desenvolvimento de microesferas de plga contendo … · 2019. 10. 25. · roseane maria ribeiro...

Roseane Maria Ribeiro Costa

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

DESENVOLVIMENTO DE MICROESFERAS DE PLGA CONTENDO

INTERLEUCINA-2 PARA APLICAÇÃO NA TERAPIA

ANTI-NEOPLÁSICA

ROSEANE MARIA RIBEIRO COSTA

RECIFE, 2008.


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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

DESENVOLVIMENTO DE MICROESFERAS DE PLGA CONTENDO

INTERLEUCINA-2 PARA APLICAÇÃO NA TERAPIA ANTI-NEOPLÁSICA

ROSEANE MARIA RIBEIRO COSTA

RECIFE, 2008.

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em

Ciências Farmacêuticas da Faculdade de Ciências

Farmacêuticas da Universidade Federal de Pernambuco

para obtenção do Título de Doutor em Ciências

Farmacêuticas.

Área de Concentração: Produção e Controle de Medicamentos

Orientadora: Drª. Maria Inês Ré


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Ribeiro-Costa, Roseane Maria

Desenvolvimento de microesferas de PLGAcontendo interleucina-2 para aplicação na terapiaanti-neoplástica / Roseane Maria Ribeiro Costa. –Recife : O Autor, 2008.

xxii, 127 folhas ; il., fig., tab., quadros.

Tese (doutorado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCS. Ciências Farmacêuticas, 2008.

Inclui bibliografia e anexos.

1. Medicamentos – Sistema de liberação controlada. I. Título.

615 CDU (2.ed.) UFPE 615.014 CDD (22.ed.) CCS2006-078


iv


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Dedico esta Tese com todo meu amor aos meus

queridos pais, Maria de Lourdes Ribeiro Costa e

José de Barros Costa, pelos verdadeiros

ensinamentos e pelo imenso amor dedicado

em minha formação.


vi

AGRADECIMENTO ESPECIAL

A Drª Maria Inês Ré, minha querida orientadora, por ter tornado possível

a realização deste trabalho, tanto no IPT como na França, pelas

orientações e ensinamentos, apoio, confiança e por sua amizade.

A você Inês, meu muito obrigada!


vii

AGRADECIMENTOS

A Deus, por tudo. Muito obrigada!

Aos meus pais, Maria de Lourdes e José de Barros, e aos meus irmãos: Romero, Rômulo e Rinaldo, pelo apoio incondicional. Muito obrigada!

A Universidade Federal de Pernambuco, em especial a todos que fazem parte da Faculdade de Ciências Farmacêuticas que contribuíram pelo apoio e realização desse trabalho.

As pesquisadoras francesas, Elizabeth Rodier e Fabienne Espitalier, pela orientação, receptividade e toda atenção dispensada durante a realização do Doutorado-Sanduíche.

Ao Drº Pedro Michaluart Júnior, Cirurgião de Cabeça e Pescoço do Hospital das Clínicas do Estado de São Paulo e Coordenador desse Projeto sob apoio FAPESP, pela atenção e confiança.

Ao Drº Célio Lopes Silva, Coordenador do Laboratório de Vacinas Gênicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da USP, e as meninas: Giovanna Santos e Ana Paula Masson, pela realização dos ensaios in vivo com o Melanoma B16F10.

Ao Drº Luiz Carlos de Sá-Rocha, Professor do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USP – São Paulo, por tornar possíveis os ensaios in vivo com o Carcinoma de Ehrlich, pelos seus ensinamentos e por toda sua atenção.

Ao Drº Mário Ricardo Gongora Rubio, Pesquisador do IPT responsável pelos Dispositivos Microfluídicos utilizados como Inovação Tecnológica neste trabalho, e Márcio Rodrigues da Cunha, pela excelente parceria de trabalho nos ensaios com os micromisturadores.

Aos Pesquisadores do Laboratório de Processos Químicos e Tecnologia de Partículas (LPP) - IPT, Marco Giulietti, Wagner Aldeia, João Poço, Modesto Danese, Marcelo Seckler pela convivência agradável, em especial Silas Derenzo, pela amizade, conversas e atenção.


viii

A Família Zanin, Maria Helena Ambrósio Zanin e Antonio Carlos Zanin, pelo acolhimento afetuoso, confiança e valiosa amizade; as crianças, Laura e Sara, pelas brincadeiras e pelas gostosas gargalhadas que mim recordavam o quanto é bom ser criança; e a Neide Maria, por sua atenção. A vocês, meu muito obrigada especialíssimo!

A Jaqueline Rodrigues da Silva, Jaque, mais uma vez por sua amizade e constante incentivo, mesmo sem estar presente. E a sua mãe, D. Maria Rodrigues da Silva, pelas palavras de estímulo e abrigo essencial para conclusão da parte escrita do final da Tese.

Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas por todo apoio do início ao fim da realização da Tese.

Ao Instituto de Pesquisas Tecnológicas (IPT), pelo financiamento através da bolsa do “Programa IPT Novos Talentos”.

Ao órgão de fomento CAPES, Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, pela oportunidade de desenvolver uma parte deste trabalho no Centro RAPSODEE da EMAC- Ecoles des Mines d’Albi Carmaux- França.

A todos os amigos da Ecoles des Mines d’Albi Carmaux, em especial Anne Marie, Marie Carria e Márcio Martins.

Existem várias pessoas a quem eu gostaria de dedicar especial atenção pela importância que representaram durante toda essa minha jornada no IPT: Adriana, Adriano, Alcione, Amélia, Bergson, David, Eduardo, Érika, Isilda, Izabela, Juliana, Klaus, Kleber, Lecsi, Lúcia, Marcelo, Maurício, Natália, Pierre, Priscila, Rosana, Shibuta, Shirley, Viviane, Sheila, Suênia, e Ana Letícia. Valeu pessoal, por toda ajuda e pelas boas risadas.

Aos demais colegas do Instituto de Pesquisas Tecnológicas que participaram e contribuirão ao longo dessa caminhada.

A toda minha família e amigos que acreditaram em mim. Muito obrigada!


ÍNDICE

1.

2.

3.

ÍNDICE

LISTA DE FIGURAS

LISTA DE TABELA

LISTA DE QUADROS

LISTA DE EQUAÇÕES

ABREVIATURAS E SIGLAS

UNIDADES

NOMENCLATURA DAS EQUAÇÕES

RESUMO

ABSTRACT

INTRODUÇÃO

OBJETIVOS

2.1. Objetivo Geral

2.2. Objetivos Específicos

CAPÍTULO I - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA – INTRODUÇÃO

3.1. CÂNCER EPIDERMÓIDE AVANÇADO DE CABEÇA E PESCOÇO

3.2. TERAPIA BIOLÓGICA CONTRA O CÂNCER

3.2.1. Função do Sistema Imune

3.3. INTERLEUCINA-2 (IL-2) IMUNO-MODULADOR

3.3.1. Atividades Biológicas e Ação Imuno-imoduladora

3.3.2. Dose e Mecanismo de Ação

3.4. SISTEMAS DE LIBERAÇÃO CONTROLADA PARA IL-2

3.4.1. Considerações Gerais sobre Sistemas de Liberação Controlada

3.4.1.1. Método de Emulsificação seguida de Extração (difusão) e Evaporação de

Solvente

3.4.2. Sistemas Biodegradáveis de Liberação Controlada

3.4.3. Sistemas Microparticulados na Terapia do Câncer

3.4.4. Sistemas Microparticulados com Interleucina 2

3.4.5. Sistemas de Liberação Controlada de Proteínas

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4.

3.4.6. Inovação Tecnológica em Processos de Produção de Sistemas de Liberação

Controlada com a Introdução de Estruturas Microfluídicas

3.4.6.1. Microfluídica

3.4.6.2. Micromisturadores em Processos de Emulsão e Preparação de Micropartículas

Poliméricas

3.4.6.3. Métodos para Caracterização da Eficiência de Mistura em Micromisturadores

3.5. TUMORES EXPERIMENTAIS

3.5.1. Melanoma B16F10

3.5.2. Carcinoma de Ehrlich

CAPÍTULO II - DESENVOLVIMENTO FARMACOTÉCNICO

DESENVOLVIMENTO FARMACOTÉCNICO

4.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

4.2. METODOLOGIA

4.2.1. Análise Preliminar da Solubilidade do PLGA 50:50 em Diferentes Solventes

4.2.2. Preparação das Micropartículas de PLGA

4.2.2.1. Micropartículas de PLGA sem Ativo (fase interna aquosa)

4.2.2.2. Micropartículas de PLGA contendo Albumina de Soro Bovino

4.2.2.3. Micropartículas de PLGA contendo Recombinante Humana IL-2

4.2.3. Caracterização Físico-química das Micropartículas

4.2.3.1 Análise Morfológica

4.2.3.2 Determinação do Tamanho de Partícula

4.2.3.3. Determinação Residual do Álcool Polivínilico (PVA)

4.2.3.4. Medida do Potencial Zeta (Análise Eletroforética)

4.2.3.5. Eficiência de Encapsulação da BSA

4.2.3.6. Eficiência de Encapsulação da IL-2

4.2.3.7. Cinética de Liberação In Vitro

4.2.3.8. Degradação In Vitro das Micropartículas Mrh-IL2 e MPEG-IL2

4.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.3.1. Análise Preliminar da Solubilidade do PLGA 50:50 em diferentes Solventes


4.3.2.1. Caracterização das Micropartículas de PLGA sem Ativo

Agente emulsificante

Velocidade de rotação do impelidor

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5.

Tipo de solvente

Análise morfológica

Determinação residual do Álcool Polivinílico (PVA)

Potencial Zeta

4.3.2.2. Caracterização das Micropartículas de PLGA Contendo Albumina de Soro

Bovino

Determinação do tamanho de partícula

Eficiência de encapsulação

Cinética de liberação in vitro

4.3.2.3. Caracterização das Micropartículas de PLGA contendo Recombinante Humana

de Interleucina-2

Determinação do tamanho de partícula

Análise morfológica

Eficiência de encapsulação

Cinética de liberação in vitro

Degradação in vitro das micropartículas Mrh-IL2 e MPEG-IL2

4.4. CONCLUSÕES

CAPÍTULO III – TESTE DE CONCEITO

TESTE DE CONCEITO

5.1. MODELO TUMORAL MELANOMA B16F10

5.1.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

5.1.2. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

5.1.2.1. Linfoproliferação rhIL-2 livre e encapsulada

5.1.2.2. Avaliação do Nível de Endotoxinas presentes nas Mrh-IL2

5.1.2.3. Tratamento

5.1.2.4. Teste de Citotoxicidade

5.1.2.5. Dissociação da Massa Tumoral para Análise por Citometria de Fluxo (FACS)

5.1.2.6. Avaliação da Expressão de Marcadores de Superfície por Citometria de Fluxo

(FACS)

5.1.2.7. Anticorpos Monoclonais

5.1.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO


5.1.3.2. Avaliação do Nível de Endotoxinas presentes nas Formulações

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6.

5.1.3.3. Estudo de Sobrevida

5.1.3.4. Estudo da Atividade Biológica da rhIL-2

5.1.3.5. Citotoxicidade

5.1.3.6. Avaliação da Expressão de Marcadores de Superfície

5.1.4. CONCLUSÕES

5.2. MODELO TUMORAL CARCINOMA DE ERLICH

5.2.1. OBJETIVO


5.2.2.1. Tratamento

5.2.2.2. Estudo Histológico


5.2.3.1. Avaliação Tumoral


5.2.4. CONCLUSÕES

CAPITULO IV – INOVAÇÃO TECNOLÓGICA EM PROCESSO DE

PRODUÇÃO DE SISTEMAS DE LIBERAÇÃO CONTROLADA

INOVAÇÃO TECNOLÓGICA EM PROCESSO DE PRODUÇÃO DE

SISTEMAS DE LIBERAÇÃO CONTROLADA

6.1. MICROMISTURADORES UTILIZADOS

6.2.CARACTERIZAÇÃO DA EFICIÊNCIA DE MISTURA EM

MICROMISTURADORES

6.2.1. Estudo da Transferência de Massa entre 2 Líquidos Imiscíveis nos

Micromisturadores

6.2.2. Cálculos das Medidas

6.2.2.1. Cálculo da Vazão Real

6.2.2.2. Cálculo do Balanço de Massa

6.2.2.3. Cálculo do Coeficiente de Partição

6.2.2.4. Calculo da Razão Concentração/ Concentração de Equilíbrio


6.3.1. Caracterização da Eficiência de Mistura em Micromisturadores

6.3.1.1. Dispositivos Microfluídicos BD1 e BD2

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v

7.

8.

9.

10.

6.3.1.2. Dispositivos Microfluídicos ED1 e ED2

6.4. CONCLUSÃO

6.5. Preparação de Micropartículas Poliméricas pelo Método Modificado de

Emulsificação e Extração de Solvente

PAPER ACEITO PARA PUBLICAÇÃO NO PERIÓDICO POWDER

TECHNOLOGY (IN PRESS)

PREPARATION OF PROTEIN-LOADED PLGA MICROSPHERES BY AN

EMULSION / SOLVENT EVAPORATION PROCESS EMPLOYING LTCC

MICROMIXERS

1. Introduction

2. Experimental

3. Results and Discussion

4. Conclusions

References

CONCLUSÃO GERAL

SUGESTÕES PARA CONTINUIDADE DAS ATIVIDADES

9.1. Sugestões para Desenvolvimento Tecnológico

9.2. Sugestões para Continuidade dos Ensaios Pré-clínicos

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ANEXOS

Trabalhos enviados para congresso

Trabalho aceito na Powder Technology

Aprovação do Comitê de Ética

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LISTA DE FIGURAS


Figura 1. Configurações possíveis para sistemas de liberação microparticulados.

16

Figura 2. Esquema do método de emulsificação seguida de extração (difusão) e evaporação de solvente.

17

Figura 3. As diferentes interfaces de transferência de massa (solvente e substância sendo encapsulada) durante a microencapsulação por processo de emulsificação e difusão de solvente (extração ou evaporação).

19

Figura 4. Desenho esquemático de micromisturadores passivos fabricados com a tecnologia de LTCC (Cunha, 2006).

34

Figura 5 Esquema experimental do Método Villermaux/Dushman (adaptado de Pànic et al., 2004).

39

Figura 6. Transferência de massa entre solução água:metanol (50:50) e heptano: a absorbância do Nile Red no espectro do UV-visível ocorre em diferentes comprimentos de onda nestes diferentes meios: 489 nm em heptano e 581 nm para a mistura água: metanol (50:50). Adaptado de Pànic et al (2004).

40

CAPITULO II - DESENVOLVIMENTO FARMACOTÉCNICO

Figura 7. Microfotografias de micropartículas de PLGA obtidas sob agitação de 7000 rpm, a) PVA 3% e DCM; e d) PVA 0,5% e ACT (magnitude 1000×).

51

Figura 8. Efeito residual de diferentes concentrações do PVA associado à superfície das micropartículas (média ± desvio padrão, n =3).

52

Figura 9. Representação do mecanismo de ligação das moléculas de PVA e PLGA na superfície das partículas (Murakami et al., 1999).

52

Figura 10. Potencial zeta das micropartículas de PLGA obtidas com diferentes concentrações de PVA na fase externa da emulsão (média ± desvio padrão, n =7), em função do pH.

53

Figura 11. Perfil da cinética de liberação in vitro da BSA a partir das microesferas de PLGA (média ± desvio padrão, n = 3).

55

Figura 12. Micrografias da microscopia eletrônica de varredura (2000 ×); (a) Micro-BSA antes e (b) após cinética de liberação in vitro.

56


vii

Figura 13. Microfotografias das microesferas de PLGA liofilizadas: a) Mrh-IL2, b) MPEG-IL2 e c) MBSA-IL2 (magnitude 1500×).

57

Figura 14. Perfil da cinética de liberação in vitro da IL-2 a partir das micropartículas de PLGA (média ± desvio padrão, n = 3).

59

Figura 15. Micrografias das partículas Mrh-IL2 e MPEG-IL2, decorridos 7, 35 e 42 dias do ensaio de degradação em tampão PBS pH 7,4 (1500×).

60

CAPITULO III - ESTUDO PRÉ-CLÍNICO

Figure 16. Sala limpa de classificação ISO 7 montada no IPT (Instituto de Pesquisas Tecnológicas do Estado de São Paulo) para desenvolvimento das micropartículas de PLGA contendo IL-2.

64

Figure 17. Linfoproliferação da forma encapsulada da interleucina 2, Mrh-IL2. 69

Figure 18. Porcentagem de sobrevivência de animais tratados com apenas 1 inoculação intra-tumoral. Camundongos C57Bl/6 foram inoculados por via s.c. com 5x104 células B16F10. Dez dias após a implantação do tumor os animais receberam 1 injeção intra-tumoral de 100 μl de acordo com o tratamento de cada grupo: Grupo 1 – microesferas sem ativo; Grupo 2 - Proleukin®/4,5x104 UI; Grupo 3 - microesferas de IL2/4,5x104 UI. Todos os animais foram acompanhados até sua morte para avaliação da taxa de sobrevida.

70

Figure 19. Peso do tumor (g) após tratamento de acordo com os grupos: Grupo 1 – microesferas sem ativo; Grupo 2 - Proleukin®/4,5x104 UI; Grupo 3 - microesferas de IL2/4,5x104 UI.

71

Figure 20. Citotoxicidade mediada por linfócitos TCD8, conforme cada grupo de tratamento: Grupo 1 – microesferas sem ativo; Grupo 2 - Proleukin®/4,5x104 UI; Grupo 3 - microesferas de IL2/4,5x104 UI.

72

Figure 21. Variação do peso corpóreo dos animais (peso final - peso inicial): Grupo 1 – controle – solução salina; Grupo 2 - microesferas sem ativo Grupo 3 - microesferas de IL2/4,5x104 UI; e Grupo 4 - Proleukin®/4,5x104 UI.

75

Figure 22. Peso tumor (g) após terapia em camundongos C57Bl/6 inoculados s.c. com 1x106 células de carcinoma de Ehrlich e com injeção intra-tumoral de acordo com o tratamento de cada grupo: Grupo 1 – solução salina (controle); Grupo 2 - microesferas sem ativo; Grupo 3 - microesferas de IL2/4,5x104 UI; Grupo 4 - Proleukin®/4,5x104 UI. Os dados representam a media ± desvio padrão plotados pelo programa Basic Statistics p > 0,05 (ANOVA, seguida pelo teste de múltipla comparação Tukey).

76

Figure 23. Lesão tumoral com a presença de extensa área de necrose (n) de acordo com os grupos: a) Grupo 1 – solução salina (controle); b) Grupo 2 - microesferas sem ativo; c) Grupo 3 - microesferas de IL2/4,5x104 UI; e d) Grupo 4 - Proleukin®/4,5x104 UI.

78


viii

CAPITULO IV - INOVAÇÃO TECNOLÓGICA EM PROCESSO DE PRODUÇÃO DE SISTEMAS DE LIBERAÇÃO CONTROLADA

Figure 24. Desenho geométrico de micromisturadores passivos fabricados com a tecnologia de LTCC utilizados nesse trabalho (Cunha, 2006).

82

Figure 25. Simulações somente do escoamento nos dispositivos realizadas por Cunha (2006), com aplicativo baseado no método de elementos finitos chamado ANSYS.

84

Figure 26. Esquema experimental para caracterização da eficácia de mistura dos micromisturadores.

85

Figure 27. Fases líquidas antes e após a realização do experimento de mistura: (a) Nile Red na fase água:metanol (50:50) (Violeta intenso) e (b) fase n-heptano (incolor), antes da passagem pelo micromisturador; (c) mistura líquida recuperada na saída do micromisturador, onde se observa a existência de 2 fases distintas: (d) fase inferior (água:metanol, violeta) e (e) fase superior (heptano, amarela).

87

Figure 28. Coeficiente de partição (CNRH/CNR

Água/MeOH) em função da vazão total para os dispositivos BD1 e BD2.

88

Figure 29. Coeficiente de partição (CNRH/CNR

Água/MeOH) em função da vazão total para os dispositivos ED1 e ED2.

89

Figure 30. Esquema do arranjo experimental para preparação de micropartículas de PLGA pelo processo modificado.

92

PAPER ACEITO PARA PUBLICAÇÃO NO PERIÓDICO POWDER TECHNOLOGY

(PREPARATION OF PROTEIN-LOADED PLGA MICROSPHERES BY AN EMULSION

/ SOLVENT EVAPORATION PROCESS EMPLOYING LTCC MICROMIXERS)

Fig. 1. Micromixers geometry. 97

Fig. 2. Experimental set-up for emulsion/solvent evaporation process with LTCC micromixers.

98

Fig. 3. SEM micrographs (750x) of PLGA microspheres generated by emulsion/solvent evaporation process, with a LTCC micromixer (BD1) at different flow rates: a) 1.1 l/h; b) 2.2 l/h.

100

Fig. 4. In vitro release profile of BSA from (■) micromixer ED2, (□) micromixer BD1 and (○) mechanical agitation PLGA microspheres generated by emulsion/solvent evaporation.

103


ix

LISTA DE TABELAS

CAPITULO II - DESENVOLVIMENTO FARMACOTÉCNICO

Tabela 1. Distribuição granulométrica das micropartículas de PLGA preparadas com diclorometano.

50

Tabela 2. Tamanho médio das micropartículas PLGA contendo BSA. 54

Tabela 3. Eficiência de encapsulação da BSA. 54

Tabela 4. Tamanho médio das microesferas PLGA contendo rhIL2. 57

Tabela 5. Eficiência de encapsulação de IL-2. 58

CAPITULO III - ESTUDO PRÉ-CLÍNICO

Tabela 6. Grupos de tratamento de ensaio de sobrevida e de atividade biológica.

66

Tabela 7. Níveis de endotoxinas presentes nas microesferas de PLGA. 70

Tabela 8. Identificação do tipo de tratamento por grupo. 74

CAPITULO IV - INOVAÇÃO TECNOLÓGICA EM PROCESSO DE PRODUÇÃO DE SISTEMAS DE LIBERAÇÃO CONTROLADA

Tabela 9 Propriedades dos micromisturadores do tipo Serpentina 3D. 83

Tabela 10. Propriedades dos micromisturadores ED1 e ED2. 83

Tabela 11. Coeficientes de partição obtidos com os micromisturadores. 90

Tabela 12. Características físico-químicas das micropartículas de PLGA com IL-2 através do micromisturador BD2.

93

PAPER ACEITO PARA PUBLICAÇÃO NO PERIÓDICO POWDER TECHNOLOGY

(PREPARATION OF PROTEIN-LOADED PLGA MICROSPHERES BY AN EMULSION

/ SOLVENT EVAPORATION PROCESS EMPLOYING LTCC MICROMIXERS)

Table 1. Particles size range for PLGA microspheres (without BSA) produced by the emulsion/solvent evaporation method, employing different LTCC microfluidics structures.

100

Table 2. Properties of BSA loaded-PLGA microspheres generated by emulsion/ solvent evaporation (under mechanical agitation and with micromixers as mixing elements).

102


x

LISTA DE QUADROS


Quadro 1. Causas e mecanismos que podem comprometer a estabilidade físico-química de proteínas, no processo de microencapsulação por emulsificação e evaporação de solvente, armazenamento e teste dos sistemas de liberação controlada.

27

Quadro 2. Alternativas e mecanismos para manter a integridade da proteína durante o processo de microencapsulação.

28


xi

LISTA DE EQUAÇÕES


Equação 1. Reações do Método Villermaux/Dushman. 38

CAPITULO IV - INOVAÇÃO TECNOLÓGICA EM PROCESSO DE PRODUÇÃO DE

SISTEMAS DE LIBERAÇÃO CONTROLADA

Equação 2. Cálculo da Vazão Real

86

Equação 3. Cálculo do Balanço de Massa

86

Equação 4. Cálculo do Coeficiente de Partição

86

Equação 5. Calculo da Razão Concentração/ Concentração de Equilíbrio

86


xii

ABREVIATURAS E SIGLAS

ACT Acetato de etila

A1/O/A2 Emulsão múltipla

A1/O Emulsão simples

ANOVA Análise de variância

APC Células apresentadoras de antígenos

BSA Albumina de soro bovina

BSA-FITC Albumina de soro bovina com um marcador isotiocianato de fluoresceína

Ca++ Íon cálcio

CAPES Coordenação de Aperfeiçoamento

CEACP Carcinoma epidermóide avançado de cabeça e pescoço

CO2 Dióxido de carbono

CTPP Centro de Tecnologia de Processos e Produtos

CNRH/CNR

água/MeOH Relação Nile Red em heptano/ concentração do NR na mistura água:metanol

DC Células dendríticas

DPPC Dipalmitiol-fosfatidilcolina

DCM Diclorometano

DP Desvio padrão

E100 Eudragit

FACS Citometria de Fluxo

FDA Food and Drug Administration

FITC Isotiocianato de fluoresceína


xiii

FMVZ Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia

FU-5 Fluoracil-5

GM-CSF Fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos

HSA Albumina de soro humano

Hep-2 Carcinoma de laringe

H2O Água

H2BO3- Íon borato

H3BO3 Ácido bórico

H&E Hematoxilina e Eosina

IO3- Íon iodato

I3- Íon monovalente do iodo

I2 Iodo

HCl Ácido clorídrico

HCFMUSP Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo

IL-2 Interleucina-2

IFNγ Interferon-γ

IL-4 Interleucina-4

IL-6 Interleucina-6

IL7 Interleucina-6

IL-12 Interleucina-12

IL-1Ra Receptor antagonista da Interleucina-1


xiv

IL-18 Interleucina-18

ISO Padrão Internacional designação ou classificação IPT Instituto de Pesquisas Tecnológicas

INCA Instituto Nacional do Câncer

KI Iodeto de potássio

KIO3 Iodato de potássio

KI Iodeto de potássio

KIO3 Iodato de potássio

LAK Células destruidoras ativadas por linfocinas

LTCC Low Temperature Co-Fired Ceramics

LDH Lactato desidrogenase

Mg++ Íon magnésio

MEMS Micro-Electro-Mechanical Systems

MeOH Metanol

Micro PLGA Micropartículas de PLGA sem ativo

Micro BSA Micropartículas de PLGA contendo albumina de soro bovina

MrhIL-2 Micropartículas de PLGA contendo recombinante humana de Interleucina-2

MPEG-IL2 Micropartículas de PLGA contendo recombinante humana de Interleucina-2 com polietilenoglicol

MBSA-IL2 Micropartículas de PLGA contendo recombinante humana de Interleucina-2 com albumina de soro bovina

M-CSF Fator estimulador de colônias de macrófagos

MHC Complexo principal de histocompatiblidade

NK Células destruidoras naturais


xv

NaOH Hidróxido de sódio

NAD+ Forma oxidada da nicotinamida adenina dinucleotídeo

NADH+ Nicotinamida adenina dinucleotídeo

NR Nile Red

PLGA Copolímero e ácido láctico glicólico

PVA Álcool polivinílico

PCL Policaprolactona

PEG Polietilenoglicol

PH poli L-histidina

PEG-IL2 forma modificada da IL-2 succinyl (SIL-2) e polietilenoglicol (PEG IL-2)

PEG-PH Copolímero de bloco de polietilenoglicol e poli L-histidina

PVP Polivinil pirrolidina

PF68 Pluronic® F68

pDNA Plasmídeo do DNA

PMN Polimofornucleares

PBS Tampão fosfato de sódio

rhIL2 Recombinante humana de interleucina-2

RSA Albumina de soro de rato

RPMI Mistura de sais minerais enriquecidos com aminoácidos, vitaminas e outros componentes essenciais para crescimento celular

SIL-2 Succinyl Interleucina-2

SDS Dodecilsulfato de sódio

s.c. Via Subcutânea

SI Sistema imune


xvi

SNC Sistema nervoso central

TNF Fator de necrose tumoral


xvii

UNIDADES

ppm Parte por milhão

m/v Relação massa por volume

rpm Rotação por minuto

mg Miligrama

ml Mililitro

°C Grau Celsius

min Minuto

μg Micrograma

a1 Fase interna do sistema

a2 Fase externa do sistema

v/v Relação volume/volume

U Unidade

UI Unidade Internacional

μCi Micro-Curir

μl Microlitro

mmol Milimol

l Litro

kDa kilo Dalton

nm Nanômetro

UE/μg Unidades de endotoxina por miligrama de amostra


xviii

NOMENCLATURA DAS EQUAÇÕES

Q Vazão real

ΔQv Variação da vazão real

Vágua/MeOH Volume real da fase aquosa água/metanol

ΔVágua/MeOH Variação do volume real da fase aquosa água/metanol

Vheptano Volume real da fase orgânica heptano

ΔVheptano Variação de volume real da fase orgânica heptano

t Tempo

Δt Variação do tempo

mNR, água/MeOH/ entrada Massa do Nile Red na entrada da fase doadora, fase água/metanol

mNR, água/MeOH/saída Massa do Nile Red na entrada da fase doadora, fase água/metanol

mNR, heptano/saída Massa do Nile Red na saída da fase receptora, fase heptano

CNR, água:MeOH/saída Concentração do Nile Red na saída da fase doadora, fase água/metanol

CNR, heptano/saída Concentração do Nile Red na saída da fase receptora, fase heptano

Vágua/MeOH/entrada Volume da fase aquosa água/metanol na entrada do micromisturador

Vágua/MeOH/saída Volume da fase aquosa água/metanol na saída do micromisturador

Vheptano/saída Volume da fase orgânica heptano na saída do micromisturador

BM Balanço de massa

�p Coeficiente de Partição

Ceq,NR, heptano Concentração de equilíbrio do Nile Red na fase heptano


xix

RESUMO

Uma estratégia tecnológica para superar as limitações hoje encontradas na aplicação

clínica da Interleucina 2 (IL-2) para imunoterapia contra o câncer é o desenvolvimento de

um sistema de liberação controlada que mantenha a estabilidade da proteína encapsulada e

promova uma liberação sustentada dessa proteína, para estimular o próprio sistema imune

do paciente a combater a doença neoplásica, sem causar efeitos indesejáveis. Sistemas de

liberação controlada, microcápsulas ou microesferas, podem ser preparados através do uso

de polímeros biodegradáveis e biocompatíveis, tais como o copolímero de ácido láctico e

glicólico (PLGA) aprovado pela vigilância sanitária americana Food and Drug

Administration (FDA) para tratamento clínico. Estes sistemas poliméricos apresentam

como principal vantagem a possibilidade de modular características da partícula, como a

eficiência da microencapsulação e o perfil de liberação da proteína. O principal desafio

deste trabalho foi desenvolver microesferas biodegradáveis de PLGA contendo

Interleucina-2 pelo método de emulsificação/evaporação do solvente com propriedades

controladas como tamanho de partícula, eficiência de encapsulação e cinética de liberação

in vitro, para posterior ensaio pré-clínico. Investigou-se o efeito de variáveis do processo

como o efeito do agente emulsificante, o tipo de solvente e a velocidade de agitação,

encapsulando-se albumina de soro bovina (BSA), como proteína modelo, em microesferas

de PLGA. Neste estudo, foram definidas as condições de processo e formulação para a

obtenção de microesferas de PLGA contendo IL-2, onde também se explorou o efeito da

presença de agentes estabilizantes como polietilenoglicol e BSA na encapsulação de IL-2.

Inovando no processo de produção de micropartículas poliméricas, o uso de

micromisturadores desenvolvidos em LTCC (Cerâmica com baixa temperatura de

sinterização) foi explorado como alternativa tecnológica ao processo convencional que

envolve agitação mecânica na etapa de emulsificação. Microesferas de PLGA foram

produzidas utilizando diferentes tipos de dispositivos microfluídicos e os resultados

obtidos mostraram a viabilidade técnica desta inovação tecnológica, gerando microesferas

contendo IL-2, com eficiência de encapsulação e tamanho de partículas similares às

microesferas obtidas pelo processo convencional (eficiência de encapsulação da ordem de

80%, partículas menores que 40 µm).

As microesferas de PLGA contendo IL-2 foram desenvolvidas na tentativa de se

estabelecer um perfil cinético de liberação de IL-2 que possa solucionar problemas


xx

relacionados à aplicação intra-tumoral da IL-2 livre, visando o desenvolvimento de terapias

biológicas para câncer avançado de cabeça e pescoço. O estudo pré-clínico das

microesferas de PLGA contendo IL-2 foi realizado em dois modelos experimentais de

tumor, Melanoma B16F10 e Carcinoma de Erlich. Os resultados obtidos no estudo pré-

clínico realizado com os dois modelos tumorais coloca em evidência a importância de

ajuste dos modelos experimentais utilizados no desenvolvimento de terapias biológicas de

câncer usando sistemas de liberação controlada, onde a velocidade de evolução do tumor e

o tempo de duração de ensaios são decisivos para o desenvolvimento da resposta biológica

desejada.

Palavras chaves: Interleucina 2; Microesferas de PLGA; Micromisturadores em LTCC


xxi

ABSTRACT

The development of a controlled release system that maintains the stability of the

encapsulated protein, and that promotes a sustained release of this protein, for stimulating

the patient proper immune system against the neoplasic illness offers a technological

strategy to overpass the today limitations met with the clinical application of the

Interleukine 2 (IL-2) for the immunotherapy against cancer. Controlled release systems,

microcapsules or microspheres, can be prepared using biodegradable and biocompatible

polymers, such as the Poly (D,L lactic-co-glycolic) acids (PLGA), approved by the

American Food and Drug Administration (FDA) for clinical treatment. The main

advantage presented by these polymeric systems is the possibility of modulating the

characteristics of the particle, such as the microencapsulation efficiency and the protein

release profile. The main challenge of this work has been to develop biodegradable

microspheres of PLGA containing Interleukin-2, through the method of solvent

emulsification/evaporation, with controlled properties such as the particle size,

encapsulation efficiency, and in vitro kinetic release, for further pre-clinical test. The effect

of the variables of the process, such as the effect of the emulsifying agent, the type of

solvent, and the stirring speed have been investigated, using bovine serum albumin (BSA)

as model for the protein, within PLGA microspheres. In this study, the process and

formulation conditions were defined, for the production of microspheres of PLGA

containing interleukin-2. The effect of the presence of stabilizing agents like

polyethylenoglycol and BSA in the encapsulation of IL-2 has also been explored.

As an innovative part of the process for polymeric microparticules production, the use of

micromixers developed in LTCC (Low Temperature Co-fired Ceramics) has been analyzed

as an alternative technology to the conventional process involving mechanical stirring

during the emulsification stage. PLGA microspheres have been produced using different

types of microfluidics devices, and the obtained results show the technical viability of such

a technological innovation, since it allowed to produce microspheres containing IL-2 with

an encapsulation efficiency and particles size similar to those obtained for particles

produced through the conventional process (encapsulation efficiency of the order of 80%,

particles smaller than 40 µm).

The PLGA microspheres containing IL-2 were developed in an attempt to establish a

release kinetic profile of IL-2 that would be suitable to solve the problems linked to the

intra-tumoral application of the IL-2 alone, in order to develop biological therapies for


xxii

advanced cancer of head and neck. The pre-clinical study of the PLGA microspheres

containing IL-2 has been performed with two experimental models of the tumor,

Melanoma B16F10 and Erlich Carcinoma. The results obtained in the pre-clinical study

performed with the two tumoral models have clearly shown the importance to adjust the

experimental models used in the development of cancer biological therapies using

controlled release system, where the tumor evolution rate and the time available for tests

are decisive factors for the development of the desired biological response.

Keywords: Interleukine 2; PLGA Microspheres; LTCC Micromixers


2

1. INTRODUÇÃO

O câncer, cientificamente conhecida como uma doença neoplásica, caracterizada pela

proliferação descontrolada de células, indiferenciação e perda da função, é uma doença

difundida no mundo inteiro que causa temor na sociedade. Palavra de origem latina

“câncer” que significa “caranguejo” deve ter sido empregada em analogia ao modo de

crescimento infiltrante, que pode ser comparado às pernas do crustáceo, que as introduz na

areia ou lama para se fixar e dificultar sua remoção.

A existência de quase 200 tipos dessa neoplasia que diferem pela capacidade de

invadir tecidos e órgãos, vizinhos ou distantes, encurta anualmente, a existência de seis

milhões de indivíduos, superando em número todas as causas de morte, exceto os

problemas cardiovasculares. De acordo com o Instituto Nacional do Câncer (INCA), no

Brasil cerca de 13,7% de pessoas morrem todos os anos vítimas de neoplasias malignas.

Porém, o INCA divulgou no Congresso de Controle de Câncer realizado no Rio de Janeiro

(26/11/2007) que a estimativa para 2008 e 2009 será de aproximadamente 470 mil novos

casos de câncer.

O carcinoma epidermóide avançado de cabeça e pescoço (CEACP), desenvolvido na

mucosa do trato aero-digestivo superior, corresponde ao quinto tumor maligno mais

comum no mundo. O câncer na região de cabeça e pescoço é um dos mais prevalentes em

nosso meio. Considerando-se apenas a cavidade oral, foram estimados no Brasil, 10.890

novos casos de câncer em 2000, em sua quase totalidade, correspondendo a carcinoma

epidermóide.

Pacientes portadores de tumores avançados de cabeça e pescoço sofrem de maneira

acentuada com dor, problemas de deglutição, respiração e desestruturação estética causada

pelo câncer. Na prática médica, o manejo de pacientes com estágios avançados de câncer é

um dos maiores desafios. As alternativas de tratamento hoje existentes são paliativas e

baseiam-se principalmente, na cirurgia seguida por seções de radio-quimio-terapia, como

modalidades isoladas ou associadas. Porém, apresentam alta toxicidade, piorando a

qualidade de vida, sem praticamente garantir nenhum aumento de sobrevida. Muitos

pacientes com recidiva do CEACP não apresentam condições para um novo tratamento,

sendo a analgesia o único paliativo para esses pacientes, o que evidencia a necessidade de

estudos e avanços científicos para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas.

A terapia biológica, que vem se renovando pela revolução contra o câncer através da

estimulação do sistema imune, faz o uso de citocina, como a interleucina 2 (IL-2), para

estratégia de tratamento. No entanto, a administração da IL-2 está hoje limitada por uma


série de dificuldades técnicas como necessidade de altas doses, curto tempo de meia vida,

injeções freqüentes e efeitos colaterais. Neste contexto, o desenvolvimento de sistemas de

liberação controlada para uma citocina como a IL-2 pode ser uma alternativa promissora

para permitir o estímulo cosntante do sistema imune, reduzir a freqüência de administração

e sustentar a proteína no nível terapêutico desejado, sem causar efeitos indesejados.

Sistemas de Liberação Controlada podem ser desenvolvidos para encapsular

fármacos e proteínas, a serem administrados por diferentes vias como parenteral, intra-

muscular, dentre outras. Estes sistemas (microcápsulas ou microesferas) podem ser

preparados através do uso de polímeros biodegradáveis e biocompatíveis, tais como o

copolímero de ácido láctico e glicólico aprovado pela vigilância sanitária americana Food

and Drug Administration (FDA) para uso clínico. O principal desafio deste trabalho de tese

foi desenvolver microesferas biodegradáveis, à base de copolímero de ácido láctico e

glicólico (PLGA), para liberação controlada da Interleucina-2 (IL-2). Essas microesferas

representam uma estratégia tecnológica para os problemas relacionados à aplicação intra-

tumoral da IL-2 livre, visando o desenvolvimento de terapias biológicas para câncer

avançado de cabeça e pescoço.


4

OBJETIVOS


5

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo Geral

O objetivo principal deste trabalho é o desenvolvimento farmacotécnico e a aplicação

de uma forma encapsulada de um imuno-modulador, recombinante humana interleucina-2,

para uso intra-tumoral no tratamento de pacientes com carcinoma epidermóide avançado

de cabeça e pescoço, tendo por meta tecnológica, aumentar o tempo de exposição de um

tumor a um fármaco sem o aumento do número de intervenções para sua administração

local, através de uma liberação lenta e programada a partir de microesferas biodegradáveis

desenvolvidas no projeto.

2.2. Objetivos Específicos

Otimizar formulações de IL-2 em microesferas biodegradáveis de PLGA, com tamanho

controlado, menor que 40 µm, eficiência de encapsulação superior ao apresentado por

sistemas de liberação similares apresentados na literatura (> 60%) e perfis cinéticos de

liberação superiores a 15 dias.

Prospectar inovações tecnológicas no processo convencional de microencapsulação por

emulsificação seguida de extração/evaporação de solvente, introduzindo conceitos de

microtecnologia e microfluídica.

Realizar testes de conceitos com as microesferas de PLGA contendo IL-2 utilizando-se

diferentes modelos tumorais.


6

CAPITULO I

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA


7

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA – INTRODUÇÃO

Nesta revisão da literatura são abordados os principais temas tratados nesse trabalho.

Inicia-se com informações sobre câncer epidermóide de cabeça e pescoço, terapia

biológica do câncer, função do sistema imune e sobre um imuno-modulador de nosso

interesse, Interleucina-2. A seguir, aspectos gerais da tecnologia de microencapsulação são

apresentados. Diferentes técnicas são citadas, com descrição de técnica específica

envolvendo a obtenção de micropartículas poliméricas a partir de uma etapa de

emulsificação seguida da remoção do solvente (difusão, extração, evaporação) e revisão do

estado da arte referente à microencapsulação de IL-2 e proteínas, abordando as principais

dificuldades relacionadas à estabilidade e manutenção da atividade biológica de proteínas.

Ainda com referência ao processo de microencapsulação, visando prospectar inovações

tecnológicas no processo de obtenção dos sistemas de liberação controlada de interesse do

trabalho com a introdução de micromisturadores, aspectos gerais ligados a microfluídica e

micromisturadores também são apresentados, assim como, estudos realizados envolvendo

preparação de emulsões ou micropartículas poliméricas em processos empregando

micromisturadores na etapa de formação da emulsão.

Por fim, considerações sobre modelos tumorais são também apresentadas nesta

revisão.

3.1. CÂNCER EPIDERMÓIDE AVANÇADO DE CABEÇA E PESCOÇO

O carcinoma epidermóide avançado de cabeça e pescoço desenvolvido na mucosa do

trato aero-digestivo superior, incluindo cavidade oral, orafaringe, hipofaringe e laringe,

caracteriza-se por ser um tumor agressivo, com freqüentes recidivas loco-regional e a

existência de metástases em linfonodos cervicais ou à distância (Amar et al., 2005; White

et al., 2007). Muitos pacientes com recidiva do câncer de cabeça e pescoço não apresentam

condições para um novo tratamento curativo, uma vez que já se submeteram às recessões

extensas e tratamento irradiante. Sendo assim, alguns dos principais determinantes de bom

prognóstico são o diagnóstico precoce, que infelizmente não é rotina, e a intervenção,

conduzida dentro de uma boa técnica oportuna, adequada e correta (Kroeff, 2004; Amar et

al., 2005; Karahatay et al., 2007; White et al., 2007).

Os principais fatores de risco relacionados ao câncer epidermóide de cabeça e

pescoço são, sobretudo, pessoas que fazem uso continuo do álcool e/ou do tabaco, falta de


8

higiene bucal e diferentes infecções causadas por vírus (Heubeck et al., 2006; Rogers et

al., 2007).

No serviço de Cirurgia de Cabeça e Pescoço do HCFMUSP (Hospital das Clínicas da

Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo), aproximadamente metade dos

pacientes com câncer já apresenta metástases cervicais na primeira consulta. Esse é o

primeiro sítio de metástases desses tumores. Visto que, em geral, a sobrevida diminui pela

metade quando existe metástase cervical, é de máxima importância o tratamento dessas

lesões cervicais.

O tratamento do carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço baseia-se

principalmente na ressecção cirúrgica da área afetada seguida por seções de radio-quimio-

terapia como modalidades isoladas ou associadas (Dadian et al., 1993; Heubeck et al.,

2006). Para metástases cervicais, o tratamento preferencial é a cirurgia seguida de

radioterapia. Em algumas situações como, por exemplo, a infiltração da artéria carótida

pelo tumor, a cirurgia não pode ser realizada. Nesses casos, associa-se quimioterapia à

radioterapia.

Por vezes, apesar do tratamento radical com intenção curativa, ocorre a recidiva do

tumor. Essa recidiva pode ser no sítio do tumor primário (local), no pescoço (regional) ou

em outros órgãos (à distância). A recidiva local é, usualmente, passível de resgate

cirúrgico, considerando também a braquiterapia e a re-irradiação de lesões residuais. A

doença em outros órgãos deve ser tratada sistemicamente. Na recidiva regional, quase

nunca é possível a re-intervenção cirúrgica nem o aumento da dose de radioterapia devido

à proximidade de estruturas nobres como a artéria carótida.

O tumor recidivado no pescoço piora muito a qualidade de vida dos doentes sendo,

freqüentemente, responsável pelo óbito. Os cuidados paliativos têm por objetivo promover

uma melhor qualidade de vida, apesar de não alterar o tempo de sobrevida (Amar et al.,

2005). Sendo assim, a analgesia é praticamente um dos únicos recursos disponíveis a

serem oferecidos a esses pacientes, que demonstra a necessidade de estudos e avanços

científicos para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para esses casos. Uma

alternativa atraente é o desenvolvimento de um sistema de liberação controlada que pode

ser utilizado para estimular o próprio sistema imune do paciente para combater o câncer.


9

3.2. TERAPIA BIOLÓGICA CONTRA O CÂNCER

A terapia biológica, que é uma antiga forma de controlar o câncer pela estimulação

do sistema imune, vem se renovando incansavelmente pela busca da terapia contra doenças

neoplásicas (Rosenberg, 2000; Moingeon, 2001; Dasgupta et al., 2006; Roger et al., 2007).

O objetivo da imunoterapia é a erradicação das células tumorais através da manipulação ou

mobilização do sistema imune do paciente, resultando em longo tempo de imunidade e

poucos efeitos adversos decorrentes do tratamento (Kim et al., 2005; Cappuccio et al.,

2007). Os efeitos biológicos in vivo modulam a resposta imune, a estimulação ou inibição

da hematopoiese, regulam o crescimento e diferenciação celular, e modulam a

vascularização do tumor (Zwierzina, 1999; Moingeon, 2001).

Atualmente, o problema e o perigo potencial encontrado na terapia biológica é a

dificuldade ao se estabelecer a dose para os ensaios clínicos (Zwierzina, 1999; Moingeon,

2001; Dasgupta et al., 2006; Gravekamp, 2007). Numerosos ensaios clínicos têm mostrado

um grande potencial na resposta imunológica da vacina contra o câncer. Uma estratégia

que vêm sendo testada é a aplicação intralesional de substâncias que tenham efeito anti-

tumoral. Esta estratégia é baseada no desenvolvimento de vacinas anti-tumorais que

demonstram o papel principal das células T na resposta anti-cancerígena e atividade anti-

tumoral em ambos os modelos, animal e humano (Zwierzina, 1999).

A terapia biológica do câncer abrange proteínas, citocinas e fatores de crescimento

hematopoiéticos, bem como estratégias de tratamento usando anticorpos, vacinas ou vários

genes de interesse terapêutico (Rosenberg et al., 1998; Zwierzina, 1999; Zhang et al.,

2006). Devido à grande variedade funcional de várias famílias de citocinas, estas

moléculas podem influenciar tanto positivamente quanto negativamente o crescimento e a

metástase do tumor (Salazar-Onfray et al., 2007; Lavi et al., 2007).

O sucesso da imunoterapia é dado pela identificação de antígenos específicos de

tumores e na geração de uma resposta imune específica contra estes antígenos (Toubaji et

al., 2007). Apesar das células B e T serem direcionadas contra as estruturas presentes nas

células tumorais, ainda há células tumorais que se desprendem da massa tumoral e entram

na corrente sanguínea, escapando da defesa do sistema imune e ocasionando a metástase.

Esta falha, em limitar o crescimento do tumor pode ser explicada pela sua própria evolução

clínica que de certa maneira torna-se insensível para rejeição do mesmo através do sistema

imune. O estado de tolerância das células B e T tem sido demonstrado em vários modelos.

Em alguns casos, esta inibição pode ser reduzida pela administração de uma citocina como


10

a interleucina 2 (IL-2), ativando o sistema imune e ampliando a imunidade anti-tumoral

(Rosenberg et al., 1998; Salazar-Onfray et al., 2007; Rescigno et al., 2007).

Referente à imuno-modulação, várias citocinas já foram testadas em aplicação intra-

tumoral em pacientes com câncer de cabeça e pescoço (Mattijssen, 1994; Clayman et al.,

1998; Moingeon, 2001; Xian et al., 2005; Pries and Wollenberg, 2006). No entanto, a

intervenção com agentes físicos tem como limitação, a proximidade com as estruturas

nobres do pescoço. A utilização de material geneticamente modificado, inclusive produtor

de citocinas, requer técnica complexa e dispendiosa, apresentando uma série de

dificuldades, tais como: a administração não pode ser feita por via oral, devido a problemas

relacionados à degradação no meio ácido do trato gastro-intestinal; curto tempo de meia-

vida, o que requer administrações freqüentes em doses altas para obter eficácia terapêutica;

uma administração sistêmica em doses altas pode conduzir a efeitos colaterais e apresentar

toxicidade; estes sistemas são também muito sensíveis às condições ambientais (Dai et al.,

2005; Dass and Choong, 2006).

3.2.1. Função do Sistema Imune

A função básica do sistema imune (SI) é proteger e defender o organismo da invasão

por substância estranha o que é feito de diferentes formas. Constituído de células e

moléculas, sua resposta aos invasores é chamada de resposta imune (Abbas et al., 2000). O

SI funciona 24 horas por dia e age de modos diferentes, porém trabalha quase sem ser

notado. A falha do SI só torna-se perceptível quando ele falha por alguma razão ou quando

ele faz alguma coisa que produza um efeito indesejado que pode ser visto ou sentido. Essa

defesa é mediada, primeiramente, pela reação da imunidade inata (barreiras físicas como:

pele, mucosa, certas enzimas e células fagocíticas) e, depois, pela resposta da imunidade

adaptativa (linfócitos T e B) (Rescigno et al., 2007).

Há muito tempo se reconhece a relação entre a competência imunológica e a

evolução da doença maligna. Mais especificamente, a redução da atividade das células

supressoras tem sido demonstrada em pacientes (Sakai, 2004, Rescigno et al., 2007). Esta

observação está mais relacionada à presença de doença avançada do que ao tipo

histológico do tumor e também oferece as bases para imunoterapia de pacientes com

câncer, sob a hipótese de que a restauração da função imunológica pode levar a um melhor

prognóstico do caso.


11

Entre as células que fazem parte da defesa do sistema imune, avanços na biologia

demonstraram que as células dendríticas (DC), apresentadoras de antígenos, são

extremamente eficientes nas respostas imunes primárias, bem como, mediadoras da

ativação das células T (Abbas et al., 2000; Konemaka et al., 2004; Hagemann et al., 2007).

Os linfócitos T auxiliares (CD4) controlam o aspecto da tolerância imunológica e os

linfócitos T citotóxicos (CD8) atuam diretamente inibindo o tumor ou indiretamente

através da ativação das CDs (Engels and Uckert, 2007). Porém, essa interação apenas se

faz presente se as células tumorais além de expressarem antígenos tumorais, expressam

ainda, antígenos do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) de classe I (Sakai,

2004).

Também fazem parte da defesa imunológica contra tumores as células:

- Natural Killer (NK) que são células matadoras naturais que destroem as células tumorais

ou infectadas por vírus.

- Destruidoras ativadas por linfocinas (LAK), que diferem das NK, por apresentarem uma

atividade em amplo espectro de células alvos, mostrando-se promissoras contra vários

tipos de câncer (Colombo and Trinchieri, 2002).

O processo de iniciação do tumor maligno e a formação de metástase em humanos

podem levar anos ou décadas, dependendo do tipo de tumor. As células cancerígenas

evoluem das células normais adquirindo diversas mutações genéticas que eventualmente se

proliferam, aumentando o processo de mutação e reduzindo a sensibilidade aos sinais

apoptóticos e citotóxicos pelo SI. Neste processo, as células apresentadoras de antígeno

tornam-se alteradas por várias maneiras que promovem a resposta imune inata e, no estágio

final, algumas células se desprendem do tumor e escapam do reconhecimento do SI (Ben-

Eliyahu et al., 2007). Contudo, o SI pode detectar estes antígenos e iniciar uma resposta

humoral e celular para detectar e eliminar as células tumorais, inibindo assim, o

desenvolvimento do tumor (Rescigno et al., 2007).

3.3. INTERLEUCINA-2 (IL-2) IMUNO-MODULADOR

3.3.1. Atividades Biológicas e Ação Imuno-moduladora

A interleucina-2 é um polipeptídio natural de 130 resíduos de aminoácidos, 14 a 17

kDa (kilo Dalton), produzido principalmente por células T, embora também possa ser

sintetizada também por macrófagos e células teciduais (Merck Index, 1996; Thomas et al.,

2004)


12

Além de possuir ações terapêuticas anti-neoplásica e imuno-moduladora, a IL-2

apresenta as seguintes atividades biológicas (Hora et al., 1990; Atkins et al., 1999; Zhang

et al., 2006):

Estimula o crescimento da célula destruidora natural (Natural Killer - NK);

Atua como principal fator de crescimento autócrino para os linfócitos T;

Age sobre as células B humanas como fator de crescimento e como estímulo para

síntese de anticorpos;

Pode também agir como um fator de morte para as células T ativadas por antígenos,

promovendo apoptose.

Na terapia contra o câncer o tratamento biológico com IL-2 difere-se dos tratamentos

convencionais, quimio e radioterapia, estimulando o sistema imune a exercer um efeito

diretamente no tumor.

IL-2 foi o primeiro agente imunológico que demonstrou um efeito anti-tumoral pela

ativação das células imune. Pacientes de carcinoma renal foram tratados com alta dose da

IL-2 e a sobrevida média para esses pacientes foi de 16,3 meses com sobrevivência de (10-

20%) 5 a 10 anos após o tratamento (Voss et al., 1989). A administração de IL-2 em baixa

dose em pacientes com câncer renal e melanoma também apresentou resultados benéficos,

sendo, neste caso, relatados índices de 18-23% de sobrevida sem níveis tóxicos elevados

(Salazar-Onfray et al., 2007).

Devido ao curto tempo de meia vida que a IL-2 apresenta, doses elevadas desta

citocina são, freqüentemente, injetadas em terapias biológicas de câncer para se manter um

tempo longo de eficácia anti-tumoral (Hora et al., 1990; Atkins et al., 1999; Thomas et al.,

2004, Zhang et al., 2006). A definição de um protocolo apropriado de uso da IL-2 em

tratamento imunoterápico virá de esforços que vão sendo realizados em estudos de

diferentes estratégias de administração da IL-2. Estratégias apontadas na literatura:

Combinação com a quimioterapia – pode ser promissora e selecionar diferentes

mecanismos para extinção do tumor (Sampath et al., 1999; Salazar-Onfray et al.,

2007; Rescigno et al., 2007);

Combinação com a radioterapia – tratamento mais efetivo e menos tóxico (Safwat et

al., 2004);

Combinação com outras citocinas – TNF, IFNγ, IL-4, IL-6, IL-7, IL-12, GM-CSF -

sugerindo um sinergismo no efeito anti-tumoral (Hill et al., 2000; Mitchell, 2003;

Toubaji et al., 2007; Salazar-Onfray et al., 2007);


13

Combinação com anticorpos monoclonais – a IL2 pode facilitar a difusão intra-

tumoral de anticorpos monoclonais (Fridman and Tartour, 1997);

Combinações com vacinas tumorais (Overwijk et al., 2000; Shimizu et al., 1999;

Antonia et al., 2004);

Encapsulação da IL2 – para uma lenta e programada liberação da IL-2 no sítio de

ação desejado (Hora et al., 1990; Liu et al., 2000; Ozbans-Turan et al., 2002; Cadée

et al., 2002; Koten et al., 2003; Akbuga et al., 2004;Thomas et al., 2004).

3.3.2. Dose e Mecanismo de Ação

A interação entre células tumorais e o sistema imune é muito complexo e evolutivo

(Fridman and Tartour, 1997). O câncer difere em vários aspectos da maioria das doenças e

patógenos que interagem com o SI (Ben-Eliyahu et al., 2007) o que, por um lado, dificulta

a identificação precisa dos mecanismos que estão ativos em uma determinada situação,

bem como estabelecer uma hierarquia precisa dos diversos componentes da resposta imune

frente aos tumores (Sakai, 2004) e, por outro lado, estimula estudos de pesquisadores e

imunologistas tumorais.

Os mecanismos baseados para avaliar a imunoterapia com citocinas em células

tumorais ainda não estão bem definidos (Hill et al., 2002). Em trabalhos recentes, entre os

vários mecanismos que contribuem para a imunosupressão, muita ênfase tem sido dada em

às células mediadoras e reguladoras do processo inflamatório. A inflamação é uma

resposta natural dos organismos vivos a uma agressão sofrida capaz de causar uma lesão

celular ou tecidual. Em estágio de inflamação, as células imunologicamentes competentes

são acionadas e agem no sentido de inativar ou destruir microrganismos invasores,

remover substâncias irritantes e proteínas antígenas, além de estimular a renovação celular

e remodelagem do tecido (Hagemann et al., 2007; Salazar-Onfray et al., 2007).

Vários trabalhos evidenciam ações da IL-2:

IL-2 quando incubada in vitro com linfócitos gerou células capazes de lisar o tumor,

denominadas, células destruidoras ativadas por linfocinas (LAK), também identificadas

como células B e T que reconhecem as células cancerígenas (Dadian et al., 1993).

Tem sido demonstrado que a administração da IL-2 in vivo pode aumentar a

imunogenicidade de alguns tumores em camundongos, induzindo a secreção de vários

mediadores solúveis incluindo IL1, TNFα, IFNβ, IFNγ, IL6, GM-CSF e M-CSF

(Thompson et al., 1986). Esta indução depende da via de administração pela qual a IL2 é

aplicada. Neste estudo, observou-se que a aplicação de IL-2 em animais permitiu a


14

detecção de linfócitos T citotóxicos específicos para tumor, não observados antes da

administração dessa citocina.

Para determinar o impacto do tratamento com a IL-2 em pacientes com câncer, têm

sido administradas pela via sistêmica altas doses sucessivas, por um extenso período de

tempo, para manter um alto nível sistêmico desta citocina (Lindsey et al., 2000; Atkins et

al., 2000). A terapia local da IL-2, intra-tumoral ou peritumoral, tem sido investigada tanto

na clínica como em vários modelos experimentais e também requer aplicações em dias

sucessivos (Liu et al., 1997; Qin et al., 2001; Greenwald et al., 2003).

A IL-2 quando administrada em alta dose produziu resposta clínica significativa em

alguns tipos de câncer (Rosenberg et al., 1998; Overwijk et al., 2000; Shimizu et al.,

1999). Contudo, a toxicidade do tratamento com IL-2 é um fator limitante. Assim, a alta

dose de IL-2 não é apenas inconveniente, mas pode resultar também em uma série de

efeitos colaterais e tóxicos, incluindo febre, náusea, vômito, diarréia, desorientação,

neurotocixidade, citopenia, dentre os mais graves como edema pulmonar (Salazar-Onfray

et al., 2007). Por outro lado, foi observado em pacientes portadores de melanoma que a

administração de baixa dose da IL-2 resultou na prolongada e persistente transferência das

células T. Conseqüentemente, a eficácia da vacina pode ser obtida com uma dose mínima

de toxicidade (Antonia et al., 2004).

Outro efeito adverso relatado quando ocorre alto nível de expressão da IL-2 é o

bloqueio da atividade desta citocina. Neste caso, o estímulo ao sistema imune pode ser

reduzido, de modo significativo, por causa de uma formação danificada de linfócitos T

citotóxicos específicos para tumor (Schmidt-Wolf and Schmid-Wolf Ingo, 1995), inibindo

ou promovendo o crescimento do tumor (Antonia et al., 2004).

Como parte dos efeitos colaterais estão relacionados à dose da IL-2, protocolos que

incluem baixa dose de IL-2 para manter a eficácia são de grande interesse (Tartour et al.,

1992; Schmidt-Wolf and Schmid-Wolf Ingo, 1995; Fridman and Tartour, 1997).

As diferenças fisiológicas entre modelo experimental (animal) e paciente, assim

como, a inadequação de vários modelos pré-clínicos, dificultam a determinação de um

protocolo clínico mais eficiente para tratamento de pacientes. Estes problemas podem ser

minimizados com o uso de sistemas apropriados de liberação controlada que possam

promover um constante estímulo do sistema imune através de uma liberação lenta e

controlada de IL-2.


15

3.4. SISTEMAS DE LIBERAÇÃO CONTROLADA PARA IL-2

3.4.1. Considerações Gerais sobre Sistemas de Liberação Controlada

Na área farmacêutica, os sistemas de liberação controlada (SLC) são sistemas

bastante promissores no que diz respeito ao aumento da eficácia terapêutica de um fármaco

através da manutenção de níveis do fármaco dentro da faixa terapêutica, diminuição

significativa da toxicidade minimizando os efeitos colaterais, redução na necessidade de

administração de várias doses e conseqüentemente, à melhor adesão do paciente ao

tratamento (Vila et al., 2002; Haider et al., 2004; Dai et al., 2005; Chen et al., 2006;

Daugherty and Mrsny, 2006; Sun et al., 2008).

Os principais sistemas de liberação controlada existentes são: lipossomas,

nanocápsulas, nanoesferas, microcápsulas, microesferas, microemulsões, cristais líquidos,

patches ou bioadesivos (Kallinteri et al., 2002; Pohlmann et al., 2002; Qvist et al., 2002;

Formariz et al., 2005; Andreadis and Geer, 2006; Dass and Choong, 2006; Dong and Feng,

2007).

Os sistemas microparticulados têm sido empregados com sucesso para grande

variedade de fármacos tanto lipofílicos como hidrofílicos, incluindo: enzimas, hormônios,

peptídeos, proteínas, antibióticos, antifúngicos, antiinflamatórios, analgésicos e

anticancerígenos (Johansen et al., 2000; Haider et al., 2004; Andreadis and Geer, 2006;

Daugherty and Mrsny, 2006; George and Abraham, 2006, Zhang and Gao, 2007; Lavi et

al., 2007).

Os sistemas microparticulados são gerados através de técnicas de microencapsulação,

correspondendo a produtos constituídos de partículas, geralmente esféricas, de tamanho

entre 1 e 1000 µm, denominados microcápsulas ou microesferas (Ré, 2000; Berkland et al.,

2001; Ré, 2002).

Microcápsulas (Figura 1a) consistem, em geral, em uma camada de polímero que

atua como um filme protetor, isolando a substância ativa (gotículas líquidas ou partículas

sólidas) e evitando os efeitos de sua exposição inadequada. Essa camada externa desfaz-se

sob estímulo específico, liberando a substância ativa. O material ativo também pode estar

incluso em uma matriz sólida de polímero, formando nesse caso, uma microesfera, como

ilustrado na Figura 1b.


16

a) Microcápsula b) Microesfera

Figura 1. Configurações possíveis para sistemas de liberação microparticulados.

Inúmeras técnicas permitem a microencapsulação de um material ativo e o

desenvolvimento de sistemas microparticulados de liberação controlada, dependendo do

tipo de material, da aplicação e do mecanismo de liberação desejada para sua ação. A

diferença entre estas técnicas está no tipo de envolvimento ou aprisionamento do material

ativo pelo agente encapsulante, sendo que a combinação entre o material e o agente pode

ser de natureza física, química ou físico-química (Jackson and Lee, 1991; Jain, 2000; Ré,

2006), tais como:

Natureza física: spray drying (secagem de gotículas líquidas por aspersão em uma

corrente gasosa de ar quente, gerando partículas sólidas), spray cooling (secagem de

gotículas por resfriamento), leito fluidizado, extrusão;

Natureza físico-química: emulsificação seguida de evaporação/extração de solvente,

coacervação, separação por fase orgânica, pulverização em agente formador de reticulação;

Natureza química: polimerização interfacial, envolvendo uma reação de

polimerização na interface de duas soluções imiscíveis contendo monômeros, uma delas

contendo material ativo em suspensão, polimerização em emulsão, polimerização in situ,

inclusão molecular envolvendo a encapsulação de certas moléculas por outras.

No desenvolvimento de um sistema de liberação controlada microparticulado,

diversos fatores devem ser levados em conta, dentre eles: propriedades do princípio ativo

(especialmente a solubilidade), natureza do polímero (propriedades e concentração), uso da

partícula (tipo de terapia, via de administração, proteção do ativo, morfologia, estabilidade

e mecanismo de liberação), assim como, as condições do processo de obtenção do produto

(Jain, 2000; Andreadis and Geer, 2006; Chen et al., 2006; Dass and Choong, 2006).


17

3.4.1.1. Método de Emulsificação seguida de Extração (difusão) e Evaporação de

Solvente

Dentre os vários métodos existentes, um dos mais utilizados para encapsular

fármacos solúveis em água, especialmente, proteína e peptídeo, é o método de emulsão

múltipla seguido de evaporação ou extração de solvente, ilustrado na Figura 2 (Igartua et

al., 1998; Yang et al., 2000; Yang et al., 2001; Wei et al., 2004).

Figura 2. Esquema do método de emulsificação seguida de extração (difusão) e

evaporação de solvente.

Etapas 1 e 2 - Formação de uma emulsão múltipla.

A substância a ser encapsulada (substância ativa) é, primeiramente, dissolvida,

dispersa ou emulsificada em uma solução polimérica de um solvente orgânico, formando

uma emulsão primária do tipo A/O (Etapa 1, Figura 2) a qual, por sua vez, é dispersa em

uma fase externa (óleo ou água, geralmente água), constituindo a Etapa 2 (Figura 2), com a

formação de uma emulsão múltipla (geralmente A/O/A).

O método mais comumente usado para formação das emulsões é a agitação

mecânica. O parâmetro mais importante para o controle do tamanho das gotas da fase

orgânica na fase aquosa é a velocidade de rotação do impelidor. Um aumento na

velocidade de agitação geralmente promove um aumento na turbulência e nas forças de

cisalhamento, gerando assim gotas menores e, conseqüentemente, micropartículas de

menor granulometria (Blanco-Prieto et al., 1998; Jain, 2000).


18

Etapa 3 - Remoção do solvente da emulsão.

Uma vez formada a emulsão múltipla, o solvente orgânico deve ser extraído da fase

dispersa, o que levará à precipitação do polímero e formação das micropartículas. A

difusão do solvente orgânico para a fase aquosa pode levar à saturação desta dependendo

da relação de volume de fases (orgânica/aquosa). Neste caso, o solvente deve ser

evaporado da superfície da fase orgânica, através de agitação mecânica ou magnética, para

que se consiga eficiência na difusão do solvente orgânico para a fase aquosa, já que a

retirada contínua do solvente da fase orgânica mantém o gradiente de concentração entre as

duas fases, permitindo a extração do solvente da fase orgânica.

Quando se dilui a fase aquosa para facilitar a extração do solvente da fase orgânica,

o volume e composição da fase aquosa são definidos de forma que o volume total de

solvente orgânico possa ser difundido nessa fase. A velocidade de remoção do solvente

depende de vários fatores, dentre eles: concentração do material polimérico, composto

ativo e o próprio solvente, bem como o perfil de liberação desejado.

Etapa 4 - Separação e secagem de micropartículas.

No término do processo, as partículas são coletadas por filtração ou centrifugação, e

em seguida, são lavadas com água, para posterior processo de secagem a vácuo ou através

de liofilização, para obtenção do produto final (Jonhasen et al., 2000; Ungaro et al., 2006).

A taxa e as condições de secagem influenciam a quantidade de solvente e umidade

residuais nas partículas sólidas formadas, suas características morfológicas e porosidade,

fatores estes que podem afetar o perfil de liberação da substância encapsulada, podendo

assim, afetar o perfil de liberação do material ativo encapsulado.

Embora o princípio desta técnica seja simples, os fenômenos físico-químicos que

governam este método são complexos. O sistema é caracterizado pela existência de duas

interfaces líquido-líquido e uma interface líquido-gás através das quais ocorrem difusão e

transferência de massa durante o período de formação das microesferas (Figura 3). Desde o

início do método, o solvente orgânico se parte da interface L1/L2 para difundir na interface

L2/G onde se evapora. Esta partição não fica, no entanto, limitada ao solvente orgânico,

refere-se igualmente ao princípio ativo introduzido na fase dispersa, que pode se difundir

do interior da fase dispersa da emulsão primária para a fase externa aquosa, a partir da

interface L1/L3. A rapidez e a importância destes diferentes eventos de transferência de

massa vão afetar a estrutura final das micropartículas. Exemplificando, uma solidificação


19

rápida das micropartículas é desejada se o material ativo a ser encapsulado migra

facilmente para a fase aquosa.

L1: fase orgânica dispersa L2: fase aquosa dispersante L2/G: interface L2 /gás L1/L2: interface entre fases dispersa e dispersante L1/L3: interface entre fase aquosa interna e dispersa e dispersante

Figura 3. As diferentes interfaces de transferência de massa (solvente e substância sendo

encapsulada) durante a microencapsulação por processo de emulsificação e difusão de

solvente (extração ou evaporação).

As partículas obtidas são do tipo matricial. Este método permite, por conseguinte, a

preparação de microesferas. A sua dimensão vai depender de condições operacionais como

a velocidade de emulsificação, a viscosidade da fase que dispersa, a concentração dos

agentes tensoativos. Deverá estar geralmente entre 0,5 e 200 µm. Pode-se citar, como

polímeros de revestimento classicamente utilizados, etilcelulose, o poliestireno, e

polímeros biodegradáveis como poli-epson-caprolactona (Igartua et al., 1998; Yang et al.,

2001; Daugherty and Mrsny, 2006; Sun et al., 2008), polihidroxialcanoatos (Maia et al,

2004) e os homopolímeros e copolímeros dos ácidos lácticos e glicólico (Kumar et al.,

2001; Kang and Schwendeman, 2002; Vila et al., 2002; Lagarce et al., 2006; Lavi et al.,

2007).

3.4.2. Sistemas Biodegradáveis de Liberação Controlada

A oferta de encapsulantes que são utilizados para produção dos sistemas de liberação

controlada, em sua maioria polímeros de origem natural e sintética, vem crescendo na

indústria farmacêutica (Alonso et al., 1998; Jain, 2001; Dai et al., 2005; George and

Abraham, 2006). Dentre estes, pode-se mencionar os poliésteres sintéticos biodegradáveis

e biocompatíveis constituídos por ésteres de ácido láctico e ácido glicólico, PLA e PLGA.

Devido à biocompatibilidade, estes polímeros foram aprovados pela vigilância

sanitária americana (FDA) para uso clínico e farmacêutico, como suturas, fixadores e

regeneradores de ossos, peles e cartilagens artificiais, materiais odontológicos e liberação


20

de fármacos (Giunchedi et al., 1998; Kumar et al., 2001; Kang and Schwendeman, 2002;

Vila et al., 2002).

Para liberação de fármacos e proteínas vários tipos de PLGA, de natureza amorfa, são

utilizados, com diferentes razões monoméricas de ácido láctico: ácido glicólico (50:50 à

100:0), massa molecular (10-100 kDa) e grupo químico final (ácido carboxílico livre),

sendo assim, possível modificar as propriedades mecânicas, térmicas e biológicas pela

modificação na proporção dos ácidos láctico e glicólico. Estes três parâmetros determinam

a hidrofobicidade e a degradação cinética dos materiais, assim como, a eficiência da

microencapsulação e o perfil de liberação dos fármacos e proteínas.

A hidrofobicidade do PLGA também afeta interações das microesferas com as

células fagocíticas, como os macrófagos e células dendríticas. Estas interações são de

importância crucial para uso de sistemas de liberação controlada, constituídos por estes

polímeros, nas formulações de vacina (Johansen et al., 2000; Dass and Choong, 2006).

Os produtos da hidrólise destes polímeros, PLA e PLGA são, respectivamente, ácido

lático e ácidos lático/glicólico, produtos estes totalmente metabolizáveis no Ciclo de

Krebs, até CO2 e H2O.

A degradação de sistemas de liberação controlada à base de PLGA ocorre em dois

estágios: 1) O primeiro envolve a cisão hidrolítica da ligação éster, gerando oligômeros e

monômeros, o que reduz a massa molar do polímero; 2) O segundo estágio deve-se à

erosão desses sistemas, que perdem massa. A cisão hidrolítica pode ser auto-catalisada pela

presença dos produtos de degradação ácida (Faisant et al., 2002).

3.4.3. Sistemas Microparticulados na Terapia do Câncer

A liberação local e sustentada de moléculas biologicamente ativas, fármacos ou

imuno-moduladores, dentro do ambiente tumoral é essencial para o desenvolvimento de

uma resposta sistêmica efetiva com o mínimo de efeitos colaterais (Hill et al., 2002). A

microencapsulação de fármacos anti-cancerígenos em polímeros biodegradáveis é uma

estratégia promissora para modificar sua biodisponibilidade, reduzir a toxicidade e

aumentar a eficácia terapêutica desses agentes anti-tumorais (Manome et al., 2006;

Prokopowicz and Przyjazny, 2007; Xie et al., 2007). Além disso, os sistemas

microparticulados podem ter suas características físico-químicas ajustadas para diferentes

vias de administração, incluindo via intra-tumoral (Dass and Burton, 1999; Tinsley-Bown

et al., 2000; Lagarce et al., 2006; Lavi et al., 2007).


21

Vários fármacos microencapsulados em matriz polimérica, caracterizados como

sistemas de liberação controlada, foram propostos para uso em tratamento de tumores

malignos (Blanco et al., 2005; Manome et al., 2006; Son and Kim, 2007). O Fluoracil-5

(FU-5) é um anti-neoplásico que vem sendo utilizado para vários tipos de câncer: mama

(Earl and Iddawela, 2004), colo retal (Rothenberg et al., 2007), trato gastro-intestinal

(Dickson and Cunningham, 2004), pâncreas (Pasetto et al., 2004) e cabeça e pescoço (Kim

and Glisson 2003). Em conseqüência do seu uso extensivo para uma variedade de

tratamento de tumores malignos, o FU-5 foi encapsulado em microesferas de diferentes

sistemas poliméricos: Eudragit (Lamprecht et al., 2003), Quitosana (Denkbas et al., 1999);

PLA e PLGA (Fu et al., 2005; Siepman et al., 2004; Blanco et al., 2005).

Implantes de hidroxiapatita (Itokazu et al., 1996) e gelatina reticulada com

glutaraldeído (Fan and Dash, 2001) contendo doxorrubicina foram investigados como

potenciais sistemas de liberação deste fármaco para tratamento anti-cancerígeno de câncer

dos ossos. Especificamente, corroborando para o tratamento de câncer dos ossos,

Prokopowicz and Przyjazny (2007) encapsularam a doxorrubicina em uma matriz de gel

mesoporosa e observaram uma liberação controlada desse fármaco. Também há relatos na

literatura da microencapsulação deste anti-neoplásico em matrizes poliméricas de ácido

láctico e glicólico. Implantes de PLGA contendo doxorrubicina direcionada para outros

fins terapêuticos, como para terapia de tumores cerebral, especialmente gliomas, também

foram propostos na literatura (Manome et al., 2006).

Devido às limitações tóxicas do uso sistêmico do plaquitaxel, Xie et al. (2007)

produziram microesferas de PLGA contendo o mesmo, para tratamento de pacientes com

carcinoma avançado de laringe. A formulação obtida, quando comparada ao injetável

convencional, mostrou um aumento na eficácia terapêutica via intra-tumoral ou intra-

peritumoral em camundongos nude com carcinoma de laringe Hep-2 (Xie et al., 2007).

Igualmente, microesferas de PLA e PLGA contendo plaquitaxel foram desenvolvidas com

conjugado de anticorpos receptor endotelial vascular do fator de crescimento 2 na

superfície das partículas para tratamento de câncer de próstata. Tumores de próstata

humana foram inoculados em camundongos, os quais mostraram variabilidade, porém, o

grupo tratado com essas microesferas apresentou uma inibição significativa no crescimento

do tumor (Lu et al., 2004).

Para fins de terapia gênica, o gene da IL-12 modificado (p2CMVmIL12) foi

encapsulado em microesferas de PLGA apresentando uma inibição do adenocarcinoma em

camundongos, quando comparado ao grupo tratado com o controle DNA/IL-12. A


22

combinação da terapia gênica do pDNA (plasmídeo do DNA) com o tratamento do

Fluoracil-5 inibiu significativamente o crescimento do tumor, quando comparado apenas

com a terapia gênica isolada (pDNA). Esses resultados sugerem que as formulações de

microesferas do pDNA podem prover um eficiente sistema de liberação em terapia gênica

(Son and Kim, 2007).

Microesferas biodegradáveis encapsulando citocinas representam uma alternativa

clínica interessante na imunoterapia contra o câncer. Hill et al. (2002) observaram que a

liberação de IL-12 e GM-CSF no ambiente tumoral, a partir de microesferas de PLA,

induziu uma persistente resposta inflamatória, evidenciada pelo aumento no nível

sistêmico de citocinas inflamatórias; subsequentemente, esta inflamação promoveu a morte

substancial das células tumorais, evidenciada pela necrose massiva dentro do tumor

primário.

Antagonista do receptor da inteleucina-1 (IL-1Ra) que apresenta um potencial para

tratamento do câncer em fase de metástase foi encapsulado em microesferas de PLGA

usando albumina e trealose, como agentes estabilizantes (Lavi et al., 2007). De acordo com

esses autores, o protocolo de ensaio pré-clínico por eles utilizado, para o tratamento

realizado em camundongos portadores de melanoma B16, apresentou uma inibição de

crescimento do tumor e um aumento na sobrevida dos animais. Além disso, observou-se

que os tumores foram menos vascularizados e que houve uma redução de metástase no

pulmão, em 70% dos animais tratados em comparação ao grupo controle (Lavi et al.,

2007).

Outro estudo foi realizado com microesferas de PLGA contendo IL-18 (Lagarce et

al., 2006), visando uma liberação local de proteínas bioativas no sistema nervoso central

(SNC). IL-18 tem ampla atividade de interesse ao SNC como anti-tumoral para erradicar

especificamente as células malignas de um glioma, diretamente no SNC.

3.4.4. Sistemas Microparticulados com Interleucina 2

O protocolo clínico utilizado com a IL-2 para a terapia contra o câncer requer a

hospitalização do paciente envolvendo dois ciclos da administração intravenosa de IL-2 a

cada 8 horas durante 5 dias, com um intervalo de 9 dias entre cada ciclo. Portanto, para

superar essa e outras dificuldades encontradas hoje na terapia com a IL-2, vários dados da

literatura têm confirmado o interesse no uso de sistemas de liberação controlada contendo

interleucina 2 em polímeros biodegradáveis, tanto de origem natural como sintética, como

alternativa promissora para superar tais limitações.


23

A microencapsulação de IL-2 em hidrogéis de dextrana mostrou que a liberação pode

ser modulada pela densidade da reticulação e/ou pela degradação característica do

hidrogel, preservando sua atividade biológica entre 50 a 70% (Cadée et al., 2002). Em

outro estudo, microesferas de dextrana com IL-2 foram injetadas subcutaneamente em

ratos formando um depósito local, o qual gerou uma reação inflamatória inicial causada

pela infiltração de polimofornucleares (PMN) e migração dos macrófagos. Com a liberação

da IL-2 proveniente das microesferas de dextrana, as atividades das PMN e dos

macrófagos foram moduladas, induzindo uma necrose em massa das células tumorais

(aumento da fagocitose), dentre outros efeitos relatados pelos autores (Koten et al., 2003).

IL-2 também já foi encapsulada em microesferas de quitosana, de cerca de 1 μm de

tamanho médio, com uma eficiência de encapsulação entre 75 e 98% (Özbas-Turan et al.,

2002). A liberação in vitro destas partículas apresentou um perfil bifásico e observou-se

que a velocidade de liberação da IL-2 dependia das condições de preparação das

microesferas (formação por precipitação a partir da adição de um sal, Na2SO4, à uma

solução de quitosana), no entanto, de modo geral, a liberação ocorria por um período de

cerca de 200 dias. Segundo os autores, a captura celular destas microesferas feita em

culturas de células HeLa e L-strain apresentou-se como dose dependente. Outra

investigação foi feita com microesferas de quitosana contendo plasmídeo de IL-2, usadas

para aumentar a expressão e controlar a liberação do gene da citocina para células

cancerígenas (Akbuga et al., 2004).

IL-2 também foi encapsulada em microesferas formadas por um complexo de

polieletrólito de alginato e quitosana (Liu et al., 1997). As microesferas formadas por esses

dois polissacarídeos apresentaram estruturas porosas que, quando foram incubadas em

solução de PBS pH 7,2 contendo IL-2, adsorveram cerca de 95% da IL-2 do meio. Devido

às características aniônicas do alginato e catiônicas da quitosana, as interações iônicas

entre estes polímeros podem ser afetadas por suas cargas opostas, alterando a estrutura

porosa das microesferas o que, conseqüentemente afeta a incorporação da IL-2 nas

microesferas, bem como sua posterior liberação. Quando incubadas in vitro na presença de

células tumorais, a liberação da IL-2 a partir destas microesferas de alginato e quitosana

induziu uma produção mais eficiente de linfócitos T citotóxicos, em comparação a IL-2 em

sua forma livre (Liu et al., 1997).

Apesar de apresentarem resultados promissores, esses sistemas de liberação de IL-2

baseados em polímeros naturais de dextrana (Cadée et al., 2002; Koten et al., 2003) e


24

quitosana (Liu et al., 2000; Ozbds-Turam et al., 2002; Akbuga et al., 2004) não são

aprovados pelo FDA para uso em terapia clínica.

Por outro lado, alguns estudos já foram realizados visando o desenvolvimento de

sistemas de liberação controlada de IL-2 à base dos co-polímeros de ácido lático e

glicólico, PLGA, aprovados pelo FDA (Food Drug Administration):

1. Hora et al. (1990) encapsularam duas formas modificadas da IL-2 succinyl (SIL-2) e

polietilenoglicol (PEG IL-2) em microesferas de PLGA (52:48). Estas formas modificadas

da IL-2 foram empregadas com a finalidade de melhorar a solubilidade da IL-2, já que esta

é uma proteína com solubilidade limitada em meio aquoso. Os resultados destes autores

mostraram que a forma SIL-2 apresentou baixa eficiência de encapsulação da proteína

(dado não relatado na literatura), sendo esta liberada nos dois primeiros dias no ensaio da

cinética de liberação in vitro. A formulação PEG IL-2 ainda foi associada à albumina

humana, utilizada como um excipiente mediador de IL-2. Esta associação resultou em

melhor solubilização e difusão da IL-2 das microesferas de PLGA nos ensaios de liberação

in vitro em meios fisiológicos simulados (meio contendo dodecilsulfato de sódio (SDS) e

meio constituído de soro fetal bovino), correspondendo a uma liberação em torno de 2% a

3% por dia, durante um período de 20 a 30 dias. Porém, a literatura também aponta que

esta modificação covalente da IL-2 com o polietilienoglicol, apesar de aumentar o tempo

de circulação dessa proteína, pode reduzir severamente sua atividade biológica (Thomas et

al., 2004).

2. Mais recentemente, IL-2 foi microencapsulada em microesferas de PLGA (50:50), pelo

método de emulsificação e evaporação de solvente (Thomas et al., 2004), a partir de

emulsões, simples e múltipla. Quando empregado o método de emulsão simples, os autores

associaram IL-2 a agentes estabilizantes como manitol (crioprotetor na etapa final de

liofilização das microesferas) e dodecil sulfato de sódio (SDS) com a finalidade de limitar

a agregação da proteína e melhorar sua estabilidade na re-suspensão em meio aquoso. No

caso da emulsão múltipla, onde IL-2 é primeiro solubilizada em meio aquoso em uma

emulsão primária, esta foi ainda associada à albumina de soro bovina (BSA) buscando-se

aumentar a estabilidade da IL-2 e melhorar sua liberação. Em ambas as preparações

(emulsão simples ou múltipla), as formulações apresentaram uma eficiência de

encapsulação da IL-2 de 40 a 60%, com um percentual de liberação de 15% por um

período de 30 dias para as partículas obtidas pelo método de emulsão simples e 30% para


25

as partículas obtidas pelo método de emulsão múltipla por um período observado de 40

dias. Diferentes causas foram apontadas para explicar a liberação incompleta da IL-2

dessas formulações: - quantidades insuficientes dos agentes estabilizantes para re-

solubilização da proteína; - possível interação da IL-2 com a matriz polimérica; -

inativação da IL-2 durante a sua liberação devido ao micro-ambiente de baixo pH gerado

pelos produtos de degradação do PLGA.

Neste mesmo trabalho, os autores Thomas et al. (2004) encapsularam a IL-2 por

spray-drying usando como agentes encapsulantes um fosfolipídeo, dipalmitiol-

fosfatidilcolina (DPPC), e um polimetacrilato, Eudragit E100 (E100), produzindo

micropartículas finas de diâmetro médio de 4 µm, com uma eficiência de encapsulação

superior a 90%. O perfil cinético de liberação da IL-2 das partículas de DPPC/E100

apresentou uma fase inicial acelerada correspondendo a uma liberação de 80% da proteína

contida nas partículas já nos dois primeiros dias de ensaio. No entanto, segundo os autores,

este perfil pode ser ajustado pela modificação da proporção de DPPC e E100 nas

partículas.

Estes estudos já realizados referentes à encapsulação de IL-2 em microesferas de

PLGA colocam em evidência dificuldades em preservar a proteína durante o processo de

microencapsulação, manter uma eficiência elevada de retenção da IL-2 nas micropartículas

e no controle de sua velocidade de liberação em meios fisiológicos simulados. Um melhor

controle destes parâmetros demanda maiores investigações e continuidade dos estudos de

desenvolvimento de sistemas de liberação controlada de IL-2 usando PLGA como matriz

polimérica. De fato, os problemas e limitações observadas para IL-2 são comuns às

proteínas e principalmente ao processo de emulsificação e evaporação de solvente, que tem

sido o processo de microencapsulação mais utilizado para obtenção de microesferas

biodegradáveis. Um avanço no estado da arte relacionado ao desenvolvimento de sistemas

de liberação controlada de proteínas talvez tenha sido obtido até o presente momento com

proteínas modelo como, por exemplo, a albumina de soro bovina (BSA) e será o tema

tratado no item 3.4.5 a seguir.


26

3.4.5. Sistemas de Liberação Controlada de Proteínas

Proteínas são macromoléculas que apresentam uma série de limitações: não podem

ser administradas por via oral, devido a problemas relacionados à degradação no meio

ácido do trato gastro-intestinal; são muito sensíveis às condições ambientais, apresentam

curto tempo de meia-vida e necessitam de freqüentes administrações em altas doses para

obter eficácia terapêutica o que, por sua vez, pode conduzir a efeitos colaterais de elevada

toxicidade na administração (Dai et al., 2005; Liu et al., 2005; Dass and Choong, 2006).

Um dos métodos de microencapsulação de proteína mais utilizados na literatura é o

método de emulsão múltipla seguida de evaporação ou extração de solvente, (Igartua et

al.,1998; Johansen et al., 2000; Yang et al., 2001; Kim et al., 2005; Daugherty and Mrsny,

2006; Feczko et al., 2007). A etapa crítica da microencapsulação de uma proteína está

associada à manutenção da sua estabilidade, que por sua vez, está diretamente relacionada

as suas propriedades como agente terapêutico. A instabilidade pode ocorrer nas várias

etapas do processo de produção, armazenamento e aplicação e, a análise das possíveis

causas que podem afetar a estabilidade das proteínas é fundamental para se minimizar estes

efeitos na proteína encapsulada. O Quadro 1 lista algumas das causas e mecanismos que

podem comprometer a estabilidade físico-química das proteínas no processo de

microencapsulação por emulsificação e evaporação de solvente, armazenamento e teste dos

sistemas de liberação controlada, geralmente empregados no desenvolvimento (Zhu et al.,

2000; Cadée et al., 2002; Tamber et al., 2005; Daugherty and Mrsny, 2006).


27

Quadro 1. Causas e mecanismos que podem comprometer a estabilidade físico-química de proteínas, no processo de microencapsulação por emulsificação e evaporação de solvente, armazenamento e teste dos sistemas de liberação controlada.

Durante um processo de microencapsulação, a meta pretendida é evitar alterações na

proteína, controlando as variáveis de processo e formulação que possam favorecer

agregação irreversível, desdobramento reversível e degradação química da molécula

protéica, ao mesmo tempo em que se garante uma elevada incorporação da proteína nas

micropartículas geradas. O Quadro 1 aponta uma série de etapas do processo e de pós-

processamento como armazenamento e caracterizações e variáveis a elas ligadas que

devem ser controladas para fins de preservação da atividade protéica, tais como: utilização

de um co-encapsulante, um agente aditivo estabilizante, controle das condições de

Causas Mecanismos

Formação da emulsão simples (A1/O)

Desdobramento de proteína devido a forças de ultra-agitação durante emulsificação;

Degradação química na interface A1/O.

Congelamento e secagem das microesferas

Instabilidade ou agregação da proteína.

Armazenamento

Solvente residual pode induzir toxicidade;

Mudança nas características do polímero, como Tg e resistência hidrolítica, afetando a estabilidade e liberação da proteína.

Alteração nas características do polímero, como Tg e resistência hidrolítica, afetam estabilidade e liberação da proteína.

Incubação simulando meio fisiológico a 37°C

Agregação de proteína durante re-hidratação em ambiente aquoso;

Reações químicas: troca de tiol-dissulfídico, oxidação, acilação e hidrólise;

Adsorção de proteína na interface polímero/líquido;

Instabilidade e degradação devido a reações em meio ácido promovido pela hidrólise do polímero.


28

encapsulação e escolha do material polimérico (Haider et al., 2004; Dai et al., 2005;

Daugherty and Mrsny, 2006; Peppas and Kavimandan, 2006).

O Quadro 2 reúne algumas alternativas para a manutenção da estabilidade da proteína

durante o processo de microencapsulação (Chen et al., 2006; Tamber et al., 2005; Dai et

al., 2005; Peppas and Kavimandan, 2006).

Quadro 2. Alternativas e mecanismos para manter a integridade da proteína durante o processo de microencapsulação.

Alternativas Mecanismos

Aumento da concentração de proteína

Quantidades limitadas de proteína adsorvem irreversivelmente na interface, resultando em uma modesta eficiência de encapsulação. Uso de concentrações elevadas tem papel de auto-proteção.

Adição de várias proteínas ou proteínas antigênicas

Adição de proteínas tem sido utilizada com uma significante atividade interfacial como co-encapsulante para estabilizar diversas proteínas. Proteínas mais utilizadas: albumina soro humano (HSA), albumina de soro bovina (BSA) e albumina soro de rato (RSA).

Adição de tensoativos

Os tensoativos oferecem proteção contra agregação irreversível de proteínas parcialmente desnaturadas. Contudo, este uso deve ser limitado ao nível mínimo exigido para evitar possíveis reações tóxicas e de hipersensibilidade.

Adição de outros excipientes e

estabilizantes

Aditivos são utilizados para estabilizar emulsões através do aumento de viscosidade da solução. Esta função pode ser importante na redução da perda de proteína por difusão na interface a1/o. Aditivos como álcool polivinílico, carboxi-metilcelulose, estearato de etila, acetato de sódio, glutamato de sódio e sorbitol têm sido empregados em diferentes estudos.

Pareamento de íon hidrofóbico

O processo aquoso pode ser evitado pelo uso de proteína ou peptídeo com um complexo de íon. O papel do complexo iônico é diminuir a solubilidade aquosa da proteína ou peptídeo e aumentar sua dissolução em meio não aquoso, como em solvente orgânico. Assim, a estabilidade estrutural da proteína é dada pela restrição da mobilidade da cadeia apenas dentro do complexo iônico.


29

A co-encapsulação de aditivos geralmente é a primeira tentativa para melhorar a

integridade durante o período de incubação e liberação da proteína (Peppas and

Kavimandan, 2006). Várias alternativas têm sido propostas, dentre elas:

A incorporação de sais na matriz polimérica

Quando os sistemas de liberação controlada são expostos em meio aquoso, as cadeias

laterais dos aminoácidos neles encapsulados podem interagir com o meio levando à

degradação e agregação da proteína e conseqüente perda da funcionalidade da mesma.

Neste caso, a incorporação de sais na matriz polimérica pode representar uma estratégia de

controle do pH evitando a acidificação do micro-ambiente na matriz polimérica que leva à

degradação da proteína (Tamber et al., 2005; Dass and Choong, 2006).

Complexação com íon metálico

A formação complexa reversível com íons metálicos representa outra alternativa para

estabilização de proteínas. Através dessa complexação, a integridade físico-química de

uma proteína pode ser preservada por períodos prolongados de tempo até a dissociação do

complexo, dissolução e liberação da proteína contida em sistemas de liberação controlada

(Peppas and Kavimandan, 2006).

Modificações química na proteína a ser encapsulada ou no polímero a ser

utilizado como encapsulante

Modificações químicas da proteína, como ligações inter ou intra-moleculares,

derivação ou conjugação covalente, podem gerar compostos imunogênicos mais estáveis

(FágáiRomero Página 29 19/06/2008Romero Página 29 19/06/2008Criado por

Romeron, 1995). Modificações com polietilenoglicol podem manter a bioatividade e

imunogenicidade de peptídeos e proteínas, representando uma alternativa interessante para

melhorar a liberação da proteína e prolongar seu tempo de meia vida in vitro e in vivo, o

que merece futuro desenvolvimento e exploração (Vila et al., 2002; Dai et al., 2005; Dass

and Choong, 2006).

No entanto, deve-se lembrar que alterações na formulação como estas mencionadas

podem se refletir na cinética de liberação da proteína de seus respectivos sistemas de

liberação controlada.


30

Várias das alternativas apresentadas no Quadro 2 vêm sendo utilizadas na

encapsulação da albumina de soro bovina (BSA), como proteína modelo e também como

agente estabilizante de outra molécula bioativa, em microesferas de PLGA de diferentes

razões monoméricas e com uso de vários agentes tensoativos através da técnica de emulsão

múltipla.

Igartua et al. (1998) prepararam microesferas de PLGA (50:50) contendo BSA, como

proteína modelo, pela técnica de emulsão múltipla, utilizando o diclorometano como

solvente e o PVA como agente emulsificante. Eles investigaram algumas das condições de

processo que podem afetar a estabilidade da proteína como: contato com solvente e tipo de

agitação (uso de ultrassom e ultra-agitação). A estabilidade da proteína foi avaliada pelas

técnicas de eletroforese capilar e gel poliacrilamida. Os resultados obtidos por esses

autores mostraram que a integridade estrutural da BSA não foi comprometida pelas

variáveis do processo, obtendo-se partículas esféricas de superfície lisa com tamanho

médio da ordem de 1 µm, que apresentaram uma característica de perfil de liberação

trifásica, iniciado pela fase burst da liberação da proteína (≅ 15%) adsorvida na superfície

das micropartículas, seguida da liberação sustentada da proteína pela difusão da matriz e

finalizada pela bioerosão do polímero, com uma liberação total de 60% da BSA em cerca

de 30 dias.

Ainda na mesma linha, Yang et al. (2000) encapsularam a BSA em microesferas de

PLGA pela técnica de emulsão múltipla com PVA na fase aquosa externa, estudando a

influência do efeito da temperatura (5ºC a 42ºC ) na formação das micropartículas e através

das características e liberação da proteína a partir destas microesferas. Todas as

microesferas apresentaram poros tanto na superfície quanto na estrutura interna, bem

como, uma eficiência de encapsulação em torno de 60%. Os perfis de liberação da BSA a

partir das partículas produzidas nos dois extremos de temperatura estudados, 5ºC e 42ºC,

apresentaram menor burst de liberação da proteína (18%) no período de 24 horas; uma

liberação lenta e sustentada de 43% e 22% foi obtida no período subseqüente de 16 dias,

para as temperaturas de 5ºC e 42ºC, respectivamente. A eficiência de encapsulação para a

BSA pode ser encontrada na literatura em diferentes ordens de grandeza, devido às

condições de processo, características finais das microesferas e técnicas de caracterização.

Yang e outros colaboradores (2001) desenvolveram um dispositivo de liberação

controlada onde foram avaliados dois poliésteres o policaprolactona (PCL) e o PLGA

(65:35) na encapsulação da BSA. Eles observaram por técnica de microfotografia confocal

que a presença de PVA na fase aquosa externa influenciou na distribuição da proteína


31

dentro da matriz polimérica. Já a presença desse emulsificante na fase aquosa interna

proporcionou maior estabilidade das gotas contra a coalescência, resultando em uma

distribuição mais uniforme da BSA na matriz do polímero e uma liberação lenta. As

partículas obtidas com o PLGA apresentaram uma eficiência que variou entre 55 e 79% de

acordo com a quantidade teórica da BSA encapsulada, sendo que a formulação de maior

quantidade de BSA o maior efeito burst (≅ 40%) durante as primeiras 36 horas de ensaio, e

uma liberação superior a 80% por um período de 15 dias.

Albumina de soro bovina também foi encapsulada em diferentes tipos de PLGA,

caracterizado por diferentes razões monoméricas de ácido láctico e glicólico, 50:50, 75:25

e 85:15, pela técnica de emulsão múltipla (Wei et al., 2004). Partículas foram preparadas

com os 3 diferentes tipos de PLGA utilizando diclorometano como solvente, solução

aquosa contendo 1% (m/v) de PVA como emulsificante e velocidade de rotação do

impelidor mantida no processo em 700 rpm. Estas apresentaram um tamanho médio de 20

a 50 µm, com uma eficiência de encapsulação de BSA na faixa de 74 a 82%.

Micropartículas de PLGA 50:50 também foram preparadas com solução de 5% (m/v)

PVA, apresentando um tamanho médio de 2 a 5 µm, com a eficiência de encapsulação de

BSA na mesma ordem de grandeza (86%) das demais. O perfil da cinética de liberação da

BSA foi semelhante para as formulações de PLGA 75:25 e 85:15 com uma liberação

inicial em torno de 10% e uma fase sustentada de 23%, por um período de 25 dias. Nas

mesmas condições, as microesferas de PLGA 50:50 apresentaram uma liberação inicial da

proteína de 20%, seguida de uma liberação sustentada de 32%, observada no mesmo

intervalo de tempo.

A estabilidade da BSA também já foi investigada no processo de encapsulação em

PLGA 50:50 com a adição de um novo excipiente, o copolímero de bloco de

polietilenoglicol (PEG) e poli L-histidina (PH) (PEG-PH), pelo método de emulsão

múltipla. A PH é um copolímero, de natureza base fraca, que pode neutralizar o micro-

ambiente ácido proporcionado pelos produtos de degradação das microseferas de PLGA,

os ácidos láctico e glicólico. O PEG, polímero hidrofílico, foi utilizado para prevenir as

interações inespecíficas entre a BSA e a matriz polimérica de PLGA. As moléculas do

PEG-PH e uma molécula da BSA coalescem para formar um complexo iônico na faixa de

pH 5 a 6. As microesferas de PLGA/BSA e PLGA/PEG-PH/BSA apresentaram um

tamanho de partícula de 27 a 35 µm e uma eficiência de encapsulação superior a 80% para

todas as formulações. Os perfis de liberação da BSA a partir das diferentes formulações

foram significativamente diferentes, com uma liberação controlada de 70% para as


32

partículas de PLGA/BSA e, em torno de 90% para as formulações PLGA/PEG-PH/BSA

preparadas com diferentes proporções de PEG-PH, estas últimas, tendo apresentado uma

redução no burst de liberação inicial da proteína (Kim et al., 2005).

Feczko et al. (2007) prepararam nano e micropartículas de PLGA (50:50) contendo

albumina de soro bovina, também como proteína modelo, pela técnica de emulsão

múltipla, investigando o uso de três diferentes tipos de estabilizantes na fase aquosa -

álcool polivinílico (PVA), polaxamer, polivinil pirrolidina (PVP) – e o efeito no tamanho

das partículas, eficiência de encapsulação e cinética de liberação. Os resultados obtidos por

esses autores apontaram que o PVA mostrou-se ser o emulsificante mais eficiente, e que as

partículas assim preparadas apresentaram maior eficiência de encapsulação (> 90%) e

maior controle do tamanho de partícula, principalmente, para aquelas de escala

nanométrica. As micropartículas apresentaram, porém, um maior percentual de liberação

de BSA (65%) que as nanopartículas (40%), durante um período de 7 dias.

3.4.6. Inovação Tecnológica em Processos de Produção de Sistemas de Liberação

Controlada com a Introdução de Estruturas Microfluídicas

Como já discutido, os métodos mais utilizados para microencapsulação utilizando

polímeros envolvem geralmente extração, evaporação de solvente ou separação de fases,

com etapas de formação de emulsões simples ou múltiplas. A etapa crítica durante o

processo de formação das emulsões é a energia de dispersão bastante elevada fornecida

para a mistura de líquidos imiscíveis, normalmente obtida com ultra-agitação ou ultra-

homogeneizadores, que compromete a estabilidade de biomoléculas que podem degradar

ou ter a estrutura conformacional alterada, inativando o efeito terapêutico ou imunogênico.

Além de comprometer a estabilidade de biomoléculas, outro problema tecnológico

está no escalonamento do processo. Micropartículas poliméricas para uso em liberação

controlada são tipicamente produzidas em tanques agitados, com uma das fases

(geralmente oleosa ou uma emulsão água/óleo pré-formada) sendo dispersa na segunda

fase (geralmente aquosa, contendo emulsificantes) por variações de pressão ou forças de

cisalhamento para gerar pequenas gotas esféricas pela ação da tensão interfacial. Quando o

volume do tanque é aumentado para o aumento da produção, o controle da temperatura e

da geração das partículas sob dispersão mecânica, o ajuste da hidrodinâmica no reator

mediante variações de concentração de polímero, tipo de polímero ou solvente são

extremamente dificultados. Além disso, é um processo de difícil controle na dispersão


33

granulométrica, que compromete a qualidade do produto, e difícil automação, requisito

requerido para uma produção asséptica em grande escala.

A produção de emulsões em micromisturadores representa hoje uma alternativa

tecnológica bastante interessante para superar limitações hoje encontradas em processos

convencionais de produção de sistemas de liberação controlada microparticulados, onde a

produção de emulsões é etapa crucial afetando características importantes do produto como

estabilidade, dispersão granulométrica e taxa de encapsulação (Freitas et al., 2003; Freitas

et al., 2005; Wischke et al., 2006). Para o entendimento desta nova abordagem de

processo, conceitos de microfluídica serão introduzidos no item 3.4.6.1.

3.4.6.1. Microfluídica Micromisturadores podem se tornar uma técnica simples e versátil para produção de

emulsões estáveis se estes forem devidamente projetados para explorar as vantagens da

hidrodinâmica. Para tanto é imprescindível entender o efeito de escala induzido pela

redução de tamanho: em microcavidades, as forças viscosas e a tensão interfacial se tornam

relativamente dominantes quando comparadas às forças inerciais. Particularmente, a razão

da tensão interfacial para a força inercial aumenta até 1018 quando o tamanho é reduzido

para a dimensão de um micrômetro (Mae et al., 2004). Isto sugere que operações

utilizando propriedades interfaciais tais como produção de emulsões pode ser

drasticamente melhorada utilizando-se microcavidades.

A microfluídica apresenta como principais vantagens técnico-econômicas:

eliminação de forças mecânicas para mistura de fluídos e formação de emulsões, baseando-

se em princípios de microfluídica; aumento da portabilidade e diminuição do volume do

equipamento de mistura e operação contínua em comparação a sistemas mecânicos

convencionais (tanques agitados); diminuição de custos de materiais (insumos de

fabricação) e fácil manutenção do equipamento; processo contínuo; facilidade de

escalonamento da bancada para a produção industrial devido à possibilidade de integração

em paralelo de um número suficiente de micromisturadores para um dado volume de

produção; facilidade de produção asséptica de sistemas micro- e nanoencapsulados (Freitas

et al., 2003).

Os dispositivos microfluídicos apresentam dimensões entre alguns milímetros e

dezenas de micrômetros, onde o número de Reynolds geralmente é menor que 2000. O

escoamento de fluidos está em regime laminar e a mistura de fluidos num microcanal reto

se realiza basicamente por difusão, que se revela um processo lento e ineficiente (Beebe,


34

2000; Liu et al., 2000a). No entanto, é possível gerar distúrbios locais para induzir a

mistura de fluidos usando diversos mecanismos passivos ou ativos (Nguyen and Wu,

2005). Adicionando cotovelos ou ressaltos aos micro-canais ou projetando geometrias que

geram fluxos rotacionais é possível realizar mistura de fluidos de forma rápida e eficiente.

A Figura 4 ilustra o misturador passivo conhecido como Serpentina 3D (Liu et al., 2000a),

fabricado em LTCC (Low Temperature Co-Fired Ceramics) – tecnologia especializada na

produção de módulos eletrônicos miniaturizados, testado neste trabalho.

Figura 4. Desenho esquemático de micromisturadores passivos fabricados com a

tecnologia de LTCC (Cunha, 2006).

Em microcanais e microcavidades os números de Reynolds são baixos devido às

pequenas dimensões; assim os líquidos estão em regime laminar e a mistura se realiza

basicamente por difusão. É possível gerar turbulência local para induzir a mistura dos

fluidos usando diversos mecanismos passivos ou ativos.

Os micromisturadores passivos apresentam as seguintes características:

Tempos de mistura rápidos.

Processo de mistura definido pela geometria do dispositivo.

Possibilidade de integração com um microssistema fluídico.

Geração de dispersões com tamanhos de partícula pequenos e com distribuições

de partícula com desvio padrão baixo.


35

Possibilita sínteses de partículas em forma de pó micro e nanoestruturadas.

Eles podem ser usados para realizar dispersões de fluídos imiscíveis como emulsões

em líquido-líquido, espumas em líquido-gás e suspensões de partículas em nano-escala.

Adicionando cotovelos, cantos e ressaltos em microcanais ou realizando geometrias

que geram fluxos rotacionais é possível realizar mistura de fluídos passivamente com

parâmetros de interesse como: custo de fabricação, complexidade da geometria, perda de

carga, volume de amostra e tempo de mistura com características favoráveis.

3.4.6.2. Micromisturadores em Processos de Emulsão e Preparação de

Micropartículas Poliméricas

Existem poucos relatos disponíveis na literatura com relação ao uso de

micromisturadores passivos como ferramenta para obtenção de emulsão, dentre estes:

Schiewe et al. (2000) obtiveram uma emulsão do tipo óleo/água para fins

dermatológicos através do uso de micromisturadores passivos com princípio de mistura de

escoamento em multilaminação (geração de mistura por difusão, através de um conjunto de

lamelas). O dispositivo foi fabricado em titânio e silicone termicamente oxidado e

composto de microcanais de 25 e 40 µm de largura, 2 × 15 µm de comprimento. Os

resultados obtidos mostraram a dependência do diâmetro de gota com relação à vazão de

mistura total. Além disso, não foi observada nenhuma alteração no diâmetro médio das

gotas com relação à largura do canal de mistura. Por fim, foi feito um estudo comparativo

do micromisturador com um misturador convencional de laboratório e, assim, algumas

vantagens foram apontadas, tais como: formação da emulsão em processo contínuo; menor

distribuição de tamanho de gotas e dispersão; alta qualidade do produto formado; e maior

estabilidade da emulsão (creme), com menor uso de agente emulsificante, consideração

importante para formulações dermatológicas devido à possibilidade de redução de irritação

na pele.

A dispersão de sistemas compostos por líquidos imiscíveis, silicone/água e n-

heptano/água, foi analisada por Löb et al. (2006). Para realização desses experimentos os

autores utilizaram dois tipos de micromisturadores interdigitais (dimensões do dispositivo:

2 x 15 canais de alimentação com 60 µm de largura e 150 µm de altura), os quais se

diferenciavam pela direção dos fluxos de mistura, um co-corrente e outro contra-corrente.

O primeiro, fabricado em vidro, permitiu a visualização da formação de emulsão. O

diâmetro médio das gotas foi investigado quanto ao efeito de vazão total de mistura,

proporção volumétrica entre as fases e a correspondente perda de carga para uma dada


36

geometria de micromisturador. A avaliação desse estudo referiu-se, principalmente, aos

efeitos das características geométricas da câmara de mistura e do sistema de alimentação

na distribuição do tamanho de gotas. Os resultados indicaram que, o diâmetro médio das

partículas diminuiu significativamente, com a diminuição da altura e números de canais de

alimentação. Foi observada também a redução de diâmetro de gotas com o aumento da

vazão total de mistura, cujo resultado foi discutido em termos do aumento da energia gasta

no processo.

Kobayashi et al. (2007) prepararam emulsões de óleo de soja em água utilizando

microdispositivos fabricados em silicone (diâmetros entre 0,57 – 1,6 µm). As emulsões

geradas foram caracterizadas como monodispersas com diâmetros médios de gotas entre

1,4 – 3,5 µm.

No tocante à produção de micropartículas poliméricas:

O desempenho de micromisturadores (dimensões: 25 ou 40 µm de largura x 300 µm

de profundidade) foi investigado para a produção de micropartículas poliméricas de PLGA

contendo albumina de soro bovina, como proteína modelo, pelo método modificado de

emulsificação e extração de solvente (Feitas et al., 2003). A influência de alguns

parâmetros de processo e formulação nas características das microesferas foi estudada.

Foram obtidas microesferas com distribuição de tamanho na faixa entre 5-30 µm, com

reprodutibilidade. Os autores observaram que o tamanho das microgotas geradas pelo

micromisturador dependeu de parâmetros como geometria do canal, parâmetros de

processo como vazão total de mistura e proporção volumétrica entre os dois líquidos

imiscíveis e de formulação como tipo de solvente orgânico utilizado (diclorometano e

acetato de etila). Já parâmetros como a concentração da solução orgânica, o tipo de

polímero e a quantidade de proteína praticamente não afetaram a distribuição de tamanho

de partícula.

Na continuidade de suas pesquisas, o mesmo grupo (Freitas et al. 2005) produziu

microesferas de PLGA encapsulando a BSA, proteína modelo, através de uma combinação

entre uma célula ultra-sônica para obtenção da emulsão simples e, um micromisturador

para produção da emulsão múltipla. A combinação (ultra-sônica e micromisturador)

possibilitou a produção asséptica de microesferas com diâmetros entre 15 a 40 µm,

eficiência de encapsulação de 70% e boa reprodutibilidade.

Wischke et al. (2005) também encapsularam a BSA com um marcador isotiocianato

de fluoresceína (BSA-FITC) em microesferas de PLGA através do processo modificado de

emulsificação e evaporação do solvente, utilizando um micromisturador (25 µm de


37

diâmetro hidráulico, baseado em laminação e fabricado em aço inoxidável). As

micropartículas produzidas apresentaram diâmetros entre 2 a 3 µm, a uma vazão total de

mistura de 25 mL/min, com boa reprodutibilidade.

3.4.6.3. Métodos para Caracterização da Eficiência de Mistura em

Micromisturadores

A agitação geralmente é o modo de iniciar, acelerar ou melhorar fenômenos físicos

de mistura ou fenômenos físico-químicos resultantes da mistura. A mistura é um processo

físico que tende a uma distribuição uniforme da concentração em um volume finito,

geralmente, desejada no menor tempo possível.

A qualidade da mistura obtida com um micromisturador é muito importante para

avaliação do seu desempenho, bem como, para otimização do seu potencial de uso.

Diferentes métodos têm sido usados para caracterização da eficiência de mistura em

micromisturadores, baseados em diferentes princípios: uso de traçadores (corantes) e

medição de produtos de reação resultantes da mistura (reações simples, paralelas ou

competitivas).

1. Variação de cor ou intensidade de cor na corrente líquida saindo do

micromisturador, por exemplo, em função de uma variação do pH, resultante da mistura de

duas correntes líquidas.

Corantes como azul de bromofenol, fluoresceína, permanganato de potássio,

rodamina e fenolftaleína têm sido citados na literatura. Dentre estes, pode-se citar o

trabalho de Liu et al. (2000a) que investigaram o grau de mistura de micromisturadores

passivos, do tipo serpentina 3D e de canal reto. Nos experimentos foram utilizadas

soluções de fenolftaleína e hidróxido de sódio para avaliar a capacidade de mistura desses

dispositivos (soluções variam de incolor para cor vermelha para valores pH > 8). Os

autores verificaram que micromisturadores tipo serpentina 3D foram mais eficientes para a

mistura que um micromisturador do tipo canal reto.

2. Quantificação de produtos de reações, simples, consecutivas ou competitivas.

Para determinar e caracterizar a eficácia de mistura de micromisturadores, tem-se

utilizado, com maior freqüência, as propriedades cinéticas de reações simples,

consecutivas ou competitivas. Reações químicas diferentes ocorrendo em um mesmo


38

sistema produzem diferentes espécies químicas, as quais se formam em velocidades

diferentes. Conhecendo-se a cinética das reações em competição, pode-se calcular o tempo

de mistura quantificando-se a concentração das diferentes espécies formadas durante um

experimento de mistura de duas correntes líquidas em um elemento de mistura, por

exemplo, um dispositivo microfluídico.

Um dos métodos mais conhecidos é baseado na competição de duas reações

paralelas quando da mistura de duas correntes líquidas, miscíveis (sistema homogêneo), o

Método de Villermaux, adaptado para micromisturadores e então chamado de Método de

Villermaux/Dushman (Villermaux et al., 1992; Villermaux, et al., 1994).

Uma corrente líquida constitui-se de uma solução de ácido forte diluído (HCl ou

H2SO4), a outra, constitui-se de uma solução tampão de um ácido fraco (H3BO3,

CH3COOH) e uma base forte (NaOH) contendo KI e KIO3. Quando ácido bórico é usado

como ácido fraco para a solução tampão, as reações são as seguintes (Equação 1):

Equação 1. Reações do Método Villermaux/Dushman.

Nos experimentos, a solução tampão de KI/KIO3 é misturada com o ácido forte

diluído, geralmente ácido sulfúrico ou clorídrico, como ilustrado na Figura 5. No caso de

uma mistura ideal dos líquidos, o ácido é consumido pela reação rápida de neutralização

(R1). No entanto, se a mistura for ineficaz, a reação R2 passa a competir com a reação R1

pelo consumo de ácido, gerando o produto que é detectado por espectrofotometria de UV-

visível, como um complexo de iodo, cuja banda característica de absorção está entre 286 e

353 nm. A absorbância no comprimento de onda de 352 nm tem sido adotada como uma

medida da eficácia de mistura (medida na corrente de saída do elemento de mistura),

quantificando-se o produto da reação mais lenta que compete pelo consumo do ácido com

a reação mais rápida.

H2BO3- + H+ ⇔ H3BO3 (R1 – etapa extremamente rápida)

5 I- + IO3- + 6 H+ ⇔ 3I2 + 3 H2O (R2- etapa rápida)

I2 + I- ⇔ I3- (detecção UV/VIS)


39

Figura 5. Esquema experimental do Método Villermaux/Dushman (adaptado de Pànic et

al., 2004).

3. Método de transferência de massa de um pigmento solvatocromático entre duas

fases líquidas imiscíveis.

O método de Villermaux/Dushman descreve um processo de mistura ocorrendo em

sistemas homogêneos, mistura de dois líquidos miscíveis. Mais recentemente,

pesquisadores alemães (Pànic et al., 2004) desenvolveram um método para avaliar a

extensão da mistura de duas correntes de líquidos imiscíveis (emulsões). O método é

baseado na transferência de massa de um pigmento solvatocromático (Nile Red) entre dois

líquidos imiscíveis: 1) uma mistura água e metanol (50:50); 2) heptano, como ilustrado na

Figura 6.


40

Figura 6. Transferência de massa entre solução água:metanol (50:50) e heptano: a

absorbância do Nile Red no espectro do UV-visível ocorre em diferentes comprimentos de

onda nestes diferentes meios: 489 nm em heptano e 581 nm para a mistura água: metanol

(50:50). Adaptado de Pànic et al (2004).

3.5. TUMORES EXPERIMENTAIS

A qualidade dos estudos na fase pré-clínica depende muito da adequação dos

modelos de tumores experimentais (Saad-Hossne, 2002; Saad-Hossne et al., 2004). Um

grande avanço na área de oncologia experimental foi a introdução de tumores

transplantáveis ou transmissíveis. Estes tumores provenientes de animais são mantidos em

laboratório pelo transplante das células tumorais para hospedeiros susceptíveis (Sakai,

2004). Os tumores transplantáveis são utilizados como ferramentas úteis em cancerologia

para estudar a biologia tumoral básica, o desenvolvimento de novas formas farmacêuticas

e, ainda assim, a investigação potencial de novas estratégias terapêuticas. Diversos

modelos experimentais têm sido propostos no intuito de atender esse objetivo. Entre os

mais utilizados tem-se: tumor de Ehrlich, tumor de Walker e melanoma B16F10. Esses

estudos são considerados essenciais para uma correta aplicação dos ensaios clínicos em

seres humanos (Sava, 1987; Saad-Hossne et al., 2004).


41

3.5.1. Melanoma B16F10

A classificação primária do câncer é feita de acordo com o tipo de célula normal que

o originou, sendo assim, o melanoma é originado das células da pele que produzem

pigmento, os melanócitos (Almeida et al., 2005). O melanoma foi descrito pela primeira

vez por Hipócrates no século V sendo o termo melanoma surgerido por Caswell em 1938,

que relatou as características malignas do tumor. O termo melanoma é sinônimo de um

processo maligno. O modelo B16 é um bom modelo para estudos de tumores metastáticos

(Hosaka et al., 2000; Saad-Hossne, 2002). O tumor pode ser mantido na forma de cultura

de células, sendo implantada uma suspensão de células no tecido subcutâneo dos ratos.

A linhagem murina B16F10 é bastante agressiva in vivo e apresenta baixa

imunogenicidade. Estas características são compartilhadas pela maioria dos melanomas

humanos, o que explica que, na maioria das vezes, a eliminação das células tumorais

através da resposta imune seja extremamente difícil. A imunidade inata (macrófagos, NK e

as LAK) é, contudo estimulada, assim como a imunidade adaptativa (anticorpos e

linfócitos T CD4+ e CD8+) para desenvolver uma resposta humoral e celular específica

para tumor em pacientes humanos, fatores que abrem maior possibilidade de estímulo para

as respostas do tratamento imunoterápico. Vários grupos de pesquisa têm demonstrado,

porém, que pela ativação da resposta imune inata pode-se eliminar as células tumorais e

melhorar a resposta imune adaptativa (Lavi et al., 2007; Li et al., 2007).

As citocinas têm um importante papel na evolução/ rejeição das células tumorais in

vivo, e principalmente, as interleucinas pro-inflamatórias que apresentam atividade

protetora contra melanoma murino (Colombo and Trinchieri, 2002). Smyth et al. (2000)

sugerem que a quantidade de IL-12 liberada via sistêmica ou de produção local da citocina

influencia o tipo de célula que vai mediar a resposta imune anti-tumoral: seus resultados

experimentais mostraram desde nenhuma atividade anti-tumoral nas células NK (baixas

doses) até indução da imunidade tumoral mediada por células NK na presença da proteína

citolítica, perforina (em maiores doses de IL-2). Autores como Colombo and Trinchieri

(2002) sugerem que, após a primeira resposta, as células efetoras entram em defesa e uma

cascata de citocinas amplifica a reação inflamatória responsável pelo resultado final.


42

3.5.2. Carcinoma de Ehrlich

Carcinoma é o tipo mais comum de câncer, originando-se de células que revestem o

corpo, incluindo a pele e uma série de revestimentos internos como os da boca, garganta,

brônquios, esôfago, estômago, intestino, bexiga, útero e ovários, e os revestimentos dos

dutos mamários, próstata e pâncreas (Almeida et al.,2005).

Em 1896, Paul Ehrlich introduziu na pesquisa científica um tumor experimental,

descrevendo-o como uma neoplasia mal diferenciada, transplantável, originária de

adenocarcinoma mamário espontâneo de camundongas, transplantada entre animais desta

espécie em sua forma sólida. Dos inúmeros tumores experimentais utilizados para estudos

in vivo em diversos animais, o uso do tumor de Erlich, tem sido uma ferramenta muito útil,

pelas seguintes razões: facilidade na padronização do número de células a serem

inoculadas, facilidade de quantificação do crescimento ou da regressão da massa tumoral e,

também, por tornar possível – quando do estudo das células tumorais – os mesmos

métodos desenvolvidos para a pesquisa de células da corrente sanguínea e demais fluídos

orgânicos (Sava, 2004).

O tumor de Ehrlich é considerado um tumor bastante agressivo, composto por

células bastante indiferenciadas e pleomórficas, com intensa atividade proliferativa, além

de possuir capacidade de crescimento em qualquer linhagem de camundongos; provoca

uma reação inflamatória no local de sua inoculação alterando padrões de migração celular

e de exsudação, além de estimular/ ativar macrófagos inflamatórios (Sava, 2004).


43

CAPITULO II

DESENVOLVIMENTO FARMACOTÉCNICO


44

4. DESENVOLVIMENTO FARMACOTÉCNICO

Este capítulo apresenta os resultados obtidos em estudo de pré-formulação, de

microesferas de PLGA envolvendo produção e caracterização, com e sem ativo e presença

de agentes estabilizantes, com a finalidade de desenvolver condições de processo e de

formulação para encapsulação da proteína de nosso interesse, recombinante humana de

interleucina-2 (rhIL-2), para posterior estudo pré-clínico.

4.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Produzir e caracterizar micropartículas de PLGA sem ativo (Micro PLGA),

investigando o uso de variáveis de processo (tipo de solvente, agente estabilizante) em

suas características como tamanho médio e distribuição de tamanho;

Produzir e caracterizar micropartículas biodegradáveis contendo albumina de soro

bovina (Micro BSA), como proteína modelo, avaliando o perfil da cinética de liberação

in vitro da albumina por diferentes períodos de tempo;

Obter e caracterizar micropartículas contendo recombinante humana de Interleucina-2

(MrhIL-2), avaliando o perfil da cinética de liberação in vitro da IL-2.

Associar polietilenoglicol e albumina de soro bovina, como agentes estabilizantes, ao

recombinante humana de Interleucina-2, gerando novas micropartículas (MPEG-IL2 e

MBSA-IL2), visando maior estabilidade da IL-2 e avaliar o perfil cinético de liberação

da IL-2 destas formulações.

4.2. METODOLOGIA

4.2.1. Análise Preliminar da Solubilidade do PLGA 50:50 em Diferentes Solventes

A solubilidade do polímero PLGA 50:50 foi avaliada em diferentes solventes,

diclorometano (DCM) e acetato de etila (ACT), através da adição de uma quantidade em

excesso do polímero, em cada solvente, a temperatura de 25°C e 35°C para o ACT e de

apenas 25°C para DCM, devido a alta solubilidade do PLGA neste último solvente, nestas

condições, cada sistema foi mantido sob agitação magnética por um período de 40 horas. A

solubilidade do polímero em cada um dos solventes foi avaliada após remoção do

sobrenadante, evaporação em estufa com circulação de ar a 70°C durante 12 horas, e

quantificação da massa seca de PLGA dissolvida no solvente, metodologia adaptada de


45

Lambert and Peck. (1995). O ensaio de solubilidade foi realizado em triplicata para cada

temperatura.


4.2.2.1. Micropartículas de PLGA sem Ativo (fase interna aquosa)

As micropartículas de PLGA (micro PLGA) foram obtidas através do método de

emulsão múltipla (A1/O/A2), seguida pelo método de evaporação de solvente (Crotts et al.,

1997; Jain, 2000; Youan et al., 2001; Rosca et al., 2004). Inicialmente, o PLGA foi

dissolvido em diclorometano ou acetato de etila (fase orgânica). A esta fase orgânica, foi

adicionado 1 mL de solução tampão pH 7,4 e a mistura das fases foi promovida sob ultra-

agitação de 7000 rpm durante 30 segundos, para formação da emulsão simples (O/A1). A

emulsão simples foi dispersa na fase contínua (A2) sob ultra homogeneização (7000 rpm)

por 1 minuto, sendo a fase (A2) constituída de uma solução aquosa de PVA 0,5% ou 3%

(m/v), obtendo-se assim, uma emulsão múltipla (A1/O/A2). A seguir, a emulsão múltipla

formada era mantida sob agitação de 800 rpm durante 4 horas, para evaporação do solvente

e conseqüentemente, solidificação das partículas. Na etapa final, a suspensão de

micropartículas era centrifugada e lavada com água, a 4000 rpm durante 5 minutos (3

vezes), e congelada em freezer -20ºC para posterior liofilização por 16 horas.

A escolha do tensoativo é muito importante para estabilizar a emulsão durante a

formação de partículas (Vandervoort and Ludwing, 2002). Assim, na tentativa de formar

microesferas com outros tensoativos Pluronic® F68 (PF68) e Àlcool Polivinílico (PVA),

ambos aprovados pelo FDA para o desenvolvimento dessas formulações, foram preparadas

micropartículas utilizando-se PF68 (300 ppm a 0,5% m/v) e PVA (0,1% a 3% m/v) como

agentes estabilizantes das emulsões.

4.2.2.2. Micropartículas de PLGA contendo Albumina de Soro Bovino

As micropartículas de PLGA contendo albumina de soro bovino (Micro-BSA), como

proteína modelo, foram obtidas pelo método de emulsão múltipla (A1/O/A2). Adicionou-se

à fase orgânica, 1 mL da solução aquosa de BSA (razão mássica 1:10, fármaco/ polímero),

sob ultra-agitação (7000 rpm), para formação da emulsão simples (O/A1). Seguiu-se o

mesmo processo da preparação das micropartículas de PLGA sem ativo (item 4.2.2.1).


46

4.2.2.3. Micropartículas de PLGA contendo Recombinante Humana IL-2

As micropartículas de PLGA contendo recombinante humana de interleucina-2 (Mrh-

IL2) também foram obtidas pelo método de emulsão múltipla, através do mesmo processo

das Micro-BSA (Hora et al., 1990; Rosca et al., 2004). O PLGA foi solubilizado em

diclorometano, formando a emulsão simples (O/A1) com uma suspensão aquosa da rh-IL2

(razão 1:1000, fármaco/ polímero). As etapas posteriores foram executadas de acordo com

o item 4.2.2.1.

Também foram produzidas microesferas de PLGA e polietilenoglicol (PEG 4000)

encapsulando rhIL2 (MPEG-IL2) e microesferas de PLGA contendo a albumina de soro

bovina (BSA) como agente co-encapsulante da interleucina-2 (MBSA-IL2). Nestas

partículas, a recombinante humana IL2 foi adicionada em solução aquosa contendo PEG

ou BSA, resultando na fase aquosa interna (A1), seguindo assim, as etapas posteriores de

processo já descritas no item 4.2.2.1.

4.2.3. Caracterização Físico-química das Micropartículas

A caracterização físico-química foi realizada para todas as partículas obtidas neste

trabalho.

4.2.3.1. Análise Morfológica

As micropartículas de PLGA foram observadas em microscópio eletrônico de

varredura (JEOL JSM5200). As micropartículas foram inicialmente metalizadas, ou seja,

depositadas em fitas de cobre dupla face e recobertas por uma fina película de ouro e

analisados a 10 kV, em diferentes magnitudes.

4.2.3.2. Determinação do Tamanho de Partícula

A distribuição e o diâmetro médio das micropartículas de PLGA foram determinados

utilizando-se um analisador de tamanho de partículas Coulter (LS 230), que opera pelo

princípio de difração de raios laser. As micropartículas foram dispersas em solução de

Tween 80 a 0,01% (v/v) e sonicadas em banho ultra-som durante 20 minutos (Murakami et

al., 1999; Siepmann et al., 2004).

4.2.3.3. Determinação Residual do Álcool Polivínilico (PVA)

O teor residual de PVA associado às micropartículas foi analisado por

espectrofotometria UV-Visível (GBC - Cintra 10), através do método colorimétrico direto,


47

baseado na formação do complexo colorido entre os dois grupos vizinhos de hidroxilas do

PVA e a molécula de Iodo (Murakami et al., 1999; Sahoo et al., 2002; Konan et al., 2002).

4.2.3.4. Medida do Potencial Zeta (Análise Eletroforética)

A técnica convencional de espalhamento de luz que mede a variação da freqüência de

um feixe laser (efeito Doppler) foi empregada para determinação experimental dos valores

de mobilidade eletroforética (μD), definida como sendo a razão entre a velocidade (v)

resultante e a magnitude do campo elétrico (E) aplicado. O equipamento utilizado foi um

analisador eletroforético modelo Malvern ZetaMaster S. A relação proposta por

Smoluchowsky foi aplicada para conversão dos valores de mobilidade eletroforética em

potencial zeta (ζ).

A medida do potencial zeta das micropartículas de PLGA foi realizada em função de

soluções aquosas com pH ajustado para 3, 5; 7, 8 e 10, utilizando ácido clorídrico (HCl)

0,1M ou hidróxido de sódio (NaOH) 0,1M. Em seguida, a suspensão resultante era

sonicada por 10 segundos e a carga superficial das partículas era determinada através do

ZetaMaster.

4.2.3.5. Eficiência de Encapsulação da BSA

Os métodos utilizados para determinação da eficiência de encapsulação da BSA, a

partir das micropartículas de PLGA, foram de Lowry e do Coomassie brilliant blue BG-

250 ou reagente de Bradford. As determinações baseiam-se em metodologias

espectrofotométricas (Peterson, 1977; Zaia et al., 1998). Os resultados apresentaram o

valor da eficiência da proteína encapsulada nas microesferas, em relação à quantidade total

de proteína utilizada no processo de obtenção das partículas.

4.2.3.6. Eficiência de Encapsulação da IL-2

As micropartículas Mrh-IL2 foram solubilizadas em acetonitrila e centrifugadas. O

sobrenadante foi descartado e o resíduo sólido foi tratado com tampão fosfato pH 7,4 e

solução de NaOH 0,1N, para extração da interleucina (Chen et al., 1997; Diwan and Park,

2001; Diwan and Park, 2003). Após esse processo de extração, a quantidade de IL2

encapsulada foi determinada através do Kit Elisa específico para IL-2 (R&D Systems) (Liu

et al., 1997).


48

4.2.3.7. Cinética de Liberação In Vitro

Pesou-se 10 mg de micropartículas contendo BSA ou rhIL-2 em tubos de eppendorf e

adicionou-se 1 mL de tampão fosfato PBS pH 7,4. Em seguida, os eppendorfs foram

incubados em Shaker sob agitação de 110 rpm/min a 37°C, mantendo as condições “sink”.

A cada intervalo de coleta os eppendorfs foram submetidos à centrifugação de 10.000 rpm

por 5 min., o precipitado foi re-suspendido com tampão PBS pH 7,4 e o sobrenadante foi

congelado para posterior análise das proteínas (Rafati et al., 1997: Yang et al., 2001;

Youan et al., 2001; Ruan et al., 2002; Zheng et al., 2004).

4.2.3.8. Degradação In Vitro das Micropartículas Mrh-IL2 e MPEG-IL2

O ensaio de degradação in vitro das micropartículas Mrh-IL2 e MPEG-IL2 foi

realizado em tampão fosfato pH 7,4 contendo azida sódica 0,01% à 37°C, durante 11

semanas (Hausberg and DeLuca, 1995; Crotts et al., 1997). Pesou-se 10 mg das

micropartículas Mrh-IL2 e MPEG-IL2 em tubos tipo eppendorf. A cada tubo foi

adicionado 1 mL de PBS pH 7,4 e mantido em incubadora (Incubadora Selecta) à 37°C

com velocidade de 80 rpm. A cada semana, as amostras foram coletadas e centrifugadas a

10.000 rpm durante 5 min. Em seguida, o meio aquoso foi removido com a micropipeta e o

mesmo volume de água Milli-Q (1 mL) foi adicionado para lavagem das microesferas.

Após centrifugação, uma quantidade suficiente de partículas foi armazenada em

dessecador em temperatura ambiente, para posterior observação morfológica da superfície

das microesferas por microscopia eletrônica de varredura.


4.3.1. Análise Preliminar da Solubilidade do PLGA 50:50 em diferentes Solventes

O diclorometano apresenta uma boa solubilidade para uma série de polímeros

encapsulantes (Jain, 2000). A quantidade total do PLGA utilizado no teste de solubilidade

frente ao DCM foi 7 vezes superior à concentração de PLGA utilizada para preparar

micropartículas (45 mg PLGA/ 1 mL DCM). A partir da quinta parte do polímero

adicionada (225 mg), a solução tornou-se visualmente muito viscosa. Portanto, a

concentração para melhor utilizar o PLGA em DCM foi menor que 315 mg do polímero/

mL do solvente. O interesse neste solvente para a preparação de microesferas pelo método

de emulsão múltipla é devido à sua volatilidade, que facilita a remoção por evaporação,


49

minimizando assim, os problemas associados com o solvente residual (Singh and

O’Hagan, 1998).

Para o acetato de etila os parâmetros encontrados nas temperaturas de 25°C e 35°C

foram de 26,7 mg/mL e 30,6 mg/mL respectivamente.


4.3.2.1. Caracterização das Micropartículas de PLGA sem Ativo

Primeiramente, investigou-se o efeito de variáveis de processo como o efeito do

agente emulsificante, o tipo de solvente e a velocidade de agitação, com a finalidade de

escolha do melhor sistema para o estudo posterior de preparação de micropartículas com os

princípios ativos (BSA e IL2).

Agente emulsificante. A Tabela 1 mostra o diâmetro médio e a distribuição de tamanho

das micropartículas de PLGA, sem ativo, obtidas com diferentes concentrações de PVA,

utilizando o DCM como solvente orgânico. Nota-se uma redução no tamanho médio das

micropartículas, de 31 a 5 μm, em função do aumento da concentração de PVA na fase

contínua. O PVA na fase externa do sistema (A2) aumenta a estabilidade da emulsão

formada, estabelecendo um melhor controle do diâmetro médio da emulsão, e

conseqüentemente, do tamanho das micropartículas, corroborando com resultados

anteriores encontrados na literatura para sistemas similares (Blanco-Pietro et al., 1998;

Murakami et al., 1999; Yang et al., 2001; Siepmann et al., 2004).

Não se evidenciou a formação de micropartículas de PLGA utilizando Pluronic®

F68 como agente emulsificante, pois o PF68 não estabilizou a emulsão simples quando

diclorometano foi utilizado como solvente. Entretanto, com o solvente acetato de etila foi

observada a formação da emulsão simples na escala nanométrica, através da miscroscopia

óptica. Neste processo, a recuperação das partículas foi difícil, devido ao tamanho

nanométrico das mesmas, que ficaram dispersas na água de lavagem. Pluronic® F68 deixou

de ser utilizado neste estudo, pelo interesse em partículas de tamanho micrométrico para

uso intra-tumoral.

Velocidade de rotação do impelidor. Avaliou-se também o efeito da velocidade de rotação

do impelidor nas formulações obtidas no processo utilizando DCM como solvente

orgânico e PVA 0,5% (m/v) como emulsificante na fase externa. A Tabela 1 mostra uma


50

redução do tamanho médio das partículas de PLGA de 12,18 μm, 6,79 μm e 4,59 μm com

o aumento da velocidade de rotação do impelidor respectivamente para 7000 rpm, 11000

rpm e 15000 rpm. Contudo, como também mostra a Tabela 1 (span), a dispersão

granulométrica entre estas micropartículas também aumentou com o aumento da ordem de

grandeza desse parâmetro.

Tabela 1. Distribuição granulométrica das micropartículas de PLGA preparadas com

diclorometano.

Microesferas

PLGA

d(4,3)

(μm)

d(v, 0.1)

μm)

d(v, 0.5)

(μm)

d(v, 0.9)

(μm)

Span

(μm)

PVA 0,1% 31,05 13,05 37,66 76,67 1,69

PVA 0,3% 18,41 5,05 19,41 54,87 2,57

PVA 0,5%a 12,18 2,47 15,78 27,34 1,58

PVA 0,5%b 6,79 0,98 9,36 23,55 2,41

PVA 0,5%c 4,59 1,03 5,29 16,42 2,91

PVA 1% 7,06 1,16 10,34 18,71 1,70

PVA 3% 5,11 0,63 8,00 15,48 1,86 a Formulação obtida a 7000 rpm; b Formulação obtida a 11.001 rpm; c Formulação obtida a 15.330 rpm; d(4,3): Diâmetro médio em volume d(v, 0.1): Diâmetro da partícula correspondente a 10% da distribuição acumulada d(v, 0.5): Diâmetro da partícula correspondente a 50% da distribuição acumulada d(v, 0.9): Diâmetro da partícula correspondente a 90% da distribuição acumulada Span: Medida indireta da dispersão ou largura da distribuição granulométrica, igual a [d(v, 0.9) - d(v, 0.1)]/ d(v, 0.5)

Tipo de solvente. As micropartículas obtidas com ACT como solvente orgânico, PVA

0,5% (m/v) como emulsificante na fase externa e velocidade de rotação do impelidor de

7000 rpm apresentaram o diâmetro médio de 3 μm, ou seja, foi de aproximadamente 4

vezes menor que as micropartículas preparadas com DCM e PVA 0,5% na mesma

intensidade de agitação (12 μm). Isto se deve à diferença de solubilidade de DCM e ACT

em água (8,7% (v/v) para ACT contra 1,6% (v/v) para DCM), o que explica uma rápida

difusão do ACT na fase aquosa, reduzindo assim, o tamanho médio das micropartículas.


51

Análise morfológica. Como evidenciado por microscopia eletrônica de varredura, as

microfotografias das micropartículas de PLGA apresentam formato predominantemente

esférico e superfície lisa para as partículas produzidas por ambos os solventes, acetato de

etila e diclorometano (Figura 7).

(a)

(b)

Figura 7. Microfotografias de micropartículas de PLGA obtidas sob agitação de 7000 rpm,

a) PVA 3% e DCM; e d) PVA 0,5% e ACT (magnitude 1000×).

Determinação residual do Álcool Polivinílico (PVA). O resíduo do PVA é um importante

parâmetro na formulação podendo ser utilizado para alterar ou modificar as diferentes

propriedades das micropartículas. A Figura 8 mostra o teor residual de PVA associado às

micropartículas, quando este foi introduzido no processo nas concentrações de 0,5%, 1% e

3% (m/v). O mecanismo da ligação de PVA tem sido proposto pela interpenetração das

moléculas de PVA e PLGA durante a formulação das partículas (Figura 9). As cadeias

hidrofóbicas do PVA penetram dentro da fase orgânica e permanecem presas na matriz

polimérica das partículas de PLGA, quando o solvente é removido (Boury et al., 1995;

Murakami et al., 1999). Os resultados encontrados aqui corroboram com os de Sahoo et al.

(2002). Contudo, os teores residuais de PVA observado nas micropartículas produzidas no

presente trabalho foram da ordem 0,1% a 0,4% (m/m) (Figura 8) menores que os obtidos

por estes autores (Sahoo et al., 2002), 2% a 4,8% (m/m).


52

Figura 8. Efeito residual de diferentes concentrações do PVA associado à superfície das

micropartículas (média ± desvio padrão, n = 3).

Figura 9. Representação do mecanismo de ligação das moléculas de PVA e PLGA na

superfície das partículas (Murakami et al., 1999).

Potencial Zeta. As micropartículas obtidas foram caracterizadas quanto ao potencial zeta

em função do pH. Como mostra a Figura 10, o potencial zeta é negativo na faixa de pH 3 a

10, porém próximo do ponto isoelétrico em pH 3, com carga negativa que se acentua em

pH mais básico (-6 a -14 em pH 10), porém, sem tendência dependente da concentração de

PVA utilizada na fase externa (A2) no processo de produção das partículas. Fazendo apelo

à literatura, têm-se dados que reportam um potencial zeta das nanopartículas de PLGA,

sem nenhum resíduo de PVA em solução tampão neutro é aproximadamente –45 mV

(Stonilk et al., 1995; Sahoo et al., 2002). Esta alta carga negativa é atribuída à presença de

grupos carboxilícos de PLGA na superfície das partículas. No presente estudo, o potencial

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

PVA 0,5% PVA 1% PVA 3%

PVA (% m/v)

Teo

r re

sidu

al d

e PV

A

(% m

/m)


53

zeta na faixa 0 a –14 mV, bem menos negativo pode ser devido ao PVA associado à

superfície das microesferas de PLGA.

-16,0

-12,0

-8,0

-4,0

0,00 3 6 9 12

pH

Pote

ncia

l Zet

a (m

V)

PVA 0,1% PVA 0,5% PVA 1% PVA 3%

Figura 10. Potencial zeta das micropartículas de PLGA obtidas com diferentes

concentrações de PVA na fase externa da emulsão (média ± desvio padrão, n =7), em

função do pH.

4.3.2.2. Caracterização das Micropartículas de PLGA contendo Albumina de Soro

Bovino

Albumina de soro bovino foi aqui utilizada como proteína modelo, numa pré-

avaliação do comportamento da proteína de nosso interesse, IL-2, em razão de seu baixo

custo. Estudou-se então a formulação e a obtenção das micropartículas poliméricas Micro-

BSA, mantendo-se as seguintes condições de processo:

Sistema acetato de etila como solvente/ PVA 0,5% (m/v) como agente emulsificante

na fase externa da emulsão múltipla (denominado Sistema ACT);

Sistema diclorometano como solvente/ PVA 3% (m/v) como agente emulsificante na

fase externa da emulsão múltipla (denominado Sistema DCM).

Determinação do tamanho de partícula. A Tabela 2 apresenta o tamanho das

micropartículas Micro-BSA preparadas pelos sistemas ACT e DCM. Nota-se que essas

micropartículas são caracterizadas por um tamanho médio de cerca de 20 μm, não afetado

pelo tipo de sistema/solvente utilizado na preparação dessas micropartículas carregadas


54

com a albumina de soro bovina, BSA, correspondendo na verdade a uma variação da

distribuição granulométrica de um sistema para o outro (DCM com maior fração de

partículas maiores e com maior dispersão, span).

Tabela 2. Tamanho médio das micropartículas PLGA contendo BSA.

d(4,3): Diâmetro médio em volume d(v, 0.1): Diâmetro da partícula correspondente a 10% da distribuição acumulada d(v, 0.5): Diâmetro da partícula correspondente a 50% da distribuição acumulada d(v, 0.9): Diâmetro da partícula correspondente a 90% da distribuição acumulada Span: Medida indireta da dispersão ou largura da distribuição granulométrica, igual a [d(v, 0.9) - d(v, 0.1)]/ d(v, 0.5)

Eficiência de encapsulação. A dosagem do teor de BSA nas micropartículas foi

determinada por dois diferentes métodos analíticos, Lowry e Bradford (Tabela 3). As

partículas preparadas com o sistema DCM apresentaram elevada taxa de encapsulação (>

94%). Em contrapartida, a taxa de encapsulação da BSA do Sistema ACT apresentou uma

eficiência de encapsulação muito baixa (Tabela 3), como determinado pelo Método de

Bradford. Este resultado pode ser explicado pela rápida difusão do acetato de etila na fase

contínua, que, diferentemente do Sistema DCM, resultou na rápida extração do solvente

sem tempo suficiente para encapsulação de todo o ativo nas partículas em formação, que é

perdido na etapa final de separação das mesmas durante os processos de centrifugação e

lavagem. Devido à pouca sensibilidade do método de Lowry não foi possível quantificar a

BSA nas micropartículas de PLGA obtidas por esse Sistema ACT.

Tabela 3. Eficiência de encapsulação da BSA.

Microesferas

PLGA/BSA

d(4,3)

(μm)

d(v, 0.1)

(μm)

d(v, 0.5)

(μm)

d(v, 0.9)

(μm)

Span

(μm)

Sistema ACT 19,39 6,47 24,56 44,32 1,54

Sistema DCM 20,4 4,05 31,01 65,92 1,99

Microesferas PLGA/BSA Eficiência de Encapsulação (%)

Método de Lowry/ DCM 94,1

Método de Bradford/DCM 96,2

Método de Bradford/ACT 3,0


55

Cinética de liberação in vitro. O perfil cinético da liberação in vitro (Figura 11) das

micropartículas de PLGA contendo BSA apresentou um modelo bimodal (fase 1: liberação

acelerada e fase 2: liberação lenta) (Rafati et al., 1997). Na primeira hora de coleta, houve

o efeito “burst” (fase 1) de cerca de 30% de liberação do conteúdo da BSA das

micropartículas, que pode ser explicado, em parte, pela dessorção da proteína adsorvida na

superfície das micropartículas durante o processo de formação (Blanco and Alonso, 1998).

Em comparação com dados da literatura, o perfil cinético aqui obtido mostra uma fase 1

melhor controlada. Zheng et al. (2004) obtiveram micropartículas similares, através do

mesmo método de preparação, com eficiência de encapsulação de 65% e liberação de 48%

de BSA nessa primeira fase, maior do que a quantidade liberada pelas micropartículas aqui

desenvolvidas (30%).

A segunda fase correspondeu a uma liberação sustentada de 60% da proteína até o

décimo dia do ensaio de liberação in vitro. Nesta fase, a liberação da BSA depende de

fatores como a degradação do polímero, das propriedades da proteína e de sua interação

com os produtos de degradação ácida da matriz de PLGA (Blanco and Alonso, 1998;

Carrasquillo et al., 2001). A Figura 12 ilustra a degradação do polímero, e

conseqüentemente, liberação da proteína.

Figura 11. Perfil da cinética de liberação in vitro da BSA a partir das microesferas de

PLGA (média ± desvio padrão, n = 3).

0

10

20

30

40

50

60

70

0 50 100 150 200 250Tempo (h)

Libe

raçã

o A

cum

ulad

a (%

)


56

(a) (b)

Figura 12. Micrografias da microscopia eletrônica de varredura (2000 ×); (a) Micro-BSA

antes e (b) após cinética de liberação in vitro.

4.3.2.3. Caracterização das Micropartículas de PLGA contendo Recombinante

Humana de Interleucina-2

As Mrh-IL2, MPEG-IL2 e MBSA-IL2 foram obtidas pelo sistema diclorometano

como solvente/ PVA 3% (m/v) como agente emulsificante. Uma dessas formulações será

utilizada em estudos pré-clínicos, visando como continuidade desse projeto, o ensaio

clínico, com aplicação intra-tumoral das Mrh-IL2 no tratamento de pacientes com

carcinoma epidermóide avançado de cabeça e pescoço.

Determinação do tamanho de partícula. A Tabela 4 apresenta a granulometria das

formulações de microesferas de PLGA encapsulando a rhIL2 com e sem aditivos. As

microesferas com BSA apresentaram menor diâmetro médio (8,3 μm), seguida das

partículas feitas com PEG (9,4 μm), sendo as partículas de maior diâmetro as Mrh-IL2

(14,6 μm). As Mrh-IL2 e MPEG-IL2 apresentam span menor que 2, considerado dentro da

faixa de tamanho adequada para sistemas de liberação controlada de fármacos (Span < 2)

(Poletto, 2006). Apesar de apresentarem partículas de menor tamanho, as micropartículas

MBSA-IL2 apresentaram uma distribuição de tamanho de partículas mais heterogênea com

span de 3,8.


57

Tabela 4. Tamanho médio das microesferas PLGA contendo rhIL2.

Microesferas

PLGA/rh-IL2

d(4,3)

μm

d(v, 0.1)

μm

d(v, 0.5)

μm

d(v, 0.9)

μm

Span

μm

Mrh-IL2 14,6 4,2 18,6 36,6 1,7

MPEG-IL2 9,4 1,3 13,5 27,2 1,9

MBSA-IL2 8,3 1,4 5,3 21,5 3,8


Análise morfológica. A Figura 13 apresenta micrografias de microesferas Mrh-IL2,

MPEG-IL2 e MBSA-IL2 liofilizadas. Observa-se que as microesferas apresentaram forma

bem definida (esféricas) e de superfície lisa.

(a) (b) (c)

Figura 13. Microfotografias das microesferas de PLGA liofilizadas: a) Mrh-IL2; b)

MPEG-IL2 e c) MBSA-IL2 (magnitude 1500×).

Eficiência de encapsulação. O teor da interleucina-2 extraída das microesferas foi dosado

pelo método ELISA específico para IL2 como mostra a Tabela 5. O interesse em adicionar

em diferentes formulações, polietilenoglicol (PEG 4000) como agente aditivo e, albumina

de soro bovino (BSA) como agente co-encapsulante, foi de preservar a estabilidade da

molécula da interleucina-2 contra a desnaturação pelo contato com o solvente orgânico


58

durante o processo de microencapsulação, visando também aumentar a eficiência de

encapsulação. De fato, como pode-se comprovar através da Tabela 5, houve tendência ao

aumento na eficiência de encapsulação das formulações MPEG-IL2 e MBSA-IL2, em

comparação à formulação sem aditivo na fase aquosa interna (Mrh-IL2). Horas et al.

(1990) e Thomas et al. (2004) produziram partículas de PLGA (50:50) encapsulando a IL-

2, por processo similar de microencapsulação, com taxa de encapsulação variando de 15 a

60%. Em comparação ao estado da arte, os resultados aqui obtidos, indicam o sucesso na

otimização do processo, atingindo-se uma eficiência de encapsulação de IL-2 da ordem de

80%.

Tabela 5. Eficiência de encapsulação de IL-2.

Cinética de liberação in vitro. A Figura 14 apresenta o perfil de liberação in vitro da

interleucina-2 a partir das microesferas de PLGA. Para todas as formulações, a fase de

liberação acelerada (Fase 1 - efeito “burst”), ocorreu no intervalo de coleta de 4 horas,

liberando 28%, 30% e 41% do conteúdo de IL2 das microesferas de PLGA, Mrh-IL2,

MPEG-IL2 e MBSA-IL2, respectivamente.

As micropartículas Mrh-IL2 e MPEG-IL2 apresentaram perfis cinéticos de liberação

semelhantes, liberando respectivamente cerca de 35% e 32% da citocina no sétimo dia do

experimento (168 h), ou seja, no final da Fase 1. Já as micropartículas com BSA associada

à IL-2 (MBSA-IL2) liberaram cerca de 50% do teor de IL-2 encapsulada, neste mesmo

intervalo de coleta.

Quanto às formulações de PLGA encontradas na literatura:

1) Micropartículas contendo a forma modificada PEG IL-2, quando associada à BSA,

apresentaram uma liberação de 10% na Fase 1 e, posteriormente, uma Fase 2 caracterizada

por uma liberação de 2 a 3% ao dia por um período de 30 dias (Horas et al., 1990);

2) Micropartículas de PLGA contendo IL-2 liberaram de 15 e 30% da IL2 em 40 dias

(Thomas et al., 2004).

Microesferas PLGA Eficiência de Encapsulação (%) ± DP

Mrh-IL2 72,6 ± 1,8

MPEG-IL2 80,4 ± 7,4

MBSA-IL2 83,4 ± 7,6


59

Em comparação a estes dados, as micropartículas produzidas neste trabalho

apresentaram um melhor controle da liberação de IL-2 pelas micropartículas Mrh-IL2 e

MPEG-IL2 e uma liberação mais acentuada da IL-2, quando esta foi co-encapsulada com

BSA (micropartículas MBSA-IL2).

0

10

20

30

40

50

60

0 50 100 150 200 250 300 350 400

Tempo (h)

Lib

eraç

ão a

cum

ulad

a (%

)

MBSA-IL2MrhIL-2MPEG-IL2

Figura 14. Perfil da cinética de liberação in vitro da IL-2 a partir das micropartículas de

PLGA (média ± desvio padrão, n = 3).

Degradação in vitro das micropartículas Mrh-IL2 e MPEG-IL2. Na tentativa de

interpretar o efeito da degradação das micropartículas de PLGA na cinética de liberação da

interleucina-2, avaliou-se a cinética de degradação in vitro das micropartículas Mrh-IL2 e

MPEG-IL2, através da observação de possíveis alterações morfológicas destas partículas

após incubação em solução tampão PBS pH 7,4. Micrografias de partículas Mrh-IL2 e

MPEG-IL2 incubadas após 7, 35 e 42 dias (Figura 15) exibem alterações morfológicas

semelhantes em função do tempo de incubação, para ambas as formulações, com e sem

PEG como aditivo. De fato, os perfis cinéticos de liberação da IL-2 destas diferentes

formulações também são semelhantes. Apesar da cinética de liberação in vitro ter sido

acompanhada por um período de 15 dias, o ensaio de degradação sugere que a liberação de

IL-2 prossegue, favorecida pelo aumento da porosidade das partículas decorrente da

degradação gradativa destas partículas no meio de liberação (ação da hidrólise no polímero

PLGA).


60

Figura 15. Micrografias das partículas Mrh-IL2 e MPEG-IL2, decorridos 7, 35 e 42 dias do ensaio de degradação em tampão PBS pH 7,4 (1500×).

Mrh-IL2 (7° dia de degradação) Mrh-IL2 (35° dia de degradação) Mrh-IL2 (42°dia de degradação)

MPEG-IL2 (7° dia de degradação) MPEG-IL2 (35° dia de degradação) MPEG-IL2 (42° dia de degradação)


61

4.4. CONCLUSÕES

O estudo de pré-formulação, produção e caracterização, das microesferas de PLGA

sem ativo e com a proteína modelo, BSA, foi importante, para determinar as condições de

preparação de uma formulação de microesferas de PLGA para encapsulação da proteína de

nosso interesse, recombinante humana de interleucina-2, a ser utilizada em estudos pré-

clínicos, visando posterior ensaio clínico.

Pode-se constatar o efeito de condições de processo e de formulação como tipo de

solvente orgânico, tipo e concentração de agente emulsificante nas características das

micropartículas de PLGA obtidas, como tamanho médio e distribuição granulométrica,

carga superficial (potencial zeta) e teor de PVA residual na superfície das partículas.

O ativo de nosso interesse, recombinante humana de interleucina-2 foi encapsulado

em micropartículas de PLGA, em formulações sem e com aditivos como polietilenoglicol

(PEG) e albumina de soro bovina (BSA), com a finalidade de garantir melhor manutenção

da atividade biológica e estabilidade da IL-2.

As micropartículas Mrh-IL2 e MPEG-IL2 apresentaram perfis cinéticos da liberação

de IL-2 semelhantes, bem como sofreram alterações físicas similares na degradação do

polímero devido á ação do meio fisiológico simulado. Por outro lado, as micropartículas

contendo IL-2 co-encapsulada com BSA proporcionaram uma liberação mais acentuada da

IL-2.

Comparando-se as micropartículas geradas neste trabalho com resultados similares

apresentados na literatura, comprova-se um aumento da eficiência de encapsulação e o

controle cinético da liberação da IL-2, como pretendido.


62

CAPÍTULO III

TESTE DE CONCEITO


63

5. TESTE DE CONCEITO

Microsferas de PLGA contendo IL-2 sem aditivos, desenvolvidas no escopo do

trabalho, foram introduzidas em testes de conceitos, utilizando-se diferentes modelos

tumorais e protocolos terapêuticos. Os resultados serão apresentados neste capítulo.

5.1. MODELO TUMORAL MELANOMA B16F10

Microesferas de PLGA contendo rhIL-2, assim como, o Proleukin®, rhIL-2 em sua

forma livre, foram administradas, através de um protocolo terapêutico desenvolvido e

proposto especificamente para este trabalho, em camundongos C57Bl/6 portadores de

melanoma B16F10.

5.1.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Linfoproliferação rhIL-2 pura e encapsulada;

Verificar o índice de endotoxinas nas formulações do estudo pré-clínico;

Realizar o ensaio pré-clínico para avaliar a atividade anti-tumoral destas microesferas

de PLGA sem ativo e das microesferas de PLGA contendo IL-2, na terapia de

camundongos (C57Bl/6) portadores de melanoma (B16F10), bem como avaliação da

toxicidade deste tratamento em animais não-portadores de tumor.

Avaliar a resposta imune através da citotoxicidade específica de células de baço e das

células imunes infiltrantes no tumor.



Camundongos fêmeas C57Bl/6, entre 5 a 8 semanas, foram sacrificados para

remoção estéril do baço. Os baços foram colocados em meio RPMI (mistura de sais

minerais enriquecidos com aminoácidos, vitaminas e outros componentes essenciais para

crescimento celular) incompleto e em seguida divulssionados. As suspensões celulares

foram lavadas e o sedimento celular coletado por meio de centrifugação a 1500 rpm

durante 10 min. O número de células nas suspensões dos baços foi ajustado para 5 x 106

células/ mL em meio RPMI completo contendo os antibióticos penicilina (100.000 UI/

mL) e gentamicina (100.000 μg/ mL) e 10% de soro bovino fetal. As células foram

distribuídas (100 μL/ poço), em triplicata, em placas de 96 poços, fundo chato (Corning).

Posteriormente, a rhIL-2 pura foi adicionada em diferentes concentrações e Concanavalina


64

A como controle positivo. Traço de timidina triciada (3H-timidina, 0,25 μCi) foi colocada

em cada poço após 54 horas de cultura à 37oC, em presença de CO2. As células

permaneceram em cultura por mais 18 horas e foram posteriormente coletadas em coletor

de células (Cell Harvester). A leitura foi realizada no contador de cintilação β.

Nos experimentos em que a rhIL-2 encapsulada foi utilizada como estímulo,

concentrações crescentes de rhIL-2 em microesferas foram colocadas em meio completo e

deixadas em estufa de CO2 a 37 oC por 120 h para permitir a liberação da rhIL-2. Após esse

período, as suspensões celulares de baço foram adicionadas em triplicata e o mesmo

protocolo (acima descrito) foi realizado.

5.1.2.2. Avaliação do Nível de Endotoxinas presentes nas Mrh-IL2

As Mrh-IL2 utilizadas para o ensaio de sobrevida foram preparadas de forma

asséptica, em sala limpa classificação Padrão Internacional designação ISO (International

Standards Organization) 7, manipuladas na Cabina de Segurança Biológica – BioSAFE

Plus Classe II tipo B2, assim como, todo material utilizado foi esterilizado e considerado

livre de endotoxinas.

Esta condição de trabalho foi especialmente montada para a realização deste estudo

(Figura 16).

(a) Ante-sala (b) Sala com Cabina de Segurança Biológica

Figura 16. Sala limpa de classificação ISO 7 montada no IPT (Instituto de Pesquisas

Tecnológicas do Estado de São Paulo) para desenvolvimento das micropartículas de PLGA

contendo IL-2.

Micropartículas de PLGA com IL-2


65

O nível de endotoxinas presente nas formulações foi determinado através de ensaio

realizado com o Kit Limulus Amebocyte Lysate QCL-1000® (Cambrex BioScience

Warkersville, United States). Em uma placa de 96 poços, curva padrão e amostras foram

incubadas com o Reagente LAL por 10 minutos e por 6 minutos com o substrato

cromogênico a 37o C. A reação foi interrompida com ácido acético 25% (v/v) e a leitura foi

realizada em espectrofotômetro µQuant (Biotek Instruments, United States) a 405 nm.

5.1.2.3. Tratamento

Camundongos fêmeas C57Bl/6, entre 5 a 8 semanas, provenientes do Biotério de

Animais Isogênicos da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - Universidade de São

Paulo (USP), onde foram realizados os experimentos.

A linhagem murina do melanoma B16F10 foi gentilmente cedida pelo Dr. Marcello

Barcinski do Instituto Nacional do Câncer (INCA) - Rio de Janeiro e a cultura de células

foi realizada em meio RPMI-1640 (Gibco) suplementado com 10% de soro bovino fetal, 2

mM de L-glutamina (Sigma), 1 mM piruvato de sódio (Sigma) e 20 mg/mL de

gentamicina. As suspensões celulares foram descoladas das garrafas de cultura com

tripsina e após a inativação da tripsina com soro bovino fetal, em seguida, as células foram

padronizadas em solução salina para posterior aplicação nos animais.

Trinta camundongos C57Bl/6 foram aleatoriamente distribuídos em 3 grupos os quais

foram inoculados por via subcutânea (s.c.) no flanco, com 5 x 104 células de melanoma

B16F10. Dez dias após a implantação do tumor os animais receberam injeções

intratumorais de 100 μL das diferentes formulações vacinais (Tabela 6). Ao final de,

respectivamente 19 dias do início do experimento 5 animais de cada grupo foram

sacrificados por deslocamento da cervical para obtenção de células do lavado peritoneal,

remoção do baço e do tumor. As células do lavado peritoneal e o baço foram removidos de

forma estéril para realização de co-cultura e posterior teste de citotoxicidade. O tumor foi

removido, pesado e, quando possível, dividido em 2 fragmentos para análise histológica e

avaliação das células imunes infiltrantes por citometria de fluxo. Separadamente, 5 animais

de cada grupo foram acompanhados até sua morte* para avaliação da taxa de sobrevida.


66

Tabela 6. Grupos de tratamento de ensaio de sobrevida e de atividade biológica.

* por questões éticas, os animais que se apresentavam debilitados ou sem locomoção foram

sacrificados por deslocamento da cervical.

5.1.2.4. Teste de Citotoxicidade

Após a morte dos animais, foram coletadas células do lavado peritoneal e baço. Os

macrófagos do lavado peritoneal, coletados em salina, foram contados, centrifugados e

ressuspendidos em meio RPMI completo. Os mesmos foram plaqueados em placa de

cultura de 24 poços (Corning NY, USA) na concentração de 2 x 105 células por poço e

deixados aderir por 1h. Paralelamente, os baços removidos foram macerados,

ressuspendidos em tampão de lise e centrifugados a 1500 rpm por 10 min. As células

foram ressuspendidas em meio RPMI completo, a concentração celular foi acertada e as

mesmas foram colocadas na concentração de 5 x 106 células/ poço em co-cultura com os

macrófagos previamente plaqueados. Em seguida, a co-cultura foi pulsada com 30 µg de

lisado total de células B16F10 e deixada em estufa a 37 °C com 5% CO2 por 4 dias.

Após esse período, o meio juntamente com as células foi removido com auxílio de

pipeta e os poços foram lavados com 4 mL de PBS estéril livre de endotoxinas. A partir

dessa suspensão, as células T CD8 (células efetoras) foram obtidas por separação com

esferas magnéticas.

Em seguida, foi avaliada a citotoxicidade específica mediada pelas células T CD8

contra as células tumorais B16F10 (células alvo).

A suspensão de células T CD8 (células efetoras) foi centrifugada por 10 min a 1500

rpm, ressuspendida em meio RPMI 1640 livre de Vermelho Fenol (Gibco-Invitrogen) com

1% de soro bovino fetal e sua concentração foi avaliada em câmara de Neubauer em 0,2%

de Trypan. Após a contagem, células T CD8 foram colocadas em placas de 96 poços de

fundo em “U” (Corning NY, USA). Paralelamente, as células B16F10 (células alvo)

mantidas em cultura foram removidas da garrafa, contadas em câmara de Neubauer com

Grupos Tratamento/dose N Experimento

5 Sobrevida 1 Microesferas sem ativo (Micro PLGA)

5 Atividade Biológica

5 Sobrevida 2 Proleukin® ( IL-2 livre)/4,5x104 UI


5 Sobrevida 3 Microesferas de IL2 (Mrh-IL2)/4,5x104 UI



67

0,2% de Trypan e ressuspendidas no mesmo meio das células T CD8. As células B16F10

foram colocadas em co-cultura com os T CD8 previamente pipetados. O estudo foi

realizado em triplicata e a razão 20:1 entre células efetoras e alvo foi utilizada.

A co-cultura foi mantida em estufa a 37°C com densidade de 5% de CO2 por 18h.

Após esse período, as placas foram centrifugadas a 1500 rpm por 10 min e os

sobrenadantes foram transferidos para uma placa de fundo chato. Os sobrenadantes foram

avaliados quanto à liberação de lactato desidrogenase (LDH) utilizando Cytotoxicity

Detection Kit (Roche Applied Science). Aos sobrenadantes foi adicionada uma mistura de

reação contendo diaforase (catalisador) e solução de revelação (sal tetrazolium). A seguir,

a placa foi incubada a temperatura ambiente sob proteção da luz e a leitura foi realizada

em leitor de ELISA a 490 nm após 10, 20 e 30 min para determinação do melhor tempo de

incubação.

O princípio do teste consiste na avaliação indireta da quantidade de LDH liberada

pela lise da célula-alvo. Primeiramente, a LDH liberada reduz NAD+ em NADH+ H+ pela

oxidação do lactato em piruvato. Na segunda reação enzimática, 2H são transferidos de

NADH+ H+ ao sal tetrazolium pelo catalisador dando origem ao sal formazan, o qual é

vermelho e solúvel. A intensidade da coloração vermelha é proporcional à quantidade de

LDH liberada pela lise celular.

A porcentagem de lise específica foi calculada segundo a fórmula:

Lise específica (%) = [(E – Le efet)– Le alvo)]/(L max – Le alvo) x 100

Na qual:

E - liberação experimental de LDH na co-cultura de células alvo e efetoras;

Le efet - liberação espontânea de LDH pelas células efetoras em meio de cultura;

Le alvo - liberação espontânea de LDH pelas células alvo em meio de cultura;

L max - liberação máxima de LDH pelas células alvo (células alvo incubadas na

presença de 1% de Triton X 100 em meio de cultura).

Além disso, foi feito um controle branco, também em triplicata, obtendo-se a

quantidade de LDH presente no meio de cultura. O valor de absorbância obtido desse

controle é subtraído de todos os demais valores.


68

5.1.2.5. Dissociação da Massa Tumoral para Análise por Citometria de Fluxo (FACS)

Os fragmentos de tumor foram cortados em fragmentos ainda menores e transferidos

para tubos de 50 mL contendo 15 mL de meio Hanks livre de Ca++ e Mg++ (Invitrogen) e

Liberase (6 µg/µL) para cada amostra e, em seguida, incubados a 37°C, sob agitação

constante, durante 30 min.

Após o período de incubação, as células foram dispersas com o auxílio de uma

seringa de 10 mL. A suspensão contendo as células e os fragmentos de tumor foram

centrifugados a 1500 rpm, durante 5 minutos, e o precipitado ressuspendido em 10 mL de

meio RPMI com 10% de soro bovino fetal para bloquear a ação da Liberase. Em seguida,

as células e o restante dos fragmentos teciduais foram ressuspendidos em tampão de lise e

centrifugados a 1500 rpm para a coleta do precipitado. Este foi ressuspendido em 5 mL de

meio RPMI completo e transferido para uma peneira de aço inoxidável (malha no 100,

SIGMA) para a obtenção das células isentas dos fragmentos teciduais. Na seqüência, as

células foram coletadas por centrifugação a 1500 rpm, ressuspendidas em meio de cultura,

coradas com azul de trypan 0,2% e contadas em Câmara de Neubauer.

5.1.2.6. Avaliação da Expressão de Marcadores de Superfície por Citometria de Fluxo

(FACS)

As populações de células do tumor obtidas por meio do procedimento descrito acima

foram caracterizadas pela expressão de marcadores de superfície utilizando anticorpos

conjugados a isotiocianato de fluoresceína. O número de células nas suspensões foi

acertado para 1x106 células/ mL em PBS. A seguir, 100 µL de cada suspensão celular

foram distribuídos em tubos FACS. As células foram, então, incubadas com anticorpo anti-

CD16/CD32 (Fc BlockTM - PharMingen) na concentração de 0,5 µg/ 106 células durante

45 minutos a 4oC para evitar a ocorrência de ligações inespecíficas. Posteriormente, as

células foram incubadas com os respectivos anticorpos monoclonais de interesse (0,5 -

0,75 µg / 106 células) durante 30 minutos, a 4oC, no escuro. Após o tempo de incubação, as

células foram lavadas com PBS contendo 2% de soro bovino fetal por tubo, sendo o

precipitado celular coletado através de centrifugação a 1500 rpm durante 5 minutos. O

sobrenadante foi retirado e o sedimento celular ressuspendido em 500 µL de PBS contendo

1% de formaldeído, para a fixação das células. As preparações celulares foram adquiridas

no FACSort (Becton & Dickinson) e coletados 50.000 eventos das amostras.


69

5.1.2.7. Anticorpos Monoclonais

A caracterização das populações de linfócitos T do infiltrado tumoral foi realizada

com anticorpos: anti-CD4, anti-CD8, e anti-CD44. Para caracterização das células

dendríticas no tumor, as células foram marcadas com anticorpos anti-CD11c e analisadas

quanto à expressão de CD86.

Foram utilizados anticorpos conjugados com FITC e isotipos controle em todos os

experimentos para o ajuste da fluorescências (FITC). A avaliação da expressão de

marcadores de superfície foi realizada por citometria de fluxo, como já descrito.



A linfoproliferação induzida pela citocina recombinante humana IL-2 nas suas

formas livre e encapsulada em microesferas de PLGA (Mrh-IL2), foi avaliada in vitro para

verificação da capacidade de estímulo de resposta proliferativa de linfócitos de

camundongos C57Bl/6. A recombinante humana IL-2 na sua forma livre estimulou a

proliferação dos linfócitos de camundongos C57Bl/6 (dado não mostrado). No

experimento com as Mrh-IL2, observou-se que a IL-2 (Figura 17) foi capaz de induzir a

proliferação dos linfócitos quando comparado aos controles (negativo e positivo). Além

disso, a partir da dose de 1000 UI de IL-2, não ocorreu aumento de proliferação com

aumento da dose da citocina. Estes resultados sugeriram que poderíamos prosseguir nos

ensaios pré-clínicos.

0,0E+00

1,0E+04

2,0E+04

3,0E+04

4,0E+04

5,0E+04

meio Con A 10 25 50 250 1000 2500 5000 10000

Concentração

cpm

Figura 17. Linfoproliferação da forma encapsulada da interleucina 2, Mrh-IL2.


70

5.1.3.2. Avaliação do Nível de Endotoxinas presentes nas Formulações

As microesferas de PLGA sem ativo e as Mrh-IL2 utilizadas para a realização dos

ensaios pré-clínicos, foram avaliadas quanto à presença de endotoxinas pelo teste de LAL.

Na Tabela 7, pode-se constatar que as mesmas puderam ser consideradas isentas de

endotoxinas, uma vez que as amostras são consideradas livres de endotoxina, para

injetáveis, quando apresentam valores menores que 0,1 UE/μg (Unidades de Endotoxina

por μg de amostra).

Tabela 7. Níveis de endotoxinas presentes nas microesferas de PLGA.

5.1.3.3. Estudo de Sobrevida

O estudo de sobrevida demonstrou que não houve diferença estatística significativa

na taxa de sobrevivência dos animais independentemente do tratamento realizado (Figura

18).

0 5 10 15 20 25 30 350

25

50

75

100Micro PLGAIL-2 livreMrh-IL2

dias

% s

obre

vivê

ncia

Figura 18. Porcentagem de sobrevivência de animais tratados com apenas 1 inoculação

intra-tumoral. Camundongos C57Bl/6 foram inoculados s.c. com 5x104 células B16F10.

Dez dias após a implantação do tumor os animais receberam 1 injeção intra-tumoral de 100

μL de acordo com o tratamento de cada grupo: Grupo 1 – microesferas sem ativo; Grupo 2

- Proleukin®/4,5x104 UI; Grupo 3 - microesferas de IL2/4,5x104 UI. Todos os animais

foram acompanhados até sua morte para avaliação da taxa de sobrevida.

Microesferas PLGA Endotoxinas (UE/μg)

Micro PLGA 0,00001

Mrh-IL2 0,00006


71

5.1.3.4. Estudo da Atividade Biológica da rhIL-2

A avaliação da massa tumoral (Figura 19) demonstrou que apesar de haver uma

tendência à redução da massa de tumor nos animais tratados com Mrh-IL2, a mesma não é

estatisticamente significativa.

0,0

0,4

0,8

1,2

1,6

2,0

Micro PLGA IL-2 livre Mrh-IL2

Grupos

Mas

sa tu

mor

al (g

)

Figura 19. Peso do tumor (g) após tratamento de acordo com os grupos: Grupo 1 –

microesferas sem ativo; Grupo 2 - Proleukin®/4,5x104 UI; Grupo 3 - microesferas de

IL2/4,5x104 UI.

5.1.3.5. Citotoxicidade

O teste de citotoxicidade foi realizado para avaliar a capacidade dos tratamentos com

Micro PLGA, Mrh-IL2, assim como IL-2 livre em induzir uma resposta citotóxica

específica mediada por células T CD8 contra as células tumorais. Na Figura 20, pode-se

observar que não houve diferença entre grupos independentemente do tratamento

empregado. Isto pode ser explicado pelas células desse tipo de melanoma B16F10 são de

natureza bastante agressiva in vivo, apresentando baixa imunogenicidade, que são, na

verdade, características compartilhadas pela maioria dos melanomas humanos os quais, na

maioria das vezes, dificilmente são capazes de eliminar as células tumorais através da

resposta imune.


72

0

4

8

12

16

20

Micro PLGA IL-2 livre Mrh-IL2

Grupos

Lise

esp

ecífi

ca (%

)

Figura 20. Citotoxicidade mediada por linfócitos TCD8, conforme cada grupo de

tratamento: Grupo 1 – microesferas sem ativo; Grupo 2 - Proleukin®/4,5x104 UI; Grupo 3 -

microesferas de IL2/4,5x104 UI.

5.1.3.6. Avaliação da Expressão de Marcadores de Superfície

Nos ensaios referentes a marcadores de superfície de expressão foram analisadas as

expressões das células CD4, CD8, CD11c (células dendríticas) e CD11b (macrófagos) dos

animais de todos os grupos que fizeram parte do ensaio in vivo, porém, os resultados

obtidos não apresentaram diferença estatística entre os grupos experimentais (dado não

mostrado).

5.1.4. CONCLUSÕES

Após a incorporação em microesferas de PLGA, a IL-2 manteve sua propriedade de

estimulação de proliferação de linfócitos in vitro e as formulações mostraram-se isentas de

endotoxinas para realização de ensaios in vivo.

Os resultados obtidos não colocaram em evidência nenhum aumento significativo de

sobrevida ou da resposta citotóxica dos grupos de animais submetidos ao tratamento

proposto. Nota-se, no entanto, que o modelo experimental de tumor para estudos de fase

pré-clínica depende muito da adequação do tempo necessário para se desenvolver uma

resposta terapêutica e a evolução do tumor, função de suas características específicas.

Os resultados aqui obtidos mostram, em um primeiro momento, que a resposta imune

que se pretende desenvolver com a administração da IL-2, feita de forma controlada pelo


73

perfil cinético de liberação programado pelas características das microesferas de PLGA

desenvolvidas neste trabalho, pode não estar adequado ao estágio de desenvolvimento do

modelo tumoral Melanoma B16F10, impossibilitando sua regressão através do protocolo

de tratamento empregado. Acredita-se assim, que a otimização do modelo experimental é

fundamental para conclusões mais definitivas.

5.2. MODELO TUMORAL CARCINOMA DE ERLICH

5.2.1. OBJETIVO

Microesferas biodegradáveis de PLGA contendo rhIL-2 foram administradas

seguindo um protocolo de tratamento imunoterápico desenvolvido neste trabalho, aplicado

em camundongos C57Bl/6 portadores de carcinoma de Ehrlich.


5.2.2.1. Tratamento

Os animais, camundongos da linhagem C57BL/6, inoculados com o carcinoma de

Ehrlich, foram gentilmente cedidos pelo Prof. Dr. Luiz Carlos de Sá Rocha, do

Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USP

(FMVZ), onde foi realizado todo o ensaio in vivo conforme as normas e procedimentos

relativos ao uso de animais do biotério dessa instituição. Os animais utilizados foram

camundongos fêmeas, entre 5 a 6 semanas.

O carcinoma de Ehrlich é mantido pelo Laboratório de Neuroimunologia da FMVZ

em camundongos C57BL/6, podendo ser transplantado entre animais da mesma espécie e

linhagem. As suspensões celulares foram padronizadas em solução salina de acordo com o

número de células a serem inoculadas nos animais.

O total de 24 animais foi distribuído de forma aleatória em 4 diferentes grupos

constituídos de 6 animais, conforme mostra a Tabela 8. A suspensão de células do

carcinoma de Ehrlich na concentração 1x106 células foi inoculada (volume total de 100

µL), por via subcutânea, na parte interior do membro traseiro esquerdo dos camundongos.

Após 3 dias da implantação do tumor, os animais receberam o tratamento (200 μL de

acordo com o tipo de tratamentos indicado na Tabela 8), aplicado no mesmo local da

inoculação da suspensão celular. As formulações liofilizadas (grupos 2 e 3) foram re-

suspensas em 200 μL de solução salina estéril. Tanto a IL-2 livre (grupo 4) quanto a IL-2

microencapsulada (grupo 3) foram injetadas com a dose de 4,5 x 104 UI/ camundongo. Os


74

animais de cada grupo foram pesados diariamente a partir do sétimo dia de aplicação do

tratamento para avaliação de peso corpóreo. No 15° dia do experimento, os animais,

devidamente anestesiados, foram sacrificados por deslocamento da cervical e o tumor foi

retirado, pesado e fixado em meio apropriado para a realização dos estudos histológicos.

Tabela 8. Identificação do tipo de tratamento por grupo.


O material coletado, depois de fixado em formol 10%, foi enviado para o

Laboratório de Histopatologia onde se procedeu a realização de lâminas que foram coradas

pela técnica de coloração hematoxilina e eosina (H&E).

O objetivo da técnica H&E é visualizar o núcleo e o citoplasma das células através

dos corantes Hematoxilina, que é um corante básico de coloração roxa que cora os

componentes de estruturas ácidas, como o núcleo. A Eosina, por sua vez, é um corante

ácido de cor vermelha que cora as estruturas básicas, como o citoplasma. O procedimento

para realização dessa técnica foi o seguinte: inicialmente, as lâminas foram colocadas

numa cuba contendo álcool a 95% durante 20 minutos, e em seguida, foram lavadas em

água corrente e coradas na solução de hematoxilina, sendo lavadas mais uma vez em água

corrente, e então, coradas na solução de eosina. Em seguida, as lâminas foram lavadas pela

terceira vez em água e lavadas em diferentes soluções alcoólicas, inclusive xilol, para

retirada do excesso dos corantes.


5.2.3.1. Avaliação Tumoral

O peso dos animais foi acompanhado uma semana depois do tratamento até o dia

em que eles foram sacrificados. Observou-se que os animais dos 4 grupos ganharam peso

Grupos Tratamento/dose N (no de animais)

1 Controle solução salina 6

2 Microesferas sem ativo 6

3 Microesferas de IL2/4,5x104 UI 6

4 IL-2 pura (Proleukin®)/4,5x104 UI 6


75

de forma progressiva (3,7g ± 0,4) ao longo de todo experimento, não apresentando

diferença significativa entre eles. A Figura 21 apresenta a diferença de pesos dos animais

por grupo, peso no último dia do tratamento (dia que os animais foram sacrificados) pelo

peso corpóreo do animal inicial.

0

1

2

3

4

5

6

salina micro-branca micro rhIL-2 IL-2 livre

Grupos

Var

iaçã

o do

pes

o co

rpór

eo d

os a

nim

ais (

g)

Figura 21. Variação do peso corpóreo dos animais (peso final - peso inicial): Grupo 1 –

controle – solução salina; Grupo 2 - microesferas sem ativo Grupo 3 - microesferas de

IL2/4,5x104 UI; e Grupo 4 - Proleukin®/4,5x104 UI.

Após 15 dias de ensaio, os animais foram sacrificados e os tumores foram

dissecados e pesados (peso úmido). Os outros órgãos como baço, pulmão e fígado foram

investigados durante a necropsia, porém, estes não apresentaram metástases visíveis. O

crescimento do tumor foi evidenciado em todos os grupos e, aparentemente, não houve

alteração no comportamento dos animais. Na análise estatística realizada com intervalo de

confiança de 95%, não foi identificada diferença significativa na análise entre cada grupo e

o controle, assim como, na análise de todos os grupos em conjunto (p > 0,05) (Figura 22).


76

±Std. Dev.±Std. Err.Mean

Box & Whisker Plot: PESO_G_

GRUPOS

PE

SO

_G_

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4

Figura 22. Peso tumor (g) após terapia em camundongos C57Bl/6 inoculados por via s.c.

com 1x106 células de carcinoma de Ehrlich e com injeção intra-tumoral de acordo com o

tratamento de cada grupo: Grupo 1 – solução salina (controle); Grupo 2 - microesferas sem

ativo; Grupo 3 - microesferas de IL2/4,5x104 UI; Grupo 4 - Proleukin®/4,5x104 UI. Os

dados representam a media ± desvio padrão plotados pelo programa Basic Statistics p >

0,05 (ANOVA, seguida pelo teste de múltipla comparação Tukey).

Porém, a partir da Figura 22, as seguintes considerações podem ser enunciadas:

1. O Grupo 3 contendo a IL-2 microencapsulada (MrhIL-2) apresentou uma tendência de

redução de tamanho do tumor em comparação ao grupo controle (Grupo 1). Isto pode ser

explicado pelo princípio de ação de um sistema de liberação controlada, pela qual a forma

encapsulada de uma substância ativa controla a liberação do ativo para o meio de forma

lenta e sustentada. Aplicando este princípio no ensaio realizado, entende-se que,

provavelmente, tenha ocorrido a liberação da interleucina-2 proveniente das

micropartículas de MrhIL-2 de forma controlada no ambiente tumoral, durante um período

de 12 dias (tempo de duração do ensaio, após o terceiro dia de inoculação das células

tumorais, totalizando os 15 dias de ensaio). Além disso, algo também interessante que foi

encontrado neste grupo da IL-2 encapsulada foi a presença de uma secreção de coloração

esbranquiçada na região do tumor, quando não dentro do próprio tumor, o que levou a

pensar na possibilidade de um exsudado inflamatório como resposta da ativação do sistema

imune do hospedeiro, causado pela liberação da IL-2 no local. Pela complexidade entre o


77

sistema imune e as células tumorais (Fridman and Tartour, 1997) não tem sido fácil

identificar com precisão os mecanismos envolvidos na resposta imunológica contra os

tumores (Sakai, 2004). Sendo assim, tem-se dado muita ênfase às células inflamatórias e

reguladoras, aos fatores solúveis que são associados com suas atividades e aos mediadores

inflamatórios. De acordo com a literatura, no estágio de inflamação avançada

primeiramente surgem os neutrófilos, em seguida, surgem vários tipos de leucócitos, o que

é seguido pela ativação de outras células inflamatórias ao local inflamado, através da

sinalização de um grande número de fatores de crescimento, citocinas e quimiocinas. É

justamente nesse momento do processo de inflamação, que o fator de necrose tumoral

apresenta um papel importante na destruição do tecido tumoral, revertendo os danos

causados no local (Hagemann et al., 2007; Salazar-Onfray et al., 2007).

2. O grupo do Proleukin (Grupo 4) mostrou um acentuado crescimento do tumor em

relação ao grupo controle (Figura 22). Apesar da dose (4,5 x 104 UI/ camundongo) da IL-2

livre ter sido a mesma que a da forma encapsulada, dose essa fixada com base nos ensaios

in vivo com IL-2 encontrados na literatura, acredita-se na possibilidade que esta dose tenha

sido demasiadamente elevada em relação ao peso corpóreo do animal portador (16,0 ± 1,0

g, no momento da aplicação). De fato, a literatura sugere que doses elevadas da IL-2 não

são apenas inconvenientes pelos efeitos colaterais e tóxicos, mas também podem induzir a

atividade bloqueadora da citocina, o que acontece quando ocorre um elevado nível de

expressão da IL2, reduzindo completamente o estímulo do sistema imune por causa da

formação danificada de linfócitos T citotóxicos específicos para tumor, que pode levar a

efeitos adversos, tanto inibindo, como promovendo o crescimento do tumor (Wolf and

Schmid-Wolf Ingo, 1995; Antonia et al., 2004; Salazar-Onfray et al., 2007).


Os estudos histopatológicos preliminares não evidenciaram diferenças significativas

entre os diferentes grupos (Figura 23). De fato, em todos os grupos estudados, verificou-se

uma intensa proliferação tumoral com a presença de células tumorais características do

carcinoma de Erlich (células grandes, com figuras de mitose e elevado pleomorfismo),

além de áreas de intensa atividade necrótica em especial no interior da massa tumoral. Este

fato deve-se, em grande parte, à incapacidade de suprimento sangüíneo adequado para o

rápido desenvolvimento do tumor. Estudos adicionais, possivelmente com o uso de

marcadores específicos deverão ser realizados visando uma melhor caracterização da


78

evolução do tumor na busca de diferenças entre os diferentes grupos experimentais. Uma

destas marcações poderia investigar a presença, maior ou menor, de células NK na região

tumoral, pois sabe-se que a IL-2 tem a capacidade de recrutar e ativar estas células

importantes para o combate ao tumor.

Figura 23. Lesão tumoral com a presença de extensa área de necrose (n) de acordo com os

grupos: a) Grupo 1 – solução salina (controle); b) Grupo 2 - microesferas sem ativo; c)

Grupo 3 - microesferas de IL2/4,5x104 UI; e d) Grupo 4 - Proleukin®/4,5x104 UI.

(a) (b)

(c) (d)

n

n

n

n


79

5.2.4. CONCLUSÕES

As microesferas contendo IL-2 apresentaram uma tendência para obtenção de uma

resposta intra-tumoral em camundongos C57Bl/6 portadores de carcinoma de Ehrlich. No

entanto, a falta de impacto do tratamento pode ter ocorrido devido à rápida evolução do

tumor e ao curto tempo de duração do experimento in vivo, 15 dias. Este período de tempo

pode ter sido demasiadamente curto para que efeitos de uma liberação controlada da IL-2

das microesferas pudessem ser observados no sítio de ação do tumor.

O modelo experimental utilizado nesse estudo mostrou-se de fácil execução, porém,

acredita-se que sejam necessários alguns ajustes, como uma inoculação de menor número

de células para se obter um crescimento lento do tumor, de maneira a melhor avaliar o

crescimento do tumor e a eficácia do tratamento imunoterápico proposto nesse trabalho e

um maior tempo de tratamento.


80

CAPITULO IV

INOVAÇÃO TECNOLÓGICA EM PROCESSO DE PRODUÇÃO

DE SISTEMAS DE LIBERAÇÂO CONTROLADA


81

6. INOVAÇÃO TECNOLÓGICA EM PROCESSO DE PRODUÇÃO DE SISTEMAS

DE LIBERAÇÃO CONTROLADA

Com o intuito de prospectar inovações tecnológicas em processos de produção de

sistemas de liberação controlada de agentes terapêuticos, o processo de microencapsulação

aqui utilizado para a produção de micropartículas poliméricas (emulsificação/extração e

evaporação de solvente) foi testado com o uso de micromisturadores desenvolvidos no IPT

(Instituto de Pesquisas Tecnológicas do Estado de São Paulo) como alternativa tecnológica

ao processo convencional que utiliza agitação mecânica na etapa de emulsificação.

Micropartículas de PLGA geradas nesta etapa foram caracterizadas em relação a

propriedades que afetam a liberação controlada de fármacos como distribuição

granulométrica.

No âmbito de um programa de cooperação internacional (CAPES), parte do trabalho

foi realizada no Centro RAPSODEE da EMAC- Ecoles des Mines d’Albi Carmaux-

França, envolvendo o desenvolvimento de metodologias de caracterização da eficácia de

mistura dos microdispositivos fabricados no IPT, visando a otimização da etapa de

emulsificação do processo de produção de micropartículas de PLGA. Os resultados serão

apresentados neste capítulo.

6.1. MICROMISTURADORES UTILIZADOS

Os micromisturadores estudados nesse projeto foram fabricados no IPT utilizando-se

uma abordagem híbrida com LTCC de cerâmicas verdes (Low Temperature Cofired

Ceramics), a qual associada à tecnologia de filmes espessos e de silício, surge como uma

alternativa interessante, viável e barata para a fabricação de dispositivos MEMS e micro-

sistemas em meso-escala.

Foram utilizados dispositivos microfluídicos que possuem geometria de canal do tipo

serpentina 3D, Figura 24. Esses dispositivos foram fabricados e, previamente,

caracterizados no Laboratório de Microfluídica do Centro de Tecnologia de Processos e

Produtos (CTPP) do IPT (Cunha, 2006).


82

Figura 24. Desenho geométrico de micromisturadores passivos fabricados com a

tecnologia de LTCC utilizados nesse trabalho (Cunha, 2006).


83

Os dispositivos microfluídicos BD1 e BD2 apresentam geometria 3D (Figura 24) e

propriedades hidráulicas mostradas na Tabela 9.

Tabela 9. Propriedades dos micromisturadores do tipo Serpentina 3D.

W: comprimento do canal (mm) H: altura do canal (mm) Dh: diâmetro hidráulico (mm) Vint - volume interno (mm3) Sint – área intrna (mm) Cef: comprimento efetivo = distância percorrida por dois fluidos a partir do ponto da mistura até a saída do micromisturador (mm) NE mistura – números de elementos de mistura

Os micromisturadores ED1 e ED2 apresentam geometrias diferentes (Figura 24) e

dimensões hidráulicas semelhantes, conforme podem ser visualizada na Tabela 10.

Tabela 10. Propriedades dos micromisturadores ED1 e ED2.

W: comprimento do canal (mm) H: altura do canal (mm) Dh: diâmetro hidráulico (mm) Vint: volume interno (mm3) Cef: comprimento efetivo = distância percorrida por dois fluidos a partir do ponto da mistura até a saída do micromisturador (mm) NE mistura: números de elementos de mistura

Dispositivo W

(mm)

H

(mm)

DH

(mm)

Vint

(mm3)

Sint

(mm2)

Cef

(mm)

NE

mistura

BD1 42,2 256,7 77 25

BD2 1,02 0,40 0,575

86,9 536,1 172 54

Dispositivo Geometria do

Canal

W

(mm)

H

(mm)

DH

(mm)

Vint

(mm3)

Cef

(mm)

NE

mistur

a

ED1 onda quadrada

XZ 0,61 0,64 0,625

23,257 48,5 10

ED2 ZigZag 3D 0,61 0,64 0,625 23,461 48,5 11


84

Todas estas estruturas foram projetadas para apresentar diferentes geometrias, que

representam diferentes variações e perturbações no escoamento dos fluidos, o que afeta o

grau de mistura, como ilustrado na Figura 25, pela simulação do escoamento nos

microdispositivos ED1 e ED2.

Micromisturador ED1 Micromisturador ED2

Figura 25. Simulações somente do escoamento nos dispositivos realizadas por Cunha

(2006), com aplicativo baseado no método de elementos finitos chamado ANSYS.

6.2. CARACTERIZAÇÃO DA EFICIÊNCIA DE MISTURA EM

MICROMISTURADORES

Um estudo de caracterização da qualidade de mistura de dois líquidos imiscíveis, foi

realizado visando possibilitar a seleção dos diferentes tipos de dispositivos microfluídicos

a serem introduzidos no processo de microencapsulação de nosso interesse.

Da literatura, selecionou-se o método recente proposto por Pànic et al. (2004),

envolvendo a transferência de massa de um pigmento solvatocromático (Nile Red) entre

dois líquidos imiscíveis, heptano (receptor) e uma mistura água:metanol 50:50 (doador).

Dependendo da intensidade de mistura entre estes dois líquidos, ocorre a difusão do Nile

Red (NR) da fase aquosa para a fase orgânica.

No método proposto, os autores avaliaram o potencial de mistura dos

micromisturadores pela medida direta da absorbância do NR. No entanto, o estudo aqui

realizado inovou esta metodologia existente na literatura pela introdução do coeficiente de

partição em função da concentração do Nile Red em heptano/ concentração do NR na

mistura água:metanol (CNRH/CNR

H2

O/MeOH), determinando-se assim, o grau de eficiência de

mistura obtido para cada micromisturador testado.


85

6.2.1. Estudo da Transferência de Massa entre 2 Líquidos Imiscíveis nos

Micromisturadores

No estudo experimental, o corante Nile Red foi dissolvido na mistura água:metanol

(50:50) na concentração de 0,01 mmol/L, sendo a absorbância da solução ajustada em

0,536 ± 0,008. Em seguida, a solução era degaseificada (efeito de ultrassom). A solução

água:metanol contendo Nile Red e o solvente n-heptano eram então introduzidos em cada

micromisturador estudado (duas entradas, como ilustrado na Figura 26), por intermédio de

duas bombas, uma peristáltica (água:metanol) e uma HPLC (heptano).

Figura 26. Esquema experimental para caracterização da eficácia de mistura dos

micromisturadores.

A mistura resultante (saída do micromisturador) era coletada em uma proveta

graduada, que era então imediatamente pesada, o volume era mensurado e, as fases eram

então separadas para posterior análise espectrofotométrica (489 nm, para determinação do

NR na fase heptano, e 581 nm, para determinação do NR na fase água/metanol).

Além da geometria do micromisturador (4 micromisturadores foram testados),

variou-se para cada microdispositivo estudado, a vazão total de mistura ( 4, 8, 12, 16 e 20

mL/min), fixando-se uma razão volumétrica entre fases de 1:1.

Nile Red na fase

água:MeOH (50:50)

n-heptano

Micromisturador


86

6.2.2. Cálculos das Medidas

6.2.2.1. Cálculo da Vazão Real

tt

VV

VV

QQ

ohep

ohep

MeOHágua

MeOHágua

v

v Δ+

Δ+

Δ=

Δ2

tan

tan

/

/ (Equação 2)

6.2.2.2. Cálculo do Balanço de Massa

O balanço de massa é dado:

0//,//,/tan, =−+ entradaMeOHáguaNRsaídaMeOHáguaNRsaídaohepNR mmm (Equação 3)

Seja,

BMVV

mVCVC entradaMeOHágua

MeOHágua

MeOHáguaNRsaídaMeOHáguasaídaMeOHáguaNRsaídaohepsaídaohepNR =−+ //

/

/,////,/tan/tan,

6.2.2.3. Cálculo do Coeficiente de Partição

saídaMeOHáguaNR

saídaohepNRp m

m

//,

/tan,=ε

Seja,

saídaMeOHáguasaídaMeOHáguaNR

saídaohepsaídaohepNRP VC

VC

////,

/tan/tan,=ε (Equação 4)

6.2.2.4. Calculo da Razão Concentração/ Concentração de Equilíbrio

ohepNReq

saídaohepNR

CC

tan,,

/tan, (Equação 5)


87


6.3.1. Caracterização da Eficiência de Mistura em Micromisturadores

Nile Red é um pigmento que apresenta extensa faixa de solubilidade em diversos

solventes orgânicos e insignificante solubilidade em água (62 µg/ mL em heptano e menor

que 1 µg/ mL em água, sendo que o coeficiente de partição heptano/ água é de 58 a 4oC). A

absorção máxima do Nile Red depende fortemente da polaridade do meio, assim como, a

coloração da solução varia de acordo com a natureza do solvente. Para minimizar erros

experimentais, acompanhava-se também visualmente a absorção da solução do Nile Red, a

qual apresentava coloração violeta na fase aquosa composta da mistura água/ metanol, e

coloração amarela na fase orgânica n-heptano (Figura 27).

Fases líquidas antes do experimento Fases líquidas após experimento

Figura 27. Fases líquidas antes e após a realização do experimento de mistura: (a) Nile

Red na fase água:metanol (50:50) (Violeta intenso) e (b) fase n-heptano (incolor), antes da

passagem pelo micromisturador; (c) mistura líquida recuperada na saída do

micromisturador, onde se observa a existência de 2 fases distintas: (d) fase inferior

(água:metanol, violeta) e (e) fase superior (heptano, amarela).

A transferência de massa através dos micromisturadores foi quantificada pelo

coeficiente de partição (CP) em função da concentração do Nile Red em heptano/

concentração do NR na mistura água:metanol (CNRH/CNR

água/MeOH), Equação 4. Considera-

(a) (b) (c) (d) (e)


88

se que a transferência de massa possa ser interpretada como uma medida direta do grau de

mistura nos micromisturadores, visto que a separação de fases na saída dos

micromisturadores é imediata, interrompendo a continuidade do processo de difusão, que

ocorre apenas no interior do dispositivo de mistura.

6.3.1.1. Dispositivos Microfluídicos BD1 e BD2

A Figura 28 apresenta a curva traçada a partir do cálculo do coeficiente de partição

de Nile Red entre as fases heptano e água:metanol, para os dispositivos BD1 e BD2, em

função da vazão total de mistura fixada para cada experimento (volumétrica).

Observa-se que a transferência de massa é melhorada com o aumento da vazão total

de alimentação dos fluidos em ambos os micromisturadores tipo serpentina 3D, BD1 e

BD2. Estes dispositivos apresentam mesma geometria e relação semelhante tanto de

Sint/Vint, BD1 = 6,08 e BD2 = 6,17, e Cef/NE mistura, BD1 = 3,08 e BD2 = 3,18 (Tabela

9). Estes resultados mostram que, para estes dispositivos tipo Serpentina 3D, a

transferência de massa depende sobretudo do comprimento efetivo do canal, sendo o

micromisturador BD2 de maior comprimento efetivo e com maior coeficiente de partição.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 5 10 15 20 25

Vazão volumétrica total dos fluidos (ml/min)

Coe

ficie

nte

de p

artiç

ão

BD1

BD2

Figura 28. Coeficiente de partição (CNR

H/CNRÁgua/MeOH) em função da vazão total para os

dispositivos BD1 e BD2.


89

6.3.1.2. Dispositivos Microfluídicos ED1 e ED2

A Figura 29 apresenta a evolução da transferência de massa, dada pelos coeficientes

de partição em função do aumento da vazão total das correntes líquidas introduzidas nos

micromisturadores ED1 e ED2.

Estes micromisturadores possuem propriedades hidráulicas semelhantes (vide Tabela

10), no entanto, o micromisturador ED2, que tem um elemento de mistura a mais (11) que

o micromisutrador ED1 (10, Tabela 10), proporcionou maior transferência de massa (maior

coeficiente de partição) em todas as vazões estudadas.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

0 5 10 15 20 25

Vazão volumétrica total dos fluidos (ml/min)

Coe

ficie

nte

de p

artiç

ão

ED2

ED1

Figura 29. Coeficiente de partição (CNR

H/CNRÁgua/MeOH) em função da vazão total para os

dispositivos ED1 e ED2.

As Figuras 28 e 29 mostram a seguinte tendência de comportamento para todos os

micromisturadores: a transferência de massa é inicialmente favorecida pelo aumento da

vazão de fluidos, no entanto, aparece um ponto de mínimo e novamente a tendência de

aumento da transferência (coeficiente de partição) com novo aumento da vazão

volumétrica. Este comportamento já foi observado por outros autores em experimentos

similares de análise da eficiência de mistura em micromisturadores de outras geometrias

(Pànic et al., 2004; Lob et al., 2006) e tem sido assim interpretado em termos de dois

efeitos físicos - energia fornecida ao sistema para mistura e tempo de residência no


90

micromisturador - , no que este trabalho também concorda: A difusão do pigmento Nile

Red da fase água:metanol para a fase heptano é um processo entrópico que pode ser

acelerado fornecendo-se maior energia ao sistema (potência de mistura); no entanto, o

aumento da vazão volumétrica não apenas proporciona aumento de energia mas também

implica em uma redução do tempo de residência dos fluidos no micromisturador. Em

vazões não muito elevadas, o aumento da energia deixa de ser suficiente para compensar o

menor tempo de residência dos fluidos na região de mistura, resultando em decréscimo da

transferência de massa do Nile Red da fase água:metanol para a fase heptano, em uma

região, onde observa-se redução deste coeficiente de partição em função do aumento da

vazão de líquidos (região de mínimo, observada nas vazões 4 e 12 mL/ min, Figuras 28 e

29). Aumentos maiores de vazão, além desta região de mínimo, representam um aporte de

energia ao sistema suficiente para acelerar a difusão do Nile Red da fase água:metanol para

a fase heptano que compensa o efeito de redução dos tempos de residência. Obviamente, a

posição do mínimo dependerá do tipo de geometria dos micromisturadores.

A Tabela 11 resume os resultados dos coeficientes de partição, parâmetro que foi

avaliado no estudo de transferência de massa para classificação da eficiência de mistura

dos dispositivos microfluídicos, apontando para cada micromisturador o CP máximo e

mínimo e em que vazões estes foram obtidos. Dos micromisturadores examinados, o

desempenho de mistura pode ser assim classificado: micromisturador BD2 > BD1 > ED1 >

ED2.

Para efeito de análise da eficiência do grau de mistura nos micromisturadores, o

coeficiente de partição entre estas 2 fases também foi determinado no equilíbrio. Para isto,

as fases foram deixadas em contato sob forte agitação magnética, durante 1 h, tempo

inferior ao tempo citado na literatura onde pode iniciar-se a degradação de Nile Red em

contato com água (Datta et al., 1997). O coeficiente de partição nesta condição, após

separação das fases, foi de 12.

Tabela 11. Coeficientes de partição obtidos com os micromisturadores.

Coeficiente de partição (CNR

H/CNRágua/MeOH)

Dispositivo microfluídico

Máximo Vazão total (mL/min)

Mínimo Vazão total (mL/min)

BD1 5,3 20 2,2 4 BD2 8,0 20 3,8 4 ED1 4,2 20 2,0 4 ED2 3,0 8 1,6 12


91

6.4. CONCLUSÃO

O método recentemente desenvolvido e apresentado na literatura para quantificar a

transferência de Nile Red a partir de dois fluidos imiscíveis (Pànic et al., 2004) foi inovado

em termos de quantificação e tratamento de dados, para avaliar o desempenho de diferentes

dispositivos microfluídicos.

A eficiência de mistura, dada pela extensão da transferência de massa entre as fases

água:metanol (doador) e heptano (receptor) mostrou-se dependente do tipo de geometria

dos microdispositivos e de parâmetros de processo como a vazão total de mistura dos

fluidos introduzidos nos dispositivos de mistura. A boa mistura parece ser atingida por

mistura intensa e rápida (foco na energia de entrada, maiores vazões) ou mistura menos

intensa, porém mais longa (foco no tempo de residência).

6.5. Preparação de Micropartículas Poliméricas pelo Método Modificado de

Emulsificação e Extração de Solvente

Após os testes de eficiência de mistura realizados com os micromisturadores

fabricados com a tecnologia de LTCC e desenvolvidos para este trabalho, foram

selecionados os micromisturadores passivos, BD1 e ED2 para incorporação no processo de

microencapsulação, em substituição à etapa convencional de emulsificação (agitação

mecânica, processo descontínuo).

O processo de obtenção de micropartículas iniciou-se com a preparação de uma fase

orgânica e uma fase aquosa, separadamente. Para a preparação da fase orgânica o polímero

PLGA foi dissolvido em uma concentração de 25 mg/ mL de acetato de etila ou 45 mg/ mL

de diclorometano, sob agitação magnética e temperatura ambiente. A fase aquosa consistiu

em uma solução contendo o álcool polivinílico (PVA), em uma concentração de 3% (m/v).

Após a preparação das fases, iniciou-se a mistura das mesmas, de acordo com esquema

mostrado na Figura 30.


92

Figura 30. Esquema do arranjo experimental para preparação de micropartículas de PLGA

pelo processo modificado.

Um estudo comparativo foi conduzido com agitador convencional (ultra

homogeneizador) para avaliação do desempenho da nova configuração de processo

concebida com os micromisturadores, na encapsulação da BSA, proteína modelo.

Todas as partículas geradas foram caracterizadas em relação a propriedades que

afetam a atuação como sistemas estruturados de liberação controlada de fármacos

(tamanho, morfologia, eficiência de microencapsulação e perfil farmacocinético de

liberação da proteína modelo, BSA).

Parte dos resultados obtidos foram aceitos em 2007 para publicação no periódico

Powder Technology e são apresentados a seguir, na forma do paper submetido (in press).

Também foram obtidas micropartículas poliméricas de PLGA encapsulando a

Interleucina-2 pelo método modificado de emulsificação e extração de solvente, utilizando

o micromisturador BD2 como processo contínuo de produção da emulsão. A Tabela 12

reúne os resultados de tamanho médio de partícula e a eficiência de encapsulação. O

tamanho médio de partículas, d(4,3), obtido foi reduzido pela metade do tamanho médio das

partículas de IL-2 produzidas pelo método convencional, porém, a distribuição mostrou-se

mais ampla, com span > 2. Quanto à eficiência de encapsulação da IL-2 nestas partículas,

esta foi da mesma ordem de grandeza das partículas obtidas pelo método convencional, ou

seja, da ordem de 80%.


93

Tabela 12. Características físico-químicas das micropartículas de PLGA com IL-2 através

do micromisturador BD2.

Micropartícula

s por BD2

d(4,3)

μm

d(v, 0.1)

μm

d(v, 0.5)

μm

d(v, 0.9)

μm

Span

μm

Eficiência de

Encapsulação (%)

Mrh-IL2 7,6 1,6 9,1 26,4 2,7 84


Para a produção de micropartículas biodegradáveis de PLGA contendo a albumina de

soro bovina foram selecionados os micromisturadores BD1 e ED2 e para obtenção de

micropartículas com Interleucina-2 foi selecionado o micromisturador BD2, que

apresentou melhor eficiência de mistura.


94

7. PAPER ACEITO PARA PUBLICAÇÃO NO PERIÓDICO POWDER

TECHNOLOGY (IN PRESS)

PREPARATION OF PROTEIN-LOADED PLGA MICROSPHERES BY AN

EMULSION / SOLVENT EVAPORATION PROCESS EMPLOYING LTCC

MICROMIXERS

R. M. Ribeiro-Costa 1, Márcio Rodrigues da Cunha 2, M. R. Gongora-Rubio 2,

P. Michaluart-Júnior3, M. I. Ré 1

1 Institute for Technological Research of São Paulo, CTPP, Laboratory of Chemical

Processes and Particle Technology, Av. Prof. Almeida Prado N° 532, Cidade Universitária,

CEP 05508-901 - São Paulo/SP, Brazil

2 Institute for Technological Research of the São Paulo State, CTPP, Microfluidics

Laboratory. *3 Hospital of the Clinics of the Faculty of Medicine of the University of São Paulo

Abstract

This study presents the possibilities offered by microfluidics structures for the

production of polymeric microspheres, using a process based upon the production of an

emulsion. LTCC (Low Temperature Co-fired Ceramics) micromixers have been used for

the preparation of polymeric microspheres. The effect of the geometry of the micromixers

have been studied, with a specific focus upon the size of the microspheres, as well upon the

control release properties of a model protein loaded within these microspheres.

Keywords: LTCC; Micromixer; Microchannel; Microspheres; Protein release

*Corresponding author: Tel./fax: + 55 11 37674739/+ 55 11 37674052 E-mail adress: [email protected] (Maria Inês Ré)


95

1. Introduction

Microfabrication technologies have played a fundamental role in the development of

microfluidics devices that recently have influenced chemical micro processing, enabling

miniaturization of operations like mixing, dispersing, extracting, and heat transfer, among

others. An alternative to classical mixing processes are micromixers [1,2,3], which in

particular present a wide range of applications in industry and research [4].

Mixing of two fluids using a micromixer mainly relies on diffusion, which can be a

long-lasting process. This can be improved with active or passive micromixers. With active

micromixers, the flow is modified by an external disturbance source, although for passive

micromixers the mixing is improved through flow disturbance obtained by increasing the

surface of contact between the two fluids by generating chaotic movements and bi or tri-

dimensional velocity fields using as a basic idea the change of channels shape, length and

direction [5].

LTCC (Low Temperature Co-fired Ceramics) technology, as described in literature

[6,7,8,9], is a good option for microfluidic devices with several advantages when compared

with other microfabrication technologies. The Green tapes are glass-ceramic composite

materials. The usual composition also includes a glass frit binder to lower processing

temperature as well as rendering the material compatible with thick film technology, and

an organic vehicle for binding and viscosity control. One of the important features of green

tape technology is the possibility of fabricating (3D) three-dimensional structures using

multiple layers of green tapes. The processing of the green ceramic tapes is usually done in

three basic steps [Erro! Indicador não definido.]: 1) Patterning of individual layers with

via holes, resistors, conductors, dielectric pastes, depending on application; 2) Collation

and lamination of the tapes under pressure and temperature; 3) Co-firing of the entire

laminate to sinter the material.

In this paper, a microfluidic approach to prepare PLGA microspheres by means of

LTCC passive micromixers integrated to an emulsion/solvent evaporation process is

presented. Passive micromixers have been selected, considering their simple and less

expensive construction. LTCC micromixers are integrated to the encapsulation process in

two steps: in a first step the mixing of two immiscible liquids to generate an emulsion.

Secondly, sequential phenomena such as solvent diffusion and crystallisation generate

solid particles such as polymeric microspheres for drug delivery.


96

2. Experimental

2.1. Materials

Poly (D,L lactic-co-glycolic) acids (PLGA, 50:50, inherent viscosity 0.83 dL/ g) from

PURAC Biochem (Netherlands). Bovine serum albumin (BSA) and polyvinyl alcohol

(PVA, hydrolyzed 88%, Mw range 13 000-17 000g/mol) from Sigma-Aldrich (St Louis,

USA). Dichloromethane (DCM) and all other chemicals reagents were of analytical grade

and used as received.

2.2. Micromixers

In this work, eight micromixers (Fig.1) were manufactured in LTCC:

- One micromixer with a straight channel (straight channel micromixer DD1) and five

micromixers with different 2D and 3D configurations:

Zig-zag 2D micromixer (DD2)

Square wave 2D-XY micromixer (DD3)

Square wave 3D-XZ micromixer (ED1)

Zig-zag 3D micromixer (ED2)

Serpentine 3D micromixer (ED3)

For comparison these structures have the same cross sections of 600 μm x 600 μm and the

same effective channel length of 48 mm.

- Two micromixers 3D configurations cross sections of 1020μmx400μm, effective channel

lengths of 77 mm (Serpentine 3D micromixer BD1) and 172 mm (Serpentine 3D

micromixer BD2).

2.3. Microspheres preparation by emulsion/solvent evaporation using mechanical

agitation method

Microspheres were prepared by a w1/o/w2 emulsion technique [10,11]. A primary

emulsion (w1/o) of aqueous solutions of BSA (1 mL; 4,5% w/v) and polymer solution of

PLGA in dichloromethane (10 mL; 45% w/v) was prepared by mechanical agitation

(Heidolph DIAX 900, Germany) at 7220 rpm for 30 seconds in an ice bath, corresponding

to a protein load of 9% wt. The secondary emulsification of w1/o in 50 mL of a 3% w/v

solution of polyvinyl alcohol (w2 phase) was carried under mechanical agitation at 7220

rpm for 1 minute. The w1/o/w2 emulsion was maintained under agitation at 500 rpm for 4


97

hours to evaporate the dichloromethane. The microspheres were collected by

centrifugation, washed three times and then vacuum filtered. The residue was left

overnight in a desiccator and the microspheres were obtained as a dry powder.

Fig. 1. Micromixers geometry.

2.4. Microspheres preparation by emulsion/solvent evaporation using micromixers

The first emulsion (w1/o) was prepared as previously described and then transferred

into a 20 mL glass syringe. By means of a HPLC pump (Alliance), a 3% w/v solution of

polyvinyl alcohol (w2 phase) was fed into one of the two inlets of the micromixer, while

the previously prepared w1/o was fed into the other inlet of the micromixer using a syringe

pump (PHD 4400 Hpsi, Harvard Apparatus). Upon contact between the w1/o and the w2

phase, nascent microdroplets were formed inside the micromixer. For final hardening and

product collection, the same experimental procedure described above for the classical

DD2

DD3

DD1

ED2

ED1

ED3

BD1

BD2


98

emulsion/solvent evaporation process was utilized. Fig. 2 shows the experimental set-up

for the PLGA microspheres production using passive micromixers.

Fig. 2. Experimental set-up for emulsion/solvent evaporation process with LTCC

micromixers.

2.5. Particles characterization

Size and morphology. A particle analyzer (Coulter Counter LS230) was used to determine

the particles size distribution of the resulting microspheres by laser light diffraction.

Samples of dried PLGA microparticles were dispersed in a 0.01%w/v solution of Tween

80 and ultrasonicated for 10 minutes. Calculated parameters were: volume mean diameter

(d(4,3)), span index which was calculated by (d(v,0.9) - d(v,0.1)) / d(v, 0.5 )) where d(v,0.9), d(v, 0.5 )

and d(v,0.1) are respectively the particle diameters determined at the 90th, 50th and 10th

percentile of particles undersized.

The shape and surface morphology of microspheres were determined from

micrographs taken with a scanning electron microscope (JEOL 5200M). Samples were

sputtered-coated with a thin layer of Au and examined at an intensity of 10 kV, using

various magnifications.

Encapsulation efficiency. The amounts of BSA encapsulated into microspheres were

determined by an extraction method, involving the dissolution of the polymer in an organic

solvent and further extraction of the protein into an aqueous medium [12]. Microspheres

(10 mg) were dissolved in 1 mL DCM and sonicated for 20 minutes. After 1 mL Milli-Q

water purification system (Millipore, USA) was added to extract the BSA. The mixture


99

was centrifuged at 5000 rpm for 5 minutes to separate the organic and aqueous phases.

After centrifuging, the aqueous solution was analyzed using protein assay by Bradford

method with GBC – Cintra 10 UV-Visible Spectrophotometer [13]. All experiments were

performed in triplicate and the encapsulation efficiency was expressed in percentage as the

ratio of the amount of BSA extracted from the microspheres to the amount of BSA

employed for the preparation of the microparticles.

In vitro BSA release. The in vitro release profile of BSA from microspheres was

determined according to Ref. [14]. Microspheres (10 mg) were placed in eppendorf tubes

and incubated in 1 mL release medium phosphate-buffered saline (PBS, pH 7,4) at 37oC

and under agitation at 220 rpm/min. At predetermined time intervals, the suspension of

microspheres was centrifuged at 5000 rpm for 5 minutes. The supernatant (1 mL) was

withdrawn and replaced with 1 mL fresh release medium. The amount BSA released was

measured in the supernatant by Bradford method and was expressed in percentage as

fraction of the total BSA content.

3. Results and discussion

3.1. Influence of micromixer geometry and flow rate of mixed fluids on the microspheres

size

Initially, the experiments were conducted with eight different LTCC microfluidic

structures to characterize the effect of the micromixer geometry and the total flow of mixed

fluids (w1/o and w2 emulsion phases) on the PLGA microparticles size. A total volumetric

flow rate of mixed fluids of 1.1 or 2.2 l/h was utilized for the experiments, with a ratio

between the emulsion phases of 1:5 (w1/o/ w2).

In a second series, two micromixers were used for BSA encapsulation as a model

protein. In each series, one process parameter (micromixer geometry) was varied while the

remaining parameters were kept constant. The BSA loaded microparticles were

characterized with respect to the particles size, the surface morphology, the encapsulation

efficiency and the in vitro drug release.

Table 1 shows the particles size range for PLGA microspheres (without BSA)

produced by the emulsion/solvent evaporation method employing the eight LTCC

micromixers presented in Fig. 1. All resulting particles size distributions exhibited a

practically monomodal shape. SEM micrographs of the PLGA microspheres show that

they are spherically shaped as illustrated in Fig. 3.


100

Table 1. Particles size range for PLGA microspheres (without BSA) produced by the

emulsion/solvent evaporation method, employing different LTCC microfluidics structures.

(a) (b)

Fig. 3. SEM micrographs (750x) of PLGA microspheres generated by emulsion/solvent

evaporation process, with a LTCC micromixer (BD1) at different flow rates: a) 1.1 l/h; b)

2.2 l/h.

PLGA Microspheres

d(4,3) μm d(v, 0.1) μm d(v, 0.5) μm d(v, 0.9) μm Span

BD1a 14.7 2.0 22.0 39.7 1.7 BD1b 9.9 1.5 13.6 26.1 1.7 BD2a 6.0 1.3 7.3 20.6 2.7 BD2b 4.6 1.1 5.8 13.3 2.1 DD1a 36.7 16.6 45.5 86.2 1.5 DD1 b 33.5 14.7 41.0 80.3 1.5 DD2a 26.0 9.9 35.2 63.0 1.5 DD2b 20.4 5.6 24.5 56.8 2.0 DD3a 33.6 15.8 42.1 74.0 1.3 DD3b 19.6 4.2 26.4 54.2 1.8 ED1a 26.7 8.5 36.0 70.0 1.7 ED1b 9.0 1.4 11.1 39.2 3.3 ED2a 23.7 8.7 31.1 57.4 1.5 ED2b 9.0 1.6 11.4 32.8 2.7 ED3a 30.8 15.5 38.6 61.9 1.1 ED3b 9.7 1.7 11.6 38.1 3.1


101

Considering that hydraulic diameter, effective length and flow input are equal for

LTCC micromixers DD1, DD2, DD3, ED1, ED2 and ED3, it is possible to evaluate their

mixing quality by observing the particle size distributions of the polymeric microspheres

generated with these devices.

Particles size distribution can be analyzed using two parameters, mean diameter d(4,3)

and a polidispersity index, span. The results show that the LTCC micromixers could

generate PLGA microspheres with mean diameter d(4,3) from 4.7 to 36.7 µm and span

variation from 1.1 to 3.3.

When comparing 2D micromixers performance (DD2 and DD3) at the same

operating total flow rate at 1.1 l/h, the zig-zag micromixer (DD2) generated smaller

particle sizes than the square-wave 2D-XY (DD3). On the other hand, when comparing 3D

devices performance (ED1, ED2 and ED3), the serpentine micromixer ED2 generated

smaller particle sizes than those obtained with ED1 or ED3. In most experiments, the

increase of the total volumetric flow rate of mixed fluids from 1.1 to 2.2 l/h led to a

reduction on particle size, mainly for 3D structures.

Similar results were obtained with the two other LTCC micromixers, BD1 and BD2,

which have larger cross sections (1020µm x 400µm) and longer effective channel lengths

(77mm and 172mm, respectively for BD1 and BD2). Moreover, it seems that the longer

channel (BD2) could enhance mixing, allowing the generation of smaller particles,

although with a tendency to larger dispersion indexes (span). Therefore, depending on

channel geometry there is a flow dynamics that influences the generation of small particles,

or particles with narrow size dispersion.

3.2. Influence of the microencapsulation process with micromixers on the properties of

the BSA loaded-PLGA microspheres

In a second series, PLGA microspheres loaded with a model protein, bovine serum

albumin (BSA), were prepared using two of the LTCC micromixers tested in the first

series of experiments: 1) Zig-zag 3D micromixer (ED2), cross section of 600 μm x 600

μm, effective channel length of 48 mm; 2) Serpentine 3D micromixer (BD1), cross section

of 1020 μm x 400 μm, effective channel length of 77mm. A total volumetric flow rate of

mixed fluids of 2.2 l/h was fixed for the experiments and the same ratio between the

emulsion phases of 1:5 (w1/o: w2) was also kept constant.


102

Particles size and encapsulation efficiency. Table 2 shows the particles size range for

BSA loaded PLGA microparticles produced with the LTCC micromixers ED2 and BD1, in

comparison to the particles size range of a similar product obtained by the “standard”

process, e.g., the emulsion/solvent evaporation method previously studied to generate the

same range of particle size.

The mean diameter and particle size distributions seem to be little influenced by the

geometry of the micromixers employed, BD1 and ED2, both of the same magnitude of

particle size generated by the “standard” process. However, the BSA loaded

microparticles (Table 2) are larger than the unloaded microparticles (Table 1) obtained

with the same micromixers and the total flow rate of 2.2 l/h. According to the d(v, 0.1) and

d(v, 0.9) diameters, most of the volume weighted particle diameters of the PLGA

microparticles obtained from the “standard “ process and with the micromixer ED2 ranged

from 18-19 µm to 53-56 µm, with a span values lower than 2, very appropriate for drug

delivery systems. PLGA microparticles generated with the micromixer BD1 are slightly

larger, ranging from 23 to 65 µm, span of 1.8.

Table 2 also shows that BSA encapsulation efficiencies were highly satisfactory in

the range of 61% to 75%. Batch-to-batch reproducibility of the encapsulation efficiency

presented standard deviations of 2-5%, comparable to variations of same magnitude

reported in the literature [2].

Table 2. Properties of BSA loaded-PLGA microspheres generated by emulsion/ solvent

evaporation (under mechanical agitation and with micromixers as mixing elements).

BSA release from the microspheres. Kinetic release profiles of BSA loaded-PLGA

microspheres produced with the micromixers BD1 and ED2 showed a similar biphasic

behavior (Fig. 4), comparable to that obtained for microspheres obtained by the ”standard

process”: - a burst release of BSA within the first 5 hours of 26% for ED2, 39% for BD1

Particles size PLGA Microspheres d(4,3) μm d(v, 0.1)

μm

d(v, 0.5)

μm

d(v, 0.9)

μm

Span Encapsulation efficiency (%

w/w)

Micromixer BD1 23.2 5.1 33.1 65.3 1.8 75.0 ± 5.3

Micromixer ED2 17.8 3.5 24.4 53.1 2.0 61.0 ± 3.9

‘Standard’

process

19.3 4.6 27.3 56.4 1.9 71.7 ± 1.7


103

and 32% for the standard process, followed by a subsequent slower release phase observed

during the following 12 days (720 h) of incubation. At the end of this period, 41%, 57%

and 49% of BSA was released, for PLGA microspheres prepared with the micromixers

ED2, BD1 and by the standard process, respectively (data not shown in Fig. 4).

0

20

40

60

80

0 50 100 150 200 250

Time (hours)

% C

umul

ativ

e B

SA R

elea

se

Fig. 4. In vitro release profile of BSA from (■) micromixer ED2, (□) micromixer BD1 and

(○) mechanical agitation PLGA microspheres generated by emulsion/solvent evaporation.

4. Conclusions

We could see that the LTCC micromixers proved to produce protein-loaded PLGA

microspheres with encapsulation efficiencies satisfactory in the range of 61 to 75% and

narrow particle size dispersion. The results show that the two immiscible liquids were well

mixed and the size dispersion could be well controlled suggesting that LTCC micromixers

are suitable for the continuous production of polymeric protein delivery systems.

Acknowledgements

The authors are grateful to CNPq, CAPES and FAPESP for research funds

supporting this work.


104

References

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105

CONCLUSÃO GERAL


106

8. CONCLUSÃO GERAL

Neste projeto cuja principal meta foi o desenvolvimento de micropartículas de PLGA

encapsulando a Interleucina-2 como uma estratégia farmacêutica para o tratamento de

pacientes com carcinoma epidermóide avançado de cabeça e pescoço, pode-se elencar as

principais conclusões:

Microesferas de PLGA contendo recombinante humano de interleucina-2, livre e

associado aos agentes estabilizantes polietilenoglicol e albumina de soro bovina,

apresentaram elevada taxa de eficiência de encapsulação e perfil cinético de liberação

controlada de IL-2. Frente ao estado da arte, obteve-se uma otimização da formulação, ou

seja, a meta do desenvolvimento tecnológico da formulação, que foi um dos desafios desse

projeto, foi alcançada.

Após a incorporação em microesferas de PLGA, a IL-2 manteve sua propriedade de

estimulação de proliferação de linfócitos in vitro.

Os cuidados de assepsia da metodologia utilizada na produção das micropartículas

foram satisfatórios para realização do ensaio in vivo.

Os resultados obtidos mostraram que o tratamento (microesferas sem ativo,

microesferas de PLGA contendo IL-2 e Proleukin®) aplicado em camundongos C57Bl/6

portadores de melanoma B16F10 não foi capaz de aumentar a taxa de sobrevivência dos

animais. Acredita-se que a dimensão inicial da neoplasia tenha sido demasiadamente

grande (em relação ao tamanho corpóreo do animal portador) quando a terapia foi iniciada,

podendo ter mascarado algum possível efeito terapêutico.

Frente ao carcinoma de Ehrlich em camundongos C57Bl/6, as micropartículas de

PLGA apresentaram uma tendência para resposta anti-tumoral em relação ao Proleukin®.

Porém, a falta de impacto do tratamento pode ter ocorrido devido à rápida evolução do

tumor e ao curto tempo de duração do experimento para observação da eficácia dessa nova

estratégia terapêutica.

Dispositivos microfluídicos representam uma alternativa tecnológica para inovação

no método de emulsificação/extração e evaporação de solvente para a produção de

micropartículas poliméricas, sendo que a eficiência de mistura para otimização da etapa de

emulsificação dependente da geometria do dispositivo e das condições hidráulicas do

sistema. Esses dispositivos microfluídicos podem ser utilizados como uma boa estratégia

tecnológica para inovação no processo de produção de partículas assépticas, de modo

contínuo e com boa reprodutibilidade.


107

SUGESTÕES


108

9. SUGESTÕES PARA CONTINUIDADE DAS ATIVIDADES

9.1. Sugestões para Desenvolvimento Tecnológico

Novas formulações de micropartículas com PLGA podem ser obtidas através da

inclusão de outras variáveis de estudo que afetam as características de encapsulação e

liberação de IL-2 como: PLGA de diferentes razões monoméricas (50:50 e 85:15);

variação da concentração dos agentes estabilizantes; adição de outros agentes co-

encapsulantes como, por exemplo, a proteína de soro humano (HSA).

Microencapsulação de um fator de crescimento junto com Interleucina-2, visando

investigar um possível efeito de sinergismo na formulação para recrutar um maior número

de células NK (Natural Killer) para o micro-ambiente tumoral.

Prosseguir a exploração do uso dos misturadores microfluídicos como ferramenta

tecnológica para implementação da produção de micropartículas poliméricas pelo processo

contínuo, controlando as características das partículas. Comparar as características físico-

quimicas e biológicas das partículas obtidas pelo processo modificado pela introdução de

micromisturadores com o processo convencional.

9.2. Sugestões para Continuidade dos Ensaios de Testes de Conceitos

Adequação dos modelos de tumores experimentais estudados, melanoma B16F10 e

carcinoma de Ehrlich, com ajuste da dose de células tumurais para provocar uma evolução

mais lenta do tumor que possa favorecer uma melhor investigação do potencial dessa nova

estratégia terapêutica.

Administrar diferentes doses da Interleucina-2, em sua forma livre e

microencapsulada, na presença de um agente co-encapsulante (albumina de soro bovina)

para avaliar os efeitos do tratamento.

Investigar as atividades biológicas da Interleucina-2, em sua forma livre e

microencapsulada, após ajuste dos modelos tumorais, e intensificar a obtenção de dados

experimentais como, por exemplo, com a atividade das células NK (Natural Killer).

Avaliar o tempo de sobrevida dos animais após adequação dos modelos dos

tumores experimentais, melanoma B16F10 e carcinoma de Ehrlich.


109

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS


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10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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ANEXOS


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Trabalhos enviados para congresso

R. M. RIBEIRO-COSTA, M. R. DA CUNHA, M. R. GONGORA-RUBIO, M. I. RÉ.

Etude dúm procede dóbtetntion de microspheres polymériques a l’aide de

micromelangeurs. Science et Technologie des Poudres & Poudres et Materiaux, Ecole des

Mines dÁlbi – França, p.114, 23 – 25 maio de 2007.

PINTO, E. F.; CRUZ, E. A.; LIMA, W. P.; PENA, L. M. R.; RIBEIRO-COSTA, R. M. ;

RE, M. I. ; BARTIRA, R. B. Comparative Study of Acute Toxicity and Allergenicityu of

Poly-Hydroxybutyrate-Valaerate (PHB-HV) and Poly-(Lactide-Co-Glycolide)

Microparticles. In: 3ª Reunião da Rede de Nanobiotecnologia, 2005, São Pedro - São

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RIBEIRO-COSTA, R. M., RE, M. I., CUNHA, M. R., RUBIO, M. G. Preparation of

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Approach to Produce Poly(Lactide-Co-Glycolide) Micro- and Nanospheres. In: 4ª Reunião

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126

Trabalho aceito na Powder Technology


127

Aprovação do Comitê de Ética

desenvolvimento de microesferas de plga contendo … · 2019. 10. 25. · roseane maria ribeiro...

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