desenvolvimento de biossensores impressos de … · ficha catalográfica elaborada pela divisão de...

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL REI UFSJ

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM TECNOLOGIAS PARA O

DESENVOLVIMENTO SUSTENTÁVEL

ALESSANDRA TEIXEIRA FÉLIX

DESENVOLVIMENTO DE BIOSSENSORES IMPRESSOS DE

TRANSISTORES DE EFEITO DE CAMPO COM GATILHO

ESTENDIDO (EGFET) UTILIZANDO PENTÓXIDO DE VANÁDIO

PARA DETECÇÃO DE GLICOSE

OURO BRANCO- 2016

i

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL REI UFSJ

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM TECNOLOGIAS PARA O

DESENVOLVIMENTO SUSTENTÁVEL

ALESSANDRA TEIXEIRA FÉLIX

DESENVOLVIMENTO DE BIOSSENSORES IMPRESSOS DE TRANSISTORES

DE EFEITO DE CAMPO COM GATILHO ESTENDIDO (EGFET) UTILIZANDO

PENTÓXIDO DE VANÁDIO PARA DETECÇÃO DE GLICOSE

Dissertação apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Tecnologias para o

Desenvolvimento Sustentável (PPGTDS) da

Universidade Federal de São João Del Rei

como requisito parcial para a obtenção do

grau de Mestre

Área de Concentração:

Química

Orientadora:ProfªDrª.Elídia Maria Guerra

Co-orientador: Prof. Dr.Marcelo Mulato

OURO BRANCO- 2016

ii

Ficha catalográfica elaborada pela Divisão de Biblioteca (DIBIB) e Núcleo de Tecnologia da Informação (NTINF) da

UFSJ, com os dados fornecidos pelo(a) autor(a)

Félix, Alessandra Teixeira.

F316d DESENVOLVIMENTO DE BIOSSENSORES IMPRESSOS DE TRANSISTORES DE EFEITO DE CAMPO COM GATILHO ESTENDIDO (EGFET) UTILIZANDO PENTÓXIDO DE VANÁDIO PARA DETECÇÃO DE GLICOSE / Alessandra Teixeira Félix ; orientadora Elídia Maria Guerra; coorientador Marcelo Mulato. -- Ouro Branco, 2016.

73 p. Tese (Doutorado - Programa de Pós-Graduação em

Tecnologias para o Desenvolvimento Sustentável) -- Universidade Federal de São João del-Rei, 2016.

1. biossensor. 2. Glicose. 3. EGFET. I. Guerra,

Elídia Maria , orient. II. Mulato, Marcelo, co orient. III. Título.

iv

AGRADECIMENTOS

Inicialmente gostaria de agradecer a Deus, ao Criador e mantenedor da minha vida.

Ao meu marido, Diego Alberto, pelo apoio, compreensão e cuidado.

Aos meus pais, Maria Aparecida e José Luiz, e à minha irmã Franciele, pelo suporte,

carinho, preocupação e principalmente pelo amor que é recíproco.

À minha orientadora prof. Elídia Maria Guerra, por ter acreditado no tema deste

trabalho, apoiado e incentivado quando necessário, pela compreensão e pela

dedicação em discussões durante as análises dos resultados e correções feitas, me

instruindo com argumentos sólidos para defesa dos meus objetivos.

Ao meu co-orientador prof. Marcelo Mulato, por ter cedido seu espaço físico na USP,

auxiliando na obtenção de diversos resultados apresentados neste trabalho, por

suas correções, preciosas sugestões e por, mesmo de longe, ter me apoiado no

desenvolvimento deste.

A professora Hállen Daniel Resende Calado, por me introduzir no mundo científico,

cedendo seu tempo e laboratório durante a graduação.

A banca examinadora da qualificação e defesa, pelo tempo dedicado nas correções

e sugestões que fizeram desse trabalho mais completo e melhor.

Ao programa PPGTDS, por ter aberto um mundo de possibilidades.

Aos meus colegas de curso e grupo de pesquisa ProDeMat, pela amizade e apoio.

Aos meus amigos da Igreja, ao meu pastor e demais líderes, que me auxiliaram e

continuam me ensinando, pelo zelo, preocupação e pelas orações.

A todos, o meu sincero e grato muito obrigada.

v

"Sou um cristão, isto significa: creio na

divindade de Jesus Cristo juntamente com Tycho

Brahe, Copérnico, Descartes, Newton, Fermat,

Leibniz, Pascal, Grimaldi, Euler, Guldin,

Boscowitsch, Gerdil, com todos os grandes

astrônomos, todos os grandes pesquisadores das

ciências naturais, todos os grandes matemáticos dos

séculos passados. E se porventura me perguntarem

pela razão, terei prazer em explicá-la. Verão que

minha convicção é resultado de estudo cuidadoso e

não de preconceitos."

Augustin Louis Cauchy (1789-1857)

vi

Lista de Figuras

Figura 1 – Desenho esquemático de um biossensor .................................................. 9

Figura 2 – Exemplos de analitos, reconhecedores e transdutores atualmente

utilizados em biossensores [11] ................................................................................ 10

Figura 3 – Esquema de um MOSFET com suas regiões destacadas ....................... 11

Figura 4 – Diagrama de bandas de energia do MOSFET, onde Ec corresponde a

energia da banca de condução, Ei nível de energia intrínseca, Ef nivel de Fermi e Ev

banda de valência ..................................................................................................... 12

Figura 5 – Respostas típicas do MOSFET. VDS, com tensão Vgs fixa. ................... 13

Figura 6 – Esquema de um ISFET com suas regiões destacadas ............................ 14

Figura 7 – Esquema de um EGFET com suas regiões destacadas .......................... 14

Figura 8 - Desenho esquemático do dispositivo EGFET. [j] ..................................... 15

Figura 9 - Resposta típica da medição de VDS e sua relação com o pH .................. 16

Figura 10 – Esquema de montagem da célula analítica com os três eletrodos

(eletrodo de trabalho, eletrodo de referência e contra eletrodo), para medição de

voltametria cíclica. ..................................................................................................... 17

Figura 11 – Reação biocatalisada da glicose pelo oxigênio ...................................... 18

Figura 12 – Esquema ilustrativo dos tipos básicos de métodos de imobilização

enzimáticos: a) adsorção, b) ligação covalente, c) encapsulação, e d) ligação

covalente cruzada. .................................................................................................... 19

Figura 13 – Relação entre VGS e pH da solução para o xerogel de V2O5 [22]. .......... 20

Figura 14 – V2O5 sol-gel ............................................................................................ 21

Figura 15 – Representação da produção do filme de V2O5/FTO. .............................. 22

Figura 16 – Imagem do sensor comercial C110 (a) sem o filme (b) após a adição de

V2O5/Gox. .................................................................................................................. 26

Figura 17 – Fotografias do aparelho usado no teste de VC (a) sensor comercial com

V2O5 testado sobre temperatura controlada usando banho maria, (b) computador e

potenciostado acoplado. ........................................................................................... 26

Figura 18 – Representação de um exemplar de cristal de quartzo piezelétrico. ....... 27

Figura 19 – Sensor EGFET. À direita temos o circuito amplificador instrumental e à

esquerda temos a representação do filme sensível e da solução tampão mensurada

[40]. ........................................................................................................................... 29

vii

Figura 20 – Difratograma da matriz de pentóxido de vanádio (V2O5.nH2O). ............. 30

Figura 21 – Difratograma do filme V2O5/GOx/GLU.................................................... 31

Figura 22 – Micrografia da matriz V2O5 ..................................................................... 33

Figura 23 – Infravermelho do filme de V2O5 antes e após a imobilização com Gox .. 34

Figura 24 – Voltamograma obtido durante os 100 ciclos do filme de V2O5 antes e

após a imobilização de Gox, a 20 mV, na faixa de potencial de -0,5 a 1,0 V, PBS

pH=5,0 glicose 4,4 mmol/L. ....................................................................................... 35

Figura 25 – Variação da carga durante 50 ciclos a 20 mV, na faixa de potencial de -

0,5 a 1,0 V, PBS pH5 glicose 4,4mmol/L, do filme de V2O5 (a) antes e (b) após a

imobilização de Gox. ................................................................................................. 36

Figura 26 – Variação da frequência na faixa de potencial de -0,5 a 1 V durante 50

ciclos a 20 mV, eletrólito PBS, pH 5 e concentração de glicose 4,4mmol/L, do filme

de V2O5 antes (em preto) e após a imobilização de Gox (em vermelho). ................. 37

Figura 27 – Variação da massa na faixa de potencial de -0,5 a 1 V durante 50 ciclos

a 20 mV, eletrólito PBS, pH 5 e concentração de glicose 4,4 mmol/L, do filme de

V2O5 antes (em preto) e após a imobilização de Gox (em vermelho). ...................... 38

Figura 28 - Variação da massa na faixa de potencial de -0,5 a 1 V durante 50 ciclos

a 20 mV, eletrólito PBS, pH 5 e concentração de glicose 4,4mmol/L, do filme de V2O5

após a imobilização de Gox com a adição de Nafion (em vermelho) e sem a adição

de Nafion (em preto). .............................................................................................. 39

Figura 29 – Fotografia do sistema utilizados nos testes do EGFET .......................... 40

Figura 30 – Fotografia (a) disposição dos nos filmes em banho maria, (b) sensores

de vidro com FTO e fio de cobre colado com cola prata e (c) sensores do o filme de

V2O5 depositado ........................................................................................................ 40

Figura 31 – Gráfico de resposta variando a corrente com relação tempo, fixando o

pH em (a) 5,0; (b) 5,2; (c) 5,5 e (d) 5,8. ..................................................................... 43

Figura 32 – Corrente por concentração de glicose, fixando o pH em (a) 5.0, (b) 5.2,

(c) 5.5 e (d) 5.8. ......................................................................................................... 44

Figura 33 – Voltamogramas obtidos durante os 100 cilcos do filme de V2O5 antes e

após a imobilização de Gox, a 20 mV, na faixa de potencial de -0,5 a 1,0 V, PBS 5,0

glicose (a) 4,4 (b) 5,0 (c) 5,5 (d) 6,0 e (e) 6,6. ........................................................... 48

viii

Figura 34 – Variação de carga durante 50 ciclos a 20 mV na faixa de potencial -0,5

a 1,0 V, PBS pH 5,0 do filme ante e após a imobilização com Gox nas

concentrações de glicose (a) 4,4 (b) 5,0 (c) 5,5 (d) 6,0 e (e) 6,6. .............................. 50

ix

Lista de Tabelas

Tabela 1 – Picos de oxidação e redução obtidos na VC antes e após a imobilização

da enzima. ................................................................................................................. 45

x

Lista de Abreviaturas e Siglas

EGFET - Transistores de Efeito de Campo com Gatilho Estendido

VC - Voltametria Cíclica

DRX - Difração de Raios-X

EQCM - Microbalança de Cristal de Quartzo Eletroquímica

Gox - Glicose Oxidase

ISFET - Transistores de Efeito de Campo Sensíveis a Íons

FET - Transistores de Efeito de Campo

MOSFET- Metal Oxide Semicondutor Field Effect Transistor

V2O5 - Petóxido de Vanádio

ZnO - Óxido de Zinco

SnO2 - Dióxido de Estanho

WO3 - Trióxido de Tungstênio

TiO2 - Dióxido de Titânio

NTC - Nanotubos de Carbono

OMS - Organização Mundial de Saúde

Vds - Tensão aplicada entre dreno e a fonte do MOSFET

Vgs - Tensão entre a porta e a fonte

Vref - Tensão de referência

Ids - Corrente entre o dreno e a fonte

AlO3 - Trióxido de Alumínio

PtO2 - Dióxido de Platina

IrO3 - Trióxido de Iridio

Glu - Glutaraldeído

NaVO3 - Metavanadato de Sódio

FTO - Óxido de Estanho dopado com Flúor

xi

NaH2PO4- Fosfato monossódico

Na2HPO4- Fosfato dissódico

xii

SUMÁRIO

1)Resumo ---------------------------------------------------------------- 1

2) Abstract ---------------------------------------------------------------- 2

3) Introdução ---------------------------------------------------------------- 3

4) Objetivos ---------------------------------------------------------------- 6

5) Revisão Teórica ---------------------------------------------------------------- 7

5. 1 Biossensores ---------------------------------------------------------------- 7

5.2 Dispositivos por Efeito de Campo ---------------------------- 10

5.3 Voltametria Cíclica ---------------------------------------------------------- 16

5.4 Glicose ---------------------------------------------------------------- 17

5.4.1 Imobilização enzimática ------------------------------------- 18

6) Procedimento Experimental ------------------------------------------------------- 21

6.1. Preparação do Pentóxido de Vanádio pelo Processo Sol-Gel 21

6.2. Confecção do gatilho estendido -------------------------------------- 21

6.2.1. Rota de Imobilização -------------------------------------- 23

6.3. Métodos de caracterização -------------------------------------- 23

6.3.1. Difração de Raios-X -------------------------------------- 24

6.3.2. Espectrometria na região do infravermelho com

transformada de Fourier ---------------------------------------------------------------- 24

6.3.3. Microscopia Eletrônica de Varredura -------------------- 25

6.3.4. Voltametria Cíclica -------------------------------------- 25

6.3.5.Microbalança de Cristal de Quartzo Eletroquímica---- 27

6.3.6.Transistor de Efeito de Campo com Gatilho Estendido 28

7) Resultados e Discussão -------------------------------------------------------- 30

7.1. Análise da estrutura de V2O5 pela técnica de Difração de Raios-X

------------------------------------------------------------------------------------------- 30

7.2. Estudo da Micrografia do filme de V2O5 ----------------------------- 32

7.3.Análise do aparecimento e deslocamento dos principais picos no

Infravermelho antes e após a imobilização da enzima -------------------- 33

7.4. Estudo do Voltamograma e a possível perda de massa com o

processo -------------------------------------------------------------------------------- 34

xiii

7.5. Variações de massa comprovadas pelo teste de EQCM

(Microbalança de Cristal de Quartzo Eletroquímica) -------------------- 37

7.6. Estudo elétrico do comportamento do biossensor sob diferentes

condições------------------------------------------------------------------------------------- 39

7.7. Estudo eletroquímico do comportamento do biossensor sob

diferentes condições ----------------------------------------------------------------- 44

8) Conclusões -------------------------------------------------------------------------- 51

9) Referências Bibliográficas --------------------------------------------------------- 54

1

1) RESUMO

Félix, A. T. Desenvolvimento de Biossensores impressos de transistores de efeito de campo com gatilho estendido

(EGFET) utilizando Pentóxido de Vanádio para detecção de Glicose.2016. 72 f. Dissertação (Mestrado) - Universidade

Federal de São João Del Rei, Minas Gerais,2016

____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Este trabalho apresenta o desenvolvimento de biossensores impressos de

Transistores de Efeito de Campo com Gatilho Estendido (EGFET), utilizando

pentóxido de vanádio para detecção de Glicose. Os filmes do óxido condutor de

vanádio foram produzidos por spin-coating,e utilizados como membrana para

imobilização da enzima glicose oxidase (Gox) por ligação covalente cruzada. O

material foi depositado sobre um substrato de vidro revestido com FTO (óxido de

estanho dopado com flúor) para os testes no EGFET, e sobre um sensor

comercial Dropsens, modelo C110, para os testes de voltametria cíclica (VC).As

técnicas de caracterização estrutural e morfológica utilizadas foram difratografia

por raios-X, espectrometria na região do infravermelho com transformada de

fourier (FTIR) e microscopia eletrônica de varredura (MEV). Para caracterização

eletroquímica foram utilizadas a voltametria cíclica, microbalança de cristal de

Quartzo Eletroquímica (EQCM) e EGFET, na qual esta última trata-se de medida

elétrica. Os filmes foram testados na faixa de pH de 5,0 a 5,8 variando a

concentração de glicose de 4,4 a 6,6 mmol/L.Os testes no EGFET permitiram

verificar que no pH 5,0, o biossensor obteve melhor resposta eletroquímica,

sendo capaz de identificar a diferença de concentração de glicose no meio com

diferentes valores de corrente. Com intuito de comparar as técnicas de

caracterização eletroquímica com a elétrica, o biossensor produzido foi testado

pela técnica de voltametria cíclica no pH 5,0 e, apesar da mesma linearidade não

ter sido notada nos resultados, a variação dos picos de oxidação e redução antes

e após a imobilização da Gox no filme de V2O5. Melhorias no dispositivo foram

propostas durante a análise parcial dos resultados, outras ainda podem ser

propostas, contudo os resultados obtidos até aqui demonstraram que o

biossensor desenvolvido é capaz de detectar a presença de glicose, gerando

sinais eletroquímicos como resposta.

Palavras-chave:1. V2O5; 2. Glicose;3. Biossensor; 4. Gox; 5. EGFET; 6.VC

2

2) ABSTRACT

This work presents the development of printed biosensors of Extended Gate

Field-Effect Transistor (EGFET) using vanadium pentoxide for glucose detection.

The vanadium conductive oxide films were produced by spin coating, and used as

a membrane for immobilization of the glucose oxidase enzyme (Gox) by covalent

cross-link. The material was deposited on a glass substrate coated with FTO

(Fluorine doped with tin oxide) for EGFET tests; and on a commercial sensor

Dropsens, model C110, for Cyclic Voltammetry (CV) tests. The structural and

morphological characterization techniques used were X-Ray Diffractography,

Fourier Transform Infrared (FTIR) Spectroscopy, and Scanning Electron

Microscope (SEM). For electrochemical characterization were used CV, Quartz

Crystal Electrochemistry Microbalance(EQCM), and EGFET. The films were

tested at a range of pH from 5.0 to 5.8 varying the glucose concentration from 4.4

to 6.6 mmol/L. The EGFET tests allowed verify that at pH 5.0 the biosensor

obtained better electrochemical response, being able to identify the glucose

concentration differences in environments with different electric current values. In

order to compare the electrochemical and electrical characterization techniques,

the produced biosensor was testes by CV technique at pH 5.0 despite the same

linearity was not noted in the results, the variation of oxidation and reduction

peaks before and after the Gox immobilization in the V2O5films. Improvements in

the device were proposed during the partial analyses of the results, others can

also be proposed, however the results obtained until now demonstrate that the

biosensor developed isable to detect the glucose presence generating

electrochemical signals as response.

Key Words: 1. V2O5; 2. Glucose; 3. Biosensor; 4. Gox; 5. EGFET; 6.CV

3

3) INTRODUÇÃO

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Um biossensor é um sensor químico cujo reconhecedor é um componente

biológico ativo usado para detecção de um analito. Existe uma corrida científica na

pesquisa e desenvolvimento desses sensores pelo fato de transcreverem

fenômenos da natureza com sensibilidade e seletividade. Tais sensores biológicos

também são vantajosos por serem construídos como dispositivos de fácil operação,

com diminuição do limite de detecção, permite análise em tempo real com elevado

grau de reprodutibilidade [1].

A busca por dispositivos cada vez menores e que utilizem um menor volume

de amostra vem sendo explorada por pesquisadores da área de química clínica,

processos industriais e medicina. No campo da medicina a necessidade de métodos

rápidos, baratos, confiáveis e que tenham especificidade para a determinação de

substâncias em fluidos biológicos, tais como, as concentrações sanguíneas de

glicose, colesterol, lactato, uréia, creatinina, ácido úrico e hemoglobina, tornou

imprescindível o desenvolvimento de novos sensores bioeletroanalíticos capazes de

realizar esse tipo de tarefa.

Com a finalidade de detectar tais concentrações em fluídos biológicos,

diversos materiais vêm sendo propostos na literatura.Entre eles encontram-se os

óxidos de zinco (ZnO) [2], de estanho (SnO2) [3,4], de tungstênio (WO3) [5], e de

titânio (TiO2) [6]. O uso de nanotubos de carbono (NTC) [7] tem se tornado uma

tendência devido as suas propriedades condutoras, porém algumas propriedades

dos óxidos, como o óxido de vanádio, podem torná-los muito atraentes para serem

usados em sensores biológicos.

O uso de óxido de vanádio obtido pelo método sol-gel apresenta versatilidade

devido à sua estrutura lamelar, a qual pode ser intercalada uma ampla gama de

espécies orgânicas e inorgânicas, resultando em propriedades eletrônicas

adquiridas devido à presença de valência mista, bem como propriedades iônicas

resultantes da difusão de prótons na fase aquosa [8]. Adicionalmente, o sol-gel de

pentóxido de vanádio apresenta maior flexibilidade em sua rede inorgânica. Tal

propriedade proporciona maior controle sobre o tamanho dos poros do

material,facilitando assim a difusão do analito até que este alcance o reconhecedor

biológico.Essa difusão facilitada permite que a integridade da estrutura

4

tridimensional das enzimas e,conseqüentemente, a atividade catalítica, sejam

amplamente preservadas durante os testes biológicos [9].

Dispositivos potenciométricos são largamente utilizados para transformação

do sinal químico proveniente das reações enzimáticas em sinais elétricos

mensuráveis.Assim, são os dispositivos baseados em efeito de campo.Os FETs

(transistores por efeito de campo) foram empregados pela primeira vez em 1970

pelo cientista e professor Piet Bergveld para realização de medidas neurofisiológicas

[10].

Transistores com sensibilidade a íons foram os primeiros a serem

desenvolvidos e são denominados Transistores de Efeito de Campo Sensíveis a

Íons, ou ISFET como sigla para o respectivo em inglês Ion Sensitive Field Effect

Transistor. Tais transistores apresentam pequenas dimensões e são baseados em

dispositivos semicondutores. Quando comparados com outros tipos de

biossensores, os ISFETs apresentam as seguintes vantagens: miniaturização, alta

sensibilidade, baixo custo e potencial para multi-detecção[11]. No entanto, como

desvantagem, os ISFETs podem apresentar problemas com o isolamento do

sistema FET em relação à solução, e o contato entre ambos é prejudicial às

medidas; além disso, o contato entre o sistema FET e a solução dificulta a

reutilização desse tipo de dispositivo. Adicionalmente, o processo de construção

desse dispositivo é oneroso e árduo. O primeiro material a ser utilizado como

dielétrico sensível a pH nesses dispositivos foi o dióxido de silício (SiO2) [11].

Tendo em vista as dificuldades de operação apresentadas pelo ISFET tornou-

se necessário aprimorar os sistemas de detecção dos sensores, O Transistor de

Efeito de Campo com Gatilho Estendido, cuja sigla EGFET é correspondente ao

nome em inglês Extended Gate Field Effect Transistor, surgiu com a finalidadede

aprimorar a construção dos sensores e proporcionar a reutilização do sistema. Uma

membrana responsável pela detecção dos íons é depositada sobre um substrato e

conectada ao transdutor comercial MOSFET do termo em inglês Metal Oxide

Semicondutor Field Effect Transistor, por um fio, sendo por isso chamado de porta

estendida [12]. Esse formato permite o isolamento total do FET em relação à

solução. No caso de biossensores a superfície de um EGFET é modificada

acrescentando sobre ela uma camada de material biológico capaz de reconhecer o

analito.

5

Existem biossensores para os quais é necessário utilizar uma matriz de

imobilização para que o material biológico não se desprenda da superfície do

EGFET durante o procedimento de análise e detecção do analito, o pentóxido de

vanádio foi utilizado nesse trabalho como membrana para imobilização da enzima

glicose oxidase (Gox). A enzima foi utilizada afim de detectar glicose em fluidos

biológicos de forma reprodutível, também foi verificada a sensibilidade do dispositivo

à detecção de glicose.

Quando se imobiliza uma enzima por ligação cruzada sobre a matriz de

imobilização, pode-se fazer de 200 a 1000 detecções com o uso de apenas uma

membrana com o material biocatalítico, esse tipo de imobilização garante a

aderência da enzima da matriz e sua reutilização [13].

A reutilização de um biossensor pode representar um considerável ganho

sócio ambiental, visto que de acordo com a Organização Mundial da Saúde, OMS,

cerca de 350 milhões de pessoas em todo o mundo sofrem de diabetes; e que no

Brasil esse número é de aproximadamente 12 milhões. Tais pacientes utilizam por

dia,no mínimo, uma fita reativa para dosagem de glicose através do próprio material

biológico,gerando,portanto,um descarte estimado de pelo menos12 milhões de fitas

diariamente. Dessa forma, considerando que um portador de diabetes use seu

biossensor 200 vezes, número que representa o mínimo possível de reutilizações

por dispositivo, a cada 200 dias 2,4 trilhões de fitas com material biológico

potencialmente contaminante deixariam de ser descartadas no meio ambiente. Logo,

o reuso dos sensores poderia ser considerado um avanço econômico e social não

só para os portadores de diabetes, mas para a população como um todo.

Sensores comerciais acessíveis à maioria da população são também doados

pelo governo a portadores de diabetes, esses sensores são fitas de papel contendo

o reconhecedor biológico. Porém, no Brasil essas fitas ainda são caras para o

governo e para a população porque o país ainda não produz esse material.Além

disso, o grande número de fitas que a população demanda torna essa

disponibilização ainda mais onerosa.

Ao consumidor final, para cada detecção,no mínimo uma tira é descartada por

dia, resultando em um custo médio de 1 a 2 reais. Pacientes que necessitam de um

maior controle, chegam a utilizar de três a cinco fitas diárias

6

Deve-se ainda levar em consideração que acidentes podem acontecer com os

encarregados de recolher o lixo doméstico, e também com as pessoas que catam

lixo nos aterros sanitários, pois trata-se de um material biológico descartado em

grande volume. Quantidade essa a qual é acrescida o número de seringas, agulhas

e lancetas utilizadas.

Considerando a importância do desenvolvimento dos biossensores como

descrito acima, e com base em trabalhos da literatura aqui usados como referenciais

teóricos, este trabalho apresenta a síntese e caracterização do filme de pentóxido de

vanádio (V2O5), via sol-gel, a imobilização da enzima glicose oxidase (Gox) para

produção do biossensor, e a sua caracterização.Como caracterizações estruturais

foram utilizadas as técnicas de Difração de Raios-X (DRX), Espectrometria na

Região do Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR), Microscopia

Eletrônica de Varredura (MEV), e para as caracterizações elétricas foram utilizados o

Transistor de Efeito de Campo com Gatilho Estendido(EGFET), Voltametria Cíclica

(VC) e Microbalança de Cristal de Quartzo Eletroquímica (EQCM).

No decorrer deste trabalho a imobilização da enzima na membrana foi

confirmada pelos métodos de caracterização empregados e listados acima. A

sensibilidade do dispositivo na faixa de pH de 5,0 a 5,8 variando a concentração de

glicose de 4,4 a 6,6 mmol/L também foi apresentada. Os testes permitiram o

aprimoramento da rota de construção do dispositivo biossensor, e a definição das

melhores condições de operação e de resposta do dispositivo.

7

4) OBJETIVOS

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Objetivo Geral

Desenvolver um biossensor impresso de transistores de efeito de campo com

gatilho estendido (EGFET) utilizando pentóxido de vanádio e glicose oxidase afim de

detectar a concentração de glicose em solução.

Objetivos específicos:

1. Preparar o pentóxido de vanádio a partir da rota sol-gel;

2. Caracterizar o óxido através das técnicas de difração de raios-X, microscopia

eletrônica de varredura, infravermelho com transformada de Fourier;

3. Promover a imobilização da enzima Gox nos filmes em estudo;

4. Estudar o sensor no EGFET para detecção de glicose.

5) REVISÃO TEÓRICA

___________________________________________________________________

A revisão teórica desse trabalho apresenta o embasamento técnico-científico

para realização desse projeto. Estão transcritos aqui os principais referenciais

teóricos sobre os biossensores enzimáticos, processos de imobilização, utilização, e

vantagens da membrana de imobilização utilizada (V2O5), bem como o processo de

caracterização EGFET utilizado e ainda pouco explorado na literatura.

5.1. Biossensores

Um sensor é um dispositivo capaz de converter um sinal de entrada em outro

tipo de sinal mensurável [14], podendo ser classificado em seis grupos distintos

entre si: químicos, elétricos, magnéticos, mecânicos, radioativos e térmicos. Os

sensores químicos são extremamente importantes, pois são capazes de determinar

as substâncias químicas presentes no meio e quantificá-las[15].

Biossensores são considerados dispositivos indispensáveis na área

médica.Existe uma crescente demanda de aprimoramento e expansão da

aplicabilidade, disponibilidade e viabilidade desses sensores para melhor

atendimento e tratamento de pacientes [16,17]. O monitoramento de parâmetros

8

como colesterol, lactato, uréia, ácido úrico, hemoglobina, dentre outros faz parte de

uma demanda reconhecida internacionalmente [18].

Um biossensor é um sensor químico cujo reconhecedor é um componente

biológico capaz de reconhecer um determinado analito, convertendo uma

informação química em um sinal elétrico detectável. Para construção desse

dispositivo, diversos materiais já foram propostos na literatura. Como reconhecedor

podem ser usados materiais biológicos como enzimas, anticorpos, antígenos,

células, organelas e outros; conectados a um transdutor, ou seja, um dispositivo

capaz de converter um tipo de sinal em outro [19, 20]. Quando o material biológico

utilizado é uma enzima, estes sensores são denominados biossensores enzimáticos,

capazes de fazer uso da atividade enzimática desse tipo de proteína como sinal a

ser monitorado no processo de identificação do analito [21].

Os biossensores podem ser classificados em três distintas gerações de

acordo com o mecanismo utilizado na transferência de elétrons: primeira, segunda

ou terceira. No primeiro caso, os biossensores de primeira geração,o sinal

amperométrico surge como resultado da oxidação ou redução do substrato sobre a

superfície do eletrodo. O substrato é definido como a molécula na qual a enzima age

de maneira específica. Por conseguinte, os dispositivos de segunda geração são

utilizados contando com o auxílio de mediadores livres em solução, ou imobilizados

na enzima, capazes de reduziras interferências causadas por outros compostos que

estão presentes em solução e são capazes de oxidar a superfície do eletrodo e

inativar o centro ativo da enzima. Os biossensores de terceira geração, por sua

vez,são classificados pela transferência direta de elétrons entre a superfície do

eletrodo e a enzima [22].

Um esquema básico do funcionamento de um biossensor pode ser visto na

Figura1, onde a superfície seletiva, o bioreceptor, reconhece o sinal biológico e o

converte em sinal elétrico pelo transdutor [23].

9

Figura 1–Desenho esquemático de um biossensor

Diferentes substâncias e espécie e grandezas podem ser detectadas por

sensores.Dentre elas constam: elétrons, íons, calor, massa, absorbância e luz. Para

cada um dos itens detectáveis existe um ou mais tipos de transdutor capaz de

transformar o sinal biológico em sinal elétrico.A escolha do transdutor está baseada

no tipo de resposta gerada pelos diferentes organismos biológicos.Quando a

grandeza a ser detectada é, por exemplo, a luz, deve-se usar um transdutor ótico.No

caso de sinais provenientes de fontes de calor, o transdutor deve ser calorimétrico e

assim por diante. A Figura 2 sumariza o tipo de transdutor adequado a ser utilizado

de acordo com a grandeza detectada, proveniente de diversos materiais biológicos.

Portanto, o primeiro passo para construção de um biossensor é definir o tipo

de detecção requerido, isto é, qual tipo de analito necessita ser mensurado. O

segundo passo deve-se então escolher o tipo de material que se encaixa ao tipo do

biossensor, buscando atingir alta sensibilidade, menor influência possível na reação

de interesse e alta especificidade, a escolha do material biológico é importante pois

determinará tais fatores. O terceiro passo é a escolha do transdutor, essa está

diretamente relacionada com a grandeza a ser detectada.

O aperfeiçoamento dos biossensores enzimáticos, requer o aperfeiçoamento

dos métodos de imobilização, preservando a atividade das biomoléculas e suas

condições particulares como concentração, pH e temperatura. Para escolha do

biomaterial,diversas técnicas de caracterização podem ser úteis, como a voltametria

cíclica para testes eletroquímicos e infravermelho e DRX para testes estruturais.

10

ANALITO (SUBSTRATO) MATERIAL

BIOLÓGICO GRANDEZA DETECTADA

TRANSDUTOR

EL

ET

RÔ

NIC

A

ANTICORPOS

ANTÍGENOS

ENZIMAS

GASES

ÍONS

METABÓLITOS

MICRORGANISMOS

PROTEÍNAS

ANTICORPOS

ANTÍGENOS

CÉLULAS

ENZIMAS

MEMBRANAS

ORGANELAS

ORGANISMOS

TECIDOS

ELÉTRONS

ÍONS

CALOR

MASSA

ABSORBÂNCIA

LUZ

AMPEROMÉTRICO

POTENCIOMÉTRICO

CONDUTIMÉTRICO

EMFET

CALORIMÉTRICO

PIEZELÉTRICO

ÓTICO

Figura 2–Exemplos de analitos, reconhecedores e transdutores atualmente utilizados em biossensores [12]

Outra forma de classificar os biossensores os divide em 4 classes:

eletroquímicos, são aqueles capazes de detectar elétrons ou íons, os calorimétricos

são responsáveis por detectar calor, os biossensores óticos detectam grandezas

como absorbância e luz e os piezelétricos diferença de massa. Dentro desses tipos

existem subclasses, no caso dos sensores eletroquímicos eles podem ser divididos

de acordo com o tipo de transdutor, podem ser amperométricos, potenciométricos,

condutométricos e os baseados em Transistor de Efeito de Campo (FETs) [24].

5.2. Dispositivos por Efeito de Campo

Os FETs surgiram como uma alternativa aos transdutores de detecção de

íons, tais transdutores utilizavam eletrodos de vidro para fabricação de sensores,

esses eletrodos apresentavam diversas desvantagens, entre elas estão a alta

impedância, o alto custo, o tamanho, fragilidades mecânicas características desse

material cerâmico e,conseqüentemente, o formato limitado; essas limitações

acabaram por reduzir significativamente o campo de uso desse material. Os FETs

têm como característica básica o controle de uma corrente por um campo elétrico

aplicado. Esses transistores de efeito de campo possuem três terminais chamados

porta (G, do inglês, gate), dreno(D, do inglês, drain), e a fonte (S, do inglês, source)e

11

possuem como vantagem a sua alta impedância de entrada, não necessitando de

praticamente nenhuma corrente de entrada na porta para o controle de corrente do

dreno.

A base de fabricação de qualquer biossensor é composta por um MOSFET, o

MOSFET é um dos dispositivos mais importantes na composição do biossensor é

baseado no efeito de campo. Esse dispositivo possui uma estrutura composta por

três partes. A primeira é um substrato de material semicondutor (S), dopado tipo-p

(portadores positivos, buracos); essa parte é tipicamente feita de silício. A segunda é

uma camada de material isolante, esta encontra-se sobre o substrato, ela é

tipicamente constituída de algum tipo de óxido (O). A terceira parte encontra-se

sobre a camada de óxido e é constituída por uma camada metálica (M). O MOSFET

possui três terminais, como mostrado na Figura 3: a fonte, o dreno – ambos

semicondutores dopados do tipo-n (portadores negativos, elétrons) – e a porta A

chamada VDS é a tensão aplicada entre dreno e a fonte do MOSFET, e a chamada

VGS, é a tensão entre a porta e a fonte. VREF é a tensão de referência, aplicada no

eletrodo de referência. A corrente medida é a chamada IDS, pois é a corrente entre o

dreno e a fonte.

Figura 3– Esquema de um MOSFET com suas regiões destacadas

Em função da tensão aplicada sobre a porta (gate) o MOSFET pode

comportar-se de maneira diferente, como demonstrado na Figura 4. Nas

configurações que se seguem a acumulação ocorre quando um potencial negativo é

aplicado à porta do transistor, temos buracos, ou seja cargas positivas, se

acumulando na superfície do semicondutor. A depleção ocorre quando a polarização

é inversa, positiva, sobre a porta, levando os buracos para longe do semicondutor,

formando assim uma região de depleção.

nível de Fermi para o metal é tão baixo que os elétrons da banda de condução do

semicondutor são atraídos para a região adjacente do isolante, até que essa região

passe a ter características de um semicondutor do tipo n.

Ao se aplicar um campo perpendicular ao plano da folha na região de

inversão, o condutor passa a ter resistência extremamente baixa,

portanto, o nome de canal tipo n

princípio de funcionamento o campo elétrico aplicado a ele.

Figura 4–Diagrama de bandas de energia do MOSFET, onde Econdução, Ei nível de energia intrínseca, E

A porta do MOSFET é isolada do restante do transistor pelo óxido, podendo

controlar a corrente entre o dreno e a f

aplicada na porta. As respostas típicas do MOSFET estão demonstradas na

5.

Configuração de

acumulação



assim uma região de depleção. Na terceira configuração, a inversão,



ter características de um semicondutor do tipo n.


inversão, o condutor passa a ter resistência extremamente baixa,

o nome de canal tipo n [24]. Com isso o dispositivo formado tem como

de funcionamento o campo elétrico aplicado a ele.

Diagrama de bandas de energia do MOSFET, onde Ec corresponde a energia da banca de nível de energia intrínseca, Ef nível de Fermi e Ev banda de valência


controlar a corrente entre o dreno e a fonte devido a uma

aplicada na porta. As respostas típicas do MOSFET estão demonstradas na

Configuração de

depleção

Configuração de

inversão

12



terceira configuração, a inversão, o




inversão, o condutor passa a ter resistência extremamente baixa, recebendo,

o formado tem como

corresponde a energia da banca de banda de valência


onte devido a uma variação de tensão

aplicada na porta. As respostas típicas do MOSFET estão demonstradas na Figura

Configuração de

inversão

13

Figura 5 –Respostas típicas do MOSFET. VDS, com tensão VGS fixa.

As curvas apresentam dois estágios, primeiro linear e segundo atingem a

saturação onde mesmo aumentando os valores de VDS os valores de corrente

permanecem inalterados. Dependendo exclusivamente dos valores de VGS aplicado.

Os eletrodos de íons seletivos são comumente utilizados ISFET (Ion Sensitive

Field Effet Transistor), onde basicamente a porta do metal do MOSFET é substituída

por uma camada sensível a íons.

O ISFET capaz de detectar mudanças de pH, surgiram 1970 fabricado por

Bergveld [25]. O seu funcionamento está baseado na combinação do MOSFET com

um eletrodo sensível a íons que introduzido no seio da solução, através da alteração

do campo elétrico na interface isolante-semicondutor que ocorre devido à

concentração de íons presentes na solução, modula-se então a intensidade da

corrente elétrica através do MOSFET [26]. Eletrodo sensível a íons são eletrodos

que permitem a determinação da atividade de espécies iônicas na presença de

outros íons [26]. O esquema de um ISFET pode ser visto na Figura6.

A capacidade de miniaturização do ISFET e a possibilidade de se utilizar

processos de microfabricação são características importantes de um FET [28].

Porém apresenta dificuldade de encapsulamento, devido ao contato da porta com a

solução sem, porém, o corpo do transistor estar em contato, além disso não é

possível a troca da camada sensível, tendo que ser trocado todo o dispositivo a cada

análise.

14

Figura 6– Esquema de um ISFET com suas regiões destacadas

Frente a diversas desvantagens do ISFET como instabilidade, devido ao

contato entre o FET e a solução iônica, e baixa sensibilidade a corrente, surge um

novo avanço no aprimoramento dos FETs que é elaboração do EGFET (Extended

Gate Field-Effect Transistor), neste tipo de sensor a porta é estendida permitindo

isolamento total do FET em relação à solução, o que permite a reutilização do

MOSFET, a camada sensível a íons é conectado ao MOSFET comercial por um fio

estendendo a porta para fora do dispositivo [29]. Por isso, o EGFET é utilizado como

uma poderosa ferramenta para o estudo de materiais que possam ser utilizados

como sensores de pH e biossensores. O esquema de um EGFET pode ser visto na

Figura7.

Figura 7 – Esquema de um EGFET com suas regiões destacadas

15

No sistema EGFET o eletrodo de referência e o filme sensível são imersos

dentro da solução de interesse e o sensor é conectado na porta do MOSFET

comercial. Analogamente ao MOSFET, a tensão aplicada entre o dreno e a fonte é

chamada VDS,VGS é a tensão entre a porta e a fonte e VREF é a tensão de referência

aplicada no eletrodo de referência. A corrente IDS é a corrente medida entre o dreno

e a fonte. Um esquema da montagem do EGFET pode ser visto na Figura 8, onde é

possível identificar o FET utilizado, bem como o eletrodo de referência e o sensor

imersos na solução tampão de PBS (solução salina, contendo cloreto de

sódio, fosfato de sódio)

Figura 8 -Desenho esquemático do dispositivo EGFET. [31]

Segundo a literatura [30], existe uma tendência dos óxidos se ligarem aos

íons hidroxila, ao entrarem em contato o sensor com a solução as moléculas de

água são atraídas para a superfície da amostra pelo óxido, formando uma camada

neutra de água que serve como sítios de ligação capazes de adsorver íons H+

formando íons hidrônios (H3O+), ou seja as cargas positivas da solução se deslocam

para perto do filme sensível a íons criando uma barreira de cargas positivas entre o

filme e a solução ficando na solução um excesso de cargas positivas, dessa maneira

observa-se um ΔV (variação de potencial) entre a superfície do filme e o interior da

solução devido à separação de cargas [31-33]. Quando se aplica uma diferença de

potencial à solução pelo eletrodo de referência com relação à fonte, obtemos o

chamado VREF, ou seja, o valor observado da diferença de potencial da amostra em

relação a fonte (VGS) será o valor do VREF acrescido do valor ΔV (VGS = VREF + ΔV).

16

Portanto, quanto maior a oferta de íons H+, maior será ΔV e a corrente medida terá

uma maior amplitude.

Mantendo-se VGS constante e variando VDS é possível medir VDS, dessa

maneira se pode observar o resultado típico de um EGFET e sua relação com o pH

do meio na Figura 9.

Figura 9 - Resposta típica da medição de VDS e sua relação com o pH

5.3 Voltametria Cíclica

A técnica de voltametria cíclica se baseia na variação de potencial elétrico

controlada em um sistema eletroquímico. Esse potencial é aplicado no eletrodo de

trabalho variando ciclicamente em função do tempo, a corrente é obtida como

resposta. Como ocorre a repetição dos ciclos, a técnica recebe o nome de

voltametria cíclica. O resultado da voltametria obtido é expresso em um

voltamograma, ou seja, um gráfico de tensão versus corrente.

O número de elétrons transferidos durante as reações de oxidação e redução

que ocorrem na superfície do eletrodo de trabalho pode ser determinado pela

equação 1, onde é necessário introduzir os valores de potencial de pico anódico

(Epa) e potencial de pico catódico (Epc).

∆� = �� − �� =�,��

�

(equação 1)

17

O esquema da Figura 10 mostra os três eletrodos (eletrodo de trabalho,

eletrodo de referência e contra eletrodo) inseridos em uma solução para medição de

voltametria cíclica. Cada um dos três eletrodos possui uma função na obtenção dos

resultados. Sobre o eletrodo de trabalho é aplicado o potencial, nele ocorrerão as

reações envolvendo o analito. O eletrodo de referência permite o controle do valor

de potencial aplicado sobre o eletrodo de trabalho, mantendo o potencial constante

na célula eletroquímica. O contra eletrodo ou eletrodo auxiliar é utilizado para

completar o circuito eletroquímico, pois permite o fluxo de corrente entre o eletrodo

de referência e o eletrodo de trabalho. Ao se aplicar a ddp (diferença de potencial)

entre o eletrodo de trabalho e o eletrodo de referência, ocorre o aumento da

resistência no eletrodo de referência e a diminuição no contra eletrodo, permitindo a

passagem da corrente entre o eletrodo de trabalho e o contra eletrodo[34].

Figura 10–Esquema de montagem da célula analítica com os três eletrodos (eletrodo de trabalho, eletrodo de referência e contra eletrodo), para medição de voltametria cíclica.

5.4 Glicose

Alguns materiais vêm sendo utilizados como membrana sensível a íons: AlO3,

PtO2, IrO3, TiO2[5], V2O5/WO3 [35] SnO2[36], ZnO [2], polímeros [37], nanotubos [38],

e o V2O5 [25], entre outros. O óxido de vanádio obtido pelo método sol-gel[40]

18

apresenta uma estrutura lamelar, onde podem ser intercaladas espécies orgânicas e

inorgânicas, conferindo ao material propriedades eletrônicas e também iônicas

através da difusão de prótons no eletrólito [7]. Outra vantagem nesse processo de

síntese é um maior controle sobre o tamanho dos poros, facilitando a difusão do

analito até o reconhecedor biológico [41].

5.4.1. Imobilização enzimática

A imobilização de moléculas sobre a matriz confere aos biossensores uma

característica importante que é a especificidade [13, 53]. Diversos estudos buscam

imobilizar enzimas para confecção de sensores [43,44]. Um importante exemplo é a

imobilização da enzima glicose oxidase (Gox) que necessita da presença da

molécula de glicose para funcionar, através de um artifício bioquímico conhecido

como "chave-fechadura".

Biossensores sensíveis à glicose são baseados na oxidação biocatalisada da

glicose pelo oxigênio molecular na presença da Gox. O ácido glucônico resultante

torna o meio mais ácido através da dissociação de prótons [8]. A reação pode ser

vista na Figura 11.

Figura 11 – Reação biocatalisada da glicose pelo oxigênio

A imobilização do material biológico sobre a matriz diminui consideravelmente

o custo da análise, isso porque o material não é difundido para solução,

conseqüentemente não é necessário recuperá-lo para realizar análises posteriores.

É importante que a imobilização não desnature o centro ativo da enzima, alguns

métodos são descritos na literatura[14], (a) oclusão em gel, onde a enzima é

confinada dentro de espaços intersticiais das ligações covalentes cruzadas de um

polímero insolúvel; (b) microencapsulação, nesse processo a enzima é confinada em

β - D Glicose D- Glicose- δ- lactona D- ácido glucônico

19

pequenas esferas de membranas semi permeáveis com micro poros que permitem a

movimentação de substrato e produtos da reação enzimática; (c) na adsorção física

e/ou química ocorrem interações entre a enzima e a matriz que geralmente

apresenta uma superfície ativa favorável à adsorção; (d) ligação química covalente,

nesse tipo de imobilização grupos funcionais não ativos da enzima se ligam de

forma covalente a grupos reativos da matriz; (e) a maneira mais vantajosa de

imobilização por meio de ligação química cruzada, isso porque a adição de

reagentes bifuncionais favorece a formação de partículas macroscópicas através da

formação de ligações covalentes cruzadas entre a enzima, o suporte e o reagente

adicionado. Na literatura o principal reagente utilizado nesse tipo de imobilização é o

glutaraldeído (Glu). O glutaraldeído garante a estabilidade da enzima frente a

variações de pH, temperatura, solvente, etc. Os tipos básicos de imobilização

enzimática podem ser vistos na figura 12 a seguir.

Figura 12– Esquema ilustrativo dos tipos básicos de métodos de imobilização enzimáticos: a) adsorção, b) ligação covalente, c) encapsulação, e d) ligação covalente cruzada.

Na confecção do EGFET sobre o gatilho estendido adiciona-se a matriz de

imobilização, neste trabalho a matriz utilizada foi o V2O5, e sobre ela a enzima Gox

foi imobilizada utilizando glutaraldeído. Uma alternativa explorada no decorrer deste

trabalho é a utilização de Nafion sobre o filme após a imobilização. Essa opção foi

explorada afim de verificar as condições em que o filme permanece estável sobre o

sensor.

Para funcionar com o sensor no EGFET o filme utilizado deve apresentar

características como boa sensibilidade ao analito de interesse, linearidade e

insensibilidade a fatores indesejáveis, ou seja, elementos interferentes. Ao se

produzir um biossensor enzimático buscou-se eliminar a interferência de tais fatores,

visto que a reação entre a enzima e substrato é altamente seletiva.

20

A sensibilidade da membrana foi testada na literatura como demonstrado na

Figura 13 [25], para o filme de V2O5a sensibilidade da membrana pode ser obtida

através da relação entre ID e VGS. Como pode ser observado na Figura 13, a

sensibilidade média (58.1 ± 0.8 mV/pH) é muito próxima ao valor teórico de 59.2 mV

[23].

Figura 13–Relação entre VGS e pH da solução para o xerogel de V2O5 [22].

2 4 6 8 10 12

1,6

1,8

2,0

2,2

2,4

2,6

Sensibilidade = 58.1 mV/pH

VDS

= 0.3 V

IDS

= 463 A

Carbono Vitreo

VG

S (

V)

pH

21

6) PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

___________________________________________________________________

6.1. Preparação do Pentóxido de Vanádio pelo Processo Sol-Gel

O gel de pentóxido de vanádio (V2O5·nH2O) foi preparado,conforme síntese

descrita da literatura [44] (Figura 14),via acidificação de uma solução aquosa de

metavanadato de sódio 0,1 mol.L-1. A solução de NaVO3 é transparente e contém

espécies de polivanadatos como [V4O12], a qual foi percolada numa coluna de resina

de troca iônica (Dowex-50x8) na forma ácida. A solução obtida após a passagem do

NaVO3pela coluna foi deixada em repouso por 7 dias obtendo-se por meio de uma

reação autocalítica uma solução viscosa de coloração vermelha escura (o gel de

pentóxido de vanádio). Em seguida, o xerogel foi obtido a partir da secagem do gel

por evaporação simples, a temperatura ambiente, formando assim o V2O5nH2O (n

1,8) [45].

Figura 14 – V2O5 sol-gel

6.2. Confecção do gatilho estendido

Para a confecção do gatilho estendido, foi escolhido o substrato de vidro de

10 mm x 10 mm de área superficial revestida com FTO (Fluorine doped Tin Oxide).

Os eletrodos vidro/FTO foram preparados e limpos com sucessivos banhos de

ultrasson. Cada banho durou 10 min, o primeiro foi feito na presença de água

destilada, para o segundo utilizou-se álcool etílico e o terceiro propanona. Após

secos, o fio condutor de cobre foi colado com cola prata e o contato foi isolado com

époxi. Os eletrodos foram então pesados afim de se ter um controle de massa do

22

filme de V2O5 adicionado. Com a utilização de uma micropipeta, foram gotejados

150�� de pentóxido de vanádio V2O5 xerogel sobre o FTO, controlando assim a

massa do filme. Os filmes foram secos na estufa a 80 ºC, afim de secar o excesso

de água, sem porém interferir na água de hidratação entre as camadas

doV2O5,obtendo-se no fim uma massa de V2O5 de 2,0 mg. Desta forma, somente o

filme fino entrou em contato com as soluções com diferentes pHs e concentrações

de glicose utilizadas (Figura15).

Figura 15– Representação da produção do filme de V2O5/FTO.

Cada filme foi feito em triplicata, foram escolhidos 4 diferentes valores de pHs

(5,0; 5,2; 5,5 e 5,8), esses valores foram escolhidos baseados em informações do

fornecedor da enzima, a temperatura ambiente de melhor atividade enzimática

ocorre no pH 6,1, como o objetivo do biossensor é a análise de fluidos corpóreos e a

temperatura corporal de 36,5 ºCo pH ideal também sofre alteração, dessa maneira

foram testados os pHs acima em tampão PBS , afim de verificar em qual pH se

obtém a melhor atividade da enzima

As concentração de glicose no eletrólito foram de (0; 4,4; 5,0; 6,0; 6,6)

mmol/L, onde zero de concentração serviu como um branco do processo.Já os

valores de 4,4 e 6,6 mmol/L representam valores limítrofes associados à

hipoglicemia e hiperglicemia, consecutivamente [45,46,53]. As demais

concentrações escolhidas de forma aleatória encontram-se dentro da faixa de

concentração de um indivíduo saudável, esses valores foram escolhidos afim de

determinar o funcionamento e sensibilidade do biossensor em toda faixa desejável

de detecção de glicose.

EPÓXI

FIO DE

COBRE

VIDRO/FTO VIDRO/FTO/V2O5

23

Em todos os testes feitos, a temperatura do sistema foi controlada e mantida

a 36,5 ºC, afim de se aproximar da temperatura em que se encontram os fluidos

corpóreos. Dessa maneira para o teste de EGFET obteve-se um total de 72

eletrodos para o teste em triplicata.

6.2.1. Rota de Imobilização

Neste trabalho utilizou-se a rota de imobilização da glicose oxidase via ligação

covalente cruzada com o V2O5 segundo procedimento abaixo:

A adição na enzima sobre o filme foi feita por spincoating na superfície da

amostra usando a razão 1:1, sendo uma camada de solução enzima glicose oxidase

(Gox) 1,5 mg/mL em solução PBS e uma solução de 5 % v/v de glutaraldeído (Glu),

somando 100�� da mistura. Em seguida, após a solução ser gotejada nos filmes

vidro/FTO/V2O5, os mesmos foram secos em um refrigerador com temperatura em

média de 4º C para que fosse mantida a atividade enzimática da Gox.

A solução de fosfato de sódio (PBS) foi preparada em pH=6,1 adicionando

fosfato monossódico (NaH2PO4) e fosfato dissódico (Na2HPO4) ambos em

concentração 0,1mol/L.

6.3. Métodos de caracterização

Neste tópico serão apresentadas as técnicas e métodos de investigação

utilizados na análise e caracterização dos materiais preparados, assim como,

quando conveniente, as condições empregadas nas mesmas.

Os equipamentos utilizados nas análises pertencem a diferentes

universidades que gentilmente colaboraram cedendo sua estrutura para realização

dos experimentos. O testes de Difração por Raios-X foram feitos na UFSJ/DCNAT, a

Espectrometria na Região do Infravermelho com Transformada de Fourier foi feita na

UFOP, a Microscopia Eletrônica de Varredura, Microbalança de Cristal de Quartzo

Eletroquímica e EGFET, foram feitas na USP, no laboratório do prof. Marcelo Mulato

e os testes de Voltametria Cíclica (VC) foram feitos na UFSJ/CAP.

24

6.3.1. Difração de Raios-X

Para a realização de medidas de Difração de Raios-X, pelo método do pó, foi

empregado um aparelho SIEMENS D5005 que utiliza cátodo de cobre e

monocromador de grafite para selecionar a região de emissão K do cobre ( =

1,5418 Å). O potencial na fonte foi de 40 kV e a corrente de 40 mA. Os padrões de

raios-X foram obtidos na faixa compreendida entre 2oa 50o (2) e em um passo de

0,2o a cada segundo. Para a obtenção dos difratogramas, as amostras foram

preparadas em substratos de vidro. De posse dos difratogramas seus picos foram

analisados utilizando a equação de Bragg para determinar a distância entre os

espaçamentos interlamelares. A lamelaridade do material pode ser obtida pela

comparação dos valores das distâncias interlamelares (dhkl) obtidas para cada um

dos picos basais. Esta distância pode ser calculada pela equação de Bragg:

n = 2 dhklsen

(Equação 2)

onde n é a ordem de reflexão do pico, dhkl o espaçamento interlamelar para o pico

hkl e o ângulo de Bragg, determinado pelo pico de difração. A repetição do valor d,

para n = 1, 2, 3,....n, demonstra a lamelaridade do material.

6.3.2.Espectrometria na região do infravermelho com transformada de

Fourier

As amostras para análise no infravermelho foram preparadas usando a

amostragem em pastilha de KBr. As pastilhas desta mistura foram obtidas utilizando-

se um pastilhador numa pressão de 107Pa.

Os espectros no infravermelho foram obtidos usando espectrofotômetro

infravermelho por transformada de Fourier, modelo Bomem MB-100, com

20acumulações, na faixa de 400 – 4000cm-1.Este método é baseado na interferência

da radiação entre dois feixes resultando um interferograma. Um interferograma é o

registro do sinal produzido pela combinação das múltiplas freqüências possíveis de

obter com a transformada de Fourier. A conversão do interferograma para espectro

é conseguida pelo tratamento matemático com transformadas de Fourier.

25

6.3.3. Microscopia Eletrônica de Varredura

A morfologia do V2O5 sol gel foi analisada por um microscópio eletrônico de

varredura JOEL modelo JSM6610LV. As amostras foram fixadas no porta-amostra

com uma fita de carbono. Uma cobertura fina de ouro ( 20Å) foi aplicada sobre as

amostras por 120s visto que o V2O5 é um material semicondutor. Esta camada é

responsável por conferir condutividade elétrica suficiente para a geração de boas

imagens.

6.3.4.Voltametria Cíclica

A voltametria cíclica permite a observação dos processos de oxidação e

redução que ocorrem nos sítios localizados na estrutura do material

eletroquimicamente ativo do eletrodo, é uma das técnicas eletroanalíticas mais

usadas no processo de caracterização eletroquímica.

Os experimentos de voltametria cíclica foram feitos num

Potenciostato/Galvonostato AutoLab III interfaciado a um computador. O eletrodo

utilizado nos testes é comercial Dropsens®, modelo C110, sendo constituído por um

eletrodo de trabalho de carbono vítriocom4 mm de diâmetro, um eletrodo auxiliar de

carbono e um contra eletrodo de prata e contatos elétricos também de prata, como

pode ser observado na Figura16 A e B.Como eletrólito utilizou-se para o primeiro

teste PBS pH 5,0 glicose 4,4mmol/L, essa concentração foi inicialmente escolhida

dentre da série de concentrações a serem testadas, como descrito na rota de

imobilização. Demais testes de VC foram feitos em diferentes concentrações de

glicose após se escolher o pH ideal para o biossensor segundo os resultados

obtidos no EGFET.

Os potenciais utilizados foram os referentes à região de transferência de

carga, conforme observado nos voltamogramas cíclicos, com velocidade de

varredura, , de20 mVs-1. Para se obter voltamogramas com picos de oxidação e

redução bem definidos, diversas velocidades de varreduras foram testadas,

obtendo-se melhores resultados a 20mV.s-1. A faixa de potencial também foi testada

de -3,0 a 3,0 V, e posteriormente reduzida aos valores onde são possíveis observar

o par redox. Sobre o eletrodo comercial foi depositado 0,2 mg de V2O5 e para

26

imobilização 100�� na mistura de Gox e Glu. Esse eletrodo foi escolhido afim de se

aproximar o máximo possível dos sensores já comercializados.

A montagem utilizada para os testes de Voltametria Cíclica pode ser vista na

Figura 17 A e B, onde o potenciostato/galvanostato usado no teste de VC é

acoplado com computador e ao sensor comercial com V2O5, imerso em solução PBS,

sobre temperatura controlada usando banho maria.

Figura 17– Imagem do potenciostato/galvanostato usado no teste de VC (a) sensor comercial com V2O5 testado sobre temperatura controlada usando banho maria, (b) computador.

A B

Figura 16– Imagem do sensor comercial C110 (a) sem o filme (b) após a adição de V2O5/Gox.

A) B)

27

6.3.5.Microbalança de Cristal de Quartzo Eletroquímica

Para medida de variação de massa foi utilizado como sensor pizoelétrico uma

Microbalança de Cristal de Quartzo Eletroquímica, ou seja, a microbalança foi

acoplada a um potenciostato. Nessa técnica oscilações mecânicas ressonantes são

geradas uma vez que a perturbação elétrica aplicada também possuía propriedades

oscilatórias, ou seja, ocorreu deformações na estrutura do cristal de quartzo.

Para esse estudo foram usados cristais de quartzo disponíveis

comercialmente, esses cristais possuem uma fina camada de ouro eletrodepositada

nas duas faces. A lâmina de quartzo apresenta 13,9 milímetros de diâmetro,o

eletrodo de ouro possui 6 milímetros de diâmetro, com uma espessura na faixa de

3.000 A 10.000 Å, como representado na Figura 18. A faixa de potencial utilizada foi

de -0,5 V a 1,0 V com uma velocidade de varredura de 20mV/s em PBS pH 5 e

concentração de glicose 4,4 mmol/L.

Depositou-se 2mg de V2O5sol gel sobre a superfície do cristal, após seco a na

estufa a 80ºC foram realizados 50 ciclos na faixa de potencial de -0,5 V a 1,0 V,

sobre o mesmo filme adicionou-se Gox/Glu como descrito na rota de imobilização e

50 ciclos foram novamente feitos.

Afim de testar se é possível melhorar a estabilidade dos filmes sobre o

eletrodo, os testes foram novamente repetidos com novos filmes adicionando-se

sobre eles 25 µL de Nafion após a imobilização da enzima pela mesma técnica

usada na fabricação de filme de V2O5de spincoating.

Figura 18– Representação de um exemplar de cristal de quartzo piezelétrico.

28

Frequências fundamentais ressonantes são geradas nos cristais piezelétricos,

podendo sofrer alterações (∆� ) de acordo coma variação de massa total (∆�) ,

presente no sitema. Sendo assim, existe uma relação de linearidade entre ∆� e ∆� ,

que pode ser expressa em termos matemáticos pela equação de Sauerbrey.

∆� = −2,3. 10��

20∆�

�

(Equação 3)

sendo:

∆� = variação da frequência (Hz)

F0 = freqüência fundamental ressonante da lâmina de quartzo (MHz)

∆� = variação de massa total depositada nos eletrodos presentes nas faces

do cristal (g)

A= área do eletrodo que pode ou não ser recoberta por modificador químico

(cm2)

A equação 2 foi usada para analisar os resultados obtidos pela técnica de

EQCM, pois através dela podemos inferir que quanto maior for o valor da vibração

de massa total do sistema, menor será o valor da freqüência de vibração

ressonante.

6.3.6.Transistores de Efeito de Campo com Gatilho Estendido

O sensor eletroquímico potenciométrico utilizado [47], baseia-se no circuito

amplificador instrumental utilizando o amplificador operacional (AmpOp) CA3140.

AFigura19 mostra o sistema experimental do sensor que por sua vez encontrou-se

interligado a um computador que recebia os dados obtidos pelos equipamentos,

sendo estes dados tratados com o programa licenciado OriginPro 8.

O filme sensível de V2O5foi conectado à entrada principal e imerso na solução

enquanto a segunda entrada foi aterrada, bem como um eletrodo de referência

(Ag/AgCl) imerso na solução. O potencial gerado pelas cargas em solução foi

mensurado pelo sistema para cada valor de pH por 900 segundos gerando um total

de 450 pontos. A caracterização foi repetida por 24 vezes, compreendendo todos os

valores de pH e concentração de glicose citados no processo de confecção do

29

gatilho estendido. Cada teste foi feito em triplicata de maneira simultânea, imergindo

no eletrólito três gatilhos, cada um conectado separadamente ao sistema de

amplificação. Após os testes com o filme de pentóxido de vanádio, a enzima Gox foi

imobilizada sobre os mesmos, após seco cada sensor recebeu 25 µL de Nafion.

Figura 19– Sensor EGFET. À direita temos o circuito amplificador instrumental e à esquerda temos a representação do filme sensível e da solução tampão mensurada [46].

30

7) RESULTADOS E DISCUSSÃO

___________________________________________________________________

7.1. Análise da estrutura de V2O5 pela técnica de Difração de Raios-X

O difratograma que caracteriza o pentóxido de vanádio é apresentado a

seguir. Na Figura 20 é possível observar que mesmo após a secagem do material a

estrutura lamelar é mantida, tal observação é provada pela presença do pico intenso

de difração (001) e três picos de menor intensidade eqüidistantes, característico de

um material lamelar.

10 20 30 40 50

00l25 cps

Inte

nsi

dad

e / u

. a

.

2 / Graus

Figura 20 – Difratogramada matriz de pentóxido de vanádio (V2O5.nH2O).

003

004 005

001

31

Através do cálculo da lei de Bragg, é possível verificar que a distância

interplanar foi de d=1,17 nm sugerindo que as moléculas de água estão intercaladas

em uma razão de 1,8, temos então a seguinte hidratação V2O5.1,8H2O, este

resultado pode também ser observado na literatura [48].

Na Figura 21 está representado o difratograma do filme com a glicose oxidase

já imobilizada com glutaraldeído. Pode-se observar o deslocamento dos picos para

ângulos maiores e uma diminuição na intensidade,com isso o espaçamento

interlamelar é diminuído, devido a diminuição da cristalinidade como conseqüência

da imobilização. Nota-se que a estrutura lamelar do V2O5 foi preservada pela

presença dos picos eqüidistantes003,004 e 005, porém a superfície ficou menos

cristalina após a imobilização.

Figura 21–Difratograma do filme V2O5/GOx/GLU

V2O5/ Glu/Gox

003

004 005

001

32

7.2. Estudo da Micrografia do filme de V2O5

A imagem referente à micrografia do V2O5 xerogel, está demonstrada na

Figura 22. Nesta Figura 22, pode-se observar a presença de aglomerados fibrosos

interconectados. Esses aglomerados podem estar associados com os centros de

nucleação. O crescimento é promovido, primeiramente, por oligômeros e, no

segundo estágio, há a formação e crescimento de fibras resultando em uma cadeia

polimérica organizada de V2O5.nH2O.

O V2O5.nH2O consiste de cadeias poliméricas localizadas no plano da

superfície de orientação ainda não estudas, porém, a distância entre as camadas é

bem definida e depende da quantidade das moléculas de água intercaladas. De

acordo com a literatura [49], em decorrência do processo de nucleação e

crescimento ocorre a produção de espécies coloidais fibrosas,durante a evolução

estrutural causada pela gelação do ácido vanádico, ocorre a formação de partículas

whisker (monocristais muito fino, de alta perfeição, que possui uma razão

comprimento/diâmetro extremamente grande). Após a reação de olação e oxolação,

formam-se fibras que se entrelaçam e são descritas como fitas planas exibindo uma

estrutura bidimensional [50].

As fibras, formadas pela reação de condensação do ácido vanádico,

provavelmente, apresenta uma estrutura VO5 piramidal e, durante o crescimento há

a formação de cátions de dioxovanadio. No crescimento dessa matriz pode ocorrer

também a formação da estrutura esferulita com cadeias poliméricas. Esse tipo de

configuração consiste de um cristalcom algumas regiões amorfas interligadas

geradas na etapa de nucleação [51].

Figura 22

Afim de comparar a morfologia do filme de V

ainda será necessário fazer novos testes de MEV após a imobilização com Gox,

complementando os resultados já obtidos pela DRX

7.3. Análise do aparecimento e deslocamento dos principais picos no

Infravermelho antes e após a imobilização da enzima

O espectro na região do

mostrado na Figura 23. A banda em 1010 cm

referente ao grupo vanadila (V=O), e a banda em 762 cm

νassim(V–O–V). A banda em 536 cm

νsim(V–O–V) associados com as pontes de ligação formadas pelo vanádio

oxigênio[52].

Para o V2O5 com a glicose imobilizada, representado pela curva preta

Figura 23, nota-se o aparecimento

C-O ao grupo carbolina dos aminoácidos que formam

A banda do ácido

intensa e larga porém,

moléculas de hidratação do V

estiramento no N-H das aminas formadas a partir das ligações peptídicas dos

aminoácidos que aparecem na região de 3300 a 350

22– Micrografia feita da superfície da matriz de V

Afim de comparar a morfologia do filme de V2O5 antes e após a imobilização,


complementando os resultados já obtidos pela DRX e o FTIR.

Análise do aparecimento e deslocamento dos principais picos no

após a imobilização da enzima

na região do infravermelho da membrana de V

. A banda em 1010 cm−1 está relacionada ao estiramento V

referente ao grupo vanadila (V=O), e a banda em 762 cm

V). A banda em 536 cm−1 é devido aos modos de vibração do

V) associados com as pontes de ligação formadas pelo vanádio

com a glicose imobilizada, representado pela curva preta

se o aparecimento de uma banda em1120 cm−1, referente a vibração

ao grupo carbolina dos aminoácidos que formam a molécula de glicose oxidase

A banda do ácido carboxílico entre 3300 e 2500 cm−

sobrepõem a banda de O-H entre 3200 e 2500

moléculas de hidratação do V2O5. O mesmo é possível ocorrer com as vibrações de

H das aminas formadas a partir das ligações peptídicas dos

aminoácidos que aparecem na região de 3300 a 3500cm−1.

33

V2O5

antes e após a imobilização,


Análise do aparecimento e deslocamento dos principais picos no

infravermelho da membrana de V2O5xerogel é

cionada ao estiramento V–O

referente ao grupo vanadila (V=O), e a banda em 762 cm−1 é referente a

é devido aos modos de vibração do

V) associados com as pontes de ligação formadas pelo vanádio-

com a glicose imobilizada, representado pela curva preta da

, referente a vibração

a molécula de glicose oxidase.

−1aparece de forma

H entre 3200 e 2500cm−1 das

. O mesmo é possível ocorrer com as vibrações de

H das aminas formadas a partir das ligações peptídicas dos

34

Para as bandas presentes antes e após a imobilização da enzima observa-se

um pequeno deslocamento em média de 4 cm−1, evidenciando a imobilização da

enzima sobre a matriz de V2O5. A imobilização da enzima com o auxílio do

glutaraldeído é evidenciada devido ao deslocamento das vibrações do V2O5que

passaram de 1010cm−1no estiramento V–O referente ao grupo vanadila (V=O) para

1006cm−1,a banda em 762 cm−1 é referente a νassim(V–O–V) passa a aparecer em

759cm−1 e a banda em 536 cm−1referente aos modos de vibração do νsim(V–O–V), se

desloca para 530cm−1.

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

(C

-O)

(V

OV

) s

(V

OV

) a

(V

=O

)

tra

nsm

itân

cia

/u

.a.

Numero de ondas /cm-1

V2O

5 / Gox

V2O

5

Figura 23– Espectro de infravermelho do filme de V2O5 antes e após a imobilização com Gox

7.4. Estudo do Voltamograma e a possível perda de massa com o

processo

Os resultados dos voltamogramas cíclicos estão representados pelos ciclos 1,

2, 25 e 50 do filme de V2O5 antes da imobilização e pelos ciclos 1, 2, 25 e 50 do

mesmo filme após a imobilização de Gox, na Figura 24. Para o filme de antes da

35

imobilização é possível observar um pico catódico em 0,26 V e um pico anódico em -

0,30 V correspondente ao par VV/IV. A área coberta do eletrodo comercial foi de

aproximadamente 1,0 cm2, utilizou-se como eletrólito o tampão PBS pH 5,0 com

glicose 4,4 mmol/L.

A intensidade de corrente diminui a medida em que se aumenta o número de

ciclos até atingir estabilidade, que será melhor explorada nas Figuras 25 A e 25 B,

ao se comparar o primeiro com o segundo ciclo ocorre uma brusca mudança na

intensidade de corrente, devido as reações de inserção e desinserção de elétrons no

filme, consequentemente, a carga total diminui a medida que ocorrem os ciclos. Com

a adição da glicose oxidase o filme V2O5/Gox apresentou um novo comportamento

devido à atividade da enzimática da Gox, frente à glicose presente no meio.O novo

material (V2O5/Gox), passa a apresentar novas características eletroquímicas,

características essas, particulares de cada material, a transferência de cargo ocorre

em outra região devido a mudança da estrutura.Nesse caso pode-se observar um

novo pico catódico em 0,19V e anódico em 0,01V que também tende à estabilidade.

Com a possível estabilização estrutural do filme antes da imobilização as mudanças

observadas no voltamograma depois da adição de Gox indicam uma possível

imobilização da enzima no substrato. O mesmo procedimento deve ser repetido em

diferentes concentrações de glicose esperando diferentes perfis voltamétricos.

-0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

-0,0012

-0,0010

-0,0008

-0,0006

-0,0004

-0,0002

0,0000

0,0002

0,0004

0,0006

V2O

5 ciclo 1

V2O

5 ciclo 2

V2O

5 ciclo 25

V2O

5 ciclo 50

V2O

5/Gox ciclo 1

V2O

5/Gox ciclo 2

V2O

5/Gox ciclo 25

V2O

5/Gox ciclo 50

potencial /V

j /

A.c

m-2

Figura 24– Voltamograma obtido durante os 100 ciclos do filme de V2O5 antes e após a imobilização de Gox, a 20 mV, na faixa de potencial de -0,5 a 1,0 V, PBS pH=5,0 glicose 4,4 mmol/L.

36

As Figuras 25 A e 25 B foram obtidas a partir do voltamograma cíclico do

V2O5 antes e após a imobilização de Gox, pode-se notar que taxa de variação da

carga diminui à medida em que se aumenta o número de ciclos, ou seja, as reações

de transferência de carga tendem a ficar estáveis devido à reestruturação do V2O5

com inserção e desinserção de íons, atingindo um equilíbrio dinâmico na superfície

do eletrodo, mantendo a estrutura do material.Porém, pequenas oscilações podem

ser observadas principalmente antes da adição de Gox. Isso se dá a uma provável

perda de massa, ou seja, uma nova camada do filme eletroativa é exposta, com isso

ocorre um aumento na transferência de carga que anteriormente tendia à

estabilização.

Com a adição de Gox nota-se uma tendência na diminuição de carga sem

tantas variações, isso porque a adição de glicose oxidase com glutaraldeído ocorre

por ligações covalentes cruzadas, dificultando a perda de massa e exposição de

camadas internas do filme. Essa melhora na estabilidade estrutural ajuda a

confirmar a eficácia na imobilização da enzima. A partir do ciclo 40 nota-se um

aumento no valor da carga provavelmente a uma nova perda de massa e exposição

de camadas internas do filme ocorreu, com isso nota-se que a imobilização dificultou

a perda de massa porém não a impediu, tal observação será melhor explorada pela

técnica de EQCM a seguir.

0 10 20 30 40 50

5

10

15

20

25

30

35

Número de ciclos

Qto

tal /

mC

.cm

-2

0 10 20 30 40 50

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

Número de ciclos

Qto

tal /

mC

.cm

-2

Figura 25–Variação da carga durante 50 ciclos a 20 mV, na fapixa de potencial de -0,5 a 1,0 V, PBS pH5 glicose 4,4mmol/L, do filme de V2O5 (a) antes e (b) após a imobilização de Gox.

a) b)

37

7.5.Variações de massa comprovadas pelo teste de EQCM (Microbalança

de Cristal de Quartzo Eletroquímica)

Através da equação de Sauerbrey podemos inferir que quanto maior for o

valor da vibração de massa total do sistema, menor será o valor da freqüência de

vibração ressonante.

O principal objetivo dos estudos com a microbalança de quartzo foi avaliar a

possível perda de massa do filme durante as ciclagens eletroquímicas antes e após

a imobilização da Gox. Isso porque durante o processo notou-se uma tendência de

aumento da carga do material. Na Figura 26 podemos observar que o valor da

freqüência é aumentado à medida em que ocorre a ciclagem do material na faixa de

potencial de -0,5 V a 1,0 V, pela equação de Sauerbrey podemos dizer que ocorre

uma perda de massa do filme. O que justifica o aumento de carga observado no

voltamograma devido à exposição de camadas mais internas do filme, ou ainda não

ativas. É provável que a perda de massa pode ser devido a saída da enzima

imobilizada deixando a superfície do V2O5 diretamente exposta. Entretanto, para

confirmar essa hipótese, será necessário fazer uso de técnicas capazes de conferir

o que realmente está presente na superfície como, por exemplo, MEV e EDX.

-0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

fre

qu

ên

cia

/ H

z

potencial/ V

V2O

5

V2O

5 / Gox

Figura 26– Variação da frequênciana faixa de potencial de -0,5 a 1 V durante 50 ciclos a 20 mV, eletrólito PBS, pH 5 e concentração de glicose 4,4mmol/L, do filme de V2O5 antes (em preto) e após a

imobilização de Gox (em vermelho).

38

Na Figura 27, podemos notar que a enzima confere ao filme uma menor

perda de massa, representada pelos valores negativos no eixo y, ou seja, o filme se

torna mais estável, evidenciando a eficiência das ligações cruzadas entre a enzima,

o substrato e o glutraldeído, dessa maneira o filme é capaz de resistir por mais

tempo. É possível observar semelhantemente ao resultado da voltametria onde o

valor da carga é mais estável após a adição de Gox que existe uma maior

estabilidade do filme quanto à perda de massa após a imobilização, o que é

favorável na construção de um biossensor capaz de ser utilizado por diversas vezes.

Na Figura 28, temos a relação da perda de massa durante os 50 ciclos de

varredura, porém para esse teste, após seguido o protocolo de imobilização da Gox

formam adicionados 25 µL de Nafion, que funciona como uma membrana

conferindo mais aderência do filme ao elétrodo, permitindo a interação entre a

enzima(Gox) e a glicose do meio. Comparando-se os dois resultados obtidos nota-

se uma diminuição na perda de massa com a adição do Nafion, que passou de

-0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

-590

-585

-580

-5

-4

-3

-2

-1

0

V2O

5/ Gox

V2O

5

mass

a /g

potencial/ V

Figura 27– Variação da massa na faixa de potencial de -0,5 a 1 V durante 50 ciclos a 20 mV, eletrólito PBS, pH 5 e concentração de glicose 4,4 mmol/L, do filme de V2O5 antes (em preto) e após a

imobilização de Gox (em vermelho).

39

uma variação de aproximadamente -13 µg para -4 µg. Dessa maneira podemos

afirmar que a adição de Nafion é uma etapa que deve ser acrescentada ao

procedimento de montagem do biossensor, após a imobilização da enzima.

7.6. Estudo elétrico do comportamento do biossensor sob diferentes

condições

Para os testes no EGFET foram utilizadas todas as combinações de pH e

concentração de glicose pré estabelecidas, afim de definir as condições ideais em

que o filme melhor responde à presença de glicose.

O equipamento utilizado para obtenção dos resultados que se seguem pode

ser visto na Figura 29, onde o sistema foi mantido a temperatura constante utilizando

-0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

-18

-16

-14

-12

-10

-8

-6

-4

-2

0

ma

ssa

/ g

potencial aplicado/ V

V2O

5/ Gox

V2O

5/ Gox/ Nafion

Figura 28- Variação da massa na faixa de potencial de -0,5 a 1 V durante 50 ciclos a 20 mV, eletrólito PBS, pH 5 e concentração de glicose 4,4mmol/L, do filme de V2O5 após a imobilização de

Gox com a adição de Nafion (em vermelho) e sem a adição de Nafion (em preto).

40

banho-maria. A Figura 30 A, B e C mostra a disposição dos filmes para teste em

triplicata simultânea, o sensor produzido antese após a adição do filme.

Figura 29 – Imagem do sistema utilizado nos testes do EGFET

Figura 30 – Imagens (a) da disposição dos nos filmes em banho maria, (b) dos sensores de vidro com FTO e fio de cobre colado com cola prata e (c) de sensores do o filme de V2O5 depositado

NaFigura31 A-D em cada uma delas o valor do pH do eletrólito foi fixado, em

5,0; 5,2; 5,5 e 5,8 respectivamente, em todos os casos observou-se que a corrente

obtida como resposta diminui após a adição de Gox de pelo menos 0,1 A quando

A) B) C)

41

comparada o valor da corrente antes da adição de glicose oxidase, evidenciando a

imobilização da enzima.

Em todas as figuras é possível também observar que após a imobilização da

enzima independente da concentração de glicose no meio ocorre um decaimento da

corrente nos primeiros instantes tendendo no decorrer do experimento à estabilidade

pois, após 200s os valores de corrente praticamente não variam.

Nos primeiros 200 segundos iniciais a estabilidade do filme é menor, no caso

do filme sem a Gox os valores de corrente primeiro crescem para depois atingir a

estabilidade, já nos filmes com a enzima imobilizada existe uma tendência inicial de

decréscimo nos valores de correm para depois atingirem a estabilidade. Essa

diferença se dá devido às reações enzimáticas que ocorrem após a imobilização,

observadas também na VC com o deslocamento dos picos de oxidação e redução. É

muito provável que ocorra uma estabilização/acomodação da estrutura, similar ao

que ocorre nos estudos eletroquímicos.

Figura 31 A – Corrente com relação tempo, fixando o pH em 5,0

0 100 200 300 400 500 600

0,45

0,50

0,55

0,60

0,65

0,70

0,75

0,80

V2O

5 - 0,0 mM

V2O

5 - 4,4 mM

V2O

5 - 5,0 mM

V2O

5 - 5,5 mM

V2O

5 - 6,0 mM

V2O

5 - 6,6 mM

V2O

5/Gox - 0,0 mM

V2O

5/Gox - 4,4 mM

V2O

5/Gox - 5,0 mM

V2O

5/Gox - 5,5 mM

V2O

5/Gox - 6,0 mM

V2O

5/Gox - 6,6 mM

Corr

ente

/ A

Tempo /s

A)

42

Figura 32 B– Corrente com relação tempo, fixando o pH em 5,2.

Figura 33 C – Corrente com relação tempo, fixando o pH em 5,5.

0 100 200 300 400 500 600

0,45

0,50

0,55

0,75

V2O

5 - 0,0 mM

V2O

5 - 4,4 mM

V2O

5 - 5,0 mM

V2O

5 - 5,5 mM

V2O

5 - 6,0 mM

V2O

5 - 6,6 mM

V2O

5/Gox - 0,0 mM

V2O

5/Gox - 4,4 mM

V2O

5/Gox - 5,0 mM

V2O

5/Gox - 5,5 mM

V2O

5/Gox - 6,0 mM

V2O

5/Gox - 6,6 mM

Corr

ente

/ A

Tempo / s

0 100 200 300 400 500 600

0,40

0,45

0,50

0,55

0,75

0,80

V2O

5 - 0,0 mM

V2O

5 - 4,4 mM

V2O

5 - 5,0 mM

V2O

5 - 5,5 mM

V2O

5 - 6,0 mM

V2O

5 - 6,6 mM

V2O

5/Gox - 0,0 mM

V2O

5/Gox - 4,4 mM

V2O

5/Gox - 5,0 mM

V2O

5/Gox - 5,5 mM

V2O

5/Gox - 6,0 mM

V2O

5/Gox - 6,6 mM

Corr

ente

/ A

Tempo (s)

B)

C)

43

Figura 34 D – Corrente com relação tempo, fixando o pH em 5,8.

Após a estabilidade dos valores de corrente é possível realizar a

correspondência de cada corrente final com relação à concentração de glicose

presente no meio 0,0, 4,4, 5,0, 5,5, 6,0 e 6,6 (mol/L),como pode ser observado na

Figuras 32 A-D. Para isso foi utilizado o último valor de corrente registrado no tempo

final igual a 450s das figuras 31 A -D. Observa-se na Figura 32 A que para o

primeiro valor de pH de 5,0 após a adição da enzima nota-se uma tendência na

diminuição da corrente ao aumentar-se a concentração de glicose. Dessa maneira,

podemos utilizar esse pH como referência para realização de experimentos

posteriores no equipamento EGFET a fim de verificar se o efeito permanece quando

os filmes são utilizados repetidas vezes.

0 100 200 300 400 500 600

0,45

0,50

0,55

0,60

0,75

0,80

V2O

5 - 0,0 mM

V2O

5 - 4,4 mM

V2O

5 - 5,0 mM

V2O

5 - 5,5 mM

V2O

5 - 6,0 mM

V2O

5 - 6,6 mM

V2O

5/Gox - 0,0 mM

V2O

5/Gox - 4,4 mM

V2O

5/Gox - 5,0 mM

V2O

5/Gox - 5,5 mM

V2O

5/Gox - 6,0 mM

V2O

5/Gox - 6,6 mM

Corr

ente

/ A

Tempo / s

D)

44

a)

-1 0 1 2 3 4 5 6 7

0,45

0,50

0,55

0,60

0,65

0,70

0,75

0,80

V2O

5

V2O

5 / Gox/ Nafion

Co

rre

nte

Fin

al (

A)

[ ] de glicose (mmol/L)

b)

-1 0 1 2 3 4 5 6 7

0,45

0,50

0,55

0,60

0,65

0,70

0,75

0,80

V2O

5

V2O

5 / Gox/ Nafion

Co

rre

nte

Fin

al (A

)


c)

-1 0 1 2 3 4 5 6 7

0,45

0,50

0,55

0,60

0,65

0,70

0,75

0,80

V2O

5

V2O

5 / Gox/ Nafion

Co

rre

nte

Fin

al (

A)


d)

-1 0 1 2 3 4 5 6 7

0,45

0,50

0,55

0,60

0,65

0,70

0,75

0,80

V2O

5

V2O

5 / Gox/ Nafion

Co

rre

nte

Fin

al (

A)


Figura 35 – Corrente por concentração de glicose, fixando o pH em (a) 5.0, (b) 5.2, (c) 5.5 e (d) 5.8.

7.7 Estudo eletroquímico do comportamento do biossensor sob

diferentes condições

De posse dos resultados obtidos no EGFET, novos testes de VC foram

realizados no pH em que melhor respondeu ao biossensor, afim de comparar os

resultados obtidos em ambas as técnicas. Adicionou-se ao filme V2O5/Gox o Nafion®

afim de impedir a exposição de novas camadas do filme e estabilizar os valores de

corrente e carga. Fixando o pH em 5,0 variou-se a concentração de glicose nas

45

concentrações de(4,4, 5,0, 5,5, 6,0 e 6,6,) mmol/L os voltamogramas obtidos estão

na Figura33 A, B, C, D, e E, respectivamente.

Para os testes de voltametria o sensor impresso comercial C110, foi escolhido

no lugar do FTO afim de se aproximar aos modelos de sensores de glicose

disponíveis no mercado. Como já explanado esse sensor possui três eletrodos

(referência, trabalho e contra-eletrodo), diferentemente da técnica de EGFET que

possui dois eletrodos (trabalho e referência).

Com a mudança da técnica e mudança do tipo de eletrodo, pretendeu-se

observar em quais circunstâncias o biossensor produzido responderia melhor, ou

seja, apresentaria melhor correlação eletroquímica ao se variar a concentração de

glicose e pH do meio.

Em todos os resultados notou-se que a intensidade de corrente diminuiu com

o aumento do número de ciclos tendendo a estabilidade, exceto na concentração de

glicose 5,5 mol/L,onde ocorreu o aumento na intensidade de corrente e carga, com o

aumento do número de ciclos, tal fator pode ser associado a exposição de novas

áreas no filme, ou seja é provável que o Náfion® adicionado não tenha coberto toda

a superfície permitindo a exposição de áreas mais internas no filme.

Com a imobilização da glicose um novo comportamento foi observado, devido

a reação enzimática,pode-se notar o deslocamento do pico anódico para valores de

menor potencial relacionados nas segunda e terceira coluna da Tabela 1, onde se

observam-se, também, os picos catódicos após a imobilização referente a redução

da enzima.

Tabela 1 – Picos de oxidação e redução obtidos na VC antes e após a

imobilização da enzima.

Concentrações de glicose (mmolL-1)

Picos anódicos V2O5(V)

Picosanódicos V2O5/ Gox (V)

Picos catódicos V2O5/ Gox (V)

4,4 0,18 -,009 0,19 5,0 0,08 -0,06 0,32 5,5 0,09 -0,01 0,27 6,0 0,18 -0,06 0,27 6,6 0,11 -0,05 0,23

46

-0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

-0,0004

-0,0003

-0,0002

-0,0001

0,0000

0,0001

0,0002

0,0003

potencial / V

j /

A.c

m-2

V2O

5 ciclo 1

V2O

5 ciclo 2

V2O

5 ciclo 25

V2O

5 ciclo 50

V2O

5/Gox ciclo 1

V2O

5/Gox ciclo 2

V2O

5/Gox ciclo 25

V2O

5/Gox ciclo 50

-0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

-0,0003

-0,0002

-0,0001

0,0000

0,0001

0,0002

potencial / V

j /

A.c

m-2

V2O

5 ciclo 1

V2O

5 ciclo 2

V2O

5 ciclo 25

V2O

5 ciclo 50

V2O

5/Gox ciclo 1

V2O

5/Gox ciclo 2

V2O

5/Gox ciclo 25

V2O

5/Gox ciclo 50

A)

B)

Figura 36 A –Voltamograma obtido durante os 100 ciclos do filme de V2O5 antes e após a

imobilização de Gox, a 20 mV, na faixa de potencial de -0,5 a 1,0 V, PBS 5,0 glicose 4,4 mmol/L.

Figura 37 B –Voltamograma obtido durante os 100 ciclos do filme de V2O5 antes e após a


47

-0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

-0,0004

-0,0003

-0,0002

-0,0001

0,0000

0,0001

0,0002

0,0003

0,0004

potencial / V

j /

A.c

m-2

V2O

5 ciclo 1

V2O

5 ciclo 2

V2O

5 ciclo 25

V2O

5 ciclo 50

V2O

5/Gox ciclo 1

V2O

5/Gox ciclo 2

V2O

5/Gox ciclo 25

V2O

5/Gox ciclo 50

-0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

-0,0004

-0,0003

-0,0002

-0,0001

0,0000

0,0001

0,0002

0,0003

0,0004

0,0005

j /

A.c

m-2

V2O

5 ciclo 1

V2O

5 ciclo 2

V2O

5 ciclo 25

V2O

5 ciclo 50

V2O

5/Gox ciclo 1

V2O

5/Gox ciclo 2

V2O

5/Gox ciclo 25

V2O

5/Gox ciclo 50

potencial / V

C)

D)

Figura 39 C –Voltamograma obtido durante os 100 ciclos do filme de V2O5 antes e após a


Figura 38 D –Voltamograma obtido durante os 100 ciclos do filme de V2O5 antes e após a


48

-0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

-0,0003

-0,0002

-0,0001

0,0000

0,0001

0,0002

j /

A.c

m-2

V2O

5 ciclo 1

V2O

5 ciclo 2

V2O

5 ciclo 25

V2O

5 ciclo 50

V2O

5/Gox ciclo 1

V2O

5/Gox ciclo 2

V2O

5/Gox ciclo 25

V2O

5/Gox ciclo 50

potencial / V

Figura 40–Voltamograma obtido durante os 100 ciclos do filme de V2O5 antes e após a

imobilização de Gox, a 20 mV, na faixa de potencial de -0,5 a 1,0 V, PBS 5,0 glicose 6,6

mmol/L.

Nas Figura 34 A, B, C, D e E,obtidas a partir do voltamogramas anteriores,

podem-se notar que a taxa de variação de carga diminui a medida que o número de

ciclos aumenta, tendendo a estabilidade, exceto na concentração de 5,5, onde é

provável que o Náfion® não tenha impedido a exposição de camadas mais internas

do filme através da inserção e desinserção de íons durante o processo de ciclagem.

A tendência na estabilidade dos valores de corrente carga demonstram que o

biossensor criado pode ser utilizado repetidas vezes sem a perda na qualidade no

resultado. Como uma tendência na linearidade dos resultados na VC não podem ser

observadas, observou-se a necessidade de testar a técnica para valores de pH

diferentes, afim de obter uma linearidade, tal qual observou-se no teste do EGFET.

Para os valores de pH e concentração de glicose escolhidos a técnica de

EGFET mostrou-se mais eficaz na detecção do analito, pois foi possível observar

uma melhor correlação entre o resultado elétrico obtido e a concentração de glicose

no meio, outro fator importante para a obtenção dos resultados além da mudança de

E)

49

técnica pode estar associada a mudança no tipo de eletrodo, já que o eletrodo de

trabalho utilizado no EGFET foi de vidro recoberto com FTO e na Voltametria cíclica

foi utilizado um sensor impresso comercial com eletrodo de trabalho de carbono

vítreo. Dessa maneira propor novos teste, com utilizando o mesmo eletrodo de

trabalho pode favorecer a comparação das técnicas e alterar os resultados obtidos.

0 10 20 30 40 50

2

4

6

8

10

12

14

Número de ciclos

Qto

tal /

mC

.cm

-2

V2O

5

V2O

5/Gox

Figura 41 A – Variação de carga durante 50 ciclos a 20 mV na faixa de potencial -0,5 a 1,0 V, PBS pH 5,0 do filme ante e após a imobilização com Gox na concentração de glicose 4,4mmol/L

0 10 20 30 40 50

2

4

6

8

10

Número de ciclos

Qto

tal /

mC

.cm

-2

V2O

5

V2O

5/Gox

Figura 42 B – Variação de carga durante 50 ciclos a 20 mV na faixa de potencial -0,5 a 1,0 V, PBS pH 5,0 do filme ante e após a imobilização

com Gox na concentração de glicose 5,0 mmol/L

0 10 20 30 40 50

2

4

6

8

10

12

14

Número de ciclos

Qto

tal /

mC

.cm

-2

V2O

5

V2O

5/Gox

Figura 43 C – Variação de carga durante 50 ciclos a 20 mV na faixa de potencial -0,5 a 1,0 V, PBS pH 5,0 do filme ante e após a imobilização


0 10 20 30 40 50

5

10

15

20

25

Número de ciclos

Qto

tal /

mC

.cm

-2

V2O

5

V2O

5/Gox

Figura 44 D – Variação de carga durante 50 ciclos a 20 mV na faixa de potencial -0,5 a 1,0 V, PBS pH 5,0 do filme ante e após a imobilização


A) B)

C) D)

50

0 10 20 30 40 50

2

4

6

8

10

12

14

16

Qto

tal /

mC

.cm

-2

Número de ciclos

V2O

5

V2O

5/Gox

Figura 45 E – Variação de carga durante 50 ciclos a 20 mV na faixa de potencial -0,5 a 1,0 V, PBS pH 5,0 do filme ante e após a imobilização com Gox na concentração de glicose 6,6 mmol/L

.

E)

51

8) CONCLUSÕES

___________________________________________________________________

No presente trabalho, foi demonstrada a adequação de emprego do filme de

V2O5,usado como matriz de imobilização da enzima glicose oxidase por ligação

covalente cruzada com glutaraldeído, para o desenvolvimento de biossensores

eletroquímicos enzimáticos. Inicialmente foi realizada a construção do sensor

através da deposição por spincoating do filme de V2O5, sobre os eletrodos de

trabalho de carbono vítreo para o teste de voltametria cíclica e sobre o eletrodo de

vidro recoberto com FTO para o teste no EGFET. Após a coleta dos resultados de

ambas as técnicas a imobilização de glicose oxidase sobre os mesmos filmes foi

feita afim de comparar os resultados obtidos e provar a efetiva imobilização da

enzima na matriz.

A imobilização da enzima por ligação covalente cruzada representou um

grande desafio e foi testada diversas vezes variando a concentração de

glutaraldeído e Gox, até a obtenção dos resultados satisfatórios apresentados pelas

técnicas de caracterização utilizadas.A falta de referências que evidenciassem a

imobilização dificultou o trabalho, por isso inúmeros testes preliminares foram feitos,

alterando a ordem de adição entre a enzima e o glutaraldeído e mistura entre elas.

Outro parâmetro também testado foi a concentração e quantidade necessária das

soluções para imobilização.

A técnica utilizada para testar inicialmente a imobilização foi a voltametria

cíclica, essa foi feita exaustivamente até que se observou o padrão apresentado

neste trabalho, onde ocorreu os deslocamentos do picos característicos do

voltamograma de cada material.Essa técnica se mostrou eficaz para tal finalidade,

visto que representou o meio mais rápido para visualizar a mudança de resposta

eletroquímica com a adição de Gox, além disso o potenciostato utilizado era de fácil

acesso, diferentemente das demais técnicas utilizadas.

O V2O5 xerogel foi caracterizado pela técnica de espectroscopia de FTIR

onde as principais bandas foram observadas, após a imobilização com Gox os

espectros foram contrapostos e novas bandas apareceram referentes a presença de

Gox. Na DRX, foi possível identificar que após a adição da enzima houve

alteraçãoda estrutura evidenciando a imobilização da enzima na matriz de

imobilização. A MEV possibilitou a caracterização morfológica do filme de V2O5, bem

52

como a visualização das fibras no filme, como previsto na literatura. Assim sendo, as

técnicas de caracterização morfológica se mostraram suficientes e eficazes para

caracterização do biossensor.

Nas caracterizações eletroquímicas os voltamogramas apresentaram perfil

diferenciado antes e após a adição de Gox, sendo possível identificar a imobilização,

porém um decaimento no valor da carga foi observado, como esse fator contrapunha

os resultados esperados, onde a carga deveria tender a estabilidade, favorecendo a

reutilização do biossensor. Esse decaimento da carga total pode estar relacionado a

reestruturação do V2O5 devido a inserção e desinserção de íons durante o processo

de ciclagem. Dessa maneira apesar da técnica ter se mostrado eficaz para avaliar o

comportamento eletroquímico do biossensor na presença do analito, foi necessário

complementar os estudos utilizando a técnica de EQCM para avaliar o motivo do

decaimento da carga e suas oscilações.

A EQCM permitiu avaliar a perda de massa do filme ao longo dos 50 ciclos

experimentais estipulados para técnica de VC.Através da técnica foi possível

aprimorar o processo de montagem do sensor acrescentando-se Nafion após a

imobilização afim de diminuir a perda de massa, motivo pelo qual observava-se o

aumento da carga no voltamograma.

Foram observados nos estudos com EGFET, que através da técnica foi

possível selecionar o melhor valor de pH, ou seja, onde o pH ideal onde o

biossensor é capaz de funcionar em toda faixa de concentração de glicose, pré

selecionada com base na literatura [47,48].

De posse dos resultados obtidos no EGFET, foram feitos testes de VC com o

pH de 5,0 que demonstrou ser o melhor por apresentar resultados mais lineares que

correlacionaram a concentração de glicose ao valor de corrente. Contudo os

resultados na VC não demonstraram a mesma tendência,pois apresentaram

variação dos picos de oxidação e redução aleatoriamente.Demais valores de pH

podem ainda ser testados afim de identificar se é possível identificar um valor de pH

onde os picos de oxidação e redução sejam proporcionais aos valores de glicose.

Apesar de não ser possível correlacionar os valores de corrente com os de

concentração de glicose na técnica de voltametria cíclica, foi possível observar a

eficácia no aprimoramento da montagem do biossensor com Nafion, pois nota-se a

tendência a estabilidade da carga durante os 50 ciclos, como esperado .

53

De posse todos os resultados obtidos até o presente momento pode-se

identificar a imobilização da Gox sobre o filme de V2O5 e o funcionamento do

biossensor na identificação de glicose, como era desejado.

O biossensor obtido após aprimoramentos é capaz de responder a

concentração de glicose no meio com diferentes valores de corrente, novos testes

devem ser programados afim de verificar toda abrangência dos resultados obtidos, a

fim de extrapolar as condições experimentais já propostas.

Buscando a sustentabilidade ambiental, menor descarte de materiais

potencialmente contaminantes, o uso de biossensores capazes de responder a

concentração de glicose em fluídos corpóreos pode representar um avanço

científico. É importante ressaltar que de maneira análoga outras enzimas podem ser

testadas afim de identificar demais analitos de interesse, isso porque as

propriedades eletroquímicas do V2O5 são potencialmente interessantes para esse

tipo de aplicação.

54

8) REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

___________________________________________________________________

[1] FILHO, O. F.; Capelato, M. D. Biossensores. Quimica Nova , v. 15, n. 1, p.

28-39, 1992.

[2] BATISTA, P. D.; MULATO, M. ZnO extended-gate field-effect transistors as

pH sensors. Applied Physics Letters, v. 87, n. 14, p. 1–3, 2008.

[3] - LI, G.-J.; KAWI, S. High-surface-area SnO2: A novel semiconductor-oxide

gas sensor. MaterialsLetters, v. 34, n. 1-2, p. 99–102, 1998.

[4] ARAUJO, L. S. Fabricação e Caracterização de Dispositivos Baseados em

Nanofitas de Óxido de Estanho (SnO2). Dissertação (Mestrado) — Mestrado em

Física - Centro de Ciências Exatas e Tecnologia , Universidade de São Carlos, São

Carlos, 2012.

[5] CHOU, J.-C.; CHIANG, J.-L. Ion sensitive field effect transistor with

amorphous tungsten trioxide gate for pH sensing. Sensors and Actuators, B:

Chemical, v. 62, n. 2, p. 81–87, 2000.

[6] ZHAO, R. et al. A pH sensor based on the TiO2 nanotube array modified Ti

electrode. ElectrochimicaActa, v. 55, n. 20, p. 5647–5651, 2010.

[7]M. D. Rubianes and G. A. Rivas, “Carbon nanotubes paste

electrode,” Electrochemistry Communications, v. 5, no. 8, p. 689–694, 2003

[8] Tsiafoulis, C. G, et al. Electrochemical study of ferrocene intercalated

vanadium pentoxidexerogel/polyvinyl alcohol composite films: Application in the

development of amperometric biosensors.Electrochem. Commun., v. 7, p 781- 788,

2005.

55

[9]ALFAYA, A. A. S.; KUBOTA L. T. A utilização de materiais obtidos pelo

processo de sol-gel na construção de biossensores. Quim.Nova, v. 25, n. 5, p835-

841, 2002.

[10] BERGVELD, P. Development of an ion-sensitive solid-state device for

neurophysiological measurements. IEEE Transactions On Biomedical Engineering, v.

17, p. 70–71, 1970.

[11] YIN, L.-T. et al. Study of indium tin oxide thin film for separative extended

gate ISFET. Materials Chemistry and Physics, v. 70, p. 12–16, 2001.

[12] SEDRA, A. S.; SMITH, K. C. Microelectronic.

"MicroelectronicCircuitsRevisedEdition." .2007.

[13] CAPELATO, M. D; FILHO, O. F. Biossensores. Química Nova, v. 15, n. 1,

p. 28-39, Out. 1991.

[14] FILHO. L. R. F. F. Módulos Eletrônicos para Caracterização Elétrica de

EGFET´s como Sensores de pH, Centro Brasileiro de Pesquisas Físicas, Rio de

Janeiro, 2012.

[15] STETTER. J.R, PENROSE .W .R, and YAO. S, Sensor, Chemical

Sensors, Electrochemical Sensor, and ECS, J Eletrochem. Soc., vol. 150, no. 2, p

11-16 , Feb. 2003.

[16] THÉVENOT, D. R. et al. Electrochemical biosensors: recommended

definitions and classification. Biosensors & Bioelectronics, v. 16, p. 121–131, 2001.

[17] BERGVELD, P. The future of biosensors. Sensors and Actuators, A:

Physical, v. 56, n. 1–2, p. 65–73, 1996.

[18] MALHOTRA,B. D.; CHAUBEY. A., Biosensors for clinical diagnostics

industry. Sensors and ActuatorsB.v.91, p. 117-127, 2003.

56

[19] NASCIMENTO, R. A. S, Análise de procedimentos de medida de

dispositivos EGFET utilizando filmes FTO. Dissertação (Mestrado)- Mestrado em

Física Aplicada a Biologia e Medicina- Departamento de física, faculdade de

Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão

Preto, 2012

[20] SZE, S. M.; KWOK, K. N. Physics of semiconductor devices. 3. ed. [S.I]:

New Jersey: Wiley- Interscience, 2007

[21] MARQUES, P. R. B. O.; YAMANAKA, H. Biossensores baseados no

processo de inibição enzimática, v 31, n-7, p 1791-1799, 2008.

[22] GALLI, A. Desenvolvimento e caracterização de um

biossensorbioenzimático imobilizado sobre monocamadas auto-organizadas para

determinação de açucares em alimentos. Tese(Doutorado) — Doutorado em

Ciências (Química Analítica) - Instituto de Química de São Carlos, Universidade de

São Paulo, São Carlos, 2009.

[23] CHAUBEY, A.; MALHOTRA, B. Mediated biosensors. Biosensors and

Bioelectronics, v. 17, n. 6–7, p. 441–456, 2002.

[24] MALHOTRA, B. D.; TURNER, A. P. F. Advances in Biosensors -

Perspectives in Biosensors. Elsevier Science BV, v.1, 2003.

[25] BERGVELD, P. Development of an Ion-Sensitive Solid-State Device for

Neurophysiological Measurements Trans. Biomed. Eng., v 17, p 70-71,1970

[26] SILVA, G. R. Materiais micro e nanoestruturados para sensores de íons

do tipo EGFET. Tese (Doutorado) — Doutorado em Física Aplicada à Medicina e

Biologia - Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade

de São Paulo, Ribeirão Preto, 2009.

57

[27] FERNANDES, J. C.B, KUBOTA, L. T., NETO, G. de O. Ion-selective

electrodes: Historical, mechanism of response, selectivity and concept review.

Química Nova, v.24, n1, p.120-130, 2001

[28] SILVA, G. R. Materiais Micro e nanoestruturados para sensores de íons

do tipo EGFET. Tese (Doutorado) - Doutorado em Física Aplicada à Medicina e

Biologia -Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade


[29] GUERRA, E. M.; SILVA, G. R.; MULATO, M., “Extended gate field effect

transistor using V2O5xerogel sensing membrane by sol–gel method,” Solid State Sci.,

vol. 11, n. 2, p. 456–460, Feb. 2009.

[30] FERNANDES, J. C. Biossensores de pH, ureia e glicose utilizando a

microeletrônica de filmes finos de AZO e TiO2. Tese (Doutorado)- Doutorado em

Física Aplicada à Medicina e Biologia -Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de

Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2016.

[31] SHINWARI, M. W.; DEEN, M. J.; LANDHEER, D. Study of the electrolyte-

insulator-semiconductor field-effect transistor (EISFET) with applications in biosensor

design. MicroelectronicsReliability, v. 47, n. 12, p. 2025–2057, 2007.

[32] SILVA, G. R. Materiais micro e nanoestruturados para sensores de íons

do tipo EGFET. Tese (Doutorado) — Doutorado em Física Aplicada à Medicina e

Biologia - Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade


[33] BUCK, R. P. Electrochemistry of ion-selective electrodes. Sensors and

Actuators, v. 1, p. 197–260, 1981.

[34] PACHECO, W. F. et al. Voltametrias: Uma breve revisão sobre os

conceitos . Revista Virtual de Química., v.5, n.4, p 516-537, 2013. Acessado em 16

de julho de 2016.

58

[35] GUIDELLI, E. J.; GUERRA, E. M.; MULATO, M. V2O5/WO3 Mixed Oxide

Films as pH-EGFET Sensor: Sequential Re-Usage and Fabrication Volume Analysis,

ECS J. Solid State Sci. Technol., vol. 1, n. 3, p. 39–44, Jan. 2012.

[36] CHI, L. L., et al., Study on extended gate field effect transistor with tin

oxide sensing membrane, Mater. Chem. Phys., vol. 63, n. 1, p. 19–23, Feb. 2000.

[37] ADHIKARI, B.; MAJUMDAR, S., Polymers in sensor applications, Prog.

Polym. Sci., vol. 29, n. 7, p. 699–766, Jul. 2004.

[38] BRIONES, M. et al. Diamond nanoparticles based biosensors for efficient

glucose and lactate determination. Biosensors and Bioelectronics. v. 68,p. 521–528.

jan 2015.

[39] ALFAYA, A. A. S.; KUBOTA, L. T. A utilização de materiais obtidos pelo

processo de sol-gel na construção de Biossensores. Quim. Nova, v. 25, n. 5,p. 835-

841, 2002.

[40] ALFAYA, A. A. S.; KUBOTA,L. T. A utilização de materiais obtidos pelo

processo de sol-gel na construção de biossensores. Quim.Nova, v.25, n. 5, 835-841,

2002.

[41] KHARITONOV A. B.; ZAYATS, M.; LICHTENSTEIN, A., KATZ, E.;

WILLNER,I. Enzyme monolayer-functionalized field-effect transistors for biosensor

applications. Sensors and Actuators B, v. 70, p. 222- 231, 2000.

[42] J. Kim, J. W. Grate, P. Wang, Nanostructures for enzyme stabilization.

Chem.lEngin. Science, v. 61, n. 3, p. 1017- 1026, 2006.

[43] POPE M. T., Inorganic Chemistry Concepts, Heteropoly and

IsopolyOxometalates, Berlin, 1983.

59

[44] J. Livage, Sol-gel chemistry and electrochemical properties of vanadium

oxide gelsSolid State Ionics, v 86-88, p 935-942, 1996.

[45] WANG, J. Electrochemical Glucose Biosensors. American Chemical

Society. v. 108, n. 2, p. 814-825, Mar. 2008.

[46] JENNIFER, E.; SPRAGUE, M. D.; ARBELÁEZ, A. M. Glucose

Counterregulatory Responses to Hypoglycemia. PediatrEndocrinol Rev. V. 9, n. 1, p.

463–475 Sep. 2011

[47]MELLO, H. J. N. P. D.; HEIMFARTH. T, MULATO. M. Influence of the

physical-chemical properties of polyaniline thin films on the final sensitivity of varied

field effect sensors.Materials Chemistry and Physics. v.160, p. 257- 263, Mar 2015

[48] BAILEY, J.K.; POZARNSKY G.A.; MECARTNEY M.L., The Direct

Observation of Structural Development During Vanadium Pentoxide Gelation, J.

Mater. Res. v. 7, n. 9, p. 2530-2537, 1992.

[49] BADDOUR, R.; PEREIRA-RAMOS, J.P.; MESSINA R;, PERICHON J.,

J.A thermodynamic, structural and kinetic study of the electrochemical lithium

intercalation into the xerogel V2O5 · 1.6 H2O in a propyleneElectroanal. Chem. v. 314,

n. 1-2, p 81-101, Sep. 1991.

[50] ALDEBERT , P. et al. Layered structure of vanadium pentoxide gels. Mat.

Res. Bull. v. 16, n. 6, p 669-676, 1981.

[51] SPAHR, M. E.et al. Vanadium Oxide Nanotubes as Electrode

Material.Electrochem.Soc.v. 146, p. 2780- 2783, 1999.

[52] J. LIVAGE.Vanadiumpentoxide gels. Chem. Mater. 3,p 578-593 , july

1991.

[53] SANTOS, J. C. D. C. Imobilização da enzima glicose oxidase em filmes

60

nanoestruturados para aplicação em biossensores. Dissertação (Mestrado) —

Dissertação de mestrado em Ciências - Instituto de Física de São Carlos,

Universidade de São Paulo, São Carlos, 2009.

[54] PICKUP JC, SUTTON AJ. Severe hypoglycaemia and glycaemic control in type

1 diabetes: Meta-analysis of multiple daily insulin injections compared with

continuous subcutaneous insulin infusion. Diabet Med. 2008;25:765

desenvolvimento de biossensores impressos de … · ficha catalográfica elaborada pela divisão de...

Documents