DESENVOLVIMENTO DE EMBRIÕES BOVINOS PRODUZIDOS IN VITRO CULTIVADOS EM MEIO LIVRE DE SORO

RAQUEL VARELLA SERAPIÃO

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO – UENF

CAMPOS DOS GOYTACAZES/RJ OUTUBRO/2007

DESENVOLVIMENTO DE EMBRIÕES BOVINOS PRODUZIDOS IN VITRO CULTIVADOS EM MEIO LIVRE DE SORO

RAQUEL VARELLA SERAPIÃO

Tese apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologia Agropecuária da Universidade Estadual do Norte Fluminense, como parte das exigências para obtenção do título de Doutor em Produção Animal.

Orientador: Prof. Dr. Francisco Aloízio Fonseca Co-Orientador: Dr. Wanderlei Ferreira de Sá

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE

CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ OUTUBRO/2007

DESENVOLVIMENTO DE EMBRIÕES BOVINOS PRODUZIDOS IN VITRO CULTIVADOS EM MEIO LIVRE DE SORO

RAQUEL VARELLA SERAPIÃO

Tese apresentada ao Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da Universidade Estadual do Norte Fluminense, como parte das exigências para obtenção do título de Doutor em Produção Animal.

Aprovada em 23 de outubro de 2007

Prof. Dr. Angelo José Burla Dias (D.S., Biociência) - UENF

Profª. Dra. Maria Clara Caldas Bussiere (D.S., Fisiologia Geral) - UENF

Dr. Luiz Sérgio de Almeida Camargo (D.S., Ciência Animal) - EMBRAPA

Dr. Wanderlei Ferreira de Sá (D.S., Protozoologia de Parasitos) – EMBRAPA (Co-Orientador)

Prof. Dr. Francisco Aloízio Fonseca (PhD, Animal Science) – UENF (Orientador)

“Caminante son tus huellas El camino y nada mas; Caminante, no hay camino Se hace camino al andar Al andar se hace camino Y al volver la vista atras Se ve la senda que nunca Se ha de volver a pisar. Caminante no hay camino Sino estelas en la mar..." (Antonio Machado)

“Alguém me disse que sou um homem de sorte, mas toda vez que a sorte me procura estou em meu atelier trabalhando.” (Leonardo da Vinci)

Dedico esta tese ao meu filho Lui

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus, pois sem ele não conseguiria concluir esta jornada. Agradeço ao meu filho Lui, por ter sido um excelente companheiro com seu amor incondicional, e ao meu marido João Carlos, pelo amor, paciência, companheirismo e incentivo que foram de fundamental importância para a conclusão do meu trabalho. Agradeço aos meus pais Roberto e Edna, que estiveram presentes a todo o momento me apoiando no que foi necessário. Agradeço à minha irmã Marta pela torcida e amizade, e aos meus sobrinhos Matheus, Caio e Luiza pelo grande carinho. Agradeço à minha avó Nilza pelas orações, e a todos os meus tios, tias e primos que se mostraram o tempo todo disponíveis para o que eu precisasse e torceram tanto por mim. Agradeço à Sandra pela amizade e o carinho, principalmente nos momentos em que fraquejei. Agradeço à minha sogra Neli (in memoriam) por sempre ter tido um grande carinho por mim, e às minhas cunhadas Denise, Andréa e Márcia pela amizade. Agradeço à família Salomão por terem acolhido a mim e ao Lui em sua casa como se fôssemos da família. Agradeço às minhas grandes e eternas amigas Carlinha, Cris, Sílvia, Alessandra, Isabella, Séfora Andréa, Juliana e Mariana, que estiveram sempre presentes e companheiras durante toda esta caminhada.

Agradeço a todos os estagiários do laboratório pela colaboração em meu experimento e pela amizade, em especial a Elisa, Ingrid, Carla, Nathalia, Michele, Alessandra Vireque, Renata, Fabrício, Gaúcho, Everton, Luiz Gustavo, Gustavo, Ríbrio e Sabine. Agradeço aos funcionários do Laboratório, Bruno, Joel, Myro e Del pela disponibilidade, amizade e colaboração, que foram fundamentais para a conclusão do nosso trabalho.

Agradeço à UENF pela oportunidade de conquistar o título de Doutora e pela bolsa concedida.

Agradeço à Embrapa Gado de Leite por permitir a realização deste trabalho. Agradeço à equipe do Laboratório de Genética Molecular da Embrapa

Gado de Leite e do Laboratório Agrogenética pela colaboração, apoio e disponibilidade. Agradeço ao Departamento de Ginecologia e Obstetrícia do Hospital das Clínicas da USP, em Ribeirão Preto pela colaboração.

Agradeço ao Dr. Ademir de Moraes Ferreira pela amizade, principalmente nos momentos em que buscávamos algum tipo de orientação. Agradeço aos pesquisadores Dr. Luiz Sérgio de Almeida Camargo, João Henrique Moreira Viana e Lilian Tamy Iguma pela amizade, orientação e oportunidades. Agradeço ao meu orientador Prof. Francisco Aloízio Fonseca que, mesmo sem me conhecer, apostou na minha capacidade e sempre se mostrou tão solícito e amigo. Agradeço muito ao meu co-orientador, Dr. Wanderlei Ferreira de Sá, por ter me dado mais esta oportunidade e me ensinado tanta coisa, sempre me motivando a seguir em frente, independentemente do que acontecesse ao redor. Agradeço ao Prof. Alberto Magno pela amizade.

Agradeço a todos os companheiros da UENF, em especial ao Bruno, à Kelen, à Amanda e à Liu. Agradeço imensamente aos amigos Janaína, Jimmy e Zé Antônio pela amizade e companheirismo nas exaustivas segundas-feiras do primeiro semestre. Agradeço aos professores da UENF pela compreensão e incentivo. Agradeço à coordenação de pós-graduação pela disponibilidade e apoio. Agradeço a todos que direta ou indiretamente foram de fundamental importância para a conquista desta vitória.

BIOGRAFIA

RAQUEL VARELLA SERAPIÃO, filha de Edna Varella Serapião e Roberto de Souza Serapião, nasceu em 11 de março de 1974, na cidade do Rio de Janeiro – RJ. Em 1999, concluiu a graduação em Medicina Veterinária, pela Universidade Federal Fluminense. Em março de 2000, iniciou no programa de Pós-Graduação (Mestrado), da Universidade Federal Fluminense, tendo obtido o título de Mestre em Patologia e Reprodução Animal em fevereiro de 2002, sob a orientação do professor Luiz Altamiro Garcia Nogueira. No mês de maio do ano de 2003, ingressou no curso de Doutorado em Produção Animal, do Programa de Pós-Graduação da Universidade Estadual do norte Fluminense - Darcy Ribeiro, submetendo-se à defesa de tese para a conclusão do curso em outubro de 2007.

CONTEÚDO

RESUMO ix

ABSTRACT xi

1. INTRODUÇÃO 1

2. REVISÃO DE LITERATURA 4

2.1- Aspectos Gerais 4

2.2- Período pré-implantacional em embriões bovinos 5

2.3- Cinética de desenvolvimento embrionário 8

2.4- Cultivo in vitro de embriões bovinos 9

2.5- Soro fetal bovino (SFB) no cultivo in vitro de embriões 12

2.6- Knockout serum replacer (KSR) como substituto do SFB 13

2.7- Resposta embrionária a condições de estresse 14

2.8- Apoptose em embriões produzidos in vitro 15

2.9- Expressão gênica em embriões bovinos 16

3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 20

4. TRABALHOS 30

DESENVOLVIMENTO DE EMBRIÕES BOVINOS CULTIVADOS IN VITRO EM

MEIO SUPLEMENTADO COM SUBSTITUTO DO SORO FETAL BOVINO

RESUMO 31

ABSTRACT 32

INTRODUÇÃO 33

MATERIAL E MÉTODOS 35

Local do experimento 35

Produção in vitro de embriões 35

Avaliação da clivagem e produção de embriões 36

Desenvolvimento embrionário 36

Contagem de células 36

Análise estatística 37

RESULTADOS 37

DISCUSSÃO 40

CONCLUSÃO 44

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 44

EXPRESSÃO DOS TRANSCRITOS Hsp70.1 E Bax EM EMBRIÕES BOVINOS

CULTIVADOS EM MEIO LIVRE DE SORO

RESUMO 50

ABSTRACT 52

INTRODUÇÃO 54

MATERIAL E MÉTODOS 56

Local do experimento 56

Produção de in vitro de embriões 57

Avaliação dos embriões 57

Extração de RNA e transcrição reversa 57

PCR em tempo real 58

Análise estatística 60

RESULTADOS 61

DISCUSSÃO 62

CONCLUSÃO 65

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 65

5. CONCLUSÕES GERAIS 69

RESUMO

SERAPIÃO Raquel Varella, D.S. Universidade Estadual do Norte Fluminense; outubro de 2007; Desenvolvimento de embriões bovinos produzidos in vitro cultivados em meio livre de soro; Orientador: Prof. Francisco Aloízio Fonseca. Co-Orientador: Dr. Wanderlei Ferreira de Sá. A exposição de embriões ao soro fetal bovino (SFB) durante o cultivo in vitro

pode alterar: a cinética de desenvolvimento, a morfologia, o metabolismo e a

expressão de transcritos específicos. Além disso, o soro pode ser uma fonte

em potencial de contaminações por patógenos para sistemas de cultivo in vitro.

O KnockoutTM Serum Replacer (Gibco Labs., Grand Island, NY) é um substituto

do soro, otimizado para estabelecer e manter linhagens de células tronco em

cultivo. Portanto, objetivou-se neste trabalho avaliar a capacidade do KSR em

substituir o soro fetal bovino no cultivo in vitro de embriões bovinos fertilizados

in vitro. No primeiro experimento, foram avaliados o desenvolvimento

embrionário, a produção de embriões e o número total de células. Os embriões

cultivados em presença de KSR apresentaram os mesmos padrões de

desenvolvimento e qualidade daqueles cultivados em presença de soro. No

segundo experimento, além das taxas de clivagem e produção de blastocistos,

também foi avaliada a expressão dos genes Hsp70.1 e Bax. Como observado

no primeiro experimento, o KSR apresentou taxas de clivagem e produção de

blastocistos similares ao SFB, assim como expressão dos genes citados. Os

resultados gerados nos dois experimentos sugerem que o KSR pode ser

utilizado como substituto do SFB no cultivo embriões bovinos produzidos in

vitro.

Palavras-chave: bovino, embrião, cultivo in vitro, Knockout serum replacer,

Hsp70.1, Bax.

ABSTRACT

SERAPIÃO Raquel Varella, D.S. Universidade Estadual do Norte Fluminense; october 2007; Development in vitro produced bovine embryos cultured in serum-free medium; Adviser: Prof. Francisco Aloízio Fonseca. Committee members: Dr. Wanderlei Ferreira de Sá. The exposition of embryos to fetal calf serum (FCS) during the culture may

alter: kinetics of development, morphology, metabolism and the expression of

specific transcripts. Yet, the serum may act as a source of contamination for in

vitro culture systems. KnockoutTM SR (Gibco Labs., Grand Island, NY) is a

serum replacer optimized in a manner to establish and keep stem cell lineage in

culture. Our aim with this work was to evaluate KSR capacity as a substitute for

FCS in vitro culture systems. During the first experiment, the embryo

development, embryo production and total number cells were evaluated. The

embryos cultured in KSR presence had the same patterns of development and

quality of those cultured in serum presence. In the second experiment we

evaluated the expression of genes Hsp70.1 and Bax. Cleavage and blastocyst

rates and the gene expression of Hsp70.1 and Bax were similar among groups.

The results of both experiments suggest that KSR may be used as substitute for

FCS in the culture of in vitro produced bovine embryos.

Key words: bovine, embryo, in vitro culture, Knockout serum replacer, Hsp70.1,

Bax

1. INTRODUÇÃO

A melhoria do manejo sanitário e nutricional aliada ao incremento no

potencial genético de animais de produção contribuirá para atender a demanda

de carne e leite para o futuro. O melhoramento genético deixou de ser, na

pecuária brasileira, um assunto puramente acadêmico para tornar-se um

importante agente de transformações, sendo necessário criar a consciência de

que existem ferramentas disponíveis para escolher, de forma objetiva, o

material genético que deve ser multiplicado, tendo como objetivo primordial a

maximização da produção de carne e leite no país (PINEDA, 2004). Dentro

desse contexto, o desempenho da pecuária nacional vem contribuindo de

forma determinante para que o Produto Interno Bruto (PIB) do agronegócio

cresça de forma substancial. Conseqüentemente, o aumento das exportações

gerado pela excelência na produção de bovinos projetou a pecuária brasileira

no mercado internacional. As biotecnologias da reprodução foram, e continuam

sendo, uma importante ferramenta para que o país atingisse essa posição de

destaque, proporcionando a obtenção de indivíduos geneticamente superiores.

Essas biotecnologias são vantajosas para programas de melhoramento

genético bovino, pois, ao explorarem racionalmente a fertilidade de animais

genotipicamente superiores e acelerarem o ganho genético entre gerações

(HASLER, 2003), maximizam o retorno econômico para o sistema de produção.

Dentre as biotecnologias utilizadas atualmente, a produção in vitro de

embriões (PIVE) associada à punção folicular guiada por ultra-som tem

ocupado um papel de destaque, por permitir a obtenção de uma gestação por

vaca/semana, em média, podendo aumentar rapidamente o número de animais

geneticamente superiores, diminuir o intervalo entre gerações e aumentar a

intensidade de seleção de maneira mais acelerada do que outras técnicas,

como a transferência de embriões (DODE & RUMPF, 2002). Para que a PIVE

alcançasse sua aplicabilidade comercial na pecuária, várias equipes de

pesquisadores contribuíram para a melhoria dos sistemas de cultivo dos

embriões. Porém, existe uma variação na produção embrionária entre

laboratórios em função dos procedimentos adotados. Espera-se que,

aproximadamente, 30% dos oócitos maturados e fecundados in vitro atinjam o

estádio de blastocisto durante o cultivo embrionário (LONERGAN et al., 2003).

Em vista destes resultados, ou seja, pelo fato de a maior parte dos gametas

não atingirem os estádios de blastocistos, é factível considerar que a etapa do

desenvolvimento embrionário é limitante para a produção de maiores taxas de

embriões (SORIA, 2005).

Alterações morfológicas e moleculares causadas pelo cultivo in vitro

têm sido responsáveis pela menor qualidade e viabilidade após inovulação ou

criopreservação dos embriões (Mc EVOY, 2003). Entre as alterações em

embriões produzidos in vitro, estão o aumento do número de células

apoptóticas e diminuição do número total de células, alterações da densidade

(com acúmulo de lipídeos), do metabolismo (com aumento da produção de

lactato) e da expressão gênica (KHURANA & NIEMANN, 2000; GUTIERRÉZ-

ADAN et al., 2001; RIZOS et al., 2003; LONERGAN et al., 2006).

Apesar de geralmente aumentar o índice de produção de blastocistos,

o soro adicionado aos meios de cultivo embrionário tem sido apontado como

um dos principais agentes envolvidos nessas alterações embrionárias

(CROSIER et al., 2000, Mc EVOY et al., 2003, RIZOS et al., 2003), além de ser

uma fonte de contaminações por patógenos (LONERGAN et al., 2006).

Estudos vêm sendo desenvolvidos visando à exclusão do soro, utilizando

meios de cultivo quimicamente definidos (LANE et al., 2003).

O Knockout Serum Replacer (KSR) é um suplemento para meio de

cultivo utilizado como substituto do soro no cultivo de células tronco.

Entretanto, poucos são os relatos de seu efeito sobre o desenvolvimento

embrionário in vitro e características embrionárias, como número total de

células e expressão gênica.

Portanto, objetivou-se neste trabalho avaliar a capacidade do KSR em

substituir o soro no cultivo in vitro de embriões bovinos, avaliando-se a taxa de

produção e a qualidade dos embriões.

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1- Aspectos gerais

O nascimento do primeiro bezerro produzido totalmente in vitro (LU et

al., 1988) despertou o interesse de vários laboratórios mundiais para a

produção in vitro de embriões (PIVE). Por meio desta biotecnologia, pode-se

obter uma produção média de uma gestação por vaca/semana (DODE &

RUMPF, 2002), o que permite uma rápida multiplicação de genótipos

superiores previamente selecionados, uma diminuição no intervalo de

gerações, propiciando uma maior intensidade de seleção, do que por outros

processos como a transferência de embriões (TE). Estima-se que a PIVE

possa aumentar o ganho genético anual acima de 10%, quando aplicada

apropriadamente, principalmente pela possibilidade de cruzamentos fatoriais,

diminuindo a taxa de consangüinidade, bem como pela utilização de fêmeas

pre-púberes. Além disso, com a PIVE pode-se ter uma produção maciça de

animais mestiços, possibilitando a manutenção de rebanhos com o grau de

sangue desejado, o que é impossível com o uso da monta natural e

inseminação artificial (ARENDONK & BIJMA, 2003).

Durante o processo de produção in vitro de embriões bovinos, cerca de

90% dos oócitos são capazes de atingir a maturação nuclear (progredindo de

prófase I a metáfase II) e aproximadamente 80% dos que são fertilizados

concluem pelo menos o segundo ciclo celular (GORDON, 1994). Do total de

oócitos fertilizados, apenas 30% a 40% dão origem a embriões que

eventualmente alcançam o estádio de blastocisto (LONERGAN et al., 2003),

sendo que o restante sofre algum tipo de bloqueio que leva à interrupção do

desenvolvimento.

Em geral, o potencial de desenvolvimento embrionário está associado

a características do oócito (folículo de origem, morfologia, estado de

poliadenilação), à cinética das primeiras clivagens (BREVINI et al., 2002;

LONERGAN et al., 2003; MEIRELLES et al., 2004) e a interações com os

sistemas de cultivo (NIEMANN & WRENZYCKI, 2000; WATSON et al., 2000;

NATALE et al., 2001; NIEMANN & WRENZYCKI, 2003; GUTIERRÉZ-ADAN et

al., 2004).

Diversas alterações encontradas nos embriões produzidos in vitro

podem estar relacionadas às condições adversas de cultivo, às quais os

embriões são expostos nesse sistema de produção, o que acaba influenciando

sua qualidade (KHURANA & NIEMANN, 2000).

2.2- Período pré-implantacional em embriões bovinos

No período de 24 a 36h após a fecundação, o zigoto contendo uma

célula divide-se em dois e, 24h mais tarde, o embrião já possui quatro células.

A divisão dos blastômeros pode ocorrer de forma assincrônica, razão pela qual

é possível observar em estádios iniciais um número ímpar de células. Ao

chegar ao estádio de 32 blastômeros, sua forma assemelha-se a uma amora,

razão pela qual é denominado mórula inicial, onde sua massa ocupa quase

todo o espaço perivitelínico (PALMA, 2001).

O estádio de mórula compacta (Mc), com aproximadamente 32-64

blastômeros, forma uma massa compacta que ocupa 60%-70% do espaço

perivitelínico. A compactação é considerada um dos sinais de diferenciação

embrionária. Ainda assim, os blastômeros continuam com sua capacidade

totipotente (SENGER, 2003). Os eventos celulares relacionados com a

compactação compreendem: o desenvolvimento da adesão celular dependente

de cálcio, o estabelecimento das junções gap mediadas pela comunicação

interblastomérica, a iniciação do contato celular induzido pela polarização das

células e o aparecimento de junções tight (WATSON & BARCROFT, 2001;

STANTON et al, 2003).

O estádio de blastocisto inicial (Bi) é identificado com

aproximadamente 100-200 células e caracteriza-se pelo começo do transporte

de fluido nas células trofoectodérmicas e pela formação de uma cavidade

(blastocele) no interior do embrião. O Bi ocupa cerca de 70%-80% do espaço

perivitelínico. Neste estádio já é possível diferenciar o trofoderma (TE) da

massa celular interna (MCI) (SENGER, 2003). O trofoderma é o primeiro tipo

celular a se diferenciar, formando a camada mais externa do blastocisto que

tem a função de, entre outras finalidades, iniciar o contato com o endométrio

materno, propiciando a implantação. Para tal é necessário que ocorra a

polarização celular caracterizada pelo estabelecimento de componentes da

superfície celular (microvilosidades apicais e receptores associados à lecitina);

pela distribuição assimétrica de proteínas de membranas; pelos componentes

específicos no citoplasma como agregação apical da actina e vesículas

endocíticas; e pela migração basal das mitocôndrias e vesículas lipídicas

(WATSON & BARCROFT, 2001).

A partir da polarização, o trofoderma adquire capacidade de iniciar e

regular os eventos de cavitação, pela expressão de produtos de genes que

facilitam o transporte e a retenção de fluido na cavidade blastocística nascente

(WATSON et al., 2004). Para a produção e acúmulo de fluido na blastocele são

necessários mecanismos de transporte de íons no trofoderma. O transporte

ativo é requerido para o movimento de íons contra seu gradiente de

concentração. O transporte de aminoácidos, como a glicina e a alanina, é feito

por um mecanismo dependente de sódio que se desenvolve no blastocisto. In

vitro, o transporte vetorial de Na+ e Cl- do meio é essencial para o início e

progressão da cavitação (WATSON & BARCROFT, 2001).

O estádio de blastocisto (Bl) possui um número de células semelhante

ao Bi, sendo que a blastocele já é bem visualizada e existe uma marcada

diferenciação entre as células trofoblásticas, formando uma camada que se

encontra aderida à zona pelúcida e a massa celular interna (SENGER, 2003).

Já o blastocisto expandido (Bx) apresenta-se com mais de 200 células.

Seu diâmetro aumenta consideravelmente (1,2 a 1,5 vezes), e, como

conseqüência, a zona pelúcida tem sua espessura diminuída a cerca de 1/3 da

espessura inicial. A pressão crescente do blastocisto em desenvolvimento

provoca a ruptura da zona pelúcida, começando assim o processo de eclosão.

Os blastocistos recuperados neste estádio podem se colabar temporariamente,

em decorrência de uma perda parcial ou total da blastocele (PALMA, 2001).

No estádio de blastocisto eclodido (Be), onde o número de células

pode variar de 200 a 800 células, os embriões já se encontram fora da zona

pelúcida, apresentando blastocele bem definida ou colabada (SENGER, 2003).

Um embrião capaz de eclodir não necessariamente implanta-se após a

transferência, caso haja um número insuficiente de células da MCI, que são

necessárias para garantir o desenvolvimento completo. Um pequeno

percentual dos embriões eclodidos quando avaliados podem ser considerados

como nada mais que vesículas trofoblásticas, uma vez que embriões com uma

MCI pequena ou ausente são capazes de eclodir, mas não se implantam

(SENGER, 2003).

Sabe-se que embriões produzidos in vitro apresentam significativas

diferenças em relação ao metabolismo, à morfologia, densidade, número de

células e características de zona pelúcida, apresentando qualidade inferior aos

produzidos in vivo. Os blastômeros são em geral mais escuros nos embriões

produzidos in vitro e as uniões celulares são anormais, razão pela qual a

compactação das mórulas, como passo prévio da blastulação, quase não se

observa (KHURANA & NIEMANN, 2000). A formação da blastocele em mórulas

produzidas in vitro normalmente ocorre de forma difusa e não localizada, como

in vivo. Este estádio pode ser caracterizado como mórula cavitacional, pela

presença de pequenas cavidades que darão origem à blastocele (PALMA,

2001). O número de células nos blastocistos produzidos in vitro pode ser menor

do que o encontrado em embriões produzidos in vivo, particularmente na MCI,

que pode se apresentar de forma desorganizada. In vivo, as células da MCI

estão presentes em uma proporção de 21%-27% dos blastocistos, enquanto in

vitro esta proporção corresponde a 12%-15%. O estabelecimento de uma

correlação da proporção de MCI:TE é considerado essencial para assegurar a

viabilidade embrionária. Embora ainda não se tenha determinado uma razão

ideal, tem-se adotado valores de 1:2 (AVELINO, 2004).

A fragmentação de blastômeros é mais difícil de ser graduada em

embriões produzidos in vitro, devido à falha na compactação, além de estar

associada com aberrações cromossômicas. Blastômeros anucleados têm sido

observados em embriões bovinos com morfologia de qualidade inferior. Ainda

não se sabe se os blastômeros anucleados representam citoplasma expelido

ou células estacionadas, em que o material nuclear foi totalmente fragmentado

(VAN SOOM et al., 1997). A incidência de anormalidades de cariótipo nos

embriões obtidos in vivo é de 2%-20%; entretanto, as mesmas são eliminadas

em grande parte por meio de seleção natural. Nos embriões produzidos in vitro

a freqüência de anormalidades é de 10%-45% e, como consequência do

cultivo, não são eliminadas. A maior parte das anormalidades apresenta-se no

trofoderma, em forma de mixploidias e poliplodias (VIUFF et al., 1999, 2000).

2.3 – Cinética de desenvolvimento embrionário

A razão pela qual clivagens mais rápidas acontecem em embriões com

maior capacidade de desenvolvimento ainda não é conhecida. A falha ou

atraso na primeira divisão da clivagem pode estar relacionada com a

competência citoplasmática, devido a uma falha das macromoléculas derivadas

do oócito, necessárias para iniciar a embriogênese (WATSON et al., 2000;

NATALE et al., 2001; NIEMANN e WRENZYCKI, 2003). Esta falha

citoplasmática também pode ser manifestada por uma falha na ativação do

genoma embrionário, podendo explicar uma relação entre as primeiras

clivagens e a competência de desenvolvimento (RIZOS et al., 2003).

Existem evidências de que a nova síntese de RNA, codificada pelo

genoma embrionário, é iniciada no estágio de duas a quatro células em

bovinos, sem um pico de transcrição diferenciada. Em embriões de duas

células com crescimento tardio, a síntese de RNA não tem sido evidenciada, o

que poderia ser explicado por sinais insuficientes no oócito necessários para

ativação do genoma embrionário (WARD et al., 2001).

GUTIERRÉZ-ADAN et al (2004) demonstraram claramente a relação

entre o momento da primeira clivagem pós-inseminação in vitro e a

competência de desenvolvimento dos zigotos clivados inicialmente. Estes

autores verificaram ainda que este momento da primeira clivagem está

relacionado com o estado de poliadenilação de vários genes transcritos

importantes. LONERGAN et al. (2003) relataram diferenças na expressão

gênica de embriões em estádio inicial, relacionadas à competência de

desenvolvimento entre zigotos de clivagem inicial, rápida e tardia.

Condições de cultivo podem influenciar na cinética de desenvolvimento

inicial, porém alguns fatores que controlam estes parâmetros são intrínsecos

ao oócito, ao espermatozóide ou a ambos (DE SOUSA et al., 1998). A

velocidade de desenvolvimento em estádio de clivagem inicial pode ser

manipulada pela adição de suplementos ao meio de cultivo, particularmente o

soro fetal (RIZOS et al., 2003). Estudos demonstraram que o ambiente pós-

fertilização altera significativamente os padrões de transcritos em embriões

bovinos, com algumas diferenças evidenciadas 10 horas após o início do

cultivo (LONERGAN et al., 2003).

2.4- Cultivo in vitro de embriões bovinos

A partir da década de 70, começaram a ser desenvolvidos os primeiros

meios de cultivo, com sucesso para embriões bovinos e ovinos. Entretanto,

neste período existiam relatos conflitantes a respeito dos requerimentos

necessários para se transpor o bloqueio do desenvolvimento embrionário entre

8-16 células (DE SOUSA et al., 1998). A partir de então, houve aumento

significativo na implementação de sistemas de co-cultivo com células

somáticas. Estas são responsáveis por secretarem fatores embriotróficos que

simulam in vitro o ambiente uterino (GANDOLFI & MOOR, 1987). Diversos

trabalhos mostram que vários tipos de células podem ser usados na co-cultura,

como células uterinas, da granulosa, do oviduto, do cumulus, Vero, Buffalo Rat

Liver (BRL), etc. (HASLER, 2000). Contudo, a utilização de células somáticas

em sistemas de cultivo pode levar à contaminação dos embriões por

patógenos. Além da preocupação com os riscos de contaminação, a

variabilidade biológica entre as células obtidas de animais diferentes pode

acrescentar maior variação nos resultados de produção de embriões (LANE et

al., 2003; HOSHI, 2003).

Uma das alternativas aos sistemas de co-cultivo foi à utilização de

fontes protéicas, pois estas aumentam a quantidade e qualidade das estruturas

que atingem o estádio de blastocisto (RORIE et al., 1994). Essa suplementação

parece reduzir a embriotoxicidade causada por produtos provenientes do

metabolismo embrionário. As fontes protéicas mais utilizadas em sistemas de

cultivo in vitro são o soro fetal bovino (SFB) e a albumina sérica bovina (BSA)

(LONERGAN et al, 1999). O soro apresenta-se como uma mistura complexa de

substâncias conhecidas e não definidas, e de fatores de crescimento que

desempenham papel importante no desenvolvimento embrionário (HOLM et al.,

1999). Por outro lado, apesar dos processos de extração e purificação, podem

estar adsorvidos ao BSA diferentes proteínas, substratos energéticos e fatores

de crescimento (BAVISTER, 1995; LONERGAN et al., 2006), corroborando

com os resultados de que as propriedades embriotróficas do BSA podem variar

entre fornecedores e partidas (VAN WAGTENDONK-DE LEEUW et al., 2000).

O interesse em estudos utilizando meios livres de proteína estaria no

fato de evitar os riscos biológicos oferecidos pelo soro e/ou albumina,

principalmente nos países em que esses produtos não são considerados livres

de patógenos (KURAN et al., 2002), como no caso dos príons no Reino Unido.

HOLM et al. (1999) conseguiram sucesso na produção de blastocistos

na ausência de soro ou de BSA utilizando o chamado meio quimicamente

definido. Esses meios são constituídos por substâncias previamente

conhecidas como aminoácidos, macromoléculas (polivinilalcool,

polivinilpirrolidona e ácido hialurônico), fatores de crescimento e suplementos

sintéticos (HOSHI, 2003), evitando os efeitos da variabilidade na composição

dos meios, bem como os riscos de contaminação dos embriões a serem

produzidos. O sucesso do sistema de cultivo semi-definido (com reduzida

quantidade de BSA) ou definido envolve tanto a utilização de concentrações

conhecidas de seus componentes, como a utilização de ambiente atmosférico

com menor concentração de O2 (5-7%) do que a utilizada em sistemas de

cultivo que fazem uso do soro, reduzindo a formação de radicais livres,

prejudiciais ao embrião.

Embora a tensão de oxigênio (O2) no oviduto e útero seja menor (3,5%

a 8,5%) do que no ar atmosférico (20%), a condição de O2 atmosférico é

utilizada rotineiramente no cultivo de embriões mamíferos (VAN SOON et al.,

2002). Em estudos onde a tensão de O2 foi reduzida de 20% para 5% foi

observada uma maior taxa de desenvolvimento embrionário em várias espécies

(YUAN et al., 2003; HOSHI, 2003; KITAGAWA et al, 2004). A baixa tensão de

O2 leva à diminuição da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS)

intracelular que induzem a apoptose, permitindo ainda que a atividade

metabólica desses embriões esteja mais próxima daqueles produzidos in vivo

(CORREA et al., 2007). Segundo PEREIRA et al. (2005), as células do cumulus

que são mantidas com os zigotos após a FIV removem as substâncias tóxicas

do meio de cultura. Conseqüentemente, o estresse oxidativo causado por uma

maior tensão de O2 seria minimizado pela presença destas células, de forma

que a produção de embriões seria similar em ambos os sistemas (FATEHI et

al, 2005).

A tensão de CO2 utilizada no cultivo embrionário varia entre 5%-7%, e

a manutenção desse nível também é importante para o sucesso de um sistema

de produção in vitro de embriões, uma vez que a queda dessa tensão aumenta

o pH intracelular e diminui o desenvolvimento embrionário (YUAN et al., 2003;

KITAGAWA et al., 2004).

Na contínua busca por embriões de melhor qualidade, surgiram os

sistemas de cultivo utilizando meios seqüenciais, que foram elaborados com o

intuito de suprir as diferentes necessidades do embrião de acordo com seu

estádio de desenvolvimento e as condições encontradas nos diversos pontos

do trato reprodutivo feminino (GARDNER & LANE, 2003). Atualmente, existem

meios seqüenciais comerciais disponíveis para o cultivo embrionário em

humanos como o G1.2/G2.2 e o M1/M2 (ZOLLNER et al., 2004). Em bovinos, o

uso de meios seqüenciais também parece promissor, principalmente na

substituição de meios com co-cultura e soro. LANE et al. (2003), usando o meio

G1.2/G2.2, obtiveram resultados de produção de embriões semelhantes aos de

co-cultura de BRL com 10% de SFB; porém, a proporção de embriões machos

e fêmeas não foi diferente no meio seqüencial, enquanto maior taxa de

embriões do sexo masculino foi observada na co-cultura com soro. A utilização

de meio KSOM com 0,1% de BSA até o dia quatro do cultivo, seguido do

cultivo em meio sintético de fluido do oviduto (SOF) com 5% de soro até o dia

nove, também proporcionou a produção de blastocistos de melhor qualidade

(NEDAMBALE et al., 2004). Atualmente existe a possibilidade de se cultivar

embriões em micro canais, utilizando um equipamento microfluídico, o que

permite o cultivo em um menor volume de meio, quando comparado com micro

gotas, e a mudança gradual do meio de cultivo sem a manipulação do embrião,

tornando o ambiente físico mais parecido com o do trato reprodutivo, com

maiores chances de proporcionar um melhor ambiente in vitro (QUINN, 2004).

Como citado anteriormente, embriões produzidos in vitro possuem

qualidade morfológica e fisiológica inferior aos produzidos in vivo. Por essas

razões as pesquisas envolvendo meios de cultivo embrionário são importantes

para melhorar a qualidade dos embriões in vitro a fim de que se possa

aproximá-la dos blastocistos produzidos in vivo.

2.5- Soro fetal bovino (SFB) no cultivo in vitro de embriões

O SFB pode fornecer vários fatores benéficos ao embrião, como

aminoácidos, vitaminas, fatores de crescimento, substratos energéticos, bem

como proteção contra radicais livres, mas também pode carrear fatores

embriotóxicos. A adição de soro em meios de cultivo geralmente melhora a

taxa de produção de blastocisto (GOMES & DIEZ, 2000) e seu efeito tem

caráter bifásico; ou seja, inibe as primeiras divisões celulares, mas estimula o

desenvolvimento embrionário posterior (CAMARGO et al., 2002). A adição de

soro acelera a cinética do desenvolvimento embrionário após as primeiras

divisões celulares, pois promove blastulação prematura e aumenta a

porcentagem total de blastocistos com maior número de células e taxa de

eclosão (LONERGAN et al., 1999). Embriões cultivados em presença de soro

apresentaram acúmulo de lipídeos citoplasmáticos, os quais são responsáveis

por uma maior sensibilidades desses embriões a processos de criopreservação

(ABE et al., 2002; RIZOS et al., 2003). O SFB pode aumentar a proporção de

embriões masculinos (GUTIERRÉZ-ADAN et al., 2001), causar alterações no

metabolismo (KHURANA & NIEMANN, 2000), diminuir a densidade de

organelas (CROSIER et al., 2000), alterar a estrutura mitocondrial (FARIN et

al., 2001) e aumentar a incidência de apoptose (KNIJN et al., 2003).

LONERGAN e seus colaboradores (2006) relataram o aumento da expressão

de genes ligados ao estresse, em embriões cultivados em presença de SFB. A

utilização do SFB no meio de cultivo tem sido apresentada como uma das

responsáveis pelo surgimento de diversas alterações fenotípicas observadas

durante a gestação e no recém-nascido, como distúrbios placentários e

excesso de peso ao nascimento, eventos estes relacionados à Síndrome do

Bezerro Grande (LOS - “Large Offspring Syndrome”) (Mc EVOY, 2003;

LONERGAN, et al., 2006). Diante dessas evidências, vários grupos de

pesquisa vêm buscando utilizar suplementos sintéticos livres de soro de forma

a minimizar ou eliminar os danos causados pelo soro.

2.6- Knockout Serum Replacer (KSR) como substituto do SFB

Os suplementos sintéticos, utilizados como substitutos de proteínas

animais para o crescimento in vitro de células indiferenciadas, representam

uma alternativa para produção in vitro de embriões bovinos. O Knockout Serum

Replacer (KSR) é um suplemento quimicamente definido que foi desenvolvido

para isolamento e manutenção de células tronco embrionárias, oriundas da

massa celular interna de blastocistos (GOLDSBOROUGH et al., 1998, BRYJA

et al, 2006). Além disso, também pode ser utilizado para estabelecimento de

linhagens celulares, seleção de drogas para células alvo, congelamento de

células e meios de manutenção para injeção de células tronco em blastocistos

(HORII et al, 2003). Por ser um produto patenteado, sua composição química

não é divulgada. No entanto, é comercializado como um suplemento livre de

soro que contém aminoácidos, glicose, insulina, transferrina, antioxidantes, sais

inorgânicos, oligoelementos e um mix de proteínas e vitaminas. Não contém

fatores de crescimento, citocinas, hormônios, imunoglobulinas ou

macromoléculas como PVA ou PVP. Sua formulação garante repetibilidade de

resultados, em comparação com a variabilidade de resultados obtidos com o

uso do soro (MOORE et al., 2007).

Corroborando com os achados de RODRIGUEZ-SALLABERRY et al

(2002), SORIA et al (2005) sugeriram que o KSR pode ser utilizado como

substituto do soro no cultivo de embriões produzidos in vitro. Entretanto, ainda

não existe muito embasamento na literatura a respeito dos efeitos que o KSR

pode causar na qualidade morfológica e nos níveis de expressão gênica de

embriões bovinos produzidos in vitro.

2.7- Resposta embrionária as condições de estresse

As modificações celulares associadas ao estresse são resultantes de

um processo multifatorial que envolve alterações no percentual de ácidos

graxos da membrana lipídica, bem como a inibição da síntese de substâncias

antioxidantes (ZERON et al., 2001; AL-KATANANI & HANSEN, 2002; PAULA-

LOPES et al., 2003). Um desses fatores de grande importância, envolvido no

processo de resposta ao estresse, é a síntese de um grupo de proteínas

altamente especializadas denominadas proteínas do choque térmico (Hsp)

(BECKER & CRAIG, 1994).

As Hsps podem ser classificadas em dois grupos principais, as formas

constitutivas e as induzidas. As Hsps sintetizadas de forma constante, sem

estímulo de estresse, são as constitutivas. As induzidas são sintetizadas

apenas sob estímulo de calor ou outro agente estressante (JU, 2005). No caso

do estresse térmico e em certos estados patológicos, ocorre ativação de

fatores de choque térmico (Hsfs) que penetram no núcleo celular e se ligam

aos elementos de choque térmico (Hses). Estes representam o sítio de ligação

no DNA para ativação e expressão dos genes de choque térmico e síntese das

Hsps (JU, 2005). Dentre as funções exercidas pelos genes de Hsps, estão

incluídas a modulação da atividade da proteína, a regulação da degradação da

proteína e o transporte das mesmas através das organelas, além de assegurar

a conformação correta das proteínas (TAKAYAMA et al., 2003).

O Hsp70.1 é um gene expresso em níveis semelhantes em todas as

células, ou seja, um gene constitutivo, e sua expressão é reflexo de estresse

celular (PEDERSEN et al., 2005). Evidências sugerem que a HSP70

desempenha um importante papel no processo de fertilização e no

desenvolvimento embrionário (WRENZYCKI et al., 2005). MATWEE et al.

(2000) observaram que a distribuição do Hsp70.1 em espermatozóides bovinos

está relacionada com a interação entre os gametas. Foi demonstrado que

embriões bovinos podem sofrer transcrição de Hsp70.1 em resposta ao choque

térmico já na fase de duas células (CHANDOLIA et al., 1999). Segundo

PEDERSEN et al. (2005), a expressão gênica embrionária pode ser modificada

em resposta a alterações do ambiente, o que provavelmente é uma tentativa do

embrião para estabilizar sua função celular. Corroborando com estes autores,

LONERGAN et al (2006) observaram o aumento da abundância relativa de

Hsp70.1 em embriões cultivados em condições adversas.

A exposição a situações de estresse ocasiona alterações ultra-

estruturais observadas em oócitos e embriões, dentre as quais estão a

redistribuição de organelas na região cortical e agregação citoplasmática,

vacuolização e rompimento da membrana e/ou matriz mitocondrial, culminando

num processo de apoptose e morte celular (LI et al. 2000). A habilidade em

regular a morte celular tem sido reconhecida como uma das funções das

Hsp70.1, podendo contribuir com seu efeito protetor nas células, mas esse

mecanismo ainda não foi esclarecido (MATWEE et al., 2000; PARK et al.,

2006).

2.8 - Apoptose em embriões produzidos in vitro

Apoptose é um processo usado por organismos multicelulares para

regular o número de células ou eliminar células que se tornaram

potencialmente prejudiciais ao organismo. Em nível celular, a apoptose é

caracterizada pela condensação da cromatina, fragmentação do DNA e

fagocitose, fragmentação citoplasmática e nuclear (MAKAREVICH &

MARKKULA, 2002). Durante as fases finais do processo apoptótico, extensões

da membrana plasmática circundam e delimitam os corpos apoptóticos que

podem ser fagocitados por células circunvizinhas, ou expulsos para o lúmen

adjacente (MATWEE et al., 2000). Os eventos moleculares envolvidos no

processo apoptótico são divididos em fase de indução (upstream) e fase de

execução (downstream). Essa segunda fase é caracterizada pela ativação das

caspazes citoplasmáticas, seguida pela fase de degradação celular (MATWEE

et al, 2000). Para tal, a proteína Bax (regulador de apoptose em Bos taurus

box-α) atua na membrana mitocondrial levando à liberação do citocromo c, que

é um ativador da cascata de caspazes, sendo estas responsáveis pela

degradação de proteínas nucleares e do citoesqueleto (DEPRAETERE &

GOLSTEIN, 1998).

Em embriões em estádio pré-implantacional, a apoptose pode ser

considerada um processo normal com importante papel durante o

desenvolvimento, funcionando inclusive como um indicador da qualidade do

embrião (BYRNE et al., 1999). Entretanto, quando o número ou razão de

células apoptóticas por células normais aumenta, esse evento torna-se

prejudicial ao desenvolvimento embrionário, interferindo em sua qualidade

(LEVY, 2001). A incidência de apoptose é maior em embriões produzidos in

vitro do que in vivo (KNINJ et al., 2003), provavelmente induzida pelo estresse

provocado pelo cultivo in vitro, envolvendo atraso no desenvolvimento

embrionário acompanhado de fragmentação celular (JURISICOVA & ACTON,

2004). O soro no cultivo in vitro de embriões pode ser um dos agentes

responsáveis pela maior incidência de embriões com alto índice de células

apoptóticas (BYRNE et al., 1999). Maior quantidade relativa de transcritos do

gene Bax, codificador da proteína pró-apoptótica, foi observada em embriões

bovinos cultivados na presença de soro (RIZOS et al., 2003). Em embriões

suínos cultivados in vitro, o soro aumentou a incidência de apoptoses e

expressão de alguns genes pró-apoptóticos (CUI et al., 2005). Portanto, a

eliminação do soro de meios de cultivo pode contribuir para aumentar a

viabilidade de embriões bovinos produzidos in vitro, por meio da redução da

incidência de apoptose.

2.9 - Expressão Gênica em embriões bovinos

O termo expressão gênica refere-se ao processo pelo qual a

informação genética contida num gene específico é traduzida em uma proteína

específica que exercerá sua função na célula ou fora dela (WILHELM, 2003).

Esse processo se dá por uma cascata de eventos, regulados por ligações de

proteínas a uma seqüência regulatória de DNA, que ativam sinais bioquímicos

em cadeia, resultando na ativação ou repressão de diversos genes. Estes

coordenam o ciclo celular através de fatores de crescimento, hormônios,

citocinas, fatores de transcrição e enzimas de controle de replicação do DNA

(LOURO, 2002). O genoma funcional que resulta deste conjunto de fatores é

responsável por explorar o papel de numerosos ligantes e receptores que

convergem sobre a regulação transcripcional (BUSTIN & NOLAN, 2004).

Os genes expressos podem ser constitutivos (housekeeping) ou

induzidos. Os constitutivos são expressos em todas as células e responsáveis

por funções comuns, como os genes de tRNA e rRNA, proteínas ribossômicas

ou proteínas próprias do metabolismo celular. Os induzidos correspondem

àqueles responsáveis por funções específicas, sendo expressos a partir de um

determinado estímulo (RAMALHO, 2000).

Uma das causas da baixa eficiência das biotecnias da reprodução é a

expressão desbalanceada de genes importantes para o desenvolvimento. Já

foram identificados vários genes com expressão alterada em embriões bovinos

produzidos in vitro, tais como genes ligados ao cromossomo X (G6PD e PGK;

WRENZYCKI et al., 2002), à apoptose e ao “stress” térmico e oxidativo

(Hsp70.1, Bax, SOD e SOX; OLIVEIRA et al., 2005; PEDERSEN et al., 2005;

BALASUBRAMANIAN et al., 2007; SAGIRKAYA et al., 2007), ao transporte de

glicose (Glut-3 e Glut- 4; KNIJN et al, 2005), à comunicação celular (Cx43 e

Cx31; RIZOS et al., 2002), à diferenciação (LIF, LR-β; LAZZARI et al., 2002;

RIZOS et al., 2002), a genes “imprinted” (MOORE & REIK, 1996; YOUNG &

FAIRBURN, 2000) e a DNA metiltransferases (RYCKE et al., 2002).

A quantificação de transcritos pode ser realizada por vários métodos,

dentre eles: Northern Blot, hibridização in situ e transcrição reversa associada

com reação em cadeia da enzima polimerase (RT-PCR). Os dois primeiros

métodos possuem grande limitação provocada pela baixa sensibilidade

(BUSTIN, 2000), exigindo grande quantidade de material inicial, o que restringe

seu uso para amostras pequenas ou com transcritos raros, além de consumir

mais tempo na sua execução e análise. O método de RT-PCR permite a

análise de diferentes amostras em um mesmo experimento, é mais sensível e

flexível, e pode ser usado para quantificar e caracterizar padrões de expressão

de RNA mensageiros (BUSTIN, 2000). Esse método também exige menos

tempo e, atualmente, é o mais utilizado para analisar níveis de RNAm em

diferentes populações (BUSTIN, 2002). Contudo, a quantificação por meio de

RT-PCR também possui limitações. A eficiência da transcrição reversa e da

amplificação durante o PCR sofre influência de diversos fatores, como

eficiência da enzima e dos oligonucleotídeos, concentração inicial da amostra,

de nucleotídeos e de outros componentes e, devido ao poder de amplificação

da reação de PCR, pequenas alterações na eficiência da amplificação podem

provocar grandes diferenças no produto final (LECHNIAK, 2002).

O Real Time – PCR é uma tecnologia que consiste no monitoramento

dos ciclos de amplificação em tempo real através de técnicas de fluorescência.

Essa tecnologia tem sido largamente utilizada para estimar os níveis de

expressão dos genes de interesse na neurociência, na biologia do

desenvolvimento e em diagnósticos médicos (BUSTIN, 2000; RAMAKERS et

al. 2003). As amostras são quantificadas utilizando-se o número de ciclos

necessários para que o acúmulo do produto de PCR, representado pela

fluorescência emitida, atinja determinado nível ou ponto considerado como

estatisticamente significante (linha limiar) (BONDIN, et al., 2005). Esse método

fornece também maior sensibilidade e precisão, podendo detectar poucas

cópias de DNA com baixo coeficiente de variação nas análises de PCR (KLEIN,

2002), além de não ser totalmente necessário realizar leitura do produto em gel

de eletroforese. Ao final da reação pode ser realizada curva de desnaturação

para identificar a presença de contaminantes, pela análise da temperatura de

desnaturação.

A quantificação do material analisado pode ser absoluta, obtendo-se o

número de moléculas de cDNA presente na amostra; ou relativa, onde a

quantidade de cDNA presente na amostra é comparada a uma amostra de

referência, denominada calibrador. Nesse caso, o resultado é obtido através da

análise do valor Ct (threshold cycle), que corresponde ao número de ciclos

necessários para a amostra emitir energia suficiente para alcançar um limiar,

na fase exponencial da amplificação, que é definido aleatoriamente

(SCHMITTGEN, 2000; BONDIN et al., 2005).

Os valores Ct do gene alvo e do controle endógeno são determinados

em cada amostra, e a diferença entre os valores Ct é denominada ∆Ct. Este é

subtraído do valor ∆Ct do calibrador (∆Ct (calibrador) - ∆Ct (controle endógeno)). A

diferença será o valor ∆∆Ct. A quantia do alvo é dada, normalizada ao controle

endógeno, e relativa ao calibrador, pela fórmula 2-∆∆Ct. Para que o método

comparativo ∆Ct seja validado, a eficiência de amplificação do alvo e do

controle endógeno deve ser igual. Para isso, diluições diferentes de cDNA são

preparadas e amplificadas (LEUTENEGGER, 2000; RAMAKERS, 2003).

3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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4. TRABALHOS

Os trabalhos a seguir foram elaborados segundo as normas do Periódico Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia com algumas adaptações às normas para elaboração de tese do curso de Pós-Graduação em Produção Animal da Universidade Estadual do Norte Fluminense – Darcy Ribeiro (UENF).

DESENVOLVIMENTO DE EMBRIÕES BOVINOS CULTIVADOS IN VITRO EM MEIO SUPLEMENTADO COM SUBSTITUTO DO SORO FETAL BOVINO

RESUMO

Este estudo teve como objetivo avaliar o efeito de um suplemento

quimicamente definido substituto do soro (KnockoutTM SR; Gibco Labs., Grand

Island, NY) na qualidade e no desenvolvimento de embriões bovinos

fertilizados in vitro. CCOs obtidos a partir de ovários coletados em matadouro

foram maturados e fertilizados in vitro. Os possíveis zigotos foram divididos

aleatoriamente em três grupos e cultivados em meio CR2aa suplementado

com: 10% soro fetal bovino (SFB); 10% Knockout SR (KSR), ou 3mg/ml de

polivinilalcool (PVA-controle). A taxa de clivagem foi determinada 72 horas pós-

fertilização (hpf) e a taxa de blastocistos (D7) 168 hpf. O número total de

células foi determinado 192 hpf (D8). O desenvolvimento foi avaliado pelas

taxas de embriões de 4-8 células, embriões ≥ 8 células, blastocistos iniciais

(Bi), blastocistos (Bl) e blastocistos expandidos (Bx). As taxas de clivagem e

blastocisto foram analisadas por Kruskal Wallis; o número total de células, por

ANOVA; e as médias comparadas, por Student Newman Keuls. A taxa de

clivagem não diferiu entre os grupos (P>0,05). No entanto, as taxas de

blastocistos e o número total de células foram semelhantes entre o KSR e o

SFB (P>0,05), sendo os dois superiores ao PVA (P<0,01). Não houve diferença

(P>0,05) na avaliação dos parâmetros de desenvolvimento entre os grupos,

exceto na taxa de Bx onde o PVA apresentou resultado inferior (P<0,05) aos

obtidos no SFB e no KSR. Os embriões cultivados em presença de KSR

apresentaram padrões de desenvolvimento e qualidade semelhantes aos

cultivados em presença de soro. Contudo, o KSR proporcionou uma maior taxa

de desenvolvimento e melhor qualidade de blastocisto do que o PVA. Conclui-

se que o KSR pode sustentar o desenvolvimento de embriões bovinos

fertilizados in vitro quando meios de cultivo livres de soro forem recomendados.

Palavras-chave: bovino, desenvolvimento embrionário, cultivo in vitro, sistema semi-definido.

DEVELOPMENT OF BOVINE EMBRYOS IN VITRO CULTURED IN SUPPLEMENTED MEDIUM WITH FETAL CALF SERUM REPLACEMENT

ABSTRACT

Our aim with this study was evaluate the effect of a defined supplement

as a serum replacer (KnockoutTM SR; Gibco Labs., Grand Island, NY) in the

quality and development grade of in vitro fertilized bovine embryos. COCs

collected in slaughterhouse were in vitro matured and fertilized. The

presumptive zygotes were randomly distributed in three groups of medium

culture CR2aa supplemented with 10% of fetal calf serum (FCS); 10% knockout

serum replacer (KSR),or 3 mg/ml of polyvinyl alcohol (PVA - control). Cleavage

rate was determined 72 hours post-fertilization, and blastocyst rate was

determined (D7) 168 hours post-fertilization. The total number cells were

determined 192 hpf (D8). Development was evaluated with 4-8 cells embryos

rate, ≥ 8 cells embryos, early blastocyst, blastocyst and expanded blastocyst.

Data of cleavage and blastocyst rate were analyzed by Kruskal Wallis and total

cell number by analyses of variance and means compared by Student Newman

Keuls. No significant difference on cleavage rate (P>0.05) was found among

groups. However, blastocyst rates and total number cells were similar between

KSR and FCS (P>0.05), and higher in both groups than in PVA (P<0.01). These

were no differences (P>0, 05) in evaluation of development parameters among

groups, except at expanded blastocyst rate, where PVA presented lower results

(P<0, 05) than FCS and KSR. In spite of supplementation with KSR in the

medium culture lead to a smaller blastocyst rate compared to FCS, total number

of cells and development kinetics were not affected. However, KSR lead to a

higher embryo development rate than PVA. In conclusion KSR may support the

development of in vitro produced bovine embryos when serum free medium is

recommended.

Keywords: bovine, embryo development, in vitro culture, semi-defined system

INTRODUÇÃO

O período pré-implantacional do embrião bovino representa uma fase

muito dinâmica da embriogênese, onde uma única célula quiescente

desenvolve-se, formando um grupo celular com intensa atividade metabólica.

Esse desenvolvimento é controlado pela expressão de famílias de genes

responsáveis por direcionar um número significativo de eventos, dentre os

quais estão incluídos o início e continuação da clivagem, ativação do genoma

embrionário (MEIRELES et al., 2004), agregação e compactação dos

blastômeros, diferenciação celular, formação e expansão da blastocele e

eclosão da zona pelúcida (WRENZYCKI et al., 2005). O embrião de mamíferos

possui uma grande capacidade em adaptar-se às condições ambientais

subótimas, o que lhe permite sobreviver em diferentes condições de cultivo, as

quais podem conferir aos embriões produzidos in vitro uma diminuição da

competência de desenvolvimento, da taxa de clivagem, do número total de

células, da quantidade e qualidade de ligações intercelulares, da transcrição de

genes relacionados ao crescimento e diferenciação celular; além de um

acréscimo na quantidade de lipídeos intracelulares (McEVOY et al., 2003;

LONERGAN et al., 2006).

Diversos fatores podem influenciar o ambiente de cultivo, como a

composição dos meios, a suplementação protéica, o número de embriões na

gota de cultivo e a atmosfera gasosa (NATALE et al., 2001; NIEMANN &

WRENZYCKI, 2003; GUTIÉRREZ-ADÁN et al. 2004).

Na tentativa de otimizar a eficácia dos sistemas de cultivo, os meios de

cultivo vêm sendo suplementados com uma variedade de antioxidantes, fatores

de crescimento e/ou macromoléculas. Nesse contexto, a Albumina Sérica

Bovina (BSA) e o Soro Fetal bovino (SFB) são as fontes protéicas mais

utilizadas. Contudo, a BSA e o SFB são misturas complexas e indefinidas de

proteínas, fatores de crescimento e peptídeos (LIM et al., 2007). THOMPSON

(2000) demonstrou claramente que a BSA exerce um papel nutricional

substancial durante o desenvolvimento embrionário, especialmente durante a

compactação. Provavelmente por ser esta a proteína em maior abundância no

trato reprodutivo feminino de mamíferos (OYAMADA et al., 2004).

A adição de soro em meios de cultivo geralmente melhora a taxa de

produção de blastocistos (GOMES & DIEZ, 2000) e seu efeito tem caráter

bifásico, inibindo as primeiras divisões celulares e estimulando o

desenvolvimento embrionário posterior (CAMARGO et al., 2002). Entretanto, o

soro também pode aumentar o acúmulo de lipídeos citoplasmáticos, reduzir a

criotolerância dos embriões (RIZOS et al., 2003) e aumentar a proporção de

embriões masculinos (GUTIERREZ-ADAN et al., 2001); bem como causar

alterações no metabolismo (KHURANA & NIEMANN, 2000), na estrutura

mitocondrial e na ultra-estrutura (FARIN et al., 2001). Em função de o soro ser

apontado como um dos principais agentes envolvidos nessas alterações

embrionárias (Mc EVOY et al., 2003; RIZOS et al., 2003), um grande número

de estudos vem sendo conduzido visando à exclusão do mesmo dos sistemas

de cultivo.

O KnockoutTM Serum Replacer (KSR) é um suplemento para meio de

cultivo, quimicamente definido, amplamente utilizado como substituto do soro

no cultivo de células tronco, podendo ser utilizado para estabelecimento de

linhagens celulares, congelamento de células e meios de manutenção para

injeção de células tronco em blastocistos (HORII et al, 2003). Sendo assim, o

presente estudo teve como objetivo avaliar as taxas de clivagem, de produção

de blastocistos, o desenvolvimento embrionário e o número total de células de

embriões bovinos produzidos in vitro e cultivados em presença de KSR.

MATERIAL E MÉTODOS

Local do Experimento O experimento foi realizado no Laboratório de Reprodução Animal da

Embrapa Gado de Leite, localizado em Juiz de Fora, MG. Os reagentes químicos

utilizados foram da Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA, a menos que indicado.

Produção de in vitro de embriões Neste experimento, foi utilizado um total de 2556 possíveis zigotos,

obtidos em 23 repetições, distribuídos em três grupos. Os embriões foram

produzidos no período de janeiro a março dos anos de 2005 e 2006. Os oócitos

foram obtidos de ovários coletados de vacas abatidas em matadouro. Após o

abate e evisceração, os ovários foram coletados e colocados em garrafas térmicas

contendo solução fisiológica (0,9% NaCl) adicionada de antibiótico (0,05g/L de

sulfato de estreptomicina), aquecida a 31-34oC, sendo imediatamente

transportados para o laboratório.

Folículos com diâmetro entre 3 e 8 mm foram puncionados e o conteúdo

aspirado foi depositado em cálice cônico contendo meio TALP-Hepes (BAVISTER

et al., 1983a), previamente aquecido a 37oC. Foram selecionados os complexos

cumulus-oócitos (CCOs) apresentando citoplasma homogêneo com no mínimo

três camadas de células do cumulus compactas. Em seguida, os CCOs

selecionados foram lavados por mais duas vezes em meio TALP-Hepes e uma

vez em TCM-199 (Gibco). A maturação de 50 CCOs por poço de 400µl foi

realizada em TCM-199 (Gibco) acrescido de 10% de soro de vaca em cio (SVC) e

10µg/ml de FSH, por 24 horas. Após a maturação, 30 CCOs por gotas de 100µl de

meio Fert-Talp acrescido de heparina cobertas com óleo mineral foram

fecundados em uma concentração espermática de 2,0 x 106 espermatozóides/ml,

por um período de 18 a 22 horas. Após a fertilização, os possíveis zigotos foram

parcialmente desnudos e distribuídos aleatoriamente em três grupos na proporção

de 20 estruturas por gotas de 50 µl recobertas com óleo mineral. As estruturas

foram cultivadas em meio CR2aa suplementado com: 10% soro fetal bovino

(SFB); 10% Knockout SR (KSR), ou 3mg/ml de polivinilalcool (PVA-controle).

Todas as etapas foram realizadas em estufa incubadora, à temperatura de 38,5oC

e 95% de umidade, com 5% de CO2 em ar atmosférico.

Avaliação da clivagem e produção de embriões

Às 72 horas pós-fecundação (hpf), foi realizada a troca de 50% do volume

de cada gota do meio de cultivo. Em seguida, foi realizada a avaliação da taxa de

clivagem dos embriões dos três grupos. No sétimo dia de cultivo, foi avaliada a

formação de blastocisto.

Desenvolvimento embrionário

O desenvolvimento embrionário foi avaliado 72 hpf (D3) e 168 hpf (D7). No

D3, foram avaliadas as taxas de embriões que apresentavam 4-8 células e

embriões com mais de 8 células. Já no D7, foram avaliadas as taxas de

blastocistos iniciais, blastocistos e blastocistos expandidos em relação ao número

total de blastocistos (SENGER, 2003).

Contagem de células

Blastocistos de oito dias foram submetidos à coloração de Giemsa (Lim et

al. 1994) para determinação do número total de células. Os embriões foram

retirados da gota de cultivo, lavados duas vezes em PBS suplementado com 10%

SFB e transferidos para solução de citrato de sódio 0,9%, onde permaneceram por

um período de 10 a 20 minutos. Passada essa etapa, os embriões foram

transferidos um a um para uma solução fixadora [metanol (3): ácido acético (2):

água destilada (1)], onde permaneceram por um minuto. Em seguida, foram

transferidos para lâmina. Depois de seca, a lâmina foi corada com Giemsa, por 15

minutos. Passado esse período, a lâmina foi lavada, secada ao ar em temperatura

ambiente e, por fim, observada em microscópio óptico para realização da

contagem de células.

Análise Estatística O efeito dos tratamentos sobre a qualidade e o desenvolvimento

embrionário foi expresso pelas taxas de clivagem (estruturas clivadas /zigotos),

blastocistos totais (blastocistos totais/zigotos), embriões de 4-8 células, embriões

≥ 8 células, blastocisto iniciais, blastocistos, blastocistos expandidos e número

total de células. As taxas de clivagem e blastocistos foram analisadas pelo teste

Kruskal Wallis, e o número total de células, por ANOVA. As diferenças entre

médias foram comparadas pelo teste de Student Newman Keuls através do

procedimento GLM do pacote estatístico SAS. Os valores foram apresentados

como médias ± erro padrão (EP).

RESULTADOS

A suplementação do meio CR2 com soro fetal bovino (SFB), Knockout SR

(KSR) ou polivinilalcool (PVA-controle) não afetou a taxa de clivagem (P>0,05). As

taxas de blastocistos (D7) e blastocistos relacionados a estruturas clivadas

(D7/CLIV), apresentadas pelo grupo cultivado em presença do substituto do soro

(Knockout SR), foram semelhantes às observadas nos embriões cultivados em

presença de soro (P>0,05); entretanto, as taxas observadas nos dois grupos

foram superiores (P<0,05) às encontradas no grupo controle (PVA) (Tabela 1).

Tabela 1: Efeito da suplementação com soro fetal bovino (SFB), Knockout SR (KSR) ou polivinilalcool (PVA) em meio CR2aa nas taxas de clivagem e produção de embriões bovinos produzidos in vitro.

Grupos N Clivagem (%) Blastocisto (%) SFB 848 57,8±4,6a 18,6±3,0a

KSR 880 62,2±4,5a 12,2±2,1a

PVA (controle) 828 60,4±4,4a 4,2±1,0b

a, b, c Letras diferentes em uma mesma coluna mostram diferença (P<0,05). Os valores estão representados como média ± erro padrão.

Na Tabela 2, está demonstrado o número total de células referente aos

blastocistos dos três grupos (SFB, KSR e PVA). Não foram observadas diferenças

(P>0,05) entre a suplementação com o soro ou seu substituto sintético (Knockout

SR). Contudo, os embriões cultivados em presença de Polivinilalcool (PVA)

apresentaram um número inferior (P<0,01) de blastômeros quando comparados

aos outros dois grupos.

Tabela 2: Média do número total de células de blastocistos cultivados por 8 dias (D8) em meio CR2aa suplementado com soro, Knockout SR ou polivinilalcool.

Tratamentos Blastocistos (n) N° total de células SFB 24 109,4±6,1a

KSR 26 105,9±5,9a

PVA 13 79,6±8,4b

a, b, c Valores com letras diferentes em uma mesma coluna diferem entre si (P<0,01).

Na Figura 1, está representada a distribuição das estruturas clivadas de

acordo com o número de blastômeros observados 72 hpf. Os três grupos

apresentaram resultados semelhantes (P>0,05) tanto na taxas de embriões com

4-8 células (SFB=35,49±2,63; KSR=38,5±2,9; PVA=38,5±2,8) como na taxa de

embriões com mais de 8 células (SFB=22,14±1,86; KSR=18,8±2,6;

PVA=16,8±2,5).

Figura 1: Distribuição de embriões clivados nos grupos SFB (n=848), KSR

(n=880) e PVA (n=828) 72 hpf (D3). As taxas foram avaliadas pelo teste Kruskal Wallis (P>0,05).

A distribuição dos estádios de desenvolvimento embrionário nos grupos

SFB, KSR e PVA está demonstrada na Figura 2. Foi observado que a

suplementação do meio de cultivo com soro, Knockout SR ou PVA não interferiu

(P>0,05) nas proporções de blastocisto inicial (16,0±3,8; 13,8±3,5 e 5,9±3,1,

respectivamente) e blastocisto (33,8±3,9; 38,7±5,5 e 50,6±8,7, respectivamente).

Entretanto, a suplementação com soro (22,8±3,6) e Knockout SR (19,9±4,6)

proporcionou uma maior taxa de blastocistos expandidos do que o grupo controle

(7,9±4,4).

Total Cliv 4-8célls >8célls0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

SFBKSRPVA

Taxa

de

Cliv

agem

(%)

Figura 2: Distribuição dos estádios de blastocisto inicial (Bi), blastocisto (Bl) e

blastocisto expandido (Bx) em relação ao número total de blastocistos, em embriões cultivados por sete dias (D7) em presença de soro (n=848), Knockout SR (n=880) e Polivinilalcool (n=828). Os valores foram avaliados pelo teste de Kruskal Wallis. Barra com asterisco difere significativamente (P<0,05).

DISCUSSÃO Para que a produção in vitro de embriões alcance sua aplicabilidade

comercial na pecuária, equipes mundiais vêm contribuindo para a melhoria dos

sistemas desse tipo de cultivo. Porém, existe uma variação na produção

embrionária entre laboratórios em função dos procedimentos adotados. Espera-se

que, aproximadamente, 30% dos oócitos maturados e fecundados in vitro atinjam

o estádio de blastocistos durante o cultivo embrionário (HOLM, 1999; RIZOS et al.,

2002; LONERGAN et al., 2003; SORIA, 2005). Em vista desses resultados, é

factível considerar que a etapa do desenvolvimento embrionário é limitante para a

produção de maiores taxas de blastocistos.

A origem do oócito é fundamental para o sistema de produção in vitro de

embriões, pois determina a sustentabilidade do gameta em ser fecundado, sofrer

Bi Bl Bx0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

SFBKSRPVA

Taxa

de

Bla

stoc

isto

(%)

*

as clivagens iniciais e transpor o bloqueio em 8-16 células e, finalmente, atingir o

estádio de blastocisto (LONERGAN et al., 2006). Oócitos obtidos de ovários de

matadouro utilizados para produção in vitro apresentam qualidade e competência

embrionária heterogêneas. Possivelmente as alterações estão relacionadas ao

fato de existirem diferenças em relação ao estádio do ciclo estral e condições

reprodutivas (CHOHAN & HUNTER, 2003), idade do animal (PONDERATO et al.,

2002), estação do ano e estado nutricional dos animais abatidos (BOLAND et al.,

2001).

Outros fatores relevantes são as condições dos meios utilizados na

produção in vitro os quais, no presente experimento, também podem ter

influenciado os resultados. VANROOSE et al. (2001) relataram que a escolha dos

meios e seus suplementos têm impacto sobre o crescimento e a viabilidade

embrionária. Entretanto, o cultivo embrionário é considerado como o período

crítico da produção in vitro, pois pode alterar o padrão de expressão gênica e,

assim, comprometer a qualidade e a sobrevivência após transferência dos

embriões em estádio pré-implantacional (RIZOS et al., 2002; LONERGAN et al.,

2003).

A relação entre o momento da primeira clivagem pós-fertilização e a

competência de desenvolvimento embrionário tem sido demonstrada em algumas

espécies domésticas, como em bovinos (LONERGAN et al. 1999), macaco rhesus

(BAVISTER et al., 1983b), hamster (Mc KIERNAN & BAVISTER, 1994),

camundongos (WARNER et al., 1998), búfalo (TOTEY et al., 1996). Corroborando

com esses autores, LONERGAN et al. (2006) relataram que oócitos clivados

inicialmente atingem primeiro o estádio de blastocisto do que aqueles clivados

mais tardiamente.

No presente estudo, foi observado que a suplementação sintética (Knockout

SR) não interferiu na taxa de clivagem. Esses resultados corroboram com os

encontrados por LIM et al. (2007) e SAGIRKAYA et al. (2007), que também

testaram suplementos substitutos ao soro. Entretanto, GUTIERREZ-ADAN et al.

(2001) observaram menor número de estruturas clivadas em embriões cultivados

em presença de soro. Foi observado no presente estudo que as clivagens iniciais

ocorreram mesmo em ausência de proteína, sugerindo que as divisões celulares

iniciais foram sustentadas pela herança materna.

Durante a oogênese, o oócito acumula grande quantidade de RNAs e proteínas

capazes de regular e manter o desenvolvimento do embrião durante o período de

pré-implantação (BREVINI-GANDOLFI & GANDOLFI, 2001; MEIRELES et al.,

2003); dentre eles, fatores transcricionais que estão envolvidos na ativação do

genoma embrionário (AGE) (VIUFF et al., 1996; MEMILI et al., 1998). Entretanto,

sabe-se que, em embriões bovinos produzidos in vitro, as taxas de falhas no

desenvolvimento são altas e quase sempre associadas a fatores intrínsecos ao

oócito e que conduzem ao bloqueio e morte embrionária (LONERGAN et al., 2003;

MEIRELLES et al., 2003; 2004). Presume-se que a incapacidade de vencer o

ambiente de repressão transcricional gerado por fatores estruturais do genoma,

como, por exemplo, o empacotamento do DNA, a acetilação, a hiperacetilação e a

metilação, seja um dos fatores que determinam a incompetência do embrião em

ultrapassar os primeiros ciclos celulares (LAVOIR et al., 1997). A ativação da

transcrição embrionária também é um fator vital para que o embrião em

desenvolvimento seja capaz de passar pelas primeiras divisões celulares

(MEIRELES et al., 2004).

LEQUARRE et al. (2003) observaram que o quarto ciclo celular em bovinos

era o mais longo, variando de 9 a 40 horas. Dessa forma, no período de cultivo de

36 a 96 horas, seria possível encontrar embriões com 8 a 16 células. Observou-se

nesse experimento que, em 72 horas de cultivo, em presença ou não de proteína,

em torno de 20% das estruturas encontravam-se naquela fase. Esses achados

têm sua importância, pois embriões produzidos in vitro que atingirem

precocemente o estádio de 8 células possuem maiores chances de

desenvolverem até blastocisto.

Em relação ao aspecto morfológico das divisões celulares, embriões do

grupo controle cultivados em presença de PVA apresentaram divisões

assimétricas e assincrônicas em sua maioria e blastômeros com aspecto

escurecido, corroborando com os achados de HOLM et al. (2002). As

características morfológicas (blastômeros escurecidos e com aspecto pulverizado)

observadas na clivagem do grupo controle podem estar associadas à baixa taxa

de produção embrionária. Por outro lado, em meio de cultivo adicionado de

suplemento sintético livre de soro (Knockout SR), as divisões celulares

apresentaram-se sincrônicas, simétricas e coesas. Além disso, os embriões desse

grupo apresentaram-se levemente mais claros do que aqueles produzidos em

presença de soro.

No presente estudo, foi demonstrado que a suplementação do meio de

cultivo com o substituto sintético do soro (Knockout SR) proporcionou taxa similar

de blastocistos quando comparada à suplementação com soro, corroborando com

os achados de RODRIGUEZ-SALLABERRY et al (2002). Entretanto, BASSO et al.

(2003), adicionando suplemento sintético livre de soro ao meio SOFaaci,

obtiveram menores taxas de blastocistos em relação ao meio suplementado com

fonte protéica. Vale salientar que a remoção do soro do meio de desenvolvimento

embrionário oferece maior segurança aos sistemas de cultivo, pois se elimina a

possibilidade de infecção dos embriões por patógenos (Manual da IETS). Além

disso, a utilização do suplemento sintético livre de soro pode ser uma promissora

alternativa para estudos envolvendo a criopreservação de embriões produzidos in

vitro.

Na distribuição dos estádios embrionários, foi observado que as estruturas

tanto do grupo SFB como do grupo KSR apresentaram uma maior velocidade de

desenvolvimento em função da maior proporção de blastocistos expandidos

comparados aos do grupo controle, suplementado apenas com PVA. Entretanto,

KURAN et al. (2002) consideraram que apenas a presença dos aminoácidos,

presentes no meio base, sustenta o desenvolvimento in vitro, já que estes ativam

alguns genes relacionados com a viabilidade embrionária.

No presente estudo, o meio de cultivo embrionário suplementado tanto com

soro como com o suplemento sintético livre de soro estimularam a velocidade de

crescimento in vitro. Como não houve diferença entre as taxas de blastocistos e

blastocistos expandidos nesses dois grupos, pode-se sugerir que o Knockout SR

acelera o processo de blastulação da mesma forma que o soro.

A melhor forma de verificar a qualidade embrionária seria através da

transferência dos embriões para receptoras e verificação do estabelecimento da

prenhez. Entretanto, alguns testes podem predizer parcialmente a qualidade

embrionária, como o número total de células, alterações do metabolismo celular,

modificações ultraestruturais ou integridade de membrana celular (DUQUE et al.,

2003). O número de células embrionárias tem sido extensivamente utilizado como

um indicador da qualidade do embrião (KHURANA & NIEMANN, 2000;

LEQUARRE et al., 2003; PEREIRA et al., 2005). No presente experimento, o

número total de células foi similar entre os grupos, sugerindo que a qualidade dos

embriões não foi afetada pela suplementação do meio de cultivo. SAGIRKAYA et

al. (2007), ao compararem o número de blastômeros de embriões cultivados em

presença de SFB ou de um substituto sintético do soro (SSS), também não

observaram diferença no número total de células.

CONCLUSÃO

A suplementação do meio CR2aa com Knockout SR é favorável ao

desenvolvimento embrionário, já que demonstrou valores semelhantes à

suplementação com SFB tanto na produção dos embriões como no número total

de células, sendo este último um parâmetro de qualidade embrionária.

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EXPRESSÃO DOS TRANSCRITOS Hsp70.1 E Bax EM EMBRIÕES BOVINOS CULTIVADOS EM MEIO LIVRE DE SORO

RESUMO Este estudo teve como objetivo determinar a abundância relativa dos

transcritos Hsp70.1 e Bax em embriões bovinos fertilizados in vitro e cultivados em

presença de substituto sintético do soro. CCOs obtidos de ovários de matadouro

foram maturados e fertilizados in vitro. Os possíveis zigotos foram cultivados

aleatoriamente, com suas células do cumulus, em meio CR2aa suplementado com

10% de soro fetal bovino (grupo SFB), com 10% de KnockoutTM SR (grupo KSR),

ou 3 mg/ml álcool polivinílico (grupo PVA). A taxa de clivagem foi determinada 72

horas pós-fecundação (hpf) (D3) e a taxa de blastocisto 168 hpf (D7). Blastocistos

D8 (192 hpf) foram rapidamente congelados em nitrogênio líquido e

subseqüentemente descongelados para extração de RNA. A extração total de

RNA foi realizada utilizando o Micro Kit Rneasy (Qiagen, Valencia, CA, USA), e a

síntese da primeira fita de DNA foi obtida com o Kit SuperscriptTM III First Strand

Synthesis (Invitrogen, Chicago, IL, USA). A quantificação relativa foi realizada em

duplicata utilizando o PCR Real Time (ABI Prism 7000 Applied Biosystem, Foster

City, CA, USA), sendo a mistura da reação composta de iTaqTM SYBR Green

Supermix, ROX (Bio-Rad, Waltham, MA, USA), cDNA equivalente a 0,8 embriões

e primers específicos para cada gene. A expressão do gene H2A foi utilizada

como referência endógena e, como calibrador, o valor do grupo PVA. As taxas de

clivagem e blastocisto foram analisadas por Kruskal Wallis e o número total de

células por ANOVA. A taxa de clivagem foi semelhante (P>0,05) entre os grupos,

porém o grupo PVA apresentou menores taxas de blastocistos (P<0,05), quando

comparado aos outros dois grupos. Não houve diferença (P>0,05) na abundância

relativa de Hsp70.1 (5.42±0.80, 3.46±1.62 e 1.85±0.85) e Bax (2.08±1.14,

0.92±0.15 e 1.82±0.82) para os grupos SFB, KSR e PVA. Esses resultados

mostram que embriões cultivados em meio suplementado com KSR apresentam o

mesmo padrão de expressão para Hsp70.1 e Bax, o que sugere condições

semelhantes de estresse e apoptose nos embriões de ambos os grupos.

Palavras-chave: embrião, cultivo in vitro, expressão gênica, Hsp70.1, Bax

EXPRESSION OF Hsp70.1 AND Bax TRANSCRIPTS IN BOVINE EMBRYOS CULTURED IN SERUM-FREE MEDIUM

ABSTRACT

This study aimed to determine whether KnockoutTM SR or FCS in culture

medium alters the relative abundance of Hsp70.1 and Bax transcripts in vitro-

fertilized bovine embryos. COCs obtained from slaughterhouse ovaries were in

vitro matured and fertilized. Presumptive zygotes were randomly cultured with their

own cumulus cells in CR2aa medium supplemented with 10% fetal calf serum

(FCS group); 10% KnockoutTM SR (KSR group), or 3 mg/ml polyvinyl alcohol (PVA

group). All steps were performed at 38.5°C, under 5% CO2 in air and 95%

humidity. Blastocysts on day 8 post-fertilization were rapidly frozen in liquid

nitrogen and subsequently thawed for RNA extraction. Total RNA extraction was

performed using Rneasy Micro kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) and first strand

DNA synthesized using SuperscriptTM III First Strand Synthesis kit (Invitrogen,

Chicago, IL, USA). Relative quantification was performed in duplicate using Real

Time PCR (ABI Prism 7000 Applied Biosystem, Foster City, CA, USA) and

reactions consisted of a mixture of iTaqTM SYBR Green Supermix with ROX (Bio-

Rad, Waltham, MA, USA) with cDNA equivalent to 0.8 embryos and gene specific

primers. Expression of H2A gene was used as endogenous reference and using

the value found in PVA group as calibrator. Rates all were evaluated by ANOVA.

Cleavage rate were similar among groups (P>0.05), however blastocyst rates were

lower in PVA (P<0.01) than others groups. There was no difference (P>0.05) on

expression of Hsp70.1 (5.42±0.80, 3.46±1.62 e 1.85±0.85) and Bax (2.08±1.14,

0.92±0.15 e 1.82±0.82) among FCS, KSR and PVA groups. This data shows that

bovine embryos cultured in medium supplemented with KSR has the same Hsp70-

1 and Bax expression pattern as those in medium added with FCS, suggesting that

embryos in both groups are under the same stress and apoptosis conditions.

Keywords: embryo, in vitro culture, gene expression, Hsp70.1, Bax.

INTRODUÇÃO

Nos mamíferos, o período pré-implantação está compreendido entre a

formação do zigoto e o estádio de blastocisto. Esse período do desenvolvimento é

caracterizado por quatro etapas biológicas distintas, que ocorrem após a

fertilização do oócito e incluem (I) a primeira clivagem, (II) a transição materno-

zigótica (MZT) ou ativação do genoma embrionário (AGE), (III) a compactação e

conseqüente polarização do epitélio embrionário e (IV) a diferenciação de mórula

em blastocisto (SCHULTZ et al., 1999; WRENZYCKI et al., 2005), sendo que cada

uma dessas etapas é acompanhada por mudanças no padrão de expressão

gênica (WARNER & BRENNER, 2001).

Embriões bovinos pré-implantação são capazes de se adaptar a grande

variedade de ambientes, incluindo condições adversas e inadequadas de cultivo

(OLIVEIRA et al., 2005). Entretanto, a maioria dos embriões produzidos in vitro

não alcança o estádio de blastocisto, e aqueles que atingem esse estádio

apresentam qualidade inferior àqueles produzidos in vivo (PEDERSEN et al.,

2005). Vários estudos têm demonstrado que o microambiente no cultivo in vitro

pode ter efeito determinante nos padrões normais de expressão gênica (RIZOS et

al., 2003; GUTIERREZ-ADAN et al., 2004; LONERGAN et al., 2006). Mais

recentemente, foi estabelecido que a associação entre a avaliação da

competência de desenvolvimento (taxas de clivagem e blastocisto) e da qualidade

(criotolerância, expressão gênica e morfologia) pode fornecer visão mais completa

das conseqüências ocasionadas pela modificação da composição dos sistemas de

cultivo (AVERY & GREVE, 2004).

A influência da suplementação protéica representa ponto crucial na

eficiência de sistemas de cultivo embrionário in vitro. O soro fetal bovino (SFB) e a

albumina sérica bovina (BSA) são as fontes protéicas mais utilizadas em meios de

cultivo (BAVISTER, 1995; LONERGAN et al, 1999; VAN WAGTENDONK-DE

LEEUW et al., 2000). Contudo, por serem de origem biológica, possuem

quantidades indefinidas de hormônios, fatores de crescimento, vitaminas e vários

outros fatores desconhecidos, podendo, ainda, veicular patógenos (KURAN et al.,

2002). Esses fatores, ao não permitir o controle das condições de cultivo,

dificultam a repetibilidade de resultados.

Diante dessas evidências, vários grupos de pesquisa vêm buscando

utilizar suplementos sintéticos livres de soro, de forma a minimizar ou eliminar os

danos causados pelo soro. Os suplementos sintéticos, utilizados como substitutos

de proteínas animais para o crescimento in vitro de células indiferenciadas,

representam alternativa para a produção in vitro de embriões bovinos. O Knockout

Serum Replacer (KSR) é um suplemento quimicamente definido, desenvolvido

para manutenção do cultivo in vitro de células tronco (HORII et al., 2003).

Entretanto, ainda não existe embasamento na literatura a respeito de seus efeitos

sobre o desenvolvimento e a expressão gênica de embriões bovinos produzidos in

vitro.

Estudos recentes têm utilizado padrões de expressão de RNAm como

critério para predizer o potencial de desenvolvimento de embriões produzidos in

vivo (RIZOS et al., 2002; WRENZYCKI et al., 2004). Contudo, a abundância

relativa de diversos transcritos tem sido afetada tanto pela escolha dos meios de

cultivo, como pelo tipo de suplemento utilizado, e essa escolha representa ponto

crítico no desenvolvimento pré-implantacional in vitro (RIZOS et al., 2002;

WRENZYCKI et al., 1999, 2001, 2004; SAGIRKAYA et al., 2006).

GUTIERREZ-ADAN et al. (2004) demonstraram que genes induzidos pelo

estresse (sarcosina oxidase - SOX, magnésio superoxido desmutase - MnSOD,

regulador de apoptose em Bos taurus box-α – Bax e interferon tau - IF ) foram

altamente transcritos em embriões produzidos in vitro. Por outro lado, genes

relacionados ao metabolismo, crescimento e diferenciação (transportador de

glicose - Glut-5, conexina 43 – Cx43 e fator semelhante à insulina II - IGF-II) foram

detectados em maior quantidade em embriões produzidos in vivo. Esses padrões

de transcrição refletem a resposta embrionária às condições adversas de cultivo in

vitro e à plasticidade do desenvolvimento pré e pós-implantacional em condições

sub-ótimas (RIZOS et al., 2003; WRENZYCKI et al., 2003).

A expressão de genes associados à resposta ao estresse e apoptose,

como a proteína do choque térmico (Hsp70.1) e a proteína reguladora de

apoptose em Bos taurus (Bax), pode ser afetada pelas condições de cultivo in

vitro, sendo induzida por uma variedade de agentes estressores, incluindo os

componentes dos meios de cultivo (WRENZYCKI et al., 2001; RIZOS et al., 2002;

PEDERSEN et al., 2005).

Atualmente, os principais obstáculos para o estabelecimento, em larga

escala, de programas de produção in vitro de embriões bovinos têm sido as altas

taxas de mortalidade embrionária e fetal, assim como a ocorrência de anomalias

nos animais nascidos. Conseqüentemente, o estudo da expressão gênica pode

fornecer subsídios para a compreensão das falhas que ocorrem nos programas de

produção de embriões, além de melhorar sua eficiência.

O objetivo deste trabalho foi avaliar a competência de desenvolvimento e

a expressão dos genes Hsp 70.1 e Bax em embriões bovinos fertilizados in vitro e

cultivados em presença de substituto sintético do soro.

MATERIAL E MÉTODOS

Local do Experimento O experimento foi realizado nos Laboratórios de Reprodução Animal e

Genética Molecular da Embrapa Gado de Leite, localizados em Juiz de Fora, MG,

no Laboratório de Ginecologia e Obstetrícia da Faculdade de Medicina da USP,

localizado em Ribeirão Preto, SP; e no Laboratório Agrogenética, localizado em

Viçosa, MG.

Produção de in vitro de embriões

Neste experimento, foi utilizado um total de 1175 possíveis zigotos,

obtidos em 11 repetições, distribuídos em três grupos. Os embriões foram

produzidos no período de outubro a novembro de 2006, a partir de oócitos obtidos

de ovários coletados de novilhas e vacas da raça nelore abatidas em matadouro.

A produção foi realizada como descrito anteriormente no capítulo 1.

Avaliação dos embriões Às 72 horas após a fecundação (hpf), foi realizada a troca de 50% do

volume de cada gota do meio de cultivo. Em seguida, foi realizada a avaliação da

taxa de clivagem dos embriões dos três tratamentos. No sétimo e oitavo dias de

cultivo, foi avaliada a formação de blastocisto.

Extração do RNA e transcrição reversa A expressão dos genes Hsp70.1 e Bax foi avaliada em 30 embriões do

grupo SFB, 30 embriões do grupo KSR e 20 embriões do grupo PVA. No oitavo

dia de cultivo (D8), embriões em estádio de blastocisto (Bl) e blastocisto

expandido (Bx), classificados em grau I e II de acordo com o manual da IETS,

foram retirados do cultivo e lavados em meio TALP-Hepes. Os blastocistos foram

agrupados em pools de 8 a 10, acondicionados em criotubos, congelados

rapidamente em nitrogênio líquido e armazenados em freezer a -80°C.

Subseqüentemente, os embriões foram descongelados para extração de RNA,

sendo esta realizada por meio da utilização Micro Kit Rneasy (Qiagen, Valencia,

CA, USA), de acordo com as instruções do fabricante.

A síntese da primeira fita de DNA foi obtida com o Kit SuperscriptTM III First

Strand Synthesis (Invitrogen, Chicago, IL, USA). Adicionou-se à amostra (8µl) 1µl

de primers oligo-dT18 e 1µl de dNTPs; então, a amostra foi incubada em

termociclador para a produção da fita de cDNA por um período de 5 minutos, a

uma temperatura de 65ºC. Em seguida, a amostra foi resfriada e mantida no gelo.

Dando continuidade ao processo de transcrição, foi adicionado a cada amostra 2µl

de tampão RT, 4 µl de MgCl2, 2 µl de DTT, 1 µl de RNase OUT e 1 µl de

SuperScript III RT. A reação de síntese do cDNA foi conduzida por 50 minutos a

50ºC, seguidos de 5 minutos a 85ºC e resfriamento em gelo. Por fim, foi

adicionado à amostra 1 µl de RNase H e o conteúdo foi incubado por mais 20

minutos a 37ºC. Essa última etapa é realizada para degradação do RNAm e

purificação do cDNA, que foi armazenado a -80ºC até o momento da reação de

PCR em tempo real.

PCR em Tempo Real

A quantificação relativa foi realizada em duplicata utilizando o PCR Real

Time (ABI Prism 7000 Applied Biosystem, Foster City, CA, USA), sendo a mistura

da reação composta de iTaqTM SYBR Green Supermix, ROX (Bio-Rad, Waltham,

MA, USA), cDNA equivalente a 0,8 embriões e primers específicos para cada

gene, em um volume final de 25 µl por reação. A seqüência dos oligonucleotídeos,

a temperatura de anelamento, o tamanho do fragmento e o código de acesso do

Genebank estão apresentados na Tabela1.

Tabela 1: Sequência de primers e temperatura de anelamento específicas para cada gene avaliado

Gene Sequência (5’-3’) TemperaturaAnelamento

(°C)

Tamanho Fragmento

(pb)

N° Acesso Genebank

Hsp70.1

5´ AACAAGATCACCATCACCAACG 59

3´ TCCTTCTCCGCCAAGGTGTTG

275 NM174550

Bax

5´ TTTTGCTTCAGGGTTTCATCCAGGA 64

3´ CAGCTGCGATCATCCTCTGCAG

174 NM173894

H2A

5´ GCCATCCTGGCGTACCTCAC 52

3´ TGGATGTGTGGAATGACACC

176 NM174809

As reações de PCR foram conduzidas a 95ºC por 2 minutos, seguido de

40 ciclos a 95ºC por 15 segundos, temperatura de anelamento específica para

cada primer por 30 segundos e elongação (extensão) a 72ºC por 30 segundos.

Após cada corrida de PCR, a análise da curva de desnaturação (melting curve) foi

realizada para cada amostra, para detectar dímeros de oligonucleotídeos e

produtos inespecíficos. O tamanho do fragmento foi confirmado por eletroforese

em gel com 2% de agarose (Figura 1), corado com brometo de etídio. Controles

negativos sem ácido nucléico também foram conduzidos simultaneamente.

L H2A Hsp70.1 Bax Controle (-)

S K P S K P S K P 1 2 3

Figura 1: Padrão de bandas, em gel de agarose (2%) corado com brometo de etídeo, do “ladder” de 100bp (L) e dos genes H2A (1), Hsp70.1 (2) e Bax (3), nas amostras de embriões do grupo SFB (S), do grupo KSR (K) e do grupo PVA (P).

Os sinais de fluorescência emitidos durante os primeiros 9 ciclos foram

utilizados para determinar a linha base de fluorescência, e o número de ciclos em

que a fluorescência é considerada significante (ciclo em que a fluorescência da

amostra atinge uma linha limiar); Ct foi estabelecido dentro da fase exponencial de

amplificação. Para corrigir variações entre amostras, o número do Ct de cada

gene foi normalizado com o Ct obtido com o gene H2A (gene de referência

275 pb

176 pb 174 pb

endógena) para, então, fornecer o número de Ct normalizado para cada gene e

amostra. Como o valor de Ct é inversamente proporcional à quantidade de

material de DNA inicial, maiores valores de Ct normalizado significam menores

quantidades de transcritos e vice-versa.

A análise dos resultados do PCR quantitativo foi realizada utilizando-se o

método 2-∆∆Ct, sendo que os resultados foram expressos relativos a um grupo

referência ou calibrador. Neste experimento, o grupo referência foi o grupo PVA. O

Ct do gene alvo (Hsp70.1 e Bax) e do gene controle endógeno (Histona H2A)

foram determinados para cada amostra. A diferença entre o Ct do alvo e o Ct

endógeno, denominado ∆Ct, foi calculada para cada amostra no grupo referência

(PVA) e experimental (SFB e KSR), objetivando-se normalizar as diferenças nas

extrações de RNA e a eficiência das reações de transcrição reversa. O ∆Ct de

cada gene obtido em cada amostra do grupo experimental foi subtraído do ∆Ct

obtido no grupo referência; o resultado obtido é chamado de ∆∆Ct (∆∆Ct = ∆Ct Exp

–∆Ct Ref.). A quantidade do gene alvo no grupo experimental, já normalizada pelo

controle endógeno (gene Histona 2a) e pelo grupo referência (∆Ct do grupo

referência), foi calculada usando 2-∆∆Ct. Desse modo, os dados obtidos foram

expressos no grupo experimental como X vezes relativas ao grupo referência.

Análises Estatísticas

As taxas de clivagem e blastocistos foram analisadas pelo teste Kruskal

Wallis. A expressão relativa, caracterizada por 2-∆∆Ct, foi analisada por ANOVA, e

as diferenças entre médias foram comparadas pelo teste Student Newman Keuls,

através do procedimento GLM do pacote estatístico SAS. Os valores foram

apresentados como médias ± erro padrão (EP).

RESULTADOS

O número de zigotos e as taxas de clivagem e de blastocistos estão

sumarizados na Tabela 2. A suplementação do meio CR2 com soro fetal bovino

(SFB), substituto sintético do soro (Knockout SR), ou álcool polivinílico (PVA-

controle), não afetou a taxa de clivagem (P>0,05). As taxas de blastocistos (D7) e

blastocistos relacionados a estruturas clivadas (D7/CLIV), apresentadas pelo

grupo cultivado em presença do substituto do soro (Knockout SR), foram

semelhantes às observadas nos embriões cultivados em presença de soro

(P>0,05); entretanto, as taxas observadas nos dois grupos foram superiores

(P<0,05) às encontradas no grupo controle (PVA).

Tabela 2: Efeito da suplementação com soro fetal bovino (SFB), Knockout SR

(KSR) ou álcool polivinílico (PVA) em meio CR2aa nas taxas de clivagem e produção de blastocistos em embriões bovinos produzidos in vitro.

Taxas de blastocistos Tratamentos Zigotos (n) Taxa de clivagem D7* D8**

SFB 401 58,4±2,8a 24,5±2,2 a 27,5±2,7a

KSR 379 70,9±4,5a 25,1±2,9 a 29,8±3,1a

PVA (controle) 395 65,7±4,6a 14,7±3,1 b 17,6±3,0b

a, b Médias, seguidas de letras diferentes, em uma mesma coluna, mostram diferença (P<0,05). Não foi detectada diferença significativa na abundância relativa entre

embriões dos grupos SFB, KSR e PVA para os genes Hsp70.1 e Bax (Tabela 3).

Tabela 3: Expressão da abundância relativa de transcritos específicos (média±EP)

em embriões bovinos em estádio de blastocisto e blastocisto expandido.

Genes Tratamento Hsp 70.1 Bax

SFB 5,42±0,80 a 2,08±1,14 a

KSR 3,46±1,62 a 0,92±0,15 a

PVA (controle) 1,85±0,85 a 1,82±0,82 a

a Médias, seguidas de letras iguais, em uma mesma coluna, não representam diferença (P>0,05).

DISCUSSÃO

Para alcançar a aplicabilidade comercial de embriões produzidos in vitro,

vários estudos têm sido realizados, contribuindo para a otimização de sistemas de

cultivo in vitro (FLEMING et al., 2004; LONERGAN et al., 2006). Entretanto,

alterações na morfologia, metabolismo e competência de desenvolvimento ainda

persistem em embriões bovinos fertilizados in vitro. O soro, que é amplamente

utilizado para cultivar embriões bovinos fertilizados in vitro, tem sido demonstrado

como um dos fatores envolvidos nessas alterações; por isso, alguns estudos têm

buscado meios livres de soro que proporcionem desenvolvimento embrionário

similar às taxas obtidas em meios suplementados com soro (DUQUE et al., 2003;

LIM et al., 2007; SAGIRKAYA et al., 2007). O presente estudo demonstrou que

embriões bovinos fertilizados in vitro podem ser co-cultivados com células do

cumulus em meio livre de soro, suplementado com um substituto comercial do

soro (KSR) em 5% CO2, sem afetar as taxas de blastocistos e a abundância

relativa de genes associados ao estresse quando comparados com sistemas de

cultivo convencionais contendo soro.

A composição do meio de cultivo tem uma relevante importância no

desenvolvimento embrionário, com grande impacto na sua viabilidade

(VANROOSE et al. 2001). O cultivo embrionário também pode alterar os padrões

de expressão de genes e comprometer a sobrevivência e qualidade embrionárias

(RIZOS et al., 2002; LONERGAN et al., 2003). O soro e a BSA são suplementos

protéicos convencionais utilizados no cultivo de embriões bovinos, que possuem

efeito positivo no desenvolvimento de blastocistos. Contudo, o uso do soro tem

sido associado a várias anormalidades na morfologia embrionária, expressão

genética, gestação e recém nascidos (VANROOSE et al., 2001). Uma alternativa

para contornar os efeitos deletérios do soro é a sua substituição por

macromoléculas sintéticas como PVA ou PVP, que requerem baixa tensão do O2.

Apesar de proporcionar taxas de clivagem semelhantes, a produção de embriões

geralmente é menor do que em meios suplementados com soro (WRENZYCKI et

al., 2001; KURAN et al., 2002; ORSI & LEESE, 2004). Resultados semelhantes

foram obtidos no presente estudo, onde não foi demonstrada diferença nas taxas

de clivagem entre os grupos SFB e PVA, sendo a taxa de blastocisto maior no

grupo SFB. Por outro lado, a substituição do soro pelo KSR não afetou a clivagem

e a produção de blastocistos, sugerindo que esse suplemento pode proporcionar

condições similares para embriões bovinos quando comparado com a

suplementação com soro. Outros substitutos do soro têm sido testados com

resultados similares. DUQUE et al. (2003) avaliou o efeito de dois diferentes

substitutos comerciais do soro (CPSR-3® e Ultrocer G®) no desenvolvimento de

embriões bovinos fertilizados in vitro e observaram que o CPSR-3® proporcionou

taxas de desenvolvimento similares ao soro.

Uma das alterações causadas por sistemas de cultivo in vitro é o

desbalanceamento da expressão de importantes genes para o desenvolvimento

embrionário. De fato, embriões produzidos in vitro demonstram alterações na

expressão de alguns genes (WRENZYCKI et al., 2002; RIZOS et al., 2002; KNIJN

et al, 2005; CAMARGO et al., 2005). Alguns desses distúrbios na expressão de

genes podem ser associados com o uso do soro no meio de cultivo (WRENZYCKI

et al. 1999; RIZOS et al. 2003). A expressão de genes relacionados à resposta ao

estresse celular, como a proteína do choque térmico (Hsp) e o Bax, pode ser

alterada pelo cultivo embrionário (PEDERSEN et al., 2005; WARZYCH et al.,

2007). Além disso, a expressão de Hsp tem sido sugerida como um indicador de

estresse no ambiente, causado por condições subótimas de estresse

(WRENZYCKI et al., 2001). No presente estudo, embriões cultivados com (SFB)

ou sem soro (grupos KSR ou PVA) não demonstraram alterações significativas na

abundância relativa de Hsp 70.1, em concordância com outros estudos.

WRENZYCKI et al. (2001) não encontraram diferença na expressão relativa de

Hsp70.1 entre grupos cultivados com soro, BSA ou PVA, embora embriões

cultivados com soro tenham demonstrado maior expressão do que embriões

produzidos in vivo. OLIVEIRA et al., (2005) cultivaram embriões bovinos em

diferentes concentrações de soro (1 a 20%) ou com 0.4% BSA, e também não

encontraram diferença na expressão relativa de Hsp70.1 entre os tratamentos.

Esses resultados sugerem que alterações na expressão do gene Hsp70.1 não

podem ser associadas à utilização de soro no meio de cultivo, como observado no

presente estudo.

Em relação à expressão de Bax, não existiu diferença entre os embriões

cultivados com SFB, KSR ou PVA, o que também sugere que os níveis de

expressão desse gene não estão relacionados à presença do soro no meio de

cultivo. Por outro lado, a presença de soro durante o período de cultivo resulta em

um significante aumento nos níveis de expressão de Bax (RIZOS et al., 2003). O

Bax é uma proteína pro-apoptótica, mas seu papel está associado com a atividade

do Bcl-2, e a relação Bcl2:Bax predetermina a resposta celular ao estímulo à

apoptose (BASU & HALDAR, 1998). FOULADI-NASHTA et al. (2005) reportaram

que a suplementação com soro no meio de cultivo não aumentou a formação de

núcleos apoptóticos em blastocistos bovinos. A associação dos resultados dos

estudos anteriores com o presente estudo sugere que o soro pode não ser o único

agente estimulador da apoptose em embriões bovinos fertilizados in vitro.

O KnockoutTM SR é um suplemento definido, livre de soro, desenvolvido

para o crescimento e manutenção de células tronco indiferenciadas

(GOLDSBOROUGH et al., 1998, BRYJA et al, 2006). Esse suplemento livre de

soro não é recomendado para cultivo em placa de células como fibroblastos, pois

não possui fatores que permitam a adesão das células na placa. O presente

estudo demonstrou que as células do cumulus cultivadas com KSR não formaram

monocamada.

CONCLUSÃO

A utilização de Knockout SR em sistemas de cultivo sustenta o

desenvolvimento de embriões bovinos produzidos in vitro e pode ser uma

alternativa para substituir o soro no cultivo embrionário. Estudos complementares

devem ser realizados com o objetivo de relacionar a expressão gênica e o

potencial de desenvolvimento in vitro com o estabelecimento de prenhez e as

taxas de nascimento.

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5. CONCLUSÕES GERAIS

É possível estabelecer a produção de embriões bovinos em meio de cultivo

CR2aa, suplementado com suplemento sintético livre de soro (Knockout Serum

Replacer).

Nos sistemas de cultivo que receberam soro fetal bovino (SFB) ou

Knockout SR (KSR), tanto a qualidade quanto a quantidade dos blastocistos

bovinos são superiores em relação àqueles produzidos na presença de álcool

polivinílico (PVA).