml of TE-lysozyme (Tris-HCl 25 mM pH 8.0; EDTA 10 mM pH 8.0;

NaCl 10 mM; lysozyme 10 mg/ml). Samples were then incubated at 37ºC for 30 min; 30 µl

of 30% sodium-N-lauroylsarcosine (sarcosyl) was added and the mixture was incubated for

20 min. at 65ºC, followed by incubation for 5 min. at 4ºC. DNA was purified with the

phenol-chloroform-isoamyl alcohol method and precipitated with ethanol (29). DNA

concentrations were determined spectrophotometrically.

(ii) Clinical samples. A DNA extraction-protocol previously described for clinical

samples of tuberculosis patients (13) was adapted for use in this study. Briefly, 100 mg of

pus or the pellet of a 2 ml blood sample was resuspended in 1 ml of TE-lysozyme. Samples

were incubated for 1 h at 37ºC; 20 µl of proteinase K (20 mg/ml) (Invitrogen, Germany)

was added, followed by incubation for 2 h at 56ºC. Samples were divided into two aliquots

of 500 µl, and 25 µl of 30% sarcosyl was added to each; mixtures were incubated for 20

min. at 65ºC and then for 5 min. at 4ºC. DNA was purified and precipitated as described

above.

Primers and mPCR conditions. The oligonucleotide primers used in this study are

listed in Table 2. Primers targeting the 16S rRNA and rpoB genes of C. pseudotuberculosis

were obtained from previously-published works (6, 15). Primers targeting the pld gene

were designed by aligning the pld nucleotide sequences of C. pseudotuberculosis and C.

ulcerans (GenBank accession numbers L16586 and L16585); the reverse primer PLD-R1

can be used, in association with the forward primer PLD-F, to amplify the pld genes of both

bacteria, while primer PLD-R2 excludes C. ulcerans (see Fig. 1B). A primer pair targeting

the mitochondrial 12S rRNA genes of Capra hircus and Ovis aries (GenBank accession

numbers AJ490504 and AJ490503) was designed in order to function as an internal

amplification control for the mPCR reactions performed with DNA extracted directly from

clinical samples of caseous lymphadenitis. This amplification control allows identification

of samples that possess inhibitory factors for the mPCR assay (14).

Multiplex PCRs were performed in a final reaction volume of 10 µl containing 1.5

U AccuPrime™ Taq DNA polymerase (Invitrogen), 1X PCR Buffer II (200 mM Tris-HCl,

500 mM KCl, 15 mM MgCl2, 2 mM dNTPs, AccuPrimeTM protein, 10% glycerol), and 2

µM of each of the primers: 16S-F/ 16S-R, C2700F/ C3130R and PLD-F/ PLD-R2. For

mPCRs performed with DNA extracted from clinical samples, primers 12S-F/ 12S-R were

added to the reaction mixture at 0.2 µM each. The template concentration was

approximately 10 ng of DNA extracted from cultured C. pseudotuberculosis or from

clinical specimens. When necessary, serial twofold dilutions (1/2, 1/4, and 1/8) were

performed on samples to dilute inhibitory components (13). Reactions were carried out in a

thermal cycler (PTC-100, MJ Research Inc.) under the following conditions: initial

denaturation at 95ºC for 3 min.; 40 cycles of 95ºC for 1 min., 58ºC for 40 sec., and 68ºC for

1 min. 30 sec.; final extension was at 68ºC for 7 min. The amplified products were resolved

by electrophoresis on 1.0 % agarose gels and visualized by ethidium bromide staining.

Sequencing of singleplex PCR products. In order to confirm the mPCR results, 10

randomly-chosen isolates were further tested in singleplex PCR assays with the three C.

pseudotuberculosis-specific primer pairs; PCR products were precipitated with 15%

polyethylene glycol (18) and sequenced by using the DYEnamic ET Dye Terminator Kit

(Amersham Biosciences), according to the manufacturer’s instructions. The sequences were

compared with previously-published 16S rRNA (GenBank accession numbers X81916,

X81907 and X84255), rpoB (GenBank accession number AY492239) and pld (GenBank

accession numbers L16586 and L16587) C. pseudotuberculosis gene sequences, through

search for similarity using the Basic Local Alignment Search Tool - N (BLAST-N) (1).

Analytical specificity and sensitivity. To evaluate the specificity of the mPCR

assay, reactions were performed with genomic DNA extracted from bacterial strains

taxonomically similar to C. pseudotuberculosis biovar ovis (Table 1). Serial 10-fold

dilutions of DNA from C. pseudotuberculosis type strain CIP 102968T, ranging from 10 ng

to 0.0001 ng DNA/reaction, were used to test the sensitivity of the method.

To evaluate the assay’s detection limit, blood samples from goats that did not

present clinical symptoms of CLA, and which were negative in ELISA tests (performed

according to ref. 24), were seeded with 106 to 101 colony-forming units (CFU) of C.

pseudotuberculosis.

Statistical analysis. An analysis to evaluate differences in the sensitivity of the

mPCR assay between samples from sheep versus goats was performed with the chi-square

test, using the STATISTICA software package (StatSoft, Inc.).

RESULTS

Specificity and sensitivity of the mPCR assay. Purified genomic DNAs were used

to evaluate the sensitivity and specificity of the mPCR assay. When tested with DNA from

bacterial strains taxonomically related to C. pseudotuberculosis biovar ovis (see Tab. 1),

only C. pseudotuberculosis biovar equi CIP 5297 yielded a similar mPCR profile, with the

816 bp, 446 bp and 203 bp amplicons, corresponding to genes 16S rRNA, rpoB and pld,

respectively (Fig. 1A). As in a previous study (15), all of the Corynebacteria species that

we tested generated an amplicon of ca. 446 bp, corresponding to the rpoB gene (Fig. 1A).

As expected, the pld gene product was not detected in any of the four C. ulcerans strains

(Fig. 1A, lanes 4-7), illustrating the ability of the mPCR assay to differentiate this

bacterium from C. pseudotuberculosis. Moreover, two other pathogenic bacteria associated

with the formation of abscesses in small ruminants, A. pyogenes and P. multocida, were

clearly distinguished (Fig. 1A). The ca. 300 bp product generated by amplification of A.

pyogenes genomic DNA was sequenced and assigned to be the rpoB gene through search

for homology in GenBank using BLAST-N (data not shown). The sequence was deposited

under accession number DQ680032.

To determine the sensitivity of the assay, reactions were performed with serial 10-

fold dilutions of purified C. pseudotuberculosis CIP 102968T DNA. The mPCR method

was able to detect bacterial DNA at concentrations ranging from 10 ng – 0.001 ng per

reaction (Fig. 2).

To assess the detection limit of the assay in clinical specimens, blood samples of

healthy animals were spiked with 10-fold dilutions of a pure culture of C.

pseudotuberculosis CIP 102968T; the mixtures were processed with the entire DNA

extraction protocol. Amplification products were detected in reactions containing 106 – 103

CFU of C. pseudotuberculosis per ml of sample (data not shown).

Identification of bacterial isolates. The characteristic mPCR amplification profile

was obtained for all 40 C. pseudotuberculosis biovar ovis field isolates tested (Table 1).

Figure 3A shows the mPCR profiles of 10 randomly-chosen C. pseudotuberculosis biovar

ovis field isolates.

Identification of the 10 isolates was confirmed by sequencing each of the three

amplicons generated, followed by a search for similar sequences using BLAST-N (data not

shown).

Direct detection of C. pseudotuberculosis in clinical samples by mPCR. Pus

samples were collected from the lymph nodes of CLA-affected sheep and goats, and DNA

was extracted directly from these specimens using our protocol (see Materials and

Methods). Bacteriological culture was made from the samples, as a gold standard to

confirm infection by C. pseudotuberculosis. The mPCR protocol was performed as

described for purified bacterial DNA; however, a noncompetitive internal amplification

control (12S rDNA; see Materials and Methods) was included in these reactions in order to

allow differentiation between inhibited reactions, i.e. those in which there was no

amplification of the internal control, versus reactions in which the mPCR yielded a negative

result (14). Typical mPCR profiles of clinical samples are shown in Figure 3B.

Most of the undiluted samples were inhibitory for the mPCR assay, but more than

52% yielded evaluable results at a 1:2 dilution; around 45% showed amplification at a 1:4

dilution and only 3% at a 1:8 dilution. The proportions of samples positive in the mPCR

assay were not significantly different when comparing samples of sheep versus goats (P

value = 0.60). Table 3 summarizes the results obtained for pus samples.

The ability of the mPCR assay to detect C. pseudotuberculosis in blood samples

from confirmed CLA-infected animals was also evaluated, however none of the 19 blood

samples that we tested yielded a positive result (data not shown).

DISCUSSION

Caseous lymphadenitis remains a cause of concern for sheep and goat producers

worldwide (2, 10, 23, 36). Due to the high transmission rate of its etiological agent, C.

pseudotuberculosis, within a herd or flock, some authors suggest culling of any animal

from which this bacterium has been cultured as a means to control the spread of the disease

(2, 36). Since microbiological and biochemical methods are not always straightforward, the

development of a rapid and specific diagnostic tool is imperative for the control of CLA

(6).

The only previously-reported molecular method employed to specifically identify

C. pseudotuberculosis isolated from pus samples of CLA-affected animals, which is based

on the amplification of a 16S rRNA gene fragment (6), has two major drawbacks: (i)

dependence on bacterial culture; and (ii) inability to distinguish the bacterium C. ulcerans.

Our mPCR assay was specific enough to differentiate C. pseudotuberculosis from

C. ulcerans (Fig. 1A). These two bacteria have been reported to possess 99.7% similarity

between their 16S rRNA genes and 93.6% between their rpoB genes (15, 28); most of their

biochemical properties are similar and both may eventually produce diphtheric toxin (9,

28). The high genomic similarity may explain the inability of a previously published work

to differentiate these two bacteria by PCR (6). Since C. ulcerans is also a PLD producer,

the reverse primer used to amplify the pld gene in our study was designed so that it

possessed a mismatch in its 3’-end (two Gs instead of two Cs) (Fig. 1B), allowing

differentiation from C. pseudotuberculosis due to the absence of the 203 bp amplicon.

Although C. ulcerans is primarily recognized as a veterinary pathogen, there has

been a marked increase in the number of human infections (7, 9); it appears that domestic

cats and dogs can be potential reservoirs (7). In this context, our mPCR would be able to

identify bacteria collected from the nasal discharges of domestic animals and could

differentiate bacteria cultured from samples of diphtheria patients, by using the primer pair

PLD-F/ PLD-R1, which allows amplification of the pld gene of C. ulcerans (see Fig. 1B).

Çetinkaya et al. (6) reported a weaker amplification of the 816 bp 16S rRNA gene

amplicon in biovar equi of C. pseudotuberculosis, when compared to that of biovar ovis.

This result was attributed to a mismatch (an A instead of a G), five bases from the 5’-end of

the forward primer used (16S-F; Table 2). However, this result was not reproducible with

the conditions used in our study; we propose that amplification of the 16S rRNA gene using

primers 16S-F/ 16S-R is not sufficient to differentiate the two biovars of C.

pseudotuberculosis. It is interesting that infection of small ruminants with biovar equi is not

known to occur (33).

The mPCR assay was able to confirm identification of 40 C. pseudotuberculosis

field isolates and reliably detected this bacterium in a reaction mixture containing as little

as 0.001 ng of genomic DNA, illustrating its reproducibility and high sensitivity.

A DNA extraction-protocol was adapted to recover bacterial genomic DNA directly

from clinical samples of CLA-affected animals. This strategy offers advantages over

bacteriological culture, including reduced time of analysis and ability to detect unviable

bacteria. The detection limit of the goat blood spiking experiment was 103 CFU of C.

pseudotuberculosis/ml of sample. However, this value may underestimate the number of

viable organisms, since intracellular bacteria such as C. pseudotuberculosis and

Rhodococcus equi have a tendency to clump when cultured (12). A detection limit above

103 CFU per ml of sample would help explain the inability of the mPCR assay to detect C.

pseudotuberculosis in blood samples of infected sheep and goats.

On the other hand, the mPCR efficiently detected this bacterium in a high

proportion (94.6%) of confirmed CLA-infected pus samples. In contrast to serological CLA

testing (8, 20), the mPCR sensitivity was the same for both sheep and goats (Table 3).

Since our mPCR assay provides an efficient, accurate, rapid and reproducible

method for the identification of cultured C. pseudotuberculosis and its direct detection in

pus samples, we propose that it may be used instead of bacteriological culture as a

confirmatory CLA test.

ACKNOWLEDGMENTS

This work was supported by FAPEMIG (Fundação de Amparo à Pesquisa do

Estado de Minas Gerais, Brasil), CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico

e Tecnológico, Brasil), and FINEP # 01.04.0760.00 (Financiadora de Estudos e Projetos –

Ministério da Ciência e Tecnologia, Brasil).

We wish to thank Dr. Mario Vaneechoutte and Dr. Andreas Tauch for providing

bacterial strains, and Frances Bolt for critical revision of the manuscript. We also

acknowledge technical assistance provided by technician Kátia Morais and by the Centro

Nacional de Pesquisa de Caprinos (EMBRAPA Caprinos, Brasil).

REFERENCES

1. Altschul, S. F., W. Gish, W. Miller, E. W. Myers, and D. J. Lipman. 1990. Basic

local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215:403-410.

2. Baird, G. 1997. Caseous lymphadenitis: an increasing cause for concern. Vet. Rec.

140:611.

3. Biberstein, E. L., H. D. Knight, and S. Jang. 1971. Two biotypes of

Corynebacterium pseudotuberculosis. Vet. Rec. 89:691-692.

4. Brown, C. C., H. J. Olander, E. L. Biberstein, and S. M. Morse. 1986. Use of a

toxoid vaccine to protect goats against intradermal challenge exposure to

Corynebacterium pseudotuberculosis. Am. J. Vet. Res. 47:1116-1119.

5. Brown, C. C., H. J. Olander, and S. F. Alves. 1987. Synergistic hemolysis-

inhibition titers associated with caseous lymphadenitis in a slaughterhouse survey of

goats and sheep in Northeastern Brazil. Can. J. Vet. Res. 51:46-49.

6. Çetinkaya, B., M. Karahan, E. Atil, R. Kalin, T. De Baere, and M

Vaneechoutte. 2002. Identification of Corynebacterium pseudotuberculosis isolates

from sheep and goats by PCR. Vet. Microbiol. 88:75-83.

7. De Zoysa, A., P. M. Hawkey, K. Engler, R. George, G. Mann, W. Reilly, D.

Taylor, and A. Efstratiou. 2005. Characterization of toxigenic Corynebacterium

ulcerans strains isolated from humans and domestic cats in the United Kingdom. J.

Clin. Microbiol. 43:4377-4381.

8. Dercksen, D. P., J. M. A. Brinkhof, T. Dekker-Nooren, K. van Maanen, C. F.

Bode, G. Baird, and E. M. Kamp. 2000. A comparison of four serological tests for

the diagnosis of caseous lymphadenitis in sheep and goats. Vet. Microbiol. 75:167-

175.

9. DeWinter, L. M., K. A. Bernard, and M. G. Romney. 2005. Human clinical

isolates of Corynebacterium diphtheriae and Corynebacterium ulcerans collected in

Canada from 1999 to 2003 but not fitting reported criteria for cases of diphtheria. J.

Clin. Microbiol. 43:3447-3449.

10. Dorella, F. A., L. G. C. Pacheco, S. C. Oliveira, A. Miyoshi, and V. Azevedo.

2006. Corynebacterium pseudotuberculosis: microbiology, biochemical properties,

pathogenesis and molecular studies of virulence. Vet. Res. 37:201-218.

11. Halbert, N. D., R. A. Reitzel, R. J. Martens, and N. D. Cohen. 2005. Evaluation

of a multiplex polymerase chain reaction assay for simultaneous detection of

Rhodococcus equi and the vapA gene. Am. J. Vet. Res. 66:1380-1385.

12. Harrington, J. R., M. C. Golding, R. J. Martens, N. D. Halbert, N. D. Cohen.

2005. Evaluation of real-time quantitative polymerase chain reaction assay for

detection and quantitation of virulent Rhodococcus equi. Am. J. Vet. Res. 66:755-

761.

13. Honoré-Bouakline, S., J. P. Vincensini, V. Giacuzzo, P. H. Lagrange, and J. L.

Herrmann. 2003. Rapid diagnosis of extrapulmonary tuberculosis by PCR: Impact

of sample preparation and DNA extraction. J. Clin. Microbiol. 41:2323-2329.

14. Hoorfar, J., B. Malorny, A. Abdulmawjood, N. Cook, M. Wagner, and P. Fach.

2004. Practical considerations in design of internal amplification controls for

diagnostic PCR assays. J. Clin. Microbiol. 42:1863-1868.

15. Khamis, A., D. Raoult, and B. La Scola. 2004. rpoB gene sequencing for

identification of Corynebacterium species. J. Clin. Microbiol. 42:3925-3931.

16. Khamis, A., D. Raoult, and B. La Scola. 2005. Comparison between rpoB and 16S

rRNA gene sequencing for molecular identification of 168 clinical isolates of

Corynebacterium. J. Clin. Microbiol. 43:1934-1936.

17. Kuria, J. K. N., P. G. Mbuthia, E. K. Kangethe, and R. G. Wahome. 2001.

Caseous lymphadenitis in goats: the pathogenesis, incubation period and serological

response after experimental infection. Vet. Res. Commun. 25:89-97.

18. Kusukawa, N., T. Uemori, K. Asada, and I. Kato. 1990. Rapid and reliable

protocol for direct sequencing of material amplified by the polymerase chain

reaction. Biotechniques. 9:66-68.

19. McNamara, P. J., W. A. Cuevas, and J. G. Songer. 1995. Toxic phospholipases

D of Corynebacterium pseudotuberculosis, C. ulcerans and Arcanobacterium

haemolyticum: cloning and sequence homology. Gene 156:113-118.

20. Menzies, P. I., and C. A. Muckle. 1989. The use of a microagglutination assay for

the detection of antibodies to Corynebacterium pseudotuberculosis in naturally

infected sheep and goat flocks. Can. J. Vet. Res. 53:313-318.

21. Menzies, P. I., T.-I. Hwang, and J. F. Prescott. 2004. Comparison of an

interferon-gamma to a phospholipase D enzyme-linked immunosorbent assay for

diagnosis of Corynebacterium pseudotuberculosis infection in experimentally

infected goats. Vet. Microbiol. 100:129-137.

22. O’Halloran, D. M., and M. T. Cafferkey. 2005. Multiplex PCR for identification

of seven Streptococcus pneumoniae serotypes targeted by a 7-valent conjugate

vaccine. J. Clin. Microbiol. 43:3487-3490.

23. Paton, M. W., S. B. Walker, I. R. Rose, and G. F. Watt. 2003. Prevalence of

caseous lymphadenitis and usage of caseous lymphadenitis vaccines in sheep flocks.

Aust. Vet. J. 81:91-95.

24. Paule, B. J. A., V. Azevedo, L. F. Regis, R. Carminati, C. R. Bahia, V. L. C.

Vale, L. F. Moura-Costa, S. M. Freire, I. Nascimento, R. Schaer, A. M. Goes,

and R. Meyer. 2003. Experimental Corynebacterium pseudotuberculosis primary

infection in goats: kinetics of IgG and interferon-gamma production, IgG avidity

and antigen recognition by Western blotting. Vet. Immunol. Immunopathol. 96:129-

139.

25. Peel, M. M., G. G. Palmer, A. M. Stacpoole, and T. G. Kerr. 1997. Human

lymphadenitis due to Corynebacterium pseudotuberculosis: report of ten cases from

Australia and review. Clin. Infect. Dis. 24:185-191.

26. Persson, S., and K. E. P. Olsen. 2005. Multiplex PCR for identification of

Campylobacter coli and Campylobacter jejuni from pure cultures and directly in

stool samples. J. Med. Microbiol. 54:1043-1047.

27. Piontkowski, M. D., and D. W. Shivvers. 1998. Evaluation of a commercially

available vaccine against Corynebacterium pseudotuberculosis for use in sheep. J.

Am. Vet. Med. Assoc. 212:1765-1768.

28. Riegel, P., R. Ruimy, D. de Briel, G. Prévost, F. Jehl, R. Christen, and H.

Monteil. 1995. Taxonomy of Corynebacterium diphthteriae and related taxa, with

recognition of Corynebacterium ulcerans sp. nov. nom. rev. FEMS Microbiol. Lett.

126:271-276.

29. Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis. 1989. Molecular cloning: a

laboratory manual, 2nd ed., CSHL Press, Cold Spring Harbor, N.Y.

30. Shigidi, M. T. 1979. A comparison of five serological tests for the diagnosis of

experimental Corynebacterium ovis infection in sheep. Br. Vet. J. 135:172-177.

31. Smibert, R. M., and N. R. Krieg. 1994. Phenotypic characterization, p. 607-654.

In P. Gerhardt, R. G. E. Murray, W. A. Wood, and N. R. Krieg (ed.), Methods for

general and molecular bacteriology, 1st ed. ASM Press, Washington D.C.

32. Songer, J. G., K. Beckenbach, M. M. Marshall, G. B. Olson, and L. Kelley.

1988. Biochemical and genetic characterization of Corynebacterium

pseudotuberculosis. Am. J. Vet. Res. 49:223-226.

33. Spier, S. J., C. M. Leutenegger, S. P. Carroll, J. E. Loye, J. B. Pusterla, T. E.

Carpenter, J. E. Mihalyi, and J. E. Madigan. 2004. Use of a real-time

polymerase chain reaction-based fluorogenic 5’ nuclease assay to evaluate insect

vectors of Corynebacterium pseudotuberculosis infections in horses. Am. J. Vet.

Res. 65:829-834.

34. Stanford, K., K. A. Brogden, L. A. McClelland, G. C. Kozub, and F. Audibert.

1998. The incidence of caseous lymphadenitis in Alberta sheep and assessment of

impact by vaccination with commercial and experimental vaccines. Can. J. Vet.

Res. 62:38-43.

35. Wadowsky, R. M., R. H. Michaels, T. Libert, L. A. Kingsley, and G. D. Ehrlich.

1996. Multiplex PCR-based assay for detection of Bordetella pertussis in

nasopharyngeal swab specimens. J. Clin. Microbiol. 34:2645-2649.

36. Williamson, L. H. 2001. Caseous lymphadenitis in small ruminants. Vet. Clin.

North Am. Food Anim. Pract. 17:359-371.

TABLE 1. Bacterial strains and field isolates of C. pseudotuberculosis used in this study

Species Source/ Strain designation

Arcanobacterium pyogenes GUHa HJ 26 BA224.11

A. pyogenes-like GUH HJ 51 B

Corynebacterium amycolatum GUH HJ 08 I4218 LV

C. bovis GUH DL BOV25

C. diphtheriae ATCCb 13812

C. jeikeium NCTCc K411

C. pseudotuberculosis biovar equi CIPd 5297

C. pseudotuberculosis biovar ovise

(n = 37)

VD21; VD23; VD27; VD28; VD33; VD36; VD37;

VD38; VD41; VD42; VD43; VD44; VD45; VD46;

VD48; VD50; VD52; VD53; VD54; VD55; VD56;

VD57; VD58; VD59; VD60; VD61; VD62; VD63;

VD99; 01; 05; 08; 09; 11; 12; 21; 217

C. pseudotuberculosis biovar ovis UFBAf T1

C. pseudotuberculosis biovar ovis UFBA 1002

C. pseudotuberculosis biovar ovis GUH HJ ULCC06.334,4

C. pseudotuberculosis biovar ovis CIP 102968T

C. renale CIP 103421T

C. ulcerans GUH HJ ULCA3.675,1

C. ulcerans GUH HJ 01 BM3796.3

C. ulcerans GUH HJ 02 MN 675.3

C. ulcerans GUH HJ ULCB12.735,2

Pasteurella multocida IOCg

a GUH: Ghent University Hospital, Belgium. DL, HJ and SL: initials of donators, Devrise

Luc, Hommez Joseph and Sabbe Luc.

b ATCC: American Type Culture Collection, United States.

c NCTC: National Collection of Type Cultures, United Kingdom.

d CIP: Collection of Institute Pasteur, France.

e Caprine field isolates: obtained from Universidade Federal da Bahia, Brazil.

f UFBA: Collection of microorganisms of Universidade Federal da Bahia, Brazil.

g IOC: Collection of microorganisms of Instituto Oswaldo Cruz, Brazil.

T Type strain.

TABLE 2. List of oligonucleotide primers used in this study

Target

gene

Primers Sequence (5’ – 3’) Length of

PCR products

Source or

Reference

16S rDNA 16S-F ACCGCACTTTAGTGTGTGTG 816 bp (6)

16S-R TCTCTACGCCGATCTTGTAT

rpoB C2700F CGTATGAACATCGGCCAGGT 446 bp (15)

C3130R TCCATTTCGCCGAAGCGCTG

pld PLD-F ATAAGCGTAAGCAGGGAGCA 203 bp This work

PLD-R1 ATCAGCGGTGATTGTCTTCC

PLD-R2 ATCAGCGGTGATTGTCTTCCAGG

12S rDNA 12S-F CCAGCCACCGCGGTCATACG 274 bp This work

12S-R TGAGTTTCGGGCTGTTGCCG

TABLE 3. Results of direct detection of C. pseudotuberculosis in pus samples of caseous

lymphadenitis-infected animals using the mPCR assay

Status in the mPCR Pus Samplesa

Positive Negative

Sensitivity

(%)

Sheep

(n = 12)

11 1 91.7

Goats

(n = 44)

42 2 95.4

Total

(n = 56)

53 3 94.6

a Samples positive for C. pseudotuberculosis in bacteriological culture (gold standard).

FIG. 1. Analytical specificity of the mPCR assay. (A) Amplification profiles of bacteria

genetically or morphologically related to Corynebacterium pseudotuberculosis. MW, 1 Kb

Plus DNA Ladder (Invitrogen); lanes 1-15, reactions with DNAs of the following bacterial

strains: 1-2 C. pseudotuberculosis ovis strains CIP 102968T and 1002; 3- C.

pseudotuberculosis equi CIP 5297; 4-7 C. ulcerans strains ULCA3.675,1, HJ01 BM3796.3,

HJ02 MN 675.3, and ULCB12.735,2; 8- C. diphtheriae ATCC 13812; 9- C. amycolatum

HJ 08 I4218 LV; 10- C. renale CIP 103421T; 11- C. bovis DL BOV25; 12- C. jeikeium

K411; 13- Arcanobacterium pyogenes HJ 26 BA224.11; 14- A. pyogenes-like HJ 51 B; 15-

Pasteurella multocida. Lane 16, negative control (reaction without template DNA). (B)

Schematic representation of primer-annealing sites in the pld genes of C.

pseudotuberculosis (Cp) and C. ulcerans (Cu). The underlined nucleotides indicate

positions of mismatch between the two aligned gene sequences (see text for details).

FIG. 2. Analytical sensitivity of the mPCR assay. MW, 1 Kb Plus DNA Ladder

(Invitrogen); lanes 1-6, mPCR with serial 10-fold dilutions of C. pseudotuberculosis CIP

102968T genomic DNA, as follows: 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001, and 0.0001 ng. Lane 7, negative

control (reaction without template DNA).

FIG. 3. Reproducibility of the mPCR assay. (A) MW, GeneRuler DNA Ladder Mix

(Fermentas); lanes 1-10, mPCR amplification profiles of 10 out of 40 field isolates of C.

pseudotuberculosis. (B) MW, 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen); lanes 1-3, direct

detection of C. pseudotuberculosis in pus samples of CLA-animals.

FIGURE 1

FIGURE 2

16S rDNA

MW 1 2 3 4 5 6 7

rpoB

pld

816 bp

446 bp

203 bp

FIGURE 3

A

B

16S rDNA

rpoB

pld

500 bp

200 bp

800 bp

MW 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

16S rDNA

rpoB

12S rDNA pld

850 bp

500 bp

300 bp 200 bp

MW 1 2 3

4.2. RESULTADOS ADICIONAIS

4.2.1. SENSIBILIDADE ANALÍTICA DO ENSAIO DE mPCR COM

DIFERENTES DNA POLIMERASES

Para comparar a sensibilidade do ensaio de mPCR quando duas enzimas

DNA polimerases diferentes foram utilizadas (vide Tab. 4), reações foram

realizadas contendo diluições seriadas de 10 vezes do DNA genômico de C.

pseudotuberculosis CIP 102968T, como descrito no item 3.4.4.1. A Figura 2

apresenta os resultados obtidos em uma das três séries de reações realizadas

com os dois sistemas de amplificação.

Figura 2. Testes de sensibilidade do ensaio de mPCR. Gel de agarose a 1%

mostrando reações realizadas com dois sistemas de amplificação diferentes. PM:

padrão de peso molecular GeneRuler DNA Ladder Mix (Fermentas). Canaletas 1-

5: Reações utilizando o sistema AccuPrime™ (Invitrogen), com as seguintes

concentrações de DNA genômico da C. pseudotuberculosis: 10ng, 1ng, 100pg,

10pg e 1pg. Canaletas 6-10: Reações utilizando o sistema Taq DNA Polimerase

Recombinante (Invitrogen), com as seguintes concentrações de DNA genômico:

10ng, 1ng, 100pg, 10pg e 1pg.

PM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Taq AccuPrimeTM Taq Recombinante

200 pb

500 pb 800 pb

É possível notar que a enzima Taq AccuPrime™ DNA polimerase

(Invitrogen) apresentou uma sensibilidade 1000 vezes superior à da Taq DNA

Polimerase Recombinante (Invitrogen), permitindo a amplificação dos três

fragmentos correspondestes aos genes 16S rRNA, rpoB e pld até a concentração

de 10 pg de DNA genômico da C. pseudotuberculosis por reação, enquanto que

produtos de amplificação com a segunda enzima foram visualizados somente até

a concentração de 10 ng de DNA genômico / reação (Figura 2).

Para avaliar se a sensibilidade de detecção dos produtos amplificados pela

reação de mPCR seria afetada pelo método de visualização utilizado, as reações

realizadas com o sistema Taq DNA Polimerase Recombinante (Invitrogen) foram

resolvidas em gel de poliacrilamida a 6% corado pela prata (Figura 3).

Figura 3. Teste de sensibilidade com o sistema Taq DNA Polimerase

Recombinante (Invitrogen), resolvido em gel de poliacrilamida a 6% corado

pela prata. PM: padrão de peso molecular 1 Kb DNA Ladder (Invitrogen).

Canaletas 1-2: Resultados das reações de mPCR utilizando como molde 10 ng e 1

ng de DNA genômico da C. pseudotuberculosis, respectivamente.

PM 1 2

1018 pb

506 pb

201 pb

16S rDNA (816 pb)

rpoB (446 pb)

pld (203 pb)

A análise dos resultados permitiu constatar que não houve diferença na

sensibilidade do gel de poliacrilamida quando comparado ao gel de agarose a 1%,

uma vez que não foram observados produtos amplificados nas reações utilizando

1 ng de DNA genômico da C. pseudotuberculosis (Figuras 2 e 3).

Figura 4. Amplificação do gene 16S rRNA de C. pseudotuberculosis

utilizando o sistema AccuPrime™ (Invitrogen). PM: padrão de peso molecular

GeneRuler DNA Ladder Mix (Fermentas). Canaletas 1-8: reações com diluições

seriadas de DNA genômico de 10ng a 10fg. CN(controle negativo): reação sem

DNA molde.

A reação de mPCR perde em sensibilidade mas é compensada pelo grande

ganho em especificidade. Quando o sistema AccuPrime™ (Invitrogen) foi utilizado

para amplificar os três loci de C. pseudotuberculosis separadamente, foi possível

visualizar produtos amplificados em gel de agarose até uma concentração de 10 fg

de DNA genômico / reação (Figura 4). Esse resultado indica que a amplificação

dos genes em formato multiplex diminui a sensibilidade de detecção da reação em

até 1000 vezes. Contudo, o limite obtido para a mPCR (10 pg) já é um valor

altamente sensível e condizente com a literatura (Cremonesi e cols., 2005; Scholz

PM 10ng 1ng 100pg 10pg 1pg 100fg 50fg 10fg CN

16S rDNA (816 pb)

e cols., 2006). Em razão dos resultados descritos acima, o sistema AccuPrime™

foi o escolhido para a continuidade dos trabalhos.

4.2.2. EQUIVALÊNCIA GENÔMICA DO LIMITE DE DETECÇÃO DA

mPCR

Para estimar a quantidade em UFC de C. pseudotuberculosis que

equivalem ao valor encontrado para a sensibilidade analítica da mPCR (10 pg de

DNA genômico), foi feita cultura dessa bactéria em caldo BHI, plaqueamento,

contagem de UFC e extração de DNA genômico seguida por dosagem em

espectrofotômetro, como descrito no item 3.4.6.

O valor médio estimado para a equivalência genômica de C.

pseudotuberculosis foi de 24,04 ± 22,57 fg de DNA / UFC. De acordo com essa

estimativa, o limite de detecção da mPCR (10 pg) seria correspondente a

aproximadamente 4,16 X 102 UFC desta bactéria. No entanto, o valor encontrado

para a equivalência genômica pode ser considerado superestimado, uma vez que

bactérias intracelulares como C. pseudotuberculosis tendem a formar agregados

quando cultivadas e, portanto, a contagem do número de UFC após plaqueamento

não reflete de maneira acurada a quantidade de células viáveis em cultura (Jolly,

1965; Harrington e cols., 2005).

4.2.3. ESPECIFICIDADE DO ENSAIO DE mPCR

A possibilidade de diferenciar C. pseudotuberculosis de C. ulcerans e A.

pyogenes representa uma grande vantagem do ensaio de mPCR desenvolvido.

Como já discutido no item 4.1., o único trabalho prévio que desenvolveu um

ensaio baseado em PCR para detectar C. pseudotuberculosis não conseguiu

diferenciar essa bactéria de C. ulcerans, devido à grande similaridade genética

entre estas duas espécies. Já a diferenciação de A. pyogenes também representa

um resultado importante, uma vez que esse patógeno está presente em

aproximadamente 5% das amostras de pus coletadas em abscessos de caprinos

(Gouveia, 1986; Jost & Billington, 2005).

Para testar a especificidade do ensaio de mPCR, foram feitas reações com

DNA genômico extraído de bactérias taxonomicamente próximas a C.

pseudotuberculosis (Tab. 1, Materiais e Métodos). A Figura 5 mostra o perfil de

amplificação obtido para cada uma das linhagens utilizadas.

Os resultados obtidos mostram que a utilização da PCR em formato

multiplex para detectar C. pseudotuberculosis faz com que a reação fique

altamente específica e torna desnecessário um passo mais trabalhoso de

detecção de produtos amplificados, como hibridização de sondas com marcação

radioativa (Edwards & Gibbs, 1995; Yang & Rothman, 2004).

Figura 5. Especificidade da reação de mPCR. Gel de agarose 1% mostrando os

perfis de amplificação do ensaio de mPCR com DNAs de diferentes espécies

bacterianas. PM: padrão de peso molecular 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen).

Canaletas 1-16: Reações de mPCR com as seguintes linhagens: (1) C.

pseudotuberculosis biovar ovis CIP102968T; (2) C. pseudotuberculosis biovar ovis

ULCC06.334,4; (3) C. pseudotuberculosis biovar equi CIP5297; (4) C. ulcerans

ULCA3.675,1; (5) C. ulcerans HJ01BM; (6) C. ulcerans ULCB12.735,2; (7) C. ulcerans

HJ02MN; (8) C. amycolatum HJ08; (9) C. renale CIP103421T; (10) C. renale CIP6937;

(11) C. bovis BOV25; (12) C. bovis BOV23; (13) A. haemolyticum SL2212; (14) A.

pyogenes HJ26; (15) A. pyogenes A93; (16) A. pseudopyogenes HJ51.

4.2.4. REPRODUTIBILIDADE DO ENSAIO DE mPCR

Como já descrito no item 4.1., a reprodutibilidade do ensaio de mPCR foi

testada com DNA extraído de 40 isolados de C. pseudotuberculosis, cuja

identificação foi confirmada previamente por testes bioquímicos. A Figura 6

apresenta os perfis de amplificação obtidos para 38 destes isolados.

PM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 PM

16S rDNA (816 pb)

rpoB (446 pb)

pld (203 pb)

Figura 6. Perfis de amplificação de 38 isolados de C. pseudotuberculosis.

PM: padrão de peso molecular GeneRuler DNA Ladder Mix (Fermentas).

Canaletas 1-19 e 20-38: mPCR com DNAs genômicos extraídos de isolados de

campo. CN (controles negativos): reações sem DNA molde.

PM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 CN

16S rDNA (816 pb)

rpoB (446 pb)

pld (203 pb)

PM 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 CN

16S rDNA (816 pb)

rpoB (446 pb)

pld (203 pb)

4.2.5. EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO DE C. pseudotuberculosis A

PARTIR DE AMOSTRAS CLÍNICAS DE LINFADENITE CASEOSA

A detecção direta de C. pseudotuberculosis através da mPCR em amostras

clínicas de animais portadores de linfadenite caseosa representa uma

possibilidade extremamente atraente para o diagnóstico desta enfermidade, uma

vez que o método padrão de diagnóstico laboratorial (isolamento bacteriano e

identificação bioquímica de isolados) é extremamente trabalhoso e de alto custo.

Quatro protocolos diferentes foram testados para extrair DNA genômico de

C. pseudotuberculosis a partir de amostras de pus e sangue de animais

portadores de linfadenite caseosa (vide item 3.4.4.2). Foi possível extrair DNA das

amostras clínicas com três dos quatro protocolos testados, a exceção do protocolo

denominado de PK-Roche (Honoré-Bouakline e cols., 2003). No entanto, só foi

possível obter amplificação dos genes de C. pseudotuberculosis por mPCR

quando foram utilizados os DNAs extraídos com os protocolos CTAB-SDS e PK-

SARCOSIL. Em razão de ser mais prático esse último protocolo foi escolhido para

ser utilizado na continuidade dos trabalhos.

Os resultados da detecção direta de C. pseudotuberculosis em amostras

clínicas são apresentados no item 4.1.

4.2.6. LIMITE DE DETECÇÃO DA mPCR EM AMOSTRAS CLÍNICAS

Para calcular o limite de detecção da reação de mPCR em amostras

clínicas, foram realizadas misturas artificiais com sangue de caprinos, como

descrito no item 3.4.4.5. Não foi possível calcular o limite de detecção em

amostras de material purulento devido à dificuldade em se conseguir pus de

animais infectados com outro patógeno que não seja C. pseudotuberculosis. As

reações de mPCR foram realizadas com dois sistemas de amplificação diferentes:

(i) o sistema AccuPrime™ Taq DNA Polymerase, e (ii) o sistema Eppendorf®

MasterMix (2.5X) (Tab. 4). Esse último sistema possui acentuadores de PCR que,

teoricamente, são responsáveis por melhorar o rendimento da reação na presença

de inibidores tais como componentes do sangue. A Figura 7 mostra os resultados

obtidos com os dois sistemas utilizados.

Como pode ser observado na Figura 7A, foi possível detectar C.

pseudotuberculosis numa mistura artificial utilizando o sistema AccuPrime™ até

uma concentração média dessa bactéria equivalente a 4,5 X 103 UFC. Já com o

sistema Eppendorf® MasterMix, não foi possível detectar o produto amplificado

equivalente ao 16S rDNA de C. pseudotuberculosis nem na reação contendo 106

UFC dessa bactéria (Figura 7B). Porém, como já discutido no item 4.1., o limite de

detecção de 103 UFC pode estar subestimado, uma vez que C.

pseudotuberculosis tende a formar agregados em cultura, o que dificulta a

contagem de células viáveis (Jolly, 1965; Harrington e cols., 2005). Isso ajuda a

explicar a inabilidade do ensaio de mPCR para detectar esta bactéria em amostras

de sangue de animais naturalmente infectados (item 4.1). Provavelmente, C.

pseudotuberculosis é encontrada no sangue destes animais em concentrações

muito menores do que as observadas para o limite de detecção.

Figura 7. Limite de detecção da mPCR em amostras clínicas utilizando dois

sistemas de amplificação diferentes. PM: padrão de peso molecular 1 Kb Plus

DNA Ladder (Invitrogen). (A) Reações de mPCR com o sistema AccuPrime™,

utilizando DNAs extraídos das misturas artificiais de sangue de caprino com

concentrações de C. pseudotuberculosis variando de 106 até 101 UFC. (B)

Reações com o sistema Eppendorf® MasterMix, de misturas artificiais contendo C.

pseudotuberculosis variando de 106 até 103 UFC.

4.2.7. DETECÇÃO DE C. pseudotuberculosis EM AMOSTRAS DE SORO

A idéia de detectar C. pseudotuberculosis diretamente no soro de animais

infectados surgiu a partir da observação de trabalhos recentes mostrando que a

utilização dessa amostra clínica em PCR é mais viável que o uso de amostras de

sangue total (Bougnoux e cols., 1999; Elfaki e cols., 2005). Tal estratégia seria

Taq AccuPrimeTM

Eppendorf® MasterMix

A B

PM 106 105 104 103 102 101 PM 106 105 104 103

16S rDNA

rpoB 12S rDNA

pld

16S rDNA

rpoB 12S rDNA

pld

diretamente aplicável na detecção de animais com infecções sub-clínicas

aparentemente sadios ou em casos de linfadenite caseosa visceral.

DNA foi extraído de amostras de soro de animais com linfadenite caseosa

(n = 9) e de animais que não apresentavam sintomas clínicos da doença (n = 5)

(vide item 3.4.2.2.4). Esses últimos animais pertenciam a rebanhos sem relatos de

infecção por C. pseudotuberculosis. Todas as amostras foram testadas em

reações de PCR utilizando os três pares de iniciadores específicos de C.

pseudotuberculosis, separadamente.

Nenhuma amostra rendeu amplificação dos genes 16S rRNA e rpoB,

embora o controle de amplificação (12S rDNA) tenha sido detectado em todas as

reações (Figura 8). Apresentamos somente os dados com o gene 16S rRNA

(figura 8).

Por outro lado, o gene pld de C. pseudotuberculosis foi detectado em todas

as amostras utilizadas, inclusive nas provenientes de animais aparentemente não

infectados (Figura 9). Em reações multiplex os fragmentos menores podem ser

mais facilmente detectados devido à competição por reagentes ou em razão da

degradação do DNA molde (Edwards & Gibbs, 1995; Yang & Rothman, 2004).

Três hipóteses foram propostas para explicar a amplificação do gene pld

em amostras de animais aparentemente sadios: (i) ocorreu contaminação das

amostras negativas com produtos de amplificações anteriores; (ii) por ser

altamente sensível, a reação de PCR rendeu resultados falso-positivos; ou (iii) os

animais dos quais as amostras foram coletadas eram portadores de infecções

sub-clínicas.

Figura 8. Reações de PCR para amplificação do 16S rDNA de C.

pseudotuberculosis e do controle positivo de amplificação 12S rDNA, em 8

amostras de soro de animais portadores de linfadenite caseosa. PM: padrão

de peso molecular 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen). Canaletas ímpares:

amplificações utilizando os iniciadores para o gene 16S rRNA. Canaletas pares:

amplificações utilizando os iniciadores para o gene 12S rRNA.

Figura 9. Amplificação do gene pld a partir de amostras de soro. PM: padrão

de peso molecular 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen). Canaletas 1-5: reações

com amostras de soro de animais que não apresentavam sinais clínicos de

linfadenite caseosa. Canaletas 6 e 7: reações com soro de animais infectados.

500 pb

300 pb

PM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

12S rDNA (274 pb)

850 pb

PM 1 2 3 4 5 6 7

pld (203 pb)

Para testar a primeira hipótese, novas extrações de DNA foram feitas para

todas as amostras testadas, dessa vez em laboratórios diferentes. As reações de

PCR foram repetidas e novamente renderam resultados positivos. Controles

negativos de reação (sem adição de DNA molde), foram sistematicamente

realizados. Estas medidas em conjunto descartaram a possibilidade de

contaminação das reações.

Para testar as duas outras possibilidades, novas amostras estão sendo

coletadas de outros animais aparentemente saudáveis na EMBRAPA Caprinos.

Será feito um acompanhamento destes animais até o momento do abate, a fim de

detectar qualquer sinal clínico de linfadenite caseosa que possa corresponder com

um resultado positivo na reação de PCR.

4.2.8. PERFIL ELETROFORÉTICO DAS DIGESTÕES ENZIMÁTICAS

DOS PRODUTOS DA MPCR

Devido à alta similaridade genética entre C. pseudotuberculosis e C.

ulcerans (Riegel e cols., 1995; Çetinkaya e cols., 2002; Khamis e cols., 2004),

inicialmente foi avaliada a possibilidade de diferenciar estas duas bactérias

através de digestão dos produtos amplificados pela mPCR. Para tal, nestas

reações foi utilizado o iniciador MPLD2 (5’-ATCAGCGGTGATTGTCTTCC-3’) ao

invés de MPLD2.1 (Tab. 3). Este iniciador permite que o gene pld de C. ulcerans

também seja amplificado (Figura 10). As enzimas Cla I e Bgl I foram selecionadas

após análise de restrição in silico das seqüências parciais dos genes 16S rRNA,

rpoB e pld.

Figura 10. Digestão enzimática das reações de mPCR com DNAs de C.

ulcerans e C. pseudotuberculosis. PM: padrão de peso molecular GeneRuler

DNA Ladder Mix (Fermentas). (A) Digestões com a enzima Cla I. Canaletas 1-4:

linhagens de C. ulcerans. Canaletas 5-8: linhagens de C. pseudotuberculosis. (B)

Digestões com a enzima Bgl I. Canaletas 1-4: linhagens de C. ulcerans. Canaletas

5-8: linhagens de C. pseudotuberculosis. (Veja Tabela 1 para as linhagens).

Como pode ser visto na Figura 10, foi possível digerir os produtos

amplificados da mPCR sem que um passo de precipitação anterior fosse

realizado. Nenhuma das quatro linhagens de C. pseudotuberculosis rendeu

PM 1 2 3 4 5 6 7 8

1 2 3 4 5 6 7 8 PM

A

B

816 pb

203 pb

16S rDNA

rpoB

pld

16S rDNA

rpoB

pld

446 pb

275 pb 203 pb

816 pb

381 pb 446 pb

produtos de digestão com as enzimas testadas (Figura 10). O gene rpoB de todas

as linhagens de C. ulcerans avaliadas foi digerido pela enzima Cla I, gerando dois

produtos: 381 pb (Figura 10A) e 65 pb (não visível). Quando os produtos de

mPCR das mesmas linhagens foram digeridos com a enzima Bgl I, foram gerados

produtos digeridos novamente do gene rpoB, nos tamanhos de 275 pb e 171 pb

(Figura 10B). Uma das linhagens de C. ulcerans testada não foi digerida pela

enzima Bgl I, indicando a existência de polimorfismo do gene rpoB nessa espécie.

Em conjunto, estes resultados indicam que é possível detectar

polimorfismos de comprimento de fragmentos de restrição (RFLP) a partir da

digestão direta dos produtos da mPCR, e portanto esta estratégia pode ser

aplicada para avaliar variabilidade genética de isolados de C. ulcerans ou C.

pseudotuberculosis. No entanto, outras enzimas de restrição devem ser testadas

para essa última espécie. As figuras 11, 12 e 13 apresentam as enzimas de

restrição que podem ser utilizadas para avaliar possíveis polimorfismos das

regiões amplificadas pela mPCR nos genes 16S rRNA, rpoB e pld, entre isolados

de C. pseudotuberculosis. Uma coleção de isolados dessa bactéria, provenientes

de diferentes regiões do Brasil, já está sendo criada com este objetivo.

Fig. 11 (continua)

Figura 11. Mapa de restrição da região amplificada do gene 16S rRNA da C.

pseudotuberculosis. O software on-line Webcutter 2.0 (Disponível em:

http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/) foi utilizado para gerar o mapa de restrição da

seqüência amplificada do gene 16S rRNA na linhagem CIP 102968T da C.

pseudotuberculosis biovar ovis.

Figura 12. Mapa de restrição da região amplificada do gene rpoB da C. pseudotuberculosis. O software on-line Webcutter 2.0 (Disponível em: http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/) foi utilizado para gerar o mapa de restrição da seqüência amplificada do gene rpoB na linhagem CIP 102968T da C. pseudotuberculosis biovar ovis.

Figura 13. Mapa de restrição da região amplificada do gene pld da C.

pseudotuberculosis. O software on-line Webcutter 2.0 (Disponível em:

http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/) foi utilizado para gerar o mapa de restrição da

seqüência amplificada do gene pld na linhagem CIP 102968T da C.

pseudotuberculosis biovar ovis.

5. CONSIDERAÇÕES FINAIS

5.1. CONCLUSÕES

Nas condições do presente estudo, é possível concluir que:

� Foi possível padronizar uma reação de PCR multiplex para amplificação

simultânea de três genes de C. pseudotuberculosis: 16S rDNA, rpoB e pld.

� O sistema de amplificação AccuPrime™ (Invitrogen) foi o mais eficiente

para utilização no formato multiplex.

� O ensaio de mPCR foi suficientemente específico para diferenciar C.

pseudotuberculosis de bactérias taxonomicamente próximas, incluindo C.

ulcerans.

� O ensaio é altamente sensível, permitindo a detecção de 10 pg de DNA

genômico de C. pseudotuberculosis por reação.

� Utilizando a reação de mPCR, foi possível confirmar a identificação de 40

isolados bacterianos.

� Foi padronizado um protocolo para extração de DNA de C.

pseudotuberculosis de amostras clínicas de animais portadores de

linfadenite caseosa.

� O ensaio de mPCR permitiu a detecção direta de C. pseudotuberculosis em

56 amostras de pus de caprinos e ovinos infectados, com alta sensibilidade

diagnóstica. Não foi possível detectar esta bactéria em amostras de

sangue.

� Através da amplificação individual do gene pld de C. pseudotuberculosis, é

possível detectar essa bactéria em amostras de soro de animais infectados.

5.2. PERSPECTIVAS

O presente trabalho abre perspectivas para:

� Empregar o ensaio de mPCR desenvolvido como ferramenta auxiliar em

estudos de prevalência de linfadenite caseosa em diferentes regiões do

Brasil.

� Avaliar a viabilidade do ensaio de mPCR na prática laboratorial, como

ferramenta para o diagnóstico da linfadenite caseosa.

� Montar uma coleção de isolados de C. pseudotuberculosis de diferentes

regiões do Brasil, para estudos posteriores de variabilidade genética.

� Montar um banco de soros de animais portadores de linfadenite

caseosa.

� Padronizar uma reação de PCR quantitativa em tempo real para

detecção do gene pld de C. pseudotuberculosis diretamente em

amostras de soro de animais infectados.

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ALVES, F.S.F. & PINHEIRO, R.R. Linfadenite caseosa – Recomendações e

medidas profiláticas. Sociedade Nacional de Agricultura, ano 100, Artigo Técnico

[on-line]. 1997. Disponível em: <http://www.snagricultura.org.br/artigos/artitec-

caprino.htm>.

ARSENAULT, J.; GIRARD, C.; DUBREUIL, P.; DAIGNAULT, D.; GALARNEAU,

J.-R.; BOISCLAIR, J.; SIMARD, C.; BÉLANGER, D. Prevalence of and carcass

condemnation from maedi-visna, paratuberculosis and caseous lymphadenitis in

culled sheep from Quebec, Canada. Prev. Vet. Med., 59:67-81, 2003.

AYERS, M.; JUNIOR, M.A.; AYERS, D.L.; SANTOS, A.S. BioEstat 2.0 Aplicações

estatísticas nas áreas das ciências biológicas e médicas. Brasília: CNPq, 2000.

260p.

BAIRD, G. 1997. Caseous lymphadenitis: an increasing cause for concern. Vet.

Rec., 140:611.

BOUGNOUX, M.E.; DUPONT, C.; MATEO, J.; SAULNIER, P. ; FAIVRE, V. ;

PPAYEN, D.O.; CHANOINE, M.H.N. Serum is more suitable than whole blood for

diagnosis of systemic candidiasis by nested PCR. J. Clin. Microbiol., 37:925-930,

1999.

BRÍGIDO, M.M. Quantificação de ácidos nucléicos e de proteínas por métodos

espectrofotométricos. In: Azevedo, M.O.; Felipe, M.S.S.; Brígido, M.M.; Maranhão,

A.Q.; De-Souza, M.T. (org.), Técnicas básicas em biologia molecular, 1ª ed. Ed.

UnB, 35-47, 2003.

CARMINATI, Renato. Estudo da sensibilidade e especificidade de quatro testes

ELISA e utilização da técnica de PCR para o diagnóstico de linfadenite caseosa

em caprinos. Salvador: Instituto de Ciências da Saúde da UFBA, 2005. 82p.

(Dissertação, Mestrado em Imunologia).

ÇETINKAYA, B.; KARAHAN, M.; ATIL, E.; KALIN, R.; DE BAERE, T.;

VANEECHOUTTE, M. Identification of Corynebacterium pseudotuberculosis

isolates from sheep and goats by PCR. Vet. Microbiol., 2359:1-9, 2002.

CREMONESI, P.; LUZZANA, M.; BRASCA, M.; MORANDO, S.; LODI, R.;

VIMERCATI, C.; AGNELLINI, D.; CARAMENTI, G.; MORONI, P.; CASTIGLIONI,

B. Development of a multiplex PCR assay for the identification of Staphylococcus

aureus enterotoxigenic strains isolated from milk and dairy products. Mol. Cell

Probes, 19:299-305, 2005.

DERCKSEN, D.P.; BRINKHOF, J.M.A.; DEKKER-NOOREN, T.; VAN MAANEN,

K.; BODE, C.F.; BAIRD, G.; KAMP, E.M. A comparison of four serological tests

for the diagnosis of caseous lymphadenitis in sheep and goats. Vet. Microbiol.,

75:167-175, 2000.

DORELLA, F.A.; PACHECO, L.G.C.; OLIVEIRA, S.C.; MIYOSHI, A.; AZEVEDO,

V. Corynebacterium pseudotuberculosis: microbiology, biochemical properties,

pathogenesis and molecular studies of virulence. Vet. Res., 37:(2)201-218, 2006.

EDWARDS, M.C. & GIBBS, R.A. Multiplex PCR. Em: Dieffenbach, C.W. &

Dveksler, G.S. (ed.) PCR primer – A laboratory manual, CSHL Press, 157-171,

1995.

ELFAKI, M.G.; UZ-ZAMAN, T.; AL-HOKAIL, A.A.; NAKEEB, S.M. Detection of

Brucella DNA in sera from patients with brucellosis by polymerase chain reaction.

Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 53:1-7, 2005.

FARIA, G.A.; MORAIS, O.R.; GUIMARÃES, P.H.S. Análise da

ovinocaprinocultura no Norte e Nordeste de Minas Gerais. Sebrae. Relatório

técnico [on-line]. 2004. Disponível em:

<www.sebraemg.com.br/arquivos/Coopere_para_crescer/geor/diagnostico/ovinoca

prinocultura.pdf>.

GOUVEIA, A.M.G. Linfadenite Caseosa. Cabras e Bodes, 5:11-13, 1986.

HALBERT, N.D.; REITZEL, R.A.; MARTENS, R.J.; COHEN, N.D. Evaluation of a

multiplex polymerase chain reaction assay for simultaneous detection of

Rhodococcus equi and the vapA gene. Am. J. Vet. Res., 66:1380-1385, 2005.

HARRINGTON, J.R.; GOLDING, M.C.; MARTENS, R.J.; HALBERT, N.D.;

COHEN, N.D. Evaluation of real-time quantitative polymerase chain reaction assay

for detection and quantitation of virulent Rhodococcus equi. Am. J. Vet. Res.,

66:755-761, 2005.

HENEGARIU, O.; HEEREMA, N.A.; DLOUHY, S.R.; VANCE, G.H.; VOGT, P.H.

Multiplex-PCR: Critical parameters and step-by-step protocol. Biotechniques,

23:504-511, 1997.

HONORÉ-BOUAKLINE, S.; VINCENSINI, J.P.; GIACUZZO, V.; LAGRANGE,

P.H.; HERRMANN, J.L. Rapid diagnosis of extrapulmonary tuberculosis by PCR:

Impact of sample preparation and DNA extraction. J. Clin. Microbiol., 41:2323-

2329, 2003.

HOORFAR, J.; MALORNY, B.; ABDULMAWJOOD, A.; COOK, N.; WAGNER,

M.; FACH, P. Practical considerations in design of internal amplification controls

for diagnostic PCR assays. J. Clin. Microbiol., 42:1863-1868, 2004.

JOLLY, R.D. The pathogenesis of experimental Corynebacterium ovis infection in

mice. N. Z. Vet. J., 13:141-147, 1965.

JOST, B.H. & BILLINGTON, S.J. Arcanobacterium pyogenes: molecular

pathogenesis of an animal opportunist. Antonie van Leeuwenhoek, 88:87–102,

2005.

KHAMIS, A.; RAOULT, D.O.; LA SCOLA, B. rpoB gene sequencing for

identification of Corynebacterium species. J. Clin. Microbiol. 42:3925-3931, 2004.

KURIA, J.K.N.; MBUTHIA, P.G.; KANGETHE, E.K.; WAHOME, R.G. Caseous

lymphadenitis in goats: the pathogenesis, incubation period and serological

response after experimental infection. Vet. Res. Commun., 25:89-97, 2001.

KUSUKAWA, N.; UEMORI, T.; ASADA, K.; KATO, I. Rapid and reliable protocol

for direct sequencing of material amplified by the polymerase chain reaction.

Biotechniques, 9:66-68, 1990.

McADAM, A.J. Discrepant analysis: how can we test a test? J. Clin. Microbiol.,

38:2027-2029, 2000.

MENZIES, P.I.; HWANG, T.-I.; PRESCOTT, J.F. Comparison of an interferon-

gamma to a phospholipase D enzyme-linked immunosorbent assay for diagnosis

of Corynebacterium pseudotuberculosis infection in experimentally infected goats.

Vet. Microbiol., 100:129-137, 2004.

O’HALLORAN, D.M. & CAFFERKEY, M.T. Multiplex PCR for identification of

seven Streptococcus pneumoniae serotypes targeted by a 7-valent conjugate

vaccine. J. Clin. Microbiol. 43:3487-3490, 2005.

PATON, M.W.; WALKER, S.B.; ROSE, I.R.; WATT, G.F. Prevalence of caseous

lymphadenitis and usage of caseous lymphadenitis vaccines in sheep flocks. Aust.

Vet. J., 81:91-95, 2003.

PAULE, Bruno Jean Adrien. Estudo de antígenos de Corynebacterium

pseudotuberculosis e de suas interações com o hospedeiro caprino. Salvador:

Instituto de Ciências da Saúde da UFBA, 2003. 138p. (Tese, Doutorado em

Imunologia).

PERSSON, S. & OLSEN, K.E.P. Multiplex PCR for identification of Campylobacter

coli and Campylobacter jejuni from pure cultures and directly in stool samples. J.

Med. Microbiol., 54:1043-1047, 2005.

PIONTKOWSKI, M.D. & SHIVVERS, D.W. Evaluation of a commercially available

vaccine against Corynebacterium pseudotuberculosis for use in sheep. J. Am. Vet.

Med. Assoc., 212:1765-1768, 1998.

RIBEIRO, M.G.; JUNIOR, J.G.D.; PAES, A.C.; BARBOSA, P.G.; JÚNIOR, G.N.;

LISTONI, F.J.P. Punção aspirativa com agulha fina no diagnóstico de

Corynebacterium pseudotuberculosis na linfadenite caseosa caprina. Arq. Inst.

Biol., 68:23-28, 2001.

RIEGEL, P.; RUIMY, R.; DE BRIEL, D.; PRÉVOST, G.; JUL, F.; CHRISTEN, R.;

MONTEIL, H. Taxonomy of Corynebacterium diphtheriae and related taxa, with

recognition of Corynebacterium ulcerans sp. nov. nom. rev. FEMS Microbiol. Lett.

126:271-276, 1995.

SAMBROOK, J.; FRITSCH, E.F.; MANIATIS, T. Molecular cloning: a laboratory

manual, 2ed. Cold Spring Harbor :CSHL Press, 1989.

SCHOLZ, H.C.; WITTE, A.; TOMASO, H.; DAHOUK, S.A.; NEUBAUER, H.

Detection of Chromobacterium violaceum by multiplex PCR targeting the prgI,

spaO, invG, and sipB genes. Syst. Appl. Microbiol., 29:45-48, 2006.

SMIBERT, R.M. & KRIEG, N. R. Phenotypic characterization In: Gerhardt, P.;

Murray, R.G.E.; Wood, W.A.; Krieg, N.R. (ed.) Methods for general and molecular

bacteriology, 1ed. ASM Press, 607-654, 1994.

WILLIAMSON, L.H. Caseous lymphadenitis in small ruminants. Vet. Clin. North

Am. Food Anim. Pract., 17:359-371, 2001.

YANG, S. & ROTHMAN, R.E. PCR-based diagnostics for infectious diseases:

uses, limitations, and future applications in acute-care settings. The Lancet, 4:337-

348, 2004.

desenvolvimento de um ensaio de pcr- multiplex para

Documents